KR20150139954A - 백신 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

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스테이시 린 람버트
엘리자베스 앤 스틸맨
로드릭 탕
제니퍼 추이 링 우
네스트 개리 반
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메디뮨 엘엘씨
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Abstract

본원에서는 백신 조성물 및 사용 방법을 기술한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 애주번트(adjuvant)와 함께 조합하여 RSV F 단백질을 포함한다. 더욱 특정의 실시양태에서, 백신 조성물은 지질 톨 유사 수용체(TLR) 효능제와 함께 조합하여 RSV 가용성 F 단백질을 포함한다. 더욱 특정의 실시양태에서, 애주번트는 글루코피라노실 지질 A(GLA)를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 애주번트는 안정한 수중유 에멀젼 중 GLA(GLA-SE)를 포함한다.

Description

백신 조성물 및 사용 방법 {VACCINE COMPOSITION AND METHOD OF USE}
우선권 주장
본 출원은 2013년 4월 8일 출원된 미국 가출원 번호 제61/809,563호의 우선권의 이점을 주장하고, 상기 출원은 그 전문이 참조로 포함된다.
전자 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원과 함께 출원된, ASCII 텍스트 파일(파일명: RSVFseqlist.txt; 크기: 46,202 바이트; 및 작성일: 2014년 4월 3일)로 전자 제출된 서열 목록의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 바이러스 감염에 대한 방어를 제공하거나, 또는 방어 항체를 유도하는 백신에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV: Respiratory Syncytial Virus), 및 더욱 특히, 인간 호흡기 세포융합 바이러스 융합 단백질(RSV F: Respiratory Syncytial Virus-F)에 대한 백신 제제를 기술한다.
배경기술
호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 영유아에서 중증의 기도 질환을 초래하는 주된 원인이다(문헌 [Feigen et al., eds., 1987, In: Textbook of Pediatric Infectious Diseases, WB Saunders, Philadelphia at pages 1653-1675]; [New Vaccine Development, Establishing Priorities, Vol. 1, 1985, National Academy Press, Washington D.C. at pages 397-409]; 및 [Ruuskanen et al., 1993, Curr. Probl. Pediatr. 23:50-79]). 매년 유행하는 RSV 감염의 성질은 전세계적으로 분명하지만, 나타나는 계절에 RSV 감염의 발병률과 중증도는 지역마다 다르다(문헌 [Hall, C. B., 1993, Contemp. Pediatr. 10:92-110]). 북반구의 온대 지방에서는 보통 늦은 가을에 시작되어 늦은 봄에 끝이 난다. 1차 RSV 감염은 가장 흔히 6주 내지 2세의 유아에서 발생하고, 드물게는 병원성 전염병인 동안에는 생후 첫 4주에도 발생한다(문헌 [Hall et al., 1979, New Engl. J. Med. 300:393-396]). RSV 감염의 위험이 증가된 유아로는 미숙아(문헌 [Hall et al., 1979, New Engl. J. Med. 300:393-396]) 및 기관지폐 형성 이상(문헌 [Groothuis et al., 1988, Pediatrics 82:199-203]), 선천성 심장 질환(문헌 [MacDonald et al., New Engl. J. Med. 307:397-400]), 선천성 또는 후천성 면역결핍(문헌 [Ogra et al., 1988, Pediatr. Infect. Dis. J. 7:246-249]; 및 [Pohl et al., 1992, J. Infect. Dis. 165:166-169]), 및 낭포성 섬유증(문헌 [Abman et al., 1988, J. Pediatr. 113:826-830])을 앓는 유아를 포함한다. RSV 감염으로 입원한, 심장 또는 폐 질환을 앓는 영아의 사망률은 3%-4%이다(문헌 [Navas et al., 1992, J. Pediatr. 121:348-354]).
RSV는 영유아 뿐만 아니라, 성인도 감염시킨다. 건강한 성인에서, RSV는 주로 상기도 질환을 유발한다. 최근 일부 성인, 특히, 노년기(elderly)가 앞서 보고된 것보다 더욱 빈번하게 증후성 RSV 감염을 앓는 것이 명백해졌다(문헌 [Evans, A. S., eds., 1989, Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control, 3rd ed., Plenum Medical Book, New York at pages 525-544]). 또한, 요양원 환자 및 자활 능력이 결여된 젊은 성인들 중에서 여러 전염병들이 보고되었다(문헌 [Falsey, A. R., 1991, Infect. Control Hosp. Epidemiol. 12:602-608]; 및 [Garvie et al., 1980, Br. Med. J. 281:1253-1254]). 마지막으로, RSV는 면역억제된 사람, 특히, 골수 이식 환자에서 중증 질환을 유발할 수 있다(문헌 [Hertz et al., 1989, Medicine 68:269-281]).
확립된 RSV 질환에 대한 치료 옵션은 제한되어 있다. 중증의 하기도 RSV 질환은 대개 습윤화된 산소 투여 및 호흡기 지원을 비롯한, 상당한 보조 치료를 필요로 한다(문헌 [Fields et al., eds, 1990, Fields Virology, 2nd ed., Vol. 1, Raven Press, New York at pages 1045-1072]). 항바이러스제인 리바비린은 감염 치료용으로 승인을 받았다(문헌 [American Academy of Pediatrics Committee on Infectious Diseases, 1993, Pediatrics 92:501-504]). 이는 면역 능력이 있는 유아에서 중증 RSV 질환 과정을 변형시키면서, RSV 폐렴 및 세기관지염 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다(문헌 [Smith et al., 1991, New Engl. J. Med. 325:24-29]). 그러나, 리바비린은 장기간의 에어로졸 투여를 필요로 하기 때문에, 그리고, 병원 환경에서 그를 투여하는 동안 약물에 노출된 임산부에 대한 그의 잠재적인 위험에 대한 우려에 기인하여 사용이 제한되었다.
백신 개발에 있어 한 주요한 장애물은 안전성이다. 비록 면역원성이기는 하지만, 포르말린 불활성화된 백신은 면역화된 영아에서 예상 밖으로 유사하게 제조된 3가 파라인플루엔자 백신으로 면역화된 영아에서보다 RSV에 기인하는 하기도 질환을 더 높은 발병률로 및 더욱 중증으로 유발하였다(문헌 [Kim et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:422-434]; 및 [Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:405-421]). 이에 따라, 50년 넘게 연구되었음에도 불구하고, RSV에 대해 적합한 백신은 개발된 바 없다. 따라서, RSV에 대한 안전하고 유효한 백신에 대하여 충족되지 못한 강렬한 요구가 여전히 남아있다.
본 발명의 요약
본원에서는 백신 조성물을 기술한다. 특히, 백신 조성물은 RSV F 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 RSV 가용성 F 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, RSV 가용성 F 단백질은 C 말단 막횡단 도메인이 결여된다. 더욱 특정의 실시양태에서, RSV 가용성 F 단백질은 세포질 테일(cytoplasmic tail) 도메인이 결여된다. 한 실시양태에서, RSV 가용성 F 단백질은 인간 균주 A2로부터의 RSV 가용성 F 단백질(서열 번호 2)의 아미노산 1-524를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, RSV 가용성 F 단백질은 서열 번호 7을 포함한다.
더욱 특정의 실시양태에서, 백신 조성물은 애주번트(adjuvant)와 함께 조합하여 RSV 가용성 F 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 애주번트는 지질 톨 유사 수용체(TLR: toll-like receptor) 효능제이다. 한 실시양태에서, 애주번트는 (TLR)4 효능제이다. 한 실시양태에서, 애주번트는 합성 헥실화 지질 A 유도체이다. 더욱 특정의 실시양태에서, 애주번트는 글루코피라노실 지질 A(GLA: glucopyranosyl lipid A)를 포함한다. 한 실시양태에서, 애주번트는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00001
상기 식에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C12-C20 알킬이다. 한 실시양태에서, 애주번트는 안정한 수중유 에멀젼 중 GLA(GLA-SE: GLA in a stable oil-in-water emulsion)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 애주번트는 안정화된 스쿠알렌계 에멀젼 중 GLA를 포함한다.
한 실시양태에서, 약 1 ㎍ 이상 약 200 ㎍ 이하의 RSV F 단백질이 백신 조성물에 포함된다. 한 실시양태에서, RSV F 단백질은 가용성 RSV F 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 약 1 ㎍ 이상 약 20 ㎍ 이하 애주번트가 백신 조성물에 포함된다. 한 실시양태에서, 애주번트는 GLA를 포함한다. 더욱 특정의 실시양태에서, 애주번트는 GLA-SE를 포함한다. 더욱 특정의 실시양태에서, 애주번트는 약 1% 이상 약 5% 이하 농도의 안정화된 수중유 에멀젼 중 GLA를 포함한다. 한 실시양태에서, 애주번트는, 평균 입자 크기가 약 50 nm 이상 약 200 nm 이하인, 안정화된 수중유 에멀젼 중 GLA를 포함한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 또한 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 그의 조합을 포함한다. 백신 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 근육내 또는 피하 투여용으로 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, 백신 조성물의 부피는 약 50 ㎕ 내지 약 500 ㎕이다.
또 다른 실시양태에서, 포유동물에서 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 포유동물에게 치료학상 유효량의 본원에 기술된 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물에게 유효량의 본원에 기술된 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물에게 유효량의 본원에 기술된 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이전에 RSV에 노출된 바 있는 포유동물에서 Th1 편향된 세포성 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 포유동물의 세포성 면역 반응은 적어도 약 1.2:1 비로 Th1 세포성 면역 반응 및 Th2 세포성 면역 반응을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물에게 유효량의 본원에 기술된 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 RSV에 대한 중화 항체를 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, RSV 중화 항체 역가는 10.0 Log2를 초과한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물 투여 후 RSV 중화 항체 역가는 투여 이전의 혈청 IgG 역가와 비교하여 약 4배 이상인 혈청 IgG 역가를 포함한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물 투여 후 RSV 중화 항체 역가는 투여 이전의 혈청 IgG 역가와 비교하여 약 10배 이상 약 200배 이하 더 큰 혈청 IgG 역가를 포함한다. 한 실시양태에서, 포유동물에게 유효량의 상기 기술된 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 RSV 바이러스 역가를 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 감염 후 RSV 바이러스 역가는 약 50 내지 약 1,000배 감소된다. 또 다른 실시양태에서, RSV 바이러스 역가는 백신 조성물 투여 후 2 log 10 pfu/그램 미만이다. 더욱 특정의 실시양태에서, RSV 바이러스 역가는 백신 조성물 투여 후 약 1주 내지 1년째 2 log 10 pfu/그램 미만이다.
한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물은 노인(elderly human)이다. 더욱 특정의 실시양태에서, 포유동물은 역연령이 약 50세 이상에 달한 노인이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 RSV 혈청 반응 양성이다.
한 실시양태에서, 백신 조성물은 단회 투여 요법으로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 백신 조성물은 1차 투여 및 2차 투여를 포함하는 2회 투여 요법으로 투여된다. 한 실시양태에서, 2차 투여는 1차 투여 후 적어도 약 1주, 2주, 3주, 1개월 또는 1년 후에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 백신 조성물은 3회 투여 요법으로 투여된다.
본 도면은 기술의 실시양태를 예시하고, 제한적인 것은 아니다. 명확하고, 용이한 예시를 위해, 도면은 일정한 비율로 제시되고 않고, 일부 경우에는 특정 실시양태의 이해를 돕기 위해 과장되거나, 확대되어 제시될 수 있다.
도 1a -f는 나이브 BALB/c 마우스에서의 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신에 대한 면역 반응을 보여주는 그래프이다. 마우스(N=7마리/군)를 명시된 백신으로 0일째 및 14일째 면역화시키고, 28일째 6 log10 PFU의 RSV를 접종하였다. 대표 데이터는 모든 군을 이용하여 수행된 2회의 실험 중 하나로부터의 것을 제시한 것이다. (a) 폐 바이러스 역가 . 접종 후 4일째 동물의 폐 중의 잔류 바이러스를 플라크 검정법에 의해 정량화하였다. 각 개체의 결과는 log10으로 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 기하 평균을 나타낸다. 역가가 검출 불가능한 개체의 점수는 검정 검출 한계(LOD: assay limit of detection)인 ~1.4 log10으로 하였다. (b) 혈청 RSV -GFP 중화 역가 . 개체의 28일째 혈청 결과는 바이러스의 형광성 포커스 단위(FFU: fluorescent focus unit)를 50% 감소시키는 log2 혈청 희석률로서 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 기하 평균을 나타낸다. 역가가 검출 불가능한 개체의 점수는 파선으로 표시된 검정 검출 한계인 3.3 log2로 하였다. (일원 ANOVA에 의한) 유의차는 ***로 표시되어 있다. (c) F 특이 CD4 T 세포 시토카인 반응. 비장세포(n = 3마리/군)를 접종 후 4일째 수거하였다가 72시간째 재자극시켰다. 다중 시토카인 분석에서 테스트 값으로부터 배지 대조군 값을 감산하여 계산된, 면역우세 MHC II 제한 RSV F 펩티드 풀에 대한 특이 IFNγ, IL-5, IL-13, 및 IL-17 반응이 제시되어 있다. 군의 평균 및 SEM이 제시되어 있다. (d) 혈청 F 특이 IgG1 및 IgG2a 역가 . 종점 역가 ELISA에 의해 F 특이 IgG1 및 IgG2a 이소형에 대하여 28일째 혈청(n = 7마리/군)을 평가하였다. 데이터는 log2 혈청 종점 희석률의 역수가 제시되어 있으며, 여기서, 검출 한계(LOD)는 5.64 log2이다. 95% 신뢰 구간으로 군의 기하 평균이 제시되어 있으며, (일원 ANOVA에 의한) 군들 간의 유의차는 ***로 표시되어 있다. (e) IFNγ ELISPOT . 접종 후 4일째 수거된 비장세포를 면역우세 RSV F 유래 MHC I 제한 펩티드로 재자극시켜 CD8 T 세포 반응을 평가하였다. (일원 ANOVA에 의한) 군들 간의 유의차는 ***로 표시되어 있다. (2-7회 반복된) 대표 실험에서 3마리 동물/군에 대한 마우스 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다. (f) 그랜자임 B ELISPOT. 비장세포를 수거하였다가 IFNγ ELISPOT를 위한 것과 같이 처리하였다. (일원 ANOVA에 의한) 군들 간의 유의차는 ***로 표시되어 있다. 3마리 동물/군에 대한 마우스 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다.
도 2a 및 b는 고정량의 및 다양한 양의 GLA-SE와 함께 RSV sF를 포함하는 조성물에 대한 IFNγ에 대하여 미치는 항원 용량 적정 효과를 보여주는 그래프이다. (a) IFNγ ELISPOT에 대하여 미치는 항원 용량 적정 효과. 고정량의 GLA-SE 중 명시된 용량의 RSV sF를 제공받은 5마리 동물/군에 대한 마우스 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다. (b) IFNγ ELISPOT에 대하여 미치는 애주번트 용량 적정 효과. 0.3 ㎍의 고정량의 RSV sF와 함께 명시된 용량의 GLA-SE를 제공받은 3-4마리 동물/군에 대한 마우스 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다.
도 3a-d는 F 특이 CD4 및 CD8 T 세포 유도 및 프라이밍을 보여주는 그래프이다. 마우스를 0일 및 14일째 10 ㎍의 RSV sF 단독 또는 명시된 GLA-SE 또는 SE 애주번트와 함께 제제화된 것으로 근육내로 면역화시켰다. 비장세포(n = 5마리/군)를 수거하였다가 28일째(부스트 후 14일째), 또는 32일째(6 log10 RSV A2 접종 후 4일째) 명시된 시점에 IFNγ ELISPOT에서 명시된 F 펩티드로 재자극시켰다. 2회의 실험 중 하나에 대한 동물 각 개체 결과가 군의 평균과 함께 제시되어 있으며, 여기서, (일원 ANOVA에 의한) 군들 간의 유의차는 ***로 표시되어 있다. (a) 부스트 후 14일째 CD4 반응. 부스트 후 14일째 MHC II 제한(CD4) F 펩티드 풀에 대한 IFNγ ELISPOT 반응. (b) 부스트 후 14일째 CD8 반응. 부스트 후 14일째 면역우세 MHC I 제한(CD8) F 펩티드에 대한 IFNγ ELISPOT 반응. (c) 접종 후 4일째 CD4 반응. 접종 후 4일째 MHC II 제한(CD4) F 펩티드 풀에 대한 IFNγ ELISPOT 반응. (d) 접종 후 4일째 CD8 반응. 접종 후 4일째 면역우세 MHC I 제한(CD8) F 펩티드에 대한 IFNγ ELISPOT 반응.
도 4a 및 b는 폐에서의 RSV에 대한 회상 CD8 T 세포 반응을 보여주는 그래프이다. 마우스를 0일째 및 14일째 명시된 백신 제제로 면역화한 후(1회 면역화당 0.3 ㎍의 RSV sF 사용), 28일째 6 log10 pfu의 RSV를 접종하였다. 접종 후 4, 7 또는 12일째 폐를 수거하고(각 군당, 및 각 시점당 n=3마리씩), (a) RSV F 유래 H-2Kd 제한 펩티드 또는 (b) RSV M2 유래 H-2Kd 제한 펩티드로 6시간 동안 재자극시켰다. 세포를 CD3 및 CD8에 대해 표면 염색하고, IFNγ, TNFα, 및 IL-2에 대해 세포내 염색하고, LSR2 상에서 반응성 CD8 T 세포의 빈도에 대하여 분석하였다. 군의 평균이 제시되어 있으며, (일원 ANOVA에 의한) 군들 간의 유의차는 ***로 표시되어 있다. 2회의 실험 중 하나로부터의 대표적인 데이터가 제시되어 있다.
도 5a-f는 나이브 BALB/c 마우스에서 RSV 접종에 대한 폐 반응을 보여주는 그래프 및 조직학적 표본이다. 마우스(N = 7마리/군)를 0일째 및 14일째 명시된 백신으로 면역화시키고, 28일째 6 log10 pfu의 RSV를 접종하였다. 폐를 접종 후 4일째 수거하였다. 대표 데이터는 모든 군을 이용하여 수행된 2회의 실험 중 하나로부터의 것을 제시한 것이다. (a-f) 폐 균질액 중 시토카인 . 다중 시토카인 분석에 의해 정화된 폐 균질액 중 IL-5, IL-13, IFNγ, IL-17, 및 에오탁신의 수준을 정량화하고, 수거된 폐 그램당의 양으로 계산하였다. 마우스 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다. IFNγ:IL-5 비를 계산하기 위해, 먼저 계산하기 전 각 값에 1을 가산하여 0 조정하였다.
도 6a-f 폐 세포 침윤. 포르말린 고정된 폐 절편을 H&E 염색하고, 염증성 마커에 대하여 평가하였다. 각 군에 대한 대표 10x 영상 영역이 제시되어 있다.
도 7a-f는 나이브 코튼 래트에서 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신에 대한 면역 반응을 보여주는 그래프이다. 동물을 0일째 및 21일째 명시된 백신 제제로 면역화한 후(1회 면역화당 0.3 ㎍의 RSV sF 사용), 42일째 6 log10 pfu의 RSV를 접종하였다. (a) 폐 바이러스 역가 . 접종 후 4일째 동물 각 개체(n= 8마리/군)로부터 폐를 수거하고, 플라크 형성 검정법에 의해 잔류 바이러스를 정량화하였다. 각 개체의 결과는 log10으로 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다. 점선은 PBS+GLA-SE 대조군과 비교하여 3 log10 잔류 바이러스 감소량을 나타낸다. 각 개별 군과 생 RSV A2 군 사이의 (일원 ANOVA에 의한) 유의차는 ***로 표시되어 있다. (b) 코 바이러스 역가. 접종 후 4일째 동물 각 개체(N=8마리/군)로부터 코 및 코 비개골을 수거하고, 플라크 형성 검정법에 의해 잔류 바이러스를 정량화하였다. 각 개체의 결과는 log10으로 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다. 점선은 PBS+GLA-SE 대조군과 비교하여 3 log10 잔류 바이러스 감소량을 나타낸다. 각 개별 군과 생 RSV A2 군 사이의 (일원 ANOVA에 의한) 유의차는 ***로 표시되어 있다. (c) 혈청 RSV 중화( Neut ) 역가. 42일째 혈청(N=5마리/군)을 열 불성화시키고, 형광성 포커스 검정법에 의해 표적 세포의 RSV-GFP 감염 중화에 대하여 테스트하였다. 데이터는 바이러스의 형광성 포커스 단위(FFU)를 50% 감소시키는 log2 혈청 희석률로서 제시되어 있으며, 3.3 log2의 검출 한계(LOD)는 파선으로 표시되어 있다. 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타내고, 95% 신뢰 구간으로 표시되어 있다. 각 개별 백신 군 사이의 (일원 ANOVA에 의한) 유의차는 ***로 표시되어 있다. (d) RSV sF에 특이적인 혈청 IgG 역가 . 42일째 혈청(N=5마리/군)을 종점 ELISA에 의해 RSV sF 결합에 대해 테스트하였다. 데이터는 OD >3x 배경을 생성하는 log2 혈청 희석률로서 제시되어 있으며, 3.3 log2의 검출 한계(LOD)는 파선으로 표시되어 있다. 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 회색 막대는 군의 평균을 나타내고, 95% 신뢰 구간으로 표시되어 있다. 각 개별 백신 군 사이의 (일원 ANOVA에 의한) 유의차는 ***로 표시되어 있다. (e) IFNγ ELISPOT. 접종 후 4일째 수거된 비장세포(N=4-5마리/군)를 IFNγ ELISPOT에서 배지로 또는 RSV sF 단백질로 재자극시켰다. 테스트 값으로부터 배지 대조군 값을 감산하여 F 특이 반응을 정량화하였다. 각 개별 백신 군 사이의 (일원 ANOVA에 의한) 유의차는 ***로 표시되어 있다. (f) IFNγ:IL-4 비 ELISPOT 반응. F 특이 IL-4 ELISPOT 반응을 평가하고, 각 값에 1을 가산하여 값을 0 조정한 후, IFNγ:IL-4 스폿 형성 단위 비를 계산하였다.
도 8a-f는 코튼 래트에서의 RSV 접종에 대한 폐 반응을 보여주는 조직학적 샘플이다. 코튼 래트를 0일째 및 21일째 명시된 백신으로 면역화시키고, 42일째 6 log10 pfu의 RSV를 접종하였다. 폐를 접종 후 4일째 수거하였다. 포르말린 고정된 폐 절편을 H&E 염색하고, 염증성 마커에 대해 평가하였다. 각 군(n =5마리/군)에 대한 대표 10x 영상 영역이 제시되어 있다.
도 9a 및 b는 친화도 정제된 RSV sF 단백질의 겔 분석에 관한 사진이다. 정제된 sF 단백질을 환원(레인 a) 및 비환원(레인 b) 조건 하에 10-12% 폴리아크릴아미드 겔에서 분해시키고, 사이프로 루비(Sypro Ruby)로 시각화하였다. 분자 질량 마커는 여백에 제시되어 있다.
도 10a 및 b는 마우스 혈청 항sF 항체 역가를 보여주는 그래프이다. 동물을 0일째 및 14일째 애주번트 없이, 또는 GLA-SE와 함께 명시된 용량의 RSV sF로 면역화시키고, 28일째 6 log10 pfu의 RSV를 접종하였다. (a) 28일째 종점 역가 ELISA에 의해 F 특이 IgG에 대하여 혈청을 평가하였다. 동물 각 개체에 대한 log2 혈청 희석률의 역수가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 기하 평균을 나타낸다. 검정 검출 한계(LOD)는 5.64 log2로 점선 표시되어 있다. (b) 32일째 종점 역가 ELISA에 의해 F 특이 IgA에 대하여 혈청을 평가하였다. 동물 각 개체에 대한 log2 혈청 희석률의 역수가 제시되어 있으며, 여기서, 회색 막대는 군의 기하 평균을 나타낸다. 검정 검출 한계(LOD)는 4.32 log2로 점선 표시되어 있다.
도 11a 및 b는 나이브 BALB/c 마우스에서의 RSV sF 항원의 생체내 최적 용량 측정을 보여주는 그래프이다. 동물을 0일째 및 14일째 애주번트 없이, 또는 5 ㎍ GLA-SE와 함께 명시된 용량의 RSV sF(0.01-1.5 ㎍)로 면역화시키고, 28일째 6 log10 pfu의 RSV를 접종하였다. (a) 접종 후 4일째 log10 pfu/그램으로 측정된 폐 중 잔류 바이러스 역가에 대한 플라크 검정법. (b) 28일째 RSV 혈청 중화 역가(log2 혈청 희석률의 역수).
도 12는 세포내 시토카인 염색을 보여주는 그래프이다. 마우스(N = 3-5마리/군)를 0일째 및 14일째 명시된 백신으로 면역화시키고, 28일째 6 log10 pfu의 RSV를 접종하였다. 32일째(접종 후 4일째) 비장세포를 수거하고, 면역우세 RSV F 유래 MHC I 제한 펩티드로 재자극시켜 CD8 T 세포 반응을 평가하였다. 세포내 시토카인 염색 및 유세포 측정 분석에 의한 다기능성 IFNγ, TNFα, IL2+ CD8+ T 세포의 정량화.
도 13은 0일째 및 14일째 PBS로, 또는 RSV sF + GLA-SE로 면역화된 나이브 BALB/c 마우스로부터의 면역 혈청에 의한 다중 RSV 단리물의 교차 중화를 보여주는 표이다. 28일째 혈청을 지난 10년 동안 수득된 미국의 넓은 지리적 분포(NY, CO, CA, NM/AZ)로부터 얻은 RSV 임상적 단리물의 중화에 대해 테스트하였다.
도 14a 및 b는 GLA-SE 없이, 또는 GLA-SE(2% 중 5 ㎍)와 함께 명시된 RSV sF 용량(0.4, 2, 또는 10 ㎍)의 것으로 백신화시키기 전 28일 전에 RSV 단일 감염에 의해 혈청 반응 양성을 보이는 BALB/c 마우스에서의 백신화 이후 시점에 대한 혈청 F 특이 IgG 종점 역가를 보여주는 그래프이다. 컷 오프 값 A450>3 x 평균 배경으로 종점 역가 ELISA에 의해 혈청을 명시된 각 시점에서 F 특이 IgG에 대해 평가하였다. 데이터는 log2로 제시되어 있으며, 여기서, 검출 한계(LOD)는 5-5.64이다. (a) 동물 각 개체 결과는 0일째 혈청 반응 양성을 보여주기 위해 제시된 것이며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다(n=8-9마리/군). (b) n=6-9마리 동물에 대한 백신화 후 각 시점에서의 F 특이 IgG 역가에 대한 군의 평균이 제시되어 있고, 여기서, 오차 막대는 98% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 15는 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스의 백신화 후 시간 경과에 따른 혈청 RSV 중화 역가를 보여주는 그래프이다. 각 시점에 마우스 각 개체로부터 얻은 혈청을 열 불활성화시키고, 보체 부재 하에서 표적 세포의 RSV-GFP 감염 중화에 대해 형광성 포커스 검정법에 의해 테스트하였다. 데이터는 형광성 포커스 단위(FFU)를 50%만큼 감소시킨 log2 혈청 희석률로서 제시되어 있다. 검출 한계(LOD) 3.32 미만인 값은 계산상의 목적으로 2.32로 기록되어 있다. n = 6-9마리 동물에 대한 각 시점에서의 군의 기하 평균이 제시되어 있고, 여기서, 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 일원 ANOVA에 의해 PBS(혈청 반응 음성) 군과 비교하여 p < 0.05인 군은 *로 표시되어 있다.
도 16은 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스의 백신화 후 14일째 혈청 F 특이 IgA를 보여주는 그래프이다. 백신화 후 14일 경과하였을 때 동물에서 혈청 종점 항체 역가를 ELISA에 의해 3배 일련의 희석액을 사용하여 정량화하였다(N=5-6마리/군). 데이터는 log2로 제시되어 있으며, 여기서, 검정에 대한 LOD는 4.32이다. 마우스 각 개체의 결과가 군의 평균과 함께 제시되어 있으며, 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. PBS로 백신화된 혈청 반응 양성 군과 비교한 유의차(p < 0.05)는 *로 표시되어 있다.
도 17a 및 b는 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스의 백신화 후 0일 및 42일째 혈청 F 특이 IgG1 및 IgG2a 역가를 보여주는 그래프이다. 컷 오프 값 A450>3 x 블랭크의 평균으로 종점 역가 ELISA에 의해 혈청을 F 특이 IgG1 및 IgG2a 이소형에 대해 평가하였다. 데이터는 log2로 제시되어 있다. 막대는 95% 신뢰 구간으로 군의 기하 평균을 나타낸다. (a) N=8-9마리 동물/군, 검출 한계(LOD), IgG1의 경우, 4.05 및 IgG2a의 경우, 4.5. (b) N=5-6마리 동물, 두 검정 모두에 대해 LOD 5.0.
도 18a-c는 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스의 백신화 후 42일째 혈청 부위 특이 경쟁 ELISA를 보여주는 그래프이다. 백신화 후 42일 경과하였을 때 개별 동물로부터 얻은 혈청을 1:25 내지 1:2x106의 희석 범위에 걸쳐 각각 부위 A, B 및 C에 결합하는 부위 특이 mAb 1121, 8599, 및 1331H를 이용하는 경쟁 ELISA에 의해서 RSV F 부위 특이 항체에 대하여 평가하였다(N=6마리/군). 본 검정법에서, 검출된 흡광도가 더 낮은 것은 부위 특이 mAb의 RSV sF에의 결합에 대한 다중클론 혈청의 경쟁이 더 크다는 것을 나타낸다. 마우스 각 개체 혈청에 대한 1:125의 각 희석률에서의 경쟁률(%)(100 x [1- {혈청OD/mAbOD평균}])이 제시되어 있고, 막대는 군의 평균을 나타낸다. 쌍을 이룬, 애주번트가 첨가되지 않은 군과 비교하여 유의 수준(p < 0.05)은 **로 표시되어 있다.
도 19a 및 b는 백신화된 1x 혈청 반응 양성에서 백신화 후 10일 및 73일째 RSV sF에 대한 CD4 T 세포 시토카인 반응을 보여주는 그래프이다. 배지로 또는 RSV sF 단백질로 재자극시킨 비장세포를 수거하여 CD4 T 세포 반응을 평가하였다(N=3마리/군). 72시간의 재자극 후 상청액 중 IFNγ, IL-10, IL-5, 및 IL-17을 바이오플렉스(Bioplex) 다중 시토카인 분석에 의해 측정하였다. 테스트 값으로부터 배지 대조군 값을 감산하여 F 특이 반응을 계산하였다. 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 군의 평균이 제시되어 있다. (a) 백신화 후 10일째, n = 3마리/군. (b) 73일째(RSV 접종 후 4일째), n= 3-5마리/군.
도 20a 및 b는 백신화 후 10일째 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 면역우세 RSV F 펩티드에 대한 CD8 T 세포 반응을 보여주는 그래프이다. 백신화 후 10일 경과하였을 때 비장세포를 수거하고, 면역우세 RSV F 유래 MHC I 제한 펩티드로 재자극시켜 CD8 T 세포 반응을 평가하였다(N=3마리/군). (a) IFNγ ELISPOT. 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다. (b) 세포내 시토카인 염색의 유세포 측정 분석에 의해 측정된, 6 hr 재자극 후 전체 CD8+ T 세포에 대한 상대적인 비율로서의 다기능성 IFNγ, TNFα, IL-2+ CD8+ T 세포. 군의 평균 및 표준 오차가 제시되어 있다.
도 21a 및 b는 백신화 후 73일째 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 면역우세 RSV F 펩티드에 대한 CD8 T 세포 반응을 보여주는 그래프이다. 접종 후 4일째 비장세포를 수거하고, 면역우세 RSV F 유래 MHC I 제한 펩티드로 재자극시켜 CD8 T 세포 반응을 평가하였다(N=3-5마리/군). (a) IFNγ ELISPOT. 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다. (b) 세포내 시토카인 염색의 유세포 측정 분석에 의해 측정된, 6 hr 재자극 후 전체 CD8+ T 세포에 대한 상대적인 비율로서의 선택된 군에서의 다기능성 IFNγ, TNFα, IL-2+ CD8+ T 세포. 군의 평균 및 표준 오차가 제시되어 있다.
도 22는 RSV로 재접종하기 이전에 백신화된 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스로부터 수거된 폐 균질액 중 시토카인 반응을 보여주는 그래프이다. 6 log10 pfu의 RSV로 접종한 후 4일째 동물의 폐 중 시토카인을 폐 균질액의 다중 시토카인 분석에 의해 정량화하였다N=5-6마리/군). 마우스 각 개체의 결과는 가장 중요한 두 시토카인(IFNγ 및 IL-5)에 대해 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타내고, 95% 신뢰 구간으로 표시되어 있다.
도 23은 sF 백신으로 백신화하기 이전 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서의 ELISA에 의한 혈청 F 특이 IgG를 보여주는 그래프이다. 참조 표준과 비교하여 ELISA에 의해 데이터를 정량화하고, 이는 mg/mL 등가량으로 제시되어 있다. 동물 각 개체 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다(n=8-9마리/군).
도 24는 RSV sF 백신으로 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스를 백신화 시킨 후 2주째의 혈청 F 특이 IgG1 및 IgG2a 이소형을 보여주는 그래프이다. 참조 표준과 비교하여 ELISA에 의해 데이터를 정량화하고, 이는 mg/mL 등가량으로 제시되어 있으며, 검출 한계(LOD)는 8 mg/mL이다. 95% 신뢰 구간과 함께 막대는 N=6-7마리 동물/군의 군의 기하 평균을 나타낸다.
도 25는 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스의 백신화 후 시간 경과에 따른 혈청 RSV 중화 역가를 보여주는 그래프이다. 각 시점에 마우스 각 개체로부터 얻은 혈청을 열 불활성화시키고, 보체 부재 하에서 표적 세포의 RSV-GFP 감염 중화에 대해 형광성 포커스 검정법에 의해 테스트하였다. 데이터는 형광성 포커스 단위(FFU)를 50%만큼 감소시킨 log2 혈청 희석률로서 제시되어 있다. 검출 한계(LOD) 3.32 미만인 값은 계산상의 목적으로 2.32로 기록되어 있다. n = 6-9마리 동물에 대한 각 시점에서의 군의 기하 평균이 제시되어 있고, 여기서, 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 26a 및 b는 백신화 후 10일째 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서의 면역우세 RSV F 펩티드에 대한 CD8 T 세포 반응을 보여주는 그래프이다. 백신화 후 10일째 비장세포를 수거하고, 면역우세 RSV F 유래 MHC I 제한 펩티드로 재자극시켰다(N=3-4마리 동물/군). a) IFNγ ELISPOT. 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다. b) 세포내 시토카인 염색의 유세포 측정 분석에 의해 측정된, 6 hr 재자극 후 전체 CD8+ T 세포에 대한 상대적인 비율로서의 다기능성 IFNγ, TNFα, IL-2+ CD8+ T 세포. 군의 평균 및 표준 오차가 제시되어 있다.
도 27은 각종 애주번트의 부재 또는 존재 하에 10 ㎍의 RSV sF로 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스의 백신화 후 시간 경과에 따른 혈청 RSV 중화 역가를 보여주는 그래프이다. 각 시점에 마우스 각 개체로부터 얻은 혈청을 열 불활성화시키고, 보체 부재 하에서 표적 세포의 RSV-GFP 감염 중화에 대해 형광성 포커스 검정법에 의해 테스트하였다. 데이터는 형광성 포커스 단위(FFU)를 50%만큼 감소시킨 log2 혈청 희석률로서 제시되어 있다. 검출 한계(LOD) 3.32 미만인 값은 계산상의 목적으로 2.32로 기록되어 있다. n = 6-9마리 동물에 대한 각 시점에서의 군의 기하 평균이 제시되어 있고, 여기서, 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 일원 ANOVA에 의해 PBS(혈청 반응 음성) 군과 비교하여 p < 0.05인 군은 표시되어 있다.
도 28a-b는 나이브 BALB/c 마우스에서 RSV 접종에 대한 폐 반응을 보여주는 그래프이다. 마우스(N = 7마리/군)를 0일째 및 14일째 명시된 백신으로 면역화시키고, 28일째 6 log10 pfu의 RSV를 접종하였다. 폐를 접종 후 4일째 수거하였다. 대표 데이터는 모든 군을 이용하여 수행된 2회의 실험 중 하나로부터의 것을 제시한 것이다. (a-b) 폐 균질액 중 시토카인 . 다중 시토카인 분석에 의해 정화된 폐 균질액 중 에오탁신 및 IL-13의 수준을 정량화하고, 수거된 폐 그램당의 양으로 계산하였다. 마우스 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다.
도 29a 및 b는 각종 애주번트의 부재 또는 존재 하에 10 ㎍의 RSV sF로 백신화 후 10일째 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서의 면역우세 RSV F 펩티드에 대한 CD8 T 세포 반응을 보여주는 그래프이다. 백신화 후 10일째 비장세포를 수거하고, 면역우세 RSV F 유래 MHC I 제한 펩티드로 재자극시켜 CD8 T 세포 반응을 평가하였다(N=3마리 동물/군). (a) IFNγ ELISPOT. 각 개체의 결과가 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 군의 평균을 나타낸다. (b) 세포내 시토카인 염색의 유세포 측정 분석에 의해 측정된, 6 hr 재자극 후 전체 CD8+ T 세포에 대한 상대적인 비율로서의 다기능성 IFNγ, TNFα, IL-2+ CD8+ T 세포. 군의 평균 및 표준 오차가 제시되어 있다
도 30a 및 b는 백신화되지 않은 나이브 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 래트에서의 RSV 복제 동력학적 성질을 보여주는 그래프이다. 나이브 5-6주령된 암컷 스프라그 다울리 래트는 0일째 비내 접종에 의해 2 x 106 pfu의 RSV A2를 받았다. 정화된 폐 또는 코 균질액의 일련의 희석액을 사용하여 플라크 검정법에 의해 RSV 역가를 정량화하였다(각 시점당 N = 5마리). 군의 기하 평균 RSV 역가를 나타내는 막대와 함께 각 개체의 결과가 제시되어 있다. 최고 검출 한계(LOD)는 실선으로 표시되어 있다. 그래프 작성 및 통계학적 계산을 위해 역가 < LOD인 개체는 값을 4.0으로 하였다.
도 31a-d는 나이브 스프라그 다울리 래트의 백신화 후 6시간째 혈청 시토카인을 보여주는 그래프이다. 혈청을 다중 비드 기반 ELISA에 의해 래트 IL-6, MCP-1, MIP-1β 및 GRO/KC에 대하여 평가하였다. 표준 곡선과의 비교에 의해 정량화(pg/mL)하였다. 막대는 N = 5-6마리 동물/군에 대한 군의 기하 평균을 나타내고, 95% 신뢰 구간으로 표시되어 있다. 검출 하한은 파선으로 표시되어 있다. 그래프 작성 및 통계학적 계산을 위해 역가 < LOD인 개체는 값을 LOD인 값으로 하였다.
도 32a-c는 나이브 스프라그 다울리 래트의 백신화 후 RSV sF 특이 혈청 IgG 역가를 보여주는 그래프이다. ELISA에 의한 RSV F 특이 IgG의 종점 역가는 log2로 제시되어 있다. 막대는 14일째에는 n = 3마리 동물/군, 및 22일째 및 42일째에는 n = 4-6마리 동물/군에 대한 군의 기하 평균을 나타내고, 95% 신뢰 구간으로 표시되어 있다. (파선으로 표시된) 검정 검출 한계(LOD) 5.64 미만인 샘플은 그래프 작성을 위해 값을 5.64로 하였다. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA를 사용하여, *는 p < 0.05 대 PBS 군을 나타내고, **는 매칭된 RSV sF 군과 비교하여 p < 0.05를 나타낸다. a) 백신화 후 14일째. b) 백신화 후 22일째. c) 백신화 후 42일째.
도 33은 나이브 스프라그 다울리 래트의 백신화 후 42일째 혈청 RSV sF 특이 이소형을 보여주는 그래프이다. RSV sF 특이 IgG1, IgG2a, 및 IgG2b 이소형을 종점 ELISA에 의해 측정하였다. 막대는 n = 4-6마리 동물/군에 대한 군의 기하 평균을 나타낸다. (파선으로 표시된) 검정 검출 한계(LOD) 5.64 미만인 샘플은 그래프 작성을 위해 값을 5.64로 하였다. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA를 사용하여, *는 p < 0.05 대 PBS 군을 나타내고, **는 매칭된 RSV sF 군과 비교하여 p < 0.05를 나타낸다.
도 34a 및 b는 나이브 스프라그 다울리 래트의 백신화 후 RSV 중화 역가를 보여주는 그래프이다. 명시된 백신으로 백신화된 개별 래트 및 대조군으로부터의 혈청을 열 불활성화시키고, 보체 부재 하에서 표적 세포의 RSV-GFP 감염을 중화시킬 수 있는 그의 능력에 대해 형광성 포커스 검정법에 의해 테스트하였다. 데이터는 형광성 포커스 단위(FFU)를 50%만큼 감소시킨 log2 혈청 희석률로서 제시되어 있다. 검출 한계(LOD) 3.32 미만인 샘플은 그래프 작성 및 통계학적 계산을 위해 값을 3.30으로 하였다. 각 개체의 결과는 n = 4-6마리 동물/군에 대한 것이며, 여기서, 95% 신뢰 구간을 나타내는 오차 막대와 함께 군의 기하 평균이 제시되어 있다. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA를 사용하여, *는 p < 0.05 대 PBS 군을 나타내고, **는 매칭된 애주번트가 첨가되지 않은 sF 군과 비교하여 p < 0.05를 나타낸다.
도 35는 백신화된 나이브 스프라그 다울리 래트로부터의 비장세포에서의 RSV F 특이 IFNγ ELISPOT 반응을 보여주는 그래프이다. 비장세포를 RSV A2 접종 후 4일째 수거하고, IFNγ ELISPOT에 의해 RSV sF 단백질 재자극에 대한 반응에 대하여 평가하였다(N = 4-6마리/군). 각 처리군에 대한 각 개체의 결과 뿐만 아니라, 군의 평균 및 표준 편차가 제시되어 있다. 본페로니(Bonferroni) 다중 비교 사후 검정을 사용하고 일원 ANOVA에 의한, *는 PBS와 비교하였을 때의 p < 0.05를 나타내고, **는 쌍을 이루는 애주번트가 첨가되지 않은 sF와 비교하였을 때의 p < 0.05를 나타낸다.
도 36a 및 b는 백신화된 나이브 스프라그 다울리 래트에서의 접종 후 RSV A2 역가를 보여주는 그래프이다. 42일째, 모든 백신 군에 2 x 106 pfu의 RSV A2를 IN으로 접종하였다. 접종 후 4일째 정화된 폐 또는 코 균질액의 일련의 희석액을 사용하여 플라크 검정법에 의해 RSV 역가를 정량화하였다(N = 4-6마리/군). 군의 기하 평균 RSV 역가를 나타내는 막대와 함께 각 개체의 결과가 제시되어 있다. 검출 한계(LOD)는 실선으로 표시되어 있고(폐의 경우, 8.7 pfu/그램, 코의 경우, 4.0 pfu/그램), LOD 미만인 샘플에는 그래프 작성 및 통계학적 계산을 위해 LOD 값을 배정하였다.
도 37a 및 b는 RSV sF 백신을 제공받은 나이브 설치류에서의 시간 경과에 따른 체중 변화를 보여주는 그래프이다. (a) 나이브 코튼 래트를 0일째 및 21일째 애주번트 부재 하에 또는 애주번트 GLA-SE(5 ㎍/2%), GLA(5 ㎍), SE(2%), 또는 알룸(100 ㎍) 존재 하에서 0.3 ㎍의 RSV sF로 백신화하고, 0일째부터 25일째까지 그의 체중 변화율(%)을 추적 조사하였다. (b) 나이브 스프라그 다울리 래트를 0일째 및 21일째 GLA-SE(2.5 ㎍/2%) 부재 또는 존재 하에서 10-100 ㎍의 RSV sF로 백신화하고, 0일째부터 42일째까지 그의 체중 변화율(%)을 추적 조사하였다.
도 38은 RSV 혈청 반응 양성 마우스에서의 중화 역가를 보여주는 그래프이다. 0일째 및 35일째 마우스에 1x106 PFU RSV A2를 비내 경로를 통해 투여하였다. 28일째(생 RS VA2의 1차 투여 후), 및 56일째(생 RS VA2의 2차 투여 후 28일째) 중화 Ab 역가를 미세중화 검정법에 의해 정량화하였고, 하한 LOD는 3.3이었다. 나이브 마우스 서브세트의 역가 또한 제시되어 있다. 역가는 FFU를 50% 감소시킨 희석률에 가장 가까운 값의 log2로서 계산하였다. 제1 혈청 희석률(1:10)이 유입된 바이러스의 형광성 포커스 단위 계수 ≤50%를 제공하지 못한 경우, 역가를 10으로 기록하였고, 분석을 위해 값 3.3 log2를 사용하였다. 나이브 마우스의 경우, N=8, 및 28일째 및 56일째의 경우, N=35. SD와 함께 평균이 제시되어 있다.
도 39는 면역화 후 14일째 중화 항체 반응을 보여주는 그래프이다. 면역화 후 14일째(70일째) 미세중화 검정법에 의해 중화 Ab 역가를 정량화하였고, 여기서, 하한 LOD는 3.3이었다. 역가는 FFU를 50% 감소시킨 희석률에 가장 가까운 값의 log2로서 계산하였다. 제1 혈청 희석률(1:10)이 유입된 바이러스의 형광성 포커스 단위 계수 ≤50%를 제공하지 못한 경우, 역가를 10으로 기록하였고, 분석을 위해 값 3.3 log2를 귀속시켰다. N=4마리 마우스에 대한 평균 및 SEM 제시.
도 40은 연구 지속 기간 동안의 중화 항체 반응을 보여주는 그래프이다. 56일째, 70일째 및 84일째 미세중화 검정법에 의해 중화 Ab 역가를 정량화하였고, 여기서, 하한 LOD는 3.3이었다. 역가는 FFU를 50% 감소시킨 희석률에 가장 가까운 값의 log2로서 계산하였다. 제1 혈청 희석률(1:20)이 유입된 바이러스의 형광성 포커스 단위 계수 ≤50%를 제공하지 못한 경우, 역가를 10으로 기록하였고, 분석을 위해 값 3.3 log2를 귀속시켰다. 56일째, N=8마리 마우스 및 70일째 및 84일째, N=4마리 마우스에 대한 평균 및 SEM 제시.
도 41은 백신화 전 혈청 반응 양성 마우스에서의 기준선 RSV F 특이 IgG 반응을 보여주는 그래프이다. 마우스 각 개체 혈청에 대한 전체 항F IgG 혈청 역가를 RSV sF 코팅된 플레이트 상에서 ELISA에 의해 정량화하였다. 정제된 단일클론 항체 1331H(문헌 [Beeler and van Wyke Coelingh, 1989)를 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 나이브 군의 경우, N=8마리 마우스 및 RSV에 의한 2회의 일련의 감염의 경우, N=35마리 마우스. 평균 및 SD가 제시되어 있다.
도 42는 면역화 후 14일째 전체 RSV F 특이 IgG 역가를 보여주는 그래프이다. 마우스 각 개체 혈청에 대한 전체 항F IgG 혈청 역가를 RSV sF 코팅된 플레이트 상에서 ELISA에 의해 정량화하고, log2 역가에 대한 그래프를 작성하였다. 정제된 단일클론 항체 1331H(문헌 [Beeler and van Wyke Coelingh, 1989])를 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. N=4에 대한 평균 SEM 제시. 일원 ANOVA 및 터키 사후 검정에 의한 통계학적 분석.
도 43은 연구 지속 기간 동안 전체 RSV F 특이 IgG 역가를 보여주는 그래프이다. 마우스 각 개체 혈청에 대한 전체 항F IgG 혈청 역가를 RSV sF 코팅된 플레이트 상에서 ELISA에 의해 정량화하고, 역가에 대한 그래프를 작성하였다. 정제된 단일클론 항체 1331H(문헌 [Beeler and van Wyke Coelingh, 1989])를 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. N=4에 대한 평균 SEM 제시. N=4에 대한 평균 SEM 제시.
도 44는 RSV F 특이 IgG1 및 IgG2a 반응을 보여주는 그래프이다. 84일째(면역화 후 28일째) 마우스 각 개체 혈청에 대한 항F IgG1 또는 IgG2a 혈청 수준을 RSV sF 코팅된 플레이트 상에서 ELISA에 의해 정량화하였다. 정제된 단일클론 항체 1331H 또는 1308(문헌 [Beeler and van Wyke Coelingh, 1989])을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. N=4에 대한 평균 및 SEM 제시.
도 45a-b는 RSV 접종 후 4일째 폐 시토카인 역가를 보여주는 그래프이다: 접종 후 4일째 단리된 폐 균질액으로부터의 상청액 중 IFNγ 및 IL-5 폐 시토카인 역가를 바이오플렉스 다중 시토카인 분석에 의해 측정하였다. SEM과 함께 N=4 마우스 제시.
도 46a-c는 RSV 접종 후 4일째 폐 시토카인 역가를 보여주는 그래프이다: 에오탁신(도 46a), IL-13(도 46b) 및 RANTES(도 46c). 접종 후 4일째 단리된 폐 균질액으로부터의 상청액 중 폐 시토카인 역가를 바이오플렉스 다중 시토카인 분석에 의해 측정하였다. SEM과 함께 N=4 마우스 제시.
도 47a-b는 ELISPOT에 의한, CD8 T 세포 F 펩티드 비장세포 재자극을 보여주는 그래프이다. 비장을 면역화 후 11일째(도 47a) 또는 접종 후 4일째(도 47b) 단리시켰다. 비장세포를 F 특이 CD8 T 세포 에피토프로 자극시키고, IFNγ 분비 세포의 개수를 ELISPOT 검정법에 의해 측정하였다. 4마리 마우스로 이루어진 군의 평균이 제시되어 있다. 일원 ANOVA 및 터키 사후 검정에 의한 통계학적 분석.
도 48a-d는 혈청 반응 양성 코튼 래트에서의 전체 RSV F IgG 혈청 반응을 보여주는 그래프이다. 1:1,000 희석률로 마우스 각 개체 혈청에 대한 전체 항F IgG 혈청 수준을 RSV sF 코팅된 플레이트 상에서 ELISA에 의해 비교하였다. SD와 함께 28일째 및 38일째에는 N=8마리 동물에 대한 군의 평균 및 49일째 및 56일째에는 N=5마리 동물에 대한 군의 평균이 제시되어 있다. 비내로 2주 간격으로 받은 1 x 106 PFU의 RSV A2로의 4회 반복된 일련의 면역화를 받은 코튼 래트으로부터 코튼 래트 양성 대조군 혈청을 풀링하였다. 코튼 래트 음성 대조군 혈청은 나이브 동물로부터 풀링하였다.
도 49a-b는 혈청 반응 양성 코튼 래트에서의 중화 항체 반응을 보여주는 것이다. 28일째 및 49일째 미세중화 검정법에 의해 중화 Ab 역가를 정량화하였고, 여기서, 하한 LOD는 3.3이었다. 역가는 FFU를 50% 감소시킨 희석률의 EC50 계산치의 log2이다. SD와 함께 28일째에는 N=8마리 동물 및 49일째에는 N=5마리 동물에 대한 군의 평균이 제시되어 있다. 제1 혈청 희석률(1:10)이 유입된 바이러스의 형광성 포커스 단위(FFU) 계수 ≤50%를 제공하지 못한 경우, 역가를 10으로 기록하였고, 분석을 위해 값 3.3[log2(10)]을 귀속시켰다.
도 50a-c는 혈청 반응 양성 코튼 래트에서 중화 항체 역가의 상승 배수를 보여주는 그래프이다. 28일째, 38일째, 49일째 및 56일째 미세중화 검정법에 의해 중화 Ab 역가를 정량화하였다. EC50 값은 유입된 바이러스의 FFU를 50% 감소시키는 희석률로서 계산하였다. 상승 배수는 각 코튼 래트에 대하여 명시된 날의 EC50 값을 28일째 EC50 값으로 나눔으로써 계산하였다. 95% 신뢰 구간과 함께 38일째에는 N = 8마리 동물, 및 49일째 및 56일째에는 N = 5마리 동물에 대한 군의 기하 평균이 제시되어 있다. 값이 1인 것은 중화 역가 부스트가 없는 것을 나타낸다.
도 51a-c는 혈청 반응 양성 코튼 래트에서 56일째 부위 특이 항체 반응을 보여주는 그래프이다. 56일째 동물 각 개체로부터의 혈청을 1:25 내지 1:2x106의 희석률 범위에 걸쳐 각각 부위 A, B 및 C에 결합하는 시나지스(Synagis)®, 1112, 및 1331H와의 경쟁 ELISA에 의해 RSV F 부위 특이 항체에 대하여 평가하였다. 각 개체 혈청에 대한 1:125의 각 희석률에서의 경쟁률(%)(100 x [1- {혈청OD/mAbOD평균}])이 제시되어 있다. SD와 함께 N=5마리 동물에 대한 군의 평균이 제시되어 있다.
도 52a-b는 혈청 반응 양성 코튼 래트에서의 전체 RSV F IgG 혈청 반응을 보여주는 그래프이다. 마우스 각 개체 혈청에 대한 전체 항F IgG 혈청 수준을 RSV sF 코팅된 플레이트 상에서 종점 희석 ELISA에 의해 정량화하였고, LOD는 6.6 log2였다. 종점은 OD가 블랭크 평균의 2배 값보다 크게 한 최고 희석률의 log2로서 계산하였다. 제1 혈청 희석률(1:100)이 블랭크 평균의 2배 값보다 높지 않을 경우, 역가를 100으로 기록하고, 분석을 위해 값 6.6(log2 100)을 사용하였다. SD와 함께 N=11마리 동물에 대한 군의 평균이 제시되어 있다. 비내로 2주 간격으로 받은 1 x 106 PFU의 RSV A2로의 4회 반복된 일련의 면역화를 받은 코튼 래트으로부터 코튼 래트 양성 대조군 혈청을 풀링하였다. 코튼 래트 음성 대조군 혈청은 나이브 동물로부터 풀링하였다. 일원 ANOVA 및 터키 사후 검정에 의한 통계학적 분석.
도 53은 혈청 반응 양성 코튼 래트에서 RSV F 특이 IgG 역가의 상승 배수를 보여주는 그래프이다. 28일째 및 3일째 RSV sF 특이 IgG 역가를 정량화하였다. 각 코튼 래트에 대해 38일째의 log2 종점 역가로부터 28일째의 log2 종점 역가를 감산하여 얻은 값을 거듭 제곱하여 상승 배수를 계산하였다. 95% 신뢰 구간과 함께 N = 11마리 동물에 대한 군의 기하 평균이 제시되어 있다. 점선은 Y=1 및 Y=4에 있다. 값이 1인 것은 중화 역가 부스트가 없는 것을 나타낸다. 비내로 2주 간격으로 받은 1 x 106 PFU의 RSV A2로의 4회 반복된 일련의 면역화를 받은 코튼 래트으로부터 코튼 래트 양성 대조군 혈청을 풀링하였다. 코튼 래트 음성 대조군 혈청은 나이브 동물로부터 풀링하였다.
도 54a-b는 혈청 반응 양성 코튼 래트에서의 RSV 중화 항체 반응을 보여주는 것이다. 28일째 및 38일째 미세중화 검정법에 의해 중화 Ab 역가를 정량화하였고, 여기서, 하한 LOD는 3.3이었다. 역가는 FFU를 50% 감소시킨 희석률의 EC50 계산치의 log2이다. SD와 함께 N=11마리 동물에 대한 군의 평균이 제시되어 있다. 제1 혈청 희석률(1:10)이 유입된 바이러스의 형광성 포커스 단위(FFU) 계수 ≤50%를 제공하지 못한 경우, 역가를 10으로 기록하였다. 분석을 위해 값 3.3[log2(10)]을 귀속시켰다. 비내로 2주 간격으로 받은 1 x 106 PFU의 RSV A2로의 4회 반복된 일련의 면역화를 받은 코튼 래트으로부터 코튼 래트 양성 대조군 혈청을 풀링하였다. 코튼 래트 음성 대조군 혈청은 나이브 동물로부터 풀링하였다. 일원 ANOVA 및 터키 사후 검정에 의한 통계학적 분석.
도 55는 혈청 반응 양성 코튼 래트에서 RSV 중화 항체 역가의 상승 배수를 보여주는 그래프이다. 28일째 및 38일째 미세중화 검정법에 의해 중화 Ab 역가를 정량화하였다. EC50 값은 유입된 바이러스의 FFU를 50% 감소시키는 희석률로서 계산하였다. 상승 배수는 각 코튼 래트에 대하여 명시된 날의 EC50 값을 28일째 EC50 값으로 나눔으로써 계산하였다. 95% 신뢰 구간과 함께 N = 11마리 동물에 대한 군의 기하 평균이 제시되어 있다. 점선은 1 및 4이다. 값이 1인 것은 중화 역가 부스트가 없는 것을 나타낸다.
도 56a-c는 혈청 반응 양성 코튼 래트에서 38일째 부위 특이 항체 반응을 보여주는 그래프이다. 56일째 동물 각 개체로부터의 혈청을 1:25 내지 1:2x106의 희석률 범위에 걸쳐 각각 부위 A, B 및 C에 결합하는 시나지스®, 1112, 및 1331H와의 경쟁 ELISA에 의해 RSV F 부위 특이 항체에 대하여 평가하였다. 각 개체 혈청에 대한 1:125의 각 희석률에서의 경쟁률(%)(100 x [1- {혈청OD/mAbOD평균}])이 제시되어 있다. SD와 함께 N=11마리 동물에 대한 군의 평균이 제시되어 있다. 비내로 2주 간격으로 받은 1 x 106 PFU의 RSV A2로의 4회 반복된 일련의 면역화를 받은 코튼 래트으로부터 코튼 래트 양성 대조군 혈청을 풀링하였다. 코튼 래트 음성 대조군 혈청은 나이브 동물로부터 풀링하였다. 일원 ANOVA 및 터키 사후 검정에 의한 통계학적 분석.
도 57a 및 b는 -7일째부터 183일째까지의 개별 시노몰구스 원숭이에서의 시간 경과에 따른 항F IgG 항체 역가를 보여주는 그래프이다. 백신(1군 RSV sF 또는 2군 RSV sF + GLA-SE)을 화살표로 표시된 바와 같이, 0, 28, 및 169일째에 투여하였다. 동물 각 개체에 대한 항F IgG 역가는 테스트된 시점에 log2 값으로서 제시되어 있고, 여기서, 검정 검출 한계는 6.6 log2(1:100 혈청 희석률에 등가)이다. 검출 한계 미만의 값은 시각화를 위해 6.0으로 추정한다.
도 58a 및 b는 -7일째부터 183일째까지의 개별 시노몰구스 원숭이에서의 시간 경과에 따른 RSV 중화 항체 역가를 보여주는 그래프이다. 백신(1군 RSV sF 또는 2군 RSV sF + GLA-SE)을 적색 화살표로 표시된 바와 같이, 0, 28, 및 169일째에 투여하였다. 동물 각 개체에 대한 중화 IC50 역가는 테스트된 시점에 log2 값으로서 제시되어 있고, 여기서, 검정 검출 한계는 2.3 log2(1:5 혈청 희석률에 등가)이다. 검출 한계 미만의 값은 시각화를 위해 2.3으로 추정한다.
도 59a 및 b는 -7일째부터 183일째까지의 개별 시노몰구스 원숭이에서의 시간 경과에 따른 IFN감마 ELISPOT 반응을 보여주는 그래프이다. 백신(1군 RSV sF 또는 2군 RSV sF + GLA-SE)을 적색 화살표로 표시된 바와 같이, 0, 28, 및 169일째에 투여하였다. 각 동물에 대한 각 개체의 결과는 테스트된 시점에 106개의 PBMC당 스폿 형성 세포(SFC)로 제시되어 있다. 반응자(기준선으로부터 4배 상승 및 >50 SFC/106 변화 둘 모두를 보이는 동물)는 별표로 표시되어 있다.
상세한 설명
1. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 과학 용어 및 기술 용어는 당업계의 숙련가가 통상 이해하는 의미를 가져야 한다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수 개의 것을 포함하여야 하고, 복수 용어는 단수 개의 것을 포함하여야 한다.
본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 본 기술 분양의 숙련가에게 쉽게 공지되는 바와 같이, 각 값에 대하여 예상되는 오차 범위를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "애주번트"라는 용어는 제제 중 특이 면역원과 함께 조합하여 사용되었을 때, 생성되는 면역 반응을 증강시키거나, 또는 다르게는 변경 또는 변형시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 면역 반응의 변형으로는 항체 및 세포성 면역 반응 중 하나 또는 그 둘 모두의 특이성 강화 또는 확장을 포함할 수 있다. 면역 반응의 변형은 또한 특정의 항원 특이 면역 반응을 감소시키거나, 또는 억제시키는 것을 의미할 수 있다.
"항체"라는 용어는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 1 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 상기의 조합을 인식하고, 그에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 항체가 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 무손상 다중클론 항체, 무손상 단일클론 항체, 항체 단편(예컨대, Fab, Fab', F(abs')2, 및 Fu 단편), 단일 쇄 Fu(scFv) 돌연변이체, 2개 이상의 무손상 항체로부터 생성된 다중특이 항체, 예컨대, 이중특이 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부위를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. "항체"라는 용어는 또한 4개의 폴리펩티드 쇄: 2개의 경쇄(L) 및 2개의 중쇄(H)로 구성되고, 분자량이 대략 150 kDa인, Y자 형상의 당단백질을 의미할 수 있다. 포유동물의 Ig 중쇄 이소형에는 5가지 유형이 존재하며, 이는 그리스 문자로 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ), 및 뮤(μ)로 표기된다. 중쇄 유형은 항체 부류, 즉, 각각 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM을 정의한다. γ 및 α 부류는 예컨대, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2와 같이, 불변 도메인 서열 및 기능상의 차이에 기초하여 하위부류로 추가로 나뉜다. 포유동물에는 2가지 유형의 면역글로불린 경쇄, λ 및 κ가 존재한다. 항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단 도메인을 의미한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로 지칭될 수 있다. 상기 도메인은 일반적으로 (같은 부류의 다른 항체에 비하여) 항체의 가장 가변성인 부분이고, 항원 결합 부위를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "항원성 제제" 또는 "항원성 조성물"이라는 용어는 척추동물, 특히, 조류 또는 포유동물에게 투여되었을 때, 면역 반응을 유도하는 제제를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 라이프 스테이지는 유년기, 생식 성숙기, 및 노년기를 포함한다. "유년기"라는 용어는 신생아 때부터, 포유동물이 생식 성숙기에 도달하는 시점까지의 포유동물을 의미한다. "생식 성숙기"라는 용어는 상기 종의 포유동물이 일반적으로 교배하고, 번식할 수 있는 연령 때의 포유동물을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "노년기"라는 용어는 생식 성숙기에서부터 사망시까지의 포유동물을 의미한다. "노년기"라는 용어는 연대순(즉, 연령(세))에 의해; 사회적 역할의 변화(즉, 작업 패턴의 변화, 유아 및 폐경기의 성인 신분); 및/또는 능력 변화(즉, 병약한 상태, 노화 및 신체적 특징의 변화)에 의해 정의될 수 있다. 연대순에 의해 인간 포유동물을 지칭할 때, "노년기"라는 용어는 일반적으로 연대기적 연령으로 약 50, 55, 60 또는 65세 이상에 도달한 인간을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "바이러스 융합 단백질" 또는 "융합 단백질" 또는 "F 단백질"은 재조합 바이러스 융합 단백질, 합성적으로 제조된 바이러스 융합 단백질, 및 세포로부터 추출된 바이러스 융합 단백질을 비롯한, 천연 바이러스 융합 단백질 또는 가용성 바이러스 융합 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 임의의 바이러스 융합 단백질을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "천연 바이러스 융합 단백질"이란 천연적으로 존재하는 바이러스 유전자 또는 자연상에 존재하는 바이러스 RNA에 의해 코딩되는 바이러스 융합 단백질을 의미한다. "가용성 융합 단백질" 또는 "가용성 F 단백질"이란 전형적으로, 천연 단백질의 C 말단 영역에 위치하는 기능성 막 결합 영역이 결여된 융합 단백질을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "재조합 바이러스 융합 단백질"이라는 용어는 조작된 뉴클레오티드 서열로부터 유도되고, 시험관내 및/또는 생체내 발현 시스템에서 제조된 바이러스 융합 단백질을 의미한다. 바이러스 융합 단백질은 인간 및 비인간 분류의 바이러스 균주를 포함하나, 이에 한정되지 않는 상이한 바이러스 및 바이러스 균주로부터의 관련 단백질을 포함한다. 바이러스 융합 단백질은 I형 및 II형 바이러스 융합 단백질을 포함한다. 다수의 RSV-융합 단백질이 기술된 바 있으며, 이는 당업자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "면역원" 또는 "항원"이라는 용어는 면역 반응을 유도할 수 있는 물질, 단백질, 펩티드, 펩티드, 핵산을 의미한다. 상기 두 용어 모두, 이는 또한 에피토프를 포함하고, 이는 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, "면역원성 제제"라는 용어는 척추동물, 예컨대, 포유동물에게 투여되었을 때, 면역 반응을 유도하는 제제를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "제약 조성물"은 제약상 허용되는 담체, 및 원하는 경우, 하나 이상의 희석제 또는 부형제와 함께 치료학상 유효량의 RSV F 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인을 받았거나, 또는 포유동물, 및 더욱 특히, 인간에서 사용하기 위한 것으로 미국 약전(U.S. Pharmacopia), 유럽 약전(European Pharmacopia), 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 열거되어 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 백신"이라는 용어는 척추동물에게 투여될 수 있는 형태로 RSV F 면역원을 함유하고, 감염 또는 질환을 예방 및/또는 호전시키기 위해, 및/또는 감염 또는 질환의 1 이상의 증상을 감소시키기 위해 면역을 유도하는 데 충분한 방어 면역 반응을 유도하는 제제를 의미한다. 한 실시양태에서, 백신은 피험체에서 RSV 감염의 1 이상의 증상을 예방 또는 감소시킨다. RSV의 증상은 당업계에 공지되어 있다. 이는 비루, 인후염, 두통, 쉰 목소리, 키침, 객담, 발열, 수포음, 쌕쌕거림, 및 호흡곤란을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 방법은 RSV 감염과 관련된 1 이상의 증상을 예방 또는 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 증상 감소는 주관적으로 또는 객관적으로, 예컨대, 예컨대, 삶의 질 평가, RSV 감염 또는 추가 증상의 느린 진행, RSV 증상 중증도의 감소, 또는 적합한 검정(예컨대, 항체 역가 및/또는 T 세포 활성화 검정)과 같이, 피험체에 의한 자가 평가에 의해, 임상의의 평가에 의해, 또는 적절한 검정법 또는 측정(예컨대, 체온)을 수행함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "유효량"이라는 용어는 원하는 생물학적 효과를 실현시키는 데 필요하거나, 그에 충분한 항원의 양을 의미한다. "유효 용량"이라는 용어는 일반적으로 감염 또는 질환을 예방 및/또는 호전시키기 위해, 및/또는 감염 또는 질환의 1 이상의 증상을 감소시키기 위해 면역을 유도하는 데 충분한 방어 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 양을 의미한다. "치료학상 유효량"이라는 용어는 주어진 조건 및 투여 요법에 치료학적 효과를 제공하는 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "나이브"라는 용어는 앞서 항원, 예를 들어, RSV에 노출된 바 없는 사람 또는 면역계를 의미한다. 나이브 사람 또는 면역계는 항원에 대한 검출가능한 항체 또는 세포성 반응을 보이지 않는다. "혈청 반응 양성"이라는 용어는 포유동물 또는 면역계가 앞서 특정 항원에 노출된 바 있고, 따라서, 관심의 대상이 되는 항원에 대하여 검출가능한 혈청 항체 역가를 보인다는 것을 의미한다. "RSV 혈청 반응 양성"이라는 용어는 포유동물 또는 면역계가 앞서 RSV 항원에 노출된 바 있다는 것을 의미한다. 혈청 반응 양성 사람 또는 면역계는 특정 항원에 대한 사전 노출을 나타내는, 혈청 중 항체 또는 다른 면역 마커의 존재에 의해 확인될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "방어 면역 반응" 또는 "방어 반응"이라는 어구는 감염을 예방 또는 호전시키거나, 또는 그의 1 이상의 질환 증상을 감소시키는, 척추동물(예컨대, 인간)에 의해 나타나는 감염원 또는 질환에 대한 항체에 의해 매개되는 면역 반응을 의미한다. 본원에 기술된 RSV F 단백질 백신은 예를 들어, 감염원을 중화시키고/거나, 감염원이 세포 내로 진입하지 못하도록 차단하고/거나, 감염원 복제를 차단하고/거나, 숙주 세포를 감염 및 파괴로부터 보호하는 항체 생산을 자극시킬 수 있다. 상기 용어는 또한 감염을 예방 또는 호전시키거나, 또는 그의 1 이상의 질환 증상을 감소시키는, 척추동물(예컨대, 인간)에 의해 나타나는 감염원 또는 질환에 대하여 T-림프구 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개되는 면역 반응을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "척추동물" 또는 "피험체" 또는 "환자"라는 용어는 제한없이, 인간 및 다른 영장류(비인간 영장류, 예컨대, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종 포함)를 포함하는, 코르다타(cordata) 아문의 임의의 구성원을 의미한다. 농장 동물, 예컨대, 소, 양, 돼지, 염소, 및 말; 가축 포유동물, 예컨대, 개 및 고양이; 실험용 동물, 예컨대, 설치류, 예컨대, 마우스, 래트(코튼 래트 포함) 및 기니아 피그; 조류, 예컨대, 가축 조류, 야생 조류 및 엽조, 예컨대, 닭, 칠면조 및 다른 가금류 조류, 오리, 거위 등도 또한 비제한적인 일례이다. "포유동물" 및 "동물"이 본 정의에 포함된다. 성인 및 신생아 개체, 둘 모두 이에 포함되는 것으로 한다. 특히, 영아 및 유아가 RSV 백신에 적절한 피험체 또는 환자이다.
본원에서 사용되는 바, "백신"이라는 용어는 사멸된 또는 약화되 병원체, 또는 병원체롭터 유래된 항원성 결정기로 이루어진 제제로서, 여기서, 제제는 병원체에 대한 항체 형성 또는 면역을 유도하는 데 사용되는 것인, 제제를 의미한다. 추가로, "백신"이라는 용어는 또한 척추동물에게 투여되어 예를 들어, 방어 면역, 즉, 감염과 관련된 질환의 중증을 예방하거나, 감소시키는 면역을 일으키는 면역원(예컨대, RSV F 단백질)으로 이루어진 현탁제 또는 액제를 의미하 수 있다.
2. 바이러스 융합 당단백질
바이러스 융합 당단백질은 막 융합 유도를 통한 바이러스 감염 동안 숙주 세포 내로의 바이러스 진입을 매개하고, 신호 펩티드를 포함하거나, 또는 포함하지 않는, 전구체(F0) 단백질, 및 F1 및 F2 서브유니트를 포함하는, 활성화된 및/또는 성숙한 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "성숙한" 및 "활성화된"이라는 용어는 숙주 프로테아제에 의해 전구체 단백질로부터 성숙한 융합 단백질로 전환된 바이러스 융합 단백질을 의미한다. 전형적으로, 활성화된 바이러스 융합 단백질은 각각 F1 및 F2로 명명되는 막 고정화된, 및 막 윈위의 서브유니트를 포함한다. 활성 F1 및 F2 서브유니트는 대개 이황화 결함을 통해 함께 연결되어 있다.
3. 인간 호흡기 세포융합 바이러스( RSV ) 단백질
인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 과, 뉴모비리나에(Pneumovirinae) 아과 및 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속의 구성원이다. RSV는 주로 G 유전자 및 코딩되는 단백질의 가변성에서 차이가 나는 2개의 서브군, A 및 B로 나뉜다. RSV는 3개의 막횡단 구조 단백질(F, G 및 SH), 2개의 기질 단백질(M 및 M2), 3개의 뉴클레오캡시드 단백질(N, P 및 L) 및 2개의 비구조 단백질(NS1 및 NS2)을 코딩하는 단일 가닥 (-) 센스 RNA 게놈을 특징으로 하는 외피 바이러스이다.
RSV의 두 주요 방어 항원은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 표면 상에서 발현되는 외피 융합(F) 및 부착(G) 당단백질이고, 이는 중화 항체의 표적이 되는 것으로 밝혀졌다. 상기 두 단백질은 또한 바이러스 인식 및 표적 세포 내로의 진입을 주로 담당한다. G 단백질은 특이세포 수용체에 결합하고, F 단백질은 바이러스와 세포의 융합을 촉진시킨다. F 단백질은 또한 감염된 세포의 표면 상에서도 발현되고, 융합체 형성을 유도하는, 다른 세포와의 후속된 융합을 담당한다. 따라서, 항체의 F 단백질에의 결합이 바이러스를 중화시키거나, 바이러스의 세포 내로의 진입을 차단하거나, 융합체 형성을 막을 수 있다. 비록 A 및 B 서브타입 사이의 항원성 및 구조적 차이가 G 및 F 단백질, 둘 모두에 대하여 기술되기는 하였지만, 더욱 유의적인 항원성 차이는 G 단백질에 존재한다. 반대로, F 단백질에 대해 생성된 항체는 서브타입 A 및 B 바이러스 사이의 고도한 정도의 교차 반응성을 나타낸다. 결과적으로, F 단백질은 중화 RSV에 대한 관심의 대상이 되는 표적이 되는데, 그 이유는 상기 단백질이 바이러스 표면 상에 존재하고, 이로써, 면역 감시에 접근가능하기 때문에, 추가로, F 단백질은 G 단백질에 비하여 가변성이 작다.
F 단백질은 N 말단 절단 신호 펩티드 및 C 말단 부근에 막 앵커를 가지는 I형 막횡단 표면 단백질이다. 실제로, RSV F 단백질은 F0으로 지정된, 단일의 불활성 574개의 아미노산 전구체로서 발현된다. 생체내에서, F0은 소포체에서 올리고머화되고, 엔도프로테아제에 의한 단백질 분해에 의해 프로세싱되어 2개의 이황화 결합 서브유니트인 F1 및 F2를 함유하는 연결된 이종이량체로 수득된다. 상기 단편 중 더 작은 것이 F2이 명명되고, F0의 전구체의 N 말단부로부터 기원하는 것이다. 절단에 의해 생성된 F1 서브유니트의 N 말단은 소수성 도메인을 함유하고(융합 펩티드), 이는 숙주 세포막과 결합하여 바이러스의 막, 또는 감염된 세포의 막과 표적 세포막 사이의 융합을 촉진시킨다. 한 실시양태에서, F 단백질은 F1/F2 이종이량체의 삼량체 또는 다량체이다.
본원에 기술된 조성물에서 사용하기에 적합한 RSV F 단백질은 당업계에 공지된 임의의 RSV 균주 또는 단리물, 예컨대, 인간 균주 예컨대, A2, Long, ATCC VR-26, 19, 6265, E49, E65, B65, RSB89-6256, RSB89-5857, RSB89-6190, 및 RSB89-6614; 또는 소 계통, 예컨대, ATue51908, 375, 및 A2Gelfi; 또는 양 계통으로부터의 것일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에서 사용하기 위한 RSV F 단백질은 본원에서 제공하는 RSV F 아미노산 서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 본원에서 제공하는 RSV F 아미노산 서열과 관련하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 RSV F 인간 균주 A2의 아미노산 서열은 예를 들어, 서열 번호 2에 기재되어 있는 것이다.
천연, 전장의 바이러스 융합 단백질은 전형적으로 막 결합 영역을 포함한다. 대개 천연 단백질의 C 말단 영역에 위치하는 기능성 막 결합 영역이 결여된, 재조합 가용성 바이러스 융합 단백질은 생성될 수 있다. 재조합 가용성 바이러스 융합 단백질은 바이러스 융합 단백질의 기능성 막 결합 영역의 결실, 돌연변이화, 또는 당업계에 공지된 임의 모드의 파괴에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 막 결합 영역 중 임의 부분 또는 그들 모두가 제거되거나, 또는 변형될 수 있되, 단, 막 결합 영역은 검출가능하게 기능성이 아니고(예컨대, 영역은 더 이상의 막에 존재하지 않는다), (ii) 특정 비율의 막 결합 영역이 그대로 유지되거나(예컨대, 약 50% 이하가 그대로 유지), 제거되거나(예컨대, 약 50% 이상이 제거), 또는 변형된다(예컨대, 약 50% 이상이 변형). 파괴된 막 결합 영역이 더 이상 단백질의 원형질 막에의 결합을 부여하지 않는 정도는 단백질의 막 결합을 평가할 수 있는, 당업계에 공지된 임의의 기법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 융합 단백질 및 공지된 막 결합 단백질의 공동 면역염색을 수행함으로써 막에 유지된 단백질을 시각화할 수 있다. 가용성 바이러스 융합 단백질의 예를 본원에서 제공하고, 이는 가용성 RSV F 단백질을 포함한다. 가용성 RSV F 단백질은 또한 본원에서 RSV sF로도 지칭된다. 가용성 RSV F는 서열 번호 2의 아미노산 525-574에 상응하는, RSV F 단백질의 50개의 아미노산 C 말단 막횡단 도메인의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상의 결실에 의해 생성될 수 있다. 가용성 RSV F에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 7에 기재되어 있다.
3개의 비중복 항원성 부위(A, B, 및 C) 및 하나의 브릿지 부위(AB)는 호흡기 세포융합 바이러스 A2 균주(RSV F A2)의 융합 당단백질에 대해 확인되었다(문헌 [Beeler and Wyke Coelingh, (1989) "Neutralization Epitopes of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus: Effect of Mutation upon Fusion Function," J. Virol. 63(7):2941-2950]). 한 실시양태에서, RSV F 단백질은 하나 이상의 무손상 A, B 또는 C 중화 에피토프를 포함한다. 한 실시양태에서, RSV F 단백질은 적어도 A 에피토프를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, RSV F 단백질은 적어도 B 에피토프를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, RSV F 단백질은 적어도 C 에피토프를 포함한다. 다른 실시양태에서, RSV F 단백질은 적어도 A 및 B 에피토프, 적어도 B 및 C 에피토프, 또는 적어도 A 및 C 에피토프를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, RSV F 단백질은 3개의 중화 에피토프(즉, A, B 및 C) 모두를 포함한다.
4. RSV F의 재조합 발현
한 실시양태에서, 백신 조성물은 RSV F 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "RSV F 단백질"이라는 용어는 전장의 야생형 RSV F 단백질 뿐만 아니라, 그의 변이체 및 단편(예를 들어, RSV 가용성 F 단백질 (RSV sF로도 지칭) 포함)을 의미한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 재조합적으로 제조된 RSV F 단백질을 포함한다. 더욱 특정의 실시양태에서, 백신 조성물은 재조합적으로 제조된 가용성 RSV F 단백질을 포함한다.
RSV F 단백질을 재조합적으로 제조하기 위해, 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)을 벡터의 복제, 벡터 중 일부의 전사(예컨대, ORF의 전사), 및/또는 세포에서의 단백질 발현을 위한 벡터 내로 삽입 또는 클로닝할 수 있다. "오픈 리딩 프레임"(ORF)이라는 용어는 출발 코돈(리보핵산에서 AUG 및 데옥시리보핵산에서 ATG)과 종결 코돈(예컨대, 리보핵산에서 UAA (오커(ochre)), UAG (앰버(amber)) 또는 UGA (오팔(opal)) 및 데옥시리보핵산에서 TAA, TAG 또는 TGA) 사이에 위치는 바이러스 융합 단백질, 예를 들어, 가용성 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다.
벡터는 또한 ORF 또는 다른 핵산 효소의 클로닝, 복제, 전사, 번역 및/또는 선별을 촉진시키는 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 벡터는 하기 요소들 중 하나 이상 또는 그들 모두를 포함할 수 있다: 하나 이상의 프로모터 요소, 하나 이상의 5' 비번역 영역(5'UTR: 5' untranslated regions), 표적 뉴클레오티드 서열이 삽입될 수 있는 하나 이상의 영역("삽입 요소"), 하나 이상의 ORF, 하나 이상의 3' 비번역 영역(3'UTR: 3' untranslated regions), 및 선별 요소. 당업계에 공지된 임의의 편리한 클로닝 전략법을 사용하여 요소, 예컨대, ORF를 벡터 핵산 내로 도입할 수 있다.
본 발명에 적용될 수 있는 분자 생물학적 기법, 예컨대, 클로닝, 돌연변이화, 세포 배양 등을 설명하는 일반 교재로는 문헌 [Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger)]; [Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook")]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel")]를 포함한다. 상기 교재에는 돌연변이 유발법, 벡터 사용, 프로모터, 및 예컨대, RSV F 단백질을 클로닝하고 돌연변이화시키는 것과 관련된 다수의 다른 관련 주제가 기술되어 있다. 추가로, 가용성 바이러스 융합 단백질에 대한 클로닝 전략법은 WO 2012/103496(발명의 명칭: EXPRESSION OF SOLUBLE VIRAL FUSION GLYCOPROTEINS IN MAMMALIAN CELLS)에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 상기 참고 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함되어 있다.
본원에서 기술하는 조성물은 또한 RSV F의 변이체를 포함한다. 변이체는 RSV F 단백질의 아미노산 서열의 변경을 포함할 수 있다. 단백질과 관련하여 "변이체"라는 용어는 참조 서열과 관련하여 하나 이상의 아미노산이 변경된 아미노산 서열을 의미한다. 변이체는 "보존적" 변이 및/또는 "비보존적" 변이를 포함할 수 있다. 다른 변이는 또한 아미노산 결실, 삽입, 치환, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학성 활성을 제거하지 않으면서, 어느 아미노산 잔기를 치환, 삽입, 또는 결실시킬 수 있는지를 결정하는 것에 관한 가이던스는 당업계에 주지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, DNASTAR 소프트웨어를 사용함으로써 찾을 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공하는 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 뉴클레오티드 서열 전역에 걸쳐 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기를 변이시킴으로써 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "뉴클레오티드 염기"는 4가지 데옥시리보핵산 염기, 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 또는 티민(T) 중 임의의 것, 또는 4가지 리보핵산 염기, 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 및 우라실(U) 중 임의의 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "코돈"이란 특정 아미노산을 코딩하는 일련의 3개의 뉴클레오티드 염기를 의미한다. 일반적으로, 각 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 코딩될 수 있다. 하기 표 1에는 각 아미노산에 대하여 가능한 실질적으로 모든 코돈이 제시되어 있다.
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한 실시양태에서, RSV F를 코딩하는 핵산은 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 치환은 생성된 단백질 중 아미노산을 비보존적 방식으로 또는 보존적 방식으로 변이시키기 위해 수행될 수 있다. 보존적 변이는 일반적으로 생성된 단백질의 구조 및 기능을 덜 변경시킨다. 비보존적 변이는 생성된 단백질의 구조, 활성 또는 기능을 변경시킬 가능성이 더 크다. 한 실시양태에서, RSF F를 코딩하는 핵산은 생성된 단백질의 활성 또는 결합 특징을 유의적으로 변경시키지 않는, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "보존적 치환"이라는 용어는 구조는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이하지만, 화학적 특징은 유사한 잔기에 의해 치환되는 치환을 의미하는 것으로, 여기서, 예컨대, 소수성 잔기는 소수성 잔기에 의해 치환되거나, 또는 산성 잔기는 또 다른 산성 잔기에 의해, 또는 극성 잔기는 극성 잔기 대신으로, 또는 염기성 잔기는 염기성 잔기 대신으로 치환된다. 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 방향족 고리 구조를 포함하는 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신이다. 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 보존적 치환의 더욱 구체적인 예로는 양전하가 유지될 수 있도록 하는 Arg 대신 Lys, 및 그 반대의 경우; 음전하가 유지될 수 있도록 하는 Asp 대신 Glu, 및 그 반대의 경우; 유리 -OH가 유지될 수 있도록 하는 Thr 대신 Ser; 및 유리 NH2가 유지될 수 있도록 하는 Asn 대신 Gln을 포함한다. 한 실시양태에서, RSV F 면역원은 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, RSV F 면역원은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "동일하다"라는 용어는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열이 서로 비교하였을 때, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진다는 것을 의미한다. 두 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 실질적으로 동일한지 여부를 측정하기 위한 한 테스트는 공유되는 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 비율(%)을 측정하는 것이다.
서열 동일성을 계산하는 것은 하기와 같이 수행될 수 있다. 서열을 최적의 비교 목적으로 정렬한다(예컨대, 최적으로 정렬될 수 있도록 하기 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 그 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비상동성 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 비교 목적을 위해 정렬되는 참조 서열의 길이는 종종 참조 서열 길이의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 대개는 60% 이상, 및 더욱 흔하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 100%이다. 이어서, 정렬된 두 서열 사이에 상응하는 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 위치의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 비교한다. 제1 서열 중의 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 뉴클레오티드 또는 아미노산은 상기 위치에서 동일한 것으로 간주된다. 두 서열 사이의 동일성(%)은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입된 갭 개수, 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일 위치의 개수의 함수이다.
두 서열 사이의 서열 비교 및 동일성(%) 측정은 수학 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성(%)은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함되어 있는, 문헌 [Meyers & Miller, CABIOS 4:11-17 (1989)]의 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(인터넷 주소 http www.gcg.com에서 이용가능) 중 GAP 프로그램에 포함되어 있는 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)]의 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다. 블로섬 62 점수화 매트릭스와 함께 주로 사용되는 파라미터 세트로는 갭 개방 패널티 12, 갭 연장 패널티 4, 및 프레임쉬프트 갭 패널티 5를 포함한다. 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성(%)은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 가중치 60 및 길이 가중치 4를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지(인터넷 주소 http www.gcg.com에서 이용가능) 중 GAP 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다.
두 핵산이 실질적으로 동일한지 여부를 측정하는 또 다른 방식은 한 핵산에 상동성이 폴리뉴클레오티드가 엄격한 조건 하에서 다른 핵산에 하이브리드화하는지 여부를 평가하는 것이다. 본원에서 사용되는 바, "엄격한 조건"이라는 용어는 하이브리드화 및 세척에 대한 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6 (1989)]에서 살펴볼 수 있다. 수성 및 비수성 방법인 상기 참고 문헌에 기술되어 있고, 그 중 어느 것이 사용될 수 있다. 엄격한 하이브리드화 조건의 예는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중에서 하이브리드화, 이어서, 50℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척이다. 엄격한 하이브리드화 조건의 또 다른 예는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중에서 하이브리드화, 이어서, 55℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척이다. 엄격한 하이브리드화 조건의 추가 예는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중에서 하이브리드화, 이어서, 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척이다. 대개, 엄격한 하이브리드화 조건은 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중에서 하이브리드화, 이어서, 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척이다. 더욱 흔하게, 엄격한 조건은 65℃에서 0.5 M 인산나트륨, 7% SDS, 이어서, 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS 중에서 1회 이상 세척이다.
지난 과거에 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 의 융합 활성에 대한 연구는 낮은 재조합 발현 수준이 방해가 되었다. 특히, 표준 발현 벡터로부터의 재조합 F 단백질 발현 수준는 RSV 복제 동안 관찰되는 F 단백질 발현 수준과 비교하여 낮은 경향이 있다(문헌 [Huang et al. (2010), "Recombinant respiratory syncytial virus F protein expression is hindered by inefficient nuclear export and mRNA processing," Virus Genes, 40:212-221]). 이러한 차이는 바이러스와 재조합 F 단백질 발현 사이의 차에 기인하는 것일 수 있다. 일반적으로, 바이러스와 재조합 F 단백질 발현 사이에는 2가지 중요한 차이점이 존재한다. 첫째, 바이러스 복제 동안 F 유전자의 전사는 세포질에서 발현되는 반면, 전사는 재조합 F 단백질 발현 동안 핵에서 표준 포유동물 발현 벡터로부터 이루어진다. 심지어, 보통 핵에서 복제되는 바이러스의 경우, 바이러스 전사체의 핵에서 세포질로의 외수송이 문제가 될 수 있다. 바이러스 전사체의 경우, 억제는 AU 흡광도의 곱으로 간주되는데, 이는 포유동물 전사체에 비하여 상대적으로 높다. 그러므로, 한 실시양태에서, F 단백질 유전자 서열 중 GC 존재비는 전사를 증진시키기 위해 변형될 수 있다(문헌 [Huang et al. (2010), "Recombinant respiratory syncytial virus F protein expression is hindered by inefficient nuclear export and mRNA processing," Virus Genes, 40:212-221).
본원에서 제공하는 뉴클레오티드 서열은 코딩된 바이러스 융합 단백질의 아미노산 서열이 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열과 유사하도록 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기를 변이시킴으로써 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, RSV-융합 단백질의 아미노산 서열은 변형되지 않은 야생형 RSV F 서열, 예컨대, 서열 번호 2에 제시된 RSV F 서열 또는 서열 번호 7에 제시된 가용성 RSV F 서열에 의해 코딩된 단백질과 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 서열 번호 2에 제시된 RSV F에 대한 변형되지 않은 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열 또는 서열 번호 7에 제시된 가용성 RSV F에 대한 아미노산 서열와 100% 동일하다.
표 1에 제시된 바와 같이, 종결 코돈 및 아미노산 서브세트는 2개 이상의 코돈 가능성에 의해 코딩될 수 있다. 예를 들어, 글루타메이트는 GAA 또는 GAG에 의해 코딩될 있다. 글루타메이트에 대한 코돈이 GAA로서 핵산 서열내 존재할 때, 세번째 위치에서의 A에서 G로의 뉴클레오티드 염기 변이는 여전히 글루타메이트를 코딩하는 변형된 코돈을 유도할 것이다. 따라서, 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 특정 변이는 여전히 같은 아미노산 코딩을 유도할 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 과정은 본원에서 코돈 최적화로 지칭된다. 본원에서는 생성된 RSV F 아미노산 서열이 (서열 번호 2에 기재된) 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열과 동일한 것인, 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기를 변이시킴으로써 변형된 RSV F에 대한 뉴클레오티드 서열의 예(서열 번호 8 및 9에 기재)를 제공한다. 본원에서는 또한 예를 들어, sRSV F 아미노산 서열이 (서열 번호 7에 기재된) 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열과 동일한 것인, 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기를 변이시킴으로써 변형된 가용성 RSV F에 대한 뉴클레오티드 서열(서열 번호 4, 5, 및 6에 기재)를 제공한다.
한 실시양태에서, 예를 들어, 가용성 RSV F를 비롯한, RSV F 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 a) 코딩된 바이러스 융합 단백질의 아미노산 서열이 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열과 유사하거나, 또는 동일하도록; 및 b) 구아닌 및 시토신의 합산 비율(GC(%))이 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열과 비교하여 변형된 뉴클레오티드 서열에서 증가되어 있도록 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기를 변이시킴으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형된 핵산 서열 중 GC(%)는 약 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상일 수 있다. 표 1에 제시된 바와 같이, 아미노산 및/또는 종결 코돈 지정은 보존하면서, A 또는 T는 G 또는 C로 변이되도록, 첫번째, 두번째, 및/또는 세번째 코돈 위치에서 뉴클레오티드 염기 변이가 이루어질 수 있다.
본원에서는 RSV F 아미노산 서열이 (서열 번호 2에 기재된) 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열과 동일하고, 구아닌 및 시토신의 합산 비율(GC(%))이 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열(35% GC; 서열 번호 1에 기재)과 비교하여 변형된 뉴클레오티드 서열(58% GC)에서 증가되어 있는 것인, 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기를 변이시킴으로써 변형된 RSV F에 대한 뉴클레오티드 서열의 예(서열 번호 9에 기재)를 제공한다. 본원에서는 또한 예를 들어, sRSV F 아미노산 서열이 (서열 번호 7에 기재된) 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열과 동일하고, 구아닌 및 시토신의 합산 비율(GC(%))이 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열(35% GC; 서열 번호 3에 기재)과 비교하여 변형된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 4의 경우, 46% GC; 서열 번호 6의 경우, 51% GC; 서열 번호 5의 경우, 58% GC)에서 증가되어 있도록, 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기를 변이시킴으로써 변형된 가용성 RSV F에 대한 뉴클레오티드 서열(예컨대, 서열 번호 4, 5, 및 6에 기재)를 제공한다.
본원에서 제공하는 뉴클레오티드 서열은 a) 코딩된 바이러스 융합 단백질의 아미노산 서열이 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열과 유사하거나, 또는 동일하도록; b) 구아닌 및 시토신의 합산 비율(GC(%))이 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열과 비교하여 변형된 뉴클레오티드 서열에서 증가되어 있도록; 및 c) 세번째 뉴클레오티드 코돈 위치에서의 구아닌 및 시토신의 전체 합산 비율(GC3(%))이 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열과 비교하여 변형된 뉴클레오티드 서열에서 증가되어 있도록 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기를 변이시킴으로써 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, GC3(%)은 약 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상이다. 표 1에 제시된 바와 같이, 대부분의 뉴클레오티드 염기 변이 가능성은 세번째 뉴클레오티드 코돈 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, 종결 코돈을 비롯한 모든 코돈은 이전에 세번째 뉴클레오티드 코돈 위치에 G 또는 C를 가지고 있거나, 또는 아미노산 지정은 변경하지 않으면서, 세번째 뉴클레오티드 코돈 위치에 G 또는 C를 가지도록 변형될 수 있다. 따라서, 임의의 주어진 뉴클레오티드 서열의 경우, 뉴클레오티드 서열 전역에 걸쳐 각 세번째 뉴클레오티드 코돈 위치(GC3)에 최대 100%까지 G 또는 C를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서는 RSV F 아미노산 서열이 (서열 번호 2에 기재된) 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열과 동일하고, 세번째 뉴클레오티드 코돈 위치에서의 구아닌 및 시토신의 전체 합산 비율이 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열(31% GC3; 서열 번호 1에 기재)과 비교하여 변형된 뉴클레오티드 서열(100% GC3)에서 증가되어 있는 것인, 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기를 변이시킴으로써 변형된 RSV F에 대한 뉴클레오티드 서열(서열 번호 9에 기재)를 제공한다. 한 실시양태에서, 본원에서는 또한 sRSV F 아미노산 서열이 (서열 번호 7에 기재된) 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열과 동일하고, 세번째 뉴클레오티드 코돈 위치에서의 구아닌 및 시토신의 전체 합산 비율이 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열(31% GC3; 서열 번호 3에 기재)과 비교하여 변형된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 4의 경우, 58% GC3; 서열 번호 6의 경우, 76% GC3; 서열 번호 5의 경우, 100% GC3)에서 증가되어 있는 것인, 하나 이상의 코돈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 염기를 변이시킴으로써 변형된 sRSV F에 대한 뉴클레오티드 서열(예컨대, 서열 번호 4, 5, 및 6에 기재)를 제공한다.
한 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 가용성 RSF-F 단백질을 비롯한 RSV F 단백질은 GC 함량이 약 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상이고, 서열 번호 2 또는 서열 번호 7과 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 98%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는, 예를 들어, 가용성 RSV F 단백질을 비롯한, RSV F 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 서열을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 8, 또는 서열 번호 9와 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 98%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일하다. 한 실시양태에서, 가용성 바이러스 융합 단백질은 기능성 막 결합 영역이 결여된다. 더욱 특정의 실시양태에서, 가용성 바이러스 융합 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 525 내지 574에 상응하는 C 말단 막횡단 영역 아미노산이 결여된다.
특정 실시양태에서는 또한 (i) GC 함량이 약 51% 이상이고, (ii) 서열 번호 1과 약 73% 이상 동일하고, (iii) 서열 번호 2와 약 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
한 실시양태에서, RSV F 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 1과 약 60% 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 98%, 98% 또는 99% 이상 동일하다.
재조합 바이러스 융합 단백질은 예컨대, 화학적 변형, 또는 번역 후 변형에 의해 추가로 변형될 수 있다. 상기 변형으로는 페길화, 알부민화, 글리코실화, 파르네실화, 카복실화, 하이드록실화, 헤실화, 카바밀화, 황산화, 인산화, 및 당업계에 공지된 다른 폴리펩티드 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 제공하는 바이러스 융합 단백질은 1급 아미노산 서열의 변형에 의해, 하나 이상의 아미노산의 결실, 부가, 또는 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 바이러스 융합 단백질은 번역 후 글리코실화에 의해 변형된다. 재조합 바이러스 융합 단백질은 전체적으로 글리코실화되거나, 부분적으로 글리코실화되거나, 탈글리코실화되거나, 또는 비글리코실화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스 융합 단백질(예컨대, RSV F 융합 단백질)은 대응 관계에 있는 천연의 상대 단백질의 글리코실화 프로파일과 유사하거나, 실질적으로 동일하거나, 또는 동일한 글리코실화 프로파일을 가질 수 있다(예컨대, 문헌 [Rixon et al., 2002 J. Gen. Virol. 83: 61-66]). 재조합 바이러스 융합 당단백질은 당업계에 공지된 다중의 글리코시드 연결부 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 백신 조성물에서의 사용에 적합한 RSV F 단백질은 당업계에 공지된 구성물 및 기법을 사용하여 발현되고, 정제될 수 있다. 바이러스 융합 단백질, 예컨대, RSV F를 제조하고, 정제하는 시스템 및 방법은 공지되어 있으며, WO 2012/103496(발명의 명칭: EXPRESSION OF SOLUBLE VIRAL FUSION GLYCOPROTEINS IN MAMMALIAN CELLS)(상기 특허의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
5. 백신 제제
앞서 본 출원의 배경 섹션에서 논의된 바와 같이, RSV 백신 개발은 어려웠다. 비록 현재까지 다른 바이러스, 예컨대, 인플루엔자에 대한 백신은 성공적으로 개발된 바 있지만, RSV에 대한 것은 성공적으로 개발된 바 없다. 백신 관점에서 볼 때, 호흡기 바이러스는 2개의 주성분 군-감염이 장기간 면역을 일으키고, 그의 연속된 생존을 위해서는 계속적인 돌연변이를 필요로 하는 것, 및 감염이 불완전 면역을 유도하고, 반복된 감염이 일반적인, 심지어 돌연변이는 거의 없거나, 전혀 없는 것으로 나뉠 수 있다. 인플루엔자 바이러스, 및 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 각각 전자 군 및 후자 군의 대표적인 것이다(문헌 [U.E. Power, 2008 "Respiratory syncytial virus (RSV) vaccines - Two steps back for one leap forward," J. Clin. Virol. 41: 38-44] 참조). 그 결과, 비록 인플루엔자 바이러스에 대해서는 성공적인 백신이 개발되었지만, RSV에 대해서는 수십년 간 연구되고, 수개의 백신 접근법이 존재함에 불구하고 성공적인 백신은 개발되지 못했다.
인간에서 RSV 질환으로부터 방법하는 데 필요한 RSV 항체 및 세포성 면역 간의 균형은 잘 이해되고 있지 못하며, 다른 연령 군에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 노년기에서는 젊은 성인에서보다 세포성 반응이 유도하기가 더 어렵고, Th2로 더욱 편향되어 있으며, 더욱 빠르게 쇠약해진다(문헌 [Kumar R and Burns EA (2008) Age-related decline in immunity: implications for vaccine responsiveness. Expert Rev Vaccines 7: 467-479]). RSV 특이 T 세포 반응은 특히 노화됨에 따라 감소한다(문헌 [Cusi MG, et al. (2010) Age related changes in T cell mediated immune response and effector memory to Respiratory Syncytial Virus (RSV) in healthy subjects. Immun Ageing 7: 14]). 노년기 개체는 RSV 중화 역가가 9-13 log2로 혈청 반응 양성임에도 불구하고, 여전히 중증 RSV 질환으로 사망할 수 있다(문헌 [Walsh EE, et al. (2004) Risk factors for severe respiratory syncytial virus infection in elderly persons. J Infect Dis 189: 233-238]). 노년기의 경우, 젊은 사람에서는 관찰되지 않는 RSV 반응상의 T 세포 결함이 있고(문헌 [Cusi MG, et al. (2010) Age related changes in T cell mediated immune response and effector memory to Respiratory Syncytial Virus (RSV) in healthy subjects. Immun Ageing 7: 14]), 젊은 성인과 유사한 중화 항체 역가를 가지고 있음에도 불구하고(문헌 [Falsey AR, et al. (1999) Comparison of respiratory syncytial virus humoral immunity and response to infection in young and elderly adults. J Med Virol 59: 221-226]), 감염 후 RSV 질환에 더 쉽게 걸린다. 이러한 관찰 결과는 RSV 백신, 및 쇠약성 RSV 특이 세포 매개 면역을 부스팅하는 데 노년기용으로서 효과적인 RSV 백신이 필요할 수 있다는 것을 제안한다.
상기 언급된 바와 같이, 노년기는 그의 면역 반응에서 Th2로 편향된 경향을 가진다. 포유동물의 세포성 면역 반응은 T 헬퍼 1(Th1: T helper 1) 세포성 면역 반응 및 T 헬퍼 2 (Th2: T helper 2) 세포성 면역 반응, 둘 모두를 포함한다. Th1 및 Th2 반응은 각 반응에서 합성되는 시토카인 프로파일에 기초하여 구별될 수 있다. 1형 T 세포는 바이러스 세포 매개 면역 반응에 연루되어 있는 시토카인인 인터페론 감마(IFNγ)를 생산한다. 그러므로, IFNγ는 "Th1 형 시토카인"으로 지칭될 수 있다. Th2 세포는 체액성 면역 발생에 참여하고, 즉시형 과민증에서 중요한 역할을 하는 것인, 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 5(IL-5) 및 인터루킨 13 (IL-13)을 선택적으로 생산한다. IL-4, IL-5 및 IL-13 또한 "Th2형 시토카인"으로 지칭될 수 있다. Th1 반응은 또한 반응에서 생산되는 항체 서브타입에 의해 확인될 수 있다. 설치류 모델에서, Th1 편향된 반응은 IgG1 항체 역가보다 큰 IgG2a 또는 IgG2b 항체 역가를 가진다(IgG2a 및 IgG2b는 Th1 서브타입이고; IgG1은 Th2 서브타입이다). (중요하게는, 인간에서는 정반대의 것도 맞고; 인간 IgG1이 Th1 서브타입이고, 인간 IgG2가 Th2 서브타입이며, Th1 편향된 반응은 IgG2 항체 역가보다 더 큰 IgG1 항체 역가를 특징으로 한다). 설치류 및 인간, 둘 모두에서, Th1 반응은 또한 CD8 T 세포 반응 증가를 특징으로 한다. Th1/Th2 시토카인 면역 반응의 불균형, 특히, 동물의 세포성 면역 반응에서 Th2 편향은 특히 폐에서의 RSV 발병기전 및 감염의 중증도에 영향을 줄 수 있다. 추가로, Th2 편향된 1차 면역 반응은 RSV 증진된 질환과 상관 관계가 있다(문헌 [Hurwitz JL (2011) Respiratory syncytial virus vaccine development. Expert Rev Vaccines 10: 1415-1433]).
그의 RSV에의 사전 노출에 기인하여, 생 약독화된 RSV 바이러스 백신은 노년기 집단에서는 면역원성이 불충분할 것이다. 기존 RSV 면역은 바이러스 백신의 복제를 억제시킬 수 있으며, 그 결과, RSV 면역을 부스팅시킬 수 있는 생 RSV 백신의 능력을 제한할 수 있다. 그러므로, 노년기에서 RSV 관련 질병을 예방할 수 있는 백신이 상기의 표적 집단에서의 충족되지 못한 의학적 요구를 다루게 될 것이다.
한 실시양태에서, 백신 조성물을 제공한다. 특히, 백신 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 RSV F 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 재조합적으로 발현된 RSV F 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 RSV 가용성 F 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, RSV 가용성 F 단백질은 C 말단 막횡단 도메인이 결여된다. 더욱 특정의 실시양태에서, RSV 가용성 F 단백질은 세포질 테일 도메인이 결여된다.
더욱 특정의 실시양태에서, 백신 조성물은 애주번트와 함께 조합하여 RSV 가용성 F 단백질을 포함한다. 빈번하게는, 정제된 단백질 항원은 고유한 면역원성이 결여되어 있으며, 이에 면역원성 백신 제제는 대개 애주번트로서 알려져 있는, 면역 반응의 비특이 자극인자를 포함한다. 일부 애주번트는 항원 제시 방법에 영향을 준다. 예를 들어, 일부 경우에서, 단백질 항원이 알룸에 의해 침전될 때, 면역 반응은 증가된다. 다른 경우에서는 항원의 유화가 항원 제시 지속 기간을 연장시킬 수 있다. 면역화 프로토콜은 수년 동안 반응을 자극시키기 위해 애주번트를 사용해 왔고, 따라서, 애주번트는 당업계의 숙련가에게 주지되어 있다. 애주번트는 문헌 [Vogel et al., "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)"](상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
공지된 애주번트의 예로는 완전 프로인트 애주번트(사멸된 마이코박테리아 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는, 면역 반응의 비특이 자극인자), 불완전 프로인트 애주번트 및 수산화알루미늄 애주번트를 포함한다. 다른 공지된 애주번트로는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSP: granulocyte macrophage colony-stimulating factor), 바실러스 칼메트-게린(BCG: Bacillus Calmette-Guerin), 수산화알루미늄, 뮤라밀 디펩티드(MDP: Muramyl dipeptide) 화합물, 예컨대, thur-MDP 및 nor-MDP, 뮤라밀 트리펩티드 포스파티딜에탄올아민 (MTP-PE: muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine), 박테리아로부터 추출된 3가지 성분을 함유하는 RIBI 애주번트(리비 이뮤노켐 리서치, 인크.(Ribi ImmunoChem Research, Inc.: 미국 몬태나주 해밀턴)), 트레할로스 디마이콜레이트(TDM: trehalose dimycolate) 및 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀젼 중 세포벽 골격(CWS: cell wall skeleton)을 포함한다. MF-59, 노바솜즈(Novasomes)®, 주조직적합 복합체(MHC: major histocompatibility complex) 항원이 다른 공지의 애주번트이다.
대개는 알룸이 백신용 애주번트로서 사용되지만, 이는 효과적인 세포성 면역을 유도하기 보다는 체액성 면역을 부스팅시키기 위한 것으로 공지되어 있다(문헌 [Langley JM et al. (2009) A dose-ranging study of a subunit Respiratory Syncytial Virus subtype A vaccine with and without aluminum phosphate adjuvantation in adults > or =65 years of age. Vaccine 27: 5913-5919]; [Falsey AR, et al. (2008) Comparison of the safety and immunogenicity of 2 respiratory syncytial virus (rsv) vaccines--nonadjuvanted vaccine or vaccine adjuvanted with alum--given concomitantly with influenza vaccine to high-risk elderly individuals. J Infect Dis 198: 1317-1326]; 및 [Kool M, et al. (2012) Alum adjuvant: some of the tricks of the oldest adjuvant. J Med Microbiol 61: 927-934]). 톨 유사 수용체(TLR)9 효능제를 도입한 신규한 애주번트 화합물은 마우스 모델에서 RSV 백신에 대한 Th1 편향된 세포성 반응을 개선시키는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Hancock GE, et al. (2001) CpG containing oligodeoxynucleotides are potent adjuvants for parenteral vaccination with the fusion (F) protein of respiratory syncytial virus (RSV). Vaccine 19: 4874-4882]; 및 [Garlapati S, et al. (2012) Enhanced immune responses and protection by vaccination with respiratory syncytial virus fusion protein formulated with CpG oligodeoxynucleotide and innate defense regulator peptide in polyphosphazene microparticles. Vaccine]). TLR4 기반 애주번트, 예컨대, 모노포스포릴 지질 A (MPL)/QS-21 조합물 또는 수막구균 외막 단백질과 함께 복합체를 형성한 LPS 제제인 프로톨린(Protollin) 또한 마우스에서 RSV 백신에 대해 세포 IFNγ 생산을 유도할 수 있었다(문헌 [Neuzil KM, et al. (1997) Adjuvants influence the quantitative and qualitative immune response in BALB/c mice immunized with respiratory syncytial virus FG subunit vaccine. Vaccine 15: 525-532]; [Cyr SL, et al. (2007) Intranasal proteosome-based respiratory syncytial virus (RSV) vaccines protect BALB/c mice against challenge without eosinophilia or enhanced pathology. Vaccine 25: 5378-5389]).
장내 세균의 지질다당류(LPS: lipopolysaccharide)는 면역계의 강력한 자극인자이다. 그러나, 애주번트에 그를 사용하는 것은 그의 독성으로 인해 축소되어 왔다. 이당류 골격의 3번 위치로부터 아실 쇄를 제거함으로써 제조된, 독소가 제거된 MPL의 추가 버전(이는 3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)로 명명)과 함께, 환원 단부 글구코사민으로부터 중심 탄수화물 기 및 포스페이트를 제거함으로써 제조되는 LPS의 비독성 유도체인 모노포스포릴 지질 A(MPL)가 제조되어 왔다. TLR4 복합체의 인간 MD2 분자에 결합하도록 하는데 최적화된 또 다른 합성 톨 유사 수용체(TLR)4 효능제는 글루코피라노실 지질 애주번트(GLA: glucopyraonosyl lipid adjuvant)로 명명되는 합성 헥실화 지질 A 유도체(아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.: 미국 앨라배마주 앨러배스터)로부터 이용가능)이다. GLA는 설치류 및 영장류 모둘 시스템 둘 모두에서 강력한 Th1 편향 애주번트인 것으로 입증되었다(문헌 [Coler RN, et al. (2010) A synthetic adjuvant to enhance and expand immune responses to influenza vaccines. PLoS One 5: e13677]; 및 [Lumsden JM, et al. (2011) Evaluation of the safety and immunogenicity in rhesus monkeys of a recombinant malaria vaccine for Plasmodium vivax with a synthetic Toll-like receptor 4 agonist formulated in an emulsion. Infect Immun 79: 3492-3500]).
GLA는 미국 특허 공개 번호 2011/0070290(발명의 명칭: "Vaccine Composition Containing Synthetic Adjuvant")(상기 특허의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 상세하게 기술되어 있다. 미국 특허 공개 번호 2011/0070290에 기술되어 있는 바와 같이, GLA는 (i) 비환원 말단 글루코사민의 헥소사민 1번 위치와 환원 말단 글루코사민의 헥소사민 6번 위치 사이의 에테르 결합을 통해 환원 말단 글루코사민이 비환원 말단 글루코사민에 연결되어 있는 디글루코사민 골격; (ii) 비환원 말단 글루코사민의 헥소사민 4번 위치에 부착되어 있는 O-포스포릴 기; 및 (iii) 최대 6개의 지방 아실 쇄(여기서, 지방 아실 쇄 중 하나는 에스테르 결합을 통해 환원 말단 글루코사민의 3-하이드록시에 부착되어 있고, 여기서, 지방 아실 쇄 중 하나는 아미노 결합을 통해 비환원 말단 글루코사민의 2-아미노에 부착되어 있고, 에스테르 결합을 통해 12개 초과의 탄소 원자로 이루어진 알카노일 쇄에 연결된 테트라데카노일 쇄를 포함하고, 여기서, 지방 아실 쇄 중 하나는 에스테르 결합을 통해 비환원 말단 글루코사민의 3-하이드록시에 부착되어 있고, 에스테르 결합을 통해 12개 초과의 탄소 원자로 이루어진 알카노일 쇄에 연결된 테트라데카노일 쇄를 포함한다)를 포함한다. GLA는 하기 화학식을 가진다:
Figure pct00003
상기 식에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C12-C20 알킬이다. 일부 실시양태에서, GLA는 본원에서 GLA-SE로 지칭되는 안정한 수중유 에멀젼(SE)으로서 제제화된다.
한 실시양태에서, 백신 조성물은 톨 유사 수용체(TLR) 효능제인 애주번트를 포함한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 (TLR)4 효능제인 애주번트를 포함한다. TLR4 신호전달에 의해 유도되는 시토카인, 예컨대, IL-6 및 IFNγ는 B 세포 성장 인자로서의 역할을 하고, Fc 수용체 및 보체와의 상호작용을 위해 최적화된 항체로의 부류 전환을 지지한다(문헌 [Finkelman FD, et al. (1988) IFN-gamma regulates the isotypes of Ig secreted during in vivo humoral immune responses. J Immunol 140: 1022-1027]; 및 [Nimmerjahn F and Ravetch JV (2007) Fc-receptors as regulators of immunity. Adv Immunol 96: 179-204]). 상기 시토카인은 추가로 T 세포가 우수하게 활성화될 수 있도록 하기 위해 MHC I 분자 및 항원 프로세싱 단백질의 상향조절을 유도하면서, 전문 항원 제시 세포를 동원한다(문헌 [Ramanathan S, et al. (2008) Antigen-nonspecific activation of CD8+ T lymphocytes by cytokines: relevance to immunity, autoimmunity, and cancer. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 56: 311-323]). TLR4 신호전달에 의해 유도되는 I형 IFN은 결합된 오브알부민 단백질에 대한 강력한 CD8 T 세포 반응의 유도를 허용하면서(문헌 [Lasarte JJ, et al. (2007) The extra domain A from fibronectin targets antigens to TLR4-expressing cells and induces cytotoxic T cell responses in vivo. J Immunol 178: 748-756; MacLeod MK, et al. (2011)]), 단백질 항원의 교차 제시를 증진시킬 수 있다(문헌 [Durand V, et al. (2009) Role of lipopolysaccharide in the induction of type I interferon-dependent cross-priming and IL-10 production in mice by meningococcal outer membrane vesicles. Vaccine 27: 1912-1922]). 더욱 특정의 실시양태에서, 백신 조성물은 글루코피라노실 지질 A(GLA)를 포함하는 애주번트를 포함한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 미립자 에멀젼으로서 제제화된다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 안정한 수중유 에멀젼 중 GLA(GLA-SE)를 포함하는 애주번트를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 백신 조성물은 안정화된 스쿠알렌계 에멀젼 중 GLA를 포함하는 애주번트를 포함한다.
RSV 백신 조성물의 투여량은 예를 들어, 연령, 신체 상태, 체중, 성별, 섭식, 투여 시간, 및 다른 임상 인자에 따라 달라질 수 있고, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 부피가 약 50 ㎕, 75 ㎕, 또는 100 ㎕ 내지 최대 약 200 ㎕, 250 ㎕, 500 ㎕, 750 ㎕ 또는 1,000 ㎕ 이상인 안정한 수성 현탁제로서 제제화된다.
한 실시양태에서, 적어도 약 1 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍ 또는 50 ㎍ 내지 최대 약 75 ㎍, 80 ㎍, 100 ㎍, 150 ㎍ 또는 200 ㎍의 본원에서 기술된 RSV 가용성 F 단백질이 백신 조성물에 포함된다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 RSV F 면역원을 적어도 약 0.01 ㎍/㎕, 0.05 ㎍/㎕, 0.1 ㎍/㎕ 내지 최대 약 0.1 ㎍/㎕, 0.2 ㎍/㎕, 0.3 ㎍/㎕, 0.4 ㎍/㎕, 0.5 ㎍/㎕ 또는 1.0 ㎍/㎕의 농도로 포함한다.
한 실시양태에서, 백신 조성물은 적어도 약 0.1 ㎍, 0.5 ㎍, 1 ㎍, 1.5 ㎍, 2 ㎍, 또는 2.5 ㎍ 내지 최대 약 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍ 또는 20 ㎍ 애주번트를 포함한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 애주번트를 적어도 약 1 ng/㎕, 2 ng/㎕, 3 ng/㎕, 4 ng/㎕ 또는 5 ng/㎕ 내지 최대 약 0.1 ㎍/㎕, 0.2 ㎍/㎕, 0.3 ㎍/㎕, 0.4 ㎍/㎕ 또는 0.5 ㎍/㎕의 농도로 포함한다.
더욱 특정의 실시양태에서, 애주번트는 GLA 농도 적어도 약 1%, 2% 는 3% 내지 최대 약 4% 또는 5%로, 안정화된 수중유 에멀젼 중 GLA를 포함한다. 한 실시양태에서, 애주번트는 안정화된 수중유 에멀젼(SE) 중 GLA를 포함하고, 여기서, GLA의 평균 입자 크기는 적어도 약 25 nm, 50 nm, 75 nm 또는 100 nm 내지 최대 약 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm 또는 200 nm이다.
더욱 특정의 실시양태에서, 백신 조성물은 최종 부피 약 100 ㎕ 내지 약 500 ㎕로 2% 내지 5% SE 중 약 1 ㎍ 내지 10 ㎍ GLA와 함께 조합하여 약 1 ㎍ 내지 100 ㎍의 RSV sF 당단백질을 포함한다. 더욱 특정의 실시양태에서, 백신 조성물은 최종 부피 약 250 ㎕ 내지 약 500 ㎕로 2% 내지 5% SE 중 약 1 ㎍ 내지 약 5 ㎍ GLA와 함께 조합하여 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 RSV sF 당단백질을 포함하는 액체 제제이다. 추가의 실시양태에서, 백신 조성물은 근육내 주사용으로 제제화되고, 최종 부피 약 500 ㎕로 2% 또는 5% SE 중 1 ㎍, 2.5 ㎍ 또는 5 ㎍ GLA와 함께 조합하여 약 10 ㎍, 30 ㎍ 또는 100 ㎍의 RSV sF 당단백질을 포함한다.
투여량 및 투여 빈도는 숙주 반응에 의존할 수 있다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 단회 용량으로 투여된다. 또 다른 실시양태에서 백신 조성물은 2회 투여 요법 하에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 백신 조성물은 투여 스케줄에 따라, 예를 들어, 초기 백신 조성물 투여 후 후속 부스터 투여로 투여된다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 2차 투여는 초기 투여 후 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 4주 후에 투여되거나, 또는 초기 투여 후 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5 또는 약 6개월 후에 투여되거나, 또는 초기 투여 후 적어도 약 1년 이상의 기간 후에 투여되는 것인, 2회 투여 요법 하에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 백신 조성물은 2차 투여는 초기 투여 후 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 4주 후에 투여되거나, 또는 초기 투여 후 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5 또는 약 6개월 후에 투여되거나, 또는 초기 투여 후 적어도 약 1년 이상의 기간 후에 투여되고, 3차 투여는 2차 투여 후에, 예를 들어, 2차 투여 후 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6개월 또는 약 1년 후에 투여되는 것인, 투여 스케줄에 따라 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 백신 조성물은 면역원이 그 안에 현탁되어 있거나, 용해되어 있는 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 공지되어 있고, 주사용수, 염수액, 완충처리된 용액, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 멸균 등장성 수성 완충제, 및 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비경구 투여, 예컨대, 피하주사를 위해, 담체는 물, 염수, 알콜, 지방, 왁스, 완충제, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서 전역에서 논의되는 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및 다른 부형제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J. current edition)](상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 제시되어 있다. 제제는 투여 모드에 적합하여야 한다. 바람직한 실시양태에서, 제제는 인간 투여에 적합하고, 바람직하게, 멸균, 비미립자 및/또는 비발열성이다.
다른 실시양태에서, 백신 조성물은 하나 이상의 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 및/또는 애주번트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물은 백신 효능을 개선시키기 위해 최소량의 습윤화제 또는 유화제, 또는 pH 완충화제를 포함할 수 있다. 조성물은 고체 형태, 예컨대, 재구성에 적합한 동결건조된 분제, 액체 액제, 현탁제, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 지효성 제제, 또는 분제일 수 있다. 경구용 제제는 표준 담체, 예컨대, 제약 등급의 만닛톨, 락토스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다.
백신 조성물 중에 다른 성분, 예컨대, 알루미늄 염, 유중수 에멀젼, 생분해성 오일 비히클, 수중유 에멀젼s, 생분해성 마이크로캡슐, 및 리포솜을 포함하나, 이에 한정되지 않는 전달 비히클을 포함하는 것 또한 바람직할 수 있다. 다른 실시양태에서, 백신 조성물은 항박테리아제, 예컨대, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이팅제, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조절제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다.
백신 조성물 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 백신 조성물을 투여하는 방법은 비경구 투여(예컨대, 진피내, 근육내, 정맥내 및 피하), 경막외, 및 점막(예컨대, 비내 및 경구 또는 폐 경로 또는 좌제에 의해)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 근육내로, 정맥내로, 피하로, 경피로 또는 진피내로 투여된다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층(예컨대, 구강 점막, 결장, 결막, 비인두, 구인두, 질, 요도, 방광 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적으로 활성인 작용제와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물의 비내 또는 다른 점막 경로를 통한 투여는 다른 투여 경로보다 실질적으로 더 높은 항체 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물의 비내 또는 다른 점막 경로를 통한 투여는 면역화 부위에서 항체 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있다.
6. 키트 및 제조 물품
한 실시양태에서, 제약 팩 또는 키트는 본원에 기술된 백신 제제 성분 중 하나 이상의 것으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함한다. 백신 조성물은 밀봉된 용기, 예컨대, 조성물 용량이 명시된 샤셋 또는 앰플에 패키징될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 액체로서 공급된다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 밀봉된 용기 중에 건식 멸균처리된 동결건조된 분제 또는 무수 농축액으로서 공급되며, 여기서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적절한 농도를 수득하기 위해 예를 들어, 물 또는 염수로 재구성될 수 있다.
백신 조성물이 예를 들어, 피하 또는 근육내 주사에 의해 전신 투여될 때, 바늘 및 시린지, 또는 바늘이 없는 주사 장치가 사용될 수 있다. 백신 제제는 앰플, 1회용 시린지 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알에 동봉될 수 있다.
7. 면역 반응 자극 방법
RSV 감염에 대한 반응으로, RSV 융합(F) 및 부착(G) 외피 당단백질을 표적하는 중화 항체가 생산된다(문헌 [Hurwitz JL (2011), "Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development," Expert Rev Vaccines, 10:1415-1433]). F 당단백질은 바이러스 RSV A 및 RSV B 균주, 둘 모두에서 고도로 보존되고, 바이러스 진입 및 복제를 위한 전제 조건인 바이러스 및 세포막의 융합에 필수적이기 때문에, F 유도성 중화 반응이 특히 바람직할 수 있다(문헌 [Maher CF, et al. (2004)]). 낮은 RSV 중화 항체 역가는 더욱 중증인 RSV 질환의 더 높은 위험과 상관 관계가 있다(문헌 [Lee FE, et al. (2004) Experimental infection of humans with A2 respiratory syncytial virus. Antiviral Res 63: 191-196]). RSV 중화 항체는, 수동 전달시 나이브 인간 및 설치류에 방어를 제공하는 RSV 면역에서 중요한 역할을 하고, RSV에 대한 세포성 반응은 질환 보호에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다(문헌 [Krilov LR (2002) Palivizumab in the prevention of respiratory syncytial virus disease. Expert Opin Biol Ther 2: 763-769] 및 [Graham BS, et al. (1993) Immunoprophylaxis and immunotherapy of respiratory syncytial virus-infected mice with respiratory syncytial virus-specific immune serum. Pediatr Res 34: 167-172]). F 당단백질은 다중 마우스 및 인간 CD8 및 CD4 T 세포 에피토프를 함유한다(문헌 [Olson MR and Varga SM (2008) Pulmonary immunity and immunopathology: lessons from respiratory syncytial virus. Expert Rev Vaccines 7: 1239-1255]). RSV 특이 CD8 T 세포 반응은 혈청 반응 양성 인간 성인에서 검출되고(문헌 [Cusi MG, et al. (2010) Age related changes in T cell mediated immune response and effector memory to Respiratory Syncytial Virus (RSV) in healthy subjects. Immun Ageing 7: 14]), 동물 모델에서 바이러스 감염된 세포를 제거하고, RSV 감염을 해결하는 데 중요한 역할을 한다(문헌 [Bangham CR, et al. (1985) Cytotoxic T-cell response to respiratory syncytial virus in mice. J Virol 56: 55-59]; [Srikiatkhachorn A and Braciale TJ (1997) Virus-specific CD8+ T lymphocytes downregulate T helper cell type 2 cytokine secretion and pulmonary eosinophilia during experimental murine respiratory syncytial virus infection. J Exp Med 186: 421-432]; [Hussell T, et al. (1997) CD8+ T cells control Th2-driven pathology during pulmonary respiratory syncytial virus infection. Eur J Immunol 27: 3341-3349]; 및 [Munoz JL, et al. (1991) Respiratory syncytial virus infection in C57BL/6 mice: clearance of virus from the lungs with virus-specific cytotoxic T cells. J Virol 65: 4494-4497]). RSV 특이 CD4 T 세포 반응은 B 세포 항체 생산 및 CD8 반응, 둘 모두를 촉진시키며, Th1형 CD4 반응은 Th2형 반응보다 더욱 효과적으로 CD8 반응을 촉진시킨다(문헌 [Hurwitz JL (2011), "Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development," Expert Rev Vaccines, 10:1415-1433]).
한 실시양태에서, 면역학상 유효량의, 면역원성 RSV F 단백질을 함유하는 조성물을 피험체(예컨대, 인간 또는 동물 피험체)에게 투여하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 면역원성 RSV F 단백질 및 1 이상의 애주번트를 포함하는 백신 조성물을 포유동물에게 투여하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, RSV F는 (RSV sF로도 지칭되는) 가용성 RSV F를 포함한다. 한 실시양태에서, 애주번트는 GLA이다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 애주번트는 GLA-SE이다. 한 실시양태에서, RSV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 면역 반응은 체액성인 것이다. 또 다른 실시양태에서, 면역 반응은 세포 매개성인 것이다. 한 실시양태에서, 본 방법은 RSV 감염 또는 그의 1 이상의 증상에 대한 방어 면역 반응을 유도한다. 추가의 실시양태에서 질환을 앓거나, 또는 상기 질환에 걸릴 위험이 있는 환자에게 치료학상 또는 예방학상 유효량의 백신 조성물을 투여하여 상기 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 질환은 호흡계 질환이고, 예를 들어, 질환은 바이러스, 특히, RSV에 의해 유발되는 것이다.
한 실시양태에서, 백신 조성물은 숙죽에서 1 이상의 면역 반응을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역 반응은 TH1형 T 림프구 반응, TH2형 T 림프구 반응, 세포독성 T 림프구(CTL: cytotoxic T lymphocyte) 반응, 항체 반응, 시토카인 반응, 림포카인 반응, 케모카인 반응, 및 염증성 반응으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 백신 조성물은 숙주에서 (a) 시토카인이 인터페론 감마(IFNγ: interferon-gamma), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α: tumor necrosis factor-alpha)로부터 선택되는 것인 하나 또는 복수 개의 시토카인 생산, (b) 인터루킨이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 및 IL-23으로부터 선택되는 것인 하나 또는 복수 개의 인터루킨생산, (c) 케모카인이 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, CCL4 및 CCL5로부터 선택되는 것인 하나 또는 복수 개의 케모카인 생산, 및 (d) 기억 T 세포 반응, 기억 B 세포 반응, 효과기 T 세포 반응, 세포독성 T 세포 반응 및 효과기 B 세포 반응으로부터 선택되는 림프구 반응으로부터 선택되는 1 이상의 면역 반응을 유도할 수 있다.
한 실시양태에서, 백신 조성물은 Th2 편향된 시토카인, 예컨대, IL-5/IL-4와 비교하여 Th1형 시토카인, 예컨대, IFNγ(Th1 편향된) 생산을 우선적으로 포함하는 면역 반응을 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, 백신 조성물 투여는 이전에 RSV에 노출된 바 있는 포유동물에서 Th1 편향된 세포성 면역 반응을 증진시킨다. 한 실시양태에서, Th1/Th2 세포성 면역 반응의 비는 적어도 약 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 또는 2:1이다. 한 실시양태에서, Th1형 F 단백질 특이 CD4 또는 CD8 반응을 유도 또는 증진시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 애주번트가 첨가된 백신 조성물 투여는 약 49 내지 약 150 F 단백질 특이 CD4 T 세포 스폿 형성 단위(SFU: spot forming unit)/106개의 전체 생 세포를 유도하거나, 또는 애주번트가 첨가되지 않은 백신 조성물과 비교하여 약 5 내지 10배 증가를 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 애주번트가 첨가된 백신 조성물 투여는 약 1069 내지 3172 F 특이 CD8 T 세포 SFU/106개의 전체 생 세포를 유도하거나, 또는 애주번트가 첨가되지 않은 백신 조성물과 비교하여 약 10 내지 20배 증가를 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 세포성 IFNγ 생산 T 세포 반응(즉, Th1형 시토카인)을 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 애주번트가 첨가된 백신 조성물 투여는 애주번트가 첨가되지 않은 조성물과 비교하여 IFNγ 생산 T 세포를 45배 이상 증가시킨다.
한 실시양태에서, 포유동물에서 RSV에 대한 중화 항체를 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, RSV 중화 항체 역가는 6 Log2, 6.5 Log2, 7.0 Log2, 7.5 Log2, 8.0 Log2, 8.5 Log2, 9.0 Log2, 9.5 Log2, 10.0 Log2, 10.5 Log2, 11.0 Log2, 11.5 Log2, 12.0 Log2, 12.5 Log2, 13.0 Log2, 13.5 Log2, 14.0 Log2, 14.5 Log2, 및 15.0 Log2로부터 선택되는 역가보다 크다. 한 실시양태에서, 백신 조성물 투여 후 RSV 중화 항체 역가는 투여 전 혈청 IgG 역가와 비교하여 약 10배 내지 약 200배 더 크거나, 또는 적어도 약 10, 25, 50, 75, 100배 더 큰 것에서부터 최대 약 100, 150 또는 200배 더 큰 혈청 IgG 역가를 포함한다. 한 실시양태에서, 백신 조성물 투여 후 RSV 중화 항체 역가는 투여 전 혈청 IgG 역가와 비교하여 약 10배 이상 약 200배 이하 더 큰 혈청 IgG 역가를 포함한다.
한 실시양태에서, 백신 조성물 투여는 RSV를 중화시킬 수 있는 점막(IgA) 및 전신 항체(IgG, IgG1, IgG2a, 및 IgG2b) 반응을 유도한다. IgG1/IgG2a 비는 IgG2a>IgG1이기 때문에 Th1 편향된 항체 반응을 보였다.
한 실시양태에서, 백신 조성물 투여는 RSV 바이러스 역가를 감소시킨다. 한 실시양태에서, RSV 바이러스 역가는 약 50 내지 약 1,000배 감소되거나, 또는 적어도 약 50, 100, 250, 500배 내지 최대 약 500 또는 1,000배 감소된다. 한 실시양태에서, RSV 바이러스 역가는 백신 조성물 투여 이후 2 log 10 pfu/그램 미만이다.
실시예
실시예 1a 및 1b: 나이브 BALB /c 마우스 및 코튼 래트
BALB/c 마우스 및 코튼 래트는 RSV 감염에 대한 특징이 잘 규명되어 있는 두 설치류 모델이다. 본 실시예에서, 상기 두 모델을 사용하여 TLR4 효능제 글루코피라노실 지질 A(GLA), 안정한 에멀젼(SE), 글루코피라노실 지질 A 안정한 에멀젼(GLA-SE), 또는 알룸 애주번트와 함께 제제화된 정제된 가용성 F(sF) 단백질을 포함하는, 근육내(IM) 투여된 RSV 백신 후보물질의 면역원성을 평가하였다. 막횡단 및 세포질 테일 도메인이 결여된 정제된 sF 단백질(문헌 [Huang K, et al. (2010) Recombinant respiratory syncytial virus F protein expression is hindered by inefficient nuclear export and mRNA processing. Virus Genes 40: 212-221])을 GLA, SE, 또는 GLA-SE와 함께 제제화하고, 알룸과 함께 제제화된, 또는 애주번트가 첨가되지 않은 상태인 sF와 백신 성능에 대해 비교하였다. 근육내로 투여된 각각의 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신 제제는 RSV 중화 역가를 유도하였고, 바이러스 복제에 대하여 방어 면역을 부여하였고, 오직 sF + GLA-SE 백신만이 BALB/c 및 코튼 래트 모델, 둘 모두에서 IFNγ 생산 T 세포 반응을 프라이밍하였다는 것이 결과를 통해 입증되었다. BALB/c 마우스에서, 상기 T 세포 반응은 주로 CD8+ 반응이었고, 폐로 수송할 수 있었고, Th1 편향된 시토카인 반응과 상관 관계가 있었다. 바이러스 감염 후 Th2 관련 폐 병적 이상은 회피하면서, 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF에 비하여 중요한 면역학적 및 방어 판독 결과를 개선시키는, GLA-SE 애주번트와 함께 제제화된 RSV sF가 본 연구에서 최상의 백신 제제인 것으로 밝혀졌다.
RSV 접종으로부터의 완전한 방어, 강건한 혈청 RSV 중화 반응, 및 항F IgG 반응이 뮤린 모델에서 모든 RSV sF 백신 제제에 의해 유도되었다. 애주번트 GLA-SE와 함께 제제화되었을 때, RSV sF 단백질 백신은 F 특이 Th1 편향된 체액성 및 세포성 반응을 유도하였다. 마우스에서, F 특이 CD4 및 CD8 T 세포 반응, 둘 모두가 확인되었다. F 특이 다기능성 CD8 T 세포는 RSV 접종 이후에 마우스 폐로 수송되었고, 여기서, Th2 매개 면역 후유증 없이 바이러스 제거가 달성되었다. 코튼 래트에서, sF + GLA-SE는 강건한 중화 항체, F 특이 IFNγ T 세포 반응, 및 전체 방법을 유도하였으며, 폐의 조직학적 병적 이상에 대한 증거는 없었다.
본원의 데이터는 RSV sF 및 GLA-SE를 포함하는 단백질 서브유니트 백신이 Th1 면역 매개 기전을 통해 바이러스 제거를 증진시키면서, RSV에 대하여 강건한 체액성 및 세포성 반응을 유도할 수 있다는 것을 입증한다. 강건한 중화 항체 및 T 세포 반응을 유도하는 애주번트가 첨가된 RSV 백신은 RSV 질환의 위험이 있는 집단에 유익할 수 있다.
백신 성분
RSV A2 F 서열의 아미노산 1-524를 함유하고, 막횡단 도메인이 결여된 RSV 가용성 F(sF) 단백질(문헌 [Huang K, et al. (2010) Recombinant respiratory syncytial virus F protein expression is hindered by inefficient nuclear export and mRNA processing. Virus Genes 40: 212-221])을 RSV F 특이 mAb인 팔리비주맙(메드이뮨 인크.(MedImmune, Inc.))을 이용하여 안정적으로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO: 차이니즈 햄스터 난소) 세포의 상청액으로부터 면역 친화도 정제하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 결과, 친화도 정제된 RSV sF 단백질은 환원 조건 하에서 ~50 kD(F1) 및 ~20 kD (F2) 밴드, 둘 모두의 것으로서 전개되는(도 9a 및 b), >95% 순수한 것으로 나타났다. 저온 영상화 결과, sF 단백질은 삼량체 및 더 큰 다량체 모두 형성한 것으로 나타났고, ELISA 결합 연구에서 상기 단백질은 무손상 부위 A, B, 및 C 중화 에피토프(데이터 나타내지 않음)를 함유하는 것으로 확인되었다. RSV sF를 브래드퍼드(Bradford) 검정법에 의해 정량화하고, ELISA 검정법에서 면역화 및 코팅, 둘 모두를 위해 사용하였다.
본 연구에서 사용되는 애주번트로는 알하이드로겔(Alhydrogel)(어큐레이트 케미칼 앤드 사이언티픽(Accurate Chemical and Scientific: 미국 뉴저지주))로서 수득된 알룸(수산화알루미늄)을 포함하였다. 알룸을 백신 용량당 100 ㎍으로 사용하였고, 22°에서 30분 동안 혼합함으로써 단백질에 흡착시켰다. 이뮨 디자인 코포레이션(Immune Design Corporation: 미국 워싱턴주 시애틀))으로부터 GLA, SE, 및 GLA-SE를 입수하였고, 이는 앞서 기술된 바 있다(문헌 [Anderson RC, et al. (2010) Physicochemical characterization and biological activity of synthetic TLR4 agonist formulations. Colloids Surf B Biointerfaces 75: 123-132]). 수성 제제 중 GLA는 백신 용량당 5 ㎍으로 사용되었다. SE는 평균 입자 크기가 ~100 nm인 안정화된 스쿠알렌계 에멀젼으로서, 2% 농도로 사용되었다. 달리 언급되는 경우를 제외하면, GLA-SE는 2% SE 중 5 ㎍ GLA 용량으로 사용되었다. 모든 백신 제제는 접종 24시간 이내에 제조되었다.
면역화 및 접종을 위해 RSV A2 균주(ATCC)를 사용하였다. 바이러스를 EMEM으로 성장시킨 베로(Vero) 세포 중에서 증식시켰다. 바이러스 상청액을 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하고, 1xSP(0.2 M 수크로스, 0.0038 M KH2PO4, 및 0.0072 M KH2PO4)로 안정화시키고, 분취량을 사용시까지 -80℃에서 급냉시켰다. 문헌 [Tang RS, et al. (2004) Parainfluenza virus type 3 expressing the native or soluble fusion (F) Protein of Respiratory Syncytial Virus (RSV) confers protection from RSV infection in African green monkeys. J Virol 78: 11198-11207]에 기술된 바와 같이, 베로 세포 단층상에서 플라크 검정법에 의해 바이러스 역가를 측정하였다.
백신화 및 접종
7-10주령된 암컷 BALB/c 마우스(찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories: 미국 캘리포니아주 홀리스터)) 및 6-8주령된 암컷 코튼 래트(할란 라보라토리즈(Harlan Laboratories: 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 병원체가 없는 조건 하에서 하우징시켰다. 마우스 군을 마취시키고, 100 ㎕ 부피의 위약(PBS) 또는 RSV sF -/+ 애주번트를 2주 간격을 두고 2회에 걸쳐 근육내로 면역화시켰다. 달리 명시되지 않는 한, RSV sF를, 적정 연구로부터 애주번트 부재 하에서 차선의 방어를 제공하는 것으로 측정된 0.3 ㎍ 용량으로 제공하였다. 각 애주번트의 가장 효과적인 용량은 예비 연구로부터 선택되었다(데이터 나타내지 않음). 양성 대조군을 D0째에 106 PFU RSV A2로 비내로 감염시켰다. 백신은 모두 투여시에 우수한 내성을 가졌고, 어느 군에서도 주사 부위 반응은 없었다. 면역화 후 14일 및 28일째 안와후 혈액 수집으로부터 혈청을 수득하고, 전혈로부터 분리하고, 평가할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 연구 28일째 100 ㎕ 부피의 106 PFU의 생 RSV A2 바이러스를 비내로 마우스에 접종하였다. T 세포 검정법을 위하여 최종 면역화 후 14일째 또는 접종 후 4일째에 비장을 수거하였다. 접종 후 4일째에 플라크 검정법에 의해 각각의 개별 폐 균질액 중에서 바이러스 역가를 정량화하였다. 조직병리학적 연구를 위해 각 동물로부터의 개별 폐엽을 보존시키고, 최대 1주 동안 PBS + 4% 파라포름알데히드로 팽창시킨 후, 탈수시키고, 파라핀에 포매시켰다. 코튼 래트 연구를 유사하게 디자인하였는데, 단, 예외적으로, 동물에 초기 프라이밍 후 3주째에 부스터링하고, 부스터 백신 후 3주째에 접종하였다.
플라크 적정에 의해 폐 RSV 정량화
안락사시킨 마우스 또는 코튼 래트로부터 절개된 신선한 폐의 중량을 측정하고, 1xSP 완충제로 보충된 옵티MEM(OptiMEM)(인비트로겐(Invitrogen)) 중에서 1회용 헤드가 장착된 OMNI 조직 균질기(옴니 인터내셔날(Omni International: 미국 조지아주 케네소))를 사용하여 균질화시켰다. 원심분리에 의해 균질액을 정화시켰다. 문헌 [Tang RS, et al. (2004) Parainfluenza virus type 3 expressing the native or soluble fusion (F) Protein of Respiratory Syncytial Virus (RSV) confers protection from RSV infection in African green monkeys. J Virol 78: 11198-11207]에 기술된 바와 같이 베로 세포 단층상에서 플라크 검정법에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. 간략하면, 새로 제조된 폐 균질액의 일련의 희석액을 6웰 플레이트 중 베로 세포에 첨가하고, 1 hr 동안 감염시킨 후, 1% 메틸 셀룰로스/EMEM로 오버레이하고, 5-7일 동안 인큐베이션시켜 플라크가 형성될 수 있도록 하였다. 오버레이를 제거하고, 세포를 메탄올 고정시키고, 염소 항RSV(밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 빌러리카)에 이어서, HRP-토끼 항염소 항체 및 AEC(다코(Dako: 덴마크 글로스트럽))로 염색하여 플라크를 시각화하였다.
혈청 IgG , IgG1 , IgG2a 및 IgA ELISA
RSV F 특이 IgG 항체를 표준 ELISA 기법을 사용하여 평가하였다. 고 결합 96웰 플레이트를 정제된 RSV sF로 코팅하였다. 차단 후, 일련의 혈청 희석액을 플레이트에 첨가하였다. 결합된 항체는 HRP 컨쥬게이트된 염소 항마우스 IgG, IgG1, 또는 IgG2a(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch: 미국 펜실베이니아주 웨스트 그로브))를 사용하여 검출하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, 시그마(Sigma: 미국 미주리주 세인트 루이스))을 이용하여 발색시켰다. HRP-컨쥬게이트된 염소 항 마우스 IgA(인비트로겐: 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 사용하여 RSV F 특이 IgA 항체를 검출하였다. ELAST ELISA 증폭용 키트(퍼킨 엘머(Perkin Elmer: 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 신호를 증폭시키고, TMB로 검출하였다. 스펙트라맥스(SpectraMax) 플레이트 판독기 상에서 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 소프트맥스 프로(SoftMax Pro)(몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices: 미국 캘리포니아주 서니베일))를 사용하여 분석하였다. 컷 오프인 3x 블랭크 웰의 평균을 사용하여 역가를 log2 종점 역가로 기록하였다.
RSV 미세중화 검정법
앞서 기술된 바와 같이(문헌 [Bernstein DI, et al. (2012) Phase 1 Study of the safety and immunogenicity of a live, attenuated respiratory syncytial virus and parainfluenza virus type 3 vaccine in seronegative children. Pediatr Infect Dis J 31: 109-114]) GFP 태깅된 RSV A2 미세중화 검정법을 사용하여 명시된 시점에서 열 불활성화된 마우스 혈청에서의 RSV 중화 항체 역가를 측정하였다. 간략하면, 컨플루언트된 베로 세포 단층을 500 PFU의 바이러스 단독, 또는 일련으로 희석된 혈청 샘플과 미리 혼합된 바이러스로 감염시킨 후, 33℃ 및 5% CO2에서 22 hr 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 유리 바이러스로 세척하고, 이소사이트(IsoCyte) 영상 스캐너(블루쉬프트(Blueshift: 미국 캘리포니아주 서니베일))를 사용하여 GFP 형광성 바이러스 포커스를 열거하였다. 4 파라미터 곡선 피트 알고리즘을 사용하여 계산된, 형광성 포커스 개수를 50% 감소시킨 log2 혈청 희석률의 역수(EC50 역가)로서 중화 역가를 표시하였다.
세포 단리
명시된 수거 시점에 100 ㎛ 나일론 필터(팔콘(Falcon))를 통과시켜 개별 비장을 파괴시켰다. 비셀(ViCell)에 의해 적혈구 제거된 비장세포의 생존가능성을 측정하고, 세포를 사용 전 5% FCS, 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L 글루타민 및 0.1% β-머캅토에탄올(cRPMI-5)로 보충된 RPMI 1640 중 10x106개의 생존가능한 세포/mL로 재현탁시켰다.
명시된 수거 시점에 효소 분산된 폐 조직으로부터 폐 백혈구를 단리시켰다. 폐를 절개하고, PBS 중에서 세척하고, 민싱하고, 100 ㎛ 나일론 필터(팔콘)를 통과시켜 개별 비장을 파괴시키기 전, RMPI 5% FCS, 1 mg/mL 콜라게나제(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)) 및 30 ㎍/mL DN아제(시그마: 미국 미주리주 세인트 루이스) 중에서 45분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, cRPMI-5 중에 재현탁시키고, 비셀에 의해 전체 생존가능한 세포 계수를 측정하였다.
시토카인 프로파일링
시토카인 재자극 검정을 위해, 배지 단독, 또는 RSV F 유래 MHC II(I-Ed) 결합 펩티드 GWYTS VrflELS NIKE(서열 번호 10) 및 VSVLTSKVLDLKNYI(서열 번호 11) 쌍과 함께 비장세포를 96웰 플레이트 중에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다(각각 5 ㎍/mL)(문헌 [Olson MR, Varga SM (2008) Pulmonary immunity and immunopathology: lessons from respiratory syncytial virus. Expert Rev Vaccines 7: 1239-1255]). 원심분리에 의해 상청액을 정화시키고, 평가할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
IFNγ, IL-5, IL-13, IL-17 및 에오탁신(밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌러리카)을 포함하도록 디자인된 마우스 시토카인/케모카인 다중 키트를 사용하여 재자극받은 비장세포 상청액 및 신선한 폐 균질액을 평가하였다. 사용하기 전, 원심분리에 의해 폐 균질액을 정화시켰다. 제조사의 설명서에 따라 검정법을 수행하고, 루미넥스(Luminex) 판독기(바이오 래드(Bio-Rad: 미국 캘리포니아주 허큘리스)) 상에서 플레이트를 분석하였다. F 자극을 받은 것의 값으로부터 배지 단독인 것의 값을 감산하여 F 특이 비장의 시토카인 생산을 측정하였다.
ELISPOT 검정법
마우스 ELISPOT 검정법을 위해 맙테크(Mabtech)(미국 오하이오주 신시내티) 뮤린 IFNγ ELISPOT 키트를 사용하였다. 세포 및 자극제 첨가 이전에 미리 코팅된 미량역가 플레이트를 cRPMI-5로 차단시켰다. 250,000개의 세포/웰을 차단 코팅된 플레이트 상에서 36-48시간 동안 배지 단독, MHC II (I-Ed) 결합 펩티드 GWYTSVITIELSNIKE(서열 번호 10) 및 VSVLTSKVLDLKNYI(서열 번호 11)(문헌 [Olson MR, Varga SM (2008) Pulmonary immunity and immunopathology: lessons from respiratory syncytial virus. Expert Rev Vaccines 7: 1239-1255])(각 5 ㎍/mL씩), MHC I(H2-Kd) 결합 펩티드, KYKNAVTEL(서열 번호 12)(문헌 [Olson MR (2008)]), 또는 양성 대조군으로서 ConA(5 ㎍/mL)와 함께 3회 중복으로 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, 세포를 세척하고, 플레이트를 키트 프로토콜에 따라 포함된 비오티닐화된 항뮤린 IFNγ, 이어서, SA-HRP와 함께 인큐베이션시키고, 포함된 TMB 시약을 이용하여 스폿을 검출하였다. CTL 이뮤노스폿(ImmunoSpot) 판독기 및 소프트웨어(셀룰라 테크놀러지 리미티드(Cellular Technology Ltd.))를 사용하여 플레이트를 판독하고, 분석하였다.
코튼 래트 세포성 면역 반응을 평가하기 위해 R&D 듀어세트 ELISA 시스템즈(R&D DuoSet ELISA Systems)에서 입수한 코튼 래트 IFNγ(#DY565) 또는 IL-4(#DY584)에 대한 쌍을 이룬 항체를 ELISPOT 검정 포맷으로 사용하였다. 96웰 PVDF 플레이트(밀리포어: 미국 매사추세츠주 빌러리카)를 PBS 중 10 ㎍/mL로 키트 제공된 포획 항체(각각 항IFNγ 또는 항IL-4)로 밤새도록 코팅하였다. 플레이트를 2시간 동안 cRPMI-5로 차단하였다. 이어서, 세포를 cRPMI-5 중 차단 코팅된 플레이트 상에서 36-48시간 동안 배지, RSV sF(2 ㎍/mL), 또는 양성 대조군으로서 ConA(5 ㎍/mL)와 함께 3회 중복으로 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, 세포를 세척하고, 플레이트를 포함된 비오티닐화된 검출 항체(PBS+1% BSA 중 1 ㎍/mL)에 이어서, 스트렙트아비딘-HRP(맙테크: 미국 오하이오주 신시내티) 및 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC, 벡터 랩스(Vector Labs: 미국 캘리포니아주 벌링게임)와 함께 인큐베이션시켰다. CTL 이뮤노스폿 판독기 및 소프트웨어(셀룰라 테크놀러지 리미티드)를 사용하여 플레이트를 판독하고, 분석하였다.
유세포 측정 분석
적혈구 제거된 비장세포 및 폐 백혈구를 1.106개의 세포/웰로 96웰 미량역가 플레이트에 배지 단독, MHC I (H2-Kd) 결합 F 펩티드 KYKNAVTEL(서열 번호 12) (10 ㎍/mL), MHC I(H2-Kd) 결합 M2 펩티드 SYIGSINNI(서열 번호 13)(10 ㎍/mL), 또는 양성 대조군으로서 ConA와 함께 분포시켰다. 세포를 37℃에서 CO2에서 5-6 hr 동안 인큐베이션시키고, 시토카인 분비를 차단하기 위해 1시간째에 자극으로 브레펠딘(Brefeldin) A를 첨가하였다. 생존가능성에 대해 세포를 라이브/데드(LIVE/DEAD) 바이올렛으로, 이어서, CD3-PerCP-Cy5.5, CD8-PE-Cy7, 및 CD19-APC-Cy7로 염색하였다. 2% 파라포름알데히드로 고정시키고, 셀펌(CellPerm)(BD 바이오사이언시스(BD Bioscience))로 투과화시킨 후, 세포를 IFNγ-APC, IL-2 FITC, 및 TNFα-PE로 염색하였다. 10,000개의 CD8+ 이벤트를 수집하면서, 세포를 LSR 2(BD 바이오사이언시스) 상에서 분석하였다.
폐 조직병리학적 성질
RSV 접종 후 4일째 수거된 파라핀 포매된 포르말린 고정된 폐엽으로부터 마이크로톰을 사용하여 폐 절편(5 ㎛)을 제조하였다. 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 절편을 디지털 방식으로 스캐닝하고, 자격증이 있는 병리학자가 검사하였다. 폐 병변 특징, 예컨대, 세기관지 과다형성, 폐포염, 호산구성 침윤물 및 세기관지주위/혈관주위 공간 침윤 존재에 대하여 폐 절편을 평가하였다.
통계
데이터를 프리즘 그래프패드(Prism GraphPad) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 제시된 데이터는 2회 이상 실시된 실험의 대표값이다. 모든 데이터는 산술 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM: standard error of the mean)로 표시되어 있다. 통계학적 유의 수준은 일원 ANOVA에 의해, 이어서, 컷오프 p<0.05로 터키 사후 검정으로 계산하였다.
결과
1. 애주번트가 첨가된 RSV sF 서브유니트 백신은 BALB /c 마우스에 방어 면역을 부여하고, GLA -SE 애주번트가 첨가된 RSV sF는 Th1 편향된 방어 면역을 유도한 다.
BALB/c 마우스 코호트를, 애주번트 없이, 또는 알룸, GLA, SE, 또는 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 서브유니트 백신으로 2회 용량으로 근육내로 면역화시켰다. RSV A2 바이러스 접종 후, 폐 바이러스 역가를 정량화하였다. 백신 모두, 평균 폐 바이러스 역가가 3.8 log10 pfu/그램인 PBS 대조군과 비교하여 폐 바이러스 역가를 유의적으로 감소시켰다(도 1a). 완전한 방어는 PBS 음성 대조군과 비교하여 100배 감소된 것으로 간주하였다. 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF로 면역화시킨 경우, 마우스에 부분적인 폐 방어를 제공하였고, 동물 7마리 중 4마리가 2.3-3.0 log10 pfu/그램 범위의 검출가능한 폐 바이러스 역가를 가진 반면, 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신은 완전한 폐 방어를 제공하였는데, 그의 평균 바이러스 역가는 생 RSV A2 면역화된 군에서 관찰된 것과 일치하는 1.8 log10 pfu/그램 미만이었다.
모든 RSV sF 애주번트가 첨가된 백신의 경우, 접종 전 혈청 RSV 중화 역가는 유의적으로 증진되었다. GLA-SE, 알룸 및 SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신은 28일째 각각 7.7 log2, 8.1 log2 및 8.1 log2의 최고 RSV 중화 역가를 달성하였다(도 1b). 상기 역가는 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF로 면역화시켰을 때 달성되는 값(4.1 log2) 16배 더 컸다. 그에 반해, GLA 애주번트가 첨가된 RSV sF는 상당한, 그러나, 유의적으로 더 낮은 6.3 log2 중화 역가를 달성하였다. 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 및 생 RSV A2 바이러스에 의한 비내 감염, 둘 모두 검출가능한 혈청 중화 역가(각각 4.1 log2 및 4.6 log2)를 유도하였지만, 상기 반응은 PBS 음성 대조군의 경우에 관찰되는 검출 한계보다 유의적으로 큰 값은 아니었다. 전체 혈청 F 특이 IgG 및 F 특이 IgA에 대한 ELISA 역가는 유사한 경향을 보였다(도 10).
접종 후 4일째 수거된 재자극받은 비장세포로부터 얻은 상청액(n=3마리/군)을 평가하여 각 백신 제제에 의해 유도된 F 특이 CD4+ T 세포의 시토카인 생산 프로파일을 측정하였다. MHC II(I-Ed) 결합 RSV F 유래 펩티드로 재자극시킨 후(문헌 [Olson MR and Varga SM (2008) Pulmonary immunity and immunopathology: lessons from respiratory syncytial virus. Expert Rev Vaccines 7: 1239-1255]), IFNγ를 원형 Th1형 시토카인으로서, IL-5 및 IL-13을 대표적인 Th2형 시토카인으로서, 및 IL-17을 Th17형 시토카인으로서 평가하였다. 예상대로, PBS 대조군 동물로부터의 재자극받은 비장세포는 어떤 F 특이 시토카인 생산도 보이지 않은 반면, 비내로 RSV 감염된 마우스로부터의 것은 약한 IFNγ 우세 반응을 보였다(도 1c). RSV sF + GLA-SE 백신 군은 IFNγ가 우세한, 강력한 RSV F 특이 반응을 유도하였는데, 이는 Th1형 반응을 나타내는 것이었다. 그에 반해, RSV sF + GLA 군은 Th1, Th2, 및 Th17 시토카인을 포함하는, 균형 잡힌 F 특이 반응을 보인 반면, RSV sF, RSV sF + SE, 및 RSV sF + 알룸 군은 IL-5 및 IL-13 시토카인을 특징으로 하는 Th2형 반응을 보였다.
IFNγ는 마우스에서 IgG1에서 IgG2a로의 항체 부류 교환을 촉진시키는 바(문헌 [Xu W and Zhang JJ (2005) Stat1-dependent synergistic activation of T-bet f또는 IgG2a production during early stage of B cell activation. J Immunol 175: 7419-7424]), 본 발명자들은 또한 각 동물로부터의 F 특이 항체의 이소형을 평가하였다. 단 2개의 군만이 F 특이 IgG2a > IgG1 역가를 보였고: RSV sF + GLA-SE 백신화된 군 및 RSV A2 감염으로 프라이밍된 군(도 1d), 상기 두 군 모두 MHC II 유래 F 펩티드에 대하여 IFNγ 우세 반응을 보였다. RSV sF + GLA-SE는 RSV sF 단독 또는 RSV sF + 알룸보다 유의적으로 더 많은 F 특이 IgG2a 항체를 유도하였다.
예컨대, RSV sF + GLA-SE의 경우에 관찰된 것과 같은, 백신에 대한 Th1형 반응이 강력한 CD8 T 세포 반응 발생을 입증할 수 있다. 따라서, 면역우세 MHC I(H2-Kd) 결합 F 유래 펩티드로 재자극하여 32일째에 각 백신 군으로부터의 대표 동물에서 백신화에 대한 CD8 T 세포 반응을 평가하였다(문헌 [Olson MR, Varga SM (2008) Pulmonary immunity and immunopathology: lessons from respiratory syncytial virus. Expert Rev Vaccines 7: 1239-1255]). PBS 대조군에서의 F 특이 CD8 IFNγ ELISPOT 계수는 거의 검출 불가능한 값에 가까운 반면, 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 군에서의 계수는 ~30 스폿 형성 단위(SFU)/106개의 세포(도 1e)였다. 그에 반해, F 특이 CD8 IFNγ ELISPOT 반응은 RSV sF와 비교하여 RSV sF + GLA-SE 백신 군에서 유의적으로 더 컸다(평균: 684, 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF와 비교하여 23배 증가). 다른 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신 제제의 경우, F 특이 CD8 IFNγ 반응은 약간 더 높았지만, 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF와 비교하였을 때, 이는 유의적이지는 않았다. 생 RSV 감염은 단지 100 SFU로 약한 F 특이 CD8 IFNγ ELISPOT 반응을 생성하였는데, 이는, BALB/c 마우스에서 RSV A2에 대한 면역우세 반응이 M2 유래 펩티드에 대한 것인 바, 예상하지 못했던 것은 아니었다(문헌 [Olson MR, Varga SM (2008) Pulmonary immunity and immunopathology: lessons from respiratory syncytial virus. Expert Rev Vaccines 7: 1239-1255]). 상기 반응 세포의 세포용해 잠재능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 ELISPOT에 의해 F 특이 그랜자임 B 분비를 평가하였다. 오직 sF + GLA-SE 백신을 받은 마우스로부터의 비장세포만이 sF 단독을 받은 것에서 관찰된 것(평균 18)보다 유의적으로 더 큰 F 특이 그랜자임 B 반응(평균 197)을 보였다(도 1f). IFNγ, TNFα(효과기 시토카인) 및 IL-2(증식 관련 시토카인)을 공동 발현하는 다기능성 T 세포가 바이러스 제거에 있어 가장 효과적이고, 그 다음은 IFNγ 및 TNFα를 공동 발현하는 T 세포인 것으로 보고되었는 바(문헌 [Seder RA, et al. (2008) T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol 8: 247-258]), 본 발명자들은 세포내 시토카인 염색에 의해 F 특이 CD8 T 세포를 추가로 평가하였다. RSV sF + GLA-SE 백신 군은 삼중 양성 및 IFNγTNFα 이중 양성 세포, 둘 모두를 가장 많은 개수로 포함하였다(도 11).
상기 결과는 RSV sF는 단독으로도 면역원성을 띠지만, RSV sF를 애주번트와 함께 제제화하는 것이 나이브 동물에서 더 높은 역가 중화 항체를 유도하고, RSV sF를 GLA-SE와 함께 제제화하는 것이, 개선된 바이러스 제거에 기여할 수 있는 강력한 F 특이 CD8 T 세포 반응에 대해 프라이밍하는 Th1 편향된 면역을 생성한다는 것을 입증한다.
2. GLA -SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신에 의해 프라이밍된 CD8 T 세포 반응은 강건하다
RSV sF + GLA-SE로의 프라임/부스트 백신화 이후 접종 후에 관찰된 CD8 T 세포 반응은 다양한 항원 및 애주번트 용량에 걸쳐 강건하였다. RSV 접종 후 4일째 수행된 ELISPOT에 의해 검출된 바, 고정량의 GLA-SE(5 ㎍/2%)와 함께 0.3, 7.5, 또는 37.5 ㎍의 RSV sF를 받은 동물은 모두 PBS 대조군과 비교하여 강력한 F 특이 CD8 T 세포를 생성하였다(도 2a). 더 높은 고용량의 RSV sF를 받은 동물에서 더 높은 절대 스폿 계수가 관찰되었다. 다양한 용량(2% SE 중 5 ㎍, 2.5 ㎍, 1 ㎍, 또는 0.5 ㎍)의 GLA-SE와 함께 0.3 ㎍의 RSV sF를 받은 동물은 또한 접종 후 4일째 PBS 대조군 또는 애주번트 단독 대조군과 비교하여 유의적으로 증진된 개수의 F 특이 CD8 T 세포를 보였다(도 2b). 2% SE 중 1-2.5 ㎍ GLA의 애주번트 용량이 최적의 비장 T 세포 반응에 충분하였다.
3. GLA -SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신이 바이러스 노출 없이 F 특이 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 유도한다.
접종 후, 방어를 제공한, RSV sF + GLA-SE 백신에 의해 프라이밍된 F 특이 T 세포가 모든 RSV sF 용량에서 쉽게 검출되었다. 그러나, 0.3 ㎍ 이하의 RSV sF로 백신화된 코호트에서 RSV 접종 이전에 유의적인 개수의 F 특이 T 세포를 검출하기는 어려웠다(데이터 나타내지 않음). RSV 접종의 부재 및 존재 하에서 T 세포 유도를 평가하기 위해, 0일째 및 14일째 마우스를 GLA-SE(2% SE 중 2.5 ㎍ 또는 1 ㎍) 애주번트가 첨가된 10 ㎍의 RSV sF로 백신화하고, 한 코호트는 2차 백신 투여 후 14일째 평가하였고, 또 다른 코호트는 생 RSV 접종 후 4일째 평가하였다. 부스트 후 14일째, F 특이 CD4 및 CD8 T 세포 개수는 PBS 또는 애주번트가 첨가되지 않은 sF 군과 비교하여 sF + GLA-SE 군 둘 모두에서(평균: CD4 반응의 경우, 49-150 SFU/106 및 CD8 반응의 경우, 1,069 - 3,172 SFU/106) 유의적으로 증진되었다(도 3a-b). sF + GLA-SE 군 둘 모두에서 F 특이 CD8 T 세포 개수 또한 sF + SE 군에서 관찰된 것보다 유의적으로 더 컸다. RSV 접종 후, F 특이 CD4 및 CD8 T 세포 개수는 PBS 군과 비교하여 sF + GLA-SE 군 둘 모두에서 유의적으로 증진되었다(도 3c-d). sF + GLA-SE 군 둘 모두에서 F 특이 CD8 T 세포 개수 또한 애주번트가 첨가되지 않은 sF 군에서 관찰된 것보다 유의적으로 더 컸다. 흥미롭게도, F 특이 비장 CD8의 절대 개수는 접종 전 코호트와 비교하여 접종 후 코호트에서 더 낮게 나타났으며, 이는 잠재적으로는 상기 세포의 바이러스 접종 부위에의 재국재화를 나타낸다. 종합해 보면, 상기 데이터는 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 단백질로의 면역화는 생 RSV에의 임의의 노출 이전에 존재하는 전신 F 특이 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 유도한다는 것을 나타낸다.
4. GLA -SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신으로의 백신화에 의해 유도된 CD8 T 세포 반응은 RSV 접종 후 폐로 동원된다
GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF로의 근육내 백신화에 의해 생성된 전신 F 특이 CD8 T 세포를 RSV 접종 후 폐로 수송할 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다. 애주번트가 첨가된 RSV sF(0.3 ㎍)로 백신화되고, RSV A2를 접종받은 마우스에서 유세포 측정 분석을 위해 접종 후 4, 7, 또는 12일째 폐 림프구s (군당 및 각 시점당 n = 3마리)를 수거하였다. RSV sF + GLA-SE로 백신화된 마우스는 접종 후 4일째까지 폐에서 3.39% F 특이 CD8 T 세포를 가졌으며, PBS 면역화된 마우스의 폐에서 관찰된 0.48% F 특이 CD8 T 세포로부터의 유의차가 있었다(도 4a). 상기 F 특이 CD8 T 세포는 우세하게는 IFNγ, TNFα, 및 IL-2에 대하여 삼중 양성(평균 1.75%)이거나, 또는 IFNγ 및 TNF에 대하여 이중 양성(평균 1.5%)이었다. 비교하면, sF + 알룸 백신 군은 상기 시점에서 폐 중 임의 기능의 F 특이 CD8을 단지 1.0%만을 가졌다. RSV sF + GLA-SE로 백신화된 마우스는 접종 후 7일째까지 폐에서 7.28% F 특이 CD8 T 세포를 가졌으며, PBS 면역화된 마우스에서 관찰된 0.44% F 특이 CD8 T 세포로부터, sF + 알룸 면역화된 마우스에서 관찰된 0.87%로부터, 또는 생 RSV 면역화된 마우스에서 관찰된 0.76%로부터의 유의차가 있었다(도 4a). 비록 이 시점까지 우세한 T 세포 집단은 IL-2 생산을 상실함과 동시에 IFNγ 및 TNFα에 대해 이중 양성이었지만, 접종 후 12일째 상기 군에서 폐 국재화된 F 특이 CD8 T 세포의 차이는 유사하게 유의적이었다. IL-2가 결여된 T 세포는 증식성이 더 작기 때문에, 상기 세포는 이환 단계 중 제1 단계 중 하나를 나타낼 수 있다. 상기 데이터는 대조군인 PBS 면역화된 동물, RSV sF +알룸 면역화된 동물, 또는 심지어는 생 RSV 감염된 동물과 비교하여 RSV sF + GLA-SE 군에서 RSV 접종 후 폐로의 다기능성 F 특이 T 세포의 동원이 더욱 빠르게 이루어진다는 것을 나타낸다.
국소 폐 F 특이 반응은 1차 RSV 감염된 동물에서는 약하지만, 폐에서 면역우세 M2 특이 반응은 2차 감염 후 신속하게 발생하였다(도 4b). RSV 재감염 후 4일째까지 전체 폐 CD8 집단 중 12% 초과가 M2 특이적이었으며, 이는 다른 군에서 관찰된 것(<1%)보다 유의적으로 더 높은 수치였다. 상기 M2 특이 CD8 T 세포는 주로 삼중 양성 CD8 T 세포였다. 생 RSV 군 중 M2 특이 CD8 T 세포의 개수는 시간 경과에 따라 유의적으로 변하지 않았지만, 이중 양성 CD8 T 세포는 우세해졌다. RSV 접종 후 7-12일째까지 M2 특이 CD8 T 세포 개수는 PBS, RSV sF + GLA-SE 및 RSV sF + 알룸 면역화된 군에서 증가하였으며, 이는 심지어는 바이러스 복제 부재 하에서도 RSV 접종시 BALB/c 마우스에서 상기 면역우세 에피토프에 대해 CD8 T 세포가 빠르게 유도되었다는 것을 나타낸다.
5. BALB /c 마우스에서 RSV 접종 후 GLA -SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신은 폐 Th2 반응을 막고, 폐 조직병리학적 성질을 악화시킨다.
BALB/c 폐에서 RSV 접종에 대한 Th2형 반응, 특히, IL-13 생산을 특징으로 하는 것은 나이브 동물에서 폐에서의 호산구성 침윤과 상관 관계가 있으며, 조직병리학적 성질을 악화시키는 것으로 보고된 바 있다(문헌 [Johnson TR, et al. (2008) Pulmonary eosinophilia requires interleukin-5, eotaxin-1, and CD4+ T cells in mice immunized with respiratory syncytial virus G glycoprotein. J Leukoc Biol 84: 748-759]). 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신 중 임의의 것이 면역화된 마우스의 폐에서 편향된 시토카인 반응을 유도하였는지 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 RSV 접종 후 4일째 수거된 개별 폐 균질액 중 IL-5, IL-13, IFNγ, IL-17, 및 에오탁신을 측정하였다. 이러한 시토카인 판독 결과는 대식세포, 호산구, B 세포, 및 T 세포를 비롯한, 폐로 동원되는 임의의 면역 세포에 의해 이루어지는 시토카인의 짧은 정보(snapshot)를 제공한다. IL-5 및 IL-13은 오직 애주번트가 첨가되지 않은 sF, SE 애주번트가 첨가된 sF, 또는 알룸 애주번트가 첨가된 sF로 면역화된 마우스의 폐에서만 검출된 반면, IFNγ는 대부분의 군에서 검출되었다. IFNγ:IL-5의 비를 사용하여 Th1/Th2 특징을 표시하였으며, 비가 >1.0인 것은 Th1형 반응이 더 크다는 것을 나타낸다. PBS 면역화된 동물은 RSV 접종 후 상기 조기 시점에 예상된 바와 같이, 테스트된 시토카인 모두를 저수준으로 가졌다(도 5a-f). Th1 반응은 생 RSV 군(평균 IFNγ:IL-5 비: 29.2), GLA 애주번트가 첨가된 sF 군(평균 비: 7.8) 및 GLA-SE 애주번트가 첨가된 sF 군(평균 비: 59.3)에서 관찰되었다. 그러나, Th2형 반응은 애주번트가 첨가되지 않은 sF 군(평균 비: 0.3), SE 애주번트가 첨가된 sF 군(평균 비 0.4), 및 알룸 애주번트가 첨가된 군(평균 비: 0.5)에서 관찰되었다(도 5a-f). 비록 Th17 세포가 각종의 임상전 폐 감염 모델에서 염증 증진 및 방어 증진과 관련이 있기는 하였지만, 면역화된 마우스는 단지 저수준의 IL-17이 검출되었고, 이는 애주번트 사용에 따른 유의적인 변화는 없었다(도 5a-f). 호산구성 침윤물과 관련된 케모카인인 에오탁신(CCL11)(문헌 [Matthews SP, et al. (2005) Role of CCL11 in eosinophilic lung disease during respiratory syncytial virus infection. J Virol 79: 2050-2057])은 PBS 군에서는 135 pg/mL, 및 생 RSV 군에서는 297 pg/mL의 기준선 수준이였다(도 5a-f). 애주번트가 첨가되지 않은 sF 군(평균: 911 pg/mL), SE 애주번트가 첨가된 sF 군(평균: 965 pg/mL), 및 알룸 애주번트가 첨가된 sF 군(평균: 796 pg/mL)을 비롯한, Th2형 면역 반응을 보인 군에서 상응된 폐 에오탁신 수준이 관찰되었다. 그에 반해, Th1형 면역 반응을 보인 군에서의 폐 에오탁신 수준은 기준선 수준으로, GLA-SE 애주번트가 첨가된 sF 군의 경우, 240 pg/mL였다.
호산구성 침윤을 추가로 평가하기 위하여, 각 백신 군으로부터의 폐 절편을 RSV 접종 후 조직병리학적 병변에 대해 점수화하였다. RSV로의 1차 감염을 경험한 동물의 폐에서는 폐 병변이 거의 검출되지 않은 반면, 2차 RSV 감염을 받은 동물에서는 저수준의 폐포염 및 혈관주위 침윤이 관찰되었다(도 6a-f). GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 제제를 받은 동물은 2차 RSV 감염을 경험한 마우스와 유사하게, 낮은 폐 염증 점수를 받았다. 그러나, SE 애주번트가 첨가된 RSV sF, 알룸 애주번트가 첨가된 RSV sF 또는 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF를 받은 동물은 증가된 폐 병변 점수를 가졌다. 상기 데이터들은 모두, GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF로의 면역화에 의해 달성된 관찰된 전신 Th1 편향된 면역 반응은 다른 테스트된 제제와 비교하여 나이브 BALB/c 마우스에서 RSV 접종 후 폐 Th1 편향된 면역 반응, 기준선 폐 에오탁신 수준, 및 폐에서의 낮은 폐 염증에 상응한다는 것을 입증한다.
6. 애주번트가 첨가된 RSV sF 서브유니트 백신이 나이브 코튼 래트에서 RSV 접종으로부터의 완전한 방어를 부여하고, RSV 중화 역가 및 Th1 편향된 세포 매개 면역, 둘 모두를 유도한다.
코튼 래트는 RSV 연구용으로서 잘 확립된 모델이며, 이는 대개 잠재적인 RSV 백신 후보물질의 임상전 평가에 사용된다. 2차 RSV 접종 모델에서 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신의 면역 프로파일을 확인하기 위해, 마우스에 대해 사용된 것과 유사한 용량으로 같은 RSV sF 서브유니트 백신을 개별 코튼 래트에 투여하였다. 애주번트 없이, 또는 GLA, SE, GLA-SE, 또는 알룸 애주번트가 첨가된, 0.3 ㎍의 RSV sF를 0일 및 22일째에 근육내로 제공하였다. 한 코튼 래트 군은 음성 대조군으로서 오직 GLA-SE 단독으로만 면역화시킨 반면, 또 다른 군에는 양성 대조군으로서 0일째에 비내 용량의 1 x 106 pfu의 생 RSV A2 바이러스를 제공하였다.
RSV 접종 후, 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신을 받은 모드 코튼 래트 코호트의 경우, 생 RSV 군과 등가로 폐에서 완전하게 방어가 이루어졌고, 평균 RSV 역가 <2 log10 pfu/그램으로, 이는 위약군(5.5 log10 pfu/그램)과 비교하여 RSV 역가가 1,000배 감소된 값이었다(도 7a). 마우스에서 관찰된 것과 대조적으로, 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF로 면역화한 것은 코튼 래트를 RSV 접종으로부터 방어하지 못했다. 상기 동물의 폐에서의 평균 바이러스 역가(5.4 log10 pfu/그램)는 위약 대조군의 것과 유사하였다. 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신은 또한 코튼 래트의 상기도(코)를 RSV 접종으로부터 방어할 수 있었다. sF + GLA-SE로 백신화된 코호트는 생 RSV 군의 것과 등가로, 코에서 완전한 방어를 보였는데, 이 둘 모두 평균 RSV 역가 <1 log10 pfu/그램으로, 이는 위약군(5.1 log10 pfu/그램)과 비교하여 RSV 역가가 1,000배 감소된 값이었다(도 7b). 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 백신 군(4.9 log10 pfu/그램) 또는 위약군과 비교하여 감소가 모두 유의적이기는 하였지만, sF + GLA(평균 2.7 log10 pfu/그램), sF + SE(평균 1.4 log10 pfu/그램), 또는 sF + 알룸(평균 2.1 log10 pfu/그램)을 받은 군에서 상기도의 부분적인 방어가 관찰되었다.
GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신 군의 코튼 래트가 42일째 평균 14.7 log2로 최고 RSV 중화 역가를 생성하였다(도 7c). 이는 SE 애주번트가 첨가된 RSV sF를 제외한, 임의의 다른 백신 제제보다 유의적으로 높았다. 높은 중화 역가는 또한 GLA 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신 군(평균 11.7 log2), SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신 군(평균 13.3 log2) 및 알룸 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신 군(평균 12.9 log2)에 대해서도 관찰되었다. 이러한 역가는 생 RSV A2 바이러스의 비내 감염에 의해(평균 9.7 log2), 또는 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF로의 근육내 면역화에 의해(평균 4.3 log2) 달성되는 것보다 유의적으로 더 큰 값이었고, 이는 높은 역가 혈청 RSV 중화 항체를 유도하는 데 있어 애주번트가 첨가된 RSV sF가 더 우수하다는 것을 나타내는 것이다. 초기 백신화 후 42일째 전체 F 특이 IgG ELISA 역가 또한 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 군 또는 생 RSV 군에서보다 SE, GLA-SE, 또는 알룸 애주번트가 첨가된 RSV sF 군에서 더 높았다(도 7d).
전체 RSV sF 단백질로 재자극시킨 후, IFNγ ELISPOT에 의해 코튼 래트에서의 T 세포 반응을 측정하였다. GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 군(평균: 2,626 SFU/106개의 세포)에서 가장 강력한 F 특이 IFNγ ELISPOT 반응이 검출되는데, 이는 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF(평균: 58 SFU/106)에 비해 45배 증가된 값이었고, 상기 군은 임의의 다른 백신 코호트에서 관찰된 것보다 유의적으로 더 강력한 반응을 보였다(도 7e). 비록 검출가능하기는 하였지만, sF 특이 IFNγ 반응은 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 군과 비교하여 GLA(평균: ~7 스폿/106), SE(평균: ~642) 또는 알룸(평균: 1,246)에 의해 유의적으로 증진되지는 않았다. 생 RSV 감염 군은 196 스폿의 상대적으로 낮은 비장 sF 특이 IFNγ ELISPOT 반응을 생성하였다. 이 결과는 BALB/c 마우스 모델에서 관찰된 것과 유사하였다.
ELISPOT에 의해 측정된 바와 같이 IFNγ:IL-4 특이 반응의 비를 사용하여 코튼 래트에서의 세포성 면역 반응의 Th1 편향을 측정하였다. 각 군에 대하여 생성된 IFNγ:IL-4 비는 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF가 가장 Th1 편향된 세포 반응을 생성한 반면(비: 26.9), 다른 것은 1 내지 10 정도인 것으로 나타났다(도 7f). 코튼 래트에서의 이러한 Th1 편향은 BALB/c 마우스에서 관찰된 것과 유사하다.
마우스 연구에 대해 기술된 바와 같이, RSV 접종 후 4일째 모든 동물로부터 수집된 코튼 래트 폐 절편에서 RSV 폐 병리와 관련된 호산구성 침윤 및 다른 조직병리학적 폐 변화를 평가하고, 점수화하였다(도 8). 2차 RSV 감염 후 생 RSV 감염 군에서 관찰된 것보다 유의적으로 더욱 중증인 조직병리학적 성질 어느 것도 코튼 래트의 임의의 백신화된 군에서 관찰되지 않았다.
논의:
본 연구는 근육내로 투여되는 정제된 RSV sF 단백질을 함유하는 GLA-SE-애주번트가 첨가된 백신은, RSV 감염 후, 어떤 면역병리학적 징후 없이, BALB/c 마우스 및 코튼 래트를 RSV 접종으로부터 완전하게 방어함과 동시에 고도로 면역원성을 띠고, 다기능성 CD8+ T 세포를 특징으로 하는 강건한 Th1 편향된 세포 반응 및 높은 중화 역가, 둘 모두를 생성하다는 것을 입증한다. 그에 반해, 알룸 또는 SE 애주번트가 첨가된 RSV sF는 높은 중화 역가를 특징으로 하는 방어 반응을 유도하였지만, 약하고, 폐 염증의 지표와 관련된 Th2 편향된 세포 반응을 유도하였고, 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF는 단지 BALB/c 마우스에 대해 부분적인 RSV 방어만을 제공하였다. 본 연구를 통해 재조합 RSV sF는 융합 후에 가능하며, 마우스에서 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF는 임상 RSV A 및 B 단리물에 대하여 강건한 교차 중화 항체를 유도한다는 것을 확인할 수 있다(데이터 나타내지 않음).
실시예 2a: 1x RSV 혈청 반응 양성 BALB /c 마우스에서의 RSV sF의 면역원성
본 연구는 RSV 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 RSV 특이 면역 반응을 부스팅하고, 유지시킬 수 있는 능력에 대하여 애주번트와 함께, 또는 애주번트 없이, RSV sF 당단백질의 용량 반응을 평가하였다. 본 연구 목적은 (1) 단회 백신 투여 후 RSV 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 면역 반응을 부스팅하는 데 충분한 RSV sF 용량을 측정하고; (2) 천연 RSV 감염 후 RSV 면역 반응을 부스팅하는 데 있어 RSV sF 백신 중 GLA-SE 애주번트를 평가하고; (3) RSV sF 백신에 의해 유도된 부스팅된 F 특이 면역 반응의 수명을 측정하는 것이었다.
RSV sF 인간 균주 A2(서열 번호 2)의 RSV F 인간 균주 A2 단백질(즉, 아미노산 525-574)의 50개의 아미노산 C 말단 막횡단 도메인을 결실시킴으로써 RSV sF(서열 번호 7)를 생성하였다. 백신 연구 개시 이전에 한번 비내로 제공된 생 RSV 바이러스 투여에 의해 마우스를 혈청 반응 양성으로 만들었다. RSV sF 단백질을 안정하게 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포로부터 제조하고, 면역 친화도 정제하고, 0.4 ㎍, 2 ㎍, 또는 10 ㎍으로 애주번트가 첨가되지 않은 상태로, 또는 안정한 에멀젼 중 글루코피라노실 지질 A(GLA-SE) 애주번트가 첨가된 상태로 1일에 걸쳐(0일째) 근육내로 암컷 BALB/c 마우스에 투여하였다. 0일째(기준선) 및 백신화 후 10주 동안 매 2주마다 혈청학적 항F 항체 반응 및 RSV 중화 항체 반응을 측정하였다. F 특이 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 동물의 대표 서브세트(n=3마리/군)에서 백신화 후 10일째 측정하고, 다시 백신화 후 10주 후 RSV 접종 후에 측정하였다. RSV 접종 후 국소 폐 특이 면역은 항체 및 시토카인의 존재로 입증되었다.
본 연구 결과, 애주번트와 함께, 또는 애주번트 없이 투여된 RSV sF는 항원 용량에 의존하는 방식으로 RSV에 대해 체액성 면역 반응을 부스팅하였고, GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 또한 항원 용량에 의존하는 방식으로 CD8 특이 면역 반응을 부스팅한 것으로 나타났다. 추가로, 본 연구 결과, 상기 부스팅된 반응은 면역화 후 10주 이상 동안 유지된 것으로 나타났다. 따라서, 본 연구는 RSV sF + GLA-SE가 백신화 이전에 실험적으로 RSV로 감염된 마우스에서 체액성 및 세포성 면역 반응, 둘 모두를 부스팅하였다는 것을 나타내며, RSV sF는 심지어 RSV 혈청 반응 양성 개체에서도 광범위한 RSV 면역 반응을 부스팅하는 데 있어 강력한 후보물질 백신이 된다는 증거를 제공한다. RSV 인간 균주 A2(서열 번호 2)의 막횡단 도메인이 결여된 가용성 F(sF) 단백질 구성물(서열 번호 7)을 조작하고, 안정한 클론성 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주로부터 발현하여 면역친화도 정제를 사용함으로써 항원적으로 무손상인 고도로 정제된 단백질을 생성하였다.
RSV 백신 평가를 위해 광범위하게 사용되는 모델은 BALB/c 마우스로서, 이는 RSV 허용성이 더 큰 마우스 계통 중 하나이다. 효과적인 RSV 제거와 상호 관련된 것으로 여겨지는 면역 반응에 대한 심층 분석을 허용하는 BALB/c 마우스 모델에 대해 시약이 이용가능하다(문헌 [Connors et al., Resistance to respiratory syncytial virus (RSV) challenge induced by infection with a vaccinia virus recombinant expressing the RSV M2 protein (Vac-M2) is mediated by CD8+ T cells, while that induced by Vac-F or Vac-G recombinants is mediated by antibodies. J Virol. 1992; 66:1277-81]). (조직 배양물에서 RSV A 및 RSV B 균주 감염, 둘 모두를 차단하는) RSV에 대한 상호 중화 항체가 마우스에서 생성되고, 마우스 및 인간 혈청, 둘 모두 RSV 감염 이후 상호 중화 RSV 항체를 함유한다. 인간과 같이 BALB/c 마우스는, 잔류 감염 세포를 제거할 수 있고, 질환을 제한할 수 있는, RSV F 당단백질에 대한 CD8+ T 세포 반응을 증가시킬 수 있다(문헌 [Olson and Varga, Pulmonary immunity and immunopathology: lessons from respiratory syncytial virus. Expert Rev. Vaccines 2008; 7(8):1239-55]). 이러한 F 특이 CD8 T 세포는 BALB/c 마우스에서 F 당단백질의 면역우세 에피토프인 KYKNAVTEL(서열 번호 12)에 대해 검출될 수 있다(문헌 [Olson and Varga, Pulmonary immunity and immunopathology: lessons from respiratory syncytial virus. Expert Rev. Vaccines 2008; 7(8):1239-55]). CD4+ T 세포 반응은 중화 항체 및 CD8+ T 세포, 둘 모두의 생성에 영향을 주는 시토카인을 생산하며, 여기서, Th1형 시토카인, 예컨대, IFNγ는 Th2형 시토카인, 예컨대, IL-4, IL-5, 및 IL-13보다 더욱 효과적인 세포성 항바이러스 반응과 관련이 있다. Th1 반응은 국소 바이러스 감염 부위에서, 또는 항원 재자극받은 비장 배양물로부터 생산되는 시토카인의 형태로 직접, 또는 항체 이소형에 의해 간접적으로 측정될 수 있는데, 여기서, 마우스 IgG2a 이소형이 더 큰 Th1형 반응과 관련이 있다. 젊은 사람과 비교하여 노년기에서 관찰되는 T 세포 결함을 극복하고, Th2 편향은 막으면서(문헌 [Liu et al., Local immune response to respiratory syncytial virus infection is diminished in senescence-accelerated mice. J. Gen. Virol. 2007; 88:2552-8]), 동시에 RSV 질환 감소에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀진 중화 항체를 유도하면서, 노년기에서 RSV 특이 세포성 반응을 부스팅하는 데 충분히 면역원성을 띠는 백신 제제를 선별하기 위해 BALB/c 마우스에서의 임상전 동물 평가를 디자인한다.
글루코피라노실 지질 A/안정한 에멀젼(GLA-SE)은 나이브 BALB/c 마우스에서 2회 투여 백신 요법으로 RSV sF에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응의 유도를 증진시키는 것으로 입증된, 조합 애주번트(이뮨 디자인 코포레이션(Immune Design Corporation: 미국 워싱턴주 시애틀))이다. 본 연구에서, 본 발명자들은 백신화 이전에 실험적으로 RSV로 감염된 BALB/c 마우스에서 면역 반응을 부스팅하는 데 단회 투여 RSV sF 백신화 요법에 애주번트가 필요한지 여부를 측정하였다.
평가된 백신 제제는 애주번트 GLA-SE와 함께, 및 그를 포함하지 않고, 0.4 ㎍, 2 ㎍, 및 10 ㎍으로 RSV sF를 포함하였다. 이를 대조군 RSV 혈청 반응 음성 동물, 위약 백신을 받은 혈청 반응 양성 동물, 및 부스터로서 2차 RSV 감염을 받은 혈청 반응 양성 동물과 비교하였다. 평가된 면역 파라미터로는 RSV sF에 대한 혈청 항체 반응(전체, IgG1/IgG2a, 및 바이러스 중화 역가), 백신화 후, 및 백신화 후 10주 회상 접종 후의 F 특이 인터페론 감마(IFNγ) 특이 CD8 T 세포 반응, 상기 두 시점에서의 F 특이 Th1/Th2 시토카인 생산 CD4 T 세포, 및 회상 접종 후 4일째 폐 시토카인 수준 및 F 특이 항체를 포함한다.
나이브 암컷 BALB/c 마우스를 각각 8-9마리의 마우스로 이루어진 지정된 백신 코호트로 나누고, 0일째 투여하였다. 9개의 군 중 8개에 백신 투여 전 28일째 비내로 106 PFU 생 RSV A2 바이러스를 접종하여 RSV 혈청 반응 양성 동물을 생성하였다. 0일째 F 특이 ELISA 종점 역가에 의해 성공적인 혈청전환을 확인하였다. 9마리의 마우스로 이루어진 군에 0일째 백신 제제를 근육내(IM)로 접종하였다. 접종 후 10일째 군당 마우스 3마리씩 세포성 면역 반응에 대해 평가하였고, 군당 남은 5-6마리의 동물은 73일째까지 혈청 항체 반응에 대해 추적 조사하였다. 69일째 남은 동물에 생 RSV A2 바이러스를 비내로 접종하여 접종 후 4일째(73일째) 잔류 회상 세포성 면역 반응을 평가할 수 있도록 하였다.
GLA-SE를 포함하거나, 또는 포함하지 않는, 3개의 상이한 용량의 RSV sF 서브유니트 백신을 평가하였다. 사용된 용량은 마우스당 0.4 ㎍, 2 ㎍, 및 10 ㎍의 서브유니트 단백질이었는데, 이는 나이브 BALB/c 마우스에서 사용되는 범위를 포괄하며, 이는 RSV sF 당단백질의 제안된 최저 임상 용량(10 ㎍)을 포함한다. 애주번트가 첨가된 군에서 GLA-SE는 5 ㎍의 2% SE 중 GLA 용량으로 제공되었다. 0일째 106 PFU 생 RSV A2 바이러스를 비내로 부스터 감염을 받은 혈청 반응 양성 마우스가 양성 대조군으로서의 역할을 하였고, 음성 대조군은 위약으로서 PBS를 접종 받은 혈청 반응 양성 군, 및 위약으로서 PBS를 접종 받은 혈청 반응 음성 군을 포함하였다.
각 군에 대해 0, 14, 28, 42, 56, 및 73일째 혈청 테스트에 대해 판독하였다. 동물을 이소플루란으로 약하게 마취시키고, 안와내로 출혈시켰다. 혈청을 분리하고, -20℃에서 보관하고, 테스트를 위해 해동시켰다. 각 시점에 전체 항F IgG를 측정하고, 0일 및 42일째에 항F IgG1 및 항F IgG2a ELISA 종점 희석 역가를 측정하였다. RSV A2 GFP 미세중화 검정법에 의해 RSV 중화 역가를 측정하였다. 42일째 RSV F에 대한 부위 특이 단일클론 항체와의 경쟁 ELISA에 의해 항F IgG 반응의 다중클론 성질을 평가하였다. 14일째 각 군에 대한 항F IgA 종점 희석 역가를 측정하였다.
백신화 후 10일째 대표 동물에서 백신화에 대한 전신 세포성 면역 반응을 평가하였다. 69일째 추가의 대표 동물을 바이러스 접종으로 회상시키고, 73일째인 바이러스 접종 후 4일째 장기간 세포성 면역 반응에 대하여 평가하였다. 각 군에 대해, 3-5개의 개별 비장세포 샘플을 제조하였다. RSV sF로의 72시간 동안 재자극 기간 이후 분비된 시토카인(IFNγ, IL-5, IL-10, IL-13, 및 IL-17 포함) 패널의 상청액 수준의 다중 시토카인 분석에 의해 CD4 T 세포 판독 결과를 평가하였다. CD8 T 세포 판독 결과는 2가지 방법: F 유래 CD8 펩티드(KYKNAVTEL aa 85 - 93)(서열 번호 12)로의 36-48시간의 재자극 기간 후 IFNγ 분비 세포의 ELISPOT 계수, 및 F 유래 CD8 펩티드로의 5시간의 재자극 기간 후 F 특이 다기능성(IFNγ+ TNFα+ IL-2+) CD8 T 세포의 세포내 염색 및 그의 비율(%) 정량에 의해 평가하였다.
73일째인, 접종 후 4일째 채취된 개별적으로 수거되 균질화된 폐 상에서 바이러스 접종에 대한 폐 특이 반응을 평가하였다. 폐 균질액 중 시토카인 수준(IFNγ, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, 에오탁신)을 국소 세포성 면역 반응의 바이오마커로서 측정하였다. ELISA 종점 역가에 의해 폐 균질액 중 F 특이 IgA 및 IgG 항체를 측정함으로써 항체 반응은 폐로 표적화됨을 밝혔다. 유의 수준 컷오프 p<0.05로 터키 사후 검정과 함께 그래프패드 프리즘 일원 ANOVA를 사용하여 유의 수준을 계산하였다.
결과
백신화 전 28일째 고용량의 106 pfu RSV A2 바이러스로 RSV 혈청 반응 양성 군(군 2-10)을 비내로 감염시켰다. 0일째 F 특이 IgG 종점 ELISA 역가에 의해 상기 동물에서 RSV 혈청전환을 확인하였다. 0일째 모든 혈청 반응 양성 동물은 검출가능한 F 특이 IgG를 가졌고, 군의 평균 종점 역가 범위는 12.81 - 15.36(평균 14.60)이었다. 그에 반해, 대조군 혈청 반응 음성 군은 5.64의 중앙 역가를 가졌다(도 14). 혈청 반응 양성 동물 대부분은 또한 0일째 3.07-3.88의 평균 log2 50% 플라크 감소 역가로, 낮지만, 검출가능한 중화 항체 역가를 가졌고, 3.07-3.88의 평균 log2 50% 플라크 감소 역가를 가졌다.
0일째 모든 동물에게 백신을 제공하였다. (10% SE로 GLA-SE[10% SE 중 1 mg/mL]를 희석하여 생성된) 10% SE 중 250 ㎍의 GLA의 작업 스톡을 사용하여 100 ㎕의 2% SE 중 5 ㎍ GLA의 최종 백신 용량을 수드하였다.
백신화 후 14, 28, 42, 및 73일째에 부스팅된 F 지시된 항체 반응을 평가하고, 각 백신 코호트에 대해 0일째 기준선 혈청학적 판독 결과와 비교하였다. 14일째 전체 항F 혈청 IgG 역가는, 항원 용량 또는 GLA-SE를 포함하는 그의 제제와는 상관없이 sF 백신을 받은 모든 혈청 반응 양성 동물이 역가 부스트와 함께 빠르게 반응하였다는 것을 나타내었다(도 14). 혈청 IgG 역가 4배 부스트는 유의적인 것으로 간주된다. 역가가 그들 간에 걸쳐 일관되게 가장 높았던 시점(일째)인 14일째 관찰된 부스트 범위는 13 내지 137배였다. PBS 백신을 받은 혈청 반응 양성 마우스는 IgG 역가 4배 부스트 미만을 가졌고, 생 RSV 감염으로 부스팅된 것은 IgG 역가 4배 부스트에 가까웠다. 흥미롭게도, 애주번트 없이 상이한 용량의 RSV sF를 받은 군과, 상이한 용량의 RSV sF + GLA-SE를 받은 군 사이에 유사한 전체 F 특이 IgG 역가가 관찰되었다. 부스팅된 항F IgG 역가는 73일째 모든 군에서 15배를 초과하였고, 어떤 용량 또는 애주번트 증진된 차이도 관찰되지 않았다(도 14).
다중 시점에 혈청 RSV 중화 역가 또한 평가하였다. 0일째 상이한 군의 RSV 혈청 반응 양성 동물에 대한 평균 log2 50% 플라크 감소 역가 범위는 3.07-3.88이었다(도 15). 백신화 후 14일째까지 생 RSV, RSV sF, 또는 RSV sF + GLA-SE로 면역화된 동물은 그의 0일째 값에 비하여 부스팅된 중화 역가를 가졌다(도 15). 역가 4배 부스트는 유의적인 것으로 간주된다. 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 백신을 받은 혈청 반응 양성 마우스는 RSV 중화 역가 15 내지 28배 부스트를 보인 반면, GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신을 투여받은 것은 중화 역가 53 내지 85배 부스트를 보였다. 그에 반해, PBS 백신을 받은 혈청 반응 양성 마우스는 14일째 중화 역가 2배 미만의 증가를 보였고, 생 RSV로 2차 감염된 것은 단지 중화 역가 7배 부스트를 보였다. 이는 RSV sF 백신이 혈청 반응 양성 마우스에서 RSV로의 재감염보다 더 큰 정도로 중화 역가를 부스팅하였다는 것을 나타낸다. 각 용량 군에 대한 14일째 평균 RSV 중화 역가는 서로 2배 이내였기 때문에(애주번트가 첨가되지 않은 용량의 경우, 8.32, 7.82, 및 8.66, 및 애주번트가 첨가된 용량의 경우, 9.32, 8.82, 및 9.49), RSV sF의 양(0.4-10 ㎍)은 상기 유도에는 중요하지 않았다. 적절한 애주번트가 포함되지 않은 경우, RSV sF 백신에 의해 극소수의 중화 항체가 유도된 나이브 마우스에서 관찰된 것과는 대조적으로, RSV 혈청 반응 양성 마우스에서는 애주번트를 포함하는 것이 부스팅된 중화 항체를 단지 ~2배 정도 증진시켰다. 각 군에 대한 중화 역가는 73일째까지 중 14일째 값의 80%로 유지되었고, 일부 경우에서는 시간 경과에 따라 증가하였다(도 15). 이는 기능성 체액성 면역이 면역화 후 10주 이상 동안 지속된다는 것을 나타낸다.
혈청 IgA는 생 마우스에서 점막 IgA보다 더욱 쉽게 측정될 수 있고, 점막 IgA 수준을 나타낼 수 있다. 백신화 후 14일째, 혈청 반응 음성 동물은 검출 한계 미만 이하인 매우 F 특이 IgA 역가를 가졌지만, 모든 혈청 반응 양성 동물은 검출가능한 F 특이 IgA를 가졌다(도 16). RSV sF(10 ㎍) 또는 3가지 용량 중 임의 용량의 RSV sF + GLA-SE로 백신화된 혈청 반응 양성 동물은 PBS로 백신화된 혈청 반응 양성 동물보다 유의적으로 더 높은 혈청 F 특이 IgA 역가를 생성하였다. 2차 RSV A2 생 감염으로 부스팅된 혈청 반응 양성 동물 또한 유의적으로 더 높은 혈청 F 특이 IgA 역가를 보였다. 이는 RSV sF + GLA-SE 백신이 혈청 반응 양성 동물에서 혈청 IgA 역가를 부스팅할 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
백신화 이전 및 이후의 혈청 반응 양성 동물의 T 헬퍼 유형 균형을 측정하기 위하여 0일 및 42일째 혈청 F 특이 항체를 또한 IgG1 및 IgG2a 이소형에 대하여 평가하였다. F 특이 IgG1 역가(Th2형 서브타입) 및 F 특이 IgG2a(Th1형 서브타입) 역가 모두 28일째 혈청 반응 양성 동물에 존재하였다(도 17). IgG2a 역가는 백신화 이전 혈청 반응 양성 동물에서 우세하게 나타났고, 받은 백신 제제와 상관없이 백신화 후 42일째에도 계속 우세하게 유지되었다(도 17). 이는 애주번트 없이 제공된 RSV sF 백신은 주로 IgG1 반응을 유도하고, IgG2a 편향된 것을 유도하기 위해서는 GLA-SE 애주번트를 포함하여야 하는 나이브 동물에서의 이전 연구와는 대조를 이룬다.
RSV sF 백신이 혈청 반응 양성 마우스에서 RSV sF의 공지된 중화 항원성 부위에 대한 다중클론 혈청 항체를 부스팅하였는지 또한 측정 연구하기 위해, 경쟁 ELISA 검정법을 사용하여 부위 A, B 및 C 특이 mAb의 RSV sF 항원 상의 표적 에티포프에의 결합을 차단시킬 수 있는 그의 능력을 측정함으로써 백신화 후 혈청의 다중클론성을 평가하였다. 모든 테스트 군으로부터의 혈청은 부위 A 및 부위 C 항체와 강력한 경쟁, 및 부위 B 항체와 검출가능한 경쟁을 보였으며, 이는 다중클론 RSV F 유래 반응을 나타낸다(도 18). 각 RSV sF 백신화된 군(±GLA-SE 애주번트)으로부터의 혈청은 부위 A 및 부위 C 결합에 대해 경쟁하는 데 있어 PBS 또는 생 RSV로 부스팅된 혈청 반응 양성 동물로부터의 혈청보다 더 우수하였으며, 이는 자연 감염에 비해 우수한 RSV sF 백신의 이점을 나타낸다. 흥미롭게도, 부위 B 결합에 대한 경쟁은 애주번트 및 RSV sF 용량에 의존적이었다. 2 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량으로 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF를 받은 마우스로부터의 혈청은 그의 매칭되는 애주번트가 첨가되지 않은 군으로부터의 혈청과 비교하여 유의적으로 증진된 부위 B 경쟁 반응을 보였다(도 18).
두 별개의 시점에서 전신 CD4 T 세포 면역 반응을 평가하였다. 백신화 후 10일째, 각 군의 3마리 동물로부터 비장세포를 수거하고, 72시간 동안 RSV sF-단백질로 재자극시키고, 바이오플렉스에 의해 시토카인을 측정하였다. 혈청 반응 음성 군이 테스트된 패널들 간에는 F 특이 시토카인 반응을 일으키지 않은 반면, F 특이 IFNγ(Th1 시토카인)는 10일째 모든 혈청 반응 양성 군에서 검출되었다(도 19). 반응 크기는 애주번트가 첨가되지 않은 sRSV F를 받은 혈청 반응 양성 마우스와 비교하여 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 군에서 더욱 크게 나타났다. IFNγ와 비교하여, IL-5(Th2 시토카인), IL-10(Th0 시토카인), 및 IL-17(Th17 시토카인)은 단지 매우 낮은 수준으로만 검출되었고, 이는 혈청 반응 양성 동물이 사용된 백신과는 상관없이 Th1 편향된 반응을 보였다는 것을 나타낸다. CD4 T 세포 면역 반응을 또한 73일째인 RSV로의 회상 감염 후 4일째에 평가하였다. 비장세포를 각 군 중 3-5마리 동물로부터 수거하고, 바이오플렉스에 의해 시토카인 반응을 측정하였다. 또한, 강력한 Th1 반응을 나타내는 F 특이 IFNγ가 관찰되는 우세한 시토카인이었고, 대표적인 Th0, Th2, 또는 Th17 시토카인은 저수준으로 나타났다(도 19). 본 결과는 상기 혈청 반응 양성 마우스에서 관찰되는 F 특이 IgG1/IgG2a 역가와 일관되는 결과이며, 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 백신이 Th2형 면역 반응을 유도한 나이브 마우스에서 관찰된 것과는 대조를 이룬다. 본 데이터는 혈청 반응 양성 마우스 모델에서 초기의 RSV 감염에 의해 설정된 Th1 편향이 RSV F 백신에 대한 추후의 부스팅된 반응의 특징을 알려준다는 것을 제안한다. 이러한 Th1 편향은 모델이 RSV 감염에 대한 사전 경험이 있는 건강한 성인을 보다 잘 나타낼 수 있지만, RSV에 대하여 혈청 반응 양성인 면역노화된 노년기 집단에서의 백신 반응을 반영할 수 없다는 것을 제안한다.
같은 두 시점에 각 군의 동물에서 CD8 T 세포 면역 반응을 평가하였다. 백신화 후 10일째, CD8 F 펩티드 재자극으로 군단 동물 3마리씩 IFNγ ELISPOT에 의해 평가하였다. 위약군에는 F 특이 CD8 반응이 결여되었던 반면(0 SFU/106개의 세포), 혈청 반응 양성 동물에서는 69 SFU/106으로 낮은 검출가능한 CD8 반응이 나타났다(도 20). 그에 반해, 애주번트가 첨가되지 않은 sF를 투여받은 군은 용량 의존성 F 특이 CD8 IFNγ 반응을 보인 반면(평균 72-224 SFU/106), sF + GLA-SE를 투여받은 군은 더욱 큰 규모의 용량 의존성 F 특이 CD8 IFNγ 반응을 보였다(평균 171-1,699 SFU/106). 애주번트가 첨가된 최고 용량의 RSV sF에서, 관찰된 CD8 반응의 크기(1,699 SFU/106)는 같은 용량의 애주번트가 첨가되지 않은 것(224 SFU/106)보다 유의적으로 더 높았고, 생 RSV 부스팅된 군에서 관찰된 것보다(145 SFU/106) 훨씬 더 높았다(도 20). 상기 CD8 IFNγ ELISPOT 반응은 최고인 것으로 측정되었다. IFNγ, TNFα(효과기 시토카인), 및 IL-2(생존 시토카인)을 특징으로 하는 다기능성 CD8 T 세포 반응에 대한 세포내 유세포 분석에 의해 모든 군들을 또한 평가하였다. 다기능성 CD8 T 세포 존재는 바이러스 방어와 상관 관계가 있으며, 이는 상기 세포가 바이러스에 의해 감염된 세포를 제거하는 데 있어 더욱 효과적일 수 있다는 것을 제안한다(문헌 [Betts et al., HIV nonprogressors preferentially maintain highly functional HIV-specific CD8+ T cells. Blood. 2006; 107(12):4781-9]). IFNγ ELISPOT 반응으로부터 예상한 바와 같이, 유의적인 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 용량 의존성 CD8 반응이 관찰되었다. 10 ㎍의, 애주번트가 첨가된 RSV sF로 부스팅된 혈청 반응 양성 마우스는 모든 CD8 T 세포 중 0.49%의 빈도로 삼중 양성 다기능성 항F CD8 T 세포를 보였다. 모든 CD8 T 세포 중 0.62%는 이중 IFNγ 및 TNFα F 특이 활성을 보였다. 이는 혈청 반응 음성 위약군(0.01-0.02%)에서의 F 펩티드 재자극된 반응의 평균 빈도의 3x 기준으로 역치 수준(0.03-0.06%)을 쉽게 능가하였다(도 20). 검출가능한 삼중(0.13%) 및 이중(0.27%) 양성 다기능성 F 특이 CD8 T 세포 또한 GLA-SE 애주번트가 첨가된 2 ㎍의 RSV sF를 투여받은 군에서 검출되었다(도 20).
CD8 반응의 지속성을 평가하기 위해, 73일째(RSV 접종 후 4일째) 두 방법에 모두에 의해 회상 CD8 T 세포 면역 반응에 대하여 군당 3-5마리의 마우스를 평가하였다. IFNγ ELISPOT에 의해 sF + GLA-SE를 투여받은 군에서 용량 의존성 F 특이 CD8 IFNγ-반응(평균 142-598 SFU/106)이 검출되었다(도 21). 역시 용량 의존성 CD8 IFNγ 반응(62-243 SFU/106)을 보인, 매칭되는 애주번트가 첨가되지 않은 sF 군에서 관찰된 것보다 더 컸다. 그에 반해, 혈청 반응 음성 대조군은 어떤 IFNγ 반응도 보이지 않았고(~4 SFU/106), 혈청 반응 양성 마우스를 PBS(35 SFU/106), 또는 생 RSV A2(61 SFU/106)로 부스팅하였을 때에는 더 낮은 반응이 관찰되었다. 애주번트가 첨가된 최고 용량의 RSV sF를 받은 군에서는 세포내 유세포 측정 결과 강력한 다기능성 F 특이 CD8 T 세포가 검출되었다(0.25% 삼중 양성 및 0.25% 이중 양성)(도 21). 반응 크기는 백신화 후 10일째 검출된 것보다 약간 낮았지만, 데이터 결과, F 특이 CD8 반응은 백신화 후 10주째에도 회상될 수 있는 것으로 나타났다.
RSV 접종 후 국소 폐 환경에서 면역 반응의 Th1 특징 지속성을 확인하기 위해, 73일째 폐 균질액을 사용하여 시토카인, 예컨대, IFNγ, IL-5, IL-13, IL-10, IL-17, 및 에오탁신 수준을 평가하였다(도 22). 상기 시토카인 판독 결과는 대식세포, 호산구, B 세포, 및 T 세포를 비롯한, 폐로 동원되는 임의의 면역 세포에 의해 이루어지는 시토카인의 짧은 정보를 제공한다. 혈청 반응 양성 면역화된 마우스로부터의 폐 균질액 중에서 검출된 주요 시토카인은 IFNγ였고, 회상 RSV 접종 후 IL-5, IL-10, IL-13, 또는 IL-17은 극소량 검출되었다. 나이브 동물에서 폐 면역병리학적 성질과 관련 호산구의 주화성을 유도할 수 있는 시토카인인 에오탁신은 모든 군에서 RSV 감염에 대한 1차 반응이 상승된 혈청 반응 음성 나이브 동물의 것과 유사한 수준으로 발현되었다. 상기 데이터는 백신화된 혈청 반응 양성 동물에서의 폐 면역 반응이 전신 면역 반응의 특징을 반영하고, 호산구 증가증의 위험은 낮은 상태로, Th1 편향된 그대로 유지된다는 것을 나타낸다.
결론
본 연구에서는 항원 용량 0.4-10 ㎍의, 애주번트가 첨가되지 않은 또는 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 접종이 RSV 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 혈청학적 면역 판독 결과를 유의적으로 부스팅시킬 수 있다는 것으로 나타났다. RSV 미세중화 검정법에 의해 중화 항체가 검출되었고, 이는 백신화 후 10주 동안 지속되었다. RSV sF에 대한 세포성 CD8 면역은 항원 용량 의존성이고, GLA-SE 애주번트를 필요로 하는 것으로 관찰되었고, 최고 용량(10 ㎍)의 RSV sF + GLA-SE에서의 혈청 반응 양성 마우스에서 유의적으로 부스팅된 개수의 다기능성 CD8 T 세포를 보였다. 이는 백신화 10일 이내에, 및 백신화 후 10주 회상 접종 이후에, 둘 모두의 시점에 관찰되었다. Th1 편향 애주번트 GLA-SE는 상기 혈청 반응 양성 모델에서 CD8 T 세포, 혈청 RSV F 부위 B 특이 항체, 및 혈청 F 특이 IgA 역가를 증진시키는 데 중용한 역할을 하는 것으로 관찰되었다. 상기 혈청 반응 양성 모델에서 혈청 중화 역가 또는 혈청 F 특이 IgG를 부스팅하는 데 있어 애주번트의 이점은 관찰되지 않았다. F 특이 혈청 항체, F 특이 CD4 T 세포 IFNγ 반응, 및 폐 시토카인 수준 평가 결과, 상기 혈청 반응 양성 마우스 모델은 초기 RSV 감염에 의해 Th1 편향된 것으로 나타났고, 이는 RSV 혈청 반응 양성인 건강한 성인에서 RSV 백신화 반응을 모델링할 수 있다는 것을 제안한다. Th2 편향된 RSV 혈청 반응 양성 숙주, 예컨대, 노인에서, GLA-SE는 Th2 헬퍼 반응을 나이브 마우스에서 관찰되는 추가의 Th1 유사 반응으로 전환시킴으로써 추가의 이점을 제공할 수 있다.
1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 2차 연구를 수행함으로써 10 ㎍ 용량의 RSV sF + GLA-SE를 제공받은 혈청 반응 양성 마우스에서 부스팅된 중화 항체 및 증진된 세포성 면역의 관찰 결과를 확인할 수 있었다. 본 연구에서, 목적은 1) 10 ㎍ 용량의 RSV sF를 단독으로 이용하였을 때 관찰되는 관찰 결과를 반복하기 위한 것, 2) 상기 반응을 단지 GLA(1 또는 2.5 ㎍)와 함께 제공된 10 ㎍ 용량의 RSV sF를 이용하였을 때 달성되는 것과 비교하기 위한 것, 3) 상기 반응을 단지 SE(0.5 또는 2%)와 함께 제공된 10 ㎍ 용량의 RSV sF를 이용하였을 때 달성되는 것과 비교하기 위한 것, 4) 상기 반응을 보다 저용량의 GLA-SE(1 또는 2.5 ㎍ + 0.5 SE, 또는 1 또는 2.5 ㎍ + 2% SE)와 함께 제공된 10 ㎍ 용량의 RSV sF를 이용하였을 때 달성되는 것과 비교하기 위한 것, 및 상기 반응을 알룸과 함께 제공된 10 ㎍ 용량의 RSV sF를 이용하였을 때 달성되는 것과 비교하기 위한 것이었다.
마우스를 각각 9마리의 동물로 이루어진 13개의 군으로 나누고, 초기 백신화 이전 28일째 고용량의 106 pfu RSV A2 바이러스로 단일 비내 감염시켜 12개의 군 (대조군외 모두)을 혈청 반응 양성으로 만들었다. 백신화 당일 혈청 F 특이 IgG 종점 ELISA 역가에 의해 상기 동물에서 RSV 혈청전환을 확인하였다(도 23). 동물을 전과 같이 100 ㎕의 PBS 또는 제제화된 RSV sF 백신으로 근육내로 백신화시켰다. 혈청 F 특이 IgG1 및 IgG2a를 백신화 후 2주째 평가하였다. 비록 RSV sF 백신이 IgG1 및 IgG2a 역가를 PBS 백신화된 동물에서 관찰된 것보다 크게 및 RSV A2로의 2차 감염에 의해 달성되는 것보다 크게 부스팅시켰지만, 모든 혈청 반응 양성 군은 제공받은 백신과는 상관없이 IgG1 수준보다 IgG2a 수준이 더 높았고, 이는 원래 Th1 편향임을 나타낸다(도 24). 백신화 후 2주, 4주 및 6주째에 혈청 RSV 중화 역가를 평가하였다. 애주번트와 상관없이 10 ㎍의 RSV sF를 받은 군에서는 중화 역가가 PBS 백신화된 1x 혈청 반응 양성의 것보다 유의적으로 부스팅된 것으로 나타났고, 서로 구별하기는 어려었다(도 25).
RSV sF 백신화된 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서는 애주번트 선택이 중화 항체 반응에 영향을 주지 않지만, 달성되는 세포 반응에는 영향을 주었다. 군당 3-4마리의 대표 동물로부터 비장세포를 백신화 후 10일째 수거하여 두 IFNγ ELISPOT에 의해 및 (IFNγ, TNFα, 및 IL-2 생산 다기능성 세포에 대한) 세포내 시토카인 염색에 의해 F 특이 CD8 T 세포 반응을 평가하였다. ELISPOT 검정법에서, sF + 2% SE 중 1 또는 2.5 ㎍ 용량의 GLA-SE를 받은 군은 sF 단독 또는 sF + 알룸을 받은 군보다 유의적으로 더 높은 반응을 보였다(도 26a). sF 또는 sF + 알룸과 비교하여 sF + GLA-SE에 대한 상기와 같은 유의적으로 더 높은 반응은 또한 세포내 시토카인 염색 검정법에서도 관찰되었다(도 26b). 추가로, 세포내 시토카인 검정법에서는 단지 RSV sF만을 제공받은 군과 비교하여 RSV sF + 2% SE 또는 RSV sF + GLA-SE(0.5% SE 중 1 또는 2.5 ㎍)를 제공받은 군에서 개선된 F 특이 CD8 반응이 검출되었다.
상기 실험을 통해 1x 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 뿐만 아니라, RSV sF + GLA-SE의 중화 역가를 부스팅할 수 있는 능력이 확인되었고, 추가로, 다른 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신과 비교하였을 때, RSV sF + GLA-SE가 혈청 반응 양성 동물에서 F 특이 CD8 T 세포 반응을 부스팅하는 데 있어 최적의 제제라는 것이 밝혀졌다.
실시예 2b: 고도로 혈청 반응 양성 BALB /c 마우스에서 GLA -SE 애주번트가 첨가된 RSV F 서브유니트 백신
본 실시예에서는 혈청 반응 양성 Balb/c 마우스를 사용하여 RSV sF가 반응에 어떻게 영향을 주는지, 및 애주번트가 어떻게 반응을 조절하는지에 대해 평가하였다. RSV 재감염은 일생에 걸쳐 발생할 수 있고, 비교적 높은 수준의 항RSV 중화 항체임에도 불구하고, 노년기(≥ 65세)는 RSV 재노출시 건강한 성인보다도 중증의 RSV 관련 질병에 더 쉽게 걸린다(문헌 [Mullooly et al.,; Vaccine Safety 데이터link Adult Working Group Influenza- 및 RSV-associated hospitalizations among adults. Vaccine. 2007 25(5):846-55], [Walsh EE, Peterson DR, Falsey AR. Risk factors for severe respiratory syncytial virus infection in elderly persons. J Infect Dis. 2004 189(2):233-8]). 노년기에서 RSV 관련 질환 중증도 증가는 부분적으로는 면역노화, 및 감염 후 RSV를 차선적으로 제거할 수 있는 상기 집단에서의 Th2 편향으로 이동에 기인할 수 있다(문헌 [Cusi MG, Martorelli B, Di Genova G, Terrosi C, Campoccia G, Correale P. Age related changes in T cell mediated immune response and effector memory to Respiratory Syncytial Virus (RSV) in healthy subjects. Immun Ageing. 2010 Oct 20;7:14.]). 바이러스로부터 추출되고, 정제된 RSV F 또는 F + G + M을 사용함 이전 임상 시험 결과, 일반적으로 상기 RSV 항원은 알룸 존재 또는 부재 하에서 기존 RSV 항체 역가를 중간 정도로 부스팅한 것으로 나타났지만, 상기 연구에서는 RSV CMI 반응의 부스팅에 대해서는 보고된 바 없다(문헌 [Langley JM, Sales V, McGeer A, Guasparini R, Predy G, Meekison W, Li M, Capellan J, Wang E. A dose-ranging study of a subunit Respiratory Syncytial Virus subtype A vaccine with and without aluminum phosphate adjuvantation in adults > or =65 years of age. Vaccine. 2009 27(42):5913-9]. [Falsey AR, Walsh EE, Capellan J, Gravenstein S, Zambon M, Yau E, Gorse GJ, Edelman R, Hayden FG, McElhaney JE, Neuzil KM, Nichol KL, Simoes EA, Wright PF, Sales VM. Comparison of the safety and immunogenicity of 2 respiratory syncytial virus (rsv) vaccines--nonadjuvanted vaccine or vaccine adjuvanted with alum--given concomitantly with influenza vaccine to high-risk elderly individuals. J Infect Dis. 2008 Nov 1;198(9):1317-26]. [Falsey AR, Walsh EE. Safety and immunogenicity of a respiratory syncytial virus subunit vaccine (PFP-2) in the institutionalized elderly. Vaccine. 1997 Jul;15(10):1130-2]. [Falsey AR, Walsh EE. Safety and immunogenicity of a respiratory syncytial virus subunit vaccine (PFP-2) in ambulatory adults over age 60. Vaccine. 1996 Sep;14(13):1214-8.]).
노인의 RSV 혈청 상태에 대한 모의 실험을 하기 위해, 고도의 RSV 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 RSV sF 단독, RSV sF + GLA-SE 또는 RSV sF + 알룸으로 면역화하여 RSV 특이 항체 및 CMI 반응 부스팅을 수행하였다. RSV 면역 반응 부스팅 이외에도, 본 연구에서는 또한 일반적으로 기존 Th 편향된 숙주 면역 반응을 변경시키는 애주번트의 능력에 관한 사례 연구에서와 같이, Th2 편향 애주번트인 RSV sF + 알룸으로의 면역화가 wt RSV 감염에 의해 확립된 기존 Th1 면역 반응을 변경시킬 수 있는지 여부를 측정하였다. 친화도 정제된 RSV sF를 사용하여 RSV 나이브 동물에서 상기 기술된 이전 마우스 연구를 수행하였다. 대조적으로, 상기 연 사용된 RSV sF는 고전적 크로마토그래피에 의해 정제된 것이었다. RSV sF를 1,000배 범위(0.05 내지 50 ㎍)에 걸쳐 단독으로, 또는 GLA-SE 또는 알룸과 함께 제제화하여 제공함으로써 앞서 생 RSV로 2회에 걸쳐 감염된 BALB/c 마우스에서 RSV 면역 반응을 부스팅할 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다.
물질 및 방법
연구 디자인
6-8주된, 103마리의 암컷 BALB/c 마우스(찰스 리버)를 13개의 군으로 나누었다. 1군은 7마리의 마우스를 포함하고, 2군부터 13군까지는 8마리씩 포함하였다. 마취시킨 후, 1군부터 12군에 0일 및 35일째에 100 ㎕ 중 1 x 106 플라크 형성 단위(PFU)의 생 RSV를 비내(IN) 경로로 투여하였다. 13군은 RSV에 노출시키지 않았다. 56일째, 1군부터 11군을 이소플루란으로 마취시킨 후, 그를 근육내(IM) 경로를 통해 위약(PBS) 또는 백신 물품으로 면역화시켰다. 백신 물품은 총 100 ㎕로 제제화되었고, 50 ㎕를 각 뒷다리에 제공하였다. 12군은 이소플루란으로 마취시키고, 100 ㎕ 중 1 x 106 PFU의 생 RSV로 IN 경로로 면역화하였다. 84일째 각 군으로부터의 마우스의 서브세트를 마취시키고, 비내 경로를 통해 1x106 PFU 생 RSV A2를 접종하였다. 연구 0, 28, 56 70 및 84일째 안와후 혈액 수집으로부터 혈청을 수득하고, 전혈로부터 분리시키고, 평가할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 67일째(면역화 후 11일째), 또는 88일째(접종 후 4일째) T 세포 검정을 위해 각 군에서 동물 4마리로부터 비장을 수거하였다. 접종 후 4일째 루미넥스 검정법(밀리포어)에 의해 개별 폐 균질액 중에서 폐 시토카인을 정량화하였다.
RSV sF 및 애주번트
RSV A2 F 서열의 아미노산 1-524를 함유하는 RSV F 단백질을 안정한 CHO 클론으로부터 발현시키고, 고전적 크로마토그래피 방법을 통해 정제하였다. RSV F 단백질의 순도는 >90%였고, 이를 동물 면역화, 및 ELISA 검정에서의 코팅, 둘 모두에 사용하였다. 알룸(알하이드로겔, 어큐레이트 케미칼 앤드 사이언티픽: 미국 뉴저지주)을 백신 용량당 100 ㎍으로 사용하고, 실온에서 30분 동안 혼합하여 단백질에 흡착시켰다. 수성 제제 중 GLA를 용량당 5 ㎍으로 사용하였다. SE는 2% 농도로 사용하였다. GLA-SE는 2% SE 중 5 ㎍ GLA의 용량으로 사용하였다. 모든 백신 제제는 투여 2시가 이내에 제조하였다.
혈청 IgG , IgG1 및 IgG2a ELISA
RSV F 특이 IgG 항체를 표준 ELISA 기법을 사용하여 평가하였다. 고 결합 96웰 플레이트를 정제된 RSV sF로 코팅하였다. 차단 후, 일련의 혈청 희석액을 플레이트에 첨가하였다. 단일클론 항체 1331H(문헌 [Beeler JA, van Wyke Coelingh K. Neutralization epitopes of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus: effect of mutation upon fusion function. J Virol. 1989; 63(7):2941-50])를 사용하여 전체 IgG 및 IgG1 정량화를 위한 표준 곡선을 작성하고, 단일클론 항체 1308을 사용하여 IgG2a 정량화를 위한 표준 곡선을 작성하였다. HRP-컨쥬게이트된 염소 항마우스 IgG, IgG1, 또는 IgG2a(잭슨 이뮤노리서치, 미국 펜실베이니아주 웨스트 그로브)를 사용하여 결합된 항체를 검출하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, 시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 발색시켰다. 스펙트라맥스 플레이트 판독기 상에서 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 소프트맥스 프로(몰레큘라 디바이시스: 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 분석하였다. 역가는 1331H 또는 1308 등가량(㎍/mL)으로 기록되어 있다.
RSV 미세중화 검정법 ( 나이브 연구와 동일)
앞서 기술된 바와 같이(문헌 [Bernstein DI, et al. (2012) Phase 1 study of the safety and immunogenicity of a live, attenuated respiratory syncytial virus and parainfluenza virus type 3 vaccine in seronegative children. Pediatr Infect Dis J 31: 109-114]) GFP 태깅된 RSV A2 미세중화 검정법을 사용하여 명시된 시점에서 열 불활성화된 마우스 혈청에서의 RSV 중화 항체 역가를 측정하였다. 간략하면, 컨플루언트된 베로 세포 단층을 500 PFU의 바이러스 단독, 또는 일련으로 희석된 혈청 샘플과 미리 혼합된 바이러스로 감염시킨 후, 33℃ 및 5% CO2에서 22 hr 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 유리 바이러스로 세척하고, 이소사이트 영상 스캐너(블루쉬프트: 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 GFP 형광성 바이러스 포커스를 열거하였다. 4 파라미터 곡선 피트 알고리즘을 사용하여 계산된, 형광성 포커스 개수를 50% 감소시킨 log2 혈청 희석률의 역수(EC50 역가)로서 중화 역가를 표시하였다.
ELISPOT 검정법( 나이브 연구와 동일)
명시된 수거 시점에 100 ㎛ 나일론 필터(팔콘)를 통과시켜 개별 비장을 파괴시켰다. 비셀에 의해 적혈구 제거된 비장세포의 생존가능성을 측정하고, 세포를 사용 전 5% FCS, 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L 글루타민 및 0.1% β-머캅토에탄올(cRPMI-5)로 보충된 RPMI 1640 중 10x106개의 생존가능한 세포/mL로 재현탁시켰다.
마우스 ELISPOT 검정법을 위해 맙테크(미국 오하이오주 신시내티) 뮤린 IFNγ ELISPOT 키트를 사용하였다. 세포 및 자극제 첨가 이전에 미리 코팅된 미량역가 플레이트를 cRPMI-5로 차단시켰다. 250,000개의 세포/웰을 차단 코팅된 플레이트 상에서 36-48시간 동안 배지 단독, MHC II (I-Ed) 결합 펩티드 GWYTSVITIELSNIKE(서열 번호 10) 및 VSVLTSKVLDLKNYI(서열 번호 11)(문헌 [Olson MR, Varga SM (2008) Pulmonary immunity and immunopathology: lessons from respiratory syncytial virus. Expert Rev Vaccines 7: 1239-1255])(각 5 ㎍/mL씩), MHC I(H2-Kd) 결합 펩티드, KYKNAVTEL(서열 번호 12)(문헌 [Olson MR (2008)]), 또는 양성 대조군으로서 ConA(5 ㎍/mL)와 함께 3회 중복으로 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, 세포를 세척하고, 플레이트를 키트 프로토콜에 따라 포함된 비오티닐화된 항뮤린 IFNγ, 이어서, SA-HRP와 함께 인큐베이션시키고, 포함된 TMB 시약을 이용하여 스폿을 검출하였다. CTL 이뮤노스폿 판독기 및 소프트웨어(셀룰라 테크놀러지 리미티드)를 사용하여 플레이트를 판독하고, 분석하였다.
시토카인 프로파일링(나이브 연구와 동일)
IFN감마, IL-5, IL-13, IL-17 및 에오탁신(밀리포어: 미국 매사추세츠주 빌러리카)를 포함하도록 디자인된 마우스 시토카인/케모카인 다중 키트를 사용하여 폐 균질액을 평가하였다. 폐 균질액을 사용하기 전 원심분리에 의해 정화시켰다. 제조사의 설명서에 따라 검정법을 수행하고, 루미넥스 판독기(바이오 래드: 미국 캘리포니아주 허큘리스) 상에서 플레이트를 분석하였다.
본 실험을 통해 높은 및 낮은 기준선 혈청 반응 양성을 가지는 혈청 반응 양성 마우스에서 사용된 애주번트 또는 제공되는 RSV sF 용량에 상관없이 RSV sF가 중화 항체 반응을 부스팅시킨다는 것이 입증되었다. 그러나, GLA-SE와 함께 RSV sF를 제제화하였을 때, 혈청 반응 양성 마우스에서 가장 강력한 CD8 T 세포 반응이 유도되었다. 추가로, 나이브 BALB/c 마우스에서 Th2 반응을 유도한 제제, 예컨대, 예컨대, RSV sF 단독 또는 RSV sF + 알룸은 RSV에의 사전 노출에 의해 유도된 혈청 반응 양성 동물에서의 Th1 편향을 변화시키지는 않았다. 혈청 반응 양성 마우스에서, RSV sF 투여는 사용된 애주번트 또는 투여된 RSV sF 용량에 상관없이 중화 항체 반응을 증가시킨다.
도 27은 혈청 반응 양성 마우스에서 RSV sF가 중화 항체를 부스팅한 것을 보여주는 그래프이다. 역가가 증가된 크기는 초기 중화 역가가 더 낮은 동물에서 더욱 뚜렷하였다. 역가는 최대 중화 역가까지 증가할 수 있으며, 이는 백신화 후 72시간 동안 유지되었다. 또한, 증가는 애주번트와는 독립적이었다.
도 28a 및 b는 에오탁신 및 IL-13이 RSV A2 접종 후 유도되지 않는다는 것을 입증하는 그래프이다. Rantes는 애주번트의 존재에 의해 영향을 받은 유일의 케모카인/시토카인이다.
도 29a 및 b는 RSV sF + GLA-SE가 CD8 T 세포 반응을 부스팅하고, CD8 T 세포 반응은 투여량에 의존한다는 것을 입증하는 그래프이다. 50 ㎍의 RSV sF의 사용으로 최대 반응에 도달하였는지 여부는 알려져 있지 않다. 그러나, RSV sF + GLA-SE로 제제화하였을 때, 다기능성 반응과 함께 가장 큰 크기의 CD8 T 세포 반응을 얻을 수 있었다.
결과
BALB/c 마우스의 기도는 RSV 복제에 대하여 유일하게 반투과성을 띠는 바, 생 RSV의 단일의 비내 투여 후 고수준의 혈청 중화 역가를 달성하기는 어렵다. 다회에 걸쳐 RSV로 재감염된 인간에 관찰된 혈청 중화 역가 수준에 더욱 근접한 모의 실험을 하기 위해, 마우스를 0일째 및 35일째 2회에 걸쳐 1x106 PFU의 RSV에 노출시켰다. 예상대로, 단회 투여 후, RSV 감염 마우스 모두에서 낮지만, 검출가능한 중화 역가가 관찰되었다(도 38). 평균 RSV 중화 역가는 4.2 log2였다. 2차 투여 후, 평균 중화 역가는 8.3 log2로 대략 16배 부스트가 일어났다. 그러나, 마우스 각 개체의 역가는 3.3 내지 12 log2 범위로 광범위하게 존재하였다.
상기 RSV 혈청 반응 양성 마우스에서 중화 역가를 부스팅할 수 있는 각종의 RSV sF 제제의 능력을 측정하기 위해, 동물을 56일째 백신화하고, 70 및 84일째(각각 백신화 후 14일째 및 28일째를 나타냄) 출혈시켰다. 도 2는 부스트 후 14일째 군의 역가를 보여주는 것이다. 도 39는 연구 기간 동안 중화 역가 상승을 보여주는 것이다. 데이터는 모든 RSV sF 백신 물품이 애주번트의 존재 여부 또는 애주번트 유형과는 상관없이, 면역화 후 14일째 중화 역가를 군 평균 8.3 log2로부터 9.3 log2 내지 11.9 log2로 부스팅할 수 있다는 것으로 보여준다. 그러므로, RSV 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서, RSV 중화 역가는 극소량의 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF에 의해 50 ㎍의 최고 용량의 애주번트가 첨가된 RSV sF에 의해 달성된 것보다 단지 대략 6배 더 낮은 수준으로까지 부스팅될 수 있다.
RSV를 2회 투여한 후, 전체 RSV F 특이 IgG 역가를 RSV 감염 전 0일째 및 56일째 측정하였다. 도 41은 백신 물품으로의 면역화 이전에 생 RSV A2에의 2회의 일련의 노출 후 고수준의 항F 특이 IgG 역가가 존재하였음을 입증하는 것이다. 도 42는 부스트 후 14일째 군 역가를 보여주는 것이다. 도 43은 연구 기간 동안 IgG 역가 상승을 보여주는 것이다. 중화 역가와 달리, 작은 용량 반응이 존재한다. 0.05 ㎍ 용량의 RSV sF는 50 ㎍의 RSV sF 용량보다 유의적으로 더 낮게 부스팅시켰고, GLA-SE와 함께 0.05 ㎍의 RSV sF는 GLA-SE를 포함하는 RSV sF 50 ㎍ 용량의 것보다 통계학상 더 낮게 부스팅시켰다. 추가로, GLA-SE 또는 알룸의 존재는 또한 반응을 증진시킨다. 5 및 50 ㎍의 RSV sF 군, 둘 모두 RSV F 특이 IgG 역가를 GLA-SE 또는 알룸과 혼합된 상응하는 용량의 것보다 통계학상 더 낮은 수준으로까지 부스팅하였다.
84일째(면역화 후 24일째) 항RSV sF 특이 IgG1 및 IgG2a 혈청 역가를 측정하였다(도 44). 나이브 마우스에서의 사전 연구에서, 생 RSV A2 감염은 Th1 편향된 반응을 일으킨 반면, RSV sF 단독 또는 알룸 상에 흡착된 RSV sF로의 면역화는 Th2 편향된 반응을 일으켰다. 본 연구와 달리, Th1 편향된 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스는 RSV sF 단독 또는 알룸 상에 흡착된 RSV sF로의 면역화 후 Th1 편향을 유지하였다. 그러므로, 사전 확립된 숙주의 Th1 편중은 RSV sF 또는 RSV sF + 알룸으로의 면역화에 의해 변경되지 못했다.
RSV sF 단독, RSV sF + GLA-SE, RSV sF + 알룸 또는 RSV로의 1차 감염을 이용한 RSV 나이브 마우스에서의 이전 면역화 연구 결과, 접종 후 4일째 고수준의 IFNγ를 얻었다. 추가로, RSV sF 단독 또는 알룸 상에 흡착된 RSV sF로의 면역화를 통해서는 RSV 접종 후 IL-5 반응이 유도되었는데, 이는 상기 두 군에서 Th2 편향된 반응을 나타내는 것이다. 상기 연구에서, 폐 중 IFNγ 및 IL-5 역가를 88일째(1x106 PFU RSV A2로의 접종 후 4일째) 측정하였다(도 45). 나이브 BALB/c 마우스와 달리, RSV sF 또는 알룸 상에 흡착된 RSV sF로의 면역화는 마우스가 RSV 접종에 대한 반응으로 IL-5를 유도하게 수립하지 못하였고, 이는 Th1 편향된 면역 반응을 나타내는 혈액 중 측정된 IgG1:IgG2a 비와 일관된다. 그러므로, RSV 감염된 BALB/c 마우스는 이전 RSV 감염에 의해 확립된 Th1 편향 면역 반응을 유지하는 것으로 나타났고, 계속해서 RSV sF 단독 또는 RSV sF + 알룸으로의 면역화 이후에도 같은 Th 반응을 보였다.
나이브 BALB/c 마우스 모델에서, 접종 후 4일째 백신 안전성에 대한 잠재적인 지표인 호산구 동원에 대한 대용 면역 마커로서 에오탁신 및 IL-13을 측정하였다. 상기 이전 연구에서는 RSV sF 단독 또는 RSV sF + 알룸으로의 면역화, 둘 모두 마우스가 RSV 접종시 1차 RSV A2 감염에 의해 유도된 것보다 더 높은 에오탁신 및 IL-13 반응을 가지도록 수립하는 것으로 나타났다. 그에 반해, RSV sF 단독 또는 RSV sF + 알룸으로 면역화된 RSV 혈청 반응 양성 마우스는 RSV 접종시 RSV로 감염된 코호트를 비롯한, 임의의 다른 군들보다 더 높은 수준의 에오탁신 또는 IL-13을 유도하지 못하였다(도 46).
IgG1/IgG2a 데이터 및 폐 시토카인 데이터, 둘 모두, 백신 물품 제제는 혈청 반응 양성 마우스에서 기존 Th1 편향에 어떤 영향도 주지 않는다는 것을 제안한다. RSV sF 용량에 의해, 또는 애주번트 존재에 의해 차별적으로 영향을 받는 것으로 밝혀진 유일의 폐 시토카인은 RANTES였다(도 46). 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신 물품은 모두 RSV A2 노출 후 RANTES 발현을 유도하였지만, RSV sF 단독으로 면역화된 군에서는 유도된 RANTES 수준은 RSV sF의 양이 증가함에 따라 증가하였다.
F 특이 CD8 T 세포에 대한 전신 회상 반응을 면역화 후 11일째(67일째) 및 접종 후 4일째(88일째), 둘 모두에서 측정하여 상이한 백신 물품에 의해 유도된 반응 크기를 비교하였다. CD8 특이 RSV F 펩티드를 사용하여 ELISPOT에 의해 IFNγ 분비 세포 검출 이전 36시간 동안 비장세포를 자극시켰다(도 47). RSV sF 단독, RSVsF +GLA-SE 및 RSV sF+알룸의 경우, RSV sF 용량이 증가함에 따라, F 특이 CD8 T 세포의 평균 개수가 증가하였다. 그러나, RSV sF 단독 또는 RSV sF + GLA-SE 또는 알룸에 의해 유도된 반응 사이에는 차이가 거의 없었다는 혈청학적 결과와는 달리, GLA-SE는, RSV 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 CMI 반응을 부스팅시키는 데 있어 우수한 애주번트일수록 더욱 뚜렷하게 차별화되었다.
결론
본 연구에서는 고전적 크로마토그래피 정제된 RSV sF를 사용하여 생 RSV으로 회에 걸쳐 일련으로 감염된 고도의 RSV 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 RSV sF 용량(0.05 내지 50 ㎍의 RSV sF 범위)이 혈청학적 반응에 미치는 효과에 대하여 특징을 규명하였다. 비교적 높은 RSV F IgG 및 중화 RSV 역가를 보인 RSV 혈청 반응 양성 마우스에서, 애주번트 존재 또는 부재 하에서 1,000배 범위의 RSV sF 용량은 중화 역가를 부스팅하는 데 있어 최소로 영향을 미쳤다. 애주번트 존재 또는 부재 하에서 0.05 ㎍ 용량은 중화 역가를 부스팅하는 데 있어 거의 50 ㎍ 용량만큼 효과적이었다. 테스팅된 모든 백신 물품은 중화 역가를 2 내지 5배만큼 부스팅시켰다. 전체 RSV F 특이 IgG 역가의 경우, GLA-SE 또는 알룸을 포함하는 보다 고용량의 RSV sF는 0.05 ㎍의 RSV F 단독인 것보다 더 높은 부스트를 촉진시켰다. 그러나, 이러한 차이는 약 5.7배 증진을 나타내는 보통 정도의 것이며, 이는 혈청 항체를 부스팅시키는 것은 비교적 소량의 RSV sF 단독으로도 RSV 혈청 반응 양성 마우스에서 달성될 수 있다는 것을 추가로 제안한다.
생 RSV A2에의 사전 노출이 BALB/c 마우스에서 Th1 편향된 반응을 유도하는 바, 공지된 Th2 편중 백신 물품, 예컨대, 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 또는 RSV sF + 알룸이 Th1 편향된 반응을 Th2 편향된 반응으로 전환시킬 수 있는지 여부를 측정하는 것이 관심의 대상이 되었다. 접종 후 4일째 혈액 중 IgG1/IgG2a의 비 뿐만 아니라, 폐 시토카인 프로파일, 둘 모두, RSV sF 단독 또는 RSV sF + 알룸으로의 면역화는 이전 RSV 감염에 의해 확립된 기존 Th 면역 프로파일을 변경시키지 못했다는 것을 제안한다. Th2 편향된 RSV 혈청 반응 양성 노년기 집단에서 강력한 Th1 편향 백신인 RSV F + GLA/SE가 생성하게 되는 면역 반응 유형은 평가될 때까지 그대로 유지된다.
본 연구에서는 또한 RSV 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서 CD8 T 세포 반응을 부스팅시킬 수 있는 그의 능력에 대해 RSV sF 용량 뿐만 아니라, 애주번트를 특징 규명하였다. 나이브 마우스에서 발견된 것과 유사하게, 더 큰 용량의 RSV sF가 더 작은 RSV sF 용량보다 더 높은 크기로 부스트를 촉진시켰다. 추가로, RSV sF + GLA-SE는 같은 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 또는 알룸 상에 흡착된 RSV sF와 비교하여 최고로 부스팅시켰다.
실시예 2c: 혈청 반응 양성 코튼 래트에서 GLA -SE 애주번트가 첨가된 RSV F 서브유니트 백신
본 연구에서, 혈청 반응 양성 코튼 래트 모델을 사용하여 실시예 2b에서 사용된 것과 유사한 프로토콜에 따라 RSV sF 용량이 반응에 어떻게 영향을 주는지, 및 애주번트가 반응을 조절하는지 여부를 평가하였다.
간략하면, 0일째, 96마리의 코튼 래트에 비내 경로를 통해 1e6 pfu RSV A2를 투여하였다. 28일째, 동물을 하기 조성물 중 하나로 근육내로 면역화시켰다: 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline); PBS + GLA-SE; 0.1 ㎍, 1.0 ㎍ 또는 10 ㎍의 RSV sF; GLA-SE와 함께 제제화된 0.1 ㎍, 1.0 ㎍ 또는 10 ㎍의 RSV sF; 10 ㎍의 RSV sF + GLA; 10 ㎍의 RSV sF + SE; 10 ㎍의 RSV sF + 알룸; 또는 생 RSV A2. D14, D28, D38, D49 및 D56에 동물을 출혈시켰다. 이어서, D67에 1x106 PFU RSV A2를 동물에 접종하고, D71에 비장/폐를 수거하였다. 또 다른 연구에서, 0일째 64마리의 코튼 래트에 비내 경로를 통해 1x106 PFU RSV A2를 투여하였다. 28일째, 동물을 하기 조성물 중 하나로 근육내로 면역화시켰다: PBS; PBS + GLA-SE; 10 ㎍의 RSV sF, GLA-SE와 함께 제제화된 10 ㎍의 RSV sF; 10 ㎍의 RSV sF + GLA; 10 ㎍의 RSV sF + SE; 10 ㎍의 RSV sF + 알룸; 또는 생 RSV A2. 동물을 D28 및 D38에 출혈시켰다.
RSV A2 F 서열의 아미노산 1-524를 함유하는 RSV F 단백질을 안정한 CHO 클론으로부터 발현시키고, 고전적 크로마토그래피 방법을 통해 정제하였다. RSV F 단백질의 순도는 >90%였고, 이를 동물 면역화, 및 ELISA 검정에서의 코팅, 둘 모두에 사용하였다. 알룸(알하이드로겔, 어큐레이트 케미칼 앤드 사이언티픽: 미국 뉴저지주)을 백신 용량당 100 ㎍으로 사용하고, 실온에서 30분 동안 혼합하여 단백질에 흡착시켰다. 수성 제제 중 GLA를 용량당 5 ㎍으로 사용하였다. SE는 2% 농도로 사용하였다. GLA-SE는 2% SE 중 5 ㎍ GLA의 용량으로 사용하였다. 모든 백신 제제는 투여 2시가 이내에 제조하였다.
RSV F 특이 IgG 항체를 표준 ELISA 기법을 사용하여 평가하였다. 고 결합 96웰 플레이트를 정제된 RSV sF로 코팅하였다. 차단 후, 일련의 혈청 희석액을 플레이트에 첨가하였다. HRP 컨쥬게이트된 닭 항코튼 래트 IgG 항체(이뮤놀러지 컨설탄츠 랩(Immunology Consultants Lab))를 사용하여 결합된 항체를 검출하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, 시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 발색시켰다. 스펙트라맥스 플레이트 판독기 상에서 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 소프트맥스 프로(몰레큘라 디바이시스: 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 분석하였다. 컷 오프인 2x 블랭크 웰의 평균을 사용하여 역가를 1:1,000 혈청 희석률에서의 흡광도 또는 log2 종점 역가로 기록하였다. 경쟁 ELISA 검정법을 통해 부위 특이 항체를 정량화하였다. 간략하면, 고 결합 96웰 플레이트를 정제된 RSV sF로 코팅하였다. 차단 후, 일련의 혈청 희석액을, 부위 A, 부위 B 또는 부위 C를 인식하는 비오티닐화된 항체를 일정한 농도로 함께 혼합하였다(문헌 [Beeler JA, van Wyke Coelingh K. Neutralization epitopes of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus: effect of mutation upon fusion function. J Virol. 1989; 63(7):2941-50]). 대표 희석율에서의 개별 혈청의 경쟁률(%)은 (100 x [1-{혈청OD/mAbOD평균}])과 같이 계산되었다. 나이브 마우스 연구에 대하여 앞서 기술된 바와 같이 미세중화 역가를 측정하였다.
결과
면역화 전 기준선 항체 역가를 확립하기 위하여 RSV 감염 후 28일째, 및 면역화 후 항체 역가 부스트를 측정하기 위해 38, 49 및 56일째 전체 RSV F 특이 IgG 역가 수준을 측정하였다. 28일째, 생 RSV A2에의 1회 노출 후 RSV F 특이 IgG는 유의적인 수준으로 존재하였다. 38, 49 및 56일째의 데이터는 RSV sF로 백신화된 군들 모두에서 용량에는 상관없이 RSV sF 특이 IgG 역가가 부스팅되었고, 부스팅은 애주번트의 존재 하에서 유의적으로 증진되지 않다는 것을 입증하였다(도 48). 38일째 및 49일째, 1:1,000 희석률에서의 평균 A450 OD 값은 모두, 위약 면역화화된 군, 및 생 RSV A2에 2차 노출된 군과 비교하여 상기 군에서 유의적으로 더 높았다. 56일째, 애주번트 없이 단지 0.1 ㎍의 RSV sF만을 투여한 것은 혈청 반응 양성/위약 군 및 생 RSV A2를 2차 투여받은 군, 둘 모두와 유의적인 차이는 없었다. 38일 및 49일째의 성향은 100배 더 많은 RSV sF(10 ㎍ 대 0.1 ㎍)가 RSV sF ± GLA-SE의 경우 RSV sF 최고 용량에서 최소로 더 높은 역가를 생성한다는 것을 제안한다. 상기의 전반적인 데이터는 RSV sF 용량도, 애주번트 존재도 RSV F 특이 혈청 역가 부스트에는 크게 영향을 주지 않는다는 것을 제안하며, 이는 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스에서의 유사한 결론을 지지한다.
기준선 중화 역가를 확립하기 위하여 28일째, 및 면역화 후 중화 항체 역가 부스트를 측정하기 위해 38, 49 및 56일째 RSV 중화 항체 역가 수준을 측정하였다. 28일째, 각 혈청 반응 양성 군에 대한 평균 평균(mean average)은 10 log2 이상이었다(도 49). 코튼 래트가 RSV 복제에 대하여 허용성이 더 큰 바, RSV에 의한 단일 감염 후 중화 역가는 BALB/c 마우스에서 관찰된 것보다 상당히 더 높은 평균 역가를 달성하였다. BALB/c 마우스에서, 1x106 PFU의 생 RSV A2에 의한 단일 감염 후 평균 중화 역가 범위는 4 log2 내지 6 log2였다.
49일째(면역화 후 21일째) 중화 역가는 역가가 평균 평균 11.4 내지 13.1로 부스팅되었다는 것을 나타낸다(도 49). RSV sF(10 ㎍) 코호트를 제외한 모든 군에서는 혈청 반응 양성/위약 코호트보다 유의적으로 더 높은 역가 부스팅이 일어났다. 애주번트를 포함하지 않는 군 중 임의의 군들 사이에, 또는 RSV sF +GLA-SE 군 중 임의의 군들 사이에는 어떤 통계학상의 차이도 없었으며, 이는 0.1 ㎍에서 10 ㎍로의 RSV sF 용량 증가가 면역화 후 평균 평균 중화 역가에는 어떤 영향도 미치지 않았다는 것을 제안하는 것이다.
중화 역가 부스트 크기를 평가하기 위해, 면역화 후 10, 21 및 28일째 각 동물에 대한 기준선 역가로부터의 상승 배수를 계산하였다(도 50). 애주번트 존재 또는 부재 하에서 RSV sF로 면역화된 모든 군들에서는 혈청 반응 양성/위약 백신화된 군보다 기하 평균 평균 상승이 더 높게 나타났지만, 그러나, 널리 퍼져 있는 바, 데이터에서는 면역화 후 10일째 오직 1 ㎍의 RSV sF + GLA-SE 및 10 ㎍의 RSV sF + 알룸으로 면역화된 군만이 혈청 반응 양성/위약 백신화된 군보다 유의적으로 높은 것으로 나타났다. 면역화 후 21일째 오직 10 ㎍의 RSV sF + 알룸 군만이 위약보다 유의적으로 높았다. 면역화 후 10일째 오직 RSV sF(10 ㎍), RSV sF(1 ㎍) + GLA-SE, RSV sF(10 ㎍) + GLA-SE, RSV sF(10 ㎍) + GLA 및 RSV sF(10 ㎍) + 알룸은 4배 이상의 기하 평균 상승을 보였다. 이러한 소규모 내지 중간 정도의 중화 역가 부스트는 10 log2인 기준선 역가가 높기 때문일 수도 있다. 상기 역가는 코튼 래트에서 최대 달성가능한 RSV 역가에 가깝다. 상기의 전체 데이터에 걸쳐 애주번트의 존재 또는 부재 하에서 RSV sF 용량은 중화 역가를 부스팅하는 데 있어 최소한의 영향을 미친다는 것이 제안되고, 이는 전체 RSV sF 특이 IgG 결과를 지지한다. 최소한의 부스트는 기준선 역가가 코튼 래트에서 최대 달성가능한 RSV 역가에 가깝다는 사실에 기인하는 것일 수도 있다. BALB/c 혈청 반응 양성 동물 모델에서 유사한 결론을 얻었다.
RSV F 단백질에 대해 특이적인 중화 단일클론 항체(Mabs)를 생성하고, 3개의 주요 부위, 부위 A, 부위 B 및 부위 C로 지도화하였다(문헌 [Beeler JA, van Wyke Coelingh K. Neutralization epitopes of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus: effect of mutation upon fusion function. J Virol. 1989; 63(7):2941-50]). 한 부위 A Mab(시나지스®), 한 부위 B(1112) 및 한 부위 C Mab(1331H)를 각각 경쟁 ELISA에서 사용하여 면역화 후 코튼 래트에서 부위 A, 부위 B 또는 부위 C에 대해 생성되는 항체의 상대적인 양을 측정하였다(도 51). 평균 평균은 RSV sF 단독 및 임의의 애주번트 존재하의 RSV sF, 둘 모두 위약보다 또는 RSV A2에의 2차 노출보다 더 우수하게 특이 중화 부위에 대하여 항체 반응을 부스팅한다는 것을 제안한다. 본 검정법에서, GLA-SE의 존재 또는 부재 하에서 0.1, 1.0 및 10 ㎍의 RSV sF 코호트 간의 차이는 유의적으로 다르지 않았지만, 그러한 성향은 고용량의 RSV sF, 및 애주번트 존재가 부위 특이 항체 반응을 부스팅하는 데 있어 유익할 수 있다는 것을 제안한다.
제2 혈청 반응 양성 코튼 래트 연구에서, 면역화 전 기준선 항체 역가를 확립하기 위하여 RSV 감염 후 28일째, 및 면역화 후 항체 역가 부스트를 측정하기 위해 38일째 전체 RSV F 특이 IgG 역가 수준을 측정하였다. 28일째, 생 RSV A2에의 1회 노출 후 RSV F 특이 IgG는 유의적인 수준으로 존재하였다(도 48). 모든 군은 13.4 내지 14.7 log2의 평균 역가에 도달하였다. 38일째의 데이터는 애주번트와는 상관없이 RSV sF로 백신화된 군 모두 위약(PBS + GLA-SE) 또는 RSV A2 2차 투여보다 유의적으로 더 높은 역가로 RSV sF 특이 IgG를 부스팅한 것이 입증되었다.
혈청 IgG 역가 부스트 크기를 평가하기 위해, 면역화 후 10일째 각 동물에 대한 기준선 역가로부터의 상승 배수를 계산하였다(도 49). 애주번트 존재 또는 부재 하에서 RSV sF로 면역화된 모든 군들에서는 4배 초과의 기하 평균 상승이 나타났고, 그 범위는 12.0 내지 25.0이었다. 대조군, 예컨대, 나이브 및 혈청 반응 양성/위약 군 뿐만 아니라, 생 RSV A2를 2차 투여받은 군에서는 혈청 역가 부스트가 일어나지 않고, 계산 결과, 상승 배수는 2미만이었다.
기준선 중화 역가를 확립하기 위하여 28일째, 및 면역화 후 중화 항체 역가 부스트를 측정하기 위해 38일째 RSV 중화 항체 역가 수준을 측정하였다. 28일째, 각 혈청 반응 양성 군에 대한 평균은 9 log2 이상이었고, 그 범위는 9.0 log2 내지 9.5 log2였다(도 50). 이전 혈청 반응 양성 코튼 래트 연구에서, 28일째, 평균 중화 역가는 10.1 내지 11.7이었다. 코튼 래트가 RSV 복제에 대하여 허용성이 더 큰 바, RSV에 의한 단일 감염 후 중화 역가는 BALB/c 마우스에서 관찰된 것보다 상당히 더 높은 평균 역가를 달성하였다. BALB/c 마우스에서, 1x106 PFU의 생 RSV A2에 의한 단일 감염 후 평균 중화 역가 범위는 전형적으로 4 log2 내지 6 log2였다.
38일째(면역화 후 10일째) 중화 역가는 역가가 평균 12.3 내지 13.9로 부스팅되었다는 것을 나타낸다(도 50). 이전 혈청 반응 양성 코튼 래트 연구에서 유사한 면역화 후 역가가 관찰되었다. RSV sF 군 모두에서는 위약 군보다 유의적으로 더 높은 역가로 부스팅되었다. 혈청 IgG 역가에 대한 데이터와 달리, 생 RSV A2 군에서도 또한 위약 군보다 유의적으로 더 높은 중화 역가 부스트가 일어났다. 추가로, RSV sF + GLA-SE, RSV sF + GLA, 및 RSV sF + 알룸 군에서는 RSV A2보다 더 높은 역가로 부스팅되었다. 중화 역가 부스트 크기를 평가하기 위해, 면역화 후 10일째 각 동물에 대한 기준선 역가로부터의 상승 배수를 계산하였다(도 51). 애주번트의 존재 또는 부재 하에서 RSV sF로 면역화된 모든 군의 평균 상승 배수는 8.1 내지 21.9였는데, 상기 범위는 혈청 IgG 역가에서 관찰된 상승 배수와 유사한 값이었다. 이전 혈청 반응 양성 코튼 래트 연구와 달리, 중화 역가 상승은 관찰하기가 더욱 용이하였는데, 그 이유는 출발 기준선 역가가 10 log2와 비교하여 9 log2로 더 낮고, 본 연구에서 각 군의 가변성이 더 작았기 때문이다. 상기의 모든 데이터에 걸쳐, 평균 RSV sF + 애주번트 중화 역가는 RSV sF 단독인 것보다 단지 2-3배 정도 더 높기 때문에, 애주번트의 존재는 중화 역가를 부스팅하는 데 있어 최소한의 영향을 미친다는 것을 제안한다. 상기 데이터는 또한 전체 RSV sF 특이 IgG 데이터를 지지한다. 혈청 반응 양성 BALB/c 마우스 연구에서또 또한 유사한 결론을 얻었다.
RSV F 단백질에 대해 특이적인 중화 단일클론 항체(Mabs)를 생성하고, 3개의 주요 부위, 부위 A, 부위 B 및 부위 C로 지도화하였다(문헌 [Beeler JA, van Wyke Coelingh K. Neutralization epitopes of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus: effect of mutation upon fusion function. J Virol. 1989; 63(7):2941-50]). 한 부위 A Mab(시나지스®), 한 부위 B(1112) 및 한 부위 C Mab(1331H)를 각각 경쟁 ELISA에서 사용하여 면역화 후 코튼 래트에서 부위 A, 부위 B 또는 부위 C에 대해 생성되는 항체의 상대적인 양을 측정하였다(도 51). RSV sF 단독 및 임의의 애주번트 존재하의 RSV sF, 둘 모두 위약보다 또는 RSV A2에의 2차 노출보다 더 우수하게 상기 특이 중화 부위에 대하여 항체 반응을 유의적으로 부스팅하였다. RSV sF + SE의 경우, 유일하게 예외적이었는데, 여기서, 부위 B 역가 부스트가 RSV A2의 2차 투여보다 유의적으로 높았지만, 위약 군보다는 통계학상 높지 않았다. 흥미롭게도, RSV A2의 2차 투여가 위약보다 유의적으로 더 높게 역가를 부스팅한 유일한 부위는 부위 C에 대한 것이었다.
결론
본 연구에서는 고전적으로 정제된 RSV sF를 사용하여 RSV 혈청 반응 양성 코튼 래트에서의 혈청학적 반응에 대해 100배 범위에 걸친 RSV sF 용량 (0.1 내지 10 ㎍의 RSV sF)이 미치는 효과 뿐만 아니라, 애주번트가 미치는 효과를 특징 규명하였다. 나이브 동물 모델과 달리, RSV sF는 애주번트의 존재 하에 또는 부재 하에서 투여되었을 때, RSV sF 용량은 전체 IgG, 부위 특이 반응 또는 전체 중화 역가 부스트 크기에 대해 최소한의 효과를 미치는 정도에서부터 전혀 영향을 미치지 못하는 정도의 효과를 가졌다. 유사하게, 최고 용량의 RSV sF에서의 임의의 애주번트 존재 또한 추가로 반응 크기를 애주번팅하는 데 있어 거의 영향을 미치지 못하거나, 전혀 영향을 미치지 못하였다.
실시예 3: 나이브 스프라그 다울리 래트에서의 RSV sF 면역원성
본 연구에서는 약물 및 백신 개발에서 독성 연구에서 통상적으로 사용되는 모델인 스프라그 다울리 모델에서의 RSV sF 백신 제제의 면역원성을 평가하였다. 본 연구의 목적은 (A) 백신화되지 않은 스프라그 다울리 래트가 폐 및 코에서의 RSV A2를 지지하는지 확인하고, 최고 RSV 복제에 도달하는 날을 확인하고; (B) 2.5 ㎍ GLA-SE/2% SE 존재 하에 0 ㎍ 또는 100 ㎍의 RSV sF를 투여받았을 때, 나이브 스프라그 다울리 래트에서 F 특이 체액성, 세포성, 및 방어 면역 반응의 수준을 정량화하고; (C) RSV sF 용량이 나이브 스프라그 다울리 래트에서 RSV SF 유도성 체액성, 세포성, 및 방어 면역 반응의 수준에 영향을 미치는지 여부를 측정하고; (D) 나이브 스프라그 다울리 래트에서 RSV sF에 대한 체액성, 세포성, 및 방어 면역 반응을 유도하는 데 필요한지 여부를 입증하고자 하는 것이었다.
상기 동물 모델에서 비내 접종 후 코 및 폐에서 RSV A2 바이러스의 바이러스 복제를 입증하였다. RSV sF 단백질을 안정하게 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 제조하고, 칼럼 정제하였다. 애주번트가 첨가되지 않은, 또는 2.5 ㎍/2% 용량의 GLA-SE 애주번트가 첨가된, 10 또는 100 ㎍의 RSV sF를 0일 및 22일째 암컷 스프라그 다울리 래트 근육내로 투여하고, 모든 동물에서 백신화 후 14, 22 및 42일째 혈청학적 항F 항체 반응 및 RSV 중화 항체 반응을 측정하였다(n = 4-6마리/군). 모든 동물에서 46일째(RSV 접종 후 4일째) F 특이 T 세포 반응을 측정하였다(n = 3-4마리/군). 접종 후 국소 방어 면역은 접종 후 4일째 폐 및 코로부터의 RSV 제거에 의해 입증되었다. 본 연구 결과, RSV F 특이 체액성 면역 반응은 애주번트 존재 및 부재하의 항원, 둘 모두에 의해 유도된 반면, RSV F 특이 세포성 면역 반응은 항원 및 애주번트에 의존적인 것으로 나타났다. 스프라그 다울리 래트에서 RSV sF + GLA-SE 백신 후보물질에 의해 유도된 체액성 및 세포성 면역 반응은 폐 및 코, 둘 모두에서 RSV 접종으로부터 완전한 방어를 제공하였다.
백신 조성물은 근육내 주사에 의한 투여용으로 글루코피라노실 지질 A/안정한 에멀젼(GLA-SE)(이뮨 디자인 코포레이션: 미국 워싱턴주 시애틀) 애주번트가 첨가된 정제된 RSV 가용성 F(sF) 단백질을 함유하였다. 재조합 RSV sF 단백질은 안정한 클론성 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주로부터 생성되었다. 고전적 칼럼 정제 방법을 사용하여 본 연구를 위해 RSV sF를 정제하였다.
이상적인 독성 연구용 동물 종은 (i) 중요한 면역학적 반응 모두를 보이며 백신 항원 및 애주번트에 반응하고, (ii) 백신 표적화된 병원체에 감수성이고, (iii) 전체 인간 용량 전달을 수용할 수 있는 것이다. 독성 연구용 모델은 F 특이 체액성 면역 반응, F 특이 T 세포 반응을 보여야 하고, 백신화되지 않은 상태에서 RSV 감염을 허용하어야 하지만, 일단 백신화되고 나며, RSV 접종으로부터 방어될 수 있어야 한다. 스프라그 다울리 래트는 최대 500 ㎕를 근육내로 투여받을 수 있는 표준 독성 연구용 종이다. 본 연구에서, 본 발명자들은 나이브 스프라그 다울리 래트에서 RSV A2 균주의 복제를 확인하였고, RSV sF가 RSV 접종에 대해 방어하는 체액성 및 세포성 면역을 유도하였다는 것을 발견하였고, 이로써, RSV 백신 후보물질을 평가하는 데 적합한 독성 연구용 모델에 대한 모든 기준을 충족시킨다는 것을 발견하게 되었다.
나이브 래트에서 초기 연구를 수행하여 RSV A2 복제를 확인하고, RSV A2 감염 후 최고 바이러스 역가에 도달하는 날을 측정하였다. RSV 나이브 암컷 SD 래트로 이루어진 5개의 코호트를 2 x 106 pfu RSV A2를 이용하여 비내로 감염시켰다. 감염 후 1, 4, 6, 8, 및 14일째, 안락사시킨 래트를 군당 5마리씩 그로부터 따로따로 폐 및 코를 수거하고, 당일 균질화시키고, 플라크 검정법에 의해 RSV에 대해 역가하였다. 본 연구 결과, 최고 바이러스 복제에 도달하는 날은 RSV 감염 후 4일째였다. 본 연구에서는 추가 검정을 수행하지 않았다.
후속 연구에서, RSV SF의 프라임 부스트 요법 후 면역원성 및 방어를 평가하였다. 40마리의 나이브 암컷 스프라그 다울리 래트를 코호트당 동물 5-6마리로 이루어진 지정된 백신 코호트로 나누었다. 간략하면, 애주번트 부재 하에 RSV sF(동물 1마리당 10 ㎍ 또는 100 ㎍씩), 또는 GLA-SE(2% SE 중 2.5 ㎍)와 함께 RSV sF(동물 1마리당 10 ㎍ 또는 100 ㎍씩)를 테스트 군에 제공하였다. 음성 대조군에는 위약(PBS 완충제) 또는 RSV sF 부재 하에 애주번트 GLA-SE(2.5 ㎍/2%)를 투여하였다. 양성 대조군에는 2 x 106 pfu 생 RSV A2를 비내로 접종하였다. 군 1-6에는 0일 및 22일째 500 ㎕의 지정된 백신 물품을 IM으로 접종하였고, 7군에는 오직 0일째에만 200 ㎕의 RSV A2 바이러스를 IN으로 접종하였다. 42일째 모든 동물에 2 x 106 pfu 생 RSV A2 바이러스를 IN으로 접종하였다. 연구 1로부터 특정된 최고 바이러스 복제에 도달한 날인 46일째인 접종 후 4일째 래트를 안락사시켰다. 폐(포르말리 고정된 1개의 엽은 제외) 및 코를 균질화시키고, 바이러스 역가에 대해 정량화하였다.
접종 후 래트를 직접 관찰함으로써, 및 연구 진행 과정 동안 매주 3회에 걸쳐 동물 체중을 추적 조사함으로써 애주번트가 첨가된 백신 제제의 반응원성을 평가하였다(데이터는 나타내지 않음).
면역화 후 6시간째, D22, 및 D42에 모든 동물에 대하여, 및 군당 동물 3마리씩 그로 이루어진 서브세트에 대해 14일째에 백신화에 대한 혈청학적 반응을 평가하였다. 동물을 이소플루란으로 약하게 마취시키고, 안와내로 출혈시켰다. 혈청을 분리하고, -20℃에서 보관하고, 테스트를 위해 해동시켰다. 면역화 후 6시간째 수득된 혈청을 다중 ELISA에 의해 시토카인 역가에 대하여 평가하였다. 14, 22, 및 42일째 얻은 혈청을 ELISA 종점 희석 역가에 의해 전체 항F IgG에 대하여 평가하였다. 42일째 혈청을 ELISA 종점 희석 역가에 의해 IgG1, IgG2a, 및 IgG2b 항F 반응의 특이적인 기여에 대하여 평가하였다. 혈청 RSV 중화 역가를 22일 및 42일째에 RSV A2-GFP 미세중화 검정법에 의해 측정하였다.
46일째(RSV 접종 후 4일째) 모드 이용가능한 동물에서 백신화에 대한 전신 세포성 면역 반응을 평가하였다. 각 군에 디하여 각각의 개별 비장세포 샘플을 제조하였다. RSV sF로의 36-48시간 동안의 재자극 후 IFNγ 분비 세포의 ELISPOT 계수에 의해 T 세포 판독 결과를 평가하였다. 유의 수준 컷오프 p<0.05로 터키 또는 본페로니 사후 검정과 함께 그래프패드 프리즘 일원 ANOVA를 사용하여 유의 수준을 계산하였다.
IM 투여용으로 테스트 물품을 제제화하여 500 ㎕ 용량으로 원하는 최종량의 항원 및 애주번트를 달성하였다. 첨가 순서는 하기와 같았다: PBS를 먼저 첨가한 후, GLA-SE 애주번트(사용시)를 1:3 최종 희석률로 첨가한 후, RSV sF 항원(사용시)을 (10 ㎍ 용량의 경우) 1:500 최종 희석률로, 또는 (100 ㎍ 용량의 경우) 1:50 최종 희석률로 첨가하였다. 제제화된 테스트 물품을 30초 동안 와동시켜 혼합하고, 동물에게 투여하기 전 최대 15시간 동안 4℃에서 보관하였다. 동물에게 투여하기 위해 ACF 직원에게 인계하기 전에 보관된 테스트 물품을 와동시켜 철저하게 혼합하였다.
동물에게 투여하기 전 1시간 이내에 IN 접종(inoculation) 및 접종(challenge)을 위해 생 RSV A2를 제조하였다. RSV A2 분취량을 얼음 상에서 해동시켰다. 200 ㎕ 중 2 x 106 pfu 용량의 경우, 1.66 x 10 pfu/mL의 120.4 ㎕ 바이러스 스톡을 79.6 ㎕ 옵티멤 플러스(Optimem plus) 1xSP로 희석시켰다. 300 ㎕ 과잉 용량으로 제조하고, 동물 접종을 위해 습식 얼음 상에서 ACF 직원에게 인계하였다.
항F mAb(팔리비주맙)를 이용하여 잔류 백신 제제에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행함으로써 음성 대조군 중 RSV sF의 결여, 및 3 및 5군, 및 4 및 6군 중 등가량의 RSV sF의 존재를 확인하였다(데이터 나타내지 않음). 웨스턴 블롯 분석에 소비되지 테스트 물품은 모두 폐기하였다.
논의
스프라그 다울리 래트의 폐 및 코에서의 시간 경과에 따른 RSV A2 균주 복제를 조사하는 초기 연구에서, 25마리의 래트를 0일째 2 x 106 pfu의 RSV A2 바이러스를 IN으로 접종하였다. 접종 후 1, 4, 6, 8, 및 14일째 수거된 균질화된 폐 및 코에서 RSV 바이러스 역가를 측정하였다. RSV 바이러스 복제는 1, 4, 및 6일째 테스트된 동물 모두에서 검출되었고, 4일째 폐 및 코, 둘 모두에서 최고점에 도달하였다(도 30). 접종 후 4일째, 폐에서의 최고 바이러스 부하량은 평균 ~105 pfu/g이고, 코 균질액에서의 최고 바이러스 부하량은 평균 ~103.4 pfu/mL인 것이 검출되었다. 6일째까지, 바이러스 역가는 약 절반만큼 감소하였다. 8일째 동물 5마리 중 단 1마리가 폐에서 임의의 검출가능한 바이러스 역가를 보였고, 상기 동물은 코에서는 어떤 검출가능한 역가도 보이지 않았다. 그러므로, 스프라그 다울리 래트에서의 RSV SF 백신 접종 연구를 위해, 최고 바이러스 복제에 도달한 날을 나타내는 것인 RSV 접종 후 4일째에 폐 및 코를 수득하였다.
백신을 제조하고, 0일째 모든 동물에 제공하였다. 1-6군은 22일째에 부스터 백신을 받았다. 모든 백신은 우수한 내성을 띠었고, 어느 군에서도 주사 부위 반응은 보고되지 않았다. 동물의 체중을 추적 조사하고, 군별 초기 출발 체중으로부터의 변화율(%)로서 제시하였다. 일반적으로, 연구 진행 동안 동물의 체중은 빠르게 증가하였고, 투여받은 백신 제제와는 상관없이 접종 후 체중 감소는 없었다. 그러나, 혈액 채취 이전 이소플루오란 마취에 기인하여 연구 진행 동안 동물 3마리의 체중은 감소하였다(0일째의 접종 시점 후 6시간째에 5군에서 동물 2마리, 및 14일째에 3군에서 동물 1마리).
GLA-SE는 마우스, 기니아 피그, 토끼, 원숭이, 및 인간에서는 활성을 보였지만, 래트에서는 앞서 평가되지 못했던 TLR4 자극 애주번트이다. TLR4 효능제 모노포스포릴 지질 A(MPL) 함유 백신 제제가 백신화 후 처음 6시간 이내에 마우스의 혈청 중에 IL-6 및 MCP-1을 검출가능한 수준으로 유도하는 것으로 보고되었다(문헌 [(Didierlaurent et al., ASO4, an aluminum salt- and TLR4 agonist-based adjuvant system, induces a transient local immune response leading to enhanced adaptive immunity. J Immunol. 2009; 183:6186-97]). 일관되게, GLA-SE 투여 후 6시간째까지 BALB/c 마우스에서 상기 및 다른 혈청 시토카인이 관찰되었다. GLA-SE가 스프라그 다울리 래트에서 선천성 면역 자극 활성을 가지는지 여부를 측정하기 위해, 비드 기반 다중 ELISA 검정법에 의해 면역화 후 6시간째 IL-6, MCP-1, MIP-1β, 및 KC를 비롯한 시토카인의 혈청 수준을 평가하였다. 각각의 상기 시토카인에 대한 GLA-SE 의존성 혈청 시토카인 반응이 관찰되었다(도 31). 혈청 중에서 검출되는 상기 시토카인 중 가장 풍부한 것은 호중구 화학주성 인자인 KC(CXCL1)이고, 그 다음은 단핵구 화학주성 인자 MCP-1(CCL2) 및 MIP-1α(CCL3), 및 다분화능 시토카인 IL-6이었다. IL-1β 및 TNFα를 비롯한 수개의 추가 시토카인 또한 연구되었지만, 나타난 시토카인은 검정 기준선 초과로 검출가능한, GLA-SE에 의해 조절되는 유일의 것이었다.
백신화 14일째, 22일째 및 42일째, 각 백신 코호트에 대해 유도된 F 유도성 항체 반응을 평가하고, 대조군과 비교하였다(도 32). 각 시점에 RSV sF + GLA-SE 군의 반응은 그의 매칭되는 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 군에서보다 유의적으로 더 컸다. 유일하게 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 코호트에서만이 생 RSV에 의해 달성된 것보다 큰 혈청 항F IgG 종점 역가가 발생하였고, 42일째 이러한 차이는 RSV sF + GLA-SE 군, 모두에 대해 유의적이었다. 그러나, 어느 시점에서도 애주번트가 첨가되지 않거나, 또는 애주번트가 첨가된, 10 및 100 ㎍의 RSV sF에 의해 유도된 IgG 역가 사이에는 유의차는 없었다. 이러한 결과는 스프라그 다울리 래트에서 혈청 항F IgG 역가 유도는 10 ㎍에서 100 ㎍으로의 RSV sF의 용량 증가에 의해 영향을 받지 않았지만, GLA-SE 애주번트 첨가에 의해서는 증진되었다는 것을 나타낸다.
42일째 백신화 후 T 헬퍼 유형 균형의 지표로서 IgG1, IgG2a, 및 IgG2b 이소형에 대하여 혈청 F 특이 항체 또한 평가하였다. 42일째 F 특이 IgG1 역가(Th2형 서브타입) 및 F 특이 IgG2a 및 IgG2b 역가(Th1형 서브타입) 둘 모두 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신 또는 생 RSV A2를 받은 래트에서 존재하였다(도 33). 생 RSV 군에서 IgG2a 역가는 IgG1 역가와 등가였고, 이는 마우스와 비교하여 래트에서 Th 평향이 명확하게 정의되어 있지 않을 수 있다는 것을 제안한다. 그러나, 생 RSV A2를 받은 래트에서 IgG2b 역가는 Th1 반응과 일관되게, IgG1 역가보다 높았다. 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF를 받은 래트는 Th2 반응과 일관되게, IgG2b 역가보다 더 높은 IgG1 역가를 보였다. RSV sF + GLA-SE로 백신화되 래트는 같은 용량의, 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 군과 비교하여 같은 이소형을 더 높은 수준으로 가졌다. 전반적으로, GLA-SE를 투여받은 군에서 IgG2b 역가 증가(~64배)는 IgG1 역가 증가(~16배)보다 더 컸다. 이는 GLA-SE가 스프라그 다울리 래트에서 RSV sF에 대하여 더욱 큰 Th1 편향된 면역 반응을 촉진시키는 데 도움을 준다는 것을 제안한다.
22일째(1차 투여 후 22일째) 및 42일째(2차 투여 후 20일째) RSV 백신에 대한 중요한 기능성 판독 결과인 혈청 RSV 중화 역가를 평가하였다. 22일째 상이한 면역화된 동물 군에 대한 GMT log2 IC50 혈청 중화 역가 범위는 2.96(위약 군) 내지 9.47(sF(100 ㎍) + GLA-SE 군)이었다(도 34). 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 백신을 받은 래트는 22일째 위약과 유의적으로 다르지 않은 RSV 중화 역가를 보였다. 그에 반해, 22일째에 음성 대조군 또는 쌍을 이룬 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 군에서 관찰되는 것보다 유의적으로 더 큰 높은 중화 역가가 GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 백신 군(log2 GMT 8.89-9.47) 및 생 RSV 군(log2 GMT 8.51)에 의해 달성되었다. 22일째의 것(log2 GMT 8.89-9.47)과 비교하여 42일째에 RSV sF + GLA-SE 군에서 RSV 중화 역가의 10-20배 증진된 것log2 GMT 13.25-12.86이 관찰된 것과 같이, 중화 항체 역가는 백신의 2차 투여로 부스팅되었다. 또한 42일 시점에 RSV sF + GLA-SE 면역화된 군은 음성 대조군 및 쌍을 이룬 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 군, 둘 모두와 비교하여 유의적으로 더 큰 중화 역가를 보였다. 생 RSV 군 또한 음성 대조군과 비교하여 유의적으로 더 큰 중화 역가(log2 GMT 9.41)를 보였다. 흥미롭게도, 본 연구에서 백신 유도성 혈청 중화 역가에 대한 RSV sF 용량 의존성은 없었다.
전신 F 특이 T 세포 면역 반응은 RSV SF 백신화에 대한 또 다른 중요한 기능성 반응이다. 46일째(RSV 접종 후 4일째) 각 군(n = 4-6)의 동물 각 개체로부터 비장세포를 수거하였다. RSV sF 단백질 재자극을 사용하여 IFNγ ELISPOT에 의해 반응을 평가하였다. 위약 군, 애주번트 단독 군, 및 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF 군(10 및 100 ㎍)은 등가인 F 특이 반응(각각 61.07, 47.73, 64.00, 및 87.78 SFU/106 세포)을 보였다. 그러나, GLA-SE 애주번트가 첨가된 RSV sF 군(10 및 100 ㎍) 및 생 RSV 군, 둘 모두는 위약군보다 유의적으로 더 큰 F 특이 IFNγ ELISPOT 반응을 보였다(각각 259, 362.67, 및 258.13 SFU/106 세포)(도 35). 이는 RSV SF가 스프라그 다울리 래트에서 RSV sF에 대한 T 세포 반응을 GLA-SE에 의존하는 방식으로 프라이밍시킬 수 있다는 것을 나타내었다. T 세포의 서브타입(CD4 또는 CD8)이 본 검정으로부터 측정될 수는 없지만, 외인성 항원, 예컨대, RSV sF 단백질이 CD4 반응을 자극시킬 가능성이 가장 크다.
RSV 접종으로부터의 방어는 백신화에 대한 측정된 면역학적 반응이 생체내에서 RSV 복제를 중화시키는 데 효과적이라는 것을 나타낸다. 백신화 후, 42일째에 모든 군에 2 x 106 pfu의 RSV A2 바이러스를 비내로 접종하였다. 46일째(접종 후 4일째) 수거된 균질화된 폐 및 코 중 RSV를 적정하였다. 모든 음성 대조군 동물에서 예상된 폐 중 바이러스 복제는 본 연구에서는 시간 경과에 따른 초기 바이러스 복제 연구에서의 것과 일치하지 않았다. 본 연구에서는 5마리의 위약 동물 중 단 3마리, 및 5마리의 애주번트 단독인 동물 중 3마리가 접종 후 폐에서 검출가능한 RSV를 가졌다(도 36). 코에서의 복제는, 5마리의 위약 동물 중 5마리, 및 5마리의 애주번트 단독인 동물 중 4마리에서의 검출가능한 RSV 바이러스 부하량과 같은 예상 결과와 더 일치하였다. 위약 바이러스 역가는 폐에서는 102.30(평균 LOD 100.94) 및 코에서는 102.62(평균 LOD 100. 60)였다. 비임상 동물 모델에서 유의적인 RSV 방어는 이력에 따르면 백신화된 동물과 위약 동물 사이의 ≥102 역가 감소로서 정의되지만, 이러한 차는 위약 동물에서는 복제 수준이 낮기 때문에 달성되지 않았다. 그러나, 생 RSV A2로의 사전 감염은 본 군 중 접종받은 모든 동물의 상기도 및 하기도에서 RSV 복제를 완전하게 억제시켰고, 6마리의 동물 중 6마리가 폐 또는 코에서 검정 LOD 초과인 바이러스 역가를 보이지 않았다. RSV sF(10 ㎍) + GLA-SE에서, 4마리 동물 모두 상기도 및 하기도, 둘 모두에서 RSV 접종으로부터 완전하게 방어되었다. RSV sF(100 ㎍) + GLA-SE 백신화는 6마리의 동물 중 5마리의 폐에서, 및 6마리의 동물 중 4마리의 코에서 바이러스 복제를 억제시켰다. 그에 반해, 10 또는 100 ㎍의, 애주번트가 첨가되지 않은 RSV sF는 위약 또는 GLA-SE 단독인 것으로 백신화된 동물과 동일한 바이러스 역가 확산을 보였고, 여기서, 군당 단 1-2마리의 동물에서 역가는 검출 한계 미만이었다. 본 데이터는 스프라그 다울리 래트에서 RSV SF 백신화의 방어 효과와 일치하는 것이다.
결론
본 연구에서는 2% 중 2.5 ㎍의 GLA-SE와 함께 10 또는 100 ㎍의 RSV sF를 이용한 프라임 부스트 접종은 스프라그 다울리 래트를 RSV 접종으로부터 방어한 RSV F 특이 체액성 및 세포성 면역을 유도하는 것으로 나타났다. F 특이 IgG는 RSV SF로의 단일 접종 후 14일째인 조기 시점에 검출가능하였고, 42일째까지 Th1 유사(IgG2b > IgG1)를 특징으로 하였다. RSV SF로의 단일 접종 후 22일째까지 RSV 중화 항체의 유의적인 역가가 검출가능하였고, RSV SF로의 2차 접종에 의해 부스팅되었다. F 특이 T 세포 반응은 RSV SF 면역화된 코호트, 둘 모두에서 접종 후 검출되었다. 고용량 및 저용량의 RSV sF가 유사한 체액성 및 세포성 면역 반응을 일으켰지만, GLA-SE 존재는 체액성 반응을 유의적으로 증가시켰고, 이는 RSV sF에 대한 세포 반응을 위해 필수적이었다. GLA-SE는 접종 후 6시간째 혈청 중에서 시토카인, 예컨대, IL-6, KC, MCP-1, 및 MIP-1α 검출에 의해 입증되는 바와 같이, 래트에서 선천성 면역을 자극시킬 수 있는 능력을 가진다. 백신에 대한 선천적인 반응이 어떤 체중 감소 또는 주사 부위 반응을 일으키지는 않았다. 단독으로 제공된 GLA-SE는 RSV sF + GLA-SE와 유사한 선천성 면역 자극 능력을 가졌지만, 이는 RSV 특이 체액성 및 세포성 반응을 유도하지도 않았고, RSV 접종에 대해 방어하지도 않았다. 따라서, 스프라그 다울리 래트는 RSV SF의 안전성을 평가하는 데 적합한 독성 연구용 동물 모델이다.
도 37a 및 b는 다양한 조성물에 대한 주사 내성을 보여주는 그래프이다. (a) 백신화된 코튼 래트에서의 체중 변화; 및 (b) 백신화된 스프라그 다울리(SD: Sprague Dawley) 래트에서의 체중 변화. sF + GLA-SE 백신은 코튼 래트(CR: cotton rat) 및 스프라그 다울리(SD) 래트에서 허용가능한 반응원성을 가진다. 부위 반응는 없고, 백신화 후 체중은 < 5%로 감소한다.
실시예 4: 비인간 영장류 면역원성 데이터
애주번트가 첨가된 RSV sF 백신이 비인간 영장류에서 장기간 지속되는 F 특이 체액성 및 세포성 면역을 유도한다
시노몰구스 원숭이는 독성 연구용으로 통상 사용되는 비인간 영장류(NHP: non-human primate) 종이고, 애주번트가 첨가된 RSV sF 후보물질 백신에 대한 그의 면역 반응에 의해 조사하였다. 상기 비GLP 연구에서, 2% 안정한 에멀젼(SE) 중 TLR4 효능제 글루코피라노실 지질 A(GLA) 애주번트와 함께 제제화된 정제된 가용성 F(sF) 단백질로 이루어진, 근육내로 투여된 RSV 백신 후보물질의 면역원성을 시노몰구스 원숭이에서 sF 단백질 단독인 것과 비교하였다. 4마리의 NHP로 이루어진 첫번째 군(1군)을 애주번트 없이 100 ㎍의 RSV sF로 면역화시킨 반면, 4마리의 원숭이로 이루어진 두번째 군(2군)은 2% SE 중 5 ㎍ GLA 애주번트와 함께 제제화된 100 ㎍의 RSV sF로 면역화시켰다. 0일 및 28일째 동물을 면역화시키고, 연구 전 -7일째부터 169일째까지 체액성 및 세포성 반응에 대해 모니터링하였다. 이어서, NHP를 각각 169일째 애주번트가 첨가되지 않은 것(1군) 또는 애주번트가 첨가된 백신(2군)으로 부스팅시키고, 이어서 추가의 14일 동안(183일째까지) 장기간 기억 반응에 대해 평가하였다.
백신 유도성 항F IgG 역가에 의해, 및 RSV 중화 항체(Ab) 반응에 의해, 그 둘 모두에 의해서 혈청학적 반응을 평가하였다. 상기 두 군 모두의 동물은 모두 면역화 이전 검출 불가능한 항F IgG 또는 RSV 중화 역가를 보였고, 이는 상기 동물이 RSV 혈청 반응 음성임을 나타낸다. RSV sF 단백질 ELISA에 의해 항F IgG 역가를 측정하였다. 42일째 반응이 최고일 때, 항F IgG 역가의 기하 평균은 RSV sF를 단독으로 받은 1군(10.45 ± 2.68 log2)에서보다 GLA-SE와 함께 RSV sF를 받은 2군에서(15.67 ± 0.53 log2) 유의적으로 더 높았다(p=0.032)(도 57). RSV sF 특이 IgG Ab 역가는 시간이 경과함에 따라 상기 두 군 모두에서 (2군에서 12.85 log2로 및 2군에서 10.13 log2로) 하락하였지만, 부스터 백신화를 제공하는 시점인 169일째(백신화 후 5개월째)까지 검출가능한 반응이 계속해서 관찰되었다. 회수 후 14일째인 183일째, sF 단독 군(기하 평균 12.55 ± 2.16 log2)과 비교하여 sF + GLA-SE 군(기하 평균 15.86 ± 0.85 log2)에서 더욱 큰 반응이 다시 관찰되었다. sF + GLA-SE 군의 모든 동물은 169일째의 것과 비교하여 183일째 ≥4배의 IgG 역가 상승을 보인 반면, sF 단독 군의 4마리 동물 중 단 2마리만이 169일째의 것과 비교하여 183일째 ≥4배의 IgG 역가 상승을 보였다. 상기 데이터는 시노몰구스 NHP 모델에서 GLA-SE 둘 모두 sF 단독인 것과 비교하여 sF에 대한 IgG 반응을 증진시키고, 면역화에 대하여 더욱 균질한 반응을 일으킨다는 것을 입증한다.
sF에 GLA-SE를 첨가한 것이 또한 혈청 RSV 중화 역가를 증진시켰는지 여부를 측정하기 위해, 녹색 형광성 단백질을 발현하도록 조작된 RSV A2 균주(RSV A2-GFP)로의 베로 세포 감염을 중화시키는 데 필요한 log2 IC50 혈청 희석률 역가에 의해 RSV 중화 Ab 수준을 측정하였다. 42일째 반응이 최고일 때, RSV 중화 Ab 역가의 기하 평균은 RSV sF를 단독으로 받은 군(3.52 ± 1.14 log2)과 비교하여 GLA-SE와 함께 RSV sF를 받은 군에서(6.36 ± 1.42 log2) 유의적으로 더 높았다(p=0.022)(도 58). 42일째 최고점일 때, RSV sF + GLA-SE 군의 4마리 동물 중 4마리가 -7일째 수준으로부터 4배 중화 역가 부스트를 보인 반면, RSV sF 단독 군의 4마리 동물 중 단 1마리만이 4배 중화 역가 부스트를 보였다. RSV 중화 Ab 역가는 시간이 경과함에 따라 상기 두 군 모두에서 (169일째 2군에서 3.60 log2로 및 1군에서 2.97 log2로) 하락하였다. 169일째(백신화 후 5개월째), 부스터 백신화를 제공하였다. 3차 면역화 후 14일째인 183일째, sF 단독 군(기하 평균 4.46 ± 1.79 log2)과 비교하여 sF + GLA-SE 군(기하 평균 6.70 ± 1.03 log2)에서 더욱 큰 중화 Ab 역가가 관찰되었다. 상기 데이터는 GLA-SE의 sF에의 첨가가 F 특이 IgG 및 RSV 중화 Ab 반응, 둘 모두의 크기 및 지속 기간, 둘 모두를 증가시킨다는 것을 나타낸다.
GLA-SE와 함께 제제화된 sF로의 면역화가 F 특이 T 세포 반응를 증진시켰는지 여부를 측정하기 위해, RSV F 단백질 서열로부터 유래된 중첩 15-mers의 펩티드 풀로 재자극한 후, ELISPOT에 의해 F 특이 IFNγ T 세포 반응을 측정하였다. 42일째 반응이 최고일 때, RSV sF + GLA-SE 군의 4마리의 NHP 모두 연구 전 기준선(-7일째)으로부터의 50 스폿 형성 계수(SFC)/106 PBMC의 최소 증가, 및 -7일째로부터의 SFC/106 PBMC의 최소 4배 상승인 것으로 정의되는 양성 반응을 보인 반면, RSV sF 단독 군의 4마리의 원숭이 중 어느 것도 양성 반응을 보이지 않았다(4마리 중 0마리). 42일째, sF + GLA-SE 군의 평균 반응은 392 SFC/106 PBMC로서, F 단독 군(8 SFC/106 PBMC)에서의 것보다 유의적으로 더 컸다(p=0.019)(도 59). sF + GLA-SE 군에서 T 세포 개수는 시간이 경과함에 따라 감소하였지만, 한 동물은 169일째까지 양성 반응자 정의를 계속해서 충족시켰다. 169일째(백신화 후 5개월째), 부스터 백신화를 제공하였다. 3차 면역화 후 14일째인 183일째, IFNγ T 세포는 sF + GLA-SE 군의 3마리의 원숭이에서 유의적으로 더 높았고, 그의 반응은 약해졌고, sF + GLA-SE 군에서 4마리 동물 중 4마리의 총 반응률(평균 261 SFC/106)을 제공하였다. 비교하면, sF 단독 군에서 4마리의 원숭이 중 어느 것도 IFNγ 분비 F 특이 T 세포(평균 5 SFC/106) 증가 반응을 보이지 않았다(4마리 원숭이 중 0마리).
결론적으로, 강건한 혈청 항F IgG 반응, RSV 중화 반응, 및 F 특이 IFNγ T 세포 반응은 sF + GLA-SE 면역화된 동물에서 애주번트가 첨가되지 않은 sF 단독 면역화된 군에서 관찰된 것보다 유의적으로 더 큰 수준으로 관찰되었다. 상기 반응은 2차 면역화 후 2주째에 최고점에 도달하였고, 백신화 후 3-5개월 동안 검출가는한 상태 그대로 유지되었고, 이 시점에 3차 면역화에 의해 등가 수준 또는 더 높은 수준으로 부스팅하였다. 본 연구는 RSV sF + GLA-SE로 이루어진 단백질 서브유니트 백신이 비인간 영장류에서 RSV에 대하여 강건하고, 장기간 지속되는 체액성 및 세포성 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
참고 문헌 포함
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등가물
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Ser Glu Arg Leu Glu Thr His Arg 1040 1045 1050 Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Gly Leu Val Ala Leu Ala Ser Asn 1055 1060 1065 Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Leu Ala Ser Pro Ile 1070 1075 1080 Leu Glu Pro His Glu Ala Ser Asn Pro Arg Leu Tyr Ser Thr Tyr 1085 1090 1095 Arg Ala Ser Pro Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Glu Met Glu 1100 1105 1110 Thr Thr His Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Ala Ser 1115 1120 1125 Pro Val Ala Leu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Val Ala 1130 1135 1140 Leu Ile Leu Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Leu Glu Gly Leu Tyr 1145 1150 1155 Ala Leu Ala Ile Leu Glu Val Ala Leu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser 1160 1165 1170 Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Thr His Arg Leu Tyr Ser 1175 1180 1185 Cys Tyr Ser Thr His Arg Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ala Ser Asn 1190 1195 1200 Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ile Leu Glu 1205 1210 1215 Ile Leu Glu Leu Tyr Ser Thr His Arg Pro His Glu Ser Glu Arg 1220 1225 1230 Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ala Ser Pro Thr Tyr Arg 1235 1240 1245 Val Ala Leu Ser Glu Arg Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr 1250 1255 1260 Val Ala Leu Ala Ser Pro Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg 1265 1270 1275 Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Thr His Arg Leu Glu Thr 1280 1285 1290 Tyr Arg Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Gly 1295 1300 1305 Leu Asn Gly Leu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Leu Glu 1310 1315 1320 Thr Tyr Arg Val Ala Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Pro 1325 1330 1335 Arg Ile Leu Glu Ile Leu Glu Ala Ser Asn Pro His Glu Thr Tyr 1340 1345 1350 Arg Ala Ser Pro Pro Arg Leu Glu Val Ala Leu Pro His Glu Pro 1355 1360 1365 Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Gly Leu Pro His Glu Ala Ser Pro 1370 1375 1380 Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ile Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Asn 1385 1390 1395 Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu Leu Tyr Ser Ile Leu Glu Ala 1400 1405 1410 Ser Asn Gly Leu Asn Ser Glu Arg Leu Glu Ala Leu Ala Pro His 1415 1420 1425 Glu Ile Leu Glu Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Ser 1430 1435 1440 Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu His Ile Ser Ala Ser Asn Val Ala 1445 1450 1455 Leu Ala Ser Asn Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ser Glu 1460 1465 1470 Arg Thr His Arg Thr His Arg Ala Ser Asn 1475 1480 <210> 8 <211> 1725 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotdie <400> 8 atggaacttc ttattctcaa agccaatgcg attacaacaa tccttactgc tgtaaccttc 60 tgcttcgcat ctggacagaa tatcaccgag gaattctatc aatccacctg cagcgcggtg 120 tcaaaggggt atctttccgc attgagaaca ggttggtata catccgttat tactattgag 180 ctgtctaaca tcaagaagaa taaatgtaat ggaactgacg caaaagtgaa gctgatcaag 240 caggagcttg ataagtacaa aaacgctgtg acagaactcc agctcctcat gcagagcacc 300 ccggcgacga acaatagagc gcggcgcgag ctgcctaggt ttatgaatta tacccttaac 360 aacgctaaga agacaaacgt gacgctctca aagaagagga aacgaaggtt tcttggattc 420 ctgctcgggg tgggatccgc tattgcaagc ggcgtggcgg tttcaaaggt cctccacctg 480 gagggggaag tgaacaagat taagtcagca ctcctgagta caaacaaagc agtggtttct 540 ctgagcaacg gagtgtcagt attgacgagc aaggtgcttg acctcaagaa ctacattgac 600 aaacagctgc tgcccatagt gaacaaacag tcatgctcca tctccaatat cgagacagtc 660 atcgaattcc agcagaagaa caacagactc ctggaaatca cacgggagtt tagcgtgaat 720 gcgggcgtaa caactcccgt gtccacctac atgctgacaa attctgagct gctgagtctg 780 ataaatgata tgcctattac aaatgaccag aagaagttga tgtccaacaa tgtgcaaata 840 gtcagacagc agtcttatag tattatgagc atcatcaaag aggaagttct tgcctatgtt 900 gtacaactgc ccctctacgg ggtcatcgac acaccctgtt ggaagctgca cacctcacct 960 ctgtgcacca ccaacacgaa agagggtagc aacatctgtc tgactaggac tgacaggggt 1020 tggtactgcg ataacgccgg tagcgtgtca tttttcccac aagcagagac ttgtaaagta 1080 cagtccaaca gggtcttttg tgacacaatg aattctctta ccctgcccag cgaagttaat 1140 ctgtgtaacg tcgatatctt taatccaaag tacgattgta aaatcatgac atctaaaacc 1200 gatgtgagca gcagcgttat tacaagtctt ggcgctatcg tcagctgtta cggaaaaacc 1260 aagtgcacgg catccaacaa gaatagaggc attataaaga ccttcagtaa tgggtgtgac 1320 tacgttagca ataagggcgt agacaccgtc tccgtaggaa acacactgta ctatgtaaat 1380 aaacaagaag gcaaatccct ttatgtgaag ggggagccta tcattaattt ctacgaccct 1440 ctggttttcc cgagtgacga gttcgatgcc agcatatccc aagtgaatga gaaaatcaac 1500 cagtccttgg cctttataag gaaaagcgat gagcttctgc acaacgtgaa tgccggtaaa 1560 tccaccacaa acataatgat caccactatc attatcgtca ttattgtgat cttgctgagc 1620 ctcatcgctg tggggctcct cttgtattgc aaagcccgct caaccccagt cactctctct 1680 aaagaccaac tgtctgggat caataacata gccttttcaa attag 1725 <210> 9 <211> 1725 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 9 atggagttgc tcatcctcaa ggccaacgcc atcaccacga tcctcacggc cgtcacgttc 60 tgcttcgcgt ccggccagaa catcaccgag gagttctacc agtcgacgtg cagcgccgtg 120 agcaagggct acctcagcgc gctgaggacg ggctggtaca ccagcgtcat cacgatcgag 180 ttgagcaaca tcaagaagaa caagtgcaac ggcaccgacg cgaaggtcaa gttgatcaag 240 caggagttgg acaagtacaa gaacgccgtg accgagttgc agttgctcat gcagagcacg 300 ccggcgacga acaaccgcgc caggagggag ctcccgaggt tcatgaacta cacgctcaac 360 aacgccaaga agaccaacgt gaccttgagc aagaagagga agaggaggtt cctcggcttc 420 ttgttgggcg tcggctcggc catcgccagc ggcgtggccg tctcgaaggt cctgcacctg 480 gagggcgagg tgaacaagat caagagcgcg ctgctctcca cgaacaaggc cgtcgtcagc 540 ttgtccaacg gcgtcagcgt cttgaccagc aaggtgttgg acctcaagaa ctacatcgac 600 aagcagttgt tgccgatcgt gaacaagcag agctgcagca tctcgaacat cgagaccgtg 660 atcgagttcc agcagaagaa caacaggctg ctcgagatca ccagggagtt cagcgtcaac 720 gccggcgtca cgacgccggt cagcacctac atgttgacca acagcgagtt gttgtccttg 780 atcaacgaca tgccgatcac caacgaccag aagaagttga tgtccaacaa cgtgcagatc 840 gtcaggcagc agagctactc gatcatgtcc atcatcaagg aggaggtctt ggcctacgtc 900 gtgcagttgc cgctgtacgg cgtcatcgac acgccctgct ggaagctgca cacgtccccg 960 ctgtgcacga ccaacacgaa ggaggggtcc aacatctgct tgaccaggac cgacaggggc 1020 tggtactgcg acaacgccgg ctccgtgtcg ttcttcccgc aggccgagac ctgcaaggtc 1080 cagtccaacc gcgtcttctg cgacacgatg aacagcttga cgttgccgag cgaggtcaac 1140 ctctgcaacg tcgacatctt caaccccaag tacgactgca agatcatgac gtccaagacc 1200 gacgtcagca gctccgtgat cacgtcgctc ggcgccatcg tgtcctgcta cggcaagacc 1260 aagtgcaccg cgtccaacaa gaaccgcggc atcatcaaga cgttctcgaa cgggtgcgac 1320 tacgtctcga acaagggggt ggacaccgtg tccgtcggca acacgttgta ctacgtcaac 1380 aagcaggagg gcaagagcct ctacgtcaag ggcgagccga tcatcaactt ctacgacccg 1440 ttggtcttcc cctcggacga gttcgacgcg tcgatctcgc aggtcaacga gaagatcaac 1500 cagagcctgg cgttcatccg gaagtccgac gagttgttgc acaacgtgaa cgccggcaag 1560 tccaccacga acatcatgat cacgacgatc atcatcgtga tcatcgtgat cttgttgtcg 1620 ttgatcgccg tcggcctgct cttgtactgc aaggccagga gcacgcccgt cacgctgagc 1680 aaggaccagc tgagcggcat caacaacatc gcgttcagca actaa 1725 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 11 Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile 1 5 10 15 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile 1 5

Claims (41)

  1. 약 1 ㎍ 이상 약 200 ㎍ 이하의 RSV 가용성 F 단백질 및 약 1 ㎍ 이상 약 20 ㎍ 이하의, 지질 톨 유사 수용체(TLR) 효능제를 포함하는 애주번트(adjuvant)를 포함하는 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, RSV 가용성 F 단백질은 C 말단 막횡단 도메인이 결여된 것인 백신 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, RSV 가용성 F 단백질은 세포질 테일(cytoplasmic tail) 도메인이 결여된 것인 백신 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 가용성 F 단백질은 인간 균주 A2로부터의 RSV 가용성 F 단백질(서열 번호 2)의 아미노산 1-524를 포함하는 것인 백신 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 가용성 F 단백질은 서열 번호 7을 포함하는 것인 백신 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 (TLR)4 효능제를 포함하는 것인 백신 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 합성 헥실화 지질 A 유도체를 포함하는 것인 백신 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 글루코피라노실 지질 A(GLA)를 포함하는 것인 백신 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하는 것인 백신 조성물:
    Figure pct00004

    상기 식에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C12-C20 알킬이다.
    [청구항 9]
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 안정한 수중유 에멀젼 중 GLA(GLA-SE)를 포함하는 것인 백신 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 안정화된 스쿠알렌계 에멀젼 중 GLA를 포함하는 것인 백신 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는, 농도가 약 1% 이상 약 5% 이하인 안정화된 수중유 에멀젼 중 GLA를 포함하는 것인 백신 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는, 평균 입자 크기가 약 50 nm 이상 약 200 nm 이하인 안정화된 수중유 에멀젼 중 GLA를 포함하는 것인 백신 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 백신 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 백신 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약 20 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 백신 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 약 30 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 백신 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 백신 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 백신 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2.5 ㎍ 이상의 애주번트를 포함하는 것인 백신 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ㎍ 이상의 애주번트를 포함하는 것인 백신 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 RSV 가용성 F 단백질 및 약 1 ㎍ 내지 약 5 ㎍의 GLA-SE를 포함하는 것인 백신 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 RSV 가용성 F 단백질, 및 농도가 약 1% 내지 5%인 안정화된 수중유 에멀젼 중 GLA 약 1 ㎍ 내지 약 5 ㎍을 포함하고, 여기서, RSV 가용성 F 단백질은 인간 균주 A2로부터의 RSV 가용성 F 단백질(서열 번호 2)의 아미노산 1-524를 포함하는 것인 백신 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 그의 조합을 추가로 포함하는 것인 백신 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 비경구 투여용으로 제제화된 백신 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 근육내 투여용으로 제제화된 백신 조성물.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 피하 투여용으로 제제화된 백신 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50 ㎕ 내지 약 500 ㎕의 부피를 포함하는 것인 백신 조성물.
  28. 포유동물에서 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염을 예방하는 방법으로서, 포유동물에서 RSV 감염을 예방하는 데 충분한 농도의 약 1 ㎍ 이상 약 200 ㎍ 이하의 RSV 가용성 F 단백질 및 약 1 ㎍ 이상 약 20 ㎍ 이하의, 지질 톨 유사 수용체(TLR) 효능제를 포함하는 애주번트를 포함하는 치료학상 유효량의 백신 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 포유동물에서 방어 면역 반응을 유도하는 데 충분한 농도의 약 1 ㎍ 이상 약 200 ㎍ 이하의 RSV 가용성 F 단백질 및 약 1 ㎍ 이상 약 20 ㎍ 이하의, 지질 톨 유사 수용체(TLR) 효능제를 포함하는 애주번트를 포함하는 치료학상 유효량의 백신 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 이전에 RSV에 노출된 바 있는 포유동물에서 Th1 편향된 세포성 면역 반응을 증진시키는 방법으로서, 포유동물에서 Th1 편향된 세포성 면역 반응을 증진시키는 데 충분한 농도의 약 1 ㎍ 이상 약 200 ㎍ 이하의 RSV 가용성 F 단백질 및 약 1 ㎍ 이상 약 20 ㎍ 이하의, 지질 톨 유사 수용체(TLR) 효능제를 포함하는 애주번트를 포함하는 치료학상 유효량의 백신 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 포유동물의 세포성 면역 반응은 Th1 세포성 면역 반응 및 Th2 세포성 면역 반응을 적어도 약 1.2:1의 비로 포함하는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 포유동물의 세포성 면역 반응은 IFNγ에 의해 지배되는 것인 방법.
  33. 포유동물에서 Th2 편향된 면역 반응을 역전시키는 방법으로서, 포유동물에서 Th2 편향된 면역 반응을 역전시키는 데 충분한 농도의 약 1 ㎍ 이상 약 200 ㎍ 이하의 RSV 가용성 F 단백질 및 약 1 ㎍ 이상 약 20 ㎍ 이하의, 지질 톨 유사 수용체(TLR) 효능제를 포함하는 애주번트를 포함하는 치료학상 유효량의 백신 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 포유동물에서 RSV에 대한 중화 항체를 유도하는 방법으로서, 포유동물에서 RSV에 대한 중화 항체를 유도하는 데 충분한 농도의 약 1 ㎍ 이상 약 200 ㎍ 이하의 RSV 가용성 F 단백질 및 약 1 ㎍ 이상 약 20 ㎍ 이하의, 지질 톨 유사 수용체(TLR) 효능제를 포함하는 애주번트를 포함하는 치료학상 유효량의 백신 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, RSV 중화 항체 역가는 10.0 Log2 초과인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 백신 조성물 투여 후 RSV 중화 항체 역가는 투여 이전의 혈청 IgG 역가와 비교하여 약 10배 이상 약 200배 이하 더 큰 혈청 IgG 역가를 포함하는 것인 방법.
  37. 포유동물에서 RSV 바이러스 역가를 감소시키는 방법으로서, 포유동물에서 RSV에 대한 중화 항체를 유도하는 데 충분한 농도의 약 1 ㎍ 이상 약 200 ㎍ 이하의 RSV 가용성 F 단백질 및 약 1 ㎍ 이상 약 20 ㎍ 이하의, 지질 톨 유사 수용체(TLR) 효능제를 포함하는 애주번트를 포함하는 치료학상 유효량의 백신 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, RSV 바이러스 역가는 약 50 내지 약 1,000배 감소되는 것인 방법.
  39. 제37항에 있어서, RSV 바이러스 역가는 백신 조성물 투여 후 2 log 10 pfu/그램 미만인 방법.
  40. 제37항에 있어서, RSV 바이러스 역가는 백신 조성물 투여 후 약 1주 내지 약 1년 사이에 2 log 10 pfu/그램 미만인 방법.
  41. 제28항에 있어서, 포유동물은 인간인 방법.
    [청구항 30]
    제28항 또는 제29항에 있어서, 포유동물은 노인(elderly human)인 방법.
    [청구항 31]
    제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 역연령이 약 50세 이상에 달한 노인인 방법.
    [청구항 32]
    제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 역연령이 약 55세 이상에 달한 노인인 방법.
    [청구항 33]
    제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 역연령이 약 60세 이상에 달한 노인인 방법.
    [청구항 34]
    제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 역연령이 약 65세 이상에 달한 노인인 방법.
    [청구항 35]
    제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 RSV 혈청 반응 양성인 방법.
    [청구항 36]
    제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단회 투여 요법을 포함하는 것인 방법.
    [청구항 37]
    제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 및 2차 투여를 포함하는 2회 투여 요법을 포함하는 것인 방법.
    [청구항 38]
    제37항에 있어서, 2차 투여는 1차 투여 후 적어도 약 1주 후에 투여되는 것인 방법.
    [청구항 39]
    제37항에 있어서, 2차 투여는 1차 투여 후 적어도 약 1개월 후에 투여되는 것인 방법.
    [청구항 40]
    제37항에 있어서, 2차 투여는 1차 투여 후 적어도 약 1년 후에 투여되는 것인 방법.
    [청구항 41]
    제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물은 비경구적으로 투여되는 것인 방법.
    [청구항 42]
    제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물은 근육내로의 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
    [청구항 43]
    제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물은 피하로 투여되는 것인 방법.
    [청구항 44]
    제28항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 가용성 F 단백질은 C 말단 막횡단 도메인이 결여된 것인 방법.
    [청구항 45]
    제28항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 가용성 F 단백질은 세포질 테일 도메인이 결여된 것인 방법.
    [청구항 46]
    제28항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 가용성 F 단백질은 인간 균주 A2로부터의 RSV 가용성 F 단백질(서열 번호 2)의 아미노산 1-524를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 47]
    제28항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 가용성 F 단백질은 서열 번호 7을 포함하는 것인 방법.
    [청구항 48]
    제28항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 (TLR)4 효능제를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 49]
    제28항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 합성 헥실화 지질 A 유도체를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 50]
    제28항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 글루코피라노실 지질 A(GLA)를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 51]
    제28항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 하기 화학식을 가지는 화합물을 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00005

    상기 식에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C12-C20 알킬이다.
    [청구항 52]
    제28항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 안정한 수중유 에멀젼 중 GLA(GLA-SE)를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 53]
    제28항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는 안정화된 스쿠알렌계 에멀젼 중 GLA를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 54]
    제28항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는, 농도가 약 1% 이상 약 5% 이하인 안정화된 수중유 에멀젼 중 GLA를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 55]
    제28항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트는, 평균 입자 크기가 약 50 nm 이상 약 200 nm(100 nm) 이하인 안정화된 수중유 에멀젼 중 GLA를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 56]
    제28항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 방법.
    [청구항 57]
    제28항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 방법.
    [청구항 58]
    제28항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 약 20 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 방법.
    [청구항 59]
    제28항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 약 30 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 방법.
    [청구항 60]
    제28항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 방법.
    [청구항 61]
    제28항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100 ㎍ 이상의 RSV 가용성 F 단백질을 포함하는 것인 방법.
    [청구항 62]
    제28항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2.5 ㎍ 이상의 애주번트를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 63]
    제28항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ㎍ 이상의 애주번트를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 64]
    제28항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 RSV 가용성 F 단백질 및 약 1 ㎍ 내지 약 5 ㎍의 GLA-SE를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 65]
    제28항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 RSV 가용성 F 단백질, 및 농도가 약 1% 내지 5%인 안정화된 수중유 에멀젼 중 GLA 약 1 ㎍ 내지 약 5 ㎍을 포함하고, 여기서, RSV 가용성 F 단백질은 인간 균주 A2로부터의 RSV 가용성 F 단백질(서열 번호 2)의 아미노산 1-524를 포함하는 것인 방법.
    [청구항 66]
    제28항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물은 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 그의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
    [청구항 67]
    제28항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물은 비경구 투여용으로 제제화된 것인 방법.
    [청구항 68]
    제28항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물은 근육내 투여용으로 제제화된 것인 방법.
    [청구항 69]
    제28항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물은 피하 투여용으로 제제화된 것인 방법.
    [청구항 70]
    제28항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물은 약 50 ㎕ 내지 약 500 ㎕의 부피를 포함하는 것인 방법.
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