JP2019509350A - Dna抗体構築物及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年3月21日出願の米国特許仮出願第62/311,316号、2016年9月19日出願の米国特許仮出願第62/396,748号、2016年9月19日出願の米国特許仮出願第62/396,750号、2016年11月3日出願の米国特許仮出願第62/417,093号、2016年5月4日出願の米国特許仮出願第62/332,381号、2016年8月17日出願の米国特許仮出願第62/376,162号、2016年12月2日出願の米国特許仮出願第62/429,454号及び2016年12月2日出願の米国特許仮出願第62/429,473号の優先権を主張し、これらは、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含め、本文書が優先される。好ましい方法及び材料が下に記載されているが、本明細書に記載されているものに類似した、または同等である方法及び材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示されている材料、方法及び例は、例示的なものにすぎず、制限することを意図していない。
1つの態様において、本発明は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘発する組成物と、抗体をコードする核酸配列、そのフラグメント、その変異体、またはその組み合わせを含む組成物との組み合わせを提供する。組成物を、それを必要とする対象に投与して、合成抗体のインビボ発現及び形成を促進することができる。
上に記載されたように、組成物には、1つ以上の抗原を含む、ワクチンのような免疫原組成物が含まれ得る。ワクチンを使用して任意の数の抗原に対して防御することができ、それによって、抗原に基づく病理に対して治療、予防及び/または防御することができる。ワクチンは、ワクチンが投与された対象に免疫応答を著しく誘導することができ、それによって、抗原による感染を防御し、治療することができる。
ワクチンは、1つ以上の抗原をコードする核酸構築物またはプラスミドを含むことができる。核酸構築物またはプラスミドは、1つ以上の異種核酸配列を含む、または含有することができる。抗原をコードする核酸配列を含むことができる遺伝子構築物が、本明細書において提供される。遺伝子構築物は、機能性染色体外分子として細胞内に存在することができる。遺伝子構築物は、セントロメア、テロメア、またはプラスミドもしくはコスミドを含む線状ミニ染色体であり得る。遺伝子構築物は、1つ以上の異種核酸配列を含む、または含有することができる。
CMVプロモーターにC>G241、
ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bGHpolyA)の下流にC>T1942主鎖、
カナマイシン遺伝子の下流にA>−2876主鎖、
pUC複製起点(Ori)の多コピー数突然変異にC>T3277(Nucleic Acid Research 1985を参照)、
RNASeH部位の上流にあるpUC Oriの最末端にG>C3753。
上に記載されたように、組成物は、組み換え核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、抗体、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。抗体は、下により詳細に記載される。
組み換え核酸配列は、1つ以上の組み換え核酸配列構築物を含むことができる。組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素を含むことができ、下により詳細に記載される。
組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖(VH)領域及び/または少なくとも1つの定常重鎖(CH)領域を含むことができる。少なくとも1つの常重鎖領域には、定常重鎖領域1(CH1)、定常重鎖領域2(CH2)及び定常重鎖領域3(CH3)、ならびに/またはヒンジ領域が含まれ得る。
組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖(VL)領域及び/または定常軽鎖(CL)領域を含むことができる。
組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含むことができる。プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼにより認識され得る。プロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼ、例えば、フリン、エラスターゼ、HtrA、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、チロシン及びペプシンであり得るが、これらに限定されない。プロテアーゼはフリンであり得る。他の実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または内部ペプチド結合を切断する(すなわち、N末端もしくはC末端ペプチド結合を切断しない)任意のプロテアーゼであり得る。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のリンカー配列を含むことができる。リンカー配列は、本明細書に記載されている1つ以上の構成要素を空間的に分離または連結することができる。他の実施形態において、リンカー配列は、2つ以上のポリペプチドを空間的に分離または連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のプロモーターを含むことができる。1つ以上のプロモーターは、遺伝子発現を推進し、遺伝子発現を調節することができる任意のプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、DNA依存性RNAポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用性配列エレメントである。遺伝子発現を指示するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、天然の設定における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離で、組み換え核酸配列構築物の転写開始部位置から位置し得る。しかし、この距離の変動は、プロモーター機能の損失を伴うことなく適応され得る。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のイントロンを含むことができる。それぞれのイントロンは、機能性スプライス供与及び受容部位を含むことができる。イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含むことができる。イントロンは、効率的なスプライシングに必要な1つ以上のシグナルを含むことができる。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の転写終止領域を含むことができる。転写終止領域は、コード配列の下流にあって、効率的な終止を提供することができる。転写終止領域は、上に記載されたプロモーターと同じ遺伝子から得ることができる、または1つ以上の異なる遺伝子から得ることができる。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の開始コドンを含むことができる。開始コドンは、コード配列の上流に位置することができる。開始コドンは、コード配列のフレーム内にあり得る。開始コドンは、効率的な翻訳開始に必要な1つ以上のシグナルと関連することができ、例えば、リボソーム結合部位であるが、これに限定されない。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の終止または停止コドンを含むことができる。終止コドンは、コード配列の下流にあり得る。終止コドンは、コード配列のフレーム内にあり得る。終止コドンは、効率的な翻訳終止に必要な1つ以上のシグナルと関連することができる。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、転写物の効率的なポリアデニル化に必要な1つ以上のシグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、コード配列の下流に位置することができる。ポリアデニル化シグナルは、SV40ポリアデニル化シグナル、LTRポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン(hGH)ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロブリンポリアデニル化シグナルであり得る。SV40ポリアデニル化シグナルは、pCEP4プラスミド(Invitrogen,San Diego,CA)からのポリアデニル化シグナルであり得る。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のリーダー配列を含むことができる。リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリン(Ig)シグナルペプチド、例えば、IgGシグナルペプチド及びIgEシグナルペプチドであり得るが、これらに限定されない。
上に記載されたように、組み換え核酸配列は、1つ以上の組み換え核酸配列構築物を含むことができ、それぞれの組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素を含むことができる。1つ以上の構成要素は、上に詳細に記載されている。1つ以上の構成要素は、組み換え核酸配列構築物に含まれるとき、互いに任意の順番で配置され得る。いくつかの実施形態において、1つ以上の構成要素は、下に記載されているように組み換え核酸配列構築物に配置され得る。
1つの配置において、第1の組み換え核酸構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸酸配列を含むことができ、第2の組み換え核酸構築物は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸酸配列を含むことができる。
第2の配置において、組み換え核酸構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列及び軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むことができる。重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流(または、5’)に位置することができる。あるいは、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流(または、5’)に位置することができる。
上に記載されたように、組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素のうち、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列及び/または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むことができる。したがって、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド及び/または軽鎖ポリペプチドの発現を促進することができる。
上に記載された組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のベクターに配置され得る。1つ以上のベクターは、複製起点を含有することができる。1つ以上のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。1つ以上のベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
1つ以上のベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であり得る。環状プラスミド及び線状核酸は、特定のヌクレオチド配列の発現を適切な対象の細胞において指示することができる。組み換え核酸配列構築物を含む1つ以上のベクターは、キメラであってもよく、これは、構成要素のうちの少なくとも1つが、他の構成要素の少なくとも1つに対して異種であることを意味する。
1つ以上のベクターはプラスミドであり得る。プラスミドは、細胞に組み換え核酸配列構築物を形質移入するのに有用であり得る。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物を対象に導入するのに有用であり得る。プラスミドは調節配列を含むこともでき、このことは、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現にとって好適であり得る。
1つ以上のベクターは環状プラスミドであってもよく、細胞ゲノムへの組み込みによって標的細胞を形質転換することができる、または染色体外に存在してもよい(例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド)。ベクターは、pVAX、pcDNA3.0、もしくはProvax、または組み換え核酸配列構築物によりコードされている重鎖ポリペプチド及び/もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することができる任意の他の発現ベクターであり得る。
組み換え核酸配列構築物が配置される1つ以上のベクターの調製方法が、本明細書において提供される。最終サブクローニングステップの後、ベクターを使用して、大規模発酵タンク内の細胞培養物に、当該技術に既知の方法の使用により接種することができる。
上に記載されたように、組み換え核酸配列は、抗体、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。抗体は、抗原に結合または反応することができ、下により詳細に記載される。
組み換え核酸配列は、二重特異性抗体、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。二重特異性抗体は、2つの抗原と結合または反応することができ、例えば、その抗原のうちの2つが下により詳細に記載される。二重特異性抗体は、本明細書に記載されている抗体のうちの2つのフラグメントから構成され得、それによって、二重特異性抗体が、2つの所望の標的分子と結合または反応することを可能にし、これには、下により詳細に記載される抗原、受容体のリガンドを含むリガンド、受容体のリガンド結合部位を含む受容体、リガンド受容体複合体及びがんマーカーを含むマーカーが含まれ得る。
組み換え核酸配列は、二機能性抗体、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。二機能性抗体は、下に記載される抗原と結合または反応することができる。二機能性抗体を修飾して、抗原の認識及び抗原との結合を超える追加の機能性を抗体に付与することもできる。そのような修飾には、H因子またはそのフラグメントへのカップリングが含まれ得るが、これに限定されない。H因子は、補体活性化の可溶性調節因子であり、したがって、補体媒介性溶解(CML)を介した免疫応答に寄与することができる。
上に記載されたように、抗体を修飾して、対象内の半減期を延長または短縮することができる。修飾は、対象の血清中の抗体の半減期を延長または短縮することができる。
組み換え核酸配列は、フコシル化されていない抗体(すなわち、脱フコシル化抗体もしくは非フコシル化抗体)、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。フコシル化には、糖のフコースを分子に付加すること、例えば、フコースをNーグルカン、O−グルカン及び糖脂質に結合することが含まれる。したがって、脱フコシル化抗体では、フコースは定常領域の炭水化物鎖に結合していない。次に、このフコシル化の欠如は、フコシル化された抗体と比較して、抗体によるFcγRIIIa結合及び抗体指向性細胞傷害(antibody directed cellular cytotoxic)(ADCC)活性を改善することができる。したがって、いくつかの実施形態において、非フコシル化抗体は、フコシル化抗体と比較して、増加したADCC活性を示すことができる。
抗体を修飾して、抗原に関連する疾患の抗体依存性感染増強(ADE)を低減または予防することができるが、依然として抗原を中和することができる。例えば、抗体を修飾して、下により詳細に記載されるDENVに関連する疾患のADEを低減または予防することができるが、依然としてDENVを中和することができる。
DNAプラスミドワクチンは、抗原、またはそのフラグメントもしくは変異体をコードする。合成抗体は、抗原、またはそのフラグメントもしくは変異体に向けられる。抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはこれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、DNA、RNA、cDNA、その変異体、そのフラグメント、またはこれらの組み合わせであり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、そのフラグメント、またはこれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態において、抗原は外来性である。外来性抗原は、体内に導入されると、免疫応答を刺激することができる任意の非自己物質である(すなわち、対象の外部に由来する)。
外来性抗原は、ウイルス抗原、またはそのフラグメント、またはその変異体であり得る。ウイルス抗原は、以下の科のうちの1つのウイルスからのものであり得る:Adenoviridae、Arenaviridae、Bunyaviridae、Caliciviridae、Coronaviridae、Filoviridae、Hepadnaviridae、Herpesviridae、Orthomyxoviridae、Papovaviridae、Paramyxoviridae、Parvoviridae、Picornaviridae、Poxviridae、Reoviridae、Retroviridae、Rhabdoviridae、またはTogaviridae。ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、チクングニアウイルス(CHIKV)、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、例えば、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス(HDV)及びE型肝炎ウイルス(HEV)、天然痘ウイルス(大天然痘及び小天然痘)、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱ウイルス、ノーウォークウイルス、A型肝炎ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV−I)、毛様細胞白血病ウイルス(HTLV−II)、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス(出血熱)、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルグウイルス、はしかウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器多核体ウイルス(RSV)、単純ヘルペス1型(口腔ヘルペス)、単純ヘルペス2型(性器ヘルペス)、帯状疱疹(水痘帯状疱疹、別名水疱瘡)、サイトメガロウイルス(CMV)、例えば、ヒトCMV、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、ラッサウイルス、アレナウイルス、または発がん性ウイルスからのものであり得る。
ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原からのものであり得る。いくつかの実施形態において、HIV抗原は、サブタイプAエンベロープタンパク質、サブタイプBエンベロープタンパク質、サブタイプCエンベロープタンパク質、サブタイプDエンベロープタンパク質、サブタイプB Nef−Revタンパク質、GagサブタイプA、B、C、もしくはDタンパク質、MPolタンパク質、Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef−Rev、Gagの核酸もしくはアミノ酸配列、またはこれらの任意の組み合せであり得る。
ウイルス抗原は、チクングニアウイルスからのものであり得る。チクングニアウイルスは、Togaviridae科のアルファウイルス属に属する。チクングニアウイルスは、感染したAedes属などの蚊に刺されることによってヒトに伝染する。
ウイルス抗原は、デングウイルスからのものであり得る。デングウイルス抗原は、ウイルス粒子を形成する3つのタンパク質またはポリペプチド(C、prM及びE)のうちの1つであり得る。デングウイルス抗原は、ウイルスの複製に関与する7つの他のタンパク質またはポリペプチド(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)のうちの1つであり得る。デングウイルスは、DENV−1、DENV−2、DENV−3及びDENV−4が含まれる、ウイルスの5つの株または血清型のうちの1つであり得る。抗原は、複数のデングウイルス抗原の任意の組み合わせであり得る。
ウイルス抗原には、肝炎ウイルス抗原(すなわち、肝炎抗原)、またはそのフラグメント、またはその変異体が含まれ得る。肝炎抗原は、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス(HDV)及び/またはE型肝炎ウイルス(HEV)の1つ以上からの抗原または免疫原であり得る。
ウイルス抗原には、HPVからの抗原が含まれ得る。HPV抗原は、子宮頸癌、直腸癌及び/または他のがんを引き起こす16、18,31,33、35、45、52及び58型のHPVからのものであり得る。HPV抗原は、6及び11型のHPVからのものであり、性器疣贅を引き起こし得、頭頸部癌を引き起こすことが知られている。
ウイルス抗原には、RSV抗原が含まれ得る。RSV抗原は、ヒトRSV縮合タンパク質(本明細書において、「RSV F」、「RSV Fタンパク質」及び「Fタンパク質」とも呼ばれる)、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。ヒトRSV縮合タンパク質は、RSVサブタイプAとBの間で保存され得る。RSV抗原は、RSV Long株(GenBank AAX23994.1)からのRSV Fタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。RSV抗原は、RSV A2株(GenBank AAB59858.1)、またはそのフラグメントもしくは変異体からのRSV Fタンパク質であり得る。RSV抗原は、RSV Fタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体の単量体、二量体、または三量体であり得る。
ウイルス抗原には、インフルエンザウイルスからの抗原が含まれ得る。インフルエンザ抗原は、1つ以上のインフルエンザ血清型に対して免疫応答を哺乳動物において誘発することができるものである。抗原には、全長翻訳産物HA0、サブユニットHA1、サブユニットHA2、その変異体、そのフラグメント、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原は、A型インフルエンザの血清型H1、A型インフルエンザの血清型H1の多数の株からの異なるセットから誘導されるハイブリッド配列である血清型H2の多数の株から誘導され得る、またはB型インフルエンザの多数の株から誘導され得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原は、B型インフルエンザからのものであり得る。
ウイルス抗原は、エボラウイルスからのものであり得る。エボラウイルス疾患(EVD)またはエボラ出血熱(EHF)には、ブンディブギョ(Bundibugyo)ウイルス(BDBV)、エボラウイルス(EBOV)、スーダンウイルス(SUDV)及びタイフォレスト(Tai Forest)ウイルス(TAFV、コートジボワールエボラウイルス(アイボリーコースト(Ivory Coast)エボラウイルス、CIEBOV)とも呼ばれる)を含む4つの既知のエボラウイルスのいずれかが含まれる。
ウイルス抗原は、ジカウイルスからのものであり得る。ジカ疾患は、ジカウイルスによる感染によって引き起こされ、蚊に刺されることによって、またはヒトの間の性行為感染によって、ヒトに伝染し得る。ジカ抗原には、ジカウイルスエンベロープタンパク質、ジカウイルスNS1タンパク質、またはジカウイルスカプシドタンパク質が含まれ得る。
ウイルス抗原は、マールブルグウイルスからのものであり得る。マールブルグウイルス免疫原を使用して、複数のマールブルグウイルスサブタイプまたは血清型に対して広範囲の免疫を誘導することができる。抗原は、マールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質から得ることができる。
外来性抗原は、細菌抗原、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。細菌は、以下の門のいずれか1つからのものであり得る:Acidobacteria、Actinobacteria、Aquificae、Bacteroidetes、Caldiserica、Chlamydiae、Chlorobi、Chloroflexi、Chrysiogenetes、Cyanobacteria、Deferribacteres、Deinococcus−Thermus、Dictyoglomi、Elusimicrobia、Fibrobacteres、Firmicutes、Fusobacteria、Gemmatimonadetes、Lentisphaerae、Nitrospira、Planctomycetes、Proteobacteria、Spirochaetes、Synergistetes、Tenericutes、Thermodesulfobacteria、Thermotogae及びVerrucomicrobia。
細菌抗原は、Mycobacterium tuberculosis抗原(すなわち、TB抗原もしくはTB免疫原)、またはそのフラグメント、またはその変異体であり得る。TB抗原は、TB抗原のAg85ファミリーからのものであり、例えば、Ag85A及びAg85Bであり得る。TB抗原は、TB抗原のEsxファミリーからのものであり、例えば、EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV及びEsxWであり得る。
外来性抗原は、寄生虫抗原、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。寄生虫は、原生動物、蠕虫、または外部寄生虫であり得る。蠕虫(すなわち、虫)は、扁虫.(例えば、吸虫及び条虫)、鉤頭虫、または円形虫(例えば、蟯虫)であり得る。外部寄生虫は、シラミ、ノミ、マダニ及びコダニであり得る。
外来性抗原は、マラリア抗原(すなわち、PF抗原もしくはPF免疫原)、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。抗原は、マラリアを引き起こす寄生虫からのものであり得る。マラリア発症寄生虫は、Plasmodium falciparumであり得る。Plasmodium falciparum抗原には、スポロゾイト周囲(CS)抗原が含まれ得る。
外来性抗原は、真菌抗原、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。真菌は、Aspergillus種、Blastomyces dermatitidis、Candida酵母(例えば、Candida albicans)、Coccidioides、Cryptococcus neoformans、Cryptococcus gattii、dermatophyte、Fusarium species、Histoplasma capsulatum、Mucoromycotina、Pneumocystis jirovecii、Sporothrix schenckii、Exserohilum、またはCladosporiumであり得る。
いくつかの実施形態において、抗原は自己抗原である。自己抗原は、免疫応答を刺激することができる、対象の自己身体の構成物であり得る。いくつかの実施形態において、自己抗原は、対象が疾患状態、例えば、自己免疫疾患にない限り、免疫応答を誘発しない。
自己抗原は、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子1(WT1)、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせであり得る。WT1は、N末端にプロリン/グルタミン豊富DNA結合ドメイン及びC末端に4つのジンクフィンガーモチーフを含有する転写因子である。WT1は、泌尿生殖器系の正常な発生に役割を果たし、多数の因子と、例えば、既知の腫瘍抑制因子であるp53及び細胞傷害性薬物による治療後に多数の部位でWT1を切断するセリンプロテアーゼであるHtrA2と相互作用する。WT1の突然変異は、腫瘍もしくはがん形成、例えば、ウィルムス腫瘍または腫瘍発現WT1をもたらす可能性がある。
自己抗原には、上皮増殖因子受容体(EGFR)またはそのフラグメントもしくは変異体が含まれ得る。EGFR(ErbB−1及びHER1とも呼ばれる)は、細胞外タンパク質リガンドの上皮増殖因子ファミリー(EGFファミリー)のメンバーのための細胞表面受容体である。EGFRは、受容体のErbBファミリーのメンバーであり、4つの緊密に関連している受容体チロシンキナーゼであるEGFR(ErbB−1)、HER2/c−neu(ErbB−2)、Her3(ErbB−3)及びHer4(ErbB−4)が含まれる。EGFR発現または活性に影響を与える突然変異は、がんをもたらす可能性がある。
自己抗原は、コカイン受容体抗原であり得る。コカイン受容体には、ドーパミン輸送体が含まれる。
自己抗原には、プログラム死1(PD−1)が含まれ得る。プログラム死1(PD−1)、ならびにそのリガンドのPD−L1及びPD−L2は、T細胞の活性化、寛容性及び免疫病理の均衡を調節する阻害シグナルを送達する。PD−1は、細胞外IgVドメイン、その後に膜貫通領域及び細胞内尾部を含む、288アミノ酸細胞表面タンパク質分子である。
自己抗原には、4−1BBリガンドが含まれ得る。4−1BBリガンドは、TNFスーパーファミリーに属する2型膜貫通糖タンパク質である。4−1BBリガンドは、活性化されたTリンパ球に発現し得る。4−1BBは、活性化誘導T細胞共刺激分子である。4−1BBによるシグナル伝達は、生存遺伝子を上方制御し、細胞分化を増強し、サイトカイン産生を誘導し、T細胞の活性化誘導細胞死を防止する。
自己抗原には、CTLA−4(細胞傷害性Tリンパ球抗原4)が含まれてもよく、CD152(分化152のクラスター)としても知られている。CTLA−4は、T細胞の表面に見出されるタンパク質受容体であり、抗原に対して細胞免疫攻撃をもたらす。抗原は、細胞外Vドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部、またはこれらの組み合わせなどの、CTLA−4のフラグメントであり得る。
自己抗原には、インターロイキン6(IL−6)が含まれ得る。IL−6は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、抑うつ症、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、多発性骨髄腫、がん、ベーチェット病及び関節リウマチが含まれるが、これらに限定されない多くの疾患において、炎症及び自己免疫過程を刺激する。
自己抗原には、単球走化性タンパク質1(MCP−1)が含まれ得る。MCP−1は、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド2(CCL2)または低分子誘導サイトカインA2とも呼ばれる。MCP−1は、CCケモカインファミリーに属するサイトカインである。MCP−1は、単球、記憶T細胞及び樹状細胞を、組織損傷または感染のいずれかによって生した炎症部位へ動員する。
自己抗原には、アミロイドベータ(Aβ)またはそのフラグメントもしくは変異体が含まれ得る。Aβ抗原は、Aβ(X−Y)ペプチドを含むことができ、XとYの両方を含むヒト配列Aβタンパク質のアミノ酸Yに対するアミノ酸位置Xからのアミノ酸配列、特に、アミノ酸配列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVI(配列番号171)(アミノ酸位置1〜47に相当、ヒト問い合わせ配列)のアミノ酸位置Yに対するアミノ酸位置Xからのアミノ酸配列またはその変異体を含むことができる。Aβ抗原は、Aβ(X−Y)ポリペプチドのAβポリペプチドを含むことができ、ここでXは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、または32であり、Yは、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、または15であり得る。Aβポリペプチドは、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも36個、少なくとも37個、少なくとも38個、少なくとも39個、少なくとも40個、少なくとも41個、少なくとも42個、少なくとも43個、少なくとも44個、少なくとも45個、または少なくとも46個のアミノ酸であるフラグメントを含むことができる。
自己抗原には、インターフェロン(IFN)ガンマ誘導タンパク質10(IP−10)が含まれ得る。IP−10は、低分子誘導サイトカインB10またはC−X−Cモチーフケモカイン10(CXCL10)としても知られている。CXCL10は、単球、内皮細胞及び線維芽細胞などのいくつかの種類の細胞により、IFN−γに応答して分泌される。
自己抗原には、前立腺特異的膜抗原(PSMA)が含まれ得る。PSMAは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII(GCPII)、N−アセチル−L−アスパルチル−L−グルタミン酸ペプチダーゼI(NAALAダーゼI)、NAAGペプチダーゼ、または葉酸ヒドロラーゼ(FOLH)としても知られている。PMSAは、前立腺癌細胞により高度に発現される膜内在性タンパク質である。
いくつかの実施形態において、抗原は、外来性抗原及び/または自己抗原以外の抗原である。
他の抗原は、HIV−1 VRC01であり得る。HIV−1 VRC01は、HIVの中和CD4結合部位抗体である。HIV−1 VRC01は、gp120ループD、CD4結合ループ及びHIV−1のV5領域内に含まれるHIV−1の一部に接触する。
他の抗原は、HIV−1 PG9であり得る。HIV−1 PG9は、HIV(HIV−1)エンベロープ(Env)糖タンパク質(gp)三量体に優先的に結合し、ウイルスを広範囲に中和する、グリカン依存性ヒト抗体の拡大するファミリーの創始メンバーである。
他の抗原は、HIV−1 4E10であり得る。HIV−1 4E10は、中和抗HIV抗体である。HIV−1 4E10は、gp41外部ドメインのC末端に位置する、HIV−1の膜近位外部領域(MPER)にマップされた線状エピトープに向けられている。
他の抗原は、DV−SF1であり得る。DV−SF1は、4つのデングウイルス血清型のエンベロープタンパク質と結合する中和抗体である。
他の抗原は、DV−SF2であり得る。DV−SF2は、デングウイルスのエピトープと結合する中和抗体である。DV−SF2は、DENV4血清型に特異的であり得る。
他の抗原は、DV−SF3であり得る。DV−SF3は、デングウイルスエンベロープタンパク質のEDIII A鎖と結合する中和抗体である。
組成物は、薬学的に許容される賦形剤を更に含むことができる。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、形質移入促進剤であり得、免疫刺激複合体(ISCOMS)などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドAを含むLPS類縁体、ムラミルペプチド、キノン類縁体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤が含まれ得る。
本発明は、合成抗体を生成する方法にも関する。本方法は、下により詳細に記載される送達方法を使用して、組成物を、それを必要とする対象に投与することを含むことができる。このようにして、合成抗体は、組成物が対象に投与されたときに、対象またはインビボにおいて生成される。
本発明は、上に記載された抗原と反応性である、または結合する、上に記載された抗体の確認または選別方法に更に関する。抗体の確認または選別方法は、抗体を確認または選別するために、当該技術に既知の方法によって抗原を使用することができる。そのような方法には、ライブラリー(例えば、ファージ提示)からの抗体の選択、ならびに動物の免疫化、続く抗体の単離及び/または精製が含まれ得るが、これらに限定されない。
本発明は、組成物を、それを必要とする対象に送達する方法にも関する。送達方法には、組成物を対象に投与することが含まれ得る。投与には、インビボ電気穿孔を伴う及び伴わないDNA注射、リポソーム媒介送達、ならびにナノ粒子促進送達が含まれ得るが、これらに限定されない。
電気穿孔を介した組成物の投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成するのに有効なエネルギーパルスを、哺乳類の所望の組織に送達するように構成され得る電気穿孔装置の使用によって達成することができ、好ましくは、エネルギーパルスは、使用者により入力される事前設定電流に類似した定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素及び電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含むことができる。電気穿孔構成要素には、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、現状報告要素、通信ポート、メモリ要素、電源及び電源スイッチを含む、電気穿孔装置の様々な要素の1つ以上が含まれ得る、または組み込まれ得る。電気穿孔は、インビボ電気穿孔装置、例えば、CELLECTRA EPシステム(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)またはElgen電気穿孔(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)を、プラスミドによる細胞への形質移入を促進するために使用して達成され得る。
対象に合成抗体を生成することによって、それを必要とする対象において疾患を治療、防御及び/または予防する方法も、本明細書において提供される。本方法には組成物を対象に投与することが含まれ得る。対象への組成物の投与は、上に記載された送達方法を使用して実行することができる。
本発明は、合成抗体と治療抗生物質剤の組み合わせを投与することによって、それを必要とする対象において疾患を治療、防御及び/または予防する方法も提供する。
本発明は、以下の実施例によって更に例示される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のためだけに提示されていることが理解されるべきである。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修正を様々な用途及び条件に適合するよう行うことができる。したがって、本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の記載から当業者には明白である。そのような修正も、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
チクングニアウイルスに対するDNAコード抗体予防法及びDNAワクチン接種により誘発された急速で長期間の免疫
ワクチン接種は、免疫の生成前に誘導期を示すことが知られており、したがって、免疫応答が効果を表す前に感染する時間のすき間がある。ワクチン及び自然免疫応答の利益を、DNA合成抗体またはdMabを使用した有効な免疫の急速な生成と共に利用する特定の新規手法が、以下に提供される。
CHIKV特異的dMAbの構築及び発現
確立された抗Env特異的CHIKV中和ヒトmAbの遺伝子配列情報を、National Center for Biotechnology Informationのデータベースから得た(Warter et al.,2011,J Immunol 186:3258−64)。発現確認試験に使用されるヒト胎児由来腎臓293T細胞及びベロ細胞を、以前に記載されたように維持した(Mallilankaraman et al.,2011,PLoS Negl Trop Dis 5:e928)。CHIKV Env dMAb調合剤の可変重(VH)及び可変軽(VL)鎖セグメントを、いくつかの修飾を有して合成オリゴヌクレオチドの使用によって生成し、全長免疫グロブリンG(IgG、「CVM1−IgG」と称する)またはFabフラグメント(「CVM1−Fab」と称する)のいずれかに構築した(Muthumani et al.,2013,Hum Vaccin Immunother 9:2253−62)。CVM1−IgGのクローニングでは、P2A自己プロセシングペプチド配列とカップリングしたフリン切断部位により分離されている重及び軽鎖遺伝子を含有する、単一オープンリーディングフレームを組み立てた。この導入遺伝子を、pVax1発現ベクターにクローン化した(Muthumani et al.,2013,Hum Vaccin Immunother 9:2253−62)。CVM1−FabのVH及びVL鎖を別々のpVax1ベクターにクローン化した。組織培養物の形質移入では、100μgのpVax1 DNA、CVM1−IgG、またはCVM1−Fab(VH及びVL構築物それぞれ100μg)を使用した。本試験に使用するCHIKV Envに基づいたDNAワクチンを、以前に記載されたように開発及び特徴決定した(Muthumani et al.,2008,Vaccine 26:5128−34、Mallilankaraman et al.,2011,PLoS Negl Trop Dis 5:e928)。
ELISAアッセイを、CMV1−IgGまたはpVax1が投与されたマウスから二重に収集及び測定した血清により実施して、発現動態及び標的抗原結合を定量化した。これらの測定及び分析を、以前に記載されたように実施した(Muthumani et al.,2015,Sci transl Med 7:301ra132)。
IgG発現のウエスタンブロット分析では、CHIKV(ウイルス分離株PC08)感染細胞を、感染の2日後に溶解し、以前に公開された方法により評価した(Mallilankaraman et al.,2011,PLoS Negl Trop Dis 5:e928、Muthumani et al.,2015,Sci transl Med 7:301ra132)。免疫蛍光分析では、チャンバースライド(Nalgene Nunc,Penfield,New York)にベロ細胞(1×104)を接種し、ウイルス分離株CHIKV PC08により感染効率1で2時間感染させた。免疫蛍光分析を以前に記載されたように実施し(Muthumani et al.,2015,Sci transl Med 7:301ra132)、スライドを共焦点顕微鏡法(LSM710;Carl Zeiss)により目視評価した。得られた画像をZenソフトウエア(Carl Zeiss)の使用により半定量的に分析した。
CVM1−Fab及びCVM1−IgGの発現動態及び機能性を、100μgの対照pVax1、CVM1−IgG、または100μgの、CVM1−Fabの各プラスミド鎖の筋肉内注射後のB6.Cg−Foxn1nu/Jマウス(Jackson Laboratory)において評価した。DNAワクチンを含む試験では、25μgのCHIKV Envプラスミドを、2週間間隔で3回注射した。全ての注射の直後に、CHIKV dMAb DNAプラスミドを電気穿孔により送達した(Flingai et al.,2015,Sci Rep 5:12616、Muthumani et al.,2015,Sci transl Med 7:301ra132、Broderick et al.,2014,Methods Mol iol 1143:123−30)。
BALB/cマウスは、CVM1−IgG、CMV−Fab(VH及びVL)、または対照pVax1プラスミドの単回(100μg)電気穿孔増強筋肉内注射を受けた。CHIKV Env DNAワクチンは、上に記載されたように送達された。DNA送達の2日または35日後、マウスに、107プラーク形成単位(25μL)のウイルス分離株CHIKV Del−03(JN578247)(Muruganandam et al.,2011,Can J Microbiol 57:1073−7)を、皮下(各後足の背面)または鼻腔内のいずれかに負荷した(Mallilankaraman et al.,2011,PLoS Negl Trop Dis 5:e928)。マウスの足の腫脹(高さ×幅)を、感染後毎日、14日間まで測定した。加えて、動物を生存、ならびに感染の徴候(すなわち、体重変化及び嗜眠)について毎日(感染後20日間まで)モニターした。体重の30%超を失った動物を安楽死させ、血清試料を、サイトカイン定量化及び他の免疫分析のために収集した。血液試料を感染の7〜14日後に尾部から収集し、ウイルス血症レベルをプラークアッセイにより測定した。
CVM1−IgGが投与されたマウスの抗CHIKV中和抗体力価を、以下のCHIKV分離離株に感染したベロ細胞の使用により、以前に記載された方法(Wang et al.,2008,Vaccine 26:5030−9、Mallilankaraman et al.,2011,PLoS Negl Trop Dis 5:e928)によって決定した:LR2006−OPY1(インド洋大流行(Indian Ocean Outbreak))、IND−63WB1及びSL−CH1(アジアクレード(Asian−clade))、Ross(ECSAクレード)、ならびにPC08及びDRDE−06(ECSAクレード)。中和力価は、ベロ細胞単層における細胞変性効果の100%低減を媒介する最高希釈の逆数として計算した。データを生成し、GraphPad Prism 5ソフトウエアパッケージ(GraphPad Software)の使用により統計分析を実施した。S字形用量応答を当てはめた非線形回帰を使用して、感染の抗体媒介50%阻害(IC50)レベルを決定した。CHIKV Env偽型産生及び蛍光活性化細胞選別(FACS)分析を、以前に記載されたように実施した(Muthumani et al.,2013,PLoS One 8:e84234)。
血清を、CVM1−Fab、CVM1−IgG及びCHIKV−Env注射マウスから、ならびにCHIKV負荷マウス(負荷の1週間後)から収集した。TNF−α、IL−1β及びIL−6の血清サイトカインレベルは、ELISAキットを製造会社の使用説明書(R&D Systems)に従って使用することにより測定した。
スチューデントt検定またはノンパラメトリックスピアマン相関係数検定を、GraphPad Prismソフトウエア(Prism Inc.)の使用によって実施した。対照と実験群の変数の相関関係を、スピアマンの順位相関係数検定の使用によって統計的に評価し、全ての試験において、p値<0.05を統計的に有意であるとみなした。
抗CHIKV dMAbの設計及び発現の確認
CHIKVによる宿主細胞へのウイルス侵入は、Envにより媒介され、それに対して大部分の中和抗体が生成される(Mallilankaraman et al.,2011,PLoS Negl Trop Dis 5:e928、Sun et al.,2013,eLife 2:e00435)。したがって、E1とE2の両方のEnvタンパク質を認識する中和抗CHIKV mAbの軽及び重免疫グロブリン鎖を発現する、DNAプラスミド(dMAb)を設計した(Warter et al.,2011,J Immunol 186:3258−64、Pal et al.,2013,PLoS Pathog 9:e1003312)。全長抗CHIKV dMAbのVL及びVH免疫グロブリン鎖のコード配列に相補的なDNAを発現増加のために最適化し、以前に記載された方法(Flingai et al.,2015,Sci Rep 5:12616、Muthumani et al.,2013,Hum Vaccin Immunother 9:2253−62)を使用して、pVax1ベクターにクローン化した。抗CHIKV−Fabを発現する構築物には、VH及びVL遺伝子を別々にクローン化した。抗Env特異的CHIKV中和mAbから構築された最適化合成プラスミドを、IgG及びFab抗体では、それぞれCVM1−IgGまたはCVM1−Fabと称した。ヒト293T細胞に、CVM1−IgGプラスミドまたはCVM1−Fab(VL、VH、もしくは組み合わせ)プラスミドのいずれかを形質移入して、インビトロ発現を確証した。図1A及び1Bに示されているように、抗CHIKV抗体レベルは、結合抗原として使用した組み換えCHIKV Envを用いて、ELISAにより測定した。これらのデータは、CVM1−Fab及びCVM1−IgGが筋肉内に抗体を発現し、インビトロにおいて正確に組み立てられ、生物学的に機能していると思われることを示している。
インビトロ発現を確認した後、CVM1−FabまたはCVM1−IgGが抗CHIKV抗体をインビボで産生する能力を測定した。5〜6週齢のB6.Cg−Foxn1nu/Jマウスに、100μgのCVM1−IgG(CVM1−IgGは1つのプラスミドである)、それぞれ100μgのCVM1 VH及びVL(CVM1−Fabは2つのプラスミドからなる)、または対照ベクターを単回筋肉内の電気穿孔媒介注射により投与した。血清を、指定された時点で収集し、標的抗原結合を、ELISAを使用してIgG定量化によって測定した。CVM1−Fabから生成されたmAbは、CVM1−IgGのものより急速に(すなわち、注射後3日以内に)現れたが、両方の構築物は、15日目までには類似したmAbレベルを生成した(平均血清レベル[±標準偏差]、CVM1−Fabでは1587.23±73.23ng/mL、CVM1−IgGでは1341.29±82.07ng/mL、図1C)。マウスに、CVM1−IgGまたはCVM1−Fabのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ELISAにより評価した。CVM1−IgGとCVM1−Fabの両方を注射した15日後に収集された血清は、CHIKV Envタンパク質に結合したが、無関係の対照抗原であるヒト免疫不全ウイルス1型Evnには結合しなかった(図1D)。これらのデータは、CVM1−IgGまたはCVM1−Fab構築物からインビボ産生された抗CHIKV抗体が、従来のように産生された抗原特異的抗体に類似した生物学的特徴を有することを示している。
抗CHIKV dMAb生成mAbを、結合特異性及び抗CHIKV中和活性について試験した。CVM1−IgGを注射したマウスからの血清を、固定したCHIKV PC08感染ベロ細胞に対して、免疫蛍光アッセイにより試験した。結果は、CHIKV感染細胞への血清抗体の結合を示した(図2A)。標的タンパク質へのCVM1−IgG注射マウスの血清の結合を確認するため、ウエスタンブロット分析により検査した。CHIKV感染細胞からの総細胞溶解産物におけるCHIKV E2タンパク質(50kDa)発現の検出は、CVM1−IgG発現の特異性を示している(図2B)。インビボ産生CVM1−IgG抗体の特異性は、緑色蛍光タンパク質コードCHIKVに感染した細胞に対するFACS分析によって更に実証された(図2C)。更に、免疫組織化学分析及びFACS分析により実証されたCVM1−Fab結合は、生成された全長CVM1−IgGのものに類似していた(データ示されず)。まとめると、これらの知見は、CVM1−IgGプラスミドから生成された抗体の強い特異性を示している。
以前の研究は、ウイルスに対する初期免疫が感染を制御する主要な要因であることを実証した(Barouch et al.,2014,Nat Rev Microbiol 12:765−71、Hudson et al.,2003,Nat Med 9:129−34、Smith et al.,2015,Chikungunya Virus 18:86−95)。CVM1−IgGまたはCVM1−Fabから生成された抗体がCHIKVへの初期曝露に対して防御を提供するかを決定するため、10頭のマウス群が、pVax1、CVM1−IgG、またはCVM1−Fabの単回投与を0日目に受けた。続いて各群には、2日目にウイルスを皮下負荷して、自然CHIKV感染を模倣した(図3A)。続いて動物の生存率及び体重変化を20日間にわたって記録した。pVax1対照プラスミドを注射したマウスは、全て、ウイルスを負荷した1週間以内に死亡した。逆に、pVax1プラスミドを受けたマウスの0%の生存率と比較して、CVM1−IgGまたはCVM1−Fabのいずれかを投与したマウスにおいて、100%の生存率が観察され(P=.0033)、CVM1−IgG及びCVM1−Fabプラスミドが、送達後の2日間以内に防御免疫を付与したことを実証している。
次に、長期CHIKV負荷防御試験を、0日目にCHIKV Env DNAワクチンをワクチン接種した後またはCVM1−IgGを投与した後の35日目に実施した。CHIKV Env DNAワクチンの多重追加免疫送達は、100%の防御を付与し(図4B)、一方、80%の生存率が、CVM1−IgGを投与したマウスにおいて観察された(P=.0007)。誘導された抗体応答の動態は、CVM1−IgGの単回注射の2日以内に測定可能であり、15日目にはピークレベルであり(およそ、1400ng/mL)、検出可能なmAbレベルは、注射後少なくとも45日間にわたって維持された(図6A)。発現は続いているが、これらのレベルは、ピークレベルと比較すると減少しており、実験において注目された部分的な防御を支持している(図4B)。
抗体送達とワクチン接種手法との組み合わせにおける1つの潜在的な問題は、抗体が多くの伝統的なワクチンを中和する可能性があり(Mallilankaraman et al.,2011,PLoS Negl Trop Dis 5:e928、Flingai et al.,2015,Sci Rep 5:12616、Muthumani et al.,2015,Sci transl Med 7:301ra132、Laddy et al.,2008,PLoS One 3:e2517)、したがって不適合なプラットフォームであることである。CHIKV負荷の文脈において、マウスの生存率に対するCVM1−IgGとCHIKV Envの共投与(co−administration)の効果も評価した。この実験において、20頭のマウスに、CVM1−IgGの単回用量及びCHIKV Env DNAの3用量を0日目に上に記載されたように投与した。続いて、動物の半分にはCHIKVを2日目に、他の半分には35日目に負荷した。これらの群の生存を時間の関数として追跡した。予想外なことではなく、両方の負荷群は、100%の長期生存を有した(図4C)。特に、2日目のCHIKV負荷実験の結果は、感染に対して防御を媒介するCVM1−IgG試薬の有用性を示し、生存率は、対照(pVax1)動物において、負荷の4日後までにおよそ30%減少している。図4Dは、CVM1−IgG及びCHIKV Env DNAワクチンを受けたマウスに生成された抗CHIKV IgGの経時的なレベルを示し、抗CHIKVヒトIgGは、CVM1−IgGプラスミドにより生成された抗体を表し、抗CHIKVマウスIgGは、CHIKV Envワクチンにより誘導された抗体を表す。ヒトIgGとマウスIgGの両方が検出され、異なる発現動態を示した。初期CHIKV Env DNAワクチン接種の3日後までには、マウスの抗Env抗体レベルは、本質的に0に近づいた(マウス抗CHIKV IgG)。逆に、単回CVM1−IgG注射の3日後には、ヒト抗Env抗体レベルは顕著であった(ヒト抗CHIKV IgG)。これらのデータは、CHIKV負荷の感染及び死亡に対して急速な防御を媒介する、CVM1−IgGの重要性を強調している。
以前の研究は、ウイルス量及び炎症促進性サイトカインレベルを含むCHIKV関連疾患の重篤度と相関関係にある分子を確認した(Ng et al.,2009,PLoS One 4:e4261、Chaaitanya et al.,2011,Viral Immunol 24:265−71)。したがって、これらの疾患関連マーカーをウイルス負荷の初期及び後期の時点で抑制する、CVM1−IgGの能力を評価した。CVM1−IgG、CVM1−Fab、CHIKV Env、またはCVM1−IgG+CHIKV Env DNAワクチンにより免疫化されたマウスは、mAbを生成し、ウイルス量を著しく低減した(図5A)。ウイルス量の低減に加えて、これらのマウスは、対照(pVax1)免疫化マウスと比較して足蹠腫脹を示さず、20日間の実験期間にわたって一貫して体重を増加した(図5B及び5C)。また、CVM1−IgG生成mAb及びCHIKV Env DNAワクチンは、ウイルス負荷の10日後に、pVax1と比較して、CHIKV媒介炎症促進性サイトカイン(すなわち、TNF−α、IL−6及びIL−β)の著しくに低減したレベルを示した(図7)。これらの知見は、CVM1−IgGの単回注射が、CHIKV関連病理を防御ワクチン接種により誘導されるものに匹敵する程度に抑制することを示唆している(Mallilankaraman et al.,2011,PLoS Negl Trop Dis 5:e928)。
結果は、CVM1 IgGの単回用量を注射したマウスが、投与の2日後にウイルス負荷から完全に防御されたこと、一方、CHIKV Env DNAワクチンの単回ワクチン接種後では、おそらく防御免疫を備えるのに十分な時間がないために、感染から生き残ったマウスがいなかったことを実証している。しかし、免疫化レジメンに続く後の時点での負荷では、完全な防御がCHIKV Envによって観察された。類似した防御レベルが、CVM1−IgGの単回用量を投与したマウスにおいて発生したが、防御は、経時的に80%に衰えた。注目すべきことに、CVM1−IgGとCHIKV Envの共送達は、急速で持続的な体液性及び細胞免疫を生じ、組み合わせ手法が相乗的で有益な効果を提供することを実証した。重要なことに、CVM1−IgGとCHIKV Envの共送達は、短期間または長期間の防御免疫応答の発生に関して拮抗的ではなかった。
ワクチン接種は、免疫の生成前に誘導期を示すことが知られており、したがって、免疫応答が効果を表す前に感染する時間のすき間がある。ワクチン及び自然免疫応答の利益を、DNA合成抗体またはdMAbを使用した有効な免疫の急速な生成と共に利用する特定の新規手法が、以下に提供される。
ELISAアッセイを、ZIKV−dMAbが投与された対象からの血清により実施して、発現動態及び標的抗原結合を定量化する。
ZIKV感染細胞のIgG発現をウエスタンブロットにより分析する。免疫蛍光分析では、ZIKV感染細胞を共焦点顕微鏡法により目視評価し、定量的または半定量的に分析する。
発現動態及び機能性を、対照またはZIKV−dMAbを注射した後の対象において評価した。DNAワクチンを含む研究では、ZIKV−DNAワクチンプラスミドが投与される。
対象は、ZIKV−dMAbまたは対照プラスミドの電気穿孔増強注射を受ける。ZIKV−DNAワクチンは、上に記載されたように送達された。DNAが送達された後、対象には、ZIKVを負荷する。動物を生存及び感染の徴候についてモニターする。血清試料を、サイトカイン定量化及び他の免疫分析のために収集する。血液試料を感染後に収集し、ウイルス血症レベルを測定する。
ZIKV−dMAbが投与された対象の抗ZIKV中和抗体力価を決定する。中和力価は、細胞における細胞変性効果の100%低減を媒介する最高希釈の逆数として計算され得る。
血清が、ZIKV−dMAb及びZIKV−DNAワクチン注射対象から、ならびにZIKV負荷対象から収集される。TNF−α、IL−1β及びIL−6血清サイトカインレベルが測定される。
抗ZIKV中和mAbから構築された最適化合成プラスミドを、IgG及びFab抗体のために設計した。細胞に、ZIKV−IgGプラスミドまたはZIKV−Fab(VL、VH、もしくは組み合わせ)プラスミドのいずれかを形質移入して、インビトロ発現を確証する。ZIKV−Fab及びZIKV−IgGは筋肉内に抗体を発現し、インビトロにおいて正確に組み立てられ、生物学的に機能していると思われた。
インビトロ発現を確認した後、ZIKV−FabまたはZIKV−IgGが抗ZIKV抗体をインビボで産生する能力を測定する。構築物は両方ともmAbを生成する。対象に、ZIKV−IgGまたはZIKV−Fabのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ELISAにより評価する。ZIKV−IgG及びZIKV−Fabの両方が注射された後に収集した血清は、ZIKVタンパク質に結合するが、無関係の対照抗原には結合しない。これらのデータは、ZIKV−IgGまたはZIKV−Fab構築物からインビボ産生された抗ZIKV抗体が、従来のように産生された抗原特異的抗体に類似した生物学的特徴を有することを示している。
抗ZIKV dMAb生成mAbが結合特異性及び抗ZIKV中和活性について試験される。血清抗体はZIKV感染細胞に結合する。抗ZIKV dMAbプラスミドから生成された抗体には強い特異性がある。
抗ZIKV dMAbから生成された抗体がZIKVへの初期曝露に対して防御を提供するかを決定するため、10頭の対象群が、対照または抗ZIKV dMAbを0日目に受ける。続いて各群には、ウイルスを皮下負荷して、自然ZIKV感染を模倣する。続いて対象の生存及び体重変化を記録する。抗ZIKV dMAbプラスミドは、防御免疫を付与する。
次に、長期ZIKV負荷防御試験を、0日目にZIKV−DNAワクチンをワクチン接種した後または抗ZIKV dMAbを投与した後に実施した。ZIKV−DNAは、抗ZIKV dMAbより長い防御免疫を付与する。
抗体送達をワクチン接種手法と組み合わせる1つの潜在的な問題は、抗体が多くの伝統的なワクチンを中和する可能性があり、したがって不適合なプラットフォームであることである。ZIKV負荷の文脈において、対象の生存に対する抗ZIKV dMAbとZIKV−DNAの共投与の効果を評価する。対象には、抗ZIKV dMAb及びZIKV−DNAが0日目に投与される。続いて、一部の動物にはZIKVが2日目に、他には35日目に負荷される。これらの群の生存を時間の関数として追跡する。抗ZIKV dMAbは感染に対する防御を媒介し、生存率は、対照(pVax1)動物では負荷の4日後におよそ30%減少している。抗ZIKV dMAb及びZIKV−DNAワクチンにより誘導されたIgGは、両方とも検出される。抗ZIKV dMAbは、ZIKV負荷による感染及び死亡に対して急速な防御を媒介する。
抗ZIKV dMAbが投与された対象は、投与の直ぐ後のウイルス負荷から完全に防御され、一方、ZIKV−DNAワクチンの単回免疫化の後では、おそらく防御免疫を備えるのに十分な時間がないために、対象は感染から生き残っていない。しかし、免疫化レジメンに続く後の時点での負荷では、ZIKV−DNAは完全な防御を提供している。類似した防御レベルが、抗ZIKV dMAbの単回用量を投与した対象において発生したが、防御は、経時的に衰えた。注目すべきことに、抗ZIKV dMAbとZIKV−DNAの共送達は、急速で持続的な体液性及び細胞免疫を生じ、組み合わせ手法が相加的または相乗的な効果を有し得ることを示唆している。重要なことに、抗ZIKV dMAbとZIKV−DNAの共送達は、短期間または長期間の防御免疫応答の発生に関して拮抗的ではない。
ワクチン接種は、免疫の生成前に誘導期を示すことが知られており、したがって、免疫応答が効果を表す前に感染する時間のすき間がある。ワクチン及び自然免疫応答の利益を、DNA合成抗体またはdMabを使用した有効な免疫の急速な生成と共に利用する特定の新規手法が、以下に提供される。
ELISAアッセイを、EBOV−dMAbが投与された対象からの血清により実施して、発現動態及び標的抗原結合を定量化する。
EBOV感染細胞のIgG発現をウエスタンブロットにより分析する。免疫蛍光分析では、EBOV感染細胞を共焦点顕微鏡法により目視評価し、定量的または半定量的に分析する。
発現動態及び機能性を、対照またはEBOV−dMAbを注射した後の対象において評価した。DNAワクチンを含む研究では、EBOV−DNAワクチンプラスミドが投与される。
対象は、EBOV−dMAbまたは対照プラスミドの電気穿孔増強注射を受ける。EBOV−DNAワクチンは、上に記載されたように送達された。DNAが送達された後、対象には、EBOVを負荷する。動物を生存及び感染の徴候についてモニターする。血清試料を、サイトカイン定量化及び他の免疫分析のために収集する。血液試料を感染後に収集し、ウイルス血症レベルを測定する。
EBOV−dMAbが投与された対象の抗EBOV中和抗体力価を決定する。中和力価は、細胞における細胞変性効果の最高希釈媒介100%低減の逆数として計算され得る。
血清は、EBOV−dMAb及びEBOV−DNAワクチン注射対象から、ならびにEBOV負荷対象から収集される。TNF−α、IL−1β及びIL−6血清サイトカインレベルが測定される。
抗EBOV中和mAbから構築された最適化合成プラスミドを、IgG及びFab抗体のために設計した。細胞に、EBOV−IgGプラスミドまたはEBOV−Fab(VL、VH、もしくは組み合わせ)プラスミドのいずれかを形質移入して、インビトロ発現を確証する。EBOV−Fab及びEBOV−IgGは筋肉内に抗体を発現し、インビトロにおいて正確に組み立てられ、生物学的に機能していると思われた。
インビトロ発現を確認した後、EBOV−FabまたはEBOV−IgGが抗EBOV抗体をインビボで産生する能力を測定する。構築物は両方ともmAbを生成する。対象に、EBOV−IgGまたはEBOV−Fabのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ELISAにより評価する。EBOV−IgG及びEBOV−Fabの両方が注射された後に収集した血清は、EBOVタンパク質に結合するが、無関係の対照抗原には結合しない。これらのデータは、EBOV−IgGまたはEBOV−Fab構築物からインビボ産生された抗EBOV抗体が、従来のように産生された抗原特異的抗体に類似した生物学的特徴を有することを示している。
抗EBOV dMAb生成mAbが結合特異性及び抗EBOV中和活性について試験される。血清抗体はEBOV感染細胞に結合する。抗EBOV dMAbプラスミドから生成された抗体には強い特異性がある。
抗EBOV dMAbから生成された抗体がEBOVへの初期曝露に対して防御を提供するかを決定するため、10頭の対象群が、対照または抗EBOV dMAbを0日目に受ける。続いて各群には、ウイルスを皮下負荷して、自然EBOV感染を模倣する。続いて対象の生存及び体重変化を記録する。抗EBOV dMAbプラスミドは、防御免疫を付与する。
次に、長期EBOV負荷防御試験を、0日目にEBOV−DNAワクチンをワクチン接種した後または抗EBOV dMAbを投与した後に実施した。EBOV−DNAは、抗EBOV dMAbより長い防御免疫を付与する。
抗体送達をワクチン接種手法と組み合わせる1つの潜在的な問題は、抗体が多くの伝統的なワクチンを中和する可能性があり、したがって不適合なプラットフォームであることである。EBOV負荷の文脈において、対象の生存に対する抗EBOV dMAbとEBOV−DNAの共投与の効果を評価する。対象には、抗EBOV dMAb及びEBOV−DNAが0日目に投与される。続いて、一部の動物にはEBOVが2日目に、他には35日目に負荷される。これらの群の生存を時間の関数として追跡する。抗EBOV dMAbは感染に対する防御を媒介し、生存率は、対照(pVax1)動物では負荷の4日後におよそ30%減少している。抗EBOV dMAb及びEBOV−DNAワクチンにより誘導されたIgGは、両方とも検出される。抗EBOV dMAbは、EBOV負荷による感染及び死亡に対して急速な防御を媒介する。
抗EBOV dMAbが投与された対象は、投与の直ぐ後のウイルス負荷から完全に防御され、一方、EBOV−DNAワクチンの単回免疫化の後では、おそらく防御免疫を備えるのに十分な時間がないために、対象は感染から生き残っていない。しかし、免疫化レジメンに続く後の時点での負荷では、EBOV−DNAは完全な防御を提供している。類似した防御レベルが、抗EBOV dMAbの単回用量を投与した対象において発生したが、防御は、経時的に衰えた。注目すべきことに、抗EBOV dMAbとEBOV−DNAの共送達は、急速で持続的な体液性及び細胞免疫を生じ、組み合わせ手法が相加的または相乗的な効果を有し得ることを示唆している。重要なことに、抗EBOV dMAbとEBOV−DNAの共送達は、短期間または長期間の防御免疫応答の発生に関して拮抗的ではない。
ワクチン接種は、免疫の生成前に誘導期を示すことが知られており、したがって、免疫応答が効果を表す前に感染する時間のすき間がある。ワクチン及び自然免疫応答の利益を、DNA合成抗体またはdMAbを使用した有効な免疫の急速な生成と共に利用する特定の新規手法が、以下に提供される。
ELISAアッセイを、MARV−dMAbが投与された対象からの血清により実施して、発現動態及び標的抗原結合を定量化する。
MARV感染細胞のIgG発現をウエスタンブロットにより分析する。免疫蛍光分析では、MARV感染細胞を共焦点顕微鏡法により目視評価し、定量的または半定量的に分析する。
発現動態及び機能性を、対照またはMARV−dMAbを注射した後の対象において評価した。DNAワクチンを含む研究では、MARV−DNAワクチンプラスミドが投与される。
対象は、MARV−dMAbまたは対照プラスミドの電気穿孔増強注射を受ける。MARV−DNAワクチンは、上に記載されたように送達された。DNAが送達された後、対象には、MARVを負荷する。動物を生存及び感染の徴候についてモニターする。血清試料を、サイトカイン定量化及び他の免疫分析のために収集する。血液試料を感染後に収集し、ウイルス血症レベルを測定する。
MARV−dMAbが投与された対象の抗MARV中和抗体力価を決定する。中和力価は、細胞における細胞変性効果の100%低減を媒介する最高希釈の逆数として計算され得る。
血清は、MARV−dMAb及びMARV−DNAワクチン注射対象から、ならびにMARV負荷対象から収集される。TNF−α、IL−1β及びIL−6血清サイトカインレベルが測定される。
抗MARV中和mAbから構築された最適化合成プラスミドを、IgG及びFab抗体のために設計した。細胞に、MARV−IgGプラスミドまたはMARV−Fab(VL、VH、もしくは組み合わせ)プラスミドのいずれかを形質移入して、インビトロ発現を確証する。MARV−Fab及びMARV−IgGは筋肉内に抗体を発現し、インビトロにおいて正確に組み立てられ、生物学的に機能していると思われた。
インビトロ発現を確認した後、MARV−FabまたはMARV−IgGが抗MARV抗体をインビボで産生する能力を測定する。構築物は両方ともmAbを生成する。対象に、MARV−IgGまたはMARV−Fabのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ELISAにより評価する。MARV−IgG及びMARV−Fabの両方が注射された後に収集した血清は、MARVタンパク質に結合するが、無関係の対照抗原には結合しない。これらのデータは、MARV−IgGまたはMARV−Fab構築物からインビボ産生された抗MARV抗体が、従来のように産生された抗原特異的抗体に類似した生物学的特徴を有することを示している。
抗MARV dMAb生成mAbが結合特異性及び抗MARV中和活性について試験される。血清抗体はMARV感染細胞に結合する。抗MARV dMAbプラスミドから生成された抗体には強い特異性がある。
抗MARV dMAbから生成された抗体がMARVへの初期曝露に対して防御を提供するかを決定するため、10頭の対象群が、対照または抗MARV dMAbを0日目に受ける。続いて各群には、ウイルスを皮下負荷して、自然MARV感染を模倣する。続いて対象の生存及び体重変化を記録する。抗MARV dMAbプラスミドは、防御免疫を付与する。
次に、長期MARV負荷防御試験を、0日目にMARV−DNAワクチンをワクチン接種した後または抗MARV dMAbを投与した後に実施した。MARV−DNAは、抗MARV dMAbより長い防御免疫を付与する。
抗体送達をワクチン接種手法と組み合わせる1つの潜在的な問題は、抗体が多くの伝統的なワクチンを中和する可能性があり、したがって不適合なプラットフォームであることである。MARV負荷の文脈において、対象の生存に対する抗MARV dMAbとMARV−DNAの共投与の効果を評価する。対象には、抗MARV dMAb及びMARV−DNAが0日目に投与される。続いて、一部の動物にはMARVが2日目に、他には35日目に負荷される。これらの群の生存を時間の関数として追跡する。抗MARV dMAbは感染に対する防御を媒介し、生存率は、対照(pVax1)動物では負荷の4日後におよそ30%減少している。抗MARV dMAb及びMARV−DNAワクチンにより誘導されたIgGは、両方とも検出される。抗MARV dMAbは、MARV負荷による感染及び死亡に対して急速な防御を媒介する。
抗MARV dMAbが投与された対象は、投与の直ぐ後のウイルス負荷から完全に防御され、一方、MARV−DNAワクチンの単回免疫化の後では、おそらく防御免疫を備えるのに十分な時間がないために、対象は感染から生き残っていない。しかし、免疫化レジメンに続く後の時点での負荷では、MARV−DNAは完全な防御を提供している。類似した防御レベルが、抗MARV dMAbの単回用量を投与した対象において発生したが、防御は、経時的に衰えた。注目すべきことに、抗MARV dMAbとMARV−DNAの共送達は、急速で持続的な体液性及び細胞免疫を生じ、組み合わせ手法が相加的または相乗的な効果を有し得ることを示唆している。重要なことに、抗MARV dMAbとMARV−DNAの共送達は、短期間または長期間の防御免疫応答の発生に関して拮抗的ではない。
ワクチン接種は、免疫の生成前に誘導期を示すことが知られており、したがって、免疫応答が効果を表す前に感染する時間のすき間がある。ワクチン及び自然免疫応答の利益を、DNA合成抗体またはdMAbを使用した有効な免疫の急速な生成と共に利用する特定の新規手法が、以下に提供される。
ELISAアッセイを、Flu−dMAbが投与された対象からの血清により実施して、発現動態及び標的抗原結合を定量化する。
Flu感染細胞のIgG発現をウエスタンブロットにより分析する。免疫蛍光分析では、Flu感染細胞を共焦点顕微鏡法により目視評価し、定量的または半定量的に分析する。
発現動態及び機能性を、対照またはFlu−dMAbを注射した後の対象において評価した。DNAワクチンを含む研究では、Flu−DNAワクチンプラスミドが投与される。
対象は、Flu−dMAbまたは対照プラスミドの電気穿孔増強注射を受ける。Flu−DNAワクチンは、上に記載されたように送達された。DNAが送達された後、対象にはFluを負荷する。動物を生存及び感染の徴候についてモニターする。血清試料を、サイトカイン定量化及び他の免疫分析のために収集する。血液試料を感染後に収集し、ウイルス血症レベルを測定する。
Flu−dMAbが投与された対象の抗Flu中和抗体力価を決定する。中和力価は、細胞における細胞変性効果の100%低減を媒介する最高希釈の逆数として計算され得る。
血清は、Flu−dMAb及びFlu−DNAワクチン注射対象から、ならびにFlu負荷対象から収集される。TNF−α、IL−1β及びIL−6血清サイトカインレベルが測定される。
抗Flu中和mAbから構築された最適化合成プラスミドを、IgG及びFab抗体のために設計した。細胞に、Flu−IgGプラスミドまたはFlu−Fab(VL、VH、もしくは組み合わせ)プラスミドのいずれかを形質移入して、インビトロ発現を確証する。Flu−Fab及びFlu−IgGは筋肉内に抗体を発現し、インビトロにおいて正確に組み立てられ、生物学的に機能していると思われた。
インビトロ発現を確認した後、Flu−FabまたはFlu−IgGが抗Flu抗体をインビボで産生する能力を測定する。構築物は両方ともmAbを生成する。対象に、Flu−IgGまたはFlu−Fabのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ELISAにより評価する。Flu−IgG及びFlu−Fabの両方が注射された後に収集した血清は、Fluタンパク質に結合するが、無関係の対照抗原には結合しない。これらのデータは、Flu−IgGまたはFlu−Fab構築物からインビボ産生された抗Flu抗体が、従来のように産生された抗原特異的抗体に類似した生物学的特徴を有することを示している。
抗Flu dMAb生成mAbが結合特異性及び抗Flu中和活性について試験される。血清抗体はFlu感染細胞に結合する。抗Flu dMAbプラスミドから生成された抗体には強い特異性がある。
抗Flu dMAbから生成された抗体がFluへの初期曝露に対して防御を提供するかを決定するため、10頭の対象群が、対照または抗Flu dMAbを0日目に受ける。続いて各群には、ウイルスを皮下負荷して、自然Flu感染を模倣する。続いて対象の生存及び体重変化を記録する。抗Flu dMAbプラスミドは、防御免疫を付与する。
次に、長期Flu負荷防御試験を、0日目にFlu−DNAワクチンをワクチン接種した後または抗Flu dMAbを投与した後に実施した。Flu−DNAは、抗Flu dMAbより長い防御免疫を付与する。
抗体送達をワクチン接種手法と組み合わせる1つの潜在的な問題は、抗体が多くの伝統的なワクチンを中和する可能性があり、したがって不適合なプラットフォームであることである。Flu負荷の文脈において、対象の生存に対する抗Flu dMAbとFlu−DNAの共投与の効果を評価する。対象には、抗Flu dMAb及びFlu−DNAが0日目に投与される。続いて、一部の動物にはFluが2日目に、他には35日目に負荷される。これらの群の生存を時間の関数として追跡する。抗Flu dMAbは感染に対する防御を媒介し、生存率は、対照(pVax1)動物では負荷の4日後におよそ30%減少している。抗Flu dMAb及びFlu−DNAワクチンにより誘導されたIgGは、両方とも検出される。抗Flu dMAbは、Flu負荷による感染及び死亡に対して急速な防御を媒介する。
抗Flu dMAbが投与された対象は、投与の直ぐ後のウイルス負荷から完全に防御され、一方、Flu−DNAワクチンの単回免疫化の後では、おそらく防御免疫を備えるのに十分な時間がないために、対象は感染から生き残っていない。しかし、免疫化レジメンに続く後の時点での負荷では、Flu−DNAは完全な防御を提供している。類似した防御レベルが、抗Flu dMAbの単回用量を投与した対象において発生したが、防御は、経時的に衰えた。注目すべきことに、抗Flu dMAbとFlu−DNAの共送達は、急速で持続的な体液性及び細胞免疫を生じ、組み合わせ手法が相加的または相乗的な効果を有し得ることを示唆している。重要なことに、抗Flu dMAbとFlu−DNAの共送達は、短期間または長期間の防御免疫応答の発生に関して拮抗的ではない。
本明細書に提示されている試験は、プラスミドDNAの筋肉内電気穿孔を介した機能性抗ジカ「DNAモノクローナル抗体」(DMAb)の生成を実証する。抗ジカモノクローナル抗体のコドン最適化可変領域DNA配列を、ヒトIgG1定量ドメインに合成した。プラスミドDNAコード抗体を、C3Hマウスに送達した。この試験は、現存する生物学的療法の代替案としてDMAbを支持するものである。
この試験では、ZIKVのプレメンブレン+エンベロープタンパク質(pre−membrane+envelope protein)(prMEnv)を標的にする新規の合成DNAワクチンを生成し、インビボ効力を評価した。プラスミド構築物の初期のインビトロ発生及び評価試験に続いて、マウス及び非ヒト霊長類を、電気穿孔媒介増強DNA送達によって、このprMEnv DNAに基づいた免疫原で免疫化した。ワクチン接種した動物は、抗原特異的細胞及び体液性免疫及び中和活性を生成することが見出された。インターフェロン(IFN)−α/βの受容体を欠いている(IFNAR−/−と称する)マウスでは、このDNAワクチンによる免疫化は、インビボウイルス負荷の後、脳組織におけるウイルス病理の予防に加えて、感染関連体重減少または死亡に対して100%の防御を誘導した。加えて、非ヒト霊長類抗ZIKV免疫血清の受動移入は、続くウイルス負荷に対してIFNAR−/−マウスを防御した。発病マウスモデルにおけるこのZIKVワクチンの最初の試験は、ZIKV感染においてprMEを標的にする免疫応答の重要性を支持し、このワクチン手法の追加的な研究が、ヒトにおけるZIKVの制御にとって重要であり得ることを示唆している。
ヒト胎児由来腎臓293T(American Type Culture Collection(ATCC)番号CRL−N268、Manassas,VA,USA)及びベロCCL−81(ATCC番号CCL−81)細胞を、10%のウシ胎児血清(FBS)、ならびに1%のペニシリン及びストレプトマイシンを補充したDMEM(ダルベッコー修飾イーグル培地、Gibco−Q3、Invitrogen)に維持し、コンフルエンスの時点で継代させた。ZIKVウイルス株MR766(Dr.Susan Weissからの寛大な贈り物)及びPR209(Bioqual,MD)を、ベロ細胞において増幅させ、貯蔵物を標準的なプラークアッセイによってベロ細胞に滴定した。5〜6週齢の雌C57BL/6(The Jackson Laboratory)及びIFNAR-/-(MMRRC貯蔵所−The Jackson Laboratory)マウスを収容し、National Institutes of Health,Wistar and the Public Health Agency of Canada IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)の指針に従って、温度制御光周期施設において治療/ワクチン接種した。
ZIKV−prMEプラスミドDNA構築物は、膜(prM)+エンベロープ(E)の全長前駆体をコードし、カプシドタンパク質が合成された。コンセンサス戦略を使用し、コンセンサス配列を、現在のZIKV prMEタンパク質配列の整列によって決定した。ワクチン挿入物を、ヒトにおける発現を増強するために遺伝子最適化(すなわち、コドン及びRNA最適化)し、IgEリーダー配列を付加して、発現を促進させた。構築物は、市販(Genscript,NJ,USA)の合成物であり、以前に記載されたように、サイトメガロウイルス前初期プロモーターの制御下で修飾pVax1発現ベクターにサブクローン化した(Muthumani et al.,2016,Sci Transl Med 7:301ra132)。最終構築物をZIKV−prMEワクチンと呼び、対照プラスミド骨格はpVax1である。加えて、MR766(DQ859059.1)及び2016ブラジル(AMA12084.1)大流行株のprM及びE遺伝子をコードする多数の他の適合DNA構築物も、更なる評価のために設計した。DNA構築物の大規模増幅をInovio Pharmaceuticals Inc.(Plymouth Meeting,PA,USA)において実施し、精製プラスミドDNAを免疫化のために水中で配合した。DNA挿入物のサイズをアガロースゲル電気泳動によって確認した。系統発生分析を、MEGAバージョン5ソフトウエア(Muthumani et al.,2016,Sci Transl Med 7:301ra132)を使用してClustalWの多重整列によって実施した。
雌C57BL/6マウス(6〜8週齢)及びIFNAR-/-マウス(5〜6週齢)を、総体積が20〜30μlの水中の25μgのDNAをインビボ電気穿孔送達により前脛骨筋に送達することによって免疫化した。インビボ電気穿孔を、CELLECTRA適応型定電流電気穿孔装置(Inovio Pharmaceuticals)により、DNA注射の直後に同じ部位に送達した。三叉CELLECTRA低侵襲装置を、筋肉の中に約2mm挿入した。方形波パルスが、26ゲージソリッドステンレス鋼電極から構成される三角形3電極アレイから送達され、0.1アンプの2つの定電流パルスが、1秒遅れの間隔で52μs/パルスにより送達された。電気穿孔の使用に関する更なるプロトコールは、以前に詳細に記載されている(Flingai et al.,2015,Sci Rep 5:12616)。マウスを2週間間隔で3回免疫化し、最終の免疫化の1週間後に殺処分した。血液を、細胞及び体液性免疫応答の分析のため、それぞれの免疫化の後に収集した(Muthumani et al.,2016,Sci Transl Med 7:301ra132)。カニクイザル免疫原性試験:5頭のカニクイザルを、2mgのZIKV−prMEワクチンにより5週間間隔で2回、2つの部位で皮内免疫化した。マウス免疫化において記載されたものと同じ装置を使用して、電気穿孔を直後に送達した。
インビトロ発現試験では、GeneJammer試薬を製造会社(Agilent)のプロトコールに従って使用して、形質移入を実施した。簡潔には、細胞を35mm皿に50%集密に増殖させ、1μgのZIKV−prMEワクチンを形質移入した。細胞を形質移入の2日後に収集し、PBSで2回洗浄し、細胞溶解緩衝液(Cell Signaling Technology)で溶解した。ウエスタンブロットを使用して、採取した細胞溶解産物におけるZIKV−prMEタンパク質の発現、ならびに、抗フラビウイルス、またはZIKV−prMEワクチン接種マウスの免疫血清のいずれかの使用によるマウス及びRMの血清の免疫特異性について、以前に記載されたように確証した(Muthumani et al.,2016,Sci Transl Med 7:301ra132)。簡潔には、3〜12%のBis−TrisNuPAGEゲル(Life Technologies)に、5μgまたは1μgのZIKVエンベロープ組み換えタンパク質(rZIKV−E)、形質移入細胞溶解産物または上澄み及びOdysseyタンパク質Molecular Weight Marker(製品番号928−40000)を装填した。ゲルを、MOPS緩衝液により200Vで50分間作動させた。タンパク質を、iBlot 2 Gel Transfer Device(Life Technologies)の使用によってニトロセルロース膜に移入した。膜を、PBS Odyssey遮断緩衝液(LI−COR Biosciences)により室温で1時間遮断した。ワクチン発現を検出するため、抗フラビウイルス群抗原(MAB10216−クローンD1−4G2−4−15)抗体を、1:500に希釈し、マウス及びRMの免疫血清を、0.2%のTween 20(Bio−Rad)を有するOdyssey遮断緩衝液で1:50に希釈し、膜と共に4℃で一晩インキュベートした。膜をPBSTで洗浄し、次に適切な二次抗体(ヤギ抗マウスIRDye680CW、LI−COR Biosciences)をマウス血清及びフラビウイルス抗体と共に、ならびにヤギ抗ヒトIRDye800CW(LI−COR Biosciences)をRM血清と共に、マウス血清では1:15,000の希釈と共に、室温で1時間インキュベートした。洗浄した後、膜をOdyssey赤外線画像装置(LI−COR Biosciences)で画像化した。
免疫蛍光アッセイでは、細胞をカバースリップにおいて増殖させ、5μgのZIKV−prMEワクチンを形質移入した。形質移入の2日後、細胞を4%パラホルムアルデヒドに15分間固定した。次に非特異的結合を、PBSに希釈した正常なヤギ血清により室温で1時間遮断した。次にスライドをPBSで5分間洗浄し、続いて免疫化マウス又はRMの血清の1:100の希釈と共に4℃で一晩インキュベートした。スライドを上に記載されたように洗浄し、適切な二次抗体(マウス血清ではヤギ抗マウスIgGAF488及びRM血清ではヤギ抗ヒトIgG−AF488、Sigma)の1:200希釈と共に室温で1時間インキュベートした。洗浄した後、DAPIを有するFlouroshield封入培地(mounting media)(Abcam)を添加して、全ての細胞の核を染色した。その後、カバースリップを載せ、スライドを顕微鏡で観察した(EVOS Cell Imaging Systems、Life Technologies)(Muthumani et al.,2016,Sci Transl Med 7:301ra132)。加えて、ベロ、SK−N−SH又はU87−MB細胞を4チャンバー組織培養処理ガラススライドにおいて増殖させ、RM免疫血清(1:200)とプレインキュベートした/しなかったZIKV−MR766またはPR209を0.01のMOIで感染させ、パンフラビウイルス抗体を記載されたように使用して、ZIKV感染の4日後に染色した(Rossi et al.,2016,J Rop Med Hyg 94:1362−9)。
病理組織学のため、ホルマリン固定パラフィン包埋脳組織を厚さ5μmの矢状切片に切断して、Superfrost顕微鏡スライド(Fisher Scientific)に載せ、37℃で一晩ベーキングした。キシレンを2回交換して、切片を脱パラフィン処理し、100%、90%、次に70%のエタノールに浸漬して再水和した。切片では、Harrisヘマトキシリン(Surgipath)を使用して、核構造を2分間染色し、続いて1%の酸アルコール(Surgipath)により分化させ、Scott水道水で2分間処理した。続いて切片では、エオシン(Surgipath)を使用して、細胞質構造を2分間対比染色した。スライドを70%、90%及び100%のエタノールで再水和し、キシレンで清浄にし、Permount(Fisher Scientific)を使用して取り付けた。
脾細胞の単一細胞懸濁液を、全てのマウスから調製した。簡潔には、マウスの脾臓を、10%FBS(R10)が補充された5mlのRPMI 1640に個別に収集し、次に、Stomacher 80パドルブレンダー(A.J.Seward and Co.Ltd.)により高速で30秒間処理した。処理された脾臓試料を45mmのナイロンフィルターで濾過し、次に1,500gにより4℃で10分間遠心分離した。細胞ペレットを、5mlのACK(アンモニウム−塩化物−カリウム)溶解緩衝液(Life Technologies)に室温で5分間再懸濁し、次にPBSを加えて、反応を停止させた。試料を再び1,500gにより4℃で10分間遠心分離した。細胞ペレットをR10に再懸濁し、次に、ELISpotアッセイ及びフローサイトメトリー分析に使用する前に45mmのナイロンフィルターに通した(Muthumani et al.,2016,Sci Transl Med 7:301ra132)。RMでは、血液(各時点で20ml)をEDTA管に収集し、Accuspin管を用いる標準的なFicoll−Hypaque手順(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO,USA)を使用して、PBMCを単離した。5ミリリットルの血液も、血清を単離する各時点において血清管に収集した。
脾細胞を96ウエルプレート(2×106/ウエル)に加え、Protein Transport Inhibitor Cocktail(ブレフェルジンA及びモネンシン、eBioscience)の存在下、ZIKV−prMEプールペプチドにより37℃/5%CO2で5時間刺激した。細胞刺激カクテル(+タンパク質輸送阻害剤のPMA(ホルボール12−ミリステート13−アセテート)、イオノマイシン、ブレフェルジンA及びモネンシン;eBioscience)を陽性対照として使用し、R10培地を陰性対照として使用した。次に全ての細胞では、製造会社(BD Biosciences,San Diego,CA,USA)の使用説明書に記載されたとおりに、表面及び細胞内タンパク質を染色した。簡潔には、細胞を、フルオロクロム結合抗体による表面染色の前に、FACS緩衝液(0.1%アジ化ナトリウム及び1%FBSを含有するPBS)で洗浄した。細胞をFACS緩衝液で洗浄し、製造会社のプロトコールに従ってBD Cytofix/Ctyoperm(商標)(BD Biosciences)を使用して固定及び透過処理し、続いて細胞内染色を行った。以下の抗体を表面染色に使用した。LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell染色キット(Invitrogen)、CD19(V450;クローン1D3;BD Biosciences)、CD4(FITC;クローンRM4−5;eBioscience)、CD8(APC−Cy7;クローン53−6.7;BD Biosciences)、CD44(BV711;クローンIM7;BioLegend)。細胞内染色では、以下の抗体を使用した。IFN−γ(APC;クローンXMG1.2;BioLegend)、TNF−α(PE;クローンMP6−XT22;eBioscience)、CD3(PerCP/Cy5.5;クローン145−2C11;BioLegend)、IL−2(PeCy7;クローンJES6−SH4;eBioscience)。全てのデータを、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)の使用により収集し、FlowJoソフトウエア(Tree Star,Ashland,OR,USA)の使用により分析した。
簡潔には、96ウエルELISpotプレート(Millipore)を、抗マウスIFN−γ捕捉Ab(R&D Systems)で被覆し、4℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをPBSで洗浄し、PBST+1%BSAで2時間遮断した。免疫化マウスからの200、000個の脾細胞を各ウエルに加え、培地のみ(陰性対照)、培地+PMA/イオノマイシ(陽性対照)、または9個のアミノ酸による15merの重複からなり、ZIKV prMEタンパク質の長さに及ぶペプチドプール(1μg/ml)(Genscript)を伴う培地の存在下、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。24時間後、細胞を洗浄し、次にビオチン化抗マウスIFN−γAb(R&D Systems)と共に4℃で一晩インキュベートした。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(R&D Systems)を、洗浄した後に各ウエルに加え、次に室温で2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に5−ブロモ−4−クロロ−3’−インドイルホスフェートp−トルイジン塩及びニトロブルー塩化テトラゾリウム(発色試薬(chromogen colour reagen)、R&D Systems)を加えた。最後に、プレートを蒸留水ですすぎ、室温で乾燥し、SFUを自動ELISpot読み取り機(CTL Limited)により定量化し、未加工値を脾細胞百万個あたりのSFUに正規化した。RM試料では、サル用ELISPOTPROIFN−γキット(MABTECH)を製造会社により記載されたように使用し、200,000個のPBMCをペプチドプールで刺激し、プレートを洗浄し、スポットを現像し、以前に記載されたように計数した(Muthumani et al.,2016,Sci Transl Med 7:301ra132)。
ELISAを使用して、マウス及びRM血清の力価を以前に記載されたように決定した(Muthumani et al.,2016,Sci Transl Med 7:301ra132)。簡潔には、1μgの精製rZIKV−Eタンパク質を使用して、96ウエルマイクロタイタープレート(Nalgene Nunc International,Naperville,IL,USA)を4℃で一晩被覆した。PBS中の10%FBSで少なくとも1時間遮断した後、プレートを0.05%PBST(PBS中のTween 20)で4回洗浄した。免疫化マウス及びRMからの血清試料を1%FBSにより段階希釈し、プレートに加え、次に室温で1時間インキュベートした。プレートを再び0.05%PBSTで4回洗浄し、次に、HRP結合抗マウスIgG(Sigma)と共に、マウス血清では1:35,000希釈と共に室温で1時間インキュベートした。RM血清では、抗サルIgG HRP(Southern Biotech)を1:5,000の希釈により室温で1時間使用した。結合した酵素は、SIGMAFAST OPD(o−フェニレンジアミン二塩酸塩)基質溶液を製造会社(Sigma−Aldrich)の使用説明書に従って加えることによって検出した。反応を、15分後に1N H2SO4の添加により停止させた。450nmでの光学濃度を、Synergyプレート読み取り機により読み取った。全てのマウス及びRM血清試料を二重にアッセイした。終点力価を、以前に記載された方法(Frey et al.,1998,J Immunol Methods 21:35−41)を使用して決定した。
MR766及びベロ細胞が関わるPRNTは、以前に記載されていた(Sun et al.,2006,J Infect Dis 193:1658−65)。簡潔には、熱不活性化マウスまたはRM血清を、無血清DMEMにより段階希釈し(1:10〜1:1280)、等量のZIKV−MR766(100PFU)と共に37℃で2時間インキュベートした。混合物をベロ細胞の集密層に加え、37℃で放置し、2時間かけて吸着させた。2×DMEM培地:ソフトアガー(1:1)オーバーレイを細胞に被せ、プレートを37℃で5日間インキュベートした。寒天オーバーレイを取り除き、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、1×PBSで洗浄し、クリスタルバイオレット溶液で染色し、1×PBSで洗浄し、プレートを放置して乾燥させた。24ウエルプレートで行ったアッセイにおけるプラークを自動Immunospot読み取り機(CTL Limited)により走査し、試料ウエルの中、ならびに陰性対照(DMEMのみ)及び陽性対照(100PFU MR766ZIKVウイルスのみ)ウエル中のプラークを、ELISpot読み取り機に備わった自動ソフトウエアを使用して計数した。プラーク低減率を以下のように計算した。低減%=100×{1−(各希釈におけるプラークの平均数/陽性対照ウエルにおけるプラークの平均数)}。GraphPad Prismソフトウエアを使用して、それぞれ個別の血清希釈の対数変換に対するプラーク低減%の非線形回帰分析を実施し、ワクチン接種後のピーク応答での実際の50%PRNT力価の線形補間を促進した。50%中和での中央値及び四分位数間範囲を、それぞれの中和標的全体において及びワクチン処理群において計算し、幾何平均抗体価も計算した。力価は、プラーク数の50%低減をもたらす最高希釈の逆数を表す。
ZIKV負荷試験では、IFNAR-/-マウス(n=10/群)をZIKV−prMEワクチンまたはpVax1により1回または2回免疫化した。マウスに、15日目(単一免疫化群)または第2の免疫化(2回免疫化群)の1週間後の21日目に、1×106PFUまたは2×106PFUのZIKV−PR209ウイルスのいずれかを負荷した。また、IFNAR-/-マウスの追加の群(n=10/群)を1回免疫化し、15日目に2×106PFUのZIKV−PR209を負荷した。負荷後に、動物を計量し、体温を皮下に位置する温度チップによって毎日測定した。加えて、疾患の臨床徴候(運動性の減少、丸まった姿勢、後肢の指背歩行(部分的な麻痺)、一方の後肢の麻痺、または両方の後肢の麻痺)について1日に2回観察し、ウイルス量を決定するために採血した。福祉に基づいた殺処分の基準は、20%の体重減または一方もしくは両方の後肢の麻痺から構成された。
処置したマウスからの脳をRNAlater(Ambion)に4℃で1週間浸漬し、次に−80で貯蔵した。次に脳組織を計量し、ステンレス鋼ビーズを有するTissueLyser(Qiagen)を30サイクル/秒で6分間使用して、2mlのクライオバイアル中の600μlのRLT緩衝液において均質化した。ウイルスRNAも、RNeasy Plusミニキット(Qiagen)により血液から単離した。ZIKV特異的リアルタイムRT−PCRアッセイを、対象動物におけるウイルスRNAの検出に利用した。RNAを、TaqMan Fast Virus 1−Step Master Mix(Applied Biosystems)により、プライマーZIKV835及びZIKV911c、ならびにプローブZIKV860FAMを使用して逆転写及び増幅した。標準曲線を、それぞれのプレートについて並行して生成し、ウイルスゲノムコピー数の定量化に使用した。StepOnePlus Real−Time PCR System(ABI)ソフトウエアバージョン2.3を使用して、サイクル閾(Ct)値を計算し、以前に記載されたように(Lanciotti et al.,2008,Emerg Infect Dis 14:1232−9)、複製の少なくとも1つにおけるCt値≦38を陽性と考慮した。前出血(pre−bleed)は、このアッセイでは陰性であった。
抗体力価における増加倍数の差を、マン・ホイットニー分析の使用により比較した。統計分析は、Graphpad, Prism 4(Graphpad software,Inc.San Diego,CA,USA)を使用して実施した。全ての分析物において、P<0.05が有意であるとみなされた。log10変換を終点結合ELISA力価及び全ウイルスPRNT50力価に適用した。
ZIKV prM(前駆体の膜)及びEnv(エンベロープ)遺伝子(ZIKV−prME)のコンセンサス配列を、ヒトに感染を引き起こした1952年から2015年の間に単離された様々なZIKVから、prMおよびEnv配列を使用して生成した。ZIKV−prMEコンセンサス配列を、高い効率の免疫グロブリンE(IgE)リーダーペプチド配列の付加を含む、追加的な修飾及び最適化を行ってインビボ発現を改善した後のpVax1ベクターに、クローン化した(図20A)。ZIKVエンベロープ配列の最適化整列を、相同性モデル及びDiscovery Studio 4.5による可視化を使用して実施した。基準モデルには、PDB 5JHM及びPDB 5IZ7が含まれた。prME抗原の特定の領域に対応して整列させた残基を、可視化の目的のためにモデルにおいて標識した(図20B)。最適化コンセンサスワクチン選択肢は、この研究で分析された多数のZIKV株と比べて、一般に保存的または半保存的である。EDE特異的中和抗体の構造研究は、これらの認識決定基がエンベロープ二量体インターフェースの血清型インバリアント部位に見出され得ることを明らかにしており、融合ループの露出主鎖、ならびに2つの保護グリカン鎖(N67及びN153連結グリカン)が含まれる(Rouvinski et al.,2015,Nature 520:109−13)。これらの2つのグリコシル化部位は、他のフラビウイルスにおいてあまり高度に保存されていない。更に、ZIKVは、N67連結グルコシル化部位を有さず、N154連結グリコシル化部位(デングにおけるN153連結グリコシル化部位と同等である)は、単離されたZIKV株にいくつかにおいて不在である。したがって、コンセンサス設計の一部として、構築物を、このグリコシル化部位を省くように設計した。この部位にグリコシル化を欠いていることは、ZIKVエンベロープタンパク質へのEDE1型の広範囲の中和抗体(bnAb)の結合を改善することに相関している(Rouvinski et al.,2015,Nature 520:109−13)。
ZIKV−prMEnvプラスミドワクチンが細胞免疫応答を誘導する能力を評価した。4頭の雌C57BL/6マウス群に、対照プラスミド主鎖(pVax1)またはZIKV−prMEプラスミドワクチンのいずれかの筋肉内(i.m.)注射、続く送達部位の電気穿孔により2週間間隔で3回免疫化した(図21A)。動物を3回目の注射の1週間後に殺処分し、それぞれの動物から採取された大量の脾細胞を、ZIKV−prMEが包含されるペプチドプールにエキソビボ曝露された後にインターフェロンγ(IFN−γ)を分泌する能力についてELISpotアッセイにより評価した。アッセイ結果は、ZIKV−prME免疫化マウスからの脾細胞が複数のZIKV−Eペプチドプールによる刺激の後に細胞免疫応答を生じたことを示している(図21B)。最も強い細胞応答(複数可)を誘発したZIKV−Envの領域(複数可)を、ZIKV−prMEタンパク質の全体に及ぶ15mer(11個のアミノ酸による重複)からなる22個のペプチドプールの使用によって、マトリックス形式のELISpotアッセイにより評価した。いくつかのプールは、上昇したT細胞応答を示し、ペプチドプール15は、最高値のスポット形成単位(SFU)を示した(図21C)。このマトリックスマッピング分析は、優位なprMEエピトープ「IRCIGVSNRDFVEGM(配列番号17)」(アミノ酸167〜181)を明らかにした。このペプチドは、Immune Epitope Database Analysis Resourceツールを利用した分析によってH2−Db制限エピトープを含有することが確認され、このことは、このハロタイプにおいて、抗原が有効に処理されたことを支持している。
これらの試験の開始時には、特定の抗ZIKV免疫応答を評価する市販の試薬は入手可能ではなかった。したがって、必要に迫られて、組み換えZIKVエンベロープタンパク質(rZIKV−E)を生成して、この試験において実施されるアッセイを支援した。この試薬を生成するため、ZIKV−prMEワクチンコンセンサス抗原に基づいたコンセンサZIKVエンベロープ配列を、pEt30a Escherichia coli発現ベクターにクローン化した(図28A)。rZIKV−E抗原をE.coli培養物で産生し、ニッケルカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、SDS−PAGEを使用して分析し、rZIKV−E形質移入細胞からの予想されたサイズの過剰発現したタンパク質を溶解産物の中に示し、抗Hisタグ抗体を使用するウエスタン分析によって検出することができた(図28B)。ZIKV−prMEワクチンで免疫化されたマウスの血清はrZIKV−Envに結合し、これをELISA(酵素連結免疫吸着アッセイ、図28C)における捕捉抗原として使用した。複数のフラビウイルスのエンベロープタンパク質と反応する市販の抗体(指定された汎フラビウイルス)も、rZIKV−Eに結合した。ウエスタン分析は、ZIKV−prMEnv免疫化マウスの免疫血清がrZIKV−Eを特異的に認識したことを実証した(図28D)。これらのデータは、生成されたrZIKV−EがZIKV−prMEnvワクチン接種マウスの免疫血清と特異的に反応したことを示し、故に、この組み換えタンパク質を更なる免疫原性試験に使用した。
コンセンサスZIKV−prMEnvワクチンが体液性免疫応答をマウスに誘導する能力を評価した。4頭のC57BL/6マウス群を、25μgの空(empty)対照pVax1またはコンセンサスZIKV−prMEnvワクチンプラスミドのいずれかにより気穿孔媒介送達を介して、2週間間隔で3回筋肉内(i.m.)において免疫化した。血清を、それぞれの免疫化マウスから得て、ZIKV特異的IgG応答について、捕捉抗原として固定rZIKV−Eを使用してELISAにより試験した。抗ZIKV特異的IgGの顕著な増加が、21日目に観察され、血清IgGレベルの更なる押し上げが35日目に認められた(図22A)。ワクチン接種した動物の60日目の血清は、上昇されたZIKV特異的抗体応答が最終追加免疫の後に長期間にわたって維持されたことを示している。最も重要なことに、ワクチン接種したマウスの血清は、終点力価が示しているように、非常に高いレベルのrZIKV−E特異的抗体を含有した(図22B)。ワクチン誘導抗体の特異性についての追加の評価を、ZIKV prMEnvプラスミド接種マウスのプールした血清を、ウエスタン分析によりrZIKV−E(エンベロープ)を検出する能力について(図22C)及び免疫蛍光アッセイによりZIKV(MR766株)感染細胞を染色する能力について(図22D)選別することによって実施した。これら両方の分析結果は、ワクチン誘導体液性応答の特異性を確認した。
ZIKV誘導疾患及び免疫の機構は、不十分に定義されており、ZIKV感染に対する免疫応答の防御対仮定的病原性の性質は、依然として不明のままである(Rossi et al.,2016,J Rop Med Hyg 94:1362−9)。マウスの大部分の系統は、ZIKV感染に対して抵抗性があるが、IFN−α/β受容体を欠いている(IFNAR-/-)マウスは、感染及び疾患にかかりやすいことが見出されており、大部分が負荷の6〜7日後に冒されている(Lazear et al.,2016,Cell Host Microbe 19:720−30)。コンセンサスZIKV−prMEプラスミドワクチンが細胞及び体液性免疫応答をこのマウス系統に誘導する能力を調査した。5〜6週齢の雌IFNAR-/-マウス(n=4)を、対照pVax1プラスミドまたはZIKV prMEワクチンプラスミドワクチンのいずれかにより、電気穿孔媒介送達を用いて、2週間間隔で3回i.m.において免疫化した。血清を免疫化マウスから0、14、21及び35日目に収集し、脾細胞を最終免疫化(35日目)の1週間後にマウスから採取した。ワクチン免疫化マウスの脾細胞は、ELISpotアッセイにおいて106細胞あたりのSFUベルにより示されているように、明確な細胞免疫応答を生じた(図29A)。rZIKV−Eを捕捉抗原として使用したELISA分析の結果は、14日目までには検出可能な抗ZIKV血清IgGを示し(約1:1,000の力価)、これらのレベルは、続く結合抗体によるワクチン接種により押し上げられて、力価は少なくとも1:100,000に到達している(図29B及び29C)。比較として、免疫後35日目の試料のPRNT50力価は、1:60であった。結果は、コンセンサスZIKV−prMEnvワクチンで免疫化されたIFNAR-/-マウスが、抗ZIKV細胞及び体液性免疫応答を生成できることを示し、この病原体負荷に対する推定ワクチン効果のモデルによる更なる研究を支持している。
NHPを、低電圧皮内形式において強力な免疫応答を示す最近の研究に基づいて、皮内電気穿孔の使用による皮内免疫化によって免疫化した(Hutnick et al.,2012,Hum gene Ther 23:943−50、Broderick et al.,Mol Ther Nucleic Acids 1:e11)。カニクイザル(RM、n=5/群)に、2.0mgのワクチンプラスミドを電気穿孔により皮内に投与し、それぞれの動物には、4週間置いて2回ワクチン接種した。血清及び末梢血単核球(PBMC)を、0日目(免疫化前)及び6週目(2回目の免疫化の2週間後)に収集した。免疫化前及びZIKV−prMEnvペプチドプールでエキソビボ刺激された6週目のPBMCのELISpot分析は、ZIKV−prMEnv免疫化がRMにおいて堅牢な抗ZIKV T細胞応答を誘導したことを示した(図23A)。
探索研究において、5〜6週齢のIFNAR(-/-)マウス(n=10)に、1×106プラーク形成単位(PFU)のZIKV−PR209分離株を、皮下(s.c.)、腹腔内(i.p.)、または静脈内(i.v.)経路により投与して負荷した。負荷した後、全ての動物を、体重の日常的な測定、ならびに後肢脱力及び麻痺などの瀕死状態の他の徴候の検査を含む、感染の臨床徴候についてモニターした。接種の最初の4日間には、マウスの一般的な外観に変化は観察されなかった。しかし、4日目の後、各群のマウスは、全体的な活動の低下、運動性の減少、多くの場合に後肢脱力を伴う丸まった姿勢、水摂取の減少及び明確な体重減を示した。動物は、ウイルス負荷の経路にかかわりなく、6日目から8日目の間に感染に冒された(図31A〜35E)。これらのデータに基づいて、このモデルにおいてZIKV−prME媒介防御を評価する後の試験は、負荷にs.c.経路を使用した。
次に、ZIKV−prMEnvワクチン接種RMの免疫血清の移入が、ZIKV媒介病理発生をIFNAR-/-マウスにおいて防御するかを試験した。このため、6週齢のRMからの150μg当量のIgG(PRNT50約1/160)を、ZIKVウイルス負荷の1日後に、IFNAR-/-マウスに養子移入した。2群の対照マウスが含まれ、一方の群は、RMから免疫前血清を受け、他方の群は、リン酸緩衝食塩水(PBS)を受けた。PBSまたは対照血清を受けたマウスは、感染の過程で最初の体重の15〜25%を減少し、感染の6〜8日後に全て死亡した。RMのワクチン免疫血清を感染にわかりやすいマウスに移入したとき、動物は3及び4日目に体重を減少したが、その後5日目から回復し始め、最終的に80%が感染負荷から生存し(図26A)、ウイルス負荷後のZIKV換算の臨床症状に対して防御を付与するNHP血清の能力を実証している(図26B)。ZIKVの負荷に対する防御について免疫血清移入の効力を評価するために実施された反復実験では、ZIKV−prME免疫血清受容動物のうち、生存率は、80〜100%の範囲であった。これらの試験は、抗ZIKVワクチン免疫血清が、獲得適応抗ZIKV免疫応答の不在下でZIKV感染に対して有意な防御を付与する能力を有したことを示している。
ヒトにおける最近のZIKVの蔓延及び関連する病理発生には、深刻な懸念が生じている。現在、この進行感染病原体に対して認可ワクチンまたは治療薬は存在していない。ごく最近、一連の実験的ZIKVワクチンが、非病原性動物感染モデルにおいて負荷のウイルス量を低下したことが示されている(Larocca et al.,2016,Nature 536:474−8、Abbink et al.,2016,Science 353:1192−32)。これらのデータは期待の持てるものである。これに関連して、ZIKVを標的にする追加的な新規ワクチン手法を、追加のモデルにおいて検査することが重要である。ここで、新規コンセンサスZIKV−prM及びE抗原を発現するように設計された合成DNAワクチンを、マウス及び非ヒト霊長類における電気穿孔増強免疫化後に免疫原性について評価した。ZIKV−prME DNAワクチン接種は、マウス及びNHPの両方において、免疫原性であること、ならびに抗原特異的T細胞、結合及び中和抗体を生成することが観察された。特有なことに、NHPには、皮内経路により電気穿孔を介してZIKV−prMEが免疫化され、これには、最近記載されているように、i.m.電気穿孔より低い電圧及び小さい形質移入域が使用される(Trimble et al.,2016,Lancet 386:2078−88)。そのような手法の更なる研究は、臨床状況において利益をもたらし得る。
Claims (28)
- a)抗原をコードする第1の核酸配列と、
b)1つ以上の抗体またはそのフラグメントをコードする第2の核酸配列と
を含む、組成物。 - 前記抗体が、重鎖ポリペプチドまたはそのフラグメント、及び軽鎖ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記重鎖ポリペプチドまたはそのフラグメントが、第3の核酸配列でコードされ、前記軽鎖ポリペプチドまたはそのフラグメントが、第4の核酸配列でコードされている、請求項2に記載の組成物。
- 前記第2の核酸配列が、前記第3の核酸配列及び前記第4の核酸配列を含む、請求項3に記載の組成物。
- 前記第2の核酸配列が、前記第3の核酸配列及び第4の核酸配列を単一転写物として発現するプロモーターを更に含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記プロモーターがサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである、請求項5に記載の組成物。
- 前記第2の核酸配列が、プロテアーゼ切断部位をコードする第5の核酸配列を更に含み、前記第5の核酸配列が、前記第3の核酸配列と前記第4の核酸配列の間に位置する、請求項5に記載の組成物。
- 対象のプロテアーゼが、前記プロテアーゼ切断部位を認識及び切断する、請求項7に記載の組成物。
- 前記重鎖ポリペプチドが、可変重領域及び定常重領域1を含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記重鎖ポリペプチドが、可変重領域、定常重領域1、ヒンジ領域、定常重量域2及び定常重量域3を含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記軽鎖ポリペプチドが、可変軽領域及び定常軽領域を含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記第2の核酸配列がコザック配列を更に含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記第4の核酸配列が免疫グロブリン(Ig)シグナルペプチドを更に含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記IgシグナルペプチドにはIgEまたはIgGシグナルペプチドが含まれる、請求項13に記載の組成物。
- 前記抗体が前記抗原に対して特異的である、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗原が外来性抗原である、請求項15に記載の組成物。
- 前記外来性抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原及び寄生虫抗原からなる群から選択される、請求項16に記載の組成物。
- 前記ウイルス抗原が、HIV抗原、チクングニア抗原、デング抗原、肝炎抗原、HPV抗原、RSV抗原、インフルエンザ抗原及びエボラ抗原からなる群から選択される、請求項17に記載の組成物。
- 前記ウイルス抗原がチクングニア抗原である、請求項18に記載の組成物。
- 前記第1の核酸配列が、配列番号81〜88に記載されているアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗原をコードする、請求項19に記載の組成物。
- 前記第1の核酸配列が、配列番号89〜96に記載されている核酸配列の全長にわたって少なくとも約95%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項20に記載の組成物。
- 前記第2の核酸配列が、配列番号59または61に記載されているアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約95%の同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項19に記載の組成物。
- 前記第2の核酸配列が、配列番号58または60に記載されている核酸配列の全長にわたって少なくとも約95%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項22に記載の組成物。
- 前記抗原が自己抗原である、請求項15に記載の組成物。
- 請求項1〜24のいずれか一項に記載の組成物を、個体に、前記個体において免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む、免疫応答を誘導する方法。
- 前記免疫応答が持続性である、請求項25に記載の方法。
- 前記免疫応答が全身性である、請求項25に記載の方法。
- 請求項1〜24のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を個体に投与することを含む、疾患または障害が診断されている個体の治療方法。
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