JP2016516755A - ワクチン組成物及びその使用方法 - Google Patents

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Abstract

ワクチン組成物及び使用方法が本明細書に記載される。一実施形態では、ワクチン組成物は、アジュバントと組み合わせてRSV−Fタンパク質を含む。より具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、脂質Toll様受容体(TLR)アゴニストと組み合わせてRSV可溶性Fタンパク質を含む。さらに具体的な実施形態では、アジュバントは、グルコピラノシルリピドA(GLA)を含む。別の実施形態では、アジュバントは、安定した水中油形エマルジョン中のGLA(GLA−SE)を含む。【選択図】図1A−B

Description

優先権の主張
本出願は、2013年4月8日に提出された先の米国仮特許出願第61/809,563号明細書の利益を主張する。尚、この文献は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
電子データにて提出した配列表の参照
本出願と一緒に提出したASCIIテキストファイル(名称:RSVFseqlist.txt;サイズ:46,202バイト;及び作成日:2014年4月3日)は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
本発明は、概して、ウイルス感染症に対する防御をもたらす、又は防御抗体を誘発するワクチンに関する。より具体的には、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、とりわけ、ヒト呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質(RSV−F)に対するワクチン製剤について記載する。
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、乳児及び小児における下気道疾患の主な原因である(Feigen et al.編,1987,In:Textbook of Pediatric Infectious Diseases,WB Saunders,Philadelphia,1653〜1675頁;New Vaccine Development,Establishing Priorities,Vol.1,1985,National Academy Press,Washington D.C.,397〜409頁;及びRuuskanen et al.,1993,Curr.Probl.Pediatr.23:50−79)。RSV感染症の毎年の流行性は世界規模で明らかであるが、所与のシーズンでのRSV感染症の発生率及び重症度は、地域によって異なる(Hall,C.B.,1993,Contemp.Pediatr.10:92−110)。北半球の温暖な地域では、これは、通常、秋後半に始まり、春後半に終わる。一次RSV感染症は、最も一般的には、生後6週間から2歳の小児に起こり、稀に、院内感染の場合、生後4週間で起こることもある(Hall et al.,1979,New Engl.J.Med.300:393−396)。RSV感染の危険性が高い小児としては、早産児(Hall et al.,1979,New Engl.J.Med.300:393−396)並びに気管支肺異形成症(Groothuis et al.,1988,Pediatrics 82:199−203)、先天性心疾患(MacDonald et al.,New Engl.J.Med.307:397−400)、先天性又は後天性免疫不全(Ogra et al.,1988,Pediatr.Infect.Dis.J.7:246−249;及びPohl et al.,1992,J.Infect.Dis.165:166−169)、及び嚢胞性線維症(Abman et al.,1988,J.Pediatr.113:826−830)を有する小児が挙げられる。RSV感染で入院し、かつ心臓又は肺疾患を有する小児の致死率は、3%〜4%である(Navas et al.,1992,J.Pediatr.121:348−354)。
RSVは、乳児及び小児同様、成人にも感染する。健康な成人において、RSVは、主に上気道疾患を引き起こす。近年、一部の成人、特に高齢者は、以前報告されているより高い頻度で症状性RSV感染を有することが明らかになっている(Evans,A.S.編,1989,Viral Infections of Humans.Epidemiology and Control,第3版,Plenum Medical Book,New York,525〜544頁)。療養施設患者及び若年青年の入院患者の間でもいくつかの流行が報告されている(Falsey,A.R.,1991,Infect.Control Hosp.Epidemiol.12:602−608;及びGarvie et al.,1980,Br.Med.J.281:1253−1254)。最後に、RSVは、免疫抑制された人、とりわけ骨髄移植患者において重篤な疾患を引き起こし得る(Hertz et al.,1989,Medicine 68:269−281)。
定着したRSV感染症についての治療の選択肢は限られている。下気道の重篤なRSV感染症は、多くの場合、加湿酸素の供給及び呼吸補助などの相当な支持療法を必要とする(Fields et al.編,1990,Fields Virology,第2版,Vol.1,Raven Press,New York,1045〜1072頁)。抗ウイルス剤のリバビリンは、感染症の治療のために承認されている(American Academy of Pediatrics Committee on Infectious Diseases,1993,Pediatrics 92:501−504)。これは、免疫応答性小児における重篤なRSV感染症の経過を改変し、RSV性肺炎及び細気管支炎の治療に有効であることが証明されている(Smith et al.,1991,New Engl.J.Med.325:24−29)。しかし、リバビリンは、長時間にわたるエーロゾル投与を必要とするとことと、妊婦が、病院の環境においてその投与中に薬物に暴露され得る潜在的危険性についての懸念から、その使用が限定されている。
Feigen et al.編,1987,In:Textbook of Pediatric Infectious Diseases,WB Saunders,Philadelphia,1653〜1675頁 New Vaccine Development,Establishing Priorities,Vol.1,1985,National Academy Press,Washington D.C.,397〜409頁 Ruuskanen et al.,1993,Curr.Probl.Pediatr.23:50−79 Hall,C.B.,1993,Contemp.Pediatr.10:92−110 Hall et al.,1979,New Engl.J.Med.300:393−396 Groothuis et al.,1988,Pediatrics 82:199−203 MacDonald et al.,New Engl.J.Med.307:397−400 Ogra et al.,1988,Pediatr.Infect.Dis.J.7:246−249 Pohl et al.,1992,J.Infect.Dis.165:166−169 Abman et al.,1988,J.Pediatr.113:826−830 Navas et al.,1992,J.Pediatr.121:348−354) Evans,A.S.編,1989,Viral Infections of Humans.Epidemiology and Control,第3版,Plenum Medical Book,New York,525〜544頁 Falsey,A.R.,1991,Infect.Control Hosp.Epidemiol.12:602−608;及びGarvie et al.,1980,Br.Med.J.281:1253−1254 Hertz et al.,1989,Medicine 68:269−281 Fields et al.編,1990,Fields Virology,第2版,Vol.1,Raven Press,New York,1045〜1072頁 American Academy of Pediatrics Committee on Infectious Diseases,1993,Pediatrics 92:501−504 Smith et al.,1991,New Engl.J.Med.325:24−29
ワクチン開発に関する1つの大きな障害は、安全性である。ホルマリン不活性化ワクチンは、免疫原性ではあるが、意外にも、同様に調製した三価パラインフルエンザワクチンで免疫した乳児より、高い発生率及び重症度のRSV性下気道疾患を免疫乳児に引き起こした(Kim et al.,1969,Am.J.Epidemiol.89:422−434;及びKapikian et al.,1969,Am.J.Epidemiol.89:405−421)。このように、50年を超える研究にもかかわらず、RSVに対する好適なワクチンは開発されていない。従って、RSVに対する安全かつ有効なワクチンの未だ満たされていない切迫した医療ニーズが残っている。
ワクチン組成物を本明細書に記載する。特に、ワクチン組成物は、RSV−Fタンパク質を含む。一実施形態において、ワクチン組成物は、RSV可溶性Fタンパク質を含む。一実施形態では、RSV可溶性Fタンパク質は、C末端膜貫通ドメインを欠失している。より具体的な実施形態では、RSV可溶性Fタンパク質は、細胞質尾部ドメインを欠失している。一実施形態では、RSV可溶性Fタンパク質は、ヒト株A2(配列番号2)由来のRSV可溶性Fタンパク質のアミノ酸1〜524を含む。別の実施形態では、RSV可溶性Fタンパク質は、配列番号7を含む。
より具体的な実施形態において、ワクチン組成物は、アジュバントと組み合わせてRSV可溶性Fタンパク質を含む。一実施形態では、アジュバントは、脂質toll様受容体である。一実施形態では、アジュバントは、(TLR)4アゴニストである。一実施形態では、アジュバントは、合成ヘキシル化リピドA誘導体である。より具体的な実施形態では、アジュバントは、グルコピラノシルリピドA(GLA)を含む。一実施形態では、アジュバントは、下記式:
Figure 2016516755
(式中、R1、R3、R5及びR6は、C11〜C20アルキルであり;R2及びR4は、C12〜C20アルキルである)
を有する化合物を含む。一実施形態では、アジュバントは、安定した水中油形エマルジョン中のGLA(GLA−SE)を含む。別の実施形態では、アジュバントは、安定化したスクアレンベースエマルジョン中のGLAを含む。
一実施形態では、少なくとも約1μg及び最大約200μgのRSV−Fタンパク質をワクチン組成物に含有させる。一実施形態では、RSV−Fタンパク質は、可溶性RSV−Fタンパク質を含む。一実施形態では、少なくとも約1μg及び最大約20μgのアジュバントをワクチン組成物に含有させる。一実施形態では、アジュバントは、GLAを含む。より具体的な実施形態では、アジュバントは、GLA−SEを含む。より具体的な実施形態では、アジュバントは、濃度が少なくとも約1%及び最大約5%の安定化水中油形エマルジョン中のGLAを含む。一実施形態では、アジュバントは、平均粒度が少なくとも約50nm及び最大約200nmの安定化水中油形エマルジョン中のGLAを含む。一実施形態では、ワクチン組成物はまた、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はこれらの組み合わせも含む。ワクチン組成物は、例えば、筋内又は皮下投与などの非経口投与用に製剤化することができる。一実施形態では、ワクチン組成物は、約50μl〜約500μlの量を有する。
別の実施形態では、哺乳動物において呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染症を予防する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、治療に有効な量の本明細書に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む。別の実施形態では、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、本方法は、有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む。別の実施形態では、過去にRSVに暴露されたことがある哺乳動物においてTh1バイアス細胞性免疫応答を増強する方法であって、本方法は、有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、哺乳動物の細胞性免疫応答は、Th1細胞性免疫応答と、Th2細胞性免疫応答を少なくとも約1.2:1の比で含む。別の実施形態では、哺乳動物においてRSVに対する中和抗体を誘発する方法であって、本方法は、有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、RSV中和抗体力価は、10.0Log2より大きい。一実施形態では、ワクチン組成物の投与後のRSV中和抗体力価は、投与前の血清IgG力価と比較して少なくとも約4倍の血清IgG力価を含む。一実施形態では、ワクチン組成物の投与後のRSV中和抗体力価は、投与前の血清IgG力価と比較して少なくとも約10倍及び最大約200倍の血清IgG力価を含む。一実施形態では、哺乳動物においてRSVウイルス力価を低減する方法であって、本方法は、有効量の本明細書に記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、感染後のRSVウイルス力価が、約50〜約1000倍低減する。別の実施形態では、ワクチン組成物の投与後、RSVウイルス力価は、2log 10pfu/グラムを下回る。より具体的な実施形態では、ワクチン組成物の投与から約1週間〜1年後に、RSVウイルス力価は、2log 10pfu/グラムを下回る。
一実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は、高齢のヒトである。より具体的な実施形態では、哺乳動物は、少なくとも約50歳の実年齢に達している高齢のヒトである。一実施形態では、哺乳動物は、RSV血清陽性である。
一実施形態では、ワクチン組成物は、単一用量レジメンで投与する。別の実施形態では、ワクチン組成物は、1回目及び2回目用量を含む2用量レジメンで投与する。一実施形態では、2回目用量は、1回目用量から少なくとも約1週間、2週間、3週間、1ヵ月又は1年後に投与する。別の実施形態では、ワクチン組成物は、3用量レジメンで投与する。
図面は、本技術の実施形態を説明するものであり、限定するものではない。説明を明瞭かつ容易にするために、図面は一定の比例で作成されているわけではなく、場合によっては、特定の実施形態を理解しやすくするために、様々な側面を強調又は拡大して示すこともある。
ナイーブBALB/cマウスにおけるアジュバント添加RSVsFワクチンに対する免疫応答を示すグラフである。マウス(群当たりN=7)を第0及び14日に、表示するワクチンで免疫し、第28日に6log10PFUのRSVで攻撃した。全ての群で実施した2回の実験のうち1つからの代表的データを示す。(A)肺ウイルス力価。攻撃から4日後の動物の肺における残留ウイルスをプラークアッセイにより定量した。群幾何平均を示すバーと一緒に、個々の結果をlog10で表示する。検出不能な力価を有する個体は、アッセイの検出限界(LOD)、約1.4log10でスコアを付与した。(B)血清RSV−GFP中和力価。群幾何平均を示すバーと一緒に、個別の第28日血清の結果を、ウイルスの50%減少蛍光フォーカス単位(FFU)をもたらす血清のlog2希釈率として表示する。検出不能な力価を有する個体は、破線により示す、3.3log2のアッセイの検出限界(LOD)でスコアを付与した。有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)は、***で示す。(C)F特異的CD4T細胞サイトカイン応答。脾細胞(群当たりn=3)を攻撃から4日後に採取し、72時間再刺激した。免疫優性MHCII制限RSV−Fペプチドプールに対する特異的IFNγ、IL−5、IL−13、及びIL−17応答を示し、これらは、多重サイトカイン分析で得られた試験値から培地対照値を差し引くことにより算出した。群平均及びSEMを示す。(D)血清F特異的IgG1及びIgG2a力価。第28日血清(群当たりn=7)を、終点力価ELISAにより、F特異的IgG1及びIgG2aアイソタイプについて評価した。データは、5.64log2の検出限界(LOD)と共に、log2反復血清終点希釈率(reciprocal serum endpoint dilution)として表示する。95%信頼区間を有する群幾何平均を示し、群同士の有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)は、***で示す。(E)IFNγELISPOT。攻撃から4日後に採取した脾細胞を免疫優性RSV−F由来のMHC1制限ペプチドで再刺激して、CD8T細胞応答を評価した。群同士の有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)は、***で示す。代表的実験(2〜7回繰り返した)の3匹/群について、群平均を示すバーと一緒に、個々のマウスの結果を示す。(F)グランザイムB ELISPOT。脾細胞を採取し、IFNγELISPOTと同様に処理した。群同士の有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)は、***で示す。3匹/群について、群平均を示すバーと一緒に、個々のマウスの結果を示す。 図1A−Bと同じ。 図1A−Bと同じ。 一定及び変動量のGLA−SEと共にRSV−sFを含む組成物についてのIFNγへの抗原用量漸増(dose titration)の作用を示すグラフである。(A)IFNγELISPOTに対する抗原用量漸増の作用。一定量のGLA−SE中、表示用量のRSV sFを投与した5匹/群について、群平均を示すバーと一緒に、個々のマウスの結果を示す。(B)IFNγELISPOTに対するアジュバント用量漸増の作用。一定量の0.3μgのRSV sFと共に表示用量のGLA−SEを投与した3〜4匹/群について、群平均を示すバーと一緒に、個々のマウスの結果を示す。 F特異的CD4及びCD8T細胞誘導及びプライミングを示すグラフである。第0及び14日に、10μgのRSV sF単独で、又は表示のGLA−SE若しくはSEアジュバントと共に製剤化した10μgのRSV sFでマウスを筋内免疫した。脾細胞(群当たりn=5)を採取し、第28日(追加免疫から14日後)、又は第32日、すなわち6log10RSV A2での攻撃から4日後のいずれかの表示時点で、IFNγELISPOTにおいて表示Fペプチドで再刺激した。2つの代表的実験のうち1つの個々の動物の結果を、群平均と一緒に示し、群同士の有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)は、***で示す。(A)追加免疫から14日後のCD4応答。追加免疫から14日後のMHC II制限(CD4)Fペプチドプールに対するIFNγELISPOT応答。(B)追加免疫から14日後のCD8応答。追加免疫から14日後の免疫優性MHC I制限(CD8)Fペプチドに対するIFNγELISPOT応答。(C)攻撃から4日後のCD4応答。攻撃から4日後のMHC II制限(CD4)Fペプチドプールに対するIFNγELISPOT応答。(D)攻撃から4日後のCD8応答。攻撃から4日後の免疫優性MHC I制限(CD8)Fペプチドに対するIFNγELISPOT応答。 肺におけるRSVに対するリコールCD8T細胞応答を示すグラフである。第0及び14日に、表示のワクチン製剤(1回の免疫当たり0.3μgのRSV sFを用いて)でマウスを免疫し、第28日に、6log10pfuのRSVで攻撃した。攻撃から4日、7日、又は12日後に肺を採取し(各群及び時点につきn=3)、(A)RSV−F由来のH−2Kd制限ペプチド又は(B)RSV M2由来H−2Kd制限ペプチドのいずれかで6時間再刺激した。細胞をCD3及びCD8のために表面染色し、IFNγ、TNFα、及びIL−2のために細胞内染色してから、応答CD8T細胞の頻度についてLSR2で分析した。***で示す群同士の有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)と共に、群平均を示す。2回の実験のうちの1つからの代表的データを示す。 ナイーブBALB/cマウスにおけるRSV攻撃に対する肺応答を示すグラフ及び組織学被検体である。第0及び14日に、表示のワクチンでマウス(群当たりn=7)を免疫し、第28日に、6log10pfuのRSVで攻撃した。攻撃から4日後に肺を採取した。全ての群で実施した2回の実験のうちの1つからの代表的データを示す。(A〜F)肺ホモジネート中のサイトカイン。清澄化した肺ホモジネート中のIL−5、IL−13、IFNγ、IL−17、及びエオタキシンを多重サイトカイン分析により定量してから、採取した肺のグラム当たりの量として計算した。個々のマウスの結果を、群平均を示すバーと一緒に示す。IFNγ:IL−5比を計算するために、計算の前に、まず各値に1を加えることにより、値をゼロ点調整した。 肺細胞浸潤。ホルマリン固定肺切片をH&E染色した後、炎症マーカについて評価した。各群について代表的10×実視野を示す。 ナイーブコットンマウスにおけるアジュバント添加RSV sFワクチンに対する免疫応答を示すグラフである。第0及び21日に、表示のワクチン製剤(1回の免疫当たり0.3μgのRSV sFを用いて)でラットを免疫し、第42日に、6log10pfuのRSVで攻撃した。(A)肺ウイルス力価。攻撃から4日後に、個々のラット(群当たりn=8)から肺を採取して、プラーク形成アッセイにより残留ウイルスを定量した。群幾何平均を示すバーと一緒に、個々の結果をlog10で表示する。点線は、対照PBS+GLA−SE群と比較した、残留ウイルスの3log10減少を示す。個々の群及び生RSV A2群同士の有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)を***で示す。(B)鼻ウイルス力価。攻撃から4日後に、個々のラット(群当たりN=8)から鼻及び鼻甲介を採取して、プラーク形成アッセイにより残留ウイルスを定量した。群幾何平均を示すバーと一緒に、個々のデータをlog10で表示する。点線は、対照PBS+GLA−SE群と比較した、残留ウイルスの3log10減少を示す。個々の群及び生RSV A2群同士の有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)を***で示す。(C)血清RSV中和力価。第42日血清(群当たりN=5)を熱不活性し、蛍光フォーカスアッセイによって標的細胞のRSV−GFP感染の中和について試験した。データは、ウイルスの50%低減蛍光フォーカス単位(FFU)をもたらす血清のlog2希釈率として表示し、3.3log2の検出限界(LOD)を破線で示す。群平均及び95%信頼区間を示すバーと一緒に、個々の結果を示す。個々のワクチン群同士の有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)を***で示す。(D)RSV sFに特異的な血清IgG力価。第42日の血清(群当たりN=5)を終点ELISAによりRSV sFの結合について試験した。データは、OD>3×バックグラウンドをもたらす血清のlog2希釈率として表示し、3.3log2の検出限界(LOD)を破線で示す。群平均及び95%信頼区間を示すグレーのバーと一緒に、個々の結果を示す。個々のワクチン群同士の有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)を***で示す。(E)IFNγELISPOT。IFNγELISPOTにおいて、攻撃から4日後に採取した脾細胞(群当たりN=4〜5)を培地又はRSV sFタンパク質のいずれかで再刺激した。試験値から培地対照値を差し引くことにより、F特異的応答を定量した。個々のワクチン群同士の有意な差(一元配置分散分析(1 way ANOVA)による)を***で示す。(F)IFNγ:IL−4ELISPOTの比。F特異的IL−4ELISPOT応答を評価した後、各値に1を加えることにより値のゼロ点調整を実施してから、IFNγ:IL−4スポット形成単位の比を計算した。 図7A−Cと同じ。 コットンラットにおけるRSV攻撃に対する肺応答を示す組織学的サンプルである。第0及び21日に、表示のワクチンでコットンラットを免疫し、第42日に、6log10pfuのRSVで攻撃した。攻撃から4日後に、肺を採取した。ホルマリン固定した肺切片をH&E染色して、炎症性マーカについて評価した。各群(群当たりn=5)からの代表的10×実視野を示す。 アフィニティ精製RSV sFタンパク質のゲル分析の写真である。還元(レーンa)及び非還元(レーンb)条件下、10〜12%ポリアクリルアミドゲル中で精製sFタンパク質を分解し、Sypro Rubyで視覚化した。分子量マーカを余白に示す。 マウス血清抗sF抗体力価を示すグラフである。第0及び14日に、アジュバントを含まないか、又はGLA−SEを含む表示用量のRSV sFでマウスを免疫し、第28日に、6log10pfuのRSVで攻撃した。(A)第28日の血清を、終点力価ELISAにより、F特異的IgGについて評価した。個々のマウスについてlog2反復血清希釈率を表示し、バーは、群幾何平均を示す。アッセイの検出限界(LOD)は、5.64log2であり、点線で示す。(B)第32日の血清を、終点力価ELISAにより、F特異的IgAについて評価した。個々のマウスについてlog2反復血清希釈率を表示し、グレーのバーは、群幾何平均を示す。アッセイの検出限界(LOD)は、4.32log2であり、点線で示す。 ナイーブBALB/cマウスにおけるRSV sF抗体の最適in vivo用量の決定を示すグラフである。第0及び14日に、アジュバントを含まないか、又は5μgのGLA−SEを含む表示用量のRSV sF(0.01〜1.5μg)でマウスを免疫し、第28日に、6log10pfuのRSVで攻撃した。(A)攻撃から4日後に、log10pfu/グラムで測定した肺中の残留ウイルス力価についてのプラークアッセイ。(B)第28日の、log2反復血清希釈率で表すRSV血清中和力価。 細胞内サイトカイン染色を示すグラフである。マウス(群当たりn=3〜5)を第0及び14日に、表示ワクチンで免疫し、第28日に6log10pfuのRSVで攻撃した。第32日、すなわち攻撃から4日後に脾細胞を採取し、免疫優性RSV−F由来MHC I制限ペプチドで再刺激して、CD8T細胞応答を評価した。細胞内サイトカイン染色及びフローサイトメトリー分析による、多機能性IFNγ、TNFα、IL−2+CD8+T細胞の定量。 第0及び14日に、PBS又はRSV sF+GLA−SEで免疫したナイーブBALB/cマウスからの免疫血清による複数のRSV単離物の交差中和を示す表である。過去10年にわたって得られた広範な米国地理的分布(NY、CO、CA、NM/AZ)からのRSV臨床分離株の中和について、第28日血清を試験した。 GLA−SE(2%中5μg)を含まないか、又は含む表示のRSV sF用量(0.4、2、又は10μg)によるワクチン接種の28日前に、RSVの1回感染により血清陽性にしたBALB/cマウスにおいて、ワクチン接種後の各時点についての血清F特異的IgG終点力価を示すグラフである。各時点で、血清を終点力価ELISAによりF特異的IgGについて評価し、カットオフ値は、A450>3×平均バックグラウンドである。データは、log2で示し、検出限界(LOD)は、5〜5.64である。(A)第0日での血清陽性を例証するために、個々のマウスの結果を、群平均(群当たりn=8〜9)を表すバーと一緒に示す。(B)n=6〜9匹についてワクチン接種後の各時点での群平均F特異的IgG力価を示し、エラーバーは、98%信頼区間を表す。 1×血清陽性BALB/cマウスのワクチン接種後の血清RSV中和力価の時間経過を示すグラフである。各時点での個々のマウスからの血清を熱不活性化し、補体の非存在下で標的細胞のRSV−GFP感染の中和について蛍光フォーカスアッセイにより試験した。データは、蛍光フォーカス単位(FFU)を50%低減した血清のlog2希釈率として表示する。値<3.32の検出限界(LOD)は、計算の目的で、2.32として記録した。n=6〜9匹について各時点の群幾何平均を示し、エラーバーは、95%信頼区間を表す。PBS(血清陰性)群に対して、一元配置分散分析(one way ANOVA)によりp<0.05である群を*で示す。 1×血清陽性BALB/cマウスのワクチン接種後の第14日の血清F特異的IgAを示すグラフである。ワクチン接種から14日後の動物の血清終点抗体力価を、3倍連続希釈を用いて、ELISAにより定量した(群当たりN=5〜6)。データは、log2で表示し、本アッセイのLODは、4.32である。個々のマウスの結果は、群平均及び95%信頼区間を表すエラーバーと一緒に示す。PBSをワクチン接種した血清陽性群と比較して有意な差(p<0.05)を*で示す。 1×血清陽性BALB/cマウスのワクチン接種後の第0日及び第42日の血清F特異的IgG1及びIgG2aを示すグラフである。血清は、A450>3×ブランクの平均値のカットオフ値で、終点力価ELISAによりF特異的IgG1及びIgG2aについて評価した。データは、log2で表示する。バーは、95%信頼区間の群幾何平均を示す。(A)N=8〜9匹/群で、検出限界(LOD)は、IgG1の場合、4.05、IgG2aは4.5である。(B)N=5〜6匹で、LODは、いずれのアッセイについても5.0である。 1×血清陽性BALB/cマウスのワクチン接種後の第42日の血清部位特異的競合ELISAを示すグラフである。ワクチン接種から42日後に個々のマウスからの血清を、RSV−F部位特異的抗体の1:25〜1:2×106の希釈率範囲にわたって、部位A、B及びCにそれぞれ結合する部位特異的mAb1121、8599、及び1331Hとの競合ELISAにより評価した。群当たりN=6。このアッセイでは、検出された吸光度が低いほど、部位特異的mAbとRSV sFの結合に対するポリクローナル血清による大きな競合を示す。1:125の代表的希釈の競合率(%)(100×[1−{血清OD/mAbOD平均}])を個々のマウス血清について示し、共に表示するバーは、群平均を示す。対応する非アジュバント添加群と比較して有意性(p<0.05)を**で示す。 ワクチン接種後の第10及び第73日の、ワクチン接種1×血清陽性BALB/cマウスにおけるRSV sFに対するCD4T細胞サイトカイン応答を示すグラフである。脾細胞を採取した後、培地又はRSV sFタンパク質で再刺激して、CD4T細胞応答を評価した(群当たりN=3)。72時間の再刺激後、上清中のIFNγ、IL−10、IL−5、及びIL−17をBioplex多重サイトカイン分析により測定した。試験値から培地対照値を差し引くことにより、F特異的応答を計算した。標準偏差を示すエラーバーと共に群平均を示す。A)ワクチン接種後の第10日、群当たりn=3。B)第73日、すなわちRSV攻撃から4日後、群当たりn=3〜5。 ワクチン接種後の第10日の、1×血清陽性BALB/cマウスにおける免疫優性RSV−Fペプチドに対するCD8T細胞応答を示すグラフである。ワクチン接種から10日後に脾細胞を採取した後、免疫優性RSV−F由来MHC I制限ペプチドで再刺激して、CD8T細胞応答を評価した(群当たりN=3)。(A)IFNγELISPOT。個々の結果を、群平均を示すバーと一緒に表示する。(B)細胞内サイトカイン染色のフローサイトメトリー分析により測定した6時間の再刺激後の総CD8+T細胞の割合(%)として示す、多機能性IFNγ、TNFα、IL−2+CD8+T細胞。群平均及び標準誤差を示す。 ワクチン接種後の第73日の、1×血清陽性BALB/cマウスにおける免疫優性RSV−Fペプチドに対するCD8T細胞応答を示すグラフである。攻撃から4日後に脾細胞を採取した後、免疫優性RSV−F由来MHC I制限ペプチドで再刺激して、CD8T細胞応答を評価した(群当たりN=3〜5)。(A)IFNγELISPOT。個々の結果を、群平均を示すバーと一緒に表示する。(B)細胞内サイトカイン染色のフローサイトメトリー分析により測定した6時間の再刺激後の総CD8+T細胞の割合(%)として示す、選択群における多機能性IFNγ、TNFα、IL2+CD8+T細胞。群平均及び標準誤差を示す。 RSVによる再攻撃前に、ワクチン接種した1×血清陽性BALB/cマウスから採取した肺ホモジネート中のサイトカイン応答を示すグラフである。6log10pfuのRSVによる攻撃から4日後のマウスの肺におけるサイトカインを肺ホモジネートの多重サイトカイン分析により定量した(群当たりN=5〜6)。群平均及び95%信頼区間を示すバーと一緒に、個々のマウスの結果を2つの最も重要なサイトカイン(IFNγ及びIL−5)について表示する。 sFワクチンによるワクチン接種前の1×血清陽性BALB/cマウスにおけるELISAによる血清F特異的IgGを示すグラフである。データは、参照標準と比較してELISAにより定量して、mg/mL当量で表示する。個々のマウスの結果を、群平均(群当たりn=8〜9)を示すバーと一緒に表示する。 RSV sFワクチンで1×血清陽性BALB/cマウスのワクチン接種から2週間後のELISAによる血清F特異的IgG1及びIgG2aアイソタイプを示すグラフである。データは、参照標準と比較してELISAにより定量して、mg/mL当量で表示し、検出限界(LOD)は8mg/mLである。バーは、95%信頼区間を有する、N=6〜7匹/群の群幾何平均を示す。 1×血清陽性BALB/cマウスのワクチン接種後の血清RSV中和力価の時間経過を示すグラフである。各時点の個々のマウスからの血清を熱不活性化し、補体の非存在下で標的細胞のRSV−GFP感染の中和について蛍光フォーカスアッセイにより試験した。データは、蛍光フォーカス単位(FFU)を50%低減した血清のlog2希釈率として表示する。値が<3.32の検出限界(LOD)である場合、計算の目的で、2.32として記録する。n=6〜9匹について各時点の群幾何平均を示し、エラーバーは、95%信頼区間を表す。 ワクチン接種から10日後の、1×血清陽性BALB/cマウスにおける免疫優性RSV Fペプチドに対するCD8T細胞応答を示すグラフである。ワクチン接種から10日後に脾細胞を採取した後、免疫優性RSV−F由来MHC I制限ペプチドで再刺激しした(群当たりN=3〜4)。A)IFNγELISPOT。個々の結果は、群平均を示すバーと一緒に表示する。B)細胞内サイトカイン染色のフローサイトメトリー分析により測定した6時間の再刺激後の総CD8+T細胞の割合(%)として示す、多機能性IFNγ、TNFα、IL−2+CD8+T細胞。群平均及び標準誤差を示す。 図26Aと同じ。 各種アジュバントを含まないか、又は含む10μgRSV sFによる1×血清陽性BALB/cマウスのワクチン接種後の血清RSV中和力価の時間経過を示すグラフである。各時点の個々のマウスからの血清を熱不活性化して、補体の非存在下で標的細胞のRSV−GFP感染の中和について蛍光フォーカスアッセイにより試験した。データは、蛍光フォーカス単位(FFU)を50%低減した血清のlog2希釈率として表す。値が<3.32の検出限界(LOD)である場合、計算の目的で、2.32として記録する。n=6〜9匹について各時点の群幾何平均を示し、エラーバーは、95%信頼区間を表す。PBS(血清陰性)群に対し、一元配置分散分析(one−way ANOVA)によるp<0.05の群を示す。 ナイーブBALB/cマウスにおけるRSV攻撃に対する肺応答を示すグラフである。マウス(群当たりn=7)を第0及び14日に、表示ワクチンで免疫し、第28日に6log10pfuのRSVで攻撃した。攻撃から4日後、肺を採取した。全ての群で実施した2回の実験のうちの1つからの代表的データを示す。(A〜B)肺ホモジネート中のサイトカイン。清澄化した肺ホモジネート中のエオタキシン及びIL−13のレベルを多重サイトカイン分析により定量してから、採取した肺のグラム当たりの量として計算した。個々のマウスの結果を、群平均を示すバーと一緒に示す。 各種アジュバントを含まないか、又は含む10μgRSV sFによるワクチン接種後の第10日の、1×血清陽性BALB/cマウスにおける免疫優性RSV−Fペプチドに対するCD8T細胞応答を示すグラフである。ワクチン接種から10日後に脾細胞を採取した後、免疫優性RSV−F由来MHC I制限ペプチドで再刺激して、CD8T細胞応答を評価した(群当たりN=3)。(A)IFNγELISPOT。個々の結果を、群平均を示すバーと一緒に表示する。(B)細胞内サイトカイン染色のフローサイトメトリー分析により測定した6時間の再刺激後の総CD8+T細胞の割合(%)として示す、多機能性IFNγ、TNFα、IL−2+CD8+T細胞。群平均及び標準誤差を示す。 非ワクチン接種ナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおけるRSV複製動力学を示すグラフである。ナイーブ5〜6週齢雌スプラーグ・ドーリーラットは、第0日に鼻内接種により2×106pfuのRSV A2を受けた。清澄化した肺又は鼻ホモジネートの連続希釈を用いたプラークアッセイによりRSV力価を定量した(1時点につきN=5)。群幾何平均RSV力価を示すバーと一緒に、個々の結果を表示する。最も高い検出限界(LOD)を実線で示す。力価<LODの個体には、グラフ作成及び統計計算のために、4.0の値を付与した。 ナイーブスプラーグ・ドーリーラットのワクチン接種から6時間後の血清サイトカインを示すグラフである。多重ビーズベースELISAにより、血清をラットIL−6、MCP−1、MCP−1β及びGRO/KCについて評価した。pg/mLでの定量を標準曲線との比較により決定した。バーは、95%信頼区間を有する群幾何平均を示す(N=5〜6匹/群)。検出下限を破線で示す。力価<LODの個体には、グラフ作成及び統計計算のために、LODと等しい値を付与した。 図31A−Bと同じ。 ナイーブスプラーグ・ドーリーラットのワクチン接種後のRSV sF特異的IgG力価を示すグラフである。ELISAによるRSV−F特異的IgGの終点力価をlog2で表示する。バーは、第14日のn=3匹/群及び第22及び42日のn=4〜6匹/群からの95%信頼区間を有する群幾何平均を示す。5.64のアッセイ検出限界(LOD)(破線で示す)を下回るサンプルには、グラフ作成のために、5.64の値を付与した。*は、PBS群に対するp<0.05を示し、**は、テューキー(Tukey)のポストテストと共に一元配置分散分析(1−way ANOVA)を用いた、対応するRSV sF群に対するp<0.05を示す。A)ワクチン接種後の第14日。B)ワクチン接種後の第22日。C)ワクチン接種後の第42日。 ナイーブスプラーグ・ドーリーラットのワクチン接種後の第42日の血清RSV sF特異的アイソタイプを示すグラフである。終点ELISAにより、RSV−F sF特異的IgG1、IgG2a、及びIgG2bアイソタイプを測定した。バーは、n=4〜6匹/群からの群幾何平均を示す。5.64のアッセイ検出限界(LOD)(破線で示す)を下回るサンプルには、グラフ作成のために、5.64の値を割り当てた。*は、PBS群に対するp<0.05を示し、**は、テューキー(Tukey)のポストテストを用いた一元配置分散分析(1−way ANOVA)による、対応するRSV sF群に対するp<0.05を示す。 ナイーブスプラーグ・ドーリーラットのワクチン接種後のRSV中和力価を示すグラフである。表示ワクチンを接種した個々のラット及び対照からの血清を熱不活性化して、補体の非存在下で標的細胞のRSV−GFP感染を中和するそれらの能力について蛍光フォーカスアッセイにより試験した。データは、蛍光フォーカス単位(FFU)を50%低減した血清のlog2希釈率として表示する。3.32の検出限界(LOD)を下回るサンプルには、グラフ作成及び統計計算の目的で、3.30の値を付与した。群当たりn=4〜6匹について個々の結果を示し、95%信頼区間を表すエラーバーと一緒に群幾何平均も表示する。*は、PBS群に対するp<0.05を示し、**は、テューキー(Tukey)のポストテストを用いた一元配置分散分析(1−way ANOVA)による、対応する非アジュバントRSV sF群に対するp<0.05を示す。 ワクチン接種したナイーブスプラーグ・ドーリーラットからの脾細胞におけるRSV F特異的IFNγELISPOT応答を示すグラフである。RSV A2攻撃から4日後に脾細胞を採取し、RSV sFタンパク質再刺激に対する応答についてIFNγELISPOTにより評価した(群当たりN=4〜6)。各処理群について個々の結果並びに群平均及び標準偏差を表示する。*は、PBSと比較したp<0.05を示し、**は、ボンフェローニ(Bonferroni)の多重比較ポストテストを用いた一元配置分散分析(1−way ANOVA)による、対応する非アジュバント添加sFと比較したp<0.05を示す。 ワクチン接種したナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおける攻撃後のRSV A2力価を示すグラフである。第42日に、全てのワクチン群を2×106pfuのRSV A2でIN攻撃した。清澄化した肺又は鼻ホモジネートの連続希釈を用いて、攻撃から4日後のプラークアッセイによりRSV力価を定量した(群当たりN=4〜6)。群幾何平均RSV力価を示すバーと一緒に、個々の結果を表示する。検出限界(LOD)を実線で示し(肺の場合は、8.7pfu/グラム、鼻の場合は4.0pfu/グラム)、LODに満たないサンプルには、グラフ作成及び統計計算のために、LOD値を割り当てた。 RSV sFワクチンを投与したナイーブげっ歯類における経時的体重変化を示すグラフである。(A)第0日及び第21日に、アジュバントを含まないか、又はアジュバントGLA−SE(5μg/2%)、GLA(5μg)、SE(2%)、若しくはミョウバン(100μg)を含む0.3μgのRSV sFで、ナイーブコットンラットにワクチン接種し、第0日から第25日までその体重変化率(%)を追跡した。(B)第0日及び第21日に、GLA−SE(2.5μg/2%)を含まないか、又は含む10〜100μgのRSV sFでナイーブスプラーグ・ドーリーラットをワクチン接種し、第0日から第42日までその体重変化率(%)を追跡した。 RSV血清陽性マウスの中和力価を示すグラフである。第0日及び第35日に、1×106PFUのRSV A2をマウスに鼻内経路で投与した。第28日(生RSV A2の1回投与後)及び第56日(生RSV A2の2回目投与から28日後)に、3.3の下限LODを用いたマイクロ中和アッセイにより中和Ab力価を定量した。ナイーブマウスサブセットの力価も示す。FFUの50%低減をもたらした最近似希釈率のlog2として力価を計算した。最初の血清希釈率(1:10)が、蛍光フォーカス単位数≦投入ウイルスの50%をもたらさなかった場合、力価は10として記録し、分析のために3.3log2の値を用いた。ナイーブマウスについてはN=8、第28日及び第56日はN=35。SDと共に平均を示す。 免疫から14日後の中和抗体応答を示すグラフである。免疫から14日後(第70日)の中和Ab力価を、3.3の下限LODを用いたマイクロ中和アッセイにより定量した。FFUの50%低減をもたらした最近似希釈率のlog2として力価を計算した。最初の血清希釈率(1:10)が、蛍光フォーカス単位数≦投入ウイルスの50%をもたらさなかった場合、力価は10として記録し、分析のために3.3log2の値を入力した。平均及びSDと共にN=4匹を示す。 試験期間にわたる中和抗体応答を示すグラフである。第56日、第70日及び第84日の中和抗体力価を、3.3の下限LODを用いたマイクロ中和アッセイにより定量した。FFUの50%低減をもたらした最近似希釈率のlog2として力価を計算した。最初の血清希釈率(1:20)が、蛍光フォーカス単位数≦投入ウイルスの50%をもたらさなかった場合、力価は10として記録し、分析のために3.3log2の値を入力した。第56日はN=8匹、第70日及び第84日はN=4匹であり、平均及びSEMを一緒に示す。 ワクチン接種前の血清陽性マウスにおけるベースラインRSV F特異的IgG応答を示すグラフである。個々のマウス血清について、RSV sF塗布プレート上でのELISAにより総抗FIgG血清力価を定量した。モノクローナル抗体1331H(Beeler及びvan Wyke Coelingh,1989)を用いて、標準曲線を作成した。ナイーブ群はN=8匹、RSVの2回連続感染を受けたマウスN=35匹。平均及びSDを示す。 免疫から14日後の総RSV F特異的IgG力価を示すグラフである。個々のマウス血清について、RSV sF塗布プレート上でのELISAにより総抗FIgG血清力価を定量し、力価のlog2をグラフ化した。精製モノクローナル抗体1331H(Beeler及びvan Wyke Coelingh,1989)を用いて、標準曲線を作成した。N=4で、平均SDを共に示す。一元配置分散分析(1−way ANOVA)及びテューキー(Tukey)による統計分析。 試験期間にわたる総RSV F特異的IgG力価を示すグラフである。個々のマウス血清について、RSV sF塗布プレート上でのELISAにより総抗FIgG血清力価を定量し、力価のlog2をグラフ化した。精製モノクローナル抗体1331H(Beeler及びvan Wyke Coelingh,1989)を用いて、標準曲線を作成した。N=4で、平均SDを共に示す。N=4で、平均SDを共に示す。 RSV F特異的IgG1及びIgG2a応答を示すグラフである。個々のマウス血清について、RSV sF塗布プレート上でのELISAにより、第84日(免疫から28日後)に抗FIgG1又はIgG2a血清レベルを定量した。精製モノクローナル抗体1331H又は1308(Beeler及びvan Wyke Coelingh,1989)を用いて、標準曲線を作成した。N=4で、平均及びSEMを共に示す。 RSV攻撃から4日後の肺サイトカイン力価を示すグラフである:攻撃から4日後に単離した肺ホモジネートからの上清中のIFNγ及びIL−5肺サイトカイン力価をBioplex多重サイトカイン分析により測定した。N=4匹で、SEMを共に示す。 図45Aと同じ。 RSV攻撃から4日後の肺サイトカイン力価:エオタキシン(図46A)、IL−13(図46B)及びRANTES(図46C)を示すグラフである。攻撃から4日後に単離した肺ホモジネートからの上清中の肺サイトカイン力価をBioplex多重サイトカイン分析により測定した。N=4匹で、SEMを共に示す。 図46A−Bと同じ。 ELISPOTによるCD8T細胞Fペプチド脾細胞再刺激を示すグラフである。免疫から11日後(図47A)又は攻撃から4日後(図47B)のいずれかに、脾細胞を単離した。F特異的CD8T細胞エピトープで脾細胞を刺激して、IFNγ分泌細胞の数をELISPOTアッセイにより決定した。マウス4匹の群平均を示す。一元配置分散分析(1−way ANOVA)及びテューキー(Tukey)ポストテストによる統計分析。 血清陽性コットンラットにおける総RSV FIgG血清応答を示すグラフである。希釈率1:1000の個々のマウス血清について、RSV sF塗布プレート上でのELISAにより、総抗FIgG血清レベルを比較した。第28及び38日についてはN=8匹の群平均を、また第49及び56日についてはN=5匹の群平均をSDと共に示す。2週間置きに1×106PFUのRSV A2の4回反復した連続免疫を鼻内経路で受けたコットンラットから、正のコットンラット対照血清をプールした。負のコットンラット対照血清は、ナイーブラットからプールした。 図48A−Bと同じ。 血清陽性コットンラットにおける中和抗体応答を示すグラフである。第28日及び第49日の中和抗体力価を、3.3の下限LODを用いたマイクロ中和アッセイにより定量した。力価は、FFUの50%低減をもたらす希釈率のEC50計算値のlog2である。第28日のN=8匹及び第49日のN=5匹の群平均、並びにSDを示す。最初の血清希釈率(1:10)が、蛍光フォーカス単位(FFU)数≦投入ウイルスの50%をもたらさなかった場合、力価は10として記録し、分析のために3.3[log2(10)]の値を入力した。 血清陽性コットンラットにおける中和抗体力価の増加倍数を示すグラフである。第28、38、49及び56日の中和抗体力価をマイクロ中和アッセイにより定量した。EC50値は、投入ウイルスのFFUの50%低減をもたらす希釈率として計算した。増加倍数は、各コットンラットについて、表示日のEC50値を第28日のEC50値で割ることにより計算した。第38日のN=8匹及び第49及び56日のN=5匹についての群幾何平均を95%信頼区間と共に示す。1の値は、中和力価の増大がないことを示す。 図50A−Bと同じ。 血清陽性コットンラットにおける第56日の部位特異的抗体応答を示すグラフである。第56日の個々のラットからの血清を、部位A、B及びCにそれぞれ結合するSynagis(登録商標)、1112及び1331Hとの競合ELISAにより、RSV F部位特異的抗体の1:25〜1:2×106の希釈率範囲にわたって評価した。個々の血清について1:125の代表的希釈率での競合率(%)(100×[1−{血清OD/mAbOD平均}])を示す。 図51A−Bと同じ。 血清陽性コットンラットにおける総RSV FIgG血清応答を示すグラフである。6.6log2のLODで、個々のマウス血清について、RSV−sF塗布プレート上での終点希釈ELISAにより、総抗FIgG血清レベルを定量した。ブランクの平均値の2倍を超えるODをもたらした最高希釈率のlog2として終点を計算した。最初の血清希釈率(1:100)が、ブランクの平均値の2倍以下であった場合、力価は100として記録し、分析のために6.6(log2100)の値を使用した。SDと共にN=11匹の群平均を示す。2週間置きに1×106PFUのRSV A2の4回反復した連続免疫を鼻内経路で受けたコットンラットから、正のコットンラット対照血清をプールした。負のコットンラット対照血清は、ナイーブラットからプールした。一元配置分散分析(1−way ANOVA)及びテューキー(Tukey)ポストテストによる統計分析。 血清陽性コットンラットにおけるRSV F特異的IgG力価の増加倍数を示すグラフである。RSV sF特異的IgG力価を第28及び3日に定量した。増加倍数は、2を、各コットンラットについて第38日のlog2終点力価から第28日のlog2終点力価を差し引くことによって得られた値の累乗にすることによって計算した。95%信頼区間を有するN=11匹の群幾何平均示す。点線は、Y=1及びY=4地点である。1の値は中和力価の増大がないことを示す。2週間置きに1×106PFUのRSV A2の4回反復した連続免疫を鼻内経路で受けたコットンラットから、正のコットンラット対照血清をプールした。負のコットンラット対照血清は、ナイーブラットからプールした。 血清陽性コットンラットにおけるRSV中和抗体応答を示すグラフである。第28日及び第38日の中和抗体力価を、3.3の下限LODを用いたマイクロ中和アッセイにより定量した。力価は、FFUの50%低減をもたらす希釈率のEC50計算値のlog2である。N=11匹の群平均をSDと共に示す。最初の血清希釈率(1:10)が、蛍光フォーカス単位(FFU)数≦投入ウイルスの50%をもたらさなかった場合、力価は10として記録し、分析のために3.3[log2(10)]の値を入力した。2週間置きに1×106PFUのRSV A2の4回反復した連続免疫を鼻内経路で受けたコットンラットから、正のコットンラット対照血清をプールした。負のコットンラット対照血清は、ナイーブラットからプールした。一元配置分散分析(1−way ANOVA)及びテューキー(Tukey)ポストテストによる統計分析。 血清陽性コットンラットにおけるRSV中和抗体力価の増加倍数を示すグラフである。第28及び38日の中和抗体力価をマイクロ中和アッセイにより定量した。EC50値は、投入ウイルスのFFUの50%低減をもたらす希釈率として計算した。増加倍数は、各コットンラットについて、表示日のEC50値を第28日のEC50値で割ることにより計算した。95%信頼区間を有するN=11匹の群幾何平均を示す。点線は、1及び4地点である。1の値は、中和力価の増大がないことを示す。 血清陽性コットンラットにおける第38日の部位特異的抗体応答を示すグラフである。第56日の個々のラットからの血清を、部位A、B及びCにそれぞれ結合するSynagis(登録商標)、1112及び1331Hとの競合ELISAにより、RSV F部位特異的抗体の1:25〜1:2×106の希釈率範囲にわたって評価した。個々の血清について1:125の代表的希釈率での競合率(%)(100×[1−{血清OD/mAbOD平均}])を示す。N=11匹の群平均をSDと共に示す。2週間置きに1×106PFUのRSV A2による4回反復した連続免疫を鼻内経路で受けたコットンラットから、正のコットンラット対照血清をプールした。負のコットンラット対照血清は、ナイーブラットからプールした。一元配置分散分析(1−way ANOVA)及びテューキー(Tukey)ポストテストによる統計分析。 図56A−Bと同じ。 第7日から第183日までの個々のカニクイザルにおける抗FIgG抗体力価の時間経過を示すグラフである。矢印で示すように、第0、28、及び169日に、ワクチン(第1群のRSV sF又は第2群のRSV sF+GLA−SEのいずれか)を投与した。個々のサルについての抗FIgG力価を試験時点でのlog2値で表示し、アッセイの検出限界は6.6log2(1:100血清希釈率に相当する)である。検出限界を下回る値は、視覚化のために6.0と推定する。 第7日から第183日までの個々のカニクイザルにおけるRSV中和抗体力価の時間経過を示すグラフである。赤い矢印で示すように、第0、28、及び169日に、ワクチン(第1群のRSV sF又は第2群のRSV sF+GLA−SEのいずれか)を投与した。個々のサルについての中和IC50力価を試験時点でのlog2値で表示し、アッセイの検出限界は2.3log2(1:5血清希釈率に相当する)である。検出限界を下回る値は、視覚化のために2.3と推定する。 第7日から第183日までの個々のカニクイザルにおけるIFNγELISPOT応答の時間経過を示すグラフである。赤い矢印で示すように、第0、28、及び169日に、ワクチン(第1群のRSV sF又は第2群のRSV sF+GLA−SEのいずれか)を投与した。各々のサルについての個々の結果は、試験した時点での100万PBMC当たりのスポット形成細胞(SFC)で表示する。応答動物(4倍増加及びベースラインからの>50SFC/百万の変化の両方を呈示する動物)を星印で示す。
1.定義
本明細書において別に定義しない限り、科学及び技術用語は、当業者に一般に理解されている意味を有する。さらに、文脈によって別段必要でない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
本明細書で用いるように、用語「約」は、この技術分野において当業者には周知である、それぞれの値についての誤差の範囲を指す。
本明細書で用いるように、用語「アジュバント」は、製剤中の特定の免疫原と組み合わせて用いられる場合、得られる免疫応答を増大、あるいは改変又は修飾する化合物を指す。免疫応答の修飾は、抗体及び細胞性免疫応答のいずれか若しくは両方の強化又はその特異性の広幅化を含んでよい。免疫応答の修飾はまた、特定の抗原特異的免疫応答を低減又は抑制することを意味する場合もある。
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を通して、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又はこれらの組み合わせなどの標的を認識して、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いるように、用語「抗体」は、抗体が要望される生物活性を発揮するものである限りにおいて、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体フラグメント(Fab、Fab’、F(abs’)2、及びFuフラグメント)、一本鎖Fu(scFv)突然変異体、少なくとも2つのインタクトな抗体から作製された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、並びに抗原認識部位を含む他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含する。用語「抗体」は、さらに、次の4つのポリペプチド鎖:2つの軽(L)鎖と2つの重(H)鎖から成る分子量約150kDaのY字型糖タンパク質も指すことができる。哺乳動物のIg重鎖アイソタイプには、次のギリシャ文字:アルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、及びミュー(μ)で示される5つのタイプがある。重鎖のタイプによって、抗体のクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMが決定される。γ及びαクラスは、定常ドメイン配列及び機能の違いに応じて、例えば、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2などのサブクラスにさらに区分される。哺乳動物の場合、λ及びκの2つのタイプの免疫グロブリン軽鎖がある。抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「VH」及び「VL」と呼ばれることもある。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性(同じクラスの他の抗体に対して)の部分であり、抗原結合部位を含む。
本明細書で用いるように、用語「抗原製剤」又は「抗原組成物」は、脊椎動物、特に、鳥類又は哺乳動物に投与すると、免疫応答を誘導する調製物を指す。
本明細書で用いるように、年齢層には、若年期、性成熟期、及び高齢期がある。用語「若年(期)」は、哺乳動物が、誕生から性成熟期に達する時期までを指す。用語「性成熟(期)」は、当該種の哺乳動物が、概して、交配及び生殖することができる年齢にある哺乳動物を指す。本明細書で用いるように、用語「高齢(期)」は、性成熟期から死までの哺乳動物を指す。用語「高齢(期)」は、年代学(すなわち、年齢);社会的役割の変化(すなわち、労働形態の変化、子供の成人及び閉経);並びに/又は能力の変化(すなわち、病弱な状態、老化及び肉体的特徴の変化)に関して定義することができる。年代学に関して、ヒトについて述べる場合、用語「高齢(期)」は、一般に、少なくとも約50、55、60又は65歳の年齢に達した人を指す。
本明細書で用いるように、「ウイルス融合タンパク質」又は「融合タンパク質」又は「Fタンパク質」は、任意のウイルス融合タンパク質を指し、限定はしないが、ネイティブウイルス融合タンパク質又は可溶性ウイルス融合タンパク質、例えば、組換えウイルス融合タンパク質、合成により生成したウイルス融合タンパク質、並びに細胞から抽出したウイルス融合タンパク質などが挙げられる。本明細書で用いるように、「ネイティブウイルス融合タンパク質」は、天然起源のウイルス遺伝子又は天然に存在するウイルスRNAによりコードされるウイルス融合タンパク質を指す。用語「可溶性融合タンパク質」又は「可溶性Fタンパク質」は、典型的に、ネイティブタンパク質のC末端領域に位置する機能性膜結合領域が欠失している融合タンパク質を指す。本明細書で用いるように、用語「組換えウイルス融合タンパク質」は、操作されたヌクレオチド配列から得られ、in vitro及び/又はin vivo発現系で生成されるウイルス融合タンパク質を指す。ウイルス融合タンパク質は、様々なウイルス及びウイルス株(限定はしないが、ヒト及び非ヒト系統のウイルス株など)由来の関連タンパク質を含む。ウイルス融合タンパク質は、I型及びII型ウイルス融合タンパク質を含む。多数のRSV−融合タンパク質が記載されており、当業者には周知である。
本明細書で用いるように、用語「免疫原」又は「抗原」は、免疫応答を誘発することができるタンパク質、ペプチド、核酸などの物質を指す。いずれの用語も、エピトープを包含し、置換え可能に用いられる。
本明細書で用いるように、用語「免疫原性製剤」は、脊椎動物、例えば、哺乳動物に投与すると、免疫応答を誘導する調製物を指す。
本明細書で用いるように、「医薬組成物」は、薬学的に許容される担体と、必要に応じて1種又は複数の希釈剤若しくは賦形剤と一緒に、治療に有効な量のRSV−Fタンパク質を含む組成物を指す。本明細書で用いるように、用語「薬学的に許容される」とは、それが、哺乳動物、とりわけヒトへの使用について、連邦若しくは州政府の取締機関により承認されているか、又は米国薬局方、欧州薬局方、若しくは他の一般に認知されている薬局方に記載されていることを意味する。
本明細書で用いるように、用語「薬学的に許容されるワクチン」は、脊椎動物に投与することができ、感染症若しくは疾患を予防及び/若しくは改善する、並びに/又は感染症若しくは疾患の少なくとも1つの症状を軽減するために免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導する形態で、RSV−F免疫原を含有する製剤を指す。一実施形態では、ワクチンは、被検者におけるRSV感染症の少なくとも1つの症状を予防又は軽減する。RSVの症状は、当該技術分野ではよく知られている。その症状として、鼻漏、咽喉痛、頭痛、嗄声、咳、喀痰、熱、ラ音、喘鳴、及び呼吸困難などが挙げられる。従って、一実施形態では、本方法は、RSV感染症に関連する少なくとも1つの症状の予防又は軽減を含み得る。症状の軽減は、例えば、被検者による自己評価、医師の評価又は適切なアッセイ若しくは測定(例えば、体温)、例えば、クォリティオブライフ評価、RSV感染症若しくは別の症状の進行の減速、RSV症状の重症度の軽減、又は好適なアッセイ(例えば、抗体力価及び/又はT細胞活性化アッセイ)により、主観的又は客観的に決定することができる。
本明細書で用いるように、用語「有効な量」は、要望される生物学的効果を実現するために必要な、又は十分な抗原の量を指す。用語「有効な用量」は、一般に、感染症若しくは疾患を予防及び/若しくは改善する、並びに/又は感染症若しくは疾患の少なくとも1つの症状を軽減するために免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導することができる抗原の量を指す。用語「治療に有効な量」は、所与の状態に対する治療効果及び投与レジメンをもたらす量を指す。
本明細書で用いるように、用語「ナイーブ」は、特定の抗原、例えば、RSVに以前暴露されたことがない人又は免疫系を指す。ナイーブな人又は免疫系は、抗原に対する検出可能な抗体又は細胞性応答がない。用語「血清陽性」は、特定の抗原に以前暴露されたことがあり、従って、対象とする抗原に対して検出可能な血清抗体力価を有する哺乳動物又は免疫系を指す。用語「RSV血清陽性」は、RSV抗原に以前暴露されたことがある哺乳動物又は免疫系を指す。血清陽性の人又は免疫系は、特定の抗原への過去の暴露を示す血清中の抗体又は他の免疫マーカの存在により識別することができる。
本明細書で用いるように、フレーズ「防御的免疫応答」又は「防御的応答」は、感染因子又は疾患に対する抗体により媒介される免疫応答を指し、これは、脊椎動物(例えば、ヒト)により呈示され、感染症を予防若しくは改善する、又はその少なくとも1つの症状を軽減する。本明細書に記載されるRSV−Fタンパク質ワクチンは、例えば、感染因子を中和する、感染因子が細胞に進入するのを阻止する、感染因子の複製を阻止する、及び/又は宿主細胞を感染及び破壊から防御する抗体の生産を刺激することができる。この用語はまた、感染因子若しくは疾患に対してTリンパ球及び/又は他の白血球により媒介される免疫応答も指し、これは、脊椎動物(例えば、ヒト)により呈示され、感染症若しくは疾患を予防若しくは改善する、又はその少なくとも1つの症状を軽減する。
本明細書で用いるように、用語「脊椎動物」又は「被検者」又は「患者」は、亜門網(subphylum cordata)の任意のメンバーを指し、これらのメンバーとしては、限定はしないが、ヒト及びそれ以外の霊長類、例えば、チンパンジーなどの非ヒト霊長類及びその他の類人猿及びサル種が挙げられる。畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマなどの家畜;イヌ及びネコなどの家庭飼育哺乳動物;マウス、ラット(コットンラットを含む)及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物;飼育される鳥、野鳥および狩猟鳥を含む鳥類(例えば、ニワトリ、七面鳥並びに他のキジ目の鳥、アヒル、ガチョウなど)も非制限的例である。用語「哺乳動物」及び「動物」は、この定義に含まれる。成体及び新生個体の両方が対象となることが意図される。特に、乳児及び幼児は、RSVワクチンの適切な被検者又は患者である。
本明細書で用いるように、用語「ワクチン」は、死んだ、若しくは弱毒化した病原体、又は病原体から得た抗原決定基の調製物を指し、この調製物は、抗体の形成又は病原体に対する免疫を誘導するために用いられる。さらに、用語「ワクチン」は、例えば、防御的免疫、すなわち感染に関連する疾患を予防するか、又はその重症度を軽減する免疫を生成するために、脊椎動物に投与される免疫原(例えば、RSV−Fタンパク質)の懸濁液若しくは溶液を指すこともある。
2.ウイルス融合糖タンパク質
ウイルス融合糖タンパク質は、ウイルスの感染中に、膜融合誘導により、宿主細胞へのウイルスの侵入を媒介するが、こうしたタンパク質として、シグナルペプチドを含む、又は含まない前駆体(F0)タンパク質、並びにF1及びF2サブユニットなどの活性化及び/又は成熟断片がある。本明細書で用いるように、用語「成熟」及び「活性化」は、宿主プロテアーゼにより前駆体タンパク質から成熟融合タンパク質に変換されたウイルス融合タンパク質を指す。典型的には、活性化ウイルス融合タンパク質は、膜アンカー型及び膜遠位サブユニットを含み、これらは、それぞれF1及びF2と称されている。活性F1及びF2サブユニットは、ジスルフィド結合により互いに連結されていることが多い。
3.ヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)タンパク質
ヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、ニューモウイルス亜科(Pneumovirinae)及びニューモウイルス属(Pneumovirus)のメンバーである。RSVは、2つの亜群A及びBに分けられ、これらは、主に、G遺伝子及びコードされたタンパク質の変異性に基づいて区別される。RSVは、3つの膜貫通構造タンパク質(F、G及びSH)、2つのマトリックスタンパク質(M及びM2)、3つのヌクレオカプシドタンパク質(N、P及びL)、並びに2つの非構造タンパク質(NS1及びNS2)をコードする一本鎖ネガティブセンスRNAゲノムを特徴とする包膜ウイルスである。
RSVの2つの主要な防御抗原は、包膜融合物(F)及び結合(G)糖タンパク質であり、これらは、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の表面上に発現され、中和抗体の標的となることがわかっている。これらの2つのタンパク質はまた、ウイルス認識及び標的細胞への侵入も主に担っている。Gタンパク質は、特定の細胞受容体に結合し、Fタンパク質は、ウイルスと細胞との融合を促進する。Fタンパク質は、感染細胞の表面にも発現され、後に他の細胞との融合を担い、合包体形成を引き起こす。従って、Fタンパク質に対する抗体は、ウイルスを中和するか、又はウイルスの細胞への侵入を阻止するか、あるいは合包体形成を防止することができる。A及びBサブタイプの間の抗原及び構造的違いが、G及びFタンパク質の両方について記載されているが、より有意な抗原の違いはGタンパク質にある。反対に、Fタンパク質に対して産生された抗体は、サブタイプA及びBウイルスの間で高度の交差反応性を示す。ゆえに、Fタンパク質は、ウイルス表面に存在し、従って、免疫監視を利用可能であることから、RSVを中和するための魅力的な標的である。さらに、Fタンパク質は、Gタンパク質と比較して変異性が低い。
Fタンパク質は、N末端切断シグナルペプチドと、C末端付近の膜アンカーとを有するI型膜貫通表面タンパク質である。天然では、RSV−Fタンパク質は、単一の不活性574アミノ酸前駆体(F0と称する)として発現される。in vivoでは、F0は、小胞体においてオリゴマー化し、エンドプロテアーゼによりタンパク質分解性プロセッシングを受けて、2つのジスルフィド結合したサブユニット、F1及びF2を含有する連結ヘテロ二量体を生成する。これらの断片の小さい方が、F2と呼ばれ、F0前駆体のN末端部分に由来する。切断によって形成されるF1サブユニットのN末端は、疎水性ドメイン(融合ペプチド)を含有し、これは、宿主細胞膜と結合して、ウイルス、又は感染細胞の膜と、標的細胞膜との融合を促進する。一実施形態では、Fタンパク質は、F1/F2ヘテロ二量体の三量体又は多量体である。
本明細書に記載する組成物に用いるのに好適なRSV−Fタンパク質は、任意のRSV株又は当該技術分野では公知の分離株由来のものでよく、そのようなものとして、例えば、A2、Long、ATCC VR−26、19、6265、E49、E65、B65、RSB89−6256、RSB89−5857、RSB89−6190、及びRSB89−6614などのヒト株;又はATue51908、375、及びA2Gelfiなどのウシ株;又はヒツジ株が挙げられる。
一実施形態では、本明細書で用いるRSV−Fタンパク質は、本明細書に記載するRSV−Fアミノ酸配列と少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含み得るか、又は本明細書に記載するRSV−Fアミノ酸配列に対して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20のアミノ酸修飾を含み得る。例えば、野生型RSV−Fヒト株A2のアミノ酸配列は、配列番号2に記載される。
ネイティブの完全長ウイルス融合タンパク質は、典型的に、膜結合領域を含む。往々にしてネイティブタンパク質のC末端領域に位置する機能性膜結合領域を欠失した組換え可溶性ウイルス融合タンパク質を作製することができる。組換え可溶性ウイルス融合タンパク質は、ウイルス融合タンパク質の機能性膜結合領域の欠失、突然変異、又は当該技術分野では公知の任意の様式の破壊によって作製することができる。例えば、膜結合領域の任意の部分若しくは全部を除去又は修飾することができる。但し、その場合、膜結合領域が、検出可能なほど機能性ではない(例えば、領域がもはや膜内に常在しない)、及び(ii)一定割合の膜結合領域が、残っている(例えば、約50%以下が残っている)、除去されている(例えば、約50%以上が除去されている)、又は修飾されている(例えば、約50%以上が修飾されている)ことを条件とする。破壊された膜結合領域が、タンパク質と原形質膜の結合をもはやもたらさなくなる程度は、タンパク質の膜結合を評価することが可能な当該技術分野で公知の任意の技術により決定することができる。例えば、ウイルス融合タンパク質と既知膜結合タンパク質の共免疫染色を実施して、膜内に保持されるタンパク質を視覚化することができる。可溶性ウイルス融合タンパク質の例を本明細書に記載するが、これには可溶性RSV−Fタンパク質が含まれる。可溶性RSV−Fタンパク質は、本明細書においてRSV−sFとも呼ばれる。可溶性RSV−Fは、例えば、配列番号2のアミノ酸525〜574に対応するRSV−Fタンパク質の50アミノ酸C末端膜貫通ドメインの少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%の欠失により作製することができる。可溶性RSV−Fのアミノ酸配列は、配列番号7に記載される。
呼吸器合胞体ウイルスのA2株(RSV−F A2)の融合糖タンパク質について、3つの非重複抗原部位(A、B、及びC)並びに1つの架橋部位(AB)が同定されている。(Beeler及びWyke Coelingh,(1989)“Neutralization Epitopes of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus:Effect of Mutation upon Fusion Function,”J.Virol.63(7):2941−2950)。一実施形態では、RSV−Fタンパク質は、1つ又は複数のインタクトなA、B若しくはC中和エピトープを含む。一実施形態では、RSV−Fタンパク質は、少なくともAエピトープを含む。別の実施形態では、RSV−Fタンパク質は、少なくともBエピトープを含む。別の実施形態では、RSV−Fタンパク質は、少なくともCエピトープを含む。他の実施形態では、RSV−Fタンパク質は、少なくともA及びBエピトープ、少なくともB及びCエピトープ、又は少なくともA及びCエピトープを含む。別の実施形態では、RSV−Fタンパク質は、3つ全ての中和エピトープを含む(すなわち、A、B及びC)。
4.RSV−Fの組換え体発現
一実施形態では、ワクチン組成物は、RSV−Fタンパク質を含む。本明細書で用いるように、用語「RSV−Fタンパク質」は、完全長野生型RSV−Fタンパク質、並びに、例えば、RSV可溶性Fタンパク質(RSV−sFとも呼ばれる)などのその変異体及び断片を指す。一実施形態では、ワクチン組成物は、組換えにより生産されたRSV−Fタンパク質を含む。より具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、組換えにより生産される可溶性RSV−Fタンパク質を含む。
組換えによりRSV−Fタンパク質を生産するために、ウイルス融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を、ベクターの複製、ベクターの一部の転写(例えば、ORFの転写)及び/又は細胞でのタンパク質の発現用のベクターに挿入又はクローン化してよい。用語「オープンリーディングフレーム」(ORF)は、ウイルス融合タンパク質、例えば、可溶性ウイルス融合タンパク質をコードする核酸配列を指し、これは、開始コドン(リボ核酸のAUG及びデオキシリボ核酸のATG)と停止コドン(例えば、リボ核酸のUAA(オークル(ochre))、UAG(アンバー(amber))若しくはUGA(オパール(opal))及びデオキシリボ核酸のTAA、TAG若しくはTGA)との間に位置する。
ベクターはまた、ORF又は他の核酸エレメントのクローン化、複製、転写、翻訳及び/又は選択を容易にするエレメントを含んでもよい。従って、ベクターは、以下のエレメントの1つ又は複数又は全部を含んでもよい:1つ又は複数のプロモータエレメント、1つ又は複数の5’非翻訳領域(5’UTR)、標的ヌクレオチド配列(「挿入エレメント」)を挿入することができる1つ又は複数の領域、1つ又は複数のORF、1つ又は複数の3’非翻訳領域(3’UTR)、及び選択エレメント。ORFのようなエレメントをベクター核酸に組み込むために、当業者には周知の任意の好都合なクローン化戦略を用いてよい。
本発明に適用することができる分子生物学的技術、例えば、クローン化、突然変異、細胞培養などを記載する一般的文献としては、以下のものが挙げられる:Berger and Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume 152 Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger);Sambrook et al.,Molecular Cloning−−A Laboratory Manual(第3版),Vol.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,2000(“Sambrook”)並びにCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel et al.編,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates Inc.and John Wiley & Sons,Inc.,(”Ausubel”)。これらの文献は、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモータ、並びに例えば、RSV−Fタンパク質のクローン化及び突然変異に関する他の様々な関連項目を記載している。さらに、可溶性ウイルス融合タンパク質のためのクローン化戦略については、EXPRESSION OF SOLUBLE VIRAL FUSION GLYCOPROTEINS IN MAMMALIAN CELLSと題する国際公開第2012/103496号パンフレットに、より詳しく記載されている。これらの参照文献の開示内容は、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
本明細書に記載する組成物は、RSV−Fの変異体も包含する。変異体は、RSV−Fタンパク質のアミノ酸配列に改変を含んでもよい。タンパク質に関する用語「変異体」は、参照配列に対して、1つ又は複数のアミノ酸により改変されているアミノ酸配列を指す。変異体は、「保存的」変化及び/又は「非保存的」変化を含み得る。また、他の変異は、アミノ酸欠失、挿入、置換、又はその組み合わせも含み得る。生物学的又は免疫学的活性を排除することなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入することができるか、又は欠失させることができるかを決定する上での指針は、当該技術分野において公知のコンピュータプログラム、例えば、DNASTARソフトウエアを用いてみいだすことができる。
一実施形態では、本明細書に記載のウイルス融合タンパク質をコードする核酸は、ヌクレオチド配列全体を通して、1つ又は複数のコドン内の1つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、修飾することができる。本明細書で用いるように、「ヌクレオチド塩基」は、4つのデオキシリボ核酸塩基、すなわちアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、及びチミン(T)のいずれか、又は4つのリボ核酸塩基、すなわちアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、及びウラシル(U)のいずれかを指す。本明細書で用いるように、「コドン」は、特定のアミノ酸をコードする、1組の3つのヌクレオチド塩基を指す。一般に、各アミノ酸は、1つ又は複数のコドンによってコードされ得る。表1は、各アミノ酸について考えられる実質的に全てのコドン候補を示す。
Figure 2016516755
一実施形態では、RSV−Fをコードする核酸は、1つ又は複数の置換を含んでよい。得られるタンパク質のアミノ酸を非保存的又は保存的に変更するように、置換を実施することができる。保存的変更は、一般に、得られるタンパク質の構造及び機能にあまり変化をもたらさない。非保存的変更は、得られるタンパク質の構造、活性又は機能を改変する傾向が大きい。一実施形態では、RSV−Fをコードする核酸は、得られるタンパク質の活性又は結合特性を大きく改変しない1つ又は複数の保存的アミノ酸置換を含む。
本明細書で用いるように、用語「保存的置換」は、1つ又は複数のアミノ酸残基が、構造は異なるが、化学的特性は類似した残基で置換される置換を指し、例えば、疎水性残基を疎水性残基で置換する場合、又は酸性残基を別の酸性残基で、又は極性残基を極性残基で、又は塩基性残基を塩基性残基で置換する場合などがある。非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。芳香環構造を含むアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンである。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正荷電(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負荷電(酸性)アミノ酸としては、アスパルギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。保存的置換のより具体的な例として、限定はしないが、正電荷が維持されるように、Argの代わりにLys及びその逆;負電荷が維持されるように、Aspの代わりにGlu及びその逆;遊離−OHが維持され得るように、Thrの代わりにSer;並びに、遊離NH2が維持され得るように、Asnの代わりにGluを用いるものが挙げられる。一実施形態では、RSV−F免疫原は、1つ又は複数の保存的若しくは非保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態では、RSV−F免疫原は、1つ又は複数の保存的アミノ酸置換を含む。
本明細書で用いるように、用語「同一の」は、お互いに比較して、実質的に同じヌクレオチド配列を有する2つ以上のヌクレオチド配列を指す。2つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が実質的に同一であるかどうかを決定するための一試験は、共通して有する同一のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の割合(%)を決定するものである。
配列同一性の計算は以下のようにして実施することができる。最適な比較の目的で配列をアラインメントする(例えば、最適アラインメントのために第1及び第2アミノ酸又は核酸配列の一方若しくは両方にギャップを導入することができ、また、比較の目的で非相同性配列は無視することができる)。比較の目的でアラインメントした参照配列の長さは、場合によっては参照配列の長さの30%以上、40%以上、50%以上、往々にして60%以上、さらに一般的には70%以上、80%以上、90%以上、又は100%である。次に、それぞれ対応するヌクレオチド又はポリペプチド位置のヌクレオチド又はアミノ酸を、2つのアラインメントした配列同士で比較する。第1配列のある位置が、第2配列の対応する位置と同じヌクレオチド又はアミノ酸で占められている場合、ヌクレオチド又はアミノ酸は、その位置で同一であるとみなされる。2つの配列同士の同一性の割合(%)は、2つの配列の最適アラインメントのために導入したギャップの数、各ギャップの長さを計算に入れて、両配列が共通に有する同一の位置の関数である。
配列の比較及び2つの配列同士の同一性(%)の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つのアミノ酸又はヌクレオチド配列同士の同一性(%)は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれているMeyers&Miller,CABIOS4:11−17(1989)のアルゴリズムを用いて決定することができ、その際、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12及びギャップペナルティ4を用いる。また、2つのアミノ酸配列同士の同一性(%)は、GCGソフトウエアパッケージ(httpアドレス:www.gcg.comから入手可能)中のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:444−453(1970)アルゴリズムを用いて決定することができ、その際、Blossum 62行列又はPAM250行列のいずれかを用いる。多くの場合、Blossum 62スコア行列と一緒に用いられるパラメータのセットは、ギャップオープンペナルティ12、ギャップ延長ペナルティ4、及びフレームシフトギャップペナルティ5を含む。2つのヌクレオチド配列同士の同一性(%)は、GCGソフトウエアパッケージ(httpアドレス:www.gcg.comから入手可能)のGAPプログラムを用いて決定することができ、その際、NWS gapdna.CMP行列並びにギャップ重量60及び長さ重量4を用いる。
2つのヌクレオチド核酸が、実質的に同一であるかどうかを決定するための別の方法は、1つの核酸と相補的なポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で他方の核酸とハイブリダイズするかどうかを評価するものである。本明細書で用いるように、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を指す。ストリンジェントな条件は、当業者には周知であり、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.,6.3.1−6.3.6(1989)にみいだすことができる。水性及び非水性方法が上記の参照文献に記載されており、いずれを用いてもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、約45℃にて6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション後、50℃にて0.2×SSC、0.1%SDS中で1回又は複数回洗浄するものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、約45℃にて6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション後、55℃にて0.2×SSC、0.1%SDS中で1回又は複数回洗浄するものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらに別の例は、約45℃にて6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション後、60℃にて0.2×SSC、0.1%SDS中で1回又は複数回洗浄するものである。多くの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約45℃にて6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーション後、65℃にて0.2×SSC、0.1%SDS中で1回又は複数回洗浄するものである。より一般的には、ストリンジェンシー条件は、65℃にて0.5Mリン酸ナトリウム、7%SDSの後、65℃にて0.2×SSC、1%SDSで1回又は複数回洗浄するものである。
これまで、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合活性の研究は、組換え体の低い発現レベルのために妨げられてきた。特に、標準的発現ベクターからの組換えFタンパク質発現レベルは、RSV複製中に認められるFタンパク質発現のレベルと比較して低い傾向がある(Huang et al.(2010),“Recombinant respiratory syncytial virus F protein expression is hindered by inefficient nuclear export and mRNA processing,”Virus Genes,40:212−221)。この差は、ウイルス及び組換えFタンパク質発現の間の違いによるものと考えられる。一般に、ウイルス及び組換えFタンパク質発現の間には2つの大きな違いがある。第1に、ウイルス複製中のF遺伝子の転写は、細胞質中で起こるのに対し、標準的哺乳動物発現ベクターからの組換えFタンパク質発現の場合、転写は核内で起こる。核から細胞質へのウイルス転写物の輸出は、核内で正常に複製するウイルスにとっても問題となり得る。ウイルス転写物の場合、阻害は、哺乳動物転写物より比較的高いAU存在量の生成物であると考えられる。従って、一実施形態では、転写を増強するために、Fタンパク質遺伝子配列中のGC存在量を修飾することができる(Huang et al.(2010),“Recombinant respiratory syncytial virus F protein expression is hindered by inefficient nuclear export and mRNA processing,”Virus Genes,40:212−221)。
本明細書に記載するヌクレオチド配列は、コードされたウイルス融合タンパク質のアミノ酸配列が、非修飾ヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列と類似するように、1つ又は複数のコドン内の1つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより修飾することができる。一実施形態では、RSV−融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号2に示すRSV−F配列又は配列番号7に示す可溶性RSV−F配列などの非修飾野生型RSV−F配列によりコードされたタンパク質と、少なくとも約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一である。ある実施形態では、修飾ヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列は、配列番号2に示すRSV−Fの非修飾野生型ヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列又は配列番号7に示す可溶性RSV−Fのアミノ酸配列と100%同一である。
表1に示すように、アミノ酸のサブセット及び停止(STOP)コドンは、少なくとも2つのコドン候補(codon possibilities)によりコードされ得る。例えば、グルタミン酸塩は、GAA又はGAGによりコードされ得る。グルタミン酸塩のためのコドンが、核酸配列内にGAAとして存在する場合、AからGまでの第3位置でのヌクレオチド塩基の変更により、やはりグルタミン酸塩をコードする修飾コドンが得られる。従って、コドン内の1つ又は複数のヌクレオチド塩基での特定の変更によって、やはり同じアミノ酸のコード化を達成することができる。このプロセスは、場合によっては、本明細書においてコドン最適化と呼ぶ。本明細書には、1つ又は複数のコドン内で1つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより修飾されたRSV−Fのヌクレオチド配列(配列番号8及び9に示す)の例を記載し、ここで、得られるRSV−Fアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列(配列番号2に示す)によりコードされたアミノ酸配列と同一である。本明細書にはまた、例えば、1つ又は複数のコドン内で1つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより修飾された可溶性RSV−Fのヌクレオチド配列(配列番号4、5及び6に示す)も記載され、ここで、sRSV−Fアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列(配列番号7に示す)によりコードされたアミノ酸配列と同一である。
一実施形態では、RSV−Fタンパク質(例えば、可溶性RSV−Fなど)をコードするヌクレオチド配列は、1つ又は複数のコドン内で1つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾することができる:a)コードされたウイルス融合タンパク質のアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列と類似しているか、又は同一であり;並びにb)グアニンとシトシンの合計割合(%GC)は、非修飾ヌクレオチド配列と比較して修飾ヌクレオチド配列において増加している。例えば、修飾核酸配列中の%GCは、少なくとも約45%、46%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%であり得る。表1に示すように、第1、第2及び/又は第3コドン位置での核酸塩基の変更は、アミノ酸及び/又は停止コドン割当を保存しながらA又はTがG又はCに変更されるように実施することができる。
本明細書には、1つ又は複数のコドン内で1つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾されたRSV−Fのヌクレオチド配列(配列番号9に示す)の一例を記載する:RSV−Fアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列(配列番号2に示す)によりコードされたアミノ酸配列と同一であり、しかも、グアニンとシトシンの合計割合(%GC)が、非修飾ヌクレオチド配列(35%GC;配列番号1に示す)と比較して修飾ヌクレオチド配列(58%GC)において増加する。さらに、本明細書には、例えば、1つ又は複数のコドン内で1つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾された可溶性RSV−Fのヌクレオチド配列(例えば、配列番号4、5及び6に記載される)も記載する:sRSV−Fアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列(配列番号7に記載される)によりコードされたアミノ酸配列と同一であり、しかも、グアニンとシトシンの合計割合(%GC)が、非修飾ヌクレオチド配列(35%GC;配列番号3に記載)と比較して修飾ヌクレオチド配列(配列番号4は46%GC;配列番号6は51%GC;配列番号5は58%GC)において増加する。
本明細書に記載するヌクレオチド配列は、1つ又は複数のコドン内の1つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾することができる:a)コードされたウイルス融合タンパク質のアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列と類似しているか、又は同一であり;b)グアニンとシトシンの合計割合(%GC)は、非修飾ヌクレオチド配列と比較して修飾ヌクレオチド配列において増加し;並びにc)第3ヌクレオチドコドン位置でのグアニンとシトシンの合計割合(%GC3)は、非修飾ヌクレオチド配列と比較して修飾ヌクレオチド配列において増加している。一実施形態では、%GC3は、少なくとも約55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%であり得る。表1に示すように、考えられるほとんどのヌクレオチド塩基変更の候補は、第3ヌクレオチドコドン位置に存在する。ある実施形態では、停止コドンを含む全てのコドンは、第3ヌクレオチドコドン位置にG又はCのいずれかをすでに有するか、又はアミノ酸割当を変更することなく、第3ヌクレオチドコドン位置にG又はCを有するように修飾することができる。従って、いずれか任意のヌクレオチド配列について、ヌクレオチド配列全体で、各第3ヌクレオチドコドン位置(GC3)に最大100%のG又はCを含有させることが可能である。本明細書には、1つ又は複数のコドン内で1つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾されたRSV−Fのヌクレオチド配列(配列番号9に示す)の一例を記載する:RSV−Fアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列(配列番号2に示す)によりコードされたアミノ酸配列と同一であり、しかも、第3ヌクレオチドコドン位置におけるグアニンとシトシンの合計割合が、非修飾ヌクレオチド配列(31%GC3;配列番号1に示す)と比較して修飾ヌクレオチド配列(100%GC3)において増加する。また、本明細書には、一実施形態において、1つ又は複数のコドン内で1つ又は複数のヌクレオチド塩基を変更することにより、以下のように修飾されたsRSV−Fのヌクレオチド配列(例えば、配列番号4、5及び6に示す)も記載する:sRSV−Fアミノ酸配列は、非修飾ヌクレオチド配列(配列番号7に記載される)によりコードされたアミノ酸配列と同一であり、しかも、第3ヌクレオチドコドン位置におけるグアニンとシトシンの合計割合は、非修飾ヌクレオチド配列(31%GC3;配列番号3に記載)と比較して修飾ヌクレオチド配列(配列番号4は58%GC3;配列番号6は76%GC3;配列番号5は100%GC3)において増加する。
一実施形態において、RSF−Fタンパク質(ある実施形態では、可溶性RSV−Fなど)は、少なくとも約45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%のGC含有率を有すると共に、配列番号2若しくは配列番号7と少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、98%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を有するRSV−Fタンパク質(例えば、可溶性RSV−Fなど)をコードする単離核酸配列を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号8、若しくは配列番号9と60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、98%、98%、99%、又は100%同一である。一実施形態では、可溶性ウイルス融合タンパク質は、機能性膜結合領域が欠失している。より具体的な実施形態では、可溶性ウイルス融合タンパク質は、配列番号2のアミノ酸525〜574に対応するC末端膜貫通領域アミノ酸が欠失している。
さらに、特定の実施形態において、(i)少なくとも約51%のGC含有率を有し、(ii)配列番号1と少なくとも約73%同一であり、しかも(iii)配列番号2と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列を含むウイルス融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を記載する。
一実施形態において、RSV−Fタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1と少なくとも約60% 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、98%、98%、又は99%同一である。
組換えウイルス融合タンパク質は、化学修飾、又は翻訳後修飾などにより、さらに修飾することができる。このような修飾として、限定はしないが、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、リン酸化、及び当該技術分野では公知の他のポリペプチド修飾が挙げられる。本明細書に記載するウイルス融合タンパク質は、一次アミノ酸配列の修飾、1つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加、又は置換によってさらに修飾することができる。
一実施形態において、ウイルス融合タンパク質は、翻訳後グリコシル化により修飾する。組換えウイルス融合タンパク質は、完全にグリコシル化、一部グリコシル化、脱グリコシル化、又は非グリコシル化することができる。ある実施形態では、組換えウイルス融合タンパク質(例えば、RSV−F融合タンパク質)は、対応するネイティブタンパク質のグリコシル化プロフィールと類似した、実質的に同一の、又は同一のグリコシル化プロフィールを有し得る(例えば、Rixon et al.,2002 J.Gen.Virol.83:61−66)。組換えウイルス融合糖タンパク質は、当該技術分野では公知の多重グリコシド結合のいずれを含んでもよい。
本明細書に記載するワクチン組成物で用いるのに好適なRSV−Fタンパク質は、当該技術分野では公知の構築物及び技術を用いて、発現させ、精製することができる。RSV−Fなどのウイルス融合タンパク質を生産及び精製するシステム及び方法は公知であり、EXPRESSION OF SOLUBLE VIRAL FUSION GLYCOPROTEINS IN MAMMALIAN CELLSと題する国際公開第2012/103496号パンフレットにさらに詳しく記載されている。尚、上記文献の開示内容は、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
5.ワクチン製剤
本願の背景技術の項ですでに述べたように、RSVワクチンの開発は困難である。インフルエンザなどの他のウイルスに対するワクチンの開発には成功しているが、現在まで、RSVに関してはいずれも開発に成功していない。ワクチンの観点から、呼吸器ウイルスは、次の2つの主な群に分けることができる:感染によって長期免疫が起こり、その生存の継続には絶えず突然変異が必要な群と、感染によって不完全な免疫が誘導され、突然変異はほとんど又は全くなくても、一般に感染が繰り返される群。インフルエンザウイルス及び呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、それぞれ前者及び後者の群の典型である。(U.E.Power,2008“Respiratory syncytial virus(RSV)vaccines−Two steps back for one leap forward,”J.Clin.Virol.41:38−44を参照のこと)。従って、インフルエンザウイルスに対してはワクチンの開発に成功しているが、RSVの場合には、数十年にわたる研究及びいくつかのワクチンアプローチにもかかわらず、成功していない。
RSV感染症から防御するのに必要なRSV抗体と細胞性免疫の均衡は、よくわかっておらず、様々な年齢層で変動し得る。例えば、高齢者の場合、細胞性応答は、若年青年と比較して、誘導するのが難しく、Th2バイアスであり、しかも急速に減少する(Kumar R and Burns EA(2008)Age−related decline in immunity:implications for vaccine responsiveness.Expert Rev Vaccines 7:467−479)。RSV特異的T細胞応答は、特に年齢と共に低下する(Cusi MG,et al.(2010)Age related changes in T cell mediated immune response and effector memory to Respiratory Syncytial Virus(RSV)in healthy subjects.Immun Ageing 7:14)。高齢の個体は、RSV中和力価が9〜13log2の血清陽性であるにもかかわらず、やはり重篤なRSV感染症に罹患し得る(Walsh EE,et al.(2004)Risk factors for severe respiratory syncytial virus infection in elderly persons.J Infect Dis 189:233−238)。高齢者は、これは若年青年には認められないT細胞のRSV応答性障害を有し(Cusi MG,et al.(2010)Age related changes in T cell mediated immune response and effector memory to Respiratory Syncytial Virus(RSV)in healthy subjects.Immun Ageing7:14)、若年青年と同様の中和抗体力価を有するにもかかわらず(Falsey AR,et al.(1999)Comparison of respiratory syncytial virus humoral immunity and response to infection in young and elderly adults.J Med Virol 59:221−226)、感染後、RSV感染症に罹患しやすい。これらの観察結果は、中和抗体及び低減するRSV特異的細胞性免疫を促進するために、高齢者に有効なRSVワクチンが必要であることを示唆している。
前述したように、高齢者は、その免疫応答にTh2バイアスを有する傾向がある。哺乳動物の細胞性免疫応答は、Tヘルパー1(Th1)細胞性免疫応答と、Tヘルパー2(Th2)細胞性免疫応答を含む。Th1及びTh2応答は、各応答で合成されたサイトカインプロフィールに基づき識別することができる。1型T細胞は、ウイルスの細胞性免疫応答に関与するサイトカインであるインターフェロンγ(IFN−γ)を産生する。そのため、IFN−γは、「Th1型サイトカイン」と呼ぶことができる。Th2細胞は、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン5(IL−5)及びインターロイキン13(IL−13)を選択的に生産し、これらは、体液性免疫の発生に参加すると共に、即時過敏症に重要な役割を有する。IL−4、IL−5及びIL−13は、「Th2型サイトカイン」とも呼ぶことができる。Th1応答は、応答して産生された抗体サブタイプによっても識別することができる。げっ歯類モデルでは、Th1バイアス応答は、IgG1抗体力価より高いIgG2a又はIgG2b抗体力価を有する(IgG2a又はIgG2bは、Th1サブタイプであり;IgG1は、Th2サブタイプである)。(極めて重要なことには、ヒトの場合、その逆である;ヒトIgG1がTh1サブタイプであり、ヒトIgG2がTh2サブタイプであり、Th1バイアス応答は、IgG2抗体力価より高いIgG1抗体力価を特徴とする)。げっ歯類及びヒトの両方で、Th1応答はまた、増大したCD8T細胞応答も特徴とする。Th1/Th2サイトカイン免疫応答における不均衡、特に動物の細胞性免疫応答におけるTh2バイアスは、RSVの病原性及びとりわけ肺における感染症の重症度に影響を与え得る。さらに、Th2バイアス一次免疫応答は、RSV増進疾患(RSV enhanced disease)と相関している(Hurwitz JL(2011)Respiratory syncytial virus vaccine development.Expert Rev Vaccines 10:1415−1433)。
過去にRSVに暴露されたことがあるために、生弱毒化RSVウイルスワクチンは、高齢者集団において免疫原性が不十分となり得る。既存のRSV免疫が、ウイルスワクチンの複製を阻害し、その結果、生RSVワクチンがRSV免疫を促進する能力を制限することになる。従って、高齢者におけるRSV関連疾患を予防することができるワクチンは、この対象集団において満たされていない医療ニーズに対処するものである。
一実施形態では、ワクチン組成物が提供される。特に、ワクチン組成物は、本明細書に記載するRSV−Fタンパク質を含む。一実施形態では、ワクチン組成物は、本明細書に記載のように、組換えにより発現したRSV−Fタンパク質を含む。一実施形態では、ワクチン組成物は、本明細書に記載のように、RSV可溶性Fタンパク質を含む。一実施形態では、RSV可溶性Fタンパク質は、C末端膜貫通ドメインを欠失している。より具体的な実施形態では、RSV可溶性Fタンパク質は、細胞質尾部ドメインを欠失している。
より具体的な実施形態において、ワクチン組成物は、アジュバントと組み合わせてRSV可溶性Fタンパク質を含む。多くの場合、精製されたタンパク質抗原は、固有の免疫原性を欠失しているため、免疫原性ワクチン製剤は、免疫応答の非特異的刺激物質(アジュバントとして知られる)を含むことが多い。一部のアジュバントは、抗原が提示される方式に影響を与える。例えば、ある例では、タンパク質抗原をミョウバンにより沈降させると、免疫応答が増大する。他の例では、抗原の乳化によって、抗原提示の持続時間を長く持続することができる。免疫プロトコルでは、多年にわたって、応答を刺激するためにアジュバントが用いられているため、アジュバントは、当業者には周知である。アジュバントは、本明細書に全体が参照により組み込まれる、Vogel et al.,“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients(第2版)”に、より詳しく記載されている。
公知のアジュバントの例は、完全フロイントアジュバント(死滅させた結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を含有する免疫応答の非特異的刺激物質)、不完全フロイントアジュバント及び水酸化アルミニウムアジュバントを含む。他の公知のアジュバントとしては、以下のものが挙げられる:顆粒菌・マクロファージコロニー刺激因子(GMCSP)、カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette−Guerin)(BCG)、水酸化アルミニウム、thur−MDP及びnor−MDPなどのムラミルジペプチド(MDP)化合物、ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン(MTP−PE)、RIBIのアジュバント(Ribi ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton MT)(2%スクアレン/Tween 80エマルジョン中に細菌から抽出された3つの成分、トレハロースジミコール酸(TDM)及び細胞壁骨格(CWS)を含有する)。MF−59、Novasomes(登録商標)、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)抗原は、他の公知のアジュバントである。
ワクチン用のアジュバントとしてミョウバンがよく用いられるが、これは、体液性免疫を促進することで知られているが、有効な細胞性免疫の誘導についてはわかっていない(Langley JM et al.(2009)A dose−ranging study of a subunit Respiratory Syncytial Virus subtype A vaccine with and without aluminum phosphate adjuvantation in adults>or=65years of age.Vaccine 27:5913−5919;Falsey AR,et al.(2008)Comparison of the safety and immunogenicity of 2 respiratory syncytial virus(rsv)vaccines−−nonadjuvanted vaccine or vaccine adjuvanted with alum−−given concomitantly with influenza vaccine to high−risk elderly individuals.J Infect Dis 198:1317−1326;並びにKool M,et al.(2012)Alum adjuvant:some of the tricks of the oldest adjuvant.J Med Microbiol 61:927−934)。Toll様受容体(TLR)9アゴニストを組み込んだ新規のアジュバント化合物は、マウスモデルにおいてRSVワクチンに対するTh1バイアス免疫細胞性応答を向上させることが判明している(Hancock GE,et al.(2001)CpG containing oligodeoxynucleotides are potent adjuvants for parenteral vaccination with the fusion(F)protein of respiratory syncytial virus(RSV).Vaccine 19:4874−4882;並びにGarlapati S,et al.(2012)Enhanced immune responses and protection by vaccination with respiratory syncytial virus fusion protein formulated with CpG oligodeoxynucleotide and innate defense regulator peptide in polyphosphazene microparticles.Vaccine)。モノホスホリルリピドA(MPL)/QS−21組み合わせ又はプロトリン(Protollin)などのTLR4ベースのアジュバント、髄膜菌外膜タンパク質と複合体化したLPSの製剤も、マウスにおいてRSVワクチンに対し細胞性IFNγ生産を誘導することができている(Neuzil KM,et al.(1997)Adjuvants influence the quantitative and qualitative immune response in BALB/c mice immunized with respiratory syncytial virus FG subunit vaccine.Vaccine 15:525−532;Cyr SL,et al.(2007)Intranasal proteosome−based respiratory syncytial virus(RSV)vaccines Protect BALB/c mice against challenge without eosinophilia or enhanced pathology.Vaccine 25:5378−5389)。
腸内細菌リポ多糖(LPS)は、免疫系の強力な刺激物質である。しかし、アジュバントでのその使用は、その毒性によって制限されてきた。還元末端グルコサミンからコア炭水化物基及びリン酸塩を除去することにより生成される、LPSの非毒性誘導体であるモノホスホリルリピドA(MPL)が、二糖骨格の3位からアシル鎖を除去することにより生成されるMPLの別の解毒形態(3−O−脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D−MPL)と呼ばれる)と一緒に生産されている。TLR4複合体のヒトMD2分子との結合のために最適化された別の合成Toll様受容体(TLR)4アゴニストは、合成ヘキシル化リピドA誘導体であり、グルコピラノシル脂質アジュバント(GLA)と呼ばれる(Avanti Polar Lipids,Inc.Alabaster,Alaから市販されている)。GLAは、げっ歯類及び霊長類モデル系の両方で、強力なTh1バイアスアジュバントであることが立証されている(Coler RN,et al.(2010)A synthetic adjuvant to enhance and expand immune responses to influenza vaccines.PLoS One 5:e13677;並びにLumsden JM,et al.(2011)Evaluation of the safety and immunogenicity in rhesus monkeys of a recombinant malaria vaccine for Plasmodium vivax with a synthetic Toll−like receptor 4 agonist formulated in an emulsion.Infect Immun 79:3492−3500)。
GLAは、“Vaccine Composition Containing Synthetic Adjuvant"と題する米国特許出願公開第2011/0070290号明細書に詳しく記載されている。尚、この文献は、その全部を参照により本明細書に組み込むものとする。米国特許出願公開第2011/0070290号明細書に記載されているように、GLAは、(i)非還元末端グルコサミンのヘキソサミン1位と還元末端グルコサミンのヘキソサミン6位との間のエーテル結合により非還元末端グルコサミンに結合された還元末端グルコサミンを有するジグルコサミン骨格;(ii)非還元末端グルコサミンのヘキソサミン4位に結合したO−ホスホリル基;及び(iii)最大6つの脂肪アシル鎖を含み、ここで、脂肪アシル鎖の1つは、還元末端グルコサミンの3−ヒドロキシルとエステル結合により結合しており、また、脂肪アシル鎖の1つは、非還元末端グルコサミンの2−アミノとアミド結合により結合しており、かつ12超の炭素原子のアルカノイル鎖とエステル結合により結合したテトラデカノイル鎖を含み、さらに、脂肪アシル鎖の1つは、非還元末端グルコサミンの3−ヒドロキシルとエステル結合により結合しており、しかも12超の炭素原子のアルカノイル鎖とエステル結合により結合したテトラデカノイル鎖を含む。GLAは、下記式:
Figure 2016516755
(式中、R1、R3、R5及びR6は、C11〜C20アルキルであり;R2及びR4は、C12〜C20アルキルである)
を有する。ある実施形態では、GLAは、安定した水中油形エマルジョン(SE)として製剤化され、これは、本明細書においてGLA−SEと呼ぶ。
一実施形態では、ワクチン組成物は、Toll様受容体(TLR)アゴニストであるアジュバントを含む。一実施形態では、ワクチン組成物は、(TLR)4アゴニストであるアジュバントを含む。TLR4シグナル伝達により誘導されるサイトカイン(例えば、IL−6及びIFNγなど)は、B細胞増殖因子として作用し、Fc受容体及び補体との相互作用について最適化された抗体へのクラススイッチを支持する(Finkelman FD,et al.(1988)IFN−gamma regulates the isotypes of IgG secreted during in vivo humoral immune responses.J Immunol 140:1022−1027;並びにNimmerjahn F and Ravetch JV(2007)Fc−receptors as regulators of immunity.Adv Immunol 96:179−204)。これらのサイトカインは、さらに、プロフェショナル抗原提示細胞を動員し、MHC I分子及び抗原プロセシングタンパク質上方制御を誘導することにより、T細胞のより良好な活性化を可能にする(Ramanathan S,et al.(2008)Antigen−nonspecific activation of CDR8+ T lymphocytes by cytokines:relevance to immunity,autoimmunity,and cancer.Arch Immunol Ther Exp(Warsz)56:311−323)。TLR4シグナル伝達により誘導されたI型IFNは、タンパク質抗原の交差提示を増大することができ(Durand V,et al.(2009)Role of lipopolysaccharide in the induction of type I interferon−dependent cross−priming and IL−10 production in mice by meningococcal outer membrane vesicles.Vaccine 27:1912−1922)、これにより、関連するオボアルブミンタンパク質に対する強力なCD8T細胞応答の誘導を可能にする(Lasarte JJ,et al.(2007)The extra domain A from fibronectin targets antigens to TLR4−expressing cells and induces cytotoxic T cell responses in vivo.J Immunol 178:748−756;MacLeod MK,et al.(2011)。より具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、グルコピラノシルリピドA(GLA)を含有するアジュバントを含む。一実施形態では、ワクチン組成物は、微粒子エマルジョンとして製剤化される。一実施形態では、ワクチン組成物は、安定した水中油形エマルジョン中のGLA(GLA−SE)を含有するアジュバントを含む。別の実施形態では、ワクチン組成物は、安定化スクアレンベースエマルジョン中のGLAを含有するアジュバントを含む。
RSVワクチン組成物の投与量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時間、及び他の臨床要因に応じて変動し得るが、これは、当業者が決定することができる。一実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも約50μl、75μl、又は100μl、及び最大約200μl、250μl、500μl、750μl又は1000μlの量を有する安定した水性懸濁液として製剤化する。
一実施形態では、少なくとも約1μg、5μg、10μg、20μg、30μg又は50μg、及び最大75μg、80μg、100μg、150μg又は200μgの本明細書に記載のRSV可溶性Fタンパク質が、ワクチン組成物に含まれる。一実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも約0.01μg/μl、0.05μg/μl、0.1μg/μl、及び最大約0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl、0.5μg/μl又は1.0μg/μlの濃度でRSV−F免疫原を含有する。
一実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも約0.1μg、0.5μg、1.5μg、2μg、2.5μg及び最大3μg、4μg、5μg、10μg又は20μgのアジュバントを含有する。一実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも約1ng/μl、2ng/μl、3ng/μl、4ng/μl又は5ng/μl及び最大約0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl又は0.5μg/μlの濃後でアジュバントを含有する。
より具体的な実施形態では、アジュバントは、少なくとも約1%、2%又は3%及び最大約4%又は5%のGLA濃度を有する安定化水中油形エマルジョン中のGLAを含む。一実施形態では、アジュバントは、安定化水中油形エマルジョン(SE)中のGLAを含み、ここで、GLAは、少なくとも約25nm、50nm、75nm又は100nm及び最大約100nm、125nm、150nm、175nm又は200nmの平均粒径を有する。
より具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、約100μl〜約500μlの最終量で、2%〜5%のSE中の約1μg〜10μgのGLAと組み合わせて、約1μg〜100μgのRSV−sF糖タンパク質を含む。より具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、約250μl〜約500μlの最終量で、2%〜5%のSE中の約1μg〜約5μgのGLAと組み合わせて、約10μg〜約100μgのRSV−sF糖タンパク質を含む液体製剤である。さらに別の実施形態では、ワクチン組成物は、筋内注射用に製剤化され、約500μlの最終量で、2%又は5%のSE中の約1μg、2.5μg若しくは5μgのGLAと組み合わせて、約10μg、30μg若しくは約100μgのRSV−sF糖タンパク質を含む。
投与の量及び頻度は、宿主の応答に応じて変動し得る。一実施形態では、ワクチン組成物は、単回用量として投与する。別の実施形態では、ワクチン組成物は、2回用量レジメンで投与する。別の実施形態では、ワクチン組成物は、例えば、ワクチン組成物の初回投与に続いて、ブースタ投与を実施する投薬スケジュールで投与する。一実施形態では、ワクチン組成物は、2回用量レジメンで投与するが、ここで、2回目の用量を、初回投与から少なくとも約1、約2、約3、若しくは約4週間後、又は初回投与から少なくとも約1、約2、約3、約4、約5若しくは約6か月後、又は初回投与から少なくとも約1年後に投与する。別の実施形態では、ワクチン組成物は、2回目の用量を、初回投与から少なくとも約1、約2、約3、若しくは約4週間後、又は初回投与から少なくとも約1、約2、約3、約4、約5若しくは約6か月後、又は初回投与から少なくとも約1年後に投与し、3回目の用量を、2回目の用量後、例えば、2回目の用量から少なくとも約1、約2、約3、約4、約5、約6か月後、又は約1年後に投与する、投薬スケジュールで投与する。
別の実施形態では、ワクチン組成物は、免疫原が懸濁又は溶解している薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容される担体は公知であり、限定はしないが、注射用水、食塩液、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等張水性バッファー、及びこれらの組み合わせが挙げられる。皮下注射などの非経口投与の場合、担体としては、水、食塩水、アルコール、脂肪、ロウ、バッファー又はこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容される担体、希釈剤、及び他の賦形剤全般については、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.N.J.current edition)に記載されており、その開示内容は、参照により全体を本明細書に組み込むものとする。製剤は、投与方法に適合させるべきである。好ましい実施形態では、製剤は、ヒトへの投与に好適であり、好ましくは、滅菌の非微粒子状及び/又は発熱性物質非含有である。
他の実施形態では、ワクチン組成物は、1種又は複数の希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、及び/又はアジュバントを含んでよい。例えば、ワクチン化合物は、ワクチン効果を向上させるために、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤を含んでよい。組成物は、再構成に好適な凍結乾燥粉末のような固形、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、徐放剤、又は粉末であってよい。経口製剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含んでよい。
また、ワクチン組成物に、送達ビヒクルなどの他の成分を含有させることが望ましい場合もあり、そのようなものとして、限定はしないが、アルミニウム塩、油中水形エマルジョン、生分解性油ビヒクル、水中油形エマルジョン、生分解性マイクロカプセル、及びリポソームが挙げられる。他の実施形態では、ワクチン組成物は、ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸又は硫酸水素ナトリウム;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩若しくはリン酸塩などのバッファー、並びに塩化ナトリウム若しくはデキストロースなどの張性の調節剤を含有してよい。
ワクチン組成物の投与は、全身又は局所であってよい。ワクチン組成物を投与する方法として、限定はしないが、非経口投与(例えば、皮内、筋内、静脈内及び皮下)、硬膜外、及び粘膜(例えば、鼻内及び口腔内若しくは肺経路又は座薬によるもの)が挙げられる。具体的な実施形態において、本明細書に記載の組成物は、筋内、静脈内、皮下、経皮又は皮内投与する。組成物は、任意の常用の経路、例えば、注入若しくはボーラス注射、上皮若しくは皮膚粘膜内層(例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽頭、中咽頭、膣、子宮、膀胱及び腸粘膜など)により投与してよく、他の生物活性剤と一緒に投与してもよい。ある実施形態では、組成物の鼻内又は他の粘膜投与経路によって、他の投与経路より実質的に高い抗体又は他の免疫応答を誘導することができる。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物の鼻内若しくは他の粘膜経路によって、免疫部位での抗体又は他の免疫応答を誘導することができる。
6.キット及び製造品
一実施形態では、本明細書に記載のワクチン製剤の1つ又は複数の材料を充填した1つ又は複数の容器を含む医薬品パック又はキット。ワクチン組成物は、組成物の量を示すアンプル又はサシェットなどの密閉容器中に包装することができる。一実施形態では、組成物は、液体として供給する。別の実施形態では、組成物は、密閉容器中の乾燥した滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給し、ここで、被検者への投与に適切な濃度を得るために、例えば、水若しくは塩水で組成物を再構成することができる。
ワクチン組成物を、例えば、皮下又は筋内注射により全身投与する場合、針と注射器、又は無針注射器を用いることができる。ワクチン製剤は、ガラス若しくはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多用量バイアル中に導入することができる。
7.免疫応答を刺激する方法
RSV感染に応答して、RSV−融合(F)及び結合(G)外皮糖タンパク質をターゲティングする中和抗体が産生される(Hurwitz JL(2011),“Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development,”Expert Rev Vaccines,10:1415−1433)。F糖タンパク質は、RSV A及びRSV Bウイルス株の両方で高度に保存されており、ウイルスと細胞膜の融合に不可欠であり、ウイルスの侵入及び複製に不可欠であることから、F指向性中和応答が特に望ましい(Maher CF,et al.(2004)。低いRSV中和抗体力価は、より重症のRSV感染症の高い危険性と相関する(Lee FE,et al.(2004)Experimental infection of humans with A2 respiratory syncytial virus.Antiviral Res 63:191−196)。RSV中和抗体が、RSV免疫において重要な役割を果たし、受身移入の際、ナイーブなヒト及びげっ歯類に防御をもたらすが、RSVに対する細胞性応答も疾患防御に一定の役割を果たすと考えられる(Krilov LR(2002)Palivizumab in the prevention of respiratory syncytial virus disease.Expert Opin Biol Ther 2:763−769及びGraham BS,et al.(1993)Immunoprophylaxis and immunotherapy of respiratory syncytial virus−infected mice with respiratory syncytial virus−specific immune serum.Pediatr Res 34:167−172)。F糖タンパク質は、複数のマウス及びヒトCD8及びCD4T細胞エピトープを含有する(Olson MR and Varga SM(2008)Pulmonary immunity and immunopathology:lessons from respiratory syncytial virus.Expert Rev Vaccines 7:1239−1255)。血清陽性成人にRSV特異的CD8T細胞応答が検出されており(Cusi MG,et al.(2010)Age related changes in T cell mediated immune response and effector memory to Respiratory Syncytial Virus(RSV)in healthy subjects.Immun Ageing 7:14)、これは、動物モデルにおいて、ウイルス感染細胞を排除し、RSV感染を消散する上で重要な役割を果たす(Bangham CR,et al.(1985)Cytotoxic T−cell response to respiratory syncytial virus in mice.J Virol 56:55−59;Srikiatkhachorn A and Braciale TJ(1997)Virus−specific CDR8+T lymphocytes downregulate T helper cell type 2 cytokine secretion and pulmonary eosinophilia during experimental murine respiratory syncytial virus infection.J Exp Med 186:421−432;Hussell T,et al.(1997)CD8+T cells control Th2−driven pathology during pulmonary respiratory syncytial virus infection.Eur J Immunol 27:3341−3349;及びMunoz JL,et al.(1991)Respiratory syncytial virus infection in C57BL/6 mice:clearance of virus from the lungs with virus−specific cytotoxic T cells.J Virol 65:4494−4497)。RSV特異的CD4T細胞応答は、B細胞抗体産生及びCD8応答の両方を促進し、Th1型CD4応答は、Th2型応答より有効にCD8応答を促進する(Hurwitz JL(2011),“Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development,”Expert Rev Vaccines,10:1415−1433)。
一実施形態では、免疫学的に有効な量の免疫原性RSV−Fタンパク質含有組成物を被検者(ヒト又は動物被検者など)に投与する方法が提供される。一実施形態では、免疫原性RSV−Fタンパク質と少なくとも1種のアジュバントを含有するワクチン組成物を哺乳動物に投与する方法が提供される。一実施形態では、RSV−Fは、可溶性RSV−F(RSV−sFとも称される)を含む。一実施形態では、アジュバントは、GLAである。より具体的な実施形態では、アジュバントは、GLA−SEである。一実施形態では、RSVに対する免疫応答を誘発する方法が提供される。一実施形態では、免疫応答は、体液性である。別の実施形態では、免疫応答は、細胞性である。一実施形態では、本方法は、RSV感染又は少なくとも1つのその症状に対する防御免疫応答を誘導する。さらに別の実施形態では、前記疾患を有する患者、又は前記疾患と接触する危険性がある患者に、治療、又は予防に有効な量のワクチン組成物を投与することにより、疾患を予防又は治療する方法が提供される。一実施形態では、上記疾患は、呼吸系の疾患、例えば、ウイルス、とりわけRSVに起因する疾患である。
一実施形態では、ワクチン組成物は、宿主において少なくとも1種の免疫応答を誘発することができる。一実施形態では、免疫応答は、以下:TH1型Tリンパ球応答、TH2型Tリンパ球応答、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答、抗体応答、サイトカイン応答、リンホカイン応答、ケモカイン応答、及び炎症性応答から選択される。一実施形態では、ワクチン組成物は、宿主において、以下から選択される少なくとも1つの免疫応答を誘発することができる:(a)インターフェロンγ(IFN−γ)、腫瘍壊死因子α(TNF−α)から選択される1種又は複数のサイトカインの産生、(b)IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10、IL−12、IL−13、IL−16、IL−18及びIL−23から選択される1種又は複数のインターロイキンの産生、(c)MIP−1α、MIP−1β、RANTES、CCL4及びCCL5から選択される1種又は複数のケモカインの産生、並びに(d)記憶T細胞応答、記憶B細胞応答、エフェクターT細胞応答、細胞傷害性T細胞応答及びエフェクターB細胞応答から選択されるリンパ球応答。
一実施形態では、ワクチン組成物は、IL−5/IL−4などのTh2バイアスサイトカインと比較して、IFNγ(Th1バイアス)などのTh1型サイトカインの産生を優先的に含む免疫応答をもたらすことができる。一実施形態では、ワクチン組成物の投与によって、過去にRSVに暴露されたことがある哺乳動物においてTh1バイアス細胞性免疫応答が増強される。一実施形態では、Th1/Th2細胞性免疫応答の比は、少なくとも約1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、又は2:1である。一実施形態では、Th1型Fタンパク質特異的CD4又はCD8応答を誘導若しくは増強する方法が提供される。一実施形態では、本明細書に記載するアジュバント添加ワクチン組成物の投与により、約49〜約150Fタンパク質特異的CD4T細胞スポット形成単位(SFU)/106総生存細胞、又は非アジュバント添加ワクチン組成物と比較して約5〜10倍の増大が誘導される。別の実施形態では、本明細書に記載のアジュバント添加ワクチン組成物の投与により、約1069〜約3172Fタンパク質特異的CD8T細胞SFU/106総生存細胞、又は非アジュバント添加組成物と比較して約10〜20倍の増大が誘導される。別の実施形態では、T細胞応答を生み出す細胞性IFNγ(すなわち、Th1型サイトカイン)を誘導する方法が提供される。一実施形態では、アジュバント添加ワクチン組成物の投与により、非アジュバント添加組成物と比較して、IFNγ産生T細胞の少なくとも45倍の増大がもたらされる。
一実施形態では、哺乳動物におけるRSVに対する中和抗体を誘導する方法が提供される。一実施形態では、RSV中和抗体力価は、以下:6Log2、6.5Log2、7.0Log2、7.5Log2、8.0Log2、8.5Log2、9.0Log2、9.5Log2、10.0Log2、10.5Log2、11.0Log2、11.5Log2、12.0Log2、12.5Log2、13.0Log2、13.5Log2、14.0Log2、14.5Log2、及び15.0Log2から選択される力価より高い。一実施形態では、ワクチン組成物の投与後のRSV中和抗体力価は、投与前の血清IgG力価と比較して約10倍〜約200倍高いか、又は少なくとも約10、25、50、75、100倍高く、最大100、150若しくは200倍高い血清IgG力価を含む。一実施形態では、ワクチン組成物の投与後のRSV中和抗体力価は、投与前の血清IgG力価と比較して少なくとも約10倍、及び最大200倍高い血清IgG力価を含む。
一実施形態では、ワクチン組成物の投与は、RSVを中和することができる粘膜性(IgA)及び全身性抗体(IgG、IgG1、IgG2a、及びIgG2b)応答を誘導する。IgG1/IgG2a比は、IgG2a>IgG1であることから、Th1バイアス抗体応答を示した。
一実施形態では、ワクチン組成物の投与により、RSVウイルス力価の低下がもたらされる。一実施形態では、RSVウイルス力価は、約50〜約1000倍、又は少なくとも約50、100、250、500倍、最大約500若しくは1000倍低下する。一実施形態では、RSVウイルス力価は、ワクチン組成物の投与後、2log10pfu/グラムを下回る。
実施例1a及び1b:ナイーブBALB/cマウス及びコットンラット
BALB/cマウス及びコットンラットは、RSV感染の特徴がはっきりした2種のげっ歯類モデルである。この実施例では、これらの2つのモデルを用いて、筋内(IM)投与RSVワクチン候補の免疫原性を評価したが、これは、TLR4アゴニストグルコピラノシルリピドA(GLA)、安定エマルジョン(SE)、グルコピラノシルリピドA安定エマルジョン(GLA−SE)、又はミョウバンアジュバントを用いて製剤化した精製可溶性F(sF)タンパク質を含有した。膜貫通及び細胞質尾部ドメインを欠失した精製sFタンパク質(Huang K,et al.(2010)Recombinant respiratory syncytial virus F protein expression is hindered by inefficient nuclear export and mRNA processing.Virus Genes 40:212−221)をGLA、SE、又はGLA−SEと共に製剤化し、ミョウバンを用いて、又はアジュバントを添加しないまま製剤化したsFとワクチン性能を比較した。結果から、筋内投与したアジュバント添加RSV sFワクチン製剤の各々が、RSV中和力価を誘導し、ウイルス複製に対して防御免疫を付与したが、sF+GLA−SEワクチンだけが、BALB/c及びコットンラットモデルの両方で、IFNγ産生T細胞応答をプライミングしたことが明らかになった。BALB/cマウスにおいて、これらのT細胞応答は、主としてCD8+であり、肺に到達することができ、Th1バイアスサイトカイン応答と相関した。GLA−SEアジュバントを含むRSV sFは、ウイルス感染後にTh2関連肺疾患を回避しながら、非アジュバント添加RSV sFに対して、重要な免疫学的及び防御読み出し情報を改善し、これらの研究において最良のワクチン製剤であることが判明した。
マウスモデルでは、全てのRSV sFワクチン製剤により、RSV攻撃からの完全な防御、頑健な血清RSV中和応答、及び抗FIgG応答が誘導された。アジュバントGLA−SEを用いて製剤化した場合、RSV sFタンパク質ワクチンは、F特異的Th1バイアス体液性及び細胞性応答を誘導した。マウスの場合、F特異的CD4且つCD8T細胞応答が認められた。RSV攻撃後、F特異的多官能性CD8T細胞はマウスの肺に到達し、そこで、Th2媒介性免疫続発症を起こすことなく、ウイルスのクリアランスが達成された。コットンラットの場合、sF+GLA−SEは、頑健な中和抗体、F特異的IFNγT細胞応答、及び十分な防御を誘導し、肺組織病理学のエビデンスはなかった。
本明細書でのデータから、RSV sF及びGLA−SEを含有するタンパク質サブユニットワクチンが、RSVに対する頑健な体液性及び細胞性応答を誘導することができ、Th1免疫媒介性機構によるウイルスクリアランスを増強することが明らかになった。頑健な中和抗体及びT細胞応答を誘導するアジュバント添加RSVワクチンは、RSV感染症の危険性を有する集団に利益をもたらし得ると考えられる。
ワクチン成分
RSV A2F配列のアミノ酸1〜524を含有し、膜貫通ドメインを欠失したRSV可溶性F(sF)タンパク質(Huang K,et al.(2010)Recombinant respiratory syncytial virus F protein expression is hindered by inefficient nuclear export and mRNA processing.Virus Genes 40:212−221)を、安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞の上清からのRSV−F特異的mAb、パリビズマブ(MedImmune,Inc.)と共に免疫−アフィニティ精製した。SDS−PAGE及びウェスタンブロット分析から、アフィニティ精製したRSV sFタンパク質は、>95%純粋であり、約50kD(F1)及び約20kD(F2)バンドの両方として還元条件下で泳動することがわかった(図9A及びB)。クライオイメージング(cryoimaging)の結果から、sFタンパク質が、三量体及びより大きな多量体のいずれもを形成することがわかり、ELISA結合試験により、該タンパク質が、インタクトな部位A、B及びC中和エピトープを含有することを確認した(データは示していない)。RSV sFをBradfordアッセイにより定量し、これをELISAアッセイにおける免疫及び塗布の両方で使用した。
この試験に使用したアジュバントは、Alhydrogel(Accurate Chemical and Scientific,NJ)として取得したミョウバン(水酸化アルミニウム)を含有した。ミョウバンは、ワクチン用量当たり100μgで使用し、22℃で30分の混合によりタンパク質に吸着させた。GLA、SE、及びGLA−SEは、Immune Design Corporation(Seattle,WA)から取得したが、これについては以前記載されている(Anderson RC,et al.(2010)Physicochemical characterization and biological activity of synthetic TLR4 agonist formulations.Colloids Surf B Biointerfaces 75:123−132)。水性製剤においてGLAをワクチン用量当たり5μg使用した。SEは、平均粒度が約100nmの安定化スクアレンベースのエマルジョンであり、これを2%濃度で用いた。別途注記する場合を除いて、GLA−SEは、2%SE中5μgのGLAの用量で使用した。接種から24時間以内に全ワクチン製剤を調製した。
免疫及び攻撃にRSV A2株(ATCC)を用いた。EMEMで成長させたVero細胞においてウイルスを増殖させた。ウイルス上清を遠心分離することにより、細胞残屑を除去し、1×SP(0.2Mスクロース、0.0038M KH2PO4、及び0.0072M KH2PO4)で安定化し、使用まで、−80℃にてアリコート中で急冷した。Tang RS,et al.(2004)Parainfluenza virus type 3 expressing the native or soluble fusion(F)Protein of Respiratory Syncytial Virus(RSV)confers protection from RSV infection in African green monkeys.J Virol 78:11198−11207に記載されているように、Vero細胞単層上でのプラークアッセイによりウイルス力価を決定した。
ワクチン接種及び攻撃
7〜10週齢の雌BALB/cマウス(Charles River Laboratories,Hollister,CA)及び6〜8週齢の雌コットンラット(Harlan Laboratories,Indianapolis,IN)を病原体のない条件下で収容した。マウス群に麻酔をかけ、100μlの量のプラセボ(PBS)又はRSV sF−/+アジュバントで、2週間あけて2回筋内免疫した。別段記載しない限り、RSV sFは、0.3μgの用量で投与したが、これは、力価測定試験から、アジュバントの非存在下で準最適防御をもたらす量として決定された。各アジュバントの最も有効な用量を予備試験から選択した(データは示していない)。正の対照を106PFUのRSV−A2を用いて第0日(D0)に1回鼻内感染させた。ワクチンは全て、投与時に良好な耐容性を示し、どの群にも注射部位反応はなかった。免疫から14日及び28日後に、眼窩後採血から血清を採取し、全血から分離して、評価するまで−20℃で保存した。試験の第28日に、100μlの量中106PFUの生RSV A2ウイルスをマウスに鼻内接種した。最終免疫から14日後、又は攻撃から4日後に、脾臓をT細胞アッセイのために採取した。プラークアッセイにより個々の肺ホモジネートにおける攻撃から4日後にウイルス力価を定量した。各マウスからの個々の肺葉を保存し、PBS+4%パラホルムアルデヒドで最大1週間膨潤させた後、脱水して、組織病理学試験のためにパラフィンで包埋した。初回プライミングから3週間後にマウスを追加免疫し、ブースタワクチンから3週間後に攻撃した以外は、コットンラット試験も同様に設計した。
プラーク力価測定による肺RSVの定量
安楽死させたマウス及びコットンラットから切除した新鮮な肺を計量して、使い捨てヘッド付きのOMNI組織ホモジナイザー(Omni International,Kennesaw,GA)を用い、1×SPバッファーを添加したOptiMEM(Invitrogen)中で均質化した。遠心分離によりホモジネートを清澄化した。Tang RS,et al.(2004)Parainfluenza virus type 3 expressing the native or soluble fusion(F)Protein of Respiratory Syncytial Virus(RSV)confers protection from RSV infection in African green monkeys.J Virol 78:11198−11207に記載されているように、Vero細胞単層上でのプラークアッセイによりウイルス力価を決定した。手短には、新しく調製した肺ホモジネートの連続希釈物を6ウェルプレート中のVero細胞に添加して、1時間感染させた後、1%メチルセルロース/EMEMで覆ってから、5〜7日間インキュベートすることにより、プラークを形成させた。被覆を除去し、細胞をメタノール固定した後、ヤギ抗−RSV(Millipore,Billerica,MA)、次いでHRP−ウサギ抗−ヤギ抗体及びAEC(Dako,Glostrup,Denmark)で染色することにより、プラークを視覚化した。
血清IgG、IgG1、IgG2a及びIgA ELISA
標準的ELISA技術を用いて、RSV−F特異的IgG抗体を評価した。高度結合96ウェルプレートに精製RSV sFを塗布した。ブロック後、血清の連続希釈物をプレートに添加した。HRP結合ヤギ抗−マウスIgG、IgG1、又はIgG2a(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)を用いて結合抗体を検出した後、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンで展開した(TMB,Sigma,St.Louis,MO)。HRP結合ヤギ抗−マウスIgA抗体(Invitrogen,Grand Island,NY)を用いて、RSV−F特異的IgA抗体を検出した。ELAST ELISA増幅キット(Perkin Elmer,Waltham,MA)を用いて、シグナルを増幅した後、TMBで検出した。SpectraMaxプレートリーダにより450nmで吸光度を測定した後、SoftMax Pro(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いて分析した。ブランクウェルの3x平均値のカットオフを用いて、log2終点力価として力価を報告した。
RSVミクロ中和アッセイ
表示の時点で熱不活性化したマウス血清中のRSV中和抗体力価を、以前記載されているようにGFP標識RSV A2マイクロ中和アッセイを用いて測定した(Bernstein DI,et al.(2012)Phase 1 study of the safety and immunogenicity of a live,attenuated respiratory syncytial virus and parainfluenza virus type 3 vaccine in seronegative children.Pediatr Infect Dis J 31:109−114)。手短には、密集Vero細胞単層を500PFUのウイルス単独、又は連続希釈した血清サンプルと事前に混合したウイルスに感染させた後、33℃及び5%CO2で22時間インキュベートした。プレートを洗浄して遊離ウイルスを除去してから、IsoCyteイメージスキャナー(Blueshift,Sunnyvale,CA)を用いてGFP蛍光ウイルスフォーカスを計数した。中和力価は、4−パラメータ曲線当てはめアルゴリズムを用いて計算されるように、蛍光フォーカスの数の50%減少(EC50力価)をもたらした細胞希釈率のlog2逆数として表した。
細胞単離
表示の採取時点で、100ミクロンナイロンフィルタ(Falcon)を通して、個々の脾臓を破砕した。使用の前に、赤血球欠失脾細胞の生存能をViCellにより決定してから、5%FCS、ペニシリン−ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン及び0.1%β−メルカプトエタノール(cRPMI−5)を添加したRPMI1640中に、10×106生存細胞/mLで細胞を懸濁させた。
表示の採取時点で、肺白血球を酵素分散肺組織から単離した。肺を切除し、PBSで洗浄し、細かく刻んでから、RMPI5%FCS、1mg/mLコラゲナーゼ(Roche Applied Science)及び30μg/mL DNase(Sigma,St Louis MO)中で45分インキュベートした後、100ミクロンナイロンフィルタ(Falcon)を通して破砕した。細胞を洗浄し、cRPMI−5中に再懸濁させてから、全生存細胞数をViCellにより決定した。
サイトカインプロファイリング
サイトカイン再刺激アッセイのために、脾細胞を96ウェルプレート中で、培地単独(cRPMI−5)、又はRSV−F由来MHC II(I−Ed)−結合ペプチドGWYTSVITIELSNIKE(配列番号10)とVSVLTSKVLDLKNYI(配列番号11)のペア(Olson MR,Varga SM(2008)Pulmonary immunity and immunopathology:lessons from respiratory syncytial virus.Expert Rev Vaccines 7:1239−1255)(各5μg/mL)と一緒に72時間インキュベートした。遠心分離により上清を清澄化し、評価するまで−80℃で保存した。
IFNγ、IL−5、IL−13、IL−17及びエオタキシンを含有するように設計されたマウスサイトカイン/ケモカイン多重キット(Millipore,Billerica,MA)を用いて、再刺激脾細胞上清及び新鮮な肺ホモジネートを評価した。肺ホモジネートは、使用前に遠心分離により清澄化した。アッセイを製造者の指示に従って実施し、プレートをLuminexリーダ(Bio−Rad,Hercules,CA)で分析した。Fで刺激した値から培地単独での値を差し引くことにより、F特異的脾臓サイトカイン生産を決定した。
ELISPOTアッセイ
マウスELISPOTアッセイのために、Mabtech(Cincinnati,OH)マウスIFNγELISPOTキットを使用した。事前に塗布したマイクロプレートをcRPMI−5でブロックしてから、細胞及び刺激物質を添加した。ブロックした塗布済みプレート上で250,000細胞/ウェルを培地のみ、MHC II(I−Ed)結合ペプチドGWYTSVITIELSNIKE(配列番号10)及びVSVLTSKVLDLKNYI(配列番号11)(Olson MR,Varga SM(2008)Pulmonary immunity and immunopathology:lessons from respiratory syncytial virus.Expert Rev Vaccines 7:1239−1255)(各5μg/mL)、MHC I(H2−Kd)結合ペプチド、KYKNAVTEL(配列番号12)(Olson MR(2008)、又は正の対照としてConA(5μg/mL)と一緒に、3回反復して36〜48時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗い流し、キットのプロトコルに従い、プレートを付属のビオチン化抗マウスIFNγと一緒にインキュベートしてから、SA−HRPを実施し、付属のTMB試薬を用いて、スポットを検出した。CTL ImmunoSpotリーダ及びソフトウエア(Cellular Technology Ltd)を用いて、プレートの読み出し及び分析を行った。
R&D DuoSet ELISA Systemで得られたコットンラットIFNγ(#DY565)又はIL−4(#DY584)について対合した抗体を、コットンラット細胞性免疫応答の評価のためのELISPOTアッセイフォーマットで使用した。PBS中10μg/mLでキット付属の捕捉抗体(それぞれ抗IFNγ又は抗IL−4)で、96ウェルPVDFプレート(Millipore,Billerica,MA)を一晩コーティングした。プレートをcRPMI−5で2時間ブロックした。次に、cRPMI−5中のブロックした塗布済みプレート上で、RSV sF(2μg/mL)、又は正の対照としてConA(5μg/mL)と一緒に、3回反復して36〜48時間細胞をインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗い流し、プレートを付属のビオチン化検出抗体(PBS中1μg/mL+1%BSA)、続いてストレプトアビジン−HRP(Mabtech,Cincinnati,OH)及び3−アミノ−9−エチルカルバゾール(AEC,Vector Labs,Burlingame,CA)と一緒にインキュベートした。CTL ImmunoSpotリーダ及びソフトウエア(Cellular Technology Ltd)を用いて、プレートの読み出し及び分析を行った。
フローサイトメトリー分析
赤血球除去脾細胞及び肺白血球を1.106細胞/ウェルで96ウェルマイクロプレート中に、培地単独、MHC I(H2−Kd)結合FペプチドKYKNAVTEL(配列番号12)(10μg/mL)、MHC I(H2−Kd)結合M2ペプチドSYIGSINNI(配列番号13)(10μg/mL)、又は正の対照としてConAと一緒に塗布した。細胞は、5%CO2中37℃で5〜6時間インキュベートし、サイトカインの分泌を阻止するため刺激物中にBrefeldin Aを1時間添加した。生存能について細胞をLIVE/DEADバイオレット、続いてCD3−PerCP−Cy5.5、CD8−PE−Cy7、及びCD19−APC−Cy7で染色した。2%パラホルムアルデヒドを用いた固定化及びCellPerm(BD Bioscience)を用いた透過処理の後、細胞をIFNγ−APC、IL−2FITC、及びTNFα−PEで染色した。LSR2(BD Bioscience)で細胞分析し、10,000CD8+イベントを収集した。
肺組織病理学
RSV攻撃から4日後に採取したパラフィン包埋ホルマリン固定肺葉から、ミクロトームを用いて、肺切片(5ミクロン)を調製した。ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片をデジタルスキャニングし、有資格病理学者による検査を実施した。肺切片を気管支過形成、肺胞炎、好酸球浸潤及び気管支周囲/血管周囲腔の浸潤の存在などの肺病変特徴について評価した。
統計
Prism GraphPadソフトウエアを用いて、データを分析した。示すデータは2回以上の実験を代表するものである。データは全て、算術平均±平均値の標準誤差(SEM)として表す。統計的有意性は、一元配置分散分析(One way ANOVA)と、これに続くp<0.05のカットオフを用いたテューキーポストテスト(Tukey post test)により計算した。
結果
1.Th1バイアス防御免疫を誘導するGLA−SEアジュバント添加RSV sFを用いると、アジュバント添加RSV sFサブユニットワクチンは、BALB/cマウスに防御免疫を付与する
アジュバントなしで投与するか、又はミョウバン、GLA、SE、若しくはGLA−SEのアジュバントを添加して投与する、2つの用量のRSV sFサブユニットで、BALB/cマウスのコホートを筋内免疫した。RSV A2ウイルスで攻撃した後、肺ウイルス力価を定量した。全てのワクチンが、肺ウイルス力価3.8log10pfu/グラムを示したPBS対照と比較して、有意な肺ウイルス力価の低減を達成した(図1A)。PBSの負の対照群と比較して100倍の低減を完全な防御とみなした。非アジュバント添加RSV sFによる免疫は、4/7匹が、2.3〜3.0log10pfu/グラムの検出可能な肺ウイルス力価を有し、マウスに部分的肺防御をもたらしたのに対し、アジュバント添加RSV sFワクチンは、完全な肺防御を達成し、平均ウイルス力価は、1.8 log10pfu/グラムを下回り、RSV A2免疫群で観測されたものと一致していた。
攻撃前の血清RSV中和力価は、全てのRSV sFアジュバント添加ワクチンで有意に増強された。GLA−SE、ミョウバン及びSEのアジュバント添加RSV sFワクチンは、第28日に、それぞれ7.7log2、8.1log2及び8.1log2の最も高いRSV中和力価を達成した(図1B)。この力価は、非アジュバント添加RSV sF(4.1log2)により達成された力価の16倍大きかった。対照的に、GLAアジュバント添加RSV sFは、相当の値ではあるが、これより有意に低い6.3log2中和力価を達成した。非アジュバント添加RSV sFと、生RSV A2ウイルスによる鼻内感染のいずれも、検出可能な血清中和力価(それぞれ、4.1log2及び4.6log2)を誘導したが、これらの応答は、PBSの負の対照群で認められた検出限界を有意に超えるものではなかった。血清F特異的IgG及びF特異的IgA全体についてのELISA力価は、同様の傾向を示した(図10)。
攻撃から4日後に採取した再刺激脾細胞からの上清(群当たりn=3)を評価して、各ワクチン製剤により誘導されたF特異的CD4+T細胞のサイトカイン産生プロフィールを決定した。MHC II(I−Ed)結合RSV−F由来ペプチドを用いた再刺激(Olson MR及びVarga SM(2008)Pulmonary immunity and immunopathology:lessons from respiratory syncytial virus.Expert Rev Vaccines 7:1239−1255)後に、IFNγをプロトタイプのTh1型サイトカインとして、IL−5及びIL−13を代表的Th2型サイトカインとして、またIL−17をTh17型サイトカインとして評価した。予測したように、PBS対照動物からの再刺激脾細胞は、F特異的サイトカイン産生を示さないが、鼻内RSV感染マウスからのものは、弱いIFNγ優勢の応答を示した(図1C)。RSV sF+GLA−SEワクチン群は、IFNγが優勢の強いRSV−F特異的応答を誘導し、これは、Th1型応答を示している。対照的に、RSV sF+GLA群は、Th1、Th2、及びTh17サイトカインを含む均衡したF特異的応答を示したが、RSV sF、RSV sF+SE、及びRSV sF+ミョウバン群は、IL−5及びIL−13サイトカインを特徴とするTh2型応答を示した。
IFNγは、マウスにおいてIgG1からIgG2aへの抗体のクラススイッチを促進する(Xu W及びZhang JJ(2005)Stat1−dependent synergistic activation of T−bet for IgG2a production during early stage of B cell activation.J Immunol 175:7419−7424)ことから、各動物からのF特異的抗体のアイソタイプも評価した。次の2群:RSV sF+GLA−SEワクチン接種群と、RSV A2による感染でプライミングした群だけがF特異的IgG2a>IgG1力価を示し(図1D)、両群とも、MHC II由来Fペプチドに対するIFNγ優勢の応答を有した。RSV sF+GLA−SEは、RSV sF単独又はRSV sF+ミョウバンより有意に多いF特異的IgG2a抗体を誘導した。
RSV sF+GLA−SEに認められたようなワクチンに対するTh1型応答は、強いCD8T細胞応答の発生を支持し得る。従って、第32日で、各ワクチン群からの代表的動物において、免疫優性MHC I(H2−Kd)結合F由来ペプチドを用いた再刺激(Olson MR,Varga SM(2008)Pulmonary immunity and immunopathology:lessons from respiratory syncytial virus.Expert Rev Vaccines 7:1239−1255)により、ワクチン接種に対するCD8T細胞応答を評価した。PBS対照群中のF特異的CD8IFNγELISPOT計数は、ほぼ検出限界未満であったのに対し、非アジュバント添加RSV sF群での計数は、百万個の細胞当たり約30スポット形成単位(SFU)であった(図1E)。対照的に、F特異的CD8IFNγELISPOT応答は、RSV sFと比較してRSV sF+GLA−SEワクチン群において有意に高かった(平均:684、非アジュバント添加RSV sFに対して23倍の増加)。F特異的CD8IFNγ応答は、他のアジュバント添加RSV sFワクチン製剤の方がやや高かったが、これは、非アジュバント添加RSV sFと比較して有意ではなかった。生RSV感染によって、わずか100SFUの弱いF特異的CD8IFNγELISPOT応答が発生したが、これは、BALB/cマウスにおけるRSV A2に対する免疫優性応答は、M2由来ペプチドに対するものであるため、予想外ではなかった(Olson MR及びVarga SM(2008)Pulmonary immunity and immunopathology:lessons from respiratory syncytial virus.Expert Rev Vaccines 7:1239−1255)。これらの応答細胞の細胞溶解能力を評価するために、ELISPOTによりF特異的グランザイムB分泌を評価した。sF+GLA−SEワクチンを受けたマウスからの脾細胞だけがF特異的グランザイムB応答を有し(平均197)、sF単独で投与したマウスに観測されたもの(平均18)より有意に高かった(図1F)。IFNγ、TNFα(エフェクターサイトカイン)及びIL−2(増殖に関連するサイトカイン)を共発現する多機能性T細胞が、ウイルスクリアランスで最も有効であり、その次に、IFNγ及びTNFαを共発現するT細胞が有効であることが報告されている(Seder RA,et al.(2008)T−cell quality in memory and protection:implications for vaccine design.Nat Rev Immunol 8:247−258)ことから、細胞内サイトカイン染色によりF特異的CD8T細胞をさらに評価した。RSV sF+GLA−SEワクチン群は、三重陽性及びIFNγTNFα二重陽性細胞の両方について最大数を有した(図11)。
これらの結果から、以下のことがわかる:RSV sFは、単独で免疫原性であるが、アジュバントと共にRSV sFを製剤化すると、より高い力価の中和抗体をネイティブ動物で誘導し、また、GLA−SEと共にRSV sFを製剤化すると、Th1バイアス免疫を生み出し、これは、ウイルスクリアランスの改善に寄与し得る強力なF特異的CD8T細胞応答をプライミングする。
2.GLA−SEアジュバント添加RSV sFワクチンでプライミングしたCD8T細胞応答は頑健である
RSV sF+GLA−SEによる初回/追加ワクチン接種に続く攻撃後に観察されたCD8T細胞応答は、様々な抗原及びアジュバント用量で頑健であった。定用量のGLA−SE(5μg/2%)と一緒に投与した0.3、7.5、又は37.5μgのRSV sFを受けた動物は全て、RSV攻撃から4日後に実施したELISPOTにより検出されるように、PBS対照と比較して強力なF特異的CD8T細胞応答を生み出した(図2A)。投与したRSV sFの用量が高い動物ほど、高いスポット絶対数が認められた。様々な用量(2%SE中5μg、2.5μg、1μg、又は0.5μg)でGLA−SEと一緒に投与した0.3μgのRSV sFを受けた動物はさらに、攻撃から4日後に、PBS対照群又はアジュバント単独対照群のいずれと比較しても、F特異的CD8T細胞の有意に増加した数も示した(図2B)。2%SE中1〜2.5μgのGLAのアジュバント用量が、最適な脾臓T細胞応答を得るのに十分であった。
3.GLA−SEアジュバント添加RSV sFワクチンは、ウイルス暴露なしでF特異的CD4及びCD8T細胞応答を誘導する
RSV sF+GLA−SEワクチンでプライミングした攻撃後F特異的T細胞は、防御をもたらす全てのRSVsF用量で容易に検出された。しかし、0.3μg以下のRSVsFでワクチン接種したコホートにおいては、RSV攻撃前に有意な数のF特異的T細胞を検出するのは難しかった(データは示していない)。RSV攻撃の非存在及び存在下でのT細胞誘導を評価するために、第0日及び第14日に、GLA−SE(2%SE中2.5μg若しくは1μg)でアジュバント添加した10μgのRSV sFでマウスにワクチン接種し、1コホートは、2回目のワクチン用量から14日後に評価し、別のコホートは、生RSV攻撃から4日後に評価した。追加免疫から14日後に、PBS又は非アジュバント添加sF群のいずれと比較しても、両sF+GLA−SE群においてF特異的CD4及びCD8T細胞数は有意に増大した(CD4応答は、平均49〜150SFU/106で、CD8応答は、1069〜3172SFU/106)(図3A〜B)。また、両sF+GLA−SE群におけるF特異的CD8T細胞応答は、sF+SE群において観測されたものより有意に高かった。RSV攻撃後、F特異的CD4及びCD8T細胞数は、PBS群と比較して、両sF+GLA−SE群において有意に高かった(図3C〜D)。さらに、両sF+GLA−SE群におけるF特異的CD8T細胞数も、非アジュバント添加sF群において観測されたものより有意に高かった。興味深いことに、F特異的脾臓CD8の絶対数は、攻撃前コホートと比較して攻撃後コホートにおいて低いことがわかったが、これは、恐らくこれらの細胞のウイルス攻撃の部位への再配置を示している。全体として、これらのデータは、GLA−SEでアジュバント添加したRSV sFタンパク質による免疫が、生RSVへのいずれの暴露の前にも存在する全身性F特異的CD4及びCD8T細胞応答を誘発することを示している。
4.GLA−SEアジュバント添加RSV sFワクチンを用いたワクチン接種により誘導されるCD8T細胞応答は、RSV攻撃後に肺に動員される
GLA−SEアジュバント添加RSV sFを用いた筋内ワクチン接種により産生された全身性F特異的CD8T細胞を、RSV攻撃後に、肺に到達するその能力について評価した。アジュバント添加RSV sF(0.3μg)でワクチン接種してから、RSV A2で攻撃したマウスは、攻撃から4日、7日又は12日後、フローサイトメトリー分析のために肺リンパ球(群及び時点当たりn=3)を採取した。RSV sF+GLA−SEでワクチン接種したマウスは、攻撃から4日後までに、肺に3.39%F特異的CD8T細胞を有し、PBS免疫マウスの肺で観測された0.48%F特異的CD8T細胞とは有意な差を示した(図4A)。これらのF特異的CD8T細胞は、主にIFNγ、TNFα、及びIL−2について三重陽性(平均1.75%)であるか、又はIFNγ及びTNFαについて二重陽性(平均1.5%)であった。比較すると、sF+ミョウバンワクチン群は、この時点で、肺にいずれかの機能の1.0%F特異的CD8しかなかった。攻撃から7日後までに、RSV sF+GLA−SEでワクチン接種したマウスは、肺に7.28%F特異的CD8T細胞を有し、PBS免疫マウスの肺で観測された0.44%F特異的CD8T細胞、sF+ミョウバン免疫マウスに観測された0.87%、又は生RSV免疫マウスに観測された0.76%とは有意な差を示した(図4A)。攻撃から12日後のこれらの群における肺局在化F特異的CD8T細胞の差は、同様に有意であったが、この時点までに、主要なT細胞集団は、IFNγ及びTNFαの二重陽性であり、IL−2産生を喪失していた。IL−2を欠失したT細胞は、増殖性が低下するため、これらの細胞は、収縮期の最初の段階の1つを表していると考えられる。これらのデータは、PBS免疫マウス、RSV sF+ミョウバン免疫マウス、あるいは生RSV免疫マウスのいずれと比較しても、RSV sF+GLA−SE群において、RSV攻撃後に肺への多機能性F特異的T細胞のより迅速な動員を示している。
局所肺F特異的応答は、一次RSV感染を有するマウスでは弱いが、肺での免疫優性M2特異的応答は、二次感染後急速に発達した(図4B)。全肺CD8集団の12%超が、RSV再感染から4日後までにM2特異的であったが、これは、他の群で観測された数(<1%)より有意に高い数である。これらのM2特異的CD8T細胞は、主に三重陽性CD8T細胞であった。生RSV群におけるM2特異的CD8T細胞の数は、経時的に有意に変化しなかったが、二重陽性CD8T細胞が優位になった。RSV攻撃から7〜12日後までには、M2特異的CD8T細胞の数は、PBS、RSV sF+GLA−SE及びRSV sF+ミョウバン免疫群において増加したが、このことは、ウイルス複製の非存在下であっても、RSV攻撃後、BALB/cマウスにおいてこの免疫優性エピトープに対するCD8T細胞の急速な誘導を示している。
5.GLA−SEアジュバント添加RSV sFワクチンは、BALB/cマウスにおいてRSV攻撃後の肺Th2応答及び肺組織病理悪化を回避する
BALB/c肺におけるRSV攻撃に対するTh2型応答、特にIL−13産生を特徴とする応答は、ナイーブ動物における肺への好酸球浸潤及び組織病理悪化と関連することが報告されている(Johnson TR,et al.(2008)Pulmonary eosinophilia requires interleukin−5,eotaxin−1,and CD4+ t cells in mice immunized with respiratory syncytial virus G glycoprotein.J Leukoc Biol 84:748−759)。アジュバント添加RSV sFワクチンのいずれかが免疫マウスの肺においてバイアスサイトカイン応答を誘導したかどうかを決定するために、RSV攻撃から4日後に採取した個別の肺ホモジネート中のIL−5、IL−13、IFNγ、IL−17、及びエオタキシンを測定した。これらのサイトカイン読み出しにより、肺に動員されたあらゆる免疫細胞(マクロファージ、好酸球、B細胞、及びT細胞など)により産生されたサイトカインのスナップショットが得られる。IL−5及びIL−13は、非アジュバント添加sF、SEアジュバント添加sF、又はミョウバンアジュバント添加sFで免疫したマウスの肺にしか検出されなかったが、IFNγは、上記群のほとんどで検出された。Th1/Th2特性を表すのにIFNγ:IL−5の比を用いたが、比>1.0は、より高いTh1型応答を示す。PBS免疫マウスは、RSV攻撃から早い時点で、予測通り、全ての試験サイトカインのレベルが低かった(図5A〜F)。Th1応答は、生RSV群(平均IFNγ:IL−5比:29.2)、GLAアジュバント添加sF群(平均比:7.8)及びGLA−SEアジュバント添加sF群(平均比:59.3)で観測された。しかし、Th2型応答は、非アジュバント添加sF群(平均比:0.3)、SEアジュバント添加sF群(平均比:0.4)、及びミョウバンアジュバント添加群(平均比:0.5)について観測された(図5A〜F)。Th17細胞は、様々な前臨床肺感染モデルにおいて、炎症の増大及び防御の増強のいずれにも関連しているが、免疫マウスでは低レベルのIL−17しか検出されず、しかもこれらは、アジュバントの使用によって有意に変動しなかった(図5A〜F)。好酸球浸潤に関連するケモカインであるエオタキシン(CCL11)(Matthews SP,et al.(2005)Role of CCL11 in eosinophilic lung disease during respiratory syncytial virus infection.J Virol 79:2050−2057)は、PBS群において135pg/mLのベースラインレベルで、生RSV群では297pg/mLであった(図5A〜F)。増大した肺エオタキシンレベルが、非アジュバント添加sF群(平均:911pg/mL)、SEアジュバント添加sF群(平均:965pg/mL)、及びミョウバンアジュバント添加sF群(平均:796pg/mL)などの、Th2型免疫応答を有する群で観測された。対照的に、Th1型免疫応答を有する群の肺エオタキシンレベルは、ベースラインであり、GLA−SEアジュバント添加sF群は240pg/mLであった。
好酸球浸潤をさらに評価するために、各ワクチン群からの肺切片を、RSV攻撃後の組織病理学的病変について採点した。RSVによる一次感染を経験した動物の肺には肺病変がほとんど検出されなかったが、二次RSV感染を有する動物において低レベルの肺胞炎及び血管周囲浸潤が認められた(図6A〜F)。GLA−SEアジュバント添加RSV sF製剤を受けた動物は、二次RSV感染を経験したマウスと同様の低い肺炎症スコアを有した。しかし、SEアジュバント添加RSV sF、ミョウバンアジュバント添加sF又は非アジュバント添加RSV sFを受けたマウスは、肺病変スコアが増加した。これらのデータ全体から、GLA−SEアジュバント添加RSV sFを用いた免疫により達成され、観測された全身性Th1バイアス免疫応答は、肺Th1バイアス免疫応答、ベースライン肺エオタキシンレベル、及び他の試験製剤と比較して、ナイーブBALB/cマウスにおけるRSV攻撃後の低い肺炎症と一致することが明らかである。
6.アジュバント添加RSV sFサブユニットワクチンは、RSV攻撃からの完全な防御を付与し、ナイーブコットンラットにおいてRSV中和力価及びTh1バイアス媒介免疫の両方を誘導する
コットンラットは、RSV研究のために確立されたモデルであり、有望なRSVワクチン候補の前臨床評価でよく使用されている。2回目のRSV攻撃モデルにおいてGLA−SEアジュバント添加RSV sFワクチンの免疫プロフィールを確認するために、個々のコットンラットに同じRSV sFサブユニットワクチンを、マウスに用いたのと同様の用量で投与した。アジュバントなし、又はGLA、SE、GLA−SE、若しくはミョウバンのアジュバントを含む0.3μgのRSV sFを第0日及び第22日に筋内投与した。コットンラットの1群を負の対照としてGLA−SE単独で免疫し、別の群には、正の対照として、第0日に1回の鼻内用量1×106pfuの生RSV A2ウイルスを投与した。
RSV攻撃後、アジュバント添加RSV sFワクチンを受けた全てのコットンラットは、生RSV群と等しく、肺において完全に防御され、平均RSV力価<2log10pfu/グラムを有し、プラセボ群(5.5log10pfu/グラム)と比較して、RSV力価は1000倍低減した(図7A)。マウスにおいて観測されたものとは対照的に、非アジュバント添加RSV sFでの免疫は、RSV攻撃からコットンラットを防御しなかった。これら動物の肺における平均ウイルス力価(5.4log10pfu/グラム)は、プラセボ対照のものと類似していた。アジュバント添加RSV sFワクチンは、RSV攻撃からコットンラットの上気道(鼻)も防御することができた。sF+GLA−SEをワクチン接種したコホートは、生RSV群と等しく、鼻での完全な防御を示し、これらのいずれも、平均RSV力価<1log10pfu/グラムを有し、プラセボ群(5.1log10pfu/グラム)と比較して、RSV力価は1000倍低減した(図7B)。sF+GLA(平均2.7log10pfu/グラム)、sF+SE(平均1.4log10pfu/グラム)、又はsF+ミョウバン(平均2.1log10pfu/グラム)を受けた群では、上気道の部分的防御が観測されたが、これらの低減は、非アジュバント添加RSV sFワクチン群(平均4.9log10pfu/グラム)又はプラセボ群と比較して、全て有意であった。
GLA−SEアジュバント添加RSV sFワクチン群におけるコットンラットは、第42日で最も高いRSV中和力価を生み出し、平均14.7log2pfu/グラムであった(図7C)。これは、SEアジュバント添加RSV sFを除く他の全てのワクチン製剤より有意に高かった。GLAアジュバント添加RSV sFワクチン群(平均11.7log2)、SEアジュバント添加RSV sFワクチン群(平均13.3log2)及びミョウバンアジュバント添加RSV sFワクチン群(平均12.9log2)についても高い中和力価が認められた。これらの力価は、生RSV A2ウイルス(平均9.7log2)での鼻内感染、又は非アジュバント添加RSV sF(平均4.3log2)での筋内免疫によって達成されたものより有意に高く、高力価血清RSV中和抗体の誘導におけるアジュバント添加RSV sFの優位性を示している。初回ワクチン接種から42日後の合計F特異的IgG ELISA力価も、非アジュバント添加RSV sF群又は生RSV群のいずれより、SE、GLA−SE、若しくはミョウバンアジュバント添加RSV sF群の方が高かった(図7D)。
コットンラットにおけるT細胞応答を、全RSV sFタンパク質での再刺激後IFNγELISPOTにより測定した。GLA−SEアジュバント添加RSV sF群(平均:2626SFU/百万個の細胞)において最も強力なF特異的IFNγELISPOT応答が検出されたが、これは、非アジュバント添加RSV sF(平均:58SFU/百万)の45倍増であり、他の全てのワクチンコホートで見られたものより有意に強力な応答であった(図7E)。検出可能ではあるが、sF特異的IFNγ応答は、非アジュバント添加RSV sF群と比べても、GLA(平均:約7スポット/百万)、SE(平均:約642)又はミョウバン(平均:1246)によって有意に増強されなかった。生RSV感染群は、196スポットという比較的低い脾臓sF特異的IFNγELISPOT応答を生み出した。これらの結果は、BALB/cマウスモデルで観測された結果と類似していた。
ELISPOTにより測定されるIFNγ:IL−4特異的応答の比を用いて、コットンラットにおける細胞性免疫応答のTh1バイアスを決定した。各群について得られたIFNγ:IL−4比から、GLA−SEアジュバント添加RSV sFが、最も高いTh1バイアス細胞性応答(比:26.9)を生み出し、それ以外は、1〜10の間にとどまったことがわかった(図7F)。コットンラットにおけるこのTh1バイアスは、BALB/cマウスで認められたものと類似している。
マウス試験について記載したように、RSV攻撃から4日後の全てのラットから採取したコットンラット肺切片において、好酸球浸潤及びRSV肺疾患に関連する他の組織病理学的な肺の変化を評価し、採点した(図8)。コットンラットのいずれのワクチン接種群にも、二次RSV感染後の生RSV感染群において見られたものより有意に重症の組織病理は観測されなかった。
論考:
この試験から、精製RSV sFタンパク質を含有するGLA−SEアジュバント添加ワクチンは、RSV感染後の免疫疾患を一切示すことなく、RSV攻撃からBALB/cマウス及びコットンラットを完全に防御すると同時に、高い中和力価及び多機能性CD8+T細胞を特徴とする頑健なTh1バイアス細胞性応答の両方を生み出し、高度に免疫原性であることが明らかである。対照的に、ミョウバン又はSEアジュバント添加RSV sFは、高い中和力価を特徴とするが、弱いTh2バイアス細胞性応答を呈示する防御応答(肺炎症の指標に関連する)を誘導し、また、非アジュバント添加RSV sFは、BALB/cマウスに対して部分的RSV防御しかもたらさなかった。この試験により、組換えRSV sFが、恐らく融合後(post−fusion)であることと、マウスにおいて、GLA−SEアジュバント添加RSV sFが、臨床RSV A及びB分離株に対して頑健な交差中和抗体を誘導することが確認される。
実施例2a:1×RSV血清陽性BALB/cマウスにおけるRSV−sFの免疫原性
この試験により、RSV血清陽性BALB/cマウスにおいてRSV特異的免疫応答を促進及び維持する能力について、アジュバントと共に、又はなしで投与したRSV sF糖タンパク質の用量応答を評価した。この試験の目標は、以下の通りである:(1)単回ワクチン投与後のRSV血清陽性BALB/cマウスにおいて免疫応答を促進するのに十分なRSV sFの用量を決定すること;(2)天然RSV感染後のRSV免疫応答を促進する上でのRSV sFワクチン中のGLA−SEアジュバントを評価すること;並びに(3)RSV sFワクチンにより誘導されるF特異的免疫応答の持続性を決定すること。
RSV−Fヒト株A2タンパク質の50アミノ酸C末端膜貫通ドメイン(すなわち、アミノ酸525〜574)の欠失により、RSV sF(配列番号7)を作製した。マウスは、ワクチン試験の開始前に、1回鼻内投与した1用量の生RSVウイルスにより血清陽性にした。安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞からRSV sFタンパク質を生成し、免疫アフィニティ精製した後、アジュバントを添加せず、又は安定エマルジョン中の糖ピラノシルリピドA(GLA−SE)を添加して、0.4μg、2μg、又は10μgで雌BALB/cマウスに1回筋内投与した(第0日)。第0日(ベースライン)、並びにワクチン接種後10週間にわたり2週間毎に血清学的抗F抗体応答及びRSV中和抗体応答を測定した。マウスの代表的サブセット(n=3/群)においてワクチン接種から10日後、さらに、ワクチン接種から10週間後のRSV攻撃の後に、F特異的CD4及びCD8T細胞応答を測定した。RSV攻撃後の局所肺特異的免疫が、抗体及びサイトカインの存在により明らかにされた。
この試験から、アジュバントと共に、又はアジュバントなしで投与したRSV sFは、抗原用量依存的に、RSVに対する体液性免疫応答を促進するが、GLA−SEアジュバント添加RSV sFは、抗原用量依存的に、CD8特異的免疫応答も促進することが判明した。さらに、上記試験から、これらの促進された応答は、免疫後少なくとも10週間維持されることもわかった。従って、上記試験は、RSV sF+GLA−SEが、ワクチン接種前に実験によりRSVに感染させたマウスにおいて、体液性及び細胞性免疫応答の両方を促進したことを示しており、RSV sFは、RSV血清陽性の個体であっても広範なRSV免疫応答を促進するための有力な候補であるというエビデンスを提供する。RSVヒト株A2(配列番号2)の膜貫通ドメインを欠失した可溶性F(sF)タンパク質構築物(配列番号7)を作製し、安定なクローンチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞から発現させて、免疫アフィニティ精製を用い、抗原的にインタクトな高度精製タンパク質を作製した。
RSVワクチン評価に広く用いられるモデルは、BALB/cマウスであり、これは、RSV許容性がより高いマウス系統の1つである。有効なRSVクリアランスと関連すると考えられる免疫応答の深さ分析(depth analysis)を可能にするBALB/cマウスモデル用の試薬が入手可能である(Connors et al,Resistance to respiratory syncytial virus(RSV)challenge induced by infection with a vaccinia virus recombinant expressing the RSV M2 protein(Vac−M2)is mediated by CD8+T cells,while that induced by Vac−F or Vac−G recombinants is mediated by antibodies.J Virol.1992;66:1277−81)。RSVに対する交差中和抗体(組織培養物中でRSV A及びRSV B株感染の両方を阻害する)はマウスにおいて産生されるが、マウス及びヒト血清のいずれも、RSV感染後に交差中和RSV抗体を含有する。BALB/cマウスは、ヒトと同様に、RSV−F糖タンパク質に対するCD8+T細胞応答を高めることができ、これによって、残留する感染細胞を排除して、疾患を制限することができる(Olson and Varga,Pulmonary immunity and immunopathology:lessons from respiratory syncytial virus.Expert Rev.Vaccines 2008;7(8):1239−55)。これらのF特異的CD8T細胞は、BALB/cマウスにおいて、F糖タンパク質、KYKNAVTEL(配列番号12)の免疫優性エピトープに対して検出することができる(Olson及びVarga,Pulmonary immunity and immunopathology:lessons from respiratory syncytial virus.Expert Rev.Vaccines 2008;7(8):1239−55)。CDR4+T細胞応答は、IL−4、IL−5及びIL−13などのTh2型サイトカインより有効な細胞性抗ウイルス応答に関連するIFNγなどのTh1型サイトカインと共に、中和抗体及びCD8+T細胞両方の生産に影響するサイトカインを生成する。Th1応答は、ウイルス感染の局所部位で、又は抗原再刺激脾臓培養物から産生されるサイトカインの形態で直接測定することもできるし、より高いTh1型応答に関連するマウスIgG2aアイソタイプを用い、抗体アイソタイプにより間接的に測定することもできる。Th2バイアスを回避して、若年に比べ高齢者に見られるT細胞欠陥を解消する(Liu et al,Local immune response to respiratory syncytial virus infection is diminished in senescence−accelerated mice.J.Gen.Virol.2007;88:2552−8)と同時に、RSV感染症の軽減に重要な役割を果たすことが判明している中和抗体を誘導して、高齢者におけるRSV特異的細胞性応答を促進する上で十分に免疫原性であるワクチン製剤を選択するために、BALB/cマウスでの前臨床動物評価を設計する。
糖ピラノシルリピドA/安定エマルジョン(GLA−SE)は、ナイーブBALB/cマウスにおいて2用量ワクチンレジメンでRSV sFに対する体液性及び細胞性免疫応答の誘導を増強することが立証された併用アジュバント(Immune Design Corporation,Seattle,WA)である。この試験では、ワクチン接種前に実験によりRSVに感染させたBALB/cマウスにおける免疫応答を促進するために、単一用量のRSV sFワクチン接種レジメンにアジュバントが必要かどうかを決定した。
評価するワクチン製剤は、アジュバントGLA−SEと共に、又はこれを含まずに0.4μg、2μg、及び10μgでRSV sFを含有した。これらを、対照RSV血清陰性マウス、プラセボワクチンを投与した血清陽性マウス、及びブースタとして二次RSV感染を付与した血清陽性マウスと比較した。評価する免疫パラメータとして、以下のものが挙げられる:RSV sFに対する血清抗体応答(総量、IgG1/IgG2a、及びウイルス中和力価)、ワクチン接種後、及びワクチン接種から10週間後のリコール(recall)攻撃後のF特異的インターフェロンγ(IFNγ)特異的CD8T細胞応答、これらの両時点でのF特異的Th1/Th2サイトカイン産生CD4T細胞、並びにリコール攻撃から4日後の肺サイトカインレベル及びF特異的抗体。
ナイーブ雌BALB/cマウスを、各8〜9匹の表示ワクチンコホートに分け、第0日に投与した。9群のうち8群に、ワクチン投与の28日前に、106PFUの生RSV A2ウイルスを鼻内接種して、RSV血清陽性マウスを作出した。第0日のF特異的ELISA終点力価により、血清転換が成功したことを確認した。マウス9匹の群に、ワクチン製剤を第0日に筋内(IM)接種した。攻撃から10日後に、1群当たり3匹を細胞性免疫応答について評価し、残る1群あたり5〜6匹は、第73日まで血清抗体応答について追跡した。残った動物は、第69日に、生RSV A2ウイルスで鼻内攻撃して、攻撃から4日後(第73日)に残留リコール細胞性免疫応答の評価を可能にした。
GLA−SEを含むか、又は含まない3つの異なる用量のRSV sFサブユニットワクチンを評価した。用いた用量は、マウス1匹当たり0.4μg、2μg、及び10μgのサブユニットタンパク質であり、これは、ナイーブBALB/cマウスに用いた範囲を含み、RSV sF糖タンパク質の提案された最低臨床用量(10μg)を含む。アジュバント添加群におけるGLA−SEは、2%SE中5μgのGLAの用量で付与した。第0日に、鼻内経路での106PFUの生RSV A2ウイルスによるブースタ感染を付与した接種血清陽性マウスは正の対照として用い、負の対照は、プラセボとしてPBSを接種した血清陽性群と、プラセボとしてPBSを接種した血清陰性群を含んだ。
第0、14、28、42、56、及び73日に、各群について血清学読み出しを実施した。マウスをイソフルランで軽度に麻酔した後、眼窩内から採血した。血清を分離し、−20℃で保存し、試験のために解凍した。各時点で全抗FIgGを測定し、第0日及び第42日に抗FIgG1及び抗FIgG2aELISA終点希釈力価を測定した。RSV中和力価をRSV A2−GFPマイクロ中和アッセイにより決定した。第42日に、RSV−Fに対する部位特異的モノクローナル抗体を用いた競合ELISAにより、抗FIgG応答のポリクローナル性を評価した。第14日に、各群について抗FIgA終点希釈力価を測定した。
ワクチン接種から10日後に、代表的マウスにおいて、ワクチン接種に対する全身性細胞性免疫応答を評価した。別の代表的マウスは、第69日にウイルス攻撃でリコールし、第73日(ウイルス攻撃から4日後)に長期細胞性免疫応答について評価した。各々の群について、3〜5つの個別の脾細胞サンプルを調製した。RSV sFを用いた72時間の再刺激時間後の分泌サイトカイン(IFNγ、IL−5、IL−10、IL−13、及びIL−17など)の集団の上清レベルの多重サイトカイン分析により、CD4T細胞読み出し情報を評価した。CD8T細胞読み出し情報は、次の2つの方法により評価した:F由来CD8ペプチド(KYKNAVTEL aa 85〜93)(配列番号12)による36〜48時間再刺激時間及び細胞内染色後のIFNγ分泌細胞のELISPOT数、並びにF由来CD8ペプチドによる5時間の再刺激時間後のF特異的多機能性(IFNγ+TNFα+IL−2+)CD8T細胞の割合(%)の定量。
ウイルス攻撃に対する肺特異的応答を、第73日(攻撃から4日後)に個別に採取した均質化肺について評価した。肺ホモジネート中のサイトカインレベル(IFNγ、IL−5、IL−10、IL−13、IL−17、エオタキシン)を局所細胞性免疫応答のバイオマーカとして測定した。抗体応答が肺にターゲティングされていることを明らかにするため、肺ホモジネート中のF特異的IgA及びIgG抗体をELISA終点力価により測定した。テューキーポストテスト(Tukey post test)及びp<0.05の有意性カットオフを用いたGraphPad Prism一元配置分散分析(1 way ANOVA)により、有意性を計算した。
結果
ワクチン接種の28日前に、高用量の106pfuのRSV A2ウイルスにRSV血清陽性群(群2〜10)を鼻内感染させた。第0日に、F特異的IgG終点ELISA力価により、これらマウスのRSV血清転換を確認した。全ての血清陽性マウスが、第0日に検出可能なF特異的IgGを呈示し、群平均終点力価は、12.81〜15.36(平均14.60)であった。対照的に、対照血清陰性群は、5.64の平均力価を有した(図14)。血清陽性マウスのほとんどは、第0日に低いものの、検出可能な中和抗体力価を有することも判明し、平均log250%プラーク減少力価は、3.07〜3.88であった。
第0日に全マウスにワクチンを投与した。100μLにおいて2%SE中5μgGLAの最終ワクチン用量を達成するために、10%SE中250μgGLA(GLA−SE[10%SE中1mg/mL]を10%SEで希釈することにより調製した)の使用原液(working stock)を用いた。
促進されたF指向抗体応答をワクチン接種から14日、28日、42日及び73日後に評価し、各ワクチンコホートについて第0日のベースライン血清学読み出し情報と比較した。第14日の合計抗F血清IgG力価は、sFワクチンを受けた全ての血清陽性マウスが、抗原用量又はGLA−SEとのその製剤化とは関係なく、力価の増大に迅速に応答したことを示している(図14)。血清IgGの4倍増大は有意とみなされる。観測された増大は、第14日で13〜137倍であり、この日は、力価が全群を通し一貫して最も高かった。PBSワクチンを受けた血清陽性マウスは、IgG力価増大が4倍に満たなかったが、生RSV感染で促進されたマウスは、IgG力価の増大は4倍近かった。興味深いことに、アジュバントなしで様々な用量のRSV sFを受けた群と、様々な用量のRSV sF+GLA−SEを受けた群との間で、類似の総F特異的IgG力価が観測された。増大した抗FIgG力価は、これら全ての群において、第73日の15倍より高く、用量又はアジュバント増強の差は認められなかった(図14)。
血清RSV中和力価を複数の時点でも評価した。第0日のRSV血清陽性マウスの各群についての平均log250%プラーク低減力価は、3.07〜3.88であった(図15)。ワクチン接種から14日後までに、生RSV、RSV sF、又はRSV sF+GLA−SEのいずれかで免疫したマウスは、それらの第0日の値に対して増大した中和力価を有した(図15)。4倍の力価増大は有意とみなされる。非アジュバント添加RSV sFワクチンを受けた血清陽性マウスは、RSV中和力価の15〜28倍増大を示したのに対し、GLA−SEアジュバント添加RSV sFワクチンを投与されたマウスは、中和力価の53〜85倍増大を示した。対照的に、PBSワクチンを受けた血清陽性マウスは、第14日の中和力価の増大は2倍に満たず、生RSVによる2回目の感染を受けたマウスは、7倍の中和力価増大しか示さなかった。このことは、RSV sFワクチンが、RSVでの再感染より、高い度合まで血清陽性マウスにおいて中和力価を増大したことを示している。各用量群について第14日の平均RSV中和力価は、互いの2倍以内であった(非アジュバント添加用量の場合、8.32、7.82、及び8.66であり、アジュバント添加の場合は、9.32、8.82、及び9.49)ことから、RSV sFの量(0.4〜10μg)は、この誘導において重要ではなかった。アジュバントの含有は、RSV血清陽性マウスの中和抗体促進に約2倍の増強しかもたらさず、これは、適切なアジュバントなしで、RSV sFワクチンによって中和抗体がほとんど誘導されないナイーブマウスにおいて観測されたものとは対照的である。各群について中和力価は、第73日まで、第14日の80%以内に維持され、場合によっては経時的に増加する(図15)。これは、免疫から少なくとも10週間にわたって機能性体液性免疫が存続することを示している。
血清IgAは、生きたマウスにおいて粘膜IgAより測定がしやすいため、粘膜IgAのレベルの指標を与え得る。ワクチン接種から14日後に、血清陰性マウスは、検出限界以下という非常に低いF特異的IgA力価を有したが、全ての血清陽性マウスは、検出可能なF特異的IgAを有した(図16)。RSV sF(10μg)又は3用量のいずれかのRSV sF+GLA−SEでワクチン接種した血清陽性マウスは、PBSワクチンを受けた血清陽性マウスより有意に高い血清F特異的IgA力価をもたらした。また、2回目の生RSV A2感染で免疫促進した血清陽性マウスも、有意に高い血清F特異的IgA力価を示した。これは、RSV sF+GLA−SEワクチンが、血清陽性マウスにおいて血清IgA力価を増大することができることを示している。
第0日及び第42日での血清F特異的抗体を、IgG1及びIgG2aアイソタイプについても評価し、ワクチン接種前及び後の血清陽性マウスのTヘルパー型均衡を決定した。F特異的IgG1力価(Th2型サブタイプ)及びF特異的IgG2a(Th1型サブタイプ)力価はいずれも、第28日に血清陽性マウスに存在した(図17)。IgG2a力価は、ワクチン接種前の血清陽性マウスにおいて優位であり、受けたワクチン製剤とは関係なく、第42日にワクチン接種後のその優勢を維持した(図17)。これは、ナイーブマウスにおける以前の試験とは対照的であり、その場合、アジュバントなしで投与されたRSV sFワクチンは、主としてIgG1応答を誘導し、IgG2aバイアスを誘導するためには、GLA−SEアジュバントの含有が必要であった。
RSV sFワクチンが、血清陽性マウスにおいてRSV sFの既知中和抗原部位に対するポリクローナル血清抗体を促進するかどうかを決定することも調べ、競合ELISAアッセイを用いて、部位A、B及びC特異的mAbと、RSV sF抗原上の標的エピトープの結合を阻止するその能力を測定することにより、ワクチン接種後の血清のポリクローン性を評価した。全ての試験群からの血清は、部位A及び部位C抗体との強力な競合、並びに部位B抗体との検出可能な競合を呈示したが、これは、ポリクローナルRSV−F指向性応答を示すものである(図18)。RSV sFワクチン接種群(±GLA−SEアジュバント)の各々からの血清は、PBS又は生RSVで促進した血清陽性マウスからの血清より、部位A及び部位Cについての競合で優れており、自然の感染に対するRSV sFワクチンの利点を示している。興味深いことに、部位B結合についての競合は、アジュバント及びRSV sF用量依存的であった。2μg又は10μgの用量で、GLA−SEアジュバント添加RSV sFを受けたマウスからの血清は、その対応する非アジュバント添加群からの血清と比較して、有意に増強された部位B競合応答を有する(図18)。
全身性CD4T細胞免疫応答を2つの個別の時点で評価した。ワクチン接種から10日後に、各群の3匹のマウスから脾細胞を採取し、Bioplexによるサイトカインの測定のために、RSV sFタンパク質で72時間再刺激した。血清陰性群は、試験した集団全体を通してF特異的サイトカイン応答をもたらさなかったが、全ての血清陽性群において、第10日にF特異的IFNγ(Th17サイトカイン)が検出された(図19)。応答の規模は、非アジュバント添加RSV sFを受けた血清陽性マウスと比較して、GLA−SEアジュバント添加RSV sF群の方が高いことがわかった。IFNγに比べ、IL−5(Th2サイトカイン)、IL−10(Th0サイトカイン)、及びIL−17(Th17サイトカイン)は、非常に低レベルでしか検出されなかったが、これは、血清陽性マウスが、使用したワクチンとは関係なく、Th1バイアス応答を提示することを示している。CD4T免疫応答は、第73日、すなわちRSVでのリコール感染から4日後にも評価した。各群の3〜5匹から脾細胞を採取し、Bioplexによりサイトカインを測定した。やはり強力なTh1応答を示すF特異的IFNγが、観測された優位なサイトカインであり、典型的Th0、Th2、又はTh17サイトカインのレベルは低かった(図19)。このデータは、これらの血清陽性マウスで観測されたF特異的IgG1/IgG2a力価と一致しており、ナイーブマウスにおいて認められたもの(非アジュバント添加RSV sFワクチンがTh2型免疫応答を誘導した)とは対照的であった。これらのデータは、血清陽性マウスモデルにおいて、初回RSV感染により形成されたTh1バイアスが、RSV−Fワクチンに対し将来増大する応答の特徴を知らせることを示唆している。このTh1バイアスは、このモデルが、過去にRSV感染の経験を有する健康な成人を十分に表し得るが、RSVについて血清陽性である免疫老化高齢者集団では、ワクチン応答を呈示しない可能性があることを示唆している。
同じ2つの時点で、CD8T細胞免疫応答を各群のマウスにおいて評価した。ワクチン接種から10日後、CD8Fペプチド再刺激を用いたIFNγ−ELISPOTにより、群当たり3匹を評価した。プラセボ群には、F特異的CD8応答がなかった(0SFU/百万個の細胞)のに対し、血清陽性マウスは、69SFU/百万の低い検出可能なCD8応答を有した(図20)。対照的に、非アジュバント添加sFを投与した群は、用量依存的F特異的CD8IFNγ応答を有した(平均72〜224SFU/百万)が、sF+GLA−SEを投与した群は、規模がより大きな用量依存的F特異的CD8IFNγ応答を有した(平均171〜1699SFU/百万)。アジュバントを添加したRSV sFの最も高い用量で、観測されたCD8応答の規模(1699SFU/百万)は、アジュバントを含まない同じ用量より有意に高く(224SFU/百万)、生RSV追加群で観測されたもの(145SFU/百万)よりはるかに高かった(図20)。このCD8IFNγELISPOT応答は、最も高い測定値であった。さらに、全ての群を細胞内フローサイトメトリーにより、IFNγ、TNFα(エフェクターサイトカイン)、及びIL−2(生存サイトカイン)の発現を特徴とする多機能性CD8T細胞応答について評価した。多機能性CD8T細胞の存在はウイルス防御と関連しており、このことは、これらの細胞が、ウイルス感染細胞のクリアランスに関して、より有効であり得ることを示唆している(Betts et al,HIV nonprogressors preferentially maintain highly functional HIV−specific CD8+T cells.Blood.2006;107(12):4781−9)。IFNγELISPOT応答から予測されたように、有意なGLA−SEアジュバント添加RSV sF用量依存的CD8応答が観測された。10μgのアジュバント添加RSV sFで追加免疫した血清陽性マウスは、全CD8T細胞の0.49%の頻度で三重陽性多機能性抗FCD8T細胞を示した。全CD8T細胞の0.62%が、二重IFNγ及びTNFαF特異的活性を示した。これは、血清陰性プラセボ群(0.01〜0.02%)におけるFペプチド再刺激応答の平均頻度の3倍に基づく閾値レベル(0.03〜0.06%)を優に超えるものであった(図20)。検出可能な三重(0.13%)及び二重(0.27%)陽性多機能性T特異的CD8T細胞は、GLA−SEでアジュバント添加した2μgのRSV sFを投与した群でも検出された(図20)。
CD8応答の存続を評価するために、第73日(RSV攻撃から4日後)に、リコールCD8T細胞免疫応答について両方法により3〜5匹のマウス/群を評価した。IFNγELISPOTでは、sF+GLA−SEを投与した群において用量依存的F特異的CD8IFNγ応答(平均142〜598SFU/百万)を検出した(図21)。これは、対応する非アジュバント添加sF群で観測されたものより高く、この群も、用量依存的CD8IFNγ応答(62〜243SFU/百万)を示した。比較すると、血清陰性対照は、IFNγ応答を全く示さず(−4SFU/百万)、PBS(35SFU/百万)、又は生RSV A2(61SFU/百万)で追加免疫すると、より低い応答が認められた。細胞内フローサイトメトリーでは、アジュバント添加した最も高い用量のRSV sFを受けた群で強力な多機能性F特異的CD8T細胞を検出した(0.25%三重陽性及び0.25%二重陽性)(図21)。応答の規模は、ワクチン接種から10日後に検出されたものよりやや低かったが、データは、ワクチン接種から10週間後にF特異的CD8応答をリコールすることができることを示している。
RSV攻撃後の局所肺環境における免疫応答のTh1特徴の存続を確認するために、IFNγ、IL−5、IL−13、IL−10、IL−17、及びエオタキシンなどのサイトカインのレベルを、第73日の肺ホモジネートを用いて評価した(図22)。これらのサイトカイン読み出し情報により、マクロファージ、好酸球、B細胞及びCD4又はCD8T細胞などの肺に動員されたあらゆる免疫細胞によって形成されるサイトカインのスナップショットが得られる。リコールRSV攻撃後、血清陽性免疫マウスからの肺ホモジネートに検出された主なサイトカインは、IFNγであり、IL−5、IL−10、IL−13、又はIL−17はほとんど検出されなかった。ナイーブマウスにおける肺免疫疾患に関連する好酸球の化学走性を誘導することができるサイトカインであるエオタキシンは、RSV感染に対する最初の応答を高めた血清陰性ナイーブマウスと類似したレベルで、全ての群において発現された。これらのデータは、ワクチン接種した血清陽性マウスにおける肺免疫応答が、全身性免疫応答の特徴を表し、好酸球増加の危険性は低いままでTh1バイアス状態を維持することを示している。
結論
この試験から、0.4〜10μgの抗原用量で、非アジュバント添加又はGLA−SEアジュバント添加RSV sFのいずれかを用いた1回の接種により、RSV血清陽性BALB/cマウスにおける免疫の血清学的読み出しを有意に高められることが判明した。中和抗体をRSVマイクロ中和アッセイにより検出したところ、ワクチン接種から10週間存続する。RSV sFに対する細胞性CD8免疫は、抗原用量依存的であり、GLA−SEアジュバントを必要とすることが判明し、RSV sF+GLA−SEの最大(10μg)用量で、血清陽性マウスにおける多機能性CD8T細胞の数が有意に増大した。これは、ワクチン接種から10日以内と、ワクチン接種から10週間後のリコール攻撃後の両方で観測された。Th1バイアス化アジュバントGLA−SEは、この血清陽性モデルにおけるCD8T細胞、血清RSV−F部位B特異的抗体、血清F特異的IgA力価の増強に重要な役割を果たすことが判明した。この血清陽性モデルにおいて、血清中和力価又は血清F特異的IgGを増大する上でのアジュバントの利点は認められなかった。F特異的CD4T細胞IFNγ応答、及び肺サイトカインレベル評価から、上記の血清陽性マウスモデルが、初回RSV感染によりTh1バイアス化されたことがわかったが、このことは、上記モデルが、RSV血清陽性の健康な成人におけるRSVワクチン接種応答のモデルとなり得ることを示唆している。高齢のヒトなどのTh2バイアスRSV血清陽性宿主において、GLA−SEは、ナイーブマウスで観測されたように、Th2ヘルパー応答をマウスTh1様応答に転換することにより、さらなる利点を提供し得る。
10μg用量のRSV sF+GLA−SEを投与した血清陽性マウスにおいて増大した中和抗体及び増強された細胞性免疫の観測結果を確認するために、第2の試験を1×血清陽性BALB/cマウスにおいて実施した。この試験では、以下を目標とする:1)10μg用量のRSV sF単独で認められる観測を繰り返すこと、2)前記応答を、GLA(1又は2.5μg)のみと一緒に投与した10μg用量のRSVsFで達成されたものと比較すること、3)前記応答を、SE(0.5又は2%)のみと一緒に投与した10μg用量のRSV sFで達成されたものと比較すること、4)前記応答を、より低用量のGLA−SE(1若しくは2.5μg+0.5%SE又は1若しくは2.5μg+2%SE)と一緒に投与した10μg用量のRSV sFで達成されたものと比較すること、5)前記応答を、ミョウバンと一緒に投与した10μg用量のRSV sFで達成されたものと比較すること。
マウスを9匹ずつ13群に分け、そのうち12群(対照を除く全て)は、初回ワクチン接種の28日前に高用量106pfuのRSV A2ウイルスを用いた単回鼻内感染により血清陽性にした。これらの動物におけるRSV血清転換を、ワクチン接種の日に血清F特異的IgG終点ELISA力価により確認した(図23)。マウスには、前回と同様に、100μlのPBS又は製剤化RSV sFワクチンで筋内接種した。ワクチン接種から2週間後に、血清F特異的IgG1及びIgG2aを評価した。RSV sFワクチンは、PBSワクチン接種マウスで認められたもの、並びにRSV A2での2回目の感染により達成されたものを超えてIgG1及びIgG2a力価を増大したが、投与したワクチンとは関係なく、全ての血清陽性群が、IgG1レベルより高いIgG2aレベルを呈示し、本来のTh1バイアスであることを示した(図24)。ワクチン接種から2週間、4週間、及び6週間後、血清RSV中和力価を評価した。アジュバントとは関係なく、10μgのRSV sFを受けた群は、PBSワクチン接種1×血清陽性対照を有意に超えて増大し、互いに差はなかった(図25)。
RSV sFワクチン接種1×血清陽性BALB/cマウスにおいて、アジュバントの選択は、中和抗体応答に影響を与えなかったが、達成された細胞性応答には影響を与えた。ワクチン接種から10日後に、群当たり3〜4匹の代表的マウスからの脾細胞を採取して、IFNγELISPOT及び細胞内サイトカイン染色(IFNγ、TNFα、及びIL−2産生多機能性細胞について)の両方により、F特異的CD8T細胞応答を評価した。ELISPOTアッセイでは、sF+2%SE中1若しくは2.5μg用量でのGLA−SEを受けた群は、sF単独又はsF+ミョウバンのいずれかを受けた群より有意に高い応答を有した(図26A)。sF又はsF+ミョウバンと比較して有意に高いGLA−SEに対するこの応答は、細胞内サイトカイン染色アッセイにおいても認められた(図26B)。さらに、細胞内サイトカイン染色アッセイでは、RSV sFのみを投与した群と比較して、RSV sF+2%SE又はRSV sF+GLA−SEを(0.5%SE中1若しくは2.5μg)を投与した群において向上したF特異的CD8応答が検出された。
この実験では、RSV sF+GLA−SEが、1×血清陽性BALB/cマウスにおいて、非アジュバント添加RSV sFと同様に、中和力価を増大する能力を確認すると共に、血清陽性マウスにおいてF特異的CD8T細胞応答を促進する上で、他のアジュバント添加RSV sFワクチンと比較して、RSV sF+GLA−SEが最適製剤であることが判明した。
実施例2b:高度に血清陽性のBALB/cマウスにおけるGLA−SEアジュバント添加RSV−サブユニットワクチン
この実施例では、血清陽性BALB/cマウスを用いて、RSV sF用量がどのように応答に影響を与えるか、及びアジュバントがどのように応答を調節するかを評価した。RSV再感染は生涯を通して起こり、比較的高レベルの抗RSV中和抗体にもかかわらず、高齢者(≧65歳)は、RSVに再暴露されると、健康な成人より、重篤なRSV関連疾患に罹患しやすい(Mullooly et al,;Vaccine Safety Datalink Adult Working Group Influenza− and RSV−associated hospitalizations among adults.Vaccine.2007 25(5):846−55,Walsh EE,Peterson DR,Falsey AR.Risk factors for severe respiratory syncytial virus infection in elderly persons.J Infect Dis 2004 189(2):233−8)。高齢者におけるRSV関連疾患の重症度の増大は、部分的に、この集団における免疫老化及びTh2バイアスへの転換によるものと考えられ、これは、感染後のRSVの準最適排除を招き得る(Cusi MG,Martorelli B,Di Genova G,Terrosi C,Campoccia G,Correale P.Age related changes in T cell mediated immune response and effector memory to Respiratory Syncytial Virus(RSV)in healthy subjects.Immun Ageing.2010 Oct 20;7:14.)。ウイルスから抽出及び精製したRSV F又はF+G+Mを用いた以前の臨床試験では、一般に、これらのRSV抗原が、ミョウバンを用いて、又は用いずに既存のRSV抗体力価の程々の増大がもたらされることを明らかにしたが、こうした試験では、RSV CMI応答の促進については報告されていない(Langley JM,Sales V,McGeer A,Guasparini R,Predy G,Meekison W,Li M,Capellan J,Wang E.A dose−ranging study of a subunit Respiratory Syncytial Virus subtype A vaccine with and without aluminum phosphate adjuvantation in adults>or=65 years of age.Vaccine.2009 27(42):5913−9.Falsey AR,Walsh EE,Capellan J,Gravenstein S,Zambon M,Yau E,Gorse GJ,Edelman R,Hayden FG,McElhaney JE,Neuzil KM,Nichol KL,Simoes EA,Wright PF,Sales VM.Comparison of the safety and immunogenicity of 2 respiratory syncytial virus(rsv)vaccines−−nonadjuvanted vaccine or vaccine adjuvanted with alum−−given concomitantly with influenza vaccine to high−risk elderly individuals.J Infect Dis.2008 Nov 1;198(9):1317−26.Falsey AR,Walsh EE.Safety and immunogenicity of a respiratory syncytial virus subunit vaccine(PFP−2)in the institutionalized elderly.Vaccine.1997 Jul;15(10):1130−2.Falsey AR,Walsh EE.Safety and immunogenicity of a respiratory syncytial virus subunit vaccine(PFP−2)in ambulatory adults over age 60.Vaccine.1996 Sep;14(13):1214−8.)。
高齢のヒトのRSV血清状態に近づけるために、高度にRSV血清陽性のBALB/cマウスにおいて、RSV sF単独、RSV sF+GLA−SE又はRSV sF+ミョウバンでの免疫により、RSV特異的抗体及びCMI応答の促進を実施した。RSV免疫応答の促進に加えて、この試験では、概してアジュバントが既存のThバイアス宿主免疫応答を改変する能力に関するケーススタディとして、RSV sF+ミョウバン(Th2バイアス化アジュバント)を用いた免疫により、野生型RSV感染により樹立された既存の免疫応答を改変できるのかどうかも決定する。前述した以前のマウス試験は、アフィニティ精製RSV sFを用い、RSVナイーブマウスで実施された。対照的に、本試験で用いるRSV sFは、典型的なクロマトグラフィーにより精製した。RSV sFは、1000倍の範囲(0.05〜50μg)で、単独又はGLA−SE若しくはミョウバンと一緒に製剤化したものを投与して、事前に生RSVに2回感染させたBALB/cマウスにおいてRSV免疫応答を促進するその能力を評価した。
材料及び方法
試験設計
6〜8週齢の103匹の雌BALB/cマウス(Charles River)を13の群に分けた。第1群は7匹で、第2〜13群は8匹のマウスを有した。第0日及び第35日に、麻酔後、100μL中1×106プラーク形成単位(PFU)の生RSVを第1〜12群に鼻内(IN)経路で投与した。第13群はRSVに暴露しなかった。第56日に、第1〜11群をイソフルランで麻酔した後、プラセボ(PBS)又はワクチン品目を用いて、筋内(IM)経路で免疫した。ワクチン品目は、合計100μLで製剤化し、後ろ足にそれぞれ50μLずつ投与した。第12群をイソフルランで麻酔した後、100μL中1×106PFUの生RSVを用いてIN経路で免疫した。第84日に、各群からのマウスのサブセットを麻酔した後、1×106PFUの生RSVを用いて鼻内経路で攻撃した。第0、28、56及び84試験日に、眼窩後から採取した血液から血清を取得して、白血球から分離した後、評価するまで−20℃で保存した。第67日、すなわち免疫から11日後、又は第88日、すなわち攻撃から4日後に、各群の4匹からT細胞アッセイのために脾臓を採取した。攻撃から4日後に、個々の肺ホモジネート中の肺サイトカインをルミネックス(luminex)アッセイ(Milipore)により定量した。
RSV sF及びアジュバント
RSV A2F配列のアミノ酸1〜524を含むRSV Fタンパク質を安定CHOクローンから発現させて、典型的クロマトグラフィー法により精製した。RSV Fタンパク質は、>90%純粋であったが、これを動物の免疫及びELISAアッセイでの塗布の両方に使用した。ミョウバン(Alhydrogel,Accurate Chemical and Scientific,NJ)は、ワクチン用量当たり100μgで使用し、室温で30分の混合により、タンパク質に吸着させた。水性製剤中のGLAを用量当たり5μgで使用した。SEは、2%濃度で使用した。GLA−SEは、2%SE中5μgの用量で使用した。ワクチン製剤は全て、投与の2時間以内に調製した。
血清IgG、IgG1及びIgG2aELISA
標準的ELISA技術を用いて、RSV−F特異的IgG抗体を評価した。高結合96ウェルプレートを精製RSV sFで塗布した。ブロック後、血清の連続希釈物をプレートに添加した。モノクローナル抗体1331H(Beeler JA,van Wyke Coelingh K.Neutralization epitopes of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus:effect of mutation upon fusion function.J Virol.1989;63(7):2941−50)を用いて、全IgG及びIgG1定量のための標準曲線を作成し、モノクローナル抗体1308を用いて、IgG2a定量のための標準曲線を作成した。HRP結合ヤギ抗マウスIgG、IgG1、又はIgG2a(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)を用いて、結合抗体を検出し、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB,Sigma,St.Louis,MO)を用いて展開させた。SpectraMaxプレートリーダにより450nmで吸光度を測定した後、SoftMax Pro(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いて分析した。力価は、1331H又は1308同等物のμg/mLとして記録する。
RSVマイクロ中和アッセイ(ナイーブ試験と同じ)
表示の時点で熱不活性化したマウス血清のRSV中和抗体力価を、以前記載されているようにGFP標識RSV A2マイクロ中和アッセイを用いて測定した(Bernstein DI,et al.(2012)Phase 1 study of the safety and immunogenicity of a live,attenuated respiratory syncytial virus and parainfluenza virus type 3 vaccine in seronegative children.Pediatr Infect Dis J 31:109−114)。手短には、密集Vero細胞単層を500PFUのウイルス単独、又は連続希釈した血清サンプルと事前に混合したウイルスに感染させた後、33℃及び5%CO2で22時間インキュベートした。プレートを洗浄して遊離ウイルスを除去し、IsoCyteイメージスキャナー(Blueshift,Sunnyvale,CA)を用いて、GFP蛍光ウイルスフォーカスを計数した。中和力価は、4−パラメータ曲線当てはめアルゴリズムを用いて計算されるように、蛍光フォーカスの数の50%低減(EC50力価)をもたらした細胞希釈率のlog2逆数として表した。
ELISPOTアッセイ(ナイーブ試験と同じ)
表示の採取時点で、100ミクロンナイロンフィルタ(Falcon)を通して、個々の脾臓を破砕した。赤血球欠失脾細胞の生存能をViCellにより決定し、使用する前に、5%FCS、ペニシリン−ストレプトマイシン、2mML−グルタミン及び0.1%β−メルカプトエタノール(cRPMI−5)を添加したRPMI1640中に、10×106生存細胞/mLで細胞を懸濁させた。
マウスELISPOTアッセイのために、Mabtech(Cincinnati,OH)マウスIFNγELISPOTキットを使用した。事前に塗布したマイクロプレートをcRPMI−5でブロックしてから、細胞及び刺激物質を添加した。ブロックした塗布済みプレート上で250,000細胞/ウェルを培地単独、MHC II(I−Ed)結合ペプチドGWYTSVITIELSNIKE(配列番号10)及びVSVLTSKVLDLKNYI(配列番号11)(Olson MR,Varga SM(2008)Pulmonary immunity and immunopathology:lessons from respiratory syncytial virus.Expert Rev Vaccines 7:1239−1255)(各5μg/mL)、MHC I(H2−Kd)結合ペプチド、KYKNAVTEL(配列番号12)(Olson MR(2008)、又は正の対照としてConA(5μg/mL)と一緒に、3回反復して36〜48時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗い流し、キットのプロトコルに従い、プレートを付属のビオチン化抗マウスIFNγと一緒にインキュベートしてから、SA−HRPを実施し、付属のTMB試薬を用いて、スポットを検出した。CTL ImmunoSpotリーダ及びソフトウエア(Cellular Technology Ltd)を用いて、プレートの読み出し及び分析を行った。
サイトカインプロファイリング(ナイーブ試験と同じ)
IFNγ、IL−5、IL−13、IL−17及びエオタキシン(Millipore,Billerica,MA)を含有するように設計されたマウスサイトカイン/ケモカインマルチプレックスキットを用いて、肺ホモジネートを評価した。肺ホモジネートは、使用前に遠心分離により清澄化した。アッセイを製造者の指示に従って実施し、プレートをLuminexリーダ(Bio−Rad,Hercules,CA)で分析した。
これらの実験から、高及び低ベースライン血清陽性度を有する血清陽性マウスにおいて、RSV−sFは、用いたアジュバント又は投与したRSV−sFの用量とは関係なく、中和抗体応答を促進することが明らかにされた。しかし、GLA−SEと一緒にRSV−sFを製剤化すると、血清陽性マウスにおいて最も強力なCD8T細胞応答が誘発された。さらに、ナイーブBALB/cマウスにおいてTh2応答を誘発したRSV sF単独又はRSV sF+ミョウバンなどの製剤では、RSVに対する事前暴露により誘発された血清陽性動物のTh1バイアスは変化しなかった。血清陽性動物において、RSV−sFの投与により、使用したアジュバント又は投与したRSV−sFの用量とは関係なく、中和抗体応答が増大する。
図27は、血清陽性マウスにおいてRSV−sFが中和抗体を増大することを示すグラフである。力価が増加する規模は、初期中和力価が低い動物ほど顕著であった。力価は、最大中和力価まで増加したとも考えられ、これは、ワクチン接種から72日間維持された。やはり、増加はアジュバントとは独立であった。
図28A及びBは、エオタキシン及びIL−13が、RSVA2攻撃後に誘導されないことを示すグラフである。ランテスは、アジュバントの存在に影響される唯一のケモカイン/サイトカインである。
図29A及びBは、RSV−sF+GLA−SEが、CD8T細胞応答を促進することと、CD8T細胞応答が用量依存的であることを示すグラフである。50μgのRSV−sFで最大応答が達成されるかどうかは不明である。しかし、RSV−sF+GLA−SEを含む製剤により、多機能性応答に関して最大規模を有するCD8T細胞応答が得られた。
結果
BALB/cマウスの気道は、RSV複製に関して半透過性でしかないため、生RSVの単回鼻内投与後に高レベルの血清中和力価を達成するのは難しい。RSVに複数回再感染したヒトに観測された血清中和力価のレベルにさらに近似させるために、第0及び35日に、マウスを1×106PFUのRSVに2回暴露した。予測通り、単回投与後に、全てのRSV感染マウスにおいて、低いものの、検出可能な中和力価が見られた(図38)。平均RSV中和力価は、4.2log2であった。2回目の投与後、平均RSV中和力価において、8.3log2まで約16倍の増大が見られた。しかし、個々のマウスの力価は、3.3〜12log2と広範囲であった。
各種RSV sF製剤が、これらのRSV血清陽性マウスにおいて中和力価を増大する能力を決定するために、第56日にマウスにワクチン接種し、70及び84日(ワクチン接種からそれぞれ14及び28日後)に採血した。図2は、追加免疫から14日後の群の力価を示す。図39は、試験期間にわたる中和力価の上昇を示す。データは、全てのRSV sFワクチンが、アジュバントの存在又はアジュバントの種類とは関係なく、免疫から14日後に、8.3log2の群平均から9.3log2及び11.9log2まで中和力価を増大する能力があったことを示している。従って、RSV 血清陽性BALB/cマウスにおいて、RSV中和力価は、極めて少量の非アジュバント添加RSV sFにより、50μgという最も高いアジュバント添加RSV sF用量で達成された力価のわずか約6倍低いレベルまで増大することができた。
RSV感染前の第0日及び2回のRSV投与後の第56日に、総RSV F特異的IgG力価を測定した。図41は、ワクチン品目での免疫前に生RSVA2への2回の連続暴露後、高レベルの抗F特異的IgG力価が認められたことを示す。図42は、追加免疫から14日後の群の力価を示す。図43は、試験期間にわたるIgG力価の上昇を示す。中和力価とは異なり、わずかな用量応答が見られる。0.05μg用量のRSV sFは、50μgのRSV sFより統計的に低い増大をもたらし、GLA−SEを含む0.05μgのRSV sFは、GLA−SEを含む50μgのRSV sFより統計的に低い増大をもたらした。さらに、GLA−SE又はミョウバンの存在も、応答を増強する。5及び50μgRSV sF群のいずれも、GLA−SE又はミョウバンと混合した対応用量より統計的に低いレベルまでRSV sF特異的IgG力価を増大した。
第84日、すなわち免疫から24日後に、抗RSV sF特異的IgG1及びIgG2a血清力価を測定した(図44)。ナイーブマウスにおける以前の試験では、生RSV A2での感染によってTh1バイアス応答が得られたが、RSV sF単独又はミョウバンに吸着させたRSV sFによる免疫では、Th2バイアス応答がもたらされた。対照的に、本試験では、Th1バイアス血清陽性BALB/cマウスは、RSV sF単独又はミョウバンに吸着させたRSV sFによる免疫後、Th1バイアスを維持した。従って、事前に確立された宿主Th1スキューイングは、RSV sF又はRSV sF+ミョウバンを用いた免疫によって改変されなかった。
RSV sF単独、RSV sF+GLA−SE、RSV sF+ミョウバン又はRSVでの一次感染を用いた、RSVナイーブマウスでの事前の免疫試験では、攻撃から4日後に高いIFNγレベルが得られた。さらに、RSV sF単独、又はミョウバンに吸着させたRSV sFによって、RSV攻撃後にIL−5応答の誘導が起こったが、これは、これらの2つの群についてTh2バイアス応答を示すものである。本試験では、第88日、すなわち1×106PFUのRSV A2による攻撃から4日後に、肺においてIFNγ及びIL−5力価を測定した(図45)。ナイーブBALB/cマウスとは異なり、RSV sF又はミョウバンに吸着させたRSV sFを用いた免疫化によって、マウスは、RSV攻撃に応答してIL−5を誘導しなかったが、これは、血液中で測定したIgG1:IgG2aの比(Th1バイアスを示す)と一致するものであった。従って、RSV感染BALB/cマウスは、以前のRSV感染によって樹立されたTh1バイアス免疫応答を維持し、RSV sF単独又はRSV sF+ミョウバンでの免疫後に同じTh応答を呈示し続けると考えられる。
ナイーブBALB/cマウスモデルにおいて、攻撃から4日に、好酸球動員の代替免疫マーカとしてエオタキシン及びIL−13を測定したが、これは、ワクチン安全性の有望な指標である。これら事前の試験は、RSV sF単独又はRSV sF+ミョウバンの両方を用いた免疫によって、マウスは、RSV攻撃後にエオタキシン及びIL−13応答を取得したが、これは、一次RSV A2感染により誘導されるものより高かった。対照的に、RSV sF単独又はRSV sF+ミョウバンで免疫したRSV血清陽性マウスは、RSV攻撃後に、RSVに感染させたコホートを含む他のいずれの群より高いエオタキシン又はIL−13レベルを誘導しなかった(図46)。
IgG1/IgG2aデータ及び肺サイトカインデータのいずれも、ワクチン品目の製剤が、血清陽性マウスにおける既存のTh1バイアスに影響しないことを示唆している。RSV sF用量又はアジュバントの存在のいずれかによる影響がこれと異なることが判明した唯一の肺サイトカインは、ランテス(RANTES)であった(図46)。アジュバントを添加した全てのRSV sFワクチン品目が、RSV A2暴露後にランテス(RANTES)の発現を誘導したが、RSV sF単独で免疫した群では、誘導されたランテス(RANTES)のレベルは、RSV sFの量の増加と共に上昇した。
F特異的CD8T細胞の全身性リコール応答を免疫から11日後(第67日)及び攻撃から4日後(第88日)の両方で測定して、異なるワクチン品目によって誘発された応答の規模を比較した。CD8特異的RSV Fペプチドを用いて、脾細胞を36時間刺激した後、ELISPOTによりIFNγ分泌細胞を検出した(図47)。RSV sF単独、RSV sF+GLA−SE及びRSV sF+ミョウバンの場合、RSV sFの用量が増加すると、F特異的CD8T細胞の平均数も増加した。しかし、RSV sF単独又はRSV sF+GLA−SE若しくはミョウバンによって誘発された応答にほとんど差がなかった血清学の結果とは異なり、GLA−SEは、RSV血清陽性BALB/cマウスにおいてCMI応答を促進する上で優れたアジュバントとしてはっきりと区別された。
結果
典型的クロマトグラフィーにより精製したRSV sFを用いて、本試験では、生RSVで2回連続的に感染させた高度にRSV血清陽性のBALB/cマウスにおいて、血清学的応答に対するRSV sF用量(0.05〜50μgのRSV sF)の作用を特性決定した。比較的高いRSV FIgG及び中和RSV力価を呈示したRSV血清陽性マウスにおいて、アジュバントを含む、又は含まない1000倍範囲のRSV sF用量は、中和力価の増大にわずかな作用しかもたらさなかった。アジュバントを含む、又は含まない0.05μgの用量は、中和力価の増大に関して50μgの用量とほとんど同等に有効であった。試験した全てのワクチン品目が、中和力価を2〜5倍増大した。総RSV F特異的IgG力価については、GLA−SE又はミョウバンのいずれかを含むRSVの sFより高い用量が、0.05μgのRSV単独より高い増大を促進した。しかし、この差は、約5.7倍の増強という控えめなものであり、このことは、血清抗体の促進が、RSV血清陽性マウスにおいて、比較的少量のRSV sF単独 Fで達成できることをさらに示唆している。
生RSV A2への暴露前に、BALB/cマウスでは、Th1バイアス応答を誘発することから、既知のTh2スキューイングワクチン品目(例えば、非アジュバント添加RSV sF又はRSV sF+ミョウバン)が、Th1バイアスRSV応答をTh2バイアス応答に転換することができるかどうかを決定するのは興味深いことであった。血液中のIgG1/IgG2aの比、並びに攻撃から4日後の肺サイトカインプロフィールのいずれも、RSV sF単独又はRSV sF+ミョウバンでの免疫が、以前のRSV注射により確立された既存のTh免疫プロフィールを変化させないことを示唆している。強力なTh1バイアス化ワクチンであるRSV F+GLA/SEが、Th2バイアスRSV血清陽性高齢者集団において生み出す免疫応答のタイプは、まだ評価されていない。
本試験はまた、RSV sF用量並びにアジュバントを、それらがRSV血清陽性BALB/cマウスにおいてDC8T細胞応答を促進する能力についても特性決定した。ナイーブマウスにおいて認められたものと同様に、RSV sFの用量が大きいほど、小さいRSV sF用量より大きな規模の増大を促進した。さらに、RSV sF+GLA−SEは、同じ非アジュバント添加RSV sF又はミョウバン吸着RSV sFと比較して、最も高い増大をもたらした。
実施例2c:血清陽性コットンラットにおけるGLA−SEでアジュバント添加したRSV−Fサブユニットワクチン
この試験では、血清陽性コットンラットモデルを用いて、実施例2bで用いたものと類似のプロトコルに従い、RSV sF用量がどのように応答に影響するか、及びアジュバントが、応答を調節するかどうかを評価した。
手短には、第0日に、96匹のコットンラットに1e6pfuのRSVA2を鼻内経路で投与した。第28日に、下記組成物のうちの1つで、ラットを筋内免疫した:リン酸緩衝食塩水(PBS);PBS+GLA−SE;0.1μg、1.0μg若しくは10μgのRSV−sF;GLA−SEと製剤化した0.1μg、1.0μg若しくは10μgのRSV−sF;10μgのRSV−sF+GLA;10μgのRSV−sF+SE;10μgのRSV−sF+ミョウバン;又は生RSV A2。ラットを第14日、第28日、第38日、第49日及び第56日に採血した。次いで、第67日に、1×106 PFU RSV A2でラットを攻撃し、第71日に脾臓/肺を採取した。別の試験では、第0日に、1×106 PFU RSV A2を鼻内経路でラットに投与した。第28日に、下記化合物のうちの1つで、ラットを筋内免疫した:PBS;PBS+GLA−SE;10μgのRSV−sF;GLA−SEと製剤化した10μgのRSV−sF;10μgのRSV−sF+GLA;10μgのRSV−sF+SE;10μgのRSV−sF+ミョウバン;又は生RSV A2。第28日及び第38日にラットを採血した。
RSV A2F配列のアミノ酸1〜524を含むRSV Fタンパク質を安定CHOクローンから発現させて、典型的クロマトグラフィー法により精製した。RSV Fタンパク質は、>90%純粋であったが、これをラットの免疫及びELISAアッセイでの塗布の両方に使用した。ミョウバン(Alhydrogel,Accurate Chemical and Scientific,NJ)は、ワクチン用量当たり100μgで使用し、室温で30分の混合により、タンパク質に吸着させた。水性製剤中のGLAを用量当たり5μgで使用した。SEは、2%濃度で使用した。GLA−SEは、2%SE中5μgの用量で使用した。ワクチン製剤は全て、投与の2時間以内に調製した。
標準的ELISA技術を用いて、RSV−F特異的IgG抗体を評価した。高結合96ウェルプレートに精製RSV sFを塗布した。ブロック後、血清の連続希釈物をプレートに添加した。HRP結合ニワトリ抗コットンラットIgG抗体(Immunology Consultants Lab)を用いて、結合抗体を検出し、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB,Sigma,St.Louis,MO)を用いて展開させた。SpectraMaxプレートリーダにより450nmで吸光度を測定した後、SoftMax Pro(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いて分析した。力価は、1:1000血清希釈での吸光度として、又はブランクウェルの平均値の2倍のカットオフを用いたlog2終点力価として記録した。部位特異的抗体を競合ELISAアッセイにより定量した。手短には、高結合96ウェルプレートに精製RSV sFを塗布した。ブロック後、血清の連続希釈物を、部位A、部位B又は部位Cを認識した定濃度のビオチン化抗体と混合した(Beeler JA,van Wyke Coelingh K.Neutralization epitopes of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus:effect of mutation upon fusion function.J Virol.1989;63(7):2941−50)。代表的希釈率の個々の血清についての競合度(%)を計算した(100×[1−{血清OD/mAbOD平均}])。ナイーブマウス試験について既述したように、マイクロ中和力価を決定した。
結果
免疫前のベースライン抗体力価を決定するために、RSV感染から28日後、また免疫後の抗体力価の増大を測定するために、第38日、第49日及び第56日に、総RSV−F特異的IgG力価のレベルを測定した。第28日に、生RSV A2への1回の暴露後に有意なレベルのRSV F特異的IgGが認められた。第38日、第49日及び第56日についてのデータから、RSV sFでワクチン接種した全ての群が、用量とは関係なく、RSV sF特異的IgG力価を増大しており、増大は、アジュバントの存在によって有意に増強されなかったことが明らかである(図48)。第38日及び第49日に、1:1000希釈率の平均A450 OD値は全て、プラセボ免疫群及び生RSV A2への2回目の暴露を受けた群と比較してこれらの群で有意に高かった。第56日に、アジュバントを含まない0.1μgのRSV sF用量のみが、血清陽性/プラセボ群及び生RSV A2への2回目の暴露を受けた群と、統計的に相違しなかった。第38及び第49日の傾向は、100倍のRSV sF(10μg対0.1μg)によって、RSV sF±GLA−SEについて最も高いRSV sF用量でわずかに高い力価が得られることを示唆している。全体としてこれらのデータは、RSV sFの用量又はアジュバントの存在のいずれも、RSV sF特異的血清力価の増大に大きく影響しないことを示し、これは、血清陽性BALB/cマウスで得られた同様の結論を支持するものである。
ベースライン中和力価を決定するために第28日に、また免疫後の抗体力価の増大を測定するために、第38日、第49日及び第56日に、RSV中和抗体力価のレベルを測定した。第28日に、各血清陽性群の平均値は、少なくとも10log2であった(図49)。コットンラットは、RSV複製に対して、より許容性が高いため、RSVでの1回の感染後の中和力価によって、BALB/cマウスで観測されたものよりかなり高い平均力価が得られる。BALB/cマウスの場合、1×106PFUの生RSV A2での1回感染後の平均中和力価は、4log2〜6log2の範囲である。
第49日、すなわち免疫から21日後の中和力価は、力価が、11.4〜13.1の平均値まで増大したことを示す(図49)。RSV sF(10μg)コホートを除く全て群が、血清陽性/プラセボコホートより有意に高い力価まで増大した。非アジュバント添加群のいずれか、及びRSV sF+GLA−SE群のいずれかの間で、統計的差はなかったが、これは、0.1μgから10μgまでのRSVの用量の増加が、免疫後の平均中和力価に影響をもたらさなかったことを示している。
中和力価の増大の規模を評価するために、免疫から10日、21日及び28日後の各ラットについてベースラインの増加倍数を計算した(図50)。アジュバントを含むか、又は含まないRSV sFで免疫した全ての群が、血清陽性/プラセボワクチン接種群より高い幾何平均増加を有したが、データが広範囲なため、1μgのRSV sF+GLA−SE及び10μgのRSV sF+ミョウバンで免疫した群のみが、免疫から10日後、血清陽性/プラセボワクチン接種群より有意に高かった。免疫から21日後、10μgのRSV sF+ミョウバン群のみが、プラセボより有意に高かった。RSV sF(10μg)、RSV sF(1μg)+GLA−SE、RSV sF(10μg)+GLA−SE、RSV sF(10μg)+GLA及びRSV sF(10μg)+ミョウバンは、4倍以上の幾何平均増加を示した。中和力価におけるこの低から中程度の増大は、恐らく、10log2という高いベースラインによるものであろう。この力価は、コットンラットにおいて最大限の達成可能なRSV力価に近い。これらのデータ全体は、アジュバントを含むか、又は含まないRSV sFの用量が、中和力価の増大にわずかな影響しかもたらさないことを示し、これは、総RSV sF特異的IgGの結果を支持するものである。わずかな増大は、恐らくベースライン力価が、コットンラットにおいて最大限の達成可能なRSV力価に近かったことによるものであろう。同様の結論は、BALB/c血清陽性マウスモデルにおいても得られた。
RSV Fタンパク質に特異的な中和モノクローナル抗体(Mab)を作製し、次の3つの主要部位にマッピングした:部位A、部位B及び部位C(Beeler JA,van Wyke Coelingh K.Neutralization epitopes of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus:effect of mutation upon fusion function.J Virol.1989;63(7):2941−50)。免疫後のコットンラットにおいて部位A、部位B又は部位Cに対して産生された抗体の相対量を測定するために、1つの部位A Mab(Synagis(登録商標))1つの部位B(1112)及び1つの部位C Mab(1331H)を各々、競合ELISAで使用した(図51)。これらの平均値は、RSV sF単独及びアジュバントのいずれかを含むRSV sFの両方が、プラセボ又はRSV A2への2回目の暴露より良好に、特異的中和部位に対する抗体応答を促進することを示唆している。このアッセイでは、GLA−SEを含むか、又は含まない0.1、1.0及び10μgのRSV sFコホートの間の差は、有意に相違しないが、これらの傾向は、より高い用量のRSV sF及びアジュバントの存在が、部位特異的抗体応答を促進する上で有益となりうることを示唆している。
2回目の血清陽性コットンラット試験において、免疫前のベースライン抗体力価を決定するために、RSV感染から28日後に、また、免疫後の抗体力価の増大を測定するために、第38日に、総RSV F特異的IgG力価のレベルを測定した。第28日に、生RSV A2に対する1回の暴露後、有意なレベルのRSV F特異的IgGが認められた(図48)。全ての群が、13.4〜14.7log2の平均力価に到達する。第38日のデータは、アジュバントとは関係なく、RSV sFでワクチン接種した全ての群が、プラセボ(PBS+GLA−SE)又は2回目の用量のRSV A2より有意に高いレベルの力価までRSV sF特異的IgGを増大した。
血清IgG力価の増大の規模を評価するために、免疫から10日後の各ラットについてベースラインの増加倍数を計算した(図49)。アジュバントを含むか、又は含まないRSV sFで免疫した全ての群が、4倍超の幾何平均増加を有し、12.0〜25.0であった。ナイーブ及び血清陽性/プラセボ群、並びに2回目用量のRSV A2を受けた群などの対照群は、血清力価に増大がなく、算出された増加倍数は2に満たなかった。
ベースライン中和力価を決定するために、第28日に、また、免疫後の中和抗体力価の増大を測定するために、第38日に、RSV中和抗体力価のレベルを測定した。各血清陽性群の第28日の平均値は、少なくとも9log2であり、9.0〜9.5log2の範囲であった(図50)。前の血清陽性コットンラット試験では、第28日の平均中和力価は、10.1〜11.7であった。コットンラットは、RSV複製に対して、より許容性が高いため、RSVでの1回の感染後の中和力価によって、BALB/cマウスで観測されたものよりかなり高い平均力価が得られる。BALB/cマウスの場合、1×106PFUの生RSV A2による1回の感染後の平均中和力価は、4log2〜6log2の範囲である。
第38日、すなわち免疫から10日後の中和力価は、力価が、12.3〜13.9の平均値まで増大したことを示す(図50)。前の血清陽性コットンラット試験でも、同様の免疫力価が観測された。全てのRSV sF群が、プラセボ群より有意に高い力価まで促進された。血清IgG力価のデータとは異なり、生RSV A2群も、プラセボ群より有意に高い中和力価の増大を有した。さらに、RSV sF+GLA−SE、RSV sF+GLA、及びRSV sF+ミョウバン群は、RSV A2より高い力価まで促進された。中和力価の増大の規模を評価するために、免疫から10日後の各ラットについてベースラインの増加倍数を計算した(図51)。アジュバントを含むか、又は含まないRSV sFで免疫した全ての群が、8.1〜21.9の平均増加倍数を有し、血清IgG力価で認められた増加倍数と類似する範囲であった。前の血清陽性コットンラット試験とは違い、中和力価の増大は、出発ベースライン力価が、10log2に対し9log2と低く、また、各群のばらつきもこの試験の方が小さかったため、観測しやすかった。これらのデータ全体は、平均RSV sF+アジュバントの中和力価が、RSV sF単独よりわずか2〜3倍高かったことから、アジュバントの存在は、中和力価の増大にわずかな影響しかもたらさないことを示している。これらのデータはまた、総RSV sF特異的IgGデータを支持している。血清陽性BALB/cマウス試験でも同様の結論が得られている。
RSV Fタンパク質に特異的な中和モノクローナル抗体(Mab)を作製し、次の3つの主要部位にマッピングした:部位A、部位B及び部位C(Beeler JA,van Wyke Coelingh K.Neutralization epitopes of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus:effect of mutation upon fusion function.J Virol.1989;63(7):2941−50)。免疫後のコットンラットにおいて部位A、部位B又は部位Cに対して産生された抗体の相対量を測定するために、1つの部位A Mab(Synagis(登録商標))1つの部位B(1112)及び1つの部位C Mab(1331H)を各々、競合ELISAで使用した(図51)。RSV sF単独及びアジュバントのいずれかを含むRSV sFの両方が、プラセボ又はRSV A2への2回目の暴露より良好に、上記の特異的中和部位に対し抗体応答を促進した。唯一の例外は、RSV sF+SEであり、この場合、部位B力価の増大が、2回目の用量のRSV A2より有意に高かったが、プラセボ群より統計的に高くなかった。興味深いことに、2回目の用量のRSV A2が、プラセボ群より有意に高く力価を増大した唯一の部位は、部位Cであった。
結論
典型的に精製したRSV sFを用いて、この試験では、RSV血清陽性コットンラットにおける血清学的応答に対する100倍の範囲(0.1〜10μgのRSV sF)にわたるRSV sF用量の作用並びにアジュバントの作用を特性決定した。ナイーブ動物モデルとは違い、RSV sF用量は、アジュバント添加又は非添加のいずれで投与しても、総IgG、部位特異的応答又は総中和力価の増大の規模に対する作用は、最小から皆無であった。同様に、最も高いRSV sF用量で、アジュバントのいずれが存在しても、応答の規模をそれ以上高めることに対する作用は、ほとんどないから皆無であった。
実施例3:ナイーブスプラーグ・ドーリー(Sprague Dawley)ラットにおけるRSV−sF免疫原性
本試験は、薬剤及びワクチン開発において毒性試験に常用的に用いられるモデルであるスプラーグ・ドーリーラットにおいて、RSV−sFワクチン製剤の免疫原性を評価した。この試験の目標は、以下の通りである:(A)非ワクチン接種スプラーグ・ドーリーラットが、肺及び鼻においてRSV A2複製を支持することを確認し、ピークRSV複製の日を明らかにすること;(B)2.5μg/2%SEのGLA−SEを含む10μg又は100μgのRSV sFを投与したとき、ナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおけるF特異的体液性、細胞性、及び防御性免疫応答のレベルを定量すること;(C)RSV sFの用量が、ナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおけるRSV−sF誘導の体液性、細胞性、及び防御性免疫応答のレベルに影響を与えるかどうかを決定すること;並びに(D)GLA−SE活性が、ナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおける体液性、細胞性、及び防御性免疫応答を誘導するのに必要かどうかを明らかにすること。
鼻内接種後の鼻及び肺におけるRSV A2のウイルス複製をこの動物モデルで明らかにした。RSV sFタンパク質を安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞から生産して、カラム精製した。第0日及び第22日に、非アジュバント添加又は2.5μg/2%用量のGLA−SEでアジュバント添加した10μg若しくは100μgのRSV sFを、雌スプラーグ・ドーリーラットに筋内投与し、全てのラット(n=4〜6/群)においてワクチン接種から14、22及び42日後に、血清学的抗F抗体応答及びRSV中和抗体応答を測定した。全てのラット(n=3〜4/群)において、第46日、すなわちRSV攻撃から4日後に、F特異的T細胞応答を測定した。攻撃から4日後に肺及び鼻からのRSVのクリアランスにより、RSV攻撃後の局所防御免疫を明らかにした。この試験から、RSV−F特異的細胞性免疫応答が、アジュバント添加及び非添加の抗原の用量の両方によって誘導されたが、RSV−F特異的細胞性免疫応答は、抗原及びアジュバント依存的であったことが判明した。スプラーグ・ドーリーラットにおいてRSV sF+GLA−SEワクチン候補により誘導された体液性及び細胞性免疫応答は、肺及び鼻の両方で、RSV攻撃からの完全な防御をもたらす。
ワクチン組成物は、筋内注射による投与のために、グルコピラノシルリピドA/安定エマルジョン(GLA−SE)をアジュバント添加した精製RSV可溶性F(sF)タンパク質(Immune Design Corporation,Seattle,WA)を含有した。組換えRSV sFタンパク質を安定なクローンチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株から作製した。典型的なカラム精製方法を用いて、本試験のためにRSV sFを精製した。
理想的な毒性試験動物種は、(i)ワクチン抗原及びアジュバントに対し、全ての重要な免疫学的応答で応答し、(ii)ワクチン標的病原体に対して感受性であり、しかも(iii)十分なヒト用量の送達に適合するものである。毒性学モデルは、F特異的体液性免疫応答、F特異的T細胞応答を呈示すると共に、非ワクチン接種状態ではRSV感染に対して許容性であるが、いったんワクチン接種されたら、RSV攻撃から防御されるものでなければならない。スプラーグ・ドーリーラットは、最大500μLを筋内投与することができる標準的毒性試験種である。この試験では、ナイーブスプラーグ・ドーリーラットにおいてRSV A2株の複製を確認し、RSV−sFが、RSV攻撃から防御する体液性及び細胞性免疫を誘導し、従って、RSVワクチン候補を評価するために好適な毒性試験モデルの全ての基準を満たすことをみいだした。
RSV A2複製を確認し、ナイーブラットにおいてRSV A2感染後のピークウイルス力価の日を決定するために、最初の試験を実施した。5コホートのRSVナイーブ雌SDラットを、2×106pfuのRSV A2に鼻内感染させた。感染から1、4、6、8、及び14日後、群当たり5匹の安楽死させたラットから肺及び鼻を個別に採取し、同じ日に均質化した後、プラークアッセイによりRSVについて力価測定した。この試験から、ピークウイルス複製の日が、RSV感染から4日後であることが判明した。この試験では、それ以外のアッセイは実施しなかった。
続く試験では、RSV−SFのプライム−ブーストレジメン後の免疫原性及び防御を評価した。40匹のナイーブ雌スプラーグ・ドーリーラットを、コホート当たり5〜6匹の指定ワクチンコホートに分けた。手短には、試験群に、アジュバントなしのRSV sF(1匹当たり10μg若しくは100μg)又はGLA−SE(2%SE中2.5μg)を含むRSV sF(1匹当たり10μg若しくは100μg)を投与した。負の対照群にプラセボ(PBSバッファー)又はRSV sFなしのアジュバントGLA−SE(2%SE中2.5μg)を投与した。正の対照群には、2×106pfuの生RSV A2を鼻内接種した。第1〜6群には、第0日及び第22日に、500μLの指定ワクチン品目をIM接種し、第7群には、第0日にのみ、200μLのRSV A2ウイルスをIN接種した。第42日に、全てのラットを2×106pfuの生RSV A2ウイルスでIN攻撃した。試験1から決定したピークウイルス複製の日である第46日、すなわち攻撃から4日後にラットを安楽死させた。肺(ホルマリン固定した1肺葉を除く)及び鼻を均質化した後、ウイルス力価のために定量した。
接種後のラットの直接観察、及び試験期間中毎週3回ラットの体重を追跡することにより、アジュバント添加ワクチン製剤の反応原性を評価した(データは示していない)。
免疫から6時間後、全てのラットについて第22日及び第42日に、また群当たり3匹のサブセットについては第14日に、ワクチン接種に対する血清学的応答を評価した。ラットをイソフルランで軽度に麻酔した後、眼窩内採血した。血清を分離し、−20℃で保存し、試験のために解凍した。免疫から6時間後に得られた血清を、多重ELISAにより、サイトカイン力価について評価した。総抗F IgG ELISA終点希釈力価について、第14、22、及び42日からの血清を測定した。第42日の血清を、ELISA終点希釈力価により、IgG、IgG2a、及びIgG2b抗F応答の特異的寄与について評価した。RSV A2−GFPマイクロ中和アッセイにより、第22及び42日に、血清RSV中和力価を決定した。
ワクチン接種に対する全身性細胞免疫応答を、第46日、すなわちRSV攻撃から4日後に全ての利用可能なラットにおいて評価した。群の各々について、個別の脾細胞サンプルを調製した。RSV sFを用いた36〜48時間の再刺激後にIFNγ分泌細胞のELISPOT数により、T細胞読み出しを評価した。有意性は、p<0.05の有意性カットオフを用いたテューキー(Tukey)又はボンフェローニ(Bonferroni)ポストテストのいずれかと共に、GraphPad Prism一元配置分散分析(1−way ANOVA)を用いて計算した。
500μL用量中に要望される最終量の抗原及びアジュバントを達成するように、IM投与用の試験品目を製剤化した。添加の順序は以下の通りである:PBSを最初に添加し、次にGLA−SEアジュバント(使用する場合)を1:3最終希釈で添加後、RSV sF抗原(使用する場合)を1:500最終希釈(10μg用量の場合)又は1:50最終希釈(100μg用量の場合)のいずれかで添加する。製剤化した試験品目を30秒間ボルテックスすることにより混合した後、動物に投与するまで最大15時間4℃で保存した。保存した試験品目は、動物への投与のためにACFスタッフへの引き渡し前に、ボルテックスにより完全に混合した。
IN接種及び攻撃用の生RSV A2は、動物への投与の1時間未満前に調製した。RSV A2アリコートを氷上で解凍した。200μL中2×106pfuの用量の場合、1.66×107pfu/mLの120.4μLウイルス原液を79.6μLのOptimem及び1×SPで希釈した。平均300μLを調製し、動物への接種のためにACFスタッフに引き渡した。
残りのワクチン製剤は、抗FmAb(パリビズマブ)を用いたウェスタンブロット分析に付すことにより、負の対照におけるRSV sFの欠失と、第3及び5群並びに第4及び6群における等量のRSV sFの存在を確認した(データは示してない)。ウェスタンブロット分析により消費されなかった全ての試験品目は破棄した。
論考
スプラーグ・ドーリーラットの肺及び鼻におけるRSV A2株複製の時間経過を調べる最初の試験では、25匹のラットを第0日に2×106pfuのRSV A2ウイルスでIN攻撃した。第1、4、6、8、及び14日後に採取し、均質化した肺及び鼻においてRSVウイルス力価を測定した。第1、4、及び6日に、全ての試験ラットにおいて、RSVウイルス複製を検出したところ、肺及び鼻の両方で第4日にピークに達した(図30)。攻撃から4日後に、肺の平均約105pfu/g、及び鼻ホモジネートの約103.4pfu/gのピークウイルス負荷を検出した。第6日までに、ウイルス力価は約半分減少した。第8日には、5匹のうち1匹だけが肺にいく分の検出可能なウイルス力価を有したが、このラットの鼻には検出可能な力価が認められなかった。従って、スプラーグ・ドーリーラットにおけるRSV sFワクチン攻撃試験の場合、肺及び鼻をRSV攻撃から4日後に採取したが、それが、ピークウイルス複製の日を呈示した。
ワクチンを調製し、第0日に全てのラットに投与した。第1〜6群は、第22日に追加(ブースタ)ワクチンを受けた。全てのワクチンは、良好な耐容性を示し、いずれの群にも注射部位の反応は報告されなかった。動物の体重を追跡し、初期出発体重からの群変化率(%)として表示した。一般に、ラットは、試験期間中急速に増量し、投与したワクチン製剤とは関係なく接種後の体重減少はなかった。しかし、次の3匹は、採血前に投与したイソフルオラン麻酔のために試験期間にわたって体重が減少した:第0日に接種から6時間後の時点で第5群から2匹、及び第14日に第3群から1匹。
GLA−SEは、マウス、モルモット、ウサギ、サル、及びヒトにおいて活性を示したが、ラットではこれまで評価されていないTLR−4刺激アジュバントである。TLR4アゴニストのモノホスホリルリピドA(MPL)含有ワクチン製剤は、ワクチン接種から最初の6時間以内にマウスの血清中に検出可能なレベルのIL−6及びMCP−1を誘導することが報告されている(Didierlaurent et al,ASO4,an aluminum salt− and TLR4 agonist−based adjuvant system,induces a transient local immune response leading to enhanced adaptive immunity.J Immunol.2009;183:6186−97)。上記及び他の血清サイトカインは、BALB/cマウスにおいて、GLA−SE投与から6時間後までに、一貫して観測された。GLA−SEが、スプラーグ・ドーリーラットにおいて自然免疫刺激活性を有するかどうかを決定するために、IL−6、MCP−1、MIP−1β、及びKCなどのサイトカインの血清レベルを、免疫から6時間後、ビーズベースの多重ELISAアッセイにより評価した。これらのサイトカインの各々について、GLA−SE依存性血清サイトカイン応答を観測した(図31)。血清中に検出されたこれらのサイトカインのうち最大量のものは、好中球走化性因子のKC(CXCL1)であり、続いて、単球走化性因子MCP−1(CCL2)及びMIP−1α(CCL3)並びに多能性サイトカインIL−6であった。IL−1β及びTNFαなどの複数の別のサイトカインも調べたが、GLA−SEによって調節され、かつアッセイベースラインを超えて検出可能であったサイトカインしか示していない。
誘導されたF指向抗体応答をワクチン接種後の第14日、22日、及び42日に評価し、各ワクチンコホートについて対照と比較した(図32)。各時点で、RSV sF+GLA−SE群の応答は、それらの対応する非アジュバント添加RSV sF群より有意に高かった。GLA−SEアジュバント添加RSV sFコホートだけが、生RSVが達成したものより高い血清抗FIgG終点力価を生成し、第42日には、この差は、RSV sF+GLA−SE両群について有意であった。しかし、どの時点でも、非アジュバント添加又はアジュバント添加にかかわらず、10及び100μgのRSV sFにより誘導されるIgG力価に有意な差はなかった。これらの結果から、スプラーグ・ドーリーラットにおける血清抗FIgG力価の誘導は、10から100μgまでRSVの用量を増加することによって影響されないが、GLA−SEアジュバント添加により増強されたことがわかる。
第42日の血清F特異的抗体は、ワクチン接種後のTヘルパー型均衡の指標として、IgG1、IgG2a、及びIgG2bアイソタイプについても評価した。F特異的IgG1力価(Th2型サブタイプ)及びF特異的IgG2a及びIgG2b力価(Th1型サブタイプ)はいずれも、第42日に、アジュバント添加RSV sFワクチン又は生のRSV sF A2を受けたラットに存在した(図33)。IgG2a力価は、生RSV群においてIgG1力価と同等であったが、これは、Thバイアスが、ラットにおいてマウスほど明瞭に確定されていない可能性を示唆している。しかし、IgG2b力価は、生RSV A2を受けたラットのIgG1力価より高く、これは、Th1応答と一致している。非アジュバント添加RSV sFを受けたラットは、IgG2b力価より高いIgG1力価を示し、これは、Th2応答と一致する。RSV sF+GLA−SEでワクチン接種したラットは、同じ用量で非アジュバント添加RSV sF群と比較して、全てのアイソタイプで高いレベルを示した。全体として、IgG2b力価の増加(約64倍)は、GLA−SEを投与された群におけるIgG1力価の増加(約16倍)より高かった。これは、GLA−SEが、スプラーグ・ドーリーラットにおいて、RSV sFに対し、よりTh1バイアスの免疫応答を促進すること示唆している。
RSVワクチンの重要な機能性読み出し情報である、血清RSV中和力価を第22日(用量1から22日後)及び第42日(用量2から20日後)に評価した。第22日の免疫ラットの様々な群についてのGMT log2IC50血清中和力価は、プラセボ群の2.96から、sF(100μg)+GLA−SE群の9.47の範囲であった(図34)。非アジュバント添加RSV sFワクチンを投与したラットは、第22日のプラセボと有意に変わらないRSV中和力価を示した。対照的に、第22日の高い中和力価が、GLA−SEアジュバント添加RSV sFワクチン群(log2GMT8.89〜9.47)及び生RSV群(log2GMT8.1)によって達成され、これらは、負の対照群又は対応する非アジュバント添加RSV sF群で観測されたものより有意に高かった。第22日(log2GMT8.89〜9.47)と比較して、第42日にRSV sF+GLA−SE群においてRSV中和力価の10〜20倍の増強(log2GMT13.25〜12.86)が観測されたように、中和抗体力価は、2回目用量のワクチンで増大した。同様に、第42日時点では、RSV sF+GLA−SE免疫群は、負の対照及び対応する非アジュバント添加RSV sFペアの両方と比較して、有意に高い中和力価も呈示した。生RSV群もまた、負の対照と比較して、有意に高い中和力価(log2GMT9.41)を示した。興味深いことに、この試験において、ワクチン誘導血清中和力価に関するRSV sF用量依存性は認められなかった。
全身性F特異的T細胞免疫応答は、RSV−SFワクチンのもう一つの重要な機能性応答である。第46日、すなわちRSV攻撃から4日後に、各群(n=4〜6)における個々のラットから脾細胞を採取した。RSV sFタンパク質再刺激を用いて、IFNγELISPOTにより評価した。プラセボ群、アジュバント単独群、及び非アジュバント添加RSV sF群(10及び100μg)は、同等のF特異的応答(それぞれ、61.07、47.73、64.00、及び87.78SFU/百万個の細胞)を示した。しかし、GLA−SEアジュバント添加RSV sF群(10及び100μg)、並びに生RSV群は共に、プラセボ群より有意に高いG特異的IFNγELISPOT応答(それぞれ、259、362.67、及び258.13SFU/百万個の細胞)を示した(図35)。これは、RSV−SFが、スプラーグ・ドーリーラットにおいて、GLA−SE依存的様式で、RSV sFに対するT細胞応答をプライミングし得ることを示した。T細胞のサブタイプ(CD4又はCD8)は、このアッセイから決定することはできなかったが、RSV sFタンパク質などの外来抗原は、CD4応答を再刺激する可能性が高い。
RSV攻撃からの防御は、ワクチン接種に対して測定された免疫応答が、in vivoでRSV複製を中和する上で有効であることを示すものである。ワクチン接種後、全ての群を第42日に2×106pfuのRSV A2ウイルスで鼻内攻撃した。第46日(攻撃から4日後)に採取して、均質化した肺及び鼻においてRSVを力価測定した。肺におけるウイルス複製は、全ての負の対照ラットで予測されたが、これは、本試験では、初期のウイルス複製経時試験ほど一貫していなかった。本試験では、5匹のプラセボラットのうち3匹と、5匹のアジュバントのみのラットのうち3匹しか攻撃後の肺に検出可能なRSVを示さなかった(図36)。鼻における複製の方が、予測した結果と一致しており、5匹のプラセボラットのうち5匹と、5匹のアジュバントのみのラットのうち4匹に検出可能なRSVウイルス負荷が認められた。プラセボウイルス力価は、肺において102.30(平均LOD100.94)及び鼻において102.62(平均LOD100.60)であった。非臨床動物モデルにおける有意なRSV防御は、ワクチン接種及びプラセボラット間で、歴史的に≧102として定義されているが、この差は、プラセボラットにおける低レベルの複製によって得られたわけではない。しかし、生RSV A2への事前の感染によって、この群における全ての攻撃ラットの上下気道におけるRSV複製が完全に阻害され、6匹中6匹が、肺又は鼻においてアッセイLODを超えるウイルス力価を示さなかった。RSV sF(10μg)+GLA−SEにおいても、4匹の全てが、上下気道の両方でRSV攻撃から完全に防御された。RSV sF(100μg)+GLA−SEワクチン接種は、6匹のうち5匹の肺及び6匹のうち4匹の鼻においてウイルス複製を阻害した。対照的に、非アジュバント添加RSV sF(10又は100μg)は、プラセボ又はGLA−SE単独でワクチン接種したラットと同じ幅のウイルス力価を示し、群当たりわずか1〜2匹が検出限界に満たない力価を有した。このデータは、スプラーグ・ドーリーラットにおけるRSV−SFワクチン接種の防御効果と一致している。
結論
この試験から、2%GLA−SE中の2.5μgを含む10又は100μgのRSV sFによるプライム−ブースト接種が、RSV攻撃からのスプラーグ・ドーリーラットを防御したRSV−F特異的体液性及び細胞性免疫を誘導することが判明した。F特異的IgGは、RSV−SFでの単回接種から14日後という早期に検出可能であり、第42日までにTh1様(IgG2b>IgG1)として特性決定された。RSV中和抗体の有意な力価が、RSV−SFでの単回接種後第22日までに検出可能であり、これは、RSV−SFでの2回目の接種によって増大された。両方のRSV−SF免疫コホートにおいて、攻撃後にF特異的T細胞応答が検出された。RSV sFの高及び低用量では、同等の体液性及び細胞性免疫応答が得られたが、GLA−SEの存在は、体液性応答を有意に増加し、これは、RSV sFに対する細胞性応答に不可欠であった。GLA−SEは、接種から6時間後の血清中のIL−6、KC、MCP−1、及びMIP−1αなどのサイトカインの検出により立証されるように、ラットにおいて自然免疫刺激能力を有する。ワクチンに対する自然応答は、体重の減少又は注射部位反応を一切引き起こさなかった。単独で投与したGLA−SEは、RSV sF+GLA−SEと類似する自然免疫刺激能力を有したが、これは、RSV特異的体液性及び細胞性応答を誘導せず、しかもRSV攻撃からの防御もしなかった。従って、スプラーグ・ドーリーラットは、RSV−SFの安全性を評価する上で好適な毒性試験動物モデルである。
図37A及びBは、様々な組成物の注射耐容性を示すグラフである。(A)ワクチン接種したコットンラットの体重変化;及び(B)ワクチン接種したスプラーグ・ドーリー(SD)ラットの体重変化。sF+GLA−SEワクチンは、コットンラット(CR)及びスプラーグ・ドーリー(SD)ラットにおいて、許容可能な反応原性を有する。ワクチン接種後、部位応答はなく、<5%の体重減であった。
実施例4:非ヒト霊長類免疫原性データ
アジュバント添加RSV sFワクチンは、非ヒト霊長類において長期持続F特異的体液性及び細胞性免疫を誘導する
カニクイザルは、毒性試験に一般に使用される非ヒト霊長類(NHP)種であり、アジュバント添加RSV sF候補ワクチンに対する免疫応答に関して調べた。この非GLP試験では、カニクイザルにおいて、筋内投与したRSVワクチン候補(2%安定エマルジョン(SE)アジュバント中のTLR4アゴニストグルコピラノシルリピドA(GLA)と共に製剤化した精製可溶性F(sF)タンパク質から成る)の免疫原性をsFタンパク質単独の場合と比較した。4匹のNHPからなる第1群(第1群)は、アジュバントを含まない100μgのRSV sFで免疫し、4匹のサルからなる第2群(第2群)は、2%SE中の5μgGLAアジュバントと共に製剤化した100μgのRSV sFで免疫した。第0及び第28にサルを免疫し、試験前の第−7日から第169日まで体液性及び細胞性免疫についてモニターした。続いて、第169日に、非アジュバント添加(第1群)又はアジュバント添加ワクチン(第2群)のいずれかでNHPにそれぞれ追加免疫し、さらに14日間(第183日まで)追跡して、長期記憶応答を評価した。
ワクチン誘導の抗FIgG力価及びRSV中和抗体(Ab)応答の両方に関して、血清学的応答を評価した。両群の全ての動物が、免疫前に検出限界に満たない抗FIgG又はRSV中和力価を有し、これらがRSV血清陰性であることを示していた。RSV sFタンパク質ELISAによって、抗FIgG力価を決定した。第42日の応答のピークで、RSV sF単独を受けた第1群(10.45±2.68log2)より、GLA−SEを含むRSV sFを受けた第2群(15.67±0.53log2)の方が、幾何平均抗FIgG力価が有意に高かった(p=0.032)(図57)。RSV sF特異的IgG Ab力価は、両群共に時間経過により低下した(第2群で12.85log2に、また第2群で10.13log2に)が、検出可能な応答は、第169日、すなわちワクチン接種から5か月後まで依然として観測され、この時点で、追加ワクチン接種を実施した。リコールから14日後の第183日に、sF単独群(幾何平均12.55±2.16log2)と比較して、sF+GLA−SE群(幾何平均15.86±0.85log2)で、より高い応答がまた観測された。sF+GLA−SE群の全ての動物が、第169日と比較して第183日で≧4倍のIgG力価増加を示したのに対し、sF単独群では4匹のうち2匹のみが、第169日と比較して第183日で≧4倍のIgG力価増加を示した。これらのデータから、GLA−SEがいずれも、sF単独と比較して、sFに対するIgG応答を増強し、カニクイザルNHPモデルにおいて、免疫に対するより均質な応答をもたらすことが明らかである。
sFへのGLA−SEの添加により、血清RSV中和力価も増強されたかどうかを決定するために、緑色蛍光タンパク質(RSV A2−GFP)を発現するように操作したRSV A2株によるVero細胞の感染を中和するのに必要なlog2IC50血清希釈力価に関して、RSV中和Abレベルを測定した。第42日の応答のピークで、RSV sF単独を受けた群(3.52±1.14log2)と比較して、GLA−SEを含むRSV sFを受けた群(6.36±1.42log2)の方が、幾何平均RSV中和Ab力価が有意に高かった(p=0.022)(図58)。第42日に、RSV sF+GLA−SE群における4/4匹が第−7日レベルから中和力価の4倍増大を示したが、RSV sF単独群では1/4匹しか中和力価の4倍増大を示さなかった。RSV中和Ab力価は、両群で時間経過と共に低下した(第169日に、第2群で3.60log2に、また第1群で2.97log2に)。第169日、すなわちワクチン接種から5か月後に、追加ワクチン接種を実施した。3回目の免疫から14日後の第183日に、sF単独群(幾何平均4.46±1.79log2)と比較して、sF+GLA−SE群(幾何平均6.70±1.03log2)で、より高い中和Ab力価が観測された。これらのデータから、sFへのGLA−SEの添加によって、F特異的IgG及びRSV中和Ab応答の両方の規模及び持続時間のいずれも増加することがわかる。
GLA−SEと共に製剤化したsFによる免疫が、F特異的T細胞応答を増強するかどうかを決定するために、RSV Fタンパク質配列由来の重複15−merのペプチドプールで再刺激した後、ELISPOTによりF特異的IFNγT細胞応答を測定した。第42日の応答のピークで、RSV sF+GLA−SE群の全4匹のNHPが、試験前ベースライン(第−7日)からの50スポット形成数(SFC)/百万PBMCの最低増加及び第−7日からのSFC/百万PBMCの最低4倍増加として定義される陽性応答を示したのに対し、RSV sF単独群の4匹のサルのうち陽性応答を示したのは0匹であった。第42日に、sF+GLA−SE群の平均応答は、392SFC/百万PBMCであり、F単独群(8SFC/百万PBMC)より有意に高かった(p=0.019)(図59)。sF+GLA−SE群のT細胞の数は、時間経過と共に減少したが、1匹だけは、第169日まで陽性応答の定義を満たした。第169日、すなわちワクチン接種から5か月後に、追加ワクチン接種を実施した。3回目の免疫から14日後の第183日に、応答が衰えていたsF+GLA−SE群の3匹でIFNγ細胞が有意に高くなったため、sF+GLA−SE群では合計応答率4匹中4匹を達成した(平均261SFC/百万PBMC)。これに比べ、sF単独群でIFNγ分泌F特異的T細胞の増加を伴って応答したのは、4匹中0匹であった(平均5SFC/百万PBMC)。
結論として、頑健な血清抗FIgG応答、RSV中和応答、及びF特異的IFNγT細胞応答が、非アジュバント添加sF単独での免疫群で観測されたものより有意に高いレベルでsF+GLA−SE免疫動物において観測された。これらの応答は、2回目の免疫から2週間後にピークに達し、ワクチン接種後3〜5か月にわたって検出可能なまま維持され、この時点で3回目の免疫により、同等又はそれより高いレベルに促進された。これらの試験から、RSV sF+GLA−SEのタンパク質サブユニットワクチンが、非ヒト霊長類において、RSVに対して頑健かつ長く持続する体液性及び細胞性応答を誘導することができることがわかる。
参照による組み込み
特許、特許出願、論文、テキストブックなど、並びにこれらに引用される参照文献を含む、本明細書に引用した全ての参照文献は、それらがまだされていない範囲まで、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
均等物
以上記載した明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。以上の説明及び実施例は、本発明の好ましい実施形態を詳しく述べている。しかし、本発明は、多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びそのあらゆる均等物に従って解釈すべきである。

Claims (83)

  1. 少なくとも約1μg及び最大約200μgのRSV可溶性Fタンパク質と、脂質Toll様受容体(TLR)アゴニストを含む少なくとも約1μg及び最大約20μgのアジュバントとを含有するワクチン組成物。
  2. 前記RSV可溶性Fタンパク質が、C末端膜貫通ドメインを欠失している、請求項1に記載のワクチン組成物。
  3. 前記RSV可溶性Fタンパク質が、細胞質尾部ドメインを欠失している、請求項1又は2に記載のワクチン組成物。
  4. 前記RSV可溶性Fタンパク質が、ヒト株A2(配列番号2)由来のRSV可溶性Fタンパク質のアミノ酸1〜524を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  5. 前記RSV可溶性Fタンパク質が、配列番号7を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  6. 前記アジュバントが、(TLR)4アゴニストを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  7. 前記アジュバントが、合成ヘキシル化リピドA誘導体を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  8. 前記アジュバントが、グルコピラノシルリピドA(GLA)を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  9. 前記アジュバントが、下記式:
    Figure 2016516755
    (式中、R1、R3、R5及びR6は、C11〜C20アルキルであり;R2及びR4は、C12〜C20アルキルである)
    を有する化合物を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  10. 前記アジュバントが、安定した水中油形エマルジョン中のGLA(GLA−SE)を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  11. 前記アジュバントが、安定化したスクアレンベースエマルジョン中のGLAを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  12. 前記アジュバントが、少なくとも約1%及び最大約5%の濃度を有する安定化水中油形エマルジョン中のGLAを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  13. 前記アジュバントが、少なくとも約50nm及び最大約200nmの平均粒度を有する安定化水中油形エマルジョン中のGLAを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  14. 少なくとも約5μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  15. 少なくとも約10μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  16. 少なくとも約20μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  17. 少なくとも約30μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  18. 少なくとも約50μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  19. 少なくとも約100μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  20. 少なくとも約2.5μgのアジュバントを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  21. 少なくとも約5μgのアジュバントを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  22. 約10μg〜約100μgのRSV可溶性Fタンパク質と、約1μg〜約5μgのGLA−SEとを含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  23. 約10μg〜約100μgのRSV可溶性Fタンパク質であって、RSV可溶性Fタンパク質は、ヒト株A2(配列番号2)由来のRSV可溶性Fタンパク質のアミノ酸1〜524を含む、RSV可溶性Fタンパク質と、濃度約1%〜5%の安定化水中油形エマルジョン中の約1μg〜約5μgのGLAとを含む、請求項1に記載のワクチン組成物。
  24. 薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  25. 非経口投与のために製剤化される、請求項1〜23のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  26. 筋内投与のために製剤化される、請求項1〜24のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  27. 皮下投与のために製剤化される、請求項1〜24のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  28. 約50μl〜約500μlの量を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  29. 哺乳動物において呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染症を予防する方法であって、以下:少なくとも約1μg及び最大約200μgのRSV可溶性Fタンパク質と、前記哺乳動物においてRSV感染症を予防するのに十分な脂質Toll様受容体(TLR)アゴニストを含む少なくとも約1μg及び最大約20μgのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
  30. 哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、以下:少なくとも約1μg及び最大約200μgのRSV可溶性Fタンパク質と、前記哺乳動物において防御免疫応答を誘発するのに十分な脂質Toll様受容体(TLR)アゴニストを含む少なくとも約1μg及び最大約20μgのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
  31. 過去にRSVに暴露されたことがある哺乳動物においてTh1バイアス細胞性免疫応答を増強する方法であって、以下:少なくとも約1μg及び最大約200μgのRSV可溶性Fタンパク質と、前記哺乳動物において前記Th1バイアス細胞性免疫応答を増強するのに十分な脂質Toll様受容体(TLR)アゴニストを含む少なくとも約1μg及び最大約20μgのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
  32. 前記哺乳動物の細胞性免疫応答が、前記Th1細胞性免疫応答及びTh2細胞性免疫応答を少なくとも1.2:1の比で含む、請求項30に記載の方法。
  33. 前記哺乳動物の細胞性免疫応答は、IFNγが優勢である、請求項30に記載の方法。
  34. 哺乳動物においてTh2バイアス免疫応答を転換する方法であって、以下:少なくとも約1μg及び最大約200μgのRSV可溶性Fタンパク質と、前記哺乳動物において前記Th2バイアス免疫応答を転換するのに十分な脂質Toll様受容体(TLR)アゴニストを含む少なくとも約1μg及び最大約20μgのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
  35. 哺乳動物においてRSVに対する中和抗体を誘導する方法であって、以下:少なくとも約1μg及び最大約200μgのRSV可溶性Fタンパク質と、前記哺乳動物においてRSVに対する中和抗体を誘導するのに十分な脂質Toll様受容体(TLR)アゴニストを含む少なくとも約1μg及び最大約20μgのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
  36. 前記RSV中和抗体力価が、10.0Log2より大きい、請求項34に記載の方法。
  37. 前記ワクチン組成物の投与後の前記RSV中和抗体力価が、投与前の血清IgG力価と比較して、少なくとも約10倍及び最大約200倍の血清IgG力価を含む、請求項34に記載の方法。
  38. 哺乳動物においてRSVウイルス力価を低減する方法であって、以下:少なくとも約1μg及び最大約200μgのRSV可溶性Fタンパク質と、前記哺乳動物においてRSVに対する中和抗体を誘発するのに十分な脂質Toll様受容体(TLR)アゴニストを含む少なくとも約1μg及び最大約20μgのアジュバントとを含有する、治療に有効な量のワクチン組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
  39. RSVウイルス力価が、約50〜約1000倍低減する、請求項37に記載の方法。
  40. 前記ワクチン組成物の投与後、RSVウイルス力価が、2log10pfu/グラムを下回る、請求項37に記載の方法。
  41. 前記ワクチン組成物の投与から約1週間〜1年後に、RSVウイルス力価が、2log10pfu/グラムを下回る、請求項37に記載の方法。
  42. 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項28のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記哺乳動物が、高齢のヒトである、請求項28〜29のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記哺乳動物が、少なくとも約50歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記哺乳動物が、少なくとも約55歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記哺乳動物が、少なくとも約60歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記哺乳動物が、少なくとも約65歳の実年齢に達している高齢のヒトである、請求項28〜33のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記哺乳動物が、RSV血清陽性である、請求項28〜34のいずれか一項に記載の方法。
  49. 単一用量レジメンを含む、請求項28〜35のいずれか一項に記載の方法。
  50. 1回目及び2回目用量を含む2用量レジメンを含む、請求項28〜35のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記1回目用量から少なくとも約1週間後に前記2回目用量を投与する、請求項37に記載の方法。
  52. 前記1回目用量から少なくとも約1ヵ月後に前記2回目用量を投与する、請求項37に記載の方法。
  53. 前記1回目用量から少なくとも約1年後に前記2回目用量を投与する、請求項37に記載の方法。
  54. 前記ワクチン組成物を非経口で投与する、請求項28〜40のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記ワクチン組成物を筋内投与する、請求項28〜41のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ワクチン組成物を皮下投与する、請求項28〜41のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記RSV可溶性タンパク質が、C末端膜貫通ドメインを欠失している、請求項28〜43のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記RSV可溶性タンパク質が、細胞質尾部ドメインを欠失している、請求項28〜44のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記RSV可溶性Fタンパク質が、ヒト株A2(配列番号2)由来のRSV可溶性Fタンパク質のアミノ酸1〜524を含む、請求項28〜45のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記RSV可溶性Fタンパク質が、配列番号7を含む、請求項28〜46のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記アジュバントが、(TLR)4アゴニストを含む、請求項28〜47のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記アジュバントが、合成ヘキシル化リピドA誘導体を含む、請求項28〜48のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記アジュバントが、グルコピラノシルリピドA(GLA)を含む、請求項28〜49のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記アジュバントが、下記式:
    Figure 2016516755
    (式中、R1、R3、R5及びR6は、C11〜C20アルキルであり;R2及びR4は、C12〜C20アルキルである)
    を有する化合物を含む、請求項28〜50のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記アジュバントが、安定した水中油形エマルジョン中のGLA(GLA−SE)を含む、請求項28〜51のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記アジュバントが、安定化したスクアレンベースエマルジョン中のGLAを含む、請求項28〜52のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記アジュバントが、少なくとも約1%及び最大約5%の濃度を有する安定化水中油形エマルジョン中のGLAを含む、請求項28〜53のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記アジュバントが、少なくとも50nm及び最大約200nm(100nm)の平均粒度を有する安定化水中油形エマルジョン中のGLAを含む、請求項28〜54のいずれか一項に記載の方法。
  69. 少なくとも約5μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項28〜55のいずれか一項に記載の方法。
  70. 少なくとも約10μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項28〜56のいずれか一項に記載の方法。
  71. 少なくとも約20μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項28〜57のいずれか一項に記載の方法。
  72. 少なくとも約30μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項28〜58のいずれか一項に記載の方法。
  73. 少なくとも約50μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項28〜59のいずれか一項に記載の方法。
  74. 少なくとも約100μgのRSV可溶性Fタンパク質を含む、請求項28〜60のいずれか一項に記載の方法。
  75. 少なくとも約2.5μgのアジュバントを含む、請求項28〜61のいずれか一項に記載の方法。
  76. 少なくとも約5μgのアジュバントを含む、請求項28〜62のいずれか一項に記載の方法。
  77. 約10μg〜約100μgのRSV可溶性Fタンパク質と、約1μg〜約5μgのGLA−SEとを含む、請求項28〜63のいずれか一項に記載の方法。
  78. 約10μg〜約100μgのRSV可溶性Fタンパク質であって、RSV可溶性Fタンパク質は、ヒト株A2(配列番号2)由来のRSV可溶性Fタンパク質のアミノ酸1〜524を含む、RSV可溶性Fタンパク質と、濃度約1%〜5%の安定化水中油形エマルジョン中の約1μg〜約5μgのGLAとを含む、請求項28〜43のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記ワクチン組成物が、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項28〜65のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記ワクチン組成物が、非経口投与のために製剤化される、請求項28〜66のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記ワクチン組成物が、筋内投与のために製剤化される、請求項28〜67のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記ワクチン組成物が、皮下投与のために製剤化される、請求項28〜67のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記ワクチン組成物が、約50μl〜約500μlの量を含む、請求項28〜69のいずれか一項に記載の方法。
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