CN117062843A

CN117062843A - 用于预防感染与治疗长期新冠肺炎的针对SARS-CoV-2变体的疫苗组合物

Info

Publication number: CN117062843A
Application number: CN202280004828.7A
Authority: CN
Inventors: 王长怡; 彭文君
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-10-12
Filing date: 2022-10-07
Publication date: 2023-11-14

Abstract

本发明是针对来自SARS‑CoV2 S1‑RBD关切变体(VoCs)，包括奥密克戎变体BA.4/BA.5蛋白与N、M及S2衍生的Th与CTL表位肽以及理想化病原体衍生的人工Th表位肽的氨基酸序列，以提供针对SARS‑CoV2 S1‑RBD关切变体，包括SARS‑CoV2奥密克戎变体BA.4/BA.5的特异性的有效避免与远程COVID的治疗。本发明的疫苗组合物利用氨基酸序列设计与制造最佳的SARS‑CoV‑2抗原蛋白、Th/CTL肽免疫原建构体、CHO‑衍生的S1‑RBD VoCs‑sFc蛋白，包括S1‑RBD奥密克戎变体BA.4/BA.5‑scFc蛋白及其组合物，作为用于避免与长期COVID之治疗的疫苗。

Description

用于预防感染与治疗长期新冠肺炎的针对SARS-CoV-2变体的疫苗组合物

技术领域

本发明涉及针对关切的SARS-CoV-2变体(VoCs)，包括SARS-CoV-2奥密克戎奥密克戎BA.4/BA.5变体的预防感染与治疗长期COVID的疫苗。

背景技术

SARS是2003年为严重急性呼吸系统症候群创建的简称，也称为COVID，是2020年为冠状病毒传染病创建的简称。该疾病最初可能几乎没有症状或没有症状，或者可能发展为发烧、咳嗽、呼吸急促、肌肉疼痛与疲倦。并发症可能包括肺炎与急性呼吸窘迫症候群。SARS-CoV-2被称为严重急性呼吸系统症候群冠状病毒2(SARS-CoV-2)。

SARS-CoV-2奥密克戎谱系从BA.1、BA.2，再到现在的BA.4/BA.5，其占SARS感染病例的90％以上，在传播性和中和抗体逃逸方面具有压倒性的优势。随附发明人小组(Wang,CY et al 2022a and b)的最新出版物以及连同包含于此的文献引用，以便于背景参考。

虽然加强第三剂的mRNA SARS疫苗可以补偿奥密克戎(BA.1)引起的血清中和抗体的减少(减少20-30倍)，当与COVID-19原始分离毒株相比，以及住院率和严重疾病(80-90％的保护)，它对轻度与无症状感染的保护效果较差(40-50％的保护)。即使在第四次接种后(对18岁及以上的成年人进行第二次加强)，以高病毒载量确定的突破性感染也很常见。

目前的疫苗是依据COVID-19原始病毒抗原制造，可解释抗原变体(如贝塔(Beta)、德尔塔(Delta)或奥密克戎)快速感染的病例，并且对中和抗体更有抗性。感染关切SARS-CoV-2变体(VoC)(https://en.wikipedia.org/wiki/Variants_of_SARS-CoV-2)的个体在其鼻腔通道中携带的病毒数量是其他变体的数倍。在这些VoCs中，奥密克戎变体(https://en.wikipedia.org/wiki/SARS-CoV-2_奥密克戎_varianthas)与COVID-19原始分离株相比共有60个突变，其中32个突变影响刺突蛋白，其具有许多疫苗广泛使用的主要抗原靶点。

奥密克戎BA.1与SARS-CoV-2原始分离株相比有严重的突变，包括S蛋白中超过35个氨基酸的变化。与S-1受体结合域(S1-RBD，残基319-541)的2个突变有关，BA.1和BA.2共享12个突变，BA.1与BA.2分别有额外的3个和4个独特的突变，这使BA.2具有更高的免疫逃避能力。BA.4与BA.5具有相同的刺突蛋白。它们与BA.2不同的是，在刺突蛋白内的69-70del、L452R、F486V和Q493位的野生型氨基酸有额外的突变，从而使它们比BA.2具有更高的免疫逃避能力。BA.2表现出比BA.1高1.3-1.5倍的传播性和1.3倍的免疫逃避，此与BA.1免疫血清以1.3至1.4的系数以低效价中和BA.2的发现一致，而且BA.2在BA.1之后可以发生再感染。BA.4/BA.5的传播性更强，对BA.1/BA.2的免疫和单克隆抗体具有抗性。

在双重接种的成年人中，针对BA.4/BA.5的加强剂(第三剂)诱导的中和效价明显低于针对BA.1/BA.2的效价。这些都表明，加强型疫苗接种或BA.1/BA.2感染可能无法达到足够的免疫力来保护人们免受BA.4/BA.5的侵害，而再次感染则很常见。

因此仍迫切需要开发疫苗，以防止未感染者感染包括贝塔、德尔塔和奥密克戎在内的SARS-CoV-2VoC，以控制疫情并减少由此带来的痛苦，包括死亡。此外，强烈需要开发成分更新的(变体特异性)疫苗。极需要开发疫苗组合物，以防止个人感染SARS-CoV-2奥密克戎，以控制疫情并减少由此产生的痛苦，包括长期新冠肺炎(long-haul COVID)和死亡。

发明简述

本发明涉及用于避免感染与治疗SARS(COVID)患者的针对SARS-CoV-2变体的疫苗组合物。更具体地而言，该疫苗组合物采用在CHO细胞中生产的融合蛋白作为B细胞免疫原，该融合蛋白在N端包含一个S-RBDVoC，与人IgG的改良铰链区与Fc片段(CH2与CH3区域)共价连接(图1)。疫苗成分中并入了混杂位点定向的SARS-CoV2 Th/CTL表位肽，可向被接种者提供最佳的T细胞免疫力。综上所述，所揭露的疫苗组合物利用SARS-CoV-2蛋白的氨基酸序列来设计与制造SARS-CoV-2M、N与S2蛋白衍生的抗原性Th/CTL表位肽(例如，SEQ ID No：2-5、7-12、14-35)，CHO衍生的S1-RBDVoC-sFc融合蛋白(例如，SEQ ID No：49-53)及其制剂，作为预防与治疗因SARS-CoV2 VoC所引起的COVID的疫苗。

附图说明

图1显示本发明的各种实施方案的单链融合蛋白的设计。具体来说，此图图解说明了融合蛋白的一般结构，此融合蛋白在N端包括一个S-RBDVoC，其与人类IgG的铰链区及Fc片段(CH2和CH3区域)共价连接。在S1-RBD奥密克戎-sFc融合蛋白中，S1-RBD奥密克戎在N末端共价连接到人类IgG修饰的铰链区(SEQ ID NO：39)和Fc片段(CH2和CH3结构域)(SEQ IDNO：46或47)。

图2显示pZD/S-RBDVoC-sFc质粒图。根据本发明的实施方案，pZD/S-RBDVoC-sFc质粒编码S-RBDVoC-sFc融合蛋白。

图3显示S1-RBDVoC-sFc的氨基酸序列、结构与功能。图3A显示S1-RBDVoC Beta-sFc的序列并确定N-连接糖基化位点(*)、O-连接糖基化位点(+)、Asn突变为His(下划线残基)和二硫键(连接线)。图3B概述S1-RBDVoC Beta-sFc融合蛋白中的二硫键。

图4显示S1-RBDVoC Delta-sFc的氨基酸序列、结构和功能，其中VoC为德尔塔。图4A显示S1-RBDVoC Delta-sFc的序列并确定N-连接糖基化位点(*)、O-连接糖基化位点(+)、Asn突变为His(下划线残基)和二硫键(连接线)。图4B概述S1-RBDVoC Delta-sFc融合蛋白中的二硫键。

图5显示S1-RBDVoC奥密克戎-sFc的氨基酸序列、结构和功能，其中VoC为奥密克戎。图5A显示S1-RBDVoC奥密克戎B1.1.529-sFc的序列并确定N-连接糖基化位点(*)、O-连接糖基化位点(+)、Asn突变为His(下划线残基)和二硫键(连接线)。图5B概述S1-RBDVoC奥密克戎B1.1.529-sFc融合蛋白中的二硫键。

图6显示S1-RBDVoC奥密克戎BA.4/BA.5-sFc的氨基酸序列、结构和功能，其中VoC为奥密克戎BA.4/BA.5。图6A显示S1-RBDVoC奥密克戎BA.4/BA.5-sFc的序列(SEQ ID NO:53)并确定N-连接糖基化位点(*)、O-连接糖基化位点(+)、Asn突变为His(下划线残基)和二硫键(连接线)。图6B概述S1-RBDVoC奥密克戎BA.4/BA.5-sFc融合蛋白中的二硫键。

图7显示药物物质(DS)S1-RBDVoC-sFc蛋白，包括S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc(SEQ ID Nos：53)的一般制造过程。此过程从工作细胞库(WCB)开始，以接种细胞种子并在2000L分批补料生物反应器中扩大培养物。在细胞培养程序之后，未处理的原液被收集并通过无菌过滤澄清以产生澄清原液。为纯化药物物质(DS)，将原料药通过蛋白A亲和层析、深度过滤与离子交换(IEX)层析，然后进行切向流过滤(TFF)进行缓冲液交换，以达到配制的药物物质。为避免外源病毒污染，澄清后的原液要经过溶剂清洁剂处理、蛋白质A层析酸灭活和纳滤处理。最后，在无菌过滤后生产配制的S1-RBDVoC-sFc DS浓缩物。因为Voc包括奥密克戎BA.4/BA.5，所以也使用上述相同的制造过程生产配制的S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc DS浓缩物。

图8显示通过非还原和还原形式SDS-PAGE对本发明的代表性设计S1-RBD-scFc蛋白进行的生化表征。

图9A及图9B显示本发明蛋白/肽疫苗成分的示意图。图9A显示UB-612多蛋白-肽亚单位疫苗的成分。此疫苗组合物包含S1-RBDVoCs-sFc融合蛋白作为B细胞表位，5个合成的Th/CTL肽作为源自于SARS-CoV-2VoC M、N与S2蛋白的I类与II类MHC分子，以及1a肽作为活化T细胞的催化剂。这些成分与CpG1混合，后者通过双极相互作用与带正(设计)电荷的肽结合，也作为佐剂，然后与明矾佐剂结合，构成疫苗组合物。图9B显示UniCoVac奥密克戎BA.4/BA.5亚单位疫苗的组成。疫苗组合物包含一个S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc融合蛋白(SEQ ID NO：53)作为主要的B细胞免疫原，5个合成的Th/CTL肽(SEQ ID NO：2、9、27、34及35)为来源于SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/BA.5M、N与S2蛋白的I类与II类MHC分子，以及/>1a肽(SEQ ID NO：36)作为活化T细胞的催化剂。这些成分与CpG1(SEQ IDNO：67)混合，后者通过双极相互作用与带正(设计)电荷的肽结合，也作为佐剂，然后与明矾佐剂结合，构成疫苗组合物。

图10A及图10B显示制造针对SARS-CoV-2，包括SARS-CoV-2的奥密克戎BA.4/BA.5设计COVID疫苗的混合(compounding)过程。图10A显示制造针对SARS-CoV-2VOC设计的COVID疫苗的混合(compounding)过程。为了生产疫苗组合物，依次添加肽、CpG1、明矾佐剂，最后是蛋白质。具体而言，将设计Th/CTL肽添加到WFI中，然后在混合物中添加CpG1以形成肽/CpG1复合物。此后，将蛋白质缓冲液、明矾和氯化钠添加到现在含有肽/CpG1/明矾/氯化钠的溶液中。最后，将S1-RBDVoCs-sFc蛋白溶液添加到溶液混合物中，获得最终的疫苗组合物：例如UB-612、UB-613或UB-614等。图10B显示制造针对SARS-CoV-2的奥密克戎BA.4/BA.5的设计COVID疫苗(或命名为单价UniCoVac奥密克戎)的混合(compounding)过程。为了生产疫苗组合物，依次添加肽、CpG1、明矾佐剂，最后是蛋白质。具体而言，将设计Th/CTL肽添加到WFI中，然后在混合物中添加CpG1以形成肽/CpG1复合物。此后，将蛋白质缓冲液、明矾和氯化钠添加到现在含有肽/CpG1/明矾/氯化钠的溶液中。最后，将S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc蛋白溶液添加到溶液混合物中以得到最终的疫苗组合物。

图11A至图11D显示在1期临床试验中初次接种2剂疫苗和加强第三剂疫苗后针对活SARS-CoV-2野生型的病毒中和效价(VNT50)。在为期196天的第1期临床试验的UB-612主要2剂疫苗系列中，60名参与者参加了10-μg、30-μg与100-μg剂量组(每组n＝20)，其中50名参与者参加了延长研究，并接受了于100-μg的加强第3剂(n＝17为10-μg剂量组；n＝15为30-μg剂量组，n＝18为100-μg剂量组)。测量抑制50％活SARS-CoV-2野生型(WT，COVID-19原始分离株)的病毒中和抗体几何平均效价(GMT，95％ CI)，并表示为10-μg(图11A)、30-μg(图11B)与100-μg(图11C)剂量组的VNT₅₀。图11D说明100-μg剂量组，对于三个剂量组的研究参与者，VNT₅₀数据记录在第0天(第1次给药前)、第14天(第1次给药后14天)、第28天(第1次给药后1个月；给药前第2剂)、第42天(第2剂后14天)、第56天(第2剂后1个月)、第112天(第2剂后3个月)、第196天(第2剂后6个月)，第255至316天(第3剂前，加强剂前)与第269至330天(加强剂后14天)。单个参与者的效价由圆圈显示。水平虚线表示定量下限(LLOQ)。HCS：对照组中的人类恢复期血清样本(n＝20)。

图12A至12C显示UB-612加强第三剂在1期试验中产生的针对SARS-CoV2野生型、德尔塔、奥密克戎与其他关切变体的有效中和效价。进行为期196天的第1期临床试验的主要2剂系列(第0天与第28天)与在平均第286天(第255-316天)给予100μg的延长加强第三剂。图12A显示100-μg组参与者在加强后14天观察到的VNT₅₀效价。加强后14天观察到对活SARS-CoV-2野生型(WT)的VNT₅₀效价达3992，对活德尔塔达到2358。在较低的30-与10-μg剂量组中观察到类似的高抗WT与抗德尔塔VNT₅₀程度。图12B提供了加强后14天观察到的针对伪SARS-CoV-2野生型(WT)与针对包括奥密克戎的伪SARS-CoV-2变体的pVNT₅₀效价。图12C显示2剂后的抗体持久性(第1期临床试验)：基于第42-196天的一阶指数模型拟合(first-orderexponential model fitting)(SigmaPlot)，抗WT中和VNT₅₀效价缓慢衰减，半衰期为187天(R²＝0.9877；衰减率常数K_el＝-0.0037；半衰期＝0.693/K_el)。此图显示，病毒中和抗体在WT活病毒下是持久性的。

图13条形图显示在100μg UB-612剂量组的第1期临床试验的主要系列中观察到针对不同SARS-CoV-2变体的病毒中和pVNT₅₀效价。在1期临床试验的主要2剂疫苗接种系列中，接种者接受了两个100μg的UB-612剂量，选择了二十个第56天免疫血清样本(n＝20)，用于测量针对关注变异体(VoCs)的比较中和抗体活性。pVNT₅₀效价藉由伪病毒-荧光素酶试验(体外活病毒微中和)进行评估。该研究在台湾地区“中央研究院”(Sinica)RNAi核心设施的BSL2实验室进行。

图14A与14B显示抗S1-RBD IgG抗体和对SARS-CoV-2野生型原始分离株的病毒中和反应。图14A提供了在100μg的UB-612的2期研究中，跨年龄组第1、29与57天的抗S1-RBDIgG反应的基于ELISA的平均GMT(总共n＝871；18-65岁组n＝731；65-85岁组n＝140)。误差条(The error bars)代表95％ CI，虚线表示ELISA测定的限值。图14B提供了跨年龄组在第1天与第57天对SARS-CoV-2-TCDC#4(原始分离株野生型)病毒的50％病毒中和反应(VNT₅₀)的GMT。GMTs值以微量中和CPE测定法进行测量。误差条代表95％ CI，虚线表示微量中和测定的限值。在18-65岁的较年轻成年人中，96.4的VNT₅₀基本上是可重复的，如在100μg疫苗剂量的疫苗接种者(20-55岁)第1期临床试验中第56天，其VNT₅₀为103(第11C图)。

图15A与15B显示第2期临床试验主要2剂系列中针对SARS-CoV-2变体的中和抗体效价(VNT₅₀)。图15A提供在第57天免疫血清中针对活SARS-CoV-2病毒变体的50％病毒中和效价(VNT₅₀)的测量值，从48名(n＝39为18-65岁的年轻成年人；n＝9为≥65岁的年长成年人)在2期试验中接受两次UB-612疫苗剂量的疫苗接种者中随机选择收集血清。活的野生型原始分离SARS-CoV-2-TCDC#4与US WA 1/2020，以及WHO列出的两种VoC(B.1.1.7与B.1.617.2谱系)以CPE进行检测。VNT₅₀值标记在每列的顶部，并用水平条显示的95％置信区间(CI)排列。图15B显示双样本t检验提供VNT₅₀针对每个变体与野生型、原始分离株与US WA1/2020相比的倍数变化(减少)(**p<0.01；****p<0.0001)。相对于从进行CPE测定的两个不同地理位置分离的两种原始分离株野生型，2.7倍与1.4倍的降低也代表了37％与72％的中和效价保留。台湾地区“中央研究院”；CDP H：美国加利福尼亚州公共卫生部(CDPH)。

图16A至16D显示根据ELISA之在主要2剂疫苗接种与加强第三剂后针对S1-RBD:ACE2结合的抑制效价。在为期196天的1期试验(60名参与者)的主要2剂疫苗系列中和在加强第三剂的延长研究中，测量基于ELISA的S1-RBD：ACE2结合效价。10-μg(图16A)、30-μg(图16B)与100-μg(图16C)剂量组(每个剂量组n＝20)的参与者接受了两次分配的疫苗剂量，间隔28天，并且在6个月内对50名参与者进行了一次100μg的第三剂加强(10-μg剂量为n＝17，30-μg剂量为n＝15，100-μg剂量组为n＝18组)。在指定的时间点收集血清样品以ELISA测量对S1-RBD与ACE2结合的抑制效价。水平虚线表示定量下限(LLOQ)。图16D显示S1-RBD：ACE2结合抑制与VNT₅₀之间的良好关联性。绘制所有主要/加强接种参与者(10-、30-与100-μg剂量组)的数据。第0天参与者的数据点被排除在相关性分析之外。藉由非参数Spearman相关方法分析相关性。

图17A至17D显示在主要2剂疫苗接种与加强第三剂后以ELISA分析抗S1-RBD IgG结合效价。在为期196天的1期临床试验(60名参与者)的主要2剂疫苗系列中，以及在加强第三剂的延长研究中，测量了基于ELISA的抗S1-RBD抗体结合效价。10-μg(图17A)、30-μg(图17B)与100-μg(图17C)剂量组(每个剂量组n＝20)的参与者，间隔28天接受了两次分配的疫苗剂量，并且在6个月内对50名参与者进行了一次100μg的加强第三剂(10-μg剂量为n＝17，30-μg剂量为n＝15，100-μg剂量组为n＝18组)。在指定的时间点收集血清样本，藉由ELISA测量抗S1-RBD抗体结合，表现为几何平均效价GMT与95％ CI。水平虚线表示定量下限(LLOQ)。图17D说明抗S1-RBD抗体结合与VNT₅₀之间的良好相关性。绘制了所有主要/加强接种参与者(10-、30-与100-μg剂量组)的数据。第0天参与者的数据点被排除在相关性分析之外。藉由非参数Spearman相关方法分析相关性。

图18A至18E显示在用设计肽抗原重新刺激PBMC后，藉由IFN-γ与IL-4ELISpot测量的UB-612诱导的持久、稳健的Th1为主的细胞反应。在为期196天的1期试验中，在第0天与第28天使用两剂UB-612，藉由IFN-γELISpot以在10-μg(图18A)、30-μg(图18B)或100-μg(图18C)剂量组(每个n＝20)中之来自年轻成年人(20至55岁)的PBMC细胞来测量疫苗诱导的T细胞反应。在第2期临床试验研究中，参与者(年轻成年人，>18至<65岁)接受了两剂100μg的UB-612(n＝88)或盐水安慰剂(n＝12)，通过IFN-γELISpot(图18D)与IL-4ELISpot(图18E)测量于第57天以设计抗原蛋白/肽重新刺激疫苗接种者之PBMC中的T细胞反应。显示以S1-RBD+Th/CTL肽池、Th/CTL肽池或CoV2 T肽(无UBITh1a的Th/CTL肽池)刺激后，每1×10⁶PBMC产生IFN-γ与IL-4之斑点形成单位(SFU)。使用双样本t检验进行统计分析(****p<0.0001)。

图19A至19C显示在第2期临床试验主要2剂疫苗接种系列中，以设计肽抗原重新刺激PBMC后，藉由IFN-γ与IL-4细胞内染色(ICS)测量的UB-612诱导的Th1为主的T细胞反应(CD4与CD8)。在第2期临床试验中，研究参与者(>18至65岁的年轻成年人以100μg接受2剂(间隔28天)的UB-612(n＝88)或生理盐水安慰剂(n＝12)。在第1天与第57天(第二次注射后4周)收集的PBMC以设计的抗原蛋白/肽重新刺激，藉由细胞内染色(ICS)评估T细胞反应。产生指示性细胞因子的CD4+与CD8+T细胞的频率对S1-RBD+Th/CTL肽池(图19A)、Th/CTL肽池(图19B)与CoV2 T肽(Th/CTL肽池没有UBITh1a)的刺激(图19C)的反应。使用Mann-Whitneyt检验进行统计分析。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)。

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发明详述

本发明涉及具有针对奥密克戎BA.4/BA.5的特异性SARS-CoV-2关切变体(VoC)，例如阿尔法,贝塔,伽马,德尔塔和奥密克戎的疫苗组合物，以预防感染和治疗那些患有SARS(即COVID)的患者。更具体地，疫苗组合物使用在CHO细胞中产生的融合蛋白作为其B细胞免疫原，该融合蛋白在N端包含S1-RBDVoC蛋白，该蛋白与人类IgG之铰链区和Fc片段(CH2与CH3区)共价连接。疫苗制剂中加入多点位SARS-CoV2 Th/CTL表位肽，以提供最佳的T细胞免疫。

总而言之，所揭露的疫苗系统利用氨基酸序列来设计与制造SARS-CoV2 M、N与S2-蛋白衍生的Th/CTL表位肽(SEQ ID NO：2-5,7-12,14-35)，这些表位肽源自于SARS-CoV-2VoCs的SARS-CoV-2蛋白，包括SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/BA.5，以及源自CHO之S1-RBDVoC-sFc融合蛋白(SEQ ID NO:49-53)，包括S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc融合蛋白(SEQ IDNO:53)，及其制剂以作为针对由SARS-CoV-2VoCs，包括SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/BA.5.引起的SARS(即COVID)疫苗。

以下更详细地讨论所公开的发明的各个方面。

一般

本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有参考文献或参考文献的一部分出于任何目的明确地通过引用整体并入本文。

除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一(a)”、“一(an)”与“该”包括复数指称。类似地，除非上下文另有明确说明，否则“或”一词旨在包括“与”。因此，短语“包含A或B”是指包括A或B，或A和B。还应理解，针对多肽给出的所有氨基酸大小与所有分子量或分子量值都是近似值，并且提供描述。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可以用于所公开方法的实践或测试，但下面描述了合适的方法与材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入。若有冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。此外，于此揭露之材料、方法和示例仅是说明性的，而不是限制性的。

SARS是严重急性呼吸系统症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome)的缩写，也被称为COVID，是冠状病毒感染疾病(Corona Virus Infectious Disease)的缩写。该病最初可能没有什么症状，也可能发展为发烧、咳嗽、呼吸急促、肌肉疼痛和疲倦。并发症可能包括肺炎与急性呼吸窘迫症候群。用于预防SARS-COV-2 VARIANTS变体(VOCs)包括SARS-COV-2奥密克戎VARIANTS BA.4/BA.5感染的蛋白质/肽疫苗组成合物

所揭露的疫苗组合物涉及预防SARS-CoV-2VoCs，包括SARS-CoV-2奥密克戎变体BA.4/BA.5感染的蛋白质/肽疫苗组合物。

1.基于S1受体结合区域的设计蛋白

目前在临床试验中的大多数疫苗只针对全长的S蛋白来诱导中和抗体反应。与自然SARS-CoV-2感染产生的反应相比，诱导的T细胞反应将是有限的。S1-RBD区域是SARS-CoV-2的一个关键组成部分。它是细胞附着所必需的，并且代表了2003年描述的高度相似的SARS-CoV病毒的主要中和域，通过消除潜在的副作用，如抗体依赖性增强(antibodydependent enhancing,ADE)效应，提供全长S抗原无法实现的安全系数，当疫苗产生的抗体实际上帮助病毒感染的细胞数量比它自己感染的细胞数量多时。在这种情况下，抗体与病毒结合并帮助它比单独的病毒更容易进入细胞，从而导致比未接种疫苗的人更严重的疾病。

由于使用较短受体结合域(S1-RBD)聚焦之B细胞疫苗成分的明显优势，蛋白质/肽疫苗组合物包括基于S1-受体结合区的设计蛋白，也称为S1-RBD-sFc融合蛋白，具有特定的变体特异性，例如贝塔、德尔塔、奥密克戎(例如BA.4/BA.5)或原始分离株和德尔塔的二价S1-RBD。如上所述，S1-RBD-sFc是由SARS-CoV-2的S1-RBD与人IgG的单链片段结晶区(sFc)融合而成的重组蛋白。此外，工程化的Fc已被用作许多治疗性抗体的解决方案，以最大限度地减少非特异性结合、增加溶解度、产量、热稳定性与体内半衰期。

在一些实施方案中，疫苗组合物含有SEQ ID NO:49-53的S1-RBD-sFc融合蛋白。这些S1-RBD-sFc蛋白各自包含各自的S1-RBD蛋白(SEQ ID NO：40 -44)，其对应于SARS-CoV-2全长S蛋白的331-530个氨基酸残基，经由来自IgG(SEQ ID NO：38或39)的突变铰链区与单链Fc肽(SEQ ID NO：46-48)融合。

在一些实施方案中，图3至6的S1-RBD序列的第61与195位半胱氨酸C)残基被突变为丙氨酸(A)残基，(S-RBD的61与195残基对应于原始分离株SEQ ID NO：13的全长S蛋白的391与525残基)。在S1-RBD序列中引入C61A与C195A突变是为了避免在重组蛋白表达中形成二硫键的错配。融合至单链Fc肽(S-RBDVoCs-sFc)之代表原始分离株、贝塔、奥密克戎(e.g.奥密克戎BA.4/BA.5)、德尔塔株的S1-RBDVoCs的氨基酸序列为SEQ ID NO：49-53，其中S-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc为SEQ ID NO:53。

疫苗组合物中基于S1受体结合区的设计蛋白的数量可以根据需要或应用而变化。疫苗组合物可包含约1μg至约1000μg的基于S1受体结合区的设计蛋白。在一些实施方案中，疫苗组合物含有约10μg至约200μg基于S1受体结合区的设计蛋白。

2.Th/CTL肽

仅针对S蛋白的中和反应不太可能提供针对SARS-CoV-2及其带有突变B细胞表位的新兴变体的持久保护。持久的细胞反应可以增强最初的中和反应(经由记忆B细胞激活)，并在抗体效价减弱时提供更长的免疫持续时间。最近的研究表明，在2-3个月内，>90％的SARS-CoV-2感染者对S的IgG反应迅速下降(Long,Q.X.,et al.,2020)。相比之下，在2003年SARS出现后，针对SARS的记忆T细胞已被证明可以持续11-17年(Ng,O.W.,et al.,2016；和Le Bert,N.,et al.,2020)。S蛋白是引发体液免疫的关键抗原，主要包含CD4+表位(Braun,J.,etal.,2020)。需要其他抗原来提高/增强细胞免疫反应以清除SARS-CoV-2感染。绝大多数报道的SARS-CoV-2蛋白中的CD8+T细胞表位位于ORF1ab、N、M与ORF3a区域；只有3个位于S中，只有1个CD8+表位位于S1-RBD中(Ferretti,A.P.,et al.,2020)。较小的M与N结构蛋白被成功控制感染的患者的T细胞识别。在对英国近3000人进行的一项研究中发现，与T细胞反应较低的人相比，T细胞数量较多的人对SARS-CoV-2的保护能力更强，这表明T细胞免疫可能在避免COVID-19方面发挥关键作用(Wyllie,D.,et al.,2020)。

为了提供引发T细胞反应的免疫原，鉴定了来自SARS-CoV与SARS-CoV-2的S、N与M蛋白的高度保守序列的Th/CTL表位。这些Th/CTL肽显示在表1-3与8和和10中。每个选定的肽都包含Th或CTL表位，并预先验证了MHC I或II结合，并表现出良好的可制造性特征(适合高质量合成的最佳长度)。它们还应该最好地展示刺激普通个体的PBMC的内在能力。这些Th/CTL肽经过广泛的筛选、鉴定、验证与设计，通过在每个肽的N端添加Lys-Lys-Lys尾进行进一步修饰，以提高肽的溶解度并丰富用于疫苗制剂的正电荷。五种最终肽的设计与序列及其各自的HLA等位基因(alleles)如表8所示。

为了增强免疫反应，可以将专属肽1a(SEQ ID NO：36)作为催化剂添加到疫苗组合物的肽混合物中。/>1a是一种专有的合成肽，具有源自麻疹病毒融合蛋白(MVF)的原始框架序列。该序列被进一步修饰以在序列内显示回文图谱(palindromic profile)，以允许在该19个氨基酸的短肽内容纳多个MHC II类结合基序(motif)。Lys-Lys-Lys序列也被添加到这种人工Th肽的N末端，以增加其正电荷，从而促进肽随后与高度带负电荷的CpG寡核苷酸分子结合，通过“电荷中和”形成免疫刺激复合物。在先前的研究中，/>1a与源自自身蛋白的目标“功能性B表位肽”的连接使自身肽具有免疫原性，从而破坏了免疫耐受性(Wang,C.Y.,etal,2017)。/>1的Th表位显示出这种刺激活性，无论是与目标肽共价连接还是作为游离带电肽，与其他设计的目标肽一起给药，这些肽通过与CpG1的“电荷中和”效应结合在一起，以引发位点定向的(site-directed)B或CTL反应。已显示此类免疫刺激复合物可增强伴随靶免疫原的弱或中等反应(例如，WO2020/132275A1)。

CpG1被设计以藉由“电荷中和”将合理设计的免疫原聚集在一起，以允许在接种疫苗的宿主中产生平衡的B细胞(中和抗体的诱导)与Th/CTL反应。此外，已知CpG激活TLR-9信号可促进IgA的产生并有利于Th1免疫反应。1肽因其“表位簇(cluster)”性质而作为Th肽之一被纳入，以进一步增强SARS-CoV-2衍生的Th与CTL表位肽的抗病毒活性。1的氨基酸序列是SEQ ID NO：36。CpG1的核酸序列是SEQ ID NO：67。

鉴于上述，蛋白质/肽疫苗组合物可以包含一种或多种Th/CTL肽。Th/CTL肽可以包括：

a.源自SARS-CoV-2M蛋白的肽(例如，SEQ ID NO：2-5)；

b.源自SARS-CoV-2N蛋白的肽(例如，SEQ ID NO：7-12)；

c.源自SARS-Cov-2S蛋白的肽(例如，SEQ ID NO：14-35)；及/或

d.源自病原体蛋白的人工Th表位(例如，SEQ ID NO：36)。

疫苗组合物可以含有一种或多种Th/CTL肽。在某些实施方案中，疫苗组合物包含多于一种Th/CTL肽的混合物。当存在于混合物中时，与其他一种或多种肽相比，每种Th/CTL肽可以以任何量或比率存在。例如，Th/CTL肽可以等摩尔量、等重量量混合，或者混合物中每种肽的量可以不同于混合物中其他肽的量。若混合物中存在多于两种Th/CTL肽，则肽肽的量可以与混合物中的任何其他肽相同或不同。

存在于疫苗组合物中的Th/CTL肽的量可以根据需要或应用而变化。疫苗组合物可含有总量在约0.1μg至约100μg之间的Th/CTL肽。在一些实施方案中，疫苗组合物含有总计约1μg至约50μg的Th/CTL肽。

在某些实施方案中，疫苗组合物包含SEQ ID NO：22,27,9,34,2,35,23,36或其任意组合。这些Th/CTL肽可以等摩尔量、等重量量混合，或者混合物中每种肽的量可以不同于混合物中其他肽的量。在某些实施方案中，这些Th/CTL肽以等重量的量混合在疫苗组合物中。

医药/疫苗制剂中Th与CTL表位的存在经由启动抗原特异性T细胞激活来引发治疗受试者的免疫反应，这与保护免受SARS-CoV-2感染有关。此外，包含精心挑选的SARS-CoV-2蛋白上的内源性Th表位及/或CTL表位的制剂可以产生广泛的细胞介导免疫，这也使得这些制剂可以有效地治疗和保护具有不同基因组成的受试者。

在医药组合物中包含一种或多种内源性SARS-CoV-2Th/CTL表位肽，S-RBDVoC-sFc蛋白，包括S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc蛋白使肽彼此紧密接触，从而使表位由抗原呈递B细胞、巨噬细胞、树突状细胞等看见与加工。这些细胞处理抗原并将它们呈递到表面以与B细胞接触以产生抗体，而T细胞则触发进一步的T细胞反应以帮助介导杀死病毒感染的细胞。内源性SARS-CoV-2CTL表位肽在N端含有Lys-Lys-Lys(KKK)尾巴。

SEQ ID NO：2、9、22/23、27、34、35、36的内源性SARS-CoVTh/CTL表位肽在用于与CpG寡核苷酸(ODN)配制成免疫刺激复合物的医药组合物中时特别有用，因为阳离子KKK尾能够通过静电缔合与CpG寡核苷酸相互作用。在肽免疫原构建体中使用内源性SARS-CoV-2Th表位可以增强S-RBD VoC-sFc蛋白细胞表位肽S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5B细胞表位肽的免疫原性，从而在感染后促进特异性高效价抗体的产生，针对基于设计原理筛选与选择的优化的S1-RBD B细胞表位肽。

在一些实施方案中，医药组合物包含一种或多种S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5sFc融合蛋白(SEQ ID NO：49、53或其任何组合)以及一种或多种含有内源性SARS-CoV-2Th/CTL表位肽(SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35及36，或其任何组合)。

3.赋形剂

疫苗组合物也可含有药学上可接受的赋形剂。

如本文所用，术语“赋形剂”或“赋形剂”是指疫苗组合物中不是(a)基于S1-受体结合区的设计蛋白或(b)Th/CTL肽的任何组分.赋形剂的实例包括载体、佐剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂、着色剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、表面活性剂、溶剂、填充剂、胶凝剂、pH缓冲剂、防腐剂、增溶剂、稳定剂等。因此，疫苗组合物包含药学有效量的活性药物成分(API)，例如基于S1受体结合区的设计蛋白及/或一种或多种Th/CTL肽，以及药学上可接受的赋形剂。

疫苗组合物可以含有一种或多种佐剂，其作用是加速、延长或增强对API的免疫反应，而本身不具有任何特异性抗原作用。佐剂可以包括油、油乳剂、铝盐、钙盐、免疫刺激复合物、细菌和病毒衍生物、病毒体、碳水化合物、细胞因子、聚合物微粒。在某些实施方案中，佐剂可以选自CpG寡核苷酸、明矾(例如磷酸铝钾)、磷酸铝(例如)、氢氧化铝(例如/>)、磷酸钙、不完全弗氏佐剂(IFA)、弗氏完全佐剂、MF59、佐剂65、Lipovant、ISCOM、liposyn、皂苷、角鲨烯、L121、/> 单磷酰脂质A(MPL)、Quil A、QS21、/>ISA 35、ISA 50V、ISA 50V2、ISA 51、ISA 206、ISA 720、脂质体、磷脂、肽聚糖,脂多糖(LPS)、ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、AF03、亲脂性磷脂(脂质A)、γ菊粉、algammulin、葡聚糖、葡聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、果聚糖(levans)、木聚糖(xylans)、二甲基双十八烷基溴化铵(dimethyldioctadecylammonium bromide,DDA)，以及其他助剂与乳化剂。

在一些实施方案中，疫苗组合物包含(磷酸铝)、MONTANIDE^TMISA 51(一种油佐剂组合物，由植物油和甘露醇油酸酯组成，用于生产油包水乳剂)、/>80(也已知为：聚山梨醇酯80(Polysorbate 80)或聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(Polyoxyethylene(20)sorbitan monooleate))、CpG寡核苷酸及/或其任何组合。在其他实施例中，医药组合物是水包油包水(即w/o/w)乳液，其中EMULSIGEN或EMULSIGEN D作为佐剂。

在某些实施例中，多表位蛋白质/肽疫苗组合物含有 (磷酸铝)作为佐剂以改善免疫反应。磷酸铝通过核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白3(NLRP3)炎性体途径作为Th2导向佐剂。此外，它具有促吞噬和储存效应，具有长期的安全记录，并且能够改善许多疫苗制剂中对靶蛋白的免疫反应。

疫苗组合物可以含有pH调节剂和/或缓冲剂，例如盐酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、组氨酸、组氨酸HCl·H₂O、乳酸、氨丁三醇、葡萄糖酸、天冬氨酸、谷氨酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、α-酮戊二酸与精氨酸HCl。

疫苗组合物可以含有表面活性剂与乳化剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(Polysorbate，)、聚氧乙烯15羟基硬脂酸酯(Macrogol 15hydroxystearate，SOLUTOL/>)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(Polyoxyethylene castor oilderivatives)(/>EL、ELP、RH 40)、聚氧乙烯硬脂酸酯(Polyoxyethylene stearates)/>山梨糖醇酐脂肪酸酯(Sorbitan fattyacid esters)/>聚氧乙烯烷基醚(Polyoxyethylene alkyl ethers)与聚氧乙烯壬基酚醚(Polyoxyethylene nonylphenol ether)

疫苗组合物可以包含载体、溶剂或渗透压保持剂，例如水、醇与食盐溶液(salinesolutions)(例如，氯化钠)。

疫苗组合物可以包含防腐剂，例如烷基/芳基醇(例如苯甲醇、三氯丁醇、2-乙氧基乙醇)、氨基芳基酸酯(amino aryl acid esters)(例如甲基、乙基、丙基丁基对羟基苯甲酸酯与组合)、烷基/芳基酸(例如、苯甲酸、山梨酸)、双胍类(如洗必泰(chlorhexidine))、芳香醚(如苯酚、3-甲酚、2-苯氧乙醇)、有机汞(如硫柳汞(thimerosal)、苯汞酸盐(phenylmercurate salts))。

4.制剂

疫苗组合物可配制成速释或缓释制剂。此外，可以配制疫苗组合物以通过免疫原包埋和与微粒共同施用来诱导全身或局部粘膜免疫。这样的递送系统很容易由该技术领域中具有普通知识者确定。可以将疫苗组合物制备成可注射的，或者作为液体溶液或悬浮液。也可以在注射前制备含有疫苗组合物的液体载体。疫苗组合物可以通过任何合适的应用方式，例如，i.d.、i.p.、i.m.、鼻内、口服、皮下等以及在任何合适的递送装置中施用。在某些实施方案中，疫苗组合物被配制用于皮下、皮内或肌肉内施用。疫苗组合物也可以制备用于其他给药方式，包括口服与鼻内应用。

疫苗组合物也可以配制成合适的剂量单位形式。在一些实施例中，疫苗组合物含有约1μg至约1,000μg的API(例如，基于S1受体结合区的设计蛋白及/或一种或多种Th/CTL肽)。疫苗组合物的有效剂量可以根据许多不同的因素而变化，包括施用方式、目标位点、受试者的生理状态、受试者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，受试者是人类，但也可以治疗非人类哺乳动物。当以多剂量递送时，疫苗组合物可以方便地分成合适的量/剂量单位形式。给药剂量将取决于受试者的年龄、体重和一般健康状况，这在治疗领域是众所周知的。

在一些实施例中，疫苗组合物在具有添加剂及/或赋形剂的制剂中包含基于S1受体结合区的设计蛋白和一种或多种Th/CTL肽。在某些实施例中，疫苗组合物在具有添加剂及/或赋形剂的制剂中包含基于S1受体结合区的设计蛋白和多于一种Th/CTL肽。含有多于一种Th/CTL肽混合物的疫苗组合物可以协同增强组合物的免疫功效。含有基于S1受体结合区的设计蛋白和一种以上的Th/CTL肽的疫苗组合物在带有添加剂及/或赋形剂的制剂中与只含有设计蛋白或一种Th/CTL肽的组合物相比，由于有广泛的MHC II类覆盖，在更大的遗传群体中可以更加有效，从而为疫苗组合物提供更好的免疫反应。

当疫苗组合物包含基于S1受体结合区的设计蛋白和一种或多种Th/CTL肽作为API时，设计蛋白与Th/CTL肽的相对量可以以任何量或比例存在于彼此。例如，设计蛋白与Th/CTL肽可以等摩尔量、等重量混合，或者设计蛋白与Th/CTL肽的量可以不同。此外，若组合物中存在多于一种Th/CTL肽，则设计蛋白与每种Th/CTL肽的量可以彼此相同或不同。在一些实施例中，设计蛋白的摩尔量或重量量以大于Th/CTL肽的量存在于组合物中。在其他实施例中，设计蛋白的摩尔量或重量量以小于Th/CTL肽的量存在于组合物中。设计蛋白与Th/CTL肽的比率(重量：重量)可以根据需要或应用而变化。在一些情况下，设计蛋白与Th/CTL肽的比例(w:w)可以是70:30、80:20或90:10。在具体实施例中，设计肽与Th/CTL肽的比例(w:w)为90:10、88:12或85:15等。在具体实施例中，设计蛋白与Th/CTL肽的比例(w:w)是88:12。

在一些实施例中，疫苗组合物包含一种或多种SEQ ID NO：49或51基于S1受体结合区的设计蛋白合并SEQ ID NO:2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽。在一些实施方案中，疫苗组合物包含来自SEQ ID NO：49、51之一的基于S1受体结合区的设计蛋白与SEQ ID NO：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽组合，以及一种或多种更多的佐剂及/或赋形剂。在各种实施例中，疫苗组合物包括SEQ ID NO：49、51的一种或多种基于S1受体结合区的设计蛋白与SEQID NO：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽，其中Th/CTL肽以彼此等重的比例存在，SEQ IDNO：49、51的一种或多种基于S1受体结合区的设计蛋白与Th/CTL肽的组合重量的比例(w：w)为88：12。表15-17分别提供了含有20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL与200μg/mL的疫苗组合物的具体实施方案，其依据是S1-RBDVoC-sFc蛋白(SEQ ID Nos：49或51)与SEQ ID Nos：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽之一的总重量。表18分别提供了含有20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL与200μg/mL的疫苗组合物的具体实施方案，其依据是S1-RBD-sFc(原始分离株)蛋白(SEQ IDNO：49)及S1-RBD奥密克戎B.1.1.529(SEQ ID NO:51)与SEQ ID NO：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽之一的总重量。在其它实施例中，疫苗组合物包含一种或多种Th/CTL肽。在某些实施例中，疫苗组合物包含基于SEQ ID NO:53之S1受体结合区的设计蛋白合并SEQ ID NO:2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽。在特定实施中，疫苗组合物包含基于SEQ ID NO:53之S1受体结合区的设计蛋白，SEQ ID NO:2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽，以及一或多个佐剂及/或赋形剂。在各种实施例中，疫苗组合物包含一或多个SEQ ID NO:53之S1受体结合区的设计蛋白以及SEQ ID NO:2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽，其中Th/CTL肽彼此为相同的重量比，且SEQ ID NO:53的一或多种基于S1受体结合区的设计蛋白与SEQ ID NOs:2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽组合重量比(w:w)为88:12。表15提供了含有20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL与200μg/mL的疫苗组合物的具体实施方案，其依据是S1-RBD-sFc(原始分离株)蛋白(SEQID Nos：49)与SEQ ID NO：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽之一的总重量。表19提供了含有20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL与200μg/mL的疫苗组合物的具体实施方案，其依据是S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc蛋白(SEQ ID Nos：53)与SEQ ID NO：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽之一的总重量。表20提供了含有20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL与200μg/mL的疫苗组合物的具体实施方案，其依据是S1-RBD-sFc(原始分离株)蛋白(SEQ ID NO：49)及S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc蛋白(SEQ ID NO：53)与SEQ ID NO：2、9、22、27、34、35、36的Th/CTL肽之一的总重量。

5.方法

本发明也涉及制备与使用疫苗组合物及其制剂的方法。

a.基于S1受体结合区域的设计蛋白与Th/CTL肽的制造方法

所揭露之基于S1-受体结合区的设计蛋白可以根据根据实施例2与3所述的方法制造。此外，所揭露之Th/CTL肽可以根据实施例1中描述的方法制造。

b.制造疫苗组合物的方法

所揭露的疫苗组合物可以根据实施例5与6中描述的方法制备它们的复合程序。

c.使用疫苗组合物之方法

在预防性应用中，所揭露的蛋白质/肽疫苗组合物可施用于易感染或有风险感染SARS-CoV-2及其相关变体的受试者，导致COVID的病毒消除或降低风险、减轻严重程度，或推迟疾病的发作。

足以完成预防性治疗的疫苗组合物的量被定义为预防有效剂量。可以将所揭露的蛋白质/肽疫苗组合物以一剂或多剂施用于受试者以产生足够的免疫反应，从而预防SARS-CoV-2感染。通常，会监测免疫反应，若免疫反应开始减弱，则会重复给药。

疫苗组合物可配制成速释或缓释制剂。此外，可以配制疫苗组合物以通过免疫原包埋和与微粒共同施用来诱导全身或局部粘膜免疫。这样的递送系统很容易由该技术领域中具有普通知识者确定。可以将疫苗组合物制备成可注射的，或者作为液体溶液或悬浮液。也可以在注射前制备含有疫苗组合物的液体载体。疫苗组合物可以通过任何合适的应用方式，例如，i.d.、i.p.、i.m.、鼻内、口服、皮下等以及在任何合适的递送装置中施用。在某些实施例中，疫苗组合物被配制用于皮下、皮内或肌肉内施用。疫苗组合物也可以制备用于其他给药方式，包括口服和鼻内应用。

疫苗组合物的剂量将根据受试者和特定的给药方式而变化。所需剂量将根据该技术领域中具有普通知识者已知的许多因素而变化，包括但不限于受试者的种类与大小。剂量范围可为设计蛋白和Th/CTL肽的总重量的1μg至1,000μg。设计蛋白与Th/CTL肽的比例(重量：重量)可以根据需要或应用而变化。在一些情况下，设计蛋白与Th/CTL肽的比例(w:w)可以是70:30、80:20或90:10。在具体实施例中，设计蛋白与Th/CTL肽的比例(w:w)为95:5、90:10、88:12或85:15等。在具体实施例中，设计蛋白与Th/CTL肽的比例(w:w)为88:12。在具体实施例中，疫苗组合物包含表15-20中所示的组分。

疫苗组合物可以在一段时间内以单剂量或多剂量的方式施用。疫苗组合物可以按照特定的剂量表给药。有效剂量可以从动物模型获得的剂量反应曲线中推算出来。在一些实施例中，疫苗组合物以单次给药方式提供给受试者。在其他实施例中，疫苗组合物以多次给药(两次或多次)提供给受试者。当以多次给药方式提供时，两次给药之间的持续时间可以根据应用或需要而变化。在一些实施例中，向受试者提供第一剂的疫苗组合物，并在第一剂后约1周至约12周提供第二剂。在某些实施例中，第二剂在第一次给药后约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周或约12周给药。在一个具体的实施例中，第二剂是在第一次给药后约4周给药。

可以在初始疫苗接种方案后向受试者施用加强剂的疫苗组合物以增加对SARS-CoV-2的免疫力。在一些实施例中，在初始疫苗接种方案后约6个月至约10年将疫苗组合物的加强剂施用于受试者。在某些实施例中，疫苗组合物的加强剂在初始疫苗接种方案后或最后一次加强剂后约3个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年或约10年给药。

本发明之特定实施例，包括但不限于以下实施例

1.一种融合蛋白，包括IgG分子的Fc片段与生物活性分子，其中该Fc片段为单链Fc(single chain Fc,sFc)，其中该Fc片段包括铰链区(hinge region)，其中该铰链区为经突变的且不形成二硫键，其中该铰链区包括择自由SEQ ID NO：38和39所组成的组的一氨基酸序列，其中该生物活性分子为来自SEQ ID NO:40的SARS-CoV2 S蛋白受体结合区域(receptor binding domain,RBD)(S-RBD)或SEQ ID NO:41-44的S-RBD变体。

2.如(1)的融合蛋白，其中该铰链区包括SEQ ID NO：39的氨基酸序列。

3.如(1)的融合蛋白，其中该融合蛋白系择自由SEQ ID NO：49与53所组成的组。

4.一种医药组合物，包括如请求项1之融合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂。

5.一种产生如(1)的融合蛋白的方法，包括：

a)提供生物活性分子，其中该生物活性分子为来自SARS-CoV2原始分离株之S蛋白(S-RBD)的受体结合区域(RBD)(SEQ ID NO：1)或其关切变体(VoC)之一，其中该S蛋白(S-RBD)之该受体结合区域(RBD)系择自于SEQ ID NO：40与44所组成的组，

b)提供IgG分子的Fc片段，其中该Fc片段包括铰链区，其中该铰链区藉由半胱氨酸残基的取代及/或缺失而突变以形成经突变的Fc，且该经突变的Fc不形成二硫键，其中该铰链区包括择自由SEQ ID NO：38和39所组成的组的一氨基酸序列，以及

c)经由该铰链区结合该生物活性分子与该经突变的Fc。

6.一种融合蛋白，系择自由SEQ ID NO：49-53之S1-RBDVoC-sFc所组成的组。

7.一种组合物，包括如请求项6之融合蛋白。

8.如请求项7之组合物，更包括Th/CTL肽，其中该Th/CTL肽系衍生自SARS-CoV-2M、N或S蛋白、病原体蛋白，或其任意之组合，其中该Th/CTL肽系择自由SEQ ID NO：2-5、7-12、14-35、36与其任意之组合所组成的组。

9.如(8)的组合物，其中该Th/CTL肽系择自由SEQ ID NO：2-5、7-12、14-35、36与其任意之组合所组成的组。

10.一种COVID疫苗组合物，包括：

a).S-RBDVoC-sFc变体蛋白，系择自SEQ ID NO：49-53的组；

b).Th/CTL肽，系择自由SEQ ID NO：2-5、7-12、14-36与其任意之组合所组成的组；

c).药学上可接受的赋形剂，其中该药学上可接受的赋形剂为佐剂、缓冲剂、表面活性剂、乳化剂、pH调节剂、食盐水溶液、防腐剂、溶剂，或其任意之组合。

11.如(10)的COVID疫苗组合物，其中于(b)中之该Th/CTL肽系择自由SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35、36与其任意之组合所组成的组。

12.如(11)的COVID疫苗组合物，其中该药学上可接受之赋形剂为CpG1寡核苷酸、ALUM(磷酸铝或氢氧化铝)、组氨酸、组氨酸HCl·H₂O、精氨酸HCl、TWEEN 80(聚氧乙烯(20)-山梨醇酐单油酸酯(polyoxyethylene(20)sorbitan monooleate))、盐酸、氯化钠与在水中之2-苯氧乙醇(2-phenoxyethanol)的组合。

13.如(12)的COVID疫苗组合物，其中该药学上可接受的赋形剂为CpG1(SEQ IDNos：67)。

14.一种预防COVID的方法，包括投予药学上有效量之如请求项10之疫苗组合物至个体。

15.一种预防COVID的方法，包括投予药学上有效量之如请求项11之疫苗组合物至个体。

16.一种产生针对SARS-CoV-2之抗体的方法，包括投予药学上有效量之如请求项10之疫苗组合物至个体。

17.一种产生针对SARS-CoV-2之抗体的方法，包括投予药学上有效量之如请求项11之疫苗组合物至个体。

18.一种COVID疫苗组合物，包括于表15-20之任何一所示之量的成分。

19.一种细胞株，系以编码如请求项6之融合蛋白的cDNA序列转染。

20.如请求项19之细胞株，其为中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞株。

21.如请求项19之细胞株，其中该cDNA序列系择自由SEQ ID NO：60-64所组成的组。

22.一种广谱COVIDT疫苗组合物，包括:

a).Th/CTL肽，其中Th/CTL肽衍生自SARS-CoV-2M、N或S蛋白、病原体蛋白或其任意组合，其中Th/CTL肽选自于SEQ ID NO：2-5、7-12、14-36及其任意组合所组成的组；

b).药学上可接受的赋形剂，其中药学上可接受的赋形剂包括佐剂、缓冲剂、pH调节剂、盐水溶液、防腐剂、溶剂或上述任意组合。

23.如请求项22之广谱COVIDT疫苗组合物，其中Th/CTL肽选自于SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35、36、3、4、7、8、25、26及其其任意组合的组。

24.如请求项23之广谱COVIDT疫苗组合物，其中药学上可接受的赋形剂是CpG1寡核苷酸、ALUM(磷酸铝或氢氧化铝)、盐酸、氯化钠和2-苯氧乙醇在水中的组合。

25.一种广谱COVIDT疫苗组合物以表21至24所示之量组成。

26.一种融合蛋白，包括IgG分子的Fc片段与生物活性分子，其中该Fc片段为单链Fc(single chain Fc,sFc)，其中该Fc片段包括铰链区(hinge region)，其中该铰链区为经突变的且不形成二硫键，其中该铰链区包括择自由SEQ ID Nos：38和39所组成的组的氨基酸序列，其中该生物活性分子为来自SEQ ID NO：40的SARS-CoV2之S蛋白(S1-RBD)(SEQ IDNO:41-44)的S-RBD变异型的受体结合区域(receptor binding domain,RBD)，其中奥密克戎BA.4/BA.5变体形式为SEQ ID NO:44。

27.如(1)所述的融合蛋白，其中该融合蛋白选自由SEQ ID NO：49和53所组成的群组。

28.如(1)的融合蛋白，其中铰链区包含SEQ ID NO：39氨基酸序列。

29.一种药物组合物，包括(1)的融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。

30.一种制备如(1)的融合蛋白的方法:

a)提供生物活性分子，其中生物活性分子是来自SARS-CoV-2原始分离株的S蛋白的受体结合域(S-RBD)(SEQ ID NO:40)或其奥密克戎BA.4/BA.5变体之一，其中S蛋白的受体结合结构域是SEQ ID NO：44，

b)提供IgG分子的Fc片段，其中Fc片段包含铰链区，其中铰链区透过半胱氨酸残基的取代及/或缺失突变以形成突变的Fc，且突变的Fc无法形成二硫键，其中铰链区包含选自由SEQ ID NO：38及39所组成的组的氨基酸序列，以及

c)通过铰链区结合生物活性分子和突变的Fc。

31.一种融合蛋白，其选自由SEQ ID NO:53的S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5变体-sF。

32.一种组合物，包括(31)的融合蛋白。

33.如(32)的组合物，更包括Th/CTL肽，其中Th/CTL肽来衍生自SARS-CoV-2M、N或S蛋白、病原体蛋白或它们的任意组合，其中Th/CTL肽选自由SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意组合所组成的群组。

34.如(33)之组合物，其中Th/CTL肽选自由SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意组合所组成的群组。

35.一种COVID疫苗组合物，包括:

a)S-RBD奥密克戎BA.4/BA.5变体蛋白，选自SEQ ID NO:53；

b)Th/CTL肽选自由SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意组合所组成的群组；

c)药学上可接受的赋形剂，其中药学上可接受的赋形剂是佐剂、缓冲剂、表面活性剂、乳化剂、pH调节剂、盐水溶液、防腐剂、溶剂或其任意组合。

36.如(35)的COVID疫苗组合物，包括Th/CTL肽，其中Th/CTL肽肽选自由2、9、22、23、27、34、35、36及其任意组合所组成的群组。

37.如(36)的COVID疫苗组合物，其中药学上可接受的赋形剂是CpG1寡核苷酸、ALUM(磷酸铝或氢氧化铝)、组氨酸、组氨酸HCl·H2O、精氨酸HCl、吐温80(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)、盐酸、氯化钠和2-苯氧乙醇在水中的组合。

38.如(37)的COVID疫苗组合物，其中药学上可接受的赋形剂是CpG1(SEQ ID NO:67)。

39.一种预防COVID的方法，包括给予受试者药学上有效量如(35)的疫苗组合物。

40.一种预防COVID的方法，包括给予受试者药学上有效量如(36)的疫苗组合物。

41.一种产生针对SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/BA.5变体的抗体的方法，包括给予受试者药学上有效量如(35)的疫苗组合物。

42.一种产生针对SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/BA.5变体的抗体的方法，包括给予受试者药学上有效量如(36)的疫苗组合物。

43.一种COVID疫苗组合物，包含表15、19和20中任一项中所示量的组成。

44.一种转染编码如(31)融合蛋白cDNA序列的细胞株。

45.如(44)的细胞株，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

46.如(44)的细胞株，其中cDNA序列选自由SEQ ID NO:

64组成的群组。

实施例1

SARS-CoV2相关肽的合成

SARS-CoV-2相关之Th与CTL肽作为用于疫苗发展之免疫原，可被以对于血清学检测、实验室试验与田野研究为有用的小规模量来合成，以及以用于医药组合物之商业生产之大规模(千克)量来合成。具有长度从约9至40个氨基酸之SARS-CoV2相关之Th/CTL表位肽的一大组库(repertoire)被设计并选择为肽免疫原建构物用于疫苗制剂。

表1-3、8与10提供具有已知MHC结合活性之衍生自SARS-CoV-2M、N与S蛋白之Th/CTL肽的序列为设计者肽(例如，为了较佳之配制，于N端具有KKK为接头以增加其正电荷)用于内含于最终SARS-CoV2疫苗制剂。也使用一理想化之人工Th表位肽(SEQ ID Nos：36)为一催化剂，使疫苗组合物中之T细胞活化。

使用F-moc化学藉由Applied BioSystems Models 430A、431及/或433之肽合成器小规模来合成可用于免疫原研究或相关血清学测试的所有肽。每个肽皆为藉由在一固相支持物上的独立合成产生的，伴随于N端之F-moc保护与三官能氨基酸的侧链保护基团。于合成后，肽从固体支持物切开，伴随以90％三氟乙酸(TFA)去除侧链保护基团。藉由基质辅助激光脱附/游离飞行时间(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-Of-Flight,MALDI-TOF)质谱测定法(Mass Spectrometr)评估合成之肽制备物，以确认正确分子量与氨基酸内容。藉由反相HPLC(Reverse Phase HPLC,RP-HPLC)评估每个合成之肽以确认制备物之合成图谱(synthesis profile)与浓度。尽管对合成过程进行了严格控制，包括偶联效率的逐步监测，但由于在延长周期中的意外事件，包括氨基酸插入、缺失、取代与过早终止，肽类似物也被产生。因此，合成之制备物通常含有多个肽类似物，尽管数量很少，但仍与目标肽一起。

尽管包含了此种非预期的肽类似物，但所产生的肽制剂还是适合用于免疫学应用与作为肽免疫原。通常，此类肽类似物经常与纯化的肽一样有效，只要开发一个有辨识度的QC程序来监测制造与评估过程两者，以确保采用这些肽的最终产品的可重复性与有效性。在一个定制的自动肽合成仪UBI2003上，以15毫摩尔到150毫摩尔的规模进行了数百至数千克量的大规模肽合成。

对于在用于临床试验或商业用途的最终医药组合物中的活性成分，肽免疫原建构体在浅洗脱梯度下藉由制备型RP-HPLC来纯化，并藉由MALDI-TOF质谱、氨基酸分析与RP-HPLC来表征纯度与成份。

实施例2

设计、质粒建构与CHO细胞中之S-RBD融合蛋白的表达

1.cDNA序列之设计

cDNA序列编码SARS-CoV-2-RBD原始分离株(SEQ ID NO:54)、SARS-CoV-2-RBD VoC贝塔(SEQ ID NO:55)、SARS-RBD VoC奥密克戎(SEQ ID NO:56)、SARS-RBD-VoC德尔塔(SEQID NO:57)及SARS-CoV-2-RBD奥密克戎BA.4/BA.5(SEQ ID NO:58)以用于CHO细胞表达。为了产生S-RBD原始分离株-sFc(DNA SEQ ID NO:60)、SARS-CoV-2-RBD VoC贝塔-sFc(DNASEQ ID NO:61)、SARS-RBD VoC奥密克戎-sFc(DNA SEQ ID NO:62)、SARS-RBD-VoC德尔塔-sFc(DNA SEQ ID NO:63)及SARS-CoV-2-RBD奥密克戎变异BA.4/BA.5-sFc(DNA SEQ ID NO:64)融合蛋白，分别将编码SARS-CoV-2之S-RBD原始分离株与4个VoCs(aa331-530)(DNA SEQID NO:55-58)，包括SARS-CoV-2的奥密克戎BA.4/BA.5(aa331-530)(DNA SEQ ID NO:58)之核酸序列融合至免疫球蛋白Fc之单链(DNASEQ ID Nos：14)的N端，随着于图2中显示之质粒图谱。携带分别S-RBD VoC sFc蛋白，例如S-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc蛋白的基因的质粒会转染进CHO细胞系统并产生分别之S-RBD-sFc融合蛋白。

由于没有二硫键形成于铰链区中，与sFc融合之大蛋白质不会限制对应之S-RBD蛋白的表现。单链Fc的结构也具有经由“蛋白A结合与洗脱”纯化过程被纯化的优点。

2.质粒建构体与蛋白质表达

a.质粒建构体

为了表达S-RBD-sFc融合蛋白，于一合适的细胞株中产生编码这些目标蛋白质之分别的cDNA。cDNA片段的N端添加用于蛋白质分泌的前导信号序列(leader signalsequence)，而C端可连接至单链Fc(sFc)。将cDNA片段插入pND表达载体中，其含有用于筛选的新霉素(neomycin)抗性基因与用于基因扩增的dhfr基因。将载体与cDNA片段以PacI/EcoRV限制酶消化，然后连接，产生四个表达载体，每个表达载体对应pS-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc。

b.宿主细胞株

CHO-S^TM细胞株(Gibco,A1134601)为一稳定的非整倍体(aneuploidy)细胞株，由成年中国仓鼠的卵巢所建立。宿主细胞系CHO-S^TM适应于无血清悬浮生长，与FREESTYLE^TMMAX试剂相容，达高转染效率。CHO-S细胞被培养于补充有8mM谷氨酰胺补充剂(LifeTechnologies,Cat.25030081)与抗凝集试剂(anti-clumping agent)(Gibco,Cat.0010057DG)的DYNAMIS^TM培养基(Gibco,Cat.A26175-01)中。

ExpiCHO-S^TM细胞株(Gibco,Cat.A29127)为一CHO-S细胞株的选殖(clonal)衍生物。ExpiCHO-S^TM细胞在ExpiCHO^TM表达培养基(Gibco,Cat.A29100)中适应高密度悬浮培养，无需任何补充。细胞被维持于具有8％ CO₂之湿润气氛的一37℃培养箱中

c.瞬时表达(transient expression)

为了瞬时表达，使用EXPIFECTAMINE^TMCHO试剂盒(Gibco,Cat.A29129)将表达载体个别地转染进ExpiCHO-S细胞中。在转染后第1天，添加EXPIFECTAMINE^TMCHO增强剂与第一次馈料，并将细胞从具有8％ CO2之湿润气氛的一37℃培养箱转移至具有5％ CO2之湿润气氛的一32℃培养箱。之后，于转染后第5天天加第二次馈料，并于转染后12-14天之后收获细胞。于收获细胞培养物之后，藉离心与0.22-μm过滤将上清液澄清。分别藉由蛋白质A层析(Gibco,Cat.101006)与Ni-NTA层析(Invitrogen,Cat.R90101)来纯化含有单链Fc与His-标签的重组蛋白。

d.稳定转染与细胞筛选

使用FreeStyle MAX试剂(Gibco,Cat.16447500)将表达载体转染进CHO-S细胞中，且之后以含有8mM L-谷氨酰胺、以1:100稀释之抗凝集试剂、嘌呤霉素(puromycin)(InvovoGen,Cat.ant-pr-1)与MTX(Sigma,Cat.M8407)之选择DYNAMIS^TM培养基培养。经过2轮选择阶段后，获得四个稳定的池(pool)(1A、1B、2A、2B)。此外，将细胞克隆铺板(plated)在半固体CloneMedia(Molecular Devices,Cat.K8700)中，同时添加检测抗体，以用于经由高通量系统ClonePixTM2(CP2)的克隆筛选与单细胞分离。使用14天葡萄糖简单分批补料培养(simple fed-batch culture)在具有8mM谷氨酰胺与抗凝集试剂的DYNAMIS^TM培养基中筛选经由CP2挑选的克隆，而无需选择。在筛选后，藉由限制性稀释法(limiting dilution)执行具有高产量之克隆的单细胞分离，并使用CloneSelect Imager(Molecular Devices)藉由成像确认单克隆性(monoclonality)。

e.简单分批补料培养

使用一简单分批补料培养以确认表达重组蛋白之CHO-S细胞的生产力。以3x10⁵个细胞/mL将CHO-S细胞连同30mL DYNAMIS培养基补充、8mM谷氨酰胺与以1:100稀释之抗凝集试剂接种于125-mL摇瓶中。将细胞培养于具有8％ CO2之湿润气氛的一37℃培养箱中。于第3与5天添加4g/L之葡萄糖，并于第7天添加6g/L之葡萄糖。每日收集培养物以确认细胞密度、存活率(viability)与生产力，直到细胞存活率降至低于50％或达到第14天之培养。

f.基因转录本(transcript)之准确性

经由CHO-S表达细胞之基因转录的准确性系藉由RT-PCR来确认。简而言之，使用PURELINK^TMRNA迷你试剂盒(Invitrogen Cat.12183018A)来分离细胞之总RNA。之后，使用Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Cat.K1652)自总RNA反转录第一链cDNA(first strand cDNA)。将重组蛋白之cDNA进行纯化并接合进yT&A载体(Yeastern BiotechCo.,Ltd Cat.YC203)。最后，藉由DNA测序来确认cDNA序列。

g.表达细胞之稳定性

将细胞以1～2x10⁵个细胞/mL接种并培养于无选择试剂的一培养基中达60代。在此期间，一旦培养物之细胞密度达1.0x10⁶个细胞/mL或更高，将细胞培养物以1～2x10⁵个细胞/mL的细胞密度再次继代。在培养达60代后，使用葡萄糖简单分批补料培养将细胞性能与生产力与刚从LMCB被解冻之细胞比较。细胞中产品生产力之稳定性的标准为于培养60代后效价大于70％。

实施例3

sFc融合蛋白之纯化与生化特性描述

1.sFc融合蛋白之纯化

从含有所收获细胞培养物之培养基藉由蛋白质A-琼脂糖(sepharose)层析来纯化所有sFc融合蛋白。藉由一蛋白质A亲合管柱来捕捉sFc融合蛋白。在清洗与洗提后，将蛋白质溶液之pH调整至3.5。之后藉由1M Tris碱(Tris base)缓冲液，pH 10.8的添加，将蛋白质溶液中和至pH 6.0。融合蛋白之纯度藉由聚丙烯酰胺凝胶电泳来确认。根据于280nm之一波长的UV吸收来测量蛋白质浓度。

2.包含S1-RBD奥密克戎变体BA.4/BA.5-sFc融合蛋白之S1-RBDVoCs-sFc做为用于预防与治疗COVID之免疫原的S1-RBDVoCs-sFc融合蛋白的生化特性描述

根据于实施例2中所述之方法来制备与纯化S1-RBDVoCs-sFc proteins，包括S-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc蛋白质(SEQ ID NOs:49-53)作为高精确度设计疫苗制剂中的代表性免疫原融合蛋白以进行免疫原性评估。

在sFc融合蛋白之纯化后，使用考马斯蓝(Coomassie blue)染色藉由SDS-PAGE在非还原与还原条件下，来确认蛋白质的纯度)。图8为显示S1-RBD-sFc蛋白质之一高度纯化制备物于非还原条件(泳道2)与还原条件(泳道3)下的一影像。

将经纯化之蛋白质藉由质谱分析与与糖基化分析来描述特征。

a.S-RBD-sFc-LC质量分析与糖基化分析

i.糖基化

糖蛋白(glycoproteins)可具有两种类型之糖基化连接(glycosylationlinkage)：N-连接糖基化(N-linked glycosylation)与O-连接糖基化。N-连接糖基化通常发生在一序列内的一天冬酰胺(Asn)残基上：Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Xaa为除了Pro之任何氨基酸残基，且碳水化合物部分经由天冬酰胺之侧链上的NH₂附着在蛋白质上。O-连接糖基化利用一丝氨酸或苏氨酸残基之侧链OH基团。

S1-RBD-sFc的糖基化位点，藉由胰蛋白酶消化，接着LC-MS与MS/MS进行研究，其显示S1-RBD-sFc在氨基酸位置13(N13)的精氨酸残基上具有一个N-连接糖基化位点，在氨基酸位置211(S211)与224(S224)的丝氨酸残基上具有一个O-连接糖基化位点。

ii.N-糖基化

藉由质谱(MS)光谱技术分析S1-RBD-sFc的N-连接聚糖(glycan)结构。简而言之，使用PNGase F以从经纯化的蛋白质释放N-寡糖。之后进一步以2-氨苯甲酰胺(2-aminobenzamide,2-AB)标示N-聚糖之部分以增强在质谱分析中之聚糖信号。

iii.O-糖基化

藉由胰蛋白酶消化与随后之质谱光谱技术研究S1-RBD-sFc的O-连接聚糖。在胰蛋白酶消化后，收集包含O-连接聚糖之波峰且藉由质谱确认它们的分子量。

iv.LC质谱分析

藉由LC质谱分析来特征描述经纯化之S1-RBD-sFc蛋白。基于其氨基酸序列S1-RBD-sFc蛋白之理论分子量为48,347.04Da。S1-RBD-sFc蛋白之质谱图谱，具有一主要波峰于49,984.51Da。在理论分子量与经由LC质谱分析观察到之重量之间的差距为1,637.47Da，其暗示经纯化之S1-RBD-sFc蛋白含有N-及/或O-聚糖。

图7图解说明药物物质(drug substance,DS)S1-RBDVoC-sFc的一般制造制程。此制程起始自工作细胞库(Working Cell Bank,WCB)以接种细胞种子并在2000L分批补料生物反应器中扩大培养物。于细胞培养制程后，收集未处理之原液(bulk)，并将其经由无菌过滤来澄清以产生经澄清的原液。为了纯化药物物质，原液经由蛋白质A亲和层析、深度过滤(Depth Filtration)与离子交换(Ion-exchange,IEX)层析，然后是切向流过滤(Tangential Flow Filtration,TFF)以缓冲液交换，以达成经配制的DS。为避免外来病毒污染，经澄清的原液也经过具有溶剂清洁剂处理、蛋白质A层析中的酸灭活与纳滤(nano-filtration)的制程。最后，在无菌过滤后产生经配制之S1-RBDVoCs-sFc DS，包括S-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc DS浓缩物。

实施例4

针对SARS-CoV2设计之蛋白质/肽的制造的混合制程

图10A及10B图解说明针对SARS-CoV2之VoCs的设计多重表位(multitope)COVID疫苗之制造的复合制程。为了产生疫苗产品，制程为相继添加肽、CpG1、明矾(Alum)佐剂与蛋白质成分于溶液中。首先，将Th/CTL肽添加至WFI且之后接着添加CpG1于肽溶液中以形成肽/CpG1复合物。此后，将蛋白质缓冲液、明矾与NaCl添加到含有肽/CpG1/明矾/NaCl之复合物的溶液中。最后，S1-RBDVoCs-sFc蛋白液或S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5-sFc蛋白液被添加、良好地混合，并调整蛋白质浓度、pH与其他缓冲液条件以达成最终疫苗产品。

实施例5

设计蛋白质/肽COVID疫苗产品与安慰剂

设计于临床前、1、2与3期临床试验或扩展加强疫苗接种中使用的设计COVID疫苗以激活体液与细胞反应两者。对于SARS-CoV-2免疫原，COVID疫苗产品结合CHO-表达之S1-RBD-sFc融合蛋白(原始分离株或奥密克戎BA.4/BA.5变体)与合成之T辅助(Th)与胞毒型T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)表位肽的混合物，其系择自已知与人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)I与II结合的免疫显性M、S2与N区。疫苗产品之制备系由混合(compounding)、过滤、混合与填充操作所组成。在添加亚单位蛋白质S1-RBD-sFc之前，经由一0.22微米膜过滤器来过滤疫苗之个别的成分，包括肽溶液(2μg/mL)、CpG1、专属(proprietary)寡核苷酸(oligonucleotide,ODN)、溶液(2μg/mL)、含40mM组氨酸、500mM精氨酸与0.6％ Tween80之10X蛋白质缓冲液、20％氯化钠储备溶液。在相继添加各个成分后，将S1-RBD-sFc融合蛋白与肽与上述成分一起配制以形成一蛋白质-肽复合物，之后被吸附在磷酸铝佐剂上。最后一步是加入含有2-苯氧乙醇防腐剂溶液的注射用水，使最终的药物产品达到200μg/mL。将完成之疫苗产品储存于2至8℃。

于所有试验中使用之安慰剂为无菌0.9％生理食盐水(normal saline)。

实施例6

用于COVID疫苗之B细胞或T细胞免疫原性之评估的补充方法

1.根据ELISA之抗S1-RBD_WT结合IgG抗体

将96-孔ELISA板以2μg/mL重组S1-RBDWT-His蛋白质抗原(100μL/孔于涂覆缓冲液，0.1M碳酸钠，pH 9.6)涂覆并于室温隔夜培养(16至18小时)。100μL/孔之连续稀释血清样本(从1:20、1:1,000、1:10,000与1:100,000被稀释，共4个稀释)以2重复被添加，并将板于37℃培养1小时。将板以250μL清洗缓冲液(PBS-0.05％ Tween 20,pH 7.4)清洗六次。经结合之抗体以HRP-rProtein A/G于37℃检测30分钟，接着六次清洗。最后添加100μL/孔之于基质工作溶液(Substrate Working Solution)(含有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液)制备的TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine))并于黑暗中于37℃培养15分钟，且藉由添加100μL/孔之H₂SO₄，1.0M终止反应。在ELISA读板器(MolecularDevice,VersaMax)上测量显色的样品颜色。使用EIA效价计算程序计算相关效价。抗S1-RBD抗体水平被表示为一测试样本之一终点稀释的Log₁₀(SoftMax Pro 6.5,二次拟合曲线(Quadratic fitting curve)，阀值0.248)。

2.以ELISA分析RBDWT结合ACE2的抑制

将96-孔ELISA板以2μg/mL ACE2-ECD-Fc抗原(100μL/孔于涂覆缓冲液中，0.1M碳酸钠，pH 9.6)涂覆并于4℃隔夜培养(16至18小时)。使用一自动微孔板清洗器将板以清洗缓冲液(具有0.05％ Tween 20之磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)的25倍溶液，pH 7.0-7.4，250μL/孔/清洗)清洗六次。额外的结合位点被200μL/孔的封闭溶液(5NHCl、蔗糖、Triton X-100、酪蛋白与Trizma碱)所封闭。将免疫血清或一阳性对照组的一五倍稀释物(稀释于含有载体蛋白与防腐剂的一缓冲盐溶液中)与一1:100稀释之RBDWT-HRP结合物(conjugate)(辣根过氧化物酶结合之重组蛋白S1-RBD-His(horseradishperoxidase-conjugated recombinant protein S1-RBD-His))混合，于25±2℃培养于30±2分钟，清洗，并添加TMB基质(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)稀释于含有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液)。藉由终止溶液(经稀释之硫酸，H₂SO₄，溶液，1.0M)停止反应，并使用微孔板读取仪(VersaMax)于10分钟内读取各孔洞于450nm的吸收。用于定量的校准标准范围为0.16至2.5μg/mL。具有低于0.16μg/mL之效价值的样本被定义为检测限的一半。具有效价超过2.5μg/mL的样本被进一步稀释以进行再分析。

3.根据基于CPE的活病毒中和测定法分析针对SARS-CoV-2野生型与变体的病毒中和抗体效价

中和抗体效价藉由基于CPE的活病毒中和测定法使用以野生型(SARS-CoV-2-Taiwan-CDC#4,原始分离株)与德尔塔变体(SARS-CoV-2-Taiwan-CDC#1144,B.1.617.2)挑战之Vero-E6细胞来测量，其在台湾地区“中央研究院”的一BSL-3实验室被执行。Vero-E6(CRL-1586)细胞于补充有10％胎牛血清(FBS,Gibco)与1x青霉素-链霉素溶液(Thermo)之DMEM(Hyclone)中在具有5％ CO₂之湿润气氛于37℃被培养。以1.2×10⁴细胞/100μL/孔来接种96-孔微效价板。将板于37℃于一CO₂培养箱隔夜培养。隔日，测试的血清在56℃加热30分钟以灭活补体，且之后在DMEM(补充有2％ FBS与1x青霉素/链霉素)中稀释。对稀释物执行血清之连续2倍稀释。50μL之经稀释的血清与一等体积之病毒(100TCID50)混合并于37℃培养1小时。于移除隔夜培养物培养基之后，100μL之血清-病毒混合物以三重复被接种于一在96孔板中之Vero-E6细胞之铺满的一单层(confluent monolayer)上。在于37℃以5％ CO₂培养4天之后，将细胞以10％甲醛(formaldehyde)固定，并以0.5％结晶紫染色溶液于室温染色20分钟。个别之孔就CPE方面被评分为“感染”或“无感染”的二元结果。SARS-CoV-2病毒专一性中和效价的确认是根据VNT₅₀效价之原理(病毒诱导的细胞病变效应(cytopathic effects)之≥50％减少)来测量针对SARS-CoV-2病毒的中和抗体效价。血清的病毒中和效价被定义为观察到细胞病变效应减少50％时最高血清稀释度的倒数，结果藉由Reed与Muench的方法计算。

4.以伪病毒(pesudovirus)测定分析针对奥密克戎BA.1/BA.2/BA.5的中和效价

中和抗体效价系藉由中和测定使用以SARS-CoV-2伪病毒变体挑战的HEK-293T-ACE2细胞来测量。此研究于台湾地区“中央研究院”生医转译研究中心(BiomedicalTranslation Research Center,Bio TReC)RNAi core的一BSL2实验室执行。人胚肾(HEK-293T/17；CRL-11268^TM)细胞获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection,ATCC)。将细胞培养于补充有10％胎牛血清(Hyclone)与100U/mL之青霉素-链霉素溶液(Gibco)的DMEM(Gibco)中，且之后37℃在具有5％ CO₂之湿润气氛中培养。HEK-293T-ACE2细胞是藉由携带人ACE2基因的VSV-G伪型慢病毒(pseudotypedlentivirus)的转导所产生。为了产生SARS-CoV-2伪病毒，使用TransIT-LT1转染试剂(Mirus Bio)，将表现C端截短的野生型原始分离-Hu-1株SARS-CoV-2刺突蛋白(spikeprotein)的一质粒(pcDNA3.1-nCoV-SΔ18)共转染进具有包装与报告质粒的HEK-293T/17细胞(分别为pCMVΔ8.91与pLAS2w.FLuc.Ppuro)(BioTReC,Academia Sinica)。藉由改变原始分离-Hu-1参考菌株的核苷酸，使用定点诱变(site-directed mutagenesis)来产生奥密克戎BA.1、BA.2与BA.4/BA.5变体。对于BA.1变体，刺突蛋白之突变为A67V、Δ69-70、T95I、G142D/Δ143-145、Δ211/L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F。对于BA.2变体，刺突蛋白之突变为T19I、L24S、Δ25-27、G142D、V213G、G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K。对于BA.4/5变体，刺突蛋白之突变为T19I、L24S、Δ25-27、Δ69-70、G142D、V213G、G339D、S371F、S373P、S375F、T,376A、D405N、R408S、K417N、N440K、L452R、S477N、T478K、E484A、L486V、Q493、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、N764K、D796Y、N856K与Q954H&L969K。

藉由使用TransITR-LT1转染试剂(Mirus Bio)将指示的质粒递送到HEK-293T/17细胞中以产生不同的SARS-CoV-2伪病毒。于72小时转染后，藉由以4,000xg离心10分钟来移除细胞残骸，且将上清液收集、过滤(0.45μm,Pall Corporation)与冷冻于-80℃直至使用。将HEK-293-hACE2 cells(1x104cells/well)接种于96孔白色分离平板(isoplates)并隔夜培养。测试的血清在56℃加热30分钟以灭活补体，且在培养基(补充有1％ FBS与100U/ml青霉素/链霉素之DMEM)中稀释，且之后执行连续2倍稀释，共8次稀释。再添加至具有细胞之板之前，25μL之经稀释的血清与一等体积之伪病毒(1,000TU)混合并于37℃培养1小时。在1小时培养之后，将50μL混合物以指定之稀释系数(factor)添加至具有细胞含有每孔50μL之DMEM培养物之板在接下来的16小时培养中，以50μL新鲜培养基(补充有10％ FBS与100U/ml青霉素/链霉素的DMEM)来替换培养物培养基。于72小时感染后，将细胞裂解，并使用Bright-Glo^TM荧光素酶检测系统(Luciferase Assay System)(Promega)来测量相对光单位(relative light units,RLU)。藉由Tecan i-control(Infinite 500)来检测荧光素酶活性。抑制百分比计算为稀释血清存在下RLU减少与仅有病毒控制组的RLU值的比值，计算公式如下所示：(RLU^控制组-RLU^血清)/RLU^控制组。藉由Reed与Muench方法来确认50％保护效价(NT50titer)。

5.ELISPOT分析T细胞的反应

于T细胞反应之检测中使用人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclearcells,PBMCs)。对于加强系列第三剂系列扩展研究，人类IFN-γ/IL-4FluoroSpot^PLUS试剂盒(MABTECH)执行ELISpot检验。将250,000PBMCs之可分量(aliquots)接种于各孔并分别以10μg/mL(各刺激物)之RBD-WT+Th/CTL、Th/CTL或Th/CTL池无UBITh1a(CoV2肽)下刺激，且在37℃与5％ CO₂下单独在培养基中培养24小时，作为每个板的阴性对照组。根据制造商指南执行分析。通过减去负对照组孔来计算每百万个细胞的斑点形成单位(pot-forming unit,SFU)。

6.胞内细胞因子染色(Intracellular cytokine staining,ICS)

使用胞内细胞因子染色与流氏细胞术(flow cytometry)来评估CD4+与CD8+T细胞反应。PBMCs分别被以S1-RBD-His重组蛋白加上Th/CTL肽池、仅有Th/CTL肽池、CoV2肽、PMA+Inonmycin(作为阳性对照)或单独培养于培养基中作为阴性对照，在37℃与具5％ CO₂下6小时。刺激后，清洗细胞并于室温以活性染料(viability dye)染色20分钟，之后于室温进行表面染色20分钟，于室温以BD cytofix/cytoperm试剂盒(Catalog#554714)进行细胞固定与透化(permeabilization)20分钟，且之后于室温进行细胞内染色20分钟。使用IFN-γ、IL-2与IL-4之胞内细胞因子染色来评估CD4+T细胞反应。使用IFN-γ、IL-2、CD107a与颗粒酶(Granzyme)B之胞内细胞因子染色来评估CD8+T细胞反应。染色完成后，使用BD FACSDiva软件在FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)中分析细胞。

7.统计学

对于II期延长加强疫苗接种(extension booster vaccination)研究。几何平均效价(Geometric Mean Titer,GMT)的免疫原性结果以95％置信区间(confidenceintervals)呈现。使用Version 9.4(SAS Institute,Cary,NC,USA)或Wilcoxon符号排序检定(Wilcoxon sign rank test)进行统计分析。Spearman相关性用于评估非常态分布数据集(data set)之间的单调关系(monotonic relationship)。对于II期主要2-剂系列，试验设计的样本数量符合在具有健康成年人疫苗组中之3,000名研究参与者的最低安全要求，如美国FDA与WHO所建议。

实施例7

含有分别之S1-RBD融合蛋白(S1-RBD_VoCs-sFc及S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5变体)的针对SARS-CoV-2感染的高精准设计疫苗

1.一般设计

针对病毒感染的一有效免疫反应取决于体液免疫与细胞免疫两者。更具体而言，高精确度设计预防性疫苗的潜力将采用设计免疫原，肽或蛋白质，为(1)经由在涉及病毒对于在目标细胞上之其受体结合之病毒蛋白上之B细胞表位之使用的中和抗体的诱导；(2)经由内源性Th与CTL表位之使用之针对入侵的病毒抗原之包括初级与记忆B细胞与CD8+T细胞反应的细胞反应的诱导的活性医药成分。此类疫苗可与ALHYDROGEL、ADJUPHOS、MONTANIDEISA、CpG等佐剂与其他赋形剂一起配制，以增强高精确度设计免疫原的免疫原性。

2.使用CHO细胞表达S-RBD-sFc蛋白(SEQ ID NO：49之氨基酸序列与SEQ ID NO：60 之核酸序列)为B细胞免疫原的代表性设计COVID-19疫苗UB-612

此蛋白质是被设计与制备以呈递具有在RBD内之非常碳水化合物结构(verycarbohydrate structure)的SARS CoV-2刺突(Spike,S)蛋白质上的受体结合区域(RBD)，以在免疫时诱导高亲和力中和抗体。疫苗也可以使用设计肽合并能够促进宿主特异性Th细胞介导的免疫的内源性SARS-CoV-2Th与CTL表位肽的混合物，促进对SARS-CoV-2之病毒专一性初级与记忆B细胞与CTL的反应，以避免SARS-CoV-2感染。有效的疫苗需要启动记忆T细胞与B细胞，以便在病毒感染/挑战时快速回忆。

为了提高所公开的设计免疫原的有效性，采用了两种代表性的佐剂配方明矾(ALUM)(ALHYDROGEL/CpG、 /CpG与MONTANIDE^TMISA/CpG)来诱导最佳之之抗SARS-CoV-2免疫反应。

明矾(ADJUPHOS与ALHYDROGEL)被普遍接受为人类疫苗的佐剂。此佐剂藉由提高设计免疫原之抗原呈递细胞(APCs)的吸引与摄入来诱导一Th2反应。MONTANIDE^TMISA 51是一种油，当与水相设计肽/蛋白质免疫原混合时会形成一乳状液，以引发对SARS-CoV-2的有效免疫反应。CpGs寡核苷酸为TLR9激动剂，其改善抗原呈递与疫苗特异性细胞与体液反应的诱导。通常，带负电荷的CpG分子与带正电荷的设计免疫原结合形成适合抗原呈递的免疫刺激复合物，以进一步增强免疫反应。

相较于使用灭活病毒裂解物或其他特征较少的免疫原之具有更复杂之免疫原内容之疫苗的弱的或不合适的抗体呈递，根据如于表7中所示的疫苗组合物所制备之所揭露的高精确度设计疫苗(例如UB-612)具有产生高特异性免疫反应的优点。此外，在COVID-19疫苗开发中存在与称为抗体依赖性增强(antibody-dependent enhancement,ADE)的机制相关的潜在缺陷。具体而言，ADE为一种现象，其中病毒对于非中和抗体的结合会增强其进入宿主细胞，有时还会增强其复制。这种导致传染性与毒力两者增加的机制已在蚊媒黄病毒、HIV与冠状病毒中观察到。所揭露的高精确度疫苗系被设计来藉由监测抗体反应的质量与数量来避免疫苗诱导之疾病增强，由于它们将决定功能结果。

实施例8与实施例9中讨论的代表性研究阐述了设计所揭露的高精确度SARS-CoV-2疫苗的方法，这些疫苗是安全的，可以促进抗体之引发，这些抗体能够(1)结合至CHO表达之S1-RBD-sFc蛋白；(2)抑制S1蛋白对固定在微孔表面或细胞表面上过表达ACE2受体蛋白的ACE2受体的结合，与(3)在细胞介导的中和试验中中和病毒介导的细胞病变效应。

实施例8

UB-612(SARS-CoV-2(原始分离株)蛋白质-肽疫苗)第1/2期临床试验中所证实之强效加强与长效免疫

1.试验程序与安全性

a.第1期临床试验之主要与加强第三剂系列

1期试验由6名参与者之哨兵小组(sentinel group)开始，接受低10-μg剂量，若无与疫苗相关的≥3级不良反应，则剩余14名参与者随后进行。同样的程序被扩展到逐步上升之30与100-μg剂量组。在第14天、第28天、第35天、第42天、第56天、第112天与第196天为所有参与者安排了额外的后续访问(follow-up visit)。研究参与者安排在加强后第14天与第84天访问。对要完成7天期间之参与者在每次注射后提供电子日记，以记录注射部位的所引发之局部反应(疼痛、硬结/肿胀、皮疹/发红、瘙痒与蜂窝织炎)与所引发的全身反应(17种不同的体质症状)。使用从无到危及生命的5级(0到4)等级对严重程度进行分级。此外，参与者从疫苗接种当天开始每天晚上记录他们的腋窝温度，并至后续6天。安全性终点包括于此中期1期延长报告中之加强后上至14天报告的非要求AEs。

b.第2期临床试验之主要系列

第2期临床试验的主要安全性终点是评估接受研究干预的所有参与者从第1天到第57天(第二次给药后28天)的安全性与耐受性。在每次注射之前和之后评估生命体征。每次注射后观察参与者30分钟的生命体征变化或任何急性过敏反应。每次注射后，参与者必须在他们的自我评估电子日记中记录达7天之所引发之局部与全身性AE，而在他们的电子日记中记录皮肤过敏反应达十四天。安全性终点包括于此中期2期报告中报告的第1天至第57天的非要求AE。

2.结果

a.试验群体

i.第1期临床试验主要与加强第三剂系列

开放标签(open-label)第1期临床试验参与者的特征包括涉及接受了两剂(间隔28天)10、30或100μg的UB-612之在三个剂量组(每个n＝20)中之60名健康成年人(年龄20-55岁)之196天的主要系列研究；与在主要系列之后的84天延长加强疫苗接种，其中对于10-μg(n＝17)、30-μg(n＝15)与100-μg(n＝18)组，50名参与者被编入在第二次注射后的7.6至9.6个月之间接受额外的100μg加强。在这份中期报告中，经加强的参与者被追踪14天，以评估安全性与免疫原性，随后监测至加强后的84天。

ii.第2期临床试验主要2剂系列

第2期临床试验为用随机双盲设计。总共3,875名参与者其接受至少一剂100μg疫苗(3,321人接受了UB-612与554人接受了安慰剂，比例6:1)被编入与包含于安全群体，其中1012名参与者(疫苗组871人与安慰剂组141人)被包含在可评估的免疫原性群体中。接受UB-612的参与者的平均年龄为44.9岁(18至83岁)，而安慰剂组参与者的平均年龄为44.4岁(19至84岁)。对于UB-612与安慰剂组两者，年轻成年人(18至65岁)与年长成年人(≥65岁)的比例约为80:20。除5人外，所有参与者皆为中国台湾人。

b.反应原性(reactogenicity)与安全性

i.第1期临床试验主要2-剂与加强第三剂系列

在196天的主要系列中与加强免疫后达14天，既没有记录到疫苗相关的严重不良事件(SAE，包括3/4级AE)，也没有记录到在发病率(incidence)或严重程度中的剂量限制(dose-limited)增加。所有疫苗接种组中在7天内报告的所引发之局部性与全身性AE均为轻度至中度(1/2级)与短暂性，随着相较于局部性反应，大部分全身性反应的频率较低。第一次与第二次疫苗接种后引起的所引发之局部性AE发生率相当，在加强剂后略有增加，最常见的加强后所引发之局部性AE为注射部位的疼痛(60-71％)。每次疫苗接种后引发的全身性AE的发生率相似，最常见的加强后所引发之全身性AE为疲劳(11-33％)。在主要2剂疫苗接种系列与加强期中观察到的安全性图谱(safety profile)相似。

ii.第2期临床试验主要2剂系列

并无与疫苗相关的SAE。局部与全身AE皆为轻度和短暂的，并为在几天内自限性的。总体而言，在1与2剂后，2546名参与者报告了所引发之局部性AE，其中2386名(72.0％)来自UB-612，160名(28.9％)来自安慰剂组。这些局部性AE的严重程度为轻度(1级)至中度(2级)，最常见的事件是疫苗组2,246名(67.8％)参与者中的注射部位疼痛，以及偶发的皮肤过敏反应。

介于UB-612疫苗组和安慰剂组之间跨年龄层之所引发的全身性AE的发生率并无显著差异(P>0.05)。疫苗组中38.6％的年长参与者(65-85岁)报告了所引发之全身性AE，相较于63.3％之总安全群体。最常见之所引发的全身性AE为于1,488名(44.9％)之UB-612治疗参与者中报告的疲劳/疲倦，并且通常是轻微的。

c.针对活SARS-CoV-2野生型与德尔塔变体的中和抗体，以及针对假SARS-CoV2野生型与包括阿尔法、贝塔、伽马与奥密克戎的VoC的中和抗体

i.第1期临床试验主要2剂与加强第三剂系列

在第2剂后7.6-9.6个月给予100μg的加强剂量，在100％的参与者中诱导了针对活的SARS-CoV-2野生型(WT，原始分离株)与德尔塔变体的强大中和抗体(第11图)。在10-、30-和100-μg UB-612剂量组中，加强剂引起针对WT之几何平均50％病毒中和效价(VNT₅₀)分别为4643、3698与3992(第11A-11D图)，表示相较于主要系列中的峰值反应(2剂后14天，即第42天)，分别增加104、118与37倍(几何平均倍数增加，GMFI(geometric mean foldincreases))，与(b)GMFI分别为465、216与65超过了加强前的程度。相较于住院COVID-19病例发病后～1个月收集的一组(panel)人类恢复期血清(human convalescent sera,HCS)，加强后中和抗体程度分别高出45.5倍、36.2倍与39.1倍(GMFI)。以WHO参考抗血清标准化并以国际单位(IU/mL)表示，同一活病毒测试中的中和抗体效价相似。

加强剂量也诱导了针对活德尔塔变体的显著高的VNT₅₀效价，达到2854、1646与2358(第12A图)，其代表相对于WT株，对于10-、30-与100-μg组之1.6、2.4与1.7的适度GMFR(即，分别保存～63％、～42％与～60％之中和强度)。表11显示了针对SARS-CoV-2野生型(WT)和德尔塔变体的加强后病毒中和抗体滴度的比较，这些抗体效价来自从不同疫苗平台接受第三次(加强)注射的疫苗接种者收集的血清，在与其它平台(NVX-CoV2373、mRNA-1273、BNT 162B2、MVC-COV1901、CoronaVac及AZD1222)相比，针对Delta株UB-612具有的最高的GMT，且WT/德尔塔(GMFR)显示这些UB-612加强剂血清在Delta中和能力方面具有很高的保存性(表11)。

评估对100-μg组(n＝18)加强后14天观察到的pVNT₅₀，对于针对伪SARS-CoV-2野生型(WT)与包含奥密克戎的其他VoC之其交叉反应中和抗体效价，如于第12B图所示。相较于野生型之14,171，针对WT、奥密克戎、阿尔法、伽马与贝塔的pVNT₅₀分别为12,778、2,325、9,300、13,408与4,974，相对于WT株，GMRF分别为5.5、1.4、1.0与2.6(即分别保持18.2％、72.7％、105％与38.9％的中和强度)

相较于较低剂量的10-与30-μg，主要系列中的中和抗体在100-μg组中较持久，与在2剂后14至28天观察到之针对WT的VNT50的最大增加有关(第11A-11C图)。100-μg组中的峰值中和抗体GMT(第42天为108；第56天为103)(第11C图)接近控制人类恢复期血清(HCS)组之GMT的102。对于100μg剂量，基于SARS-CoV-2中和抗体效价在第1期临床试验第57天的血清转化(seroconversion)率为100％，此后在整个监测期间保持为100％。

在施打加强剂前(第255至316天)，在100-μg组中的18名参与者(0％)VNT₅₀效价均未低于检测极限(LLOQ)，显示诱导的中和效应持续很长期间。使用一阶指数模型拟合(SigmaPlot)计算第1期临床试验100-μg组施打2剂后的抗体持久性，用于第42至196天的抗WT中和VNT₅₀(r²＝0.9877，衰减率常数K_el＝-0.0037；t_1/2＝0.693/K_el)。随着187天之t_1/2，中和抗体VNT₅₀GMT缓慢下降(第12C图)。

我们也以自100-μg UB-612剂量组的第1期临床试验主要系列的所有血清样本(n＝20)研究在第1期临床试验主要疫苗接种阶段期间针对德尔塔与其他VoC的中和作用(第13图)。结果显示保留了病毒中和活性，特别是针对Delta B.1.617.2变体，对其而言，相对于野生型原始分离株株保留了63％的中和活性(1.6之GMFR)。还保留了针对阿尔法(B.1.1.7)变体的显著中和抗体，具有91％保留(1.1之GMFR)，伽马(P.1)变体具有56％保留(1.8之GMFR)，而针对贝塔B.1.351较弱，具有20％保留(5.1之GMFR)。

ii.第2期临床试验主要2剂

于第57天(第2剂后4周)，跨所有年龄(18至85岁)的参与者，抗S1-RBD效价的GMT为518.8(图14A)而针对原始野生(WT原始分离株)株的病毒中和效价为年龄依赖性的，总VNT50为87.2(图14B)。相较于年轻成年人(18至65岁)具有较高之VNT50为96.4，其与在20-55岁的第1期临床试验研究参与者(VNT₅₀为103)观察到可再现地接近(图11C)，而年长成年人(≥65岁)表现出较低的VNT₅₀为51.6。进行具有加强第三剂的第2期临床试验的延长研究。在第2阶段中涵盖所有年龄(18至85岁)的受试者，基于野生型SARS-CoV-2中和抗体效价在第57天(或1剂后第56天)的血清转化率从年长者的88.6％到年轻成年人的96.4％。

在第57天，观察到大量程度的抗德尔塔中和抗体。从跨年龄组的疫苗接种者中随机选择48份血清样本池(n＝39对于18-65岁的年轻成年人；n＝9对于≥65岁的年长成年人)在两个独立实验室接受了特设活病毒检测分析(ad hoc live virus assay analysis)(台湾地区“中央研究院”与加利福尼亚病毒与立克次体病部)。结果是一致的，显示免疫血清可以中和两个关键的SARS-CoV-2原型，其VNT50相似：针对于中国台湾获得的原始分离株WT的329，与针对于美国之USA WA 1/2020的308(第15图)。相较于USA WA 1/2020变体，针对阿尔法B.1.1.7与Delta B.1617.2的VNT50估计分别为122与222，代表减少了2.7倍与1.4倍。

d.针对结合至ACE2受体之S1-RBD的中和抗体

i.第1期临床试验主要2剂与加强第三剂系列

针对S1-RBD:ACE2相互作用的功能性抑制(中和)的ELISA结果(图16)与VNT50数据(图11)基本一致。100-μg剂量组表现出最高的中和效价(图16C)，在第112天抗S1-RBD:ACE2定量中和抗体(qNeuAb)水平为6.4μg/mL，相较于来自20人类恢复期血清(HCS)之1.4μg/mL增加了4.6倍。加强接种后，抗S1-RBD:ACE2 qNeuAb水平达到303至521μg/mL，代表比主要系列疫苗接种后的峰值增加77至168倍；类似地，与加强前水平相比，观察到显著的82至579倍增加(图16A-16C)。因此，UB-612加强剂可以在接种对像中引发显著的免疫反应，无论它们的增强前水平有多低。

ELISA上S1-RBD:ACE2结合的中和与VNT50的研究结果有很好的相关性(Spearman’s r＝0.9012)(第16D图)因此通过细胞病变效应(CPE)测定证实了抗WT VNT50结果的有效性(第16A-16C图)。此外，加强后抗S1-RBD:ACE2 qNeuAb程度为303至521μg/mL(第16A-16C图)，比人类恢复期血清(HCS)高216至372倍。这显示相较于在病毒S1-RBD与ACE2受体相互作用的正构(orthosteric)(RBD)位点，HCS中的大多数抗体似乎更多地与变构(allosteric)位点(S1的N或C-末端结构域)结合。

e.S1-RBD Ig G抗体ELISA反应

i.第1期临床试验

藉由ELISA测量的S1-RBD结合抗体(第17图)再次显示，100-μg接种组在196天的主要系列中引发了最高的免疫反应，第42天的GMT为2,240，其远远超过了来自20位人类恢复期血清(HCS)之141的GMT。接种加强疫苗后，三个剂量组中之抗S1-RBD GMT于7,154至9,863达到峰值(比主要系列期间的峰值增加3至28倍(GMFIs))；同样，与加强前程度相比，观察到了37至378倍的显著增长。

f.ELISpot之T细胞反应

i.第1期临床试验

在1期试验的主要疫苗接种系列中，从接种者收集外周血单核细胞(PBMC)以藉由干扰素-γ+(IFN-γ+)-ELISpot进行评估(图18A-18C)。在100-μg剂量组中观察到最高的抗原特异性反应：在第35天，以S1-RBD+Th/CTL肽池刺激后有254个斑点形成单位(SFU)/106个PBMC，以Th/CTL肽池单独刺激后有173个(第18C图)，证明UB-612疫苗中的Th/CTL肽主要负责T细胞反应。

在第196天，100-μg剂量组的IFN-γ+ELISpot反应维持在峰值反应的～50％程度，以RBD+Th/CTL肽池重新刺激从254个SFU/10⁶个细胞减少到121个SFU/10⁶个细胞，或仅以Th/CTL肽池重新刺激从173减少到86.8个SFU/10⁶个细胞。这一观察表明，UB-612疫苗在两剂疫苗后引起的T细胞反应至少持续了6个月。这与前面提到的中和抗体的持久性是一致的(图11C)。

ii.第2期临床试验

在第2期临床试验中，也观察到第57天强的IFN-γ+-ELISpot反应：几何平均值，以S1-RBD+Th/CTL重新刺激为370个(SFU/106个细胞)，以Th/CTL重新刺激为322个，以Th/CTL肽肽池无UBITh1a为181个(图18D)，其皆远高于安慰剂组的对应物(p<0.0001)。与IFN-γ相比，IL-4的反应要低得多：分别为13.6、7.5与5.4(图18E)。整体ELISpot结果指出，Th/CTL肽之内含物是T细胞反应必不可少的且主要负责，而重组蛋白S1-RBD仅起次要作用。重要的是，T细胞反应的方向主要是Th1导向的。UBITh1a像往常一样起着催化剂的作用，藉由病毒专一性的Th/CTL肽池触发Th1反应。

g.细胞内细胞因子染色(ICS)的CD4+与CD8+T细胞反应

i.第2期临床试验

T细胞反应藉由细胞内细胞因子染色(ICS)被评估(第16图)。跨三个肽再刺激组观察到IFN-γ与IL-2产生之CD4+与CD8+细胞显著增加；并且，与ELISpot的发现一致(第18D-18E图)，检测到较低的IL-4产生之CD4+T细胞，证实了T细胞反应的Th1优势。

在分别以S1-RBD+Th/CTL、Th/CTL与Th/CTL池无UBITh1a再刺激后，观察到表达细胞毒性标志物CD107a与颗粒酶B的CD8+T细胞，占循环CD8+T细胞的3.5％、2.1％与1.8％。总体而言，UB-612引发了具有强大CD8+细胞毒性T细胞反应的Th1导向免疫，其将有利于病毒感染的清除，并且再刺激结果指出包括非刺突核衣壳(nucleocapsid)(N)与膜(M)结构蛋白之Th/CTL肽，是负责T细胞免疫的主要因素。

3.结论

并未记录到与疫苗相关的严重不良事件(SAE)。最常见的所引发之AE为注射部位疼痛与疲劳，大多是轻微与短暂的。在这两项试验中，UB-612引发了类似于一组之人类恢复期血清之分别的中和抗体效价。最引人注目的发现是：针对包括德尔塔与奥密克戎的SARS-CoV2 VoCs的持久病毒中和抗体与广泛的T细胞免疫，以及针对德尔塔与奥密克戎变体具有高交叉反应中和效价之强的加强记忆免疫。

UB-612具有良好的安全性图谱、针对VoC的有效加强作用以及持久的B与广泛的T细胞免疫，值得进一步开发其他COVID-19疫苗的主要免疫与异源加强。

特别值得注意的是，5个精确设计的T细胞表位肽代表了来自N、M与S2蛋白的沙比克病毒(Sarbecovirus)区域的Th与CTL表位肽。这些表位肽跨包括德尔塔与奥密克戎的所有关切变体为高度保守，并且是混杂的表位，其允许在广泛的群体中诱导记忆回忆、T细胞启动和效应子功能。因此，除了关于UB-612之加强第3剂之有效的抗德尔塔与抗奥密克戎作用外，持久而强大的T细胞免疫可针对包括奥密克戎的所有VoC有效。由于目前批准的COVID疫苗无法识别非刺突结构M与N蛋白，UB-612疫苗具有良好的立场来抵御新的关切变体，如德尔塔与奥密克戎，其需要大规模的田野试验进行评估。

实施例9

UB-612第2期临床试验加强剂接种相较于仅有“刺突(Spike)”的COVID疫苗可以更好地保护避免奥密克戎感染

与实施例8中显示的针对德尔塔和奥密克戎BA.1变体的第1期临床试验加强剂的结果一样，第2期临床试验加强剂的结果肯定了UB-612可以作为一种通用的(泛沙比克病毒)疫苗，以保护抵抗奥密克戎变体与其他不断出现的新变体。

除了刺突S1-RBD(受限的ACE2受体结合域)作为刺激B细胞(持久中和抗体)的免疫原之外，UB-612在刺突S2与非刺突(核衣壳N与膜M)结构蛋白上富含5个保守序列、混杂的Th/CTL表位，用于促进更全面的T细胞(辅助与细胞毒性)记忆免疫。

由于疫苗设计的独特性，UB-612与辉瑞BNT及莫德纳疫苗一起被列入白宫次世代COVID-19疫苗高峰会7月26日的议程，以展示先锋疫苗平台。UB-612加强疫苗接种可以引发有效、广泛识别与持久的B细胞(中和抗体)与T细胞(辅助与细胞毒性)记忆免疫，其可以仿真以任何SARS-CoV-2变体的感染。

1.UB-612疫苗与采用其他平台技术并仅使用“刺突”蛋白作为免疫原的COVID疫苗的比较

最近在英国、美国和中国台湾批准使用mRNA二价疫苗(莫德纳与辉瑞)作为第四剂(第二次加强剂)引起了关注与怀疑。因此，在对使用即将到来的进口二价mRNA疫苗的关切中，目前是对比当前疫苗在对抗奥密克戎变体的病毒中和抗体之程度与T细胞免疫强度方面的表现的时候。

a.伪病毒中和活性

在对未感染者使用每种疫苗进行加强剂注射(第三剂，同源加强)后，藉由“伪病毒中和试验”测量针对BA.1/BA.2/BA.5变体的UB-612免疫血清(50％几何平均GMT，即pVNT50/ID50效价)显示高于莫德纳(mRNA-1273)、辉瑞(BNT162b2)与NVX-CoV2373；并远高于MVC-COV1901、AZD1222、CoronaVac与BBIBIP疫苗(表12)。以传染性最强的BA.5pVNT50为例，中和效价被报道为，UB-612为854，NVX-CoV2373为582，莫德纳mRNA-1273为378，辉瑞BNT162b2为360，CoronaVac为75，AZD1222为43。这些数据表明，UB-612疫苗实现了协同B细胞与T细胞免疫的设计理念，并且第三剂(第一加强剂)已经能够基本上中和奥密克戎BA.5变体，其为中国台湾目前面临的一种强大的、占主导地位的SARS-CoV-2变体。UB-612加强剂表现优于AZ疫苗。

重要需要注意的是，伪病毒检测是建立在一种仅冠上刺突蛋白之人工(伪)病毒上，而活病毒的临床分离物是在病毒主体上含有刺突蛋白与非刺突蛋白的实际分离物。目前所有使用仅刺突免疫原设计的许可疫苗皆无法识别病毒的非刺突蛋白的本体结构。

非刺突蛋白也在病毒进化的过程中发生突变(表13)，当前的仅有刺突(Spike-only)疫苗产生的抗体既不能归巢，也不能诱导B与T细胞记忆免疫以识别非刺突蛋白。因此，对于那些仅有刺突蛋白的疫苗，伪病毒与活病毒测定之间会出现数据不一致，除非疫苗抗原被设计为同时考虑刺突蛋白与非刺突蛋白两者。不一致在下面得到验证。

b.活病毒中和活性

在向未感染者接种每种疫苗(第三剂，同源加强)加强剂注射后，藉由“活病毒中和试验”(50％几何平均GMT，即VNT50/FRNT50效价)对UB-612(值为670)显示出比其他疫苗(值为46至106)(mRNA-1273、BNT162b2与AZD1222疫苗)更高的GMT效力，代表6至12倍更高的效价强度(表13)。

对比活病毒与人工伪病毒中和试验方法(表12与13)，只有UB-612疫苗呈现出方法间的一致性，而且UB-612的病毒中和强度在任何一种病毒试验方法中都优于所有其他EUL上市疫苗。

这些品牌疫苗的伪病毒与活病毒检测之间存在数据差异。注意，以抗BA.1pVNT50为例(表13)，UB-612(值为1,196-2,325)与mRNA-1273/BNT162b2(值为945-1,116)之间的pVNT₅₀(假病毒中和试验)差距是小的；而抗BA.1 VNT50的活病毒试验差距更大，大约相差6-12倍(表12)

2.UB-612卓越的病毒中和活性背后

UB-612在伪病毒与活病毒中和强度方面优于其他疫苗可归因于其识别刺突蛋白与非刺突蛋白上的靶标(S2、M与N蛋白上的保守和混杂的Th/CTL表位)，产生引人注目的、广泛认可的全面T细胞免疫记忆，其加强针对BA1、BA.2至BA.5的交叉中和抗体之协同反应的B细胞免疫反应与T细胞免疫。

品牌疫苗的加强剂疫苗接种(第三剂)已经暴露了它们在对抗BA.1活病毒方面的弱点，更不用说对抗BA.2与BA.5。从目前的mRNA疫苗很难在加强剂后产生>100的VNT₅₀峰值效价来对抗BA.1活病毒来看，可以预测疫苗在中和BA.2与BA.5活病毒方面会进一步减弱。

3.刺突蛋白与非刺突蛋白上的突变位点

除了刺突蛋白上的30多个突变外，如表14所示，BA.1、BA.2与BA.5变体的非刺突蛋白(E、M与N)上也有突变位点，这些突变位点是仅有刺突的疫苗无法识别的，即它们对于促进更充分的T细胞免疫具有内在的不足。而且，相比之下，藉由针对刺突蛋白中较小的S1-RBD蛋白片段和设计的具有保守与混杂之T表位的T免疫原，UB-612诱导的免疫会比其他疫苗遇到更少的病毒突变体抵抗，从而使奥密克戎逃避的可能性降低，因为UB-612疫苗诱导的免疫可以表现得更接近感染诱导的免疫的气息。

上述观察结果也显示：1)在比较不同疫苗平台的病毒中和效力时，只有活病毒试验检测是真正可靠的；2)人工伪病毒检测有利于在那些专注于刺突(Spike-focused)的疫苗中进行比较。

4.一种潜在的泛沙巴克病毒疫苗

特别值得注意的是，包膜(E)、膜(M)与核衣壳(N)等非刺突结构蛋白，关键性地参与了宿主细胞干扰素反应与T细胞记忆的诱导。因此，UB-612疫苗所唤起的深刻的T细胞记忆免疫力在长期控制SARS-CoV-2感染方面可以发挥关键作用。因此，UB-612作为加强剂可能会使感染者在防止再感染上有最大的潜在受益。

与其他使用刺突(S)蛋白作为唯一的B与T免疫原的疫苗不同，UB-612的组成包括免疫原S1-RBD以触发B细胞产生中和抗体，以及五个保守的、不可变的混杂表位(S2x3，N与M蛋白)作为T免疫原(表15)。独特、合理的疫苗设计使UB-612有可能成为一种泛沙巴甲病毒疫苗。

5.防止免疫逃逸之强大的T细胞免疫力.

由于疫苗能够对保守的、不可变异的表位产生强烈的T细胞免疫反应，因此能够防止免疫逃逸。研究不同形式的疫苗所产生的T细胞免疫反应是非常有意义的。如下所述，UB-612作为加强剂(第三剂，同源加强)，引起的T细胞免疫程度(SFU/10⁶个PBMC细胞)远远高于mRNA疫苗(BNT162b2)或腺病毒DNA疫苗(ChAdOx1或AZD1222)。

在加强剂前/加强剂后的SFU单位，分别为3个剂量的ChAd/ChAd/ChAd为38/45，3个剂量的BNT/BNT/BNT为28/82，低于第2期临床试验延长研究中观察到的UB-612加强剂的261/374SFU。这些结果与UB-612具有较强的抗BA.1活病毒中和效价，而BNT162b2与ADZ1222的效价较弱的事实相一致(表13)。一般来说，已知强大的T细胞免疫力对于保护人们抵抗严重疾病的侵害和疫苗的长期成功也是至关重要的。

6.UB-612疫苗针对感染的有效性

虽然现实世界中疫苗对感染的有效程度尚不清楚，但UB-612对ACE2:RBDWT相互作用的强烈阻断与病毒中和VNT₅₀(活病毒WT与德尔塔)与pVNT₅₀(伪病毒BA.1)之间的正功能关联，推断出对COVID-19的临床疗效很可观。事实上，利用S蛋白结合活性和中和抗体的模型，预测UB-612的2剂主要免疫对原始分离株/德尔塔的临床疗效为70-80％，而加强疫苗接种可能导致对由祖先原始分离株/德尔塔或奥密克戎株引起的有症状的COVID-19的疗效为95％。

7.UB-612在中国台湾与美国进行中的有效性调查

应该指出的是，在1480名接受了两或三剂UB-612疫苗的受试者中(中国台湾的第2期临床试验)，截至今年3月所设计的第2期临床试验研究结束时，没有发生感染病例的报告。

此外，在今年5月中国台湾内奥密克戎感染迅速升级之际，正在对第2期临床试验的受试者进行电话采访，以及在中国台湾空前的暴发期间，接受两剂或三剂针对奥密克戎的UB-612疫苗的受试者的初始疫苗保护效果估计大于95％(该试验正在进行中)。

此外，保护包括主要奥密克戎B5的循环亚变体感染的第3期临床试验疗效将等待正在进行的第3期临床试验的结果，该试验将UB-612与批准疫苗在同源与异源加强下进行比较[ClinicalTrials.gov ID:NCT05293665]。

使用mRNA二价疫苗作为第四剂。目前，作为第四剂(第二次加强针)的莫德纳二价疫苗mRNA-1273.214(原刺突加奥密克戎BA.1刺突)最近获得了紧急使用批准(EmergencyUse Authorization)。据报道，针对BA.5的伪病毒中和效价(pVNT50)为727，比原mRNA-1273疫苗(第四剂)高50-60％，比第三剂mRNA-1273疫苗高90％(表12)；均未超过2倍。此pVNT50的小幅增加已被证明不会导致疫苗效力的提高。另一种含有BA.5的二价疫苗也在9月6日获得了紧急用户许可证；该批准仅基于一项8只小鼠的研究。

遗憾的是，莫德纳并未在6月28日的美国FDA审查会议上提交关键的"活病毒中和效力"数据。目前，只有抗BA.1活病毒的VNT₅₀数据，据报道，第三剂后原mRNA-1273的VNT₅₀为81.0(表13)；而二价疫苗mRNA-1273.214第四剂后的抗BA.5活病毒的VNT₅₀可能更低。

根据表12数据对抗伪病毒pVNT50的总体估计，相对于抗BA.1/抗BA.2，对BA.1的中和效力是1.3倍；对BA.5的中和效力是2-3倍以内。若不戴口罩，不经常洗手，不与社会保持适当的距离，很有可能被奥密克戎BA.5变体再次感染或突破性感染。虽然需要进行全面的疫苗接种与加强针，以防止感染，但问题仍为人们是否能正确掌握疫苗与剂量方案。

8.预防长期COVID的潜在好处

最后，无论疫苗接种状态或混合免疫如何，每次再感染都会增加死亡、住院与其他健康危害的风险，包括长期COVID的负担，而目前批准的疫苗免疫对缓解长期COVID的益处有限。

由于发现长期COVID与产生IFNγ的CD8+T细胞的下降有关，因此，在预防长期COVID方面，希望有一个能够引起强大而持久的T细胞免疫力以清除残留的全身性感染(持续的病毒库)的疫苗平台，对此，UB-612可能发挥正向作用。

实施例10

预防与治疗SARS-CoV2感染，清除病毒感染并治疗长期COVID之泛沙比科(Pan-Sarbeco)疫苗的开发

奥密克戎BA.1从原SARS-CoV-2分离株发生了严重的变异，包括于S蛋白中之大于35个的氨基酸变化。与2个与S-1受体结合域(S1-RBD，残基319-541)的德尔塔相关的突变相比，BA.1与BA.2共有12个突变，BA.1与BA.2各有3个与4个独特的，其分别赋予BA.2更高的免疫逃避能力。BA.4与BA.5具有相同的刺突蛋白。它们与BA.2的不同之处在于在69-70del、L452R、F486V与野生型氨基酸在刺突蛋白内的Q493位处具有额外的突变(表14)，这有助于它们比BA.2更高程度的免疫逃逸。BA.2表现出比BA.1高1.3至1.5倍的传播率与1.3倍的免疫逃避，这与BA.1免疫血清中和BA.2的结果一致，其效价较低，达1.3至1.4倍，BA.2再感染可能发生在BA.1之后。BA.4/BA.5更具传播性，对BA.1/BA.2免疫与单克隆抗体更具有抗性。

此外，在UB-612疫苗接种者进行加强注射后，免疫血清中和活原始分离株病毒的能力仍然较低，其效价降低(50％几何平均GMT，即VNT₅₀/FRNT₅₀效价)在10至50倍范围内(GMFR＝～10至50)，如表13所示，这未达到开发泛沙比科疫苗的目标。

强烈提倡开发成分更新(变种特异性)疫苗，以满足这一迫切需要，以防止个人感染SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/BA.5以控制病情并减少由此产生的痛苦，包括远程COVID与死亡。

根据如表15、19及20所示之疫苗组合物所制备之所揭露高精确度设计者疫苗(例如UB-612、UniCoVac-2、UniCoVac-3)，与采用灭活病毒裂解液或其他特征较少的免疫原的免疫原含量较复杂的疫苗的弱或不适当的抗体呈现相比，具有产生高度特异性免疫反应的优势。此外，在COVID-19疫苗开发中存在与称为抗体依赖性增强(ADE)的机制相关的潜在缺陷。具体而言，ADE是一种现象，其中病毒与非中和抗体的结合会增强其进入宿主细胞，有时还会增强其复制。此机制导致传染性与毒力两者增加，并已在蚊媒黄病毒、HIV与冠状病毒中观察到。所揭露的高精确度疫苗组合物，仅采用S1-RBD-sFc蛋白作为B细胞免疫原，被设计以通过监测抗体反应的质量与和数量来避免疫苗相关疾病增强(vaccine-induceddisease enhancement)，因为它们将决定功能结果。

除了UB-612与其他使用不同平台的COVID疫苗相比，采用"刺突"蛋白作为疫苗目标的优势外，正如在实例9中广泛讨论的那样，我们的单价UniCoVac 2和二价UniCoVac 3将具有变体特异性(奥密克戎BA.4/BA.5)成分更新疫苗的额外优势，满足COVID疫苗的紧急需求。UniCoVac 2将通过提供高度互补的S1-RBD-奥密克戎BA.4/BA.5变体特异性sFc来补充现有的UB-612单价疫苗，该疫苗采用原始株WuHan序列衍生的S1-RBD WuHan-sFc蛋白作为B细胞免疫原作为B细胞免疫原，从而诱导出能有效中和目前流行的BA.4/BA.5变体的中和抗体。

根据表20制备的组合疫苗使用S1-RBD原始分离株-sFc(SEQ ID Nos：49)与S1-RBD奥密克戎-BA.4/BA.5-sFc蛋白(SEQ ID Nos：53)作为B细胞免疫原将允许产生针对SARS-CoV2的广谱(broad spectrum)之RBD的互补中和抗体。如此广泛的中和抗体，加上保守的T细胞免疫所提供的长效免疫记忆，通过加入SARS-CoV Th/CTL肽(SEQ ID NO：27、9、34、2、35)与理想化的人工Th肽(SEQ ID NO：36)作为T细胞启动的催化剂，可以开发出最理想的泛沙巴科病毒疫苗组合物，该组合物(1)由于疫苗平台的高精确度与亚单位性质而具有安全性；(2)可以促进激发与CHO表现的S1-RBD-sFc蛋白结合的抗体，覆盖从原始分离株到最新的奥密克戎BA4./BA.5株，并在细胞介导的中和试验中中和病毒介导的细胞病理学效应；(3)可以产生Th1倾向的T细胞免疫力，在粘膜接触后启动产生IFN-γ的Th细胞，立即抵御入侵的SARS-CoV-2变体；(4)可以产生病毒抗原(M.M与S2)特异性的CD8+细胞溶解细胞来清除病毒感染的细胞；以及(5)由于远远增强了免疫记忆的记忆力而提供持久的免疫力，以达到理想的泛沙巴科病毒疫苗的最终目标，防止个人感染SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/BA.5，控制SARS-COV2的暴发，并减少由此带来的痛苦，包括长期COVID与死亡。

实施例11

一种预防SARS-CoV-2感染的多表位蛋白/肽疫苗组合物

以天竺鼠进行初步免疫原性评估确定RBD蛋白的体液免疫原性，并允许选择S1-RBD-sFc(SEQ ID NO：49)作为针对SARS-CoV-2疫苗的主要免疫原性B细胞成分。

T细胞表位的存在对于诱导针对病毒抗原的B细胞记忆反应很重要。SARS-CoV-2CTL和Th表位，经MHC结合和T细胞功能测定验证，SARS-CoV-2和SARS-CoV-1(2003)病毒之间具序列保守，用于设计针对COVID-19的高精准SARS-CoV-2疫苗。

使用MHC结合测定法确定SARS-CoV-1(2003)上的T细胞表位，用于通过序列比对确定SARS-CoV-2(2019)中相应的T细胞表位。以类似方式鉴定己知高精准设计型SARS-CoV-2疫苗的设计中并入的CTL表位。包含Th和CTL表位的SARS-CoV-2疫苗设计已透过MHC II类结合和T细胞刺激得到验证。由于透过先前感染或初次疫苗接种获得适当程度预先存在的记忆T细胞免疫对于控制SARS-CoV-2再感染和突破性感染非常重要，因此加入UB-612多重表位疫苗中源自SARS病毒膜(M)、核衣壳(N)和刺突S2蛋白(表10)的高度保守区域的表位肽的选定的Th/CTL在结构上受到突变的限制，且从COVID疾病中康复的个体确认，无论关切变体(VoCs)为何，这样的全球性T疫苗可抵御SARS-CoV-2感染的细胞。用于预防SARS-CoV-2感染的特定多表位蛋白/肽疫苗组合物，含有20μg/mL、40ug/mL、60μg/mL和200μg/mL(S1-RBD-sFc融合蛋白(例如原始分离株和/或奥密克戎菌株)和Th/CTL肽的合并重量)，如表15、19及20所述。由于基于本发明的T细胞疫苗也可以独立配制用于与其他B免疫原导向疫苗共同注射，因此它们的代表性制剂也显示为广谱(Global)T1-T4疫苗(仅具有Th/CTL肽)，其制剂仅具有10ug/mL、25ug/mL或50ug/mL的Th/CTL表位肽，如表21-24中所示实施例。

1.大鼠免疫原性研究

在大鼠中进行的一组实验中，将专有的Th/CTL肽混合物添加到S1-RBD-sFc融合蛋白中，以进一步评估最佳配方和佐剂以及疫苗的细胞免疫成分的建立。这些疫苗组合物进行下列研究。

a.大鼠体液免疫原性试验

在大鼠中进行的实验中，评估不同剂量的免疫原和佐剂，以根据S1-RBD结合抗体效价与平衡的Th1/Th2反应选择最佳佐剂。

将含有S1-RBD-sFc蛋白和Th/CTL肽的疫苗组合物与佐剂系统组合。这些疫苗-佐剂组合在0WPI(初始)和2WPI(加强)上以每次注射10至300μg的宽剂量范围以IM对大鼠给药。在0、2(即，1剂后)、3和4WPI(即，第2剂后1和2周)取动物血液进行抗体效价分析。

于所有时间点的结合抗体(BAb)测试结果显示，用2种佐剂系统配制的疫苗在10到300μg所有剂量范围内都引发了相似程度的抗S1-RBD ELISA效价，显示即使仅含有少量的基本蛋白免疫原，疫苗制剂也可有出色的免疫原性。

在S1-RBD:ACE2结合抑制的ELISA试验中，最有效的抑制活性被视为进一步反复实验以提高免疫原性的最佳候选制剂。在针对原始SARS-CoV-2分离株的复制病毒中和试验中，疫苗组合物诱导的4WPI免疫血清可以在VNT50>10,240稀释倍下中和病毒感染。

b.大鼠细胞免疫原性试验

为了解决与Th1/Th2反应平衡的问题，使用ELISpot评估接种大鼠的细胞反应。

i.大鼠Th1/Th2平衡研究程序

8-10周龄的雄性Sprague Dawley大鼠(300-350gm/BW)购自BioLASCO TaiwanCo.,Ltd.。经过3天的驯化后，将动物随机分为4组。所有动物程序均按照联亚生技动物护理和使用委员会(IACUC)审查和批准的法规和指南进行。IACUC编号为AT-2028。大鼠在第0周(初免)和第2周(加强)用1至100μg的疫苗组合物的不同剂量进行肌肉内接种。在第0、2、3和4周收集大鼠的免疫血清(每个剂量组n＝3)用于评估抗原性。在4WPI收集脾细胞并在体外以2μg/孔用Th/CTL肽库合并S1-RBD或单独的Th/CTL肽库刺激。通过ELISpot分析确定分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的脾细胞。透过减去阴性对照孔计算每百万个细胞的细胞因子分泌细胞(SC)。

ii.测量细胞反应的ELISpot

收集4WPI接种疫苗的大鼠的脾脏置于淋巴细胞条件培养基(LCM；补充有10％ FBS和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基)中，并形成成单细胞悬浮液。在室温(RT)下，将细胞沉淀重新悬浮于5mL RBC裂解缓冲液中3分钟，然后加入含有青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基以停止反应。离心后，重新悬浮在LCM中的细胞沉淀以ELISpot进行分析。使用大鼠IFN-γELISpotPLUS试剂盒(MAB TECH，货号：3220-4APW)、大鼠IL-4T细胞ELISpot试剂盒(U-CyTech，货号：CT081)和大鼠IL-2ELISpot试剂盒(R&D Systems，Cat.No.：XEL502)进行ELISpot分析。

预涂有捕获抗体的ELISpot板在室温下以LCM封阻至少30分钟。将250,000个大鼠脾细胞接种到每个孔中，并用S1-RBD-His蛋白与Th/CTL肽库、S1-RBD-His蛋白、Th/CTL肽库或每个单一的Th/CTL肽刺激18-24小时37℃。在LCM中以每孔1μg每种蛋白质/肽的最终浓度刺激细胞。斑点根据制造商的说明书生成。LCM和ConA分别用于阴性和阳性对照组。利用AIDiSpot检测仪分析和量化斑点。通过减去阴性对照组来计算每百万个细胞的斑点形成单位(SFU)。

在脾细胞中观察到IFN-γ分泌的剂量依赖性趋势，而IL-4的分泌很少。结果显示，疫苗组合物具有高免疫原性并诱导Th1的细胞免疫反应，如高比例的IFN-γ/IL-4或IL-2/IL-4。在Th/CTL肽库存在下和以单个肽进行刺激时，也观察到高比率的IL-2/IL-4，而几乎没有诱导IL-4分泌。

2.疫苗产品临床试验中代表性毒性研究的准备，表15-20和21-24显示各疫苗产品的配方

为了进行临床试验，疫苗组合物在Sprague-Dawley大鼠中针对每种产品进行了符合GLP的重复剂量毒理学研究，具有如下所述的标准设计和程序

a.毒理试验程序

根据第-1天(首次给药前1天，首次给药日定义为第1天)获得的体重，将总共160只大鼠(80只/性别)随机分为8组，其中120只大鼠被分配到第1、2、3和4组(15/性别/组)进行毒性研究，40只大鼠被分配到第5、6、7和8组(5/性别/组)进行卫星试验(satellitestudy)。第1组和第5组以盐水注射大鼠作为阴性对照，第2组和第6组用疫苗组合物安慰剂作为佐剂对照，第3组和第7组以及第4组和第8组的疫苗组合物剂量分别为100、300μg/动物。大鼠每两周一次，连续2周多部位肌肉注射单侧后肢肌肉(股四头肌和腓肠肌，左侧为第一剂，右侧为第二剂)，共2剂(第1天和第15天)。剂量体积为0.5mL/动物。在研究期间进行临床观察(包括注射部位观察)、体重、食物消耗、体温、眼底镜检查、血液学、凝血、临床化学、尿液分析、T淋巴细胞亚群、外周血单个核细胞(PBMCs)分泌IFN-γ的T淋巴细胞斑点数、细胞因子和免疫原性、中和抗体效价和IgG2b/IgG1比率分析。第1组至第4组中的前10只动物/性别/组在给药2周(第18天)后进行最终尸检，其余5只动物/性别/组被指定在最后一次给药后进行4周恢复后尸体剖检(Recovery Necropsy)(第44天)。对第1组至第4组的所有动物进行完整的尸检，评估器官重量、进行宏观和微观检查。

b.临床试验中毒理试验的准备

为了进行临床试验，疫苗组合物在Sprague-Dawley大鼠中进行了符合GLP的重复剂量毒理试验。该研究包括300ug的剂量，是临床使用的最高剂量的3倍。虽然2次注射的时间表没有超出临床使用的预期，但根据WHO指南这是可以接受的。研究目的在于评估疫苗组合物的免疫原性。160只大鼠被随机分为8组(80只雄性和80只雌性)，其中40只大鼠被纳入卫星免疫原性研究。低剂量组和高剂量组为分别接种100μg/动物(0.5mL)和300μg/动物(0.5mL)的疫苗组合物；对照组以相同剂量体积注射生理盐水(0.9％生理盐水)或佐剂(疫苗组合物安慰剂)。前10只动物/性别/组在第2次WPI(第18天)给药两周后进行终末尸检，其余20只动物/性别/组在4WPI(第44天)在最后一次给药后进行4周恢复后尸体剖检(Recovery Necropsy)。在试验条件下，大鼠在一个后肢肌肉(股四头肌和腓肠肌，左侧为第一剂，右侧为第二剂)在多个部位进行肌肉注射，在0和2WPI(第1天和第15天)，每2周一次，连续2周，总共2剂。

在第1周和第3周用疫苗组合物以高达300μg/动物的剂量进行治疗，发现具有良好的耐受性，没有全身性毒性迹象。在整个研究过程中都没有发现与测试物品相关的死亡和垂死。在整个研究过程中，临床观察(包括注射部位观察)中未发现与疫苗相关的异常。注射部位未发现红斑或水肿，所有观察时间点的Draize评分均为0。同样地，在体重、食物消耗、体温、血液学、化学(除AG比率)、眼底镜检查或尿液分析方面未观察到与疫苗相关的变化，并且在CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+以及CD3+CD4+/CD3+CD8的比值未发现统计学上意义的变化。观察到纤维蛋白原、IFN-γ和IL-6具有统计学上显著增加，而白蛋白/球蛋白比率降低；这些结果与对疫苗的急性期反应一致，并且在恢复期结束时全部恢复正常。附睾、皮肤、肝脏、前列腺和乳腺的组织病理学检查显示炎症细胞浸润很少，未发现损伤或异常。

在卫星组中测量疫苗组合物的免疫原性显示，疫苗在2和4WPI(间隔14天)接种两剂100μg/动物或300μg/动物的动物中诱导大量抗SARS-CoV-2S1-RBD IgG(数据未显示)。在2WPI(第15天)进行加强后，S1-RBD结合IgG效价随着时间上升，在6WPI(第44天)，接种100μg/动物和300μg/动物疫苗组合物的大鼠中分别达到约2.6log₁₀和3.3log₁₀。本研究中观察到的结果与设计用于刺激免疫反应产生高效价抗体疫苗的预期一致。在分析S1-RBD特异性IgG亚类时，Th2相关亚类IgG1抗SARS-CoV-2S1-RBD的模式和诱导程度与总IgG抗SARS-CoV-2S1-RBD中观察到的程度相当。在6WPI(第43天)，接种疫苗组合物的大鼠中仅检测到Th1相关亚类IgG2b抗SARS-CoV-2S1-RBD的轻微诱导。然而，透过ELISA测量的血清细胞因子模式显示Th1/Th2的平衡反应(数据未显示)。一系列透过多面向设计的产品在进入临床试验前根据上述程序进行安全性测试，使下一代产品取得核可。

实施例12

具有持久免疫力代表性的UB-SARS-CoV-2广谱(Global)T疫苗在第1/2期临床试验中消除SARS-CoV-2变异感染细胞

由先前感染或初次接种而获得的适当预先存在的记忆T细胞免疫对于控制SARS-CoV-2再感染和突破性感染至关重要，UB-612多重表位疫苗合并选定源自SARSr-CoV病毒膜(M)、核衣壳(N)和刺突S2蛋白高度保守区域的Th/CTL多肽表位(表10)，其在结构上受到突变的限制，并从COVID-19康复的个体所发现，显示主要疫苗接种系列中预先存在的记忆T细胞免疫对于决定增强免疫的巨大潜力，以防止包括Delta在内的VoCs感染，尤其是奥密克戎(B.1.1.529)突变的S蛋白难以被抗体交互中和。

此外，病毒特异性B体液和T细胞反应协同作用保护个体免受病毒感染。使用体液抗体反应作为保护性免疫的唯一指标缺乏对疫苗接种后免疫反应的充分理解，因为抗体反应维持的时间比病毒反应性T细胞短。

如实施例6所述通透过ELISpot和细胞内细胞因子染色检测T细胞反应。结果表明，在第1期和2期临床试验中，UB-612诱导由ELISpot所测得持久、稳健的Th1为主的IFN-γ+-T细胞反应，这证实精准设计的Th/CTL肽库是重要，且主要负责T细胞反应，而更集中“S-1RBD”功能区域，其主要作为B免疫原成分，缺乏Th/CTL表位。总体而言，在第1期临床试验主试验、延长加强第三剂疫苗以及第2期临床试验主试验的三项临床试验中，我们已证明UB-612疫苗接种(100μg剂量组)可以同时诱导大量具长半衰期的病毒中和抗体以及持久的细胞免疫免疫。由于记忆B和T细胞在对感染的次级反应非常重要，因此成功的疫苗必须产生并维持免疫记忆，并在自然暴露或疫苗加强后迅速产生有效的体液和细胞反应。UB-612确实通过这些临床研究证明以上疫苗设计特征。

虽然中和抗体的程度与疫苗的保护效果密切相关，但病毒抗原大量活化CD4+和CD8+T细胞对于更好的免疫持续时间和免疫记忆也非常重要。还发现早期诱导功能性SARS-CoV-2特异性T细胞对于快速清除病毒和改善疾病非常重要。因此，由代表性的病毒结构和非结构蛋白的Th/CTL肽所诱发的T细胞反应可增加评估感染控制的好处，因为病毒衍生肽可辨识异源性和COVID-19诱导的T细胞。

开发可诱导CD4+/CD8+T细胞对SARS-CoV-2蛋白质组中高度保守的表位产生反应的免疫原，这些表位在结构上受到突变的限制，在VoC和Sarbecovirus中是保守的，并从COVID-19康复个体中发现，大幅强化目前SARS-CoV-2疫苗因可逃避恢复期血浆和疫苗诱导的抗体反应的变体的紧急情况。

UB-612是第一个精准设计的多表位蛋白/肽亚单位COVID疫苗，可活化B细胞和T细胞免疫，其包含S1受体结合域(S1-RBD)-在CHO细胞中产生的单链Fc融合蛋白，合并5种设计的Th和CTL表位肽，其已知可与多个MHC I和MHC II结合，由来自Sarbecovirus病毒刺突(S2)、核衣壳(N)和膜(M)蛋白保守区域作为辅助T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(CTL)，以及由麻疹病毒融合(MVF)蛋白修饰的外在MHC II表位(1a)，作为活化T细胞的催化剂(第9A图)。Th和CTL肽是混杂的表位，可以诱导免疫记忆回忆(memory recall)、T细胞活化和效用功能(effector function)。

基于实施例6中提到的ELISpot和ICS的结果，UB-SARS-CoV-2广谱(Global)T疫苗的结论如下所述。如表10所示，我们的UB-SARS-CoV-2全球T疫苗系列(例如原始分离株、阿尔法、贝塔、伽马、德尔塔、奥密克戎)中设计的Th/CTL表位肽的氨基酸序列在所有的SARS-CoV-2VOC中都高度保守。正如UB-612的第1期和第2期临床试验中所观察到的结果，接受UB-SARS-CoV-2广谱(Global)T疫苗的受试者可引起Th1诱导的免疫和强大的CD8+细胞毒性T细胞反应，有利于清除所有关切变体(VoCs)的SARS-CoV-2，这是我们的多重SARS-COV-2疫苗系列与其他目前使用的SARS-CoV-2疫苗(例如mRNA、DNA、灭活病毒裂解物或SARS-CoV-2载体)相比前所未有的强大功能。

UB-广谱(Global)T1至T4疫苗的具体配方如表21-24所示，每剂0.1至0.5mL，可与来自不同平台的任何其他SARS-COV-2疫苗共同使用，其中体液免疫反应更多是注重于检测中和抗体，而忽略了最佳的T细胞反应。及时地提供最佳病毒T免疫原可使CD4+和CD8+T细胞大量活化，这对于更好的免疫持续时间和免疫记忆非常重要。还发现早期诱导功能性SARS-CoV-2特异性T细胞对于快速清除病毒和改善疾病也非常重要。如表10所示，SARS-CoV-2Th/CTL肽和表21-24中的制剂可诱导CD4+/CD8+T细胞对SARS-CoV-2蛋白质组中高度保守的表位的反应，这些表位序列在VOCs和Sarbecoviruses中保守一致，突变在结构上受到限制，且可从COVID-19疾病中康复的个体中发现，本发明制剂可极大地增强目前SARS-CoV-2疫苗因出现可逃避恢复期血浆和疫苗诱导抗体反应变体的紧急情况。

表1.来自SARS-CoV-2的膜糖蛋白M的氨基酸序列，以及在N端具有KKK接头用于疫苗设计的高度保守的CTL表位(先前已通过PBMC结合和刺激测定验证)的氨基酸序列

表2.来自SARS-CoV-2的核衣壳磷蛋白N的氨基酸序列，以及在N端具有KKK接头用于疫苗设计的高度保守的CTL和Th表位(先前已通过PBMC结合和刺激测定验证)的氨基酸序列

表3.来自SARS-CoV-2的表面糖蛋白S的氨基酸序列，以及在N端具有KKK接头用于疫苗设计的高度保守的CTL和Th表位(先前已通过PBMC结合和刺激测定验证)的氨基酸序列

/>

表4.用于SARS-CoV肽免疫原结构设计包括理想化人工Th表位之病原体蛋白衍生的Th表位的氨基酸序列

表5.来自人类IgG1的野生型和突变铰链区

SEQ ID NO	描述	序列
			37	野生型IgG1	EPKSCDKTHTCPPCP
38	突变IgG1	EPKSXDKTHTXPPXP
			39	突变IgG1	EPKSSDKTHTSPPSP

X：Ser、Gly、Thr、Ala、Val、Leu、Ile、Met和/或缺失

画有下划线的残基代表与野生型IgG序列相关的突变位点

表6.SARS-Co-V2变体(贝塔、德尔塔和奥密克戎)的S1-RBD-sFc融合蛋白的氨基酸序列

/>

表7.SARS-Co-V2变体(贝塔、德尔塔和奥密克戎)的S1-RBD-sFc融合蛋白的核酸序列

/>

表8.用于高精确度SARS-CoV-2设计疫苗之包含具有已知MHC I/II结合的SARS-CoV-2 Th/CTL表位的肽的选择

粗体:MHC I,下划线:MHC II

表9.可选的异源性间隔物与CpG寡核苷酸的例子

/>

^b除了S2刺突蛋白上S_957-984肽中的N969K(在BA.1至BA.5上)与L981F(在BA.1上)，UB-612疫苗的其他四个设计表位肽都没有与刺突蛋白、M蛋白与N蛋白上报告的突变位点相重迭的aa残基(表14)。

^c在S957-984中，奥密克戎BA.1与BA.2/BA.4/BA.5之间存在微小的序列差异，以粗体标记。

表11.利用来自不同平台的疫苗对SARS-CoV-2野生型(WT))和Delta变体的加强剂后病毒中和抗体效价的比较

缩写：MNA＝微量中和试验；PNA＝伪型病毒中和试验；PRNT＝斑块减少中和试验；FRNT＝焦点减少中和测试；NA＝遗失值；GMT＝几何平均效价；GMFI＝几何平均倍数增加；GMFR＝几何平均倍数减少；WT＝野生型病毒；以及Delta＝SAR-CoV-2WT的德尔塔变体。

^a在本报告中，报告了NVX-CoV2373、mRNA-1273、BNT16b2、MVC-Cov1901、CoronaVac、ADZ1222(ChAdOx1 nCov-19)和UB-612疫苗于加强剂后的GMT。

^b在加强剂第三剂后第14或28天测量的针对WT的GMT。

^c针对WT于峰值/接受加强剂前的第二剂后的GMT。

^d针对WT于峰值/接受加强剂前的第二剂后的GMFI。

^e用于测定的德尔塔株的来源：MNA和FRNT/活临床分离物：PNA/伪型病毒：PRNT/WT利用德尔塔刺突蛋白进行重组工程。

^f GMFR，相对于抗WT效价于加强剂后抗德尔塔效价降低的倍数。

表12.伪型病毒中和测定(pVNT₅₀/ID₅₀)

缩写：PNA＝伪型病毒中和试验；GMT＝几何平均效价；GMFR＝相对于WT的几何平均倍数减少；WT＝SARS-CoV-2的野生型毒株；奥密克戎＝奥密克戎子变体BA.1/BA.2/BA.5；ND＝未确认。pVNT₅₀&ID₅₀＝利用伪病毒测定的50％中和GMT

^a_报告了同源加强剂(第三剂)疫苗接种的疫苗。

^b在加强第三剂后第14或28天测量的针对WT的GMTs。

^c UB-612-当Omicron感染依次由BA.2与BA.5子变体主导时，以子集参与者的血清进行伪病毒测定(2期加强延长研究)。

表13.活病毒中和测定(VNT₅₀/FRNT₅₀/ID₅₀)

缩写：MNA＝微量中和测定；PRNT＝斑块减少中和试验；FRNT＝焦点减少中和测试；GMT＝几何平均效价；GMFR＝相对于WT的几何平均倍数减少；WT＝SARS-CoV-2的野生型毒株；奥密克戎＝奥密克戎子变体BA.1/BA.2；ND＝未确认。pVNT₅₀&ID₅₀＝50％中和GMT，藉由活病毒检测；VNT₅₀、ID₅₀与FRNT₅₀＝50％中和GMT，藉由活病毒检测。

^a报告了同源加强剂(第三剂)疫苗接种的疫苗。

^b在加强第三剂后第14或28天测量的针对WT的GMTs。

表14.SARS-CoV-2刺突(S)蛋白以及非刺突蛋白之包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白与核衣壳(N)蛋白上的突变位点

^a报告的位于刺突、E、M与N蛋白的突变位点(粗体)。

^b奥密克戎BA.4与BA.5在刺突蛋白上具有相同的突变位点谱，其与BA.2的相关性高于BA.1。在BA.2、BA.4与BA.5中，在S、E、M与N蛋白上的突变位点的变体间差异用红色标记。

^c除了S2刺突蛋白上S_957-984肽中的N969K(在BA.1至BA.5上)与L981F(在BA.1上)，UB-612疫苗的其他四个设计表位肽都没有与刺突蛋白、M蛋白与N蛋白上的报告突变位点重迭的aa-残基。

表15.UB-612(原始分离株)200μg/mL的组成

¹用于2期与2/3期临床试验的材料将按照cGMP制造

表16.UB-613(原始分离株)40μg/mL的组成

¹用于2期与2/3期临床试验的材料将按照cGMP制造

表17.UB-614(奥密克戎B.1.1.529)40μg/mL的组成

¹用于2期与2/3期临床试验的材料将按照cGMP制造

表18.UB-615(原始分离株+奥密克戎B.1.1.529)40μg/mL的组成

¹用于2期与2/3期临床试验的材料将按照cGMP制造

表19.UniCoVac 2单价(奥密克戎BA.4/BA.5)40μg/mL的组成

¹用于2期与2/3期临床试验的材料将按照cGMP制造

表20.UniCoVac 3双价(原始分离株+奥密克戎BA.4/BA.5)40μg/mL的组成

¹用于2期与2/3期临床试验的材料将按照cGMP制造

表21.UB-广谱T1 10μg/mL的组成

¹用于2期与2/3期临床试验的材料将按照cGMP制造

表22.UB-广谱T2 25μg/mL的组成

¹用于2期与2/3期临床试验的材料将按照cGMP制造

表23.广谱T3疫苗20μg/mL的组成

¹用于2期与2/3期临床试验的材料将按照cGMP制造

表24.Global T4疫苗50μg/mL的组成

¹用于2期与2/3期临床试验的材料

Claims

1.融合蛋白，其包括IgG分子的Fc片段与生物活性分子，其中所述Fc片段为单链F，其中所述Fc片段包括铰链区，其中所述铰链区为经突变且不形成二硫键，其中所述铰链区包括选自由SEQ ID NO：38及39所组成的组的氨基酸序列，其中所述生物活性分子为来自SEQ IDNO:40的SARS-CoV2S蛋白受体结合区域或SEQ ID NO:41-44的S-RBD变体。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述铰链区包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白选自由SEQ ID NO:49-53所组成的组。

4.药物组合物，其包括权利要求1所述的融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。

5.生产根据权利要求1的融合蛋白的方法，包括：

a)提供生物活性分子，其中所述生物活性分子为来自SARS-CoV2原始分离株或其关切变体(VoC)之一的S蛋白的受体结合区域(S-RBD)，其中所述S蛋白的受体结合区域选自由SEQ ID NO:40-44所组成的组，

b)提供IgG分子的Fc片段，其中所述Fc片段包括铰链区，其中所述铰链区藉由半胱氨酸残基的取代及/或缺失突变以形成经突变的Fc，且所述经突变的Fc不形成二硫键，其中所述铰链区包括选自由SEQ ID NO:38及39所组成的组的氨基酸序列，以及

c)经由所述铰链区结合所述生物活性分子与所述经突变的Fc。

6.融合蛋白，其选自由SEQ ID NO：49-53所组成的组的S1-RBDVoC-sFc融合蛋白。

7.组合物，其包括根据权利要求6所述的融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的组合物，还包括Th/CTL肽，其中所述Th/CTL肽衍生自SARS-CoV-2M、N或S蛋白、病原体蛋白，或其任意组合，其中所述Th/CTL肽选自由SEQ ID NO：2-5、7-12、14-35、36与其任意组合所组成的组。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述Th/CTL肽选自由SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35、36与其任意组合所组成的组。

10.COVID疫苗组合物，其包括

a)S-RBDVoC-sFc蛋白，其选自由SEQ ID NO：49-53所组成的组，

b)Th/CTL肽，其选自SEQ ID NO：2-5、7-12、14-36及其任意组合所组成的组；

c)药学上可接受的赋形剂，其中所述药学上可接受的赋形剂为佐剂、缓冲剂、表面活性剂、乳化剂、pH调节剂、食盐水溶液、防腐剂、溶剂，或其任意组合。

11.根据权利要求10所述的COVID疫苗组合物，其中(b)中的Th/CTL肽选自由SEQ IDNO：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意组合的组。

12.根据权利要求11所述的COVID疫苗组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂为CpG1寡核苷酸、ALUM(磷酸铝或氢氧化铝)、组氨酸、组氨酸HCl·H₂O、精氨酸HCl、TWEEN 80(聚氧乙烯(20)-山梨醇酐单油酸酯)、盐酸、氯化钠与2-苯氧乙醇在水中的组合。

13.根据权利要求12所述的COVID疫苗组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂为CpG1(SEQ ID NO:67)。

14.预防COVID的方法，包括向受试者施用药学有效量的根据权利要求10所述的疫苗组合物。

15.预防COVID的方法，包括向受试者施用药学有效量的根据权利要求11所述的疫苗组合物。

16.生产针对SARS-CoV-2抗体的方法，包括向受试者施用药学有效量的根据权利要求10所述的疫苗组合物。

17.生产针对SARS-CoV-2抗体的方法，包括向受试者施用药学有效量的根据权利要求11所述的疫苗组合物。

18.COVID疫苗组合物，其以表15-20中任一所示量的组成。

19.细胞系，其转染编码根据权利要求6所述的融合蛋白的cDNA序列。

20.根据权利要求19所述的细胞系，其为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

21.根据权利要求19所述的细胞系，其中cDNA序列选自由SEQ ID NO:60-64所组成的组。

22.广谱T疫苗组合物，其包括:

a).Th/CTL肽，其中所述Th/CTL肽衍生自SARS-CoV-2M、N或S蛋白、病原体蛋白或其任意组合，其中所述Th/CTL肽选自由SEQ ID NO：2-5、7-12、14-36及其任意组合所组成的组；

b).药学上可接受的赋形剂，其中所述药学上可接受的赋形剂包括佐剂、缓冲剂、pH调节剂、盐水溶液、防腐剂、溶剂或上述任意组合。

23.根据权利要求22所述的广谱COVID T疫苗组合物，其中Th/CTL肽选自由SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35、36、3、4、7、8、25、26及其任意组合的组。

24.根据权利要求23所述的广谱COVID T疫苗组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂为CpG1寡核苷酸、ALUM(磷酸铝或氢氧化铝)、盐酸、氯化钠和2-苯氧乙醇在水中的组合。

25.广谱COVIDT疫苗组合物，其以表21至24所示量组成。

26.融合蛋白，其包括IgG分子的Fc片段与生物活性分子，其中所述Fc片段为单链Fc，其中所述Fc片段包括铰链区，其中所述铰链区为经突变且不形成二硫键，其中所述铰链区包括选自由SEQ ID NOs:38及39所组成的组的氨基酸序列，其中所述生物活性分子是来自SARS-CoV-2S蛋白的受体结合结构域(S1-RBD)(SEQ ID NO:40或44)，其中原始分离株是SEQID NO:40，其中奥密克戎BA.4/BA.5变体是SEQ ID NO:44。

27.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白选自由SEQ ID NOs:49及53所组成的组。

28.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

29.医药组合物，包括根据权利要求1所述的融合蛋白及药学上可接受的载体或赋形剂。

30.制备根据权利要求1所述的融合蛋白的方法:

b)提供IgG分子的Fc片段，其中Fc片段包含铰链区，其中铰链区透过半胱氨酸残基的取代及/或缺失突变以形成突变的Fc，且突变的Fc无法形成二硫键，其中所述铰链区包含选自由SEQ ID NO：38及39所组成的组的氨基酸序列，以及

c)通过所述铰链区结合所述生物活性分子和所述突变的Fc。

31.融合蛋白，其选自SEQ ID NO:53的S1-RBD奥密克戎BA.4/BA.5变体-sFc。

32.组合物，包括根据权利要求31所述的融合蛋白。

33.根据权利要求32的组合物，还包括Th/CTL肽，其中所述Th/CTL肽衍生自SARS-CoV-2M、N或S蛋白、病原体蛋白或其任意组合，其中所述Th/CTL肽选自由SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意组合所组成的组。

34.根据权利要求33的组合物，其中所述Th/CTL肽选自由SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意组合所组成的组。

35.COVID疫苗组合物，其包括:

a)S-RBD奥密克戎BA.4/BA.5变体蛋白，其选自SEQ ID NO:53；

b)Th/CTL肽，其选自由SEQ ID NO：2、9、22、23、27、34、35、36及其任意组合所组成的组；

36.根据权利要求35所述的COVID疫苗组合物，其中(b)的Th/CTL肽选自由2、9、22、23、27、34、35、36及其任意组合所组成的组。

37.根据权利要求36所述的COVID疫苗组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂是CpG1寡核苷酸、ALUM(磷酸铝或氢氧化铝)、组氨酸、组氨酸HCl·H2O、精氨酸HCl、吐温80(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)、盐酸、氯化钠和2-苯氧乙醇在水中的组合。

38.根据权利要求37所述的COVID疫苗组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂是CpG1(SEQ ID NO:67)。

39.预防COVID的方法，包括向受试者施用药学有效量的根据权利要求35所述的疫苗组合物。

40.预防COVID的方法，包括向受试者施用药学有效量的根据权利要求36所述的疫苗组合物。

41.产生针对SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/BA.5变体的抗体的方法，包括向受试者施用药学有效量的根据权利要求35所述的疫苗组合物。

42.产生针对SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/BA.5变体的抗体的方法，包括向受试者施用药学有效量的根据权利要求36所述的疫苗组合物。

43.COVID疫苗组合物，其包括表15、19和20中任一所示量的组成。

44.细胞株系，其被转染编码如根据利要求31所述的融合蛋白cDNA序列。

45.根据权利要求44所述的细胞系，其为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株。

46.根据权利要求44所述的细胞系，其中cDNA序列选自由SEQ ID NO:64组成的组。