CN116648257A - 含有含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的covid-19疫苗 - Google Patents

Abstract

提供了用于预防性治疗SARS‑CoV‑2感染和COVID‑19的新型疫苗以及制造所述疫苗的方法，其中所述疫苗含有包含生育酚和角鲨烯的水包油乳剂。

Description

含有含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的COVID-19疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求来自2020年8月24日提交的美国临时申请63/069,171；2021年5月4日提交的美国临时申请63/184,155；2021年5月14日提交的美国临时申请63/189,044；和2021年6月25日提交的美国临时申请63/215,092的优先权。将以上提及的优先权申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。

联邦资助的研究或开发

本发明是在由美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)和ASPR-BARDA授予的HHSO100201600005I；以及由美国陆军承包司令部(U.S.Army Contracting Command)ACC-NJ颁发且作为卫生与公众服务部与国防部之间的联合任务授予的其他交易协议(Other Transaction Agreement，OTA)W15QKN-16-9-1002下在政府的支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。在2021年8月10日创建的序列表的电子副本名称为025532_WO005_SL.txt并且大小为48,845字节。

背景技术

冠状病毒是感染多种多样的哺乳动物和禽类物种的有包膜的正义单链RNA病毒家族。病毒基因组被包装在由病毒核衣壳(N)蛋白组成的衣壳中并且被脂质包膜包围。嵌入脂质包膜中的是膜(M)蛋白、包膜小膜(E)蛋白、血凝素酯酶(HE)和刺突(S)蛋白。S蛋白介导病毒附着和进入细胞。

人冠状病毒(hCoV)引起呼吸系统疾病。低致病性hCoV感染上呼吸道并且引起轻度感冒。高致病性hCoV主要感染下气道并且能够引起严重的(并且有时是致命的)肺炎，诸如严重急性呼吸综合征(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS-CoV)。由hCoV引起的严重肺炎通常与病毒快速复制、大量炎性细胞浸润以及促炎细胞因子和趋化因子升高相关，导致急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征(参见例如，Channappanavar和Perlman,SeminImmunopathol(2017)39(5):529-39)。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)(也称为2019新型冠状病毒(2019-nCoV))是继HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV和原始SARS-CoV之后的第七种已知感染人的冠状病毒(Zhu等人,N Eng Med.(2020)382(8):727-33)。像牵涉2003年SARS爆发的SARS相关冠状病毒株一样，SARS-CoV-2是沙贝病毒(Sarbecovirus)亚属(β-CoV谱系B)的成员。SARS-CoV-2是持续发生的2019-21冠状病毒疾病(COVID-19)的原因(Chan等人,Lancet(2020)395(10223):514-23；Xu等人,Lancet Respir Med.(2020)doi:10.1016/S2213-2600(20)30076-X；Gen Bank：MN908947.3；Gorbalenya等人,bioRxiv(2020)doi:10.1101/2020.02.07.937862)。人与人之间的传播主要经由呼吸道飞沫和气溶胶发生。

COVID-19的临床特征各不相同。在大多数情况下，被感染的个体可能是无症状的或具有轻微症状。在有症状的那些中，典型的表现包括发热、咳嗽、呼吸短促、嗅觉缺失和疲劳。更严重的表现包括急性呼吸窘迫综合征、中风和细胞因子释放综合征，在一些情况下导致死亡。严重的疾病可能发生在任何年龄的健康个体中，但是主要发生在高龄或有基础医学共病的成年人中。老年人最常受到影响，并且具有高死亡率。与严重疾病和死亡率相关的共病和其他病症包括慢性肾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、免疫受损状态、肥胖症、严重心脏病症(例如，心力衰竭、冠状动脉疾病或心肌病)、镰状细胞疾病、糖尿病、高血压、肝病和肺纤维化。来自COVID-19的风险在全世界也因国家和国家内部的区域而异(参见例如，deSouza,Nat Hum Behav.(2020)4:856-865；Chen,Cell Death Dis.(2020)11:438)。

SARS-CoV-2通过与细胞表面蛋白血管紧张素转换酶2(ACE2)结合来感染细胞(Hoffmann等人,Cell(2020)181(2):271-80；Walls等人,Cell(2020)181(2):281-92)。病毒通过S蛋白获得进入宿主细胞的入口。S蛋白是I类融合蛋白，并且被多糖厚厚地包被，从而帮助病毒逃避免疫监视。所述蛋白质是通过前体S多肽的加工产生的。前体多肽经历糖基化，去除信号肽，并且在残基685与686之间被前蛋白转化酶弗林蛋白酶切割以产生两个亚基S1和S2。S1和S2作为原聚体保持缔合。S蛋白是原聚体的三聚体，以亚稳定融合前构象存在。在S1亚基与宿主细胞受体结合后，S1亚基从蛋白质中释放出来。剩余的S2亚基转变为高度稳定的融合后构象并且促进病毒与宿主细胞之间的膜融合，因此促进病毒进入细胞(参见例如，Wrapp等人,Science(2020)10.1126/science.abb2507；Shang等人,PNAS(2020)117(21):11727-34)。

S蛋白是疫苗开发的关键靶标。预期处于融合前构象的蛋白质呈现出中和最敏感的表位(参见例如，Wrapp,同上)。成功的免疫策略需要稳定的抗原，并且已经描述了稳定处于融合前构象的SARS-CoV-2 S蛋白的尝试(参见例如，Xiong等人,Nat Struct Mol Biol.(2020)doi.org/10.1038/s41594-020-0478-5)。

由COVID-19引起的公共卫生危机持续不减弱，尤其是在发展中国家。SARS-CoV-2的变体不断出现。仍然迫切需要开发能够帮助对抗COVID-19的持续威胁的有效疫苗。

发明内容

本公开文本提供了一种免疫原性组合物，所述组合物包含(a)一种、两种、三种或更多种重组SARS-CoV-2蛋白，其中一种或多种的所述蛋白质是多肽的三聚体，所述多肽从N末端至C末端包含(i)与(1)SEQ ID NO:10的残基19-1243或(2)SEQ ID NO:13的残基19-1240至少94％，例如至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)相同的序列，其中SEQ IDNO:10的位置687-690(和SEQ ID NO:13中的相应位置)处的残基GSAS(SEQ ID NO:6)和SEQID NO:10的位置991和992(和SEQ ID NO:13中的相应位置)处的残基PP被维持在所述序列中；和(ii)三聚化结构域，其中所述三聚化结构域包含SEQ ID NO:7；以及(b)佐剂，其中所述佐剂是包含生育酚和角鲨烯的水包油乳剂。当组合物被说成具有两种或更多种蛋白质时，意图是这些蛋白质彼此不同。

在另一方面，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，所述组合物包含(a)一种、两种、三种或更多种重组SARS-CoV-2 S蛋白，各自可通过包括以下的方法获得：向昆虫细胞中引入用于表达多肽的杆状病毒载体，所述多肽从N末端至C末端包含(i)源自昆虫或杆状病毒蛋白(例如，几丁质酶)的信号肽；(ii)与(1)SEQ ID NO:10的残基19-1243或(2)SEQ IDNO:13的残基19-1240至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)相同的序列，其中SEQID NO:10的位置687-690(和SEQ ID NO:13中的相应位置)处的残基GSAS(SEQ ID NO:6)和SEQ ID NO:10的位置991和992(和SEQ ID NO:13中的相应位置)处的残基PP被维持在所述序列中；和(iii)三聚化结构域，其中所述三聚化结构域包含SEQ ID NO:7；将所述昆虫细胞在允许使所述多肽表达和三聚化的条件下培养；以及从所述培养物中分离所述重组SARS-CoV-2 S蛋白，其中所述重组SARS-CoV-2 S蛋白是不含所述信号序列的所述多肽的三聚体；以及(b)佐剂，其中所述佐剂是包含生育酚和角鲨烯的水包油乳剂。在一些实施方案中，所述杆状病毒表达载体包含可操作地与所述多肽的编码序列连接的多角体蛋白启动子。在一些实施方案中，所述信号肽源自昆虫或杆状病毒几丁质酶。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:3。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含一种(单价)或多种(多价)不同的重组SARS-CoV-2 S蛋白。例如，所述组合物包含两种(二价)、三种(三价)或四种(四价)不同的重组SARS-CoV-2 S蛋白。

在一些实施方案中，所述重组多肽包含或具有与(i)SEQ ID NO:10的残基19-1243或(ii)SEQ ID NO:13的残基19-1240相同的序列。在一些实施方案中，所述组合物是二价的并且包含重组蛋白，所述重组蛋白是任选地等量的包含或具有与SEQ ID NO:10的残基19-1243相同的序列的重组多肽的三聚体和包含或具有与SEQ ID NO:13的残基19-1240相同的序列的重组多肽的三聚体。

在一些实施方案中，每个剂量(以例如约0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mL)的所述免疫原性组合物包含以下或通过将以下混合而制备：(i)抗原组分，所述抗原组分包含约2μg至约50μg、任选地约2.5μg至约50μg或约5μg至约50μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2 S蛋白中的每一种；以及(ii)水包油乳剂佐剂，所述佐剂包含a)在磷酸盐缓冲盐水中的10.69mg角鲨烯、4.86mg聚山梨醇酯80和11.86mgα-生育酚，任选地如表9所示，进一步任选地其中所述佐剂以0.25mL提供，b)在磷酸盐缓冲盐水中的5.34mg角鲨烯、2.43mg聚山梨醇酯80和5.93mgα-生育酚，任选地如表9所示，进一步任选地其中所述佐剂以0.25mL提供，c)在磷酸盐缓冲盐水中的2.67mg角鲨烯、1.22mg聚山梨醇酯80和2.97mgα-生育酚，任选地如表9所示，进一步任选地其中所述佐剂以0.25mL提供，或d)在磷酸盐缓冲盐水中的1.34mg角鲨烯、0.61mg聚山梨醇酯80和1.48mgα-生育酚，任选地如表9所示，进一步任选地其中所述佐剂以0.25mL提供。可替代地，上述蛋白量是组合物中的总蛋白量。

在一些实施方案中，每个剂量(以例如约0.5mL)的所述免疫原性组合物通过将0.25mL的抗原组分和0.25mL的AS03佐剂(AS03_A)混合而制备。0.25mL的所述抗原组分可以包含以下或通过将以下混合而制备：0.0975mg磷酸二氢钠一水合物、0.65mg磷酸氢二钠十二水合物(对应于0.26mg无水磷酸氢二钠)、2.2mg氯化钠、50-600(例如，55或550)μg聚山梨醇酯20和约0.25mL水(足量添加的(q.s.ad)0.25mL)。在某些实施方案中，0.25mL的所述抗原组分或0.5mL的最终免疫原性组合物(含佐剂)包含2.5μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2 S蛋白中的每一种，任选地其中所述组合物包含等量的两种不同的重组SARS-CoV-2S蛋白；如果所述组合物是单价的，则它包含2.5μg的所述重组S蛋白。在某些实施方案中，0.25mL的所述抗原组分或0.5mL的最终免疫原性组合物(含佐剂)包含5μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2 S蛋白中的每一种，任选地其中所述组合物包含等量的两种不同的重组SARS-CoV-2 S蛋白；如果所述组合物是单价的，则它包含5μg的所述重组S蛋白。在某些实施方案中，0.25mL的所述抗原组分或0.5mL的最终免疫原性组合物(含佐剂)包含10μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2 S蛋白中的每一种，任选地其中所述组合物包含等量的两种不同的重组SARS-CoV-2 S蛋白；如果所述组合物是单价的，则它包含10μg的所述重组S蛋白。可替代地，上述蛋白量是组合物中的总蛋白量，而不是组合物中每种蛋白的蛋白量。

在另一方面，本公开文本提供了一种以单个剂量或多个剂量含有本文所述的免疫原性组合物的容器，其中每个剂量的体积是例如约0.25或约0.5mL。在一些实施方案中，所述容器是小瓶或注射器。

在另一方面，本公开文本提供了一种用于肌内疫苗接种的试剂盒，其中所述试剂盒包含两个容器，其中(a)第一容器含有包含一种、两种、三种或更多种重组SARS-CoV-2 S蛋白的药物组合物，其中一种或多种的所述蛋白质是多肽的三聚体，所述多肽从N末端至C末端包含(i)与以下至少94％，例如至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)相同的序列：(A)SEQ ID NO:10的残基19-1243，其中SEQ ID NO:10的位置687-690处的残基GSAS(SEQID NO:6)和SEQ ID NO:10的位置991和992处的残基PP被维持在所述序列中，或(B)SEQ IDNO:13的残基19-1240，其中SEQ ID NO:13的位置684-687处的残基GSAS(SEQ ID NO:6)和SEQ ID NO:13的位置988和989处的残基PP被维持在所述序列中；和(ii)三聚化结构域，其中所述三聚化结构域包含SEQ ID NO:7；并且(b)第二容器含有包含生育酚和角鲨烯的水包油佐剂。在一些实施方案中，所述多肽包含或具有与(i)SEQ ID NO:10的残基19-1243或(ii)SEQ ID NO:13的残基19-1240相同的序列。在进一步的实施方案中，所述容器含有两种不同的重组S蛋白，各自具有上述序列之一。在一些实施方案中，所述第一容器包含一个或多个剂量的在磷酸盐缓冲盐水中提供的所述一种或多种重组SARS-CoV-2 S蛋白，任选地如表A、表8或表12所示，其中每个剂量(体积为0.25mL)具有约2.5μg至45μg、任选地5μg至45μg(例如，2.5、5、10、15或45μg)的所述一种或多种重组S蛋白(总共或单独)。在一些实施方案中，所述第二容器包含一个或多个剂量的所述佐剂，其中每个剂量的所述佐剂的体积是0.25mL，所述佐剂包含a)在磷酸盐缓冲盐水中的10.69mg角鲨烯、4.86mg聚山梨醇酯80和11.86mgα-生育酚，任选地如表9所示，b)在磷酸盐缓冲盐水中的5.35mg角鲨烯、2.43mg聚山梨醇酯80和5.93mgα-生育酚，任选地如表9所示，c)在磷酸盐缓冲盐水中的2.67mg角鲨烯、1.22mg聚山梨醇酯80和2.97mgα-生育酚，任选地如表9所示，或d)在磷酸盐缓冲盐水中的1.34mg角鲨烯、0.61mg聚山梨醇酯80和1.48mgα-生育酚，任选地如表9所示。

本公开文本还提供了一种制造疫苗试剂盒的方法，所述方法包括提供所述免疫原性组合物的一种或多种重组S蛋白和佐剂以及将所述蛋白质和所述佐剂包装到单独的无菌容器中。

本公开文本进一步提供了一种预防或改善有需要的受试者的COVID-19的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防有效量的本文的免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述预防有效量以单个剂量或以两个或更多个剂量施用。在一些实施方案中，所述预防有效量是每剂约5至约50μg，任选地每剂5、10、15或45μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2 S蛋白，以单个剂量或以两个或更多个剂量肌内施用。在一些实施方案中，以约两周至约三个月(例如，约三周或约21天)的间隔施用两个或更多个剂量的所述免疫原性组合物，其中每个剂量的所述免疫原性组合物包含5μg或10μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2 S蛋白。在一些实施方案中，根据下文表B中的方案1、10、11或12向所述受试者施用本文的免疫原性组合物。

在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物被用作先前有SARS-CoV-2感染的受试者或已经接种针对相同或不同的病毒株的COVID-19疫苗的受试者的加强疫苗，例如以预防或改善COVID-19。第一COVID-19疫苗可以是灭活疫苗、亚单位疫苗或基因疫苗(例如，mRNA疫苗或病毒载体疫苗)。在某些实施方案中，所述受试者已经接种包含编码重组SARS-CoV-2 S抗原的mRNA的基因疫苗。在某些实施方案中，在感染后或在所述受试者接种所述第一COVID-19疫苗后约4周、约一个月、约三个月、约六个月、约四至十个月或约一年向所述受试者施用本发明的免疫原性组合物，任选地其中所述免疫原性组合物包含2.5μg或5μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2蛋白，并且进一步任选地其中所述免疫原性组合物是单价的或多价的。在进一步的实施方案中，在第一次COVID-19疫苗接种完成后约八个月给予加强注射剂。在一些实施方案中，所述基因疫苗包含编码重组SARS-CoV-2 S抗原的mRNA，任选地其中所述重组SARS-CoV-2 S蛋白包含SEQ ID NO:1、4、10、13或14或其抗原片段。在某些实施方案中，本文的加强免疫原性组合物包含每剂2.5或5μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2 S蛋白。在某些实施方案中，所述加强免疫原性组合物是单价的(例如，包含不含信号序列的含有SEQ ID NO:10或13的重组S蛋白)或二价的(例如，包含不含信号序列的含有SEQID NO:10的第一重组S蛋白和不含信号序列的含有SEQ ID NO:13的第二重组S蛋白)。在一些实施方案中，根据下文表B中的方案2、3、4、5、6、7、8或9向所述受试者施用本文的免疫原性组合物。

本公开文本还提供了用于在预防性治疗COVID-19中使用的本文所述的免疫原性组合物。

本公开文本进一步提供了本文所述的免疫原性组合物用于制造用以预防性治疗COVID-19的药剂的用途。所述预防性治疗可以预防或改善本文所述的有需要的受试者的COVID-19。

在某些实施方案中，在本文所述的免疫原性组合物中，所述重组S蛋白与本文的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂联合用于预防性治疗COVID-19；本文所述的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂与所述重组S蛋白联合用于预防性治疗COVID-19；所述重组S蛋白和所述佐剂用于制造用于在预防性治疗COVID-19中使用的制品(诸如疫苗接种试剂盒，例如用于肌内注射的疫苗接种试剂盒)的用途。

以下实施方案适用于(i)本文所述的免疫原性组合物，(ii)其任何用途，(iii)本文所述的容器试剂盒，(iv)所述免疫原性组合物和所述容器试剂盒的预防性和治疗性用途，以及(v)本文所述的预防或改善有需要的受试者的COVID-19的方法。

在某些实施方案中，所述生育酚是α-生育酚，任选地D/L-α-生育酚。

在某些实施方案中，所述佐剂的平均液滴尺寸小于1μm，任选地其中所述平均液滴尺寸是小于500nm、小于200nm、50至200nm、120至180nm或140至180nm。

在某些实施方案中，所述佐剂的多分散性指数是0.5或更小，诸如0.3或更小、或0.2或更小。

在某些实施方案中，所述佐剂包含选自以下的表面活性剂：泊洛沙姆401、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇三油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯12鲸蜡基/硬脂基醚，单独地或与彼此组合地或与其他表面活性剂组合地。

在某些实施方案中，所述佐剂包含选自以下的表面活性剂：聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇三油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯12鲸蜡基/硬脂基醚，单独地或与彼此组合地。

在某些实施方案中，所述佐剂包含聚山梨醇酯80。

在某些实施方案中，所述佐剂包含一种、两种或三种表面活性剂。

在某些实施方案中，在所述佐剂中的角鲨烯与生育酚的重量比是0.1至10，任选地0.2至5、0.3至3、0.4至2、0.72至1.136、0.8至1、0.85至0.95、或0.9。

在某些实施方案中，在所述佐剂中的角鲨烯与表面活性剂的重量比是0.73至6.6，任选地1至5、1.2至4、1.71至2.8、2至2.4、2.1至2.3、或2.2。

在某些实施方案中，人类受试者是儿童、成年人或老年人。

在某些实施方案中，在单个剂量的所述佐剂中的角鲨烯的量是至少1.2mg，任选地1.2至20mg、1.2至15mg、1.2至2mg、1.21至1.52mg、2至4mg、2.43至3.03mg、4至8mg、4.87至6.05mg、8至12.1mg或9.75至12.1mg。

在某些实施方案中，在单个剂量的所述佐剂中的生育酚的量是至少1.3mg，任选地1.3至22mg、1.3至16.6mg、1.3至2mg、1.33至1.69mg、2至4mg、2.66至3.39mg、4至8mg、5.32至6.77mg、8至13.6mg或10.65至13.53mg。

在某些实施方案中，在单个剂量的所述佐剂中的表面活性剂的量是至少0.4mg，任选地0.4至9.5mg、0.4至7mg、0.4至1mg、0.54至0.71mg、1至2mg、1.08至1.42mg、2至4mg、2.16至2.84mg、4至7mg或4.32至5.68mg。

在某些实施方案中，所述佐剂包含以下或基本上由以下组成：角鲨烯；生育酚，任选地D/L-α-生育酚；表面活性剂，任选地聚山梨醇酯80；和水。

在某些实施方案中，用于肌内注射的单个剂量的所述免疫原性组合物的体积是0.05mL至1mL，任选地0.1至0.6mL、0.2至0.3mL、0.25mL、0.4至0.6mL、或0.5mL。

在某些实施方案中，所述免疫原性组合物或所述第一容器和所述第二容器的内容物的混合物的pH是4至9，任选地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4。

在某些实施方案中，所述免疫原性组合物或所述第一容器和所述第二容器的内容物的混合物的重量摩尔渗透压浓度是250至750mOsm/kg，任选地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg。

在某些实施方案中，所述免疫原性组合物或所述第一容器和所述第二容器的内容物的混合物所包含的角鲨烯是0.8至100mg/mL，任选地1.2至48.4mg/mL、10至30mg/mL、或21.38mg/mL。

在某些实施方案中，在与所述重组S蛋白混合之前，用于肌内注射的单个剂量的所述佐剂的体积是0.05mL至1mL，任选地0.1至0.6mL、0.2至0.3mL、0.25mL、0.4至0.6mL、或0.5mL。

在某些实施方案中，在与所述重组S蛋白混合之前，所述佐剂具有4至9，任选地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4的pH；具有250至750mOsm/kg，任选地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度；包含缓冲剂和/或张力调节剂，任选地改良的磷酸盐缓冲盐水；具有0.8至100mg/mL、任选地1.2至48.4mg/ml的角鲨烯浓度；并且具有0.05mL至1mL、任选地0.1至0.6mL的单剂量体积。

在某些实施方案中，所述重组S蛋白提供在水性液体溶液中，所述水性液体溶液在与所述佐剂混合之前具有0.2至0.3mL、任选地0.25mL，0.4至0.6mL，或0.5ml的单剂量体积；4至9，任选地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4的pH；和250至750mOsm/kg，任选地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。

所公开的实施方案适用于治疗未感染SARS-CoV-2的受试者。所公开的实施方案适用于在有需要的人类受试者中引发免疫反应，所述免疫反应部分或完全降低一种或多种症状的严重程度和/或受试者经历一种或多种症状的时间，降低攻击后患上已建立的感染的可能性，减慢疾病的进展、任选地延长存活期，产生针对SARS-CoV-2的中和抗体，和/或是SARS-CoV-2 S蛋白特异性T细胞反应。

本发明的其他特征、目的和优势在以下的具体实施方式中是清楚的。然而，应当理解，尽管指示了本发明的实施方案和方面，但具体实施方式是通过仅说明而非限制的方式给出的。根据具体实施方式，在本发明范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言应变得清楚。

附图说明

图1是示出了构建体1的设计的简图，所述构建体含有用于重组SARS-CoV-2 S蛋白的杆状病毒表达盒。所述表达盒包括多角体蛋白启动子和多肽的编码序列，所述多肽含有几丁质酶信号序列(“ss”)和在S1/S2连接处的假定的弗林蛋白酶切割位点处含有突变且在S2亚基中含有双脯氨酸取代的SARS-CoV-2 S蛋白胞外域。

图2A是描绘SapI消化的pPSC12DB-LIC转移质粒与合成的gBlock片段组装的示意图。SapI线性化的转移质粒以灰色示出，多角体蛋白启动子以绿色箭头示出，gBlock片段着色为黄色、蓝色和橙色，并且将各自的重叠序列描绘为相同的颜色(上图)。含有preS dTM基因的最终转移质粒在下图示出。

图2B示出了gBlock片段(按出现的顺序分别为SEQ ID NO:14-23)的5'和3'末端序列。

图3是展示了用于产生表达重组SARS-CoV-2 S蛋白的杆状病毒构建体的方法的简图。MV：主病毒。

图4是示出了在D0/D21注射不含佐剂的preS dTM和S dTM的小鼠中D21和D36的血清S特异性IgG水平的图。滴度表示为OD＝0.2的稀释度的倒数。EU：ELISA单位。preS dTM：一种缺失了跨膜结构域和胞质结构域的重组的稳定的预融合SARS-CoV-2 S蛋白(SEQ ID NO:10)。S dTM：一种缺失了跨膜结构域和胞质结构域的重组的非稳定的SARS-CoV-2 S蛋白。

图5是示出了在第21天和第36天在注射的小鼠中佐剂AS03对S特异性IgG水平的影响的图。滴度表示为OD＝0.2的稀释度的倒数。浅灰色正方形和三角形：D21。深灰色正方形和三角形：D36。

图6A是示出了在D36从免疫小鼠获得的血清抗体的PRNT₅₀滴度的图。下水平虚线指示定量下限(LLOQ)，即起始稀释度的1/2。

图6B示出了针对来自与图6A相同研究的展示SARS-CoV-2 S蛋白的IntegralMolecular SARS-CoV-2 S假病毒的中和抗体的50％抑制浓度(IC₅₀)滴度。

图7是在加有AS03佐剂的preS dTM组和未经处理的对照组中响应于用S1肽库刺激的表达IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4和IL-5细胞因子的CD4⁺T细胞的百分比的图(条＝平均％)。

图8是示出了在用目标为15μg的含或不含AS03佐剂的preS dTM免疫的恒河猴中针对SARS-CoV-2融合前S蛋白的血清IgG水平的图。在D0、D21和D28测量IgG水平。X轴上的“-”指示媒介物对照。Y轴表示EU的log标度。

图9是示出了针对来自与图8相同研究的展示SARS-CoV-2 S蛋白的IntegralMolecular SARS-CoV-2 S假病毒的中和抗体的50％抑制浓度(IC₅₀)滴度的图。Y轴表示IC₅₀滴度的Log₁₀值。“Conv”：人SARS-CoV-2恢复期血清(高滴度)。

图10是示出了针对来自与图8相同研究的野生型SARS-CoV-2病毒的中和抗体的50％微量中和(MN₅₀)滴度的图。Y轴表示微量中和(MN)测定中MN₅₀滴度的Log₁₀值。

图11是示出了在用目标为2.25μg剂量的含或不含佐剂的preS dTM相比于安慰剂免疫一次或两次的仓鼠中针对SARS-CoV-2融合前S蛋白的血清IgG水平的图。在D35(对于一剂群组在第1剂后14天，并且对于两剂群组在第2剂后14天)测量IgG水平。滴度表示为OD＝0.2的稀释度的倒数。下水平虚线是所测试的最低稀释度的倒数。Y轴表示EU的Log₁₀标度。

图12是示出了在用目标为2.25μg剂量的含或不含佐剂的preS dTM相比于安慰剂免疫一次或两次的仓鼠中针对展示SARS-CoV-2 S蛋白的Integral Molecular SARS-CoV-2S假病毒的中和抗体的ID₅₀滴度的图。在D35(对于一剂群组在第1剂后14天，并且对于两剂群组在第2剂后14天)测量假病毒中和抗体水平。下水平虚线指示所测试的最低稀释度的倒数。由于技术问题，来自安慰剂组的一只仓鼠被从分析中移除。

图13是示出了用目标为2.25μg剂量的含或不含AS03佐剂的preS dTM相比于安慰剂免疫一次(一剂群组，左图)或两次(两剂群组，右图)的仓鼠在用SARS-CoV-2USA/WA1/2020(P2)毒株攻击后第0-4天的体重变化百分比的一对图。

图14是示出了在用目标为2.25μg剂量的含或不含佐剂的preS dTM相比于安慰剂免疫，然后在最后一次免疫后35天用2.3E4 PFU的SARS-CoV-2USA/WA1/2020毒株攻击的仓鼠的两剂群组中肺(左图)和鼻孔(右图)中的总病毒载量的一对图。Y轴以Log₁₀标度示出了攻击后D4和D7的基因组拷贝/克。

图15是示出了在用目标为2.25μg剂量的含或不含佐剂的preS dTM相比于安慰剂免疫，然后在最后一次免疫后35天用2.3E4 PFU的SARS-CoV-2USA/WA1/2020毒株攻击的仓鼠的两剂群组中肺(左图)和鼻孔(右图)中的亚基因组病毒载量的一对图。Y轴以Log₁₀标度示出了攻击后D4和D7的基因组拷贝/克。

图16A是示出了用目标为2.25μg剂量的含或不含佐剂的preS dTM相比于安慰剂免疫，然后在最后一次免疫后35天用SARS-CoV-2USA/WA1/2020毒株攻击的仓鼠的肺病理评分的一对图。每个点表示单只仓鼠。Y轴以0(正常)至3(严重)的标度示出了肺病理得分。条表示组中值。

图16B是示出了在用β变体攻击后未经处理的和重组S免疫的仓鼠的个体每日体重减轻(％)的图。符号表示个体数据，并且线表示组的平均值。

图17是示出了在所有年龄组中在任何剂量的preS dTM后征集的反应的发生率的条形图。

图18是示出了按年龄组的在任何剂量的preS dTM后征集的反应的发生率的一对条形图。

图19是示出了在第2次注射(“PD2”)后三个剂量的preS dTM(5、10和15μg)的反应原性的条形图。VAT02：II期临床试验。

图20是示出了在来自CoV2-06_NHP研究的食蟹猴中在第5周使用VSV-PsV(Nexelis，左图)或慢病毒-PsV(SP REI，右图)中和测定测量的个体D614假病毒体(PsV)中和抗体(NAb)滴度(Log₁₀)的一对图。粗条表示组的平均值，点划线是所测试的最低稀释度的倒数，并且VSV-PsV测定的LLOQ是1.5Log₁₀。图下方指示了合并的所有3个剂量水平的倍数变化。

图21是示出了在食蟹猴中在第5周针对所关注的变体的个体慢病毒-PsV NAb滴度(Log₁₀)的图。点划线表示所测试的最低稀释度的倒数。CoV2 preS dTM-AS03：如本文所述，用AS03配制的源自武汉毒株(D614)和/或B.1.351(南非)变体毒株的一种或多种重组S蛋白。

图22是示出了在mRNA初免的猕猴(左图)、亚单位初免的猕猴(中图)和人恢复期血清(右图)中，在加强免疫前后的个体S结合IgG滴度(Log₁₀ EU)的一对图。线和条表示组的平均值，并且水平点划线表示所测试的最低稀释度的倒数。

图23是示出了如与人恢复期血清中的D614 PsV NAb滴度(右图)相比，在mRNA初免的(左图)和亚单位初免的(中图)猕猴中，在加强免疫前后的个体D614G(上图)和B.1.351(下图)PsV NAb滴度(Log₁₀)的一组图。线和条表示组的平均值，并且水平点划线表示所测试的最低稀释度的倒数。

图24是示出了在mRNA初免的(左图)和亚单位初免的(右图)猕猴中，在加强免疫之后针对所关注的变体和SARS-CoV-1的个体PsV NAb滴度的图。

具体实施方式

本公开文本提供了针对COVID-19具有保护作用的免疫原性组合物。所述组合物包含源自SARS-CoV-2 S蛋白并且在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中表达的重组蛋白。所述重组蛋白可以包含S蛋白的细胞外部分(例如，S蛋白胞外域的全部或部分)，同时缺少S蛋白的全部或部分的跨膜结构域和胞质结构域。所述重组蛋白可以由三个相同的亚基多肽组成(即，同源三聚体)，每个亚基多肽含有优化用于在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达的三聚化基序，所述基序促进以稳定的天然融合前三聚体构型使三个亚基多肽三聚化。所述免疫原性组合物进一步包含含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂。

本文的免疫原性组合物可以用于预防未感染SARS-CoV-2的人类受试者的有症状的COVID-19，预防中度至重度COVID-19(例如，预防住院治疗)，预防无症状感染，引发针对同源匹配的毒株的免疫原性，减少病毒负荷，和/或针对循环变异毒株进行保护。除非另有指示，否则SARS-CoV-2“变体”是指在S蛋白中相对于原始武汉毒株(SEQ ID NO:1)具有一个或多个氨基酸差异的SARS-CoV-2毒株。

如本文所用，术语“免疫原性组合物”、“疫苗”和“疫苗组合物”可互换，并且是指含有可以引发针对SARS-CoV-2感染的预防性保护(包括缓解COVID-19症状和改善从疾病中康复和存活)的组分的组合物。

如本文所用，两个氨基酸序列之间的同一性百分比是指当将查询序列和参考序列针对最大同一性而比对时，查询序列中与参考序列中的残基相同的氨基酸残基的百分比。同源序列可以具有与参考序列相同或更短的长度(例如，具有参考序列的长度的至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％))。

I.免疫原性组合物的抗原组分

本公开文本的免疫原性组合物包含重组SARS-CoV-2 S蛋白。稳定所述重组蛋白以维持在病毒包膜上的天然的融合前三聚构象。

所述SARS-CoV-2 S蛋白具有1273个氨基酸残基。S蛋白的氨基酸序列可在NCBI登录号YP_009724390下获得。下文示出了序列。信号序列被加框(MFVFLVLLPLVSS(SEQ ID NO:2))，并且跨膜结构域和细胞内结构域被加下划线。S1和S2连接在残基685与686之间，将所述残基以粗体且加下划线显示。

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本文的重组S蛋白由三个相同的多肽(本文的“重组S多肽”)组成。在成熟之前，每个重组S多肽可以包含适合在昆虫细胞中表达蛋白质的信号序列。例如，所述信号序列源自昆虫或杆状病毒蛋白。所述信号序列也可以是人工信号序列。在一些实施方案中，所述信号序列源自昆虫或杆状病毒蛋白，诸如几丁质酶和GP64。示例性几丁质酶信号序列是野生型几丁质酶信号序列

MLYKLLNVLW LVAVSNA(SEQ ID NO:11)

或突变型几丁质酶信号序列

MPLYKLLNVL WLVAVSNA(SEQ ID NO:3)。

也可以使用与此几丁质酶信号序列同源(例如，至少95％、96％、97％、98％或99％相同)的序列，只要保留信号肽功能即可。还参见美国专利8,541,003。

本文的重组S蛋白包含SARS-CoV-2 S蛋白胞外域序列，例如对应于SEQ ID NO:1的残基14至1,211的序列。示例性SARS-CoV-2 S蛋白胞外域序列如下所示：

在一些实施方案中，所述重组S蛋白可以包含SEQ ID NO:4的序列，如果没有如本文进一步所述的某些氨基酸取代的话，并且与SEQ ID NO:4至少99％(例如，至少99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)相同。在进一步的实施方案中，将SEQ ID NO:4的位置669-672处的残基(粗体)改变为残基GSAS(SEQ ID NO:6)和/或将SEQ ID NO:4的位置973和74处的残基(加下划线)改变为残基PP。

在一些实施方案中，所述重组S蛋白包含一种或多种在COVID-19大流行中循环的变体中发现的常见的突变。一种此类突变是D614G突变(根据SEQ ID NO:1编号)，与世界各地当前大多数COVID-19发病情况相关。可以包括在所述重组S蛋白中的其他突变可以是以下的一种或多种：W152C、K417T/N、N440K、V445I、G446A/S、L452R、Y453F、L455F、F456L、A475V、G476S、T478I/K/A、V483A/F/I、E484Q/K/D/A、F490S/L、Q493L/R、S494P/L、Y495N、G496L、P499H、N501Y、V503F/I、Y505W/H、Q506H/K和P681H突变(根据SEQ ID NO:1编号)。在一些实施方案中，所述重组S蛋白可以包括突变N440K、T479I/K/A和D614G中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述重组S蛋白包含在诸如以下的SARS-CoV-2变体中发现的一种或多种突变：B.1.1.7(英国或α变体；例如，N501Y/P681H/H69/V70缺失)、B.1.351(南非或β变体；例如，K417N/E484K/N501Y)、B1.617(印度或δ变体；例如，L452R/E484Q突变)、P.1(巴西或γ变体；例如，K417T/E484K/N501Y)和CAL.20C毒株(亦称B.1.429；加利福尼亚或ε变体；例如，W152C/L452R)。

可以修饰所述重组S蛋白中的胞外域序列以改善所述蛋白质在宿主细胞(例如，昆虫细胞)中的表达和所产生的蛋白质的稳定性。在一些实施方案中，所述S胞外域序列在S1亚基和S2亚基连接处含有去除前蛋白转化酶(PPC)基序(弗林蛋白酶切割位点)的突变。例如，将在弗林蛋白酶切割位点处的序列RRAR(SEQ ID NO:5；对应于SEQ ID NO:1的残基682-685)改变为GSAS(SEQ ID NO:6)。此类突变帮助保留天然S蛋白的融合前构象。

在一些实施方案中，胞外域序列含有帮助将所述重组S蛋白维持处于更稳定构象的其他突变，以促进更可能导致中和反应的融合前表位的抗原呈递。例如，将对应于SEQ IDNO:1的残基986和987的氨基酸(KV)突变为PP(参见例如，Wrapp,同上；Kirchdoerfer等人,Sci Rep.(2018)8:15701；Xiong,同上)。

本文的重组S蛋白在C末端区包含优化用于在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中表达的三聚化结构域，使得所述S蛋白可以采取天然S蛋白的稳定的融合前构象。可以将折叠子结构域编码序列插入在所述S胞外域编码序列的最后一个密码子与终止密码子之间。在一些实施方案中，所述三聚化结构域源自T4噬菌体次要纤维蛋白(fibritin)的折叠子结构域(参见例如，Meier等人,J Mol Biol.(2004)344(4):1051-69；WO 2018/081318)。下文示出了示例性折叠子序列：

GYIPEAPRDG QAYVRKDGEW VFLSTFL(SEQ ID NO:7)。

在一些实施方案中，所述折叠子序列可以被优化以增强所述重组蛋白在宿主细胞中的表达。例如，为了增强所述重组蛋白在昆虫细胞(例如，夜蛾属(Spodoptera)细胞)中的表达，可以将编码所述折叠子序列的序列进行密码子优化。以下示出了折叠子结构域的天然编码序列(上部)和密码子优化版本(下部)(核苷酸点突变用星号标记)：

所述重组S蛋白可以包含标签(例如，His标签、FLAG标签、HA标签、Myc标签或V5标签)以促进纯化。

在一些实施方案中，所述重组S蛋白可以是具有以下序列的多肽的三聚体，但是一旦加工和组装则不含信号序列。在下文的序列中，信号序列被加下划线(残基1-18)，折叠子序列被加双下划线(残基1217-1243)，而相对于野生型序列的突变(人工引入的)以粗体且加下划线显示(残基687-690和991-992)。此蛋白质在本文中也称为“preS dTM”或“D614preS dTM”。

也可以使用与SEQ ID NO:10同源的序列。例如，可以使用其序列与SEQ ID NO:10至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)相同的重组S多肽。所述同源序列可以具有与SEQ ID NO:10相同的长度或比SEQ ID NO:10短或长不多于10％(例如，不多于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)。在进一步的实施方案中，将SEQ ID NO:10的位置687-690处的残基GSAS(SEQ ID NO:6)和/或SEQ ID NO:10的位置991和992处的残基PP维持在这种同源序列中。两个氨基酸序列的同一性百分比可以通过例如使用默认参数(可在美国国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(U.S.National Library of Medicine’sNational Center for Biotechnology Information)网站上获得)获得。

在一些实施方案中，使用preS dTM的变体(在本文中也称为“preS dTM变体”)，即相对于SEQ ID NO:10(例如，在信号序列区之外)含有一个或多个氨基酸差异的重组S蛋白。在进一步的实施方案中，所述重组S蛋白源自南非或β变体B.1.351。此变体含有以下突变(相对于武汉毒株或SEQ ID NO:1)：(i)在NTD结构域中：L18F、D80A、D215G、L242del、A243del和L244del；(ii)在RBD结构域中：K417N、E484K、N501Y；(iii)在S1结构域中：D614G；和(iv)A701V。所述S蛋白可以包含以下序列(SEQ ID NO:13)，一旦加工并且从生产细胞中分泌则不含信号序列(加下划线；残基1-18)。T4折叠子序列被加双下划线(残基1214-1240)；相对于SEQ ID NO:10的变异被加框并且加粗；并且人工引入的突变(残基684-687和残基988-989)被加下划线并且加粗。与源自武汉毒株的S蛋白相比，此蛋白质紧接在以下位置243-246处的“FQTL”之后具有三个残基“LAL”缺失。

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在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物是多价的(例如，二价的、三价的或四价的)。也就是说，所述组合物包含多种(例如，两种、三种或四种)不同的重组S蛋白。在多价组合物中的一种或多种的所述重组S蛋白可以包含一种或多种在SARS-CoV-2变体中发现的突变，诸如D614G和在新出现的变异毒株(例如，B.1.1.7、B.1.351、B.1.617、P.1和CAL.20C)中发现的突变。

在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物是二价的。在进一步的实施方案中，所述二价组合物包含源自武汉毒株的第一重组S蛋白和源自南非毒株的第二重组S蛋白。在某些实施方案中，所述二价组合物包含不含信号序列的含有SEQ ID NO:10的重组S蛋白和不含信号序列的含有SEQ ID NO:13的重组S蛋白。

II.免疫原性组合物的佐剂组分

本发明的免疫原性组合物包含具有药学上可接受的成分的含生育酚的基于角鲨烯的水包油(O/W)乳剂佐剂。此类佐剂(也称为含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂)增强对所述重组S蛋白的免疫反应的幅度和/或质量。

角鲨烯是一种支链的不饱和萜类化合物，其化学式为[(CH₃)₂C[＝CHCH₂CH₂C(CH₃)]₂＝CHCH₂-]₂(即，C₃₀H₅₀；CAS登记号7683-64-9)。它也被称为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。角鲨烯显示出良好的生物相容性并且易于代谢。

所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂含有一种或多种生育酚。可以使用α、β、γ、δ、ε和/或ξ生育酚中的任一种，但是通常使用α-生育酚(α-tocopherol或alpha-tocopherol)。D-α-生育酚和D/L-α-生育酚二者均可以使用。在一些实施方案中，所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂含有α-生育酚，例如D/L-α-生育酚。

含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂通常将具有亚微米(小于1μm)的液滴尺寸。在一些实施方案中，液滴平均小于500nm，例如小于200nm。低于200nm的液滴尺寸是有益的，因为它们可以促进通过过滤灭菌。有证据表明，出于效力、制造一致性和稳定性的原因，在80至200nm范围内的液滴尺寸是令人感兴趣的(Klucker等人,J Pharm Sci.(2012)101(12):4490-500；Shah等人,Nanomedicine(Lond)(2014)9:2671-81；Shah等人,J Pharm Sci.(2015)104:1352-61；Shah等人,Scientific Reports(2019)9:11520)。在一些实施方案中，所述佐剂的平均液滴尺寸是至少50nm、至少80nm或至少100nm(例如，至少120nm)。例如，所述佐剂的平均液滴尺寸可以是50至200nm(例如，80至200nm)、120至180nm或140至180nm，诸如约160nm。

液滴尺寸均匀性是所希望的。大于0.7的多分散性指数(PdI)指示样品具有非常广泛的尺寸分布，并且报告值为0意指不存在尺寸变化。合适地，所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的PdI是0.5或更小、或0.3或更小，诸如0.2或更小。

如本文所用，液滴尺寸意指乳剂中油滴的平均直径，并且可以以多种方式确定，例如使用动态光散射和/或单粒子光学传感的技术与诸如可从Particle Sizing Systems(美国圣巴巴拉)获得的Accusizer^TM和Nicomp^TM系列仪器、可从Malvern Instruments(英国)获得的Zetasizer^TM仪器或可从Horiba(日本京都)获得的Particle Size DistributionAnalyzer仪器的装置来确定(Schartl,Light Scattering from Polymer Solutions andNanoparticle Dispersions(2007))。动态光散射(DLS)是一种确定液滴尺寸的方法。一种用于定义平均液滴直径的方法是Z-平均值，即通过DLS测量的液滴总体集合的强度加权平均流体动力学尺寸。Z-平均值由对所测量的相关曲线的累积量分析导出，其中假定单个粒度(液滴直径)并且将单指数拟合应用于自相关函数。因此，本文对平均液滴尺寸的提及应当被视为强度加权平均值，并且理想地为Z-平均值。PdI值很容易由测量平均直径的相同仪器提供。

为了维持稳定的亚微米乳剂，通常需要一种或多种乳化剂(即，表面活性剂)。表面活性剂可以按它们的“HLB”(Griffin亲水亲油平衡)分类，其中在1-10范围内的HLB通常意指表面活性剂在油中比在水中更易溶，而在10-20范围内的HLB意指表面活性剂在水中比在油中更易溶。许多感兴趣的表面活性剂的HLB值可以很容易地获得，或者可以通过实验确定，例如，聚山梨醇酯80的HLB是15.0，并且TPGS的HLB是13至13.2。脱水山梨糖醇三油酸酯的HLB是1.8。当将两种或更多种表面活性剂共混时，所得的共混物的HLB通常由加权平均值计算。例如，聚山梨醇酯80和TPGS的70/30重量％混合物的HLB是(15.0x0.70)+(13x0.30)，即14.4。聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的70/30重量％混合物的HLB是(15.0x0.70)+(1.8x0.30)，即11.04。

一种或多种表面活性剂通常将是可代谢(可生物降解)且生物相容的，从而适合用作药物。表面活性剂可以包括离子(阳离子、阴离子或两性离子)表面活性剂和/或非离子表面活性剂。仅使用非离子表面活性剂是所希望的，由于例如它们的pH无关性。因此，本发明可以使用包括但不限于以下的表面活性剂：(i)聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为Tween或聚山梨醇酯)，诸如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；(ii)环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAX^TM、Pluronic^TM(例如，F68、F127或L121等级)或Synperonic^TM商品名出售，诸如线性EO/PO嵌段共聚物，例如泊洛沙姆407、泊洛沙姆401和泊洛沙姆188；(ii)辛基酚聚醚，其重复乙氧基(氧基-1,2-乙烷二基)基团的数量可以变化，其中辛基酚聚醚-9(Triton X 100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)是令人感兴趣的；(iv)(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；(v)磷脂，诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；(vi)源自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为表面活性剂)，诸如聚氧乙烯-4-月桂基醚(/>30、/>104P)、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯12鲸蜡基/硬脂基醚(/>B 1、鲸蜡硬脂醇聚醚-12或聚氧乙烯十六十八烷基醚)；(vii)脱水山梨糖醇酯(通常称为Span)，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(/>85)、脱水山梨糖醇单油酸酯(/>80)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯(/>20)；或(viii)生育酚衍生物表面活性剂，诸如α-生育酚-聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)。药学上可接受的表面活性剂的许多例子是本领域已知的。参见例如，Handbook of Pharmaceutical Excipients(2009第6版)。用于优化在角鲨烯乳剂佐剂中使用的表面活性剂的选择的方法阐述于Klucker等人,JPharm Sci.(2012)101(12):4490-500中。

通常，所述表面活性剂组分的HLB在10与18之间，诸如在12与17之间(例如，13至16)。这通常可以使用单一表面活性剂或在一些实施方案中使用表面活性剂的混合物来实现。感兴趣的表面活性剂可以包括：泊洛沙姆401、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇三油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯12鲸蜡基/硬脂基醚，单独地、与彼此组合地或与其他表面活性剂组合地。感兴趣的是聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇三油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯12鲸蜡基/硬脂基醚，单独地或与彼此组合地。感兴趣的表面活性剂是聚山梨醇酯80。感兴趣的表面活性剂的组合是聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯。感兴趣的表面活性剂的进一步的组合是脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯十六十八烷基醚。

在某些实施方案中，所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂包含一种表面活性剂，诸如聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂包含两种表面活性剂，诸如聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯或脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯十六十八烷基醚。在其他实施方案中，所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂包含三种或更多种表面活性剂，诸如三种表面活性剂。

理想地，角鲨烯与生育酚的重量比是20或更小(即，每重量单位的生育酚20重量单位的角鲨烯或更小，或者换言之，每20重量单位的角鲨烯至少1重量单位的生育酚)，诸如10或更小。合适地，角鲨烯与生育酚的重量比是0.1或更大。典型地，角鲨烯与生育酚的重量比是0.1至10、0.2至5或0.3至3，诸如0.4至2。合适地，角鲨烯与生育酚的重量比是0.72至1.136、0.8至1或0.85至0.95，诸如0.9。

典型地，角鲨烯与表面活性剂的重量比是0.73至6.6、1至5或1.2至4。合适地，角鲨烯与表面活性剂的重量比是1.71至2.8、2至2.4或2.1至2.3，诸如2.2。

单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的角鲨烯的量通常是至少1.2mg。通常，单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的角鲨烯的量是50mg或更少。单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的角鲨烯的量可以是1.2至20mg(例如，1.2至15mg)。单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的角鲨烯的量可以是1.2至2mg、2至4mg、4至8mg或8至12.1mg。例如，单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的角鲨烯的量可以是1.21至1.52mg、2.43至3.03mg、4.87至6.05mg或9.75至12.1mg。

单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的生育酚的量通常是至少1.3mg。通常，单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的生育酚的量是55mg或更少。单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的生育酚的量可以是1.3至22mg(例如，1.3至16.6mg)。单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的生育酚的量可以是1.3至2mg、2至4mg、4至8mg或8至13.6mg。例如，单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的生育酚的量可以是1.33至1.69mg、2.66至3.39mg、5.32至6.77mg或10.65至13.53mg。

单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的表面活性剂的量通常是至少0.4mg。通常，单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的表面活性剂的量是18mg或更少。单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的表面活性剂的量可以是0.4至9.5mg(例如，0.4至7mg)。单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的表面活性剂的量可以是0.4至1mg、1至2mg、2至4mg或4至7mg。例如，单个剂量(诸如单个人剂量)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的表面活性剂的量可以是0.54至0.71mg、1.08至1.42mg、2.16至2.84mg或4.32至5.68mg。

在某些实施方案中，所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂可以包含以下或基本上由以下组成：角鲨烯、生育酚、表面活性剂和水。例如，除了角鲨烯、生育酚、表面活性剂和水之外，含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂可以根据预期的最终呈现和疫苗接种策略根据希望或需要含有另外的组分，诸如缓冲剂和/或张力调节剂，例如改良的磷酸盐缓冲盐水(磷酸二钠、磷酸氢钾、氯化钠和氯化钾)。

可以应用高压均质法(HPH或微流化)以产生具有均匀小的液滴尺寸和长期稳定性的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂(参见例如，EP 0868918B1和WO 2006/100109)。简言之，可以在氮气气氛下配制由角鲨烯和生育酚构成的油相。水相是单独制备的，通常由注射用水或磷酸盐缓冲盐水和聚山梨醇酯80构成。在均质化和微流化之前将油相和水相合并(诸如以1:9(油相体积比水相体积)的比率)，诸如通过单次通过在线均质器和三次通过微流化器(以约15000psi)。然后，可以将所得的乳液无菌过滤，例如通过两列串联的两个0.5/0.2μm过滤器(即，0.5/0.2/0.5/0.2)(参见例如，WO 2011/154444)。操作理想地在惰性气氛(例如，氮气)下进行。可以施加正压(参见例如，WO 2011/154443)。

国际专利申请WO 2020/160080和Lodaya等人(J Control Release(2019)316:12-21)描述了作为自乳化佐剂系统(SEAS)的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂及其制造。

在一些实施方案中，所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂是AS03佐剂。参见例如，WO2006/100109；等人,Expert Rev Vaccines(2012)11:349-66；Cohet等人,Vaccine(2019)37(23):3006-21。此佐剂包括角鲨烯、α-生育酚和聚山梨醇酯80。对于成年人用途，单次全剂量的所述佐剂(也称为AS03_A)是0.25mL的水包油乳剂，所述水包油乳剂含有10.69mg角鲨烯、11.86mgα-生育酚和4.86mg聚山梨醇酯80和PBS(Fox,Molecules(2009)14:3286-312；Morel等人,Vaccine(2011)29:2461-73)。还参见下表9。

还已经描述了某些降低剂量的AS03(WO 2008/043774)，包括AS03_B(1/2剂量)、AS03_C(1/4剂量)和AS03_D(1/8剂量)(Carmona Martinez等人,Hum Vaccin Immunother.(2014)10(7):1959-68)。因此，在需要的情况下，所述水包油乳剂佐剂每(单)剂仅含有1/2、1/4或1/8的量的作为AS03_A的角鲨烯、α-生育酚和聚山梨醇酯80。这些降低的剂量(例如AS03_B或AS03_C)在需要降低反应原性时(例如，在儿科受试者中)可能有用。例如，单佐剂剂量可以含有：(i)5.34mg角鲨烯、5.93mgα-生育酚和2.43mg聚山梨醇酯80(例如，AS03_B；125μL的下表9所示的水包油乳剂)；(ii)2.67mg角鲨烯、2.97mgα-生育酚和1.22mg聚山梨醇酯80(例如，AS03_C；62.5μL的下表9所示的水包油乳剂)；或(iii)1.34mg角鲨烯、1.48mgα-生育酚和0.61mg聚山梨醇酯80(例如，AS03_D；即31.25μL的下表9所示的水包油乳剂)。通常，单个剂量的AS03佐剂的最终体积是0.25mL或0.5mL。因此，如果与以上所需量的角鲨烯、α-生育酚和聚山梨醇酯80相匹配所需的浓缩水包油乳剂物料(例如，下表9的水包油乳剂)的体积低于0.25mL或0.5mL，可以用磷酸盐缓冲盐水将此体积补足至所需体积(0.25mL或0.5mL)。

为了限制不希望的降解，含生育酚的角鲨烯乳剂通常应当在有限的氧气暴露条件下储存，例如在顶部空间有限的容器中和/或在氮气下储存。

冠状病毒疫苗的一个潜在的安全问题是在暴露于野生型病毒后增强疫苗免疫病理学的能力(Smatti等人,Front Microbiol.(2018)9:2991)。对于这种现象(称为病毒感染的抗体依赖性增强或免疫增强)的分子机制仍未完全了解。在冠状病毒感染的背景下，多种因素被认为可能导致这种现象。这些因素包括所靶向的表位、抗原的递送方法、免疫反应的幅度、结合抗体与功能抗体之间的平衡、具有功能特征(诸如与特定Fc受体结合)的抗体的引发和T辅助细胞反应的特性(Tseng等人,PLoS One(2012)7(4)；Y asui等人,J Immunol.(2008)181(9):6337-48；Czub等人,Vaccine(2005)23(17-18):2273-9)。预期包括包含佐剂(诸如AS03)的加佐剂的配制品将进一步增强中和抗体反应的幅度，因此缓解病毒感染的抗体依赖性增强，这被认为主要是由非中和抗体介导的。

III.重组S蛋白的产生

本发明的免疫原性组合物的病毒抗原组分可以通过重组技术在已经用杆状病毒表达载体(诸如源自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV)的表达载体)转导的昆虫细胞(例如，果蝇属(Drosophila)S2细胞、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞、Sf9细胞、Sf21、High Five细胞或expresSF+细胞)中产生。杆状病毒(诸如AcMNPV)在被感染的细胞的细胞核内形成大的蛋白质结晶包含体，其中称为多角体蛋白的单一多肽占蛋白质质量的大约95％。多角体蛋白的基因在杆状病毒基因组中以单拷贝形式存在，并且能够很容易地被外源基因替换，因为它对于在培养细胞中的病毒复制不是必需的。表达外源基因(诸如所述重组S多肽)的重组杆状病毒是通过杆状病毒基因组DNA与含有所述外源基因的转移质粒之间的同源重组的方式构建的。

在某些实施方案中，所述转移质粒含有所述重组S多肽的表达盒，其中所述表达盒侧接在AcMNPV中天然侧接多角体蛋白基因座的序列(图1)。将所述转移质粒与杆状病毒基因组DNA共转染到宿主细胞中，所述基因组DNA已经用酶(例如，Bsu36I)线性化，从而去除了多角体蛋白基因和多角体蛋白基因座下游的一部分必需基因，使得亲本病毒DNA分子不能复制，从而使基因组DNA无感染性；然而，这部分必需基因存在于所述转移质粒上。在共转染后，所述转移质粒与所述线性化基因组DNA之间的同源重组使基因组病毒DNA重新环化，从而恢复其复制能力。由于线性化前的原始杆状病毒基因组DNA含有多角体蛋白基因，由非重组病毒形成的噬斑是混浊的(由于被感染细胞中的结晶包含体)，而由重组病毒形成的噬斑是澄清的。

所述杆状病毒表达载体可以被工程化以增加所述重组蛋白的产量。在一些实施方案中，所述杆状病毒载体敲除了一个或多个基因。杆状病毒基因组含有对在细胞培养中的病毒复制和重组蛋白的表达非必需的基因。此类基因的缺失可以消除不必要的基因负担，帮助产生更稳定的杆状病毒表达载体，减少已建立的昆虫细胞感染所需的时间，并且导致重组蛋白的更有效的表达。在一些实施方案中，多角体蛋白启动子通过在其中包括多于一个拷贝的突发(burst)序列而被修饰；例如，所述启动子可以被工程化以包括两个突发序列以产生含有核苷酸序列CTGTTTTCGTAACAGTTTTGTA ATAAAAAAACCTATAAATA(SEQ ID NO:12)的两个重复序列的“双突发”(DB)启动子。参见例如，Manohar等人,Biotechnol Bioeng.(2010)107:909-16。为了将病毒抗原编码序列整合到杆状病毒表达载体中，可以通过同源重组将携带所述编码序列的转移质粒整合到编码杆状病毒基因组的DN A中。病毒的身份可以通过例如来自纯化的杆状病毒DNA的S蛋白编码序列插入物的DNA印迹或Sanger测序分析和在被感染的昆虫细胞中产生的重组蛋白的免疫印迹分析来确认。参见例如，美国专利6,245,532和8,541,003。

将含有病毒抗原表达构建体的宿主细胞在生物反应器(例如，45L、60L、459L、2000L或20,000L)中以例如分批工艺或补料分批工艺培养。可以通过例如流过模式或结合与洗脱模式的柱色谱法从细胞培养物中分离所产生的S蛋白。例子是离子交换树脂和亲和树脂，诸如小扁豆凝集素琼脂糖凝胶；和混合模式阳离子交换-疏水相互作用柱(CEX-HIC)。可以将所述蛋白质浓缩，通过超滤交换缓冲液，并且可以通过0.22μm过滤器过滤来自超滤的渗余物。参见例如，McPherson等人,“Development of a SA RS Coronavirus Vaccinefrom Recombinant Spike Protein Plus Delta Inulin Adjuvant,”第4章,Sunil Thomas(编辑),Vaccine Design:Methods and P rotocols:第1卷:Vaccines for HumanDiseases,Methods in Molecular Biol ogy,Springer,New York,2016。还参见美国专利5,762,939。

杆状病毒表达载体系统(BEVS)为开发理想的亚单位疫苗提供了一种极好的方法。可以通过此类系统在大约八周内生产出重组蛋白。当存在大流行威胁时，快速生产尤其重要。此外，杆状病毒是安全的，因为它们的宿主范围很窄，局限于一些分类学相关的昆虫物种，并且尚未观察到在哺乳动物细胞中复制。此外，已知很少有微生物能够在昆虫细胞和哺乳动物细胞二者中复制；因此，在由昆虫细胞制成的临床产品中外来因子污染的可能性非常低。此外，人通常对来自作为杆状病毒天然宿主的昆虫的蛋白质没有预先存在的免疫，因为这些昆虫不咬人；因此，不太可能对在BEV系统中制造的临床产品产生过敏反应。此外，尽管添加到昆虫细胞的蛋白质中的碳水化合物部分似乎没有它们的哺乳动物细胞表达的对应物上的碳水化合物部分复杂，但昆虫细胞表达的糖蛋白和哺乳动物细胞表达的糖蛋白的免疫原性似乎是相当的。在杆状病毒系统中表达的全长蛋白通常通过调节表面活性剂浓度自组装成天然蛋白通常采用的高级结构。最终，由于多角体蛋白启动子的极高活性，BEVS系统非常高效，这允许以显著降低的成本高水平地生产重组蛋白。

IV.疫苗的配制和包装

所述一种或多种重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂可以经由多种合适的途径施用，包括肠胃外(诸如肌内或皮下)施用。如上所述，所述免疫原性组合物可以是单价的或多价的。合适地，所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂被配制用于肌内(IM)注射。所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂可以以混合物形式向受试者施用，例如通过肌内注射到受试者上臂的三角肌中来施用。可替代地，可以通过相同或不同的途径，在相同或不同的位置并且在相同或不同的时间分别施用所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂。

当作为单独的配制品施用时，将所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂理想地施用至具有足够空间接近度的位置，使得充分维持佐剂效应。例如，空间接近度足以维持在施用至相同位置所见的佐剂效应的至少50％、至少75％或至少90％。在施用至相同位置所见的佐剂效应被定义为，与仅施用重组S蛋白相比，因为将重组S蛋白和含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂施用至相同位置而观察到的增加水平。将所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂理想地施用至引流至相同淋巴结的位置，诸如施用至相同肢体或施用至相同肌肉。合适地，将重组S蛋白和含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂肌内施用至相同肌肉。在某些实施方案中，将所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂施用至相同位置。施用位置的空间分离可以是至少5mm，诸如至少1cm。施用位置的空间分离可以小于10cm，诸如隔开小于5cm。

当作为单独的配制品施用时，理想地以足够的时间接近度施用所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂，使得充分维持佐剂效应。例如，时间接近度足以维持在相同时间施用所见的佐剂效应的至少50％、至少75％或至少90％。在相同时间施用所见的佐剂效应被定义为与施用重组S蛋白而不施用含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂相比，因为在(基本上)相同时间施用而观察到的增加水平。当作为单独的配制品施用时，重组S蛋白和含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂可以在12小时内施用。合适地，将所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂在6小时内、在2小时内或在1小时内(诸如在30分钟内或在15分钟内(例如，在5分钟内))施用。所述重组S蛋白与所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的施用之间的延迟可以是至少5秒(例如，10秒)或至少30秒。当作为单独的配制品施用时，如果在延迟的情况下施用所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂，则可以首先施用所述重组S蛋白，然后施用所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂。可替代地，首先施用所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂，然后施用所述重组S蛋白。适当的时间接近度可以取决于顺序或施用。理想地，在没有故意延迟的情况下施用所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂(考虑到多次施用的实用性)。

除了用于直接施用的重组S蛋白和含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的共同配制的或单独配制的呈现形式之外，所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂最初可以以促进制造、储存和分销的多种形式提供。例如，某些组分在液体形式下的稳定性可能有限，某些组分可能无法干燥，某些组分在混合时可能不相容(短期或长期)。无论是否在施用时共同配制重组S蛋白和含生育酚的角鲨烯乳剂，它们均可以在单独的容器中提供，随后将其内容物合并。所述重组S蛋白可以以液体或干燥(例如冻干)形式提供；所选择的形式将取决于诸如重组S蛋白的精确性质(例如，重组S蛋白是否能够干燥)或可能存在的其他组分等因素。通常以液体形式提供所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂。

所述免疫原性组合物可以呈临时配制品的形式，其中刚好在使用前或使用时使所述抗原和所述佐剂接触。例如，所述抗原可以在注射之前与所述佐剂(乳剂)按体积比体积混合。因此，本公开文本提供了一种制品，诸如试剂盒，所述制品在单独的容器(例如，预处理的玻璃小瓶或安瓿)中提供本发明的免疫原性组合物的抗原组分和佐剂，并且在注射之前将所述佐剂和所述抗原组分混合；在一些实施方案中，在所述制品中提供重新悬浮冻干组分(如果有的话)所需的溶液。可替代地，将所述抗原组分和所述佐剂混合并且提供在同一容器中，并且可以向需要疫苗接种的受试者直接施用所述组合物。所述制品也可以包括使用说明书。在一些情况下，每个容器的内容物可以旨在作为第一配制品和第二配制品分开施用。

在一些实施方案中，所述重组S蛋白可以呈干燥形式，并且所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂可以呈液体形式。在此类情况下，第一容器和第二容器的内容物可以旨在合并以提供用于施用的共配制品。可替代地，所述重组S蛋白可以旨在在每个容器的内容物用于作为第一配制品和第二配制品分开施用之前被重构。

用于重构的液体的精确组成将取决于被重构的容器的内容物和重构的内容物的后续用途二者，例如，它们是旨在直接施用还是在施用前可以与其他组分合并。旨在在施用前与其他组合物合并的组合物(诸如含有重组S蛋白或含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的那些)本身不需要具有生理学上可接受的pH或生理学上可接受的张力；旨在施用的配制品应当具有生理学上可接受的pH并且应当具有生理学上可接受的重量摩尔渗透压浓度。

考虑到所述组合物的组分和施用于人类受试者的必要适合性，调节液体制剂的pH。配制品的pH通常是至少4、至少5或至少5.5，诸如至少6。配制品的pH通常是9或更小、8.5或更小、或8或更小，诸如7.5或更小。配制品的pH可以是4至9、5至8.5或5.5至8，诸如6.5至7.4(例如，6.5至7.1，诸如约6.8)。

对于肠胃外施用，溶液应当具有生理学上可接受的重量摩尔渗透压浓度以避免过度的细胞变形或裂解。生理学上可接受的重量摩尔渗透压浓度通常将意指溶液将具有近似等渗或轻度高渗的重量摩尔渗透压浓度。合适地，用于施用的配制品的重量摩尔渗透压浓度将是250至750mOsm/kg、250至550mOsm/kg或270至500mOsm/kg，诸如270至400mOsm/kg(例如，约280mOsm/kg)。重量摩尔渗透压浓度可以根据本领域已知的技术测量，诸如通过使用可商购获得的渗透压计(例如，可从Advanced Instruments Inc.(美国)获得的Model 2020)来测量。

用于重构的液体将基本上是水性的，诸如注射用水、磷酸盐缓冲盐水等。如上文提及的，对缓冲剂和/或张力调节剂的需要将取决于被重构的容器的内容物和重构的内容物的后续用途二者。缓冲剂可以选自乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和TRIS。所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲液，诸如Na/Na₂PO₄、Na/K₂PO₄或K/K₂PO₄。合适的缓冲剂是改良的磷酸盐缓冲盐水。

合适地，在本发明中使用的配制品具有在0.05mL与1mL之间(诸如在0.1与0.6mL之间)的剂量体积，或者具有0.45至0.55mL(诸如0.5mL)的剂量体积。所使用的组合物的体积可以取决于受试者、递送途径和位置(其中通过皮内途径给予较小剂量)或所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂二者是否递送至相同位置。用于通过诸如肌内等途径施用的典型的人剂量在200μl至750mL的范围内(诸如400至600μl)，或者是约500μl。

如果所述重组S蛋白呈液体形式并且所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂呈液体形式，如果两种液体旨在合并例如用于共同配制的话，则每种液体的体积可以相同或不同。用于合并的体积通常将在10:1至1:10的范围内，诸如2:1至1:2。合适地，每种液体的体积将基本上相同，诸如相同。例如，250μl体积的呈液体形式的重组S蛋白可以与250μl体积的呈液体形式的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂合并，以提供500μl体积的共配制品剂量，所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂中的每一种在合并期间被稀释2倍。

因此，含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂可以制备为浓缩物，预期在施用前通过含重组S蛋白的液体组合物稀释。例如，含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂可以以双倍强度制备，预期在施用前通过等体积的含重组S蛋白的组合物稀释。

在施用时角鲨烯的浓度可以在0.8至100mg/mL的范围内(例如，1.2至48.4mg/ml)。

重组S蛋白和含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂(无论是旨在共同配制还是单独配制)均可以以多种物理容器(诸如小瓶或预填充的注射器)的形式提供。

在一些实施方案中，以单剂量的形式提供所述重组S蛋白、所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂或包含重组S蛋白和含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的所述试剂盒。在其他实施方案中，以多剂量形式(诸如含有2、5或10个剂量)提供所述重组S蛋白、所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂或包含重组S蛋白和含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的所述试剂盒。多剂量形式(诸如包含10个剂量的那些)可以以具有单个剂量的一个部分(例如，重组S蛋白)的多个容器和具有多个剂量的第二部分(例如，含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂)的单个容器的形式提供，或者可以以具有多个剂量的一个部分(重组S蛋白)的单个容器和具有多个剂量的第二部分(含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂)的单个容器的形式提供。

通常将在容器之间转移液体(诸如从小瓶到注射器)以提供“过量(overage)”，从而确保可以便利地转移所需的全部体积。所需的过量水平将视情况而定，但是应当避免过度过量以减少浪费，并且过量不足可能会导致实际困难。过量可以是大约每剂20至100μl，诸如30μl或50μl。例如，双倍浓缩的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的典型的10剂容器(每剂250μl)可以含有约2.85至3.25mL的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂。

可以存在稳定剂或防腐剂。在提供多剂量容器的情况下，它们可能是有用的，因为可以在一段时间内向受试者施用一定剂量的一种或多种最终配制品。此类稳定剂/防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、氯丁醇、苯扎氯铵和螯合剂(例如，EDTA)。

呈液体形式的重组S蛋白和含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂可以以多室的注射器的形式提供。多室的注射器的使用为所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的单独顺序施用提供了便利的方法。多室的注射器可以被配置为提供所述重组S蛋白和所述含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的同时但分开的递送，它们可以被配置为提供顺序递送(以任一顺序)，或者它们可以被配置为在合并施用之前促进混合。在多室的注射器的其他配置中，所述重组S蛋白可以以干燥形式(例如，冷冻干燥)在一个室中提供，并且在施用前由另一个室中包含的含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂重构。多室的注射器的例子可以在诸如WO 2016/172396等公开文本中找到，但是一系列其他配置也是可能的。

在一些实施方案中，单位剂量是以每剂0.25mL或0.5mL提供的1-50或5-50(例如，2.5、5、10、15、30或45)μg重组S蛋白。

在一些实施方案中，所述单位剂量(即，单个剂量)对应于在磷酸盐缓冲盐水(足量0.25mL)中配制的5或10μg重组S蛋白，所述磷酸盐缓冲盐水含浓度为0.2％的Tween而不含防腐剂或抗生素。可以在多剂量小瓶中提供所述抗原单位剂量。它们可以在使用前与单个剂量的AS03佐剂(例如，AS03_A、AS03_B或AS03_C)混合。

在一些实施方案中，一个单位剂量含有如下表A所示的成分。

表A CoV2 preS dTM配制品(未加佐剂)

在一些实施方案中，对于通过肌内注射的每次人疫苗接种，在注射之前，将在0.25mL的无菌、澄清且无色的PBS溶液中的2.5μg preS dTM或变体(参见例如，表A、下文的表8或表12)与0.25mL的AS03(AS03_A；参见例如，表9)按体积比体积混合，以达到0.5mL的最终注射体积。在进一步的实施方案中，所述变体是β变体(例如，不含信号序列的SEQ ID NO:13)。在其他实施方案中，用于与抗原溶液混合的AS03佐剂的剂量是表9所示的0.25mL的所述乳剂的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此类实施方案中，可以任选地将磷酸盐缓冲盐水添加至AS03乳剂中以达到0.25mL的佐剂剂量的最终体积(参见例如，表9)。

在一些实施方案中，对于通过肌内注射的每次人疫苗接种，在注射之前，将在0.25mL的无菌、澄清且无色的PBS溶液中的5μg preS dTM或变体(参见例如，表A、下文的表8或表12)与0.25mL的AS03(AS03_A)按体积比体积混合，以达到0.5mL的最终注射体积。在进一步的实施方案中，所述变体是β变体(例如，不含信号序列的SEQ ID NO:13)。在其他实施方案中，用于与抗原溶液混合的AS03佐剂的剂量是表9所示的0.25mL的所述乳剂的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此类实施方案中，可以任选地将磷酸盐缓冲盐水添加至AS03乳剂中以达到0.25mL的佐剂剂量的最终体积(参见例如，表9)。

在一些实施方案中，对于通过肌内注射的每次人疫苗接种，在注射之前，将在0.25mL的无菌、澄清且无色的PBS溶液中的10μg preS dTM或变体(参见例如，表A、下文的表8或表12)与0.25mL的AS03(AS03_A)按体积比体积混合，以达到0.5mL的最终注射体积。在进一步的实施方案中，所述变体是β变体(例如，不含信号序列的SEQ ID NO:13)。在其他实施方案中，用于与抗原溶液混合的AS03佐剂的剂量是表9所示的0.25mL的所述乳剂的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此类实施方案中，可以任选地将磷酸盐缓冲盐水添加至AS03乳剂中以达到0.25mL的佐剂剂量的最终体积(参见例如，表9)。

在一些实施方案中，对于通过肌内注射的每次人疫苗接种，在注射之前，将在0.25mL的无菌、澄清且无色的PBS溶液中的15μg preS dTM或变体(参见例如，表A、下文的表8或表12)与0.25mL的AS03(AS03_A)按体积比体积混合，以达到0.5mL的最终注射体积。在进一步的实施方案中，所述变体是β变体(例如，不含信号序列的SEQ ID NO:13)。在其他实施方案中，用于与抗原溶液混合的AS03佐剂的剂量是表9所示的0.25mL的所述乳剂的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此类实施方案中，可以任选地将磷酸盐缓冲盐水添加至AS03乳剂中以达到0.25mL的佐剂剂量的最终体积(参见例如，表9)。

在一些实施方案中，对于通过肌内注射的每次人疫苗接种，在注射之前，将在0.25mL的无菌、澄清且无色的PBS溶液中的45μg preS dTM或变体(参见例如，表A、下文的表8或表12)与0.25mL的AS03(AS03_A)按体积比体积混合，以达到0.5mL的最终注射体积。在进一步的实施方案中，所述变体是β变体(例如，不含信号序列的SEQ ID NO:13)。在其他实施方案中，用于与抗原溶液混合的AS03佐剂的剂量是表9所示的0.25mL的所述乳剂的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此类实施方案中，可以任选地将磷酸盐缓冲盐水添加至AS03乳剂中以达到0.25mL的佐剂剂量的最终体积(参见例如，表9)。

在一些实施方案中，对于通过肌内注射的每次人疫苗接种，在注射之前，将在0.25mL的无菌、澄清且无色的PBS溶液中的总共10μg的两种不同的重组S蛋白(例如，preSdTM或变体诸如源自B.1.351的变体(例如，不含信号序列的SEQ ID NO:13)；各5μg)(参见例如，表A、下文的表8或表12)与0.25mL的AS03(AS03_A)按体积比体积混合，以达到0.5mL的最终注射体积。在其他实施方案中，用于与抗原溶液混合的AS03佐剂的剂量是表9所示的0.25mL的所述乳剂的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此类实施方案中，可以任选地将磷酸盐缓冲盐水添加至AS03乳剂中以达到0.25mL的佐剂剂量的最终体积(参见例如，表9)。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物是单价的并且每剂含有10μg的单一重组S蛋白(例如，preS dTM或preS dTM变体)。所述注射用组合物包含AS03佐剂(参见例如，表9)。在进一步的实施方案中，所述变体是β变体(例如，不含信号序列的SEQ ID NO:13)。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物是二价的并且以每剂各自5μg含有两种不同的重组S蛋白(例如，preS dTM和preS dTM变体)。所述注射用组合物包含AS03佐剂(参见例如，表9)。在进一步的实施方案中，所述变体是β变体(例如，不含信号序列的SEQ IDNO:13)。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物是三价的并且以每剂各自3.3μg含有三种不同的重组S蛋白(例如，preS dTM和两种preS dTM变体)。所述注射用组合物包含AS03佐剂(参见例如，表9)。在进一步的实施方案中，所述变体中的一种是β变体(例如，不含信号序列的SEQ ID NO:13)。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物是单价的并且以每剂2.5μg含有重组S蛋白(例如，preS dTM)。所述注射用组合物包含AS03佐剂(参见例如，表9)。

在一些实施方案中，本公开文本的疫苗产品可以在2℃-8℃下储存。

V.疫苗的用途

本发明通常旨在用于哺乳动物受试者，例如人类受试者。

所述受试者可以是任何年龄。在一个实施方案中，所述受试者是人类婴儿(至多12月龄)。在一个实施方案中，所述受试者是人类儿童(小于18岁)。在一个实施方案中，所述受试者是成年人(18-59岁)。在一个实施方案中，所述受试者是老年人(60岁或以上)。向年幼儿童(诸如小于12岁)施用的剂量可以相对于当量的成年人剂量降低诸如50％。在一些实施方案中，将施用2.5μg剂量的抗原。在一些实施方案中，将施用5μg剂量的抗原。在一些实施方案中，将施用10μg剂量的抗原。在一些实施方案中，将施用15μg剂量的抗原。在一些实施方案中，将施用45μg剂量的抗原。

合适地，所述受试者未感染SARS-CoV-2。在某些实施方案中，所述受试者先前未感染SARS-CoV-2。在其他实施方案中，所述受试者先前已经感染SARS-CoV-2(例如，进展的COVID-19)。

适合通过本公开文本的疫苗组合物进行疫苗接种的受试者包括易感SARS-CoV-2感染的人。可以根据本领域普通技术人员熟知的标准技术(包括所用佐剂的类型、施用途径以及受试者的年龄和体重)确定待向受试者施用的疫苗的量。在一些实施方案中，将施用2.5μg剂量的与含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂混合的抗原。在一些实施方案中，将施用5μg剂量的与含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂混合的抗原。在一些实施方案中，将施用10μg剂量的与含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂混合的抗原。在一些实施方案中，将施用15μg剂量的与含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂混合的抗原。在一些实施方案中，将施用45μg剂量的与含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂混合的抗原。

所述组合物可以以单个剂量或以一系列剂量(例如，一至三个初次剂量以及一个或多个随后的“加强”剂量)施用。在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量将隔开约14天(或约2周)至约六个月。例如，剂量之间的间隔可以隔开14-35天(例如，约21或28天)或约2-5周(例如，约3或4周)或约一个月。

在一些实施方案中，单个剂量是约0.25mL的如表A、表8或表12所示的抗原组合物(含有5或10μg重组S蛋白)和AS03佐剂(例如，AS03_A、AS03_B或AS03_C)的混合物。在进一步的实施方案中，向受试者给予两个此类剂量，每个剂量隔开21天或3周。在其他进一步的实施方案中，向受试者给予两个此类剂量，每个剂量隔开28天或4周或一个月。

以预防有效量向受试者提供所述疫苗组合物，其可以以单个剂量或以一系列剂量施用。“预防有效量”是指诱导足以预防或延迟COVID-19的一种或多种症状的发作和/或降低其频率和/或严重程度的免疫反应所需的量。在一些实施方案中，所述量引发免疫反应，所述免疫反应部分或完全降低一种或多种症状的严重程度和/或受试者经历一种或多种症状的时间，降低攻击后患上已建立的感染的可能性，减慢疾病的进展、任选地延长存活期，产生针对SARS-CoV-2的中和抗体和SARS-CoV-2 S蛋白特异性T细胞反应。

在一些实施方案中，本公开文本提供了如下表B所示的疫苗接种方案。所述方案预防或改善COVID-19，诸如其一种或多种症状；或预防与COVID-19相关的住院治疗或死亡或降低其风险。在一种方案中，向未患COVID-19或未接种的受试者肌内接种免疫原性组合物，所述组合物是通过将0.25mL的水性抗原组分和0.25mL的AS03佐剂(例如，AS03_A、AS03_B或AS03_C，其体积可以用PBS补足至0.25mL，如果需要的话)混合来制备的。0.25mL水性抗原组分可以是单价的(MV)并且包含在PBS中配制的10μg的D614 preS dTM或B.1.351(β)preSdTM，如表A所示。可替代地，所述水性抗原组分是二价的(BV)并且包含在PBS中配制的5μg的D614 preS dTM和5μg的βpreS dTM，如表A所示。在所述方案中，隔开三周或四周向所述受试者施用两次所述免疫原性组合物。

VI.疫苗作为加强剂的用途

本发明的疫苗组合物可以用作通用加强剂。本发明的疫苗组合物可以用作先前施用的COVID-19疫苗的加强剂，用作初免-加强疫苗接种方案(例如，异源或同源初免-加强疫苗接种方案)的一部分。所述方案中的初免剂量(即，初次疫苗)可以是基于以下的疫苗：mRNA、DNA、病毒载体(例如，腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、水泡性口炎病毒载体、痘苗病毒载体或麻疹病毒载体)、肽或蛋白质、病毒样颗粒(VLP)、衣壳样颗粒(CLP)、减毒活病毒、灭活病毒(灭活疫苗)等。在一些实施方案中，所述初次疫苗含有与加强疫苗相同的抗原(即，同源初免-加强疫苗接种方案)。部分由于再利用(尤其是对于病毒载体初免)并且由于通过加强提供的定性和定量不同的免疫特征，初免-加强方案可能是有利的。预期此类方案将在接种受试者中在抗病毒免疫的广度、效力和持久性方面产生增强的结局。

包含用于在体内表达SARS-CoV-2抗原(例如，S蛋白抗原)的遗传物质(例如，mRNA、DNA或病毒载体)的疫苗统称为“基因疫苗”。例如，基因疫苗包括含有mRNA、含或不含化学修饰或核苷酸类似物的那些疫苗。mRNA可以被封装(例如，在脂质纳米颗粒(LNP)中)或与载体或佐剂(例如，鱼精蛋白或皂苷)复合。mRNA可以是自我复制的或非自我复制的。本发明的疫苗组合物可用作基因疫苗的加强剂，因为基因疫苗可能在接种受试者中引发抗药物免疫反应，所述免疫反应破坏并且因此降低相同疫苗的后续剂量的功效。在此类情况下，不能向相同的受试者重复(例如，季节性地)施用所述基因疫苗。

在本发明的初免-加强方案的一些实施方案中，所述初免剂量可以是编码重组S蛋白的基因疫苗，所述重组S蛋白可以包括SARS-CoV-2 S蛋白的胞外域。在一些实施方案中，所述重组S蛋白是包含来自SARS-CoV-2胞外域或受体结合结构域(RBD)的序列和三聚化序列(例如，天然SARS-CoV-2 S三聚化结构域)的多肽的三聚体。在一些实施方案中，所编码的重组S蛋白可以包含促进所述重组S蛋白从接种受试者的生产细胞中分泌的信号肽序列(例如，来自SARS-CoV-2(诸如S蛋白)的信号肽)。

在一些实施方案中，所述基因疫苗编码出于特定的设计目的与参考(例如，天然存在的)S蛋白相比具有一种或多种突变的S蛋白或其抗原部分。例如，所编码的S蛋白可以含有(i)在弗林蛋白酶切割位点处的突变以防止弗林蛋白酶切割(例如，“GSAS”(SEQ ID NO:6)突变)；(ii)改变内质网(ER)保留的突变；(iii)消除推定的糖基化的突变；(iv)引入可替代信号肽的突变；和/或(v)稳定S多肽的融合前构象的突变(例如，“PP”突变)。

在一些实施方案中，由所述基因疫苗编码的S蛋白可以包括天然存在的突变，诸如D614G突变和本文所述的其他突变。在某些实施方案中，所述基因疫苗可以编码源自SARS-CoV-2变体(诸如上述变体)的重组S蛋白。

在一些实施方案中，所述基因疫苗是Moderna COVID-19疫苗(mRNA-1273)、Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗(BNT162b2)、Janssen COVID-19疫苗(Ad26.CoV2.S)和Vaxzevria(以前的COVID-19疫苗，AstraZeneca)。

在本发明的初免-加强方案的一些实施方案中，所述初免剂量是灭活疫苗，诸如Sinovac-CoronaVac和Sinopharm BIBP疫苗。

所述初免-加强方案包括用初次疫苗(例如，基因疫苗或亚单位疫苗)进行疫苗接种，然后用本发明的蛋白质疫苗进行一次或多次加强剂量。在一些实施方案中，所述初次疫苗需要疫苗的一次施用(例如，肌内、皮下、皮内或鼻内施用)；或间隔一段时间(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9或10周或更长时间)的疫苗的两次施用。

在一些实施方案中，可以在初次疫苗接种后至少两周(例如，四周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年、一年半、两年、三年、四年、五年或更长时间)给予本发明的重组蛋白的加强剂量。例如，一旦施用了基因疫苗(例如，mRNA或腺病毒基疫苗)或亚单位疫苗，便可以每年或每半年向受试者给予本发明的蛋白质疫苗的加强剂量。为方便起见，所述加强疫苗可以每年与流感疫苗共同施用(例如，作为单独的配制品或共同配制品)。

在一些实施方案中，所述加强剂是本文所述的单价或多价的免疫原性组合物，在含或不含佐剂的情况下使用。在一些实施方案中，所述加强剂是单价的免疫原性组合物(例如，含有源自武汉毒株或南非变体的重组S蛋白的组合物)。在其他实施方案中，所述加强剂是二价的免疫原性组合物(例如，含有源自武汉毒株的重组S蛋白和源自南非变体的重组S蛋白的组合物)。

在某些实施方案中，加强剂量可以是0.5mL免疫原性组合物，所述组合物通过在注射之前将在0.25mL的无菌、澄清且无色的PBS溶液中的5μg preS dTM和/或5μg变体(参见例如，表A、下文的表8或表12)与0.25mL的AS03(AS03_A)按体积比体积混合而制成。在进一步的实施方案中，所述变体是β变体(例如，含信号序列的SEQ ID NO:13)。用于与抗原溶液混合的AS03佐剂的剂量也可以是下表9所示的0.25mL的所述乳剂的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)。在此类实施方案中，可以任选地将磷酸盐缓冲盐水添加至AS03乳剂中以达到0.25mL的佐剂剂量的最终体积(参见例如，表9)。

在某些实施方案中，加强剂量可以是0.5mL免疫原性组合物，所述组合物通过在注射之前将在0.25mL的无菌、澄清且无色的PBS溶液中的2.5μg preS dTM和/或2.5μg变体(参见例如，表A、下文的表8或表12)与0.25mL的AS03(AS03_A)按体积比体积混合而制成。在进一步的实施方案中，所述变体是β变体(例如，含信号序列的SEQ ID NO:13)。用于与抗原溶液混合的AS03佐剂的剂量也可以是表9所示的0.25mL的所述乳剂的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此类实施方案中，可以任选地将磷酸盐缓冲盐水添加至AS03乳剂中以达到0.25mL的佐剂剂量的最终体积(参见例如，表9)。

在某些实施方案中，初次疫苗接种是用包含重组S蛋白的亚单位疫苗进行的，并且与用于初次(非加强剂)疫苗接种的疫苗相比，所述加强疫苗含有较少量的重组S蛋白。例如，初次疫苗接种需要两次注射，按一定间隔(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多周；14-35天的间隔)分别地每次注射10μg重组S蛋白，而加强注射剂可以仅含有2.5或5μg重组S蛋白。

在一些实施方案中，初次疫苗接种需要按两次注射之间一定的间隔(例如，3、4、5、6、7、8或更多周的间隔)两次注射0.5mL免疫原性组合物，所述组合物是通过在注射之前将在0.25mL的无菌、澄清且无色的PBS溶液中的10μg的preS dTM或变体(或5μg的preS dTM加5μg的变体(例如，β变体)，对于二价疫苗来说)(参见例如，表A、下文的表8或表12)与0.25mL的AS03(AS03_A)按体积比体积混合来制备的。用于与抗原溶液混合的AS03佐剂的剂量也可以是表9所示的0.25mL的所述乳剂的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此类实施方案中，可以任选地将磷酸盐缓冲盐水添加至AS03乳剂中以达到0.25mL的佐剂剂量的最终体积(参见例如，表9)。然后在稍后的时间(例如，在初次疫苗接种的第二次注射后至少3、6、7、9或12个月)向受试者给予加强疫苗，其中所述加强疫苗可以是0.5mL免疫原性组合物，所述组合物通过在注射之前将在0.25mL的无菌、澄清且无色的PBS溶液中的2.5或5μg的preS dTM或变体(例如，β变体)(参见例如，表A、表8或表12)与0.25mL的AS03(AS03_A)按体积比体积混合而制成。用于与抗原溶液混合的AS03佐剂的剂量也可以是表9所示的0.25mL的所述乳剂的二分之一(AS03_B)、四分之一(AS03_C)或八分之一(AS03_D)；在此类实施方案中，可以任选地将磷酸盐缓冲盐水添加至AS03乳剂中以达到0.25mL的佐剂剂量的最终体积(参见例如，表9)。

在一些实施方案中，本公开文本的疫苗接种方案选自下表B中所述的方案：

表B示例性疫苗接种方案

*已经接种(初免)基于mRNA的疫苗或基于腺病毒的疫苗的受试者。

**已经接种(初免)基于mRNA的疫苗、基于腺病毒的疫苗或重组S蛋白(例如，preSdTM)疫苗的受试者。

MV：单价的。

BV：二价的。

D614：源自武汉毒株的重组S蛋白(例如，preS dTM；不含信号序列的SEQ ID NO:10)。

β：源自β变体的重组S蛋白(例如，不含信号序列的SEQ ID NO:13)。

AS03：在这里使用的剂量是0.25mL(即，AS03_A；参见下文表9)。

1/2AS03(也称为AS03_B)：一半剂量的AS03_A(参见下文表12)；即0.125mL AS03(参见下文表9)。

在上表B中，方案2-9是本公开文本的示例性初免-加强方案。所述方案预防或改善COVID-19，诸如其一种或多种症状；或预防住院治疗或死亡或降低其风险。

在一些实施方案中，向已经从COVID-19中恢复或已经接种COVID-19疫苗的受试者在这种恢复或疫苗接种后例如三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多个月给予加强剂。在进一步的实施方案中，加强免疫的时间是在这种恢复或疫苗接种后约四至约十个月。在某些实施方案中，加强免疫的时间是在这种恢复或疫苗接种后约八个月。可以向此受试者肌内施用免疫原性组合物，所述组合物是通过将0.25mL的水性抗原组分和AS03佐剂(例如，AS03_A或AS03_B(其体积可以用PBS补足至0.25mL，如果需要的话))混合来制备的。在一个实施方案中，0.25mL水性抗原组分可以是单价的(MV)并且包含在PBS中配制的2.5μg的D614preS dTM或βpreS dTM，如表A所示，其中AS03佐剂是AS03_A或AS03_B(其体积可以用PBS补足至0.25mL，如果需要的话)。在一个实施方案中，0.25mL水性抗原组分可以是单价的(MV)并且包含在PBS中配制的5μg的D614 preS dTM或βpreS dTM，如表A所示，其中AS03佐剂是AS03_A或AS03_B(其体积可以用PBS补足至0.25mL，如果需要的话)。在一个实施方案中，所述水性抗原组分是二价的(BV)并且包含在PBS中配制的2.5μg的D614 preS dTM和2.5μg的βpreSdTM，如表A所示，其中AS03佐剂是AS03_A或AS03_B(其体积可以用PBS补足至0.25mL，如果需要的话)。

除非本文另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。下文描述了示例性方法和材料，但在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料。在发生冲突的情况下，应以包括定义在内的本说明书为准。通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、医学和药物化学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名法以及其技术是本领域熟知且常用的那些。根据制造商的说明书如本领域通常所实现的或如本文所述的来进行酶反应和纯化技术。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。在整个本说明书和实施方案中，词语“具有(have)”和“包含(comprise)”或变型诸如“具有(has)”、“具有(having)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应被理解为暗示包括所陈述的整数或整数组，但是不排除任何其他整数或整数组。本文提及的所有出版物和其他参考文献均通过引用以其整体并入。尽管本文引用了许多文件，但该引用并不意味着承认这些文件中的任何文件构成本领域公知常识的一部分。

如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与所陈述的参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或另外从上下文显而易见，所述术语是指落入所陈述的参考值的任一方向(大于或小于)的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。

为了可以更好地理解本发明，阐述了以下实施例。这些实施例仅用于说明目的，并不被解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：SARS-CoV-2 S编码序列克隆进入杆状病毒转移质粒中

将Gibson组装(GA)用于产生转移质粒，所述质粒包含由SARS-CoV-2刺突糖蛋白(来自基因组分离物Wuhan-Hu-1 GenBank NC045512的YP_009724390.1)修饰的所指示的SARS-CoV-2刺突糖蛋白。对于每个构建体，设计了三个基因片段(gBlock)用于克隆进入线性化的SapI pPSC12 DB转移载体中。gBlock基因片段在其连接位点处具有40bp的重叠序列，并且对于gBlock片段1和3分别在5'和3'处与pPSC12具有重叠序列。由Integrated DNATechnologies(IDT)合成了gBlock。Gibson组装反应的描绘示于(图2A和2B)中。由EurofinsGenomics经由Sanger测序确认了最终的转移质粒。定点诱变也可以用于产生变体蛋白。

实施例2：重组S蛋白的产生和纯化

将含有在多角体蛋白启动子控制下编码preS dTM的序列的重组杆状病毒用于感染草地贪夜蛾(S.frugiperda)细胞。使细胞在27℃下在PSFM培养基(SAFC)中生长至2.5x10⁶个细胞/mL的密度，并且用2％(体积/体积)的重组杆状病毒感染。感染后72小时通过在3,400x g下离心15分钟收获细胞。将上清液用于重组S蛋白的纯化。

在一种纯化方法中，将含有分泌的重组SARS-CoV-2刺突蛋白的上清液使用SUPRACAP 100双层K250P/KS50P 5”过滤器(Pall，#NP5LPDG41)深度过滤。使用100kDaSartocon Slice Cassette(0.1m²)、200mL/min的流速在15psi下将深度滤液浓缩10x，然后用20mM Tris；50mM NaCl(pH 7.4)进行5x渗滤。将含有SARS-CoV-2刺突蛋白的渗滤液通过Capto^TM小扁豆凝集素(Cytiva)色谱法(作为捕获步骤纯化)进行纯化。将Capto^TM小扁豆凝集素柱用20mM Tris；50mM NaCl；10mM甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(pH 7.4)平衡。在这些条件下，使SARS-CoV-2刺突蛋白与Capto^TM小扁豆凝集素树脂结合并且使污染物流过柱。将柱用20mM Tris；50mM NaCl；10mM甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(pH 7.4)洗涤以去除未结合的蛋白质。将SARS-CoV-2刺突蛋白用含有20mM Tris；500mM甲基-α-D-吡喃甘露糖苷的洗脱缓冲液(pH 7.4)从Capto^TM小扁豆凝集素柱上洗脱下来。

将Capto^TM小扁豆凝集素洗脱液通过苯基Sepharose^TM HP疏水相互作用色谱树脂(Cytiva)(作为精细纯化(polishing)步骤)进行进一步纯化。将Capto^TM小扁豆凝集素洗脱液调节至750mM硫酸铵浓度、0.01％Triton X-100浓度，并且加载到用含有50mM磷酸钠；750mM硫酸铵；0.01％v/v Triton X-100的缓冲液(pH 7.0)平衡的苯基琼脂糖凝胶HP柱上。在加载后，将苯基琼脂糖凝胶HP柱用50mM磷酸钠；750mM硫酸铵；0.01％v/v Triton X-100(pH 7.0)洗涤以去除未结合的污染物。将SARS-CoV2刺突蛋白用含有50mM磷酸钠；300mM硫酸铵；0.01％v/v Triton X-100的洗脱缓冲液(pH 7.0)从苯基琼脂糖凝胶HP柱上洗脱下来。

将苯基琼脂糖凝胶HP洗脱液用蒸馏水稀释3.25x，并且使用单个Mustang Q XTAcrodisc过滤器(Pall，#MSTGXT25Q16)进行Q膜过滤。在Q膜过滤后，使用Sartocon Slice50(Sartorius Stedim，#3D91465050ELLPU)进行TFF。将Q滤液浓缩至0.25mg/mL，然后用10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8-7.2)渗滤10x。将含有SARS-CoV-2刺突蛋白的TFF渗余物用0.005％Tween 20配制，并且使用0.2μm过滤器进行无菌过滤，并且在4℃下储存直至使用。

可替代的纯化方法使用CEX-HIC。可以通过深度过滤(有或没有初始离心步骤)完成收获。然后可以将捕获的重组蛋白通过超滤/渗滤步骤进行进一步纯化。

实施例3：乳剂佐剂制造

在氮气气氛下配制了由角鲨烯和D/L-α生育酚构成的油相。单独制备了由改良的磷酸盐缓冲盐水和聚山梨醇酯80构成的水相。在均质化和微流化之前将油相和水相以1:9(油相体积比水相体积)的比率合并(以约15,000psi三次通过微流化器)。将所得的乳液通过两列串联的两个0.5/0.2μm过滤器(即，0.5/0.2/0.5/0.2)进行无菌过滤。

目标最终含量为42.76mg/mL角鲨烯、47.44mg/mL生育酚和19.44mg/mL聚山梨醇酯80(参见表9)。

通过DLS确定粒度和多分散性分别在140至180nm范围内和小于0.2。通过HPLC确认角鲨烯和生育酚含量并且通过分光光度法确认聚山梨醇酯80含量在规格范围内。

实施例4：关键的小鼠研究

此实施例描述了一项在小鼠中的SARS-CoV-2重组蛋白疫苗配制品的研究。疫苗配制品含有缺失了跨膜区和胞质区的SARS-CoV-2融合前稳定的S蛋白(preS dTM)。疫苗含有AS03佐剂。此疫苗研究调查了对体液免疫和细胞介导的免疫二者的剂量反应和佐剂效应。所述研究还比较了非稳定的S胞外域(缺失了跨膜区和胞质区；“S dTM”)与preS dTM之间的影响。S dTM含有带有His标签的SARS-CoV-2刺突蛋白ECD S1和S2区(Protein Sciences)。

在这里使用的小鼠是6-8周龄的远交雌性Swiss Webster小鼠。为它们在第0天和第21天肌内注射50μL(25μL的抗原溶液加25μL的AS03)的疫苗配制品。

以下数据反映了目标抗原剂量和实际抗原剂量。在实验运行后，发现了一种用于检测SARS-CoV-2preS蛋白的关键多克隆抗体试剂也识别糖基化的宿主细胞蛋白(HCP)。因此，目标纯度和HCP水平是不准确的，并且在配制的疫苗产品中的SARS-CoV-2preS蛋白的浓度显著低于计划。表1示出了给药方案，并且表2反映了重新计算后的如下实际剂量。

表1用于小鼠研究的给药方案

表2 CoV2 preS dTM抗原的CoV2-02_Ms目标剂量和实际剂量

注射日期	目标剂量(μg)	CoV2 preS dTM含量％*	实际剂量(μg)
				D0	0.167/0.5/1.5/4.5	41	0.07/0.2/0.6/1.8
D21	0.167/0.5/1.5/4.5	26	0.04/0.13/0.4/1.17

*实际剂量是基于新的测定重新计算的，所述测定将结构正确的CoV2 preS dTM三聚体与HCP杂质区分开来。所述测定是基于ACE2结合和/或HPSEC的。

由于基于新的定量测定的给药调整，D0和D21注射的实际剂量是不同的。为了保持一致性，在文本和图中仅指示了目标剂量。

在第-4天、第21天和第36天从动物中抽取血液。通过ELISA测量了S特异性IgG、IgG1和IgG2a水平，其中将板用含有S1和S2区的刺突ECD(S dTM；Sino Biological)包被。将滴度报告为引起大于0.2的OD值的最后一个稀释度的倒数。OD＝0.2值表示测定背景的至少两倍。首先在BSL 3下在噬斑减少中和试验(PRNT)中使用SARS-CoV-2USA/WA1/2020病毒株评估了血清抗体中和活病毒的能力。简言之，将血清样品在56℃下加热灭活30分钟，并且在稀释剂(DMEM/2％FBS)中稀释。将稀释的血清样品与等体积的稀释以含有30PFU/孔的SARS-CoV-2混合，并且在37℃下孵育1小时。将汇合的Vero E6细胞的板用血清-病毒混合物接种并且在37℃下孵育1h。在孵育后，将板用1mL的0.5％甲基纤维素培养基覆盖并且在37℃/5％CO₂下孵育3天。然后将板洗涤，用冰冷的甲醇固定并且用0.2％结晶紫染色。然后将板洗涤，干燥，并且将中和抗体滴度确定为将测试中病毒噬斑的数量减少50％或更多的最高血清稀释度。

使用假病毒中和测定评估了由preS dTM疫苗引发的功能性抗体反应。将血清样品稀释并且在56℃下加热灭活30分钟。将稀释的血清样品与一定体积的报告病毒颗粒(RVP)-GFP(Integral Molecular)(稀释至每孔含有300个感染性颗粒)混合，并且在37℃下孵育1小时。将50％汇合的293T-hsACE2克隆细胞的96孔板用血清+病毒混合物接种，并且在37℃下孵育72h。将板在高内涵成像仪上扫描，并且对单独的GFP表达细胞进行计数。将中和抗体滴度报告为将测试中的病毒噬斑数量减少50％的稀释度的倒数。

在不含佐剂的情况下，preS dTM和S dTM不具有免疫原性，如在1或2个剂量后通过非常低的或不存在IgG和中和抗体反应所证明的那样。这两种抗原之间的血清S特异性IgG水平是类似的，并且从第21天至第36天没有统计学上显著的滴度变化(图4)。相比之下，加有含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的preS dTM疫苗在所测试的所有剂量下在1个剂量(D21)后均引发了高IgG反应(不同疫苗剂量组的平均值范围为从4.1至4.6Log₁₀ ELISA单位(EU))。第二次注射(D36)进一步增加了反应，并且IgG平均值达到5.1至5.5Log₁₀ EU，这取决于疫苗剂量。证明了佐剂效应(倍数增加和P值)和加强剂效应二者。在1个剂量后(x1.5，p值<0.05)和在2个剂量后，对于IgG反应观察到适度的剂量效应。因此，在第21天和第36天，含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂均显著增加了动物中由用preS dTM免疫诱导的S特异性IgG滴度，并且观察到第36天的滴度高于第21天(图5)。用含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂获得的滴度显著高于在不含佐剂的情况下获得的滴度。总之，含有含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的疫苗配制品的剂量-反应效应是统计学上显著的，其中p<0.05。然而，未加佐剂的配制品的剂量-反应效应不是统计学上显著的(p＝0.7866)。简言之，无论使用什么剂量，均显示出显著的含α生育酚的角鲨烯乳剂佐剂效应，其中所有剂量的p值均<0.001。

与IgG反应一致，加有含α-生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的疫苗在2个剂量后引发了稳健的中和抗体反应。除在最低剂量组(0.167和0.5μg)中的两只小鼠之外，在所有小鼠中均检测到了PRNT₅₀滴度。中和平均值范围为从最低疫苗剂量组(0.167μg)的2.5Log₁₀至最高疫苗剂量组(4.5μg)的3.5Log₁₀。

与PRNT50测定一致，在所有加有含α生育酚的角鲨烯乳剂AS03佐剂的preS dTM免疫的小鼠(除在0.5ug组中的一只之外)中均检测到了假病毒中和滴度。在最高疫苗剂量组(4.5ug)中，中和平均滴度范围为从2.6Log₁₀至3.6Log₁₀。因此，用加佐剂的配制品免疫的动物到第36天以剂量依赖性方式产生了显著更高量的SARS-CoV-2中和抗体，图6A和6B。

实施例5：辅助的小鼠研究

此实施例描述了在小鼠中的SARS-CoV-2重组蛋白疫苗配制品的第二项研究。此研究聚焦在评价免疫小鼠的细胞介导的免疫(CMI)。在这里使用的小鼠是6-8周龄的近交雌性BALB/c小鼠。为它们在第0天和第14天肌内注射50μL的疫苗配制品。给药方案如下所示，其中每组五只小鼠。所注射的preS dTM目标为4.5μg，含有或不含有含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂。为了保持一致性，在文本和图中仅指示了目标剂量。

表3 CoV2 preS dTM抗原的CoV2-03_Ms目标剂量和实际剂量

注射日期	目标剂量(μg)	CoV2 preS dTM含量％*	实际剂量(μg)
				D0	4.5	41	1.8
D21	4.5	26	1.17

*实际剂量是基于新的测定重新计算的，所述测定将结构正确的CoV2 preS dTM三聚体与HCP杂质区分开来。所述测定是基于ACE2结合和/或HPSEC的。

在第0天、第14天和第24天从动物中抽取血液。在第24天收获脾用于CMI分析，并且将脾细胞用具有11个氨基酸重叠的S1+S2 15聚体肽库(JPT)刺激。通过流式细胞术方法对细胞进行表型分析，并且通过细胞内细胞因子染色(ICS)评估细胞因子的产生。下文示出了所评价的生物标记物组。

表4 CMI生物标记物组

抗体	形式	克隆	供应商
				CD3	BUV395	17A2	BD
CD4	PerCP-Cy5.5	RM4-5	Biolegend
				CD8	AF700	53-6.7	BD
IFN-γ	FITC	XMG1.2	BD
				IL-5	PE	TRFK5	Biolegend
TNF	Pacific Blue	MP6-XT22	Biolegend
				IL-4	APC	11B11	Biolegend
CD45RA	PE-Cy7	RA3-6B2	BD
				CD14	PE-Cy7	Sa14-2	Biolegend
IL-2	BV605	JES6-SH4	BD
				LIVE/DEAD	Near-IR(APC-Cy7)		ThermoFisher

为了进行细胞内染色(ICS)，将脾匀浆，将红细胞裂解，并且将细胞在37℃和5％CO₂下放置1小时。然后对脾细胞进行计数，并且将2x10⁶个细胞在37℃和5％CO₂下在以下四种条件下与Golgi Plug(BD Biosciences)一起孵育6小时：无肽刺激(仅培养基对照)、阳性对照刺激和用两个单独的刺突肽库(JPT产品PM-WCPV-S-1)刺激。将来自每只单独动物的细胞用细胞活化混合物(Cell Activation Cocktail)刺激，其中布雷菲德菌素A(Biolegend)作为阳性对照。在刺激后，将细胞洗涤并且在4℃下重新悬浮于Mouse BD Fc Block^TM(克隆2.4G2)中持续10分钟。然后将细胞离心，去除Fc块，并且将细胞在4℃下用含有以下的抗体混合物进行30分钟表面染色和活/死染色：在染色缓冲液(FBS)(BD Biosciences)中的CD4(RM4-5)PerCP-Cy5.5(Biolegend)、CD8(53-6.7)AF700(BD Biosciences)、CD45R/B220(RA3-6B2)PE/Cy7(BD Biosciences)、CD14(Sa14-2)PE/Cy7(Biolegend)和LIVE/DEAD可固定近红外死细胞染色试剂盒(Invitrogen)。在表面染色后，将细胞洗涤，固定并且用Cytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)在4℃下透化30分钟。然后将细胞用1x Perm/Wash溶液(BD Biosciences)洗涤，然后在4℃下避光用含有以下的混合物进行30分钟细胞内染色：在1X Perm/Wash缓冲液中的CD3e(17A2)BUV395(BD Biosciences)、IFN-γ(XMG1.2)FITC(BD Biosciences)、TNF-α(MP6-XT22)Pacific Blue(Biolegend)、IL-2(JES6-5H4)BV605(BD Biosciences)、IL-4(11B11)APC(Biolegend)和IL-5(TRFK5)PE(Biolegend)。然后将细胞洗涤并且重新悬浮于FACS缓冲液中。将样品在LSR Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上运行，并且在FlowJo软件(10.6.1版)上进行分析。

ICS分析表明，在加有AS03佐剂的疫苗免疫的小鼠中，在用S1和S2肽库二者刺激脾细胞后，没有或有低的S特异性CD4⁺T细胞。在S1和S2肽库的情况下观察到类似的CD4⁺T细胞反应，低于0.05％，在仅佐剂免疫的小鼠中检测到的非特异性信号的范围内；仅示出了S1刺激结果。未检测到S特异性CD8⁺T细胞反应。在加有含α生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的疫苗免疫的小鼠中检测到S特异性CD4⁺T细胞，其中主要是TNF-α分泌细胞(约0.1％)和一些IL-5分泌细胞(约0.05％)。如基于重组抗原的疫苗所预期的那样，未检测到S特异性CD8⁺T细胞反应。细胞因子概况表明了由加有含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的preS dTM疫苗诱导的混合Th1/Th2反应。细胞因子概况表明了在BALB/c小鼠中由加有AS03佐剂的preS dTM疫苗诱导的混合Th1/Th2反应(图7)。

实施例6：非人灵长类动物研究

此实施例描述了一项在非人灵长类动物(NHP)中评价体液免疫和CMI的研究。在这里使用的动物是4-12岁的恒河猴。在第0天和第21天，为NHP肌内注射目标剂量为15μg的混合有含α-生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的preS dTM，体积为0.5mL。在D4、D21、D28和D35收集血清。为了保持一致性，在文本和图中仅指示了目标剂量。

表5 CoV2 preS dTM抗原的CoV2-02_NHP目标剂量和实际剂量

注射日期	目标剂量(μg)	CoV2 preS dTM含量％*	实际剂量(μg)
				D0	15	26	3.9
D21	15	14	2.1

*实际剂量是基于ACE2结合定量重新计算的。

通过ELISA测量了S特异性IgG水平，其中将板用GCN4融合前形式的刺突蛋白(GeneArt)包被。

与在用preS dTM的小鼠中观察到的抗体反应一致，在不存在佐剂的情况下未检测到反应或检测到非常低的反应(图8)。然而，当在AS03佐剂中配制时，早在第1剂后2周，15μgpreS dTM疫苗便在所有免疫的猴中引发了高水平的与融合前S蛋白结合的IgG(平均滴度为3.7Log₁₀ EU)。第二次免疫在D28有效地增加了IgG滴度(平均滴度为5.1Log₁₀ EU)。

使用假病毒中和测定评估了由preS dTM疫苗引发的功能性抗体反应。将血清样品稀释并且在56℃下加热灭活30分钟。将稀释的血清样品与一定体积的报告病毒颗粒(RVP)-GFP(Integral Molecular)(稀释至每孔含有300个感染性颗粒)混合，并且在37℃下孵育1小时。将50％汇合的293T-hsACE2克隆细胞的96孔板用血清+病毒混合物接种，并且在37℃下孵育72h。将板在高内涵成像仪上扫描，并且对单独的GFP表达细胞进行计数。将中和抗体滴度报告为将测试中的病毒噬斑数量减少50％的稀释度的倒数。

在第1剂后三周，在任何组中均未检测到假病毒中和滴度。然而，在第二次注射后，在加有含α生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的preS dTM免疫的恒河猴(除一只之外)中检测到假病毒中和滴度(平均滴度为2.1Log₁₀IC50)。免疫的恒河猴的中和滴度与针对一组人恢复期(Conv.)血清观察到的滴度相当(图9)。微量中和(MN)测定数据还表明，AS03显著增加了针对野生型SARS-CoV-2病毒的中和抗体滴度(图10)。

实施例7.1：仓鼠研究1

先前的研究已经表明，仓鼠在用SARS-CoV-2攻击后持续出现临床体征，包括嗜睡、毛发竖起、呼吸急促、体重显著减轻(高达20％体重)以及在D2至D14的人的SARS-CoV-2肺炎所特有的肺中的弥漫性肺泡损伤。因此，仓鼠是用于研究COVID疫苗的合适动物模型。此实施例描述了一项在仓鼠中的评估SARS-CoV-2重组蛋白疫苗配制品的免疫原性和SARS-CoV-2病毒攻击后的功效的研究。疫苗配制品含有preS dTM和AS03佐剂。此研究调查了一个剂量相比于两个剂量的疫苗的特异性抗体反应和功效、以及对体液反应的佐剂效应。

在这里使用的动物是6-8周龄的叙利亚金仓鼠。在第0天(对于两剂群组)和第21天(对于一剂群组和两剂群组)，在一剂群组和两剂群组中为它们肌内注射75μL(37.5μL的抗原溶液加37.5μL的AS03)的疫苗配制品。剂量如下所示。

表6用于仓鼠研究的给药方案

*用于一剂群组的有效剂量是0.6μg。两剂群组的第一剂和第二剂的有效剂量分别是0.6μg和0.3μg。

**n＝4。在D23处死并且收集PBMC用于转录组学。

在第一次注射之前(基线)和D35从动物中抽取血液。

通过ELISA测量了S特异性IgG水平，其中将板用融合前刺突抗原(GCN4稳定的)(GeneArt)包被。将滴度报告为给出等于0.2的OD值的稀释度的倒数(图11)。OD＝0.2值表示以ELISA单位(EU)表示的稀释度的倒数。

除用未加佐剂的preS dTM免疫的1只仓鼠之外，所有接种的仓鼠在一次免疫后均出现了S特异性IgG反应。与未加佐剂的2.25μg目标剂量的preS dTM疫苗相比，加有AS03佐剂的preS dTM疫苗(2.25μg目标剂量)在一次注射(平均值为3.8Log₁₀ EU与3.3Log₁₀ EU)或两次注射(平均值为5.2Log₁₀ EU与4.8Log₁₀ EU)后诱导了更高的S特异性IgG滴度。在未加佐剂的和加有AS03佐剂的疫苗的两剂与一剂疫苗方案之间观察到显著差异，其中S特异性IgG滴度分别增加32倍和25倍(p值<0.001)。

使用假病毒中和测定(对于一剂群组和两剂群组二者)评估了由含和不含AS03的preS dTM疫苗引发的功能性抗体反应。如下进行假病毒中和测定：将血清样品稀释并且在56℃下加热灭活30分钟。将热灭活的血清样品的进一步2倍连续稀释液与一定体积的报告病毒颗粒(RVP)-GFP(Integral Molecular)(稀释至每孔含有300个感染性颗粒)混合，并且在37℃下孵育1小时。将50％汇合的293T-hsACE2克隆细胞的96孔板用血清+病毒混合物接种，并且在37℃下孵育72小时。将板在高内涵成像仪上扫描，并且对单独的GFP表达细胞进行计数。将假病毒中和抗体滴度报告为将测试中的病毒噬斑数量减少50％的稀释度(ID₅₀，其中ID₅₀＝IC₅₀)的倒数。

除来自加有AS03佐剂的preS dTM组的1只仓鼠具有非常低的滴度之外，在一次注射后没有测量到假病毒中和抗体反应(一剂群组)(图12)。未加佐剂的preS dTM和加有AS03佐剂的疫苗在2次注射后引发了显著的假病毒中和抗体反应(两剂群组)，其中平均滴度分别是2.4Log₁₀和3.1Log₁₀。在所有用加有AS03佐剂的疫苗免疫的仓鼠中均检测到了假病毒中和抗体滴度，而在未加佐剂的疫苗组的7/8仓鼠中检测到滴度并且更不均匀。观察到AS03的适度但显著的佐剂效应(增加4.6倍；p＝0.014)。

为了评估疫苗功效，用2.3x10⁴PFU的SARS-CoV-2(USA-WA1/2020毒株)经由100μl鼻内施用对仓鼠进行攻击。在攻击后每天监测临床体征(体重减轻、一般情况、呼吸频率)。在尸检时(在攻击后D4(n＝4)或在攻击后D7(n＝7))，收集鼻孔和肺用于使用qRT-PCR进行病毒载量评估，并且进行肺病理分析。在一剂群组中在攻击后长达3天并且在两剂群组中在攻击后长达4天，监测体重减轻。在攻击后四天，对照组显示出意想不到的非常适度的体重减轻，约3％-4％(图13)。低体重减轻可以通过用于动物攻击的低致病性病毒攻击原液来解释。由于体重减轻的低增量，无论免疫次数如何，在对照、未加佐剂的或加有AS03佐剂的preS dTM疫苗组之间在攻击后均没有能够观察到体重减轻差异。

在攻击后4天或7天，使用qRT-PCR测量SARS-CoV-2总RNA或亚基因组(sg)RNA，仅评估了来自两剂群组的鼻孔和肺中的病毒载量含量。值得注意的是，sgRNA是特定于主动病毒复制的，而总病毒RNA既负责病毒输入又负责主动复制。

尽管体重减轻有限，但对照组在D4的肺和鼻孔中展示出高sgRNA滴度(平均滴度分别为9.0和7.6Log₁₀拷贝/克)，这在D7仍然在四分之三的仓鼠中有检测到(平均滴度分别为5.4和4.5Log₁₀拷贝/克)(图15)。当与对照组相比时，在攻击后D4和D7，在两个疫苗组(未加佐剂的和加有AS03佐剂的)中均观察到肺中的病毒载量(图14)和病毒复制(图15)的强烈减少。在D4，仅在未加佐剂的疫苗组的四分之二的动物中检测到病毒复制，而在加有AS03佐剂的疫苗的仓鼠中均未检测到病毒复制，这表明了加有AS03佐剂的疫苗对肺的完全保护。在攻击后七天在疫苗组的肺中病毒复制的减少甚至更加明显(其中没有阳性动物)，而对照组仍然展示出5.4Log₁₀ sgRNA拷贝/克的平均滴度。在鼻孔中，与对照组相比，在攻击后D4和D7，在疫苗组中观察到病毒载量和病毒复制有所减少。在D4，疫苗组的sgRNA平均滴度低约2Log₁₀，并且在D7，所有接种的动物均是阴性的，这表明病毒快速清除。这些数据表明，用未加佐剂的preS dTM和加有AS03佐剂的疫苗进行免疫针对肺和鼻孔中的病毒复制具有明显的保护作用，这与在所有疫苗组中测量到的中和抗体反应一致。

在攻击后D4或D7对来自一剂群组和两剂群组的4只仓鼠/组的肺病理进行分析。此分析发现，对于所有疫苗配制品在D7肺部病变明显减少，这对于2.25μg/AS03剂量甚至更加明显，并且在肺实质中病毒蛋白表达强烈减少。表7示出了用于组织病理学的标准。

对照组在攻击后D4和D7收集的所有仓鼠的肺中均展示出3的高病理得分，这表示超过50％的肺具有严重病变。(图16A)。在一剂群组中，免疫一次的未加佐剂的preS dTM组在攻击后D4展示出从1至3变化的病理得分，并且在攻击后D7所有仓鼠的得分均等于3。然而，在免疫一次的加有AS03佐剂的组中，所有病理得分在D4均降低至2，并且在D7是变化的(在1与3之间)，这表明与未加佐剂的preS dTM组和对照组相比，肺病理较少。在两剂群组中，与对照组相比，在未加佐剂的preS dTM和加有AS03佐剂的preS dTM组中观察到较低的肺病理，尤其是在D7(两组的D4得分范围均为从1至3，并且D7得分在未加佐剂的组中为1至2，且在加有AS03佐剂的组中为0至1)。在加有AS03佐剂的preS dTM组中从D4至D7病理得分下降表明肺病理快速消退。

表7组织病理学评估

实施例7.2：仓鼠研究2

此实施例描述了另一项评估SARS-CoV-2重组蛋白疫苗配制品在仓鼠中的免疫原性和功效的研究。在此研究中使用的疫苗配制品是单价的(含有原始D614 preS dTM(SEQID NO:10)或B.1.351preS dTM变体(SEQ ID NO:13))或二价的(含有原始D614 preS dTM和B.1.351preS dTM变体)，二者均用AS03佐剂配制。在免疫后三周，在仓鼠中评价了疫苗针对两种所关注的变体α(B.1.1.7)和β(B.1.351)的功效。

在此研究中，将八只6-8周龄的雌性叙利亚金仓鼠的各组在D0和D21用三种疫苗配制品以1μg/重组蛋白组分的剂量进行肌内免疫。在免疫前、D21、D35和攻击前收集血液样品，以分析刺突结合IgG和中和抗体反应(表7.1)。在第二剂后四周，将所有的仓鼠用三种SARS-CoV-2毒株(D614G、B.1.351(β)或B.1.1.7(α))以先前确定的感染100％的动物且在攻击后的前七天内诱导10％与20％之间的体重减轻的剂量进行肌内接种。

表7.1用于第二项仓鼠研究的给药方案

在攻击后七天每天监测临床体征(体重减轻、一般情况和呼吸频率)。在攻击后D4处死四只动物/组，并且剩余四只在D7处死以收集肺和鼻甲(或鼻孔)。通过qRT-PCR定量了病毒基因组RNA和亚基因组病毒RNA。在攻击后D4和D7评估了肺中的组织病理。

在用β(B.1.351)变体病毒攻击后，每天测量免疫的仓鼠和未经处理的仓鼠的体重。对于每只仓鼠，每天计算与D0相比的体重变化，直至攻击后D7(最终尸检时间)。体重变化百分比表示在图16B中。结果表明未经处理的仓鼠的体重减轻明显，这指示生产性感染和病理，而免疫的仓鼠在用β变体攻击后没有经历任何体重减轻。这些数据表明，所测试的三种疫苗配制品CoV2 preS dTM-AS03(D614)、(B.1.351)和(D614+B.1.351)在仓鼠模型中赋予了针对由β变体诱导的感染和相关病理的稳健保护。

实施例8：临床研究

此实施例描述了用于评价本公开文本的疫苗组合物的安全性和功效的I/II期临床方案。参与者、结局评估员、研究人员、实验室人员和大多数申办方研究人员(参与ESDR的人员和仅针对相关参与者的人员除外)将对疫苗组分配组(配制品和佐剂；注射计划将不设盲)不知情。那些制备/施用研究干预的人将对疫苗组分配知情。参与者被随机分组并且按年龄分层。

组合物包含含或不含佐剂的preS dTM(SEQ ID NO:10的多肽的三聚体，不含信号肽)。疫苗组合物以两种剂量强度提供：配制品1和2，分别含有5μg(低剂量)或15μg(高剂量)的preS dTM抗原。下文示出了抗原组合物：

表8用于临床研究的抗原组合物

为了评价佐剂AS03的作用，使用水包油乳剂。用于佐剂研究组的单位剂量强度是5μg和15μg的preS dTM。每个单剂量小瓶的基于角鲨烯的含α生育酚的角鲨烯乳剂佐剂含有下文所示的成分。此乳剂具有含有角鲨烯和D,L-α-生育酚的油相；以及含有改良的PBS和聚山梨醇酯80的水相。下文所示的成分的量对应于250μL的AS03本体乳剂(即，AS03_A)。

表9用于临床研究的AS03佐剂组合物

*此剂量也称为AS03_A。AS03_B：此剂量的一半(125μL的乳剂，所有成分的数量的一半)。AS03_C：此剂量的四分之一(62.5μL的乳剂，所有成分的数量的四分之一)。AS03_D：此剂量的八分之一(31.25μL的乳剂，所有成分的数量的八分之一)。

将抗原组合物和佐剂组合物在使用前混合，其中总体积为0.5mL。安慰剂是每剂0.5mL的0.9％生理盐水。

施用途径是肌内注射，在上臂的三角肌处。

将在单独的盒子中提供每种研究干预(抗原与佐剂或抗原与稀释剂(PBS)将在2个小瓶的盒子中成套放在一起)。

参与者是18岁及以上的健康的个体，并且在年龄组内被随机分组。由18-49岁的参与者组成的小标记群组(群组1)将接受单个剂量。如果基于不设盲的数据审查群组1中到D09的安全性数据和实验室量度被视为是可接受的，则群组1中的剩余参与者和群组2中的所有参与者将被招募。所有参与者将在D01接受调查研究疫苗配制品或安慰剂对照的一次注射(疫苗接种[VAC]1)。群组2中的参与者将在D22接受研究疫苗配制品或安慰剂的第二次注射(VAC2)。每名参与者参与研究的持续时间将是大约在最后一次注射后365天。

COVID-19样疾病将成为主动和被动监视的功效目标的一部分。预期为此研究选择的候选SARS-CoV-2抗原的设计将促进比结合抗体稳健的中和抗体的产生。预期包括加佐剂的配制品将进一步增强中和抗体反应的幅度并且诱导平衡的Th1/Th2 T辅助细胞反应。总之，这些策略通过设计来减轻病毒感染的免疫增强的理论风险。患有认为与严重的COVID-19风险增加相关的慢性共病病症的个体将被排除在外。

所述研究的主要目标是通过描述在D01、D22和D36的中和抗体的水平和概况来评价疫苗组合物的免疫原性。将用中和测定来测量中和抗体滴度。预期在疫苗接种后在D22和D36的血清抗体中和滴度将相对于D01增加约2至4倍。中和抗体血清转化的发生被定义为值在基线时低于定量下限(LLOQ)且在D22和D36时可检测的中和滴度高于测定LLOQ。

所述研究的次要目标是通过描述每个研究干预组在D01、D22、D36和D181(群组1)或D202(群组2)和D366(群组1)或D387(群组2)的结合抗体概况，并且通过描述每个研究干预组在D181(群组1)或D202(群组2)和D366(群组1)或D387(群组2)的中和抗体概况来评价疫苗组合物的免疫原性。将用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法来测量每个研究干预组的全长SARS-CoV-2刺突蛋白的结合抗体滴度。预期在D22、D36、D181(群组1)或D202(群组2)和D366(群组1)或D387(群组2)，抗S抗体浓度的倍数上升[后/前]将是2或更多、或4或更多。将用中和测定来测量中和抗体滴度。预期在疫苗接种后在D181(群组1)或D202(群组2)和D366(群组1)或D387(群组2)的血清中和滴度相对于D01的倍数上升将是2或更多或者4或更多。中和抗体血清转化的发生被定义为基线值在基线时低于LLOQ且在D181(群组1)或D202(群组2)和D366(群组1)或D387(群组2)时可检测的中和滴度高于测定定量下限。

所述研究的另一个次要目的是通过描述病毒学确认的COVID-19样疾病和血清学确认的SARS-CoV-2感染的发生并且评价对SARS-CoV-2重组蛋白的抗体反应与COVID-19样疾病和/或血清学确认的SARS-CoV-2感染的风险之间的相关性/关联来评价功效。病毒学确认的COVID-19样疾病是通过规定的临床症状和体征来定义，并且通过核酸测定病毒检测测定来确认。血清学确认的SARS-CoV-2感染是通过非S ELISA中的SARS-CoV-2特异性抗体检测来定义。考虑到如上定义的病毒学确认的COVID-19样疾病和/或血清学确认的SARS-CoV-2感染，风险/保护相关性是基于对SARS-CoV-2的抗体反应的(如使用病毒中和或ELISA所评价的)。

所述研究的探索性目标是通过描述群组2中每个研究干预组在D22和D36的细胞免疫反应概况并且描述中和抗体与结合抗体之间的比率来评价免疫原性。将在用全长S蛋白和/或S抗原肽库刺激后的全血和/或冷冻保存的PBMC中来测量Th1和Th2细胞因子。将计算结合抗体(ELISA)浓度与中和抗体滴度之间的比率。

SARS-CoV-2中和抗体评估

将使用中和测定来测量SARS-CoV-2中和抗体。在此测定中，将血清样品与恒定浓度的SARS-CoV2病毒混合。可以通过ELISA来检测病毒感染性(病毒抗原产生)由于血清样品中存在的抗体的中和作用的降低。在洗涤和固定后，可以通过与抗SARS-CoV-2特异性抗体、HRP IgG缀合物和显色底物连续孵育来检测细胞中的SARS-CoV-2抗原产生。使用酶标仪测量所得的光密度。SARS-CoV-2感染性的降低(如与病毒对照孔中的相比)构成了阳性中和反应，这表明血清样品中存在中和抗体。

SARS-CoV-2刺突蛋白抗体血清IgG ELISA

将使用ELISA来测量SARS-CoV-2抗S蛋白IgG抗体。将微量滴定板用在包被缓冲液中稀释至最佳浓度的SARS-CoV-2融合前形式的刺突蛋白抗原来包被。可以将板通过向所有孔中添加封闭缓冲液并且孵育一段确定的时间来封闭。在孵育后，将洗涤板。将所有的对照、参考和样品用稀释缓冲液预稀释。然后将预稀释的对照、参考和样品在包被的测试板的孔中进一步连续稀释。将板孵育一段确定的时间。在孵育后，将洗涤板，将山羊抗人IgG酶缀合物的优化稀释液添加至所有孔中，并且将板进一步孵育。在此孵育后，将洗涤板，并且将酶底物溶液添加至所有孔中。将板孵育一段确定的时间以允许底物显色。将通过向每个孔中添加终止溶液来终止底物显色。ELISA微量滴定板读取器将用于使用测定专用SoftMaxPro模板来读取测试板。将从每个板内的所有光密度(OD)中减去板空白的平均OD值。将使用空白、对照和参考标准曲线的测量值导出样品滴度，这些值将被包括在运行内的每个测定板上。

细胞介导的免疫(使用全血和/或PBMC)

将在用全长S蛋白和/或S抗原肽库刺激后的全血和/或冷冻保存的PBMC中来测量细胞因子。

COVID-19样疾病

COVID-19样疾病被定义为具有(i)以下任一种情况(持续至少12小时的时间或在12小时的时间内再次发生)：咳嗽(干咳或咳痰)；发热；嗅觉缺失；味觉缺失；嗅觉缺失；冻疮(COVID脚趾)；呼吸困难或呼吸短促；肺炎的临床或影像学证据；以及任何临床诊断为中风、心肌炎、心肌梗塞、血栓栓塞事件(例如，肺栓塞、深静脉血栓形成和中风)和/或暴发性紫癜的住院治疗；或(ii)以下任两种情况(持续至少12小时的时间或在12小时的时间内再次发生)：咽炎；寒战；肌痛；头痛；鼻漏；腹痛；以及恶心、腹泻和呕吐中的至少一种。

病毒学确认的COVID-19疾病

病毒学确认的COVID-19疾病被定义为通过对与COVID-19样疾病相关的呼吸道样品进行核酸扩增试验(NAAT)得到的SARS-CoV-2阳性结果。

血清学确认的SARS-CoV-2感染

血清学确认的SARS-CoV-2感染被定义为血清中存在通过ELISA检测到的对SARS-CoV-2的非刺突蛋白具有特异性的抗体的阳性结果。

SARS-CoV-2核蛋白抗体血清IgG ELISA

将使用ELISA来测量SARS-CoV-2抗核蛋白抗体。将微量滴定板用在包被缓冲液中稀释至最佳浓度的SARS-CoV-2核蛋白抗原来包被。可以将板通过向所有孔中添加封闭缓冲液并且孵育一段确定的时间来封闭。在孵育后，将洗涤板。将所有的对照、参考和样品用稀释缓冲液预稀释。然后将预稀释的对照、参考和样品在包被的测试板的孔中进一步连续稀释。将板孵育一段确定的时间。在孵育后，将洗涤板，将山羊抗人IgG酶缀合物的优化稀释液添加至所有孔中，并且将板进一步孵育。在此孵育后，将洗涤板，并且将酶底物溶液添加至所有孔中。将板孵育一段确定的时间以允许底物显色。将通过向每个孔中添加终止溶液来终止底物显色。ELISA微量滴定板读取器将用于使用测定专用SoftMax Pro模板来读取测试板。将从每个板内的所有OD中减去板空白的平均OD值。将使用空白、对照和参考标准曲线的测量值导出样品滴度，这些值将被包括在运行内的每个测定板上。

用于COVID-19病例检测的核酸扩增试验(NAAT)

在所述测定中，将收集呼吸道样品并且提取RNA。然后通过NAAT使用特异性扩增SARS-CoV-2靶标的SARS-CoV-2特异性引物来评价纯化的模板。

实施例9：含AS03佐剂的SARS-CoV-2重组蛋白疫苗在18岁及以上的成年人中的免疫原性和安全性

此实施例描述了在18岁及以上的成年人中进行的II期、随机、改良的双盲、多中心、剂量探索研究的方案，以评价通过肌内(IM)途径施用的preS dTM/加有AS03佐剂的疫苗(也称为“CoV2 preS dTM-AS03”)的2次注射的安全性、反应原性和免疫原性。在此研究(VAT00002)中，评价了含固定剂量的AS03佐剂(AS03_A)的三种不同的抗原剂量(5μg、10μg和15μg的preS dTM的有效剂量)。在此研究中利用了两次注射时间表，其中隔开21天施用剂量。

通过收集每次疫苗接种后7天征集的不良事件(AE)和直到最后一次疫苗接种后21天未征集的AE，在所有参与者中评估了反应原性。所有参与者将在研究的持续时间内提供有关严重AE、医学上关注的AE(medically-attended AE，MAAE)和特别关注的不良事件(AESI)的信息。在研究的持续时间内的多个时间点在所有参与者中评估了中和抗体和结合抗体。在参与者的子集中评估了细胞反应和粘膜反应。此外，在研究的持续时间内收集了所有COVID-19事件。

来自此II期研究的期中安全性、反应原性和免疫原性数据将用于决定进展到III期以及用于选择抗原剂量配制品以进展到III期。此期中分析将在可获得所有参与者在第2次注射后长达21天的反应原性数据和第2次注射后长达14天的中和抗体反应数据后进行。

将参与者基于血清学(Roche抗N免疫测定和Roche抗S免疫测定)或病毒学(核酸扩增试验[NAAT])确定为未感染(先前未感染的)和非未感染(有先前感染的证据)的在先SARS-CoV-2感染进行分类。未感染的个体(没有在先SARS-CoV-2感染的证据)被定义为在招募时在一个或多个血清样品中通过抗N免疫测定和抗S免疫测定呈阴性，并且呼吸道标本的NAAT呈阴性，而非未感染的个体(有在先SARS-CoV-2感染的证据)被定义为在招募时在一个或多个血清样品中通过抗N免疫测定或抗S免疫测定呈阳性，或呼吸道标本中的NAAT呈阳性。

目标和终点

主要安全性

为了评估在每个年龄组和在每个研究干预组中所有参与者的安全性概况，检查以下参数：

-在每次疫苗接种后30分钟内报告的未征集的全身性AE的存在；

-在每次疫苗接种后长达7天发生的征集的(在参与者的日记卡[DC]和[电子]病历报告表[CRF]中预先列出的)注射部位反应和全身性反应的存在；

-在最后一次疫苗接种后长达21天报告的未征集的AE的存在；

-在整个研究中严重不良事件(SAE)的存在；

-在整个研究中AESI的存在；以及

-在整个研究中MAAE的存在。

主要免疫原性

为了评估在每个研究干预组中的未感染SARS-CoV-2的成年人中在最后一次疫苗接种后14天(D36)的中和抗体概况，在每个研究干预组的未感染SARS-CoV-2的参与者中测量了针对D614G变体的中和抗体滴度，包括评价：

-在D01和D36的个体血清中和滴度；

-在D36相对于D01在疫苗接种后个体血清中和滴度的倍数上升；

-相对于D01在D36血清中和滴度上升2倍和上升4倍[后/前](倍数上升≥2和≥4)；以及

-在未感染SARS-CoV-2者中的反应者，定义为基线值低于定量下限(LLOQ)且在D36可定量的中和滴度高于测定LLOQ的参与者。

次要免疫原性

所述研究的次要目标包括评估(1)在每个研究干预组的未感染SARS-CoV-2的成年人中在D22、D78、D134、D202、D292和D387的中和抗体概况；(2)在非未感染SARS-CoV-2的参与者的每个研究干预组中在D01、D22、D36、D78、D134、D202、D292和D387的中和抗体概况；和(3)在未感染和非未感染SARS-CoV-2的参与者的每个研究干预组中在D01、D22、D36、D78、D134、D202、D292和D387的结合抗体概况。

次要免疫原性目标(1)和(2)的终点是在每个研究干预组的参与者中针对D614G变体的中和抗体滴度，包括评价：

-在每个预定的时间点的个体血清中和滴度；

-在每个预定的时间点相对于D01在疫苗接种后个体血清中和滴度的倍数上升；

-在每个预定的疫苗接种后时间点的血清中和滴度上升2倍和上升4倍[后/前](倍数上升≥2和≥4)；以及

-反应者，定义为基线值低于LLOQ且在每个预定的疫苗接种后时间点的可定量的中和滴度高于测定LLOQ的参与者，和基线值高于LLOQ且在每个预定的疫苗接种后时间点中和抗体滴度增加4倍的参与者。

次要免疫原性目标(3)的终点是在每个研究干预组的参与者中针对D614G变体的结合抗体浓度，包括评价：

-在每个预定的时间点的个体抗体浓度；

-在每个预定的疫苗接种后时间点相对于D01在疫苗接种后个体抗体的倍数上升；

-在每个预定的疫苗接种后时间点上升2倍和上升4倍(抗体浓度倍数上升[后/前]≥2和≥4)；以及

-反应者，定义为基线值低于LLOQ且在预定的疫苗接种后时间点的可定量的抗体浓度高于测定LLOQ的参与者，和基线值高于LLOQ且在每个预定的疫苗接种后时间点结合抗体浓度增加4倍的参与者。

次要安全性

所述研究的次要目标还包括描述(1)在每个研究干预组的所有参与者中实验室确认的有症状的COVID-19的发生和(2)在每个研究干预组中血清学确认的SARS-CoV-2感染的发生。

次要安全性目标(1)的终点是：

-实验室确认的有症状的COVID-19的发生(基于本地确认的或方案定义的NAAT)；

-与住院治疗相关的有症状的COVID-19事件的发生；

-严重的有症状的COVID-19的发生；以及

-与有症状的COVID-19相关的死亡。

次要安全性目标(2)的终点是血清学确认的SARS-CoV-2感染的发生。

探索性免疫原性

所述研究的探索性目标包括(1)描述中和抗体与结合抗体之间的比率；(2)评估在参与者的子集中在D01、D22和D36的T细胞细胞因子概况；(3)进一步评估在参与者的子集中在D01、D22、D36、D134和D387的细胞免疫反应；(4)评估在参与者的子集中在D01、D22、D36和D134的粘膜抗体反应；以及(5)描述对新出现的SARS-CoV-2变异毒株的中和抗体反应。

探索性免疫原性目标(1)的终点是结合抗体(酶联免疫吸附测定[ELISA])浓度与中和抗体滴度之间的比率。

探索性免疫原性目标(2)的终点是在D01、D22和D36在用全长S蛋白刺激后在全血中测量的Th1和Th2细胞因子。

探索性免疫原性目标(3)的终点是其他细胞介导的免疫(CMI)评估，所述评估可以通过细胞内细胞因子染色或/和酶联免疫斑点(ELISpot)测定进行。

探索性免疫原性目标(5)的终点是对新出现的变异毒株的中和抗体反应，这将在每个研究干预组的参与者中进行测量，包括评价：

-在每个预定的时间点的个体血清中和滴度；

-在每个预定的时间点相对于D01在疫苗接种后个体血清中和滴度的倍数上升；

-在每个预定的疫苗接种后时间点的血清中和滴度上升2倍和上升4倍[后/前](倍数上升≥2和≥4)；以及

-反应者，定义为基线值低于LLOQ且在每个预定的疫苗接种后时间点的可定量的中和滴度高于测定LLOQ的参与者，和基线值高于LLOQ且在每个预定的疫苗接种后时间点中和抗体滴度增加4倍的参与者。

整体设计

所述研究的整体设计示于表10中。

表10整体设计

计划招募总共720名参与者。在按年龄组(18-59岁和≥60岁)、基线SARS-CoV-2快速血清学诊断测试阳性(阳性/阴性[如在招募时确定的])和高危医疗状况(有/无)分层后，将参与者随机分配到研究组。

对于所有研究组，一半的参与者将是18-59岁，并且一半的参与者将是60岁或以上。此外，在每个研究组中至多20％的参与者可以在招募时的快速血清学诊断测试时呈测试阳性。按年龄组分层的120名快速诊断测试阴性参与者的随机分组的子集(20名参与者/研究组/年龄组)将提供用于细胞免疫反应和粘膜抗体评估的样品。

干预组和持续时间

干预组和持续时间总结于下表11中。指示了每个干预组的所使用的preS dTM抗原的量。

表11计划的样本量和子集的近似大小

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*96/年龄组。

至多24/年龄组。

在基线时SARS-CoV-2血清学诊断测试阴性的参与者将被随机分组至此子集。

所有参与者均接受隔开3周给予的两次疫苗注射：第一次注射在D01(疫苗接种[VAC]1)，并且第二次注射在D22(VAC2)。在每次注射前、最后一次注射后14天、2个月、4个月、6个月、9个月和12个月，从所有参与者中收集血液样品。将从所有参与者中收集的血液样品用于研究中的血清学评估。从参与者的子集中收集全血、外周血单核细胞(PBMC)和唾液样品，以评估细胞免疫反应和粘膜抗体反应。

在试验的持续时间内对所有参与者进行随访，以通过被动监视来捕捉COVID-19的发生情况，其中如果参与者在研究期间的任何时间经历COVID-19样疾病的症状/病症，他们将被指导联系站点。此外，对所有参与者进行主动监视，其中在D43联系后每2周与所有参与者联系一次，以询问关于COVID-19样疾病的发展情况。

每名参与者参与研究的持续时间将是大约在第2次注射后365天(即，总共大约386天)。

分析集

在D01或D01和D22两个时间点对未感染和非未感染SARS-CoV-2者的以下亚组定义适用于所有随机分组的参与者：

参与者分析集是：

1.在基线时未感染SARS-CoV-2者(未感染者-D01)

-通过对D01血清样品进行抗S免疫测定(Roche Elecsys)，呈阴性，

-通过对D01血清样品进行抗N免疫测定，呈阴性，并且

-对D01收集的呼吸道样品的SARS-CoV-2的NAAT，呈阴性。

2.在基线时非未感染SARS-CoV-2者(非未感染者-D01)

-通过对D01血清样品进行抗S免疫测定(Roche Elecsys)，呈阳性，

-通过对D01血清样品进行抗N免疫测定，呈阳性，或者

-对D01收集的呼吸道样品的SARS-CoV-2的NAAT，呈阳性

3.在第二次注射时未感染SARS-CoV-2者(未感染者-D01+D22)

-通过对D01血清样品进行抗S免疫测定(Roche Elecsys)，呈阴性，

-通过对D01和D22血清样品进行抗N免疫测定，呈阴性，并且

-对D01和D22收集的呼吸道样品的SARS-CoV-2的NAAT，呈阴性。

4.在第二次注射时非未感染SARS-CoV-2者(非未感染者-D01/D22)

-通过对D01血清样品进行抗S免疫测定(Roche Elecsys)，呈阳性，

-通过对D01或D22血清样品进行抗N免疫测定，呈阳性，或者

-对D01或D22收集的呼吸道样品的SARS-CoV-2的NAAT，呈阳性。

所定义的群体包括以下：

1.全分析集(FAS)：所有接受至少一次研究注射的随机分组的参与者；参与者将根据他们随机分组的干预

进行分析。

2.符合方案分析集(PPAS)：FAS的子集；呈现至少一项以下标准的参与者将被排除在PPAS之外：

-参与者不符合所有方案规定的纳入标准或符合至少一项方案规定的排除标准，

-参与者不接受两次注射，

-参与者接受了与他/她被随机分组接受的疫苗不同的疫苗，

-未按照方案制备和/或施用疫苗，

-参与者未在适当的时间窗口内接受疫苗，

-未收集D01或D36血液样品的参与者，

-尽管符合任何明确的禁忌症标准，但参与者仍接受了第二次注射的，以及

-参与者在D36之前接受授权/批准的COVID-19疫苗。

实施例10：II期数据

来自根据以上实施例中所述的方案进行的II期临床研究的数据表明，在720名志愿者的所有成年人年龄组中CoV2 preS dTM AS03成功地展现出强烈的免疫反应。

在所述研究中，在水性磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中提供了CoV2 preS dTM。以0.25mL的溶液提供了每个剂量的抗原(5、10或15μg)，并且在床边与0.25mL的AS03混合。混合后的每个疫苗接种剂量具有表12所示的组成。在2个小瓶的盒子中的单独小瓶中提供了抗原溶液和佐剂。将小瓶在2℃至8℃下储存。

表12 CoV2 preS dTM AS03配制品

*这对应于0.26mg无水磷酸氢二钠，其也可以用于制备配制品。

安全性数据证明三个处理组(5、10或15μg抗原+AS03)的安全性概况类似。在所述研究中，存在两例直接相关的反应；但是在所述研究中没有特别关注的不良事件(AESI)，没有严重不良事件(SAE)，并且没有导致研究中止的不良事件(AE)。存在有限数量的3级未征集的相关反应和相关的医学上关注的不良事件(MAAE)。在所有处理组中的反应原性是类似的(图17)。与≥60岁组相比，18-59岁组中征集的反应的频率和强度更高(图18)。第2次注射后征集的反应的频率和强度也有所增加(图19)。

免疫原性数据表明年轻人和老年人的血清转化率和反应者比率均很高。在符合方案分析集(PPAS)-未感染者D1+D22中的第2剂后(D36)反应在年轻人和老年人中显示出超过95％的血清转化率和反应者比率，并且在三个处理组之间没有差异(表13；CI＝置信区间)。

表13所有年龄组的血清转化率

所有处理组的抗体反应数据(如由在PPAS-未感染者D1+D22中在Monogram PsVN测定中的第2剂后中和抗体滴度所指示的)示于下表14中(“GMT”：几何平均滴度)。在探索性分析中，在一组人恢复期血清样品中测量到了中和抗体滴度。在COVID-19的PCR阳性诊断后的第17天与第47天之间，从79名捐赠者获得恢复期样品。捐赠者已经康复(临床严重程度范围为从轻度至重度)并且在样品收集时没有症状。

数据表明，在低剂量组，参与者达到了与在恢复期血清中观察到的类似的中和抗体滴度。在18-59岁年龄组中，GMT几乎高达恢复期血清组的两倍。

表14跨处理组的抗体反应

以上数据表明，在未感染的参与者中，在年轻人和老年人中血清转化率均>95％，并且在处理组之间没有观察到差异。与60岁及以上的那些相比，18-59岁中的抗体滴度的量级更高。在60岁及以上(而不是18岁及以上)组的处理组之间没有观察到量级增加。在18-59岁组中在较高抗原剂量的情况下观察到增加。

在非未感染的参与者中也评价了CoV2 preS dTM AS03组合物。表15中的数据表明，低剂量组中的参与者在仅注射一次后中和抗体便显著增加(如在(Monogram PsVN测定)中所测量的)，其中在第22天的GMT为35,275。此GMT是表14所示的恢复期血清组的15倍。

表15非未感染的群体(FAS)中的中和抗体

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*GMTR：几何平均滴度比率。FAS：全分析集。

非未感染的参与者的数据表明，单次注射后18-59岁和≥60岁年龄组的抗体滴度的量级均≥5,000。在处理组之间没有观察到差异。

这些结果表明，CoV2 preS dTM AS03在所有成年人年龄组(包括60岁及以上的那些和有在先感染的那些)中均引发了高中和抗体反应。免疫原性组合物没有显示出安全性问题，其中在所测试的所有三个剂量水平上均具有良好耐受的安全性概况。所述II期研究表明，在所有年龄组和所有剂量下，第二次注射后的血清转化率为95％至100％。在先前有SARS-CoV-2感染证据的参与者中，单个疫苗剂量后产生了显著更高的抗体反应，这表明了作为加强疫苗开发的潜力很大。

2期数据确认了CoV2 preS dTM AS03免疫原性组合物在解决全球公共卫生危机方面发挥作用的潜力，因为众所周知将需要多种疫苗，尤其是由于变体不断出现以及需要加强疫苗。基于这些积极的2期结果，将在超过35,000名参与者中在全球3期研究中进一步评价10μg剂量水平。

实施例11：变体单价(B.1.351)和二价(D614+B.1.351)疫苗在非人灵长类动物中的免疫原性

在未感染的非人灵长类动物(NHP)中进行了一项免疫原性研究(CoV2-06_NHP)，以评估在AS03的存在下变体单价疫苗(B.1.351)的免疫原性以及当与D614 preS dTM抗原以二价配制品(D614+B.1.351)合并时的潜在的负面干扰。在抗体反应的峰值(第34天)，测量了针对这两种病毒(D614和β)以及其他所关注的变体(VoC)α、γ和δ的中和抗体滴度。在单价配制品与二价配制品之间比较了针对D614毒株的中和滴度(在来自Nexelis的VSV-假病毒合格的测定中获得)，以评价在二价配制品中的每种组分对另一种组分的免疫原性的影响。

研究设计

将五十四只二至八岁的成年毛里求斯食蟹猴(雄性和雌性)按年龄、体重和性别随机分组。将九组食蟹猴(每组六只)用在AS03的存在下的三种疫苗配制品(D614、B.1.351和二价的)以每种组分2.5、5和10μg的剂量进行免疫(表16)。通过肌内途径在三角肌中给予隔开三周的两次注射，两次施用在同一侧，剂量为0.5mL。

表16 CoV2-06_NHP研究组

在整个研究中监测动物的不良事件的任何临床体征。在研究前以及D2、D21、D23和D34收集血液样品用于血细胞计数和化学参数。在D21和D34收集血液样品用于抗体滴定。在ELISA中测量了针对GCN4-刺突蛋白的结合IgG水平，并且在D34使用PsV中和测定(SP REICambridge)测量了针对D614、D614G、α、β、γ和δ变体的中和抗体。平行地，在合格的D614PsV中和测定(Nexelis)中滴定了样品以定量对D614滴度的干扰。所使用的这两种中和测定的特征示于下表17中。

表17 用于CoV2-06_NHP研究的中和测定

测定	Nexelis	SP REI Cambridge
			病毒	VSV-PsV	慢病毒-PsV
细胞	Vero	293-ACE2
			合格	是	否
毒株	D614	D614G、α、γ、β、δ

结果

在研究期间没有观察到临床体征，并且血液学和临床化学参数以及体温没有显示出任何关注的安全性信号。在第一次注射后三周(D21)，所有食蟹猴均产生了(mounted)S结合抗体，如通过ELISA所测量的，除在2.5μg B.1.351单价疫苗组中的一只食蟹猴之外。平均ELISA滴度范围为从3.5至4.1Log₁₀ EU(数据未显示)。在第二次注射后两周(D34)，与D21相比，在所有组中S结合抗体滴度均增加了，并且范围为从4.9至5.4Log₁₀ EU。在剂量与疫苗配制品之间的ELISA滴度方面没有观察到统计学上显著的差异。

在第二次注射后两周(D34)，在两种中和测定(合格的VSV-PsV和慢病毒-PsV)中均测量到了针对亲本毒株D614的中和抗体(NAb)(图20)，并且在慢病毒-PsV测定中测量到了针对亲本毒株D614G、α、β、γ和δ变体的中和抗体(图21)。

根据疫苗配制品，在各个水平下，在D34在所有食蟹猴中均检测到了D614 VSV-PsVNAb滴度。对于三种配制品(单价的D614和B.1.351配制品和二价的D614+B.1.351配制品)从每种组分2.5至10μg没有观察到剂量效应。D614 VSV-PsV中和滴度在单价的D614疫苗组中最高，所有三个剂量水平的平均滴度为3.6Log₁₀；在B.1.351单价组中最低，平均滴度为2.5Log₁₀；并且在二价疫苗组中中等，平均滴度为3.1Log₁₀。当在每种组分的相同剂量下比较二价的和单价的D614疫苗时，在2.5μg剂量水平(单价的D614 2.5μg和二价的2.5μg+2.5μg)下，D614 NAb滴度的差异是统计学上显著的(5.4倍，p值<0.001)。在两个其他剂量水平(5μg和10μg的D614组分)下，差异较低(2倍)并且不是统计学上显著的。

相比之下，在所有剂量水平下，与单价的B.1.351疫苗相比，在二价疫苗中D614VSV-PsV NAb滴度的增加是统计学上显著的(3.6至5.3倍，p值<0.05)。当合并所有三个剂量水平时，与单价的D614疫苗组中的滴度相比，在二价疫苗的情况下观察到的D614 VSV-PsV中和滴度下降3倍(p值<0.001)，但是它们是由单价的B.1.351疫苗诱导的滴度的4.1倍(p值<0.001)。

在慢病毒-PsV中和测定中在2.5μg剂量水平下(3.8倍，p值<0.01)以及对于合并的所有三个剂量(2.3倍，p值<0.005)确认了与单价的D614疫苗相比，在VSV-PsV测定中在二价疫苗的情况下观察到的D614 NAb滴度的中等下降。与VSV-PsV测定的结果类似，在慢病毒-PsV测定中，在所有三个剂量水平(2.9至5.3倍，p值<0.01)和合并的所有三个剂量(4.3倍，p值<0.001)下确认了与单价的B.1.351疫苗相比D614 NAb滴度的增加。在单价的B.1.351 5μg组中的一只动物具有无法检测到的D614 NAb滴度，并且同一只动物在VSV-PsV测定中针对D614的滴度较低，并且针对D614G和所有VoC的滴度较低。

在慢病毒-PsV中和测定中还评估了对β变体和其他已知VoC(α、γ和δ)的中和作用。对于每种疫苗配制品，针对α和δ变体的NAb滴度遵循与针对D614G的滴度相同的模式：单价的D614疫苗最高，单价的B.1.351疫苗最低，并且二价疫苗中等。针对α和δ变体的滴度仅略低于针对D614G毒株的滴度(分别类似于低2.5倍和低1.2至4.9倍)。针对β和γ变体的滴度对于单价的D614疫苗最低，而对于单价的B.1.351疫苗最高。二价疫苗所诱导的β和γNAb滴度与单价的B.1.351疫苗在相同的水平下。

总体而言，与单价的D614疫苗相比，二价疫苗所诱导的针对亲本毒株的NAb滴度略低(2至3倍，取决于测定)，针对β和γ变体的滴度高得多，并且对两种最广泛循环的变体α和δ的中和作用相当。与单价的B.1.351疫苗相比，二价疫苗所诱导的针对亲本D614毒株和D614G毒株以及针对α和δ变体的NAb滴度高得多(表18)。

表18在二价相比于单价疫苗中NAb滴度的倍数变化*

*合并的所有剂量。÷：倍数下降，x：倍数增加，p：p值，NS：不是统计学上显著的。

除非说明，否则使用基于慢病毒的PsV测定来测定NAb滴度。

总而言之，这些在未感染的NHP中生成的数据表明了对迄今为止已知的所有关注的变体的平衡的中和作用。考虑到高度动态的流行病学，二价疫苗(D614+B.1.351)需要针对初次疫苗接种进行进一步的临床研究，因为它可以降低疫苗逃逸的风险。确实，随着由于疫苗接种和自然感染α和δ变体的D614样刺突的血清阳性率增加，疫苗逃逸变体(诸如β和γ)可能在未来成为主导，尤其是如果与抗体逃逸相关的突变(诸如E484K)和与增加的传播性相关的突变(如δ变体中存在的)相结合的话。

实施例12：NHP变体加强剂研究

此实施例描述了评价在用不同的疫苗平台进行初次疫苗接种后单价的和二价的CoV2 preS dTM-AS03疫苗(D614、B.1.351或D614+B.1.351)作为加强剂的用途的研究(CoV2-07_NHP和CoV2-08_NHP)。尽管在初次疫苗接种中清楚地证明了AS03诱导稳健的免疫反应的益处，但在这里评价了AS03在增强免疫反应中的作用，以确定佐剂是否可用于加强方案中。

在用COVID-19 mRNA-LNP候选疫苗免疫的食蟹猴(CoV2-07_NHP，mRNA初免的群组)中和在用CoV2 preS dTM-AS03疫苗免疫的恒河猴(CoV2-08_NHP，亚单位初免的群组；武汉毒株)中评价了加强免疫。两个群组均在初次疫苗接种后约7个月接受了加强剂注射。

研究设计

在CoV2-07_NHP研究中，将先前接种了COVID-19 mRNA-LNP候选疫苗(Kalnin等人,NPJ Vaccines(2021)6(1):61)的16只毛里求斯食蟹猴(八只雄性和八只雌性，四至十岁)随机分为四组，每组四只食蟹猴。仅选择在初次疫苗接种后两周(D35)产生针对亲本D614病毒的中和抗体反应的动物用于所述研究。

在CoV2-08-NHP研究中，将先前用CoV2 preS dTM-AS03(武汉毒株)免疫的24只印度恒河猴(雄性，2.7至4岁)随机分为五组，每组四至五只恒河猴。

在两个群组中，随机分组是基于基线特征(性别和年龄)和初次免疫后以及加强剂疫苗接种前一个月的中和反应。不同的组接受了一个剂量的CoV2 preS dTM疫苗配制品，如表19中所述。

表19 NHP加强剂研究组

在整个研究中监测动物的不良事件的任何临床体征。在加强剂注射前、注射后D2、D7、D14、D21和D28收集血液样品用于血细胞计数和化学参数。在D7、D14、D21和D28收集血液样品用于对SARS-CoV-2D614G、α、β、γ和δ变体进行结合和慢病毒-PsV中和抗体滴定。

结果

在研究期间没有观察到临床体征，并且血液学和临床化学参数以及体温没有显示出任何关注的安全性信号。

在加强剂后四周每周测量一次针对D614G毒株和B.1.351变体的S结合IgG滴度和NAb滴度，并且与初次疫苗接种后(D35)或在基线时(即，初次免疫后七个月)(分别地，在mRNA初免的群组中的D205和在亚单位初免的群组中的D196)的峰值滴度进行了比较。S结合IgG滴度示于图22中，并且D614G和B.1.351 NAb滴度示于图23中。在人恢复期血清中测量到的S结合和D614 NAb滴度表示在相应的图中。

在初次疫苗接种后七个月(D205或D196，表示基线)，两个群组中的S结合滴度均有所下降，但是在大多数动物中仍然有检测到。无论疫苗配制品如何，加强免疫早在D7便在所有动物中增加了S结合滴度。在AS03的存在下，增加更加显著(在mRNA初免的群组中为3.5倍，不是统计学上显著的；并且在亚单位初免的群组中为5.7倍，p<0.05)。高IgG滴度在D7与D28(所分析的最终时间点)之间是稳定的。

与S结合滴度一致，D614G NAb滴度在两个群组中在初次疫苗接种后七个月(D205或D196)均有所下降，并且来自mRNA初免的群组的一些动物的滴度呈阴性。在此时间点，B.1.351 NAb滴度在mRNA初免的群组中均无法检测到，并且在亚单位初免的群组中无法检测到或很低。

在加强剂后一周，在来自两个群组的所有接种组中，针对两种毒株(D614G和B.1.351)的NAb滴度均强烈增加，除来自用加有AS03佐剂的单价的D614加强的mRNA初免的群组的一只动物之外(仅在D14检测到B.1.351 NAb滴度，而D614G NAb滴度在与其他动物相同的范围内)。重要的是，在所有组和两个群组中，增加至少稳定4周(所测试的最终时间点)。

为了探索中和反应的广度，在加强剂后两周分析了针对其他已知VoC(α、γ和δ)和SARS-CoV-1的NAb滴度，并且与在相同的时间点的针对D614G和B.1.351的NAb滴度进行了比较(图24)。确认两种原型毒株(D614G和B.1.351)的结果，在用所有疫苗配制品进行加强免疫后测量到了针对其他变体的高NAb滴度。

数据表明，在疫苗初免的猕猴中，第三次注射多种疫苗配制品(未加佐剂的单价的B.1.351、加有AS03佐剂的单价的D614或B.1.351、或二价的)诱导了针对亲本D614毒株的初始NAb反应的强烈回忆，将中和作用扩展到β变体和所有其他已知VoC(α、γ和δ)以及SARS-CoV-1。

与未加佐剂的单价配制品相比，加有AS03佐剂的配制品诱导了更高的NAb滴度(与基线相比D614G NAb滴度增加是统计学上显著的-在mRNA初免的群组和亚单位初免的群组中分别是6.5倍和8.1倍)。

在含有B.1.351S抗原的疫苗(单价的或二价的)的情况下观察到针对β和γ变体的更高反应的趋势，其中在加强剂后两周在两个群组中针对VoC的平均NAb滴度均大于3.5Log₁₀，并且针对D614G的平均NAb滴度大于4.0Log₁₀。与单价的D614或B.1.351相比，在二价疫苗中没有观察到对NAb反应的干扰(阴性或阳性)。

重要的是，在加强剂后每周测量的Ab滴度(针对D614G和β的S结合和NAb)从D7至D28似乎是稳定的，这表明它们早在D7便达到了平台期。所述观察结果在用不同疫苗平台(mRNA和亚单位)免疫的猕猴中重现，但是在加强免疫时针对变体的NAb反应很低至无法检测到。

序列表

SEQ ID NO	描述
		1	SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列(武汉)
2	SARS-CoV-2 S蛋白信号肽氨基酸序列
		3	突变型几丁质酶信号肽氨基酸序列
4	SARS-CoV-2 S蛋白胞外域氨基酸序列
		5	RRAR
6	GSAS
		7	折叠子氨基酸序列
8	野生型折叠子编码序列
		9	密码子优化的折叠子编码序列
10	preS dTM氨基酸序列
		11	野生型几丁质酶信号肽氨基酸序列
12	多角体蛋白启动子突发序列
		13	源自B.1.351的重组S蛋白质氨基酸序列
14	gBlock pPSC12-DB 3'片段序列
		15	F1-gBlock-5'片段序列
16	F1-gBlock-3'片段序列
		17	F2-gBlock-5'片段序列
18	F2-gBlock-3'片段序列
		19	F3-gBlock-5'片段序列
20	F3-gBlock-3'片段序列
		21	gBlock pPSC12-DB 5'片段1序列
22	F3b-gBlock-3'片段序列
		23	gBlock pPSC12-DB 5'片段2序列

序列表

<110> 圣诺菲·帕斯图尔公司(SANOFI PASTEUR INC.)

葛兰素史密斯克莱生物股份有限公司(GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA)

<120> 含有含生育酚的角鲨烯乳剂佐剂的COVID-19疫苗

<130> 025532.WO005

<140>

<141>

<150> 63/215,092

<151> 2021-06-25

<150> 63/189,044

<151> 2021-05-14

<150> 63/184,155

<151> 2021-05-04

<150> 63/069,171

<151> 2020-08-24

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2

<400> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 3

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<212> PRT

<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2

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<213> 人工序列

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<212> DNA

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<220>

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<400> 18

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<221> 来源

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<400> 19

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<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成寡核苷酸"

<400> 20

atgagcaggt atataaatga gtaattaatt aagtaccgac tctgctgaag aggagga 57

<210> 21

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成寡核苷酸"

<400> 21

gtaattaatt aagtaccgac tctgctgaag aggaggaaat tctccttgaa gtttccc 57

<210> 22

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成寡核苷酸"

<400> 22

tattcctttc taccttttta taattaatta agtaccgact ctgctgaaga ggagga 56

<210> 23

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成寡核苷酸"

<400> 23

taattaatta agtaccgact ctgctgaaga ggaggaaatt ctccttgaag tttccc 56

Claims (55)

1.一种免疫原性组合物，所述组合物包含

(a)一种、两种、三种或更多种重组SARS-CoV-2蛋白，其中一种或多种的所述蛋白质是多肽的三聚体，所述多肽从N末端至C末端包含，

(i)与SEQ ID NO:10的残基19-1243至少95％相同的序列，其中SEQID NO:10的位置687-690处的残基GSAS(SEQ ID NO:6)和SEQ ID NO:10的位置991和992处的残基PP被维持在所述序列中；和

(ii)三聚化结构域，其中所述三聚化结构域包含SEQ ID NO:7；以及

(b)佐剂，其中所述佐剂是包含生育酚和角鲨烯的水包油乳剂。

2.一种免疫原性组合物，所述组合物包含

(a)一种、两种、三种或更多种重组SARS-CoV-2S蛋白，各自通过包括以下的方法产生：

向昆虫细胞中引入用于表达多肽的杆状病毒载体，所述多肽从N末端至C末端包含(i)源自昆虫或杆状病毒蛋白的信号肽；(ii)与SEQ IDNO:10的残基19-1243至少95％相同的序列，其中SEQ ID NO:10的位置687-690处的残基GSAS(SEQ ID NO:6)和SEQ ID NO:10的位置991和992处的残基PP被维持在所述序列中；和(iii)三聚化结构域，其中所述三聚化结构域包含SEQ ID NO:7；

将所述昆虫细胞在允许使所述多肽表达和三聚化的条件下培养；以及

将所述重组SARS-CoV-2S蛋白从所述培养物中分离，其中所述重组SARS-CoV-2S蛋白是不含所述信号序列的所述多肽的三聚体；以及

(b)佐剂，其中所述佐剂是包含生育酚和角鲨烯的水包油乳剂。

3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述杆状病毒载体包含可操作地与所述多肽的编码序列连接的多角体蛋白启动子。

4.根据权利要求2或3所述的免疫原性组合物，其中所述昆虫或杆状病毒蛋白是几丁质酶。

5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述信号肽包含SEQ ID NO:3。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫原性组合物，其中组合物包含

(i)重组SARS-CoV-2蛋白，所述蛋白质是包含或具有与SEQ ID NO:10的残基19-1243相同的序列的多肽的三聚体，

(ii)重组SARS-CoV-2蛋白，所述蛋白质是包含或具有与SEQ ID NO:13的残基19-1240相同的序列的多肽的三聚体，或

(iii)任选地等量的(i)和(ii)二者。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫原性组合物，其中对于每0.5mL或每个剂量的所述组合物，所述组合物包含以下或通过将以下混合而制备：

(i)抗原组分，所述抗原组分包含约2μg至约50μg、任选地约2.5μg至约50μg或约5μg至约50μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2S蛋白中的每一种；以及

(ii)水包油乳剂佐剂，所述佐剂包含以下或通过将以下混合而制备：

a)在磷酸盐缓冲盐水中的10.69mg角鲨烯、4.86mg聚山梨醇酯80和11.86mgα-生育酚，任选地如表9所示，进一步任选地其中所述佐剂以0.25mL提供，

b)在磷酸盐缓冲盐水中的5.35mg角鲨烯、2.43mg聚山梨醇酯80和5.93mgα-生育酚，任选地如表9所示，进一步任选地其中所述佐剂以0.25mL提供，

c)在磷酸盐缓冲盐水中的2.67mg角鲨烯、1.22mg聚山梨醇酯80和2.97mgα-生育酚，任选地如表9所示，进一步任选地其中所述佐剂以0.25mL提供，或

d)在磷酸盐缓冲盐水中的1.34mg角鲨烯、0.61mg聚山梨醇酯80和1.48mgα-生育酚，任选地如表9所示，进一步任选地其中所述佐剂以0.25mL提供。

8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中对于每0.5mL或每个剂量的所述组合物，所述组合物包含2.5、5、10、15或45μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2S蛋白中的每一种。

9.根据权利要求7或8所述的免疫原性组合物，其中所述抗原组分包含以下或通过将以下混合而制备：

0.097mg磷酸二氢钠一水合物，

0.26mg无水磷酸氢二钠，

2.2mg氯化钠，

550μg聚山梨醇酯20，和

约0.25mL水。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的免疫原性组合物，其中对于每0.5mL或每个剂量的所述组合物，所述组合物包含总共5μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2S蛋白，任选地其中所述组合物包含等量的两种不同的重组SARS-CoV-2S蛋白。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的免疫原性组合物，其中对于每0.5mL或每个剂量的所述组合物，所述组合物包含总共10μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2S蛋白，任选地其中所述组合物包含等量的两种不同的重组SARS-CoV-2S蛋白。

12.一种容器，所述容器含有根据权利要求1-11中任一项所述的免疫原性组合物。

13.根据权利要求12所述的容器，其中所述容器是小瓶或注射器。

14.根据权利要求12或13所述的容器，其中所述容器含有单个剂量的所述免疫原性组合物，任选地所述单个剂量的体积是0.5mL。

15.根据权利要求12或13所述的容器，其中所述容器含有多个剂量的所述免疫原性组合物，任选地所述剂量中的每一个的体积是0.5mL。

16.一种用于肌内疫苗接种的试剂盒，其中所述试剂盒包含两个容器，其中(a)第一容器含有包含一种、两种、三种或更多种重组SARS-CoV-2S蛋白的药物组合物，其中一种或多种的所述蛋白质是多肽的三聚体，所述多肽从N末端至C末端包含，

(i)与以下至少95％相同的序列：

(A)SEQ ID NO:10的残基19-1243，其中SEQ ID NO:10的位置687-690处的残基GSAS(SEQ ID NO:6)和SEQ ID NO:10的位置991和992处的残基PP被维持在所述序列中，或

(B)SEQ ID NO:13的残基19-1240，其中SEQ ID NO:13的位置684-687处的残基GSAS(SEQ ID NO:6)和SEQ ID NO:13的位置988和989处的残基PP被维持在所述序列中；和

(ii)三聚化结构域，其中所述三聚化结构域包含SEQ ID NO:7；并且

(b)第二容器含有包含生育酚和角鲨烯的水包油佐剂。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述第一容器包含

(i)重组SARS-CoV-2蛋白，所述蛋白质是包含或具有与SEQ ID NO:10的残基19-1243相同的序列的多肽的三聚体，

(ii)重组SARS-CoV-2蛋白，所述蛋白质是包含或具有与SEQ ID NO:13的残基19-1240相同的序列的多肽的三聚体，或

(iii)任选地等量的(i)和(ii)二者。

18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其中所述第一容器包含一个或多个剂量的所述一种或多种重组SARS-CoV-2S蛋白，其中每个剂量的所述一种或多种蛋白质是在0.25mL的磷酸盐缓冲盐水中提供的总共约2.5至45、任选地5至45μg，任选地如表A、表8或表12所示。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中每个剂量的所述蛋白质是总共2.5、5、10、15或45μg。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的试剂盒，其中所述第二容器包含一个或多个剂量的所述佐剂，其中每个剂量的所述佐剂的体积是0.25mL并且包含

(a)在磷酸盐缓冲盐水中的10.69mg角鲨烯，

4.86mg聚山梨醇酯80，和

11.86mgα-生育酚，任选地如表9所示；

(b)在磷酸盐缓冲盐水中的5.35mg角鲨烯，

2.43mg聚山梨醇酯80，和

5.93mgα-生育酚，任选地如表9所示；

(c)在磷酸盐缓冲盐水中的2.67mg角鲨烯，

1.22mg聚山梨醇酯80，和

2.97mgα-生育酚，任选地如表9所示；或

(d)在磷酸盐缓冲盐水中的1.34mg角鲨烯，

0.61mg聚山梨醇酯80，和

1.48mgα-生育酚，任选地如表9所示。

21.一种制造疫苗试剂盒的方法，所述方法包括：

提供根据权利要求1-11中任一项所述的免疫原性组合物的一种或多种重组S蛋白和佐剂，以及

将所述蛋白质和所述佐剂包装到单独的无菌容器中。

22.一种预防或改善有需要的受试者的COVID-19的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防有效量的根据权利要求1-11中任一项所述的免疫原性组合物。

23.一种预防或改善有需要的受试者的COVID-19的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防有效量的根据权利要求1-11中任一项所述的免疫原性组合物，其中在所述施用步骤之前，所述受试者已经感染SARS-CoV-2或已经接种第一COVID-19疫苗。

24.根据权利要求23所述的方法，其中在所述施用步骤之前，所述受试者已经接种基因疫苗、亚单位疫苗或灭活疫苗。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述受试者已经接种包含编码重组SARS-CoV-2S抗原的mRNA的基因疫苗。

26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述施用步骤在感染后或在所述受试者接种所述第一COVID-19疫苗后4周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年或更长时间，任选地四至十个月，进一步任选地八个月进行，任选地其中所述免疫原性组合物包含2.5或5μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2S蛋白中的每一种，并且进一步任选地其中所述免疫原性组合物是单价的或多价的。

27.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中以每剂约5至约50μg或约2.5至约50μg，任选地2.5、5、10、15或45μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2S蛋白向所述受试者肌内施用所述免疫原性组合物。

28.根据权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述预防有效量以单个剂量或以两个或更多个剂量施用，任选地肌内施用。

29.根据权利要求28所述的方法，所述方法包括以约两周至约三或四个月的间隔向所述受试者施用两个剂量的所述免疫原性组合物，其中每个剂量的所述免疫原性组合物包含总共2.5、5或10μg的所述一种或多种重组SARS-CoV-2S蛋白。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述间隔是约三周或约21天、或约四周或约28天、或约一个月。

31.根据权利要求22-30中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类受试者，任选地其中所述人类受试者是儿童、成年人或老年人。

32.根据权利要求1-11中任一项所述的免疫原性组合物，用于在预防性治疗COVID-19中、任选地在根据权利要求22-31中任一项所述的方法中使用。

33.根据权利要求1-11中任一项所述的免疫原性组合物用于制造用以预防性治疗COVID-19、任选地用于根据权利要求22-31中任一项所述的方法中的药剂的用途。

34.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述生育酚是α-生育酚，任选地D,L-α-生育酚。

35.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述佐剂的平均液滴尺寸小于1μm，任选地其中所述平均液滴尺寸是小于500nm、小于200nm、50至200nm、120至180nm或140至180nm。

36.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述佐剂的多分散性指数是0.5或更小、或0.3或更小，诸如0.2或更小。

37.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述佐剂包含选自以下的表面活性剂：泊洛沙姆401、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇三油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯12鲸蜡基/硬脂基醚，单独地或与彼此组合地或与其他表面活性剂组合地。

38.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述佐剂包含选自以下的表面活性剂：聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇三油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯12鲸蜡基/硬脂基醚，单独地或与彼此组合地。

39.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述佐剂包含聚山梨醇酯80。

40.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中佐剂包含一种、两种或三种表面活性剂。

41.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中在所述佐剂中的角鲨烯与生育酚的重量比是0.1至10，任选地0.2至5、0.3至3、0.4至2、0.72至1.136、0.8至1、0.85至0.95、或0.9。

42.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中在所述佐剂中的角鲨烯与表面活性剂的重量比是0.73至6.6，任选地1至5、1.2至4、1.71至2.8、2至2.4、2.1至2.3、或2.2。

43.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中在单个剂量的所述佐剂中的角鲨烯的量是至少1.2mg，任选地1.2至20mg、1.2至15mg、1.2至2mg、1.21至1.52mg、2至4mg、2.43至3.03mg、4至8mg、4.87至6.05mg、8至12.1mg或9.75至12.1mg。

44.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中在单个剂量的所述佐剂中的生育酚的量是至少1.3mg，任选地1.3至22mg、1.3至16.6mg、1.3至2mg、1.33至1.69mg、2至4mg、2.66至3.39mg、4至8mg、5.32至6.77mg、8至13.6mg或10.65至13.53mg。

45.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中在单个剂量的所述佐剂中的表面活性剂的量是至少0.4mg，任选地0.4至9.5mg、0.4至7mg、0.4至1mg、0.54至0.71mg、1至2mg、1.08至1.42mg、2至4mg、2.16至2.84mg、4至7mg或4.32至5.68mg。

46.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述佐剂包含以下或基本上由以下组成：

角鲨烯；

生育酚，任选地D,L-α-生育酚；

表面活性剂，任选地聚山梨醇酯80；和

水。

47.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中用于肌内注射的单个剂量的体积是0.05至1mL，任选地0.1至0.6mL、0.2至0.3mL、0.25mL、0.4至0.6mL、或0.5mL。

48.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述免疫原性组合物或所述第一容器和所述第二容器的内容物的混合物的pH是4至9，任选地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4。

49.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述免疫原性组合物或所述第一容器和所述第二容器的内容物的混合物的重量摩尔渗透压浓度是250至750mOsm/kg，任选地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg。

50.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述免疫原性组合物或所述第一容器和所述第二容器的内容物的混合物所包含的角鲨烯是0.8至100mg/mL，任选地1.2至48.4mg/mL、10至30mg/mL、或21.38mg/mL。

51.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中在与所述重组S蛋白混合之前，用于肌内注射的单个剂量的所述佐剂的体积是0.05mL至1mL，任选地0.1至0.6mL、0.2至0.3mL、0.25mL、0.4至0.6mL、或0.5mL。

52.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中在与所述重组S蛋白混合之前，所述佐剂

具有4至9，任选地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4的pH；

具有250至750mOsm/kg，任选地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度；

包含缓冲剂和/或张力调节剂，任选地改良的磷酸盐缓冲盐水，任选地如表9所示；

具有0.8至100mg/mL、任选地1.2至48.4mg/mL的角鲨烯浓度；并且

具有0.05mL至1mL、任选地0.1至0.6mL的单剂量体积。

53.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，其中所述重组S蛋白提供在水性液体溶液中，所述水性液体溶液在与所述佐剂混合之前具有

0.2至0.3mL、任选地0.25mL，0.4至0.6mL，或0.5mL的单剂量体积；

4至9，任选地5至8.5、5.5至8或6.5至7.4的pH；和

250至750mOsm/kg，任选地250至550mOsm/kg、270至500mOsm/kg或270至400mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。

54.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，用于治疗未感染SARS-CoV-2的受试者。

55.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、用于所述用途的免疫原性组合物、容器、试剂盒、方法或用途，用于在有需要的人类受试者中引发免疫反应，所述免疫反应

部分或完全降低一种或多种COVID-19症状的严重程度和/或所述受试者经历一种或多种COVID-19症状的时间，

降低攻击后患上已建立的感染的可能性，

减慢疾病的进展、任选地延长存活期，

产生针对SARS-CoV-2的中和抗体，和/或

是SARS-CoV-2S蛋白特异性T细胞反应。