CN105188748A - 疫苗组合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

在此所描述的是疫苗组合物及使用方法。在一个实施例中，该疫苗组合物包括与佐剂组合的RSV-F蛋白。在更具体的实施例中，该疫苗组合物包括与脂质Toll样受体(TLR)激动剂组合的RSV可溶性F蛋白。在更具体的实施例中，该佐剂包括吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。在另外的实施例中，该佐剂包括在稳定的水包油乳剂中的GLA(GLA-SE)。

Description

疫苗组合物及使用方法
优先权要求
本申请要求2013年4月8日提交的在先美国临时专利申请号61/809,563的权益，将其通过引用以其整体结合在此。
对以电子方式提交的序列表的引用
将与本申请一起以电子方式提交的处于ASCII文本文件形式的序列表的内容(名称：RSVFseqlist.txt；大小：46,202字节；创建日期为2014年4月3日)通过引用以其全文结合在此。
发明领域
本发明总体上涉及提供保护或引起对病毒感染的保护性抗体的疫苗。更具体地说，描述了针对呼吸道合胞体病毒(RSV)的疫苗制剂，并且更具体地说，人呼吸道合胞体病毒融合蛋白(RSV-F)。
背景
呼吸道合胞体病毒(RSV)是在婴儿和儿童中的严重下呼吸道疾病的主导原因(费根(Feigen)等人，编著，1987，在：《儿科传染病(PediatricInfectiousDiseases)》教科书，桑德斯(WBSaunders)，费城在第1653-1675页中；新的疫苗开发，建立优先性，第1卷，1985，国家学术出版社，华盛顿特区在第397-409页；和鲁斯坎宁(Ruuskanen)等人，1993，《当代儿科学问题》(Curr.Probl.Pediatr.)23:50-79)。RSV感染的每年流行性质在全世界范围内是显而易见的，但在给定季节中，RSV疾病的发病率和严重程度因地区而异(霍尔(Hall,C.B.)，1993，《当代儿科》(Contemp.Pediatr.)10:92-110)。在北半球的温带地区，通常在深秋开始并在晚春结束。在医院流行期间，原发性RSV感染最经常发生在6周到2岁的儿童中，罕见地发生在生命的前4周中(霍尔(Hall)等人.，1979，《新英格兰医学杂志》(NewEngl.J.Med.)300:393-396)。处于增加的RSV感染的风险下的儿童包括早产儿(霍尔(Hall)等人.，1979，《新英格兰医学杂志》(NewEngl.J.Med.)300:393-396)以及具有支气管肺发育不良(古修伊斯(Groothuis)等人，1988，《儿科学》(Pediatrics)82:199-203)、先天性心脏病(麦克唐纳(MacDonald)等人，《新英格兰医学杂志》(NewEngl.J.Med.)307:397-400)、先天性或获得性免疫缺陷(奥格拉(Ogra)等人，1988，《小儿传染病期刊》(Pediatr.Infect.Dis.J.)7:246-249；和波尔(Pohl)等人，1992，感染疾病杂志(J.Infect.Dis.)165:166-169)和囊性纤维化(阿布曼(Abman)等人，1988，《儿科学杂志》(J.Pediatr.)113:826-830)的儿童。因RSV感染住院的具有心脏或肺部疾病的婴儿的死亡率是3％-4％(纳瓦斯(Navas)等人，1992，《儿科学杂志》(J.Pediatr.)121:348-354)。
RSV感染成人以及婴儿和儿童。在健康成人中，RSV主要引起上呼吸道疾病。最近已经变得显而易见地是：一些成人(尤其老年人)具有比先前报道的更频繁的有症状的RSV感染(埃文斯(Evans,A.S.)，编著，1989，《人类的病毒感染：流行病学和控制》(ViralInfectionsofHumans.EpidemiologyandControl)，第3版，《普雷纳姆医学书》(PlenumMedicalBook)，纽约在第525-544页)。若干传染病也已在养老院患者和被送至专门机构的年轻人之间报告(法尔塞(Falsey,A.R.)，1991，《传染控制和医院流行病学》(Infect.ControlHosp.Epidemiol.)12:602-608；和加威(Garvie)等人，1980，《英国医学杂志》(Br.Med.J.)281:1253-1254)。最后，RSV可以引起免疫抑制个体、特别是骨髓移植患者中的严重疾病(赫兹(Hertz)等人，1989，《医学》(Medicine)68:269-281)。
对于确定的RSV疾病的治疗选择是有限的。下呼吸道的严重RSV疾病往往需要相当大的支持性护理，包括湿氧和呼吸道援助管理(菲尔茨(Fields)等人，编著，1990，《菲尔茨病毒学》(FieldsVirology)，第2版，第1卷，雷文出版社(RavenPress)，纽约在第1045-1072页)。抗病毒剂利巴韦林已被批准用于治疗感染(关于传染性疾病的美国儿科学会委员会(AmericanAcademyofPediatricsCommitteeonInfectiousDiseases)，1993，《儿科》学(Pediatrics)92:501-504)。它已被证明在RSV肺炎和毛细支气管炎治疗中是有效的，且有效于在免疫活性的儿童中修改严重RSV疾病的进程(史密斯(Smith)等人，1991，《新英格兰医学杂志》(NewEngl.J.Med.)325:24-29)。然而，因为需要长时间的气溶胶给予并且担心其对在医院环境中给予期间可能暴露于该药物的孕妇的潜在风险，利巴韦林使用受限。
疫苗开发的一个主要障碍是安全性。福尔马林-灭活的疫苗，尽管是免疫原性的，但由于RSV，出乎意料地在经免疫的婴儿的中比在用类似制备的三价副流感病毒疫苗免疫的婴儿中引起了更高和更严重的下呼吸道疾病的发生率(金姆(Kim)等人，1969，《美国流行病学杂志》(Am.J.Epidemiol.)89:422-434；和《卡皮奇恩》(Kapikian)等人，1969，美国流行病学杂志89:405-421)。因此，尽管进行了超过50年的研究，但是并未开发出合适的抗RSV的疫苗。因此，对于安全且有效的抗RSV疫苗仍存在引人注目的尚未满足的医疗需求。
发明概述
在此所描述疫苗组合物。具体而言，该疫苗组合物包括RSV-F蛋白。在一个实施例中，该疫苗组合物包括RSV可溶性F蛋白。在一个实施例中，该RSV可溶性F蛋白缺乏一个C-末端跨膜结构域。在更具体的实施例中，该RSV可溶性F蛋白缺乏一个胞质尾区结构域。在一个实施例中，该RSV可溶性F蛋白包括来自人菌株A2(SEQIDNO:2)的RSV可溶性F蛋白的氨基酸1-524。在另一个实施例中，该RSV可溶性F蛋白包括SEQIDNO.7。
在更具体的实施例中，该疫苗组合物包括RSV可溶性F蛋白，与一种佐剂组合。在一个实施例中，该佐剂是脂质toll样受体(TLR)激动剂。在一个实施例中，该佐剂是(TLR)4激动剂。在一个实施例中，该佐剂是合成的己酸化脂质A衍生物。在更具体的实施例，该佐剂包括吡喃葡糖糖基脂质A(GLA)。在一个实施例中，该佐剂包括具有以下化学式的化合物：
其中R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；并且R2和R4是C12-C20烷基。在一个实施例中，该佐剂包括在稳定的水包油乳剂中的GLA(GLA-SE)。在另一个实施例中，该佐剂包括在稳定的基于角鲨烯的乳剂中的GLA。
在一个实施例中，在该疫苗组合物中包括至少约1μg和高达约200μgRSV-F蛋白。在一个实施例中，RSV-F蛋白包括可溶性RSV-F蛋白。在一个实施例中，在该疫苗组合物中包括至少约1μg和高达约20μg佐剂。在一个实施例中，该佐剂包括GLA。在更具体的实施例中，该佐剂包括GLA-SE。在更具体的实施例中，该佐剂该佐剂包括在具有浓度为至少约1％和高达约5％的稳定的水包油乳剂中的GLA。在一个实施例中，该佐剂包括在具有平均粒径为至少约50nm和高达约200nm的稳定的水包油乳剂中的GLA。在一个实施例中，该疫苗组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、或其组合。可以配制该疫苗组合物用于肠胃外给药，例如肌内或皮下给予。在一个实施例中，该疫苗组合物具有在约50μl和约500μl之间的体积。
在另一个实施例中，提供预防在哺乳动物中的呼吸道合胞体病毒(RSV)感染的方法。在一个实施例中，该方法包括向该哺乳动物给予治疗有效量的如在此所描述的疫苗组合物。在另一个实施例中，在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，其中该方法包括向该哺乳动物给予有效量的在此所描述的疫苗组合物。在另一个实施例中，用于在先前已暴露于RSV的哺乳动物中增强Th1偏向性细胞免疫应答的方法，其中该方法包括向该哺乳动物给予有效量的在此所描述的疫苗组合物。在一个实施例中，该哺乳动物的细胞免疫应答包括以至少约1.2:1的比率的Th1细胞免疫应答和Th2细胞免疫应答。在另一个实施例中，在哺乳动物中诱导抗RSV的中和抗体的方法，其中该方法包括向该哺乳动物给予有效量的在此所描述的疫苗组合物。在一个实施例中，该RSV中和抗体滴度是大于10.0Log2。在一个实施例中，在给予该疫苗组合物后，该RSV中和抗体滴度包括血清IgG滴度，这些血清IgG滴度与给予前的血清IgG滴度相比是至少约4倍。在一个实施例中，在给予该疫苗组合物后，RSV中和抗体滴度包括血清IgG滴度，这些血清IgG滴度相较于给予前的血清IgG滴度是至少约10倍和高达约200倍更高。在一个实施例中，在哺乳动物中诱导RSV病毒滴度的方法，其中该方法包括向该哺乳动物给予有效量的在以上描述的疫苗组合物。在一个实施例中，以下感染的RSV病毒滴度被降低约50和约1000倍之间。在另一个实施例中，在给予该疫苗组合物后，RSV病毒滴度是少于2log10pfu/克。在更具体的实施例中，在给予该疫苗组合物后约1周和1年之间，该RSV病毒滴度是少于2log10pfu/克。
在一个实施方案中，该哺乳动物是人。在另一个实施方案中，该哺乳动物为老年人。在更具体的实施例中，该哺乳动物是已经达到了至少约50岁实龄的老年人。在一个实施例中，该哺乳动物是RSV血清反应阳性的。
在一个实施例中，该疫苗组合物以单一剂量方案给予。在另一个实施例中，该疫苗组合物以二剂量方案给予，该二剂量方案包括第一和第二剂量。在一个实施例中，该第二剂量是在第一剂量后至少约1周、2周、3周、1月或1年给予的。在另一个实施例中，该疫苗组合物以三剂量方案给予。
附图简要说明
这些附图示例了本技术的实施例且并非限制性的。为了清晰和容易地说明，附图未按比例作出，并且在一些情况下，不同的方面可能被夸张或放大地显示以促进具体实施例的理解。
图1A-F是显示在未致敏BALB/c小鼠中对有佐剂的RSVsF疫苗的免疫应答的图。将小鼠(每组N＝7)在0和14天用指定的疫苗进行免疫并且在第28天用RSV的6log10PFU激发。自2个实验中的1个所示的代表性数据用所有组运行。(A)肺病毒滴度。通过噬斑测定量化激发后4天在动物肺中残留的病毒。将个体的结果以log10、连同代表该组几何均数的横条来呈现。具有不可检出的滴度的个体在测定检出限(LOD)处得分为大约1.4log10。(B)血清RSV-GFP中和滴度。个体第28天血清结果被表示为提供50％降低的病毒荧光聚焦单位(FFU)的log2血清稀释度，用横条代表该组几何平均数。具有不可检出的滴度的个体在测定检出限(LOD)处得分为3.3log2，由虚线指示。显著性差异(通过单因子ANOVA)由***指示。(C)F-特异性CD4T-细胞细胞因子应答。激发后4天收获脾细胞(每组n＝3)并且再刺激72小时。显示了通过从多重细胞因子分析中的测试值减去培养基对照值计算的该特异性IFNγ、IL-5、IL-13和IL-17对免疫显性的MHCII限制性RSV-F多肽池的应答。显示了该组平均数和SEM。(D)血清F-特异IgG1和IgG2a滴度。通过终点滴度ELISA对第28天血清(每组n＝7)的F-特异性IgG1和IgG2a同种型进行评价。将数据表示为log2血清端点稀释度倒数，具有检出限(LOD)为5.64log2。显示了该组具有95％置信区间的几何平均数，组间显著性差异(通过单因子ANOVA)由***指示。(E)IFNγELISPOT。将在激发后4天收获的脾细胞用免疫显性RSV-F-衍生的MHCI限制性肽再刺激，以评价CD8T细胞应答。组间显著性差异(通过单因子ANOVA)由***指示。显示了对于在代表性实验(重复2-7次)中的3个动物/组的个体小鼠结果，连同代表该组平均数的横条。(F)颗粒酶BELISPOT。将脾细胞收获并如针对IFNγELISPOT一样处理。组间显著性差异(通过单因子ANOVA)由***指示。显示了对于3个动物/组的个体小鼠结果，连同代表该组平均数的横条。
图2A和B是显示抗原剂量调整对IFNγ针对包括具有固定和变化GLA-SE量的RSV-sF的组合物的影响的图。(A)抗原剂量调整对IFNγELISPOT的影响。显示了对于给定指示剂量的RSVsF在GLA-SE的固定量中的5个动物/组的个体小鼠结果，连同代表该组平均数的横条。(B)佐剂剂量调整对于IFNγELISPOT的影响。显示了对于具有固定的0.3μg量的RSVsF的给定指示剂量的GLA-SE的3-4个动物/组的个体小鼠结果，连同代表该组平均数的横条。
图3A-D是显示F-特异性CD4和CD8T-细胞诱导和引发的图。在0和14天，将小鼠用10μg的RSVsF单独的或与指定的GLA-SE或SE佐剂一起配制进行肌内免疫。将脾细胞(n＝5/组)收获并用指示的在IFNγELISPOT中的F肽在指示的时间点下再刺激，这些时间点是在第28天(加强后的14天)，或在第32天(用6log10RSVA2激发后的4天)。显示了两个代表性实验之一的个体动物结果连同组平均数，组间(通过单因子ANOVA)显著性差异由***指示。(A)加强后第14天CD4应答。在加强后14天，IFNγELISPOT对MHCII-限制性(CD4)F肽池的应答。(B)加强后第14天CD8应答。在加强后14天，IFNγELISPOT对免疫显性MHCI-限制性(CD8)F肽的应答。(C)激发后第4天CD4应答。在激发后4天，IFNγELISPOT对MHCII-限制性(CD4)F肽池的应答。(D)激发后第4天CD8应答。在激发后4天，IFNγELISPOT对免疫显性MHCI-限制性(CD8)F肽的应答。
图4A和B是显示召回CD8T-细胞(recallCD8T-cell)对在肺中的RSV的应答的图。在0和14天，将小鼠用指示的疫苗配制品进行免疫(使用0.3μg的RSVsF/免疫)，然后在第28天用6log10pfu的RSV激发。激发后(对于每个组和时间点n＝3)4、7或12天收获肺，并用(A)RSV-F-衍生的H-2Kd限制性肽或(B)RSVM2-衍生的H-2Kd限制性肽再刺激6小时。将细胞针对CD3和CD8表面染色，针对IFNγ、TNFα和IL-2细胞内染色，并在LSR2上针对应答CD8T细胞的频率进行分析。显示了该组平均数，组间显著性差异(通过单因子ANOVA)由***指示。呈现了自2个实验中的1个的代表性数据。
图5A-F是显示在未致敏BALB/c小鼠中肺对RSV激发的应答的图和组织学样品。将小鼠(每组n＝7)在0和14天用指示的疫苗进行免疫并且在第28天用6log10pfuRSV激发。在激发后4天收获肺。自2个实验中的1个所示的代表性数据用所有组运行。(A-F)肺匀浆中的细胞因子。将在经澄清的肺匀浆中的IL-5、IL-13、IFNγ、IL-17和嗜酸性粒细胞活化趋化因子的水平通过多重细胞因子分析量化并且计算为每克收获的肺的量。显示了个体小鼠结果，连同代表该组平均数的横条。为了计算IFNγ对IL-5的比率，在计算之前，将数值首先通过对每个值加1进行归零调整。
图6A-F肺的细胞渗透。将福尔马林固定的肺切片进行H&E染色并且针对炎性标志物进行评价。显示了针对每个组的代表性的10x视野。
图7A-F是显示在未致敏棉鼠中对有佐剂的RSVsF疫苗的免疫应答的图。在第0和21天，将动物用指示的疫苗配制品进行免疫(使用0.3μg的RSVsF/免疫)并在第42天用6log10pfu的RSV激发。(A)肺病毒滴度。在激发后的4天，自具有通过噬斑形成测定量化的残留病毒的个体动物(每组n＝8)收获肺。将个体的结果以log10、连同代表该组平均数的横条来显示。与对照PBS+GLA-SE组相比，该虚线指示残留病毒的3log10降低。个体组间显著性差异(通过单因子ANOVA)以及活的RSVA2组由***指示。(B)鼻病毒滴度。在激发后的4天，自具有通过噬斑形成测定量化的残留病毒的个体动物(每组n＝8)收获鼻和鼻甲。将个体的结果以log10、连同代表该组平均数的横条来显示。与对照PBS+GLA-SE组相比，该虚线指示残留病毒的3log10降低。个体组间显著性差异(通过单因子ANOVA)以及活的RSVA2组由***指示。(C)血清RSV中和滴度。将第42天的血清(每组N＝5)进行热灭活并且通过荧光聚焦测定检测目标细胞的RSV-GFP感染的中和。将数据呈现为log2血清稀释度，其提供了病毒的50％降低的荧光聚焦单位(FFU)，具有通过虚线指示的3.3log2的检出限(LOD)。显示了个体结果，连同代表该组平均数的横条和95％置信区间。个体疫苗组间显著性差异(通过单因子ANOVA)由***指示。(D)对RSVsF特异的血清IgG滴度。针对RSVsF的结合，通过终点ELISA对第42天血清进行测定(每组N＝5)。将数据呈现为log2血清稀释度，其产生OD>3x背景，具有通过虚线指示的3.3log2的检出限(LOD)。显示了个体结果，连同代表该组平均数的灰色横条和95％置信区间。个体疫苗组间显著性差异(通过单因子ANOVA)由***指示。(E)IFNγELISPOT。在IFNγELISPOT中，将激发后4天收获的脾细胞(每组N＝4-5)用培养基或用RSVsF蛋白再刺激。F-特异性应答通过从测试值减去培养基对照值来量化。个体疫苗组间显著性差异(通过单因子ANOVA)由***指示。(F)IFNγ对IL-4ELISPOT应答的比率。对F-特异性IL-4ELISPOT应答进行评价并且在通过向每个值加1来进行值归零调整后，计算IFNγ对IL-4斑点形成单位的比率。
图8A-F是显示在棉鼠中肺对RSV激发的应答的组织学样本。将棉鼠在0和21天用指示的疫苗进行免疫并且在第42天用6log10pfuRSV激发。在激发后4天收获肺。将福尔马林固定的肺切片进行H&E染色并且针对炎性标志物进行评价。显示了自每个组(每组n＝5)的代表性的10x视野。
图9A和B是亲和纯化的RSVsF蛋白的凝胶分析的图。将纯化的sF蛋白在还原条件下(泳道a)和非还原(泳道b)条件下溶解在10％-12％聚丙烯酰胺凝胶中，并且用SyproRuby进行显影。分子量标准参照物在边缘中显示。
图10A和B是显示小鼠血清抗sF抗体滴度的图。在第0和14天，将动物用指示剂量的不含有佐剂或含有GLA-SE的RSVsF进行免疫，并在第28天用6log10pfu的RSV激发。(A)通过终点滴度ELISA评价第28天血清的F-特异性IgG。显示针对个体动物的Log2血清稀释度倒数以及显示代表组几何平均数的横条。该测定检出限(LOD)是由虚线指示的5.64log2。(B)通过终点滴度ELISA评价第32天血清的F-特异性IgA。显示针对个体动物的Log2血清稀释度倒数以及代表组几何平均数的灰色横条。该测定检出限(LOD)是由虚线指示的4.32log2。
图11A和B是显示在未致敏BALB/c小鼠中确定RSVsF抗原的最优体内剂量的图。在第0和14天，将动物用指示剂量的不含有佐剂或含有5μgGLA-SE的RSVsF(0.01-1.5μg)进行免疫，并在第28天用6log10pfu的RSV激发。(A)激发后4天，以log10pfu/克测量的、针对肺中残余病毒滴度的噬斑测定。(B)第28天，处于log2血清稀释度倒数的RSV血清中和滴度。
图12是显示胞内细胞因子染色的图。将小鼠(每组n＝3-5)在0和14天用指示的疫苗进行免疫并且在第28天用6log10pfu的RSV激发。在第32天(激发后的4天)收获脾细胞，并且用免疫显性RSV-F-衍生的MHCI限制性肽再刺激，以评价CD8T细胞应答。通过胞内细胞因子染色和流式细胞术分析来量化多功能的IFNγ、TNFα、IL-2+CD8+T细胞。
图13是通过自在第0和14天用PBS或用RSVsF+GLA-SE免疫的未致敏BALB/c小鼠中显示多种RSV分离株的交叉中和的表。针对来自最近10年获得的宽US地理分布(NY、CO、CA、NM/AZ)的RSV临床分离株的中和，对第28天血清进行检测。
图14A和B是显示以下项的图：在用指示的、具有或不具有GLA-SE(5μg，在2％中)的RSVsF剂量(0.4、2或10μg)疫苗接种前28天，在通过具有RSV的单一注射使得血清反应阳性的BALB/c小鼠中接种时间点后的血清F-特异性IgG终点滴度。通过具有A450>3x平均背景的截留值的终点滴度ELISA评价在F-特异性IgG的每个指示时间点处的血清。将数据以具有5-5.64的检出限(LOD)的log2来呈现。(A)显示了个体动物结果以说明在第0天的血清阳性连同代表该组平均数的横条，每组n＝8-9。(B)用描绘了98％置信区间的误差条显示了在每个时间点处针对n＝6-9个动物的该组平均的F-特异性IgG滴度。
图15是显示在对1x血清反应阳性的BALB/c小鼠疫苗接种后的血清RSV中和滴度的时程的图。在每个时间点处将来自个体小鼠的血清进行热灭活，并且在缺乏补偿下针对靶细胞的RSV-GFP感染的中和通过荧光聚焦测定进行测试。将数据呈现为log2血清稀释度，其使荧光聚焦单位(FFU)降低50％。出于计算目的，将<3.32的检出限(LOD)的值报道为2.32。显示了针对n＝6-9个动物的在每个时间点处的组几何均数以及描绘95％置信区间的误差条。通过单因子ANOVA对PBS(血清反应阴性的)确定的p<0.05的组由*进行标记。
图16是显示在对1x血清反应阳性BALB/c小鼠疫苗接种后第14天的血清F-特异性IgA。在疫苗接种后14天的动物中的血清终点抗体滴度通过ELISA使用3倍血清稀释度来量化，每组N＝5-6。对于该测定，将数据以log2来呈现，其中LOD为4.32。显示了个体小鼠结果，连同组平均数和代表95％置信区间的误差条。与用PBS疫苗接种的血清反应阳性组相比的显著性差异(p<0.05)由*指示。
图17A和B是显示在对1x血清反应阳性的BALB/c小鼠疫苗接种后第0天和第42天的血清F-特异性IgG1和IgG2a滴度的图。通过具有截留值为A450>3×空白组平均值的终点滴度ELISA评价血清的F-特异性IgG1和IgG2a同种型。将数据以log2呈现。横条表示具有95％置信区间的该组几何均数。(A)具有检出限(LOD)(对于IgG1为4.05且对于IgG2a为4.5)的N＝8-9个动物/组。(B)对于两个测定，具有LOD为5.0的N＝5-6个动物。
图18A-C是显示在对1x血清反应阳性的BALB/c小鼠疫苗接种后第42天的血清位点特异性竞争ELISA的图。疫苗接种后的42天，将来自个体动物的血清通过用分别结合至位点A、B和C的位点-特异性mAb1121、8599和1331H的竞争ELISA经RSV-F位点-特异性抗体的1:25至1:2×106的稀释范围进行评价，每组N＝6。在这个测定中，更低的检测吸光度指示更高的竞争性，通过多克隆血清对位点-特异性mAb与RSVsF的结合。用代表该组平均数的横条显示针对个体小鼠的处于1:125的代表性稀释度的竞争百分比(100×[1-{血清OD/mAbOD平均数}])。与成对的无佐剂的组相比的显著性(p<0.05)由**指示。
图19A和B是显示在疫苗接种后第10天和第73天，CD4T-细胞细胞因子对经疫苗接种1x血清反应阳性的BALB/c小鼠中的RSVsF的应答的图。将脾细胞收获并且用培养基或用RSVsF蛋白再刺激，以评价CD4T细胞应答，每组N＝3。在再刺激72-小时后，将在上清液中的IFNγ、IL-10、IL-5和IL-17通过博尔普莱斯(Bioplex)多重细胞因子分析进行测量。F-特异性应答通过从测试值减去培养基对照值来计算。显示了具有代表标准偏差的误差条的组平均数。A)疫苗接种后第10天，每组n＝3。B)第73天(RSV激发后的4天)，每组n＝3-5。
图20A和B是显示在疫苗接种后第10天，CD8T-细胞对在1x血清反应阳性的BALB/c小鼠中的免疫显性的RSV-F肽的应答的图。免疫接种后的10天收获脾细胞，并且用免疫显性RSV-F-衍生的MHCI限制性肽再刺激，以评价CD8T细胞应答，每组N＝3。(A)IFN-γELISPOT。显示了个体结果，连同代表该组平均数的横条。(B)在再刺激6hr后，将多功能的IFNγ、TNFα、IL-2+CD8+T细胞通过胞内细胞因子染色的流式细胞术分析测量为总CD8+T细胞的百分比。显示了该组平均数和标准误差。
图21A和B是显示在疫苗接种后第73天，CD8T-细胞对在1x血清反应阳性的BALB/c小鼠中的免疫显性的RSV-F肽的应答的图。激发后的4天收获脾细胞，并且用免疫显性RSV-F-衍生的MHCI限制性肽再刺激，以评价CD8T细胞应答，每组N＝3-5。(A)IFN-γELISPOT。显示了个体结果，连同代表该组平均数的横条。(B)在再刺激6-小时后，将在所选择的组中的多功能的IFNγ、TNFα、IL2+CD8+T细胞通过胞内细胞因子染色的流式细胞术分析测量为总CD8+T细胞的百分比。显示了该组平均数和标准误差。
图22是显示在用RSV再激发之前，收获自1x血清反应阳性的BALB/c小鼠中的肺匀浆中的细胞因子应答的图。用6log10pfu的RSV激发后的4天，将在动物的肺中的细胞因子通过肺匀浆的多重细胞因子分析来量化，每组N＝5-6。显示了个体小鼠结果的两种最重要的细胞因子(IFNγ和IL-5)，连同代表该组平均数和95％置信区间的横条。
图23是显示在用sF疫苗疫苗接种之前，在1x血清反应阳性的BALB/c小鼠中通过ELISA进行的血清F-特异性IgG的图。将数据通过ELISA相比参比标准来量化并且以mg/mL等效物来呈现。显示了个体动物结果连同代表该组平均数的横条，每组n＝8-9。
图24是用RSVsF疫苗对1x血清反应阳性的BALB/c小鼠疫苗接种之后2周，显示通过ELISA的血清F-特异性IgG1和IgG2a同种型的图。将数据通过ELISA相比参比标准来量化并且以mg/mL等效物、用检出限(LOD)为8mg/mL来呈现。横条代表N＝6-7个动物/组的具有95％置信区间的该组几何均数。
图25是显示在对1x血清反应阳性的BALB/c小鼠疫苗接种后的血清RSV中和滴度的时程的图。在每个时间点处将来自个体小鼠的血清进行热灭活，并且在缺乏补偿下针对靶细胞的RSV-GFP感染的中和通过荧光聚焦测定进行测试。将数据呈现为log2血清稀释度，其使荧光聚焦单位(FFU)降低50％。出于计算目的，将<3.32的检出限(LOD)的值报道为2.32。显示了针对n＝6-9个动物的在每个时间点处的组几何均数以及描绘95％置信区间的误差条。
图26A和B是显示在疫苗接种后10天，CD8T-细胞对在1x血清反应阳性的BALB/c小鼠中的免疫显性的RSVF肽的应答的图。免疫接种后10天收获脾细胞，并且用免疫显性RSVF-衍生的MHCI限制性肽再刺激，每组N＝3-4个动物。A)IFN-γELISPOT。显示了个体结果，连同代表该组平均数的横条。B)在再刺激6hr后，将多功能的IFNγ、TNFα、IL-2+CD8+T细胞通过胞内细胞因子染色的流式细胞术分析测量为总CD8+T细胞的百分比。显示了该组平均数和标准误差。
图27是显示在用10μgRSVsF(有或没有各种佐剂)对1x血清反应阳性的BALB/c小鼠疫苗接种后的血清RSV中和滴度的时程的图。在每个时间点处将来自个体小鼠的血清进行热灭活，并且在缺乏补偿下针对靶细胞的RSV-GFP感染的中和通过荧光聚焦测定进行测试。将数据呈现为log2血清稀释度，其使荧光聚焦单位(FFU)降低50％。出于计算目的，将<3.32的检出限(LOD)的值报道为2.32。显示了针对n＝6-9个动物的在每个时间点处的组几何均数以及描绘95％置信区间的误差条。指示了通过单因子ANOVA，相对于PBS(血清反应阴性的)组，p<0.05的组。
图28A-B是显示在未致敏BALB/c小鼠中肺对RSV激发的应答的图。将小鼠(每组n＝7)在0和14天用指示的疫苗进行免疫并且在第28天用6log10pfuRSV激发。在激发后4天收获肺。自2个实验中的1个所示的代表性数据用所有组运行。(A-B)肺匀浆中的细胞因子。将在经澄清的肺匀浆中的嗜酸性粒细胞活化趋化因子和IL-13的水平通过多重细胞因子分析量化并且计算为每克收获的肺的量。显示了个体小鼠结果，连同代表该组平均数的横条。
图29A和B是显示在用10μgRSVsF(没有或有各种佐剂)疫苗接种后的第10天，CD8T-细胞对在1x血清反应阳性的BALB/c小鼠中的免疫显性的RSV-F肽的应答的图。免疫接种后的10天收获脾细胞，并且用免疫显性RSV-F-衍生的MHCI限制性肽再刺激，以评价CD8T细胞应答，每组N＝3。(A)IFN-γELISPOT。显示了个体结果，连同代表该组平均数的横条。(B)在再刺激6hr后，将多功能的IFNγ、TNFα、IL-2+CD8+T细胞通过胞内细胞因子染色的流式细胞术分析测量为总CD8+T细胞的百分比。显示了该组平均数和标准误差。
图30A和B是显示在未接种的未致敏斯普拉道来(SpragueDawley)大鼠中的RSV复制动力学的图。未致敏5-6周龄雌性斯普拉道来大鼠在通过鼻内接种第0天接受2x106pfu的RSVA2。将RSV滴度通过使用连续稀释的经澄清的肺或鼻匀浆的噬斑测定来量化，每个时间点N＝5。显示了个体结果连同代表该组几何均数RSV滴度的横条。最高检出限(LOD)通过实线指示。具有滴度<LOD的个体给出4.0的值，用于绘图和统计学计算。
图31A-D是显示对未致敏斯普拉道来大鼠疫苗接种后6小时的血清细胞因子的图。通过多重基于珠粒的ELISA针对大鼠IL-6、MCP-1、MIP-1β和GRO/KC来评价血清。将以pg/mL的量化通过与标准曲线相比来确定。横条代表具有95％置信区间的该组几何均数，N＝5-6个动物/组。最低检出限(LOD)通过虚线指示。具有滴度<LOD的个体给出等于LOD的值，用于绘图和统计学计算。
图32A-C是显示在对未致敏斯普拉道来大鼠疫苗接种之后的RSVsF特异性血清IgG滴度的图。通过ELISA的RSV-F-特异性IgG的终点滴度以log2呈现。横条代表在第14天自n＝3个动物/组并且在第22和42天自n＝4-6个动物/组的组几何均数，具有95％置信区间。低于5.64(通过虚线指示)的测定检出限(LOD)的样本给出5.64的值，用于绘图。使用单因子ANOVA用杜奇事后检验(Tukey’sposttest)，*指示p<0.05(对PBS组)并且**指示p<0.05(对匹配的RSVsF组)。A)疫苗接种后第14天。B)疫苗接种后第22天C)疫苗接种后第42天。
图33是显示在对未致敏斯普拉道来大鼠疫苗接种后第42天的血清RSVsF-特异性同种型。通过终点ELISA测量RSVsF-特异性IgG1、IgG2a和IgG2b同种型。横条代表自n＝4-6个动物/组的该组几何均数。少于5.64(通过虚线指示)的测定检出限(LOD)的样本指定为允许用于绘图的5.64的值。通过单因子ANOVA用杜奇事后检验(Tukey’sposttest)，*指示p<0.05(对PBS组)并且**指示p<0.05(对匹配的RSVsF组)。
图34A和B是显示在对未致敏斯普拉道来大鼠疫苗接种后的RSV中和滴度的图。将来自用指示的疫苗进行疫苗接种的个体小鼠和对照的血清进行热灭活，并且通过荧光聚焦测定测试它们中和靶细胞的RSV-GFP感染的能力(在缺乏补偿下)。将数据呈现为log2血清稀释度，其使荧光聚焦单位(FFU)降低50％。将少于3.32的检出限(LOD)的样本给出用于绘图和统计学计算的3.30的值。示出了针对每组n＝4-6个动物的个体结果，其中该组几何均数连同描绘95％置信区间的误差条一起显示。通过单因子ANOVA用杜奇事后检验(Tukey’sposttest)，*指示p<0.05(对PBS组)并且**指示p<0.05(对匹配的无佐剂的sF组)。
图35是显示在来自经疫苗接种的未致敏斯普拉道来大鼠脾细胞中的RSVF-特异性IFNγELISPOT应答的图。在RSVA2激发后的4天收获脾细胞并通过IFNγELISPOT评价对RSVsF蛋白再刺激的应答，每组N＝4-6。针对每个处理组显示了个体结果连同该组平均数和标准偏差。通过单因子ANOVA使用邦费罗尼(Bonferroni)氏多重比较事后检验(Bonferroni’smultiplecomparisonposttest)，*指示与PBS相比p<0.05并且**指示与成对的无佐剂的sF相比p<0.05。
图36A和B是显示在经疫苗接种的未致敏斯普拉道来(SpragueDawley)大鼠中激发后的RSVA2滴度的图。在第42天，将所有疫苗组用2x106pfu的RSVA2进行IN激发。将RSV滴度通过在激发后的4天使用连续稀释的经澄清的肺或鼻匀浆的噬斑测定来量化，每组N＝4-6。显示了个体结果连同代表该组几何均数RSV滴度的横条。将检出限(LOD)通过实线(针对肺为8.7pfu/克，针对鼻为4.0pfu/克)来指示，并且将低于该LOD的样本指定为该LOD值用于绘图和统计学计算。
图37A和B是显示在给予RSVsF疫苗的未致敏啮齿类中随着时间的推移重量变化的图。(A)将未致敏棉鼠在第0天和第21天用具有或不具有佐剂GLA-SE(5μg/2％)、GLA(5μg)、SE(2％)、或明矾(100μg)的0.3μgRSVsF进行疫苗接种，并且追踪其从第0天到第25天的百分比重量变化。(B)将未致敏斯普拉道来大鼠在第0天和第21天用具有或不具有GLA-SE(2.5μg/2％)的10-100μgRSVsF进行疫苗接种，并且追踪其从第0天到第42天的百分比重量变化。
图38是显示在RSV血清反应阳性的小鼠中的中和滴度的图。在第0天和第35天，将小鼠经由鼻内途经给予1x106PFURSVA2。将在第28天(1个剂量的活的RSVA2之后)和第56天(活的RSVA2的二次剂量后的28天)的中和Ab滴度通过具有3.3的较低LOD的微量中和法测定来量化。也显示了未致敏小鼠亚组的滴度。将滴度计算为导致FFU的50％降低的最接近的稀释度的log2。如果该第一血清稀释度(1:10)未提供荧光聚焦单位计数<＝输入病毒的50％，那么该滴度被报道为10并且3.3log2的值被用于分析。针对未致敏小鼠，N＝8；并且对于第28天和第56天，N＝35。显示了平均数，以及具有SD。
图39是显示免疫后14天的中和抗体应答的图。将在免疫后14天(第70天)的中和Ab滴度通过使用3.3的较低LOD的微量中和法测定来量化。将滴度计算为导致FFU的50％降低的最接近的稀释度的log2。如果该第一血清稀释度(1:10)未提供荧光聚焦单位计数<＝输入病毒的50％，那么该滴度被报道为10并且3.3log2的值被输入用于分析。显示了具有平均数和SD的N＝4小鼠。
图40是显示随着研究持续时间的中和抗体应答的图。将在第56天、第70天和第84天的中和Ab滴度通过使用3.3的较低LOD的微量中和法测定来量化。将滴度计算为导致FFU的50％降低的最接近的稀释度的log2。如果该第一血清稀释度(1:20)未提供荧光聚焦单位计数<＝输入病毒的50％，那么该滴度被报道为10并且3.3log2的值被输入用于分析。显示了针对第56天的N＝8小鼠和针对第70天和第84天具有平均数和SEM的N＝4小鼠。
图41是显示在疫苗接种之前在血清反应阳性的小鼠中的基线RSVF特异性IgG应答的图。将总抗FIgG血清滴度通过在用于个体小鼠血清的RSVsF涂覆板上的ELISA来量化。使用单克隆抗体1331H(比勒(Beeler)和范·怀克寇林格(vanWykeCoelingh)，1989)来产生标准曲线。针对未致敏组，N＝8小鼠；并且对于使用RSV的2次连续感染，N＝35小鼠。显示了平均值和SD。
图42是显示在免疫后14天的总RSVF特异性IgG滴度的图。将总抗FIgG血清滴度通过在用于个体小鼠血清的RSVsF涂覆板上的ELISA来量化并且将滴度的log2进行绘图。使用纯化的单克隆抗体1331H(比勒(Beeler)和范·怀克寇林格(vanWykeCoelingh)，1989)来产生标准曲线。显示了N＝4，以及平均数SD。通过单因子ANOVA和杜克(Tukey)事后测试进行的统计分析。
图43是显示随着研究持续时间的总RSVF特异性IgG滴度的图。将总抗FIgG血清滴度通过在用于个体小鼠血清的RSVsF涂覆板上的ELISA来量化并且将滴度的log2进行绘图。使用纯化的单克隆抗体1331H(比勒(Beeler)和范·怀克寇林格(vanWykeCoelingh)，1989)来产生标准曲线。显示了N＝4，以及平均数SD。显示了N＝4，以及平均数SD。
图44是显示RSVF-特异性IgG1和IgG2a应答的图。将在第84天(免疫后的28天)的抗FIgG1或IgG2a血清水平通过在用于个体小鼠血清的RSVsF涂覆板上的ELISA来量化。使用纯化的单克隆抗体1331H或1308(比勒(Beeler)和范·怀克寇林格(vanWykeCoelingh)，1989)来产生标准曲线。N＝4，显示了平均数和SEM。
图45A-B是显示RSV激发后4天的肺细胞因子滴度的图：将在激发后4天从肺匀浆分离的上清液中的IFNγ和IL-5肺细胞因子滴度通过博尔普莱斯(Bioplex)多重细胞因子分析来测量。显示了N＝4个小鼠，以及SEM。
图46A-C是显示RSV激发后4天的肺细胞因子滴度的图：嗜酸性粒细胞活化趋化因子(图46A)、IL-13(图46B)和RANTES(图46C)。将在激发后4天从肺匀浆分离的上清液中的肺细胞因子滴度通过博尔普莱斯(Bioplex)多重细胞因子分析来测量。显示了N＝4个小鼠，以及SEM。
图47A-B是显示通过ELISPOT进行的CD8T-细胞F-肽脾细胞再刺激的图。在免疫后11天(图47A)或激发后4天(图47B)将脾分离。将脾细胞用F-特异性CD8T-细胞表位刺激并且将IFNγ分泌细胞的数目通过ELISPOT测定来确定。显示了4只小鼠的组平均数。通过单因子ANOVA和杜克(Tukey)事后测试进行的统计分析。
图48A-D是显示在血清反应阳性的棉鼠中的总RSVFIgG血清应答的图。将总抗FIgG血清水平通过在用于以1:100的稀释度的个体小鼠血清的RSVsF涂覆板上的ELISA来量化。显示针对第28天和第38天的N＝8个动物的组平均数以及针对在第49天和第56天的N＝5个动物的组平均数，以及SD。从以2周时间间隔经鼻内接受了4次重复连续免疫的1x106PFURSVA2的棉鼠汇集棉鼠阳性对照血清。从未致敏动物汇集棉鼠阴性对照血清。
图49A-B是显示在血清反应阳性的棉鼠中的中和抗体应答的图。将在第28天和第49天的中和Ab滴度通过使用3.3的较低LOD的微量中和法测定来量化。滴度是产生了50％FFU降低的稀释度的EC50计算的log2。显示了针对第28天的N＝8个动物以及针对第49天的N＝5个动物的组平均数和SD。如果该第一血清稀释度(1:10)未提供荧光聚焦单位(FFU)计数<＝输入病毒的50％，那么该滴度被报道为10，并且3.3[log2(10)]的值被输入用于分析。
图50A-C是显示在血清反应阳性的棉鼠中的中和抗体滴度的倍数增加的图。将在第28、38、49和56天的中和Ab滴度通过微量中和法测定来量化。将EC50值计算为产生50％输入病毒FFU降低的稀释度。通过将在指示的天数的EC50值除以每个棉鼠的在第28天的EC50值来计算倍数增加。显示了针对第38天的N＝8个动物以及针对第49和56天的N＝5个动物的组几何均数，具有95％置信区间。一个值指示在中和滴度中无加强。
图51A-C是显示在血清反应阳性的棉鼠中在第56天的位点特异性抗体应答的图。将来自第56天的个体动物的血清通过用分别结合至位点A、B和C的1112和1331H的竞争ELISA经RSVF位点-特异性抗体的1:25至1:2×106的稀释范围进行评价。针对个体血清，显示处于1:125的代表性稀释度的竞争百分比(100×[1-{血清OD/mAbOD平均数}])。显示了N＝5个动物的组平均数以及SD。
图52A-B是显示在血清反应阳性的棉鼠中的总RSVFIgG血清应答的图。将总抗FIgG血清水平通过具有6.6log2的LOD的在针对个体小鼠血清的RSV-sF涂覆板上的终点稀释度ELISA来量化。将终点计算为导致OD大于2倍空白组平均数的最高稀释度的log2。如果该第一血清稀释度(1:100)不是高于2倍空白组平均数，那么将该滴度报道为100，并且使用6.6(log2100)的值用于分析。显示了N＝11个动物的组平均数以及SD。从以2周时间间隔经鼻内接受了4次重复连续免疫的1x106PFURSVA2的棉鼠汇集棉鼠阳性对照血清。从未致敏动物汇集棉鼠阴性对照血清。通过单因子ANOVA和杜克(Tukey)事后测试进行的统计分析。
图53是显示在血清反应阳性棉鼠中的RSVF特异性IgG滴度的倍数增加的图。将RSVsF-特异性IgG滴度在第28和第3天进行量化。将该倍数增加通过自乘2至以下获得的值的幂来计算，该值是通过从每个棉鼠的在第38天的log2终点滴度中减去在第28天的log2终点滴度而获得的。显示了N＝11个动物的组几何均数，具有95％置信区间。虚线是在Y＝1和Y＝4处。一个值指示在中和滴度中无加强。从以2周时间间隔经鼻内接受了4次重复连续免疫的1x106PFURSVA2的棉鼠汇集棉鼠阳性对照血清。从未致敏动物汇集棉鼠阴性对照血清。
图54A-B是显示在血清反应阳性的棉鼠中的RSV中和抗体应答的图。将在第28天和第38天的中和Ab滴度通过使用3.3的较低LOD的微量中和法测定来量化。滴度是产生了50％FFU降低的稀释度的EC50计算的log2。显示了N＝11个动物的组平均数以及SD。如果该第一血清稀释度(1:10)未提供荧光聚焦单位(FFU)计数<＝输入病毒的50％，那么该滴度被报道为10，并且3.3[log2(10)]的值被输入用于分析。从以2周时间间隔经鼻内接受了4次重复连续免疫的1x106PFURSVA2的棉鼠汇集棉鼠阳性对照血清。从未致敏动物汇集棉鼠阴性对照血清。通过单因子ANOVA和杜克(Tukey)事后测试进行的统计分析。
图55是显示在血清反应阳性棉鼠中的RSV中和抗体滴度的倍数增加的图。将在第28和38天的中和Ab滴度通过微量中和法测定来量化。将EC50值计算为产生50％输入病毒FFU降低的稀释度。通过将在指示的天数的EC50值除以每个棉鼠的在第28天的EC50值来计算倍数增加。显示了N＝11个动物的组几何均数，具有95％置信区间。这些虚线是在1和4处。一个值指示在中和滴度中无加强。
图56A-C是显示在血清反应阳性的棉鼠中在第38天的位点特异性抗体应答的图。将来自第56天的个体动物的血清通过用分别结合至位点A、B和C的1112和1331H的竞争ELISA经RSVF位点-特异性抗体的1:25至1:2×106的稀释范围进行评价。针对个体血清，显示处于1:125的代表性稀释度的竞争百分比(100×[1-{血清OD/mAbOD平均数}])。显示了N＝11个动物的组平均数以及SD。从以2周时间间隔经鼻内接受了用1x106PFU的RSVA2的4次重复连续免疫的棉鼠汇集棉鼠阳性对照血清。从未致敏动物汇集棉鼠阴性对照血清。通过单因子ANOVA和杜克(Tukey)事后测试进行的统计分析。
图57A和B是展示在个体猕猴中从第-7天直到第183天的抗FIgG抗体滴度的时程的图。将疫苗(针对组1的RSVsF或针对组2的RSVsF+GLA-SE)在如通过箭头指示的第0、28和169天进行给予。将针对个体动物的抗FIgG滴度以在测试时间点处的log2值呈现，其中测定检出限为6.6log2(等于1:100血清稀释度)。将低于该检出限的值估算为6.0以用于形象化。
图58A和B是展示在个体猕猴中从第-7天直到第183天的RSV中和抗体滴度的时程的图。将疫苗(针对组1的RSVsF或针对组2的RSVsF+GLA-SE)在如通过红色箭头指示的第0、28和169天进行给予。将针对个体动物的中和IC50滴度以在测试时间点处的log2值呈现，其中测定检出限为2.3log2(等于1:5血清稀释度)。将低于该检出限的值估算为2.3以用于形象化。
图59A和B是展示在个体猕猴中从第-7天直到第183天的IFNγELISPOT应答的时程的图。将疫苗(针对组1的RSVsF或针对组2的RSVsF+GLA-SE)在如通过红色箭头指示的第0、28和169天进行给予。针对每个动物的个体结果以在测试时间处的斑点形成细胞(SFC)/百万PBMC呈现。应答者(展示4倍升高和>50SFC/百万自基线改变两者的动物)由星号指示。
详细说明
1.定义
除非在此另外定义，否则科技术语应当具有本领域的普通技术人员通常所了解的意义。另外，除非上下文另外需要，否则单数形式的术语应当包括复数形式并且复数形式的术语应当包括单数形式。
如此处使用的术语“约”是指容易为本领域普通技术人员所知的相应值的容许误差的范围。
如在此所使用，该术语“佐剂”是指一种化合物，当其与特异的免疫原组合使用时将增大或否则改变或修饰所产生的免疫应答。修改免疫应答可以包括增强或扩大抗体和细胞免疫应答的两者之一或两者的特异性。修改免疫应答还可以表示降低或抑制某些抗原特异性免疫应答。
术语“抗体”意指通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合一个靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述物质的组合的一个免疫球蛋白分子。如此处使用，术语“抗体”包括完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(abs')2和Fu片段)、单一链Fu(scFv)突变体、从至少两种完整抗体中产生的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包括抗体的抗原就决定部分的融合蛋白、以及包括抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所希望的生物活性。术语“抗体”还可以是指具有的分子量为约150kDa的Y形糖蛋白，其由四个多肽链组成：两个轻(L)链和两个重链(H)。存在五种类型的由希腊字母alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)表示的哺乳动物Ig重链同种型。重链类型定义抗体的“类别”，即分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。基于恒定结构域序列和功能差异，γ和α类别进一步分成亚类，例如IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在哺乳动物中存在两种类型的免疫球蛋白轻链，λ和κ。抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链和轻链的可变结构域可以分别被称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变部分(相对于相同类别的其他抗体)并且包含抗原结合位点。
如在此所使用，术语“抗原配制品”或“抗原组合物”是指一种制剂，当其被给予至脊椎动物(尤其是鸟或哺乳动物)时将诱导免疫应答。
如在此所使用，生命的阶段包括：青年、生殖成熟个体和老年。术语“青年”是指从新生到哺乳动物已经达到生殖成熟点的哺乳动物。术语“生殖成熟个体”是指处于一个年龄的哺乳动物，其中该种哺乳动物通常能够交配并繁殖。如在此所使用，术语“老年”是指从生殖成熟个体到死亡的哺乳动物。该术语“老年”可以依据年表(即年龄)；社会角色的变化(即工作模式的变化、孩子的成人状态和更年期)；和/或能力的变化(即无效状态、衰老和物理特性的变化)来定义。依据年表，当提及人哺乳动物时，术语“老年”总体上是指已经达到实龄为至少约50、55、60或65年龄的人。
如在此所使用，“病毒融合蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白”是指任意病毒融合蛋白，包括但不限于，天然病毒融合蛋白或可溶性病毒融合蛋白(包括重组病毒融合蛋白)、合成产生的病毒融合蛋白，以及提取自细胞的病毒融合蛋白。如在此所使用，“天然病毒融合蛋白”是指自然中存在的、由天然发生的病毒基因或病毒RNA编码的病毒融合蛋白。术语“可溶性融合蛋白”或“可溶性F蛋白”是指缺乏功能膜相关区域的融合蛋白，典型地位于天然蛋白的C-末端区域中。如在此所使用，术语“重组病毒融合蛋白”是指衍生自工程化核苷酸序列的病毒融合蛋白并且是体外和/或体内表达系统中产生的。病毒融合蛋白包括来自不同病毒和病毒菌株(包括但不限于人类以及非人类)的病毒菌株的相关蛋白。病毒融合蛋白包括I类和II类病毒融合蛋白。多种RSV-融合蛋白已经被描述并且是本领域技术人员已知的。
如在此所使用，术语“免疫原”或“抗原”是指能够引发免疫应答的物质，诸如蛋白、肽、肽、核酸。这两个术语还包括表位，并且可以互换使用。
如在此所使用，术语“免疫原性配制品”是指一种制剂，当其被给予至脊椎动物(例如哺乳动物)时将诱导免疫应答。
如在此所使用，“药物组合物”是指一种组合物，该组合物包括治疗有效量的RSV-F蛋白与药学上可接受的载体和(如果希望的话)一种或多种稀释剂或赋形剂一起。如在此所使用，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的监管机构批准的或者美国药典、欧洲药典或其他公认药典中列出的在哺乳动物中，并且更尤其是在人类中使用的。
如在此所使用，术语“药学上可接受的疫苗”是指包含以能够被给予至脊椎动物的形式的RSV-F免疫原的配制品，并且其诱导足以诱导免疫力的保护性免疫应答以预防和/或减轻感染或疾病，和/或以减少感染或疾病的至少一种症状。在一个实施例中，该疫苗预防或减少受试者中的RSV感染的至少一种症状。RSV的症状是本领域众所周知的。它们包括鼻漏、咽喉痛、头痛、声嘶、咳嗽、痰、发热、啰音、喘息和呼吸困难。因此，在一个实施例中，该方法可以包括预防或减少与RSV感染相关的至少一种症状。症状的减少可以主观地或客观地确定，例如通过受试者的自我评价、通过临床医生的评价或通过进行适当的测定或测量(例如体温)，包括例如生活质量评价、RSV感染或其他症状的减缓进展、RSV症状降低的严重程度或适合的测定(例如抗体滴度和/或T-细胞激活测定)。
如在此所使用的，术语“有效量”是指抗原必需的或足以实现希望的生物效应的量。术语“有效剂量”通常是指可以诱导足以诱导免疫力的保护性免疫应答以预防和/或减轻感染或疾病和/或以减少感染或疾病的至少一种症状的抗原量。术语“治疗有效量”是指对给定病症和给药方案提供治疗效果的量。
如在此所使用，术语“未致敏”是指先前未被暴露于具体的抗原(例如RSV)的人或免疫系统。未致敏人或免疫系统不具有针对抗原的可检出的抗体或细胞应答。术语“血清反应阳性”是指先前已经被暴露于具体抗原并因此具有针对该感兴趣的抗原的可检出的血清抗体滴度的哺乳动物或免疫系统。术语“RSV血清反应阳性”是指先前已经被暴露于RSV抗原的哺乳动物或免疫系统。血清反应阳性的人或免疫系统可以通过指示先前暴露于具体抗原的血清中的抗体或其他免疫标记物的存在来鉴定。
如在此所使用，短语“保护性免疫应答”或“保护性应答”是指通过抗体介导的针对传染原或疾病的免疫应答，通过脊椎动物(例如人)展现，预防或减轻感染或减少其至少一种疾病症状。在此所描述的RSV-F蛋白疫苗可以刺激抗体的产生，这些抗体例如中和传染原、阻断传染原进入细胞、阻断传染原的复制，和/或保护宿主细胞避免感染和破坏。该术语也可以指由脊椎动物(例如人)所展现的由T淋巴细胞和/或其他白细胞所介导的针对传染原或疾病的免疫应答，该免疫应答预防或减轻感染或疾病或减少其至少一种症状。
如在此所使用，术语“脊椎动物”或“受试者”或“患者”是指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于人和其他灵长类动物，包括非人灵长类动物诸如黑猩猩和其他猿和猴物种。家畜诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物诸如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠(包括棉鼠)和豚鼠；鸟包括驯养、野生和猎鸟诸如鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟、鸭、鹅，以及类似物也是非限制性实例。术语“哺乳动物”和“动物”被包括在这个定义中。旨在涵盖成年以及新生个体。具体而言，婴儿和幼儿是用于RSV疫苗的适当的受试者或患者。
如在此所使用，术语“疫苗”是指致死或消弱病原体或衍生自病原体的抗原决定簇的制剂，其中该制剂被用来诱导针对病原体的抗体的形成或免疫力。此外，该术语“疫苗”还可以指被给予至脊椎动物的免疫原(例如RSV-F蛋白)的悬浮液或溶液，例如以产生保护性免疫力，即预防或减少与感染相关的疾病的严重程度的免疫力。
2.病毒融合糖蛋白
在经由膜融合诱导的病毒感染过程中，病毒融合糖蛋白介导病毒进入到宿主细胞中，并且包括具有或不具有信号肽的前体(F0)蛋白，以及激活的和/或成熟的片段，包括F1和F2亚基。如在此所使用，术语“成熟的”以及“激活的”是指已经通过宿主蛋白酶从前体蛋白转换为成熟融合蛋白的病毒融合蛋白。典型地，激活的病毒融合蛋白包括膜-锚定亚基以及膜-远端亚基，其分别称为F1和F2。活性的F1和F2亚基通常经由一个二硫键连接在一起。
3.人呼吸道合胞体病毒(RSV)蛋白
人呼吸道合胞体病毒(RSV)是副粘病毒(Paramyxoviridae)科、肺炎病毒(Pneumovirinae)亚科和肺炎病毒(Pneumovirus)属的成员。RSV被分为两个亚组A和B，其主要在G基因和编码的蛋白上有差别。RSV是包膜病毒，其特征在于编码三种膜结构蛋白(F、G和SH)、两个基质蛋白(M和M2)、三个核衣壳蛋白(N、P和L)和两个非结构蛋白(NS1和NS2)的单链反义RNA基因组。
RSV的两个主要保护性抗原是在呼吸道合胞体病毒(RSV)的表面上表达的包膜融合(F)和附着(G)糖蛋白，并且已经显示是中和抗体的靶标。这两种蛋白还主要负责病毒识别和进入到靶细胞中。G蛋白结合至特异性细胞受体并且F蛋白促进该病毒与该细胞的融合。该F蛋白还在被感染的细胞的表面表达并且负责随后与其他导致合胞体形成的细胞融合。因此，F蛋白的抗体可以中和病毒或阻断病毒进入到细胞或预防合胞体形成。虽然A和B亚型之间的抗原和结构差异已经针对G和F蛋白两者被描述，但是更显著的抗原差异位于G蛋白上。相反地，升至F蛋白的抗体显示亚型A和B病毒之间高度的交叉反应性。因此，F蛋白是用于中和RSV的有吸引力的靶标，因为它存在于病毒表面上并且因此易进入免疫监视。此外，与G蛋白相比，F蛋白不易变异。
F蛋白是I类跨膜表面蛋白，其具有N-末端切割的信号肽和C-末端附近的膜锚着点。实质上，该RSV-F蛋白被表达为单一失活的574位氨基酸前体，被命名为F0。在体内，F0在内质网中寡聚化并且经内切蛋白酶蛋白质水解加工以产生包含两个二硫化物连接的亚单元(F1和F2)的连接异二聚体。这些片段中较小的被称为F2并且源自F0前体的N-末端部分。通过切割产生的F1亚单元的N-末端包含疏水性结构域(该融合肽)，其与宿主细胞膜相关并且促进病毒或被感染的细胞的膜与靶细胞膜的融合。在一个实施例中，该F-蛋白是F1/F2异源二聚体的三聚体或多聚体。
用于在在此所述的组合物中使用的适合的RSV-F蛋白可以是本领域中已知的任何RSV菌株或分离群，包括，例如，人的菌株像A2，Long，ATCCVR-26，19，6265，E49，E65，B65，RSB89-6256，RSB89-5857，RSB89-6190，以及RSB89-6614；或牛的菌株像ATue51908，375，以及A2Gelfi；或羊的菌株。
在一个实施例中，用于在此使用的RSV-F蛋白可以包括与在此提供的RSV-F氨基酸序列是至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，或相对于在此提供的RSV-F氨基酸序列可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰。例如，野生型RSV-F人菌株A2的氨基酸序列例如在SEQIDNO:2中给出。
天然的、全长的病毒融合蛋白典型地包括膜相关区域。可以产生重组可溶性病毒融合蛋白，其缺乏常位于该天然蛋白的C-末端区域的功能膜相关区域。重组可溶性病毒融合蛋白可以通过病毒融合蛋白的功能膜相关区域的缺失、突变、或本领域中已知的任何破坏模式产生。例如，该膜相关区域的任意部分或全部可以被去除或修饰，其条件是该膜相关区域是功能未检出的(例如，不再存在于该膜中的区域)，以及(ii)一定百分率的膜相关区域残余物(例如，约50％或更少的残余物)被去除(例如，约50％或更多的去除)或经修饰(例如，约50％或更高的修饰)。被破坏的膜相关区域(不再赋予蛋白与质膜的相关性)的程度可以通过本领域中已知的、可以评估蛋白的膜相关性的任何技术来确定。例如，可以进行该病毒融合蛋白以及已知的膜相关蛋白的共免疫染色对保留在该膜中的蛋白进行显影。在此提供了可溶性病毒融合蛋白的实例并且包括可溶性RSV-F蛋白。可溶性RSV-F蛋白在此还被称为RSV-sF。可溶性RSV-F可以通过，例如，对应于SEQIDNO:2的525-574位氨基酸的、RSV-F蛋白的50个氨基酸C-末端跨膜结构域的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的缺失产生。用于可溶性RSV-F的氨基酸序列在SEQIDNO:7中给出。
已经鉴定了针对呼吸道合胞体病毒的A2菌株(RSV-FA2)的融合糖蛋白的三个不重叠的抗原位点(A、B和C)和一个桥连位点(AB)。(比勒(Beeler)和怀克寇林格(WykeCoelingh)，(1989)“呼吸道合胞体病毒的F糖蛋白的中和表位：突变对融合功能的影响(NeutralizationEpitopesoftheF糖蛋白ofRespiratorySyncytialVirus:EffectofMutationuponFusionFunction)，”《病毒学杂志》(J.Virol.)63(7):2941-2950)。在一个实施例中，该RSV-F蛋白包括一个或多个完整的A、B或C中和表位。在一个实施例中，该RSV-F蛋白包括至少A表位。在另一个实施例中，该RSV-F蛋白包括至少B表位。在另一个实施例中，该RSV-F蛋白包括至少C表位。在其他实施例中，该RSV-F蛋白包括至少A和B表位、至少B和C表位、或至少A和C表位。在另一个实施例中，该RSV-F蛋白包括所有三个中和表位(即A、B和C)。
4.RSV-F的重组表达
在一个实施例中，疫苗组合物包括RSV-F蛋白。如在此所使用，术语“RSV-F蛋白”是指全长野生型RSV-F蛋白连同其变体和片段，例如包括RSV可溶性F蛋白(还被称为RSV-sF)。在一个实施例中，该疫苗组合物包括重组产生的RSV-F蛋白。在更具体实施例中，该疫苗组合物包括重组产生的可溶性RSV-F蛋白。
为了重组产生RSV-F蛋白，可以将编码该病毒融合蛋白的开放阅读框(ORF)插入或克隆到一个载体中，用于该载体的复制、该载体部分的转录(例如，ORF的转录)和/或细胞中蛋白的表达。术语“开放阅读框”(ORF)是指编码病毒融合蛋白(例如可溶性病毒融合蛋白)的核酸序列，该核酸序列位于起始密码子(在核糖核酸中为AUG并且在脱氧核糖核酸中为ATG)和终止密码子(例如在核糖核酸中为UAA(赭石)、UAG(琥珀)或UGA(蛋白石))并且在脱氧核糖核酸中为TAA、TAG或TGA)之间。
载体还包括促进ORF或其他核酸元件的克隆、复制、转录、翻译和/或选择的元件。因此，载体可以包括以下元件中的一个或多个或全部：一个或多个启动子元件、一个或多个5'非翻译区(5'UTR)、靶核苷酸序列可以插入其中的一个或多个区域(“插入元件”)、一个或多个ORF、一个或多个3'非翻译区(3'UTR)、以及一个选择元件。可以使用本领域中已知的任何便利克隆策略来将一个元件，诸如ORF合并到一个载体核酸中。
描述可适用于本发明的分子生物技术(诸如克隆、突变、细胞培养以及类似物)的一般性文献包括贝格尔(Berger)和基梅尔(Kimmel)，分子克隆技术指南(GuidetoMolecularCloningTechniques)，酶学方法(MethodsinEnzymology)第152卷学术出版公司(AcademicPress,Inc.)，圣地亚哥，加州(“贝格尔”)；萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆--实验手册(MolecularCloning--ALaboratoryManual)(第3版)，第1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，2000(“萨姆布鲁克”)以及当代分子生物学实验方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人，编著，当代方案(CurrentProtocols)，格林出版协会公司(GreenePublishingAssociates,Inc.)与约翰&威利父子公司(JohnWiley&Sons,Inc.)之间的合资企业，(“奥苏贝尔”)。这些文献描述诱变、载体的使用、启动子和许多其他与例如克隆并突变RSV-F蛋白有关的相关主题。此外，可溶性病毒融合蛋白的克隆策略更全面地描述在标题为可溶性病毒融合糖蛋白在哺乳动物细胞中的表达的WO2012/103496中。这些参考文献的披露内容特此通过引用以其全文结合在此。
在此所述的组合物还包括RSV-F的比变体。这些变体可以包含RSV-F蛋白的氨基酸序列的改变。相对于蛋白的术语“变体”是指通过相对于参照序列的一种或多种氨基酸而改变的氨基酸序列。该变体可以包括“保守性”改变和/或“非保守性”改变。其他变异还可以包括氨基酸缺失、插入、取代或其组合。可以使用本领域中熟知的计算机程序(例如DNASTAR软件)发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除生物或免疫活性的指导。
在一个实施例中，在此提供的、编码病毒融合蛋白的核酸可以通过改变整个核苷酸序列的一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸碱基进行修饰。如在此所使用，“核苷酸碱基”是指四种脱氧核糖核酸碱基，腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、以及胸腺嘧啶(T)中的任一种，或是四种核糖核酸碱基，腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、以及尿嘧啶(U)中的任一种。如在此所使用，“密码子”是指用于编码特定氨基酸的一连串的三个核苷酸碱基。通常，每个氨基酸可以由一个或多个密码子编码。表1列出了针对每个氨基酸的实质上全部的密码子可能性。
在一个实施例中，编码RSV-F的核酸可以包括一个或多个取代。能以非保守性方式或以保守性方式进行这些取代以改变所得到的蛋白质中的氨基酸。保守性改变通常导致所得到的蛋白质的结构和功能中的较少改变。非保守改变更可能改变所得到的蛋白质的结构、活性或功能。在一个实施例中，编码RSF-F的核酸包括一种或多种保守性氨基酸取代，其未显著地改变所得的蛋白的活性或结合特征。
如在此所使用，术语“保守性取代”是指其中一种或多种氨基酸残基被结构不同但化学特性相似的残基取代，诸如其中一个疏水性残基被一个疏水性残基取代或其中一个酸性残基被另一个酸性残基取代或一个极性残基被另一个极性残基取代或一个碱性残基被另一个碱性残基取代。非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。包含芳香族环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。荷正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。荷负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守性取代的更具体实例包括但不限于Lys置换Arg，并且反之亦然，这样使得正电荷可以被维持；Glu置换Asp，并且反之亦然，这样使得负电荷可以被维持；Ser置换Thr，这样使得游离-OH可以被维持；以及Gin置换Asn，这样使得游离NH2可以被维持。在一个实施例中，该RSV-F免疫原包括一个或多个保守的或非保守的氨基酸取代。在一个实施例中，该RSV-F免疫原包括一个或多个保守的氨基酸取代。
如在此所使用的术语“一致的”是指两个或更多个核苷酸序列当彼此比较时，具有实质上相同的核苷酸序列。用于确定两个核苷酸序列或氨基酸序列是否实质上一致的一个试验是确定共享的、一致的核苷酸序列或氨基酸序列百分比。
可以如以下进行序列一致性的计算。出于最佳比对的目的将序列对齐(例如，在一个第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入空位以用于最佳对其并且出于比较目的，非同源序列可以被忽视)。出于比较目的对齐的参比序列的长度有时是该参比序列长度的30％或更高、40％或更高、50％或更高，通常是60％或更高，并且更通常是70％或更高、80％或更高、90％或更高、或100％。然后，在相应核苷酸或多肽位置处的核苷酸或氨基酸分别与这两个对齐的序列进行比较。当该第一序列中的一个位置被与该第二序列中的对应位置相同的核苷酸或氨基酸占据时，该核苷酸或氨基酸被认为是在那个位置处一致的。两个序列之间的百分比一致性是这些序列共享的多个一致性位置的一个函数，考虑了空位数目以及每个空位的长度，引入以用于两个序列的最佳对齐。
序列比较以及两个序列之间的百分比一致性的确定可以使用数学算法完成。两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比一致性可以使用迈耶斯&米勒(Meyers&Miller)算法，CABIOS4:11-17(1989)，其已经结合到ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12以及空位罚分4来确定。同样地，两个氨基酸序列之间的百分比一致性可以使用Needleman&Wunsch(尼德曼&温驰)，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)48:444-453(1970)算法，其已经被结合到GCG软件包(在http地址www.gcg.com可得)中的GAP程序里，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵来确定。经常与Blossum62打分矩阵一起使用的一套参数包括空位开放罚分12、空位延伸罚分4、以及移码空位罚分5。两个核苷酸序列之间的百分比一致性可以使用GCG软件包(在http地址www.gcg.com可得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及空位权重60和长度权重4来确定。
用于确定两个核酸是否实质上一致的另一种方法是在严格条件下评估一个多核苷酸与将要杂交一个核酸的另一个核酸是否同源。如在此所使用，术语“严格条件”是指用于杂交和洗涤的条件。严格条件是本领域的普通技术人员已知的并且可以发现于分子生物学当前技术(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，约翰威利父子出版社(JohnWiley&Sons)，N.Y.,6.3.1-6.3.6(1989)中。水性和非水性方法描述于参考文献中并且可以使用任何一种。严格杂交条件的一个实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃进行杂交，随后在0.2XSSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤一次或多次。严格杂交条件的另一个实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃进行杂交，随后在0.2XSSC、0.1％SDS中在55℃下洗涤一次或多次。严格杂交条件的另外的实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、在大约45℃下的杂交，随后在0.2XSSC、0.1％SDS中在60℃下洗涤一次或多次。经常地，严格杂交条件是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、在大约45℃下的杂交，随后在0.2XSSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤一次或多次。更经常地，严格条件是在0.5M磷酸钠、7％SDS、在65℃，随后在0.2XSSC、1％SDS中在65℃下洗涤一次或多次。
在过去，呼吸道合胞体病毒(RSV)的融合活性的研究已经受到低重组表达水平的阻碍。具体而言，从标准表达载体的重组F蛋白表达水平与在RSV复制过程中观察到的F蛋白表达水平相比趋向于是低的(黄(Huang)等人(2010)，“重组呼吸道合胞体病毒F蛋白表达受到无效核输出和mRNA加工的阻碍(RecombinantrespiratorysyncytialvirusFproteinexpressionishinderedbyinefficientnuclearexportandmRNAprocessing)，”病毒基因(VirusGenes)，40:212-221)。该差异可能归因于病毒和重组F蛋白表达之间的差异。总的来说，在病毒和重组F蛋白表达之间存在两种主要差异。首先，该F基因在病毒复制过程中的转录发生在细胞质中，然而在自标准哺乳动物表达载体的重组F蛋白表达过程中，转录发生在细胞核中。从病毒转录本的细胞核至细胞质的输出可能是有问题的，即使是对于通常在细胞核中复制的病毒。对于病毒转录本，认为该抑制是AU丰度的产物，其AU丰度与哺乳动物转录本相比是相当高的。因此，在一个实施例中，在F蛋白基因序列中的GC丰度可以被修饰以增强转录。(黄(Huang)等人(2010)，“重组呼吸道合胞体病毒F蛋白表达受到无效核输出和mRNA加工的阻碍(RecombinantrespiratorysyncytialvirusFproteinexpressionishinderedbyinefficientnuclearexportandmRNAprocessing)，”病毒基因(VirusGenes)，40:212-221)。
在此提供的核苷酸序列可以通过改变一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸碱基进行修饰以使得编码的病毒融合蛋白的氨基酸序列类似于未修饰的核苷酸序列编码的蛋白的氨基酸序列。在一个实施例中，该RSV-融合蛋白的氨基酸序列与由未修饰的野生型RSV-F序列(诸如在SEQIDNO:2中所示的RSV-F序列或在SEQIDNO:7中所示的可溶性RSV-F序列)编码的蛋白是至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的。在一些实施例中，通过修饰的核苷酸序列编码的氨基酸序列与由在SEQIDNO:2中所示的RSV-F的未修饰的野生型核苷酸序列或在SEQIDNO:7中所示的可溶性RSV-F的氨基酸序列编码的氨基酸序列是100％一致的。
如在表1中指出的，氨基酸和终止密码子的一个子集可由至少两个密码子可能性编码。例如，谷氨酸可由GAA或GAG编码。如果用于谷氨酸的密码子存在于如GAA的核酸序列之内，在第三位上的核苷酸碱基从A变为G，将导致仍然编码谷氨酸的修饰的密码子。因此，一个密码子中的一个或多个核苷酸碱基的特定变化仍然可以导致相同氨基酸的编码。在一些情况下，这个过程在此称作密码子优化。在此提供了针对已经通过改变一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的RSV-F(列举于SEQIDNO:8与9中)的核苷酸序列的实例，其中所得的RSV-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列举于SEQIDNO:2中)编码的氨基酸序列是一致的。在此还提供了，例如，针对已经通过改变一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的可溶性RSV-F(列举于SEQIDNO:4、5与6中)的核苷酸序列，由此该sRSV-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列举于SEQIDNO:7中)编码的氨基酸序列一致。
在一个实施例中，编码RSV-F蛋白(例如包括可溶性RSV-F)的核苷酸序列可以通过改变一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸碱基进行修饰以使得a)编码的病毒融合蛋白的氨基酸序列与未修饰的核苷酸序列编码的蛋白的氨基酸序列类似或一致；以及b)鸟嘌呤与胞嘧啶的组合百分数(％GC)相较于该未修饰的核苷酸序列在该修饰的核苷酸序列中增加。例如，在该修饰的核酸序列中的％GC可以是至少约45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。如在表1中指出的，可以进行密码子第一、第二和/或第三位置上的核苷酸碱基变化，这样使得A或T变为G或C同时保留氨基酸和/或终止密码子分配。
在此提供了针对已经通过改变一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的RSV-F(列举于SEQIDNO:9中)的核苷酸序列的一个实例，其中该RSV-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列举于SEQIDNO:2中)编码的氨基酸序列一致，并且鸟嘌呤与胞嘧啶的组合百分数(％GC)相较于该未修饰的核苷酸序列(35％GC；列举于SEQIDNO:1中)在该修饰的核苷酸序列中增加。在此还提供了，例如，针对已经通过改变一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的可溶性RSV-F(例如，列举于SEQIDNO:4、5与6中)的核苷酸序列，这样使得该sRSV-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列举于SEQIDNO:7中)编码的氨基酸序列一致，并且鸟嘌呤与胞嘧啶的组合百分数(％GC)相较于该未修饰的核苷酸序列(35％GC；列举于SEQIDNO:3中)在该修饰的核苷酸序列(对于SEQIDNO:4为46％GC；对于SEQIDNO:6为51％GC；对于SEQIDNO:5为58％GC)中增加。
在此提供的核苷酸序列可以通过改变一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸碱基进行修饰以使得a)编码的病毒融合蛋白的氨基酸序列与未修饰的核苷酸序列编码的蛋白的氨基酸序列类似或一致；b)鸟嘌呤与胞嘧啶的组合百分数(％GC)相较于该未修饰的核苷酸序列在该修饰的核苷酸序列中增加；以及c)在该核苷酸密码子的第三位置上的鸟嘌呤与胞嘧啶的总的组合百分数(％GC3)相较于该未修饰的核苷酸序列在该修饰的核苷酸序列中增加。在一个实施例中，该％GC3是至少约55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。如在表1中指出的，大部分核苷酸碱基改变可能性存在于该核苷酸密码子的第三位置上。在一些实施例中，每一个密码子，包括终止密码子，在该核苷酸密码子的第三位置上已经具有G或C或可以被修饰为在该核苷酸密码子的第三位置上具有G或C而不改变氨基酸分配。因此，对于任何给出的核苷酸序列，在该整个核苷酸序列中，在每一个核苷酸密码子的第三位置上可能具有高达100％的G或C(GC3)。在一个实施例中，在此提供了针对已经通过改变一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的RSV-F(列举于SEQIDNO:9中)的核苷酸序列，由此该RSV-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列举于SEQIDNO:2中)编码的氨基酸序列一致，并且在该核苷酸密码子的第三位置上的鸟嘌呤与胞嘧啶的总的组合百分数相较于该未修饰的核苷酸序列(31％GC3；列举于SEQIDNO:1中)在该修饰的核苷酸序列(100％GC3)中增加。在一个实施例中，在此还提供了针对已经通过改变一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的sRSV-F(列举于SEQIDNO:4、5与6中)的核苷酸序列，由此该sRSV-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列举于SEQIDNO:7中)编码的氨基酸序列一致，并且在该核苷酸密码子的第三位置上的鸟嘌呤与胞嘧啶的总的组合百分数相较于该未修饰的核苷酸序列(31％GC3；列举于SEQIDNO:3中)在该修饰的核苷酸序列(对于SEQIDNO:4为58％GC3；对于SEQIDNO:6为76％GC3；对于SEQIDNO:5为100％GC3)中增加。
在一个实施例中，该RSV-F蛋白(包括在一些实施例中的可溶性RSF-F蛋白)具有GC含量为至少约45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的分离的核酸序列，并且该核酸序列编码具有与SEQIDNO:2或SEQIDNO:7是至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的RSV-F蛋白(包括例如可溶性RSV-F蛋白)。在另一个实施例，该核苷酸序列与SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9是60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、98％、99％或100％一致的。在一个实施例中，该可溶性病毒融合蛋白缺乏功能膜相关区域。在更具体的实施例中，该可溶性病毒融合蛋白缺乏相对应于SEQIDNO:2的525至574位氨基酸的C-末端跨膜区域氨基酸。
在某些实施例中，还提供了分离的核酸，该核酸包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列(i)具有至少约51％的GC含量，(ii)与SEQIDNO:1是至少73％一致性的，并且(iii)编码包括与SEQIDNO:2具有至少90％一致性的一个氨基酸序列的一种病毒融合蛋白。
在一个实施例中，编码RSV-F蛋白的核酸序列与SEQIDNO:1是至少约60％60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、98％或99％一致的。
例如，通过化学修饰或翻译后修饰，可以进一步修饰重组病毒融合蛋白。此类修饰包括但不限于，聚乙二醇化、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化、羧基化、羟基化、hasylation、氨基甲酰化、硫酸化、磷酸化、以及本领域中已知的其他多肽修饰。在此提供的病毒融合蛋白可以进一步通过初级氨基酸序列的稀释，通过一个或多个氨基酸的缺失、添加、或置换进行修饰。
在一个实施例中，该病毒融合蛋白通过翻译后糖基化来修饰。重组病毒融合蛋白可以是完全糖基化、部分糖基化、去糖基化或非糖基化的。在一些实施例中，重组病毒融合蛋白(例如RSV-F融合蛋白)可以具有类似于、实质上等同于、或等同于天然对应物蛋白(例如，里克森(Rixon)等人，2002《普通病毒学杂志》(J.Gen.Virol.)83:61-66)的糖基化特性的糖基化特性。重组病毒融合糖蛋白可以包括本领域中已知的多个糖苷键中的任一个。
适用于在在此所述的疫苗组合物中使用的RSV-F蛋白可以使用本领域已知的构建体和技术来表达和纯化。用于产生和纯化病毒融合蛋白(例如RSV-F)的系统和方法是已知的，并且更全面地描述在标题为哺乳动物细胞中可溶性病毒融合糖蛋白的表达(EXPRESSIONOFSOLUBLEVIRALFUSIONGLYCOPROTEINSINMAMMALIANCELLS)的WO2012/103496中，其披露内容特此通过引用以其全文结合在此。
5.疫苗配制品
如先前在本申请书的背景部分中所讨论的，RSV疫苗的开发已遭遇困难。虽然疫苗已成功开发用于其他病毒(诸如流感)，但是到目前为止，尚未已成功开发用于RSV的疫苗。从疫苗的观点来看，呼吸道病毒可以被分成两个原理组，即其中感染导致长期免疫力并且其继续生存需要不断突变的那些，以及其中感染导致不完全免疫力并且重复感染是常见的、甚至很少或没有突变的那些。流感病毒和呼吸道合胞体病毒(RSV)分别代表前者组和后者组。(参见鲍尔(U.E.Power)，2008“呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗-两个步骤支持一个飞跃(Respiratorysyncytialvirus(RSV)vaccines–Twostepsbackforoneleapforward)，”《临床病毒学杂志》(J.Clin.Virol.)41:38-44)。因此，虽然成功的疫苗已经针对流感病毒开发，但针对RSV情况不是这样，尽管已经进行了几十年的研究和研发了几种疫苗方法。
保护针对人类中的RSV疾病所需的RSV抗体和细胞免疫的平衡尚未被完全了解并且能够随着不同的年龄组而改变。例如在老年人中，比年轻人中，细胞应答更难以诱导，更多Th2-偏向性且衰退更迅速(库马尔(KumarR)和伯恩斯(BurnsEA)(2008)年龄相关的免疫力下降：对疫苗应答性的影响，《疫苗专家评论》(ExpertRevVaccines)7:467-479)。RSV-特异性T细胞应答特别是随着年龄的增长而下降(库西(CusiMG)等人(2010)T细胞介导的免疫应答中的年龄相关变化以及在健康受试者中对呼吸道合胞体病毒(RSV)的效应记忆(AgerelatedchangesinTcellmediatedimmuneresponseandeffectormemorytoRespiratorySyncytialVirus(RSV)inhealthysubjects)，《免疫衰老》(ImmunAgeing)7:14)。老年人个体仍可能死于严重的RSV疾病，尽管为具有RSV中和滴度为9-13log2的血清反应阳性(沃尔什(WalshEE)等人(2004)针对老年人中的严重呼吸道合胞体病毒感染风险因子(Riskfactorsforsevererespiratorysyncytialvirusinfectioninelderlypersons)，《传染病杂志》(JInfectDis)189:233-238)。老年人具有未见于年轻人的RSV应答性中的T细胞缺陷(库西(CusiMG)等人(2010)T细胞介导的免疫应答中的年龄相关变化以及在健康受试者中对呼吸道合胞体病毒(RSV)的效应记忆，《免疫衰老》(ImmunAgeing)7:14)，并且尽管具有与年轻人相似的中和抗体滴度(法尔塞(FalseyAR)等人(1999)年轻人和老年人中的呼吸道合胞体病毒体液免疫及对感染的应答的比较(Comparisonofrespiratorysyncytialvirushumoralimmunityandresponsetoinfectioninyoungandelderlyadults)，《医学病毒学杂志》(JMedVirol)59:221-226)，在感染后更易于患RSV疾病。这些观察表明针对老年人的有效RSV疫苗可能需要加强中和抗体和减弱RSV特定细胞介导的免疫两者。
如以上所提及的，老年人倾向于在其免疫应答中具有Th2偏向性。哺乳动物的细胞免疫应答包括T辅助细胞1(Th1)细胞免疫应答和T辅助细胞2(Th2)细胞免疫应答两者。基于每个应答中合成的细胞因子谱，Th1和Th2应答是可区别的。1型T细胞产生干扰素γ(IFN-γ)，为一种在病毒细胞-介导的免疫应答中涉及的细胞因子。因此，IFN-γ可以被称为“Th1-型细胞因子”。Th2细胞选择性地产生白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)和白细胞介素13(IL-13)，其参与体液免疫的发展并且在速发型超敏反应中具有重要作用。IL-4、IL-5和IL-13还可以被称为“Th2型细胞因子”。Th1应答还可以通过在该应答中产生的抗体亚型来鉴定。在啮齿动物模型中，Th1偏向性应答具有大于IgG1抗体滴度的IgG2a或IgG2b抗体滴度(IgG2a和IgG2b是Th1亚型；IgG1是Th2亚型)。(值得注意的是，在人中该逆转是真实的；人IgG1是Th1亚型并且人IgG2是具有Th1偏向性应答的Th2亚型，其特征在于比IgG2抗体滴度更大的IgG1抗体滴度。)在啮齿类动物和人两者中，Th1应答还通过增加的CD8T细胞应答来标明。在Th1/Th2细胞因子免疫应答中的不平衡(特别是在动物的细胞免疫应答中的Th2偏向性)能够影响RSV的发病机理和感染(特别是在肺中)的严重程度。此外，Th2-偏向性初次免疫应答与RSV增强的疾病有关联(赫维茨(Hurwitz)JL(2011)呼吸合胞体病毒疫苗开发(Respiratorysyncytialvirusvaccinedevelopment)，疫苗专家评论(ExpertRevVaccines)10:1415-1433)。
由于它们先前暴露于RSV，所以在老年人群体中减活RSV病毒疫苗将是不足以产生免疫原性的。预先存在的RSV免疫力将很可能抑制病毒疫苗的复制并因此限制活的RSV疫苗加强RSV免疫力的能力。因此，可以预防老年人中的RSV相关疾病的疫苗将解决该目的群体中尚未被满足的医疗需求。
在一个实施例中，提供了疫苗组合物。具体而言，该疫苗组合物包括如在此所述的RSV-F蛋白。在一个实施例中，该疫苗组合物包括如在此所述的重组表达的RSV-F蛋白。在一个实施例中，该疫苗组合物包括如在此所述的RSV可溶性F蛋白。在一个实施例中，该RSV可溶性F蛋白缺乏一个C-末端跨膜结构域。在更具体的实施例中，该RSV可溶性F蛋白缺乏一个胞质尾区结构域。
在更具体的实施例中，该疫苗组合物包括RSV可溶性F蛋白，与一种佐剂组合。经常地，纯化的蛋白抗原缺乏固有免疫原性，所以免疫原性的疫苗配制品常包括免疫应答的非特异性刺激剂，被称为佐剂。一些佐剂影响抗原被递呈的方式。例如，在一些实例中，当蛋白抗原被明矾沉淀时，免疫应答被增加。在另外的情况中，抗原的乳化可以延长抗原递呈的持续时间。多年来，免疫方案已经使用佐剂以刺激应答，佐剂是本领域普通技术人员众所周知的。佐剂更详细地描述在沃格尔(Vogel)等人，“疫苗佐剂和赋形剂的纲要(ACompendiumofVaccineAdjuvantsandExcipients)(第2版)”中，将其通过引用以其全文结合在此。
已知佐剂的实例包括完全弗氏佐剂(包含杀死的结核分枝杆菌的非特异性免疫应答的刺激剂)、不完全弗氏佐剂以及氢氧化铝佐剂。其他的已知佐剂包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSP)、卡介苗(BCG)、氢氧化铝、胞壁酰二肽(MDP)化合物(例如thur-MDP和nor-MDP)、胞壁三肽磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)、RIBI佐剂(RIBI’sadjuvants)(Ribi免疫化学研究公司(RibiImmunoChemResearch,Inc.)，蒙大拿州哈密尔顿)，其在2％角鲨烯/吐温80乳剂中包含提取自细菌、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的三种组分。MF-59，主要组织相容性复合物(MHC)抗原是其他的已知佐剂。
然而明矾经常被用作疫苗佐剂，已知其用于促进体液免疫而非诱导有效的细胞免疫(兰利(LangleyJM)等人，(2009)具有和不具有磷酸铝佐剂(adjuvantation)的亚单元呼吸道合胞体病毒亚型A疫苗在成人>或＝65周岁中的剂量范围研究(Adose-rangingstudyofasubunitRespiratorySyncytialVirussubtypeAvaccinewithandwithoutaluminumphosphateadjuvantationinadults>or＝65yearsofage)，《疫苗》(Vaccine)27:5913-5919；法尔塞(FalseyAR)等人(2008)比较2种呼吸道合胞体病毒(rsv)疫苗--无佐剂的疫苗或用明矾佐剂的疫苗的安全性和免疫原性--附随地向高风险的老年人个体给予流感疫苗(Comparisonofthesafetyandimmunogenicityof2respiratorysyncytialvirus(rsv)vaccines--nonadjuvantedvaccineorvaccineadjuvantedwithalum--givenconcomitantlywithinfluenzavaccinetohigh-riskelderlyindividuals)，《感染疾病杂志》(JInfectDis)198:1317-1326；和库尔(KoolM)等人(2012)明矾佐剂：最古老的佐剂的一些技巧(Alumadjuvant:someofthetricksoftheoldestadjuvant)，《医学微生物学杂志》(JMedMicrobiol)61:927-934)。已经显示新的佐剂化合物结合toll样受体(TLR)9激动剂在小鼠模型中改善对RSV疫苗的Th1-偏向性细胞应答(汉考克(HancockGE)，等人(2001)包含寡脱氧核糖核苷的CpG是用于用呼吸道合胞体病毒(RSV)的融合(F)蛋白的肠胃外疫苗接种的有效佐剂(HancockGE,etal.(2001)CpGcontainingoligodeoxynucleotidesarepotentadjuvantsforparenteralvaccinationwiththefusion(F)proteinofrespiratorysyncytialvirus(RSV))，《疫苗》(Vaccine)19:4874-4882；和加拉帕替(GarlapatiS)，等人(2012)通过用使用CpG寡脱氧核糖核苷酸和先天防御调节剂肽在聚磷腈微粒中配制的呼吸道合胞体病毒融合蛋白进行疫苗接种增强了免疫应答和保护(EnhancedimmuneresponsesandprotectionbyvaccinationwithrespiratorysyncytialvirusfusionproteinformulatedwithCpGoligodeoxynucleotideandinnatedefenseregulatorpeptideinpolyphosphazenemicroparticles)，《疫苗》(Vaccine))。基于TLR4的佐剂(诸如单磷酰脂质A(MPL)/QS-21组合)或Protollin(LPS与脑膜炎球菌外膜蛋白复合的配制品，也能够诱导细胞IFNγ在小鼠中生产RSV疫苗(诺伊齐尔(NeuzilKM)，等人(1997)佐剂影响在用呼吸道合胞病毒FG亚单元疫苗免疫的BALB/c小鼠中的定量和定性免疫应答(AdjuvantsinfluencethequantitativeandqualitativeimmuneresponseinBALB/cmiceimmunizedwithrespiratorysyncytialvirusFGsubunitvaccine)，《疫苗》(Vaccine)15:525-532；西尔(CyrSL)，等人(2007)鼻内的基于蛋白酶体的呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗保护BALB/c小鼠对抗激发而没有嗜酸性粒细胞增多或增强的病理(Intranasalproteosome-basedrespiratorysyncytialvirus(RSV)vaccinesprotectBALB/cmiceagainstchallengewithouteosinophiliaorenhancedpathology)，《疫苗》(Vaccine)25:5378-5389)。
肠道菌脂多糖(LPS)是该免疫系统的有效刺激剂。然而，由于其毒性，其在佐剂中的使用已经被减少。已经生产了通过从还原性末端葡糖胺去除核心碳水化合物基团和磷酸产生的LPS的无毒衍生物(单磷酰脂质A(MPL))，连同通过从二糖骨架的3-位去除酰基链产生的MPL的进一步脱毒版本，称为3-O-脱酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。经优化以结合至人TLR4复合物的MD2分子的另一个合成toll样受体(TLR)4激动剂是一种合成的己酸化脂质A衍生物，被成为吡喃葡糖糖基脂质佐剂(GLA)(可获自阿文蒂极性脂质公司(AvantiPolarLipids,Inc.)阿拉巴斯特，亚拉巴马州)。已经证实GLA在啮齿类动物和灵长类动物模型系统两者中均是一种有效的Th1-偏向性佐剂(科勒(ColerRN)，等人(2010)一种增强和扩大对流感疫苗的免疫应答的合成佐剂(Asyntheticadjuvanttoenhanceandexpandimmuneresponsestoinfluenzavaccines).《公共科学图书馆·综合》(PLoSOne)5:e13677；和拉姆斯登(LumsdenJM)，等人(2011)在一种乳液中配制的具有合成toll样受体4激动剂的间日疟原虫的重组疟疾疫苗在猕猴中的安全性和免疫原性的评价(EvaluationofthesafetyandimmunogenicityinrhesusmonkeysofarecombinantmalariavaccineforPlasmodiumvivaxwithasyntheticToll-likereceptor4agonistformulatedinanemulsion)，《感染与免疫》(InfectImmun)79:3492-350)。
GLA详细描述在标题为“包含合成佐剂的疫苗组合物”的美国专利公开号2011/0070290中，该公开的披露内容通过引用以其全部内容结合在此。如在美国专利公开号2011/0070290中所述的，GLA包括(i)二葡糖胺骨架，具有通过非还原性末端葡糖胺的己糖胺1位与还原性末端葡糖胺的己糖胺6位之间的醚键连接至非还原性末端葡糖胺的还原性末端葡糖胺；(ii)O-磷酰基基团，被附接至该非还原型末端葡糖胺的己糖胺4位；以及(iii)高达六个脂酰基链；其中该脂酰基链之一通过酯键附接至该还原型末端葡糖胺的3-羟基，其中该脂酰基链之一通过酰胺键附接至该非还原性末端葡糖胺的2-氨基并且包括通过酯键连接至具有大于12个碳原子的烷酰基链的十四烷酰链，并且其中该脂酰基链之一通过酯键附接至该非还原性末端葡糖胺的3-羟基并且包括通过酯键连接至具有大于12个碳原子的烷酰基链的十四烷酰链。GLA具有化学式
其中R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；并且R2和R4是C12-C20烷基。在一些实施例中，GLA被配制为稳定的水包油乳剂(SE)，其在此被称为GLA-SE。
在一个实施例中，该疫苗组合物包括佐剂，该佐剂是toll样受体(TLR)激动剂。在一个实施例中，疫苗组合物包括佐剂，该佐剂是(TLR)4激动剂。通过TLR4信号转导(例如IL-6和IFNγ)诱导的细胞因子充当B细胞生长因子并且支持类别转换为抗体优化以用于与Fc受体和补体相互作用(芬克尔曼(FinkelmanFD)，等人(1988)IFN-γ调节在体内的体液免疫应答过程中分泌的Ig的同种型(IFN-gammaregulatestheisotypesofIgsecretedduringinvivohumoralimmuneresponses)，《免疫学杂志》(JImmunol)140:1022-1027；以及尼默雅恩(NimmerjahnF)和拉维奇(RavetchJV)(2007)作为免疫力的调节剂的Fc-受体(Fc-receptorsasregulatorsofimmunity)，《免疫学进展》(AdvImmunol)96:179-204)。此外，这些细胞因子招募专职性抗原递呈细胞，从而诱导MHCI分子和抗原加工蛋白上调以允许更好活化T细胞(拉马纳坦(RamanathanS)，等人(2008)通过细胞因子的CD8+T淋巴细胞的抗原-非特异性活化：与免疫、自身免疫和癌症相关(Antigen-nonspecificactivationofCD8+Tlymphocytesbycytokines:relevancetoimmunity,autoimmunity,andcancer)，《免疫和治疗试验档案》(ArchImmunolTherExp(Warsz)56:311-323)。由TLR4信号转导诱导的I类IFN可以增强蛋白抗原的交叉递呈(杜兰德(DurandV)，等人(2009)脂多糖通过脑膜炎球菌外膜囊泡在小鼠中诱导I型干扰依赖的交叉引发和IL-10产生中的作用(RoleoflipopolysaccharideintheinductionoftypeIinterferon-dependentcross-primingandIL-10productioninmicebymeningococcaloutermembranevesicles)，《疫苗》(Vaccine)27:1912-1922)，从而允许诱导强的CD8T细胞对卵白蛋白相关蛋白的应答(拉萨特(LasarteJJ)，等人(2007)。来自纤连蛋白的额外结构域A靶标抗原至TLR4表达细胞并诱导细胞毒性T细胞在体内应答(TheextradomainAfromfibronectintargetsantigenstoTLR4-expressingcellsandinducescytotoxicTcellresponsesinvivo)，《免疫学杂志》(JImmunol)178:748-756；麦克劳德(MacLeodMK)，等人(2011)。在更具体的实施例，疫苗组合物包括佐剂，该佐剂包括吡喃葡糖糖基脂质A(GLA)。在一个实施例中，该疫苗组合物被配制为微粒乳剂。在一个实施例中，疫苗组合物包括佐剂，该佐剂包括在稳定的水包油乳剂中的GLA(GLA-SE)。在另一个实施例中，疫苗组合物包括佐剂，该佐剂包括在稳定的基于角鲨烯的乳剂中的GLA。
RSV疫苗组合物的剂量可以根据例如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、给药时间以及其他临床因素变化并且可以由本领域技术人员确定。在一个实施例中，该疫苗组合物被配制为具有体积为至少约50μl、75μl或100μl并且高达约200μl、250μl、500μl、750μl或1000μl的稳定的水性悬浮液。
在一个实施例中，该疫苗组合物包括至少约1μg、5μg、10μg、20μg、30μg或50μg并且高达约75μg、80μg、100μg、150μg或200μg的如在此所述的RSV可溶性F蛋白。在一个实施例中，该疫苗组合物包括处于浓度为至少约0.01μg/μl、0.05μg/μl、0.1μg/μl并且高达0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl、0.5μg/μl或1.0μg/μl的RSV-F免疫原。
在一个实施例中，该疫苗组合物包括至少约0.1μg、0.5μg、1μg、1.5μg、2μg或2.5μg并且高达3μg、4μg、5μg、10μg或20μg佐剂。在一个实施例中，该疫苗组合物包括处于浓度为至少约1ng/μl、2ng/μl、3ng/μl、4ng/μl或5ng/μl并且高达约0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl或0.5μg/μl的佐剂。
在更具体的实施例中，该佐剂包括在具有GLA浓度为至少约1％、2％或3％并且高达约4％或5％的稳定的水包油乳剂中的GLA。在一个实施例中，该佐剂包括在稳定的水包油乳剂(SE)中的GLA，其中GLA具有平均粒径为至少约25nm、50nm、75nm或100nm并且高达约100nm、125nm、150nm、175nm或200nm。
在更具体的实施例中，该疫苗组合物包括以最终体积约100μl至约500μl之间的在2％至5％之间SE中的约1μg和100μg之间RSV-sF糖蛋白，与约1μg和10μg之间GLA组合。在更具体的实施例中，该疫苗组合物是液体配制品，该液体配制品包括以最终体积约250μl至约500μl之间的在2％至5％之间SE中的约10μg和约100μg之间RSV-sF糖蛋白，与约1μg和约5μg之间GLA组合。在一个另外的实施例中，该疫苗组合物被配制用于肌内注射并且包括以最终体积为约500μl的在2％或5％SE中的约10μg、30μg或100μgRSV-sF糖蛋白与1μg、2.5μg或5μgGLA的组合。
给予的量和频率可以取决于宿主的应答。在一个实施例中，以单个剂量形式给予该疫苗组合物。在另一个实施例中，以二剂量方案给予该疫苗组合物。在另一个实施例中，根据计量方案给予该疫苗组合物，例如，初始给予该疫苗组合物，随后加强给予。在一个实施例中，以二剂量方案给予该疫苗组合物，其中该第二剂量是在初次给予后至少约1、约2、约3或约4周、或在初次给予后至少约1、约2、约3、约4、约5或约6个月、或在初次给予后至少约1年或更长时间给予的。在另一个实施例中，根据计量方案给予该疫苗组合物，其中第二剂量是在初次给予后至少约1、约2、约3或约4周、或在初次给予后至少约至少约1、约2、约3、约4、约5或约6个月、或在初次给予后至少约1年或更长给予的，并且第三剂量是在该第二剂量后例如至少约1、约2、约3、约4、约5、约6个月、或在该第二剂量后约一年给予的。
在另一个实施例中，该疫苗组合物包括药学上可接受的载体或稀释剂，其中该免疫原被悬浮或溶解。药学上可接受的载体是已知的，并且包括但不限于注射用水、盐溶液、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等渗水缓冲液，及其组合。对于肠胃外给予，例如皮下注射，该载体可以包括水、盐水、乙醇、脂肪、蜡、缓冲液或其组合。药学上可接受的载体、稀释剂和其他赋形剂的充分讨论呈现在《雷明顿药物科学》(REMNGTON'SPHARMACEUTCALSCENCES)(Mack出版公司，新泽西州现行版)中。该配制品应适合给予的方式。在一个优选的实施例中，该配制品适合于给予至人，优选地是无菌的、非微粒的和/或无热源的。
在另外的实施例中，该疫苗组合物可以包括一种或多种稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂和/或佐剂。例如，该疫苗组合物可以包括小量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂以提高疫苗效力。该组合物可以是固体形式(诸如适合于复原的冻干粉末)、液体溶液、混悬剂、乳剂、片剂、药丸、胶囊、持续释放配制品或粉剂。口服配制品可以包括标准载体，诸如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
还令人希望的是在疫苗组合物中包括其他组分，诸如递送运载体，包括但不限于铝盐、油包水乳剂、生物可降解的油性运载体、水包油乳剂、生物可降解的微囊剂和脂质体。在另外的实施例中，该疫苗组合物可以包括抗菌剂，诸如卞基醇或对羟基苯甲酸甲醋；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；蟹合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于张度调节的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。
该疫苗组合物的给予可以是全身性的或局部的。给予一种疫苗组合物的方法包括但不限于：肠胃外给予(例如，真皮内的、肌内的、静脉内的以及皮下的)、硬膜外给予、以及粘膜给予(例如，鼻内的和口腔或肺的途径或通过栓剂给予)。在特定实施例中，在此所述的组合物按以下方式给予：肌内、静脉内、皮下、经皮或皮内。可以通过任何方便的途径给予这些组合物，例如通过输注或单次快速静脉注射(bolusinjection)、通过经由上皮或皮肤粘膜内层(例如口腔粘膜、结肠、结膜、鼻咽、口咽、阴道、尿道、膀胱和肠道粘膜等)吸收，并且可以将其与其他生物活性剂一起给予。在一些实施例中，组合物的鼻内或其他粘膜的给药途径可以诱导实质上高于其他给药途径的抗体或其他免疫应答。在另一个实施例中，在此所述的组合物的鼻内或其他粘膜的给药途径可以在免疫位点处诱导抗体或其他免疫应答。
6.试剂盒和制造的物品
在一个实施例中，一个药物包或试剂盒包括填充有在此所述的疫苗配制品的一种或多种成分的一个或多个容器。该疫苗组合物可以被包装在指明组合物的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中。在一个实施例中，该组合物是作为液体来供应。在另一个实施例中，该组合物是作为一种处于密封容器中的干燥的无菌冻干粉或无水浓缩物来供应，其中该组合物可以例如用水或盐水复原以获得用于给予至受试者的适当浓度。
当例如通过皮下或肌内注射而全身性给予该疫苗配制品时，可以使用针头和注射器或无针注射装置。可将疫苗配制品装在玻璃或塑料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量小药瓶中。
7.刺激免疫应答的方法
在对RSV感染的应答中，产生了标靶RSV-融合(F)和附接(G)包膜糖蛋白的中和抗体(赫维茨(HurwitzJL)(2011)，“呼吸道合胞体病毒疫苗开发(RespiratorySyncytialVirusVaccineDevelopment)，”《疫苗专家评论》(ExpertRevVaccines)，10:1415-1433)。F定向的中和应答特别令人希望的，因为F糖蛋白在病毒的RSVA和RSVB菌株之间均是高度保守的并且对于病毒和细胞膜的融合、病毒进入和复制的先决条件是必要的(马赫(MaherCF)，等人(2004)低的RSV中和抗体滴度与更严重的RSV疾病的更高风险相关(LowRSVneutralizingantibodytiterscorrelatewithahigherriskofmoresevereRSVdisease)(李(LeeFE)，等人(2004)具有A2呼吸道合胞体病毒的人的实验性感染(ExperimentalinfectionofhumanswithA2respiratorysyncytialvirus)，《抗病毒研究》(AntiviralRes)63:191-196)。然而RSV中和抗体在RSV免疫力中发挥重大作用，一旦进行被动转移试验就为未致敏人类和啮齿类动物提供保护，还认为在疾病保护中对RSV的细胞应答发挥作用(克雷洛夫(KrilovLR)(2002)预防呼吸道合胞体病毒疾病中的帕利珠单抗(Palivizumabinthepreventionofrespiratorysyncytialvirusdisease)，《生物疗法专家评论》(ExpertOpinBiolTher)2:763-769和格拉哈姆(GrahamBS)，等人(1993)用呼吸道合胞体病毒特异性免疫血清感染呼吸道合胞体病毒的小鼠的免疫预防和免疫治疗(Immunoprophylaxisandimmunotherapyofrespiratorysyncytialvirus-infectedmicewithrespiratorysyncytialvirus-specificimmuneserum)，《儿科学研究》(PediatrRes)34:167-172)。该F糖蛋白包含多种小鼠和人CD8和CD4T细胞表位(奥尔森(OlsonMR)和瓦尔加(VargaSM)(2008)《肺部免疫力和免疫病理学：从呼吸道合胞体病毒的经验教训》(Pulmonaryimmunityandimmunopathology:lessonsfromrespiratorysyncytialvirus)，《疫苗专家评论》(ExpertRevVaccines)7:1239-1255)。将RSV-特异性CD8T细胞应答在血清反应阳性成年人中进行检测(库西(CusiMG)，等人(2010)T细胞介导的免疫应答中的年龄相关变化以及在健康受试者中对呼吸道合胞体病毒(RSV)的效应记忆(AgerelatedchangesinTcellmediatedimmuneresponseandeffectormemorytoRespiratorySyncytialVirus(RSV)inhealthysubjects)，《免疫衰老》(ImmunAgeing)7:14)并且在清除病毒感染的细胞和在动物模型中解决RSV感染中发挥重要作用(班厄姆(BanghamCR)，等人(1985)小鼠中对呼吸道合胞体病毒的细胞毒性T细胞应答(CytotoxicT-cellresponsetorespiratorysyncytialvirusinmice)，《病毒学杂志》(JVirol)56:55-59；西起亚阿特秋忠(SrikiatkhachornA)和布拉西亚勒(BracialeTJ)(1997)病毒特异性CD8+T淋巴细胞在实验性鼠类呼吸道合胞体病毒感染过程中下调T辅助细胞2型细胞因子分泌及肺嗜酸性粒细胞增多(Virus-specificCD8+TlymphocytesdownregulateThelpercelltype2cytokinesecretionandpulmonaryeosinophiliaduringexperimentalmurinerespiratorysyncytialvirusinfection)，《实验医学杂志》(JExpMed)186:421-432；胡斯泽尔(HussellT)，等人(1997)CD8+T细胞在肺呼吸道合胞体病毒感染过程中控制Th2驱使的病理(CD8+TcellscontrolTh2-drivenpathologyduringpulmonaryrespiratorysyncytialvirusinfection)，《欧洲免疫学杂志》(EurJImmunol)27:3341-3349；和穆尼奥斯(MunozJL)，等人(1991)在C57BL/6小鼠中的呼吸道合胞体病毒感染：自具有病毒特异性T细胞的肺中的病毒的清除(clearanceofvirusfromthelungswithvirus-specificcytotoxicTcells)，《病毒学杂志》(JVirol)65:4494-4497)。RSV-特异性CD4T细胞应答促进B细胞抗体产生和CD8应答两者，其中Th1型CD4应答比Th2型应答更有效地促进CD8应答(赫维茨(HurwitzJL)(2011)，“呼吸道合胞体病毒疫苗开发(RespiratorySyncytialVirusVaccineDevelopment),”《疫苗专家评论》(ExpertRevVaccines)，10:1415-1433)。
在一个实施例中，提供了用于向受试者(例如人或动物受试者)给予免疫有效量的包含免疫原RSV-F蛋白的组合物的方法。在一个实施例中，提供了向哺乳动物给予疫苗组合物的方法，该疫苗组合物包括免疫原RSV-F蛋白和至少一种佐剂。在一个实施例中，RSV-F包括可溶性RSV-F(还被命名为RSV-sF)。在一个实施例中，该佐剂是GLA。在更具体的实施例中，该佐剂是GLA-SE。在一个实施例中，提供了用于引发针对RSV的免疫应答的方法。在一个实施例中，该免疫应答是体液的。在另一个实施例中，该免疫应答是细胞介导的。在一个实施例中，该方法诱导对RSV感染的保护性免疫应答或其至少一种症状。在另外的实施例中，提供了通过向具有所述疾病或处于感染所述疾病的风险的患者给予治疗或预防有效量的该疫苗组合物用于预防或治疗疾病的方法。在一个实施例中，该疾病是呼吸系统疾病，例如，由病毒(具体而言，RSV)引起的疾病。
在一个实施例中，该疫苗组合物能够在宿主中引发至少一种免疫应答。在一个实施例中，该免疫应答选自TH1-型T淋巴细胞应答、TH2-型T淋巴细胞应答、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、抗体应答、细胞因子应答、淋巴因子应答、趋化因子应答以及炎症应答。在一个实施例中，该疫苗组合物能够在宿主中引发至少一种免疫应答，该免疫应答选自(a)一个或多个细胞因子的产生，其中该细胞因子选自干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，(b)一个或多个白细胞介素的产生，其中该白细胞介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18和IL-23，(c)一个或多个趋化因子的产生，其中该趋化因子选自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4和CCL5，以及(d)淋巴细胞应答，选自记忆T细胞应答、记忆B细胞应答、效应T细胞应答、细胞毒性T细胞应答和效应B细胞应答。
在一个实施例中，该疫苗组合物能够提供一种免疫应答，该免疫应答优先包括产生Th1-型细胞因子的产生，如与Th2偏向性细胞因子诸如IL-5/IL-4相比较，诸如IFNγ(Th1偏向性)。在一个实施例中，在先前已暴露于RSV的哺乳动物中，该疫苗组合物的给予增强Th1偏向性细胞免疫应答。在一个实施例中，Th1/Th2细胞免疫应答的比率是至少约1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、或2:1。在一个实施例中，提供了诱导或增强Th1-类型F蛋白特异性CD4或CD8应答的方法。在一个实施例中，此处所述的有佐剂的疫苗组合物的给予诱导约49个和约150个之间F蛋白特异性CD4T细胞斑点形成单位(SFU)/106总活细胞，或与无佐剂的疫苗组合物相比增加约5至10倍。在另一个实施例中，此处所述的有佐剂的疫苗组合物的给予诱导约1069个和3172个之间F特异性CD8T细胞SFU/106总活细胞，或与无佐剂的组合物相比增加约10至20倍。在另一个实施例中，提供了诱导细胞IFNγ产生T细胞应答(即，Th1类型细胞因子)的方法。在一个实施例中，如与无佐剂的组合物相比，有佐剂的疫苗组合物的给予在IFNγ产生T细胞中提供至少45倍增加。
在一个实施例中，提供了在哺乳动物中诱导针对RSV的中和抗体的方法。在一个实施例中，该RSV中和抗体滴度大于选自以下项的滴度：6Log2、6.5Log2、7.0Log2、7.5Log2、8.0Log2、8.5Log2、9.0Log2、9.5Log2、10.0Log2、10.5Log2、11.0Log2、11.5Log2、12.0Log2、12.5Log2、13.0Log2、13.5Log2、14.0Log2、14.5Log2、和15.0Log2。在一个实施例中，在给予该疫苗组合物之后，该RSV中和抗体滴度包括血清IgG滴度，其相较于给予之前的血清IgG滴度是在约10倍和约200倍之间更高的，或至少约10、25、50、75、100倍更高和高达约100、150或200倍更高的。在一个实施例中，在给予该疫苗组合物后，该RSV中和抗体滴度包括血清IgG滴度，这些血清IgG滴度相较于给予前的血清IgG滴度是至少约10倍和高达约200倍更高的。
在一个实施例中，该疫苗组合物的给予诱导粘膜(IgA)和全身性抗体(IgG、IgG1、IgG2a、和IgG2b)应答，这些应答能够中和RSV。由于IgG2a>IgG1，IgG1/IgG2a比率表明一种Th1偏向性抗体应答。
在一个实施例中，该疫苗组合物的给予导致RSV病毒滴度的降低。在一个实施例中，RSV病毒滴度被降低在约50和约1000倍之间，或降低至少约50、100、250、500倍和高达约500或1000倍。在一个实施例中，在给予该疫苗组合物后，RSV病毒滴度是少于2log10pfu/克。
实例
实例1a和1b：未致敏BALB/c小鼠和棉鼠
BALB/c小鼠和棉属是RSV感染的两种良好表征的啮齿动物模型。在这个实例中，使用这两种模型来评价肌内(IM)给予RSV疫苗候选物的免疫原性，这些候选物包括用TLR4激动剂吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)、稳定的乳剂(SE)、吡喃葡萄糖基脂质A稳定乳剂(GLA-SE)或明矾佐剂配制的经纯化的可溶性F(sF)蛋白。将缺少跨膜和胞质尾区结构域的经纯化的sF蛋白(黄(HuangK)，等人(2010)重组呼吸道合胞体病毒F蛋白表达受到无效核输出和mRNA加工的阻碍(RecombinantrespiratorysyncytialvirusFproteinexpressionishinderedbyinefficientnuclearexportandmRNAprocessing)，《病毒基因》(VirusGenes)40:212-221)用GLA、SE或GLA-SE来配制，并且在疫苗的性能方面与用明矾或无佐剂配制的sF进行比较。结果表明虽然每个肌内给予的有佐剂的RSVsF疫苗配制品诱导RSV中和滴度并且赋予针对病毒复制的保护性免疫力，但是在BALB/c和棉鼠两者模型中，仅sF+GLA-SE疫苗引发IFNγ-产生的T细胞应答。在BALB/c小鼠中，这些T细胞应答主要是CD8+，能够流通至肺中并与Th1-偏向性细胞因子应答相关。发现含有GLA-SE佐剂的RSVsF是这些研究中最好的疫苗配制品，提高关键免疫学和保护读数超过无佐剂的RSVsF，同时避免在病毒感染后的Th2-相关肺病症。
在该鼠类模型中，通过所有RSVsF疫苗配制品来诱导完全保护免受RSV激发影响、稳健的血清RSV中和应答和抗FIgG应答。当用佐剂GLA-SE配制时，该RSVsF蛋白疫苗诱导F-特异性Th1-偏向性的体液和细胞应答。在小鼠中，鉴定F-特异性CD4和CD8T细胞应答两者。在RSV激发后，F-特异性多功能的CD8T细胞流通至小鼠肺中，在此处病毒清除被实现而没有Th2-介导的免疫后遗症。在棉鼠中，sF+GLA-SE诱导啮齿类动物中和抗体、F-特异性IFNγT细胞应答以及完全保护，没有肺组织病理学证据。
在此的数据展示包括RSVsF和GLA-SE的蛋白亚单元疫苗可以诱导对RSV的稳健的体液和细胞应答，从而经由Th1免疫-介导机制增强病毒清除。诱导稳健的中和抗体和T细胞应答的有佐剂的RSV疫苗对处于RSV疾病风险的群体可以是有利的。
疫苗组分
将包含RSVA2F序列的氨基酸1-524并且缺少跨膜结构域的RSV可溶性F(sF)蛋白(黄(HuangK)，等人(2010)重组呼吸道合胞体病毒F蛋白表达受到无效核输出和mRNA加工的阻碍，《病毒基因》(VirusGenes)40:212-221)用RSV-F-特异性mAb、帕利珠单抗(米迪缪尼有限公司(MedImmune，Inc.))从稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的上清液中进行免疫亲和纯化。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明亲和纯化的RSVsF蛋白是>95％纯的，在还原条件下进行跑胶呈约50kD(F1)和约20kD(F2)带两者(图9A和B)。低温成像(Cryoimaging)结果表明该sF蛋白形成三聚体和更大的多聚体，ELISA结合研究证实它包含完整位点A、B和C中和表位(数据未显示)。将RSVsF通过Bradford测定来定量并且在ELISA测定中用于免疫和涂覆。
在这个研究中使用的佐剂包括作为铝胶(Alhydrogel)(精确化学和科学公司(AccurateChemicalandScientific)，新泽西州)而获得的明矾(氢氧化铝)。以100μg/疫苗剂量使用明矾，并且将明矾通过在22度下混合30分钟吸附至蛋白上。GLA、SE和GLA-SE获自免疫设计公司(ImmuneDesignCorporation)(西雅图，华盛顿州)并且先前已经被描述(安德森(AndersonRC)，等人(2010)合成的TLR4激动剂配制品的物理化学特性和生物活性(PhysicochemicalcharacterizationandbiologicalactivityofsyntheticTLR4agonistformulations)，《胶体和表面B生物界面》(ColloidsSurfBBiointerfaces)75:123-132)。以每疫苗剂量5μg使用在水性配制品中的GLA。SE是具有平均粒径为约100nm的稳定的基于角鲨烯的乳剂，将其以2％浓度使用。除非另外指出，以在2％SE中5μgGLA的剂量使用GLA-SE。在接种的24小时之内制备所有疫苗配制品。
使用RSVA2菌株(ATCC)用于免疫和激发。在用EMEM生长的Vero细胞中繁殖病毒。将病毒上清液离心以去除细胞碎片，用1xSP(0.2M蔗糖，0.0038MKH2PO4和0.0072MKH2PO4)稳定化并且以等分试样在-80摄氏度下迅速冷冻直至使用。在Vero细胞单层上通过噬斑测定来确定病毒滴度，如通过以下项所述的：唐(TangRS)，等人(2004)表达呼吸道合胞体病毒(RSV)的天然或可溶性融合(F)蛋白的副流感病毒3型在非洲绿猴中赋予保护免受RSV感染(ProteinofRespiratorySyncytialVirus(RSV)confersprotectionfromRSVinfectioninAfricangreenmonkeys)，《病毒学杂志》(JVirol)78:11198-11207。
疫苗接种和激发
将7-10周龄雌性BALB/c小鼠(查尔斯河实验室(CharlesRiverLaboratories)，霍利斯特，加利福尼亚州)和6-8周龄雌性棉鼠(哈兰实验室(HarlanLaboratories)，印第安纳波利斯，印第安纳州)在无病原体的条件下饲养。将各组小鼠麻醉并且用安慰剂(PBS)或RSVsF-/+佐剂以100μl体积进行两次肌内免疫，每次间隔两周。除非另外表明，将RSVsF以0.3μg的剂量给出，其已经从滴定研究中确定以在不存在佐剂的情况下提供次优保护。每种佐剂的最有效剂量选择自初步研究(数据未显示)。将阳性对照在第0天用106PFURSV-A2经鼻内感染一次。一旦给予，在任何组中没有注射位点反应，所有疫苗都是耐受性良好的。在免疫后第14和28天，自眶后采血(retroorbitalbloodcollection)获得血清，从全血中分离并且贮存在-20℃下直至评价。在该研究的第28天，将小鼠用106PFU的活RSVA2病毒以100μl体积经鼻内接种。在最终免疫后14天或在激发后4天，收获脾用于T细胞测定。在激发后的4天，将病毒滴度在个体的肺匀浆中通过噬斑测定来量化。保留来自每个动物的个体肺叶并且用PBS+4％多聚甲醛膨胀持续高达1周，然后脱水并包埋于石蜡中用于组织病理学研究。将棉鼠研究进行类似地设计，除了将这些动物在初始引发后3周进行加强，并且在加强疫苗后3周进行激发之外。
通过噬斑滴定进行肺部RSV定量
将从安乐死的小鼠或棉鼠上切除的鲜肺称重并且在补充有1xSP缓冲液的OptiMEM(英杰公司(Invitrogen))中使用有一次性头的OMNI组织匀浆器(欧美妮国际(OmniInternational)，肯尼索，佐治亚州)进行均质化。将匀浆通过离心澄清。在Vero细胞单层上通过噬斑测定来确定病毒滴度，如通过以下项所述的：唐(TangRS)，等人(2004)表达呼吸道合胞体病毒(RSV)的天然或可溶性融合(F)蛋白的副流感病毒3型在非洲绿猴中赋予保护免受RSV感染(ProteinofRespiratorySyncytialVirus(RSV)confersprotectionfromRSVinfectioninAfricangreenmonkeys)，《病毒学杂志》(JVirol)78:11198-11207。简言之，将新鲜制备的肺匀浆的连续稀释液添加至6孔板中的Vero细胞，允许感染1hr，然后用1％甲基纤维素/EMEM覆盖并且孵育5-7天以允许噬斑形成。去除覆盖，将细胞甲醇固定，并且将噬斑通过用山羊抗-RSV(密理博公司(Millipore)，比勒利卡，马萨诸塞州)、随后用HRP-兔抗羊抗体和AEC(Dako,Glostrup,Denmark)染色可视化。
血清IgG、IgG1、IgG2a和IgAELISA
使用标准ELISA技术对RSV-F-特异性IgG抗体进行评估。将高结合96孔板用纯化的RSVsF涂覆。在阻断之后，将血清的连续稀释液添加至板中。将结合抗体使用HRP轭合的山羊抗-小鼠IgG、IgG1或IgG2a(杰克逊免疫研究实验室公司(JacksonImmunoResearch)，西格鲁(WestGrove)，宾夕法尼亚州)进行检测并且用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB，西格玛公司(Sigma)，圣路易斯，密苏里州)进行显影。将RSV-F-特异性IgA抗体使用HRP轭合的山羊抗-小鼠IgA(英杰公司(Invitrogen)，格兰德岛，纽约州)进行检测。将该信号使用ELASTELISA扩增试剂盒(珀金埃尔默公司(PerkinElmer)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)进行扩增并且用TMB进行检测。吸光度在450nm处在SpectraMax酶标仪上进行测量并且使用SoftMaxPro(分子设备公司(MolecularDevices)，森尼维耳，加利福尼亚州)进行分析。使用3x空白组孔平均数的截留值将滴度报道为log2终点滴度。
RSV微中和测定
将在指示的时间点处的热灭活的小鼠血清中的RSV中和抗体滴度使用如先前所述的GFP标记的RSVA2微量中和测定(伯恩斯坦(BernsteinDI)，等人(2012)一种减毒活的呼吸道合胞体病毒和副流感病毒3型疫苗在血清反应阴性的儿童中安全性和免疫原性的1期研究，《儿科传染病杂志》(PediatrInfectDisJ)31:109-114)进行测量。简言之，将融合的Vero细胞单层用500PFU的病毒单独地或用与连续稀释的血清样本预混合的病毒一起进行感染，然后在33℃和5％CO2下孵育22小时。将板洗涤掉游离病毒并且使用IsoCyte图像扫描仪(蓝移公司(Blueshift)，森尼维耳，加利福尼亚州)计算GFP荧光病毒灶。将中和滴度表达为log2血清稀释度倒数，其导致荧光病灶数目减少50％(EC50滴度)，如使用4-参数曲线拟合算法所计算的。
细胞分离
在指示的收获时间，将个体的脾通过100微米尼龙过滤器(福尔肯(Falcon))来破碎。红血细胞耗尽的脾细胞的生活力通过ViCell来确定，并且在使用之前，将细胞以10x106活细胞/mL再悬浮于补充有5％FCS、青霉素-链霉素、2mML-谷氨酰胺和0.1％β-巯基乙醇(cRPMI-5)的RPMI1640中。
在指示的收获时间，将肺白细胞从酶分散的肺组织中分离。将肺切除，用PBS洗涤，切碎，并且在通过100微米尼龙过滤器(福尔肯(Falcon))破坏之前，在RMPI5％FCS、1mg/mL胶原酶(罗氏应用科学公司(RocheAppliedScience))和30μg/mLDNase(西格玛公司(Sigma)，圣路易斯，密苏里州)中孵育45分钟。将细胞洗涤并且再悬浮于cRPMI-5中，并且通过ViCell来确定总活细胞计数。
细胞因子谱
对于细胞因子再刺激测定，将脾细胞在96孔板中用培养基单独地(cRPMI-5)或用RSV-F衍生的MHCII(I-Ed)-结合肽对GWYTSVITIELSNIKE(SEQIDNO:10)和VSVLTSKVLDLKNYI(SEQIDNO:11)(奥尔森(OlsonMR)，瓦尔加(VargaSM)(2008)肺部免疫力和免疫病理学：从呼吸道合胞体病毒的经验教训(Pulmonaryimmunityandimmunopathology:lessonsfromrespiratorysyncytialvirus)，《疫苗专家评论》(ExpertRevVaccines)7:1239-1255)(各自5μg/mL)孵育72小时。将上清液通过离心澄清并且贮存在-80摄氏度下直至评价。
使用被设计成包括IFNγ、IL-5、IL-13、IL-17和嗜酸性粒细胞活化趋化因子的小鼠细胞因子/趋化因子多重试剂盒(密理博公司(Millipore)，比尔里卡，马萨诸塞州)来评价再刺激的脾细胞上清液和新鲜肺匀浆。在使用之前，将肺匀浆通过离心澄清。遵循制造商的说明书进行测定并且将板在Luminex读取器(伯乐公司(Bio-Rad)，圣荷西，加利福尼亚州)上进行分析。将F-特异性脾细胞因子产生通过从F刺激值中减去培养基单独值来确定。
ELISPOT测定
使用梅布科技公司(Mabtech)(辛辛那提，俄亥俄州)鼠类IFNγELISPOT试剂盒用于小鼠ELISPOT测定。在添加细胞和刺激剂之前，将预涂覆的微量滴定板用cRPMI-5阻断。将250,000个细胞/孔在阻断的涂覆板上一式三份地用培养基单独地、MHCII(I-Ed)-结合肽GWYTSVITIELSNIKE(SEQIDNO:10)和VSVLTSKVLDLKNYI(SEQIDNO:11)(奥尔森(OlsonMR)，瓦尔加(VargaSM)(2008)肺部免疫力和免疫病理学：从呼吸道合胞体病毒的经验教训(Pulmonaryimmunityandimmunopathology:lessonsfromrespiratorysyncytialvirus).《疫苗专家评论(ExpertRevVaccines)》7:1239-1255)(各自5μg/mL)、MHCI(H2-Kd)结合肽、KYKNAVTEL(SEQIDNO:12)(奥尔森(OlsonMR)(2008))、或ConA(5μg/mL)(作为阳性对照)孵育36-48小时。将孵育细胞洗涤掉后，将板用包含的生物素化抗-鼠IFNγ进行孵育，随后遵循试剂盒方案用SA-HRP进行孵育，并且将斑点用包含的TMB试剂进行检测。将板使用CTLImmunoSpot读取器和软件(细胞技术有限公司(CellularTechnologyLtd))进行读数和分析。
在ELISPOT测定格式中使用在R&DDuoSetELISA系统中获得的针对棉鼠IFNγ(#DY565)或L-4(#DY584)的成对抗体，用于评价棉鼠细胞免疫应答。将96孔PVDF板(密理博公司(Millipore)，比尔里卡，马萨诸塞州)用提供捕获抗体(分别是抗-IFNγ或抗-IL-4)的试剂盒以10μg/mL在PBS中进行涂覆过夜。将板用cRPMI-5阻断2小时。然后，将细胞在用cRPMI-5阻断的涂覆板上一式三份地用培养基、RSVsF(2μg/mL)、或ConA(5μg/mL)(作为阳性对照)孵育36-48小时。将孵育细胞洗涤掉后，将板用包括生物素化的检测抗体(1μg/mL，于PBS+1％BSA中)、随后是链霉抗生物素蛋-HRP(梅布科技公司(Mabtech)，辛辛那提，俄亥俄州)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC载体实验室(AEC，VectorLabs)，伯灵格姆市，加利福尼亚州)进行孵育。将板使用CTLImmunoSpot读取器和软件(细胞技术有限公司(CellularTechnologyLtd))进行读数和分析。
流式细胞计数分析
将红血细胞耗尽的脾细胞和肺白细胞以1.106个细胞/孔分布在具有培养基单独地、MHCI(H2-Kd)结合F肽KYKNAVTEL(SEQIDNO:12)(10μg/mL)、MHCI(H2-Kd)结合M2肽SYIGSINNI(SEQIDNO:13)(10μg/mL)、或ConA(作为阳性对照)的96孔微量滴定板中。将细胞在37℃下在5％CO2中孵育5-6小时，添加一小时布雷菲德菌素A(BrefeldinA)至该刺激中以阻断细胞因子分泌。将细胞用LIVE/DEAD紫、然后用CD3-PerCP-Cy5.5、CD8-PE-Cy7和CD19-APC-Cy7染色以用于生活力。用2％多聚甲醛固定并用CellPerm(碧迪生物科学公司(BDBioscience))透化后，将细胞用IFNγ-APC、IL-2FITC和TNFα-PE染色。将细胞在LSR2(碧迪生物科学公司(BDBioscience))上进行分析，收集10,000CD8+事件。
肺组织病理学
使用切片机从石蜡包埋的福尔马林固定的在RSV激发后第4天收获的肺叶来制备肺切片(5微米)。将用苏木精和伊红染色的切片进行数字式扫描并且由获得许可证的病理学家进行检查。评价肺切片的肺部损伤特征，诸如细支气管增生、肺泡炎、嗜酸性粒细胞浸润以及细支气管周/血管周空间的浸润物的存在。
统计
使用PrismGraphPad软件分析数据。所示的数据是两个或更多个实验的代表。将所有数据表达为算术平均数+_平均数标准误差(SEM)。通过单因子ANOVA计算统计显著性，随后进行杜奇事后检验(Tukeyposttest)，截留值p<0.05。
结果
1.有佐剂的RSVsF亚单元疫苗赋予BALB/c小鼠保护性免疫力，其中 有GLA-SE佐剂的RSVsF诱导Th1-偏向的保护性免疫力
向BALB/c小鼠的同龄组给予两个剂量的不含有佐剂或含有明矾、GLA、SE或GLA-SE佐剂的RSVsF亚单元疫苗，进行肌内免疫。用RSVA2病毒激发后，将肺病毒滴度量化。与PBS对照相比，所有疫苗提供了显著的肺病毒滴度减少，具有平均肺病毒滴度为3.8log10pfu/克(图1A)。与PBS阴性对照组相比，完全保护被认为是100倍降低。用无佐剂的RSVsF进行免疫为小鼠提供部分肺保护，其中4/7动物具有可检出的肺病毒滴度(范围为从2.3-3.0log10pfu/克)，而有佐剂的RSVsF疫苗提供完全肺保护，其中平均病毒滴度低于1.8log10pfu/克，与在活的RSVA2免疫组中所见的一致。
在激发前的血清RSV中和滴度显著地被所有RSVsF有佐剂的疫苗增强。在第28天，含有GLA-SE、明矾和SE佐剂的RSVsF疫苗达到最高RSV中和滴度，分别为7.7log2、8.1log2和8.1log2(图1B)。这些滴度比通过用无佐剂的RSVsF免疫的那些的滴度大16倍(4.1log2)。相比之下，含有GLA佐剂的RSVsF达到相当数量的但显著较低的中和滴度(6.3log2)。然而，无佐剂的RSVsF和用活的RSVA2病毒鼻内感染两者均诱导可检出的血清中和滴度(分别为4.1log2和4.6log2)，这些应答不是显著地高于用PBS阴性对照组发现的检出限。针对全血清F-特异性IgG和F-特异性IgA的ELISA滴度显示相似的趋势(图10)。
对从在激发后的4天收获的再刺激的脾细胞(每组n＝3)的上清液进行评价以确定由每个疫苗配制品诱导的F-特异性CD4+T细胞的细胞因子产生谱。用MHCII(I-Ed)-结合RSV-F衍生的肽(奥尔森(OlsonMR)和瓦尔加(VargaSM)(2008)《肺部免疫力和免疫病理学：从呼吸道合胞体病毒的经验教训》(Pulmonaryimmunityandimmunopathology:lessonsfromrespiratorysyncytialvirus)，《疫苗专家评论》(ExpertRevVaccines)7:1239-1255)再刺激后，评价IFNγ为原型Th1-型细胞因子，IL-5和IL-13为代表性的Th2-型细胞因子并且IL-17为Th17-型细胞因子。如所预期的，当来自PBS对照动物的再刺激的脾细胞未展示F-特异性细胞因子产生时，来自经鼻内RSV感染的小鼠的那些展示弱IFNγ支配的应答(图1C)。RSVsF+GLA-SE疫苗组诱导强RSV-F-特异性应答，该应答是由指示Th1-型应答的IFNγ支配的。相比之下，该RSVsF+GLA组展示平衡的F-特异性应答，该应答包括Th1、Th2和Th17细胞因子，而RSVsF、RSVsF+SE和RSVsF+明矾组展示由IL-5和IL-13细胞因子表征的Th2-型应答。
因为IFNγ促进在小鼠中的抗体从IgG1到IgG2a的类别转换(许(Xu)W和张(Zhang)JJ(2005)T-bet的Stat1-依赖性协同激活用于在B细胞激活的早期过程中的IgG2a产生(Stat1-dependentsynergisticactivationofT-betforIgG2aproductionduringearlystageofBcellactivation)，《免疫学杂志》(JImmunol)175:7419-7424)，我们还对来自每个动物的F-特异性抗体的同种型进行评价。仅仅两个组展示F-特异性IgG2a>IgG1滴度：RSVsF+GLA-SE接种疫苗组以及用具有RSVA2感染引发的组(图1D)，两组均具有IFNγ支配的对MHCII-衍生的F肽的应答。RSVsF+GLA-SE比RSVsF单独的或RSVsF+明矾诱导显著更多的F-特异性IgG2a抗体。
Th1-型对疫苗的应答(诸如对RSVsF+GLA-SE所看到的那些)能够支持强CD8T细胞应答的开发。因此，在通过用免疫显性的MHCI(H2-Kd)结合F-衍生肽(奥尔森(OlsonMR)，瓦尔加(VargaSM)(2008)肺部免疫力和免疫病理学：从呼吸道合胞体病毒的经验教训(Pulmonaryimmunityandimmunopathology:lessonsfromrespiratorysyncytialvirus)，《疫苗专家评论(ExpertRevVaccines)》7:1239-1255)再刺激后的第32天，在来自每个疫苗组的代表性动物中评价CD8T-细胞对疫苗的应答。在PBS对照组中的F-特异性CD8IFNγELISPOT计数是近似于不可检出的，然而在无佐剂的RSVsF组中的那些计数是约30个斑点形成单位(SFU)/百万细胞(图1E)。相比之下，与RSVsF相比，在RSVsF+GLA-SE疫苗组中的F-特异性CD8IFNγELISPOT应答是显著更大的(平均数：684，相对于无佐剂的RSVsF是23倍增加)。而F-特异性CD8IFNγ应答是略微高于其他有佐剂的RSVsF疫苗配制品，与无佐剂的RSVsF相比，这些是不显著的。活RSV感染产生弱的F-特异性CD8IFNγELISPOT应答(仅100SFU)，这不是所期望的，因为对BALB/c小鼠中的RSVA2的免疫显性应答是针对M2-衍生肽的(奥尔森(OlsonMR)和瓦尔加(VargaSM)(2008)《肺部免疫力和免疫病理学：从呼吸道合胞体病毒的经验教训》(Pulmonaryimmunityandimmunopathology:lessonsfromrespiratorysyncytialvirus)，《疫苗专家评论》(ExpertRevVaccines)7:1239-1255)。为了评价这些应答细胞的细胞溶解潜能，我们通过ELISPOT评价了F-特异性颗粒酶B分泌。仅来自已经接受sF+GLA-SE疫苗的小鼠的脾细胞具有F-特异性颗粒酶B应答(平均数197)，显著大于在单独给予sF的那些应答中观察到的(平均数18)(图1F)。因为共表达IFNγ，TNFα(效应细胞因子)和IL-2(与增殖相关的细胞因子)的多功能T细胞被报道为对病毒清除是最有效的，随后是共表达IFNγ和TNFα两者的T细胞(塞德尔(SederRA)，等人(2008)记忆和保护中的T-细胞质量：影响疫苗设计(T-cellqualityinmemoryandprotection:implicationsforvaccinedesign)，《免疫学自然评论》(NatRevImmunol)8:247-258)，所以此外，我们通过胞内细胞因子染色对F-特异性CD8T细胞进行了评价。RSVsF+GLA-SE疫苗组具有最高数量的三重阳性和IFNγTNFα双重阳性细胞两者(图11)。
这些结果展示：当RSVsF是单独的免疫原性时，具有佐剂的RSVsF配制品在未致敏动物中诱导更高滴度中和抗体，并且用GLA-SE配制RSVsF产生Th1-偏向性免疫力，该Th1-偏向性免疫力引发强F-特异性CD8T细胞应答，有助于提高病毒清除率。
2.通过含有GLA-SE佐剂的RSVsF疫苗引发的CD8T细胞应答是稳 健的
用RSVsF+GLA-SE引发/加强接种疫苗后，激发后观察的CD8T细胞应答是稳健的(在整个抗原和佐剂剂量范围内)。与PBS对照相比，接受了与固定剂量的GLA-SE(5μg/2％)一起给予的0.3、7.5或37.5μgRSVsF的动物均产生强F-特异性CD8T细胞，如在RSV激发后的4天通过进行ELISPOT所检测的(图2A)。在给予更高剂量的RSVsF的动物中发现更高的绝对斑点计数。与PBS对照组或单独的佐剂对照组相比，在激发后的4天，接受了与在剂量范围(5μg、2.5μg、1μg或0.5μg，在2％SE中)下的GLA-SE一起给予的0.3μgRSVsF的动物展示了显著增加数目的F-特异性CD8T细胞(图2B)。1-2.5μgGLA在2％SE中的佐剂剂量足以用于最优脾T细胞应答。
3.含有GLA-SE佐剂的RSVsF疫苗诱导F-特异性CD4和CD8T细胞 应答而无病毒暴露
激发后，通过RSVsF+GLA-SE疫苗引发的F-特异性T细胞在提供保护的所有RSVsF剂量下容易地被检出。然而，在用0.3μgRSVsF或更少(数据未显示)接种疫苗的同龄组中，在RSV激发之前，难以检出显著数目的F-特异性T细胞。为了评价在不存在和存在RSV激发情况下的T细胞诱导，在第0天和第14天，将小鼠用具有GLA-SE(2.5μg或1μg，在2％SE中)佐剂的10μgRSVsF接种疫苗，其中将一个同龄组在第二疫苗剂量后的14天进行评价而另一个在活的RSV激发后的4天进行评价。在加强后的14天，与PBS或无佐剂的sF组(图3A-B)相比，F-特异性CD4和CD8T细胞数目在sF+GLA-SE两组中均是显著增加的(平均49-150SFU/106，针对CD4应答；并且1069-3172SFU/106，针对CD8应答)。在sF+GLA-SE两组中的F-特异性CD8T细胞数目也是显著大于在sF+SE组中观察到那些。RSV激发后，与PBS组相比，F-特异性CD4和CD8T细胞数目在sF+GLA-SE两组中是显著增加的(图3C-D)。在sF+GLA-SE两组中的F-特异性CD8T细胞数目也是显著大于在无佐剂的sF组中观察到那些。有趣的是，与激发前同龄组相比，F-特异性脾CD8的绝对数目在激发后同龄组中显现更低，这潜在地表明这些细胞重定位至病毒激发的位点。总之，这些数据指示用含有GLA-SE佐剂的RSVsF蛋白进行免疫引发全身性F-特异性CD4和CD8T-细胞应答，该应答在任何暴露于活的RSV之前即存在。
4.RSV激发后，将通过含有GLA-SE佐剂的RSVsF疫苗进行接种疫 苗诱导的CD8T细胞应答招募至肺
将通过用含有GLA-SE佐剂的RSVsF肌内接种疫苗产生的全身性F-特异性CD8T-细胞针对在RSV激发后流通至肺中的能力进行评价。用有佐剂的RSVsF(0.3μg)接种疫苗并用RSVA2激发的小鼠具有肺淋巴细胞，将这些肺淋巴细胞(每组且每个时间点n＝3)在激发后的4、7或12天收获，用于流式细胞术分析。用RSVsF+GLA-SE接种疫苗的小鼠肺中在激发后的4天具有3.39％F-特异性CD8T细胞，其与在PBS免疫的小鼠的肺中观察到的0.48％F-特异性CD8T细胞有显著性差异(图4A)。这些F-特异性CD8T细胞主要是IFNγ、TNFα、和IL-2(平均数1.75％)三重阳性的或IFNγ和TNFα(平均数1.5％)双重阳性的。相比之下，在这个时间点处，该sF+明矾疫苗组在肺中具有任何功能的仅1.0％F-特异性CD8。在激发后的第7天，用RSVsF+GLA-SE接种疫苗的小鼠在肺中具有7.28％F-特异性CD8T细胞，其与在PBS免疫的小鼠中观察到的0.44％F-特异性CD8T细胞、在sF+明矾免疫的小鼠中观察到的0.87％、或在活的RSV免疫的小鼠中观察到的0.76％有显著性差异(图4A)。在激发后第12天，定位于肺的F-特异性CD8T细胞在这些组中的差异是显著类似的，虽然在这个时间点，主要的T细胞群体是IFNγ和TNFα，双重阳性的(已经失去IL-2产生)。因为缺少IL-2的T细胞是较少增殖的，这些细胞可以代表收缩期的首要步骤之一。这些数据指示与对照PBS免疫的动物、RSVsF+明矾免疫的动物、或甚至活的RSV感染的动物相比，在RSV激发后，RSVsF+GLA-SE组更快速募集多功能的F-特异性T细胞到肺中。
然而，局部肺F-特异性应答在具有原发性RSV感染的动物中是弱的，肺中的免疫显性M2-特异性应答在继发性感染后迅速发展(图4B)。在RSV再感染后的4天，超过12％的总肺CD8群体是M2-特异性的，为比在其他组(<1％)中观察到的显著更高的数目。这些M2-特异性CD8T细胞主要是三重阳性的CD8T细胞。在活的RSV组中的M2-特异性CD8T细胞数目不随着时间的推移显著地改变，但双重阳性的CD8T细胞变为主要的。在RSV激发后的7-12天，M2-特异性CD8T细胞的数目在PBS、RSVsF+GLA-SE和RSVsF+明矾免疫的组中已经增加，指示在BALB/c小鼠中，一旦RSV激发，甚至在不存在病毒复制的情况下，就迅速诱导CD8T细胞至这个免疫显性的表位。
5.在BALB/c小鼠中，RSV激发后，含有GLA-SE佐剂的RSVsF疫 苗避免肺Th2应答和加重的肺组织病理学。
对BALB/c肺中的RSV激发的Th2-型应答(尤其是由IL-13产生表征的那些)已经被报道与肺中的嗜酸性粒细胞浸润有关并且加重未致敏动物中的组织病理学(JohnsonTR，等人(2008)肺嗜酸性粒细胞增多症在用呼吸道合胞体病毒G糖蛋白免疫的小鼠中需要白细胞介素-5、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-1和CD4+T细胞(Pulmonaryeosinophiliarequiresinterleukin-5,eotaxin-1,andCD4+TcellsinmiceimmunizedwithrespiratorysyncytialvirusGglycoprotein).《白细胞生物学杂志》(JLeukocBiol)84:748-759)。为了确是否任何有佐剂的RSVsF疫苗在经免疫的小鼠的肺中诱导偏向性细胞因子应答，我们测量了在RSV激发后的4天收获的个体肺匀浆中的IL-5、IL-13、IFNγ、IL-17和嗜酸性粒细胞活化趋化因子。这些细胞因子读数提供了由任何招募至肺的免疫细胞(包括巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞和T细胞)产生的细胞因子的简单印象。仅在用无佐剂的sF、含有SE佐剂的sF或含有明矾佐剂sF免疫的小鼠的肺中检出IL-5和IL-13，而在大部分组中检出IFNγ。使用IFNγ与IL-5的比率来表达Th1/Th2特性，其中比率>1.0指示更多Th1-型应答。PBS-免疫的动物具有低水平的所有测试的细胞因子，如在RSV激发后的这个早期时间点处所期望的(图5A-F)。在活的RSV组(平均的IFNγ与IL-5比率：29.2)、含有GLA佐剂的sF组(平均的比率：7.8)和含有GLA-SE佐剂的sF组(平均的比率：59.3)中观察Th1-应答。然而，对于无佐剂的sF组(平均的比率：0.3)、含有SE佐剂的sF组(平均比率0.4)和含有明矾佐剂的组(平均的比率：0.5)观察到Th2-型应答(图5A-F)。尽管Th17细胞已经与不同的临床前肺感染模型中增强的炎症和增强的保护两者相关，但仅低水平的IL-17在免疫的小鼠中被检出，并且这些并没有随着佐剂的使用而显著地变化(图5A-F)。嗜酸性粒细胞活化趋化因子(CCL11)(与嗜酸性粒细胞浸润相关的趋化因子)(马修斯(MatthewsSP)，等人(2005)CCL11在呼吸道合胞体病毒感染过程中在嗜酸性粒细胞肺疾病中的作用(RoleofCCL11ineosinophiliclungdiseaseduringrespiratorysyncytialvirusinfection)，《病毒学杂志》(JVirol)79:2050-2057)是在基线水平，在PBS组中为135pg/mL并且在活的RSV组中为297pg/mL(图5A-F)。提高的肺部嗜酸性粒细胞活化趋化因子水平在具有Th2-型免疫应答的组中被观察到，包括无佐剂的sF组(平均数：911pg/mL)、含有SE佐剂的sF组(平均数：965pg/mL)和含有明矾佐剂的sF组(平均数：796pg/mL)。相比之下，肺部嗜酸性粒细胞活化趋化因子水平在具有Th1-型免疫应答的组中是在基线处，其中含有GLA-SE佐剂的sF组在240pg/mL处。
为了进一步评价嗜酸性粒细胞浸润，对来自每个疫苗组的肺切片进行评分(针对RSV激发后的组织组织病理学损伤)。在经历RSV原发性感染的动物的肺中检测到很少的肺部损伤，而在具有继发性RSV感染的那些中注意到低水平的肺泡炎和血管周围浸润(图6A-F)。接受含有GLA-SE佐剂的RSVsF配制品的动物具有低肺部炎症得分，与经历继发性RSV感染的小鼠相似。然而，接受含有SE佐剂的RSVsF、含有明矾佐剂的RSVsF或无佐剂的RSVsF的动物具有升高的肺部损伤得分。这些数据一起表明：与其他测试的配制品相比，在未致敏BALB/c小鼠中，RSV激发后，观察到的通过用含有GLA-SE佐剂的RSVsF免疫达到的全身性Th1-偏向性免疫应答与肺Th1-偏向性免疫应答、基线肺嗜酸性粒细胞活化趋化因子水平以及低肺肺部炎症相对应。
6.在未致敏棉鼠中，有佐剂的RSVsF亚单元疫苗赋予完全保护免受 RSV激发并且诱导RSV中和滴度和Th1-偏向性细胞-介导的免疫力两者
棉鼠是充分建立的RSV研究模型并且常被用于潜在的RSV疫苗候选物的临床前评价中。为了证实含有GLA-SE佐剂的RSVsF疫苗在继发性RSV激发模型中的免疫谱，以与用于小鼠的相似剂量向棉鼠给予相同的RSVsF亚单元疫苗。在第0和22天，以0.3μg经肌内给予不含有佐剂或含有GLA、SE、GLA-SE或明矾佐剂的RSVsF。将棉鼠的一个组仅用GLA-SE进行免疫作为阴性对照，然而将另一个组在第0天给予一个鼻内剂量(1x106pfu)的活的RSVA2病毒作为阳性对照。
RSV激发后，将接受有佐剂的RSVsF疫苗的所有棉鼠同龄组完全保护在肺中(等效于活的RSV组)，其中平均的RSV滴度<2log10pfu/克，与安慰剂组相比(5.5log10pfu/克)RSV滴度降低1000倍(图7A)。与在小鼠中观察到的相反，用无佐剂的RSVsF进行免疫不会保护棉鼠免受RSV激发。这些动物的肺中的平均病毒滴度(5.4log10pfu/克)与安慰剂对照的平均病毒滴度相似。有佐剂的RSVsF疫苗还能保护棉鼠的上呼吸道(鼻)免受RSV激发。用sF+GLA-SE接种免疫的同龄组在鼻中显示完全保护(等效于活的RSV组的完全保护)，两者都具有平均RSV滴度<1log10pfu/克，与安慰剂组(5.1log10pfu/克)相比RSV滴度降低1000倍(图7B)。在接受sF+GLA(平均2.7log10pfu/克)、sF+SE(平均1.4log10pfu/克)、或sF+明矾(平均2.1log10pfu/克)的组中观察到上呼吸道的部分保护，尽管与无佐剂的RSVsF疫苗组(4.9log10pfu/克)或安慰剂组相比，这些降低全部是显著的。
在第42天，含有GLA-SE佐剂的RSVsF疫苗组中的棉鼠产生了最高的RSV中和滴度，其中平均数为14.7log2(图7C)。这显著高于任何其他疫苗配制品，除含有SE佐剂的RSVsF之外。对于含有GLA佐剂的RSVsF疫苗组(平均11.7log2)、含有SE佐剂的RSVsF疫苗组(平均13.3log2)和含有明矾佐剂的RSVsF疫苗组(平均12.9log2)，也观察到高的中和滴度。这些滴度显著高于通过用活的RSVA2病毒鼻内感染(平均9.7log2)或通过用无佐剂的RSVsF肌内免疫(平均4.3log2)达到的那些滴度，指示有佐剂的RSVsF在诱导高滴度血清RSV中和抗体中的优越性。在初始接种疫苗后第42天的总F-特异性IgGELISA滴度在含有SE、GLA-SE或明矾佐剂的RSVsF组中也比无佐剂的RSVsF组或活的RSV组高(图7D)。
用完整的RSVsF蛋白再刺激后，通过IFNγELISPOT测量棉鼠中的T细胞应答。在含有GLA-SE佐剂的RSVsF组(平均数：2626SFU/百万细胞)中检测到最强的F-特异性IFNγELISPOT应答，增加超过无佐剂的RSVsF(平均数：58SFU/百万)的45倍并且应答比在任何其他疫苗同龄组中看到的显著更强(图7E)。尽管可检出，与无佐剂的RSVsF组相比，sF-特异性IFNγ应答未被GLA(平均数：约7个斑点/百万)、SE(平均数：约642)或明矾(平均数：1246)显著地增加。活的RSV感染的组产生相当低的脾sF-特异性IFNγELISPOT应答(196个斑点)。这些结果与在BALB/c小鼠模型中观察到的相似。
使用如通过ELISPOT测量的IFNγ与IL-4特异性应答的比率来确定棉鼠中的细胞免疫应答的Th1偏向性。每个组产生的IFNγ：IL-4比率显示含有GLA-SE佐剂的RSVsF产生最高Th1-偏向性的细胞应答(比率：26.9)，而其他在1和10之间徘徊(图7F)。在棉鼠中的Th1偏向性与在BALB/c小鼠中看到的相似。
对嗜酸性粒细胞浸润以及其他与RSV肺病理学相关的组织病理学的肺改变进行评价并且对RSV激发后第4天收集自所有动物的棉鼠肺切片进行评分，如针对小鼠研究所描述的(图8)。继发性RSV感染后，比在活的RSV感染组中所看到的显著更严重的组织病理学未在棉鼠的任何接种疫苗的组中观察到。
讨论：
本研究展示经肌内给予包含纯化的RSVsF蛋白的含有GLA-SE佐剂的疫苗是高度免疫原性的，从而RSV感染后，产生高的中和滴度以及稳健的由多功能的CD8+T细胞表征的Th1-偏向性细胞应答，同时完全保护BALB/c小鼠和棉鼠免受RSV激发，而无任何免疫病理学指征。相比之下，含有明矾或SE佐剂的RSVsF诱导由高但弱的中和滴度表征的保护性应答以及与肺炎指标相关的Th2-偏向性细胞应答，并且无佐剂的RSVsF仅为BALB/c小鼠提供部分RSV保护。该研究证实重组RSVsF很可能是融合后的，并且在小鼠中，含有GLA-SE佐剂的RSVsF诱导稳健的交叉中和抗体至临床RSVA和B隔离群(数据未显示)。
实例2a：1xRSV血清反应阳性的BALB/c小鼠中的RSV-sF的免疫原性
本研究评价含有或不含有佐剂给予的RSVsF糖蛋白的剂量应答，针对在RSV-血清反应阳性的BALB/c小鼠中加强和维持RSV特异性免疫应答的能力。本研究的目标是：(1)在单一疫苗给予后，确定RSVsF足以加强在RSV血清反应阳性的BALB/c小鼠中的免疫应答的剂量；(2)在自然RSV感染后，评价在加强RSV免疫应答中的RSVsF疫苗中的GLA-SE佐剂；以及(3)确定由RSVsF疫苗诱导的加强的F-特异性免疫应答的寿命。
通过RSV-sF人菌株A2(SEQIDNO:2)的RSV-F人菌株A2蛋白(即氨基酸525-574)的50氨基酸C-末端跨膜结构域的缺失来产生RSV-sF(SEQIDNO:7)。在该疫苗研究起始之前，通过经鼻内一次给予一个剂量的活的RSV病毒使小鼠产生血清反应阳性。RSVsF蛋白产自稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，经免疫亲和纯化，并且以0.4μg、2μg或10μg的无佐剂的或在稳定的乳剂中含有吡喃葡萄糖基脂质A(GLA-SE)佐剂的一次肌内给予至雌性BALB/c小鼠(第0天)。在第0天(基线)并且接种疫苗后的每两周持续10周测量血清学的抗-F抗体应答以及RSV中和抗体应答。在接种疫苗后的10天，将F-特异性CD4和CD8T-细胞应答在动物的代表性亚组(n＝3/组)中进行测量并且在接种疫苗的10周在RSV激发后再次进行测量。将RSV激发后的局部肺-特异显性免疫力通过抗体和细胞因子的存在来展示。
本研究显示给予的含有或不含有佐剂的RSVsF以抗原剂量依赖性方式加强对RSV的体液免疫应答，而含有GLA-SE佐剂的RSVsF也以抗原剂量依赖性方式加强CD8-特异型免疫应答。此外，本研究显示这些加强的应答在免疫后被维持至少10周。因此，本研究指示在接种疫苗前，在用RSV实验性地感染的小鼠中，RSVsF+GLA-SE加强体液和细胞免疫应答两者，从而提供证据：甚至在RSV血清反应阳性的个体中，RSV-sF是强的候选疫苗以用于加强宽的RSV免疫应答。将缺少RSV人菌株A2(SEQIDNO:2)的F的跨膜结构域的可溶性F(sF)蛋白构建体(SEQIDNO:7)工程化并且从稳定克隆的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系表达以使用免疫亲和纯化产生抗原性完整的高度纯化蛋白。
广泛使用的RSV疫苗评价模型是BALB/c小鼠，更高RSV容许的小鼠菌株之一。可用于该允许对免疫应答深入分析的BALB/c小鼠模型的试剂被认为与有效的RSV清除率相关(康纳斯(Connors)等人，对于通过用表达RSVM2蛋白(Vac-M2)的牛痘病毒重组体感染诱导的呼吸道合胞体病毒(RSV)激发的抗性通过CD8+T细胞来介导，然而通过Vac-F或Vac-G重组体诱导的是通过抗体介导的(Resistancetorespiratorysyncytialvirus(RSV)challengeinducedbyinfectionwithavacciniavirusrecombinantexpressingtheRSVM2protein(Vac-M2)ismediatedbyCD8+Tcells,whilethatinducedbyVac-ForVac-Grecombinantsismediatedbyantibodies)，《病毒学杂志》(JVirol.)1992；66:1277-81)。对RSV的交叉中和抗体(其阻断在组织培养中的RSVA和RSVB菌株两者)在小鼠中产生，并且RSV感染后，小鼠以及人血清两者包含交叉中和RSV抗体。BALB/c小鼠像人一样能够增加对RSV-F糖蛋白的CD8+T-细胞应答，该应答可以清除残留的感染细胞并且限制疾病(奥尔森(OlsonMR)和瓦尔加(VargaSM)，《肺部免疫力和免疫病理学：从呼吸道合胞体病毒的经验教训》(Pulmonaryimmunityandimmunopathology:lessonsfromrespiratorysyncytialvirus)，《疫苗专家评论》(ExpertRevVaccines)2008；7(8):1239-55)。这些F-特异性CD8T细胞可以在BALB/c小鼠中针对F糖蛋白的免疫显性表位KYKNAVTEL(SEQIDNO:12)来检测(《肺部免疫力和免疫病理学：从呼吸道合胞体病毒的经验教训》(Pulmonaryimmunityandimmunopathology:lessonsfromrespiratorysyncytialvirus).《疫苗专家评论》(ExpertRevVaccines)2008；7(8):1239-55)。CD4+T-细胞应答产生影响中和抗体和CD8+T细胞两者的产生的细胞因子，其中Th1-型细胞因子(诸如IFNγ)相比于Th2-型细胞因子(诸如IL-4、IL-5和IL-13)与更有效的细胞抗病毒应答相关联。Th1应答可以直接地以在病毒感染的局部位点处或从抗原-再刺激的脾培养产生的细胞因子形式、连同间接地通过抗体同种型来测量，其中小鼠IgG2a同种型与更多Th1-型应答相关联。BALB/c小鼠中的临床前动物评价被设计为选择一种疫苗配制品，该疫苗配制品将是充分免疫原性的以加强老年中的RSV-特异型细胞应答，从而避免Th2偏向性并克服与青年相比的老年中所看到的T-细胞缺陷(刘(Liu)等人，对呼吸道合胞体病毒感染的局部免疫应答在衰老加速的小鼠中被减弱(Localimmuneresponsetorespiratorysyncytialvirusinfectionisdiminishedinsenescence-acceleratedmice)，《普通病毒学杂志》(J.Gen.Virol.)2007；88:2552-8)，然而在该相同的时间诱导已显示在减少RSV疾病中发挥关键作用的中和抗体。
吡喃葡萄糖基脂质A/稳定的乳剂(GLA-SE)是一种组合佐剂(免疫设计公司(ImmuneDesignCorporation)，西雅图，华盛顿州)，该组合佐剂被显示在未致敏BALB/c小鼠中以2-剂量疫苗方案增强对RSVsF的体液和细胞免疫应答的诱导。在本研究中，我们确定在单一-剂量的RSVsF接种疫苗方案中是否需要佐剂以加强在接种疫苗前用RSV实验式地感染的BALB/c小鼠中的免疫应答。
所评价的疫苗配制品包括含有和不含有该佐剂GLA-SE的0.4μg、2μg和10μg的RSVsF。将这些与对照RSV血清反应阴性动物、给予安慰剂疫苗的血清反应阳性动物、和给予继发性RSV感染的血清反应阳性动物(作为加强)相比较。所评价的免疫参数包括接种疫苗后和接种疫苗后的10周召回激发后的对RSVsF的血清抗体应答(总、IgG1/IgG2a、和病毒中和滴度)、F-特异性干扰素γ(IFNγ)-特异性CD8T-细胞应答、在这些时间点处的F-特异性Th1/Th2细胞因子-产生的CD4T细胞、以及在召回激发后的4天肺细胞因子水平和F-特异性抗体。
未致敏雌性BALB/c小鼠被分为各自8-9只小鼠的指定疫苗同龄组并且在第0天给予。在疫苗给予前28天，将9个组中的8个用106PFU活RSVA2病毒经鼻内接种以产生RSV血清反应阳性的动物。在第0天，通过F-特异性ELISA终点滴度证实成功的血清转化。在第0天，将9只小鼠的多个组用疫苗配制品经肌内(IM)进行接种。在激发后的10天，评价每组3只小鼠的细胞免疫应答，同时追踪每组剩余的5-6只动物的血清抗体应答直至第73天。将剩余的动物在第69天用活的RSVA2病毒经鼻内进行激发以允许对在激发后的4天(第73天)残留的召回细胞免疫应答进行评价。
评估含有或不含GLA-SE的3种不同剂量的RSVsF亚单元疫苗。所使用的剂量是每只小鼠0.4μg、2μg、和10μg的亚单元蛋白，其涵盖在未致敏BALB/c小鼠中所使用的范围并且包括建议的最低临床剂量的RSVsF糖蛋白(10μg)。有佐剂组中的GLA-SE以5μg的GLA(在2％SE中)的剂量给予。在第0天，用106PFU活RSVA2病毒经鼻内地给予加强感染到血清反应阳性小鼠充当阳性对照，而阴性对照包括用PBS(作为安慰剂)接种的血清反应阳性组和用PBS(作为安慰剂)接种的血清反应阴性组。
在第0、14、28、42、56和73天对每个组进行血清学读数。将动物用异氟烷轻度麻醉并经眶内放血。将血清分离并且贮存在-20℃下并且被解冻用于测试。在每个时间点测量总抗-FIgG，其中在第0天和第42天测量抗-FIgG1和抗-FIgG2aELISA终点稀释度滴度。通过RSVA2-GFP微量中和法测定来确定RSV中和滴度。在第42天，用对RSV-F具有位点特异性的单克隆抗体通过竞争ELISAF评价抗-FIgG应答的多克隆性质。在第14天，测量每个组的抗-FIgA终点稀释度滴度。
在接种疫苗后第10天，在代表性动物中评价对接种疫苗的全身性细胞免疫应答。在第69天，用病毒激发召回另外的代表性动物并且在第73天(病毒激发后的4天)评价长期的细胞免疫应答。对于这些组中的每一组，制备3-5个个体的脾细胞样品。用RSVsF72小时再刺激时期后，通过一组分泌的细胞因子(包括IFNγ、IL-5、IL-10、IL-13和IL-17)的上清液水平的多重细胞因子分析对CD4T-细胞读数进行评估。通过2种方法评估CD8T-细胞读数：在用F-衍生的CD8肽(KYKNAVTEL氨基酸85-93)(SEQIDNO:12)的36-48小时再刺激时期后，对IFNγ分泌的细胞进行ELISPOT计数及细胞内染色，以及在用F-衍生的CD8肽的5小时再刺激时期后，对F-特异性多功能(IFNγ+TNFα+IL-2+)CD8T细胞的百分比进行量化。
对该病毒激发的肺-特异性应答针对第73天(激发后的4天)单独收获的均质化肺进行评估。将肺匀浆中的细胞因子水平(IFNγ、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、嗜酸性粒细胞活化趋化因子)测量为局部细胞免疫应答的生物标记物。通过ELISA终点滴度测量肺匀浆中的F-特异性IgA和IgG抗体以显示抗体应答靶向肺。使用GraphPadPrism单因子ANOVA与杜奇事后检验和显著性截留值p<0.05来计算显著性。
结果
在接种疫苗前的28天，用高剂量的106pfuRSVA2病毒经鼻内感染RSV血清反应阳性组(组2-10)。在第0天，将这些动物中的RSV血清转化通过F-特异性IgG终点ELISA滴度进行确认。在第0天，所有血清反应阳性动物具有可检出的F-特异性IgG，其中组平均终点滴度范围为从12.81-15.36(平均14.60)。相比之下，该对照血清反应阴性组具有中位数滴度为5.64(图14)。在第0天，大部分血清反应阳性动物还被发现具有低但可检出的中和抗体滴度，其中平均log250％噬斑降低滴度为3.07-3.88。
将疫苗在第0天给予至所有动物。使用250μgGLA在10％SE中的工作母液(通过用10％SE稀释GLA-SE[1mg/mL，在10％SE中]产生)来达到100μL的5μgGLA(在2％SE中)的最终疫苗剂量。
在接种疫苗后第14、28、42和73天评估加强的F-定向抗体应答，并且与在第0天针对每个疫苗同龄组的基线血清学读数相比较。在第14天的总抗-F血清IgG滴度指示接受sF疫苗的所有血清反应阳性动物迅速地以滴度加强作为应答，而不论抗原剂量或其含有GLA-SE的配制品(图14)。血清IgG滴度的4-倍加强被认为显著的。在第14天，观察到加强范围为从13到137-倍，在该天中的滴度始终是组间最高的。接受PBS疫苗的血清反应阳性小鼠具有少于4倍的IgG滴度加强，而用活RSV感染加强的那些具有接近于4倍的IgG滴度加强。有趣的是，在接受不同剂量的RSVsF而不含有佐剂的组与接受不同剂量的RSVsF+GLA-SE的组之间观察到相似的总F-特异性IgG滴度。在第73天，在所有这些组中，该加强的抗-FIgG滴度大于15倍，并且未观察到剂量-或佐剂-增强的差异(图14)。
还将血清RSV中和滴度在多个时间点进行评价。在第0天，针对RSV血清反应阳性动物的不同组的平均的log250％噬斑降低滴度范围为从3.07-3.88(图15)。在接种疫苗后第14天，用活RSV、RSVsF或RSVsF+GLA-SE进行免疫的动物已使中和滴度加强超过其在第0天的值(图15)滴度的4-倍加强被认为显著的。给予无佐剂的RSVsF疫苗的血清反应阳性小鼠展示RSV中和滴度的15至28倍加强，而给予含有GLA-SE佐剂的RSVsF疫苗的那些展示中和滴度的53至85倍加强。相比之下，在第14天，接受PBS疫苗的血清反应阳性小鼠具有中和滴度的少于2倍增加而用活RSV给予继发性感染的那些显示中和滴度的仅7倍加强。这指示RSVsF疫苗比用RSV再次感染在更大程度上加强血清反应阳性小鼠的中和滴度。RSVsF(0.4-10μg)的量在这个诱导中不是至关重要的，因为在第14天对于每个剂量组，该平均RSV中和滴度在彼此的2倍之内(针对无佐剂的剂量8.32、7.82和8.66，和针对有佐剂的剂量9.32、8.82和9.49)。与在未致敏小鼠中观察到的相反，在RSV血清反应阳性小鼠中，佐剂的包含物在加强的中和抗体中提供仅2倍增强，其中没有适当佐剂的话，非常少的中和抗体被RSVsF疫苗诱导。每个组的中和滴度保持在第14天值的80％之内直至第73天，在一些实例中随着时间的推移而增加(图15)。这指示功能性体液免疫力的持久性在免疫后持续至少10周。
血清IgA比活的小鼠中的粘膜IgA更易于进行测量并且能够给出粘膜IgA的水平的指示。在接种疫苗后第14天，血清反应阴性动物具有非常低的F-特异性IgA滴度，这些滴度少于或等于检出限，但是所有血清反应阳性动物具有可检出的F-特异性IgA(图16)。用RSVsF(10μg)或处于3个剂量中任一个的RSVsF+GLA-SE接种疫苗的血清反应阳性动物产生比用PBS接种疫苗的血清反应阳性动物显著更高的血清F-特异性IgA滴度。用继发性活的RSVA2感染加强的血清反应阳性动物也显示显著更高的血清F-特异性IgA滴度。这指示RSVsF+GLA-SE疫苗可以加强血清反应阳性动物中的血清IgA滴度。
还评价了在第0天和第42天的血清F-特异性抗体的IgG1和IgG2a同种型以确定接种疫苗前后血清反应阳性动物的T辅助细胞型平衡。F-特异性IgG1滴度(Th2-型亚型)和F-特异性IgG2a(Th1-型亚型)滴度两者均在第28天存在于血清反应阳性动物中(图17)。在接种疫苗前，IgG2a滴度在血清反应阳性动物中占主导并且接种疫苗后在第42天维持其优势，而不论接受的疫苗配制品如何(图17)。这与在未致敏动物中的之前研究相反，其中给予不含佐剂的RSVsF疫苗主要诱导IgG1应答，并且需要GLA-SE佐剂的包含物来诱导IgG2a-偏向性的。
为了确定是否RSVsF疫苗针对血清反应阳性小鼠中的已知RSVsF的中和抗原位点加强多克隆血清抗体也得以检查，使用竞争ELISA测定通过测量其阻断位点A、B和C-特异性mAb结合至该RSVsF抗原上的靶标表位的能力来评估接种疫苗后的血清的多克隆性。来自所有测试组的血清显示与位点A和位点C抗体的强竞争以及与位点B抗体的可检出竞争，指示多克隆的RSV-F-定向应答(图18)。来自RSVsF接种疫苗的组(±GLA-SE佐剂)中的每一个的血清比来自用PBS或活的RSV加强的血清反应阳性动物的血清更擅于竞争位点A和位点C结合，指示RSVsF疫苗优于天然感染。有趣的是，对于位点B的竞争是佐剂和RSVsF剂量依赖性的。来自以2μg或10μg剂量接受含有GLA-SE佐剂的RSVsF的小鼠的血清相对于自其相配的无佐剂组的血清具有显著增强的位点B竞争应答(图18)。
在2个分开的时间点，评价全身性CD4T-细胞免疫应答。在接种疫苗后第10天，将脾细胞从每个组中的3只动物进行收获并且用RSVsF-蛋白再刺激72小时以用于通过Bioplex测量细胞因子。然而，该血清反应阴性组在该测试的组中未给出F-特异性细胞因子应答，在第10天，将F-特异性IFNγ(Th1细胞因子)在所有血清反应阳性组中进行检测(图19)。与接受无佐剂的sRSV-F的血清反应阳性小鼠相比，该应答的量级在含有GLA-SE佐剂的RSVsF组中显得更大。与IFNγ相比较，IL-5(Th2细胞因子)、IL-10(Th0细胞因子)和IL-17(Th17细胞因子)以非常低的水平被检出，指示血清反应阳性动物展示Th1-偏向性应答，而不论所使用的疫苗如何。还在第73天(用RSV召回感染后的4天)，评价CD4T细胞免疫应答。将脾细胞从每个组中的3-5只动物进行收获并且通过Bioplex测量细胞因子应答。此外，指示强Th1应答的F-特异性IFNγ是所观察到的主要细胞因子，具有低水平的代表性Th0、Th2或Th17细胞因子(图19)。这个数据与在这些血清反应阳性小鼠中所观察到的F-特异性IgG1/IgG2a滴度一致，并且与在未致敏小鼠中所看到的相反，在后者中无佐剂的RSVsF疫苗诱导Th2-型免疫应答。这些数据表明在血清反应阳性的小鼠模型中，通过初始RSV感染建立的Th1-偏向性告知未来对RSV-F疫苗的加强应答的特性。这个Th1-偏向性表明该模型可以更好代表先前具有RSV感染经历的健康成人，但在RSV血清反应阳性的免疫衰老的老年人群体中不能够反映疫苗应答。
在相同的2个时间点处，评价动物的每个组中的CD8T-细胞免疫应答。在接种疫苗后第10天，通过IFNγ-ELISPOT用CD8F肽再刺激对每组3只动物进行评价。安慰剂组缺少F-特异性CD8应答(0SFU/百万细胞)，而血清反应阳性动物具有低可检出的CD8应答(69SFU/百万)(图20)。相比之下，用无佐剂的sF给予的组具有剂量依赖性F-特异性CD8IFNγ-应答(平均72-224SFU/百万)，而用sF+GLA-SE给予的组具有更大量级(平均171-1699SFU/百万)的剂量依赖性F-特异性CD8IFNγ-应答。在RSVsF的最高有佐剂剂量下，观察到CD8应答的量级(1699SFU/百万)显著地高于没有佐剂的相同剂量(224SFU/百万)，并且比在活的RSV加强的组(145SFU/百万)中观察到的更高(图20)。这个CD8IFNγELISPOT应答是所测量的最高的。还通过细胞内流式细胞术评价所有组的多功能的CD8T细胞应答，其特征在于IFNγ、TNFα(效应细胞因子)、和IL-2(生存细胞因子)的表达。多功能的CD8T细胞的存在与病毒保护相关联，表明这些细胞在病毒感染的细胞的清除方面更有效(贝茨(Betts)等人，非HIV进展者优先地维持功能性HIV-特异性CD8+T细胞(HIVnonprogressorspreferentiallymaintainhighlyfunctionalHIV-specificCD8+Tcells)，《血液》(Blood)，2006；107(12):4781-9)。如从IFNγELISPOT应答所预期的，观察到显著的含有GLA-SE佐剂的RSVsF的剂量依赖性CD8应答。用有佐剂的RSVsF以10μg加强的血清反应阳性小鼠以所有CD8T细胞的0.49％的频率显示三重阳性的多功能抗-FCD8T细胞。所有CD8T细胞的0.62％显示双重的IFNγ和TNFαF-特异性活性。基于3×血清反应阴性的安慰剂组中的F-肽再刺激的应答的平均频率(0.01％-0.02％)，这容易超过阈值水平(0.03％-0.06％)(图20)。还检测了用2μg含有GLA-SE佐剂的RSVsF给予的组中的可检出的三重(0.13％)和双重(0.27％)阳性多功能的F特异性CD8T细胞(图20)。
为了评价CD8应答的持久性，在第73天(RSV激发后的4天)通过两种方法评价3-5只小鼠/组的召回CD8T-细胞免疫应答。在用sF+GLA-SE给予的组中，IFNγELISPOT检测到剂量依赖性F-特异性CD8IFNγ的应答(平均142-598SFU/百万)(图21)。这多于相匹配的无佐剂的sF组观察到的，该sF组还显示剂量依赖性CD8IFNγ应答(62-243SFU/百万)。相比之下，当该血清反应阳性小鼠用PBS(35SFU/百万)或活的RSVA2(61SFU/百万)进行加强时，看到该血清反应阴性对照未给出IFNγ应答(-4SFU/百万)和更低的应答。在接受最高有佐剂剂量的RSVsF的组中，细胞内流式细胞术检测到强的多功能性F-特异性CD8T细胞(0.25％三重阳性和0.25％双重阳性)(图21)。该应答的量级略微低于在接种疫苗后第10天所检测到的，但是数据显示接种疫苗后的10周，F-特异性CD8应答可以被召回。
为了证实RSV激发后，局部肺环境中的免疫应答的Th1特性的持久性，使用第73天的肺匀浆来评价细胞因子诸如IFNγ、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17和嗜酸性粒细胞活化趋化因子的水平(图22)。这些细胞因子读数提供了由任何招募至肺的免疫细胞(包括巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞和CD4或CD8T细胞)产生的细胞因子的简单印象。在来自血清反应阳性的经免疫的小鼠的肺匀浆中检测到的主要细胞因子是IFNγ，召回RSV激发后，检测到非常少的IL-5、IL-10、IL-13或IL-17。嗜酸性粒细胞活化趋化因子(可以诱导与未致敏动物的肺免疫病理学相关联的嗜酸性粒细胞的趋化性细胞因子)在所有组中以与血清反应阴性的未致敏动物增加对RSV感染的第一应答的水平相似的水平被表达。这些数据指示在接种疫苗的血清反应阳性动物中的肺免疫应答反应全身性免疫应答的特性并且保留具有低风险的嗜酸性粒细胞增多症的Th1-偏向性。
结论
本研究发现用无佐剂的或含有GLA-SE佐剂的RSVsF以抗原剂量从0.4-10μg进行一次接种可以显著地加强RSV血清反应阳性的BALB/c小鼠的免疫力的血清学读数。通过RSV微量中和法测定并接种疫苗后坚持10周来检测中和抗体。观察细胞CD8对RSV的免疫力为抗原剂量依赖性的并且需要GLA-SE佐剂，在以最高(10μg)剂量的RSVsF+GLA-SE的血清反应阳性小鼠中具有显著加强数目的多功能性CD8T细胞。这在接种疫苗10天内和接种疫苗后10周召回激发后均被观察到。在这个血清反应阳性模型中，观察Th1-偏向性的佐剂GLA-SE在增强CD8T细胞、血清RSV-F位点B-特异性抗体、和血清F-特异性IgA滴度中发挥重要的作用。在这个血清反应阳性模型中，在加强血清中和滴度或血清F-特异性IgG中未看到优点。F-特异性血清抗体、F-特异性CD4T细胞IFNγ应答和肺细胞因子水平评价指示这个血清反应阳性小鼠模型由于初始RSV感染是Th1-偏向性的，表明其可以模拟RSV血清反应阳性健康成年人中的RSV接种疫苗应答。在Th2-偏向性RSV血清反应阳性宿主(诸如老年人)中，GLA-SE可以提供另外的优点，通过转换Th2辅助细胞应答为更多的Th1-样应答，如在未致敏小鼠中观察到的。
第二研究在1x血清反应阳性的BALB/c小鼠中进行以在给予10μg剂量的RSVsF+GLA-SE的血清反应阳性小鼠中证实加强的中和抗体和增强的细胞免疫力的这些观察。在本研究中，目的是：1)重复仅用10μg剂量的RSVsF看到的观察结果，2)将这个应答与用10μg剂量的仅与GLA(1或2.5μg)一起给予的RSVsF达到的应答相比较，3)将这个应答与用10μg剂量的仅与SE(0.5％或2％)一起给予的RSVsF达到的应答相比较，4)将这个应答与用10μg剂量的与更低剂量的GLA-SE(1或2.5μg+0.5％SE或1或2.5μg+2％SE)一起给予的RSVsF达到的应答相比较，和5)将这个应答与用10μg剂量的与明矾一起给予的RSVsF相比较。
将小鼠分为13个组，每组具有9只动物，其中在初始接种疫苗前的28天，将12个组(除了对照的所有组)用具有高剂量的106pfuRSVA2病毒单一鼻内感染产生血清反应阳性。在接种疫苗那天，通过血清F-特异性IgG终点ELISA滴度确认这些动物中的RSV血清转化。将动物如前所述用100μl的PBS或经配制的RSVsF疫苗经肌内进行接种疫苗。在接种疫苗后的2周，评价血清F-特异性IgG1和IgG2a。尽管RSVsF疫苗加强IgG1和IgG2a滴度超过在PES接种疫苗的动物中所看到的滴度并且超过通过用RSVA2继发性感染所达到的滴度，但是所有血清反应阳性组具有比IgG1水平更高的IgG2a水平，不论给予的疫苗是否指示初始Th1偏向(图24)。在接种疫苗后的2周、4周和6周评价血清RSV中和滴度。接受10μgRSVsF的组(不论是否含佐剂)具有显著被加强超过PBS接种疫苗的1x血清反应阳性对照组的那些的中和滴度并且是彼此不可区分的(图25)。
虽然佐剂的选择不会影响在RSVsF接种疫苗的1x血清反应阳性的BALB/c小鼠中的中和抗体应答，但它确实影响所实现的细胞应答。在接种疫苗后的10天从每组3-4只代表性动物收获脾细胞，以通过IFNγELISPOT和通过细胞内细胞因子染色(针对IFNγ、TNFα、和IL-2产生多功能的细胞)两者评价F-特异性CD8T细胞应答。在ELISPOT测定中，以1或2.5μg在2％SE中的剂量接受sF+GLA-SE的组具有比仅接受sF或sF+明矾的那些显著更高的应答(图26A)。与sF或sF+明矾相比，对sF+GLA-SE的显著更高的应答还在细胞内细胞因子染色测定中看到(图26B)。此外，与仅给予RSVsF的组相比，该细胞内细胞因子测定在给予RSVsF+2％SE或RSVsF+GLA-SE(1或2.5μg，在0.5％SE中)的组中检测到改善的F-特性性CD8应答。
这个实验证实RSVsF+GLA-SE连同无佐剂的RSVsF加强在1x血清反应阳性的BALB/c小鼠的中和滴度的能力，并且此外显示RSVsF+GLA-SE与其他有佐剂的RSVsF疫苗相比是最优的配制品，以用于在血清反应阳性的动物中加强F-特异性CD8T细胞应答。
实例2b：在高度血清反应阳性的BALB/c小鼠中含有GLA-SE佐剂的RSV-F亚单元疫苗
在这个实例中，使用血清反应阳性的Balb/c小鼠来评价RSVsF剂量如何影响应答并且佐剂如何调节该应答。RSV再感染在整个生命期间发生并且尽管相对高水平的抗-RSV中和抗体，一旦RSV再暴露，老年人(≥65周龄)比健康成年人更易感严重RSV相关的疾病(马尔洛里(Mullooly)等人，疫苗安全性数据链成年人工作组成年人间的流行性感冒-和RSV-相关的住院治疗(VaccineSafetyDatalinkAdultWorkingGroupInfluenza-andRSV-associatedhospitalizationsamongadults)，《疫苗》(Vaccine)，200725(5):846-55，沃尔什(WalshEE)，彼得森(Peterson)DR，法尔塞(FalseyAR)，老年人中的严重呼吸道合胞体病毒感染的风险因子.《传染病杂志》(JInfectDis.)2004189(2):233-8)。RSV-相关疾病严重程度在老年人中的增加可以部分归因于这个群体中的免疫衰老和移向Th2偏向性，其可以在感染后导致次优的RSV清除(库西(CusiMG)，马尔托雷尔(MartorelliB)，迪吉诺瓦(DiGenovaG)，泰诺斯(TerrosiC)，坎波西亚(CampocciaG)，科尔雷亚莱(CorrealeP)，健康受试者中的对呼吸道合胞体病毒(RSV)的T细胞介导的免疫应答和效应因子记忆中的年龄相关改变(AgerelatedchangesinTcellmediatedimmuneresponseandeffectormemorytoRespiratorySyncytialVirus(RSV)inhealthysubjects)，《免疫衰老》(ImmunAgeing)，201010月20；7:14.)。使用萃取和纯化自病毒的RSVF或F+G+M进行的先前临床实验显示：总的来说，这些RSV抗原含有或不含有明矾对预先存在的RSV抗体滴度提供适度加强，但这些研究并未报道对RSVCMI应答的加强(兰利(LangleyJM)，塞尔斯(SalesV)，麦吉尔(McGeerA)，格斯帕里尼(GuaspariniR)，普里迪(PredyG)，米克逊(MeekisonW)，李(Li)M，科普兰(CapellanJ)，王(Wang)E.具有和不具有磷酸铝佐剂的亚单元呼吸道合胞体病毒亚型A疫苗在成人>或＝65周岁中的剂量范围研究(Adose-rangingstudyofasubunitRespiratorySyncytialVirussubtypeAvaccinewithandwithoutaluminumphosphateadjuvantationinadults>or＝65yearsofage)，《疫苗》(Vaccine)，200927(42):5913-9。
法尔塞(FalseyAR)，沃尔什(WalshEE)，科普兰(CapellanJ)，格拉文施泰因(GravensteinS)，赞邦(ZambonM)，邱(YauE)，戈尔斯(GorseGJ)，埃德尔曼(EdelmanR)，海登(HaydenFG)，麦克尔哈尼(McElhaneyJE)，纽齐尔(NeuzilKM)，尼科尔(NicholKL)，锡蒙伊斯赖特(WrightPF)，塞尔斯(SalesVM)，2种呼吸道合胞体病毒(rsv)疫苗--不含佐剂的疫苗或含有明矾佐剂的疫苗--附随地与流感疫苗给予至高-风险老年人个体的安全性和免疫原性的比较(Comparisonofthesafetyandimmunogenicityof2respiratorysyncytialvirus(rsv)vaccines--nonadjuvantedvaccineorvaccineadjuvantedwithalum--givenconcomitantlywithinfluenzavaccinetohigh-riskelderlyindividuals)，《传染病杂志》(JInfectDis)，2008年11月1日；198(9):1317-26，法尔塞(FalseyAR)，沃尔什(WalshEE).呼吸道合胞体病毒亚单元疫苗(PFP-2)在被收容的老年人中的安全性和免疫原性(Safetyandimmunogenicityofarespiratorysyncytialvirussubunitvaccine(PFP-2)intheinstitutionalizedelderly)，《疫苗》(Vaccine)，1997年7月；15(10):1130-2，法尔塞(FalseyAR)，沃尔什(WalshEE)，呼吸道合胞体病毒亚单元疫苗(PFP-2)在超60年龄的流动成年人中的安全性和免疫原性(Safetyandimmunogenicityofarespiratorysyncytialvirussubunitvaccine(PFP-2)inambulatoryadultsoverage60)，疫苗，1996年9月；14(13):1214-8.)。
为了接近老年人的RSV血清状态，通过用RSVsF单独地、RSVsF+GLA-SE或RSVsF+明矾进行的免疫对RSV特异性抗体和CMI应答的加强在高度RSV血清反应阳性的BALB/c小鼠中进行。除加强RSV免疫应答之外，本研究也通过wtRSV感染作为对佐剂总体上改变预先存在的Th-偏向性宿主免疫应答的能力的案例分析确定了是否用RSVsF+明矾(Th2偏向性佐剂)进行的免疫可以改变预先存在的Th1免疫应答。以上所述的先前小鼠研究是使用亲和力纯化的RSVsF在RSV未致敏动物中进行的。相比之下，在本研究中使用的RSVsF是通过经典色谱法纯化的。将RSVsF在1000倍范围(0.05至50μg)之内单独地或与GLA-SE或明矾一起配制地进行给予以评价其加强先前用活的RSV感染两次的BALB/c小鼠中的RSV免疫应答的能力。
材料和方法
研究设计
将一百零三只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(查尔斯河)分成13个组。组1具有7只小鼠并且组2到13具有8只小鼠。在第0天和第35天，将组1到12麻醉后，将1x106噬斑形成单位(PFU)以100μL的活RSV经由鼻内(IN)途径给予。组13未暴露于RSV。在第56天，将组1到11用异氟烷麻醉后，用安慰剂(PBS)或疫苗物品经由肌内(IM)途径进行免疫。该疫苗物品以总计100μL进行配制，其中每个后肢给予50μL。将组12用异氟烷麻醉并且用1x106PFU以100μL的活的RSV经由IN途径进行免疫。在第84天，将来自每个组的小鼠亚组麻醉并且用1x106PFU活的RSVA2经由鼻内途径进行激发。在第0、28、56、70和84天，自眶后采血获得血清，从全血中分离并且贮存在-20℃下直至评价。在第67天(免疫后的11天)或在第88天(激发后的4天)，收获来自每个组中的4只动物的脾用于T细胞测定。在激发后的4天，通过luminex测定(密理博公司(Milipore))量化个体的肺匀浆中的肺细胞因子。
RSVsF和佐剂
包含RSVA2F序列的氨基酸1-524的RSVF蛋白表达自稳定的CHO克隆并且经由经典的色谱法进行纯化。该RSVF蛋白是>90％纯的并且在ELISA测定中用于动物免疫和涂覆两者。以每疫苗剂量100μg使用明矾(铝胶，精确化学和科学公司(AccurateChemicalandScientific)，新泽西州)并且将明矾通过在室温下混合30分钟而吸附至蛋白。以每剂量5μg使用在水性配制品中的GLA。以2％浓度使用SE。以5μgGLA(在2％SE中)的剂量使用GLA-SE。在给予的2小时之内制备所有疫苗配制品。
血清IgG、IgG1和IgG2aELISA
使用标准ELISA技术对RSV-F-特异性IgG抗体进行评估。将高结合96孔板用纯化的RSVsF涂覆。在阻断之后，将血清的连续稀释液添加至板中。使用单克隆抗体1331H(比勒(BeelerJA)，范怀克寇林格(WykeCoelinghK)，呼吸道合胞体病毒的F糖蛋白的中和表位(抗原决定基)：突变对融合功能的影响(NeutralizationepitopesoftheFglycoproteinofrespiratorysyncytialvirus:effectofmutationuponfusionfunction)，《病毒学杂志》(J.Virol.)，1989；63(7):2941-50)来产生标准曲线(用于总IgG和IgG1量化)并且使用单克隆抗体1308来产生标准曲线(用于IgG2a量化)。将结合抗体使用HRP轭合的山羊抗-小鼠IgG、IgG1或IgG2a(杰克逊免疫研究实验室公司(JacksonImmunoResearch)，西格鲁(WestGrove)，宾夕法尼亚州)进行检测并且用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB，西格玛公司(Sigma)，圣路易斯，密苏里州)进行显影。吸光度在450nm处在SpectraMax酶标仪上进行测量并且使用SoftMaxPro(分子设备公司(MolecularDevices)，森尼维耳，加利福尼亚州)进行分析。将滴度报道为μg/mL的1331H或1308等价。
RSV微量中和法测定(与未致敏研究相同)
将在指示的时间点处的热灭活的小鼠血清中的RSV中和抗体滴度使用如先前所述的GFP标记的RSVA2微量中和测定(伯恩斯坦(BernsteinDI)，等人(2012)一种减毒活的呼吸道合胞体病毒和副流感病毒3型疫苗在血清反应阴性的儿童中安全性和免疫原性的1期研究，《儿科传染病杂志》(PediatrInfectDisJ)31:109-114)进行测量。简言之，将融合的Vero细胞单层用500PFU的病毒单独地或用与连续稀释的血清样本预混合的病毒一起进行感染，然后在33℃和5％CO2下孵育22小时。将板洗涤掉游离病毒并且使用IsoCyte图像扫描仪(蓝移公司(Blueshift)，森尼维耳，加利福尼亚州)计算GFP荧光病毒灶。将中和滴度表达为log2血清稀释度倒数，其导致荧光病灶数目减少50％(EC50滴度)，如使用4-参数曲线拟合算法所计算的。
ELISPOT测定(与未致敏研究相同)
在指示的收获时间，将个体的脾通过100微米尼龙过滤器(福尔肯(Falcon))来破碎。红血细胞耗尽的脾细胞的生活力通过ViCell来确定，并且在使用之前，将细胞以10x106活细胞/mL再悬浮于补充有5％FCS、青霉素-链霉素、2mML-谷氨酰胺和0.1％β-巯基乙醇(cRPMI-5)的RPMI1640中。
使用梅布科技公司(Mabtech)(辛辛那提，俄亥俄州)鼠类IFNγELISPOT试剂盒用于小鼠ELISPOT测定。在添加细胞和刺激剂之前，将预涂覆的微量滴定板用cRPMI-5阻断。将250,000个细胞/孔在阻断的涂覆板上一式三份地用培养基单独地、MHCII(I-Ed)-结合肽GWYTSVITIELSNIKE(SEQIDNO:10)和VSVLTSKVLDLKNYI(SEQIDNO:11)(奥尔森(OlsonMR)，瓦尔加(VargaSM)(2008)肺部免疫力和免疫病理学：从呼吸道合胞体病毒的经验教训(Pulmonaryimmunityandimmunopathology:lessonsfromrespiratorysyncytialvirus)，《疫苗专家评论(ExpertRevVaccines)》7:1239-1255)(各自5μg/mL)、MHCI(H2-Kd)结合肽、KYKNAVTEL(SEQIDNO:12)(奥尔森(OlsonMR)(2008))、或ConA(5μg/mL)(作为阳性对照)孵育36-48小时。将孵育细胞洗涤掉后，将板用包含的生物素化抗-鼠IFNγ进行孵育，随后遵循试剂盒方案用SA-HRP进行孵育，并且将斑点用包含的TMB试剂进行检测。将板使用CTLImmunoSpot读取器和软件(细胞技术有限公司(CellularTechnologyLtd))进行读数和分析。
细胞因子谱(与未致敏研究相同)
使用被设计成包括IFNγ、IL-5、IL-13、IL-17和嗜酸性粒细胞活化趋化因子的小鼠细胞因子/趋化因子多重试剂盒(密理博公司(Millipore)，比尔里卡，马萨诸塞州)来评价肺匀浆。在使用之前，将肺匀浆通过离心澄清。遵循制造商的说明书进行测定并且将板在Luminex读取器(伯乐公司(Bio-Rad)，圣荷西，加利福尼亚州)上进行分析。
这些实验证实，在具有高和低基线血清反应阳性的血清反应阳性小鼠中，RSV-sF加强中和抗体应答，而不论该所使用的佐剂或提供的RSV-sF剂量如何。然而，用GLA-SE配制RSV-sF在血清反应阳性的小鼠中引发最强CD8T细胞应答。此外，在未致敏BALB/c小鼠中引发Th2应答的配制品(诸如RSVsF单独地或RSVsF+明矾)不会改变在通过预先暴露于RSV而被引发的血清反应阳性动物中的Th1偏向性。在血清反应阳性小鼠中，RSV-sF的给予增加中和抗体应答，而不论所使用的佐剂或给予的RSV-sF剂量如何。
图27是显示RSV-sF加强血清反应阳性小鼠的中和抗体的图。滴度增加的量级对于具有较低初始中和滴度的动物来说是更显著的。这些滴度可以已经被增加至最大中和滴度，该最大中和滴度在接种疫苗后被维持72天。此外，该增加是独立于佐剂的。
图28A和B是展示嗜酸性粒细胞活化趋化因子和IL-13在RSVA2激发后未被诱导的图。Rantes是仅有的受佐剂的存在影响的趋化因子/细胞因子。
图29A和B是展示RSV-sF+GLA-SE加强CD8T-细胞应答的图并且该CD8T细胞应答是剂量依赖性的。未知用50μgRSV-sF是否达到最大应答。然而，具有RSV-sF+GLA-SE的配制品导致具有最大量级多功能应答的CD8T细胞应答。
结果
因为BALB/c小鼠的呼吸道仅是RSV复制半容许的，单一鼻内给予的活的RSV后，高水平的血清中和滴度难以达到。为了在已经用RSV再倍增感染的人中观察到更加接近血清中和滴度的水平，在第0天和35天将小鼠暴露于1x106PFU的RSV两次。如所预期的，单一剂量后，在所有RSV感染的小鼠中存在低的但可检出的中和滴度(图38)。该平均RSV中和滴度是4.2log2。第二剂量后，在平均中和滴度中有16倍加强(至8.3log2)。然而，个体小鼠的滴度中的广泛范围具有范围为3.3至12log2。
为了确定不同的RSVsF配制品加强这些RSV血清反应阳性小鼠的中和滴度的能力，将动物在第56天接种疫苗并且在第70和84天(分别代表接种疫苗后的14和28天)放血。图2展示在加强后的14天的组滴度。图39显示中和滴度随着该研究的持续时间而升高。这些数据说明所有RSVsF疫苗物品都能够在免疫后的14天加强中和滴度从8.3log2的组平均数到9.3log2和11.9log2之间，不论佐剂的存在或佐剂类型。因此，在RSV血清反应阳性BALB/c小鼠中，该RSV中和滴度可以通过非常小量的无佐剂RSVsF加强至比通过50μg的最高有佐剂的RSVsF剂量达到的水平仅低大约6倍的水平。
在第0天(RSV感染前)和在第56天(两个剂量的RSV后)，测量总RSVF-特异性IgG滴度。图41展示在用疫苗物品免疫前，两次连续暴露于活的RSVA2后，存在高水平的抗-F特异性IgG滴度。图42展示在加强后的14天的组滴度。图43显示IgG滴度随着该研究的持续时间而升高。与中和滴度不同，存在小剂量应答。处于0.05μg剂量的RSVsF给出显著低于50μgRSVsF剂量的加强，并且处于0.05μg的含有GLA-SE的RSVsF给出显著低于50μg含有GLA-SE的RSVsF剂量的加强。此外，GLA-SE或明矾的存在也增强该应答。5和50μgRSVsF两组加强RSVF特异性IgG滴度至显著低于与GLA-SE或明矾混合的相应剂量的水平。
在第84天(免疫后24天)，测量抗RSVsF-特异性IgG1和IgG2a血清滴度(图44)。在未致敏小鼠中的先前研究中，用活的RSVA2感染导致Th1偏向性应答，而用RSVsF单独地或吸附于明矾上的RSVsF进行免疫产生Th2偏向性应答。在本研究中相反，Th-1偏向性的血清反应阳性BALB/c小鼠在用RSVsF单独地或吸附于明矾上的RSVsF进行免疫后维持该Th-1偏向性。因此，预建立的宿主Th1偏移未通过用RSVsF或RSVsF+明矾进行免疫而改变。
先前在RSV未致敏小鼠中用RSVsF单独地、RSVsF+GLA-SE、RSVsF+明矾或用RSV原发性感染的免疫研究导致在激发后的4天高IFNγ水平。此外，用RSVsF单独地或吸附于明矾上的RSVsF进行免疫导致在RSV激发后诱导IL-5应答，指示这两组的Th2-偏向性应答。在本研究中，在第88天(用1x106PFURSVA2激发后的4天)，测量肺中的IFNγ和IL-5滴度(图45)。与未致敏BALB/c小鼠不同，用RSVsF或吸附于明矾上的RSVsF进行免疫未引起小鼠响应于RSV激发诱导IL-5，与在血中所测量的IgG1对IgG2a比率一致，IgG1对IgG2a比率指示Th-1偏向性免疫应答。因此，RSV感染的BALB/c小鼠似乎维持通过以前RSV感染确立的Th1偏向性免疫应答，并且在用RSV单独地或RSVsF+明矾进性免疫后继续显示相同的Th应答。
在未致敏BALB/c小鼠模型中，在激发后第4天测量嗜酸性粒细胞活化趋化因子和IL-13，作为嗜酸性粒细胞招募(疫苗安全性的可能指标)的替代免疫标记。这些先前研究显示用RSVsF单独地或RSVsF+明矾两者进行免疫均引起小鼠在RSV激发后具有嗜酸性粒细胞活化趋化因子和IL-13应答，该应答高于通过原发性RSVA2感染诱导的应答。相比之下，用RSVsF单独地或RSVsF+明矾进行免疫的RSV血清反应阳性小鼠在RSV激发后并未诱导嗜酸性粒细胞活化趋化因子或IL-13的高于任何其他组(包括用RSV感染的同龄组)的水平(图46)。
IgG1/IgG2a数据和肺细胞因子数据均表明该疫苗物品的配制品不会影响血清反应阳性小鼠中预先存在的Th-1偏向性。发现仅有的受RSVsF剂量或佐剂的存在差异影响的肺细胞因子是RANTES(图46)。在RSVA2暴露后，所有有佐剂的RSVsF疫苗物品诱导RANTES表达，但在用RSVsF单独地进行免疫的组中，诱导的RANTES的水平随着RSVsF的数量增加而增加。
在免疫后的11天(第67天)和在激发后的4天(第88天)测量针对F-特异性CD8T-细胞的全身性召回应答，以比较通过不同的疫苗物品引发的应答的量级。在通过ELISPOT检测IFNγ分泌细胞之前，使用CD8特异性RSVF肽来刺激脾细胞持续36小时(图47)。针对RSVsF单独地、RSVsF+GLA-SE和RSVsF+明矾，增加剂量的RSVsF增加F-特异性CD8T-细胞的平均数目。然而，与血清学结果不同，在血清学结果中通过RSVsF单独地或RSVsF+GLA-SE或明矾引发的应答之间几乎不存在差异，GLA-SE清楚地被区分为更好的佐剂(用于加强RSV血清反应阳性BALB/c小鼠中的CMI应答)。
结论
使用经典色谱法纯化RSVsF，本研究表征RSVsF剂量(范围为从0.05至50μgRSVsF)对已经用活的RSV连续感染两次的高度RSV血清反应阳性BALB/c小鼠中的血清学应答的影响。在显示相对高RSVFIgG和中和RSV滴度的RSV血清反应阳性小鼠中，该1000倍范围的含有或不含有佐剂的RSVsF剂量对加强中和滴度具有最小的影响。含有或不含有佐剂的0.05μg剂量与50μg剂量在加强中和滴度方面是几乎一样有效的。所有测试的疫苗物品加强中和滴度2到5倍。针对总RSVF特异性IgG滴度，更高剂量的含有GLA-SE或明矾的RSVsF促进比0.05μgRSVF单独地更高的加强。然而，这个差异是适度的，导致约5.7倍增强，进一步表明血清抗体的加强可以用相对小量的RSVsF单独地在RSV血清反应阳性小鼠中被达到。
因为先前暴露于活的RSVA2在BALB/c小鼠中引发Th1偏向性应答，感兴趣的是确定是否已知的Th2偏移疫苗物品(诸如无佐剂的RSVsF或RSVsF+明矾)可以转换Th1偏向性RSV应答为Th2偏向性应答。在激发后的4天，血液中的IgG1/IgG2a比率连同肺细胞因子谱两者表明用RSVsF单独地或RSVsF+明矾进行免疫并未改变预先存在的通过先前RSV感染确立的Th免疫谱。RSVF+GLA/SE(强Th1偏向性疫苗)将在Th2偏向性的RSV血清反应阳性的老年人群体中产生的免疫应答类型仍有待被评价。
本研究还表征了RSVsF剂量连同佐剂在RSV血清反应阳性BALB/c小鼠中加强CD8T-细胞应答的能力。与在未致敏小鼠中发现的相似，较大剂量的RSVsF不会比较小RSVsF剂量促进更高的量级加强。此外，与相同无佐剂的或吸附于明矾上的RSVsF相比，RSVsF+GLA-SE导致最高加强。
实例2c：在血清反应阳性的棉鼠中含有GLA-SE佐剂的RSV-F亚单元疫苗
在本研究中，遵循与实例2b中所使用的类似的方案，使用血清反应阳性的棉鼠模型来评价RSVsF剂量如何影响应答以及佐剂是否调节应答。
简言之，在第0天，经由鼻内途径向96只棉鼠给予1e6pfuRSVA2。在第28天，将这些动物用以下组合物之一经肌内进行免疫：磷酸盐缓冲盐水(PBS)；PBS+GLA-SE；0.1μg、1.0μg或10μgRSV-sF；GLA-SE配制的0.1μg、1.0μg或10μgRSV-sF；10μgRSV-sF+GLA；10μgRSV-sF+SE；10μgRSV-sF+明矾；或活的RSVA2。在D14、D28、D38、D49和D56将这些动物放血。然后在D67，将这些动物用1x106PFURSVA2进行激发并且在D71收获脾/肺。在另一个研究中，在第0天，将64只棉鼠经由鼻内途径给予1x106PFURSVA2。在第28天，将这些动物用以下组合物之一经肌内进行免疫：PBS；PBS+GLA-SE；GLA-SE配制的10μgRSV-sF、10μgRSV-sF；10μgRSV-sF+GLA；10μgRSV-sF+SE；10μgRSV-sF+明矾；或活的RSVA2。在D28和D38，将这些动物放血。
包含RSVA2F序列的氨基酸1-524的RSVF蛋白表达自稳定的CHO克隆并且经由经典的色谱法进行纯化。该RSVF蛋白是>90％纯的并且在ELISA测定中用于动物免疫和涂覆两者。以每疫苗剂量100μg使用明矾(铝胶，精确化学和科学公司(AccurateChemicalandScientific)，新泽西州)并且将明矾通过在室温下混合30分钟而吸附至蛋白。以每剂量5μg使用在水性配制品中的GLA。以2％浓度使用SE。以5μgGLA(在2％SE中)的剂量使用GLA-SE。在给予的2小时之内制备所有疫苗配制品。
使用标准ELISA技术对RSV-F-特异性IgG抗体进行评估。将高结合96孔板用纯化的RSVsF涂覆。在阻断之后，将血清的连续稀释液添加至板中。使用HRP轭合的鸡抗棉鼠IgG抗体(免疫学咨询实验室公司(ImmunologyConsultantsLab))检测结合抗体并且用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB，西格玛公司(Sigma)，圣路易斯，密苏里州)显色。吸光度在450nm处在SpectraMax酶标仪上进行测量并且使用SoftMaxPro(分子设备公司(MolecularDevices)，森尼维耳，加利福尼亚州)进行分析。将滴度报道为以1:1000血清稀释度或log2终点滴度使用2倍空白组孔的平均数的截留值的吸光度。通过竞争ELISA测定量化位点特异性抗体。简言之，高结合96孔板用纯化的RSVsF进行涂覆。在阻断后，将连续稀释的血清与恒定浓度的生物素化抗体混合，该生物素化抗体识别位点A、位点B或位点C(比勒(BeelerJA)，范怀克寇林格(WykeCoelinghK)，呼吸道合胞体病毒的F糖蛋白的中和表位：突变对融合功能的影响(NeutralizationepitopesoftheFglycoproteinofrespiratorysyncytialvirus:effectofmutationuponfusionfunction)，《病毒学杂志》(J.Virol.)，1989；63(7):2941-50)。计算对处于代表性稀释度的个体血清的竞争百分比(100×[1-{血清OD/mAbOD平均数}])。将微量中和滴度如先前针对未致敏小鼠研究所述的来确定。
结果
RSV感染后的28天，测量总RSVF-特异性IgG滴度的水平，以确立在免疫之前和在38、49和56天的基线抗体滴度以测量免疫后抗体滴度的加强。在第28天，在暴露于活的RSVA2之后，存在显著水平的RSVF特异性IgG。第38、49和56天的数据展示所有用RSVsF接种疫苗的组(不论剂量)加强了RSVsF特异性IgG滴度并且由于佐剂的存在，加强不是显著增强的(图48)。在第38和49天，与安慰剂免疫的组和接受第二次暴露于活的RSVA2的组相比，这些组处于1:1000稀释度的平均A450OD值均是显著更高的。在第56天，仅0.1μg不含佐剂的RSVsF剂量与血清反应阳性/安慰剂组和接受第二活的RSVA2剂量的组两者没有统计差异。第38天和第49天的趋势表明100倍以上的RSVsF(10μg对比0.1μg)导致以最高RSVsF剂量针对RSVsF±GLA-SE的最低程度地更高滴度。全部这些数据表明不是RSVsF的剂量也不是佐剂的存在极大地影响RSVF特异性血清滴度的加强，从而支持血清反应阳性的BALB/c小鼠组中的相似结论。
在第28天测量RSV中和抗体滴度的水平以确立基线中和滴度，并且在38、49和56天测量免疫后中和抗体滴度的加强。在第28天，每个血清反应阳性组的平均值是至少10log2(图49)。因为棉鼠是更容许RSV复制的，用RSV单一感染后的中和滴度导致远高于在BALB/c小鼠中所观察到的平均滴度的平均滴度。在BALB/c小鼠中，用1x106PFU的活的RSVA2单一感染后的平均中和滴度的范围在4log2和6log2之间。
在第49天(免疫后的21天)的中和滴度指示这些滴度被加强至在11.4和13.1之间的平均值(图49)。除RSVsF(10μg)同龄组之外的所有组被加强至比血清反应阳性/安慰剂同龄组显著更高的滴度。任何无佐剂组之间或任何RSVsF+GLA-SE组之间不存在统计学差异，表明增加RSVsF的剂量从0.1至10μg对免疫后的平均值中和滴度没有影响。
为了评价中和滴度的加强的量级，在免疫后的10、21和28天，计算对于每个动物的基线滴度的倍数增加(图50)。用含有或不含有佐剂的RSVsF免疫的所有组具有几何平均值增加高于血清反应阳性/安慰剂接种疫苗的组，然而归因于数据的广泛分散，在免疫后的10天，仅用1μgRSVsF+GLA-SE和10μgRSVsF+明矾免疫的组是显著地高于血清反应阳性/安慰剂接种疫苗的组。在免疫后的21天，仅10μgRSVsF+明矾组是显著地高于安慰剂。仅RSVsF(10μg)、RSVsF(1μg)+GLA-SE、RSVsF(10μg)+GLA-SE、RSVsF(10μg)+GLA和RSVsF(10μg)+明矾在免疫后的10天具有4倍或更大的几何均数增加。中和滴度的小至中等加强很可能归因于10log2的高基线滴度。在棉鼠中，这个滴度接近于最大可达到的RSV滴度。总的这些数据表明含有或不含有佐剂的RSVsF的剂量对加强中和滴度具有最小的影响，支持总RSVsF特异性IgG结果。在棉鼠中，最小加强很可能归因于基线滴度接近于最大可达到的RSV滴度的事实。在BALB/c血清反应阳性的动物模型中产生相似的结论。
对该RSVF蛋白具有特异性的中和单克隆抗体(Mab)已经被产生并且被定位到3个主要的位点，位点A、位点B和位点C(比勒(BeelerJA)，范怀克寇林格(WykeCoelinghK)，呼吸道合胞体病毒的F糖蛋白的中和表位：突变对融合功能的影响(NeutralizationepitopesoftheFglycoproteinofrespiratorysyncytialvirus:effectofmutationuponfusionfunction)，《病毒学杂志》(J.Virol.)，1989；63(7):2941-50)。在棉鼠中，免疫后，各自在竞争ELISA中利用一个位点AMab一个位点B(1112)和一个位点CMab(1331H)以测量产生至位点A、位点B或位点C的抗体的相对量(图51)。这些平均值表明RSVsF单独地和含有任何佐剂的RSVsF两者加强抗体对特异的中和位点的应答比安慰剂或第二次暴露于RSVA2的更好。在这个测定中，含有或不含有GLA-SE的0.1、1.0和10μgRSVsF同龄组之间没有显著差异，然而这些趋势表明更高剂量的RSVsF和佐剂的存在可以有利于加强位点特异的抗体应答。
在第二血清反应阳性的棉鼠研究中，RSV感染后的28天，测量总RSVF-特异性IgG滴度的水平，以确立在免疫之前和在第38天的基线抗体滴度以测量免疫后抗体滴度的加强。在第28天，在暴露于活的RSVA2之后，存在显著水平的RSVF特异性IgG(图48)。所有组均达到在13.4和14.7log2之间的平均滴度。第38天的数据展示所有用RSVsF(不论佐剂)接种疫苗的组加强RSVsF特异性IgG至滴度显著地高于安慰剂(PBS+GLA-SE)或第二剂量的RSVA2。
为了评价血清IgG滴度的加强的量级，在免疫后的10天，计算对于每个动物的自基线滴度的倍数增加(图49)。用含有或不含有佐剂的RSVsF免疫的所有组几何均数增加大于4倍且范围在12.0和25.0之间。对照组(诸如未致敏和血清反应阳性/安慰剂组)连同接受第二剂量的活RSVA2的组不具有血清滴度的加强并且已经计算倍数增加少于2。
在第28天测量RSV中和抗体滴度的水平以确立基线中和滴度，并且在第38天测量免疫后中和抗体滴度的加强。在第28天，每个血清反应阳性组的平均值是至少9log2并且范围在9.0log2和9.5log2之间(图50)。在先前血清反应阳性的棉鼠研究中，在第28天的平均中和滴度是在10.1和11.7之间。因为棉鼠是更容许RSV复制的，用RSV单一感染后的中和滴度导致远高于在BALB/c小鼠中所观察到的平均滴度的平均滴度。在BALB/c小鼠中，用1x106PFU的活的RSVA2单一感染后的平均中和滴度的范围典型在4log2和6log2之间。
在第38天(免疫后的10天)的中和滴度指示这些滴度被加强至在12.3和13.9之间的平均值(图50)。在先前血清反应阳性的棉鼠研究中观察到相似的免疫后滴度。所有RSVsF组被加强至显著高于安慰剂组的滴度。与血清IgG滴度的数据不同，活的RSVA2组的中和滴度也具有加强，该加强显著高于安慰剂组。此外，RSVsF+GLA-SE、RSVsF+GLA、和RSVsF+明矾组被加强至高于RSVA2的滴度。为了评价中和滴度的加强的量级，在免疫后的10天，计算每个动物的自基线滴度的倍数增加(图51)。用含有或不含有佐剂的RSVsF免疫的所有组具有在8.1和21.9之间的平均倍数增加，该范围与用血清IgG滴度所看到的倍数增加相似。与在先前血清反应阳性的棉鼠研究中不同，该中和滴度的增加更易于观察，因为与10log2相比，起始基线滴度在9log2更低，并且在本研究中，每个组中的变异性更小。总的这些数据表明佐剂的存在对加强中和滴度有最小的影响，因为平均的RSVsF+佐剂中和滴度比RSVsF单独地仅高2-3倍。这些数据也支持总的RSVsF特异性IgG数据。在血清反应阳性的BALB/c小鼠中也产生相似的结论。
对该RSVF蛋白具有特异性的中和单克隆抗体(Mab)已经被产生并且被定位到3个主要的位点，位点A、位点B和位点C(比勒(BeelerJA)，范怀克寇林格(WykeCoelinghK)，呼吸道合胞体病毒的F糖蛋白的中和表位：突变对融合功能的影响(NeutralizationepitopesoftheFglycoproteinofrespiratorysyncytialvirus:effectofmutationuponfusionfunction)，《病毒学杂志》(J.Virol.)，1989；63(7):2941-50)。在棉鼠中，免疫后，各自在竞争ELISA中利用一个位点AMab一个位点B(1112)和一个位点CMab(1331H)以测量产生至位点A、位点B或位点C的抗体的相对量(图51)。RSVsF单独地和含有任何佐剂的RSVsF两者显著地加强抗体对这些特异的中和位点的应答比安慰剂或第二次暴露于RSVA2的更好。仅有的例外是RSVsF+SE，其中位点B中滴度的加强显著高于第二剂量的RSVA2，但并非显著高于安慰剂组。有趣的是，其中第二剂量的RSVA2加强滴度显著地高于安慰剂的仅有的位点是位点C。
结论
使用典型纯化的RSVsF，本研究表征在100倍范围内(0.1至10μgRSVsF)的RSVsF剂量的影响连同佐剂对RSV血清反应阳性的棉鼠中的血清学应答的影响。与未致敏动物模型不同，当与佐剂一起或不与佐剂一起被给予时，RSVsF剂量对总IgG、位点特异性应答或总的中和滴度的加强的量级具有最小至无影响。同样地，在最高RSVsF剂量处任何佐剂的存在也对进一步辅助的应答的量级具有很少至无影响。
实例3：未致敏斯普拉道来大鼠中的RSV-sF免疫原性
本研究评价RSV-sF疫苗配制品在斯普拉道来大鼠中的免疫原性，斯普拉道来大鼠是通常用于药物和疫苗开发的毒理学研究的模型。本研究的目标是：(A)证实未接种疫苗的斯普拉道来大鼠支持在肺和鼻中的RSVA2复制，并且鉴定峰值RSV复制的天数；(B)在未致敏斯普拉道来大鼠中，当用10μg或100μg含有GLA-SE的RSVsF以2.5μg/2％SE给予时，量化F-特异性体液、细胞和保护性免疫应答的水平；(C)在未致敏斯普拉道来大鼠中确定该剂量的RSVsF是否影响RSV-SF诱导的体液、细胞和保护性免疫应答的水平；以及(D)在未致敏斯普拉道来大鼠中展示是否需要GLA-SE活性来诱导对RSVsF的体液、细胞和保护性免疫应答。
在这个动物模型中，展示了鼻内接种后，RSVA2病毒在鼻和肺中的病毒复制。RSVsF蛋白产生自稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和柱纯化。在第0天和第22天，将10或100μg无佐剂的或含有2.5μg/2％剂量的GLA-SE的RSVsF经肌内给予至雌性斯普拉道来大鼠，在所有动物(n＝4-6/组)接种疫苗后的14、22和42天测量血清学的抗-F抗体应答以及RSV中和抗体应答。在第46天，在所有动物(n＝3-4/组)中RSV激发后的4天，测量F-特异性T-细胞应答。激发后的4天，通过从肺和鼻中清除RSV来展示RSV激发后的局部保护性免疫力。本研究显示通过含有或不含有佐剂的抗原剂量两者诱导的RSV-F特异性体液免疫应答，而RSV-F特异性细胞免疫应答是抗原-和佐剂-依赖性的。通过RSVsF+GLA-SE疫苗候选物在斯普拉道来大鼠中诱导的体液和细胞免疫应答在肺和鼻两者中提供完全保护免受RSV激发。
该疫苗组合物包含纯化的含有吡喃葡萄糖基脂质A/稳定乳剂(GLA-SE)(免疫设计公司(ImmuneDesignCorporation)，西雅图，华盛顿州)的RSV可溶性F(sF)蛋白，用于通过肌内注射给予。重组RSVsF蛋白产生自稳定克隆的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。对于本研究，使用经典的柱纯化方法来纯化RSVsF。
理想的毒理学动物物种是这样一个物种：(i)用所有关键的免疫学应答对该疫苗抗原和佐剂产生应答，(ii)对该疫苗靶向病原体易感，和(iii)将调节全部人剂量的递送。该毒理学模型应展示F-特异性体液免疫应答、F-特异性T细胞应答，并且在未接种状态下，一旦接种疫苗，就容许RSV感染但保护免受RSV激发。斯普拉道来大鼠是标准的毒理学物种，其可以用高达500μL经肌内被给予。在本研究中，我们证实该RSVA2菌株在未致敏斯普拉道来大鼠中的复制并且发现RSV-sF诱导保护对抗RSV激发的体液和细胞免疫力，因此满足适合的毒理学模型的、用于评价RSV疫苗候选物所有标准。
在未致敏大鼠中，进行一个初始研究来证实RSVA2感染后，RSVA2复制并且确定峰值病毒滴度的天数。用2x106pfuRSVA2经鼻内感染5个同龄组的RSV未致敏雌性SD大鼠。在感染后的1、4、6、8和14天，分别从每组5只安乐死的大鼠中收获肺和鼻，在同一天均质化并且通过噬斑测定确定RSV滴度。本研究显示峰值病毒复制的天数是RSV感染后的4天。在本研究中未进行另外的测定。
在随后的研究中，在RSV-SF引发-加强方案后评价免疫原性和保护。将40只未致敏雌性斯普拉道来大鼠分为指定的疫苗同龄组，每个同龄组5-6只动物。简言之，向测试组给予不含佐剂的RSVsF(每只动物10μg或100μg)或含有GLA-SE(2.5μg，在2％SE中)的RSVsF(每只动物10μg或100μg)。向阴性对照组给予安慰剂(PBS缓冲液)或不含RSVsF的佐剂GLA-SE(2.5μg/2％)。将阳性对照组用2x106pfu活的RSVA2经鼻内接种。在第0天和第22天，将组1-6用500μL的指定疫苗物品IM接种，而仅在第0天，将组7用200μL的RSVA2病毒接种。在第42天，用2x106pfu活的RSVA2病毒将所有动物IN激发。在激发后的4天(在第46天)将大鼠进行安乐死，峰值病毒复制的天数从研究1开始确定。将肺(除了福尔马林固定的1个肺叶外)和鼻均质化并且对病毒滴度进行量化。
将有佐剂的疫苗配制品的反应原性通过接种后对大鼠的直接观察并且在研究过程中通过每周3次追踪动物重量(数据未显示)进行评估。
在免疫后的6小时、D22和D42针对所有动物以及在第14天针对每组3只动物的亚组，对接种疫苗的血清学应答进行评价。将动物用异氟烷轻度麻醉并经眶内放血。将血清分离并且贮存在-20℃下并且被解冻用于测试。通过多重ELISA评价免疫后的6小时获得的血清的细胞因子滴度。测量来自第14、22和42天的血清的总抗-FIgGELISA终点稀释度滴度。通过ELISA终点稀释度滴度评价第42天血清的IgG1、IgG2a和IgG2b抗-F应答的特异性贡献。在第22和42天，通过RSVA2-GFP微量中和测定确定血清RSV中和滴度。
在第46天(RSV激发后的4天)，在所有可获得的动物中评价对接种疫苗的全身性细胞免疫应答。对于这些组中的每一个，制备个体的脾细胞样品。用RSVsF再刺激36-48小时后，通过对IFNγ-分泌的细胞进行ELISPOT计数来评估T-细胞读数。使用GraphPadPrism单因子ANOVA与杜奇(Tukey)或邦费罗尼(Bonferroni)事后检验来计算显著性，其中截留值p<0.05。
配制用于IM给予的测试物品以达到抗原和佐剂在500μL剂量中的所希望的最终量。添加的顺序是如下：首先添加PBS，然后是处于1:3最终稀释度的GLA-SE佐剂(当使用时)，然后是处于1:500稀释度(针对10μg剂量)或1:50最终稀释度(针对100μg剂量)的RSVsF抗原(当使用时)。将配制的测试物品通过涡旋30秒进行混合并且在给予至动物之前贮存在4℃下持续高达15小时。将贮存的测试物品在转移至ACF棒(staff)之前通过涡旋彻底混合以用于给予至动物。
在给予至动物之前少于1小时制备用于IN接种和激发的活的RSVA2。将RSVA2等分部分在冰上解冻。对于200μL的2x106pfu剂量，将120.4μL处于1.66x107pfu/mL的病毒母液用79.6μLOptimemplus1xSP进行稀释。制备过剩的300μL并且转移至在湿冰上的ACF棒用于动物接种。
将残留的疫苗配制品用抗-FmAb(帕利珠单抗)经受蛋白质印迹分析以证实在该阴性对照中缺乏RSVsF并且在组3和5以及在组4和6中存在等量的RSVsF(数据未显示)。将未经蛋白质印迹分析消耗的所有测试物品丢弃。
讨论
在为了研究RSVA2菌株复制在斯普拉道来大鼠的肺和鼻中的时程的初始研究中，将25只大鼠在第0天用2x106pfu的RSVA2病毒进行IN激发。在激发后的1、4、6、8和14天收获的均质化肺和鼻中测量RSV病毒滴度。将RSV病毒复制在第1、4和6天在所有测试动物中进行检测并且在肺和鼻两者中均在第4天达到峰值(图30)。在激发后第4天，检测到峰值病毒载量在肺中平均为约105pfu/g并且在鼻匀浆中平均为约103.4pfu/mL。在第6天，病毒滴度已经减少大约一半。在第8天，在肺中，5只动物中仅有1只具有任何可检出的病毒滴度，并且这个动物在鼻中不具有可检出的滴度。因此，对于在斯普拉道来大鼠中的RSV-SF疫苗激发研究，在RSV激发后第4天收货肺和鼻，RSV激发后第4天代表峰值病毒复制的天数。
制备疫苗并且在第0天给予至所有动物。组1-6在第22天接受了加强的疫苗。所有疫苗是耐受良好的，其中在任何组中没有注射位点反应的报道。对动物重量进行追踪并且呈现为与初始起始重量的组百分数变化。总的来说，在该研究的进程中动物迅速获得重量，而在接种后无重量降低，不论是否给予疫苗配制品。然而，在该研究的进程内失去3只动物，归因于在采血之前给予的异氟烷麻醉：来自组5的2只动物在第0天在接种时间后6小时死亡和来自组3的1只动物在第14天死亡。
GLA-SE是TLR4-刺激的佐剂，其已经在小鼠、豚鼠、兔、猴和人中显示活性，但先前尚未在大鼠中进行评价。已经报道包含疫苗配制品的TLR4激动剂单磷酰基脂质A(MPL)在接种疫苗后的第一个6小时之内在小鼠的血清中诱导可检出水平的IL-6和MCP-1(迪迪埃劳伦特(Didierlaurent)等人，ASO4，一种基于佐剂系统的铝盐-和TLR4激动剂，诱导瞬时免疫应答从而导致增加的适应性免疫.《免疫学杂志》(JImmunol.)2009；183:6186-97)。这些和其他血清细胞因子一致地在BALB/c小鼠中在GLA-SE给予后的6小时被观察到。为了确定GLA-SE是否在斯普拉道来大鼠中具有先天性免疫刺激活性，将包括IL-6、MCP-1、MIP-1β和KC的细胞因子的血清水平在免疫后的6小时通过基于珠粒的多重ELISA测定进行评价。针对这些细胞因子中的每个，观察到GLA-SE依赖性血清细胞因子应答(图31)。在血清中检测到的这些细胞因子中最丰富的是KC(CXCL1)，这是嗜中性白细胞趋化因子，随后是单核细胞趋化因子MCP-1(CCL2)和MIP-1α(CCL3)以及多能细胞因子IL-6。同时，也研究了若干另外的细胞因子，包括IL-1β和TNFα，所示的细胞因子是仅通过GLA-SE调节的细胞因子，这些细胞因子在检测基线之上是可检出的。
在接种疫苗后的第14天、第22天和第42天评估诱导的F-定向的抗体应答并且与针对每个疫苗同龄组的对照相比较(图32)。在每个时间点，在RSVsF+GLA-SE组中的应答是显著大于在其相匹配的无佐剂的RSVsF组中的。仅含有GLA-SE佐剂的RSVsF同龄组开发的血清抗-FIgG终点滴度大于通过活的RSV所达到的滴度，并且在第42天，对于RSVsF+GLA-SE两个组这个差异是显著的。然而，在任何时间点，通过10和100μg无佐剂或有佐剂的RSVsF诱导的IgG滴度之间都不存在显著差异。这些结果指示血清抗-FIgG滴度在斯普拉道来大鼠中的诱导不受RSVsF的剂量从10至100μg的增加的影响，但是通过添加GLA-SE佐剂而加强。
在第42天还评价了血清F-特异性抗体的IgG1、IgG2a和IgG2b同种型，作为接种疫苗后T辅助细胞型平衡的指标。F-特异性IgG1滴度(Th2-型亚型)和F-特异性IgG2a和IgG2b滴度(Th1-型亚型)均在第42天存在于接受有佐剂的RSVsF疫苗或活的RSVA2的大鼠中(图33)。在活的RSV组中，IgG2a滴度等于IgG1滴度，表明与小鼠相比较，Th偏向性在大鼠中可能不是如此清楚定义的。然而，在接受活的RSVA2的大鼠中，IgG2b滴度高于IgG1滴度，与Th1-应答一致。接受无佐剂的RSVsF的大鼠具有比IgG2b滴度更高的IgG1滴度，与Th2-应答一致。与以相同剂量的无佐剂的RSVsF组相比，用RSVsF+GLA-SE接种疫苗的大鼠具有更高水平的所有同种型。总的来说，在用GLA-SE给予的组中，IgG2b滴度的增加(约64倍)大于IgG1滴度的增加(约16倍)。这表明在斯普拉道来大鼠中，GLA-SE帮助促进更多对RSVsF的Th1-偏向性免疫应答。
在第22天(剂量1后的22天)和在第42天(剂量2后的20天)，评价血清RSV中和滴度(针对RSV疫苗的关键功能性读数)。在第22天，对于不同组的经免疫的动物的GMTlog2IC50血清中和滴度的范围为自安慰剂组中的2.96至sF(100μg)+GLA-SE组的9.47(图34)。在第22天，给予无佐剂的RSVsF疫苗的大鼠具有与安慰剂没有显著差异的RSV中和滴度。相比之下，通过含有GLA-SER佐剂的RSVsF疫苗组(log2GMT8.89-9.47)和活的RSV组(log2GMT8.51)达到的高的第22天中和滴度，该滴度显著地大于在该阴性对照组或成对的无佐剂的RSVsF组中所观察到的。将中和抗体滴度用第二剂量的疫苗加强，正如在RSVsF+GLA-SE组中，与第22天(log2GMT8.89-9.47)的相比，在第42天观察到RSV中和滴度的10-20倍加强(log2GMT13.25-12.86)。同样地在第42天时间点，与阴性对照和成对的无佐剂的RSVsF组相比，RSVsF+GLA-SE免疫的组显示显著更大的中和滴度。与阴性对照相比，该活的RSV组也具有显著更大的中和滴度(log2GMT9.41)。有趣的是，在本研究中，不存在疫苗诱导的血清中和滴度对RSVsF剂量的依赖性。
全身性F-特异性T-细胞免疫应答是对RSV-SF接种疫苗的另一个关键功能性应答。在第46天(激发后的4天)，从每个组(n＝4-6)中的个体动物收获脾细胞。将应答通过IFNγELISPOT使用RSVsF蛋白再刺激进行评价。该安慰剂组、仅佐剂的组和无佐剂的RSVsF组(10和100μg)具有相等的F-特异性应答(分别为61.07、47.73、64.00和87.78SFU/百万细胞)。然而，含有GLA-SE佐剂的RSVsF组(10和100μg)和活的RSV组两者均显示比安慰剂组显著更大的F-特异线性IFNγELISPOT应答(分别为259、362.67和258.13SFU/百万细胞)(图35)。这指示RSV-SF可以在斯普拉道来大鼠中以GLA-SE依赖的方式引发对RSVsF的T细胞应答。然而，T细胞(CD4或CD8)亚型不能从这个测定进行确定，外源抗原(诸如RSVsF蛋白)最有可能再刺激CD4应答。
来自RSV激发的保护指示该测量的对接种疫苗的免疫应答在体内中和RSV复制方面是有效的。接种疫苗后，在第42天，将所有组用2x106pfu的RSVA2病毒经鼻内进行激发。将RSV在均质化的肺中确定滴度并且在第46天(激发后的4天)收获鼻。在肺中的病毒复制(其在所有阴性对照动物中是预期的)在本研究中并不是与初始病毒复制时程研究中的一致。在本研究中，在激发后5只安慰剂动物中仅3只以及仅有佐剂的动物中的3只在肺中具有可检出的RSV(图36)。在鼻中的复制与所预期的结果更一致，在5只安慰剂动物中的5只以及5只仅有佐剂的动物中的4只具有可检出的RSV病毒载量。该安慰剂病毒滴度是102.30于肺中(具有100.94平均LOD)以及102.62于鼻中(具有100.60平均LOD)。在非临床的动物模型中的显著的RSV保护在历史上被定义为在接种疫苗的和安慰剂动物之间的≥102滴度降低，但这个差异并未达到，归因于安慰剂动物中低水平的复制。然而，在用活的RSVA2感染之前，完全抑制这个组中的所有经激发的动物的上和下呼吸道中的RSV复制，6只动物中有6只未显示病毒滴度超过肺或鼻中的测定LOD。在RSVsF(10μg)+GLA-SE中，将所有4只动物也完全地保护免受在上和下呼吸道两者中的RSV激发。RSVsF(100μg)+GLA-SE接种疫苗抑制病毒在6只动物中的5只的肺中以及在6只动物的4只的鼻中复制。相比之下，以10或100μg的无佐剂的RSVsF显示与用安慰剂或GLA-SE单独地接种疫苗的动物相同扩大的病毒滴度，其中滴度在每组仅1-2只动物中低于检出限。这个数据与斯普拉道来大鼠中的RSV-SF接种疫苗的保护性作用一致。
结论
本研究发现以含有2.5μg在2％GLA-SE中的10或100μgRSVsF引发-加强接种诱导RSV-F特异性体液和细胞免疫应答，从而保护斯普拉道来大鼠免受RSV激发。F-特异性IgG早在用RSV-SF单一接种后的第14天就是可检出的，并且在第42天被表征为Th1-样(IgG2b>IgG1)。在用RSV-SF单一接种后第22天，RSV中和抗体的显著滴度是可检出的并且通过用RSV-SF第二次接种而加强。在RSV-SF免疫的同龄组两者中，在激发后检测F-特异性T细胞应答。然而，该高和低剂量的RSVsF导致可比较的体液和细胞免疫应答，GLA-SE的存在显著地增加了体液应答并且对RSVsF的细胞应答是必需的。GLA-SE在大鼠中具有先天性免疫刺激能力，如通过在接种后的6小时检测血清中的细胞因子诸如IL-6、KC、MCP-1和MIP-1α所展示的。对该疫苗的先天性应答并未导致任何重量丧失或注射位点反应。然而，单独地给予GLA-SE具有与RSVsF+GLA-SE相似的先天性免疫刺激能力，其并未诱导RSV特异的体液和细胞应答，也并未保护免受RSV激发。因此，斯普拉道来大鼠是用于评价RSV-SF安全性的适合的毒理学动物模型。
图37A和B是显示对各种组合物的注射耐受的图。(A)接种疫苗的棉鼠的重量变化；以及(B)接种疫苗的斯普拉道来(SD)大鼠的重量变化。sF+GLA-SE疫苗在棉鼠(CR)和斯普拉道来(SD)大鼠中具有可接受的反应原性。无位点应答，接种疫苗后<5％体重降低。
实例4：非人灵长类动物免疫原性数据
有佐剂的RSVsF疫苗在非人灵长类动物中诱导长效的F-特异性体液和细胞免 疫
猕猴是用于毒理学的常用非人灵长类动物(NHP)物种并且就其对有佐剂的RSVsF候选疫苗的免疫应答进行研究。在这个非-GLP研究中，将经肌内给予的RSV疫苗候选物的免疫原性与猕猴中的单独的sF蛋白进行比较，RSV疫苗候选物由以下项组成：用在2％稳定乳剂(SE)佐剂中的TLR4激动剂吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)配制的经纯化的可溶性F(sF)蛋白。将具有4只NHP的第一组(组1)用不含佐剂的100μgRSVsF进行免疫，而将具有4只猴的第二组4(组2)用由5μgGLA在2％SE佐剂中配制的100μgRSVsF进行免疫。在第0和28天将动物进行免疫并且从预研究的第7天到第169天检测体液和细胞应答。然后在第169天分别用无佐剂(组1)或有佐剂(组2)的NHP进行加强，并且跟踪持续另外的14天(至第183天)来评价长期的记忆应答。
依据疫苗诱导的抗-FIgG滴度以及依据RSV中和抗体(Ab)应答两者来评价血清学应答。在免疫之前，两组中的所有动物均具有不可检出的抗-FIgG或RSV中和滴度，指示它们是RSV血清反应阴性的。通过RSVsF蛋白ELISA来确定抗-FIgG滴度。在第42天，应答达峰值，几何均数抗-FIgG滴度在接受含有GLA-SE的RSVsF的组2(15.67±0.53log2)中是显著地高于接受RSVsF单独地的组1(10.45±2.68log2)(p＝0.032)(图57)。RSVsF-特异性IgGAb滴度随着时间的推移在两组中降低(至12.85log2于组2中以及10.13log2于组2中)，但在第169天(接种疫苗后的5个月)之后仍观察到可检出的应答，在该点给予加强的接种疫苗。召回后的14天(在第183天)，与sF单独地组(几何均数12.55±2.16log2)相比，在sF+GLA-SE组(几何均数15.86±0.85log2)中再次观察到更大的应答。与第169天相比，在第183天在sF+GLA-SE组中的所有动物展示IgG滴度的≥4倍的增加，然而与第169天相比，在第183天在sF单独地组中4只动物中仅有2只展示IgG滴度的≥4倍的增加。这些数据展示与sF单独地相比，GLA-SE增加IgG对sF的应答并且在猕猴NHP模型中导致对免疫的更同质的应答两者。
为了确定添加GLA-SE至sF是否也增加血清RSV中和滴度，依据log2IC50血清稀释度滴度测量RSV中和Ab水平，该log2IC50血清稀释度滴度是必需的以用经工程化以表达绿色荧光蛋白(RSVA2-GFP)的RSVA2菌株来中和Vero细胞的感染。在第42天，应答达峰值，与接受RSVsF单独地(3.52±1.14log2)相比，该几何均数RSV中和Ab滴度显著高于接受含有GLA-SE的RSVsF(6.36±1.42log2)的组中的(p＝0.022)(图58)。在第42天峰值，在RSVsF+GLA-SE组中的4/4动物展示自第7天的中和滴度水平的4倍加强，而在RSVsF单独地组中，仅1/4动物展示中和滴度的4倍加强。RSV中和Ab滴度随着时间的推移在两个组中均降低(在第169天，在组2中降低至3.60log2并且在组1中降低至2.97log2)。在第169天(接种疫苗后的5个月)，给予加强的接种疫苗。第三次免疫后的14天(在第183天)，与sF单独地组(几何均数4.46±1.79log2)相比，在sF+GLA-SE组(几何均数6.70±1.03log2)中观察到更大的中和Ab滴度。这些数据显示添加GLA-SE至sF增加了F-特异性IgG以及RSV中和Ab应答两者的量级和持续时间两者。
为了确定用使用GLA-SE配制的sF进行免疫是否增强F-特异性T细胞应答，在用具有衍生自RSVF蛋白序列的重叠15-mer的肽池再刺激后，通过ELISPOT测量F-特异性IFNγT细胞应答。在第42天，达到应答峰值，在RSVsF+GLA-SE组中，所有4只NHP均显示阳性应答，该阳性应答被定义为从预研究基线(第7天)最小增加为50个斑点形成计数(SFC)/百万PBMC以及从第-7天的SFC/百万PBMC最小4倍增加，而在RSVsF单独组中4只猴中0只显示阳性应答。在第42天，在sF+GLA-SE组中的平均应答是392SFC/百万PBMC，显著地大于在F单独的组(8SFC/百万PBMC)中的应答(p＝0.019)(图59)。然而，在sF+GLA-SE组中T细胞数目随着时间的推移而减少，在第169天之外，一只动物仍然满足阳性应答者的定义。在第169天(接种疫苗后的5个月)，给予加强的接种疫苗。在第三次免疫后的14天(在第183天)，在sF+GLA-SE组中的应答已经衰退的3只猴中的IFNγT细胞显著更高，以给出sF+GLA-SE组中的总应答速率为4只动物中的4只(261SFC/百万)。相比之下，在sF单独的组中4只猴中的0只随着IFNγ分泌的F-特异性T细胞(平均5SFC/百万)的增加而应答。
总之，在sF+GLA-SE免疫的动物中观察到处于显著地大于在无佐剂的sF单独地免疫的组中观察到的水平的稳健的血清抗-FIgG应答、RSV中和应答和F-特异性IFNγT细胞应答。这些应答在第二次免疫后的2周达到峰值并且接种疫苗后持续3-5个月仍可检出，在可检出的点处将它们通过第三次免疫加强至相等的或更高水平。这些研究指示RSVsF+GLA-SE的蛋白亚单位疫苗可以在非人类灵长动物中诱导对RSV的稳健的和历时长久的体液和细胞应答。
通过引用进行的结合
将在此引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及在尚未被结合在此的程度上在此引用的所有参考文献特此通过引用以其全文结合在此。
等效物
前述书面说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践本发明。前述说明和实例详述本发明的某些优选实施例。然而，应理解的是本发明可以按多种方式进行实践，并且本发明应该依据所附权利要求书及其任何等效物来解释。

Claims (83)

1.一种疫苗组合物，包括：至少约1μg和高达约200μg的RSV可溶性F蛋白以及至少约1μg和高达约20μg的包括脂质toll样受体(TLR)激动剂的佐剂。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中该RSV可溶性F蛋白缺乏C-末端跨膜结构域。
3.如权利要求1或2所述的疫苗组合物，其中该RSV可溶性F蛋白缺乏胞质尾区结构域。
4.如权利要求1-3中任一项所述的疫苗组合物，其中该RSV可溶性F蛋白包括来自人菌株A2(SEQIDNO:2)的RSV可溶性F蛋白的氨基酸1-524。
5.如权利要求1-4中任一项所述的疫苗组合物，其中该RSV可溶性F蛋白包括SEQIDNO.7。
6.如权利要求1-5中任一项所述的疫苗组合物，其中该佐剂包括(TLR)4激动剂。
7.如权利要求1-6中任一项所述的疫苗组合物，其中该佐剂包括合成的己酸化脂质A衍生物。
8.如权利要求1-7中任一项所述的疫苗组合物，其中该佐剂包括吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。
9.如权利要求1-8中任一项所述的疫苗组合物，其中该佐剂包括具有以下化学式的化合物：
其中R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；并且R2和R4是C12-C20烷基。
9.如权利要求1-8中任一项所述的疫苗组合物，其中该佐剂包括在稳定的水包油乳剂中的GLA(GLA-SE)。
10.如权利要求1-9中任一项所述的疫苗组合物，其中该佐剂包括在稳定的基于角鲨烯的乳剂中的GLA。
11.如权利要求1-10中任一项所述的疫苗组合物，其中该佐剂包括在具有浓度为至少约1％和高达约5％的稳定的水包油乳剂中的GLA。
12.如权利要求1-11中任一项所述的疫苗组合物，其中该佐剂包括在具有平均粒径为至少约50nm和高达约200nm的稳定的水包油乳剂中的GLA。
13.如权利要求1-12中任一项所述的疫苗组合物，包括至少约5μgRSV可溶性F蛋白。
14.如权利要求1-13中任一项所述的疫苗组合物，包括至少约10μgRSV可溶性F蛋白。
15.如权利要求1-14中任一项所述的疫苗组合物，包括至少约20μgRSV可溶性F蛋白。
16.如权利要求1-15中任一项所述的疫苗组合物，包括至少约30μgRSV可溶性F蛋白。
17.如权利要求1-16中任一项所述的疫苗组合物，包括至少约50μgRSV可溶性F蛋白。
18.如权利要求1-17中任一项所述的疫苗组合物，包括至少约100μgRSV可溶性F蛋白。
19.如权利要求1-18中任一项所述的疫苗组合物，包括至少约2.5μg佐剂。
20.如权利要求1-19中任一项所述的疫苗组合物，包括至少约5μg佐剂。
21.如权利要求1-20中任一项所述的疫苗组合物，包括约10μg和约100μg之间的RSV可溶性F蛋白以及约1μg和约5μg之间的GLA-SE。
22.如权利要求1所述的疫苗组合物，包括约10μg和约100μg之间的RSV可溶性F蛋白以及约1μg和约5μg之间的、在具有约1％和5％之间浓度的稳定的水包油乳剂中的GLA，其中RSV可溶性F蛋白包括来自人菌株A2(SEQIDNO:2)的RSV可溶性F蛋白的氨基酸1-524。
23.如权利要求1-22中任一项所述的疫苗组合物，进一步包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、或其组合。
24.如权利要求1-23中任一项所述的疫苗组合物，被配制成用于肠胃外给予。
25.如权利要求1-24中任一项所述的疫苗组合物，被配制成用于肌内给予。
26.如权利要求1-24中任一项所述的疫苗组合物，被配制成用于皮下给予。
27.如权利要求1-26中任一项所述的疫苗组合物，包括在约50μl和约500μl之间的体积。
28.一种预防哺乳动物中的呼吸道合胞体病毒(RSV)感染的方法，该方法包括：向该哺乳动物给予治疗有效量的、足以预防该哺乳动物中RSV感染的疫苗组合物，该疫苗组合物包括：处于一定浓度的至少约1μg和高达约200μg的RSV可溶性F蛋白以及至少约1μg和高达约20μg的包括脂质toll样受体(TLR)激动剂的佐剂。
29.一种在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，该方法包括：向该哺乳动物给予治疗有效量的、足以引起在该哺乳动物中的保护性免疫应答的疫苗组合物，该疫苗组合物包括：处于一定浓度的至少约1μg和高达约200μg的RSV可溶性F蛋白以及至少约1μg和高达约20μg的包括脂质toll样受体(TLR)激动剂的佐剂。
30.一种用于在先前已暴露于RSV的哺乳动物中增强Th1偏向性细胞免疫应答的方法，该方法包括：向该哺乳动物给予治疗有效量的、足以在该哺乳动物中增强Th1偏向性细胞免疫应答的疫苗组合物，该疫苗组合物包括：处于一定浓度的至少约1μg和高达约200μg的RSV可溶性F蛋白以及至少约1μg和高达约20μg的包括脂质toll样受体(TLR)激动剂的佐剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中该哺乳动物的细胞免疫应答包括处于至少约1.2:1的比率的Th1细胞免疫应答和Th2细胞免疫应答。
32.如权利要求30所述的方法，其中该哺乳动物的细胞免疫应答受IFNγ支配。
33.一种在哺乳动物中逆转Th2偏向性免疫应答的方法，该方法包括：向该哺乳动物给予治疗有效量的、足以逆转该哺乳动物中的Th2偏向性免疫应答的疫苗组合物，该疫苗组合物包括：处于一定浓度的至少约1μg和高达约200μg的RSV可溶性F蛋白以及至少约1μg和高达约20μg的包括脂质toll样受体(TLR)激动剂的佐剂。
34.一种在哺乳动物中诱导抗RSV的中和抗体的方法，该方法包括：向该哺乳动物给予治疗有效量的、足以在该哺乳动物中诱导抗RSV的中和抗体的疫苗组合物，该疫苗组合物包括：处于一定浓度的至少约1μg和高达约200μg的RSV可溶性F蛋白以及至少约1μg和高达约20μg的包括脂质toll样受体(TLR)激动剂的佐剂。
35.如权利要求34所述的方法，其中该RSV中和抗体滴度是大于10.0Log2。
36.如权利要求34所述的方法，其中在给予该疫苗组合物后，该RSV中和抗体滴度包括血清IgG滴度，这些血清IgG滴度相较于给予前的血清IgG滴度是至少约10倍和高达约200倍更高的。
37.一种降低哺乳动物中的RSV病毒滴度的方法，该方法包括：向该哺乳动物给予治疗有效量的、足以在该哺乳动物中诱导抗RSV的中和抗体的疫苗组合物，该疫苗组合物包括：处于一定浓度的至少约1μg和高达约200μg的RSV可溶性F蛋白以及至少约1μg和高达约20μg的包括脂质toll样受体(TLR)激动剂的佐剂。
38.如权利要求37所述的方法，其中将该RSV病毒滴度降低约50和约1000倍之间。
39.如权利要求37所述的方法，其中在给予该疫苗组合物后，RSV病毒滴度是少于2log10pfu/克。
40.如权利要求37所述的方法，其中在给予该疫苗组合物后约1周和1年之间，RSV病毒滴度是少于2log10pfu/克。
41.如权利要求28中任一项所述的方法，其中该哺乳动物是人。
30.如权利要求28-29中任一项所述的方法，其中该哺乳动物是老年人。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中该哺乳动物是已经达到了至少约50岁实龄的老年人。
32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中该哺乳动物是已经达到了至少约55岁实龄的老年人。
33.如权利要求28-32中任一项所述的方法，其中该哺乳动物是已经达到了至少约60岁实龄的老年人。
34.如权利要求28-33中任一项所述的方法，其中该哺乳动物是已经达到了至少约65岁实龄的老年人。
35.如权利要求28-34中任一项所述的方法，其中该哺乳动物是RSV血清反应阳性的。
36.如权利要求28-35中任一项所述的方法，该方法包括单一剂量方案。
37.如权利要求28-35中任一项所述的方法，该方法包括二剂量方案，该方案包括第一和第二剂量。
38.如权利要求37所述的方法，其中该第二剂量是在第一剂量后至少约1周给予的。
39.如权利要求37所述的方法，其中该第二剂量是在第一剂量后至少约1月给予的。
40.如权利要求37所述的方法，其中该第二剂量是在第一剂量后至少约1年给予的。
41.如权利要求28-40中任一项所述的方法，其中该疫苗组合物是经肠胃外给予的。
42.如权利要求28-41中任一项所述的方法，其中该疫苗组合物是经肌内给药给予的。
43.如权利要求28-41中任一项所述的方法，其中该疫苗组合物是经皮下给予的。
44.如权利要求28-43所述的方法，其中该RSV可溶性F蛋白缺乏C-末端跨膜结构域。
45.如权利要求28-44所述的方法，其中该RSV可溶性F蛋白缺乏胞质尾区结构域。
46.如权利要求28-45中任一项所述的方法，其中该RSV可溶性F蛋白包括来自人菌株A2(SEQIDNO:2)的RSV可溶性F蛋白的氨基酸1-524。
47.如权利要求28-46中任一项所述的方法，其中该RSV可溶性F蛋白包括SEQIDNO.7。
48.如权利要求28-47中任一项所述的方法，其中该佐剂包括(TLR)4激动剂。
49.如权利要求28-48中任一项所述的方法，其中该佐剂包括合成的己酸化脂质A衍生物。
50.如权利要求28-49中任一项所述的方法，其中该佐剂包括吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)。
51.如权利要求28-50中任一项所述的方法，其中该佐剂包括具有以下化学式的化合物：
其中R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；并且R2和R4是C12-C20烷基。
52.如权利要求28-51中任一项所述的方法，其中该佐剂包括在稳定的水包油乳剂中的GLA(GLA-SE)。
53.如权利要求28-52中任一项所述的方法，其中该佐剂包括在稳定的基于角鲨烯的乳剂中的GLA。
54.如权利要求28-53中任一项所述的方法，其中该佐剂包括在具有浓度为至少约1％和高达约5％的稳定的水包油乳剂中的GLA。
55.如权利要求28-54中任一项所述的方法，其中该佐剂包括在具有平均粒径为至少约50nm和高达约200nm(100nm)的稳定的水包油乳剂中的GLA。
56.如权利要求28-55中任一项所述的方法，包括至少约5μgRSV可溶性F蛋白。
57.如权利要求28-56中任一项所述的方法，包括至少约10μgRSV可溶性F蛋白。
58.如权利要求28-57中任一项所述的方法，包括至少约20μgRSV可溶性F蛋白。
59.如权利要求28-58中任一项所述的方法，包括至少约30μgRSV可溶性F蛋白。
60.如权利要求28-59中任一项所述的方法，包括至少约50μgRSV可溶性F蛋白。
61.如权利要求28-60中任一项所述的方法，包括至少约100μgRSV可溶性F蛋白。
62.如权利要求28-61中任一项所述的方法，包括至少约2.5μg佐剂。
63.如权利要求28-62中任一项所述的方法，包括至少约5μg佐剂。
64.如权利要求28-63中任一项所述的方法，包括约10μg和约100μg之间的RSV可溶性F蛋白以及约1μg和约5μg之间的GLA-SE。
65.如权利要求28-43中任一项所述的方法，包括约10μg和约100μg之间的RSV可溶性F蛋白，其中RSV可溶性F蛋白包括来自人菌株A2(SEQIDNO:2)的RSV可溶性F蛋白的氨基酸1-524及约1μg和约5μg之间的、在具有约1％和5％之间浓度的稳定的水包油乳剂中的GLA。
66.如权利要求28-65中任一项所述的方法，其中该疫苗组合物进一步包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、或其组合。
67.如权利要求28-66中任一项所述的方法，其中将该疫苗组合物配制为用于肠胃外给予。
68.如权利要求28-67中任一项所述的方法，其中将该疫苗组合物配制为用于肌内给予。
69.如权利要求28-67中任一项所述的方法，其中将该疫苗组合物配制为用于皮下给予。
70.如权利要求28-69中任一项所述的方法，其中该疫苗组合物包括在约50μl和约500μl之间的体积。
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