TW202228770A

TW202228770A - 具有含有生育酚之鯊烯乳劑佐劑之covid-19疫苗

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Publication number: TW202228770A
Application number: TW110131151A
Authority: TW
Inventors: 娜塔莉阿諾索娃; 薩爾瓦多奧薩爾; 凱瑟琳貝瑞; 佛羅倫薩布德; 托馬斯布魯爾; 達尼洛卡西米羅; 羅曼奇契; 古斯塔沃達亞安; 蓋伊德布倫; 卡洛斯迪亞茲格拉納多斯; 東明傅; 瑪麗亞加里諾; 羅瑞格雷迪; 桑傑古魯納坦; 基里爾卡爾寧; 尼古拉赫拉姆佐夫; 瓦萊麗勒庫圖里耶; 瑙申拉曼; 索菲亞瑞茲; 斯蒂芬薩瓦里諾
Original assignee: 美商賽諾菲巴斯德公司; 比利時商葛蘭素史密斯克萊生物股份有限公司
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2022-08-01
Also published as: CO2023003157A2; WO2022046633A1; CA3190375A1; IL300630A; KR20230058101A; MX2023002356A; JP2023538665A; EP4200317A1; AU2021330836A1; AU2021330836A9; BR112023002804A2

Abstract

提供用於預防性治療SARS-CoV-2感染和COVID-19的新型疫苗以及製造所述疫苗的方法。

Description

具有含有生育酚之鯊烯乳劑佐劑之COVID-19疫苗

相關申請的交叉參考

本申請要求來自2020年8月24日提交的美國臨時申請63/069,171；2021年5月4日提交的美國臨時申請63/184,155；2021年5月14日提交的美國臨時申請63/189,044；和2021年6月25日提交的美國臨時申請63/215,092的優先權。將以上提及的優先權申請的公開內容藉由引用以其整體併入本文。

聯邦資助的研究或開發

本發明是在由美國衛生與公眾服務部(U.S.Department of Health and Human Services)和ASPR-BARDA授予的HHSO100201600005I；以及由美國陸軍承包司令部(U.S.Army Contracting Command)ACC-NJ頒發且作為衛生與公眾服務部與國防部之間的聯合任務授予的其他交易協定(Other Transaction Agreement，OTA)W15QKN-16-9-1002下在政府的支持下完成的。政府擁有本發明的某些權利。

序列表

本申請含有已經以ASCII格式電子提交並且藉由引用以其整體特此併入的序列表。在2021年8月10日創建的序列表的電子副本名稱為025532_TW005_SL.txt並且大小為48,127位元組。

冠狀病毒是感染多種多樣的哺乳動物和禽類物種的有包膜的正義單鏈RNA病毒家族。病毒基因組被包裝在由病毒核衣殼(N)蛋白組成的衣殼中並且被脂質包膜包圍。嵌入脂質包膜中的是膜(M)蛋白、包膜小膜(E)蛋白、血凝素酯酶(HE)和刺突(S)蛋白。S蛋白介導病毒附著和進入細胞。

人類冠狀病毒(hCoV)引起呼吸系統疾病。低致病性hCoV感染上呼吸道並且引起輕度感冒。高致病性hCoV主要感染下氣道並且能夠引起嚴重的(並且有時是致命的)肺炎，諸如嚴重急性呼吸症候群(SARS-CoV)和中東呼吸症候群(MERS-CoV)。由hCoV引起的嚴重肺炎通常與病毒快速複製、大量炎性細胞浸潤以及促炎細胞因子和趨化因子升高相關，導致急性肺損傷和急性呼吸窘迫症候群(參見例如，Channappanavar和Perlman,Semin Immunopathol(2017)39(5)：529-39)。

嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)(也稱為2019新型冠狀病毒(2019-nCoV))是繼HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV和原始SARS-CoV之後的第七種已知感染人的冠狀病毒(Zhu等人，N Eng Med.(2020)382(8)：727-33)。像牽涉2003年SARS爆發的SARS相關冠狀病毒株一樣，SARS-CoV-2是沙貝病毒(Sarbecovirus)亞屬(β-CoV譜系B)的成員。SARS-CoV-2是持續發生的2019-21冠狀病毒疾病(COVID-19) 的原因(Chan等人，Lancet(2020)395(10223)：514-23；Xu等人，Lancet Respir Med.(2020)doi：10.1016/S2213-2600(20)30076-X；GenBank：MN908947.3；Gorbalenya等人，bioRxiv(2020)doi：10.1101/2020.02.07.937862)。人與人之間的傳播主要經由呼吸道飛沫和氣溶膠發生。

COVID-19的臨床特徵各不相同。在大多數情況下，被感染的個體可能是無症狀的或具有輕微症狀。在有症狀的那些中，典型的表現包括發熱、咳嗽、呼吸短促、嗅覺缺失和疲勞。更嚴重的表現包括急性呼吸窘迫症候群、中風和細胞因子釋放症候群，在一些情況下導致死亡。嚴重的疾病可能發生在任何年齡的健康個體中，但是主要發生在高齡或有基礎醫學共病的成年人中。老年人最常受到影響，並且具有高死亡率。與嚴重疾病和死亡率相關的共病和其他病症包括慢性腎病、慢性阻塞性肺病(COPD)、免疫受損狀態、肥胖症、嚴重心臟病症(例如，心力衰竭、冠狀動脈疾病或心肌病)、鐮狀細胞疾病、糖尿病、高血壓、肝病和肺纖維化。來自COVID-19的風險在全世界也因國家和國家內部的區域而異(參見例如，de Souza,Nat Hum Behav.(2020)4：856-865；Chen,Cell Death Dis.(2020)11：438)。

SARS-CoV-2藉由與細胞表面蛋白血管緊張素轉換酶2(ACE2)結合來感染細胞(Hoffmann等人，Cell(2020)181(2)：271-80；Walls等人，Cell(2020)181(2)：281-92)。病毒藉由S蛋白獲得進入宿主細胞的入口。S蛋白是I類融合蛋白，並且被多糖厚厚地包覆，從而說明病毒逃避免疫監視。所述蛋白質是藉由前體S多肽的加工產生的。前體多肽經歷糖基化，去除訊號肽，並且在殘基685與686之間被前蛋白轉化酶弗林蛋白酶切割以產生兩個次單元S1和S2。S1和S2作為原聚體保持締合。S蛋白是原聚體的三聚體，以準穩定融合前構形存在。在 S1次單元宿主細胞受體結合後，S1次單元從蛋白質中釋放出來。剩餘的S2次單元轉變為高度穩定的融合後構形並且促進病毒與宿主細胞之間的膜融合，因此促進病毒進入細胞(參見例如，Wrapp等人，Science(2020)10.1126/science.abb2507；Shang等人，PNAS(2020)117(21)：11727-34)。

S蛋白是疫苗開發的關鍵靶標。預期處於融合前構形的蛋白質呈現出中和最敏感的表位(參見例如，Wrapp，同上)。成功的免疫策略需要穩定的抗原，並且已經描述了穩定處於融合前構形的SARS-CoV-2 S蛋白的嘗試(參見例如，Xiong等人，Nat Struct Mol Biol.(2020)doi.org/10.1038/s41594-020-0478-5)。

由COVID-19引起的公共衛生危機持續不減弱，尤其是在發展中國家。SARS-CoV-2的變異體不斷出現。仍然迫切需要開發能夠說明對抗COVID-19的持續威脅的有效疫苗。

本揭露提供了一種免疫原性組合物，所述組合物包含(a)一種、兩種、三種或更多種重組SARS-CoV-2蛋白，其中一種或多種的所述蛋白質是多肽的三聚體，所述多肽從N末端至C末端包含(i)與(1)SEQ ID NO：10的殘基19-1243或(2)SEQ ID NO：13的殘基19-1240至少94%，例如至少95%(例如，至少96%、97%、98%或99%)相同的序列，其中SEQ ID NO：10的位置687-690(和SEQ ID NO：13中的相應位置)處的殘基GSAS(SEQ ID NO：6)和SEQ ID NO：10的位置991和992(和SEQ ID NO：13中的相應位置)處的殘基PP被保留在所述序列中；和(ii)三聚化結構域，其中所述三聚化結構域包含SEQ ID NO：7；以及(b) 佐劑，其中所述佐劑是包含生育酚和鯊烯的水包油乳劑。當組合物被說成具有兩種或更多種蛋白質時，意圖是這些蛋白質彼此不同。

在另一態樣，本揭露提供了一種免疫原性組合物，所述組合物包含(a)一種、兩種、三種或更多種重組SARS-CoV-2 S蛋白，各自可藉由包括以下的方法獲得：向昆蟲細胞中引入用於表現多肽的桿狀病毒載體，所述多肽從N末端至C末端包含(i)源自昆蟲或桿狀病毒蛋白(例如，幾丁質酶)的訊號肽；(ii)與(1)SEQ ID NO：10的殘基19-1243或(2)SEQ ID NO：13的殘基19-1240至少95%(例如，至少96%、97%、98%或99%)相同的序列，其中SEQ ID NO：10的位置687-690(和SEQ ID NO：13中的相應位置)處的殘基GSAS(SEQ ID NO：6)和SEQ ID NO：10的位置991和992(和SEQ ID NO：13中的相應位置)處的殘基PP被保留在所述序列中；和(iii)三聚化結構域，其中所述三聚化結構域包含SEQ ID NO：7；將所述昆蟲細胞在允許所述多肽表現和三聚化的條件下培養；以及從所述培養物中分離所述重組SARS-CoV-2 S蛋白，其中所述重組SARS-CoV-2 S蛋白是不含所述訊號序列的所述多肽的三聚體；以及(b)佐劑，其中所述佐劑是包含生育酚和鯊烯的水包油乳劑。在一些實施例中，所述桿狀病毒表現載體包含可操作地與所述多肽的編碼序列連接的多角體啟動子。在一些實施例中，所述訊號肽源自昆蟲或桿狀病毒幾丁質酶。在一些實施例中，所述訊號肽包含SEQ ID NO：3。

在一些實施例中，所述免疫原性組合物包含一種(單價)或多種(多價)不同的重組SARS-CoV-2 S蛋白。例如，所述組合物包含兩種(二價)、三種(三價)或四種(四價)不同的重組SARS-CoV-2 S蛋白。

在一些實施例中，所述重組多肽包含或具有與(i)SEQ ID NO：10的殘基19-1243或(ii)SEQ ID NO：13的殘基19-1240相同的序列。在一些實施例中，所述組合物是二價的並且包含重組蛋白，所述重組蛋白是任選地等量的包含或具有與SEQ ID NO：10的殘基19-1243相同的序列的重組多肽的三聚體和包含或具有與SEQ ID NO：13的殘基19-1240相同的序列的重組多肽的三聚體。

在一些實施例中，每個劑量(以例如約0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mL)的所述免疫原性組合物包含以下或藉由將以下混合而製備：(i)抗原組分，所述抗原組分包含各種約2μg至約50μg、任選地約2.5μg至約50μg或約5μg至約50μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白；以及(ii)水包油乳劑佐劑，所述佐劑包含a)在磷酸鹽緩衝鹽水中的10.69mg鯊烯、4.86mg聚山梨醇酯80和11.86mg α-生育酚，任選地如表9所示，進一步任選地其中所述佐劑以0.25mL提供，b)在磷酸鹽緩衝鹽水中的5.34mg鯊烯、2.43mg聚山梨醇酯80和5.93mg α-生育酚，任選地如表9所示，進一步任選地其中所述佐劑以0.25mL提供，c)在磷酸鹽緩衝鹽水中的2.67mg鯊烯、1.22mg聚山梨醇酯80和2.97mg α-生育酚，任選地如表9所示，進一步任選地其中所述佐劑以0.25mL提供，或d)在磷酸鹽緩衝鹽水中的1.34mg鯊烯、0.61mg聚山梨醇酯80和1.48mg α-生育酚，任選地如表9所示，進一步任選地其中所述佐劑以0.25mL提供。

在一些實施例中，每個劑量(以例如約0.5mL)的所述免疫原性組合物藉由將0.25mL的抗原組分和0.25mL的AS03佐劑(AS03_A)混合而製備。0.25mL的所述抗原組分可以包含以下或藉由將以下混合而製備：0.0975mg磷酸二氫鈉一水合物、0.65mg磷酸氫二鈉十二水合物(對應於0.26mg無水磷酸氫二鈉)、2.2mg氯化鈉、50-600(例如，55或550)μg聚山梨醇酯20和約0.25mL水 (足量添加的(q.s.ad)0.25mL)。在某些實施例中，0.25mL的所述抗原組分或0.5mL的最終免疫原性組合物(含佐劑)包含各種2.5μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白，任選地其中所述組合物包含等量的兩種不同的重組SARS-CoV-2 S蛋白；如果所述組合物是單價的，則它包含2.5μg的所述重組S蛋白。在某些實施例中，0.25mL的所述抗原組分或0.5mL的最終免疫原性組合物(含佐劑)包含各種5μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白，任選地其中所述組合物包含等量的兩種不同的重組SARS-CoV-2 S蛋白；如果所述組合物是單價的，則它包含5μg的所述重組S蛋白。在某些實施例中，0.25mL的所述抗原組分或0.5mL的最終免疫原性組合物(含佐劑)包含各種10μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白，任選地其中所述組合物包含等量的兩種不同的重組SARS-CoV-2 S蛋白；如果所述組合物是單價的，則它包含10μg的所述重組S蛋白。

在另一態樣，本揭露提供了一種以單個劑量或多個劑量含有本文所述的免疫原性組合物的容器，其中每個劑量的體積是例如約0.25或約0.5mL。在一些實施例中，所述容器是小瓶或注射器。

在另一態樣，本揭露提供了一種用於肌內疫苗接種的套組，其中所述套組包含兩個容器，其中(a)第一容器含有包含一種、兩種、三種或更多種重組SARS-CoV-2 S蛋白的醫藥組合物，其中一種或多種的所述蛋白質是多肽的三聚體，所述多肽從N末端至C末端包含(i)與以下至少94%，例如至少95%(例如，至少96%、97%、98%或99%)相同的序列：(A)SEQ ID NO：10的殘基19-1243，其中SEQ ID NO：10的位置687-690處的殘基GSAS(SEQ ID NO：6)和SEQ ID NO：10的位置991和992處的殘基PP被保留在所述序列中，或(B)SEQ ID NO：13的殘基19-1240，其中SEQ ID NO：13的位置684-687處的殘基GSAS(SEQ ID NO：6)和SEQ ID NO：13的位置988和989處的殘基PP被保留在所述序列中；和(ii)三聚化結構域，其中所述三聚化結構域包含SEQ ID NO：7；並且(b)第二容器含有包含生育酚和鯊烯的水包油佐劑。在一些實施例中，所述多肽包含或具有與(i)SEQ ID NO：10的殘基19-1243或(ii)SEQ ID NO：13的殘基19-1240相同的序列。在進一步的實施例中，所述容器含有兩種不同的重組S蛋白，各自具有上述序列之一。在一些實施例中，所述第一容器包含一個或多個劑量的在磷酸鹽緩衝鹽水中提供的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白，任選地如表A、表8或表12所示，其中每個劑量(體積為0.25mL)具有約2.5μg至45μg、任選地5μg至45μg(例如，2.5、5、10、15或45μg)的所述一種或多種重組S蛋白。在一些實施例中，所述第二容器包含一個或多個劑量的所述佐劑，其中每個劑量的所述佐劑的體積是0.25mL，所述佐劑包含a)在磷酸鹽緩衝鹽水中的10.69mg鯊烯、4.86mg聚山梨醇酯80和11.86mg α-生育酚，任選地如表9所示，b)在磷酸鹽緩衝鹽水中的5.35mg鯊烯、2.43mg聚山梨醇酯80和5.93mg α-生育酚，任選地如表9所示，c)在磷酸鹽緩衝鹽水中的2.67mg鯊烯、1.22mg聚山梨醇酯80和2.97mg α-生育酚，任選地如表9所示，或d)在磷酸鹽緩衝鹽水中的1.34mg鯊烯、0.61mg聚山梨醇酯80和1.48mg α-生育酚，任選地如表9所示。

本揭露還提供了一種製造疫苗套組的方法，所述方法包括提供所述免疫原性組合物的一種或多種重組S蛋白和佐劑以及將所述蛋白質和所述佐劑包裝到分別的無菌容器中。

本揭露進一步提供了一種預防或改善有需要的個體的COVID-19的方法，所述方法包括向所述個體投予預防有效量的本文的免疫原性組合物。在一些實施例中，所述預防有效量以單個劑量或以兩個或更多個劑量投予。在一些實施例中，所述預防有效量是每劑約5至約50μg，任選地每劑5、10、15或45μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白，以單個劑量或以兩個或更多個劑量肌內投予。在一些實施例中，以約兩周至約三個月(例如，約三周或約21天)的間隔投予兩個或更多個劑量的所述免疫原性組合物，其中每個劑量的所述免疫原性組合物包含5μg或10μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白。在一些實施例中，根據下文表B中的方案1、10、11或12向所述個體投予本文的免疫原性組合物。

在一些實施例中，本發明的免疫原性組合物被用作先前有SARS-CoV-2感染的個體或已經接種針對相同或不同的病毒株的COVID-19疫苗的個體的加強疫苗，例如以預防或改善COVID-19。第一COVID-19疫苗可以是滅活疫苗、次單元疫苗或基因疫苗(例如，mRNA疫苗或病毒載體疫苗)。在某些實施例中，所述個體已經接種包含編碼重組SARS-CoV-2 S抗原的mRNA的基因疫苗。在某些實施例中，在感染後或在所述個體接種所述第一COVID-19疫苗後約4周、約一個月、約三個月、約六個月、約四至十個月或約一年向所述個體投予本發明的免疫原性組合物，任選地其中所述免疫原性組合物包含2.5μg或5μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2蛋白，並且進一步任選地其中所述免疫原性組合物是單價的或多價的。在進一步的實施例中，在第一次COVID-19疫苗接種完成後約八個月給予加強注射劑。在一些實施例中，所述基因疫苗包含編碼重組SARS-CoV-2 S抗原的mRNA，任選地其中所述重組SARS-CoV-2 S蛋白包含SEQ ID NO：1、4、10、13或14或其抗原片段。在某些實施例中，本文的加強免疫原性組合物包含每劑2.5或5μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白。在某些實施例中，所述加強免疫原性組合物是單價的(例如，包含不含訊號序列的含有SEQ ID NO：10或13的重組S蛋白)或二價的(例如，包含不含訊號序列的含有SEQ ID NO：10的第一重組S蛋白和不含訊號序列的含有SEQ ID NO：13的第二重組S蛋白)。在一些實施例中，根據下文表B中的方案2、3、4、5、6、7、8或9向所述個體投予本文的免疫原性組合物。

本揭露還提供了用於在預防性治療COVID-19中使用的本文所述的免疫原性組合物。

本揭露進一步提供了本文所述的免疫原性組合物用於製造用以預防性治療COVID-19的藥劑的用途。所述預防性治療可以預防或改善本文所述的有需要的個體的COVID-19。

在某些實施例中，在本文所述的免疫原性組合物中，所述重組S蛋白與本文的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑聯合用於預防性治療COVID-19；本文所述的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑與所述重組S蛋白聯合用於預防性治療COVID-19；所述重組S蛋白和所述佐劑用於製造用於在預防性治療COVID-19中使用的製品(諸如疫苗接種套組，例如用於肌內注射的疫苗接種套組)的用途。

以下實施例適用於(i)本文所述的免疫原性組合物，(ii)其任何用途，(iii)本文所述的容器套組，(iv)所述免疫原性組合物和所述容器套組的預防性和治療性用途，以及(v)本文所述的預防或改善有需要的個體的COVID-19的方法。

在某些實施例中，所述生育酚是α-生育酚，任選地D/L-α-生育酚。

在某些實施例中，所述佐劑的平均液滴尺寸小於1μm，任選地其中所述平均液滴尺寸是小於500nm、小於200nm、50至200nm、120至180nm或140至180nm。

在某些實施例中，所述佐劑的多分散性指數是0.5或更小，諸如0.3或更小、或0.2或更小。

在某些實施例中，所述佐劑包含選自以下的表面活性劑：泊洛沙姆401、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯80、脫水山梨糖醇三油酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯12鯨蠟基/硬脂基醚，單獨或與彼此組合或與其他表面活性劑組合。

在某些實施例中，所述佐劑包含選自以下的表面活性劑：聚山梨醇酯80、脫水山梨糖醇三油酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯12鯨蠟基/硬脂基醚，單獨或與彼此組合。

在某些實施例中，所述佐劑包含聚山梨醇酯80。

在某些實施例中，所述佐劑包含一種、兩種或三種表面活性劑。

在某些實施例中，在所述佐劑中的鯊烯與生育酚的重量比是0.1至10，任選地0.2至5、0.3至3、0.4至2、0.72至1.136、0.8至1、0.85至0.95、或0.9。

在某些實施例中，在所述佐劑中的鯊烯與表面活性劑的重量比是0.73至6.6，任選地1至5、1.2至4、1.71至2.8、2至2.4、2.1至2.3、或2.2。

在某些實施例中，人類個體是兒童、成年人或老年人。

在某些實施例中，在單個劑量的所述佐劑中的鯊烯的量是至少1.2mg，任選地1.2至20mg、1.2至15mg、1.2至2mg、1.21至1.52mg、2至4mg、2.43至3.03mg、4至8mg、4.87至6.05mg、8至12.1mg或9.75至12.1mg。

在某些實施例中，在單個劑量的所述佐劑中的生育酚的量是至少1.3mg，任選地1.3至22mg、1.3至16.6mg、1.3至2mg、1.33至1.69mg、2至4mg、2.66至3.39mg、4至8mg、5.32至6.77mg、8至13.6mg或10.65至13.53mg。

在某些實施例中，在單個劑量的所述佐劑中的表面活性劑的量是至少0.4mg，任選地0.4至9.5mg、0.4至7mg、0.4至1mg、0.54至0.71mg、1至2mg、1.08至1.42mg、2至4mg、2.16至2.84mg、4至7mg或4.32至5.68mg。

在某些實施例中，所述佐劑包含以下或基本上由以下組成：鯊烯；生育酚，任選地D/L-α-生育酚；表面活性劑，任選地聚山梨醇酯80；和水。

在某些實施例中，用於肌內注射的單個劑量的所述免疫原性組合物的體積是0.05mL至1mL，任選地0.1至0.6mL、0.2至0.3mL、0.25mL、0.4至0.6mL、或0.5mL。

在某些實施例中，所述免疫原性組合物或所述第一容器和所述第二容器的內容物的混合物的pH是4至9，任選地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4。

在某些實施例中，所述免疫原性組合物或所述第一容器和所述第二容器的內容物的混合物的滲透壓是250至750mOsm/kg，任選地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg。

在某些實施例中，所述免疫原性組合物或所述第一容器和所述第二容器的內容物的混合物所包含的鯊烯是0.8至100mg/mL，任選地1.2至48.4mg/mL、10至30mg/mL、或21.38mg/mL。

在某些實施例中，在與所述重組S蛋白混合之前，用於肌內注射的單個劑量的所述佐劑的體積是0.05mL至1mL，任選地0.1至0.6mL、0.2至0.3mL、0.25mL、0.4至0.6mL、或0.5mL。

在某些實施例中，在與所述重組S蛋白混合之前，所述佐劑具有4至9，任選地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4的pH；具有250至750mOsm/kg，任選地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg的滲透壓；包含緩衝劑和/或張力調節劑，任選地改良的磷酸鹽緩衝鹽水；具有0.8至100mg/mL、任選地1.2至48.4mg/ml的鯊烯濃度；並且具有0.05mL至1mL、任選地0.1至0.6mL的單劑量體積。

在某些實施例中，所述重組S蛋白提供在水性液體溶液中，所述水性液體溶液在與所述佐劑混合之前具有0.2至0.3mL、任選地0.25mL，0.4至0.6mL，或0.5ml的單劑量體積；4至9，任選地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4的pH；和250至750mOsm/kg，任選地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg的滲透壓。

所公開的實施例適用於治療未感染SARS-CoV-2的個體。所公開的實施例適用於在有需要的人類個體中引發免疫反應，所述免疫反應部分或完全降低一種或多種症狀的嚴重程度和/或個體經歷一種或多種症狀的時間、降低攻擊後患上已建立的感染的可能性、減慢疾病的進展、任選地延長存活期、產生針對SARS-CoV-2的中和抗體、和/或是SARS-CoV-2 S蛋白特異性T細胞反應。

本發明的其他特徵、目的和優勢在以下的具體實施方式中是清楚的。然而，應當理解，儘管指示了本發明的實施例和態樣，但具體實施方式是藉由僅說明而非限制的方式給出的。根據具體實施方式，在本發明範圍內的各種變化和修改對於熟習此項技術者而言應變得清楚。

圖1是揭露構建體1的設計的簡圖，所述構建體含有用於重組SARS-CoV-2 S蛋白的桿狀病毒表現盒。所述表現盒包括多角體啟動子和多肽的編碼序列，所述多肽含有幾丁質酶訊號序列(“ss”)和在S1/S2連接處的假定的弗林蛋白酶切割位點處含有突變且在S2次單元中含有雙脯胺酸取代的SARS-CoV-2 S蛋白胞外域。

圖2A是描繪SapI消化的pPSC12DB-LIC轉移質體與合成的gBlock片段組裝的示意圖。SapI線性化的轉移質體以灰色示出，多角體啟動子以綠色箭頭示出，gBlock片段著色為黃色、藍色和橙色，並且將各自的重疊序列描繪為相同的顏色(上圖)。含有preS dTM基因的最終轉移質體在下圖示出。

圖2B揭露gBlock片段(按出現的順序分別為SEQ ID NO：14-23)的5'和3'末端序列。

圖3是展示了用於產生表現重組SARS-CoV-2 S蛋白的桿狀病毒構建體的方法的簡圖。MV：主病毒。

圖4是揭露在D0/D21注射不含佐劑的preS dTM和S dTM的小鼠中D21和D36的血清S特異性IgG水平的圖。滴度表示為OD=0.2的稀釋度的倒數。EU：ELISA單位。preS dTM：一種缺失了跨膜結構域和胞質結構域的重組的穩定的預融合SARS-CoV-2 S蛋白(SEQ ID NO：10)。S dTM：一種缺失了跨膜結構域和胞質結構域的重組的非穩定的SARS-CoV-2 S蛋白。

圖5是揭露在第21天和第36天在注射的小鼠中佐劑AS03對S特異性IgG水平的影響的圖。滴度表示為OD=0.2的稀釋度的倒數。淺灰色正方形和三角形：D21。深灰色正方形和三角形：D36。

圖6A是揭露在D36從免疫小鼠獲得的血清抗體的PRNT₅₀滴度的圖。下水準虛線指示定量下限(LLOQ)，即起始稀釋度的½。

圖6B揭露針對來自與圖6A相同研究的展示SARS-CoV-2 S蛋白的Integral Molecular SARS-CoV-2 S假病毒的中和抗體的50%抑制濃度(IC₅₀)滴度。

圖7是在加有AS03佐劑的preS dTM組和未經處理的對照組中回應於用S1肽庫刺激的表現IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4和IL-5細胞因子的CD4⁺ T細胞的百分比的圖(條=平均%)。

圖8是揭露在用目標為15μg的含或不含AS03佐劑的preS dTM免疫的恒河猴中針對SARS-CoV-2融合前S蛋白的血清IgG水平的圖。在D0、D21和D28測量IgG水平。X軸上的“-”指示媒介物對照。Y軸表示EU的log標度。

圖9是揭露針對來自與圖8相同研究的展示SARS-CoV-2 S蛋白的Integral Molecular SARS-CoV-2 S假病毒的中和抗體的50%抑制濃度(IC₅₀)滴度的圖。Y軸表示IC₅₀滴度的Log₁₀值。“Conv”：人SARS-CoV-2恢復期血清(高滴度)。

圖10是揭露針對來自與圖8相同研究的野生型SARS-CoV-2病毒的中和抗體的50%微量中和(MN₅₀)滴度的圖。Y軸表示微量中和(MN)測定中MN₅₀滴度的Log₁₀值。

圖11是揭露在用目標為2.25μg劑量的含或不含佐劑的preS dTM相比於安慰劑免疫一次或兩次的倉鼠中針對SARS-CoV-2融合前S蛋白的血清IgG水平的圖。在D35(對於一劑群組在第1劑後14天，並且對於兩劑群組在第2劑後14天)測量IgG水平。滴度表示為OD=0.2的稀釋度的倒數。下水準虛線是所測試的最低稀釋度的倒數。Y軸表示EU的Log₁₀標度。

圖12是揭露在用目標為2.25μg劑量的含或不含佐劑的preS dTM相比於安慰劑免疫一次或兩次的倉鼠中針對展示SARS-CoV-2 S蛋白的Integral Molecular SARS-CoV-2 S假病毒的中和抗體的ID₅₀滴度的圖。在D35(對於一劑群組在第1劑後14天，並且對於兩劑群組在第2劑後14天)測量假病毒中和抗體水平。下水準虛線指示所測試的最低稀釋度的倒數。由於技術問題，來自安慰劑組的一隻倉鼠被從分析中移除。

圖13是揭露用目標為2.25μg劑量的含或不含AS03佐劑的preS dTM相比於安慰劑免疫一次(一劑群組，左圖)或兩次(兩劑群組，右圖)的倉鼠在用SARS-CoV-2 USA/WA1/2020(P2)毒株攻擊後第0-4天的體重變化百分比的一對圖。

圖14是揭露在用目標為2.25μg劑量的含或不含佐劑的preS dTM相比於安慰劑免疫，然後在最後一次免疫後35天用2.3E4 PFU的SARS-CoV-2 USA/WA1/2020毒株攻擊的倉鼠的兩劑群組中肺(左圖)和鼻孔(右圖)中的總病毒負荷量的一對圖。Y軸以log10標度揭露攻擊後D4和D7的基因組拷貝/克。

圖15是揭露在用目標為2.25μg劑量的含或不含佐劑的preS dTM相比於安慰劑免疫，然後在最後一次免疫後35天用2.3E4 PFU的SARS-CoV-2 USA/WA1/2020毒株攻擊的倉鼠的兩劑群組中肺(左圖)和鼻孔(右圖)中的次單元因組病毒負荷量的一對圖。Y軸以log10標度揭露攻擊後D4和D7的基因組拷貝/克。

圖16A是揭露用目標為2.25μg劑量的含或不含佐劑的preS dTM相比於安慰劑免疫，然後在最後一次免疫後35天用SARS-CoV-2 USA/WA1/2020毒株攻擊的倉鼠的肺病理評分的圖組。每個點表示單隻倉鼠。Y軸以0(正常)至3(嚴重)的標度揭露肺病理評分。條形表示組中位數。

圖16B是揭露在用α變異體攻擊後天然的和重組S免疫的倉鼠的個體每日體重減輕(%)的圖。符號表示個體資料，並且線表示組的平均值。

圖17是揭露在所有年齡組中在任何劑量的preS dTM後誘導反應的發生率的橫條圖。

圖18是揭露按年齡組的在任何劑量的preS dTM後誘導反應的發生率的一對橫條圖。

圖19是揭露在第2次注射(“PD2”)後三個劑量的preS dTM(5、10和15μg)的反應原性的橫條圖。VAT02：II期臨床試驗。

圖20是揭露在來自CoV2-06_NHP研究的食蟹猴中在第5周使用VSV-PsV(Nexelis，左圖)或慢病毒-PsV(SP REI，右圖)中和測定測量的個體D614假病毒體(PsV)中和抗體(NAb)滴度(log₁₀)的一對圖。粗條表示組的平均值，點劃線是所測試的最低稀釋度的倒數，並且VSV-PsV測定的LLOQ是1.5 log₁₀。圖下方指示合併的所有3個劑量水平的倍數變化。

圖21是揭露在食蟹猴中在第5周針對所關注的變異體的個體慢病毒-PsV NAb滴度(log₁₀)的圖。點劃線表示所測試的最低稀釋度的倒數。CoV2 preS dTM-AS03：如本文所述，用AS03配製的源自武漢毒株(D614)和/或B.1.351(南非)變異體毒株的一種或多種重組S蛋白。

圖22是揭露在mRNA初免的獼猴(左圖)、次單元初免的獼猴(中圖)和人類恢復期血清(右圖)中，在加強免疫前後的個體S結合IgG滴度(log₁₀ EU)的圖組。線和條表示組的平均值，並且水平點劃線表示所測試的最低稀釋度的倒數。

圖23是揭露如與人恢復期血清中的D614 PsV NAb滴度(右圖)相比，在mRNA初免的(左圖)和次單元初免的(中圖)獼猴中，在加強免疫前後的個體D614G(上圖)和B.1.351(下圖)PsV NAb滴度(log₁₀)的圖組。線和條表示組的平均值，並且水平點劃線表示所測試的最低稀釋度的倒數。

圖24是揭露在mRNA初免的(左圖)和次單元初免的(右圖)獼猴中，在加強免疫之後針對所關注的變異體和SARS-CoV-1的個體PsV NAb滴度的圖。

本揭露提供了針對COVID-19具有保護作用的免疫原性組合物。所述組合物包含源自SARS-CoV-2 S蛋白並且在桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統中表現的重組蛋白。所述重組蛋白可以包含S蛋白的細胞外部分(例如，S蛋白胞外域的全部或部分)，同時缺少S蛋白的全部或部分的跨膜結構域和胞質結構域。所述重組蛋白可以由三個相同的次單元多肽組成(即，同源三聚體)，每個次單元多肽含有優化用於在桿狀病毒/昆蟲細胞系統中表現的三聚化模體，所述模體促進以穩定的天然融合前三聚體構型使三個次單元多肽三聚化。所述免疫原性組合物進一步包含含生育酚的鯊烯乳劑佐劑。

本文的免疫原性組合物可以用於預防未感染SARS-CoV-2的人類個體的有症狀的COVID-19、預防中度至重度COVID-19(例如，預防住院治療)、預防無症狀感染、引發針對同源匹配的毒株的免疫原性、減少病毒負荷、和/或針對循環變異毒株進行保護。除非另有指示，否則SARS-CoV-2“變異體”是指在S蛋白中相對於原始武漢毒株(SEQ ID NO：1)具有一個或多個胺基酸差異的SARS-CoV-2毒株。

如本文所用，術語“免疫原性組合物”、“疫苗”和“疫苗組合物”可互換，並且是指含有可以引發針對SARS-CoV-2感染的預防性保護(包括緩解COVID-19症狀和改善從疾病中康復和存活)的組分的組合物。

如本文所用，兩個胺基酸序列之間的同一性百分比是指當將查詢序列和參考序列針對最大同一性而比對時，查詢序列中與參考序列中的殘基相同的胺基酸殘基的百分比。同源序列可以具有與參考序列相同或更短的長度(例如，具有參考序列的長度的至少90%(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%))。

I.免疫原性組合物的抗原組分

本揭露的免疫原性組合物包含重組SARS-CoV-2 S蛋白。穩定所述重組蛋白以保留在病毒包膜上的天然的融合前三聚構形。

所述SARS-CoV-2 S蛋白具有1273個胺基酸殘基。S蛋白的胺基酸序列可在NCBI登錄號YP_009724390下獲得。下文揭露序列。訊號序列被加框(MFVFLVLLPLVSS(SEQ ID NO：2))，並且跨膜結構域和細胞內結構域被加底線。S1和S2連接在殘基685與686之間，將所述殘基以粗體且加底線顯示。

(SEQ ID NO：1)

本文的重組S蛋白由三個相同的多肽(本文的“重組S多肽”)組成。在成熟之前，每個重組S多肽可以包含適合在昆蟲細胞中表現蛋白質的訊號序列。例如，所述訊號序列源自昆蟲或桿狀病毒蛋白。所述訊號序列也可以是人工訊號序列。在一些實施例中，所述訊號序列源自昆蟲或桿狀病毒蛋白，諸如幾丁質酶和GP64。例示性幾丁質酶訊號序列是野生型幾丁質酶訊號序列

MLYKLLNVLW LVAVSNA(SEQ ID NO：11)

或突變型幾丁質酶訊號序列

MPLYKLLNVL WLVAVSNA(SEQ ID NO：3)。

也可以使用與此幾丁質酶訊號序列同源(例如，至少95%、96%、97%、98%或99%相同)的序列，只要保留訊號肽功能即可。還參見美國專利8,541,003。

本文的重組S蛋白包含SARS-CoV-2 S蛋白胞外域序列，例如對應於SEQ ID NO：1的殘基14至1,211的序列。例示性SARS-CoV-2 S蛋白胞外域序列如下所示：

(SEQ ID NO：4)

在一些實施例中，所述重組S蛋白可以包含SEQ ID NO：4的序列，如果沒有如本文進一步所述的某些胺基酸取代的話，並且與SEQ ID NO：4至少99%(例如，至少99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%)相同。在進一步的實施例中，將SEQ ID NO：4的位置669-672處的殘基(粗體)改變為殘基GSAS(SEQ ID NO：6)和/或將SEQ ID NO：4的位置973和74處的殘基(加底線)改變為殘基PP。

在一些實施例中，所述重組S蛋白包含一種或多種在COVID-19大流行中循環的變異體中發現的常見的突變。一種此類突變是D614G突變(根據SEQ ID NO：1編號)，與世界各地當前大多數COVID-19發病情況相關。可以包括在所述重組S蛋白中的其他突變可以是以下的一種或多種：W152C、K417T/N、N440K、V445I、G446A/S、L452R、Y453F、L455F、F456L、A475V、G476S、T478I/K/A、V483A/F/I、E484Q/K/D/A、F490S/L、Q493L/R、S494P/L、Y495N、G496L、P499H、N501Y、V503F/I、Y505W/H、Q506H/K和P681H突變 (根據SEQ ID NO：1編號)。在一些實施例中，所述重組S蛋白可以包括突變N440K、T479I/K/A和D614G中的一種或多種。

在一些實施例中，所述重組S蛋白包含在諸如以下的SARS-CoV-2變異體中發現的一種或多種突變：B.1.1.7(英國或α變異體；例如，N501Y/P681H/H69/V70缺失)、B.1.351(南非或β變異體；例如，K417N/E484K/N501Y)、B1.617(印度或δ變異體；例如，L452R/E484Q突變)、P.1(巴西或γ變異體；例如，K417T/E484K/N501Y)和CAL.20C毒株(亦稱B.1.429；加利福尼亞或ε變異體；例如，W152C/L452R)。

可以修飾所述重組S蛋白中的胞外域序列以改善所述蛋白質在宿主細胞(例如，昆蟲細胞)中的表現和所產生的蛋白質的穩定性。在一些實施例中，所述S胞外域序列在S1次單元和S2次單元連接處含有去除前蛋白轉化酶(PPC)模體(弗林蛋白酶切割位點)的突變。例如，將在弗林蛋白酶切割位點處的序列RRAR(SEQ ID NO：5；對應於SEQ ID NO：1的殘基682-685)改變為GSAS(SEQ ID NO：6)。此類突變幫助保留天然S蛋白的融合前構形。

在一些實施例中，胞外域序列含有幫助將所述重組S蛋白保留處於更穩定構形的其他突變，以促進更可能導致中和反應的融合前表位的抗原呈現。例如，將對應於SEQ ID NO：1的殘基986和987的胺基酸(KV)突變為PP(參見例如，Wrapp，同上；Kirchdoerfer等人，Sci Rep.(2018)8：15701；Xiong，同上)。

本文的重組S蛋白在C末端區包含優化用於在桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統中表現的三聚化結構域，使得所述S蛋白可以採取天然S蛋白的穩定的融合前構形。可以將折疊子結構域編碼序列插入在所述S胞外域編碼序列的最後一個密碼子與終止密碼子之間。在一些實施例中，所述三聚化結構域源自T4噬菌體次要纖維蛋白(fibritin)的折疊子結構域(參見例如，Meier等人，J Mol Biol.(2004)344(4)：1051-69；WO 2018/081318)。下文揭露例示性折疊子序列：

GYIPEAPRDG QAYVRKDGEW VFLSTFL(SEQ ID NO：7)。

在一些實施例中，所述折疊子序列可以被優化以增強所述重組蛋白在宿主細胞中的表現。例如，為了增強所述重組蛋白在昆蟲細胞(例如，夜蛾屬(Spodoptera)細胞)中的表現，可以將編碼所述折疊子序列的序列進行密碼子優化。以下揭露折疊子結構域的天然編碼序列(上部)和密碼子優化版本(下部)(核苷酸點突變用星號標記)：

所述重組S蛋白可以包含標籤(例如，His標籤、FLAG標籤、HA標籤、Myc標籤或V5標籤)以促進純化。

在一些實施例中，所述重組S蛋白可以是具有以下序列的多肽的三聚體，但是一旦加工和組裝則不含訊號序列。在下文的序列中，訊號序列被加底線(殘基1-18)，折疊子序列被加雙底線(殘基1217-1243)，而相對於野生型序列的突變(人工引入的)以粗體且加底線顯示(殘基687-690和991-992)。此蛋白質在本文中也稱為“preS dTM”或“D614 preS dTM”。

(SEQ ID NO：10)

也可以使用與SEQ ID NO：10同源的序列。例如，可以使用其序列與SEQ ID NO：10至少95%(例如，至少96%、97%、98%或99%)相同的重組S多肽。所述同源序列可以具有與SEQ ID NO：10相同的長度或比SEQ ID NO：10 短或長不多於10%(例如，不多於9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)。在進一步的實施例中，將SEQ ID NO：10的位置687-690處的殘基GSAS(SEQ ID NO：6)和/或SEQ ID NO：10的位置991和992處的殘基PP保留在這種同源序列中。兩個胺基酸序列的同一性百分比可以藉由例如BLAST®使用默認參數(可在美國國家醫學圖書館的國家生物技術資訊中心(U.S.National Library of Medicine’s National Center for Biotechnology Information)網站上獲得)獲得。

在一些實施例中，使用preS dTM的變異體(在本文中也稱為“preS dTM變異體”)，即相對於SEQ ID NO：10含有一個或多個胺基酸差異的重組S蛋白。在進一步的實施例中，所述重組S蛋白源自南非或β變異體B.1.351。此變異體含有以下突變(相對於武漢毒株或SEQ ID NO：1)：(i)在NTD結構域中：L18F、D80A、D215G、L242del、A243del和L244del；(ii)在RBD結構域中：K417N、E484K、N501Y；(iii)在S1結構域中：D614G；和(iv)A701V。所述S蛋白可以包含以下序列(SEQ ID NO：13)，一旦加工並且從生產細胞中分泌則不含訊號序列(加底線；殘基1-18)。T4折疊子序列被加雙底線(殘基1214-1240)；相對於SEQ ID NO：10的變異(殘基684-687和殘基988-989)被加框並且加粗；並且人工引入的突變被加底線並且加粗。與源自武漢毒株的S蛋白相比，此蛋白質緊接在以下位置243-246處的“FQTL”之後具有三個殘基“LAL”缺失。

(SEQ ID NO：13)

在一些實施例中，本發明的免疫原性組合物是多價的(例如，二價的、三價的或四價的)。也就是說，所述組合物包含多種(例如，兩種、三種或四種)不同的重組S蛋白。在多價組合物中的一種或多種的所述重組S蛋白可以包含一種或多種在SARS-CoV-2變異體中發現的突變，諸如D614G和在新出現的變異毒株(例如，B.1.1.7、B.1.351、B.1.617、P.1和CAL.20C)中發現的突變。

在一些實施例中，本發明的免疫原性組合物是二價的。在進一步的實施例中，所述二價組合物包含源自武漢毒株的第一重組S蛋白和源自南非毒株的第二重組S蛋白。在某些實施例中，所述二價組合物包含不含訊號序列的含有SEQ ID NO：10的重組S蛋白和不含訊號序列的含有SEQ ID NO：13的重組S蛋白。

II.免疫原性組合物的佐劑組分

本發明的免疫原性組合物包含具有醫藥上可接受的成分的含生育酚的基於鯊烯的水包油(O/W)乳劑佐劑。此類佐劑(也稱為含生育酚的鯊烯乳劑佐劑)增強對所述重組S蛋白的免疫反應的幅度和/或品質。

鯊烯是一種支鏈的不飽和萜類化合物，其化學式為[(CH₃)₂C[=CHCH₂CH₂C(CH₃)]₂=CHCH₂-]₂(即，C₃₀H₅₀；CAS登記號7683-64-9)。它也被稱為2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。鯊烯顯示出良好的生物相容性並且易於代謝。

所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑含有一種或多種生育酚。可以使用α、β、γ、δ、ε和/或ξ生育酚中的任一種，但是通常使用α-生育酚(α-tocopherol或alpha-tocopherol)。D-α-生育酚和D/L-α-生育酚二者均可以使用。在一些實施例中，所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑含有α-生育酚，例如D/L-α-生育酚。

含生育酚的鯊烯乳劑佐劑通常將具有亞微米(小於1μm)的液滴尺寸。在一些實施例中，液滴平均小於500nm，例如小於200nm。低於200nm的液滴尺寸是有益的，因為它們可以促進藉由過濾滅菌。有證據表明，出於效力、製造一致性和穩定性的原因，在80至200nm範圍內的液滴尺寸是令人感興趣的(Klucker等人，J Pharm Sci.(2012)101(12)：4490-500；Shah等人，Nanomedicine (Lond)(2014)9：2671-81；Shah等人，J Pharm Sci.(2015)104：1352-61；Shah等人，Scientific Reports(2019)9：11520)。在一些實施例中，所述佐劑的平均液滴尺寸是至少50nm、至少80nm或至少100nm(例如，至少120nm)。例如，所述佐劑的平均液滴尺寸可以是50至200nm(例如，80至200nm)、120至180nm或140至180nm，諸如約160nm。

液滴尺寸均勻性是所希望的。大於0.7的多分散性指數(PdI)指示樣品具有非常廣泛的尺寸分佈，並且報告值為0意指不存在尺寸變化。合適地，所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的PdI是0.5或更小、或0.3或更小，諸如0.2或更小。

如本文所用，液滴尺寸意指乳劑中油滴的平均直徑，並且可以以多種方式確定，例如使用動態光散射和/或單粒子光學傳感的技術與諸如可從Particle Sizing Systems(美國聖巴巴拉)獲得的Accusizer^TM和Nicomp^TM系列儀器、可從Malvern Instruments(英國)獲得的Zetasizer^TM儀器或可從Horiba(日本京都)獲得的Particle Size Distribution Analyzer儀器的裝置來確定(Schartl,Light Scattering from Polymer Solutions and Nanoparticle Dispersions(2007))。動態光散射(DLS)是一種確定液滴尺寸的方法。一種用於定義平均液滴直徑的方法是Z-平均值，即藉由DLS測量的液滴總體集合的強度加權平均流體動力學尺寸。Z-平均值由對所測量的相關曲線的累積量分析匯出，其中假定單顆粒尺寸(液滴直徑)並且將單指數擬合應用於自相關函數。因此，本文對平均液滴尺寸的提及應當被視為強度加權平均值，並且理想地為Z-平均值。PdI值很容易由測量平均直徑的相同儀器提供。

為了維持穩定的亞微米乳劑，通常需要一種或多種乳化劑(即，表面活性劑)。表面活性劑可以按它們的“HLB”(Griffin親水親油平衡)分類，其中在1-10範圍內的HLB通常意指表面活性劑在油中比在水中更易溶，而在10-20範圍內的HLB意指表面活性劑在水中比在油中更易溶。許多感興趣的表面活性劑的HLB值可以很容易地獲得，或者可以藉由實驗確定，例如，聚山梨醇酯80的HLB是15.0，並且TPGS的HLB是13至13.2。脫水山梨糖醇三油酸酯的HLB是1.8。當將兩種或更多種表面活性劑共混時，所得的共混物的HLB通常由加權平均值計算。例如，聚山梨醇酯80和TPGS的70/30重量%混合物的HLB是(15.0 x 0.70)+(13 x 0.30)，即14.4。聚山梨醇酯80和脫水山梨糖醇三油酸酯的70/30重量%混合物的HLB是(15.0 x 0.70)+(1.8 x 0.30)，即11.04。

一種或多種表面活性劑通常將是可代謝(可生物降解)且生物相容的，從而適合用作藥物。表面活性劑可以包括離子(陽離子、陰離子或兩性離子)表面活性劑和/或非離子表面活性劑。僅使用非離子表面活性劑是所希望的，由於例如它們的pH無關性。因此，本發明可以使用包括但不限於以下的表面活性劑：(i)聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為Tween或聚山梨醇酯)，諸如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；(ii)環氧乙烷(EO)、環氧丙烷(PO)和/或環氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAX^TM、Pluronic^TM(例如，F68、F127或L121等級)或Synperonic^TM商品名出售，諸如線性EO/PO嵌段共聚物，例如泊洛沙姆407、泊洛沙姆401和泊洛沙姆188；(iii)辛基酚聚醚，其重複乙氧基(氧基-1,2-乙烷二基)基團的數量可以變化，其中辛基酚聚醚-9(Triton X 100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)是令人感興趣的；(iv)(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；(v)磷脂，諸如磷脂醯膽鹼(卵磷脂)；(vi)源自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為Brij®表面活性劑)，諸如聚氧乙烯-4-月桂基醚(Brij® 30、Emulgin® 104P)、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯12鯨蠟基/硬脂基醚(Eumulgin® B 1、鯨蠟硬脂醇聚醚-12或聚氧乙烯十六十八烷基醚)；(vii)脫水山梨糖醇酯(通常稱為Span)，諸如脫水山梨糖醇三油酸酯(Span® 85)、脫水山梨糖醇單油酸酯(Span® 80)和脫水山梨糖醇單月桂酸酯(Span® 20)；或(viii)生育酚衍生物表面活性劑，諸如α-生育酚-聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)。醫藥上可接受的表面活性劑的許多例子是本領域習知的。參見例如，Handbook of Pharmaceutical Excipients(2009第6版)。用於優化在鯊烯乳劑佐劑中使用的表面活性劑的選擇的方法闡述於Klucker等人，J Pharm Sci.(2012)101(12)：4490-500中。

通常，所述表面活性劑組分的HLB在10與18之間，諸如在12與17之間(例如，13至16)。這通常可以使用單一表面活性劑或在一些實施例中使用表面活性劑的混合物來實現。感興趣的表面活性劑可以包括：泊洛沙姆401、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯80、脫水山梨糖醇三油酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯12鯨蠟基/硬脂基醚，單獨、與彼此組合或與其他表面活性劑組合。感興趣的是聚山梨醇酯80、脫水山梨糖醇三油酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯12鯨蠟基/硬脂基醚，單獨或與彼此組合。感興趣的表面活性劑是聚山梨醇酯80。感興趣的表面活性劑的組合是聚山梨醇酯80和脫水山梨糖醇三油酸酯。感興趣的表面活性劑的進一步的組合是脫水山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯十六十八烷基醚。

在某些實施例中，所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑包含一種表面活性劑，諸如聚山梨醇酯80。在一些實施例中，所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑包含兩種表面活性劑，諸如聚山梨醇酯80和脫水山梨糖醇三油酸酯或脫水山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯十六十八烷基醚。在其他實施例中，所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑包含三種或更多種表面活性劑，諸如三種表面活性劑。

理想地，鯊烯與生育酚的重量比是20或更小(即，每重量單位的生育酚20重量單位的鯊烯或更小，或者換言之，每20重量單位的鯊烯至少1重量單位的生育酚)，諸如10或更小。合適地，鯊烯與生育酚的重量比是0.1或更大。典型地，鯊烯與生育酚的重量比是0.1至10、0.2至5或0.3至3，諸如0.4至2。合適地，鯊烯與生育酚的重量比是0.72至1.136、0.8至1或0.85至0.95，諸如0.9。

典型地，鯊烯與表面活性劑的重量比是0.73至6.6、1至5或1.2至4。合適地，鯊烯與表面活性劑的重量比是1.71至2.8、2至2.4或2.1至2.3，諸如2.2。

單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的鯊烯的量通常是至少1.2mg。通常，單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的鯊烯的量是50mg或更少。單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的鯊烯的量可以是1.2至20mg(例如，1.2至15mg)。單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的鯊烯的量可以是1.2至2mg、2至4mg、4至8mg或8至12.1mg。例如，單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的鯊烯的量可以是1.21至1.52mg、2.43至3.03mg、4.87至6.05mg或9.75至12.1mg。

單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的生育酚的量通常是至少1.3mg。通常，單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的生育酚的量是55mg或更少。單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的生育酚的量可以是1.3至22mg(例如，1.3至16.6mg)。單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的生育酚的量可以是1.3至2mg、2至4mg、4至8mg或8至13.6mg。例如，單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的生育酚的量可以是1.33至1.69mg、2.66至3.39mg、5.32至6.77mg或10.65至13.53mg。

單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的表面活性劑的量通常是至少0.4mg。通常，單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的表面活性劑的量是18mg或更少。單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的表面活性劑的量可以是0.4至9.5mg(例如，0.4至7mg)。單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的表面活性劑的量可以是0.4至1mg、1至2mg、2至4mg或4至7mg。例如，單個劑量(諸如單個人劑量)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的表面活性劑的量可以是0.54至0.71mg、1.08至1.42mg、2.16至2.84mg或4.32至5.68mg。

在某些實施例中，所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑可以包含以下或基本上由以下組成：鯊烯、生育酚、表面活性劑和水。例如，除了鯊烯、生育酚、表面活性劑和水之外，含生育酚的鯊烯乳劑佐劑可以根據預期的最終呈現和疫苗接種策略根據希望或需要含有另外的組分，諸如緩衝劑和/或張力調節劑，例如改良的磷酸鹽緩衝鹽水(磷酸二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉和氯化鉀)。

可以應用高壓均質法(HPH或微流化)以產生具有均勻小的液滴尺寸和長期穩定性的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑(參見例如，EP 0868918B1和WO 2006/100109)。簡言之，可以在氮氣環境下配製由鯊烯和生育酚構成的油相。水相是單獨製備的，通常由注射用水或磷酸鹽緩衝鹽水和聚山梨醇酯80構成。在均質化和微流化之前將油相和水相合併(諸如以1：9(油相體積比水相體積)的比率)，諸如藉由單次藉由線上均質器和三次藉由微流化器(以約15000psi)。然後，可以將所得的乳液無菌過濾，例如藉由兩列串聯的兩個0.5/0.2μm過濾器(即，0.5/0.2/0.5/0.2)(參見例如，WO 2011/154444)。操作理想地在惰性環境(例如，氮氣)下進行。可以施加正壓(參見例如，WO 2011/154443)。

國際專利申請WO 2020/160080和Lodaya等人(J Control Release(2019)316：12-21)描述了作為自乳化佐劑系統(SEAS)的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑及其製造。

在一些實施例中，所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑是AS03佐劑。參見例如，WO 2006/100109；Garçon等人，Expert Rev Vaccines(2012)11：349-66；Cohet等人，Vaccine(2019)37(23)：3006-21。此佐劑包括鯊烯、α-生育酚和聚山梨醇酯80。對於成年人用途，單次全劑量的所述佐劑(也稱為AS03_A)是0.25mL的水包油乳劑，所述水包油乳劑含有10.69mg鯊烯、11.86mg α-生育酚和4.86mg聚山梨醇酯80和PBS(Fox,Molecules(2009)14：3286-312；Morel等人，Vaccine(2011)29：2461-73)。還參見下表9。

還已經描述了某些降低劑量的AS03(WO 2008/043774)，包括AS03_B(1/2劑量)、AS03_C(1/4劑量)和AS03_D(1/8劑量)(Carmona Martinez等人，Hum Vaccin Immunother.(2014)10(7)：1959-68)。因此，在需要的情況下，所述水包油乳劑佐劑每(單)劑僅含有1/2、1/4或1/8的量的作為AS03_A的鯊烯、α-生育酚和聚山梨醇酯80。這些降低的劑量(例如AS03_B或AS03_C)在需要降低反應原性時(例如，在兒科個體中)可能有用。例如，單佐劑劑量可以含有：(i) 5.34mg鯊烯、5.93mg α-生育酚和2.43mg聚山梨醇酯80(例如，AS03_B；125μL的下表9所示的水包油乳劑)；(ii)2.67mg鯊烯、2.97mg α-生育酚和1.22mg聚山梨醇酯80(例如，AS03_C；62.5μL的下表9所示的水包油乳劑)；或(iii)1.34mg鯊烯、1.48mg α-生育酚和0.61mg聚山梨醇酯80(例如，AS03_D；即31.25μL的下表9所示的水包油乳劑)。通常，單個劑量的AS03佐劑的最終體積是0.25mL或0.5mL。因此，如果與以上所需量的鯊烯、α-生育酚和聚山梨醇酯80相匹配所需的濃縮水包油乳劑物料(例如，下表9的水包油乳劑)的體積低於0.25mL或0.5mL，可以用磷酸鹽緩衝鹽水將此體積補足至所需體積(0.25mL或0.5mL)。

為了限制不希望的降解，含生育酚的鯊烯乳劑通常應當在有限的氧氣暴露條件下儲存，例如在頂部空間有限的容器中和/或在氮氣下儲存。

冠狀病毒疫苗的一個潛在的安全問題是在暴露於野生型病毒後增強疫苗免疫病理學的能力(Smatti等人，Front Microbiol.(2018)9：2991)。對於這種現象(稱為病毒感染的抗體依賴性增強或免疫增強)的分子機制仍未完全瞭解。在冠狀病毒感染的背景下，多種因素被認為可能導致這種現象。這些因素包括所靶向的表位、抗原的遞送方法、免疫反應的幅度、結合抗體與功能抗體之間的平衡、具有功能特徵(諸如與特定Fc受體結合)的抗體的引發和T輔助細胞反應的特性(Tseng等人，PLoS One(2012)7(4)；Yasui等人，J Immunol.(2008)181(9)：6337-48；Czub等人，Vaccine(2005)23(17-18)：2273-9)。預期包括包含佐劑(諸如AS03)的佐劑配製物的配製物將進一步增強中和抗體反應的幅度，因此緩解病毒感染的抗體依賴性增強，這被認為主要是由非中和抗體介導的。

III.重組S蛋白的產生

本發明的免疫原性組合物的病毒抗原組分可以藉由重組技術在已經用桿狀病毒表現載體(諸如源自苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)的表現載體)轉導的昆蟲細胞(例如，果蠅屬(Drosophila)S2細胞、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞、Sf9細胞、Sf21、High Five細胞或expresSF+細胞)中產生。桿狀病毒(諸如AcMNPV)在被感染的細胞的細胞核內形成大的蛋白質結晶包含體，其中稱為多角體的單一多肽占蛋白質品質的大約95%。多角體的基因在桿狀病毒基因組中以單拷貝形式存在，並且能夠很容易地被外源基因替換，因為它對於在培養細胞中的病毒複製不是必需的。表現外源基因(諸如所述重組S多肽)的重組桿狀病毒是藉由桿狀病毒基因組DNA與含有所述外源基因的轉移質體之間的同源重組的方式構建的。

在某些實施例中，所述轉移質體含有所述重組S多肽的表現盒，其中所述表現盒側接在AcMNPV中天然側接多角體基因座的序列(圖1)。將所述轉移質體與桿狀病毒基因組DNA共轉染到宿主細胞中，所述基因組DNA已經用酶(例如，Bsu36I)線性化，從而去除了多角體基因和多角體基因座下游的一部分必需基因，使得親代病毒DNA分子不能複製，從而使基因組DNA無感染性；然而，這部分必需基因存在於所述轉移質體上。在共轉染後，所述轉移質體與所述線性化基因組DNA之間的同源重組使基因組病毒DNA重新環化，從而恢復其複製能力。由於線性化前的原始桿狀病毒基因組DNA含有多角體基因，由非重組病毒形成的噬斑是混濁的(由於被感染細胞中的結晶包含體)，而由重組病毒形成的噬斑是澄清的。

所述桿狀病毒表現載體可以被工程化以增加所述重組蛋白的產量。在一些實施例中，所述桿狀病毒載體剔除一個或多個基因。桿狀病毒基因組含有對在細胞培養中的病毒複製和重組蛋白的表現非必需的基因。此類基因的缺失可以消除不必要的基因負擔，幫助產生更穩定的桿狀病毒表現載體，減少已建立的昆蟲細胞感染所需的時間，並且導致重組蛋白的更有效的表現。在一些實施例中，多角體啟動子藉由在其中包括多於一個拷貝的突發(burst)序列而被修飾；例如，所述啟動子可以被工程化以包括兩個突發序列以產生含有核苷酸序列CTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATA(SEQ D NO：12)的兩個重複序列的“雙突發”(DB)啟動子。參見例如，Manohar等人，Biotechnol Bioeng.(2010)107：909-16。為了將病毒抗原編碼序列整合到桿狀病毒表現載體中，可以藉由同源重組將攜帶所述編碼序列的轉移質體整合到編碼桿狀病毒基因組的DNA中。病毒的身份可以藉由例如來自純化的桿狀病毒DNA的S蛋白編碼序列插入物的DNA印跡或Sanger測序分析和在被感染的昆蟲細胞中產生的重組蛋白的免疫印跡分析來確認。參見例如，美國專利6,245,532和8,541,003。

將含有病毒抗原表現構建體的宿主細胞在生物反應器(例如，45 L、60 L、459 L、2000 L或20,000 L)中以例如分批工藝或補料分批工藝培養。可以藉由例如流過模式或結合與洗脫模式的柱層析法從細胞培養物中分離所產生的S蛋白。例子是離子交換樹脂和親和樹脂，諸如小扁豆凝集素瓊脂糖凝膠；和混合模式陽離子交換-疏水相互作用柱(CEX-HIC)。可以將所述蛋白質濃縮，藉由超濾交換緩衝液，並且可以藉由0.22μm過濾器過濾來自超濾的滲餘物。參見例如，McPherson等人，“Development of a SARS Coronavirus Vaccine from Recombinant Spike Protein Plus Delta Inulin Adjuvant,”第4章，Sunil Thomas(編輯)，Vaccine Design：Methods and Protocols：第1卷：Vaccines for Human Diseases,Methods in Molecular Biology,Springer,New York,2016。還參見美國專利5,762,939。

桿狀病毒表現載體系統(BEVS)為開發理想的次單元疫苗提供了一種極好的方法。可以藉由此類系統在大約八周內生產出重組蛋白。當存在大流行威脅時，快速生產尤其重要。此外，桿狀病毒是安全的，因為它們的宿主範圍很窄，局限於一些分類學相關的昆蟲物種，並且尚未觀察到在哺乳動物細胞中複製。此外，已知很少有微生物能夠在昆蟲細胞和哺乳動物細胞二者中複製；因此，在由昆蟲細胞製成的臨床產品中外來因子污染的可能性非常低。此外，人通常對來自作為桿狀病毒天然宿主的昆蟲的蛋白質沒有預先存在的免疫，因為這些昆蟲不咬人；因此，不太可能對在BEV系統中製造的臨床產品產生過敏反應。此外，儘管添加到昆蟲細胞的蛋白質中的碳水化合物部分似乎沒有它們的哺乳動物細胞表現的對應物上的碳水化合物部分複雜，但昆蟲細胞表現的糖蛋白和哺乳動物細胞表現的糖蛋白的免疫原性似乎是相當的。在桿狀病毒系統中表現的全長蛋白通常藉由調節表面活性劑濃度自組裝成天然蛋白通常採用的高級結構。最終，由於多角體啟動子的極高活性，BEVS系統非常高效，這允許以顯著降低的成本高水平地生產重組蛋白。

IV.疫苗的配製和包裝

所述一種或多種重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑可以經由多種合適的途徑投予，包括腸胃外(諸如肌內或皮下)投予。如上所述，所述免疫原性組合物可以是單價的或多價的。合適地，所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑被配製用於肌內(IM)注射。所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑可以以混合物形式向個體投予，例如藉由肌內注射到個體上臂的三角肌中來投予。可替代地，可以藉由相同或不同的途徑，在相同或不同的位置並且在相同或不同的時間分別投予所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑。

當作為單獨的配製物投予時，將所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑理想地投予具有足夠空間接近度的位置，使得充分保留佐劑效應。例如，空間接近度足以維持在投予相同位置所見的佐劑效應的至少50%、至少75%或至少90%。在投予相同位置所見的佐劑效應被定義為，與僅投予重組S蛋白相比，因為將重組S蛋白和含生育酚的鯊烯乳劑佐劑投予相同位置而觀察到的增加水平。將所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑理想地投予引流至相同淋巴結的位置，諸如投予相同肢體或投予相同肌肉。合適地，將重組S蛋白和含生育酚的鯊烯乳劑佐劑肌內投予相同肌肉。在某些實施例中，將所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑投予相同位置。投予位置的空間分離可以是至少5mm，諸如至少1cm。投予位置的空間分離可以小於10cm，諸如隔開小於5cm。

當作為單獨的配製物投予時，理想地以足夠的時間接近度投予所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑，使得充分維持佐劑效應。例如，時間接近度足以維持在相同時間投予所見的佐劑效應的至少50%、至少75%或至少90%。在相同時間投予所見的佐劑效應被定義為與投予重組S蛋白而不投予含生育酚的鯊烯乳劑佐劑相比，因為在(基本上)相同時間投予而觀察到的增加水平。當作為單獨的配製物投予時，重組S蛋白和含生育酚的鯊烯乳劑佐劑可以在12小時內投予。合適地，將所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑在6小時內、在2小時內或在1小時內(諸如在30分鐘內或在15分鐘內(例如，在5分鐘內))投予。所述重組S蛋白與所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的投予之間的延遲可以是至少5秒(例如，10秒)或至少30秒。當作為單獨的配製物投予時，如果在延遲的情況下投予所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑，則可以首先投予所述重組S蛋白，然後投予所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑。可替代地，首先投予所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑，然後投予所述重組S蛋白。適當的時間接近度可以取決於順序或投予。理想地，在沒有故意延遲的情況下投予所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑(考慮到多次投予的實用性)。

除了用於直接投予的重組S蛋白和含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的共同配製的或單獨配製的呈現形式之外，所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑最初可以以促進製造、儲存和分銷的多種形式提供。例如，某些組分在液體形式下的穩定性可能有限，某些組分可能無法乾燥，某些組分在混合時可能不相容(短期或長期)。無論是否在投予時共同配製重組S蛋白和含生育酚的鯊烯乳劑，它們均可以在單獨的容器中提供，隨後將其內容物合併。所述重組S蛋白可以以液體或乾燥(例如凍乾)形式提供；所選擇的形式將取決於諸如重組S蛋白的精確性質(例如，重組S蛋白是否能夠乾燥)或可能存在的其他組分等因素。通常以液體形式提供所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑。

所述免疫原性組合物可以呈臨時配製物的形式，其中剛好在使用前或使用時使所述抗原和所述佐劑接觸。例如，所述抗原可以在注射之前與所述佐劑(乳劑)按體積比體積混合。因此，本揭露提供了一種製品，諸如套組，所述製品在單獨的容器(例如，預處理的玻璃小瓶或安瓿)中提供本發明的免疫原性組合物的抗原組分和佐劑，並且在注射之前將所述佐劑和所述抗原組分混合；在一些實施例中，在所述製品中提供重新懸浮凍乾組分(如果有的話)所需的溶液。可替代地，將所述抗原組分和所述佐劑混合並且提供在同一容器中，並且可以向需要疫苗接種的個體直接投予所述組合物。所述製品也可以包括使用說明書。在一些情況下，每個容器的內容物可以旨在作為第一配製物和第二配製物分開投予。

在一些實施例中，所述重組S蛋白可以呈乾燥形式，並且所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑可以呈液體形式。在此類情況下，第一容器和第二容器的內容物可以旨在合併以提供用於投予的共配製物。可替代地，所述重組S蛋白可以旨在在每個容器的內容物用於作為第一配製物和第二配製物分開投予之前被重構。

用於重構的液體的精確組成將取決於被重構的容器的內容物和重構的內容物的後續用途二者，例如，它們是旨在直接投予還是在投予前可以與其他組分合併。旨在在投予前與其他組合物合併的組合物(諸如含有重組S蛋白或含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的那些)本身不需要具有生理學上可接受的pH或生理學上可接受的張力；旨在投予的配製物應當具有生理學上可接受的pH並且應當具有生理學上可接受的滲透壓。

考慮到所述組合物的組分和投予於人類個體的必要適合性，調節液體製劑的pH。配製物的pH通常是至少4、至少5或至少5.5，諸如至少6。配製物的pH通常是9或更小、8.5或更小、或8或更小，諸如7.5或更小。配製物的pH可以是4至9、5至8.5或5.5至8，諸如6.5至7.4(例如，6.5至7.1，諸如約6.8)。

對於腸胃外投予，溶液應當具有生理學上可接受的滲透壓以避免過度的細胞變形或裂解。生理學上可接受的滲透壓通常將意指溶液將具有近似等滲或輕度高滲的滲透壓。合適地，用於投予的配製物的滲透壓將是250至750mOsm/kg、250至550mOsm/kg或270至500mOsm/kg，諸如270至400mOsm/kg(例如，約280mOsm/kg)。滲透壓可以根據業內已知的技術測量，諸如藉由使用可商購獲得的滲透壓計(例如，可從Advanced Instruments Inc.(美國)獲得的Advanced® Model 2020)來測量。

用於重構的液體將基本上是水性的，諸如注射用水、磷酸鹽緩衝鹽水等。如上文提及的，對緩衝劑和/或張力調節劑的需要將取決於被重構的容器的內容物和重構的內容物的後續用途二者。緩衝劑可以選自乙酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、馬來酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽和TRIS。所述緩衝劑可以是磷酸鹽緩衝液，諸如Na/Na₂PO₄、Na/K₂PO₄或K/K₂PO₄。合適的緩衝劑是改良的磷酸鹽緩衝鹽水。

合適地，在本發明中使用的配製物具有在0.05mL與1mL之間(諸如在0.1與0.6mL之間)的劑量體積，或者具有0.45至0.55mL(諸如0.5mL)的劑量體積。所使用的組合物的體積可以取決於個體、遞送途徑和位置(其中藉由皮內途徑給予較小劑量)或所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑二者是否遞送至相同位置。用於藉由諸如肌內等途徑投予的典型的人類劑量在200μl至750mL的範圍內(諸如400至600μl)，或者是約500μl。

如果所述重組S蛋白呈液體形式並且所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑呈液體形式，如果兩種液體旨在合併例如用於共同配製的話，則每種液體的體積可以相同或不同。用於合併的體積通常將在10：1至1：10的範圍內，諸如2： 1至1：2。合適地，每種液體的體積將基本上相同，諸如相同。例如，250μl體積的呈液體形式的重組S蛋白可以與250μl體積的呈液體形式的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑合併，以提供500μl體積的共配製物劑量，所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑中的每一種在合併期間被稀釋2倍。

因此，含生育酚的鯊烯乳劑佐劑可以製備為濃縮物，預期在投予前藉由含重組S蛋白的液體組合物稀釋。例如，含生育酚的鯊烯乳劑佐劑可以以雙倍強度製備，預期在投予前藉由等體積的含重組S蛋白的組合物稀釋。

在投予時鯊烯的濃度可以在0.8至100mg/mL的範圍內(例如，1.2至48.4mg/ml)。

重組S蛋白和含生育酚的鯊烯乳劑佐劑(無論是旨在共同配製還是單獨配製)均可以以多種物理容器(諸如小瓶或預填充的注射器)的形式提供。

在一些實施例中，以單劑量的形式提供所述重組S蛋白、所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑或包含重組S蛋白和含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的所述套組。在其他實施例中，以多劑量形式(諸如含有2、5或10個劑量)提供所述重組S蛋白、所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑或包含重組S蛋白和含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的所述套組。多劑量形式(諸如包含10個劑量的那些)可以以具有單個劑量的一個部分(例如，重組S蛋白)的多個容器和具有多個劑量的第二部分(例如，含生育酚的鯊烯乳劑佐劑)的單個容器的形式提供，或者可以以具有多個劑量的一個部分(重組S蛋白)的單個容器和具有多個劑量的第二部分(含生育酚的鯊烯乳劑佐劑)的單個容器的形式提供。

通常將在容器之間轉移液體(諸如從小瓶到注射器)以提供“過量(overage)”，從而確保可以便利地轉移所需的全部體積。所需的過量水平將視情況而定，但是應當避免過度過量以減少浪費，並且過量不足可能會導致實際困難。過量可以是大約每劑20至100μl，諸如30μl或50μl。例如，雙倍濃縮的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的典型的10劑容器(每劑250μl)可以含有約2.85至3.25mL的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑。

可以存在穩定劑或防腐劑。在提供多劑量容器的情況下，它們可能是有用的，因為可以在一段時間內向個體投予一定劑量的一種或多種最終配製物。此類穩定劑/防腐劑包括但不限於對羥基苯甲酸酯、硫柳汞、氯丁醇、苯紮氯銨和螯合劑(例如，EDTA)。

呈液體形式的重組S蛋白和含生育酚的鯊烯乳劑佐劑可以以多室的注射器的形式提供。多室的注射器的使用為所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的單獨順序投予提供了便利的方法。多室的注射器可以被配製為提供所述重組S蛋白和所述含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的同時但分開的遞送，它們可以被配製為提供順序遞送(以任一順序)，或者它們可以被配製為在合併投予之前促進混合。在多室的注射器的其他配製中，所述重組S蛋白可以以乾燥形式(例如，冷凍乾燥)在一個室中提供，並且在投予前由另一個室中包含的含生育酚的鯊烯乳劑佐劑重構。多室的注射器的例子可以在諸如WO 2016/172396等公開文本中找到，但是一系列其他配製也是可能的。

在一些實施例中，單位劑量是以每劑0.25mL或0.5mL提供的1-50或5-50(例如，2.5、5、10、15、30或45)μg重組S蛋白。

在一些實施例中，所述單位劑量(即，單個劑量)對應於在磷酸鹽緩衝鹽水(足量0.25mL)中配製的5或10μg重組S蛋白，所述磷酸鹽緩衝鹽水含濃度為0.2%的Tween 20®而不含防腐劑或抗生素。可以在多劑量小瓶中提供所述抗原單位劑量。它們可以在使用前與單個劑量的AS03佐劑(例如，AS03_A、AS03_B或AS03_C)混合。

在一些實施例中，一個單位劑量含有如下表A所示的成分。

在一些實施例中，對於藉由肌內注射的每次人類疫苗接種，在注射之前，將在0.25mL的無菌、澄清且無色的PBS溶液中的2.5μg preS dTM或變異體(參見例如，表A、下文的表8或表12)與0.25mL的AS03(AS03_A；參見例如，表9)按體積比體積混合，以達到0.5mL的最終注射體積。在進一步的實施例中，所述變異體是β變異體(例如，不含訊號序列的SEQ ID NO：13)。在其他實施例中，用於與抗原溶液混合的AS03佐劑的劑量是表9所示的0.25mL的所述乳劑的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此類實施例中，可以任選地將磷酸鹽緩衝鹽水添加至AS03乳劑中以達到0.25mL的佐劑劑量的最終體積(參見例如，表9)。

在一些實施例中，對於藉由肌內注射的每次人類疫苗接種，在注射之前，將在0.25mL的無菌、澄清且無色的PBS溶液中的5μg preS dTM或變異體(參見例如，表A、下文的表8或表12)與0.25mL的AS03(AS03_A)按體積比體積混合，以達到0.5mL的最終注射體積。在進一步的實施例中，所述變異體是β變異體(例如，不含訊號序列的SEQ ID NO：13)。在其他實施例中，用於與抗原溶液混合的AS03佐劑的劑量是表9所示的0.25mL的所述乳劑的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此類實施例中，可以任選地將磷酸鹽緩衝鹽水添加至AS03乳劑中以達到0.25mL的佐劑劑量的最終體積(參見例如，表9)。

在一些實施例中，對於藉由肌內注射的每次人類疫苗接種，在注射之前，將在0.25mL的無菌、澄清且無色的PBS溶液中的10μg preS dTM或變異體(參見例如，表A、下文的表8或表12)與0.25mL的AS03(AS03_A)按體積比體積混合，以達到0.5mL的最終注射體積。在進一步的實施例中，所述變異體是β變異體(例如，不含訊號序列的SEQ ID NO：13)。在其他實施例中，用於與抗原溶液混合的AS03佐劑的劑量是表9所示的0.25mL的所述乳劑的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此類實施例中，可以任選地將磷酸鹽緩衝鹽水添加至AS03乳劑中以達到0.25mL的佐劑劑量的最終體積(參見例如，表9)。

在一些實施例中，對於藉由肌內注射的每次人類疫苗接種，在注射之前，將在0.25mL的無菌、澄清且無色的PBS溶液中的15μg preS dTM或變異體(參見例如，表A、下文的表8或表12)與0.25mL的AS03(AS03_A)按體積比體積混合，以達到0.5mL的最終注射體積。在進一步的實施例中，所述變異體是β變異體(例如，不含訊號序列的SEQ ID NO：13)。在其他實施例中，用於與抗原溶液混合的AS03佐劑的劑量是表9所示的0.25mL的所述乳劑的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此類實施例中，可以任選地將磷酸鹽緩衝鹽水添加至AS03乳劑中以達到0.25mL的佐劑劑量的最終體積(參見例如，表9)。

在一些實施例中，對於藉由肌內注射的每次人類疫苗接種，在注射之前，將在0.25mL的無菌、澄清且無色的PBS溶液中的45μg preS dTM或變異體(參見例如，表A、下文的表8或表12)與0.25mL的AS03(AS03_A)按體積比體積混合，以達到0.5mL的最終注射體積。在進一步的實施例中，所述變異體是β變異體(例如，不含訊號序列的SEQ ID NO：13)。在其他實施例中，用於與抗原溶液混合的AS03佐劑的劑量是表9所示的0.25mL的所述乳劑的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此類實施例中，可以任選地將磷酸鹽緩衝鹽水添加至AS03乳劑中以達到0.25mL的佐劑劑量的最終體積(參見例如，表9)。

在一些實施例中，對於藉由肌內注射的每次人疫苗接種，在注射之前，將在0.25mL的無菌、澄清且無色的PBS溶液中的總共10μg的兩種不同的重組S蛋白(例如，preS dTM或變異體諸如源自B.1.351的變異體(例如，不含訊號序列的SEQ ID NO：13)；各5μg)(參見例如，表A、下文的表8或表12)與0.25mL的AS03(AS03_A)按體積比體積混合，以達到0.5mL的最終注射體積。在其他實施例中，用於與抗原溶液混合的AS03佐劑的劑量是表9所示的0.25mL 的所述乳劑的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此類實施例中，可以任選地將磷酸鹽緩衝鹽水添加至AS03乳劑中以達到0.25mL的佐劑劑量的最終體積(參見例如，表9)。

在一些實施例中，所述免疫原性組合物是單價的並且每劑含有10μg的單一重組S蛋白(例如，preS dTM或preS dTM變異體)。所述注射用組合物包含AS03佐劑(參見例如，表9)。在進一步的實施例中，所述變異體是β變異體(例如，不含訊號序列的SEQ ID NO：13)。

在一些實施例中，所述免疫原性組合物是二價的並且以每劑各自5μg含有兩種不同的重組S蛋白(例如，preS dTM和preS dTM變異體)。所述注射用組合物包含AS03佐劑(參見例如，表9)。在進一步的實施例中，所述變異體是β變異體(例如，不含訊號序列的SEQ ID NO：13)。

在一些實施例中，所述免疫原性組合物是三價的並且以每劑各自3.3μg含有三種不同的重組S蛋白(例如，preS dTM和兩種preS dTM變異體)。所述注射用組合物包含AS03佐劑(參見例如，表9)。在進一步的實施例中，所述變異體中的一種是β變異體(例如，不含訊號序列的SEQ ID NO：13)。

在一些實施例中，所述免疫原性組合物是單價的並且以每劑2.5μg含有重組S蛋白(例如，preS dTM)。所述注射用組合物包含AS03佐劑(參見例如，表9)。

在一些實施例中，本揭露的疫苗產品可以在2℃-8℃下儲存。

V.疫苗的用途

本發明通常旨在用於哺乳動物個體，例如人類個體。

所述個體可以是任何年齡。在一個實施例中，所述個體是人類嬰兒(至多12月齡)。在一個實施例中，所述個體是人類兒童(小於18歲)。在一個實施例中，所述個體是成年人(18-59歲)。在一個實施例中，所述個體是老年人(60歲或以上)。向年幼兒童(諸如小於12歲)投予的劑量可以相對於當量的成年人劑量降低諸如50%。在一些實施例中，將投予2.5μg劑量的抗原。在一些實施例中，將投予5μg劑量的抗原。在一些實施例中，將投予10μg劑量的抗原。在一些實施例中，將投予15μg劑量的抗原。在一些實施例中，將投予45μg劑量的抗原。

合適地，所述個體未感染SARS-CoV-2。在某些實施例中，所述個體先前未感染SARS-CoV-2。在其他實施例中，所述個體先前已經感染SARS-CoV-2。

適合藉由本揭露的疫苗組合物進行疫苗接種的個體包括易感SARS-CoV-2感染的人。可以根據一般熟習此項技術者熟知的標準技術(包括所用佐劑的類型、投予途徑以及個體的年齡和體重)確定待向個體投予的疫苗的量。在一些實施例中，將投予2.5μg劑量的與含生育酚的鯊烯乳劑佐劑混合的抗原。在一些實施例中，將投予5μg劑量的與含生育酚的鯊烯乳劑佐劑混合的抗原。在一些實施例中，將投予10μg劑量的與含生育酚的鯊烯乳劑佐劑混合的抗原。在一些實施例中，將投予15μg劑量的與含生育酚的鯊烯乳劑佐劑混合的抗原。在一些實施例中，將投予45μg劑量的與含生育酚的鯊烯乳劑佐劑混合的抗原。

所述組合物可以以單個劑量或以一系列劑量(例如，一至三個初次劑量以及一個或多個隨後的“加強”劑量)投予。在一些實施例中，第一劑量和第二劑量將隔開約14天(或約2周)至約六個月。例如，劑量之間的間隔可以隔開14-35天(例如，約21或28天)或約2-5周(例如，約3或4周)或約一個月。

在一些實施例中，單個劑量是約0.25mL的如表A、表8或表12所示的抗原組合物(含有5或10μg重組S蛋白)和AS03佐劑(例如，AS03_A、AS03_B或AS03_C)的混合物。在進一步的實施例中，向個體給予兩個此類劑量，每個劑量隔開21天或3周。在其他進一步的實施例中，向個體給予兩個此類劑量，每個劑量隔開28天或4周或一個月。

以預防有效量向個體提供所述疫苗組合物，其可以以單個劑量或以一系列劑量投予。“預防有效量”是指誘導足以預防或延遲COVID-19的一種或多種症狀的發作和/或降低其頻率和/或嚴重程度的免疫反應所需的量。在一些實施例中，所述量引發免疫反應，所述免疫反應部分或完全降低一種或多種症狀的嚴重程度和/或個體經歷一種或多種症狀的時間、降低攻擊後患上已建立的感染的可能性、減慢疾病的進展、任選地延長存活期、產生針對SARS-CoV-2的中和抗體和SARS-CoV-2 S蛋白特異性T細胞反應。

在一些實施例中，本揭露提供了如下表B所示的疫苗接種方案。所述方案預防或改善COVID-19，諸如其一種或多種症狀；或預防與COVID-19相關的住院治療或死亡或降低其風險。在一種方案中，向未患COVID-19或未接種的個體肌內接種免疫原性組合物，所述組合物是藉由將0.25mL的水性抗原組分和0.25mL的AS03佐劑(例如，AS03_A、AS03_B或AS03_C，其體積可以用PBS補足至0.25mL，如果需要的話)混合來製備的。0.25mL水性抗原組分可以是單價的(MV)並且包含在PBS中配製的10μg的D614 preS dTM或B.1.351(β)preS dTM，如表A所示。可替代地，所述水性抗原組分是二價的(BV)並且包含在 PBS中配製的5μg的D614 preS dTM和5μg的β pr，eS dTM，如表A所示。在所述方案中，隔開三周或四周向所述個體投予兩次所述免疫原性組合物。

VI.疫苗作為加強劑的用途

本發明的疫苗組合物可以用作通用加強劑。本發明的疫苗組合物可以用作先前投予的COVID-19疫苗的加強劑，用作初免-加強疫苗接種方案(例如，異源或同源初免-加強疫苗接種方案)的一部分。所述方案中的初免劑量(即，初次疫苗)可以是基於以下的疫苗：mRNA、DNA、病毒載體(例如，腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、水泡性口炎病毒載體、痘苗病毒載體或麻疹病毒載體)、肽或蛋白質、病毒樣顆粒(VLP)、衣殼樣顆粒(CLP)、減毒活病毒、不活化病毒(滅活疫苗)等。在一些實施例中，所述初次疫苗含有與加強疫苗相同的抗原(即，同源初免-加強疫苗接種方案)。部分由於再利用(尤其是對於病毒載體初免)並且由於藉由加強提供的定性和定量不同的免疫特徵，初免-加強方案可能是有利的。預期此類方案將在接種個體中在抗病毒免疫的廣度、效力和持久性方面產生增強的結局。

包含用於在體內表現SARS-CoV-2抗原(例如，S蛋白抗原)的遺傳物質(例如，mRNA、DNA或病毒載體)的疫苗統稱為“基因疫苗”。例如，基因疫苗包括含有mRNA、含或不含化學修飾或核苷酸類似物的那些疫苗。mRNA可以被封裝(例如，在脂質奈米顆粒(LNP)中)或與載體或佐劑(例如，魚精蛋白或皂苷)複合。mRNA可以是自我複製的或非自我複製的。本發明的疫苗組合物可用作基因疫苗的加強劑，因為基因疫苗可能在接種個體中引發抗藥物免疫反應，所述免疫反應破壞並且因此降低相同疫苗的後續劑量的功效。在此類情況下，不能向相同的個體重複(例如，季節性地)投予所述基因疫苗。

在本發明的初免-加強方案的一些實施例中，所述初免劑量可以是編碼重組S蛋白的基因疫苗，所述重組S蛋白可以包括SARS-CoV-2 S蛋白的胞外域。在一些實施例中，所述重組S蛋白是包含來自SARS-CoV-2胞外域或受體結合結構域(RBD)的序列和三聚化序列(例如，天然SARS-CoV-2 S三聚化結構域)的多肽的三聚體。在一些實施例中，所編碼的重組S蛋白可以包含促進所述重組S蛋白從接種個體的生產細胞中分泌的訊號肽序列(例如，來自SARS-CoV-2(諸如S蛋白)的訊號肽)。

在一些實施例中，所述基因疫苗編碼出於特定的設計目的與參考(例如，天然存在的)S蛋白相比具有一種或多種突變的S蛋白或其抗原部分。例如，所編碼的S蛋白可以含有(i)在弗林蛋白酶切割位點處的突變以防止弗林蛋白酶切割(例如，“GSAS”(SEQ ID NO：6)突變)；(ii)改變內質網(ER)保留的突變；(iii)消除推定的糖基化的突變；(iv)引入可替代訊號肽的突變；和/或(v)穩定S多肽的融合前構形的突變(例如，“PP”突變)。

在一些實施例中，由所述基因疫苗編碼的S蛋白可以包括天然存在的突變，諸如D614G突變和本文所述的其他突變。在某些實施例中，所述基因疫苗可以編碼源自SARS-CoV-2變異體(諸如上述變異體)的重組S蛋白。

在一些實施例中，所述基因疫苗是Moderna COVID-19疫苗(mRNA-1273)、Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗(BNT162b2)、Janssen COVID-19疫苗(Ad26.CoV2.S)和Vaxzevria(以前的COVID-19疫苗，AstraZeneca)。

在本發明的初免-加強方案的一些實施例中，所述初免劑量是滅活疫苗，諸如Sinovac-CoronaVac和Sinopharm BIBP疫苗。

所述初免-加強方案包括用初次疫苗(例如，基因疫苗或次單元疫苗)進行疫苗接種，然後用本發明的蛋白質疫苗進行一次或多次加強劑量。在一些實施例中，所述初次疫苗需要疫苗的一次投予(例如，肌內、皮下、皮內或鼻內投予)；或間隔一段時間(例如，約2、3、4、5、6、7、8、9或10周或更長時間)的疫苗的兩次投予。

在一些實施例中，可以在初次疫苗接種後至少兩周(例如，四周、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、一年、一年半、兩年、三年、四年、五年或更長時間)給予本發明的重組蛋白的加強劑量。例如，一旦投予了基因疫苗(例如，mRNA或腺病毒基疫苗)或次單元疫苗，便可以每年或每半年向個體給予本發明的蛋白質疫苗的加強劑量。為方便起見，所述加強疫苗可以每年與流感疫苗共同投予(例如，作為單獨的配製物或共同配製物)。

在一些實施例中，所述加強劑是本文所述的單價或多價的免疫原性組合物，在含或不含佐劑的情況下使用。在一些實施例中，所述加強劑是單價的免疫原性組合物(例如，含有源自武漢毒株或南非變異體的重組S蛋白的組合物)。在其他實施例中，所述加強劑是二價的免疫原性組合物(例如，含有源自武漢毒株的重組S蛋白和源自南非變異體的重組S蛋白的組合物)。

在某些實施例中，加強劑量可以是0.5mL免疫原性組合物，所述組合物藉由在注射之前將在0.25mL的無菌、澄清且無色的PBS溶液中的5μg preS dTM和/或5μg變異體(參見例如，表A、下文的表8或表12)與0.25mL的AS03(AS03_A)按體積比體積混合而製成。在進一步的實施例中，所述變異體是β變異體(例如，含訊號序列的SEQ ID NO：13)。用於與抗原溶液混合的AS03 佐劑的劑量也可以是下表9所示的0.25mL的所述乳劑的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)。在此類實施例中，可以任選地將磷酸鹽緩衝鹽水添加至AS03乳劑中以達到0.25mL的佐劑劑量的最終體積(參見例如，表9)。

在某些實施例中，加強劑量可以是0.5mL免疫原性組合物，所述組合物藉由在注射之前將在0.25mL的無菌、澄清且無色的PBS溶液中的2.5μg preS dTM和/或2.5μg變異體(參見例如，表A、下文的表8或表12)與0.25mL的AS03(AS03_A)按體積比體積混合而製成。在進一步的實施例中，所述變異體是β變異體(例如，含訊號序列的SEQ ID NO：13)。用於與抗原溶液混合的AS03佐劑的劑量也可以是表9所示的0.25mL的所述乳劑的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此類實施例中，可以任選地將磷酸鹽緩衝鹽水添加至AS03乳劑中以達到0.25mL的佐劑劑量的最終體積(參見例如，表9)。

在某些實施例中，初次疫苗接種是用包含重組S蛋白的次單元疫苗進行的，並且與用於初次(非加強劑)疫苗接種的疫苗相比，所述加強疫苗含有較少量的重組S蛋白。例如，初次疫苗接種需要兩次注射，按一定間隔(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多周；14-35天的間隔)分別地每次注射10μg重組S蛋白，而加強注射劑可以僅含有2.5或5μg重組S蛋白。

在一些實施例中，初次疫苗接種需要按兩次注射之間一定的間隔(例如，3、4、5、6、7、8或更多周的間隔)兩次注射0.5mL免疫原性組合物，所述組合物是藉由在注射之前將在0.25mL的無菌、澄清且無色的PBS溶液中的10μg的preS dTM或變異體(或5μg的preS dTM加5μg的變異體(例如，β變異體)，對於二價疫苗來說)(參見例如，表A、下文的表8或表12)與0.25mL的AS03(AS03_A)按體積比體積混合來製備的。用於與抗原溶液混合的AS03佐劑的劑量也可以是表9所示的0.25mL的所述乳劑的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此類實施例中，可以任選地將磷酸鹽緩衝鹽水添加至AS03乳劑中以達到0.25mL的佐劑劑量的最終體積(參見例如，表9)。然後在稍後的時間(例如，在初次疫苗接種的第二次注射後至少3、6、7、9或12個月)向個體給予加強疫苗，其中所述加強疫苗可以是0.5mL免疫原性組合物，所述組合物藉由在注射之前將在0.25mL的無菌、澄清且無色的PBS溶液中的2.5或5μg的preS dTM或變異體(例如，β變異體)(參見例如，表A、表8或表12)與0.25mL的AS03(AS03_A)按體積比體積混合而製成。用於與抗原溶液混合的AS03佐劑的劑量也可以是表9所示的0.25mL的所述乳劑的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此類實施例中，可以任選地將磷酸鹽緩衝鹽水添加至AS03乳劑中以達到0.25mL的佐劑劑量的最終體積(參見例如，表9)。

在一些實施例中，本揭露的疫苗接種方案選自下表B中所述的方案：

在上表B中，方案2-9是本揭露的例示性初免-加強方案。所述方案預防或改善COVID-19，諸如其一種或多種症狀；或預防住院治療或死亡或降低其風險。

在一些實施例中，向已經從COVID-19中恢復或已經接種COVID-19疫苗的個體在這種恢復或疫苗接種後例如三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多個月給予加強劑。在進一步的實施例中，加強免疫的時間是在這種恢復或疫苗接種後約四至約十個月。在某些實施例中，加強免疫的時間是在這種恢復或疫苗接種後約八個月。可以向此個體肌內投予免疫原性組合物，所述組合物是藉由將0.25mL的水性抗原組分和AS03佐劑(例如，AS03_A或AS03_B(其體積可以用PBS補足至0.25mL，如果需要的話))混合來製備的。在一個實施例中，0.25mL水性抗原組分可以是單價的(MV)並且包含在PBS中配製的2.5μg的D614 preS dTM或β preS dTM，如表A所示，其中AS03佐劑是AS03_A或AS03_B(其體積可以用PBS補足至0.25mL，如果需要的話)。在一個實施例中，0.25mL水性抗原組分可以是單價的(MV)並且包含在PBS中配製的5μg的D614 preS dTM或β preS dTM，如表A所示，其中AS03佐劑是AS03_A或AS03_B(其體積可以用PBS補足至0.25mL，如果需要的話)。在一個實施例中，所述水性抗原組分是二價的(BV)並且包含在PBS中配製的2.5μg的D614 preS dTM和2.5μg的β preS dTM，如表A所示，其中AS03佐劑是AS03_A或AS03_B(其體積可以用PBS補足至0.25mL，如果需要的話)。

除非本文另有定義，否則結合本發明使用的科學和技術術語應當具有一般熟習此項技術者通常所理解的含義。下文描述了例示性方法和材料，但在本發明的實踐或測試中也可以使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料。在發生衝突的情況下，應以包括定義在內的本說明書為准。通常，本文所述的結合細胞和組織培養、分子生物學、病毒學、免疫學、微生物學、遺傳學、分析化學、合成有機化學、醫學和藥物化學以及蛋白質和核酸化學和雜交使用的命名法以及其技術是業內熟知且常用的那些。根據製造商的說明書如業內通常所實現的或如本文所述的來進行酶反應和純化技術。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應當包括複數，並且複數術語應當包括單數。在整個本說明書和實施例中，詞語“具有(have)”和“包含(comprise)”或變型諸如“具有(has)”、“具有(having)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”應被理解為暗示包括所陳述的整數或整數組，但是不排除任何其他整數或整數組。本文提及的所有出版物和其他參考文獻均藉由引用以其整體併入。儘管本文引用了許多文件，但該引用並不意味著承認這些文件中的任何文件構成業內公知常識的一部分。

如本文所用，如應用於一個或多個目的值的術語“大約”或“約”是指與所陳述的參考值類似的值。在某些實施例中，除非另有說明或另外從上下文顯而易見，所述術語是指落入所陳述的參考值的任一方向(大於或小於)的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少內的值的範圍。

為了可以更好地理解本發明，闡述了以下實例。這些實例僅用於說明目的，並不被解釋為以任何方式限制本發明的範圍。

實例

實例1：SARS-CoV-2 S編碼序列選殖進入桿狀病毒轉移質體中

將Gibson組裝(GA)用於產生轉移質體，所述質體包含由SARS-CoV-2刺突糖蛋白(來自基因組分離物Wuhan-Hu-1 GenBank NC045512的YP_009724390.1)修飾的所指示的SARS-CoV-2刺突糖蛋白。對於每個構建體，設計了三個基因片段(gBlock)用於選殖進入線性化的SapI pPSC12 DB轉移載體中。gBlock基因片段在其連接位點處具有40 bp的重疊序列，並且對於gBlock片段1和3分別在5'和3'處與pPSC12具有重疊序列。由Integrated DNA Technologies(IDT)合成了gBlock。Gibson組裝反應的描繪示於(圖2A和2B)中。由Eurofins Genomics經由Sanger測序確認了最終的轉移質體。定點誘變也可以用於產生變異體蛋白。

實例2：重組S蛋白的產生和純化

將含有在多角體啟動子控制下編碼preS dTM的序列的重組桿狀病毒用於感染草地貪夜蛾(S.frugiperda)細胞。使細胞在27℃下在PSFM培養基(SAFC)中生長至2.5 x 10⁶個細胞/mL的密度，並且用2%(體積/體積)的重組桿狀病毒感染。感染後72小時藉由在3,400 x g下離心15分鐘收取細胞。將上清液用於重組S蛋白的純化。

在一種純化方法中，將含有分泌的重組SARS-CoV-2刺突蛋白的上清液使用SUPRACAP 100雙層K250P/KS50P 5”過濾器(Pall，#NP5LPDG41)深度過濾。使用100kDa Sartocon Slice Cassette(0.1m²)、200mL/min的流速在15psi下將深度濾液濃縮10x，然後用20mM Tris；50mM NaCl(pH 7.4)進行5x滲濾。將含有SARS-CoV-2刺突蛋白的滲濾液藉由Capto^TM小扁豆凝集素(Cytiva)層析法(作為捕獲步驟純化)進行純化。將Capto^TM小扁豆凝集素柱用20mM Tris；50mM NaCl；10mM甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(pH 7.4)平衡。在這些條件下，使SARS-CoV-2刺突蛋白與Capto^TM小扁豆凝集素樹脂結合並且使污染物流過柱。將柱用20mM Tris；50mM NaCl；10mM甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(pH 7.4)洗滌以去除未結合的蛋白質。將SARS-CoV-2刺突蛋白用含有20mM Tris；500mM甲基-α-D-吡喃甘露糖苷的洗脫緩衝液(pH 7.4)從Capto^TM小扁豆凝集素柱上洗脫下來。

將Capto^TM小扁豆凝集素洗脫液藉由苯基Sepharose^TM HP疏水相互作用層析樹脂(Cytiva)(作為精細純化(polishing)步驟)進行進一步純化。將Capto^TM小扁豆凝集素洗脫液調節至750mM硫酸銨濃度、0.01% Triton X-100濃度，並且載入到用含有50mM磷酸鈉；750mM硫酸銨；0.01% v/v Triton X-100的緩衝液(pH 7.0)平衡的苯基瓊脂糖凝膠HP柱上。在載入後，將苯基瓊脂糖凝膠HP柱用50mM磷酸鈉；750mM硫酸銨；0.01% v/v Triton X-100(pH 7.0)洗滌以去除未結合的污染物。將SARS-CoV2刺突蛋白用含有50mM磷酸鈉；300 mM硫酸銨；0.01% v/v Triton X-100的洗脫緩衝液(pH 7.0)從苯基瓊脂糖凝膠HP柱上洗脫下來。

將苯基瓊脂糖凝膠HP洗脫液用蒸餾水稀釋3.25x，並且使用單個Mustang Q XT Acrodisc過濾器(Pall，#MSTGXT25Q16)進行Q膜過濾。在Q膜過濾後，使用Sartocon Slice 50(Sartorius Stedim，#3D91465050ELLPU)進行TFF。將Q濾液濃縮至0.25mg/mL，然後用10mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.8-7.2)滲濾10x。將含有SARS-CoV-2刺突蛋白的TFF滲餘物用0.005% Tween 20配製，並且使用0.2μm過濾器進行無菌過濾，並且在4℃下儲存直至使用。

可替代的純化方法使用CEX-HIC。可以藉由深度過濾(有或沒有初始離心步驟)完成收取。然後可以將捕獲的重組蛋白藉由超濾/滲濾步驟進行進一步純化。

實例3：乳劑佐劑製造

在氮氣環境下配製了由鯊烯和D/L-α生育酚構成的油相。單獨製備了由改良的磷酸鹽緩衝鹽水和聚山梨醇酯80構成的水相。在均質化和微流化之前將油相和水相以1：9(油相體積比水相體積)的比率合併(以約15,000psi三次藉由微流化器)。將所得的乳液藉由兩列串聯的兩個0.5/0.2μm過濾器(即，0.5/0.2/0.5/0.2)進行無菌過濾。

目標最終含量為42.76mg/mL鯊烯、47.44mg/mL生育酚和19.44mg/mL聚山梨醇酯80(參見表9)。

藉由DLS確定顆粒尺寸和多分散性分別在140至180nm範圍內和小於0.2。藉由HPLC確認鯊烯和生育酚含量並且藉由分光光度法確認聚山梨醇酯80含量在規格範圍內。

實例4：小鼠樞紐性試驗

此實例描述了一項在小鼠中的SARS-CoV-2重組蛋白疫苗配製物的研究。疫苗配製物含有缺失了跨膜區和胞質區的SARS-CoV-2融合前穩定的S蛋白(preS dTM)。疫苗含有AS03佐劑。此疫苗研究調查了對體液免疫和細胞介導的免疫二者的劑量反應和佐劑效應。所述研究還比較了非穩定的S胞外域(缺失了跨膜區和胞質區；“S dTM”)與preS dTM之間的影響。S dTM含有帶有His標籤的SARS-CoV-2刺突蛋白ECD S1和S2區(Protein Sciences)。

在這裡使用的小鼠是6-8周齡的遠交雌性Swiss Webster小鼠。為它們在第0天和第21天肌內注射50μL(25μL的抗原溶液加25μL的AS03)的疫苗配製物。

以下資料反映了目標抗原劑量和實際抗原劑量。在實驗運行後，發現了一種用於檢測SARS-CoV-2 preS蛋白的關鍵多株抗體試劑也識別糖基化的宿主細胞蛋白(HCP)。因此，目標純度和HCP水平是不準確的，並且在配製的疫苗產品中的SARS-CoV-2 preS蛋白的濃度顯著低於計畫。表1揭露投予方案，並且表2反映了重新計算後的如下實際劑量。

表2 CoV2 preS dTM抗原的CoV2-02_Ms目標劑量和實際劑量

由於基於新的定量測定的投予調整，D0和D21注射的實際劑量是不同的。為了保持一致性，在文本和圖中僅指示了目標劑量。

在第-4天、第21天和第36天從動物中抽取血液。藉由ELISA測量了S特異性IgG、IgG1和IgG2a水平，其中將培養盤用含有S1和S2區的刺突ECD(S dTM；Sino Biological)塗佈。將滴度報告為引起大於0.2的OD值的最後一個稀釋度的倒數。OD=0.2值表示測定背景的至少兩倍。首先在BSL 3下在噬斑減少中和試驗(PRNT)中使用SARS-CoV-2 USA/WA1/2020病毒株評估了血清抗體中和活病毒的能力。簡言之，將血清樣品在56℃下加熱滅活30分鐘，並且在稀釋劑(DMEM/2% FBS)中稀釋。將稀釋的血清樣品與等體積的稀釋以含有30PFU/孔的SARS-CoV-2混合，並且在37℃下培育1小時。將匯合的Vero E6細胞的盤用血清-病毒混合物接種並且在37℃下培育1h。在培育後，將盤用1mL的0.5%甲基纖維素培養基覆蓋並且在37℃/5% CO₂下培育3天。然後將盤洗滌，用冰冷的甲醇固定並且用0.2%結晶紫染色。然後將盤洗滌，乾燥，並且將中和抗體滴度確定為將測試中病毒噬斑的數量減少50%或更多的最高血清稀釋度。

使用假病毒中和測定評估了由preS dTM疫苗引發的功能性抗體反應。將血清樣品稀釋並且在56℃下加熱滅活30分鐘。將稀釋的血清樣品與一定體積的報告病毒顆粒(RVP)-GFP(Integral Molecular)(稀釋至每孔含有300個感染性顆粒)混合，並且在37℃下培育1小時。將50%匯合的293T-hsACE2殖株細胞的96孔盤用血清+病毒混合物接種，並且在37℃下培育72h。將盤在高內涵成像儀上掃描，並且對單獨的GFP表現細胞進行計數。將中和抗體滴度報告為將測試中的病毒噬斑數量減少50%的稀釋度的倒數。

在不含佐劑的情況下，preS dTM和S dTM不具有免疫原性，如在1或2個劑量後藉由非常低的或不存在IgG和中和抗體反應所證明的那樣。這兩種抗原之間的血清S特異性IgG水平是類似的，並且從第21天至第36天沒有統計學上顯著的滴度變化(圖4)。相比之下，加有含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的preS dTM疫苗在所測試的所有劑量下在1個劑量(D21)後均引發了高IgG反應(不同疫苗劑量組的平均值範圍為從4.1至4.6 Log₁₀ ELISA單位(EU))。第二次注射(D36)進一步增加了反應，並且IgG平均值達到5.1至5.5 Log₁₀ EU，這取決於疫苗劑量。證明了佐劑效應(倍數增加和P值)和加強劑效應二者。在1個劑量後(x1.5，p值<0.05)和在2個劑量後，對於IgG反應觀察到適度的劑量效應。因此，在第21天和第36天，含生育酚的鯊烯乳劑佐劑均顯著增加了動物中由用preS dTM免疫誘導的S特異性IgG滴度，並且觀察到第36天的滴度高於第21天(圖5)。用含生育酚的鯊烯乳劑佐劑獲得的滴度顯著高於在不含佐劑的情況下獲得的滴度。總之，含有含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的疫苗配製物的劑量-反應效應是統計學上顯著的，其中p<0.05。然而，未加佐劑的配製物的劑量-反應效應不是統計學上顯著的(p=0.7866)。簡言之，無論使用什麼劑量，均顯示出顯著的含α生育酚的鯊烯乳劑佐劑效應，其中所有劑量的p值均<0.001。

與IgG反應一致，加有含α-生育酚的鯊烯乳劑佐劑的疫苗在2個劑量後引發了穩健的中和抗體反應。除在最低劑量組(0.167和0.5μg)中的兩隻小鼠之外，在所有小鼠中均檢測到了PRNT₅₀滴度。中和平均值範圍為從最低疫苗劑量組(0.167μg)的2.5 Log₁₀至最高疫苗劑量組(4.5μg)的3.5 Log₁₀。

與PRNT50測定一致，在所有加有含α生育酚的鯊烯乳劑AS03佐劑的preS dTM免疫的小鼠(除在0.5ug組中的一隻之外)中均檢測到了假病毒中和滴度。在最高疫苗劑量組(4.5ug)中，中和平均滴度範圍為從2.6 Log10至3.6 Log10。因此，用加佐劑的配製物免疫的動物到第36天以劑量依賴性方式產生了顯著更高量的SARS-CoV-2中和抗體，圖6A和6B。

實例5：輔助的小鼠研究

此實例描述了在小鼠中的SARS-CoV-2重組蛋白疫苗配製物的第二項研究。此研究聚焦在評價免疫小鼠的細胞介導的免疫(CMI)。在這裡使用的小鼠是6-8周齡的近交雌性BALB/c小鼠。為它們在第0天和第14天肌內注射50μL的疫苗配製物。投予方案如下所示，其中每組五隻小鼠。所注射的preS dTM目標為4.5μg，含有或不含有含生育酚的鯊烯乳劑佐劑。為了保持一致性，在文本和圖中僅指示了目標劑量。

在第0天、第14天和第24天從動物中抽取血液。在第24天收取脾用於CMI分析，並且將脾細胞用具有11個胺基酸重疊的S1+S2 15聚體肽庫(JPT)刺激。藉由流式細胞術方法對細胞進行表型分析，並且藉由細胞內細胞因子染色(ICS)評估細胞因子的產生。下文揭露所評價的生物標記物組。

為了進行細胞內染色(ICS)，將脾勻漿，將紅細胞裂解，並且將細胞在37℃和5% CO₂下放置1小時。然後對脾細胞進行計數，並且將2 x 10⁶個細胞在37℃和5% CO₂下在以下四種條件下與Golgi Plug(BD Biosciences)一起培育6小時：無肽刺激(僅培養基對照)、陽性對照刺激和用兩個單獨的刺突肽庫(JPT產品PM-WCPV-S-1)刺激。將來自每隻單獨動物的細胞用細胞活化混合物(Cell Activation Cocktail)刺激，其中佈雷菲德菌素A(Biolegend)作為陽性對照。在刺激後，將細胞洗滌並且在4℃下重新懸浮於Mouse BD Fc Block^TM(殖株2.4G2)中持續10分鐘。然後將細胞離心，去除Fc塊，並且將細胞在4℃下用含有以下的抗體混合物進行30分鐘表面染色和活/死染色：在染色緩衝液(FBS)(BD Biosciences)中的CD4(RM4-5)PerCP-Cy5.5(Biolegend)、CD8(53-6.7)AF700(BD Biosciences)、CD45R/B220(RA3-6B2)PE/Cy7(BD Biosciences)、CD14(Sa14-2)PE/Cy7(Biolegend)和LIVE/DEAD可固定近紅外死細胞染色套組(Invitrogen)。在表面染色後，將細胞洗滌，固定並且用Cytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)在4℃下透化30分鐘。然後將細胞用1x Perm/Wash溶液(BD Biosciences)洗滌，然後在4℃下避光用含有以下的混合物進行30分鐘細胞內染色：在1X Perm/Wash緩衝液中的CD3e(17A2)BUV395(BD Biosciences)、IFN-γ(XMG1.2)FITC(BD Biosciences)、TNF-α(MP6-XT22)Pacific Blue(Biolegend)、IL-2(JES6-5H4)BV605(BD Biosciences)、IL-4(11B11)APC(Biolegend)和IL-5(TRFK5)PE(Biolegend)。然後將細胞洗滌並且重新懸浮於FACS緩衝液中。將樣品在LSR Fortessa流式細胞儀(BD Biosciences)上運行，並且在FlowJo軟體(10.6.1版)上進行分析。

ICS分析表明，在加有AS03佐劑的疫苗免疫的小鼠中，在用S1和S2肽庫二者刺激脾細胞後，沒有或有低的S特異性CD4⁺ T細胞。在S1和S2肽庫的情況下觀察到類似的CD4⁺ T細胞反應，低於0.05%，在僅佐劑免疫的小鼠中檢測到的非特異性訊號的範圍內；僅揭露S1刺激結果。未檢測到S特異性CD8⁺ T細胞反應。在加有含α生育酚的鯊烯乳劑佐劑的疫苗免疫的小鼠中檢測到S特異性CD4⁺ T細胞，其中主要是TNF-α分泌細胞(約0.1%)和一些IL-5分泌細胞(約0.05%)。如基於重組抗原的疫苗所預期的那樣，未檢測到S特異性CD8⁺ T細胞反應。細胞因子概況表明了由加有含生育酚的鯊烯乳劑佐劑的preS dTM疫苗誘導的混合Th1/Th2反應。細胞因子概況表明了在BALB/c小鼠中由加有AS03佐劑的preS dTM疫苗誘導的混合Th1/Th2反應(圖7)。

實例6：非人靈長類動物研究

此實例描述了一項在非人靈長類動物(NHP)中評價體液免疫和CMI的研究。在這裡使用的動物是4-12歲的恒河猴。在第0天和第21天，為NHP肌內注射目標劑量為15μg的混合有含α-生育酚的鯊烯乳劑佐劑的preS dTM，體積為0.5mL。在D4、D21、D28和D35收集血清。為了保持一致性，在文本和圖中僅指示了目標劑量。

藉由ELISA測量了S特異性IgG水平，其中將培養盤用GCN4融合前形式的刺突蛋白(GeneArt)塗佈。

與在用preS dTM的小鼠中觀察到的抗體反應一致，在不存在佐劑的情況下未檢測到反應或檢測到非常低的反應(圖8)。然而，當在AS03佐劑中配製時，早在第1劑後2周，15μg preS dTM疫苗便在所有免疫的猴中引發了高水平的與融合前S蛋白結合的IgG(平均滴度為3.7 log10 EU)。第二次免疫在D28有效地增加了IgG滴度(平均滴度為5.1 Log10 EU)。

使用假病毒中和測定評估了由preS dTM疫苗引發的功能性抗體反應。將血清樣品稀釋並且在56℃下加熱滅活30分鐘。將稀釋的血清樣品與一定體積的報告病毒顆粒(RVP)-GFP(Integral Molecular)(稀釋至每孔含有300個感染性顆粒)混合，並且在37℃下培育1小時。將50%匯合的293T-hsACE2殖株細胞的96孔盤用血清+病毒混合物接種，並且在37℃下培育72h。將孔盤在高內涵成像儀上掃描，並且對單獨的GFP表現細胞進行計數。將中和抗體滴度呈現為將測試中的病毒噬斑數量減少50%的稀釋度的倒數。

在第1劑後三周，在任何組中均未檢測到假病毒中和滴度。然而，在第二次注射後，在加有含α生育酚的鯊烯乳劑佐劑的preS dTM免疫的恒河猴(除一隻之外)中檢測到假病毒中和滴度(平均滴度為2.1 Log10 IC50)。免疫的恒河猴的中和滴度與針對一組人恢復期(Conv.)血清觀察到的滴度相當(圖9)。微量中和(MN)測定資料還表明，AS03顯著增加了針對野生型SARS-CoV-2病毒的中和抗體滴度(圖10)。

實例7.1：倉鼠研究1

先前的研究已經表明，倉鼠在用SARS-CoV-2攻擊後持續出現臨床病兆，包括嗜睡、毛髮豎起、呼吸急促、體重顯著減輕(高達20%體重)以及在D2至D14的人的SARS-CoV-2肺炎所特有的肺中的彌漫性肺泡損傷。因此，倉鼠是用於研究COVID疫苗的合適動物模型。此實例描述了一項在倉鼠中的評估SARS-CoV-2重組蛋白疫苗配製物的免疫原性和SARS-CoV-2病毒攻擊後的功效的研究。疫苗配製物含有preS dTM和AS03佐劑。此研究調查了一個劑量相比於兩個劑量的疫苗的特異性抗體反應和功效、以及對體液反應的佐劑效應。

在這裡使用的動物是6-8周齡的敘利亞金倉鼠。在第0天(對於兩劑群組)和第21天(對於一劑群組和兩劑群組)，在一劑群組和兩劑群組中為它們肌內注射75μL(37.5μL的抗原溶液加37.5μL的AS03)的疫苗配製物。劑量如下所示。

**n=4。在D23犧牲並且收集PBMC用於轉錄體學。

在第一次注射之前(基線)和D35從動物中抽取血液。

藉由ELISA測量了S特異性IgG水平，其中將培養盤用融合前刺突抗原(GCN4穩定的)(GeneArt)塗佈。將滴度報告為給出等於0.2的OD值的稀釋度的倒數(圖11)。OD=0.2值表示以ELISA單位(EU)表示的稀釋度的倒數。

除用未加佐劑的preS dTM免疫的1只倉鼠之外，所有接種的倉鼠在一次免疫後均出現了S特異性IgG反應。與未加佐劑的2.25μg目標劑量的preS dTM疫苗相比，加有AS03佐劑的preS dTM疫苗(2.25μg目標劑量)在一次注射(平均值為3.8 Log₁₀ EU與3.3 Log₁₀ EU)或兩次注射(平均值為5.2 Log₁₀ EU與4.8 Log₁₀ EU)後誘導了更高的S特異性IgG滴度。在未加佐劑的和加有AS03佐劑的疫苗的兩劑與一劑疫苗方案之間觀察到顯著差異，其中S特異性IgG滴度分別增加32倍和25倍(p值<0.001)。

使用假病毒中和測定(對於一劑群組和兩劑群組二者)評估了由含和不含AS03的preS dTM疫苗引發的功能性抗體反應。如下進行假病毒中和測定：將血清樣品稀釋並且在56℃下加熱滅活30分鐘。將熱滅活的血清樣品的進一步2倍連續稀釋液與一定體積的報告病毒顆粒(RVP)-GFP(Integral Molecular)(稀釋至每孔含有300個感染性顆粒)混合，並且在37℃下培育1小時。將50%匯合的293T-hsACE2殖株細胞的96孔盤用血清+病毒混合物接種，並且在37℃下培育72小時。將盤在高內涵成像儀上掃描，並且對單獨的GFP表現細胞進行計數。將假病毒中和抗體滴度報告為將測試中的病毒噬斑數量減少50%的稀釋度(ID₅₀，其中ID₅₀=IC₅₀)的倒數。

除來自加有AS03佐劑的preS dTM組的1隻倉鼠具有非常低的滴度之外，在一次注射後沒有測量到假病毒中和抗體反應(一劑群組)(圖12)。未加佐劑的preS dTM和加有AS03佐劑的疫苗在2次注射後引發了顯著的假病毒中和抗體反應(兩劑群組)，其中平均滴度分別是2.4 Log₁₀和3.1 Log₁₀。在所有用加有AS03佐劑的疫苗免疫的倉鼠中均檢測到了假病毒中和抗體滴度，而在未加佐劑的疫苗組的7/8倉鼠中檢測到滴度並且更不均勻。觀察到AS03的適度但顯著的佐劑效應(增加4.6倍；p=0.014)。

為了評估疫苗功效，用2.3 x 10⁴PFU的SARS-CoV-2(USA-WA1/2020毒株)經由100μl鼻內投予對倉鼠進行攻擊。在攻擊後每天監測臨床病兆(體重減輕、一般情況、呼吸頻率)。在屍檢時(在攻擊後D4(n=4)或在攻擊後D7(n=7))，收集鼻孔和肺用於使用qRT-PCR進行病毒負荷量評估，並且進行肺病理分析。在一劑群組中在攻擊後長達3天並且在兩劑群組中在攻擊後長達4天，監測體重減輕。在攻擊後四天，對照組顯示出意想不到的非常適度的體重減輕，約3%-4%(圖13)。低體重減輕可以藉由用於動物攻擊的低致病性病毒攻擊原液來解釋。由於體重減輕的低增量，無論免疫次數如何，在對照、未加佐劑的或加有AS03佐劑的preS dTM疫苗組之間在攻擊後均沒有能夠觀察到體重減輕差異。

在攻擊後4天或7天，使用qRT-PCR測量SARS-CoV-2總RNA或次基因組(sg)RNA，僅評估了來自兩劑群組的鼻孔和肺中的病毒負荷量含量。值得注意的是，sgRNA是特定於主動病毒複製的，而總病毒RNA既負責病毒輸入又負責主動複製。

儘管體重減輕有限，但對照組在D4的肺和鼻孔中展示出高sgRNA滴度(平均滴度分別為9.0和7.6 Log10拷貝/克)，這在D7仍然在四分之三的倉鼠中有檢測到(平均滴度分別為5.4和4.5 Log₁₀拷貝/克)(圖15)。當與對照組相比時，在攻擊後D4和D7，在兩個疫苗組(未加佐劑的和加有AS03佐劑的)中均觀察到肺中的病毒負荷量(圖14)和病毒複製(圖15)的強烈減少。在D4，僅在未加佐劑的疫苗組的四分之二的動物中檢測到病毒複製，而在加有AS03佐劑的疫苗的倉鼠中均未檢測到病毒複製，這表明了加有AS03佐劑的疫苗對肺的完全保護。在攻擊後七天在疫苗組的肺中病毒複製的減少甚至更加明顯(其中沒有陽性動物)，而對照組仍然展示出5.4 Log₁₀ sgRNA拷貝/克的平均滴度。在鼻孔中，與對照組相比，在攻擊後D4和D7，在疫苗組中觀察到病毒負荷量和病毒複製有所減少。在D4，疫苗組的sgRNA平均滴度低約2 Log₁₀，並且在D7，所有接種的動物均是陰性的，這表明病毒快速清除。這些資料表明，用未加佐劑的preS dTM和加有AS03佐劑的疫苗進行免疫針對肺和鼻孔中的病毒複製具有明顯的保護作用，這與在所有疫苗組中測量到的中和抗體反應一致。

在攻擊後D4或D7對來自一劑群組和兩劑群組的4隻倉鼠/組的肺病理進行分析。此分析發現，對於所有疫苗配製物在D7肺部病變明顯減少，這對於2.25μg/AS03劑量甚至更加明顯，並且在肺實質中病毒蛋白表現強烈減少。表7揭露用於組識病理學的標準。

對照組在攻擊後D4和D7收集的所有倉鼠的肺中均展示出3的高病理得分，這表示超過50%的肺具有嚴重病變。(圖16A)。在一劑群組中，免疫一次的未加佐劑的preS dTM組在攻擊後D4展示出從1至3變化的病理得分，並且在攻擊後D7所有倉鼠的得分均等於3。然而，在免疫一次的加有AS03佐劑的組中，所有病理得分在D4均降低至2，並且在D7是變化的(在1與3之間)，這表明與未加佐劑的preS dTM組和對照組相比，肺病理較少。在兩劑群組中，與對照組相比，在未加佐劑的preS dTM和加有AS03佐劑的preS dTM組中觀察到較低的肺病理，尤其是在D7(兩組的D4得分範圍均為從1至3，並且D7得分在未加佐劑的組中為1至2，且在加有AS03佐劑的組中為0至1)。在加有AS03佐劑的preS dTM組中從D4至D7病理得分下降表明肺病理快速消退。

實例7.2：倉鼠研究2

此實例描述了另一項評估SARS-CoV-2重組蛋白疫苗配製物在倉鼠中的免疫原性和功效的研究。在此研究中使用的疫苗配製物是單價的(含有原始D614 preS dTM(SEQ ID NO：10)或B.1.351 preS dTM變異體(SEQ ID NO：13))或二價的(含有原始D614 preS dTM和B.1.351 preS dTM變異體)，二者均用AS03佐劑配製。在免疫後三周，在倉鼠中評價了疫苗針對兩種所關注的變異體α(B.1.1.7)和β(B.1.351)的功效。

在此研究中，將八隻6-8周齡的雌性敘利亞金倉鼠的各組在D0和D21用三種疫苗配製物以1μg/重組蛋白組分的劑量進行肌內免疫。在免疫前、D21、D35和攻擊前收集血液樣品，以分析刺突結合IgG和中和抗體反應(表7.1)。在第二劑後四周，將所有的倉鼠用三種SARS-CoV-2毒株(D614G、B.1.351(β)或B.1.1.7(α))以先前確定的感染100%的動物且在攻擊後的前七天內誘導10%與20%之間的體重減輕的劑量進行肌內接種。

在攻擊後七天每天監測臨床病兆(體重減輕、一般情況和呼吸頻率)。在攻擊後D4犧牲四隻動物/組，並且剩餘四隻在D7犧牲以收集肺和鼻甲(或鼻孔)。藉由qRT-PCR定量了病毒基因組RNA和次單元因組病毒RNA。在攻擊後D4和D7評估了肺中的組織病理。

在用β(B.1.351)變異體病毒攻擊後，每天測量免疫的倉鼠和未經處理的倉鼠的體重。對於每隻倉鼠，每天計算與D0相比的體重變化，直至攻擊後D7(最終屍檢時間)。體重變化百分比表示在圖16B中。結果表明未經處理的倉鼠的體重減輕明顯，這指示生產性感染和病理，而免疫的倉鼠在用β變異體攻擊後沒有經歷任何體重減輕。這些資料表明，所測試的三種疫苗配製物CoV2 preS dTM-AS03(D614)、(B.1.351)和(D614+B.1.351)在倉鼠模型中賦予了針對由β變異體誘導的感染和相關病理的穩健保護。

實例8：臨床研究

此實例描述了用於評價本揭露的疫苗組合物的安全性和功效的I/II期臨床方案。參與者、結局評估員、研究人員、實驗室人員和大多數申辦方研究人員(參與ESDR的人員和僅針對相關參與者的人員除外)將對疫苗組分配組(配製物和佐劑；注射計畫將不設盲)不知情。那些製備/投予研究干預的人將對疫苗組分配知情。參與者被隨機分組並且按年齡分層。

組合物包含含或不含佐劑的preS dTM(SEQ ID NO：10的多肽的三聚體，不含訊號肽)。疫苗組合物以兩種劑量強度提供：配製物1和2，分別含有5μg(低劑量)或15μg(高劑量)的preS dTM抗原。下文揭露抗原組合物：

為了評價佐劑AS03的作用，使用水包油乳劑。用於佐劑研究組的單位劑量強度是5μg和15μg的preS dTM。每個單劑量小瓶的基於鯊烯的含α生育酚的鯊烯乳劑佐劑含有下文所示的成分。此乳劑具有含有鯊烯和D,L-α-生育酚的油相；以及含有改良的PBS和聚山梨醇酯80的水相。下文所示的成分的量對應於250μL的AS03本體乳劑(即，AS03_A)。

將抗原組合物和佐劑組合物在使用前混合，其中總體積為0.5mL。安慰劑是每劑0.5mL的0.9%生理鹽水。

投予途徑是肌內注射，在上臂的三角肌處。

將在單獨的盒子中提供每種研究干預(抗原與佐劑或抗原與稀釋劑(PBS)將在2個小瓶的盒子中成套放在一起)。

參與者是18歲及以上的健康的個體，並且在年齡組內被隨機分組。由18-49歲的參與者組成的小標記群組(群組1)將接受單個劑量。如果基於不設盲的資料審查群組1中到D09的安全性資料和實驗室量度被視為是可接受的，則群組1中的剩餘參與者和群組2中的所有參與者將被招募。所有參與者將在D01接受調查研究疫苗配製物或安慰劑對照的一次注射(疫苗接種[VAC]1)。群組2中的參與者將在D22接受研究疫苗配製物或安慰劑的第二次注射(VAC2)。每名參與者參與研究的持續時間將是大約在最後一次注射後365天。

COVID-19樣疾病將成為主動和被動監視的功效目標的一部分。預期為此研究選擇的候選SARS-CoV-2抗原的設計將促進比結合抗體穩健的中和抗體的產生。預期包括加佐劑的配製物將進一步增強中和抗體反應的幅度並且誘導平衡的Th1/Th2T輔助細胞反應。總之，這些策略藉由設計來減輕病毒感染的免疫增強的理論風險。患有認為與嚴重的COVID-19風險增加相關的慢性共病病症的個體將被排除在外。

所述研究的主要目標是藉由描述在D01、D22和D36的中和抗體的水平和概況來評價疫苗組合物的免疫原性。將用中和測定來測量中和抗體滴度。預期在疫苗接種後在D22和D36的血清抗體中和滴度將相對於D01增加約2至4倍。中和抗體血清轉化的發生被定義為值在基線時低於定量下限(LLOQ)且在D22和D36時可檢測的中和滴度高於測定LLOQ。

所述研究的次要目標是藉由描述每個研究干預組在D01、D22、D36和D181(群組1)或D202(群組2)和D366(群組1)或D387(群組2)的結合抗體概況，並且藉由描述每個研究干預組在D181(群組1)或D202(群組2)和D366(群組1)或D387(群組2)的中和抗體概況來評價疫苗組合物的免疫原性。將用酶聯免疫吸附測定(ELISA)方法來測量每個研究干預組的全長SARS-CoV-2刺突蛋白的結合抗體滴度。預期在D22、D36、D181(群組1)或D202(群組2)和D366(群組1)或D387(群組2)，抗S抗體濃度的倍數上升[後/前]將是2或更多、或4或更多。將用中和測定來測量中和抗體滴度。預期在疫苗接種後在D181(群組1)或D202(群組2)和D366(群組1)或D387(群組2)的血清中和滴度相對於D01的倍數上升將是2或更多或者4或更多。中和抗體血清轉化的發生被定義為基線值在基線時低於LLOQ且在D181(群組1)或D202(群組2)和D366(群組1)或D387(群組2)時可檢測的中和滴度高於測定定量下限。

所述研究的另一個次要目的是藉由描述病毒學確認的COVID-19樣疾病和血清學確認的SARS-CoV-2感染的發生並且評價對SARS-CoV-2重組蛋白的抗體反應與COVID-19樣疾病和/或血清學確認的SARS-CoV-2感染的風險之間的相關性/關聯來評價功效。病毒學確認的COVID-19樣疾病是藉由規定的臨床症狀和病兆來定義，並且藉由核酸測定病毒檢測測定來確認。血清學確認的SARS-CoV-2感染是藉由非SELISA中的SARS-CoV-2特異性抗體檢測來定義。考慮到如上定義的病毒學確認的COVID-19樣疾病和/或血清學確認的SARS-CoV-2感染，風險/保護相關性是基於對SARS-CoV-2的抗體反應的(如使用病毒中和或ELISA所評價的)。

所述研究的探索性目標是藉由描述群組2中每個研究干預組在D22和D36的細胞免疫反應概況並且描述中和抗體與結合抗體之間的比率來評價免疫原性。將在用全長S蛋白和/或S抗原肽庫刺激後的全血和/或冷凍保存的PBMC中來測量Th1和Th2細胞因子。將計算結合抗體(ELISA)濃度與中和抗體滴度之間的比率。

SARS-CoV-2中和抗體評估

將使用中和測定來測量SARS-CoV-2中和抗體。在此測定中，將血清樣品與恒定濃度的SARS-CoV2病毒混合。可以藉由ELISA來檢測病毒感染性(病毒抗原產生)由於血清樣品中存在的抗體的中和作用的降低。在洗滌和固定後，可以藉由與抗SARS-CoV-2特異性抗體、HRP IgG綴合物和顯色基質連續培育來檢測細胞中的SARS-CoV-2抗原產生。使用酶標儀測量所得的光密度。SARS-CoV-2感染性的降低(如與病毒對照孔中的相比)構成了陽性中和反應，這表明血清樣品中存在中和抗體。

SARS-CoV-2刺突蛋白抗體血清IgG ELISA

將使用ELISA來測量SARS-CoV-2抗S蛋白IgG抗體。將微量滴定盤用在塗佈緩衝液中稀釋至最佳濃度的SARS-CoV-2融合前形式的刺突蛋白抗原來塗佈。可以將盤藉由向所有孔中添加封閉緩衝液並且培育一段確定的時間來封閉。在培育後，將洗滌盤。將所有的對照、參考和樣品用稀釋緩衝液預稀釋。然後將預稀釋的對照、參考和樣品在塗佈的測試盤的孔中進一步連續稀釋。將盤培育一段確定的時間。在培育後，將洗滌盤，將山羊抗人IgG酶綴合物的優化稀釋液添加至所有孔中，並且將盤進一步培育。在此培育後，將洗滌盤，並且將酶基質溶液添加至所有孔中。將盤培育一段確定的時間以允許基質顯色。將藉由向每個孔中添加終止溶液來終止基質顯色。ELISA微量滴定盤讀取器將用於使用測定專用SoftMax Pro範本來讀取測試盤。將從每個盤內的所有光密度(OD)中減去盤空白的平均OD值。將使用空白、對照和參考標準曲線的測量值匯出樣品滴度，這些值將被包括在運行內的每個測定盤上。

細胞介導的免疫(使用全血和/或PBMC)

將在用全長S蛋白和/或S抗原肽庫刺激後的全血和/或冷凍保存的PBMC中來測量細胞因子。

COVID-19樣疾病

COVID-19樣疾病被定義為具有(i)以下任一種情況(持續至少12小時的時間或在12小時的時間內再次發生)：咳嗽(乾咳或咳痰)；發熱；嗅覺缺失；味覺缺失；嗅覺缺失；凍瘡(COVID腳趾)；呼吸困難或呼吸短促；肺炎的臨床或影像學證據；以及任何臨床診斷為中風、心肌炎、心肌梗塞、血栓栓塞事件(例如，肺栓塞、深靜脈血栓形成和中風)和/或暴發性紫癜的住院治療；或(ii)以下任兩種情況(持續至少12小時的時間或在12小時的時間內再次發生)：咽炎；寒顫；肌痛；頭痛；鼻漏；腹痛；以及噁心、腹瀉和嘔吐中的至少一種。

病毒學確認的COVID-19疾病

病毒學確認的COVID-19疾病被定義為藉由對與COVID-19樣疾病相關的呼吸道樣品進行核酸擴增試驗(NAAT)得到的SARS-CoV-2陽性結果。

血清學確認的SARS-CoV-2感染

血清學確認的SARS-CoV-2感染被定義為血清中存在藉由ELISA檢測到的對SARS-CoV-2的非刺突蛋白具有特異性的抗體的陽性結果。

SARS-CoV-2核蛋白抗體血清IgG ELISA

將使用ELISA來測量SARS-CoV-2抗核蛋白抗體。將微量滴定盤用在塗佈緩衝液中稀釋至最佳濃度的SARS-CoV-2核蛋白抗原來塗佈。可以將盤藉由向所有孔中添加封閉緩衝液並且培育一段確定的時間來封閉。在培育後，將洗滌盤。將所有的對照、參考和樣品用稀釋緩衝液預稀釋。然後將預稀釋的對照、參考和樣品在塗佈的測試盤的孔中進一步連續稀釋。將盤培育一段確定的時間。在培育後，將洗滌盤，將山羊抗人類IgG酶綴合物的優化稀釋液添加至所有孔中，並且將盤進一步培育。在此培育後，將洗滌盤，並且將酶基質溶液添加至所有孔中。將盤培育一段確定的時間以允許基質顯色。將藉由向每個孔中添加終止溶液來終止基質顯色。ELISA微量滴定盤讀取器將用於使用測定專用SoftMax Pro範本來讀取測試盤。將從每個盤內的所有OD中減去盤空白的平均OD值。將使用空白、對照和參考標準曲線的測量值匯出樣品滴度，這些值將被包括在操作中的每個測定盤上。

用於COVID-19病例檢測的核酸擴增試驗(NAAT)

在所述測定中，將收集呼吸道樣品並且提取RNA。然後藉由NAAT使用特異性擴增SARS-CoV-2靶標的SARS-CoV-2特異性引物來評價純化的範本。

實例9：含AS03佐劑的SARS-CoV-2重組蛋白疫苗在18歲及以上的成年人中的免疫原性和安全性

此實例描述了在18歲及以上的成年人中進行的II期、隨機、改良的雙盲、多中心、劑量探索研究的方案，以評價藉由肌內(IM)途徑投予的preS dTM/加有AS03佐劑的疫苗(也稱為“CoV2 preS dTM-AS03”)的2次注射的安全性、反應原性和免疫原性。在此研究(VAT00002)中，評價了含固定劑量的AS03佐劑(AS03_A)的三種不同的抗原劑量(5μg、10μg和15μg的preS dTM的有效劑量)。在此研究中利用了兩次注射時間表，其中隔開21天投予劑量。

藉由收集每次疫苗接種後7天誘發的不良事件(AE)和直到最後一次疫苗接種後21天未誘發的AE，在所有參與者中評估了反應原性。所有參與者將在研究的持續時間內提供有關嚴重AE、醫學上關注的AE(medically-attended AE，MAAE)和特別關注的不良事件(AESI)的資訊。在研究的持續時間內的多個時間點在所有參與者中評估了中和抗體和結合抗體。在參與者的子集中評估了細胞反應和粘膜反應。此外，在研究的持續時間內收集了所有COVID-19事件。

來自此II期研究的期中安全性、反應原性和免疫原性資料將用於決定進展到III期以及用於選擇抗原劑量配製物以進展到III期。此期中分析將在可獲得所有參與者在第2次注射後長達21天的反應原性資料和第2次注射後長達14天的中和抗體反應資料後進行。

將參與者基於血清學(Roche抗N免疫測定和Roche抗S免疫測定)或病毒學(核酸擴增試驗[NAAT])確定為未感染(先前未感染的)和非未感染(有先前感染的證據)的在先SARS-CoV-2感染進行分類。未感染的個體(沒有在先SARS-CoV-2感染的證據)被定義為在招募時在一個或多個血清樣品中藉由抗N免疫測定和抗S免疫測定呈陰性，並且呼吸道標本的NAAT呈陰性，而非未感染的個體(有在先SARS-CoV-2感染的證據)被定義為在招募時在一個或多個血清樣品中藉由抗N免疫測定或抗S免疫測定呈陽性，或呼吸道標本中的NAAT呈陽性。

目標和終點

主要安全性

為了評估在每個年齡組和在每個研究干預組中所有參與者的安全性概況，檢查以下參數：

- 在每次疫苗接種後30分鐘內報告的未誘發的全身性AE的存在；

- 在每次疫苗接種後長達7天發生的誘發的(在參與者的日記卡[DC]和[電子]病歷報告表[CRF]中預先列出的)注射部位反應和全身性反應的存在；

- 在最後一次疫苗接種後長達21天報告的未誘發的AE的存在；

- 在整個研究中嚴重不良事件(SAE)的存在；

- 在整個研究中AESI的存在；以及

- 在整個研究中MAAE的存在。

主要免疫原性

為了評估在每個研究干預組中的未感染SARS-CoV-2的成年人中在最後一次疫苗接種後14天(D36)的中和抗體概況，在每個研究干預組的未感染SARS-CoV-2的參與者中測量了針對D614G變異體的中和抗體滴度，包括評價：

- 在D01和D36的個體血清中和滴度；

- 在D36相對於D01在疫苗接種後個體血清中和滴度的倍數上升；

- 相對於D01在D36血清中和滴度上升2倍和上升4倍[後/前](倍數上升

2和

4)；以及

- 在未感染SARS-CoV-2者中的反應者，定義為基線值低於定量下限(LLOQ)且在D36可定量的中和滴度高於測定LLOQ的參與者。

次要免疫原性

所述研究的次要目標包括評估(1)在每個研究干預組的未感染SARS-CoV-2的成年人中在D22、D78、D134、D202、D292和D387的中和抗體概況；(2)在非未感染SARS-CoV-2的參與者的每個研究干預組中在D01、D22、D36、D78、D134、D202、D292和D387的中和抗體概況；和(3)在未感染和非未感染SARS-CoV-2的參與者的每個研究干預組中在D01、D22、D36、D78、D134、D202、D292和D387的結合抗體概況。

次要免疫原性目標(1)和(2)的終點是在每個研究干預組的參與者中針對D614G變異體的中和抗體滴度，包括評價：

- 在每個預定的時間點的個體血清中和滴度；

- 在每個預定的時間點相對於D01在疫苗接種後個體血清中和滴度的倍數上升；

- 在每個預定的疫苗接種後時間點的血清中和滴度上升2倍和上升4倍[後/前](倍數上升

2和

4)；以及

- 反應者，定義為基線值低於LLOQ且在每個預定的疫苗接種後時間點的可定量的中和滴度高於測定LLOQ的參與者，和基線值高於LLOQ且在每個預定的疫苗接種後時間點中和抗體滴度增加4倍的參與者。

次要免疫原性目標(3)的終點是在每個研究干預組的參與者中針對D614G變異體的結合抗體濃度，包括評價：

- 在每個預定的時間點的個體抗體濃度；

- 在每個預定的疫苗接種後時間點相對於D01在疫苗接種後個體抗體的倍數上升；

- 在每個預定的疫苗接種後時間點上升2倍和上升4倍(抗體濃度倍數上升[後/前]

2和

4)；以及

- 反應者，定義為基線值低於LLOQ且在預定的疫苗接種後時間點的可定量的抗體濃度高於測定LLOQ的參與者，和基線值高於LLOQ且在每個預定的疫苗接種後時間點結合抗體濃度增加4倍的參與者。

次要安全性

所述研究的次要目標還包括描述(1)在每個研究干預組的所有參與者中實驗室確認的有症狀的COVID-19的發生和(2)在每個研究干預組中血清學確認的SARS-CoV-2感染的發生。

次要安全性目標(1)的終點是：

- 實驗室確認的有症狀的COVID-19的發生(基於本地確認的或方案定義的NAAT)；

- 與住院治療相關的有症狀的COVID-19事件的發生；

- 嚴重的有症狀的COVID-19的發生；以及

- 與有症狀的COVID-19相關的死亡。

次要安全性目標(2)的終點是血清學確認的SARS-CoV-2感染的發生。

探索性免疫原性

所述研究的探索性目標包括(1)描述中和抗體與結合抗體之間的比率；(2)評估在參與者的子集中在D01、D22和D36的T細胞細胞因子概況；(3)進一步評估在參與者的子集中在D01、D22、D36、D134和D387的細胞免疫反應；(4)評估在參與者的子集中在D01、D22、D36和D134的粘膜抗體反應；以及(5)描述對新出現的SARS-CoV-2變異毒株的中和抗體反應。

探索性免疫原性目標(1)的終點是結合抗體(酶聯免疫吸附測定[ELISA])濃度與中和抗體滴度之間的比率。

探索性免疫原性目標(2)的終點是在D01、D22和D36在用全長S蛋白刺激後在全血中測量的Th1和Th2細胞因子。

探索性免疫原性目標(3)的終點是其他細胞介導的免疫(CMI)評估，所述評估可以藉由細胞內細胞因子染色或/和酶聯免疫斑點(ELISpot)測定進行。

探索性免疫原性目標(5)的終點是對新出現的變異毒株的中和抗體反應，這將在每個研究干預組的參與者中進行測量，包括評價：

- 在每個預定的時間點的個體血清中和滴度；

2和

4)；以及

整體設計

所述研究的整體設計示於表10中。

計畫招募總共720名參與者。在按年齡組(18-59歲和

60歲)、基線SARS-CoV-2快速血清學診斷測試陽性(陽性/陰性[如在招募時確定的])和高危醫療狀況(有/無)分層後，將參與者隨機分配到研究組。

對於所有研究組，一半的參與者將是18-59歲，並且一半的參與者將是60歲或以上。此外，在每個研究組中至多20%的參與者可以在招募時的快速血清學診斷測試時呈測試陽性。按年齡組分層的120名快速診斷測試陰性參與者的隨機分組的子集(20名參與者研究組/年齡組)將提供用於細胞免疫反應和粘膜抗體評估的樣品。

干預組和持續時間

干預組和持續時間總結於下表11中。指示了每個干預組的所使用的preS dTM抗原的量。

所有參與者均接受隔開3周給予的兩次疫苗注射：第一次注射在D01(疫苗接種[VAC]1)，並且第二次注射在D22(VAC2)。在每次注射前、最後一次注射後14天、2個月、4個月、6個月、9個月和12個月，從所有參與者中收集血液樣品。將從所有參與者中收集的血液樣品用於研究中的血清學評估。從參與者的子集中收集全血、外周血單核細胞(PBMC)和唾液樣品，以評估細胞免疫反應和粘膜抗體反應。

在試驗的持續時間內對所有參與者進行隨訪，以藉由被動監視來捕捉COVID-19的發生情況，其中如果參與者在研究期間的任何時間經歷COVID-19樣疾病的症狀/病症，他們將被指導聯繫網站。此外，對所有參與者進行主動監視，其中在D43聯繫後每2周與所有參與者聯繫一次，以詢問關於COVID-19樣疾病的發展情況。

每名參與者參與研究的持續時間將是大約在第2次注射後365天(即，總共大約386天)。

分析集

在D01或D01和D22兩個時間點對未感染和非未感染SARS-CoV-2者的以下亞組定義適用於所有隨機分組的參與者：

參與者分析集是：

1.在基線時未感染SARS-CoV-2者(未感染者-D01)

- 藉由對D01血清樣品進行抗S免疫測定(Roche Elecsys)，呈陰性，

- 藉由對D01血清樣品進行抗N免疫測定，呈陰性，並且

- 對D01收集的呼吸道樣品的SARS-CoV-2的NAAT，呈陰性。

2.在基線時非未感染SARS-CoV-2者(非未感染者-D01)

- 藉由對D01血清樣品進行抗S免疫測定(Roche Elecsys)，呈陽性，

- 藉由對D01血清樣品進行抗N免疫測定，呈陽性，或者

- 對D01收集的呼吸道樣品的SARS-CoV-2的NAAT，呈陽性

3.在第二次注射時未感染SARS-CoV-2者(未感染者-D01+D22)

- 藉由對D01血清樣品進行抗S免疫測定(Roche Elecsys)，呈陰性，

- 藉由對D01和D22血清樣品進行抗N免疫測定，呈陰性，並且

- 對D01和D22收集的呼吸道樣品的SARS-CoV-2的NAAT，呈陰性。

4.在第二次注射時非未感染SARS-CoV-2者(非未感染者-D01/D22)

- 藉由對D01血清樣品進行抗S免疫測定(Roche Elecsys)，呈陽性，

- 藉由對D01或D22血清樣品進行抗N免疫測定，呈陽性，或者

- 對D01或D22收集的呼吸道樣品的SARS-CoV-2的NAAT，呈陽性。

所定義的群體包括以下：

1.全分析集(FAS)：所有接受至少一次研究注射的隨機分組的參與者；參與者將根據他們隨機分組的干預進行分析。

2.符合方案分析集(PPAS)：FAS的子集；呈現至少一項以下標準的參與者將被排除在PPAS之外：

- 參與者不符合所有方案規定的納入標準或符合至少一項方案規定的排除標準，

- 參與者不接受兩次注射，

- 參與者接受了與他/她被隨機分組接受的疫苗不同的疫苗，

- 未按照方案製備和/或投予疫苗，

- 參與者未在適當的時間視窗內接受疫苗，

- 未收集D01或D36血液樣品的參與者，

- 儘管符合任何明確的禁忌症標準，但參與者仍接受了第二次注射的，以及

- 參與者在D36之前接受授權/批准的COVID-19疫苗。

實例10：II期資料

來自根據以上實例中所述的方案進行的II期臨床研究的資料表明，在720名志願者的所有成年人年齡組中CoV2 preS dTM AS03成功地展現出強烈的免疫反應。

在所述研究中，在水性磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液中提供了CoV2 preS dTM。以0.25mL的溶液提供了每個劑量的抗原(5、10或15μg)，並且在床邊與0.25mL的AS03混合。混合後的每個疫苗接種劑量具有表12所示的組成。在2個小瓶的盒子中的單獨小瓶中提供了抗原溶液和佐劑。將小瓶在2℃至8℃下儲存。

安全性資料證明三個處理組(5、10或15μg抗原+AS03)的安全性概況類似。在所述研究中，存在兩例直接相關的反應；但是在所述研究中沒有特別關注的不良事件(AESI)，沒有嚴重不良事件(SAE)，並且沒有導致研究中止的不良事件(AE)。存在有限數量的3級未誘發的相關反應和相關的醫學上關注的不良事件(MAAE)。在所有處理組中的反應原性是類似的(圖17)。與

60歲組相比，18-59歲組中誘發的反應的頻率和強度更高(圖18)。第2次注射後誘發的反應的頻率和強度也有所增加(圖19)。

免疫原性資料表明年輕人和老年人的血清轉化率和反應者比率均很高。在符合方案分析集(PPAS)-未感染者D1+D22中的第2劑後(D36)反應在年輕人和老年人中顯示出超過95%的血清轉化率和反應者比率，並且在三個處理組之間沒有差異(表13；CI=信賴區間)。

所有處理組的抗體反應資料(如由在PPAS-未感染者D1+D22中在Monogram PsVN測定中的第2劑後中和抗體滴度所指示的)示於下表14中(“GMT”：幾何平均滴度)。在探索性分析中，在一組人恢復期血清樣品中測量到了中和抗體滴度。在COVID-19的PCR陽性診斷後的第17天與第47天之間，從79名捐贈者獲得恢復期樣品。捐贈者已經康復(臨床嚴重程度範圍為從輕度至重度)並且在樣品收集時沒有症狀。

數據顯示，在低劑量組，參與者達到了與在恢復期血清中觀察到的類似的中和抗體滴度。在18-59歲年齡組中，GMT幾乎高達恢復期血清組的兩倍。

以上數據顯示，在未感染的參與者中，在年輕人和老年人中血清轉化率均>95%，並且在處理組之間沒有觀察到差異。與60歲及以上的那些相比，18-59歲中的抗體滴度的量級更高。在60歲及以上(而不是18歲及以上)組的處理組之間沒有觀察到量級增加。在18-59歲組中在較高抗原劑量的情況下觀察到增加。

在非未感染的參與者中也評價了CoV2 preS dTM AS03組合物。表15中的資料表明，低劑量組中的參與者在僅注射一次後中和抗體便顯著增加(如在(Monogram PsVN測定)中所測量的)，其中在第22天的GMT為35,275。此GMT是表14所示的恢復期血清組的15倍。

表15 非未感染的群體(FAS)中的中和抗體

非未感染的參與者的數據顯示，單次注射後18-59歲和

60歲年齡組的抗體滴度的量級均

5,000。在處理組之間沒有觀察到差異。

這些結果表明，CoV2 preS dTM AS03在所有成年人年齡組(包括60歲及以上的那些和有在先感染的那些)中均引發了高中和抗體反應。免疫原性組合物沒有顯示出安全性問題，其中在所測試的所有三個劑量水平上均具有良好耐受的安全性概況。所述II期研究表明，在所有年齡組和所有劑量下，第二次注射後的血清轉化率為95%至100%。在先前有SARS-CoV-2感染證據的參與者中，單個疫苗劑量後產生了顯著更高的抗體反應，這表明了作為加強疫苗開發的潛力很大。

2期資料確認了CoV2 preS dTM AS03免疫原性組合物在解決全球公共衛生危機方面發揮作用的潛力，因為眾所周知將需要多種疫苗，尤其是由於變異體不斷出現以及需要加強疫苗。基於這些積極的2期結果，將在超過35,000名參與者中在全球3期研究中進一步評價10μg劑量水平。

實例11：變異體單價(B.1.351)和二價(D614+B.1.351)疫苗在非人靈長類動物中的免疫原性

在未感染的非人靈長類動物(NHP)中進行了一項免疫原性研究(CoV2-06_NHP)，以評估在AS03的存在下變異體單價疫苗(B.1.351)的免疫原性以及當與D614 preS dTM抗原以二價配製物(D614+B.1.351)合併時的潛在的負面干擾。在抗體反應的峰值(第34天)，測量了針對這兩種病毒(D614和β)以及其他所關注的變異體(VoC)α、γ和δ的中和抗體滴度。在單價配製物與二價配製物之間比較了針對D614毒株的中和滴度(在來自Nexelis的VSV-假病毒合格的測定中獲得)，以評價在二價配製物中的每種組分對另一種組分的免疫原性的影響。

研究設計

將五十四隻二至八歲的成年模里西斯食蟹猴(雄性和雌性)按年齡、體重和性別隨機分組。將九組食蟹猴(每組六隻)用在AS03的存在下的三種疫苗配製物(D614、B.1.351和二價的)以每種組分2.5、5和10μg的劑量進行免疫(表16)。藉由肌內途徑在三角肌中給予隔開三周的兩次注射，兩次投予在同一側，劑量為0.5mL。

在整個研究中監測動物的不良事件的任何臨床病兆。在研究前以及D2、D21、D23和D34收集血液樣品用於血細胞計數和化學參數。在D21和D34收集血液樣品用於抗體滴定。在ELISA中測量了針對GCN4-刺突蛋白的結合IgG水平，並且在D34使用PsV中和測定(SP REI Cambridge)測量了針對D614、D614G、α、β、γ和δ變異體的中和抗體。平行地，在合格的D614 PsV中和測定(Nexelis)中滴定了樣品以定量對D614滴度的干擾。所使用的這兩種中和測定的特徵示於下表17中。

結果

在研究期間沒有觀察到臨床病兆，並且血液學和臨床化學參數以及體溫沒有顯示出任何關注的安全性訊號。在第一次注射後三周(D21)，所有食蟹猴均產生了(mounted)S結合抗體，如藉由ELISA所測量的，除在2.5μg B.1.351單價疫苗組中的一隻食蟹猴之外。平均ELISA滴度範圍為從3.5至4.1 log₁₀ EU(數據未顯示)。在第二次注射後兩周(D34)，與D21相比，在所有組中S結合抗體滴度均增加了，並且範圍為從4.9至5.4 log₁₀ EU。在劑量與疫苗配製物之間的ELISA滴度方面沒有觀察到統計學上顯著的差異。

在第二次注射後兩周(D34)，在兩種中和測定(合格的VSV-PsV和慢病毒-PsV)中均測量到了針對親代毒株D614的中和抗體(NAb)(圖20)，並且在慢病毒-PsV測定中測量到了針對親代毒株D614G、α、β、γ和δ變異體的中和抗體(圖21)。

根據疫苗配製物，在各個水平下，在D34在所有食蟹猴中均檢測到了D614 VSV-PsV NAb滴度。對於三種配製物(單價的D614和B.1.351配製物和二價的D614+B.1.351配製物)從每種組分2.5至10μg沒有觀察到劑量效應。D614 VSV-PsV中和滴度在單價的D614疫苗組中最高，所有三個劑量水平的平均滴度為3.6 log₁₀；在B.1.351單價組中最低，平均滴度為2.5 log₁₀；並且在二價疫苗組中中等，平均滴度為3.1 log10。當在每種組分的相同劑量下比較二價的和單價的D614疫苗時，在2.5μg劑量水平(單價的D614 2.5μg和二價的2.5μg+2.5μg)下，D614 NAb滴度的差異是統計學上顯著的(5.4倍，p值<0.001)。在兩個其他劑量水平(5μg和10μg的D614組分)下，差異較低(2倍)並且不是統計學上顯著的。

相比之下，在所有劑量水平下，與單價的B.1.351疫苗相比，在二價疫苗中D614 VSV-PsV NAb滴度的增加是統計學上顯著的(3.6至5.3倍，p值<0.05)。當合併所有三個劑量水平時，與單價的D614疫苗組中的滴度相比，在二價疫苗的情況下觀察到的D614 VSV-PsV中和滴度下降3倍(p值<0.001)，但是它們是由單價的B.1.351疫苗誘導的滴度的4.1倍(p值<0.001)。

在慢病毒-PsV中和測定中在2.5μg劑量水平下(3.8倍，p值<0.01)以及對於合併的所有三個劑量(2.3倍，p值<0.005)確認了與單價的D614疫苗相比，在VSV-PsV測定中在二價疫苗的情況下觀察到的D614 NAb滴度的中等下降。與VSV-PsV測定的結果類似，在慢病毒-PsV測定中，在所有三個劑量水平(2.9至5.3倍，p值<0.01)和合併的所有三個劑量(4.3倍，p值<0.001)下確認了與單價的B.1.351疫苗相比D614 NAb滴度的增加。在單價的B.1.351 5μg組中的一隻動物具有無法檢測到的D614 NAb滴度，並且同一只動物在VSV-PsV測定中針對D614的滴度較低，並且針對D614G和所有VoC的滴度較低。

在慢病毒-PsV中和測定中還評估了對β變異體和其他已知VoC(α、γ和δ)的中和作用。對於每種疫苗配製物，針對α和δ變異體的NAb滴度遵循與針對D614G的滴度相同的模式：單價的D614疫苗最高，單價的B.1.351疫苗最低，並且二價疫苗中等。針對α和δ變異體的滴度僅略低於針對D614G毒株的滴度(分別類似於低2.5倍和低1.2至4.9倍)。針對β和γ變異體的滴度對於單價的D614疫苗最低，而對於單價的B.1.351疫苗最高。二價疫苗所誘導的β和γ NAb滴度與單價的B.1.351疫苗在相同的水平下。

總體而言，與單價的D614疫苗相比，二價疫苗所誘導的針對親代毒株的NAb滴度略低(2至3倍，取決於測定)，針對β和γ變異體的滴度高得多，並且對兩種最廣泛循環的變異體α和δ的中和作用相當。與單價的B.1.351疫苗相比，二價疫苗所誘導的針對親代D614毒株和D614G毒株以及針對α和δ變異體的NAb滴度高得多(表18)。

總而言之，這些在未感染的NHP中生成的資料表明了對迄今為止已知的所有關注的變異體的平衡的中和作用。考慮到高度動態的流行病學，二價疫苗(D614+B.1.351)需要針對初次疫苗接種進行進一步的臨床研究，因為它可以降低疫苗逃逸的風險。確實，隨著由於疫苗接種和自然感染α和δ變異體的D614樣刺突的血清陽性率增加，疫苗逃逸變異體(諸如β和γ)可能在未來成為主導，尤其是如果與抗體逃逸相關的突變(諸如E484K)和與增加的傳播性相關的突變(如δ變異體中存在的)相結合的話。

實例12：NHP變異體加強劑研究

此實例描述了評價在用不同的疫苗平臺進行初次疫苗接種後單價的和二價的CoV2 preS dTM-AS03疫苗(D614、B.1.351或D614+B.1.351)作為加強劑的用途的研究(CoV2-07_NHP和CoV2-08_NHP)。儘管在初次疫苗接種中清楚地證明了AS03誘導穩健的免疫反應的益處，但在這裡評價了AS03在增強免疫反應中的作用，以確定佐劑是否可用於加強方案中。

在用COVID-19mRNA-LNP候選疫苗免疫的食蟹猴(CoV2-07_NHP，mRNA初免的群組)中和在用CoV2 preS dTM-AS03疫苗免疫的恒河猴(CoV2-08_NHP，次單元初免的群組；武漢毒株)中評價了加強免疫。兩個群組均在初次疫苗接種後約7個月接受了加強劑注射。

研究設計

在CoV2-07_NHP研究中，將先前接種了COVID-19 mRNA-LNP候選疫苗(Kalnin等人，NPJ Vaccines(2021)6(1)：61)的16只模里西斯食蟹猴(八隻雄性和八隻雌性，四至十歲)隨機分為四組，每組四隻食蟹猴。僅選擇在初次疫苗接種後兩周(D35)產生針對親代D614病毒的中和抗體反應的動物用於所述研究。

在CoV2-08-NHP研究中，將先前用CoV2 preS dTM-AS03(武漢毒株)免疫的24只印度恒河猴(雄性，2.7至4歲)隨機分為五組，每組四至五隻恒河猴。

在兩個群組中，隨機分組是基於基線特徵(性別和年齡)和初次免疫後以及加強劑疫苗接種前一個月的中和反應。不同的組接受了一個劑量的CoV2 preS dTM疫苗配製物，如表19中所述。

在整個研究中監測動物的不良事件的任何臨床病兆。在加強劑注射前、注射後D2、D7、D14、D21和D28收集血液樣品用於血細胞計數和化學參數。在D7、D14、D21和D28收集血液樣品用於對SARS-CoV-2 D614G、α、β、γ和δ變異體進行結合和慢病毒-PsV中和抗體滴定。

結果

在研究期間沒有觀察到臨床病兆，並且血液學和臨床化學參數以及體溫沒有顯示出任何關注的安全性訊號。

在加強劑後四周每週測量一次針對D614G毒株和B.1.351變異體的S結合IgG滴度和NAb滴度，並且與初次疫苗接種後(D35)或在基線時(即，初次免疫後七個月)(分別地，在mRNA初免的群組中的D205和在次單元初免的群組中的D196)的峰值滴度進行了比較。S結合IgG滴度示於圖22中，並且D614G和B.1.351 NAb滴度示於圖23中。在人類恢復期血清中測量到的S結合和D614 NAb滴度表示在相應的圖中。

在初次疫苗接種後七個月(D205或D196，表示基線)，兩個群組中的S結合滴度均有所下降，但是在大多數動物中仍然有檢測到。無論疫苗配製物如何，加強免疫早在D7便在所有動物中增加了S結合滴度。在AS03的存在下，增加更加顯著(在mRNA初免的群組中為3.5倍，不是統計學上顯著的；並且在次單元初免的群組中為5.7倍，p<0.05)。高IgG滴度在D7與D28(所分析的最終時間點)之間是穩定的。

與S結合滴度一致，D614G NAb滴度在兩個群組中在初次疫苗接種後七個月(D205或D196)均有所下降，並且來自mRNA初免的群組的一些動物的滴度呈陰性。在此時間點，B.1.351 NAb滴度在mRNA初免的群組中均無法檢測到，並且在次單元初免的群組中無法檢測到或很低。

在加強劑後一周，在來自兩個群組的所有接種組中，針對兩種毒株(D614G和B.1.351)的NAb滴度均強烈增加，除來自用加有AS03佐劑的單價的D614加強的mRNA初免的群組的一隻動物之外(僅在D14檢測到B.1.351 NAb滴度，而D614G NAb滴度在與其他動物相同的範圍內)。重要的是，在所有組和兩個群組中，增加至少穩定4周(所測試的最終時間點)。

為了探索中和反應的廣度，在加強劑後兩周分析了針對其他已知VoC(α、γ和δ)和SARS-CoV-1的NAb滴度，並且與在相同的時間點的針對D614G和B.1.351的NAb滴度進行了比較(圖24)。確認兩種原型毒株(D614G和B.1.351)的結果，在用所有疫苗配製物進行加強免疫後測量到了針對其他變異體的高NAb滴度。

數據顯示，在疫苗初免的獼猴中，第三次注射多種疫苗配製物(未加佐劑的單價的B.1.351、加有AS03佐劑的單價的D614或B.1.351、或二價的)誘導了針對親代D614毒株的初始NAb反應的強烈記憶，將中和作用擴展到β變異體和所有其他已知VoC(α、γ和δ)以及SARS-CoV-1。

與未加佐劑的單價配製物相比，加有AS03佐劑的配製物誘導了更高的NAb滴度(與基線相比D614G NAb滴度增加是統計學上顯著的-在mRNA初免的群組和次單元初免的群組中分別是6.5倍和8.1倍)。

在含有B.1.351 S抗原的疫苗(單價的或二價的)的情況下觀察到針對β和γ變異體的更高反應的趨勢，其中在加強劑後兩周在兩個群組中針對VoC的平均NAb滴度均大於3.5 log₁₀，並且針對D614G的平均NAb滴度大於4.0 log₁₀。與單價的D614或B.1.351相比，在二價疫苗中沒有觀察到對NAb反應的干擾(陰性或陽性)。

重要的是，在加強劑後每週測量的Ab滴度(針對D614G和β的S結合和NAb)從D7至D28似乎是穩定的，這表明它們早在D7便達到了平臺期。所述觀察結果在用不同疫苗平臺(mRNA和次單元)免疫的獼猴中重現，但是在加強免疫時針對變異體的NAb反應很低至無法檢測到。

序列表

<110> 美商賽諾菲巴斯德公司(SANOFI PASTEUR INC.) 比利時商葛蘭素史密斯克萊生物股份有限公司(GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA)

<120> 具有含有生育酚之鯊烯乳劑佐劑之COVID-19疫苗

<130> 025532.TW005

<140>

<141>

<150> 63/215,092

<151> 2021-06-25

<150> 63/189,044

<151> 2021-05-14

<150> 63/184,155

<151> 2021-05-04

<150> 63/069,171

<151> 2020-08-24

<160> 23

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> 嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2

<400> 1

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2

<400> 2

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 3

<210> 4

<211> 1198

<212> PRT

<213> 嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2

<400> 4

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2

<400> 5

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 6

<210> 7

<211> 27

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 未知的描述：折疊子序列

<400> 7

<210> 8

<211> 81

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 未知的描述：折疊子序列

<400> 8

<210> 9

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 9

<210> 10

<211> 1243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 未知的描述：幾丁質酶信號序列

<400> 11

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 12

<210> 13

<211> 1240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 13

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 14

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 15

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 16

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 17

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 18

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 19

<210> 20

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 20

<210> 21

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 21

<210> 22

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 22

<210> 23

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 23

Claims

一種免疫原性組合物，所述組合物包含

(a)一種、兩種、三種或更多種重組SARS-CoV-2蛋白，其中一種或多種的所述蛋白質是多肽的三聚體，所述多肽從N末端至C末端包含，

(i)與SEQ ID NO：10的殘基19-1243至少95%相同的序列，其中SEQ ID NO：10的位置687-690處的殘基GSAS(SEQ ID NO：6)和SEQ ID NO：10的位置991和992處的殘基PP被保留在所述序列中；和

(ii)三聚化結構域，其中所述三聚化結構域包含SEQ ID NO：7；以及

(b)佐劑，其中所述佐劑是包含生育酚和鯊烯的水包油乳劑。
一種免疫原性組合物，所述組合物包含

(a)一種、兩種、三種或更多種重組SARS-CoV-2 S蛋白，各自藉由包括以下的方法產生：

向昆蟲細胞中引入用於表現多肽的桿狀病毒載體，所述多肽從N末端至C末端包含(i)源自昆蟲或桿狀病毒蛋白的訊號肽；(ii)與SEQ ID NO：10的殘基19-1243至少95%相同的序列，其中SEQ ID NO：10的位置687-690處的殘基GSAS(SEQ ID NO：6)和SEQ ID NO：10的位置991和992處的殘基PP被保留在所述序列中；和(iii)三聚化結構域，其中所述三聚化結構域包含SEQ ID NO：7；

將所述昆蟲細胞在允許所述多肽表現和三聚化的條件下培養；以及

將所述重組SARS-CoV-2 S蛋白從所述培養物中分離，其中所述重組SARS-CoV-2 S蛋白是不含所述訊號序列的所述多肽的三聚體；以及

(b)佐劑，其中所述佐劑是包含生育酚和鯊烯的水包油乳劑。
如請求項2所述的免疫原性組合物，其中所述桿狀病毒載體包含可操作地與所述多肽的編碼序列連接的多角體啟動子。
如請求項2或3所述的免疫原性組合物，其中所述昆蟲或桿狀病毒蛋白是幾丁質酶。
如請求項4所述的免疫原性組合物，其中所述訊號肽包含SEQ ID NO：3。
如請求項1-5中任一項所述的免疫原性組合物，其中組合物包含

(i)重組SARS-CoV-2蛋白，所述蛋白質是包含或具有與SEQ ID NO：10的殘基19-1243相同的序列的多肽的三聚體，

(ii)重組SARS-CoV-2蛋白，所述蛋白質是包含或具有與SEQ ID NO：13的殘基19-1240相同的序列的多肽的三聚體，或

(iii)任選地等量的(i)和(ii)二者。
如請求項1-6中任一項所述的免疫原性組合物，其中對於每0.5mL或每個劑量的所述組合物，所述組合物包含以下或藉由將以下混合而製備：

(i)抗原組分，所述抗原組分包含各種約2μg至約50μg、任選地約2.5μg至約50μg或約5μg至約50μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白；以及

(ii)水包油乳劑佐劑，所述佐劑包含以下或藉由將以下混合而製備：

a)在磷酸鹽緩衝鹽水中的10.69mg鯊烯、4.86mg聚山梨醇酯80和11.86mg α-生育酚，任選地如表9所示，進一步任選地其中所述佐劑以0.25mL提供，

b)在磷酸鹽緩衝鹽水中的5.35mg鯊烯、2.43mg聚山梨醇酯80和5.93mg α-生育酚，任選地如表9所示，進一步任選地其中所述佐劑以0.25mL提供，

c)在磷酸鹽緩衝鹽水中的2.67mg鯊烯、1.22mg聚山梨醇酯80和2.97mg α-生育酚，任選地如表9所示，進一步任選地其中所述佐劑以0.25mL提供，或

d)在磷酸鹽緩衝鹽水中的1.34mg鯊烯、0.61mg聚山梨醇酯80和1.48mg α-生育酚，任選地如表9所示，進一步任選地其中所述佐劑以0.25mL提供。
如請求項7所述的免疫原性組合物，其中對於每0.5mL或每個劑量的所述組合物，所述組合物包含各種2.5、5、10、15或45μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白。
如請求項7或8所述的免疫原性組合物，其中所述抗原組分包含以下或藉由將以下混合而製備：

0.097mg磷酸二氫鈉一水合物，

0.26mg無水磷酸氫二鈉，

2.2mg氯化鈉，

550μg聚山梨醇酯20，和

約0.25mL水。
如請求項1-9中任一項所述的免疫原性組合物，其中對於每0.5mL或每個劑量的所述組合物，所述組合物包含總共5μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白，任選地其中所述組合物包含等量的兩種不同的重組SARS-CoV-2 S蛋白。
如請求項1-9中任一項所述的免疫原性組合物，其中對於每0.5mL或每個劑量的所述組合物，所述組合物包含總共10μg的所述一種或多種重組 SARS-CoV-2 S蛋白，任選地其中所述組合物包含等量的兩種不同的重組SARS-CoV-2 S蛋白。
一種容器，所述容器含有如請求項1-11中任一項所述的免疫原性組合物。
如請求項12所述的容器，其中所述容器是小瓶或注射器。
如請求項12或13所述的容器，其中所述容器含有單個劑量的所述免疫原性組合物，任選地所述單個劑量的體積是0.5mL。
如請求項12或13所述的容器，其中所述容器含有多個劑量的所述免疫原性組合物，任選地所述劑量中的每一個的體積是0.5mL。
一種用於肌內疫苗接種的套組，其中所述套組包含兩個容器，其中

(a)第一容器含有包含一種、兩種、三種或更多種重組SARS-CoV-2 S蛋白的醫藥組合物，其中一種或多種的所述蛋白質是多肽的三聚體，所述多肽從N末端至C末端包含，

(i)與以下至少95%相同的序列：

(A)SEQ ID NO：10的殘基19-1243，其中SEQ ID NO：10的位置687-690處的殘基GSAS(SEQ ID NO：6)和SEQ ID NO：10的位置991和992處的殘基PP被保留在所述序列中，或

(B)SEQ ID NO：13的殘基19-1240，其中SEQ ID NO：13的位置684-687處的殘基GSAS(SEQ ID NO：6)和SEQ ID NO：13的位置988和989處的殘基PP被保留在所述序列中；和

(ii)三聚化結構域，其中所述三聚化結構域包含SEQ ID NO：7；並且

(b)第二容器含有包含生育酚和鯊烯的水包油佐劑。
如請求項16所述的套組，其中所述第一容器包含

(i)重組SARS-CoV-2蛋白，所述蛋白質是包含或具有與SEQ ID NO：10的殘基19-1243相同的序列的多肽的三聚體，

(ii)重組SARS-CoV-2蛋白，所述蛋白質是包含或具有與SEQ ID NO：13的殘基19-1240相同的序列的多肽的三聚體，或

(iii)任選地等量的(i)和(ii)二者。
如請求項16或17所述的套組，其中所述第一容器包含一個或多個劑量的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白，其中每個劑量的所述一種或多種蛋白質是在0.25mL的磷酸鹽緩衝鹽水中提供的約2.5至45、任選地5至45μg，任選地如表A、表8或表12所示。
如請求項18所述的套組，其中每個劑量的所述蛋白質是2.5、5、10、15或45μg。
如請求項16-19中任一項所述的套組，其中所述第二容器包含一個或多個劑量的所述佐劑，其中每個劑量的所述佐劑的體積是0.25mL並且包含

(a)在磷酸鹽緩衝鹽水中的10.69mg鯊烯，

4.86mg聚山梨醇酯80，和

11.86mg α-生育酚，任選地如表9所示；

(b)在磷酸鹽緩衝鹽水中的5.35mg鯊烯，

2.43mg聚山梨醇酯80，和

5.93mg α-生育酚，任選地如表9所示；

(c)在磷酸鹽緩衝鹽水中的2.67mg鯊烯，

1.22mg聚山梨醇酯80，和

2.97mg α-生育酚，任選地如表9所示；或

(d)在磷酸鹽緩衝鹽水中的1.34mg鯊烯，

0.61mg聚山梨醇酯80，和

1.48mg α-生育酚，任選地如表9所示。
一種製造疫苗套組的方法，所述方法包括：

提供如請求項1-11中任一項所述的免疫原性組合物的一種或多種重組S蛋白和佐劑，以及

將所述蛋白質和所述佐劑包裝到分別的無菌容器中。
一種預防或改善有需要的個體的COVID-19的方法，所述方法包括向所述個體投予預防有效量的如請求項1-11中任一項所述的免疫原性組合物。
一種預防或改善有需要的個體的COVID-19的方法，所述方法包括向所述個體投予預防有效量的如請求項1-11中任一項所述的免疫原性組合物，其中在所述投予步驟之前，所述個體已經感染SARS-CoV-2或已經接種第一COVID-19疫苗。
如請求項23所述的方法，其中在所述投予步驟之前，所述個體已經接種基因疫苗或次單元疫苗、或滅活疫苗。
如請求項24所述的方法，其中所述個體已經接種包含編碼重組SARS-CoV-2 S抗原的mRNA的基因疫苗。
如請求項23-25中任一項所述的方法，其中所述投予步驟在感染後或在所述個體接種所述第一COVID-19疫苗後4周、一個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月或一年，任選地四至十個月，進一步任選地八個月進行，任選地其中所述免疫原性組合物包含各種2.5或5μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白，並且進一步任選地其中所述免疫原性組合物是單價的或多價的。
如請求項22-26中任一項所述的方法，其中以每劑約5至約50μg或約2.5至約50μg，任選地2.5、5、10、15或45μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白向所述個體肌內投予所述免疫原性組合物。
如請求項22-27中任一項所述的方法，其中所述預防有效量以單個劑量或以兩個或更多個劑量投予。
如請求項28所述的方法，所述方法包括以約兩周至約三或四個月的間隔向所述個體投予兩個劑量的所述免疫原性組合物，其中每個劑量的所述免疫原性組合物包含總共2.5、5或10μg的所述一種或多種重組SARS-CoV-2 S蛋白。
如請求項29所述的方法，其中所述間隔是約三周或約21天、或約四周或約28天、或約一個月。
如請求項22-30中任一項所述的方法，其中所述個體是人類個體，任選地其中所述人類個體是兒童、成年人或老年人
如請求項1-11中任一項所述的免疫原性組合物，用於在預防性治療COVID-19中、任選地在如請求項22-31中任一項所述的方法中使用。
如請求項1-11中任一項所述的免疫原性組合物用於製造用以預防性治療COVID-19、任選地用於如請求項22-31中任一項所述的方法中的藥劑的用途。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述生育酚是α-生育酚，任選地D,L-α-生育酚。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述佐劑的平均液滴尺寸小於1μm，任選地其中所述平均液滴尺寸是小於500nm、小於200nm、50至200nm、120至180nm或140至180nm。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述佐劑的多分散性指數是0.5或更小、或0.3或更小，諸如0.2或更小。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述佐劑包含選自以下的表面活性劑：泊洛沙姆401、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯80、脫水山梨糖醇三油酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯12鯨蠟基/硬脂基醚，單獨或與彼此組合或與其他表面活性劑組合。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述佐劑包含選自以下的表面活性劑：聚山梨醇酯80、脫水山梨糖醇三油酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯12鯨蠟基/硬脂基醚，單獨或與彼此組合。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述佐劑包含聚山梨醇酯 80。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中佐劑包含一種、兩種或三種表面活性劑。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中在所述佐劑中的鯊烯與生育酚的重量比是0.1至10，任選地0.2至5、0.3至3、0.4至2、0.72至1.136、0.8至1、0.85至0.95、或0.9。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中在所述佐劑中的鯊烯與表面活性劑的重量比是0.73至6.6，任選地1至5、1.2至4、1.71至2.8、2至2.4、2.1至2.3、或2.2。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中在單個劑量的所述佐劑中的鯊烯的量是至少1.2mg，任選地1.2至20mg、1.2至15mg、1.2至2mg、1.21至1.52mg、2至4mg、2.43至3.03mg、4至8mg、4.87至6.05mg、8至12.1mg或9.75至12.1mg。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中在單個劑量的所述佐劑中的生育酚的量是至少1.3mg，任選地1.3至22mg、1.3至16.6mg、1.3至2mg、1.33至1.69mg、2至4mg、2.66至3.39mg、4至8mg、5.32至6.77mg、8至13.6mg或10.65至13.53mg。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中在單個劑量的所述佐劑中的表面活性劑的量是至少0.4mg，任選地0.4至9.5mg、0.4至7mg、0.4至1mg、0.54至0.71mg、1至2mg、1.08至1.42mg、2至4mg、2.16至2.84mg、4至7mg或4.32至5.68mg。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述佐劑包含以下或基本上由以下組成：

鯊烯；

生育酚，任選地D,L-α-生育酚；

表面活性劑，任選地聚山梨醇酯80；和

水。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中用於肌內注射的單個劑量的體積是0.05至1mL，任選地0.1至0.6mL、0.2至0.3mL、0.25mL、0.4至0.6mL、或0.5mL。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述免疫原性組合物或所述第一容器和所述第二容器的內容物的混合物的pH是4至9，任選地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述免疫原性組合物或所述第一容器和所述第二容器的內容物的混合物具有的滲透壓是250至750mOsm/kg，任選地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述免疫原性組合物或所述第一容器和所述第二容器的內容物的混合物所包含的鯊烯是0.8至100mg/mL，任選地1.2至48.4mg/mL、10至30mg/mL、或21.38mg/mL。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中在與所述重組S蛋白混合之前，用於肌內注射的單個劑量的所述佐劑的體積是0.05mL至1mL，任選地0.1至0.6mL、0.2至0.3mL、0.25mL、0.4至0.6mL、或0.5mL。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中在與所述重組S蛋白混合之前，所述佐劑

具有4至9，任選地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4的pH；

具有250至750mOsm/kg，任選地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg的滲透壓；

包含緩衝劑和/或張力調節劑，任選地改良的磷酸鹽緩衝鹽水，任選地如表9所示；

具有0.8至100mg/mL、任選地1.2至48.4mg/mL的鯊烯濃度；並且

具有0.05mL至1mL、任選地0.1至0.6mL的單劑量體積。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，其中所述重組S蛋白在水性液體溶液中提供，所述水性液體溶液在與所述佐劑混合之前具有

0.2至0.3mL、任選地0.25mL，0.4至0.6mL，或0.5mL的單劑量體積；

4至9，任選地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4的pH；和

250至750mOsm/kg，任選地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg的滲透壓。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，用於治療未感染SARS-CoV-2的個體。
如前述請求項中任一項所述的免疫原性組合物、用於所述用途的免疫原性組合物、容器、套組、方法或用途，用於在有需要的人類個體中引發免疫反應，所述免疫反應

部分或完全降低一種或多種COVID-19症狀的嚴重程度和/或所述個體經歷一種或多種COVID-19症狀的時間，

降低攻擊後患上已建立的感染的可能性，

減慢疾病的進展，任選地延長存活期，

產生針對SARS-CoV-2的中和抗體，和/或

是SARS-CoV-2 S蛋白特異性T細胞反應。