TW202328210A - 用於預防感染與治療遠程新冠肺炎之針對ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２變體的疫苗組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明是針對來自SARS-CoV2 S1-RBD關切變體（VoCs），包括Omicron變體BA.4/BA.5蛋白與N、M及S2衍生的Th與CTL抗原決定位胜肽以及理想化病原體衍生的人工Th抗原決定位胜肽的胺基酸序列，以提供針對SARS-CoV2 S1-RBD關切變體，包括SARS-CoV2 Omicron變體BA.4/BA.5之專一性的有效避免與遠程COVID的治療。本發明的疫苗組成物利用胺基酸序列設計與製造最佳的SARS-CoV-2抗原蛋白、Th/CTL胜肽免疫原建構體、CHO-衍生的S1-RBD VoCs-sFc 蛋白，包括S1-RBD Omicron變體BA.4/BA.5-scFc蛋白及其組合物，作為用於避免與遠程COVID之治療的疫苗。

Description

用於預防感染與治療遠程新冠肺炎之針對SARS-CoV-2變體的疫苗組合物
本發明涉及針對SARS-CoV-2關切變體(VoCs)，包括SARS-CoV-2 Omicron BA.4/BA.5變體之預防感染與治療遠程COVID的疫苗。
SARS是2003年為嚴重急性呼吸系統症候群創建的簡稱，也稱為COVID，是2020年為冠狀病毒傳染病創建的簡稱。 該疾病最初可能幾乎沒有症狀或沒有症狀，或者可能發展為發燒、咳嗽、呼吸急促、肌肉疼痛與疲倦。併發症可能包括肺炎與急性呼吸窘迫症候群。SARS-CoV-2被稱為嚴重急性呼吸系統症候群冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2)，是指在中國武漢首次發現並導致2019 年冠狀病毒傳染病(COVID-19)的冠狀病毒株。
SARS-CoV-2 中和逃逸變體、高傳染性、無症狀者傳播以及由於目前已獲批准疫苗的免疫力下降導致的突破性感染，繼續造成人類生命損失，並削弱世界經濟和醫療保健系統。
SARS-CoV-2 Omicron譜系已經席捲全球，從最初的武漢株，具有快速連續優勢亞變體，從BA.1、BA.2，再到現在的BA.4/BA.5，其佔SARS感染病例的90%以上，在傳播性和中和抗體逃逸方面具有壓倒性的優勢。隨附發明人小組(Wang, CY et al  2022a and b)的最新出版物以及連同包含於此的文獻引用，以便於背景參考。
雖然追加第三劑的mRNA SARS疫苗可以補償Omicron（BA.1）引起的血清中和抗體的減少（減少20-30倍），當與原始武漢毒株相比，以及住院率和嚴重疾病（80-90%的保護），它對輕度與無症狀感染的保護效果較差（40-50%的保護）。即使在第四次接種後（對18歲及以上的成年人進行第二次追加），以高病毒載量確定的突破性感染也很常見。
目前的疫苗是依據原始病毒抗原製造，可解釋抗原變體（如 Beta、Delta 或 Omicron）快速感染的病例，並且對中和抗體更有抗性。感染 SARS-CoV-2 關切變體(VoC)(https://en.wikipedia.org/wiki/Variants_of_ SARS-CoV-2)的個體在其鼻腔通道中攜帶的病毒數量是其他變體的數倍。在這些 VoCs 中，Omicron 變體（https://en.wikipedia.org/wiki/SARS-CoV-2_Omicron_ varianthas）與原始武漢株相比共有60個突變，其中32個突變影響刺突蛋白，其具有許多疫苗廣泛使用的主要抗原靶點。
Omicron BA.1與SARS-CoV-2武漢原株相比有嚴重的突變，包括S蛋白中超過35個胺基酸的變化。與S-1受體結合域（S1-RBD，殘基319-541）的2個突變有關，BA.1和BA.2共用12個突變，BA.1與BA.2分別有額外的3個和4個獨特的突變，這使BA.2具有更高的免疫逃避能力。BA.4與BA.5具有相同的棘蛋白。它們與BA.2不同的是，在棘蛋白內的69-70del、L452R、F486V和Q493位的野生型胺基酸有額外的突變，從而使它們比BA.2具有更高的免疫逃避能力。BA.2表現出比BA.1高1.3-1.5倍的傳播性和1.3倍的免疫逃避，此與BA.1免疫血清以1.3至1.4之係數以低力價中和BA.2的發現一致，而且BA.2在BA.1之後可以發生再感染。BA.4/BA.5的傳播性更強，對BA.1/BA.2的免疫和單株抗体具有抗性。
在雙重接種的成年人中，針對BA.4/BA.5的加強劑（第三劑）誘導的中和力價明顯低於針對BA.1/BA.2的力價。這些都表明，加強型疫苗接種或BA.1/BA.2感染可能無法達到足夠的免疫力來保護人們免受BA.4/BA.5的侵害，而再次感染則很常見。
因此仍迫切需要開發疫苗，以防止未感染者感染包括 Beta、Delta 和 Omicron 在內的 SARS-CoV-2 VoC，以控制疫情並減少由此帶來的痛苦，包括死亡。此外，強烈需要開新發成分的（變體特異性）疫苗。極需要開發疫苗組合物，以防止個人感染 SARS-CoV-2 Omicron，以控制疫情並減少由此產生的痛苦，包括遠程新冠肺炎（long-haul COVID）和死亡。
本發明涉及用於避免感染與治療SARS（COVID）患者之針對SARS-CoV-2變體的疫苗組成物。更具體地而言，該疫苗組成物採用在CHO細胞中生產的融合蛋白作為B細胞免疫原，該融合蛋白在N端包含一個S-RBDVoC，與人IgG的改良鉸鏈區與Fc片段（CH2與CH3區域）共價連接（第1圖）。疫苗成分中併入了混雜位點定向的SARS-CoV2 Th/CTL抗原決定位胜肽，可向被接種者提供最佳的T細胞免疫力。綜上所述，所揭露的疫苗組成物利用SARS-CoV-2蛋白的胺基酸序列來設計與製造SARS-CoV-2 M、N與S2蛋白衍生的抗原性Th/CTL抗原決定位胜肽（例如，序列識別號：2-5、7-12、14-35），CHO衍生的S1-RBDVoC-sFc融合蛋白（例如，序列識別號：49-53）及其配方，作為預防與治療因SARS-CoV2 VoC所引起的COVID的疫苗。
本發明涉及具有針對Omicron BA.4/BA.5的特異性SARS-CoV-2關切變體（VoC），例如Alpha, Beta, Gamma, Delta and Omicron的疫苗組合物，以預防感染和治療那些患有SARS（即COVID）的患者。更具體地，疫苗組合物使用在 CHO 細胞中產生的融合蛋白作為其 B 細胞免疫原，該融合蛋白在 N 端包含 S1-RBDVoC蛋白，該蛋白與人類 IgG之鉸鏈區和 Fc 片段 (CH2與CH3區）共價連接。疫苗製劑中加入多點位 SARS-CoV2 Th/CTL抗原決定位胜肽，以提供最佳的 T 細胞免疫。總而言之，所揭露的疫苗系統利用胺基酸序列來設計與製造SARS-CoV2 M、N與S2-蛋白衍生的Th/CTL抗原決定位胜肽（序列識別號：2-5、7-12、14-35），這些抗原決定位源自於SARS-CoV-2 VoCs的SARS-CoV-2蛋白，包括SARS-CoV-2 Omicron BA.4/BA.5，以及源自CHO之S1-RBDVoC-sFc融合蛋白(序列識別號： 49-53)，包括S1-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc融合蛋白(序列識別號： 53)，及其製劑以作為針對由SARS-CoV-2 VoCs，包括SARS-CoV-2 Omicron BA.4/BA.5.引起的 SARS（即 COVID）疫苗。
以下更詳細地討論所公開的發明的各個方面。
一般
本文使用的章節標題僅用於組織目的，不應解釋為限制所描述的主題。 本申請中引用的所有參考文獻或參考文獻的一部分出於任何目的明確地通過引用整體併入本文。
除非另有說明，本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同。除非上下文另有明確說明，否則單數術語“一(a)”、“一(an)”與“該”包括複數指稱。類似地，除非上下文另有明確說明，否則“或”一詞旨在包括“與”。因此，短語“包含A或B”是指包括A或B，或A和B。 還應理解，針對多胜肽給出的所有胺基酸大小與所有分子量或分子量值都是近似值，並且提供描述。儘管與本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可以用於所公開方法的實踐或測試，但下面描述了合適的方法與材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻通過引用整體併入。若有衝突，以本說明書（包括術語解釋）為準。此外，於此揭露之材料、方法和示例僅是說明性的，而不是限制性的。
SARS-CoV-2被稱為嚴重急性呼吸系統症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2），是指在中國武漢首次發現的引起2019年冠狀病毒病（COVID-19）的冠狀病毒毒株。
SARS是嚴重急性呼吸系統症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome)的縮寫，也被稱為COVID，是冠狀病毒感染疾病(Corona Virus Infectious Disease)的縮寫。該病最初可能沒有什麼症狀，也可能發展為發燒、咳嗽、呼吸急促、肌肉疼痛和疲倦。併發症可能包括肺炎與急性呼吸窘迫症候群。SARS-CoV-2被稱為嚴重急性呼吸系統症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2），是指在中國武漢首次發現的引起2019年冠狀病毒病（COVID-19）的冠狀病毒毒株。
用於預防 SARS-COV-2 VARIANTS 變體 (VOCs) 包括 SARS-COV-2 OMICRON VARIANTS BA.4/BA.5 感染的蛋白質 / 胜肽疫苗組成合物
所揭露的疫苗組成物關於預防SARS-CoV-2 VoCs，包括SARS-CoV-2 Omicron Variants BA.4/BA.5感染的蛋白質/胜肽疫苗組合物。
1. 基於 S1 受體結合區域的設計蛋白
目前在臨床試驗中的大多數疫苗只針對全長的S蛋白來誘導中和抗體反應。與自然SARS-CoV-2感染產生的反應相比，誘導的T細胞反應將是有限的。S1-RBD區域是SARS-CoV-2的一個關鍵組成部分。它是細胞附著所必需的，並且代表了2003年描述的高度相似的SARS-CoV病毒的主要中和域，通過消除潛在的副作用，如抗體依賴性增強 (antibody dependent enhancing, ADE)效應，提供全長S抗原無法實現的安全係數，當疫苗產生的抗體實際上幫助病毒感染的細胞數量比它自己感染的細胞數量多時。在這種情況下，抗體與病毒結合併幫助它比單獨的病毒更容易進入細胞，從而導致比未接種疫苗的人更嚴重的疾病。
由於使用較短受體結合域 (S1-RBD) 聚焦之B細胞疫苗成分的明顯優勢，蛋白質/胜肽疫苗組成物包括基於 S1-受體結合區的設計蛋白，也稱為S1- RBD -sFc融合蛋白，具有特定的 Omicron專一性，例如 BA.4/BA.5。如上所述，S1-RBD-sFc是由SARS-CoV-2的S1-RBD 與人IgG 的單鏈片段結晶區(sFc) 融合而成的重組蛋白。此外，工程化的Fc已被用作許多治療性抗體的解決方案，以最大限度地減少非專一性結合、增加溶解度、產量、熱穩定性與體內半衰期。
在一些實施例中，疫苗組合物含有序列識別號：49或53的S1-RBD-sFc融合蛋白。這些S1-RBD-sFc蛋白各自包含各自的S1-RBD蛋白（序列識別號：40或44），其對應於SARS-CoV-2全長S蛋白的331-530個胺基酸殘基，經由來自IgG（序列識別號：46或48）的突變鉸鏈區與單鏈Fc胜肽（序列識別號：38-39）融合。
在一些實施例中，序列識別號：10或11及 第 3 至 6 圖的S1-RBD序列的第61與195位半胱胺酸C）殘基被突變為丙胺酸（A）殘基，（S-RBD的61與195殘基對應於原武漢株序列識別號：13的全長S蛋白的391與525殘基）。在S1-RBD序列中引入C61A與C195A突變是為了避免在重組蛋白表達中形成雙硫鍵的錯配。融合至單鏈Fc肽（S-RBDVoCs-sFc）之代表武漢、Beta、Omicron (e.g. Omicron BA.4/BA.5)、Delta株的S1-RBDVoCs的胺基酸序列為序列識別號：49-53，其中S-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc為序列識別號：53。
疫苗組成物中基於S1受體結合區的設計蛋白的數量可以根據需要或應用而變化。疫苗組成物可包含約1 µg至約1000 µg的基於S1受體結合區的設計蛋白。在一些實施例中，疫苗組成物含有約10 µg至約200 µg基於S1受體結合區的設計蛋白。
2. Th/CTL 胜肽
僅針對S蛋白的中和反應不太可能提供針對 SARS-CoV-2及其帶有突變B細胞抗原決定位的新興變體的持久保護。持久的細胞反應可以增強最初的中和反應（經由記憶 B 細胞激活），並在抗體力價減弱時提供更長的免疫持續時間。最近的研究表明，在 2-3 個月內，＞90%的 SARS-CoV-2 感染者對S的IgG反應迅速下降(Long, Q.X., et al., 2020)。相比之下，在2003年SARS爆發後，針對SARS的記憶T細胞已被證明可以持續11-17年(Ng, O.W., et al., 2016; and Le Bert, N., et al., 2020)。S蛋白是引發體液免疫的關鍵抗原，主要包含CD4+抗原決定位(Braun, J., et al., 2020)。需要其他抗原來提高/增強細胞免疫反應以清除 SARS-CoV-2感染。絕大多數報導的SARS-CoV-2蛋白中的 CD8+ T細胞抗原決定位位於ORF1ab、N、M與ORF3a區域；只有3個位於S 中，只有1個CD8+抗原決定位位於S1-RBD中(Ferretti, A.P., et al., 2020)。較小的M與N結構蛋白被成功控制感染的患者的T細胞識別。在對英國近3000人進行的一項研究中發現，與T細胞反應較低的人相比，T細胞數量較多的人對SARS-CoV-2的保護能力更強，這表明T細胞免疫可能發揮關鍵作用在避免COVID-19方面(Wyllie, D., et al., 2020)。
為了提供引發T細胞反應的免疫原，鑑定了來自SARS-CoV與SARS-CoV-2的S、N與M蛋白的高度保守序列的Th/CTL抗原決定位。這些Th/CTL胜肽顯示在 表 1 、 3 與 8-10中。每個選定的胜肽都包含Th或CTL抗原決定位，並預先驗證了MHC I或II結合，並表現出良好的可製造性特徵（適合高品質合成的最佳長度）。它們還應該最好地展示刺激普通個體的PBMC的內在能力。這些Th/CTL胜肽經過廣泛的篩選、鑑定、驗證與設計，通過在每個胜肽的N端添加Lys-Lys-Lys尾進行進一步修飾，以提高胜肽的溶解度並豐富用於疫苗製劑的正電荷。五種最終胜肽的設計與序列及其各自的HLA等位基因(alleles)如 表 8所示。
為了增強免疫反應，可以將專屬胜肽UBITh®1a（序列識別號：36）作為催化劑添加到疫苗組成物的胜肽混合物中。UBITh®1a是一種專有的合成胜肽，具有源自麻疹病毒融合蛋白(MVF)的原始框架序列。該序列被進一步修飾以在序列內顯示回文圖譜(palindromic profile)，以允許在該19個胺基酸的短胜肽內容納多個MHC II類結合基序(motif)。Lys-Lys-Lys序列也被添加到這種人工Th胜肽的N末端，以增加其正電荷，從而促進胜肽隨後與高度帶負電荷的CpG寡核苷酸分子結合，通過“電荷中和”形成免疫刺激複合物。在先前的研究中，UBITh®1a與源自自身蛋白的目標“功能性B抗原決定位胜肽”的連接使自身胜肽具有免疫原性，從而破壞了免疫耐受性(Wang,C.Y.,etal,2017)。UBITh®1的Th抗原決定位顯示出這種刺激活性，無論是與目標胜肽共價連接還是作為游離帶電胜肽，與其他設計的目標胜肽一起給藥，這些胜肽通過與CpG1的“電荷中和”效應結合在一起，以引發位點定向的(site-directed)B或CTL反應。已顯示此類免疫刺激複合物可增強伴隨靶免疫原的弱或中等反應（例如，WO2020/132275A1）。
CpG1被設計以藉由“電荷中和”將合理設計的免疫原聚集在一起，以允許在接種疫苗的宿主中產生平衡的B細胞（中和抗體的誘導）與Th/CTL反應。此外，已知CpG激活TLR-9訊號可促進IgA的產生並有利於Th1免疫反應。UBITh®1胜肽因其“抗原決定位簇(cluster)”性質而作為Th胜肽之一被納入，以進一步增強SARS-CoV-2衍生的Th與CTL抗原決定位胜肽的抗病毒活性。UBITh®1的胺基酸序列是序列識別號：36。CpG1的核酸序列是序列識別號：67。
鑑於上述，蛋白質/胜肽疫苗組合物可以包含一種或多種Th/CTL胜肽。Th/CTL胜肽可以包括： a.源自SARS-CoV-2M蛋白的胜肽（例如，序列識別號：2-5）； b.源自SARS-CoV-2N蛋白的胜肽（例如，序列識別號：7-12）； c.源自SARS-Cov-2S蛋白的胜肽（例如，序列識別號：14-35）；及/或 d. 源自病原體蛋白的人工Th抗原決定位（例如，序列識別號：36）。
疫苗組成物可以含有一種或多種Th/CTL胜肽。在某些實施例中，疫苗組成物包含多於一種Th/CTL胜肽的混合物。當存在於混合物中時，與其他一種或多種胜肽相比，每種Th/CTL胜肽可以以任何量或比率存在。例如，Th/CTL胜肽可以等莫耳量、等重量量混合，或者混合物中每種胜肽的量可以不同於混合物中其他胜肽的量。若混合物中存在多於兩種Th/CTL胜肽，則胜肽的量可以與混合物中的任何其他胜肽相同或不同。
存在於疫苗組成物中的Th/CTL胜肽的量可以根據需要或應用而變化。疫苗組成物可含有總量在約0.1 μg至約100 μg之間的Th/CTL胜肽。在一些實施例中，疫苗組成物含有總計約1 μg至約50 μg的Th/CTL胜肽。
在某些實施例中，疫苗組成物包含序列識別號：22、27、9、34、2、35、23、36或其任意組合。這些Th/CTL胜肽可以等莫耳量、等重量量混合，或者混合物中每種胜肽的量可以不同於混合物中其他胜肽的量。在某些實施例中，這些Th/CTL胜肽以等重量的量混合在疫苗組成物中。
醫藥/疫苗製劑中Th與CTL抗原決定位的存在經由啟動抗原特異性T細胞激活來引發治療對象的免疫反應，這與保護免受SARS-CoV-2感染有關。此外，包含精心挑選的SARS-CoV-2蛋白上的內源性Th抗原決定位及/或CTL抗原決定位的製劑可以產生廣泛的細胞介導免疫，這也使得這些製劑可以有效地治療和保護具有不同基因組成的受試者。
在醫藥組成物中包含一種或多種內源性SARS-CoV-2Th/CTL抗原決定位胜肽，S-RBDVoC-sFc蛋白，包括S1-RBDOmicronBA.4/BA.5-sFc蛋白使胜肽彼此緊密接觸，從而使抗原決定位由抗原呈現B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等看見與加工。這些細胞處理抗原並將它們呈現到表面以與B細胞接觸以產生抗體，而T細胞則觸發進一步的T細胞反應以幫助介導殺死病毒感染的細胞。內源性SARS-CoV-2CTL抗原決定位胜肽在N端含有Lys-Lys-Lys(KKK)尾巴。
序列識別號：2、9、22/23、27、34、35、36的內源性SARS-CoVTh/CTL抗原決定位胜肽在用於與CpG寡核苷酸(ODN)配製成免疫刺激複合物的醫藥組成物中時特別有用，因為陽離子KKK尾能夠通過靜電締合與CpGODN相互作用。在胜肽免疫原構建體中使用內源性SARS-CoV-2Th抗原決定位可以增強S-RBD VoC-sFc蛋白細胞抗原決定位胜肽S1-RBDOmicronBA.4/BA.5 B細胞抗原決定位胜肽的免疫原性，從而在感染後促進特異性高力價抗體的產生，針對基於設計原理篩選與選擇的最佳化的S1-RBD B細胞抗原決定位胜肽。
在一些實施例中，醫藥組成物包含一種或多種S1-RBDOmicronBA.4/BA.5sFc融合蛋白（序列識別號：49、53或其任何組合）以及一種或多種含有內源性SARS-CoV-2Th/CTL抗原決定位胜肽（序列識別號：2、9、22、23、27、34、35及36，或其任何組合）。
3. 賦形劑
疫苗組成物也可含有藥學上可接受的賦形劑。
如本文所用，術語“賦形劑”或“賦形劑”是指疫苗組成物中不是(a)基於S1-受體結合區的設計蛋白或(b)Th/CTL胜肽的任何組分。賦形劑的實例包括載體、佐劑、抗氧化劑、粘合劑、緩沖劑、填充劑、螯合劑、著色劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、表面活性劑、溶劑、填充劑、膠凝劑、pH緩衝劑、防腐劑、增溶劑、穩定劑等。 因此，疫苗組成物可以包含藥學。因此，疫苗組合物包含藥學有效量的活性藥物成分(API)，例如基於S1受體結合區的設計蛋白及/或一種或多種Th/CTL胜肽，以及藥學上可接受的賦形劑。
疫苗組成物可以含有一種或多種佐劑，其作用是加速、延長或增強對API的免疫反應，而本身不具有任何特異性抗原作用。佐劑可以包括油、油乳劑、鋁鹽、鈣鹽、免疫刺激複合物、細菌和病毒衍生物、病毒體、碳水化合物、細胞因子、聚合物微粒。在某些實施方案中，佐劑可以選自CpG寡核苷酸、明礬(例如磷酸鋁鉀)、磷酸鋁（例如ADJU-PHOS®）、氫氧化鋁（例如ALHYDROGEL®）、磷酸鈣、不完全弗氏佐劑(IFA)、弗氏完全佐劑、MF59、佐劑 65、Lipovant、ISCOM、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、EMULSIGEN®、EmulsIL-6n®、單磷酰脂質 A (MPL)、Quil A、QS21、MONTANIDE® ISA 35、ISA 50V、ISA 50V2、ISA 51、ISA 206、ISA 720、脂質體、磷脂、肽聚醣, 脂多醣 (LPS) 、ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、AF03、親脂性磷脂（脂質 A）、γ 菊粉、algammulin、葡聚醣、葡聚醣、葡甘露聚醣、半乳甘露聚醣、果聚醣(levans)、木聚醣(xylans)、二甲基雙十八烷基溴化銨 (dimethyldioctadecylammonium bromide, DDA)，以及其他助劑與乳化劑。
在一些實施例中，疫苗組成物包含 ADJU-PHOS® （磷酸鋁）、MONTANIDE™ ISA 51（一種油佐劑組合物，由植物油和甘露醇油酸酯組成，用於生產油包水乳劑）、TWEEN® 80 （也已知為：聚山梨醇酯 80( Polysorbate 80)或聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯(Polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate))、CpG 寡核苷酸及/或其任何組合。在其他實施例中，醫藥組成物是水包油包水（即w/o/w）乳液，其中EMULSIGEN或EMULSIGEN D作為佐劑。
在某些實施例中，多抗原決定位蛋白質/胜肽疫苗組成物含有ADJU-PHOS®（磷酸鋁）作為佐劑以改善免疫反應。磷酸鋁通過核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)樣受體蛋白3(NLRP3)炎性體途徑作為Th2導向佐劑。此外，它具有促吞噬和儲存效應，具有長期的安全記錄，並且能夠改善許多疫苗製劑中對靶蛋白的免疫反應。
疫苗組合物可以含有pH調節劑及/或緩衝劑，例如鹽酸、磷酸、檸檬酸、乙酸、組胺酸、組胺酸HCl•H 2O、乳酸、氨丁三醇、葡萄糖酸、天冬胺酸、麩胺酸、酒石酸 、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、α-酮戊二酸與精胺酸HCl。
疫苗組成物可以含有表面活性劑與乳化劑，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯（Polysorbate，TWEEN®）、聚氧乙烯15羥基硬脂酸酯（Macrogol 15 hydroxy stearate，SOLUTOL HS15®）、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(Polyoxyethylene castor oil derivatives)（CREMOPHOR® EL、ELP、RH 40)、聚氧乙烯硬脂酸酯(Polyoxyethylene stearates)(MYRJ®)、山梨糖醇酐脂肪酸酯(Sorbitan fatty acid esters) (SPAN®)、聚氧乙烯烷基醚(Polyoxyethylene alkyl ethers) (BRIJ®)與聚氧乙烯壬基酚醚(Polyoxyethylene nonylphenol ether) (NONOXYNOL®)。
疫苗組成物可以包含載體、溶劑或滲透壓保持劑，例如水、醇與食鹽溶液(saline solutions)（例如，氯化鈉）。
疫苗組成物可以包含防腐劑，例如烷基/芳基醇（例如苯甲醇、三氯丁醇、2-乙氧基乙醇）、胺基芳基酸酯(amino aryl acid esters)（例如甲基、乙基、丙基丁基對羥基苯甲酸酯與組合）、烷基/芳基酸（例如 、苯甲酸、山梨酸）、雙胍類（如洗必泰(chlorhexidine)）、芳香醚（如苯酚、3-甲酚、2-苯氧乙醇）、有機汞（如硫柳汞(thimerosal)、苯汞酸鹽(phenylmercurate salts)）。
4. 配方
疫苗組成物可配製成速釋或緩釋製劑。此外，可以配製疫苗組成物以通過免疫原包埋和與微粒共同施用來誘導全身或局部粘膜免疫。這樣的遞送系統很容易由該技術領域中具有通常知識者確定。可以將疫苗組成物製備成可注射的，或者作為液體溶液或懸浮液。 也可以在注射前製備含有疫苗組成物的液體載體。 疫苗組合物可以通過任何合適的應用方式，例如，i.d.、i.p.、i.m.、鼻內、口服、皮下等以及在任何合適的遞送裝置中施用。 在某些實施例中，疫苗組成物被配製用於皮下、皮內或肌肉內施用。疫苗組成物也可以製備用於其他給藥方式，包括口服與鼻內應用。
疫苗組成物也可以配製成合適的劑量單位形式。在一些實施例中，疫苗組合物含有約1 μg至約1,000 μg的API（例如，基於S1受體結合區的設計蛋白及/或一種或多種Th/CTL胜肽）。疫苗組成物的有效劑量可以根據許多不同的因素而變化，包括施用方式、目標位點、受試者的生理狀態、受試者是人還是動物、施用的其他藥物以及治療是預防性的還是治療性的。 通常，受試者是人類，但也可以治療非人類哺乳動物。當以多劑量遞送時，疫苗組合物可以方便地分成合適的量/劑量單位形式。給藥劑量將取決於受試者的年齡、體重和一般健康狀況，這在治療領域是眾所周知的。
在一些實施例中，疫苗組成物在具有添加劑及/或賦形劑的製劑中包含基於S1受體結合區的設計蛋白和一種或多種Th/CTL胜肽。 在某些實施例中，疫苗組成物在具有添加劑及/或賦形劑的製劑中包含基於S1受體結合區的設計蛋白和多於一種Th/CTL胜肽。含有多於一種Th/CTL胜肽混合物的疫苗組合物可以協同增強組合物的免疫功效。含有基於S1受體結合區的設計蛋白和一種以上的Th/CTL胜肽的疫苗組合物在帶有添加劑及/或賦形劑的配方中與只含有設計蛋白或一種Th/CTL胜肽的組成物相比，由於有廣泛的MHC II類覆蓋，在更大的遺傳群體中可以更加有效，從而為疫苗組成物提供更好的免疫反應。
當疫苗組成物包含基於S1受體結合區的設計蛋白和一種或多種Th/CTL胜肽作為API 時，設計蛋白與Th/CTL胜肽的相對量可以以任何量或比例存在於彼此。例如，設計蛋白與Th/CTL胜肽可以等莫耳量、等重量混合，或者設計蛋白與Th/CTL胜肽的量可以不同。此外，若組成物中存在多於一種Th/CTL胜肽，則設計蛋白與每種Th/CTL胜肽的量可以彼此相同或不同。在一些實施例中，設計蛋白的莫耳量或重量量以大於Th/CTL胜肽的量存在於組合物中。在其他實施例中，設計蛋白的莫耳量或重量量以小於Th/CTL胜肽的量存在於組成物中。設計蛋白與Th/CTL胜肽的比率（重量：重量）可以根據需要或應用而變化。在一些情況下，設計蛋白與Th/CTL胜肽的比例(w:w)可以是70:30、80:20或90:10。在具體實施例中，設計胜肽與Th/CTL胜肽的比例(w:w)為90:10、88:12或85:15等。在具體實施例中，設計蛋白與Th/CTL胜肽的比例(w:w)是88:12。
在一些實施例中，疫苗組合物包含一種或多種序列識別號：49、51基於S1受體結合區的設計蛋白合併序列識別號： 2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽。在其他實施方案中，疫苗組合物包含一種或多種Th/CTL胜肽。在一些實施方案中，疫苗組合物包含來自序列識別號：49、51之一的基於S1受體結合區的設計蛋白與序列識別號：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽組合，以及一種或多種更多的佐劑及/或賦形劑。在各種實施例中，疫苗組合物包括序列識別號：49、51的一種或多種基於S1受體結合區的設計蛋白與序列識別號：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽，其中Th/CTL胜肽以彼此等重的比例存在，序列識別號：49、51的一種或多種基於S1受體結合區的設計蛋白與Th/CTL胜肽的組合重量的比例（w：w）為88：12。 表 15-17分別提供了含有20μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL與200 μg/mL的疫苗組成物的具體實施方案，其依據是S1-RBD VoC-sFc蛋白（序列識別號：49或51）與序列識別號：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽之一的總重量。 表 18分別提供了含有20μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL與200 μg/mL的疫苗組成物的具體實施方案，其依據是S1-RBD-sFc（武漢）蛋白（序列識別號：49）及S1-RBD Omicron B.1.1.529（序列識別號： 51）與序列識別號：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽之一的總重量。在其它實施例中，疫苗組合物包含一種或多種Th/CTL胜肽。在某些實施例中，疫苗組合物包含基於序列識別號：53之S1受體結合區的設計蛋白合併序列識別號：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽。在特定實施中，疫苗組合物包含基於序列識別號：53之S1受體結合區的設計蛋白，序列識別號：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽，以及一或多個佐劑及/或賦形劑。在各種實施例中，疫苗組合物包含一或多個序列識別號：53之S1受體結合區的設計蛋白以及序列識別號：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽，其中Th/CTL胜肽彼此為相同的重量比，且序列識別號： 53的一或多種基於S1受體結合區的設計蛋白與序列識別號： 2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽組合重量比(w:w)為 88:12。 表 15提供了含有20μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL與200 μg/mL的疫苗組成物的具體實施方案，其依據是S1-RBD-sFc（武漢）蛋白（序列識別號：49）與序列識別號：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽之一的總重量。 表 19提供了含有20μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL與200 μg/mL的疫苗組成物的具體實施方案，其依據是S1-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc蛋白（序列識別號：53）與序列識別號：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽之一的總重量。 表 20提供了含有20μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL與200 μg/mL的疫苗組成物的具體實施方案，其依據是S1-RBD-sFc（武漢）蛋白（序列識別號：49）及S1-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc蛋白（序列識別號：53）與序列識別號：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL胜肽之一的總重量。
5. 方法
本發明也關於製備與使用疫苗組成物及其配方的方法。
a. 基於 S1 受體結合區域的設計蛋白與 Th/CTL 胜肽的製造方法
所揭露之基於S1-受體結合區的設計蛋白可以根據根據實施例2與3所述的方法製造。此外，所揭露之Th/CTL胜肽可以根據實施例1中描述的方法製造。
b. 製造疫苗組成物的方法
所揭露的疫苗組成物可以根據實施例5與6中描述的方法製備它們的複合程序。
c. 使用疫苗組成物之方法
在預防性應用中，所揭露的蛋白質/胜肽疫苗組合物可施用於易感染或有風險感染SARS-CoV-2及其相關變體的受試者，導致COVID的病毒消除或降低風險、減輕嚴重程度，或延緩疾病的發作。
足以完成預防性治療的疫苗組合物的量被定義為預防有效劑量。可以將所揭露的蛋白質/胜肽疫苗組合物以一劑或多劑施用於受試者以產生足夠的免疫反應，從而預防SARS-CoV-2感染。 通常，會監測免疫反應，若免疫反應開始減弱，則會重複給藥。
疫苗組合物可配製成速釋或緩釋製劑。此外，可以配製疫苗組合物以通過免疫原包埋和與微粒共同施用來誘導全身或局部粘膜免疫。這樣的遞送系統很容易由該技術領域中具有通常知識者確定。可以將疫苗組合物製備成可注射的，或者作為液體溶液或懸浮液。也可以在注射前製備含有疫苗組合物的液體載體。疫苗組合物可以通過任何合適的應用方式，例如，i.d.、i.p.、i.m.、鼻內、口服、皮下等以及在任何合適的遞送裝置中施用。 在某些實施例中，疫苗組成物被配製用於皮下、皮內或肌肉內施用。疫苗組成物也可以製備用於其他給藥方式，包括口服和鼻內應用。
疫苗組合物的劑量將根據受試者和特定的給藥方式而變化。所需劑量將根據該技術領域中具有通常知識者已知的許多因素而變化，包括但不限於對象的種類與大小。劑量範圍可為設計蛋白和 Th/CTL 肽的總重量的1 μg至1,000 μg。設計蛋白與Th/CTL胜肽的比例（重量：重量）可以根據需要或應用而變化。在一些情況下，設計蛋白與Th/CTL胜肽的比例 (w:w) 可以是 70:30、80:20 或 90:10。在具體實施例中，設計蛋白與Th/CTL胜肽的比例(w:w)為95:5、90:10、88:12或85:15等。在具體實施例中，設計蛋白與Th/CTL胜肽的比例(w:w)為88:12。在具體實施例中，疫苗組成物包含表15-20中所示的組分。
疫苗組合物可以在一段時間內以單劑量或多劑量的方式施用。疫苗組成物可以按照特定的劑量表給藥。有效劑量可以從動物模型獲得的劑量反應曲線中推算出來。在一些實施例中，疫苗組成物以單次給藥方式提供給受試者。在其他實施例中，疫苗組合物以多次給藥（兩次或多次）提供給受試者。當以多次給藥方式提供時，兩次給藥之間的持續時間可以根據應用或需要而變化。在一些實施例中，向受試者提供第一劑的疫苗組合物，並在第一劑後約1週至約12週提供第二劑。在某些實施例中，第二劑在第一次給藥後約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約11週或約12週給藥。在一個具體的實施例中，第二劑是在第一次給藥後約4週給藥。
可以在初始疫苗接種方案後向受試者施用追加劑的疫苗組成物以增加對SARS-CoV-2的免疫力。在一些實施例中，在初始疫苗接種方案後約6個月至約10年將疫苗組成物的追加劑施用於受試者。在某些實施例中，疫苗組成物的追加劑在初始疫苗接種方案後或最後一次追加劑後約3個月、約6個月、約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年或約10年給藥。
本發明之特定實施例，包括但不限於以下實施例1. 一種融合蛋白，包括一IgG分子之一Fc片段與一生物活性分子，其中該Fc片段為一單鏈Fc(single chain Fc, sFc)，其中該Fc片段包括一鉸鏈區(hinge region)，其中該鉸鏈區為經突變的且不形成雙硫鍵，其中該鉸鏈區包括擇自由序列識別號：38至39所組成之群組的一胺基酸序列，其中該生物活性分子為來自序列識別號：40的SARS-CoV2 S蛋白受體結合區域(receptor binding domain, RBD)(S-RBD)或序列識別號：41-44的S-RBD變體。 2. 如(1)的融合蛋白，其中該鉸鏈區包括序列識別號：39的胺基酸序列。 3. 如(1)的融合蛋白，其中該融合蛋白係擇自由序列識別號：49-53所組成之群組。 4. 一種醫藥組成物，包括如請求項1之融合蛋白與一藥學上可接受之載體或賦形劑。 5. 一種產生如(1)的融合蛋白的方法，包括： a) 提供一生物活性分子，其中該生物活性分子為來自SARS-CoV2武漢之S蛋白(S-RBD)的一受體結合區域(RBD)（序列識別號：1）或其關切變體(VoC)之一，其中該S蛋白(S-RBD)之該受體結合區域(RBD)係擇自於序列識別號：40-44所組成之群組， b) 提供一IgG分子之一Fc片段，其中該Fc片段包括一鉸鏈區，其中該鉸鏈區藉由一半胱胺酸殘基的取代及/或缺失而突變以形成一經突變的Fc，且該經突變的Fc不形成雙硫鍵，其中該鉸鏈區包括擇自由序列識別號：38-39所組成之群組的一胺基酸序列，以及 c) 經由該鉸鏈區結合該生物活性分子與該經突變的Fc。 6. 一種融合蛋白，係擇自由序列識別號：49-53之S1-RBDVoC-sFc所組成之群組。 7. 一種組成物，包括如請求項6之融合蛋白。 8. 如請求項7之組成物，更包括一Th/CTL胜肽，其中該Th/CTL胜肽係衍生自SARS-CoV-2 M、N或S蛋白、一病原體蛋白，或其任意之組合，其中該Th/CTL胜肽係擇自由序列識別號：2-5、7-12、14-35、36與其任意之組合所組成之群組。 9. 如(8)的組成物，其中該Th/CTL胜肽係擇自由序列識別號：2-5、7-12、14-35、36與其任意之組合所組成之群組。 10. 一種COVID疫苗組成物，包括： a). 一S-RBDVoC-sFc變體蛋白，係擇自序列識別號：49-53之群組； b). 一Th/CTL胜肽，係擇自由序列識別號：2-5、7-12、14-36與其任意之組合所組成之群組； c). 一藥學上可接受之賦形劑，其中該藥學上可接受之賦形劑為一佐劑、緩衝劑、界面活性劑、乳化劑、pH調整劑、食鹽水溶液、防腐劑、溶劑，或其任意之組合。 11. 如(10)的COVID疫苗組成物，其中於(b)中之該Th/CTL胜肽係擇自由序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36與其任意之組合所組成之群組。 12. 如(11)的COVID疫苗組成物，其中該藥學上可接受之賦形劑為一CpG1寡核苷酸、ALUM（磷酸鋁或氫氧化鋁）、組胺酸、組胺酸HCl•H 2O、精胺酸HCl、TWEEN 80（聚氧乙烯(20)-山梨醇酐單油酸酯(polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate)）、鹽酸、氯化鈉與在水中之2-苯氧乙醇(2-phenoxyethanol)的一組合。 13. 如(12)的COVID疫苗組成物，其中該藥學上可接受之賦形劑為CpG1（序列識別號：67）。 14. 一種預防COVID的方法，包括投予一藥學上有效量之如(10)之疫苗組成物至一個體。 15. 一種預防COVID的方法，包括投予一藥學上有效量之如(11)之疫苗組成物至一個體。 16. 一種產生針對SARS-CoV-2之抗體的方法，包括投予一藥學上有效量之如(10)之疫苗組成物至一個體。 17. 一種產生針對SARS-CoV-2之抗體的方法，包括投予一藥學上有效量之如 (11)之疫苗組成物至一個體。 18. 一種COVID疫苗組成物，包括於表15-20之任何一所示之量的成分。 19. 一種細胞株，係以編碼如(6)之融合蛋白的一cDNA序列轉染。 20. 如(19)之細胞株，其為一中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)細胞株。 21. 如(19)之細胞株，其中該cDNA序列係擇自由序列識別號：60-64所組成之群組。 22. 一種廣譜COVIDT疫苗組合物，包括: a). Th/CTL胜肽，其中Th/CTL胜肽衍生自SARS-CoV-2 M、N或S蛋白、病原體蛋白或其任意組合，其中Th/CTL胜肽選自於 序列識別號：2-5、7-12、14-36 及其任意組合所組成之群組； b). 藥學上可接受的賦形劑，其中藥學上可接受的賦形劑包括佐劑、緩沖劑、pH調節劑、鹽水溶液、防腐劑、溶劑或上述任意組合。 23. 如(22)之廣譜COVIDT疫苗組合物，其中Th/CTL胜肽選自於序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36、3、4、7、8、25、26及其其任意組合之群組。 24. 如(23)之廣譜COVIDT疫苗組合物，其中藥學上可接受的賦形劑是CpG1寡核苷酸、ALUM(磷酸鋁或氫氧化鋁)、鹽酸、氯化鈉和2-苯氧乙醇在水中的組合。 25.一種廣譜COVIDT疫苗組合物以表21至24所示之量組成。 26. 一種融合蛋白，包括一IgG分子之一Fc片段與一生物活性分子，其中該Fc片段為一單鏈Fc(single chain Fc, sFc)，其中該Fc片段包括一鉸鏈區(hinge region)，其中該鉸鏈區為經突變的且不形成雙硫鍵，其中該鉸鏈區包括擇自由序列識別號：38至39所組成之群組的一胺基酸序列，其中該生物活性分子為來自序列識別號：40的SARS-CoV2之S蛋白(S1-RBD)的一受體結合區域(receptor binding domain, RBD)(序列識別號：40或44)，其中Omicron BA.4/BA.5變體形式為序列識別號： 44。 27. 如(1)所述的融合蛋白，其中該融合蛋白選自由序列識別號：49和53所組成的群組。 28. 如(1)的融合蛋白，其中鉸鏈區包含序列識別號：39胺基酸序列。 29. 一種藥物組合物，包括(1)的融合蛋白和藥學上可接受的載體或賦形劑。 30. 一種製備如(1)的融合蛋白的方法: a) 提供生物活性分子，其中生物活性分子是來自SARS-CoV-2武漢的S蛋白的受體結合域(S-RBD)(序列識別號：40)或其Omicron BA.4/BA.5變體之一，其中S蛋白的受體結合結構域是序列識別號：44， b) 提供IgG分子的Fc片段，其中Fc片段包含鉸鏈區，其中鉸鏈區透過半胱胺酸殘基的取代及/或缺失突變以形成突變的Fc，且突變的Fc無法形成雙硫鍵，其中鉸鏈區包含選自由序列識別號：38及39所組成之群組的胺基酸序列，以及 c) 通過鉸鏈區結合生物活性分子和突變的Fc。 31. 一種融合蛋白，其選自由序列識別號： 53的S1-RBD Omicron BA.4/BA.5變體-sF。 32. 一種組合物，包括(31)的融合蛋白。 33. 如(32)的組合物，更包括Th/CTL胜肽，其中Th/CTL胜肽來衍生自SARS-CoV-2 M、N或S蛋白、病原體蛋白或它們的任意組合，其中Th/CTL胜肽選自由序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意組合所組成的群組。 34. 如(33)之組合物，其中Th/CTL胜肽選自由序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意組合所組成的群組。 35. 一種COVID疫苗組合物，包括: a) S-RBD Omicron BA.4/BA.5 變體蛋白，選自 序列識別號： 53； b) Th/CTL胜肽選自由序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意組合所組成的群組； c) 藥學上可接受的賦形劑，其中藥學上可接受的賦形劑是佐劑、緩沖劑、表面活性劑、乳化劑、pH調節劑、鹽水溶液、防腐劑、溶劑或其任意組合。 36. 如(35)的COVID疫苗組合物，包括Th/CTL胜肽，其中Th/CTL胜肽選自由2、9、22、23、27、34、35、36及其任意組合所組成的群組。 37. 如(36)的COVID疫苗組合物，其中藥學上可接受的賦形劑是CpG1寡核苷酸、ALUM(磷酸鋁或氫氧化鋁)、組胺酸、組胺酸HCl•H2O、精胺酸HCl、吐溫80(聚氧乙烯(20)山梨聚醣 單油酸酯）、鹽酸、氯化鈉和 2-苯氧乙醇在水中的組合。 38. 如(37)的COVID疫苗組合物，其中藥學上可接受的賦形劑是CpG1 (序列識別號： 67)。 39. 一種預防COVID的方法，包括給予受試者一藥學上有效量如(35)的疫苗組合物。 40. 一種預防COVID的方法，包括給予受試者一藥學上有效量如(36)的疫苗組合物。 41. 一種產生針對SARS-CoV-2 Omicron BA.4/BA.5變體的抗體的方法，包括給予受試者一藥學上有效量如（35）的疫苗組合物。 42. 一種產生針對SARS-CoV-2 Omicron BA.4/BA.5變體的抗體的方法，包括給予受試者一藥學上有效量如（36）的疫苗組合物。 43. 一種COVID疫苗組合物，包含表15、19和20中任一項中所示量的組成。 44. 一種轉染編碼如(31)融合蛋白cDNA序列的細胞株。 45. 如(44)的細胞株，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。 46. 如(44)的細胞株，其中cDNA序列選自由序列識別號： 64組成的群組。
實施例 1
SARS-CoV2 相關胜肽的合成
SARS-CoV-2相關之Th與CTL胜肽作為用於疫苗發展之免疫原，可被以對於血清學檢測、實驗室試驗與田野研究為有用的小規模量來合成，以及以用於醫藥組成物之商業生產之大規模（公斤）量來合成。具有長度從約9至40個胺基酸之SARS-CoV2相關之Th/CTL抗原決定位胜肽的一大組庫(repertoire)被設計並選擇為胜肽免疫原建構物用於疫苗配方。
表1-3、8與10提供具有已知MHC結合活性之衍生自SARS-CoV-2 M、N與S蛋白之Th/CTL胜肽的序列為設計者胜肽（例如，為了較佳之配製，於N端具有KKK為一連接子以增加其正電荷）用於內含於最終SARS-CoV2疫苗配方。也使用一理想化之人工Th抗原決定位胜肽（序列識別號：36）為一催化劑，使疫苗組成物中之T細胞活化。
使用F-moc化學藉由Applied BioSystems Models 430A、431及/或433之胜肽合成器小規模來合成可用於免疫原研究或相關血清學測試的所有胜肽。每個胜肽皆為藉由在一固相支持物上的獨立合成產生的，伴隨於N端之F-moc保護與三官能胺基酸的側鏈保護基團。於合成後，胜肽從固體支持物切開，伴隨以90%三氟乙酸(TFA)去除側鏈保護基團。藉由基質輔助雷射脫附/游離飛行時間(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-Of-Flight, MALDI-TOF)質譜測定法(Mass Spectrometr)評估合成之胜肽製備物，以確認正確分子量與胺基酸內容。藉由逆向HPLC (Reverse Phase HPLC, RP-HPLC)評估每個合成之胜肽以確認製備物之合成圖譜(synthesis profile)與濃度。儘管對合成過程進行了嚴格控制，包括偶聯效率的逐步監測，但由於在延長週期中的意外事件，包括胺基酸插入、缺失、取代與過早終止，胜肽類似物也被產生。因此，合成之製備物通常含有多個胜肽類似物，儘管數量很少，但仍與目標胜肽一起。
儘管包含了此種非預期的胜肽類似物，但所產生的胜肽製劑還是適合用於免疫學應用與作為胜肽免疫原。通常，此類胜肽類似物經常與純化的胜肽一樣有效，只要開發一個有辨識度的QC程式來監測製造與評估過程兩者，以確保採用這些胜肽的最終產品的可重複性與有效性。在一個訂製的自動胜肽合成儀UBI2003上，以15 mmole到150 mmole的規模進行了數百至數千克量的大規模胜肽合成。
對於在用於臨床試驗或商業用途的最終醫藥組合物中的活性成分，胜肽免疫原建構物在淺洗脫梯度下藉由製備型 RP-HPLC來純化，並藉由MALDI-TOF質譜、胺基酸分析與RP-HPLC來表徵純度與成份。
實施例 2
設計、質體建構與 CHO 細胞中之 S-RBD 融合蛋白的表現
1. cDNA 序列之設計
最適化cDNA序列編碼SARS-CoV-2-RBD武漢（序列識別號： 54）、SARS-CoV-2-RBD VoC Beta （序列識別號： 55）、SARS-RBD VoC Omicron（序列識別號： 56）、SARS-RBD-VoC Delta（序列識別號： 57）及SARS-CoV-2-RBD Omicron BA.4/BA.5（序列識別號： 58）以用於CHO細胞表現。為了產生S-RBD武漢-sFc （DNA 序列識別號： 60)、SARS-CoV-2-RBD VoC Beta-sFc（DNA 序列識別號： 61）、SARS-RBD VoC Omicron-sFc（DNA 序列識別號： 62）、SARS-RBD-VoC Delta-sFc（DNA 序列識別號： 63）及SARS-CoV-2-RBD Omicron變異BA.4/BA.5-sFc (DNA 序列識別號： 64）融合蛋白，分別將編碼SARS-CoV-2之S-RBD武漢與4個VoCs （aa331-530）（DNA 序列識別號： 55-58），包括SARS-CoV-2的Omicron BA.4/BA.5（aa331-530)(DNA 序列識別號： 58）之核酸序列融合至免疫球蛋白Fc之單鏈（DNA序列識別號：59）的N端，隨著於第2圖中顯示之質體圖譜。攜帶分別S-RBD VoC sFc蛋白，例如S-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc蛋白的基因的質體會轉染進CHO細胞系統並產生分別之S-RBD-sFc融合蛋白。
由於沒有雙硫鍵形成於鉸鏈區中，與sFc融合之大蛋白質不會限制對應之S-RBD蛋白的表現。單鏈Fc的結構也具有經由“蛋白A結合與洗脫”純化過程被純化的優點。
2. 質體建構物與蛋白質表現
a. 質體建構物
為了表現S-RBD-sFc融合蛋白，於一合適的細胞株中產生編碼這些目標蛋白質脂之分別的cDNA。cDNA片段的N端添加用於蛋白質分泌的前導訊息序列(leader signal sequence)，而C端可連接至單鏈Fc (sFc)。將 cDNA 片段插入 pND 表現載體中，其含有用於篩選的新黴素(neomycin)抗性基因與用於基因擴增的dhfr基因。將載體與cDNA片段以PacI/EcoRV限制酶消化，然後連接，產生四個表現載體，每個表現載體對應pS-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc。
b. 宿主細胞株
CHO-S™細胞株(Gibco, A1134601)為一穩定的非整倍體(aneuploidy)細胞株，由成年中國倉鼠的卵巢所建立。宿主細胞系CHO-S™適應於無血清懸浮生長，與FREESTYLE™ MAX試劑相容，達高轉染效率。CHO-S細胞被培養於補充有8 mM麩醯胺酸補充劑(Life Technologies, Cat. 25030081) 與抗凝集試劑(anti-clumping agent)(Gibco, Cat. 0010057DG)的DYNAMIS™培養基(Gibco, Cat. A26175-01)中。
ExpiCHO-S™細胞株(Gibco, Cat. A29127)為一CHO-S細胞株的選殖(clonal)衍生物。ExpiCHO-S™細胞在ExpiCHO™表現培養基(Gibco, Cat. A29100)中適應高密度懸浮培養，無需任何補充。細胞被維持於具有8% CO 2之濕潤氣氛的一37°C培養箱中。
c. 瞬時表現 (transient expression)
為了瞬時表現，使用EXPIFECTAMINE™ CHO 套組(Gibco, Cat. A29129)將表現載體個別地轉染進ExpiCHO-S細胞中。在轉染後第 1 天，添加 EXPIFECTAMINE™ CHO增強劑與第一次饋料，並將細胞從具有8% CO2之濕潤氣氛的一37°C培養箱轉移至具有5% CO2之濕潤氣氛的一32°C培養箱。之後，於轉染後第5天天加第二次饋料，並於轉染後12-14天之後收穫細胞。於收穫細胞培養物之後，藉離心與0.22-µm過濾將上清液澄清。分別藉由蛋白質A層析(Gibco, Cat. 101006)與Ni-NTA層析(Invitrogen, Cat. R90101)來純化含有單鏈Fc與His-標籤的重組蛋白。
d. 穩定轉染與細胞篩選
使用FreeStyle MAX試劑(Gibco, Cat. 16447500)將表現載體轉染進CHO-S細胞中，且之後以含有8 mM L-麩醯胺酸、以1:100稀釋之抗凝集試劑、嘌黴素(puromycin) (InvovoGen, Cat. ant-pr-1)與MTX(Sigma, Cat. M8407)之選擇DYNAMIS™培養基培養。經過2輪選擇階段後，獲得四個穩定的池(pool)（1A、1B、2A、2B）。此外，將細胞選殖體鋪板(plated)在半固體CloneMedia (Molecular Devices, Cat. K8700)中，同時添加檢測抗體，以用於經由高通量系統ClonePixTM2 (CP2)的選殖體篩選與單細胞分離。使用14天葡萄糖簡單饋料批式培養(simple fed-batch culture)在具有8mM麩醯胺酸與抗凝集試劑的DYNAMIS™培養基中篩選經由CP2挑選的選殖體，而無需選擇。在篩選後，藉由限制性稀釋法(limiting dilution)執行具有高產量之選殖體的單細胞分離，並使用CloneSelect Imager (Molecular Devices)藉由成像確認單株性(monoclonality)。
e. 簡單饋料批式培養
使用一簡單饋料批式培養以確認表現重組蛋白之CHO-S細胞的生產力。以3 x 10 5個細胞/mL將CHO-S細胞連同30 mL DYNAMIS培養基補充、8 mM麩醯胺酸與以1:100稀釋之抗凝集試劑接種於125-mL搖瓶中。將細胞培養於具有8% CO2之濕潤氣氛的一37°C培養箱中。於第3與5天添加4 g/L之葡萄糖，並於第7天添加6 g/L之葡萄糖。每日收集培養物以確認細胞密度、存活率(viability)與生產力，直到細胞存活率降至低於50%或達到第14天之培養。
f. 基因轉錄本 (transcript) 之準確性
經由CHO-S表現細胞之基因轉錄的準確性係藉由RT-PCR來確認。簡而言之，使用PURELINK™ RNA迷你套組 (Invitrogen Cat. 12183018A)來分離細胞之總。之後，使用Maxima H Minus第一股cDNA合成套組(Thermo Cat. K1652)自總RNA反轉錄第一股cDNA (first strand cDNA)。將重組蛋白之cDNA進行純化並接合進yT&A載體(Yeastern Biotech Co., Ltd Cat.YC203)。最後，藉由DNA定序來確認cDNA序列。
g. Stability of the expressing cells 表現細胞之穩定性
將細胞以1~2 x 10 5個細胞/mL接種並培養於無選擇試劑的一培養基中達60代。在此期間，一旦培養物之細胞密度達1.0 x 10 6個細胞/mL或更高，將細胞培養物以1~2 x 10 5個細胞/mL的細胞密度再次繼代。在培養達60代後，使用葡萄糖簡單饋料批式培養將細胞性能與生產力與剛從LMCB被解凍之細胞比較。細胞中產品生產力之穩定性的標準為於培養60代後力價大於70%。
實施例 3
sFc 融合蛋白之純化與生化特性描述
1. sFc 融合蛋白之純化
從含有所收穫細胞培養物之培養基藉由蛋白質A-瓊脂糖(sepharose)層析來純化所有sFc融合蛋白。藉由一蛋白質A親合管柱來捕捉sFc融合蛋白。在清洗與洗提後，將蛋白質溶液之pH調整至3.5。之後藉由1 M Tris鹼(Tris base)緩衝液，pH 10.8的添加，將蛋白質溶液中和至pH 6.0。融合蛋白之純度藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳來確認。根據於280 nm 之一波長的UV吸收來測量蛋白質濃度。
2. 包含 S1-RBD Omicron 變體 BA.4/BA.5-sFc 融合蛋白之 S1-RBDVoCs-sFc 做為用於預防與治療 COVID 之免疫原的 S1-RBDVoCs-sFc 融合蛋白的生化特性描述
根據於實施例2中所述之方法來製備與純化S1-RBDVoCs-sFc proteins，包括S-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc蛋白質(序列識別號： 49-53)作為高精確度設計疫苗配方中的代表性免疫原融合蛋白以進行免疫原性評估。
在sFc融合蛋白之純化後，使用考馬斯藍(Coomassie blue)染色藉由SDS-PAGE在非還原與還原條件下，來確認蛋白質的純度)。 第 8 圖為顯示S1-RBD-sFc 蛋白質之一高度純化製備物於非還原條件（泳道2）與還原條件（泳道3）下的一影像。
將經純化之蛋白質藉由質譜分析與與醣基化分析來描述特徵。
a. S-RBD-sFc - LC 質量分析與醣基化分析
i. 醣基化
醣蛋白(glycoproteins)可具有兩種類型之醣基化連接(glycosylation linkage)：N-連接醣基化(N-linked glycosylation)與O-連接醣基化。N-連接醣基化通常發生在一序列內的一天冬醯胺酸(Asn)殘基上：Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Xaa為除了Pro之任何胺基酸殘基，且碳水化合物部分經由天冬醯胺酸之側鏈上的NH 2附著在蛋白質上。O-連接醣基化利用一絲胺酸或蘇胺 酸殘基之側鏈OH基團。
S1-RBD-sFc的醣基化位點，藉由胰蛋白酶消化，接著LC-MS與MS/MS進行研究，其顯示S1-RBD-sFc在胺基酸位置13 (N13)的精胺酸殘基上具有一個N-連接醣基化位點，在胺基酸位置211 (S211)與224 (S224)的絲胺酸殘基上具有一個O-連接醣基化位點。
ii. N- 醣基化
藉由質譜(MS)光譜技術分析S1-RBD-sFc的N-連接聚醣(glycan)結構。簡而言之，使用PNGase F以從經純化的蛋白質釋放N-寡醣。之後進一步以2-胺苯甲醯胺(2-aminobenzamide, 2-AB)標示N-聚糖之部分以增強在質譜分析中之聚醣訊號。
iii. O- 醣基化
藉由胰蛋白酶消化與隨後之質譜光譜技術研究S1-RBD-sFc的O-連接聚醣。在胰蛋白酶消化後，收集包含O-連接聚醣之波峰且藉由質譜確認它們的分子量。
iv. LC 質譜分析
藉由LC質譜分析來特徵描述經純化之S1-RBD-sFc蛋白。基於其胺酸序列S1-RBD-sFc蛋白之理論分子量為48,347.04 Da。S1-RBD-sFc蛋白之質譜圖譜，具有一主要波峰於49,984.51 Da。在理論分子量與經由LC質譜分析觀察到之重量之間的差距為1,637.47 Da，其暗示經純化之S1-RBD-sFc蛋白含有N-及/或O-聚醣。
第 7 圖圖解說明藥物基質(drug substance, DS) S1-RBDVoC-sFc的一般製造製程。此製程起始自工作細胞庫 (Working Cell Bank, WCB)以接種細胞種子並在2000 L饋料批式生物反應器中擴大培養物。於細胞培養製程後，收集未處理之原液(bulk)，並將其經由無菌過濾來澄清以產生經澄清的原液。為了純化藥物基質，原液經由蛋白質A親和層析、深度過濾(Depth Filtration)與離子交換(Ion-exchange, IEX) 層析，然後是切向流過濾(Tangential Flow Filtration, TFF)以緩衝液交換，以達成經配製的DS。為避免外來病毒污染，經澄清的原液也經過具有溶劑清潔劑處理、蛋白質A層析中的酸滅活與奈過濾(nano-filtration)的製程。最後，在無菌過濾後產生經配製之S1-RBDVoCs-sFc DS，包括S-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc DS濃縮物。
實施例 4
針對 SARS-CoV2 設計之蛋白質 / 胜肽的製造的混合製程
第 10A 及 10B 圖圖解說明針對SARS-CoV2之VoCs的設計多重抗原決定位(multitope) COVID疫苗之製造的複合製程。為了產生疫苗產品，製程為相繼添加胜肽、CpG1、明礬(Alum)佐劑與蛋白質成分於溶液中。首先，將Th/CTL胜肽添加至WFI且之後接著添加CpG1於胜肽溶液中以形成胜肽/CpG1複合物。此後，將蛋白質緩衝液、明礬與NaCl添加到含有胜肽/CpG1/明礬/NaCl之複合物的溶液中。最後，S1-RBDVoCs-sFc蛋白液或S1-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc蛋白液被添加、良好地混合，並調整蛋白質濃度、pH與其他緩衝液條件以達成最終疫苗產品。  
實施例 5
設計蛋白質 / 胜肽 COVID 疫苗產品與安慰劑
設計於臨床前、1、2與3期臨床試驗或擴展追加疫苗接種中使用的設計COVID疫苗以激活體液與細胞反應兩者。對於SARS-CoV-2免疫原，COVID疫苗產品結合CHO-表現之S1-RBD-sFc融合蛋白（武漢株或Omicron BA.4/BA.5變體）與合成之T輔助(Th)與胞毒型T淋巴球(cytotoxic T lymphocyte, CTL)抗原決定位胜肽的混合物，其係擇自已知與人類主要組織相容複合體(major histocompatibility complex, MHC)I與II結合的免疫顯性M、S2與N區。疫苗產品之製備係由混合(compounding)、過濾、混合與填充操作所組成。在添加次單元蛋白質S1-RBD-sFc之前，經由一0.22微米膜過濾器來過濾疫苗之個別的成分，包括胜肽溶液(2 µg/mL)、CpG1、專屬(proprietary)寡核苷酸 (oligonucleotide, ODN)、溶液 (2 µg/mL)、含40 mM 組胺酸、500 mM精胺酸與0.6% Tween 80之10X蛋白質緩衝液、20%氯化鈉儲備溶液。在相繼添加各個成分後，將S1-RBD-sFc融合蛋白與胜肽與上述成分一起配製以形成一蛋白質-胜肽複合物，之後被吸附在磷酸鋁(Adju-Phos®)佐劑上。最後一步是加入含有2-苯氧乙醇防腐劑溶液的注射用水，使最終的藥物產品達到200 μg/mL。將完成之疫苗產品儲存於2至8°C。
於所有試驗中使用之安慰劑為無菌0.9%生理食鹽水(normal saline)。
實施例 6
用於 COVID 疫苗之 B 細胞或 T 細胞免疫原性之評估的補充方法
1. 根據 ELISA 之抗 S1-RBD WT 結合 IgG 抗體
將96-孔ELISA盤以2 µg/mL重組S1-RBDWT-His蛋白質抗原（100 µL/孔於塗覆緩衝液，0.1 M碳酸鈉，pH 9.6）塗覆並於室溫隔夜培養（16至18小時）。100 μL/孔之連續稀釋血清樣本（從1:20、1:1,000、1:10,000與1:100,000被稀釋，共4個稀釋）以2重複被添加，並將盤於37°C培養1小時。將盤以250 μL清洗緩衝液(PBS-0.05% Tween 20, pH 7.4)清洗六次。經結合之抗體以HRP-rProtein A/G於37°C偵測30分鐘，接著六次清洗。最後添加100 μL/孔之於基質工作溶液(Substrate Working Solution)（含有過氧化氫的檸檬酸鹽緩衝液）製備的TMB（3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)）並於黑暗中於37°C培養15分鐘，且藉由添加100 μL/孔之H 2SO 4，1.0 M停止反應。在ELISA讀盤器(Molecular Device, VersaMax)上測量顯色的樣品顏色。使用UBI® EIA力價計算程式計算相關力價。抗S1-RBD抗體程度 被表現為一測試樣本之一終點稀釋的Log 10（SoftMax Pro 6.5, 二次擬合曲線(Quadratic fitting curve)，閥值0.248）。
2. 以 ELISA 分析 RBDWT 結合 ACE2 的抑制
將96-孔ELISA盤以2 µg/mL ACE2-ECD-Fc抗原（100 µL/孔於塗覆緩衝液中，0.1 M碳酸鈉，pH 9.6）塗覆並於4°C隔夜培養（16至18小時）。使用一自動微孔盤清洗器將盤以清洗緩衝液（具有0.05% Tween 20之磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline)的25倍溶液，pH 7.0-7.4，250 μL/孔/清洗）清洗六次。額外的結合位點被200 μL/孔的阻斷溶液（5 N HCl、蔗糖、Triton X-100、酪蛋白與Trizma鹼）所阻斷。將免疫血清或一正控制組的一五倍稀釋物（稀釋於含有載體蛋白與防腐劑的一緩衝鹽溶液中）與一1:100稀釋之RBDWT-HRP結合物(conjugate)（辣根過氧化物酶結合之重組蛋白S1-RBD-His (horseradish peroxidase-conjugated recombinant protein S1-RBD-His)）混合，於25±2°C培養於30±2分鐘，清洗，並添加TMB基質（3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)稀釋於含有過氧化氫的檸檬酸鹽緩衝液）。藉由停止溶液（經稀釋之硫酸，H 2SO 4，溶液，1.0 M）停止反應，並使用微孔盤讀取儀(VersaMax)於10分鐘內讀取各孔洞於450nm的吸收。用於定量的校準標準範圍為0.16至2.5 μg/mL。具有低於0.16 μg/mL之力價值的樣本被定義為偵測極限的一半。具有力價超過2.5 μg/mL的樣本被進一步稀釋以進行再分析。
3. 根據基於 CPE 的活病毒中和測定法分析針對 SARS-CoV-2 野生型與變體的病毒中和抗體力價
中和抗體力價藉由基於CPE的活病毒中和測定法使用以野生型(SARS-CoV-2-Taiwan-CDC#4, 武漢)與 Delta 變體(SARS-CoV-2-Taiwan-CDC#1144, B.1.617.2)挑戰之Vero-E6細胞來測量，其在中央研究院，台灣的一BSL-3實驗室被執行。Vero-E6 (ATCC® CRL-1586)細胞於補充有10%胎牛血清(FBS, Gibco)與1x青黴素-鏈黴素溶液(Thermo)之DMEM (Hyclone)中在具有5% CO 2之濕潤氣氛於37°C被培養。以1.2×10 4細胞/100 μL/孔來接種96-孔微力價盤。將盤於37°C於一CO 2培養箱隔夜培養。隔日，測試的血清在56°C加熱30分鐘以滅活補體，且之後在DMEM（補充有2% FBS與1x 青黴素/鏈黴素）中稀釋。對稀釋物執行血清之連續2倍稀釋。五十μL之經稀釋的血清與一等體積之病毒(100 TCID50)混合並於37°C培養1小時。於移除隔夜培養物培養基之後，100 μL之血清-病毒混合物以三重複被接種於一在96孔盤中之Vero-E6細胞之鋪滿的一單層(confluent monolayer)上。在於37°C以5% CO 2培養4天之後，將細胞以10%甲醛(formaldehyde)固定，並以0.5%結晶紫染色溶液於室溫染色20分鐘。個別之孔洞就CPE方面被評分為 “感染”或 “無感染”的二元结果。SARS-CoV-2病毒專一性中和力價的確認是根據VNT 50力價之原理（病毒誘導的細胞病變效應(cytopathic effects)之≥50%減少）來測量針對SARS-CoV-2病毒的中和抗體力價。血清的病毒中和力價被定義為觀察到細胞病變效應減少 50% 時最高血清稀釋度的倒數，結果藉由Reed與Muench 的方法計算。
4. 以偽病毒 (pesudovirus) 檢驗分析針對 Omicron BA.1/BA.2/BA.5 的中和力價
中和抗體力價係藉由中和檢驗使用以SARS-CoV-2 偽病毒變體挑戰的HEK-293T-ACE2細胞來測量。此研究於中央研究院生醫轉譯研究中心(Biomedical Translation Research Center, BioTReC)RNAi core的一BSL2實驗室執行。人胚腎(HEK-293T/17; ATCC® CRL-11268 TM)細胞獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。將細胞培養於補充有10%胎牛血清(Hyclone)與100 U/mL之青黴素-鏈黴素溶液(Gibco)的DMEM (Gibco)中，且之後37°C 在具有5% CO 2之濕潤氣氛中培養。HEK-293T-ACE2細胞是藉由攜帶人ACE2基因的VSV-G偽型慢病毒(pseudotyped lentivirus)的轉導所產生。為了產生SARS-CoV-2偽病毒，使用TransIT-LT1轉染試劑(Mirus Bio)，將表現C端截短的野生型武漢-Hu-1株SARS-CoV-2棘蛋白(spike protein)的一質體(pcDNA3.1-nCoV-SΔ18)共轉染進具有包裝與報告質體的HEK-293T/17細胞（分別為pCMVΔ8.91與pLAS2w.FLuc.Ppuro）(BioTReC, Academia Sinica)。藉由改變武漢-Hu-1參考菌株的核苷酸，使用定點誘變(site-directed mutagenesis)來產生Omicron BA.1、BA.2與BA.4/BA.5變體。對於BA.1變體，棘蛋白之突變為A67V、 Δ69-70、T95I、G142D/Δ143-145、Δ211/L212I、 ins214EPE、 G339D、 S371L、 S373P、 S375F、 K417N、 N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、 G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、 H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、 Q954H、N969K、L981F。對於BA.2變體，棘蛋白之突變為T19I、 L24S、Δ25-27、G142D、V213G、G339D、S371F、 S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、 N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、 N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、 N764K、D796Y、Q954H、N969K。對於BA.4/5變體，棘蛋白之突變為T19I、L24S、Δ25-27、Δ69-70、G142D、V213G、G339D、S371F、S373P、S375F、T,376A、D405N、R408S、 K417N、N440K、L452R、S477N、T478K、E484A、L486V、Q493、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、N764K、D796Y、N856K與Q954H & L969K。
藉由使用TransITR-LT1轉染試劑(Mirus Bio) 將指示的質體遞送到HEK-293T/17細胞中以產生不同的 SARS-CoV-2偽病毒。於72小時轉染後，藉由以4,000 xg離心10 分鐘來移除細胞殘骸，且將上清液收集、過濾(0.45 μm, Pall Corporation)與冷凍於-80°C直至使用。將HEK-293-hACE2 cells (1x104 cells/well)接種於96孔白色分離平盤(isoplates)並隔夜培養。測試的血清在56°C加熱30分鐘以滅活補體，且在培養基（補充有1% FBS與100 U/ml青黴素/鏈黴素之DMEM）中稀釋，且之後執行連續2倍稀釋，共8次稀釋。再添加至具有細胞之盤之前，25 μL之經稀釋的血清與一等體積之偽病毒(1,000 TU)混合並於37°C培養1小時。在1小時培養之後，將 50 μL混合物以指定之稀釋係數(factor)添加至具有細胞含有每孔50 μL之DMEM 培養物之盤在接下來的16小時培養中，以50 μL 新鮮培養基（補充有 10% FBS與100 U/ml 青黴素/鏈黴素的 DMEM）來替換培養物培養基。於72小時感染後，將細胞裂解，並使用Bright-Glo TM螢光素酶檢測系統(Luciferase Assay System)(Promega)來測量相對光單位(relative light units, RLU)。藉由Tecan i-control (Infinite 500)來偵測螢光素酶活性。抑制百分比計算為稀釋血清存在下 RLU減少與僅有病毒控制組的RLU值的比值，計算公式如下所示： (RLU 控制組- RLU 血清) / RLU 控制組。藉由 Reed與Muench方法來確認50%保護力價(NT50 titer)。
5. ELISPOT 分析 T 細胞的反應
於T細胞反應之偵測中使用人類周邊血液單核細胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。對於追加系列第三劑系列擴展研究，人類IFN-γ/IL-4 FluoroSpot PLUS套組(MABTECH)執行ELISpot檢驗。將250,000 PBMCs之可分量(aliquots)接種於各孔洞並分別以10 μg/mL（各刺激物）之RBD-WT+Th/CTL、Th/CTL或Th/CTL池無UBITh1a（CoV2胜肽）下刺激，且在37°C與5% CO 2下單獨在培養基中培養24小時，作為每個盤的負控制組。根據製造商指南執行分析。通過減去負控制組孔洞來計算每百萬個細胞的斑點形成單位(pot-forming unit, SFU)。
6. 胞內細胞因子染色 (Intracellular cytokine staining, ICS)
使用胞內細胞因子染色與流氏細胞術(flow cytometry)來評估CD4+與CD8+ T細胞反應。PBMCs分別被以 S1-RBD-His重組蛋白加上Th/CTL胜肽池、僅有Th/CTL胜肽池、CoV2胜肽、PMA + Inonmycin（作為正控制組）或單獨培養於培養基中作為負控制組，在37°C與具5% CO 2下6小時。刺激後，清洗細胞並於室溫以活性染料(viability dye)染色20分鐘，之後於室溫進行表面染色 20 分鐘，於室溫以BD cytofix/cytoperm 套組(Catalog # 554714)進行細胞固定與透化(permeabilization)20分鐘，且之後於室溫進行細胞內染色20分鐘。使用IFN-γ、IL-2與IL-4之胞內細胞因子染色來評估CD4+ T細胞反應。使用IFN-γ、IL-2、CD107a與顆粒酶(Granzyme) B之胞內細胞因子染色來評估CD8+ T細胞反應。染色完成後，使用BD FACSDiva軟體在 FACSCanto II 流式細胞儀(BD Biosciences)中分析細胞。
7. 統計學
對於II期延長追加疫苗接種(extension booster vaccination)研究。幾何平均力價(Geometric Mean Titer, GMT) 的免疫原性結果以95%信心區間(confidence intervals)呈現。使用 SAS® Version 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA)或 Wilcoxon符號排序檢定(Wilcoxon sign rank test)進行統計分析。Spearman相關性用於評估非常態分佈資料集(data set)之間的單調關係(monotonic relationship)。對於II期主要2-劑系列，試驗設計的樣本數量符合在具有健康成年人疫苗組中之3,000名研究參與者的最低安全要求，如美國 FDA與WHO所建議。
實施例 7
含有分別之 S1-RBD 融合蛋白 (S1-RBDVoCs-sFc 及 S1-RBD Omicron BA.4/BA.5 變體 ) 的針對 SARS-CoV-2 感染的高精準設計疫苗
1. 一般設計
針對病毒感染的一有效免疫反應取決於體液免疫與細胞免疫兩者。更具體而言，高精確度設計預防性疫苗的潛力將採用設計免疫原，胜肽或蛋白質，為(1) 經由在涉及病毒對於在目標細胞上之其受體結合之病毒蛋白上之B細胞抗原決定位之使用的中和抗體的誘導；(2) 經由內源性Th與CTL抗原決定位之使用之針對入侵的病毒抗原之包括初級與記憶B細胞與CD8+T 細胞反應的細胞反應的誘導的活性醫藥成分。此類疫苗可與ALHYDROGEL、ADJUPHOS、MONTANIDE ISA、CpG等佐劑與其他賦形劑一起配製，以增強高精確度設計免疫原的免疫原性。
2. 使用 CHO 細胞表現 S-RBD-sFc 蛋白（序列識別號： 49 之胺基酸序列與序列識別號： 60 之核酸序列）為 B 細胞免疫原的代表性設計 COVID-19 疫苗 UB-612
此蛋白質是被設計與製備以表現具有在RBD內之非常碳水化合物結構(very carbohydrate structure)的SARS CoV-2棘(Spike, S)蛋白質上的受體結合區域(RBD)，以在免疫時誘導高親和力中和抗體。疫苗也可以使用設計胜肽合併能夠促進宿主專一性Th細胞介導的免疫的內源性SARS-CoV-2 Th與CTL抗原決定位胜肽的混合物，促進對 SARS-CoV-2之病毒專一性初級與記憶B細胞與CTL的反應，以避免SARS-CoV-2感染。有效的疫苗需要啟動記憶T細胞與B細胞，以便在病毒感染/挑戰時快速回憶。
為了提高所公開的設計免疫原的有效性，採用了兩種代表性的佐劑配方明礬(ALUM) (ALHYDROGEL/CpG、ADJU-PHOS®/CpG與MONTANIDE™ ISA/CpG)來誘導最佳之之抗SARS-CoV-2免疫反應。
明礬（ADJUPHOS與ALHYDROGEL）被普遍接受為人類疫苗的佐劑。此佐劑藉由提高設計免疫原之抗原呈現細胞(APCs)的吸引與攝入來誘導一Th2反應。MONTANIDE™ ISA 51 是一種油，當與水相設計胜肽/蛋白質免疫原混合時會形成一乳狀液，以引發對SARS-CoV-2的有效免疫反應。CpGs寡核苷酸為TLR9激動劑，其改善抗原呈現與疫苗專一性細胞與體液反應的誘導。通常，帶負電荷的CpG 分子與帶正電荷的設計免疫原結合形成適合抗原呈現的免疫刺激複合物，以進一步增強免疫反應。
相較於使用滅活病毒裂解物或其他特徵較少的免疫原之具有更複雜之免疫原內容之疫苗的弱的或不合適的抗體呈現，根據如於表7中所示的疫苗組成物所製備之所揭露的高精確度設計疫苗（例如UB-612）具有產生高專一性免疫反應的優點。此外，在 COVID-19 疫苗開發中存在與稱為抗體依賴性增強(antibody-dependent enhancement, ADE)的機制相關的潛在缺陷。具體而言，ADE為一種現象，其中病毒對於非中和抗體的結合會增強其進入宿主細胞，有時還會增強其複製。這種導致傳染性與毒力兩者增加的機制已在蚊媒黃病毒、HIV與冠狀病毒中觀察到。所揭露的高精確度疫苗係被設計來藉由監測抗體反應的品質與數量來避免疫苗誘導之疾病增強，由於它們將決定功能結果。
實施例 8與實施例 9 中討論的代表性研究闡述了設計所揭露的高精確度SARS-CoV-2疫苗的方法，這些疫苗是安全的，可以促進抗體之引發，這些抗體能夠(1)結合至CHO表現之S1- RBD-sFc蛋白；(2)抑制S1蛋白對固定在微孔表面或細胞表面上過度表現ACE2受體蛋白的ACE2受體的結合，與(3)在細胞介導的中和試驗中中和病毒介導的細胞病變效應。
實施例 8
UB-612 （ SARS-CoV-2 （武漢）蛋白質 - 胜肽疫苗）第 1/2 期臨床試驗中所證實之強效追加與長效免疫
1. 試驗程序與安全性
a. 第 1 期臨床試驗之主要與追加第三劑系列
1期試驗由6名參與者之哨兵小組(sentinel group)開始，接受低10-μg劑量，若無與疫苗相關的≥3級不良反應，則剩餘14名參與者隨後進行。同樣的程式被擴展到逐步上升之30與100-μg劑量組。在第14天、第28天、第35天、第42天、第56天、第112天與第196天為所有參與者安排了額外的後續訪問(follow-up visit)。研究參與者安排在追加後第14天與第84天訪問。對要完成7天期間之參與者在每次注射後提供電子日記，以記錄注射部位的所引發之局部反應（疼痛、硬結/腫脹、皮疹/發紅、瘙癢與蜂窩織炎）與所引發的全身反應（17種不同的體質症狀）。使用從無到危及生命的5級（0到4）等級對嚴重程度進行分級。此外，參與者從疫苗接種當天開始每天晚上記錄他們的腋窩溫度，並至後續6天。安全性終點包括於此中期1期延長報告中之追加後上至14天報告的非訴求AEs。
b. 第 2 期臨床試驗之主要系列
第2期臨床試驗的主要安全性終點是評估接受研究干預的所有參與者從第1天到第57天（第二次給藥後28天）的安全性與耐受性。在每次注射之前和之後評估生命體徵。 每次注射後觀察參與者30分鐘的生命體徵變化或任何急性過敏反應。每次注射後，參與者必須在他們的自我評估電子日記中記錄達7天之所引發之局部與全身性AE，而在他們的電子日記中記錄皮膚過敏反應達十四天。安全性終點包括於此中期 2 期報告中報告的第1天至第57天的非訴求AE。
2. RESULTS 結果
a. 試驗群體
i. 第 1 期臨床試驗主要與追加第三劑系列
開放標籤(open-label)第1期臨床試驗參與者的特徵包括涉及接受了兩劑（間隔28 天）10、30 或 100 μg 的UB-612之在三個劑量組（每個 n = 20）中之60 名健康成年人（年齡 20-55 歲）之196天的主要係列研究；與在主要係列之後的84天延長追加疫苗接種，其中對於10-μg (n = 17)、30-μg (n = 15)與100-μg (n = 18)組，50名參與者被編入在第二次注射後的7.6至 9.6個月之間接受額外的100 μg追加。在這份中期報告中，經追加的參與者被追蹤14天，以評估安全性與免疫原性，隨後監測至追加後的84 天。
ii. 第 2 期臨床試驗主要 2 劑系列
第2期臨床試驗為用隨機雙盲設計。總共3,875名參與者其接受至少一劑 100 μg 疫苗（3,321人接受了UB-612與554人接受了安慰劑，比例6:1）被編入與包含於安全群體，其中1012名參與者（疫苗組871人與安慰劑組141人）被包含在可評估的免疫原性群體中。接受UB-612的參與者的平均年齡為44.9歲（18至83歲），而安慰劑組參與者的平均年齡為44.4歲（19至84歲）。對於UB-612與安慰劑組兩者，年輕成年人（18 至 65 歲）與年長成年人（≥65 歲）的比例約為80:20。除5人外，所有參與者皆為台灣人。
b. 反應原性 (reactogenicity) 與安全性
i. 第 1 期臨床試驗主要 2- 劑與追加第三劑系列
在196天的主要係列中與加強免疫後達14天，既沒有記錄到疫苗相關的嚴重不良事件（SAE，包括3/4級AE），也沒有記錄到在發生率(incidence)或嚴重程度中的劑量限制(dose-limited)增加。所有疫苗接種組中在 7 天內報告的所引發之局部性與全身性AE均為輕度至中度（1/2 級）與短暫性，隨著相較於局部性反應，大部分全身性反應的頻率較低。第一次與第二次疫苗接種後引起的所引發之局部性AE發生率相當，在追加劑後略有增加，最常見的追加後所引發之局部性AE為注射部位的疼痛(60-71%)。每次疫苗接種後引發的全身性AE的發生率相似，最常見的追加後所引發之全身性AE為疲勞(11-33%)。在主要 2 劑疫苗接種系列與追加期中觀察到的安全性圖譜(safety profile)相似。
ii. 第 2 期臨床試驗主要 2 劑系列
並無與疫苗相關的SAE。局部與全身AE皆為輕度和短暫的，並為在幾天內自限性的。總體而言，在1與2劑後，2546名參與者報告了所引發之局部性AE，其中2386名(72.0%)來自UB-612，160名(28.9%)來自安慰劑組。這些局部性AE的嚴重程度為輕度（1 級）至中度（2 級），最常見的事件是疫苗組2,246名 (67.8%) 參與者中的注射部位疼痛，以及偶發的皮膚過敏反應。
介於UB-612疫苗組和安慰劑組之間跨年齡層之所引發的全身性AE的發生率並無顯著差異(P ＞ 0.05)。疫苗組中 38.6%的年長參與者（65-85 歲）報告了所引發之全身性AE，相較於63.3%之總安全群體。最常見之所引發的全身性AE為於1,488 名(44.9%)之UB-612治療參與者中報告的疲勞/疲倦，並且通常是輕微的。
c. 針對活 SARS-CoV-2 野生型與 Delta 變體的中和抗體，以及針對假 SARS-CoV2 野生型與包括 Alpha 、 Beta 、 Gamma 與 Omicron 的 VoC 的中和抗體
i. 第 1 期臨床試驗主要 2 劑與追加第三劑系列
在第2劑後7.6-9.6個月給予100 μg的追加劑量，在100%的參與者中誘導了針對活的SARS-CoV-2野生型（WT，武漢株）與Delta 變體的強大中和抗體（第11圖）。在10-、30-和100-μg UB-612劑量組中，追加劑引起針對WT之幾何平均50%病毒中和力價(VNT 50)分別為4643、3698與3992（第11A-11D圖），表示相較於主要系列中的峰值反應（2劑後14天，即第42天），分別增加 104、118與37倍（幾何平均倍數增加，GMFI (geometric mean fold increases)），與(b) GMFI分別為465、216與65超過了追加前的程度。相較於住院COVID-19病例發病後~1個月收集的一組(panel)人類恢復期血清(human convalescent sera, HCS)，追加後中和抗體程度分別高出45.5倍、36.2倍與39.1倍(GMFI)。以WHO參考抗血清標準化並以國際單位(IU/mL)表示，同一活病毒測試中的中和抗體力價相似。
追加劑量也誘導了針對活Delta變體的顯著高的VNT 50力價，達到2854、1646與2358（第12A圖），其代表相對於WT株，對於10-、30-與100-μg組之1.6、2.4與1.7的適度GMFR（即，分別保存~63%、~42%與~60%之中和強度）。表 11 顯示了針對 SARS-CoV-2 野生型 (WT)和Delta變體的加強後病毒中和抗體滴度的比較，這些抗體力價來自從不同疫苗平台接受第三次（加強）注射的疫苗接種者收集的血清，在與其它平台(NVX-CoV2373、mRNA-1273、BNT 162B2、MVC-COV1901、CoronaVac及AZD1222)相比，針對Delta株UB-612具有的最高的GMT，且WT/Delta(GMFR)顯示這些UB-612追加劑血清在 Delta 中和能力方面具有很高的保存性(表11)。
評估對100-μg組(n = 18)追加後14天觀察到的pVNT 50，對於針對偽SARS-CoV-2野生型 (WT)與包含Omicron的其他VoC之其交叉反應中和抗體力價，如於第12B圖所示。相較於野生型之14,171，針對WT、Omicron、Alpha、Gamma 與Beta的pVNT 50分別為12,778、2,325、9,300、13,408與4,974，相對於WT株，GMRF分別為5.5、1.4、1.0與2.6（即分別保持 18.2%、72.7%、105%與38.9%的中和強度）。
相較於較低劑量的10-與30-μg，主要系列中的中和抗體在100-μg組中較持久，與在2劑後14至28天觀察到之針對WT的VNT50的最大增加有關（第11A-11C圖）。100-μg組中的峰值中和抗體GMT（第42天為108；第56天為103）（第11C圖）接近控制人類恢復期血清(HCS)組之GMT的102。對於100 μg劑量，基於SARS-CoV-2中和抗體力價在第1期臨床試驗第57天的血清轉化 (seroconversion)率為100%，此後在整個監測期間保持為100%。
在施打追加劑前（第255至316天），在100-μg組中的18名參與者(0%)VNT 50力價均未低於檢測極限(LLOQ)，顯示誘導的中和效應持續很長期間。使用一階指數模型擬合 (SigmaPlot) 計算第1期臨床試驗100-μg組施打2劑後的抗體持久性，用於第42至196天的抗WT中和VNT 50（r 2= 0.9877，衰減率常數 K el= -0.0037；t 1/2= 0.693/K el）。隨著187天之t 1/2，中和抗體VNT 50GMT緩慢下降（第12C圖）。
我們也以自 100-μg UB-612 劑量組的第1期臨床試驗主要系列的所有血清樣本 (n = 20) 研究在第1期臨床試驗主要疫苗接種階段期間針對Delta與其他VoC的中和作用（第13圖）。結果顯示保留了病毒中和活性，特別是針對Delta B.1.617.2 變體，對其而言，相對於野生型武漢株保留了63%的中和活性（1.6之GMFR）。還保留了針對 Alpha (B.1.1.7) 變體的顯著中和抗體，具有91%保留（1.1之GMFR），Gamma (P.1) 變體具有56%保留（1.8之GMFR），而針對Beta B.1.351較弱，具有20%保留（5.1之GMFR）。
ii. 第 2 期臨床試驗主要 2 劑
於第57天（第2劑後4週），跨所有年齡（18 至85歲）的參與者，抗S1-RBD力價的GMT為518.8（第14A圖）而針對原始野生（WT武漢）株的病毒中和力價為年齡依賴性的，總VNT50為87.2（第14B圖）。相較於年輕成年人（18至65歲）具有較高之VNT50為96.4，其與在20-55歲的第1期臨床試驗研究參與者（VNT50 為 103）觀察到可再現地接近（第11C圖），而年長成年人（≥65歲）表現出較低的VNT50為51.6。進行具有追加第三劑的第2期臨床試驗的延長研究。在第2階段中含蓋所有年齡（18至85歲）的受試者，基於野生型SARS-CoV-2中和抗體力價在第57天（或1劑後第56天）的血清轉化率從年長者的88.6%到年輕成年人的96.4%。
在第57天，觀察到大量程度的抗Delta中和抗體。從跨年齡組的疫苗接種者中隨機選擇48份血清樣本池（n = 39對於18-65歲的年輕成年人；n = 9對於≥65歲的年長成年人）在兩個獨立實驗室接受了特設活病毒檢測分析(ad hoc live virus assay analysis)（中央研究院與加利福尼亞病毒與立克次體病部）。結果是一致的，顯示免疫血清可以中和兩個關鍵的SARS-CoV-2原型，其VNT50相似：針對於臺灣獲得的武漢WT的329，與針對於美國之USA WA 1/2020的308（第15圖）。相較於USA WA 1/2020變體，針對Alpha B.1.1.7與Delta B.1617.2的VNT50估計分別為122與222，代表減少了2.7倍與1.4倍。
在第57天，觀察到大量程度的抗Delta中和抗體。從跨年齡組的疫苗接種者中隨機選擇48份血清樣本池（n = 39對於18-65歲的年輕成年人；n = 9對於≥65歲的年長成年人）在兩個獨立實驗室接受了特設活病毒檢測分析(ad hoc live virus assay analysis)（中央研究院與加利福尼亞病毒與立克次體病部）。結果是一致的，顯示免疫血清可以中和兩個關鍵的SARS-CoV-2原型，其VNT50相似：針對於臺灣獲得的武漢WT的329，與針對於美國之USA WA 1/2020的308（第15圖）。相較於USA WA 1/2020變體，針對Alpha B.1.1.7與Delta B.1617.2的VNT50估計分別為 122與222，代表減少了2.7倍與1.4倍。
d. 針對結合至 ACE2 受體之 S1-RBD 的中和抗體
i. 第 1 期臨床試驗主要 2 劑與追加第三劑系列
針對 S1-RBD:ACE2相互作用的功能性抑制（中和）的 ELISA 結果（第16圖）與VNT50數據（第11圖）基本一致。100-μg劑量組表現出最高的中和力價（第16C圖），在第112天抗S1-RBD:ACE2定量中和抗體(qNeuAb)程度為6.4 μg/mL，相較於來自20人類恢復期血清(HCS)之1.4 μg/mL增加了4.6倍。追加接種後，抗 S1-RBD:ACE2 qNeuAb程度達到303至521 μg/mL，代表比主要系列疫苗接種後的峰值增加77至168倍；類似地，與追加前程度相比，觀察到顯著的82至579倍增加（第16A-16C圖）。因此，UB-612追加劑可以在接種對像中引發顯著的免疫反應，無論它們的增強前水平有多低。
ELISA上S1-RBD:ACE2結合的中和與VNT50的研究結果有很好的相關性(Spearman’s r = 0.9012)（第16D圖）因此通過細胞病變效應(CPE)測定證實了抗WT VNT50結果的有效性（第16A-16C圖）。此外，追加後抗S1-RBD:ACE2 qNeuAb程度為303至521 μg/mL（第16A-16C圖），比人類恢復期血清 (HCS) 高216至372倍。這顯示相較於在病毒S1-RBD與ACE2受體相互作用的正構(orthosteric)(RBD)位點，HCS中的大多數抗體似乎更多地與變構(allosteric)位點（S1的N或C-末端結構域）結合。
e. S1-RBD IgG 抗體 ELISA 反應
i. 第 1 期臨床試驗
藉由ELISA測量的S1-RBD結合抗體（第17圖）再次顯示，100-μg接種組在196天的主要系列中引發了最高的免疫反應，第42天的GMT為2,240，其遠遠超過了來自20位人類恢復期血清(HCS)之141的GMT。接種追加疫苗後，三個劑量組中之抗S1-RBD GMT於7,154 至 9,863達到峰值（比主要系列期間的峰值增加 3 至 28 倍(GMFIs)）；同樣，與追加前程度相比，觀察到了37至378倍的顯著增長。
f. ELISpot 之 T 細胞反應
i. 第 1 期臨床試驗
在1期試驗的主要疫苗接種系列中，從接種者收集周邊血液單核細胞(PBMC)以藉由干擾素-γ+ (IFN-γ+)-ELISpot進行評估（第18A-18C圖）。在100-μg劑量組中觀察到最高的抗原專一性反應：在第35天，以S1-RBD+Th/CTL胜肽池刺激後有254個斑點形成單位(SFU)/106個PBMC，以Th/CTL胜肽池單獨刺激後有173個（第18C圖），證明 UB-612 疫苗中的 Th/CTL胜肽主要負責T細胞反應。
在第196天，100-μg劑量組的IFN-γ+ ELISpot 反應維持在峰值反應的~50%程度，以RBD+Th/CTL胜肽池重新刺激從254個SFU/10 6個細胞減少到121個SFU/10 6個細胞，或僅以 Th/CTL胜肽池重新刺激從173減少到86.8個SFU/10 6個細胞。這一觀察表明，UB-612疫苗在兩劑疫苗後引起的T細胞反應至少持續了6個月。這與前面提到的中和抗體的持久性是一致的（第11C圖）。
ii. 第 2 期臨床試驗
在第2期臨床試驗中，也觀察到第57天強的IFN-γ+-ELISpot反應：幾何平均值，以S1-RBD+Th/CTL重新刺激為370個（SFU/106個細胞），以Th/CTL重新刺激為322個，以Th/CTL胜肽池無UBITh1a為181個（第18D圖），其皆遠高於安慰劑組的對應物（p＜0.0001）。與IFN-γ相比，IL-4的反應要低得多：分別為13.6、7.5與5.4（第18E圖）。整體ELISpot結果指出，Th/CTL胜肽之內含物是T細胞反應必不可少的且主要負責，而重組蛋白 S1-RBD僅起次要作用。重要的是，T細胞反應的方向主要是 Th1 導向的。UBITh1a像往常一樣起著催化劑的作用，藉由病毒專一性的Th/CTL胜肽池觸發Th1反應。
g. 細胞內細胞因子染色 (ICS) 的 CD4+ 與 CD8+ T 細胞反應
i. 第 2 期臨床試驗
T細胞反應藉由細胞內細胞因子染色(ICS)被評估（第19圖）。跨三個胜肽再刺激組觀察到IFN-γ與IL-2產生之CD4+ 與CD8+細胞顯著增加；並且，與 ELISpot 的發現一致（第18D-18E圖），檢測到較低的IL-4產生之 CD4+ T 細胞，證實了T細胞反應的Th1優勢。
在分別以S1-RBD+Th/CTL、Th/CTL與Th /CTL池無UBITh1a再刺激後，觀察到表現細胞毒性標誌物CD107a與顆粒酶B的CD8+ T細胞，佔循環CD8+ T細胞的3.5%、2.1%與1.8%。總體而言，UB-612 引發了具有強大CD8+ 細胞毒性T細胞反應的 Th1導向免疫，其將有利於病毒感染的清除，並且再刺激結果指出 包括非棘核衣殼(nucleocapsid)(N)與膜(M)結構蛋白之Th/CTL胜肽，是負責T細胞免疫的主要因素。
3. 結論
並未記錄到與疫苗相關的嚴重不良事件(SAE)。最常見的所引發之 AE為注射部位疼痛與疲勞，大多是輕微與短暫的。在這兩項試驗中，UB-612引發了類似於一組之人類恢復期血清之分別的中和抗體力價。最引人注目的發現是：針對包括 Delta與Omicron的SARS-CoV2 VoCs的持久病毒中和抗體與廣泛的T細胞免疫，以及針對Delta與Omicron變體具有高交叉反應中和力價之強的追加記憶免疫。
UB-612 具有良好的安全性圖譜、針對VoC的有效追加作用以及持久的B與廣泛的T細胞免疫，值得進一步開發其他COVID-19疫苗的主要免疫與異源追加。
特別值得注意的是，5個精確設計的T細胞抗原決定位胜肽代表了來自N、M與S2蛋白的沙比克病毒(Sarbecovirus)區域的Th與CTL抗原決定位胜肽。這些抗原決定位胜肽跨包括Delta與Omicron的所有關切變體為高度保守，並且是混雜的抗原決定位，其允許在廣泛的群體中誘導記憶回憶、T細胞啟動和效應子功能。因此，除了關於UB-612之追加第3劑之有效的抗Delta與抗Omicron作用外，持久而強大的T細胞免疫可針對包括Omicron的所有VoC有效。由於目前批准的COVID疫苗無法識別非棘結構M與N蛋白，UB-612疫苗具有良好的立場來抵禦新的關切變體，如Delta與Omicron，其需要大規模的田野試驗進行評估。
實施例 9
UB-612 第 2 期臨床試驗追加劑接種相較於僅有 “ 棘 (Spike)” 的 COVID 疫苗可以更好地保護避免 Omicron 感染
與實施例8中顯示的針對Delta和Omicron BA.1變體的第1期臨床試驗追加劑的結果一樣，第2期臨床試驗追加劑的結果肯定了UB-612可以作為一種通用的（泛沙比克病毒）疫苗，以保護抵抗Omicron變體與其他不斷出現的新變體。
除了棘S1-RBD（受限的 ACE2 受體結合域）作為刺激B 細胞（持久中和抗體）的免疫原之外，UB-612在棘S2與非棘（核衣殼N與膜M）結構蛋白上富含5個保守序列、混雜的 Th/CTL抗原決定位，用於促進更全面的 T 細胞（輔助與細胞毒性）記憶免疫。
由於疫苗設計的獨特性，UB-612與輝瑞BNT及莫德納疫苗一起被列入白宮次世代COVID-19疫苗高峰會7月26日的議程，以展示先鋒疫苗平台。UB-612追加疫苗接種可以引發有效、廣泛識別與持久的B 細胞（中和抗體）與T 細胞（輔助與細胞毒性）記憶免疫，其可以模擬以任何SARS-CoV-2變體的感染。
1. UB-612 疫苗與採用其他平台技術並僅使用 “ 棘 ” 蛋白作為免疫原的 COVID 疫苗的比較
最近在英國、美國和台灣批准使用mRNA二價疫苗（莫德納與輝瑞）作為第四劑（第二次追加劑）引起了關注與懷疑。 因此，在對使用即將到來的進口二價mRNA疫苗的關切中，目前是對比當前疫苗在對抗Omicron變體的病毒中和抗體之程度與T 細胞免疫強度方面的表現的時候。
a. 偽病毒中和活性
在對未感染者使用每種疫苗進行追加劑注射（第三劑，同源追加）後，藉由“ 偽病毒中和試驗”測量針對BA.1/BA.2/BA.5變體的UB-612 免疫血清（50%幾何平均 GMT，即pVNT50/ID50力價）顯示高於莫德納(mRNA-1273)、輝瑞 (BNT162b2)與NVX-CoV2373；並遠高於MVC-COV1901、AZD1222、CoronaVac與BBIBIP 疫苗（表 12）。以傳染性最強的BA.5 pVNT50為例，中和力價被報導為，UB-612為854，NVX-CoV2373為582，莫德納mRNA-1273為378，輝瑞 BNT162b2為360，CoronaVac為75，AZD1222為43。這些數據表明，UB-612疫苗實現了協同B細胞與T細胞免疫的設計理念，並且第三劑（第一追加劑）已經能夠基本上中和Omicron BA.5 變體，其為台灣目前面臨的一種強大的、占主導地位的SARS-CoV-2變體。UB-612追加劑表現優於AZ疫苗。
重要需要注意的是，偽病毒檢測是建立在一種僅冠上棘蛋白之人工（偽）病毒上，而活病毒的臨床分離物是在病毒主體上含有棘蛋白與非棘蛋白的實際分離物。目前所有使用僅棘免疫原設計的許可疫苗皆無法識別病毒的非棘蛋白的本體結構。
非棘蛋白也在病毒進化的過程中發生突變（表 13），當前的僅有棘(Spike-only)疫苗產生的抗體既不能歸巢，也不能誘導 B與T細胞記憶免疫以識別非棘蛋白。因此，對於那些僅有棘蛋白的疫苗，偽病毒與活病毒測定之間會出現數據不一致，除非疫苗抗原被設計為同時考慮棘蛋白與非棘蛋白兩者。不一致在下面得到驗證。
b. 活病毒中和活性
在向未感染者接種每種疫苗（第三劑，同源加強）追加劑注射後，藉由“ 活病毒中和試驗”（50%幾何平均 GMT，即VNT50/FRNT50力價）對UB-612（值為670）顯示出比其他疫苗（值為46至106）（mRNA-1273、BNT162b2與AZD1222疫苗）更高的GMT效力，代表6至12倍更高的力價強度（表 13）。
對比活病毒與人工偽病毒中和試驗方法（表12與13），只有UB-612疫苗呈現出方法間的一致性，而且UB-612的病毒中和強度在任何一種病毒試驗方法中都優於所有其他EUL上市疫苗。
這些品牌疫苗的偽病毒與活病毒檢測之間存在資料差異。注意，以抗BA.1 pVNT50為例（表13），UB-612（值為1,196-2,325）與mRNA-1273/BNT162b2（值為945-1,116）之間的pVNT 50（假病毒中和試驗）差距是小的；而抗BA.1 VNT50的活病毒試驗差距更大，大約相差6-12倍（表12）。
2. UB-612 卓越的病毒中和活性背後
UB-612在偽病毒與活病毒中和強度方面優於其他疫苗可歸因於其識別棘蛋白與非棘蛋白上的靶標（S2、M與N蛋白上的保守和混雜的 Th/CTL抗原決定位），產生引人注目的、廣泛認可的全面T細胞免疫記憶，其加強針對BA1、BA.2至 BA.5 的交叉中和抗體之協同反應的B細胞免疫反應與T細胞免疫。
品牌疫苗的追加劑疫苗接種（第三劑）已經暴露了它們在對抗BA.1活病毒方面的弱點，更不用說對抗BA.2與BA.5。從目前的mRNA疫苗很難在追加劑後產生＞100的VNT 50峰值力價來對抗BA.1活病毒來看，可以預測疫苗在中和BA.2與BA.5活病毒方面會進一步減弱。
3. 棘蛋白與非棘蛋白上的突變位點
除了棘蛋白上的30多個突變外，如表14所示，BA.1、BA.2與BA.5變體的非棘蛋白（E、M與N）上也有突變位點，這些突變位點是僅有棘之疫苗無法識別的，即它們對於促進更充分的T細胞免疫具有內在的不足。而且，相比之下，藉由針對棘蛋白中較小的S1-RBD蛋白片段和設計的具有保守與混雜之T抗原決定位的T免疫原，UB-612誘導的免疫會比其他疫苗遇到更少的病毒突變體抵抗，從而使Omicron逃避的可能性降低，因為UB-612疫苗誘導的免疫可以表現得更接近感染誘導的免疫的氣息。
上述觀察結果也顯示：1）在比較不同疫苗平臺的病毒中和效力時，只有活病毒試驗檢測是真正可靠的；2）人工偽病毒檢測有利於在那些專注於棘(Spike-focused)的疫苗中進行比較。
4. 一種潛在的泛沙巴克病毒疫苗
特別值得注意的是，套膜（E）、膜（M）與核衣殼（N）等非棘結構蛋白，關鍵性地參與了宿主細胞干擾素反應與T細胞記憶的誘導。因此，UB-612疫苗所喚起的深刻的T細胞記憶免疫力在長期控制SARS-CoV-2感染方面可以發揮關鍵作用。因此，UB-612作為追加劑可能會使感染者在防止再感染上有最大的潛在受益。
與其他使用棘（S）蛋白作為唯一的B與T免疫原的疫苗不同，UB-612的組成包括免疫原S1-RBD以觸發B細胞產生中和抗體，以及五個保守的、不可變的混雜抗原決定位（S2x3，N與M蛋白）作為T免疫原（表15）。獨特、合理的疫苗設計使UB-612有可能成為一種泛沙巴甲病毒疫苗。
5. 防止免疫逃逸之強大的 T 细胞免疫力 .
由於疫苗能夠對保守的、不可變異的抗原決定位產生強烈的T細胞免疫反應，因此能夠防止免疫逃逸。研究不同形式的疫苗所產生的T細胞免疫反應是非常有意義的。如下所述，UB-612作為加強劑（第三劑，同源追加），引起的T細胞免疫程度（SFU/10 6個PBMC細胞）遠遠高於mRNA疫苗（BNT162b2）或腺病毒DNA疫苗（ChAdOx1或AZD1222）。
在追加劑前/追加劑後的SFU單位，分別為3個劑量的ChAd/ChAd/ChAd為38/45，3個劑量的BNT/BNT/BNT為28/82，低於第2期臨床試驗延長研究中觀察到的UB-612追加劑的261/374 SFU。這些結果與UB-612具有較強的抗BA.1活病毒中和力價，而BNT162b2與ADZ1222的力價較弱的事實相一致（表13）。一般來說，已知強大的T細胞免疫力對於保護人們抵抗嚴重疾病的侵害和疫苗的長期成功也是至關重要的。
6. UB-612 疫苗針對感染的有效性
雖然現實世界中疫苗對感染的有效程度尚不清楚，但UB-612對ACE2:RBDWT相互作用的強烈阻斷與病毒中和VNT 50（活病毒WT與Delta）與pVNT 50（偽病毒BA.1）之間的正功能關聯，推斷出對COVID-19的臨床療效很可觀。事實上，利用S蛋白結合活性和中和抗體的模型，預測UB-612的2劑主要免疫對武漢/ Delta的臨床療效為70-80%，而追加疫苗接種可能導致對由祖先武漢/ Delta或Omicron株引起的有症狀的COVID-19的療效為95%。
7. UB-612 在臺灣與美國進行中的有效性調查
應該指出的是，在1480名接受了兩或三劑UB-612疫苗的受試者中（臺灣的第2期臨床試驗），截至今年3月所設計的第2期臨床試驗研究結束時，沒有發生感染病例的報告。
此外，在今年5月台灣內Omicron感染迅速升級之際，正在對第2期臨床試驗的受試者進行電話採訪，以及在台灣空前的暴發期間，接受兩劑或三劑針對Omicrons的UB-612疫苗的受試者的初始疫苗保護效果估計大於 95%（該試驗正在進行中）。
此外，保護包括主要Omicron B5的循環亞變體感染的第3期臨床試驗療效將等待正在進行的第3期臨床試驗的結果，該試驗將 UB-612與批准疫苗在同源與異源追加下進行比較 [ClinicalTrials.gov ID: NCT05293665]。
使用mRNA二價疫苗作為第四劑。目前，作為第四劑（第二次追加針）的莫德納二價疫苗mRNA-1273.214（原棘加Omicron BA.1棘）最近獲得了緊急使用批准(Emergency Use Authorization)。據報導，針對BA.5的偽病毒中和力價（pVNT50）為727，比原mRNA-1273疫苗（第四劑）高50-60%，比第三劑mRNA-1273疫苗高90%（表12）；均未超過2倍。此pVNT50的小幅增加已被證明不會導致疫苗效力的提高。另一種含有BA.5的二價疫苗也在9月6日獲得了緊急使用授權；該批准僅基於一項8隻小鼠的研究。
遺憾的是，莫德納並未在6月28日的美國FDA審查會議上提交關鍵的 "活病毒中和效力 "資料。目前，只有抗BA.1活病毒的VNT 50資料，據報導，第三劑後原mRNA-1273的VNT 50為81.0（表13）；而二價疫苗mRNA-1273.214第四劑後的抗BA.5活病毒的VNT 50可能更低。
根據表12資料對抗偽病毒pVNT50的總體估計，相對於抗BA.1/抗BA.2，對BA.1的中和效力是1.3倍；對BA.5的中和效力是2-3倍以內。若不戴口罩，不經常洗手，不與社會保持適當的距離，很有可能被Omicron BA.5變體再次感染或突破性感染。雖然需要進行全面的疫苗接種與追加針，以防止感染，但問題仍為人們是否能正確掌握疫苗與劑量方案。
8. 預防遠程 COVID 的潛在好處
最後，無論疫苗接種狀態或混合免疫如何，每次再感染都會增加死亡、住院與其他健康危害的風險，包括長期 COVID 的負擔，而目前批准的疫苗免疫對緩解長期 COVID 的益處有限。
由於發現遠程COVID與產生IFNγ的CD8+T細胞的下降有關，因此，在預防遠程COVID方面，希望有一個能夠引起強大而持久的T細胞免疫力以清除殘留的全身性感染（持續的病毒庫）的疫苗平臺，對此，UB-612可能發揮正向作用。
實施例 10
預防與治療 SARS-CoV2 感染，清除病毒感染並治療遠程 COVID 之泛沙比科 (Pan-Sarbeco) 疫苗的開發
SARS-CoV-2 Omicron株系從最初的武漢株系開始，以快速連續的優勢亞變體，從BA.1、BA.2到目前的BA.4/BA.5，占SARS感染病例的90%以上，在傳播性和中和抗體逃逸方面具有壓倒性優勢，席捲全球。
Omicron BA.1從原SARS-CoV-2武漢株發生了嚴重的變異，包括於S蛋白中之大於35個的胺基酸變化。與2個與 S-1受體結合域（S1-RBD，殘基319-541）的Delta相關的突變相比，BA.1與BA.2共有12個突變，BA.1與BA.2各有3個與4個獨特的，其分別賦予BA.2更高的免疫逃避能力。BA.4與BA.5具有相同的棘蛋白。它們與BA.2的不同之處在於在69-70del、L452R、F486V與野生型胺基酸在棘蛋白內的Q493位處具有額外的突變（表14），這有助於它們比BA.2更高程度的免疫逃逸。BA.2表現出比BA.1高1.3至1.5倍的傳播率與1.3倍的免疫逃避，這與BA.1免疫血清中和BA.2的結果一致，其力價較低，達1.3至1.4 倍，BA.2再感染可能發生在BA.1之後。BA.4/BA.5更具傳播性，對BA.1/BA.2免疫與單株抗體更具有抗性。
此外，在 UB-612疫苗接種者進行追加注射後，免疫血清中和活武漢病毒的能力仍然較低，其力價降低（50% 幾何平均 GMT，即 VNT 50/FRNT 50力價）在10至50倍範圍內（GMFR= ~10至50），如表13所示，這未達到開發泛沙比科疫苗的目標。
強烈提倡開發成分更新（變種專一性）疫苗，以滿足這一迫切需要，以防止個人感染 SARS-CoV-2 Omicron BA.4/BA.5以控制爆發並減少由此產生的痛苦 ，包括遠程 COVID 與死亡。
根據如表15、19及20所示之疫苗組成物所製備之所揭露高精確度設計者疫苗（例如UB-612、UniCoVac-2、UniCoVac-3），與採用滅活病毒裂解液或其他特徵較少的免疫原的免疫原含量較複雜的疫苗的弱或不適當的抗體呈現相比，具有產生高度特異性免疫反應的優勢。此外，在COVID-19疫苗開發中存在與稱為抗體依賴性增強(ADE)的機制相關的潛在缺陷。具體而言，ADE 是一種現象，其中病毒與非中和抗體的結合會增強其進入宿主細胞，有時還會增強其複製。此機制導致傳染性與毒力兩者增加，並已在蚊媒黃病毒、HIV與冠狀病毒中觀察到。所揭露的高精確度疫苗組成物，僅採用S1-RBD-sFc蛋白作為B細胞免疫原，被設計以通過監測抗體反應的品質與和數量來避免疫苗相關疾病增強(vaccine-induced disease enhancement)，因為它們將決定功能結果。
除了UB-612與其他使用不同平臺的COVID疫苗相比，採用 "棘"蛋白作為疫苗目標的優勢外，正如在實例9中廣泛討論的那樣，我們的單價UniCoVac 2和二價UniCoVac 3將具有變體特異性（Omicron BA.4/BA.5）成分更新疫苗的額外優勢，滿足COVID疫苗的緊急需求。UniCoVac 2將通過提供高度互補的S1-RBD-Omicron BA.4/BA.5變體專一性sFc來補充現有的 UB-612單價疫苗，該疫苗採用原始株WuHan序列衍生的S1-RBD WuHan-sFc蛋白作為B細胞免疫原作為B細胞免疫原，從而誘導出能有效中和目前流行的BA.4/BA.5變體的中和抗體。
根據表20製備的組合疫苗使用S1-RBD武漢-sFc（序列識別號：49）與S1-RBD Omicron-BA.4/BA.5-sFc蛋白（序列識別號：53）作為B細胞免疫原將允許產生針對SARS-CoV2的廣譜(broad spectrum)之RBD的互補中和抗體。如此廣泛的中和抗體，加上保守的T細胞免疫所提供的長效免疫記憶，通過加入SARS-CoV Th/CTL胜肽（序列識別號：27、9、34、2、35）與理想化的人工Th胜肽（序列識別號：36）作為T細胞啟動的催化劑，可以開發出最理想的泛沙巴科病毒疫苗組成物，該組成物 (1)由於疫苗平臺的高精確度與次單位性質而具有安全性；(2)可以促進激發與CHO表現的S1-RBD-sFc蛋白結合的抗體，覆蓋從原始武漢株到最新的Omicron BA4./BA.5株，並在細胞介導的中和試驗中中和病毒介導的細胞病理學效應；(3)可以產生Th1傾向的T細胞免疫力，在粘膜接觸後啟動產生IFN-γ的Th細胞，立即抵禦入侵的SARS-CoV-2變體；(4)可以產生病毒抗原（M．M與S2）專一性的CD8+細胞溶解細胞來清除病毒感染的細胞；以及(5) 由於遠遠增強了免疫記憶的記憶力而提供持久的免疫力，以達到理想的泛沙巴科病毒疫苗的最終目標，防止個人感染SARS-CoV-2 Omicron BA.4 /BA.5，控制SARS-COV2的暴發，並減少由此帶來的痛苦，包括遠程COVID與死亡。
實施例 11
一種預防 SARS-CoV-2 感染的多抗原決定位蛋白 / 胜肽疫苗組合物
以天竺鼠進行初步免疫原性評估確定RBD蛋白的體液免疫原性，並允許選擇 S1-RBD-sFc（序列識別號：49）作為針對 SARS-CoV-2疫苗的主要免疫原性B細胞成分。
T 細胞抗原決定位的存在對於誘導針對病毒抗原的B細胞記憶反應很重要。SARS-CoV-2 CTL和Th抗原決定位，經MHC結合和T細胞功能測定驗證，SARS-CoV-2和SARS-CoV-1(2003)病毒之間具序列保守，用於設計針對COVID-19的高精準SARS-CoV-2 疫苗。
使用MHC結合測定法確定SARS-CoV-1 (2003)上的T細胞表位，用於通過序列比對確定SARS-CoV-2 (2019)中相應的T細胞抗原決定位。以類似方式鑑定己知高精準設計型SARS-CoV-2 疫苗的設計中併入的CTL抗原決定位。包含Th和CTL抗原決定位的SARS-CoV-2疫苗設計已透過MHC II類結合和T細胞刺激得到驗證。由於透過先前感染或初次疫苗接種獲得適當程度預先存在的記憶 T 細胞免疫對於控制SARS-CoV-2再感染和突破性感染非常重要，因此加入UB-612多重表位疫苗中源自SARS病毒膜 (M)、核衣殼 (N) 和刺突 S2 蛋白（表 10）的高度保守區域的抗原決定位胜肽的選定的Th/CTL在結構上受到突變的限制，且從COVID疾病中康復的個體確認，無論關切變體(VoCs)為何，這樣的全球性T疫苗可抵禦SARS-CoV-2感染的細胞。用於預防SARS-CoV-2感染的特定多抗原決定位蛋白/胜肽疫苗組合物，含有20 µg/mL、40ug/mL、60 µg/mL和200 µg/mL(S1-RBD-sFc融合蛋白（例如武漢和/或 Omicron 菌株）和 Th/CTL 肽的合併重量），如表 15、19 及20所述。由於基於本發明的T細胞疫苗也可以獨立配製用於與其他B免疫原導向疫苗共同注射，因此它們的代表性製劑也顯示為廣譜(Global) T1-T4疫苗（僅具有 Th/CTL胜肽），其製劑僅具有10ug/mL、25ug/mL或50ug/mL的Th/CTL抗原決定位胜肽，如表21-24中所示實施例。
1. 大鼠免疫原性研究
在大鼠中進行的一組實驗中，將專有的Th/CTL胜肽混合物添加到S1-RBD-sFc融合蛋白中，以進一步評估最佳配方和佐劑以及疫苗的細胞免疫成分的建立。這些疫苗組合物進行下列研究。
a. 大鼠體液免疫原性試驗
在大鼠中進行的實驗中，評估不同劑量的免疫原和佐劑，以根據S1-RBD結合抗體力價與平衡的Th1/Th2反應選擇最佳佐劑。
將含有S1-RBD-sFc蛋白和Th/CTL胜肽的疫苗組合物與佐劑系統組合。這些疫苗-佐劑組合在 0 WPI（初始）和 2 WPI（加強）上以每次注射10至300 μg的寬劑量範圍以IM對大鼠給藥。在 0、2（即，1劑後）、3 和 4 WPI（即，第2劑後1和2週）取動物血液進行抗體力價分析。
於所有時間點的結合抗體(BAb)測試結果顯示，用2種佐劑系統配製的疫苗在10到300 µg所有劑量範圍內都引發了相似程度的抗S1-RBD ELISA力價，顯示即使僅含有少量的基本蛋白免疫原，疫苗製劑也可有出色的免疫原性。
在 S1-RBD:ACE2 結合抑制的ELISA試驗中，最有效的抑制活性被視為進一步反復實驗以提高免疫原性的最佳候選製劑。在針對武漢SARS-CoV-2分離株的複製病毒中和試驗中，疫苗組合物誘導的4 WPI免疫血清可以在VNT50＞10,240稀釋倍下中和病毒感染。
b. 大鼠細胞免疫原性試驗
為了解決與Th1/Th2反應平衡的問題，使用 ELISpot 評估接種大鼠的細胞反應。
i. 大鼠 Th1/Th2 平衡研究程序
8-10週齡的雄性 Sprague Dawley 大鼠 (300-350 gm/BW) 購自 BioLASCO Taiwan Co., Ltd.。經過 3 天的馴化後，將動物隨機分為4組。所有動物程序均按照聯亞生技動物護理和使用委員會 (IACUC) 審查和批准的法規和指南進行。IACUC 編號為 AT-2028。大鼠在第0週（初免）和第2週（加強）用1 至100 μg的疫苗組合物的不同劑量進行肌肉內接種。在第 0、2、3和4週收集大鼠的免疫血清（每個劑量組 n = 3）用於評估抗原性。在4 WPI收集脾細胞並在體外以2 μg/孔用Th/CTL胜肽庫合併 S1-RBD 或單獨的 Th/CTL 肽庫刺激。通過 ELISpot 分析確定分泌IFN-γ、IL-2 和 IL-4 的脾細胞。透過減去陰性對照孔計算每百萬個細胞的細胞因子分泌細胞 (SC)。
ii. 測量細胞反應的 ELISpot
收集4 WPI接種疫苗的大鼠的脾臟置於淋巴細胞條件培養基（LCM；補充有 10% FBS 和青黴素/鏈黴素的 RPMI-1640 培養基）中，並形成成單細胞懸浮液。在室溫 (RT) 下，將細胞沉澱重新懸浮於5 mL RBC裂解緩衝液中 3 分鐘，然後加入含有青黴素/鏈黴素的 RPMI-1640 培養基以停止反應。離心後，重新懸浮在 LCM 中的細胞沉澱以 ELISpot進行分析。使用大鼠 IFN-γELISpotPLUS 套組（MABTECH，貨號：3220-4APW）、大鼠 IL-4 T 細胞 ELISpot 套組（U-CyTech，貨號：CT081）和大鼠IL-2 ELISpot套組（R&D Systems，Cat. No.：XEL502）進行 ELISpot 分析。
預塗有捕獲抗體的 ELISpot盤在室溫下以LCM封阻至少 30 分鐘。 將 250,000 個大鼠脾細胞接種到每個孔洞中，並用 S1-RBD-His蛋白與Th/CTL胜肽庫、S1-RBD-His蛋白、Th/CTL胜肽庫或每個單一的Th/CTL胜肽刺激18-24小時37°C。在LCM中以每孔洞1 μg每種蛋白質/胜肽的最終濃度刺激細胞。斑點根據製造商的說明書生成。LCM和ConA分別用於陰性和陽性對照組。利用AID iSpot檢測儀分析和量化斑點。通過減去陰性對照組來計算每百萬個細胞的斑點形成單位(SFU)。
在脾細胞中觀察到IFN-γ分泌的劑量依賴性趨勢，而IL-4的分泌很少。結果顯示，疫苗組合物具有高免疫原性並誘導Th1的細胞免疫反應，如高比例的IFN-γ/IL-4或IL-2/IL-4。在Th/CTL胜肽庫存在下和以單個胜肽進行刺激時，也觀察到高比率的IL-2/IL-4，而幾乎沒有誘導 IL-4分泌。
2. 疫苗產品臨床試驗中代表性毒性研究的準備，表 15-20 和 21-24 顯示各疫苗產品的配方
為了進行臨床試驗，疫苗組合物在Sprague-Dawley大鼠中針對每種產品進行了符合 GLP 的重複劑量毒理學研究，具有如下所述的標准設計和程序。
a. 毒理試驗程序
根據第-1天（首次給藥前1天，首次給藥日定義為第1天）獲得的體重，將總共160隻大鼠（80隻/性別）隨機分為8組，其中120隻大鼠被分配到第1、2、3和4組（15/性別/組）進行毒性研究，40 隻大鼠被分配到第5、6、7 和 8 組（5/性別/組）進行衛星試驗(satellite study)。第1組和第5組以鹽水注射大鼠作為陰性對照，第2組和第6組用疫苗組合物安慰劑作為佐劑對照，第3組和第7組以及第4組和第8組的疫苗組合物劑量分別為100、300μg/動物。大鼠每兩週一次，連續2週多部位肌肉注射單側後肢肌肉（股四頭肌和腓腸肌，左側為第一劑，右側為第二劑），共2劑（ 第 1 天和第 15 天）。劑量體積為0.5 mL/動物。在研究期間進行臨床觀察（包括注射部位觀察）、體重、食物消耗、體溫、眼底鏡檢查、血液學、凝血、臨床化學、尿液分析、T淋巴細胞亞群、外周血單個核細胞（PBMCs）分泌IFN-γ的T淋巴細胞斑點數、細胞因子和免疫原性、中和抗體力價和 IgG2b/IgG1 比率分析。第 1 組至第 4 組中的前 10 隻動物/性別/組在給藥2週（第 18 天）後進行最終屍檢，其餘5隻動物/性別/組被指定在最後一次給藥後進行 4 週恢復後屍體剖檢(Recovery Necropsy) （第 44 天）。 對第1組至第4組的所有動物進行完整的屍檢，評估器官重量、進行宏觀和微觀檢查。
b. 臨床試驗中毒理試驗的準備
為了進行臨床試驗，疫苗組合物在Sprague-Dawley大鼠中進行了符合 GLP 的重複劑量毒理試驗。該研究包括300 ug的劑量，是臨床使用的最高劑量的3倍。雖然2次注射的時間表沒有超出臨床使用的預期，但根據WHO指南這是可以接受的。研究目的在於評估疫苗組合物的免疫原性。160隻大鼠被隨機分為8組（80隻雄性和80隻雌性），其中 40 隻大鼠被納入衛星免疫原性研究。低劑量組和高劑量組為分別接種100μg/動物(0.5mL)和300μg/動物(0.5mL)的疫苗組合物；對照組以相同劑量體積注射生理鹽水（0.9%生理鹽水）或佐劑（疫苗組合物安慰劑）。前 10 隻動物/性別/組在第2次WPI（第 18 天）給藥兩週後進行終末屍檢，其餘20隻動物/性別/組在4 WPI（第 44 天）在最後一次給藥後進行4週恢復後屍體剖檢(Recovery Necropsy)。在試驗條件下，大鼠在一個後肢肌肉（股四頭肌和腓腸肌，左側為第一劑，右側為第二劑）在多個部位進行肌肉注射，在 0 和 2 WPI（第 1 天和第 15 天），每2週一次，連續2週，總共2劑。
在第1週和第3週用疫苗組合物以高達 300 μg/動物的劑量進行治療，發現具有良好的耐受性，沒有全身性毒性跡象。在整個研究過程中都沒有發現與測試物品相關的死亡和垂死。在整個研究過程中，臨床觀察（包括注射部位觀察）中未發現與疫苗相關的異常。注射部位未發現紅斑或水腫，所有觀察時間點的 Draize 評分均為 0。同樣地，在體重、食物消耗、體溫、血液學、化學（除 AG 比率）、眼底鏡檢查或尿液分析方面未觀察到與疫苗相關的變化，並且在 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+ 以及CD3+CD4+/CD3+CD8的比值未發現統計學上意義的變化。觀察到纖維蛋白原、IFN-γ和 IL-6具有統計學上顯著增加，而白蛋白/球蛋白比率降低；這些結果與對疫苗的急性期反應一致，並且在恢復期結束時全部恢復正常。附睾、皮膚、肝臟、前列腺和乳腺的組織病理學檢查顯示炎症細胞浸潤很少，未發現損傷或異常。
在衛星組中測量疫苗組合物的免疫原性顯示，疫苗在2和4 WPI（間隔14天）接種兩劑100 μg/動物或300 μg/動物的動物中誘導大量抗 SARS-CoV-2 S1-RBD IgG（數據未顯示）。在2 WPI（第 15 天）進行追加後，S1-RBD 結合 IgG力價隨著時間上升，在 6 WPI（第 44 天），接種100 μg/動物和 300 μg/動物疫苗組合物的大鼠中分別達到約2.6 log 10和3.3 log 10。本研究中觀察到的結果與設計用於刺激免疫反應產生高力價抗體疫苗的預期一致。在分析 S1-RBD 特異性 IgG 亞類時，Th2相關亞類 IgG1 抗 SARS-CoV-2 S1-RBD 的模式和誘導程度與總IgG抗SARS-CoV-2 S1-RBD中觀察到的程度相當。在 6 WPI（第 43 天），接種疫苗組合物的大鼠中僅檢測到Th1相關亞類 IgG2b抗SARS-CoV-2 S1-RBD的輕微誘導。然而，透過 ELISA測量的血清細胞因子模式顯示Th1/Th2的平衡反應（數據未顯示）。一系列透過多面向設計的產品在進入臨床試驗前根據上述程序進行安全性測試，使下一代產品取得核可。
實施例 12
具有持久免疫力代表性的 UB-SARS-CoV-2 廣譜 (Global) T 疫苗在第 1/2 期臨床試驗中消除 SARS-CoV-2 變異感染細胞
由先前感染或初次接種而獲得的適當預先存在的記憶T細胞免疫對於控制SARS-CoV-2再感染和突破性感染至關重要，UB-612多重表位疫苗合併選定源自SARSr-CoV病毒膜(M)、核衣殼(N)和刺突S2蛋白高度保守區域的Th/CTL多胜肽抗原決定位（表 10），其在結構上受到突變的限制，並從COVID-19康復的個體所發現，顯示主要疫苗接種系列中預先存在的記憶 T 細胞免疫對於決定增強免疫的巨大潛力，以防止包括 Delta 在內的 VoCs 感染，尤其是 Omicron (B.1.1.529)突變的S蛋白難以被抗體交互中和。
此外，病毒特異性B體液和T細胞反應協同作用保護個體免受病毒感染。使用體液抗體反應作為保護性免疫的唯一指標缺乏對疫苗接種後免疫反應的充分理解，因為抗體反應維持的時間比病毒反應性T細胞短。
如實施例6所述，透過ELISpot和細胞內細胞因子染色檢測T細胞反應。結果表明，在第1期和2期臨床試驗中，UB-612 誘導由ELISpot所測得持久、穩健的 Th1 為主的 IFN-γ+-T 細胞反應，這證實精準設計的Th/CTL胜肽庫是重要，且主要負責T細胞反應，而更集中“S-1 RBD”功能區域，其主要作為B免疫原成分，缺乏Th/CTL抗原決定位。總體而言，在第1期臨床試驗主試驗、延長加強第三劑疫苗以及第2期臨床試驗主試驗的三項臨床試驗中，我們已證明UB-612疫苗接種（100 μg劑量組）可以同時誘導大量具長半衰期的病毒中和抗體以及持久的細胞免疫免疫。由於記憶B和T細胞在對感染的次級反應非常重要，因此成功的疫苗必須產生並維持免疫記憶，並在自然暴露或疫苗加強後迅速產生有效的體液和細胞反應。UB-612確實通過這些臨床研究證明以上疫苗設計特徵。
雖然中和抗體的程度與疫苗的保護效果密切相關，但病毒抗原大量活化CD4+和CD8+ T細胞對於更好的免疫持續時間和免疫記憶也非常重要。還發現早期誘導功能性SARS-CoV-2特異性T細胞對於快速清除病毒和改善疾病非常重要。因此，由代表性的病毒結構和非結構蛋白的Th/CTL胜肽所誘發的T細胞反應可增加評估感染控制的好處，因為病毒衍生胜肽可辨識異源性和COVID-19誘導的T細胞。
開發可誘導 CD4+/CD8+ T細胞對SARS-CoV-2蛋白質組中高度保守的抗原決定位產生反應的免疫原，這些抗原決定位在結構上受到突變的限制，在VoC和Sarbecovirus中是保守的，並從COVID-19康復個體中發現，大幅強化目前SARS-CoV-2疫苗因可逃避恢復期血漿和疫苗誘導的抗體反應的變體的緊急情況。
UB-612是第一個精準設計的多抗原決定位蛋白/胜肽次單位COVID疫苗，可活化B 細胞和 T 細胞免疫，其包含S1受體結合域(S1-RBD) - 在 CHO細胞中產生的單鏈Fc融合蛋白，合併5種設計的Th和CTL抗原決定位胜肽，其已知可與多個MHC I 和MHC II結合，由來自Sarbecovirus病毒刺突(S2)、核衣殼(N)和膜(M)蛋白保守區域作為輔助 T 細胞(Th)和細胞毒性 T 細胞(CTL)，以及由麻疹病毒融合(MVF)蛋白修飾的外在MHC II抗原決定位 (UBITh ®1a)，作為活化T細胞的催化劑（第 9A圖）。Th和CTL胜肽是混雜的抗原決定位，可以誘導免疫記憶回憶(memory recall)、T細胞活化和效用功能(effector function)。
基於實施例6中提到的ELISpot和ICS的結果，UB-SARS-CoV-2 廣譜(Global)T疫苗的結論如下所述。如表 10 所示，我們的 UB-SARS-CoV-2 全球 T 疫苗系列（例如武漢、Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron）中設計的Th/CTL抗原決定位胜肽的胺基酸序列在所有的SARS-CoV-2 VOC中都高度保守。正如UB-612的第1期和第2期臨床試驗中所觀察到的結果，接受UB-SARS-CoV-2廣譜(Global)T疫苗的受試者可引起Th1誘導的免疫和強大的CD8+細胞毒性T細胞反應，有利於清除所有關切變體 (VoCs)的SARS-CoV-2，這是我們的多重SARS-COV-2疫苗系列與其他目前使用的SARS-CoV-2 疫苗（例如 mRNA、DNA、滅活病毒裂解物或SARS-CoV-2載體）相比前所未有的強大功能。
UB-廣譜(Global) T1至T4疫苗的具體配方如表 21-24所示，每劑0.1至0.5 mL，可與來自不同平台的任何其他SARS-COV-2疫苗共同使用，其中體液免疫反應更多是注重於檢測中和抗體，而忽略了最佳的T細胞反應。及時地提供最佳病毒T免疫原可使CD4+和CD8+T細胞大量活化，這對於更好的免疫持續時間和免疫記憶非常重要。還發現早期誘導功能性 SARS-CoV-2 特異性 T 細胞對於快速清除病毒和改善疾病也非常重要。如表10所示，SARS-CoV-2 Th/CTL胜肽和表21-24中的製劑可誘導CD4+/CD8+ T細胞對SARS-CoV-2蛋白質組中高度保守的抗原決定位的反應，這些抗原決定位序列在VOCs和Sarbecoviruses中保守一致，突變在結構上受到限制，且可從COVID-19疾病中康復的個體中發現，本發明製劑可極大地增強目前SARS-CoV-2疫苗因出現可逃避恢復期血漿和疫苗誘導抗體反應變體的緊急情況。
表格
表1. 來自 SARS-CoV-2 的膜醣蛋白M的胺基酸序列，以及在 N 端具有 KKK 間隔物用於疫苗設計的高度保守的 CTL抗原決定位(先前已通過 PBMC 結合和刺激測定驗證) 的胺基酸序列
SEQ ID NO 描述 序列
1 SARS-CoV-2 M蛋白 (YP_009724393.1) MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLV GLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ
2 KKK-SARS-CoV-2 M89-111 (CTL抗原決定位) KKK-GLMWLSYFIASFRLFARTRSMWS
3 KKK_SARS-CoV-2 M112-132 (CTL抗原決定位) KKK-FNPETNILLNVPLHGTILTRP
4 KKK-SARS-CoV-2 M133-156 (CTL抗原決定位) KKK-LLESELVIGAVILRGHLRIAGHHL
5 KKK-SARS-CoV-2 M101-156 (CTL抗原決定位) KKK-RLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGH LRIAGHHL (=5815)
表2. 來自SARS-CoV-2 的核衣殼磷蛋白N的胺基酸序列，以及在N端具有 KKK 間隔物用於疫苗設計的高度保守的 CTL和Th抗原決定位(先前已通過 PBMC 結合和刺激測定驗證) 的胺基酸序列
SEQ ID NO 敘述 序列
6 SARS-CoV-2 N蛋白 (YP_009724397.2) MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINT NSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFG RRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
7 KKK-SARS-CoV-2 N 78-88(CTL抗原決定位) KKK-NSSPDDQIGYY
8 KKK-SARS-CoV-2 N 277-318(CTL抗原決定位) KKK-RRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGM
9 KKK-SARS-CoV-2 N 305-331(Th /CTL抗原決定位) KKK-AQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL (=5754)
10 KKK-SARS-CoV-2 N 305-321(Th抗原決定位) KKK-AQFAPSASAFFGMSRIGM
11 KKK-SARS-CoV-2 N 316-324(CTL抗原決定位) KKK-GMSRIGMEV
12 KKK-SARS-CoV-2 N 322-331(CTL抗原決定位) KKK-MEVTPSGTWL
表3. 來自 SARS-CoV-2 的表面醣蛋白S的胺基酸序列，以及在 N 端具有 KKK 間隔物用於疫苗設計的高度保守的 CTL和Th抗原決定位(先前已通過 PBMC 結合和刺激測定驗證) 的胺基酸序列
SEQ ID NO 敘述 序列
13 SARS-CoV-2 S蛋白 (YP_009724390.1) MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFT RGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVE KGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPT KLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLS FELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTN TSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVT TEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLP PLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMA YRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNA QALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQ LIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQS KRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPRE GVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
14 KKK-SARS-CoV-2 S 34-47(CTL抗原決定位) KKK-RGVYYPDKVFRSSV
15 KKK-SARS-CoV-2 S 310-329(CTL抗原決定位) KKK-KGIYQTSNFRVQPTESIVRF (=RBD)
16 KKK-SARS-CoV-2 S 386-396(CTL抗原決定位) KKK-KLNDLCFTNVY          (=RBD)
17 KKK-SARS-CoV-2 S 515-524(CTL抗原決定位) KKK-FELLHAPATV           (=RBD)
18 KKK-SARS-CoV-2 S 604-620(CTL抗原決定位) KKK-TSNQVAVLYQDVNCTEV
19 KKK-SARS-CoV-2 S 724-741(CTL抗原決定位) KKK-TEILPVSMTKTSVDCTMY
20 KKK-SARS-CoV-2 S 863-877(CTL抗原決定位) KKK-PLLTDEMIAQYTSAL
21 KKK-SARS-CoV-2 S 904-911(CTL抗原決定位) KKK-YRFNGIGV
22 KKK-SARS-CoV-2 S 957-984(CTL/Th抗原決定位) KKK-QALNTLVKQLSS NFGAISSVLNDI LSRL (=5752)
23 KKK-SARS-CoV-2 S 957-984 (Omicron CTL/Th抗原決定位 ) KKK-QALNTLVKQLSS KFGAISSVLNDI FSRL (=5752 Omicron)
24 KKK-SARS-CoV-2 S 1012-1030(CTL抗原決定位) KKK-LIRAAEIRASANLAATK
25 KKK-SARS-CoV-2 S 1093-1102(CTL抗原決定位) KKK-RVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVF
26 KKK-SARS-CoV-2 S 1093-1102(CTL抗原決定位) KKK-GVFVSNGTHW
27 KKK-SARS-CoV-2 S 891-917(Th抗原決定位) KKK-GAALQIPFAMQMA YRFNGIGVTQNVLY (=5753)
28 KKK-SARS-CoV-2 S 902-917(Th抗原決定位) KKK-MA YRFNGIGVTQNVLY
29 KKK-SARS-CoV-2 S 957-973(Th抗原決定位) KKK-QALNTLVKQLSS NFGAI
30 KKK-SARS-COV-2-Omicron S 957-973(Th抗原決定位) KKK-QALNTLVKQLSS KFGAI
31 KKK-SARS-CoV-2 S 976-984(CTL抗原決定位) KKK-VLNDILSRL
32 KKK-SARS-CoV-2-Omicron S 976-984(CTL抗原決定位) KKK-VLNDI FSRL
33 KKK-SARS-CoV-2 S 996-1004(CTL抗原決定位) KKK-LITGRLQSL
34 KKK-SARS-CoV-2 S 996-1028 (CTL/Th抗原決定位) KKK-LITGRLQSLQTVVTQLIRAAEIRASANLAATK (=5755)
35 KKK-SARS-CoV-2 S 957-984(Omicron BA.2/BA.4/ BA.5 CTL/Th抗原決定位) KKK-QALNTLVKQLSS K FGAISSVLNDILSRL
表4. 用於SARS-CoV胜肽免疫原結構設計包括理想化人工Th抗原決定位之病原體蛋白衍生的Th抗原決定位的胺基酸序列
SEQ ID NO 敘述 序列
36 KKK-MvF5 Th (UBITh®1) KKK-ISITEIKGVIVHRIETILF
表5. 來自人類IgG1的野生型和突變樞紐區域
SEQ ID NO 敘述 序列
37 野生型IgG1 EPKSCDKTHTCPPCP
38 突變IgG1 EPKS XDKTHT XPP XP
39 突變IgG1 EPKS SDKTHT SPP SP
X：Ser、Gly、Thr、Ala、Val、Leu、Ile、Met及/或刪除 畫有底線的殘基代表與野生型 IgG 序列相關的突變位點
表6. 針對SARS-Co-V2關注變體((Beta、Delta和Omicron)之S1-RBD-sFc融合蛋白的胺基酸序列
40 NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL C FTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV C GPKKS S蛋白 RBD-武漢
41 NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL C FTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTG N IADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV K GFNCYFPLQSYGFQPT Y GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV C GPKKS S蛋白 RBD-Beta (B.1.351,南非)
42 nitnlcpf Devfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlyn La Pf Ftfkcygvsptklndl c ftnvyadsfvirgdevrqiapgqtg niadynyklpddftgcviawns nKldskv Sgnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqag NKpcNgv Agfncyfp lKsy Sf Rpt ygvg Hqpyrvvvlsfellhapatv c gpkks S蛋白 RBD-Omicron (B.1.1.529,南非)
43 NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL C FTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNY R YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS K PCNGVEGFNCYFP LQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV C GPKKS S蛋白 RBD-Delta (B.1.617.2,印度)
44 nitnlcpfDevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynFaPfFAfkcygvsptklndl cftnvyadsfvirgNevSqiapgqtgniadynyklpddftgcviawnsnKldskvGgnynyRyrlfrksnlkpferdisteiyqagNKpcNgvAgVncyfp lQsyGfRptygvgHqpyrvvvlsfellhapatv cgpkks S蛋白 RBD-Omicron BA.4/BA.5 (B.1.1.529.4/ B.1.1.529.5,南非)
45 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY N STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fc胜肽 (野生型)
46 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY H STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fc胜肽 突變醣基化位點 (N-＞H)
47 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY A STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fc胜肽 突變醣基化位點 (N-＞A)
48 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY X STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fc胜肽 突變醣基化位點 (N-＞X) X = N,H,A
49 NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL C FTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV C GPKKS EPKSSDKTHTSPPSP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY H STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG S-RBD-武漢 -sFc融合蛋白
50 NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL C FTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTG N IADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV K GFNCYFPLQSYGFQPT Y GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV C GPKKS EPKSSDKTHTSPPSP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY H STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG S-RBD-Beta-sFc融合蛋白
51 nitnlcpfDevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynLaPfFtfkcygvsptklndl c ftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniadynyklpddftgcviawnsnKldskvSgnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagNKpcNgvAgfncyfplKsySfRptygvgHqpyrvvvlsfellhapatv c gpkks EPKSSDKTHTSPPSP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY H STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG S-RBD-Omicron- (B.1.1.529) sFc融合蛋白
52 NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL C FTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNY R YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS K PCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV C GPKKS EPKSSDKTHTSPPSP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY H STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG S-RBD-Delta-sFc融合蛋白
53 nitnlcpfDevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynFaPfFAfkcygvsptklndl cftnvyadsfvirgNevSqiapgqtgniadynyklpddftgcviawnsnKldskvGgnynyRyrlfrksnlkpferdisteiyqagNKpcNgvAgVncyfplQsyGfRptygvgHqpyrvvvlsfellhapatv cgpkks EPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY H STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG S-RBD-Omicron BA.4/BA.5- sFc融合蛋白
表7. 針對SARS-Co-V2關注變體((Beta、Delta和Omicron)之S1-RBD-sFc融合蛋白的核酸序列
SEQ ID NO 序列 種類
54 AACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCCACCCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCC S蛋白RBD (武漢)
55 AACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGC AACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCCACCCCCTGCAACGGCGTG AAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACC TACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCC S蛋白RBD-Beta (B.1.351,南非)
56 AACATCACCAACCTGTGCCCCTTC GACGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAAC CTGGCC CCCTTC TTCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGC AACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAAC AAGCTGGACTCCAAGGTG TCCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGC AACAAGCCCTGCAACGGCGTG GCCGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTG AAGTCCTAC TCCTTC AGGCCCACC TACGGCGTGGGC CACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCC S蛋白RBD-Omicron (B.1.1.529,南非)
57 AACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTAC AGGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCC AAGCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCC S蛋白RBD-Delta (B.1.617.2,印度)
58 AACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGACGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTTCGCCCCCTTCTTCGCCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGGGGCAACGAGGTGTCGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAAGCTGGACTCCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACAGGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAACAAGCCCTGCAACGGCGTGGCCGGCGTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCAGGCCCACCTACGGCGTGGGCCACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCC S蛋白RBD-Omicron BA.4/BA.5 (B.1.1.529.4, B.1.1.529.5,南非)
59 GCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACCACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGC Fc胜肽 突變醣基化位點 (N-＞H)
60 AACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCCACCCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCC GAGCCCAAGTCCTCCGACAAGACCCACACCTCCCCCCCCTCCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC CAC TCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGC S-RBD-武漢 sFc融合蛋白
61 AACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGC AACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCCACCCCCTGCAACGGCGTG AAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACC TACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCC GAGCCCAAGTCCTCCGACAAGACCCACACCTCCCCCCCCTCCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC CAC TCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGC S-RBD-Beta-sFc融合蛋白
62 AACATCACCAACCTGTGCCCCTTC GACGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAAC CTGGCC CCCTTC TTCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGC AACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAAC AAGCTGGACTCCAAGGTG TCCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGC AACAAGCCCTGCAACGGCGTG GCCGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTG AAGTCCTAC TCCTTC AGGCCCACC TACGGCGTGGGC CACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCC GAGCCCAAGTCCTCCGACAAGACCCACACCTCCCCCCCCTCCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC CAC TCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGC S-RBD-Omicron (B.1.1.529)-sFc融合蛋白
63 AACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTAC AGGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCC AAGCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCC GAGCCCAAGTCCTCCGACAAGACCCACACCTCCCCCCCCTCCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC CAC TCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGC S-RBD-Delta-sFc融合蛋白
64 AACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGACGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTTCGCCCCCTTCTTCGCCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGGGGCAACGAGGTGTCGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAAGCTGGACTCCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACAGGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAACAAGCCCTGCAACGGCGTGGCCGGCGTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCAGGCCCACCTACGGCGTGGGCCACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCC GAGCCCAAGTCCTCCGACAAGACCCACACCTCCCCCCCCTCCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC CAC TCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGC S-RBD-Omicron BA.4/BA.5-sFc融合蛋白
表8. 用於高精確度SARS-CoV-2設計疫苗之包含具有已知MHC I/II 結合的SARS-CoV-2 Th/CTL抗原決定位的胜肽的選擇
位置 抗原決定位之類型 胺基酸序列 SEQ ID NO MHC I MHC II
S 957-984 Th/CTL KKK- QALNTLVKQLSSNFGAIS SVLNDILSRL    QALNTLVKQLSSNFGAI(HLA DRB1*04:01)                       SVLNDILSR(HLA-A*11:01; 43.38%覆蓋) 22 29 31 HLA-A*11:01 HLA-DRB1*04:01
S 891-917 Th KKK- GAALQIPFAMQMA YRFNGIGVTQNVLY         GAALQIPFAMQMAYRF(HLA-DRA*01:01; HLA-DRB1*07:01)                MA YRFNGIGVTQNVLY (HLA-DRB1*04:01) 27 28 HLA-DRA*01:01 HLA-DRB1*07:01 HLA-DRB1*04:01
N 305-331 Th/CTL KKK- AQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL    AQFAPSASAFFGMSRIGM(HLA-B*40:01)                      MEVTPSGTWL(HLA-B*40:01; 77.23%覆蓋) 9 10 12 HLA-B*40:01 II
S 996-1028 Th/CTL KKK- LITGRLQSLQTYVTQ QLIRAAEIRASANLAATK    LITGRLQSL(HLA-A2)                    QLIRAAEIRASANLAATK(HLA-DRB1*04:01)         RLQSLQTYV(HLA-A*02:01, 69.63%覆蓋) VQIDR LITGR(HLA-A*31:01; 80.62%覆蓋) 34 33 HLA-A2 HLA-A*02:01 HLA-A*31:01 HLA-DRB1*04:01
M 89-111 Th/CTL KKK- GLMWLSYF I ASFRLFARTRSMWS    GLMWLSYFI(HLA-A*02:01)對MHC I 100%覆蓋             IASFRLFARTRSMWS(MHC II)對MHC II 65%覆蓋 2 HLA-A*02:01 II
粗體: MHC I, 底線: MHC II
表9. 可選的異源性間隔物與CpG寡核苷酸的例子
SEQ ID NO 敘述 序列 / 組成
N/A 天然胺基酸 天然胺基酸包括： 丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、蛋胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸與纈胺酸
N/A 非天然胺基酸 非天然胺基酸包括，但不限於： ε-N離胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸、正亮胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、甲狀腺素、γ-胺基丁酸、高絲胺酸、瓜胺酸、胺基苯甲酸、6-胺基己酸(Aca; 6-胺基己酸)、羥脯胺酸、巰基丙酸(MPA)、3-硝基-酪胺酸、焦麩胺酸及其類似物。
N/A Gly-Gly -GG-
N/A Epsilon-N Lysine ε-K
65 Epsilon-N Lysine-KKK ε-K-KKK
66 KKK-Epsilon-N Lysine KKK- ε-K
67 CpG1 5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT TTg TCg TT 3' (完全硫代磷酸酯化)
68 CpG2 Phosphate TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT 3' (完全硫代磷酸酯化)
69 CpG3 5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT 3' (完全硫代磷酸酯化)
表10. 在針對 COVID 的 T 細胞疫苗中使用的在 SARS-CoV-2 關注變體 (VoCs)間位於膜(M)、核衣殼(N)和棘-2 (S2)蛋白保守的 Th/CTL抗原決定位
SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 34
M蛋白 KKK-SARS-CoV-2 M101-156CTL抗原決定位 N蛋白 KKK-SARS-CoV-2 N 305-331Th/CTL抗原決定位 S2蛋白 KKK-SARS-CoV-2 S 957-984(Th/CTL抗原決定位) S2蛋白 KKK-SARS-CoV-2 S 891-917(Th抗原決定位) S2蛋白 KKK-SARS-CoV-2 S 996-1028 (Th/CTL抗原決定位)
武漢 (原始) KKK- GLMWLSYFIASFRLFARTRSMWS KKK-AQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL KKK-QALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL KKK-GAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLY KKK-LITGRLQSLQTVVTQLIRAAEIRASANLAATK
Alpha (B1.1.7) 英國 KKK-GLMWLSYFIASFRLFARTRSMWS KKK-AQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL KKK-QALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL KKK-GAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLY KKK-LITGRLQSLQTVVTQLIRAAEIRASANLAATK
Beta (B.1.351) 南非 KKK- GLMWLSYFIASFRLFARTRSMWS KKK-AQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL KKK-QALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL KKK-GAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLY KKK-LITGRLQSLQTVVTQLIRAAEIRASANLAATK
Gamma (P.1) 巴西 KKK-GLMWLSYFIASFRLFARTRSMWS KKK-AQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL KKK-QALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL KKK-GAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLY KKK-LITGRLQSLQTVVTQLIRAAEIRASANLAATK
Delta (B.1.617.2) 印度 KKK-GLMWLSYFIASFRLFARTRSMWS KKK-AQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL KKK-QALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL KKK-GAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLY KKK-LITGRLQSLQTVVTQLIRAAEIRASANLAATK
Omicron (B.1.1.529) 波札那, 南非 KKK- GLMWLSYFIASFRLFARTRSMWS KKK-AQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL KKK-QALNTLVKQLSS K FGAISSVLNDI F SRL (SEQ ID NO: 23) KKK-GAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLY KKK-LITGRLQSLQTVVTQLIRAAEIRASANLAATK
Omicron c(BA.2/BA.4/ BA.5) KKK-GLMWLSYFIASFRLFARTRSMWS KKK-AQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL KKK-QALNTLVKQLSS K FGAISSVLNDILSRL (SEQ ID NO: 35) KKK-GAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLY KKK-LITGRLQSLQTVVTQLIRAAEIRASANLAATK
aT 細胞抗原決定位的存在對於誘導 B與T 細胞對病毒抗原的記憶反應至關重要。經HLA結合與T細胞功能測定驗證的SARS-CoV-2 CTL與Th抗原決定位在SARS-CoV-2與SARS-CoV-1病毒之間高度保守，僅在S 957-984中觀察到較小的變體間差異。武漢野生型胜肽（M、N與S2x3）用於精確設計針對COVID-19的UB-612 疫苗。使用HLA結合測定法確定SARS-CoV-1上的T細胞抗原決定位(2003)，其用於通過序列比對確定SARS-CoV-2中的相應T細胞抗原決定位(2019)。 b除了S2棘蛋白上S 957-984胜肽中的N969K（在BA.1至BA.5上）與L981F（在BA.1上），UB-612疫苗的其他四個設計抗原決定位胜肽都沒有與棘蛋白、M蛋白與N蛋白上報告的突變位點相重疊的aa殘基（表14）。 c在S957-984中，Omicron BA.1與 BA.2/BA.4/BA.5之間存在微小的序列差異，以粗體標記。
表11. 利用來自不同平台的疫苗對 SARS-CoV-2 野生型 (WT))和 Delta 變體的追加劑後病毒中和抗體效價的比較 縮寫：MNA = 微量中和試驗； PNA = 偽型病毒中和試驗；PRNT = 斑塊減少中和試驗；FRNT = 焦點減少中和測試；NA = 遺失值；GMT = 幾何平均效價；GMFI = 幾何平均倍數增加； GMFR = 幾何平均倍數減少；WT = 野生型病毒；以及Delta = SAR-CoV-2 WT 的 Delta 變體。 a在本報告中，報告了 NVX-CoV2373、mRNA-1273、BNT16b2、MVC-Cov1901、Corona Vac、ADZ1222 (ChAdOx1 nCov-19) 和 UB-612 疫苗於追加劑後的GMT。 b在追加劑第三劑後第 14 或 28 天測量的針對 WT 的 GMTs。 c針對 WT 於峰值/接受追加劑前的第二劑後的GMTs。 d針對 WT 於峰值/接受追加劑前的第二劑後的GMFIs。 e用於測定的 Delta 株的來源：MNA 和 FRNT/活臨床分離物：PNA/偽型病毒：PRNT/WT 利用 Delta 棘蛋白進行重組工程。 fGMFR，相對於抗 WT 效價於追加劑後抗 Delta 效價降低的倍數。
表12. 偽型病毒中和測定 (pVNT 50/ID 50)
疫苗 a (同源-追加劑) a 參與者(No.) NeuAb 測定(方法/單位) WT(GMT) b Omicrons BA.1/BA.2/BA.5(GMT) b WT/Omicrons BA.1/BA.2/BA.5(GMFR)
UB-612 (Ph-1) (n = 45) PNA/pVNT 50 12,778 2,325/ND/ND 5.5/ND/ND
UB-612 (Ph-2) c (n = 41) PNA/pVNT 50 6,254 1,196/985/ND 5.2/6.3/ND
UB-612 (Ph-2) c (n = 12) PNA/pVNT 50 11,167 2,314/1,890/854 4.8/5.9/13.0
BNT162b2 (n = 24) PNA/pVNT 50 6,539 1066/776/ND 6.1/8.4/ND
BNT162b2 (n = 19) PNA/pVNT 50 4,122 1,116/1,113/360 3.7/3.7/11.5
BNT162b2 (n = 27) PNA/ID 50 5783 900/829/275 6.4/7.0/21.0
NVX-CoV2373 (n = 48) PNA/ID 50 10,862 1,197/ND/582 9.1/ND/18.7
mRNA-1273 (n = 16) PNA/ID 50 4,679 945/780/378 5.0/5.9/12.4
MVC-COV1901 (n = 15) PNA/ID 50 1,280-640 160-80/ND/ND 8.7/ND/ND
CoronaVac (n = 40) PNA/pVNT 50 632 122/122/75 5.2/5.2/8.4
AZD1222 (n = 41) PNA/pVNT 50 516 89/76/43 5.8/6.8/12
BBIBIP-CorV (n = 75) PNA/pVNT 50 295 15/ND/ND 20.1/ND/ND
縮寫：PNA = 偽型病毒中和試驗；GMT = 幾何平均效價； GMFR = 相對於WT的幾何平均倍數減少；WT = SARS-CoV-2的野生型毒株；Omicrons = Omicron子變體 BA.1/BA.2/BA.5；ND = 未確認。 pVNT 50& ID 50=利用偽病毒測定的50% 中和GMT a報告了同源追加劑（第三劑）疫苗接種的疫苗。 b在追加第三劑後第14或28天測量的針對WT的GMTs。 cUB-612 - 當Omicron感染依次由 BA.2與BA.5子變體主導時，以子集參與者的血清進行偽病毒測定（2期追加延長研究）。
表13. 活病毒中和測定 (VNT 50/FRNT 50/ID 50)
疫苗 a (同源-追加劑) a 參與者(No.) NeuAb 分析(方法/單位) WT(GMT) b Omicrons BA.1/BA.2(GMT) b WT/Omicrons BA.1/BA.2(GMFR)
UB-612 (n = 15) MNA/VNT 50 6,159 670/485 9.2/12.7
mRNA-1273 (n = 20) FRNT/ID 50 1659 81.0/ND 20.5/ND
BNT162b2 (n = 20) FRNT/ID 50 640 46.2/ND 13.3/ND
BNT162b2 (n = 30) PRNT/VNT 50 673 106/ND 6.3/ND
AZD1222 (n = 41) FRNT/FRNT 50 723 57.0/ND 12.7/ND
縮寫：MNA = 微量中和測定；PRNT = 斑塊減少中和試驗； FRNT = 焦點減少中和測試；GMT = 幾何平均效價；GMFR = 相對於WT的幾何平均倍數減少；WT = SARS-CoV-2的野生型毒株；Omicrons = Omicron 子變體 BA.1/BA.2；ND = 未確認。pVNT 50& ID 50= 50%中和GMT，藉由活病毒檢測；VNT 50、ID 50與FRNT 50= 50%中和GMT，藉由活病毒檢測。 a報告了同源追加劑（第三劑）疫苗接種的疫苗。 b在追加第三劑後第14或28天測量的針對WT的GMTs。
表14. SARS-CoV-2 棘(S)蛋白以及非棘蛋白之包膜 (E)蛋白、膜(M)蛋白與核衣殼(N)蛋白上的突變位點
VoC b, 棘蛋白(位於319-541的S1-RBD殘基) E M N
Delta T19R, G142D, Δ156-157, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, & D950N T9I I82T D63G, R203M, & D377Y
Omicron (BA.1) A67V, Δ69-70, T95I, G142D, Δ143, Y144del, Δ145, Δ211, L212I, +214EPE, G339D, R346K, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H, T547K, D614G, H655Y, N679K, N764K, D796Y, N856K, and Q954H, L969K, & L981F T9I D3G, Q19E, & A63T P13L, Δ31-33, R203K, & G204R
Omicron (BA.2) T19I, L24S, Δ25-27, G142D, V213G, G339D, S371F, S373P, S375F, T,376A, D405N, R408S, K417N, N440K, S477N, T478K, E484A, Q493R , Q498R, N501Y, Y505H, D614G, H655Y, N679K, N764K, D796Y, N856K, Q954H, & L969K T9I Q19E& A63T P13L, Δ31-33, R203K, G204R, & S413R
Omicron (BA. 4) T19I, L24S, Δ25-27, Δ69-70, G142D, V213G, G339D, S371F, S373P, S375F, T,376A, D405N, R408S, K417N, N440K, L452R, S477N, T478K, E484A, L486V, Q493, Q498R, N501Y, Y505H, D614G, H655Y, N679K, N764K, D796Y, N856K, and Q954H, & L969K T9I Q19E& A63T P13L, Δ31-33, P151S, R203K, G204R, & S413R
Omicron (BA.5) T19I, L24S, Δ25-27, Δ69-70, G142D, V213G, G339D, S371F, S373P, S375F, T,376A, D405N, R408S, K417N, N440K, L452R, S477N, T478K, E484A, L486V, Q493, Q498R, N501Y, Y505H, D614G, H655Y, N679K, N764K, D796Y, N856K, and Q954H, & L969K T9I D3N, Q19E, & A63T P13L, Δ31-33, R203K, G204R, & S413R
a報告的位於棘、E、M與N蛋白的突變位點( 粗體)。 b Omicron BA.4與BA.5在棘蛋白上具有相同的突變位點譜，其與 BA.2的相關性高於 BA.1。在 BA.2、BA.4與BA.5中，在S、E、M與N蛋白上的突變位點的變體間差異用紅色標記。 c除了S2棘蛋白上S 957-984胜肽中的N969K（在BA.1至BA.5上）與L981F（在BA.1上），UB-612疫苗的其他四個設計抗原決定位胜肽都沒有與棘蛋白、M蛋白與N蛋白上的報告突變位點重疊的aa-殘基。
表15. UB-612 (武漢) 200 μg/mL之組成
描述 SEQ ID NO 單位 Q'ty/mL 功能 品質等級
S1-RBD-sFc (武漢) 49 176 μg B-免疫原 (GMP) 1
 Th/CTL胜肽 2 4 μg T-免疫原 (GMP) 1
9 4 μg
22 4 μg
27 4 μg
34 4 μg
36 4 μg
 CpG1 67 4 μg 佐劑 GMP
 ADJU-PHOS -- 1.6 mg 佐劑 GMP
 組胺酸 -- 4.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, JP, USP
 組胺酸HCl•H 2O -- 6.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP
 精胺酸HCl -- 50.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP, USP
 TWEEN 80 -- 0.06% (v/v) 界面活性劑/乳化劑 Ph Eur, JP, NF
 鹽酸 -- q.s. to pH 5.9~6.0 pH調整劑 Ph Eur, BP, JP, NF
 氯化鈉 -- 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
 2-苯氧乙醇 -- 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
注射用水(q.s.to) -- 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於2期與2/3期臨床試驗的材料將按照cGMP製造
表16. UB-613 (武漢) 40 μg/mL之組成
描述 SEQ ID NO 單位 Q'ty/mL 功能 等級
S1-RBD-sFc (武漢) 49 35.2 μg B- 免疫原 (GMP) 1
Th/CTL胜肽 2 0.8 μg T- 免疫原 (GMP) 1
9 0.8 μg
22 0.8 μg
27 0.8 μg
34 0.8 μg
36 0.8 μg
CpG1 67 120 μg 佐劑 (GMP) 1
鋁膠 -- 1.2 mg 佐劑 GMP
組胺酸 -- 4.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, JP, USP
組胺酸 HCl•H 2O -- 6.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP
精胺酸HCl -- 50.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP, USP
TWEEN 80 -- 0.06% (v/v) 界面活性劑/乳化劑 Ph Eur, JP, NF
鹽酸 -- q.s. to pH 5.9~6.0 pH調整劑 Ph Eur, BP, JP, NF
氯化鈉 -- 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
2-苯氧乙醇 -- 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
注射用水(q.s.to) -- 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於2期與2/3期臨床試驗的材料將按照cGMP製造
表17. UB-614 (Omicron B.1.1.529) 40 μg/mL之組成
描述 SEQ ID NO 單位 Q'ty/mL 功能 等級
S1-RBD-sFc (Omicron B.1.1.529) 51 35.2  μg B-免疫原 (GMP) 1
Th/CTL胜肽 2 0.8 μg T-免疫原 (GMP) 1
9 0.8 μg
22 0.8 μg
27 0.8 μg
34 0.8 μg
36 4.0 μg
CpG1 67 120 μg 佐劑 GMP
鋁膠 -- 1.2mg 佐劑 GMP
組胺酸 -- 4.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, JP, USP
組胺酸HCl•H 2O -- 6.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP
精胺酸HCl -- 50.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP, USP
TWEEN 80 -- 0.06% (v/v) 界面活性劑/乳化劑 Ph Eur, JP, NF
鹽酸 -- q.s. to pH 5.9~6.0 pH調整劑 Ph Eur, BP, JP, NF
氯化鈉 -- 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
2-苯氧乙醇 -- 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
注射用水(q.s.to) -- 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於2期與2/3期臨床試驗的材料將按照cGMP製造
表18. UB-615 (武漢+Omicron B.1.1.529) 40 μg/mL之組成
描述 SEQ ID NO 單位 Q'ty/mL 功能 Quality Grade
S1-RBD-sFc (武漢+Omicron B.1.1.529) 49+51(1:1) 35.2 μg B-免疫原 (GMP) 1
 Th/CTL胜肽 2 0.8 μg T-免疫原 (GMP) 1
9 0.8 μg
22 0.8 μg
27 0.8 μg
34 0.8 μg
36 0.8 μg
 CpG1 67 120 μg 佐劑 GMP
 鋁膠 -- 1.2 mg 佐劑 GMP
 組胺酸 -- 4.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, JP, USP
 組胺酸 HCl•H 2O -- 6.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP
 精胺酸HCl -- 50.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP, USP
 TWEEN 80 -- 0.06% (v/v) 界面活性劑/乳化劑 Ph Eur, JP, NF
鹽酸 -- q.s. to pH 5.9~6.0 pH調整劑 Ph Eur, BP, JP, NF
氯化鈉 -- 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
 2-苯氧乙醇 -- 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
 注射用水(q.s.to) -- 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於2期與2/3期臨床試驗的材料將按照cGMP製造
表19. UniCoVac 2單價(Omicron BA.4/BA.5) 40 μg/mL之組成
SEQ ID NO 描述 單位 Q'ty/mL 功能 等級
53 S1-RBD-sFc (OmicronBA.4/BA.5) 35.2 μg B-免疫原 (GMP) 1
35 Th/CTL胜肽 0.8 μg T-免疫原 (GMP) 1
27 0.8 μg
9 0.8 μg
34 0.8 μg
2 0.8 μg
36 4.0 μg
67  CpG1 120 μg 佐劑 (GMP) 1
--  鋁膠 1.2 mg 佐劑 GMP
--  組胺酸 4.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, JP, USP
--  組胺酸 HCl•H 2O 6.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP
--  精胺酸HCl 50.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP, USP
--  TWEEN 80 0.06% (v/v) 界面活性劑/乳化劑 Ph Eur, JP, NF
-- 鹽酸 q.s. to pH 5.9~6.0 pH調整劑 Ph Eur, BP, JP, NF
-- 氯化鈉 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
--  2-苯氧乙醇 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
-- 注射用水(q.s.to) 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於2期與2/3期臨床試驗的材料將按照cGMP製造
表20. UniCoVac 3雙價(武漢+Omicron BA.4/BA.5) 40 μg/mL之組成
SEQ ID NO 描述 單位 Q'ty/mL 功能 等級
49+53 (1:1) S1-RBD-sFc (武漢+Omicron BA.4/BA.5) 35.2  μg B-免疫原 (GMP) 1
35 Th/CTL胜肽 0.8 μg T-免疫原 (GMP) 1
27 0.8 μg
9 0.8 μg
34 0.8 μg
2 0.8 μg
36 0.8 μg
67 CpG1 120 μg 佐劑 GMP
-- 鋁膠 1.2mg 佐劑 GMP
-- 組胺酸 4.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, JP, USP
-- 組胺酸 HCl•H 2O 6.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP
-- 精胺酸HCl 50.0 mM 蛋白質緩衝劑 Ph Eur, BP, JP, USP
-- TWEEN 80 0.06% (v/v) 界面活性劑/乳化劑 Ph Eur, JP, NF
-- 鹽酸 q.s. to pH 5.9~6.0 pH調整劑 Ph Eur, BP, JP, NF
-- 氯化鈉 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
-- 2-苯氧乙醇 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
注射用水(q.s.to) 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於2期與2/3期臨床試驗的材料將按照cGMP製造
表21. UB-Global T1 10 μg/mL之組成
描述 SEQ ID NO 單位 Q'ty/mL 功能 等級
S1-RBD-sFc N/A 0.0 μg 免疫原 (GMP) 1
Th/CTL胜肽 2 0.8 μg T-免疫原 (GMP) 1
9 0.8 μg
22 or 25 0.8 μg
27 0.8 μg
34 0.8 μg
36 0.8 μg
CpG1 67 5 μg 佐劑 (GMP) 1
鋁膠 -- 1.2 mg 佐劑 GMP
鹽酸 -- q.s. to pH 5.9~6.0 pH調整劑 Ph Eur, BP, JP, NF
氯化鈉 -- 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
2-苯氧乙醇 -- 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
注射用水(q.s.to) -- 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於2期與2/3期臨床試驗的材料將按照cGMP製造
表22. UB-Global T2 25 μg/mL之組成
描述 SEQ ID NO 單位 Q'ty/mL 功能 等級
S1-RBD-sFc N/A 0.0 ug 免疫原 (GMP) 1
Th/CTL胜肽 2 2 μg T-免疫原 (GMP) 1
9 2 μg
23 or 25 2 μg
27 2 μg
34 2 μg
36 2 μg
CpG1 67 12 ug 佐劑 GMP
鋁膠 -- 1.2 mg 佐劑 GMP
鹽酸 -- q.s. to pH 5.9~6.0 pH調整劑 Ph Eur, BP, JP, NF
氯化鈉 -- 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
2-苯氧乙醇 -- 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
注射用水(q.s.to) -- 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於2期與2/3期臨床試驗的材料將按照cGMP製造
表23. Global T3疫苗20 μg/mL之組成
描述 SEQ ID NO 單位 Q'ty/mL 功能 等級
Th/CTL胜肽 2 0.8 μg T-免疫原 (GMP) 1
9 0.8 μg
22 0.8 μg
27 0.8 μg
34 0.8 μg
36 0.8 μg
3 0.8 μg
4 0.8 μg
7 0.8 μg
8 0.8 μg
25 0.8 μg
26 0.8 μg
CpG1 67 10 μg 佐劑 GMP
鋁膠 -- 1.2 mg 佐劑 GMP
鹽酸 -- q.s. to pH 5.9~6.0 pH調整劑 Ph Eur, BP, JP, NF
氯化鈉 -- 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
2-苯氧乙醇 -- 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
注射用水(q.s.to) -- 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於2期與2/3期臨床試驗的材料將按照cGMP製造
表24. Global T4疫苗50 μg/mL之組成
描述 SEQ ID NO 單位 Q'ty/mL 功能 等級
Th/CTL胜肽 2 2 μg 免疫原 (GMP) 1
9 2 μg
22 2 μg
27 2 μg
34 2 μg
36 2 μg
3 2 μg
4 2 μg
7 2 μg
8 2 μg
25 2 μg
26 2 μg
CpG1 67 25 ug 佐劑 GMP
鋁膠 -- 1.2 mg 佐劑 GMP
鹽酸 -- q.s. to pH 5.9~6.0 pH調整劑 Ph Eur, BP, JP, NF
氯化鈉 -- 9 mg 滲透壓保持劑 Ph Eur, BP, USP
2-苯氧乙醇 -- 0.5% (v/v) 防腐劑 USP-NF
注射用水(q.s.to) -- 1.0 mL 溶劑 Ph USP
1用於2期與2/3期臨床試驗的材料
無。
第 1 圖顯示本發明的各種實施例的單鏈融合蛋白的設計。具體來說，此圖圖解說明瞭融合蛋白的一般結構，此融合蛋白在N端包括一個S-RBDVoC，其與人類IgG的鉸鏈區及Fc片段（CH2和CH3區域）共價連接。在 S1-RBD Omicron -sFc 融合蛋白中，S1-RBD Omicron 在 N 末端共價連接到人類 IgG修飾的鉸鏈區（序列識別號：39）和Fc 片段（CH2 和 CH3 結構域）（序列識別號：46 或 47)。 第 2 圖顯示pZD/S-RBDVoC-sFc質體圖。根據本發明的一個實施例，pZD/S-RBDVoC -sFc質體編碼S-RBDVoC-sFc融合蛋白。 第 3A 圖及第 3B 圖顯示S1-RBDVoC-sFc的胺基酸序列、結構與功能。 第 3A 圖顯示S1-RBDVoC Beta-sFc的序列並確定N-連接醣基化位點(*)、O-連接醣基化位點 (+)、Asn突變為His（下底線殘基）和雙硫鍵（連接線）。 第 3B 圖概述S1-RBDVoC Beta-sFc 融合蛋白中的雙硫鍵。 第 4A 圖及第 4B 圖顯示S1-RBDVoC Delta-sFc的胺基酸序列、結構和功能，其中VoC為 Delta。 第 4A 圖顯示S1-RBDVoC Delta-sFc的序列並確定N-連接醣基化位點(*)、O-連接醣基化位點 (+)、Asn突變為His（下底線殘基）和雙硫鍵（連接線）。 第 4B 圖概述S1-RBDVoC Delta-sFc 融合蛋白中的雙硫鍵。 第 5A 圖及第 5B 圖顯示S1-RBDVoC Omicron-sFc的胺基酸序列、結構和功能，其中 VoC 為Omicron。 第 5A 圖顯示S1-RBDVoC Omicron B1.1.529-sFc的序列並確定N-連接醣基化位點(*)、O-連接醣基化位點 (+)、Asn突變為His（下底線殘基）和雙硫鍵（連接線）。 第 5B 圖概述S1-RBDVoC Omicron B1.1.529-sFc 融合蛋白中的雙硫鍵。 第 6A 圖及第 6B 圖顯示S1-RBDVoC Omicron BA.4/BA.5-sFc的胺基酸序列、結構和功能，其中 VoC 為Omicron BA.4/BA.5。 第 6A 圖顯示S1-RBDVoC Omicron BA.4/BA.5-sFc的序列(序列識別號： 53)並確定N-連接醣基化位點(*)、O-連接醣基化位點 (+)、Asn突變為His（下底線殘基）和雙硫鍵（連接線）。 第 6B 圖概述S1-RBDVoC  Omicron BA.4/BA.5-sFc 融合蛋白中的雙硫鍵。 第 7 圖顯示藥物基質(DS)S1-RBDVoC-sFc蛋白，包括S1-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc（序列識別號：53）的一般製造過程。此過程從工作細胞庫 (WCB) 開始，以接種細胞種子並在2000 L饋料批式生物反應器中擴大培養物。在細胞培養程序之後，未處理的原液被收集並通過無菌過濾澄清以產生澄清原液。為純化藥物基質 (DS)，將原料藥通過蛋白 A 親和層析、深度過濾與離子交換(IEX)層析，然後進行切向流過濾(TFF)進行緩衝液交換，以達到配製的藥物基質。為避免外源病毒污染，澄清後的原液要經過溶劑清潔劑處理、蛋白質A層析酸滅活和奈濾處理。最後，在無菌過濾後生產配製的S1-RBDVoC-sFc DS濃縮物。因為 Voc 包括 Omicron BA.4/BA.5，所以也使用上述相同的製造過程生產配製的S1-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc DS濃縮物。 第 8 圖顯示透過非還原和還原形式SDS-PAGE對本發明的代表性設計S1-RBD-scFc蛋白進行的生化特徵。 第 9A 圖及第 9B 圖顯示本發明蛋白/胜肽疫苗成分的示意圖。 第 9A 圖顯示多蛋白/胜肽UB-612蛋白肽次單位疫苗的成分。此疫苗組合物包含一個S1-RBDVoCs-sFc融合蛋白作為主要的B細胞免疫原，5個合成的Th/CTL胜肽作為源自於SARS-CoV-2 Omicron BA.4/BA.5 M、N與S2蛋白的第I類與II類MHC分子，以及UBITh®1a胜肽作為活化T細胞的催化劑。這些成分與CpG1混合，後者通過雙極相互作用與帶正（設計）電荷的胜肽結合，也作為佐劑，然後與明礬佐劑結合，構成疫苗組合物。 第 9B 圖顯示UniCoVac Omicron BA.4/BA.5次單位疫苗的組成。疫苗組合物包含一個S1-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc融合蛋白（序列識別號：53）作為主要的B細胞免疫原，5個合成的Th/CTL胜肽（序列識別號：2、9、27、34及35）為來源於SARS-CoV-2 Omicron BA.4/BA.5 M、N與S2蛋白的第I類與II類MHC分子，以及UBITh®1a胜肽（序列識別號：36）作為活化T細胞的催化劑。這些成分與CpG1（序列識別號：67）混合，後者通過雙極相互作用與帶正（設計）電荷的胜肽結合，也作為佐劑，然後與明礬佐劑結合，構成疫苗組合物。 第 10A 圖及第 10B 圖顯示製造針對SARS-CoV-2，包括 SARS-CoV-2的Omicron BA.4/BA.5設計COVID疫苗的混合(compounding)過程。 第 10A 圖顯示製造針對 SARS-CoV-2 VOC設計的COVID疫苗的混合(compounding)過程。為了生產疫苗組合物，依次添加胜肽、CpG1、明礬佐劑，最後是蛋白質。具體而言，將設計Th/CTL胜肽添加到WFI中，然後在混合物中添加CpG1以形成胜肽/CpG1複合物。此後，將蛋白質緩衝液、明礬和氯化鈉添加到現在含有胜肽/CpG1/明礬/氯化鈉的溶液中。最後，將 S1-RBDVoCs-sFc 蛋白溶液添加到溶液混合物中，獲得最終的疫苗組合物：例如UB-612、UB-613或UB-614 等。 第 10B 圖顯示製造針對SARS-CoV-2的Omicron BA.4/BA.5的設計COVID疫苗（或命名為 單價 UniCoVac Omicron）的混合(compounding)過程。為了生產疫苗組合物，依次添加胜肽、CpG1、明礬佐劑，最後是蛋白質。具體而言，將設計Th/CTL胜肽添加到 WFI 中，然後在混合物中添加CpG1以形成胜肽/CpG1複合物。此後，將蛋白質緩衝液、明礬和氯化鈉添加到現在含有肽/CpG1/明礬/氯化鈉的溶液中。最後，將S1-RBD Omicron BA.4/BA.5-sFc 蛋白溶液添加到溶液混合物中以得到最終的疫苗組合物。 第 11A 至 11D 圖顯示在 1 期臨床試驗中初次接種2劑疫苗和追加第三劑疫苗後針對活SARS-CoV-2野生型的病毒中和力價 (VNT50)。在為期196天的第1期臨床試驗的UB-612主要2劑疫苗系列中，60 名參與者參加了10-μg、30-μg 與100-μg 劑量組（每組 n = 20），其中50名參與者參加了延長研究，並接受了於 100-μg 的追加第3劑（n = 17為10-μg劑量組；n = 15為30-μg劑量組，n = 18為100-μg劑量組）。測量抑制50%活SARS-CoV-2野生型（WT，武漢株）的病毒中和抗體幾何平均力價（GMT，95% CI），並表示為10-μg（ 第 11A 圖）、30-μg（ 第 11B 圖）與 100-μg（ 第 11C 圖）劑量組的VNT 50。 第 11D圖說明100-μg劑量組，對於三個劑量組的研究參與者，VNT 50數據記錄在第0天（第1次給藥前）、第14天（第1次給藥後14天）、第28天（第1次給藥後1個月；給藥前第2劑）、第42天（第2劑後14天）、第56天（第2劑後1個月）、第112天（第2劑後3個月）、第196天（第2劑後6個月），第255至316天（第3劑前，追加劑前）與第269至330天（追加劑後 14 天）。單個參與者的力價由圓圈顯示。水平虛線表示量化下限 (LLOQ)。HCS：控制組中的人類恢復期血清樣本（n = 20）。 第 12A 至 12C 圖顯示UB-612 追加第三劑在 1 期試驗中產生的針對 SARS-CoV2 野生型、Delta、Omicron與其他關切變體的有效中和力價。進行為期 196 天的第1期臨床試驗的主要 2 劑系列（第 0 天與第 28 天）與在平均第286天（第 255-316 天）給予100 μg 的延長追加第三劑。 第 12A 圖顯示100-μg組參與者在追加後14天觀察到的VNT 50力價。追加後14天觀察到對活SARS-CoV-2野生型(WT)的VNT 50力價達3992，對活Delta達到2358。在較低的30-與10-μg劑量組中觀察到類似的高抗WT與抗Delta VNT 50程度。 第 12B 圖提供了追加後14天觀察到的針對偽SARS-CoV-2野生型(WT)與針對包括Omicron的偽SARS-CoV-2 變體的pVNT 50力價。 第 12C圖顯示2劑後的抗體持久性（第1期臨床試驗）：基於第42-196天的一階指數模型擬合(first-order exponential model fitting) (SigmaPlot)，抗WT 中和 VNT 50力價緩慢衰減，半衰期為187天（R 2= 0.9877；衰減率常數K el= -0.0037；半衰期 = 0.693/K el）。此圖顯示，病毒中和抗體在WT活病毒下是持久性的。 第 13 圖條形圖顯示在100μg UB-612劑量組的第1期臨床試驗的主要系列中觀察到針對不同SARS-CoV-2變體的病毒中和pVNT 50力價。在1期臨床試驗的主要2劑疫苗接種系列中，接種者接受了兩個100 μg的UB-612劑量，選擇了二十個之第56天免疫血清樣本（n = 20），用於測量針對關注變異體（VoCs）的比較中和抗體活性。pVNT 50力價藉由偽病毒-螢光素酶試驗（體外活病毒微中和）進行評估。該研究在中研院RNAi核心設施的BSL2實驗室進行。 第 14A 圖及第 14B 圖顯示抗 S1-RBD IgG 抗體和對 SARS-CoV-2 野生型武漢株的病毒中和反應。 第 14A 圖提供了在 100 μg 的UB-612的2期研究中，跨年齡組第 1、29與57 天的抗 S1-RBD IgG 反應的基於 ELISA 的平均 GMT（總共n = 871；18-65 歲組n = 731；65-85 歲組n = 140）。 誤差條(The error bars)代表95% CI，虛線表示ELISA測定的限制。 第 14B 圖提供了跨年齡組在第1天與第57天對SARS-CoV-2-TCDC#4（武漢野生型）病毒的50%病毒中和反應(VNT 50) 的GMT。GMTs值以微量中和CPE測定法進行測量。誤差條代表 95% CI，虛線表示微量中和測定的限制。在18-65歲的較年輕成年人中，96.4的VNT50基本上是可重複的，如在100 μg疫苗劑量的疫苗接種者（20-55歲）第1期臨床試驗中第56天，其VNT 50為103（ 第 11C 圖）。 第 15A 圖及第 15B 圖顯示第2期臨床試驗主要2劑系列中針對SARS-CoV-2變體的中和抗體力價(VNT 50)。 第 15A 圖提供在第57天免疫血清中針對活SARS-CoV-2病毒變體的50%病毒中和力價 (VNT 50)的測量值，從48名（n = 39為18-65 歲的年輕成年人；n = 9為≥65歲的年長成年人）在2期試驗中接受兩次UB-612疫苗劑量的疫苗接種者中隨機選擇收集血清。活的野生型武漢 SARS-CoV-2-TCDC#4與US WA 1/2020，以及 WHO 列出的兩種 VoC（B.1.1.7 與B.1.617.2 譜系）以CPE進行檢測。VNT 50值標記在每列的頂部，並用水平條顯示的95%信心區間(CI) 排列。 第 15B 圖顯示雙樣本t檢驗提供VNT 50針對每個變體與野生型、武漢與US WA 1/2020相比的倍數變化（減少）（** p＜0.01；****p＜0.0001 )。相對於從進行CPE測定的兩個不同地理位置分離的兩種武漢野生型，2.7倍與1.4倍的降低也代表了37%與72%的中和力價保留。中研院：台灣中央研究院；CDPH：美國加利福尼亞州公共衛生部(CDPH)。 第 16A 至 16D 圖顯示根據ELISA之在主要2劑疫苗接種與追加第三劑後針對S1-RBD:ACE2結合的抑制力價。在為期 196 天的 1 期試驗（60名參與者）的主要2劑疫苗系列中和在追加第三劑的延長研究中，測量基於ELISA的S1-RBD：ACE2結合力價。10-μg（ 第 16A 圖）、30-μg（ 第 16B 圖）與 100-μg（ 第 16C 圖）劑量組（每個劑量組n = 20）的參與者接受了兩次分配的疫苗劑量，間隔28天，並且在6個月內對50名參與者進行了一次 100 μg 的第三劑追加（10-μg 劑量為n = 17，30-μg 劑量為n = 15，100-μg 劑量組為n = 18組）。在指定的時間點收集血清樣品以ELISA測量對S1-RBD與ACE2結合的抑制力價。水平虛線表示量化下限 (LLOQ)。 第 16D 圖顯示S1-RBD：ACE2結合抑制與VNT 50之間的良好關聯性。繪製所有主要/追加接種參與者（10-、30-與100-μg劑量組）的數據。第0天參與者的數據點被排除在相關性分析之外。藉由非參數Spearman相關方法分析相關性。 第 17A 至 17D 圖顯示在主要2劑疫苗接種與追加第三劑後以ELISA分析抗S1-RBD IgG結合力價。在為期196天的1期臨床試驗（60名參與者）的主要2劑疫苗系列中，以及在追加第三劑的延長研究中，測量了基於ELISA的抗 S1-RBD 抗體結合力價。10-μg（ 第 17A 圖）、30-μg（ 第 17B 圖）與 100-μg（ 第 17C 圖）劑量組（每個劑量組n = 20）的參與者，間隔28天接受了兩次分配的疫苗劑量，並且在6個月內對50名參與者進行了一次100 μg的追加第三劑（10-μg劑量為n = 17，30-μg 劑量為n = 15，100-μg 劑量組為n = 18組）。在指定的時間點收集血清樣本，藉由ELISA測量抗S1-RBD 抗體結合，表現為幾何平均力價GMT與95% CI。水平虛線表示量化下限(LLOQ)。 第 17D 圖說明抗S1-RBD抗體結合與VNT 50之間的良好相關性。繪製了所有主要/追加接種參與者（10-、30-與100-μg劑量組）的數據。第0天參與者的數據點被排除在相關性分析之外。藉由非參數Spearman相關方法分析相關性。 第 18A 至 18E 圖顯示在用設計胜肽抗原重新刺激PBMC後，藉由IFN-γ與IL-4 ELISpot測量的UB-612誘導的持久、穩健的Th1為主的細胞反應。在為期196天的1期試驗中，在第0天與第28天使用兩劑UB-612，藉由IFN-γ ELISpot以在 10-μg（ 第 18A 圖）、30-μg（ 第 18B 圖）或 100-μg（ 第 18C 圖）劑量組（每個 n = 20）中之來自年輕成年人（20 至 55 歲）的 PBMC 細胞來測量疫苗誘導的T細胞反應。在第2期臨床試驗研究中，參與者（年輕成年人，＞18 至 ＜65 歲）接受了兩劑 10​​0 μg 的 UB-612（n = 88）或鹽水安慰劑（n = 12），通過 IFN-γ ELISpot（ 第 18D 圖）與 IL-4 ELISpot（ 第 18E 圖）測量於第57天以設計抗原蛋白/胜肽重新刺激疫苗接種者之PBMC中的T細胞反應。顯示以S1-RBD+Th/CTL胜肽池、Th/CTL胜肽池或CoV2 T胜肽（無 UBITh1a的Th/CTL胜肽池）刺激後，每 1×10 6PBMC產生IFN-γ與IL-4之斑點形成單位(SFU)。使用雙樣本t檢驗進行統計分析 (**** p＜0.0001)。 第 19A 至 19C 圖顯示在第2期臨床試驗主要2劑疫苗接種系列中，以設計胜肽抗原重新刺激PBMCs後，藉由IFN-γ與IL-4細胞內染色（ICS）測量的UB-612誘導的Th1為主的T細胞反應（CD4與CD8）。在第2期臨床試驗中，研究參與者（＞18至65歲的年輕成年人以100 μg接受2劑（間隔28天）的UB-612（n = 88）或生理鹽水安慰劑（n = 12）。在第1天與第57天（第二次注射後4周）收集的PBMCs以設計的抗原蛋白/胜肽重新刺激，藉由細胞內染色（ICS）評估T細胞反應。產生指示性細胞因子的CD4+與CD8+T細胞的頻率對S1-RBD+Th/CTL胜肽池（ 第 19A 圖）、Th/CTL胜肽池（ 第 19B 圖）與CoV2 T胜肽（Th/CTL胜肽池沒有UBITh1a）的刺激（ 第 19C 圖）的反應。使用Mann-Whitney t檢驗進行統計分析。(* p＜0.05; ** p＜0.01; ***p＜0.001; **** p＜0.0001)。
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Claims (46)

  1. 一種融合蛋白，包括一IgG分子之一Fc片段與一生物活性分子，其中該Fc片段為一單鏈Fc(single chain Fc, sFc)，其中該Fc片段包括一鉸鏈區(hinge region)，其中該鉸鏈區為經突變且不形成雙硫鍵，其中該鉸鏈區包括擇自由序列識別號：38及39所組成之群組的一胺基酸序列，其中該生物活性分子為來自序列識別號:40的SARS-CoV2S蛋白受體結合區域(receptor binding domain, RBD)(S1-RBD)或序列識別號:41-44的S-RBD變體。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中該鉸鏈區包括序列識別號:39的胺基酸序列。
  3. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白係擇自由序列識別號:49-53所組成之群組。
  4. 一種藥物組合物，包括請求項1的融合蛋白和藥學上可接受的載體或賦形劑。
  5. 一種生產如請求項1的融合蛋白的方法，包括： a) 提供一生物活性分子，其中該生物活性分子為來自SARS-CoV2武漢或其關切變體(VoC)之一S蛋白的受體結合區域(S-RBD)，其中該S蛋白之受體結合區域係擇自於序列識別號:40-44所組成之群組； b) 提供一IgG分子之一Fc片段，其中該Fc片段包括一鉸鏈區，其中該鉸鏈區藉由一半胱胺酸殘基的取代及/或缺失突變以形成一經突變的Fc，且該經突變的Fc不形成雙硫鍵，其中該鉸鏈區包括擇自由序列識別號:38及39所組成之群組的一胺基酸序列，以及 c) 經由該鉸鏈區結合該生物活性分子與該經突變的Fc。
  6. 一種融合蛋白，其選自由序列識別號：49-53所組成之群組的S1-RBDVoC-sFc融合蛋白。
  7. 一種組合物，包括請求項6之融合蛋白。
  8. 如請求項7之組合物，更包括一Th/CTL胜肽，其中該Th/CTL胜肽衍生自SARS-CoV-2 M、N或S蛋白、病原體蛋白，或其任意之組合，其中該Th/CTL胜肽係擇自由序列識別號：2-5、7-12、14-35、36與其任意組合所組成之群組。
  9. 如請求項8之組成物，其中該Th/CTL胜肽係擇自由序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36與其任意組合所組成之群組。
  10. 一種COVID疫苗組合物，包括： a) 一S-RBDVoC-sFc蛋白，其選自由序列識別號：49-53所組成之群組； b) 一Th/CTL胜肽，其選自序列識別號：2-5、7-12、14-36及其任意組合所組成之群組； c) 一藥學上可接受之賦形劑，其中該藥學上可接受之賦形劑為一佐劑、緩衝劑、界面活性劑、乳化劑、pH調整劑、食鹽水溶液、防腐劑、溶劑，或其任意之組合。
  11. 如請求項10之COVID疫苗組合物，其中該(b)中的Th/CTL胜肽選自序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意組合之群組。
  12. 如請求項11之COVID疫苗組合物，其中該藥學上可接受之賦形劑為一CpG1寡核苷酸、ALUM（磷酸鋁或氫氧化鋁）、組胺酸、組胺酸HCl•H 2O、精胺酸HCl、TWEEN 80（聚氧乙烯(20)-山梨醇酐單油酸酯(polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate)、鹽酸、氯化鈉與2-苯氧乙醇(2-phenoxyethanol) 在水中的組合。
  13. 如請求項12之COVID疫苗組合物，其中該藥學上可接受之賦形劑為CpG1 (序列識別號: 67)。
  14. 一種預防COVID的方法，包括向給予一受試者一藥學上有效量的請求項10的疫苗組合物。
  15. 一種預防COVID的方法，包括給予一受試者一藥學上有效量的請求項11的疫苗組合物。
  16. 一種生產針對SARS-CoV-2抗體的方法，包括給予一受試者一藥學上有效量如請求項10的疫苗組合物。
  17. 一種生產針對SARS-CoV-2抗體的方法，包括給予一受試者一藥學上有效量如請求項11的疫苗組合物。
  18. 一種COVID疫苗組合物以表15-20中任一所示量的組成。
  19. 一種細胞株，其轉染編碼如請求項6的融合蛋白的cDNA序列。
  20. 如請求項19之細胞株，其為一中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。
  21. 如請求項19之細胞株，其中該cDNA序列選自由序列識別號: 60-64所組成之群組。
  22. 一種廣譜COVID T疫苗組合物，包括： a). 一Th/CTL胜肽，其中該Th/CTL胜肽衍生自SARS-CoV-2 M、N或S蛋白、病原體蛋白或其任意組合，其中該Th/CTL胜肽選自於 序列識別號：2-5、7-12、14-36 及其任意組合所組成之群組； b). 一藥學上可接受的賦形劑，其中該藥學上可接受的賦形劑包括一佐劑、緩沖劑、pH調節劑、鹽水溶液、防腐劑、溶劑或上述任意組合。
  23. 如請求項22之廣譜COVID T疫苗組合物，其中Th/CTL胜肽選自於序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36、3、4、7、8、25、26及其任意組合之群組。
  24. 如請求項23之廣譜COVID T疫苗組合物，其中該藥學上可接受的賦形劑為一CpG1寡核苷酸、ALUM(磷酸鋁或氫氧化鋁)、鹽酸、氯化鈉和2-苯氧乙醇在水中的組合。
  25. 一種廣譜COVIDT疫苗組合物以表21至24所示量組成。
  26. 一種融合蛋白，包括一IgG分子之一Fc片段與一生物活性分子，其中該Fc片段為一單鏈Fc(single chain Fc, sFc)，其中該Fc片段包括一鉸鏈區(hinge region)，其中該鉸鏈區為經突變且不形成雙硫鍵，其中該鉸鏈區包括選自由序列識別號:38及39所組成之群組的一胺基酸序列，其中該生物活性分子是來自SARS-CoV-2 S蛋白的受體結合結構域(S1-RBD)( 序列識別號: 40或44)，其中武漢株是序列識別號:40，其中Omicron BA.4/BA.5變體是序列識別號:44。
  27. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白選自由序列識別號: 49及53所組成之群組。
  28. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包括序列識別號: 39的胺基酸序列。
  29. 一種醫藥組合物，包括如請求項1的融合蛋白及藥學上可接受的載體或賦形劑。
  30. 一種製備如請求項1的融合蛋白的方法： a) 提供一生物活性分子，其中生物活性分子是來自SARS-CoV-2武漢的S蛋白的受體結合域(S-RBD)(序列識別號:40)或其Omicron BA.4/BA.5變體之一，其中S蛋白的受體結合結構域是序列識別號：44； b) 提供一IgG分子的Fc片段，其中Fc片段包含一鉸鏈區，其中鉸鏈區透過半胱胺酸殘基的取代及/或缺失突變以形成突變的Fc，且突變的Fc無法形成雙硫鍵，其中該鉸鏈區包含選自由序列識別號：38及39所組成之群組的氨基酸序列，以及 c) 通過該鉸鏈區結合該生物活性分子和該突變的Fc。
  31. 一種融合蛋白，其選自序列識別號: 53的S1-RBD Omicron BA.4/BA.5變體-sFc。
  32. 一種組合物，包括請求項31的融合蛋白。
  33. 如請求項32之組合物，更包括Th/CTL胜肽，其中該Th/CTL胜肽衍生自SARS-CoV-2 M、N或S蛋白、病原體蛋白或其任意組之合，其中該Th/CTL胜肽選自由序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意組合所組成的群組。
  34. 如請求項33之組合物，其中該Th/CTL胜肽選自由序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意組合所組成的群組。
  35. 一種COVID疫苗組合物，包括： a) 一S-RBD Omicron BA.4/BA.5變體蛋白，其選自序列識別號: 53； b) 一Th/CTL胜肽選自由序列識別號：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意組合所組成的群組； c) 一藥學上可接受的賦形劑，其中藥學上可接受的賦形劑是佐劑、緩沖劑、表面活性劑、乳化劑、pH調節劑、鹽水溶液、防腐劑、溶劑或其任意組合。
  36. 如請求項35之COVID疫苗組合物，其中該(b)的Th/CTL胜肽選自由2、9、22、23、27、34、35、36及其任意組合所組成的群組。
  37. 如請求項36之COVID疫苗組合物，其中該藥學上可接受的賦形劑是CpG1寡核苷酸、ALUM(磷酸鋁或氫氧化鋁)、組胺酸、組胺酸HCl•H2O、精胺酸HCl、吐溫80(聚氧乙烯(20)山梨聚醣 單油酸酯）、鹽酸、氯化鈉和 2-苯氧乙醇在水中的組合。
  38. 如請求項37之COVID疫苗組合物，其中該藥學上可接受的賦形劑是CpG1 (序列識別號: 67)。
  39. 一種預防COVID的方法，包括給予一受試者一藥學上有效量如請求項35的疫苗組合物。
  40. 一種預防COVID的方法，包括給予一受試者一藥學上有效量如請求項36的疫苗組合物。
  41. 一種產生針對SARS-CoV-2 Omicron BA.4/BA.5變體的抗體的方法，包括給予一受試者一藥學上有效量如請求項35的疫苗組合物。
  42. 一種產生針對SARS-CoV-2 Omicron BA.4/BA.5變體的抗體的方法，包括給予一受試者一藥學上有效量如請求項36的疫苗組合物。
  43. 一種COVID疫苗組合物，包括表15、19和20中任一所示量的組成。
  44. 一種轉染編碼如請求項31的融合蛋白cDNA序列的細胞株。
  45. 如請求項44之細胞株，其係為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。
  46. 如請求項44之細胞株，其中該cDNA序列選自由序列識別號: 64組成的群組。
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