KR101966841B1 - 지카바이러스 e 단백질 유래의 재조합 항원 및 이의 용도 - Google Patents

지카바이러스 e 단백질 유래의 재조합 항원 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지카바이러스 E 단백질 유래의 재조합 항원 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터, 및 지카바이러스 항원 단백질을 효과적으로 발현하여 지카바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 백신 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 얻어진 지카바이러스에 대한 중화항체 및 이의 제조 방법을 제공한다.

Description

지카바이러스 E 단백질 유래의 재조합 항원 및 이의 용도{RECOMBINANT ANTIGEN DERIVED FROM ZIKA VIRUS E PROTEIN AND USE THEREOF}
본 발명은 지카바이러스 E 단백질 유래의 재조합 항원 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 지카바이러스 외피 단백질(Envelope Protein, "E")의 도메인 III(Domain III)의 반복 서열을 포함하는 재조합 항원, 이를 이용한 지카바이러스 예방용 DNA 백신 조성물, 이를 이용하여 제조된 지카바이러스에 대한 중화항체에 관한 것이다.
지카바이러스(Zika Virus, 간단히 "ZIKV"로도 지칭됨)는 1947년 우간다의 Rhesus 원숭이에서 발견된 모기로 전파되는 신종 바이러스이며, 1952년 우간다와 탄자니아에서 인간에서도 발견되었다. 이후 아프리카, 동남아시아 일부 국가에서 산발적 발생 보고가 있었으나 큰 관심의 대상이 되지 못했고, 2007년 Yap island에서 바이러스 질병이 크게 유행한 이후 태평양의 여러 섬나라로 확산되었다. 상기 바이러스 질환이 2015년부터 브라질을 중심으로 아메리카 대륙에서 크게 유행하였고 현재까지 중앙 및 남아메리카의 많은 국가에서 지속되고 있다.
지카바이러스는 임신한 여성에서 태아로 전염될 가능성이 있는 것으로 밝혀져 있고, 실제로 출생된 유아에서 소두증(microcephaly)이라는 뇌의 심각한 출생 결함에 관한 보고가 있다. 이를 계기로 WHO는 지카바이러스를 국제적으로 우려되는 공중 보건 위기라고 선언하였다.
지카바이러스가 인간에서 질병을 유발한 경우, 미열, 발진, 두통, 결막염, 근육통, 관절통으로 나타나는 자가한정적 열성 질환(self-limited febrile illness)이 발생한다. 최근에는, 지카바이러스의 감염이, 태아 및 유아에서의 소두증 발현의 증가, 및 성인에서의 길랑바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)과 관련이 있음이 밝혀졌다. 지카바이러스 질병에 대한 잠복기는 정확히 알려져 있지 않지만, 수일에서 일주일 정도일 것으로 예상되며, 일반적으로 가벼운 증상으로 수일에서 일주일 정도 지속된다. 지카바이러스는 일반적으로 감염된 사람의 혈액 속에 약 일주일 동안 머물러 있지만 일부 사람들에게는 더 오랜 기간 동안 머물러 있을 수도 있다.
현재 지카바이러스의 감염을 막기 위한 예방 백신이나 치료제는 존재하지 않는다. 지카바이러스 감염과 관련된 증상은 일반적으로는 경미하지만, 임산부에 감염시 태아에서 소두증이 발현될 수 있고, 또한 마비를 일으킬 수 있는 길랑발레 증후군의 발병과 같은 매우 치명적인 위협이 존재한다. 따라서 지카바이러스 질병으로부터 보호하기 위한 면역 반응을 유발하는 안전한 백신을 개발할 필요성이 있다.
지카바이러스는 Flavivirus 속(genus), Flaviviridae 과(family)에 속하는 양성센스 단일가닥 RNA 바이러스(positive-sense single-stranded RNA virus)이다. 지카바이러스는 3개의 구조 단백질인 Capsid ("C"), Precursor Membrane ("prM"), Envelope ("E") 단백질과, 7개의 비구조 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 및 NS5)를 코딩하는 약 11kb 길이의 RNA 게놈을 갖고 있다.
바이러스 백신 개발을 위해 정제된 사백신, 약독화 생백신, 재조합 서브유닛 백신, 아데노바이러스 벡터 백신, 바이러스 유사 입자(VLP), 및 DNA 또는 RNA 백신 등이 시도되었다. 이들 중 약독화된 생백신(life attenuated virus, LAV)의 경우, 효율적인 백신으로 오랫동안 사용되어 왔다. LAV는 질병을 일으키는 병원체에서 유래되었지만 실험실에서 의도적으로 약화되었기 때문에 면역 반응을 일으키는데 적합한 것으로 여겨지고 있다. 현재, 경구 소아마비 백신, 홍역 백신, 로타 바이러스 및 황열병 백신 등이 LAV 형태의 백신으로 판매되고 있다. 그러나 LAV 백신 등에 사용되는 바이러스 제제에서의 reversion, 순도 및 잠재적인 오염과 같은 안전성 문제가 여전히 존재한다.
DNA 백신은 종래 백신에 비해 많은 이점을 가지고 있다. DNA 백신은 면역 반응 유도에 필요한 항원 전체를 유전자 형태로 이용할 수 있어 광범위한 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한 다유전자(multi-genes) 또는 반복 도메인에 대해 변경될 수 있도록 고안된 항원 유전자만을 포함하여 항원성을 증가시킴으로써, 전체 감염성 제제를 포함하는 다른 백신에 비해 보다 안전하다. 나아가 여러 항원을 하나의 플라스미드 DNA에 삽입할 수 있어 항원 디자인 및 제작이 용이하고, 대장균을 숙주세포로 이용하여 쉽게 대량생산이 가능하며, 플라스미드 DNA가 매우 안정한 고분자 물질이므로 타 백신에 비해 실온에서도 장기간 보관이 가능한 특징을 가지고 있다.
한편, 지카바이러스 백신과 관련된 몇 가지의 선행 연구에서는, 정제된 사백신을 기반으로 하거나, 항원으로서 지카바이러스의 E 단백질 전체를 활용하고 있다. 예를 들어, 유럽특허 제3184118호에서는 항원으로서 E 단백질 염기 서열을 포함하면서, prM 단백질을 코딩하는 부분을 포함하고 있으며, 바이러스 유래 벡터를 사용하고 있다. 또한 한국특허공개번호 제10-2018-0036987호에서는 지카바이러스의 항원이 불활성화된 전체 비리온(inactivated whole virion)이거나 또는 항원으로서 E 단백질, M 단백질, 및 선택적으로 비구조1 (NS1) 단백질을 포함한다. 그러나 현재까지 E 단백질의 일부 도메인만을 반복하여 사용한 DNA 백신에 대해서 공개된 바 없다.
본 발명에서는, 지카바이러스 E 단백질 도메인 III의 반복 서열을 이용함으로써, 항원의 발현을 높이고 높은 항체가를 유도하여 지카바이러스 감염을 예방하기 위한 효과적인 DNA 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 지카바이러스의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 중화항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. 바람직한 실시 태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 IgE 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 재조합 발현 벡터(pVAX1-ENV domain III X 3)이다.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 플라스미드일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주세포를 제공한다. 일 특정 실시태양에서, 상기 숙주세포는 pVAX1-ENV domain III X 3 재조합 발현 벡터를 포함하며 수탁번호 KCTC13685BP로 기탁된 E.Coli-DH5α이다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 지카바이러스 감염 예방용 DNA 백신 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 및 IgE 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 재조합 발현 벡터를 포함하는 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 면역증강제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 지카바이러스 항원 단백질을 발현하여 지카바이러스에 대한 면역 반응을 유도한다.
본 발명은 또한 (a) 상기 폴리뉴클레오타이드를 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계; 및 (b) 상기 포유동물로부터 지카바이러스에 특이적으로 결합하는 중화항체를 수득하는 단계를 포함하는, 지카바이러스에 대한 중화항체의 제조 방법 및 이로부터 제조된 중화항체에 관한 것이다. 상기 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 중화항체를 인간화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 백신 조성물은 지카바이러스 E 단백질 도메인 III의 코돈 최적화된 항원 유전자를 반복하여 포함함으로써 항원 발현율을 증진시키고, 이에 따라서 효과적인 항원 특이적인 항체반응, 중화항체 반응, 동물모델의 비장세포에서 높은 IFN-γ 생성을 나타내는 세포매개성 면역 반응을 유도한다.
특히 본 발명에 따른 DNA 백신 조성물은 종래의 prME 항원 전체가 발현되는 백신과 비교하여 월등하게 우수한 효과를 나타낸다.
따라서 본 발명에 따른 DNA 백신 조성물은 지카바이러스 감염의 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 지카바이러스 E 단백질 도메인 III의 코돈 최적화된 항원 유전자를 반복하여 포함하는 폴리뉴클레오타이드는, 지카바이러스의 예방 또는 치료를 위한 중화항체 제조 및 지카바이러스 검출에도 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에 사용된 지카바이러스(ZIKV) DNA 백신 후보주 제조를 위한 플라스미드 구축물의 다이어그램을 도시한다. ZIKV 서열의 prM 또는 E 단백질 암호화하는 유전자 및 IgE 시그널 펩타이드를 암호화하는 유전자를 pVAX1 포유동물 발현 벡터에 도입시킨 것이다.
도 2는 실시예 2에서 기재된 바와 같이 DNA 백신 후보주를 사용한 마우스의 면역화 및 면역 분석 스케줄을 나타낸다.
도 3은 DNA 백신 후보주에 의해 유도되는 지카바이러스 E 단백질에 대한 항원 특이 항체가(Total IgG)를 ELISA를 통해 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 DNA 백신 후보주에 의해 유도되는 지카바이러스 E 단백질에 대한 IgG 항체의 아형(IgG subtype)을 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 DNA 백신 후보주에 의해 유도되는 지카바이러스 MR766주에 대한 혈청 중화항체 반응을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 DNA 백신 후보주에 의해 유도되는 세포성 면역 반응을 ELISPOT을 통해 비장세포에서의 IFN-γ 발현 정도를 측정하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 DNA 백신 후보주에 의해 유도되는 세포성 면역 반응을 FACS 분석을 통해 T cell에서 IFN-γ 발현 정도를 측정하여 분석한 결과를 나타낸다.
1. 폴리뉴클레오타이드
본 발명은 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 IgE 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 지카바이러스 백신의 항원으로서 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 선정한다. 지카바이러스 E 단백질(외피 단백질)은 바이러스 어셈블리, 세포 수용체에 부착을 매개하며, 바이러스 진입과 관련된 후속 막 융합에 필수적이다. 지카바이러스 E 단백질은 3개의 β-시트 도메인으로 이루어지는데, 이중 도메인 III은 세포 수용체 결합 모티프를 포함한다. 특히, 도메인 III에는 강력한 숙주 항체 반응 또는 방어 면역(protective immunity)을 유도하는 유형 특이적 중화 에피토프가 매핑되어 있다.
선택된 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 DNA 백신의 항원으로 사용하기 위해서는 바이러스 유래의 유전자를 포유동물(mammalian)에서 효율적으로 발현되도록 할 필요가 있다. 이를 위해 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환할 수 있다. 본 발명에서 사용된 "숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하는 것" 또는 "코돈 최적화"란 숙주세포 내에서 DNA가 단백질로 전사(transcription) 및 번역(translation)될 때 아미노산을 지령하는 코돈 사이에 숙주에 따라 선호도가 높은 코돈이 존재하는데, 이들 선호도가 높은 코돈으로 치환함으로써 그 핵산이 암호화하는 아미노산 또는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 것을 말한다.
본 발명에서는 천연형의 지카바이러스 E 단백질 도메인 III의 폴리뉴클레오티드를 포유동물에서의 발현에 적합하게 코돈 최적화시킨 뒤, 3회 반복 구조를 갖도록 제조하였다(서열번호 1). 코돈 최적화에는 예를 들어, Kazusa 프로그램(www.kazusa.or.jp/codon/)을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 따르면, 상기 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드는 이의 N-말단에 연결되며 IgE 시그널 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "시그널 펩타이드"란 세포 내에서 발현된 E 단백질 도메인 III을 세포 밖으로 이동시켜 주는 역할을 하는 펩타이드로, 일반적으로 DNA 백신에서 만들어진 항원 단백질이 세포 밖으로 분비되는 경우, 세포 내부(cytosol)나 세포막에 위치하는 경우보다 많은 양의 항원 특이적 IgG생성을 유도하여 더 효과적인 면역 반응을 얻을 수 있다.
본 발명에서는 IgE 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 코돈 최적화된 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 N-말단 부분에 연결시킴으로써, 세포 내에서 발현된 지카바이러스 E 단백질 도메일 III을 세포 밖으로 이동하도록 유도시킬 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 또는 둘 이상의 면역 증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "면역 증진 펩타이드"는 면역 반응에 관계하는 세포(예를 들어, 수지상 세포 등)를 활성화시켜 면역 반응을 증가시키는 펩타이드를 의미한다. 상기 면역 증진 펩타이드는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, CD40 리간드, Flt3(fms 유사 타이로신 kinase-3) 리간드, 플라젤린(flagellin), 또는 CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4) 등 일 수 있다.
본 발명의 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들면 폴리뉴클레오타이드 분자는 화학적 합성을 통해 직접적으로 제조될 수 있다.
2. 재조합 발현 벡터
본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시태양에 따른 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오타이드가 조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 포함하여 숙주세포에서 상기 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 발현하도록 할 수 있는 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체일 수 있다.
"작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적하는 핵산 서열의 발현이 이루어질 수 있도록 조절 서열에 연결되어 있음을 의미한다.
조절 서열은 프로모터, 인핸서, 개시 코돈, 중단 코돈 또는 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 조절 서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절 서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절 서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터이며, 더욱 바람직하게는, pVAX1TM (Invitrogen, San Diego, California) 발현 플라스미드이다. 이 발현 벡터는 고카피 pUC 복제 오리진을 pBR322의 저카피 pMB1 복제 오리진으로 치환하여 변형시킨 것이다. 저카피 변형물은 대사 부담을 줄여 구조체를 보다 안정적으로 만들기 위해 행해졌다.
본 발명에서는 pVAX1을 발현 벡터 벡본(backbone)으로 하고, 상기 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 상기 백터에 삽입하여, 발현 플라스미드 "pVAX1-ENV domain III X 3"을 제조하였다. 플라스미드 pVAX1-ENV domain III X 3 구조체에 대해서는 도 1에 도시되어 있으며, 이는 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 갖는다.
본 발명의 벡터는 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는, 예를 들어, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 IgE 시그널 펩타이드를 암호화하는 DNA, 본 발명의 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 DNA를, 적절한 조절 서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 DNA 백신 제조용 벡터인 pVAX1을 제조하여 사용하였다.
3. 숙주세포
본 발명은 상기 벡터를 포함하는 단리된 숙주세포에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주세포"란 원핵 또는 진핵 세포를 포함하며, 진핵세포는 진균, 효모 등을 포함하는 하등 진핵 세포뿐만 아니라 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포를 포함한다. 적당한 원핵세포들은 대장균(E. Coli) 또는 고초균(Bacillus subtilis)와 같이 클로닝에 보통 사용되는 세포들이다. 그리고, 진핵세포들은 진균세포(fungus), 식물세포 또는 동물세포들을 포함한다. 적당한 진균세포들의 예로는 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 중의 효모일 수 있다. 적당한 동물세포들의 예로는 곤충세포들, 식물세포들, 바람직하게는 포유류 세포들, 예컨대 HEK293, 293T, NSO, CHO, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따른 벡터로 형질감염 또는 형질전환된 숙주세포는 상기 벡터에 의해 유전적으로 변형된 숙주세포일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "유전적으로 변형된(genetically modified)"은 숙주세포에 도입된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를, 숙주세포가 자신의 게놈 외에 포함하는 것을 의미한다. 아울러, 본 발명의 일 실시태양에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 바람직하게는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주세포의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 숙주세포는 E.Coli이다. 특히 바람직하게는, 상기 숙주세포는 재조합 발현 벡터 pVAX1-ENV domain III X 3를 포함하며 수탁번호 KCTC13685BP로 기탁된 E.Coli-DH5α이다.
4. DNA 백신 조성물
본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 재조합 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 DNA 백신 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "DNA 백신"은 병원균 감염으로 유발되는 질병을 예방, 치료하기 위해 면역 반응을 유도하는 항원을 코딩하는 유전자를 정제된 플라스미드 벡터에 삽입시켜 생체 내에 주입하고, 숙주 시스템에서 전사 및 번역 과정을 통하여 단백질/펩타이드 형태로 발현된 항원이 세포성 및 체액성 면역 반응을 동시에 유도하는 백신 플랫폼이다.
DNA 백신에 사용되는 플라스미드는 동물세포 내에서 항원 단백질을 강하게 발현할 수 있는 프로모터 서열을 가지고 있으며, 박테리아에서 대량으로 플라스미드를 증폭시키기 위해 동물세포와 박테리아에서 모두 적용 가능한 셔틀벡터를 사용한다. 박테리아에서 대량 증폭되고 분리 및 정제를 거친 플라스미드 DNA는 세포 내로 주입되어 세포핵 내에서 전사된 다음, 세포질에서 번역되어 목적하는 항원 단백질/펩타이드를 발현하게 한다.
세포 내에서 발현된 항원 단백질/펩타이드가 세포질 내 프로테아좀(proteasome)에서 작은 펩타이드로 분해되면 골지체에서 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 클래스 I분자와 결합하여 세포표면에 제시되고, 이를 CD8+ 세포독성 T세포가 인지하여 세포성 면역을 유도하게 된다. 생체 내에서 발현된 항원 단백질이 체내 항원제시 세포인 B세포나 대식세포(macrophage)내로 포획되면, 세포 내 라이소좀에서 MHC 클래스 II 분자와 결합하여 세포표면에 제시되고 이를 CD4+ 도움 T세포가 인지하여 체액성 면역 반응이 활성화된다. 또한 항원 단백질을 인지한 B세포는 활성화되어 항원 특이 항체를 생산한다.
또한 본 발명의 백신 조성물은 높은 역가의 중화항체를 유도한다. 일 실시태양에서, 본 발명의 백신 조성물은 지카바이러스의 구조 단백질, 예를 들어, E 단백질 및/또는 prM을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 이용한 경우에 비해 더 높은 역가의 중화항체를 유도한다. 이에 따라 본 발명의 백신 조성물은 효과적인 중화항체 반응을 나타낸다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 발명의 DNA 백신 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여 방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 발명의 DNA 백신 조성물은 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보조제(adjuvant) 또는 면역증강제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "보조제(adjuvant)" 또는 "면역증강제"는 백신의 면역 반응을 향상시킬 목적으로 투여되는 약학적 또는 면역학적 제제를 의미한다. 상기 보조제는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알룸(포타슘 알루미늄 설페이트), MF59, virosome, AS04[알루미늄 하이드록사이드 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)의 혼합물], AS03(DL-α-tocopherol, squalene 및 유화제인 polysorbate 80의 혼합물), CpG, Flagellin, Poly I:C, AS01,AS02, ISCOMs 또는 ISCOMMATRIX일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 비경구 투여 시, 산화방지제, 완충제, 정균제, 및 의도한 수용자의 혈액과 등장액 상태가 되도록 한 용질 등을 포함하는 수성 및 비수성 멸균 주사 용제를 포함할 수 있으며, 수성 및 비수성 멸균 현탁제는 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 주사용 용제로 이용하기에 유용한 첨가제는 예를 들어 물, 알코올, 폴리올(polyol), 글리세린 및 식물성 오일 등을 포함한다. 상기 조성물은 단위 용량(1 회분) 또는 다중 용량(수 회분) 용기로 나타낼 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 앰풀(ampoule) 및 바이알(vial)에 제시될 수 있고, 사용직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면 주사액 제조시 필요한 물의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 조건 하에 저장할 수 있다. 예를 들어, 상기 투여는 근육주사, 피하주사, 또는 복강주사를 통한 투여일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 피투여자의 건강 상태, 체중, 성별 및 투여 목적 등에 따라 적절하게 용량을 설정하여 투여될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 발명의 DNA 백신 조성물에 포함된 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 예를 들어, 발현 플라스미드 pVAX1-ENV domain III X 3은 생체 내에 주입된 후 생체 내에서 지카바이러스 항원 단백질을 발현하고 생산하여 세포 밖으로 분비한다. 예를 들어, 상기 항원 단백질은 세포 내에서 생산된 후 시그널 펩타이드에 의하여 세포 바깥으로 이송되는 것일 수 있다. 이 때 생성된 지카바이러스 항원 단백질에 의하여, 생체 내에서 지카바이러스에 대한 면역 반응이 유도될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 반응"은 항원 도입에 대한 반응에서 숙주, 예를 들어 포유류의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응, 또는 둘 다의 형태일 수 있다. 또한 면역 반응은 중화항체의 생산을 유도하는 것일 수 있다.
5. 중화항체 및 이의 제조 방법
본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 얻어진 지카바이러스에 대한 중화항체 및 이의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시태양에서, 중화항체는 상기 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 포유동물을 면역화함으로써 수득될 수 있다. 구체적으로, 상기 중화항체는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포유동물에 투여하는 단계 및 상기 포유동물로부터 지카바이러스에 특이적으로 결합하는 중화항체를 수득하는 단계를 포함한다. 이 때 상기 포유동물은 인간을 제외한 포유동물 일 수 있다. 예를 들어, 래트, 마우스, 햄스터, 돼지, 토끼, 말, 당나귀, 염소, 양, 기니 피그, 라마 등을 비제한적으로 포함한다. 예를 들어, 마우스는 단클론성 항체를 제조하기 위해 사용되며, 토끼 또는 기니피그는 다클론성 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 비-인간 포유동물에서 제조된 중화항체는 인간화 항체로 변환될 수 있다. 이 경우 본 발명의 상기 방법은 비-인간 포유동물에서 생성된 중화항체를 인간화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 비인간 "공여자(donor)" 항체로부터의 CDR이 인간 "수용자" 항체 서열에 접합된 유전자 조작된 항체이다. 수용자 항체 서열은, 예를 들어, 성숙 인간 항체 서열, 이러한 서열의 복합체, 인간 항체 서열의 공통 서열 또는 생식계열 서열일 수 있다. 비-인간 항체로부터 인간화 항체로 변환시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 중화항체는 포유동물에서 지카바이러스 감염에 의한 질병을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 중화항체는 지카바이러스를 중화시키기에 충분한 용량으로 사용된다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1] DNA 백신 후보주의 제작
지카바이러스의 구조 단백질인 E 단백질("ENV") 및 prM을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(후보주 1); E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(후보주 2); E 단백질 도메인 III을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(후보주 3); 또는 E 단백질 도메인 III의 3회 반복 폴리뉴클레오타이드(후보주 4)를 DNA 백신 개발을 위한 목적으로 디자인된 pVAX1 벡터에 각각 삽입하여 4개의 DNA 백신 후보주를 제작하였다(표 1 및 도 1).
DNA 백신 후보주 발현 단백질 폴리뉴클레오타이드
1 prM + ENV 서열번호 4
2 ENV 서열번호 5
3 ENV domain III (단독) 서열번호 6
4 ENV domain III X 3 (3회 반복) 서열번호 3
지카바이러스의 구조 단백질 중 세포 수용체 부착 모티프를 많이 포함하고 있어 항체 형성반응과 방어 면역에 중요하다고 알려진 E 단백질의 도메인 III 부분은 포유동물(mammalian)에서 발현이 잘 되도록 코돈을 최적화하여 단독 또는 반복 구조로 제작하였다(후보주 3 및 4).
이를 위해 SPH2015 Strain(Brazil 지카바이러스) 클론을 주형(Template)으로 하여 PCR 반응을 수행하여 후보주 1 내지 3의 각 단백질 유전자를 증폭시켰다. 이 때 사용된 Forward(F) Primer와 Reviser® Primer는 표 2 내지 표 4에 나타낸 바와 같다.
Figure 112018124964986-pat00001
Figure 112018124964986-pat00002
Figure 112018124964986-pat00003
후보주 4의 경우, E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 유전자 합성을 통해 제작한 후, 이를 표 5의 Primer를 이용하여 PCR 합성으로 증폭시켰다.
Figure 112018124964986-pat00004
각 DNA 백신 후보주는 항원 발현양을 증가시키기 위해 IgE 시그널 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 2)를 연결하여 제작하였다. 구체적으로, IgE 시그널 펩타이드 및 Kozak consensus sequence가 포함된 pVAX1 벡터와 상기 증폭된 각 유전자들을 동일한 제한효소로 처리한 후 리게이션하여, 각 DNA 백신 후보주를 제작하였다.
[실시예 2] 마우스 면역화
실시예 1에서 제조된 각각의 DNA 백신 후보주 200μg와 면역증강제로서 알루미늄 하이드록사이드를 혼합하여 5주령 암컷 C57BL/6 마우스에 3주 간격으로 3회 근육 접종하여 면역화시켰다. 2차 및 3차 접종 1주 후 마우스로부터 얻은 혈액 및 비장세포를 이용하여, 세포성 면역 반응 및 체액성 면역 반응을 분석하였다. 구체적인 마우스 면역화 및 면역 반응 분석 스케줄은 도 2에 나타내었다.
[실시예 3] 지카바이러스 E 단백질에 대한 항원 특이 항체가 분석
실시예 2에 따라 면역화된 마우스로부터 얻어진 혈청을 이용하여 백신 후보주들의 항원 특이 항체가를 분석하였다.
Baculovirus 유래 E 단백질 1 ug/ml을 ELISA 96웰 플레이트(Nunc Maxisorp; Nunc, 442404)에 ELISA 코팅 버퍼(Biolegend, 4217)을 이용하여 각 웰 당 50 ul씩 첨가하고 4°C에서 밤새 반응시켜 코팅하였다. 반응 후 반응액을 제거하고 각 웰에 워싱 버퍼 1XPBST(0.05% Tween20)을 첨가하여 2회 반복 세척한 후, 블로킹 버퍼 PBS+1% BSA를 각 웰 당 100 ul씩 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켜 블로킹하였다.
위와 동일한 방법으로 1XPBST(0.05% Tween20)을 사용하여 2회 반복 세척한 후, 희석 버퍼 PBS+1% BSA에 100:1부터 2:1까지 연속적으로 희석된 실시예 2의 면역화된 마우스 혈청을 1차 항체로 사용하여 50 ul씩 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 1XPBST(0.05% Tween20)을 사용하여 3회 반복 세척한 후, 2차 항체로서 홀스래디쉬 과산화효소(HRP)-접합된 마우스 IgG(Santacruz, sc-2005)를 희석 버퍼 PBS+1% BSA에 5000:1로 희석하여 각 웰에 50 ul씩 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 1XPBST(0.05% Tween20)을 사용하여 5회 반복 세척한 후, 발색 시약 TMB를 각 웰당 50 ul씩 첨가하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 중단 용액(GenDEPOT, T3550-100)을 100 ul씩 첨가하여 반응을 중단시킨 후 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 백신 후보주 1 내지 4에서 모두 3회차 접종 1주 후인 7주에 항체가를 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 후보주 4(pVAX1-ENV domain III X 3 백신 후보주)의 경우 다른 백신 후보주와 비교하여 5배 이상 월등하게 높은 수준의 항체가를 나타내었고, 2회 접종만으로도 충분한 항체가를 유도하였다(도 3).
[실시예 4] 지카바이러스 E 단백질에 대한 특이적 IgG 아형 분석
실시예 2의 백신 후보주 접종 후 7주째 채혈된 마우스의 혈청을 이용하여, 면역화된 마우스에서 형성된 항-지카바이러스 IgG 항체의 아형을 분석하였다.
실시예 3에서 사용한 것과 동일한 ELISA 분석법을 사용하였으며, 단, 2차 항체로서 표 6의 마우스 IgG의 각 아형 항체를 사용하였다.
아형 제조사(Southern biotech)
카탈로그 번호
IgG1 1071-05
IgG2a 1081-05
IgG2b 1091-05
IgG3 1101-05
그 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이, 후보주 1 내지 3(prM-ENV, ENV, 및 ENV domain Ⅲ)에서 IgG2b 항체 생성능이 높았다. 반면, 후보주 4(ENV domain Ⅲ X 3)의 경우 IgG2b와 IgG1 항체 생성능이 모두 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] 중화항체가 분석
실시예 2에 따라 면역화된 마우스로부터 얻어진 혈청을 이용하여 백신 후보주들의 중화항체가를 분석하였다.
분석 24시간 전에 시딩된 융합한(confluent) Vero 세포를 포함하는 96-웰 플레이트에서 혈청 중화 분석을 수행하였다. 동일 부피로 순차적으로 2배 희석시킨 혈청 시료들을 50 μl의 100 TCID50 지카바이러스(MR766 주, 아프리카 계통)와 혼합시킨 후 37ºC에서 1시간 인큐베이션하였다. 혼합물을 단일층(monolayer)의 Vero 세포에 도포한 후 37ºC에서 5일동안 인큐베이션하였다. 세포변성 효과(cytopathic effect, CPE)가 나타나지 않는 최고차 희석물로서 중화항체가를 결정하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 후보주 3 및 4(ENV domain Ⅲ를 단독으로 혹은 반복적으로 발현하는 백신 후보주)가 후보주 1(prM-ENV을 발현하는 백신 후보주)에 비해 더 높은 중화항체가를 나타내는 것을 확인하였다.
[실시예 6] 세포성 면역 반응 분석
실시예 2에서 DNA 백신 후보주를 3차 접종하여 얻은 마우스의 비장세포를 이용하여 항원 특이적 T 세포 반응을 분석하였다.
분리된 비장세포를 지카바이러스의 E 단백질을 구성하는 15mer 펩타이드 146개 혼합물로 이루어진 지카바이러스 pepmix(JPT) 1 μg/ml를 이용하여 37ºC에서 24시간 자극하였다.
비장세포에서의 인터페론-감마(IFN-γ) 발현 정도를 ELISPOT을 이용하여 분석하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, pVAX1 control에 비해 본 발명의 DNA 백신 후보주가 더 높은 IFN-γ Spot 수를 나타내었다. 특히, 후보주 4가 가장 높은 발현을 나타내었으며, 후보주 3과 비교하여 5배 이상 월등하게 높은 수준을 나타내었다.
또한, 세포유동분석법(구체적으로는, Fluorescence-Activated Cell Sorting(FACS)) 분석을 통해 T cell에서 IFN-γ 발현을 확인한 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 후보주 4에서 가장 높은 수치를 나타내는 것을 알 수 있다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13685BP
수탁일자 : 20181025
<110> Korea Centers for Disease Control and Prevention <120> RECOMBINANT ANTIGEN DERIVED FROM ZIKA VIRUS E PROTEIN AND USE THEREOF <130> P180054 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon opti ED3 <400> 1 ggagtgagct atagtctgtg tacagccgct tttacattca ctaagatccc agccgaaacc 60 cttcacggaa cagtgacagt ggaagtgcag tacgctggaa ctgacggacc atgtaaggtg 120 ccagctcaga tggccgtgga tatgcaaaca ctgacacccg tgggaagact gatcacagct 180 aatccagtga ttactgaatc tacagagaat agcaaaatga tgctggaact tgacccccca 240 tttggagact catatattgt gatcggcgtg ggcgagaaga agatcaccca ccactggcat 300 agatccggca gcacgggggg cggcggaggc gtgagctaca gcctgtgcac cgccgccttc 360 acctttacca agatcccagc cgagacgctg cacggcacag tgaccgtgga ggtgcagtac 420 gccggaaccg acggaccatg caaggtgcca gcccagatgg ctgtggacat gcagaccctg 480 acccccgtgg gcagactgat caccgccaac ccagtgatca cagagtctac cgagaacagc 540 aagatgatgc tggaactgga cccacccttc ggagatagct atatcgtgat cggagtgggc 600 gagaaaaaga tcacacacca ctggcacaga 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cccccatttg gagactcata tattgtgatc ggcgtgggcg agaagaagat cacccaccac 360 tggcatagat ccggcagcac ggggggcggc ggaggcgtga gctacagcct gtgcaccgcc 420 gccttcacct ttaccaagat cccagccgag acgctgcacg gcacagtgac cgtggaggtg 480 cagtacgccg gaaccgacgg accatgcaag gtgccagccc agatggctgt ggacatgcag 540 accctgaccc ccgtgggcag actgatcacc gccaacccag tgatcacaga gtctaccgag 600 aacagcaaga tgatgctgga actggaccca cccttcggag atagctatat cgtgatcgga 660 gtgggcgaga aaaagatcac acaccactgg cacagaagcg gcagcaccgg aggaggcgga 720 ggcgtgagct actctctgtg cactgctgcc ttcaccttca ccaaaatccc cgccgagaca 780 ctgcacggaa ccgtgaccgt agaagtgcag tacgctggca ccgacggacc ctgcaaggtg 840 cccgcccaga tggccgtgga catgcagaca ctgaccccag tgggcagact gatcacagct 900 aaccccgtga tcacagagag caccgaaaac tctaaaatga tgcttgagct tgacccccct 960 tttggagata gctatatagt gataggagta ggtgaaaaga agataactca ccactggcat 1020 agatccggta gcacatgact cgag 1044 <210> 4 <211> 2088 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prM + ENV <400> 4 ggatccgcca ccatggactg gacctggatt 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tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccagc cagagaatct ggagtaccgg 480 ataatgctgt cagttcatgg ctcccagcac agtgggatga tcgttaatga cacaggacat 540 gaaactgatg agaatagagc gaaggttgag ataacgccca attcaccaag agccgaagcc 600 accctggggg gttttggaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg ccttgacttt 660 tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa ggagtggttc 720 cacgacattc cattaccttg gcacgctggg gcagacaccg gaactccaca ctggaacaac 780 aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactgt cgtggttcta 840 gggagtcaag aaggagcagt tcacacggcc cttgctggag ctctggaggc tgagatggat 900 ggtgcaaagg gaaggctgtc ctctggccac ttgaaatgtc gcctgaaaat ggataaactt 960 agattgaagg gcgtgtcata ctccttgtgt accgcagcgt tcacattcac caagatcccg 1020 gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac agatggacct 1080 tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaactc tgaccccagt tgggaggttg 1140 ataaccgcta accccgtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat gctggaactt 1200 gatccaccat ttggggactc ttacattgtc ataggagtcg gggagaagaa gatcacccac 1260 cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt gagaggtgcc 1320 aagagaatgg cagtcttggg agacacagcc tgggactttg gatcagttgg aggcgctctc 1380 aactcattgg gcaagggcat ccatcaaatt tttggagcag ctttcaaatc attgtttgga 1440 ggaatgtcct ggttctcaca aattctcatt ggaacgttgc tgatgtggtt gggtctgaac 1500 acaaagaatg gatctatttc ccttatgtgc ttggccttag ggggagtgtt gatcttctta 1560 tccacagccg tctctgctga ttagctcgag 1590 <210> 6 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ENV domain III <400> 6 ggatccgcca ccatggactg gacctggatt ctgttcctcg tggctgctgc tacaagagtg 60 cacagcggcg tgtcatactc cttgtgtacc gcagcgttca cattcaccaa gatcccggct 120 gaaacactgc acgggacagt cacagtggag gtacagtacg cagggacaga tggaccttgc 180 aaggttccag ctcagatggc ggtggacatg caaactctga ccccagttgg gaggttgata 240 accgctaacc ccgtaatcac tgaaagcact gagaactcta agatgatgct ggaacttgat 300 ccaccatttg gggactctta cattgtcata ggagtcgggg agaagaagat cacccaccac 360 tggcacagga gtggcagcac ctagctcgag 390

Claims (15)

  1. 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, IgE 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  4. 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 재조합 발현 벡터.
  5. 제4항의 재조합 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포가 기탁번호 KCTC13685BP로 기탁된 E.Coli-DH5α인 것을 특징으로 하는 단리된 숙주세포.
  7. 지카바이러스 E 단백질 도메인 III을 3회 반복하여 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 IgE 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물.
  9. 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 재조합 발현 벡터를 포함하는 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 면역증강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 지카바이러스 항원 단백질을 발현하여 지카바이러스에 대한 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 지카바이러스 항원 단백질을 발현하여 지카바이러스에 대한 중화항체의 생산을 유도하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. (a) 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오타이드를 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계; 및
    (b) 상기 포유동물로부터 지카바이러스에 특이적으로 결합하는 중화항체를 수득하는 단계
    를 포함하는, 지카바이러스에 대한 중화항체의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 중화항체를 인간화하는 단계
    를 추가로 포함하는, 지카바이러스에 대한 중화항체의 제조 방법.
  15. 제13항의 제조 방법으로 제조된 중화항체.
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