KR101989978B1 - 프라임 부스트 백신용 수포성 구내염 바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)의 기질(matrix, M) 단백질 돌연변이에 관한 것이다. 하나의 돌연변이 M 단백질은 번 위치(21)에서 글루타민산으로 변경된 글리신, 위치(111)에서 페닐알라닌으로 변경된 류신 및 위치(51)에서 아르기닌으로 변경된 메티오닌을 포함한다. 다른 하나의 M 단백질 돌연변이는 위치(22)에서 글루타민산으로 변경된 글리신 및 위치(48 및 51)에서 아르기닌으로 변경된 메티오닌을 포함한다. 또 다른 M 단백질 돌연변이는 위치(22)에서 글루타민산으로 변경된 글리신, 위치(110)에서 페닐알라닌으로 변경된 류신 및 위치(48 및 51)에서 아르기닌으로 변경된 메티오닌을 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 M 돌연변이를 갖는 재조합 VSV(rVSV) 및 본 발명의 M 돌연변이를 갖는 rVSV를 기반으로 하는 백신에 관한 것이다. 돌연변이 M을 갖는 이러한 새로운 rVSV는 신경독성을 포함하여 크게 약독화되었고 독성을 고 상당히 약독화되었고 무독성이며, 관심 있는 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, 처음 언급한 M 돌연변이를 갖는 rVSV 혈청형 인디애나는 31℃에서 효율적으로 복제될 수 있고, 대략 37℃ 이상에서는 저조하게 복제되거나 복제될 수 없다.

Description

프라임 부스트 백신용 수포성 구내염 바이러스{VESICULAR STOMATITIS VIRUS FOR PRIME BOOST VACCINES}
본 발명은 일반적으로 생명 공학 및 면역학에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)의 신규한 기질(matrix, M) 단백질, 상기 신규한 M 단백질을 발현하는 약독화(attenuated) 재조합 VSV, 및 외래 유전자를 갖는 재조합 VSV에 의해 발현되는 외부 항원에 대해 오래 지속되는 체액성(humoral), 세포 매개성(cell-mediated) 및 점막 면역 반응을 유도하는 VSV기반 프라임-부스트 백신에 관한 것이다.
수포성 구내염 바이러스(VSV)는 대부분의 포유류 세포를 감염시키고 감염된 세포의 전체 단백질 중 최대 60%의 바이러스 단백질을 발현하는 음성 가닥(negative stranded) RNA 바이러스이다[Kim, G. N. and C. Y. Kang. Virology 357:41, 2007]. 자연적으로, VSV는 돼지, 소 그리고 말을 감염시키며 입과 발 주위에 수포병(vesicular disease)을 유발한다. VSV에 의한 인체 감염이 보고되었지만, VSV는 인간에게서 심각한 증상을 유발하지 않는다[Fields, B, N., and K. Hawkins. N Engl J Med 277:989, 1967; Johnson, K. M. et al. Am J Trop Med Hyg 15:244, 1966].
VSV는 다섯 가지 단백질, 즉, 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein, N), 인단백질(phosphoprotein, P), 기질 단백질(matrix protein, M), 표면 당단백질(surface glycoprotein, G), 및 RNA 의존성 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase, L)를 암호화한다.
VSV 기질(M) 단백질에 의한 숙주 세포 단백질 합성의 차단은 세포 사멸을 유도한다. M 단백질의 51번 위치의 메티오닌 잔기를 수포성 구내염 바이러스의 인디애나 혈청형 (VSVInd)에서 아르기닌(M51R)으로 변경시키는 것과 48번(Met48) 및 51번(Met51) 위치에서의 메티오닌을 수포성 구내염 바이러스의 뉴저지 혈청형(VSVNJ) M 유전자로 변경시키는 것은 VSV M 단백질의 기능을 무력화시킬 수 있다(Kim, G. and Kang, C, Virology, 357:41-53, 2007). M 단백질에서의 Arg 돌연변이에 대한 이러한 MET를 갖는 VSV는 세포변성 효과를 크게 감소시키지만, 이들은 세포에서 그리고 감염된 동물에서 여전히 자손 바이러스를 복제하고 생산한다. VSVInd 오르세이(Orsay) 균주의 온도 민감성(temperature sensitive, ts) M 유전자 돌연변이 중 하나인 tsO23은 37℃와 39℃에서 쥐 신경교 세포주(glial cell line)에서 제한된 복제를 나타냈다(Rabinowitz, S. et al. Infection and Immunity 33:120-125, 1981). tsO23의 온도 민감성은 39℃에서 특징적인 탄환형(bullet shaped) 구조를 갖는 바이러스 어셈블리의 부적절한 개시 또는 개시의 결핍의 결과인 것으로 나타났다 (Flood, E. et al. Virology 278:520-533, 2000; Lyles, D. et al Virology, 217:76-87, 1996). 또한, tsO23는 뇌에 직접 접종된 후에도 쥐에서 이의 신경 독성을 잃었다(Rabinowjtz, S. et al. Infection and Immunity, 33:120-125, 1981).
VSV 오르세이 균주의 야생형 M과 tsO23의 M 간에 세 가지 아미노산 차이가 있으며, 이는 21번째 아미노산에서 글루타민산(E)에 대한 글리신(G) (G21E), 111번째 아미노산에서 페닐알라닌(F)에 대한 류신(L) (LI111F), 및 227번째 아미노산에서 타이로신(Y)에 대한 히스티딘(H) (H227Y)이다(Morita, K. et al. J. Virol. 61: 256-263, 1987). 복귀 돌연변이에서 하나의 아미노산이 F111에서 L로 복귀되는 것은 F111이 tsO23의 온돈 민감성에서 중요한 역할을 하는 것으로 보이는 것을 시사한다. 그러나, 111번째 위치에서 F에서 L로의 단일 복귀가 바이러스를 원래의 야생형 표현형으로 완전히 회복시키지 않기 때문에 나머지 두 가지 돌연변이도 일부 역할을 가질 수 있다 (Morita, K. et al. J. Virol. 61:256-263, 1987; Li, Y. et al. J. Virol. 62:3729-3737, 1988).
현재, 연구 그룹들은 안전한 백신 벡터로서 결손된 G 당단백질(G) 유전자(ΔG) 또는 결손된 G와 M 유전자(ΔMG) 모두를 갖는, 복제가 능숙한, 조립이 불완전한 VSV를 개발하고 있다(Kahn, J. et al. J. Virol. 75:11079- 11087, 2001; Schwartz, J. et al, Virology 366:166-73, 2007). 그러나, 결손된 G 유전자 또는 결손된 M과 G 유전자를 가짐으로 인해, VSV 벡터는 조립이 불완전한 VSV의 생성을 위해 도중에 G또는 M과 G 단백질 모두의 공급을 필요로 한다. 백신 생산 비용을 줄이기 위해서는, 높은 역가로 복제될 수 있는 바이러스 백신 벡터를 생산할 수 있는 시스템을 형성할 필요가 있다. 따라서, 필요한 것은, 자체 독성을 상실했고(무독성) 여전히 31℃의 시험관에서 높은 역가로 복제될 수 있고, 비-허용 온도에서 적절하게 조립될 수 없으며, 발현하는 관심 있는 유전자에 대해 양호한 면역 반응을 유도할 수 있는 전장 VSV 벡터 시스템이다.
본 발명의 추가의 그리고 다른 목적은 다음과 같은 본 발명의 요약, 본 발명의 논의 및 이의 실시형태와 실시예로부터 구현될 것이다.
본 발명의 목적은 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)의 신규한 기질(matrix, M) 단백질, 상기 신규한 M 단백질을 발현하는 약독화(attenuated) 재조합 VSV, 및 외래 유전자를 갖는 재조합 VSV에 의해 발현되는 외부 항원에 대해 오래 지속되는 체액성(humoral), 세포 매개성(cell-mediated) 및 점막 면역 반응을 유도하는 VSV기반 프라임-부스트 백신을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)의 인디애나 혈청형(VSVInd) 및 VSV의 뉴저지 혈청형(VSVNJ)을 포함하는 VSV의 새로운 기질(M) 단백질 돌연변이들을 생성하였다. 변이 단백질을 갖는 이러한 새로운 VSV들은 본질적으로 비-세포용해성(non-cytolytic)이고, 신경독성(neurovirulence)을 포함하여 크게 약독화되고 무독성이다(안전함). 또한, 변이 M 단백질을 갖는 이러한 새로운 VSV들은 관심 있는 항원 또는 에피토프(epitope)에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 면역 반응은 체액성, 세포성 및 점막 면역 반응일 수 있다. 또한, M 돌연변이를 갖는 VSVInd는 보통 31℃에서 조립되고 감염된 세포에서 방출될 수 있지만, 37℃ 이상에서는 적절하게 조립될 수 없으며, 감염된 세포로부터의 이러한 바이러스의 방출은 야생형 VSVInd에 비해 대략 1,000 배 또는 10,000 배 정도 크게 감소된다.
이와 같이, 일 실시형태에서, 본 출원은 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)의 변형된 기질(M) 단백질에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 변형된 M 단백질은 (i) 적어도 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3; 및 (ii) 적어도 다음의 치환: G22E/M48R+M51R을 포함하는 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 변형된 M 단백질은 적어도 다음의 치환: G22E/L110F/M48R+M51R을 포함하는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 변형된 M 단백질의 다른 실시형태에서, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 4, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 출원은 재조합 VSV(rVSV)를 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 rVSV는 변형된 기질(M) 단백질을 포함하며, 상기 변형된 기질(M) 단백질은 (i) 적어도 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3; 및 (ii) 적어도 다음의 치환: G22E/M48R+M51R을 포함하는 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 rVSV는 외부 병원균의 단백질을 발현하는 키메라(chimeric) rVSV이고, 상기 키메라 rVSV는 상기 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 rVSV의 다른 실시형태에서, 상기 병원균은 바이러스성, 곰팡이성, 세균성 또는 기생성 병원균이다.
본 발명의 rVSV의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSV는 본질적으로 비-세포용해성이고 무독성이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 rVSV는 재조합 수포성 구내염 바이러스의 인디애나 혈청형(rVSVInd)이고, 상기 변형된 M 단백질은 적어도 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 rVSVInd의 일 실시형태에서, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 rVSVInd의 다른 실시형태에서, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화된다.
본 발명의 rVSVInd의 또 다른 실시형태에서, 이전 실시형태 중 어느 하나의 rVSVInd는 허용 온도에서 VSVInd 입자를 생성할 수 있고 비-허용 온도에서는 상기 입자를 생성할 수 없다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSV는 재조합 수포성 구내염 바이러스의 뉴저지 혈청형(rVSVNJ)이고, 상기 변형된 M 단백질은 적어도 다음의 치환: G22E/M48R+M51R을 포함하는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 rVSVNJ의 일 실시형태에서, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화된다.
본 발명의 rVSVNJ의 다른 실시형태에서, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 rVSVNJ의 또 다른 실시형태에서, 상기 변형된 M 단백질은 다음의 치환: G22E/M48R+M51R을 포함한다.
본 발명의 rVSVNJ의 또 다른 실시형태에서, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 7의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화된다.
본 발명의 rVSVNJ의 또 다른 실시형태에서, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 백신을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 백신은 하나 이상의 약독화 rVSV의 유효량을 포함하고, 상기 하나 이상의 약독화 rVSV는 변형된 기질(M) 단백질을 포함하며, 상기 변형된 M 단백질은 (i) 적어도 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3; 및 (ii) 적어도 다음의 치환: G22E/M48R+M51R을 포함하는 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 백신의 일 실시형태에서, 상기 rVSV은 재조합 수포성 구내염 바이러스의 인디애나 혈청형(rVSVInd)이고, 상기 변형된 M 단백질은 적어도 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 백신의 다른 실시형태에서, 상기 rVSVInd의 변형된 M 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSVInd의 변형된 M 단백질은 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화된다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSVInd는 허용 온도에서 VSVInd 입자를 생성할 수 있고 비-허용 온도에서는 상기 입자를 생성할 수 없다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSV는 재조합 수포성 구내염 바이러스의 뉴저지 혈청형(rVSVNJ)이고, 상기 변형된 M 단백질은 적어도 다음의 치환: G22E/M48R+M51R을 포함하는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSV는 rVSVNJ이고, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화된다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSV는 rVSVNJ이고, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSV는 rVSVNJ이고, 상기 변형된 M 단백질은 다음의 치환: G22E/L110F/M48R+M51R을 포함한다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSV는 rVSVNJJ이고, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 7의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화된다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSV는 rVSVNJ이고, 상기 변형된 M 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 이전 실시형태 중 어느 하나에 따른 rVSV는 외부 병원균의 단백질을 발현하는 키메라 rVSV이고, 상기 키메라 rVSV는 상기 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 rVSV는 약독화 키메라 rVSV들의 혼합물을 포함하고, 상기 혼합물에서 적어도 두 개의 키메라 rVSV는 외부 병원균의 다른 단백질을 발현한다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 병원균은 바이러스성, 곰팡이성, 세균성 또는 기생성 병원균이다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 병원균은 렌티바이러스(lentivirus)이다.
본 발명의 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 렌티바이러스는 HIV이고 에피토프는 HIV 단백질이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 병원균은 HCV이고 에피토프는 HCV 단백질이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 이전 실시형태 중 어느 하나의 백신은 체액성, 세포성 및 점막 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 이전 실시형태 중 어느 하나의 백신은 면역보강제(adjuvant)를 더 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 적어도 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 변형된 M 단백질을 갖는 하나의 혈청형의 약독화 rVSV를 포함하는 하나의 백신의 유효량; 및 (b) 적어도 다음의 치환: G22E/M48R+M51R을 포함하는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 변형된 M 단백질을 갖는 다른 하나의 혈청형의 약독화 rVSV를 포함하는 다른 하나의 백신의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 제 2 변형된 M 단백질은 적어도 다음의 치환: G22E/L110F/M48R+M51R을 포함하는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 방법의 일 실시형태에서, (a)는 (b)가 환자에 투여되기 전에 대상에 투여된다.
본 발명의 방법의 다른 실시형태에서, (b)는 유도 과정 동안 한 번 이상 대상에 투여된다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, (a)는 대상에 투여되고 (b)는 (a)의 투여 이후 대략 3 주, 8 주 및 16 주에 대상에 투여된다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, (b)는 (a)가 대상에 투여되기 전에 대상에 투여된다.
본 발명의 방법의 다른 실시형태에서, (a)는 유도 과정 동안 한 번 이상 대상에 투여된다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, (b)는 대상에 투여되고 (a)는 (b)의 투여 이후 대략 3 주, 8 주 및 16 주에 대상에 투여된다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 백신 (a)의 rVSV와 백신 (b)의 rVSV는 외부 병원균의 단백질을 발현하는 키메라 rVSV이고, 상기 두 개의 rVSV는 상기 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 병원균은 바이러스성, 곰팡이성, 세균성 또는 기생성 병원균이다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 병원균은 렌티바이러스이다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 렌티바이러스는 HIV이고 단백질은 HIV 단백질이다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 하나의 혈청형의 rVSV와 상기 다른 하나의 혈청형의 rVSV는 표면 당단백질(G) 유전자와 RNA 의존성 RNA 중합효소(L) 유전자를 포함하고, 상기 HIV 단백질을 발현하는 유전자는 G 유전자와 L 유전자 사이에 삽입된 HIV 단백질이다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 HIV 유전자는 gag , env 및 pol로 이루어진 HIV 유전자의 군에서 선택된다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 병원균은 HCV이고 단백질은 HCV 단백질이다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 하나의 혈청형의 rVSV와 상기 다른 하나의 혈청형의 rVSV는 표면 당단백질(G) 유전자와 RNA 의존성 RNA 중합효소(L) 유전자를 포함하고, 상기 HCV 단백질을 발현하는 유전자는 상기 rVSV의 G 유전자와 L 유전자 사이에 삽입된다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 백신 (a)와 백신 (b)는 약독화 키메라 rVSV들의 혼합물을 포함하고, 상기 혼합물에서 약독화 키메라 rVSV 중 적어도 두 개는 병원균의 다른 단백질을 발현한다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 두 개의 백신 (a)와 (b) 각각은 체액성, 세포성 및 점막 면역 반응을 유도한다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 백신 (a)의 rVSV의 혈청형은 인디애나이고 백신 (b)의 rVSV의 혈청형은 뉴저지이다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시형태에서, 백신 (a)와 (b) 각각은 면역보강제를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 프라임 부스트 복합 백신(prime boost combination vaccine)을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 프라임 부스트 복합 백신은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 변형된 M 단백질을 갖는 하나의 혈청형의 약독화 rVSV를 포함하는 하나의 백신의 유효량; 및 (b) 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 변형된 M 단백질을 갖는 다른 하나의 혈청형의 rVSV를 포함하는 다른 하나의 백신의 유효량을 포함한다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 일 실시형태에서, 백신 (a)는 프라이밍(priming) 백신이고 백신 (b)는 부스터(booster) 백신이다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 다른 실시형태에서, 백신 (b)는 프라이밍 백신이고 백신 (a)는 부스터 백신이다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 두 개의 약독화 rVSV는 외부 병원균의 단백질을 발현하는 키메라 rVSV이고, 상기 두 개의 키메라 rVSV는 상기 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 병원균은 바이러스성, 곰팡이성, 세균성 또는 기생성 병원균이다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 병원균은 렌티바이러스이다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 렌티바이러스는 HIV이고 단백질은 HIV 단백질이다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 하나의 혈청형의 rVSV와 상기 다른 하나의 혈청형의 rVSV는 표면 당단백질(G) 유전자와 RNA 의존성 RNA 중합효소(L) 유전자를 포함하고, 상기 HIV 단백질을 발현하는 유전자는 G 유전자와 L 유전자 사이에 삽입된다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 HIV 유전자는 gag , env 및 pol로 이루어진 HIV 유전자의 군에서 선택된다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 병원균은 HCV이고 에피토프는 HCV 단백질이다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 하나의 혈청형의 rVSV와 상기 다른 하나의 혈청형의 rVSV는 표면 당단백질(G) 유전자와 RNA 의존성 RNA 중합효소(L) 유전자를 포함하고, 상기 HCV 단백질을 발현하는 유전자는 G 유전자와 L 유전자 사이에 삽입된다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 HCV 단백질은 구조 또는 비구조 HCV 단백질이다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 두 개의 백신 각각은 약독화 키메라 rVSV들의 혼합물을 포함하고, 상기 혼합물에서 약독화 키메라 rVSV 중 적어도 두 개는 병원균의 다른 단백질을 발현한다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 두 개의 백신 각각은 체액성, 세포성 및 점막 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 상기 백신 (a)의 혈청형은 인디애나이고 상기 백신 (b)의 혈청형은 뉴저지이다.
본 발명의 프라임 부스트 복합 백신의 또 다른 실시형태에서, 백신 (a)와 (b) 각각은 면역보강제를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 M 단백질을 갖는 rVSVInd를 포함하는 백신의 유효량의 적어도 1회 투여량; 및 (b) 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 M 단백질을 갖는 rVSVNJ를 포함하는 백신의 유효량의 적어도 1회 투여량을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 키트의 일 실시형태에서, (a)와 (b)는 약학적으로 허용 가능한 담체에 제형화된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 4, 9 및 10의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리 펩타이드(isolated peptide)를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 4, 9 및 10의 분리된 펩타이드를 암호화하는 분리된 염기 서열을 제공한다.
실시형태들이 이제 도면을 참조하여 오직 예로서 설명될 것이다, 도면에서:
도 1은 M 유전자에서 돌연변이를 갖는 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 인디애나(Ind) 혈청형의 유전자 구성을 도시한다.
도 2는 M 유전자에서 돌연변이를 갖는 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 뉴저지(NJ) 혈청형의 유전자 구성을 도시한다.
도 3은 cDNA로부터 VSV의 회수를 위한 역유전학 시스템을 도시한다.
도 4는 재조합 VSV로 감염된 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포에서[패널 B) 및 D)] 그리고 rVSV로 감염된 인간 신경아세포종 세포(SH-SY5Y)에서, 허용 온도[패널 A) 및 C)] 그리고 반-허용 온도[패널 B) 및 D)]에서의 rVSVInd의 M 단백질의 돌연변이 L111F의 방출량(burst size) 효과를 도시한다.
도 5는 BHK21 세포에서 31℃ 및 37℃에서, rVSVNJ의 M 단백질의 돌연변이 M48R+51R, G22E, G22E/M48R+51R, G22E/L110F, G22E/L110F/M48R+M51R의 방출량 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6A는 rVSVInd(1. WT, 2. M51R, 3. G21E, 4. G21E/M51R, 5. G21E/L111F 및 6. G21E/L111F/M51R)의 rVSV 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 6B는 rVSVNJ(1. WT, 2. M48R+M51R, 3. G22E, 4. G22E/M48R+M51R, 5. G22E/L110F 및 6. G22E/L110F/M48R+M51)의 rVSV 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 7은 야생형 M 유전자를 갖는 rVSVInd로 감염된 BHK21 세포(패널 B 및 I) 및 M 유전자에서 서로 다른 돌연변이를 갖는 rVSVInd로 감염된 BHK21 세포(패널 A, D, E, F, G, H, K, L, M 및 M)의 사진 및 감염되지 않는 BHK21 세포(패널 C 및 J)의 사진을 포함한다. 세포는 31℃에서(패널 A 내지 G) 또는 37℃에서(패널 H 내지 N) 배양되었다.
도 8은 M 유전자에서 서로 다른 돌연변이를 갖는 rVSVInd로 감염된 SH-SY5Y 세포(패널 C, D, E, F, I, J, K 및 L) 또는 야생형 M 유전자를 갖는 rVSVInd로 감염된 SH-SY5Y 세포(패널 A 및 G)의 사진 및 감염되지 않는 SH-SY5Y 세포(패널 B 및 H)의 사진을 포함한다. 세포는 31℃에서(패널 A 내지 F) 또는 37℃에서(패널 G 내지 L) 배양되었다.
도 9는 M 유전자에서 서로 다른 돌연변이를 갖는 rVSVNJ로 감염된 BHK21 세포(패널 A, D, E, F, G, H, K, L, M 및 N) 또는 야생형 M 유전자를 갖는 rVSVNJ로 감염된 BHK21 세포(패널 B 및 I)의 사진 및 감염되지 않는 BHK21 세포(패널 C 및 J)의 사진을 포함한다. 세포는 31℃에서(패널 A 내지 G) 또는 37℃에서(패널 H 내지 N) 배양되었다.
도 10은 M 유전자에서 서로 다른 돌연변이를 갖는 rVSVNJ로 감염된 SH-SY5Y 세포(패널 A, D, E, F, G, H, K, L, M 및 N) 또는 야생형 M 유전자를 갖는 rVSVNJ로 감염된 SH-SY5Y 세포(패널 B 및 I)의 사진 및 감염되지 않는 SH-SY5Y 세포(패널 C 및 J)의 사진을 포함한다. 세포는 31℃에서(패널 A 내지 G) 또는 37℃에서(패널 H 내지 N) 배양되었다.
도 11은 측면 심실 주입에 의한 스위스 웹스터 마우스에서의 신경독성 연구를 나타낸 그래프이다: A) UV-조사된 rVSVInd G21E/L111F/M51R, B) rVSVInd WT, C) rVSVInd M51R 및 D) rVSVInd G21E/L111F/M51R.
도 12는 측면 심실 주입에 의한 스위스 웹스터 마우스에서의 신경독성 연구를 나타낸 그래프이다 A) rVSVNJ WT, B) rVSVNJ M48R+M51R, C) rVSVNJ G22E/M48R+M51R 및 D) rVSVNJ G22E/L110F/ 48R+51R.
도 13(서열번호 11 - 15)A는 rVSV의 cDNA 클론으로의 HIV-1 Gag-En 유전자의 클로닝을 도시한다. 도 13B는 Gag-En을 발현하고 M 유전자에 대해 서로 다른 돌연변이를 갖는 rVSV로 감염되고 31℃에서 배양된 BHK 세포의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다. 도 13C Gag-En을 발현하고 M 유전자에 대해 서로 다른 돌연변이를 갖는 rVSV로 감염되고 37℃에서 배양된 BHK 세포의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 14는 백신접종 방법 및 백신접종군의 표를 도시한다.
도 15는 디메틸설폭사이드(DMSO)로 자극한, 삽입된 도면에 나타낸 다양한 백신접종군에서 펩타이드 특이적 CD8+ IFN 감마+ T 세포의 빈도를 나타낸 그래프이다.
도 16은 VSV N으로 자극한, 삽입된 도면에 나타낸 다양한 백신접종군에서 VSV N 펩타이드 특이적 CD8+ IFN 감마+ T 세포의 빈도를 나타낸 그래프이다.
도 17은 HIV-1 Gag로 자극한, 삽입된 도면에 나타낸 다양한 백신접종군에서 HIV-1 Gag 펩타이드 특이적 CD8+ IFN 감마+ T 세포의 빈도를 나타낸 그래프이다.
도 18은 삽입된 도면에 나타낸 다양한 백신접종군에서 HIV-1 Gag 특이적 항체 반응을 나타낸 그래프이다.
도 19는 표 1의 rVSV의 다양한 투여량으로 접종한 다양한 백신접종군에서 VSV N 펩타이드 특이적 CD8+ IFN 감마+ T 세포의 빈도를 나타낸 그래프이다.
도 20은 표 1의 rVSV의 다양한 투여량으로 접종한 다양한 백신접종군에서 HIV-1 Gag 펩타이드 특이적 CD8+ IFN 감마+ T 세포의 빈도를 나타낸 그래프이다.
도 21은 표 1의 rVSV의 다양한 투여량으로 접종한 다양한 백신접종군에서 HIV-1 Gag 특이적 항체 반응을 나타낸 그래프이다.
도 22(서열번호 16 - 26)는 rVSVInd G21E/L111F/M51R 및 rVSVNJ G22E/M4SR+M51R의 cDNA 클론으로의, gp120 및 gp41의 인간 B 세포 및 T 세포 에피토프를 암호화하는 뉴클레오티드에 연결된 HIV-1 gag 유전자의 클로닝을 도시한다.
도 23(각각, 서열번호 11-15 및 27-31)은 rVSVInd G21E/L111F/M51R 및 rVSVNJ G22E/M4SR+M51R의 cDNA 클론으로의, gp41, nef, gp120, RT, Tat 및 Rev의 인간 B 세포 및 T 세포 에피토프를 암호화하는 뉴클레오티드에 연결된 HIV-1 gag 유전자의 클로닝을 도시한다. 또한, rVSVInd G21E/L111F/M51R 및 rVSVNJ G22E/M48R+M51R의 cDNA 클론으로의 HIV-1 pol 및 env 유전자의 클로닝을 도시한다.
도 24는 Gag A, B, C, En 및 RT를 발현하는 rVSVInd G21E/L111F/M51R로 감염되고 31℃ 및 37℃에서 배양된 BHK21 세포의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 25는 Gag A, B, C, En 및 RT를 발현하는 rVSVNJ G22E/M48R+M51R로 감염되고 31℃ 및 37℃에서 배양된 BHK21 세포의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 26은 HIV-1 pol 유전자를 발현하는 rVSVInd G21E/L111F/M51R 또는 rVSVNJ G22E/M48R+M51R로 감염된 BHK21 세포의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 27은 HIV-1 gp160mss 유전자를 발현하는 rVSVInd G21E/L111F/M51R 또는 rVSVNJ G22E/M48R+M51R로 감염된 BHK21 세포의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 28은 표 6의 다양한 백신접종군: G1, G2, G3, G4, G5 및 Env P18이 없는 G5 중에서 VSV N 및 HIV-1 단백질 펩타이드 특이적 CD8+ T 세포의 반응을 나타낸 그래프를 포함한다.
도 29는 은 표 6의 백신접종군 G6에서 VSV N 및 HIV-1 단백질 펩타이드 특이적 CD8+ T 세포의 반응을 나타낸 그래프이다. VSV N 펩타이드 및 비장세포를 자극하는데 사용되는 HIV-1 단백질로부터의 펩타이드의 아미노산 서열이 나타나 있다(서열번호 32 - 37).
도 30은 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)으로 결정한, 표 6의 백신접종군에서 유도된 HIV-1 Gag(패널 A) 및 Gp120(패널 B)에 대한 체액성 면역 반응을 도시한다.
도 31은 rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM) 및 rVSVNJ(GLM)로 클로닝된 HCV 구조 단백질 유전자를 도시한다.
도 32는 rVSVInd(GLM), rVSVNJ(GM), rVSVNJ(GLM)에서의 HCV 코어(패널 A), E1(패널 B), E2(패널 C) 및 NS4B(패널 D) 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 33은 rVSVInd(GLM), rVSVNJ(GM), rVSVNJ(GLM)으로 클로닝된 HCV 비구조 단백질 유전자를 도시한다.
도 34는 rVSVInd(GLM)로부터 37℃ 및 31℃에서 HCV NS3의 발현(패널A), 37℃에서의 NS5A의 발현(패널 B), 및 37℃ 및 31℃에서 NS5B의 발현(panel C)의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 35는 rVSVNJ(GM)로부터 37℃에서 HCV NS3, NS4B, NS5A, 및 NS5B의 발현(패널 A) 및 37℃에서 HCV NS5AB의 발현(패널 B)을 도시한다.
개요
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 또한, 달리 명시하지 않는 한, 청구항에서는 제외하고 "또는"의 사용은 "그리고"를 포함하며 그 반대도 마찬가지이다. 명백하게 언급하거나 문맥에서 명백하게 다르게 명시하지 않는 한 비제한적 용어는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다(예를 들어, "포함하는", "갖는" 및 "~구성되는"은 일반적으로 "제한 없이 포함하는"을 나타낸다). 청구항에서도 포함하여, 부정관사 및 정관사와 같은 단수 형태는 달리 명백하게 달리 언급하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. "기본적으로 ~으로 구성되는"은 인용된 모든 요소가 반드시 포함되고, 나열된 요소의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치는 요소는 제외되며, 다른 요소들이 선택적으로 포함될 수 있는 것을 의미한다. "~로 구성되는"은 나열된 것 이외의 모든 요소는 제외되는 것을 의미한다. 이러한 각각의 용어에 의해 정의되는 실시형태는 본 발명의 범위에 있다.
범위를 포함해서, 예를 들어 크기와 무게와 같은 모든 수치 지정은 적절하게 0.1, 1.0 또는 10.0의 증가만큼 (+) 또는 (-)로 변할 수 있다. 모든 수치 지정은 용어 "대략"이 선행되는 것으로 이해할 수 있다.
용어 "투여하는"은, 약학적 조성물, 백신 또는 치료제를 포함하여, 본 발명의 화합물을 대상의 몸에 또는 대상의 특정 부위 내에 또는 특정 부위 상에 전달하는 모든 방법을 포함한다. 본원에서 사용되는 어구 "전신 투여", "전신에 투여되는", "말초 투여" 및 "말초로 투여되는"은 화합물, 약물 또는 기타 물질을 중추신경계로의 직접 투여 이외의 방식으로 투여하여, 예를 들어, 피하 투여와 같이 환자의 몸에 진입하게 함으로써 대사 및 기타 유사한 과정을 겪도록 하는 것을 의미한다. "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"은 소화관내 및 국소 투여 이외의 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 동맥내(intraarterial), 척추강내(intrathecal), 관절내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내(intracardiac), 피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 경기관내(transtracheal), 피하(subcutaneous), 표피하(subcuticular), 관절내(intra-articular), 피막하(subcapsular), 자주막하(subarachnoid), 척추내(intraspinal) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입을 제한 없이 포함한다.
용어 "아미노산"은 본 기술분야에 공지되어 있다. 일반적으로 아미노산과 보호기를 지칭하기 위해 본원에서 사용되는 약어는 생화학 명명법에 관한 IUPAC-IUB 위원회의 추천을 근거로 한다(Biochemistry (1972) 11 :1726-1732 참조). 본 발명과 관련된 아미노산에 대해 명칭은 다음과 같다: M: 메티오닌, R: 아르기닌, G: 글리신, E: 글루타민산, L: 류신, F: 페닐알라닌. 특정 실시형태에서, 본 발명의 명세서에서 사용된 아미노산은 단백질에서 발견되는 아미노산에서 자연적으로 발생하는 것들 또는 아미노기와 카르복실기를 포함하는 아미노산의 자연적으로 발생하는 동화 또는 이화 작용의 산물이다. 특히 적합한 아미노산 측쇄는 다음의 아미노산의 측쇄로부터 선택되는 측쇄를 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글루타민산, 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴, 리신, 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 단백질을 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있는 다클론, 단클론, 재조합 및 인간화 항체와 이의 절편을 포함하는, 예를 들어, 모든 동형(IgG, IgA, IgM, IgE 등)의 전체 항체를 포함하도록 의도된다. 항체는 종래 기술을 이용하여 절단될 수 있고 절편은 동일한 방식으로 사용을 위해 선별될 수 있다. 따라서, 상기 용어는 선택적으로 특정 단백질과 반응할 수 있는 항체 분자의 단백질 가수분해로 절단되거나 재조합으로 제조한 부분의 분절을 포함한다. 이러한 단백질 가수분해 및/또는 재조합 절편은 Fab, F(ab')2, Fab', Fv, 및 펩타이드 링커에 의해 결합된 V[L] 및/또는 V[H] 도메인을 포함하는 단쇄 항체(scFv)를 포함한다. 상기 scFv는 둘 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 형성하기 위해 공유 결합 또는 비공유 결합으로 결합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유 동물에서 항원 활성 또는 면역원 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질의 부위 또는 절편을 말한다. 면역원 활성을 갖는 에피토프는 동물에서 면역 반응을 유도하는 폴리펩타이드 또는 단백질의 부위 또는 절편이다. 항원 활성을 갖는 에피토프는, 예를 들어, 면역 분석법과 같이 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 임의의 방법에 의해 결정되는 바와 같이 항체가 면역 특이적으로 결합하는 폴립펩타이드 또는 단백질의 부위 또는 절편이다.
본원에서 사용되는, 단백질성(proteinaceous) 물질의 맥락에서 용어 "절편"은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열의 적어도 2 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 5 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 10 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 15 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 20 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 25 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 40 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 50 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 60 개의 인접한 아미노산 잔기,
적어도 70 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 80 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 90 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 100 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 125 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 150 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 175 개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 200 개의 인접한 아미노산 잔기, 또는 적어도 250 개의 인접한 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 말한다. 일 실시형태에서, 전장 단백질의 절편은, 예를 들어 면역원 활성과 같이, 전장 단백질의 활성을 보유한다. 다른 실시형태에서, 전장 단백질의 절편은, 예를 들어 비-면역원 활성과 같이, 전장 단백질의 활성을 보유하지 않는다.
본원에서 사용되는, 핵산의 맥락에서 용어 "절편"은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 적어도 2 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 5 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 10 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 15 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 20 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 25 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 30 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 35 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 40 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 50 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 60 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 70 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 80 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 90 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 100 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 125 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 150 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 175 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 200 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 250 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 300 개의 인접한 뉴클레오티드, 적어도 350 개의 인접한 뉴클레오티드, 또는 적어도 380 개의 인접한 뉴클레오티드의 핵산 서열을 포함하는 핵산을 말한다. 일 실시형태에서, 핵산의 절편은, 예를 들어 면역원 활성과 같이, 전장 단백질의 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 실시형태에서, 전장 단백질의 절편은, 예를 들어 비-면역원 활성과 같이, 전장 단백질의 활성을 보유하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "본질적으로 비-세포용해성"는 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)가 자신이 감염시킨 세포를 크게 손상시키거나 사멸시키지 않는 것을 의미한다.
용어 "HIV"는 본 기술분야의 숙련자에게 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)를 의미하는 것을 알려져 있다. HIV에는 두 가지 종류의 HIV, 즉 HIV-1와 HIV-2가 있다. HIV-1에는 많은 다양한 균주가 있다. HIV-1의 균주는 세 그룹, 즉, "주요" 그룹(M), "아웃라이어(outlier)" 그룹(O) a및 "신규" 그룹(N)으로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 인간으로의 시미안(simian) 면역결핍 바이러스의 3가지 개별적 도입을 나타낼 수 있다. M-그룹 내에는 적어도 10개의 서브타입 또는 클레이드(clade), 예를 들어 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J 및 K가 존재한다."클레이드"는 구성원들이 공통의 조상으로부터 유래된 상동적 특징(homologous feature)을 공유하는 종(species)과 같은 생물체의 군이다. 본원에서 HIV-1이라 함은 이러한 균주들 모두를 포함한다.
용어 "비감염성"은 감염시킬 능력이 감소된 상태 내지 그러한 능력이 존재하지 않음을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상" 또는 "환자"는 통용된다. 본원에서 사용되는 용어 "대상"과 "대상들"은 인간 또는 비인간 동물을 말한다.
용어 "약물 전달 장치"는 치료제또는 치료제들을 대상에 투여하기 위해 사용될 수 있는 임의의 장치를 지칭한다. 약물 전달 장치의 비제한적 예는 피하 주사기, 다중챔버 주사기, 스텐트(stent), 카테터, 경피 패치, 미세침(microneedle), 마이크로어브레이더(microabrader) 및 이식형 방출 제어 장치를 포함한다. 일 실시형태에서, 용어 "약물 전달 장치"는 주사 전에 두 개의 화합물을 혼합할 수 있는 2중 챔버 주사기를 말한다.
어구 "약학적으로 허용 가능한"은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 합리적인 이익/위험 비율에 상응하게 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 그 밖의 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉한 상태로 사용하기에 적절한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 어구 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 하나의 기관 또는 신체의 일부에서 또 다른 기관 또는 신체의 일부로 본 발명의 화합물을 운반하거나 수송하는 데에 관여하는, 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 또는 물질을 캡슐화하는 용매를 의미한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분들과 호환될 수 있고 환자에게 유해하지 않다면 "허용 가능"하다고 해야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 역할을 할 수 있는 물질의 몇 가지 예는 (1) 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; (4) 분말 트라가칸스(tragacanth); (5) 맥아(malt); (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌약용 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열성 물질 제거수(pyrogen-free water); (17) 등장 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드(polyanhydride); 및 (22) 약학적 제형에 사용되는 그 밖의 비독성인 호환 물질을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하기 위해 통용된다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 다음과 같다: 유전자 또는 유전자 절편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석으로 정의된 유전자자리(들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 분리된 DNA, 임의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 간섭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예를 들어 표지화 성분과의 접합(에 의해 추가로 변형될 수 있다. 용어 "재조합" 폴리뉴클레오티드는 게놈, cDNA, 준-합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드로서, 천연 상태에서는 존재하지 않거나 비-천연 배열로 또 다른 폴리뉴클레오티드에 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드이다. "올리고뉴클레오티드"는 약 100개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어 약 75개, 약 50개, 약 25개 또는 약 10개의 뉴클레오티드를 지닌 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 말한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"(단일 사슬인 경우)은 본원에서 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 통용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산(non-amino acid)에 의해 간섭될 수 있다. 상기 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함하는데, 변형은 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지화 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 화학적으로, 무세포계(cell free system)에서 리보솜에 의해, 또는 세포에서 리보솜에 의해 합성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 화학적 합성은, 단계적 고체상 합성, 펩타이드 단편의 입체형태적으로 보조된 재연결을 통한 준-합성, 클로닝된 또는 합성된 펩타이드 분절의 효소적 연결, 및 화학적 연결을 포함하는 다양한 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 고유의 화학적 연결은 두 개의 보호되지 않은 펩타이드 분절의 화학 선택적 반응을 이용하여, 일시적으로 티오에스테르가 결합된 중간체를 생성시킨다. 이후, 일시적으로 티오에스테르가 결합된 중간체는 자발적으로 재배열되어, 연결 부위에서 고유의 펩타이드 결합을 지닌 전장 연결 생성물을 제공한다. 전장 연결 생성물은 무세포 합성에 의해 생성된 단백질과 화학적으로 동일하다. 전장 연결 생성물은 허용되는 경우, 다시 접히고 및/또는 산화되어, 고유의 이황화 함유 단백질 분자를 형성한다 (참조: 예를 들어, 미국 특허 제 6,184,344호 및 제 6,174,530호; 및 T. W. Muir et al., Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4, p 420; M Miller, et al., Science (1989): vol. 246, p 1149; A. Wlodawer, et al., Science (1989): vol. 245, p 616; L. H. Huang, et al., Biochemistry (1991): vol. 30, p 7402; M. Schnolzer, et al, Int. J. Pept. Prot. Res. (1992): vol. 40, p 180-193; K. Rajaratanam, et al., Science (1994): vol. 264, p 90; R. E. Offord, "Chemical Approaches to Protein Engineering", . in Protein Design and the Development of New therapeutics and Vaccines, J. B. Hook, G. Poste, Eds., (Plenum Press, New York, 1990) pp. 253-282; C. J. A. Wallace, et al., J. Biol. Chem. (1992): vol 267, p 3852; L. Abrahmsen, et al., Biochemistry (1991): vol. 30, p 4151 ; T. . Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 12544-12548; M. Schnlzer, et al., Science (1992): vol., 3256, p 221 ; and K. Akaji, et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985) 33: 184).
"VSV"는 수포성 구내염 바이러스를 지칭하기 위해 사용된다.
"rVSV"는 재조합 수포성 구내염 바이러스를 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "인디애나"와 "Ind"는 VSV 혈청형 인디애나(VSVInd)를 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "뉴저지"와 "NJ"는 VSV 혈청형 뉴저지(VSVNJ)를 지칭하기 위해 사용된다.
"MWT"와 "M(WT)"는 야생형 M 유전자를 지칭하기 위해 사용된다. VSVInd의 야생형 M 유전자의 염기 서열은 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함할 수 있다. VSVInd의 야생형 M 유전자의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VSVNJ의 야생형 M 유전자의 염기 서열은 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함할 수 있다. VSVNJ의 야생형 M 유전자의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. "M51R"은 51번 위치에서 아르기닌으로 변경된 메티오닌을 갖는 VSVInd 내의 M(WT)을 지칭하기 위해 사용된다. "G21E"는 21번 위치에서 글루타민산으로 변경된 글리신을 갖는 VSVInd 내의 M(WT)을 지칭하기 위해 사용된다 "L111F"는 111번 위치에서 페닐알라닌으로 변경된 류신을 갖는 VSVInd 내의 M(WT)을 지칭하기 위해 사용된다. "G22E"는 22번 위치에서 글루타민산으로 변경된 글리신(G)을 갖는 VSVNJ 내의 M(WT)을 지칭하기 위해 사용된다 "L110F"는 110번 위치에서 페닐알라닌(F)으로 변경된 류신(L)을 갖는 VSVNJ 내의 M(WT)을 지칭하기 위해 사용된다. "M48R+M51R"은 48번과 51번 위치에서 아르기닌(R)으로 변경된 메티오닌(M)을 갖는 VSVNJ 내의 M(WT)을 지칭하기 위해 사용된다. "rVSVInd M(G21E/L111F/M51R)" 또는 "rVSVInd(GLM)"는 21번 위치에서 글루타민산으로 변경된 글리신, 111번 위치에서 페닐알라닌으로 변경된 류신 및 51번 위치에서 아르기닌으로 변경된 메티오닌을 갖는 M(WT)을 포함하는 rVSVInd를 지칭하기 위해 사용된다. "rVSVNJ M(G22E/M48R+M51R)" 또는 "rVSVNJ(GM)"는 22번 위치에서 글루타민산으로 변경된 글리신 및 48번과 51번 위치에서 아르기닌으로 변경된 메티오닌을 갖는 M(WT)을 포함하는 rVSVNJ를 지칭하기 위해 사용되며, "rVSVNJ M(G22E/L110F/M48R+M51R)" 또는 "rVSVNJ(GLM)"는 22번 위치에서 글루타민산으로 변경된 글리신, 110번 위치에서 페닐알라닌으로 변경된 류신 및 48번과 51번 위치에서 아르기닌으로 변경된 메티오닌을 갖는 M(WT)을 포함하는 rVSVNJ를 지칭하기 위해 사용된다.
개요
본 발명자들은 신규한 M 단백질 및 상기 신규한 M 단백질을 생성할 수 있는 신규한 약독화 rVSV를 생성하였다. 본 발명의 신규한 단백질은 M(G21E/L111F/M51R), M(G22E/M48R+M51R), 및 M(G22E/L110F/M48R+M51R)을 포함할 수 있다. 본 발명의 신규한 약독화 rVSV는 단백질 발현 및 백신 벡터로 그리고 감염을 예방 또는 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 rVSV는 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도하기 위해 인간 및 다른 동물의 전염병에 대한 백신을 제조하기 위해 적용될 수 있다.
분리된 단백질 및 M 단백질
일 실시형태에서, 본 발명은 분리된 단백질 및 상기 분리된 단백질을 암호화하는 염기 서열에 관한 것이다. 이와 같이, 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 4, 9 및 10의 아미노산 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리 펩타이드에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 2, 6 및 7의 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 염기 서열을 포함하는 분리된 염기 서열에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 적어도 다음의 치환: M(G21E/L111F/M51R), M(G22E/M48R+M51R), 및 M(G22E/L110F/M48R+M51R) 중 하나를 갖는 신규한 VSV M 단백질에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 서열 번호 4, 9 및 10의 아미노산 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VSV M 단백질에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 신규한 VSV M 단백질을 암호화하는 염기 서열에 관한 것이다. 염기 서열은 서열 번호 2, 6 및 7의 서열로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
감염을 예방 또는 치료하는 방법
면역 반응을 유도하고, 감염을 예방 또는 치료하는 방법이 개시된다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 적어도 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 (i) 제 1 변형된 M 단백질 및 (ii) 병원균의 에피토프를 갖는 하나의 혈청형의 약독화 rVSV를 포함하는 하나의 백신의 유효량; 및 (b) 적어도 다음의 치환: G22E/M48R+M51R을 포함하는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 (i) 제 2 변형된 M 단백질 및 (ii) 병원균의 에피토프를 갖는 다른 하나의 혈청형의 약독화 rVSV를 포함하는 다른 하나의 백신의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 상기 방법은 프라임-부스트 면역화 양식(prime-boost immunization modality)에서 (a) rVSVInd M(G21E/L111F/M51R)의 유효량 및 (b) rVSVNJ M(G22E/M48R+M51R) 또는 rVSVNJ M(G22E/L110F/M48R+M51R)의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 그리고 필요한 기간 동안의 유효한 양을 의미한다.
특정 실시형태에서, (a)는 (b)가 대상에 투여되기 전에 대상에 투여된다.
특정 실시형태에서, (b)는 유도 과정 동안 한 번 이상 대상에 투여된다.
특정 실시형태에서, (a)는 이를 필요로 하는 대상에 투여되고 (b)는 (a)의 투여 이후 대략 3 주, 8 주 및 16 주에 이를 필요로 하는 대상에 투여된다.
특정 실시형태에서, (b)는 (a)가 대상에 투여되기 전에 대상에 투여된다.
특정 실시형태에서, (a)는 유도 과정 동안 한 번 이상 대상에 투여된다.
특정 실시형태에서, (b)는 이를 필요로 하는 대상에 투여되고 (a)는 (b)의 투여 이후 대략 3 주, 8 주 및 16 주에 이를 필요로 하는 대상에 투여된다.
재조합 바이러스
특정 실시형태에서, 본 발명은 본질적으로 비-세포용해성이고, 무독성이며, 대상에서 면역 반응을 유도할 수 있고, 허용 온도에서 높은 역가로 바이러스 입자를 복제할 수 있고 반-허용 온도에서 낮은 역가로 바이러스 입자를 복제할 수 있는 전장 VSV일 수 있고, 비-허용 온도에서 바이러스를 생성할 수 없으며, 외부 병원균의 에피토프를 발현할 수 있는 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)에 관한 것이다. 본 발명의 rVSV은 체액성, 세포성 및 점막 면역 반응을 유도할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 rVSVInd 및 rVSVNJ에 관한 것이다. 상기 rVSVInd는 대략 31℃의 허용 온도에서 바이러스 입자를 생성할 수 있고, 대략 37℃의 반-허용 온도에서 바이러스 입자를 생성할 없거나 저조하게 생성할 수 있으며, 예를 들어 39℃와 같은 37℃ 이상의 비-허용 온도에서 바이러스 입자를 생성할 수 없는, 전장의, 본질적으로 비-세포용해성인 rVSVInd M(G21E/L111F/M51R일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 rVSVInd는 M(G21E/L111F/M51R)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 rVSVInd는 서열 번호 2의 염기 서열을 포함하는 M 유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 rVSV는 전장의, 본질적으로 비-세포용해성인 rVSVNJ M(G22E/M48R+M51R) 또는 rVSVNJ M(G22E/L110F/M48R+M51R)이다. 특정 실시형태에서, 상기 rVSV는 M 유전자를 포함하는, 본질적으로 비-세포용해성인 rVSVNJ이며, 상기 M 유전자의 염기 서열은 서열 번호 6 및 서열 번호 7에서 선택된다.
본 발명의 rVSV는 본 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 rVSV는 숙주 세포에서 rVSV의 복제 및 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 rVSVInd를 갖는 세포를 제공하며, 상기 바이러스의 M 단백질의 아미노산 서열은, rVSVInd가 허용 온도에서 효과적으로 복제될 수 있게 하지만 비-허용 온도에서는 복제될 수 없게 하는 본질적으로 비-세포용해성을 제공하도록 변형된다.
이와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 재조합 VSV를 갖는 세포에 관한 것이다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 rVSV를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 rVSVInd를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물 및 rVSVNJ를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 상기 백신은 병원균의 에피토프를 발현하는 rVSV를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 백신은 한 가지 병원균의 다양한 에피토프를 발현하는 rVSV들의 혼합물 또는 칵테일을 포함할 수 있다(표 6, 백신접종군 5 및 6 참조).
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 체내에서 생물학적으로 적합한 형태로 대상에 투여하기 적합하다. 본원에서 사용되는 표현 "체내에서 투여하기에 적합한 생물학적으로 적합한 형태"는 임의의 독성 효과가 치료 효과에 의해 상쇄되는, 투여되는 물질의 형태를 의미한다. 상기 물질은 임의의 동물 또는 대상, 바람직하게 인간에 투여될 수 있다. 본 발명의 백신은 또한 수송을 위해 냉동될 수 있는 용액으로 제공될 수 있다. 또한, 상기 백신은 글리세롤과 같은 적절한 방부제를 포함할 수 있고 또는 방부제 없이 제형화될 수 있다. 적절하다면(즉, 백신 내의 VSV에 손상을 주지 않는다면), 상기 백신은 또한 적절한 희석제, 면역보강제 및/또는 담체를 포함할 수 있다.
상기 백신의 투여량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 투여 방법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 또한 상기 백신의 투여량은 상황에 따라 최적의 예방적 용량 반응을 제공하도록 변경될 수 있다.
키트
본 발명은, 예를 들어 감염을 예방 또는 치료하기 위한 키트를 제공한다. 예를 들어, 키트는 상기한 바와 같은 하나 이상의 약학적 조성물 또는 백신 그리고 선택적으로 이들의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 약학적 조성물 또는 백신 그리고 이러한 조성물의 투여를 달성하기 위한 하나 이상의 장치를 포함하는 키트를 제공한다.
키트의 구성요소는 상기한 방법의 수동적 실시 또는 부분적으로 또는 완전히 자동화된 실시를 위해 패키징될 수 있다. 키트와 관련된 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 선택적으로 이들의 사용 설명서를 포함하는 키트를 고려한다. 이러한 키트는 예를 들어 영상화, 진단, 치료 및 다른 적용을 포함하는 다양한 용도를 지닐 수 있다.
본 발명의 rVSV 의 장점 및 독특한 특징
본 발명의 신규하고 특이한 특징:
허용 온도(대략 31℃)에서의 rVSVInd M(G21E/L111F/M51R의 정상적인 조립 및 방출은 허용 온도에서 새로운 변이 rVSV를 높은 역가로 증폭할 수 있게 하여 바이러스 스톡을 생산할 수 있게 했다. 비-허용 온도(대략 체온 근처의 37℃)에서의 rVSVInd M(G21E/L111F/M51R의 조립 결함은 비-허용 온도에서의 자손 감염 바이러스의 수를 상당히 줄임으로써 인간 및 다른 동물에서의 rVSV 사용의 안전성을 증가시켰다. 이러한 돌연변이를 rVSVInd의 M 단백질에서의 기존의 M51R에 첨가함으로써 VSVInd의 독성을 더욱 약화시켰다.
rVSVInd의 M 단백질에서의 세 개의 돌연변이 M(G22E/M48R+M51R) 또는 네 개의 돌연변이 M(G22E/L110F/M48R+M51R)은 바이러스의 조립에 대해 바이러스 온도를 민감하게 하지 않았다. 그러나, G22E 돌연변이 또는 G22E/L110F를 M48R+51R에 첨가함으로써 VSVNJ를 더욱 약독화시켰고 병원성을 크게 약화시켰다.
상기 개시는 일반적으로 본 발명을 설명한다. 다음의 구체적인 실시예를 참조하여 보다 완전한 이해를 얻을 수 있다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 설명되며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 상황이 제안하거나 편리하게 할 수 있듯이 형태의 변화 및 등가물의 대체가 고려된다. 특정 용어가 본원에서 사용되었지만, 이러한 용어는 기술적 의미에서 의도된 것이며 제한의 목적은 아니다.
실시예
본 발명은 어떠한 방식으로든 제한하려는 것으로 해석되어서는 안 되는 다음의 실시예에 의해 더 제시된다.
실시예 1: rVSV Ind 및 rVSV NJ 의 M 유전자로의 돌연변이의 도입 및 역유전학에 의한 재조합 VSV 의 회수
돌연변이를 rVSVInd(도 1) 및 rVSVNJ(도 2)의 M 유전자로 도입하였다. 각각의 위치에서 아미노산을 암호화하는 염기 서열을 메가-프라이머 PCT 방법에 의해 변형시켰다. 각각의 돌연변이는 특정 위치(예를 들어, M51R에서 M51)에서의 어느 아미노산의 다른 아미노산과의 치환으로 표현된다. VSV의 독성을 더욱 악화시키기 위해, 본 발명자들은 tsO23에서의 돌연변이(G21E와 L11F)를 M 유전자에서의 메티오닌에서 아르기닌으로의 돌연변이(M51R)와 결합시켰으며, 이는 세포성 단백질 합성에 대한 M 단백질의 억제 활성을 감소시켰고, 또한 비-허용(39℃) 및 반-허용(37℃) 온도에서 VSV 입자의 조립을 감소시켰다. 야생형에서 rVSVInd 및 rVSVNJ의 M 유전자 내의 돌연변이로의 염기 서열 및 아미노산 서열의 변화가 표 2, 3, 4 및 5에 도시되어 있다. 변화된 염기 코돈에는 밑줄이 쳐있고 변화된 염기 서열과 아미노산 서열은 볼드체로 나타내었다.
야생형 및 돌연변이 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)를 역유전학에 의해 cDNA 플라스미드로부터 회수하였다(도 3). VSV 역유전학은 살균바이러스 T7(T7)의 DNA 의존성 RNA 중합효소를 발현하는 BHK21 세포, VSV의 전장 게놈 RNA(pVSV)를 암호화하는 플라스미드 및 뉴클레오캡시드 단백질(pN), 인단백질(pP), 및 VSV 중합효소 L 단백질(pL)을 발현하는 세 개의 플라스미드를 사용한다. 전장 게놈 RNA와 N, P 및 L 단백질에 대한 메신저 RNA의 전사는 T7 RNA 중합효소의 제어 하에 있다. 각각의 VSV N, P 및 L 유전자의 상류에서의 내부 리소좀 유입점(internal ribosome entry site, IRES)은 단백질의 번역을 향상시킨다. 플라스미드를 10 μg의 pN, 10 μg의 pP, 5 μg의 pL, 및 15 μg의 pVSV 농도에서 리포펙타민™을 이용하여 BHK-T7 세포로 형질감염시켰다. 세포가 대략 50 내지 70%의 CPE를 보일 때 형질감염된 세포에서 배양 배지를 수확하였다.
실시예 2: M 유전자 내의 돌연변이 L111F 는 반-허용온도인 37℃에서 rVSV Ind 의 방출량을 크게 감소시킨다 .
회수된 바이러스를 플라크 피킹(plaque picking)에 의해 세 번 정제하였으며 31℃에서 0.1 MOI로 BHK21 세포를 감염시킴으로써 다량의 스톡 바이러스를 위해 증폭시켰다. 본 발명자들은 BHK21 세포와 인간 신경아세포종 세포인 SH-SY5Y를 rVSV의 3 MOI로 감염시켰다. 바이러스 입자의 조립에서 새로운 M 돌연변이의 온도 민감성을 결정하기 위해 감염된 세포를 허용 온도(31℃)와 반-허용 온도(37℃, 체온)에서 배양하였다. 감염 이후 10 시간까지 매 2 시간 마다 감염된 세포에서 배양 배지를 수거하였으며, 배양 배지에서 감염성 바이러스 입자의 수를 Vero E6 세포를 이용하여 플라크 검정에 의해 결정하였다. 플라크 검정 동안 변이 바이러스에 감염된 세포를 31℃에서 배양하였다. 야생형 및 모든 돌연변이가 동일하게 잘 복제되었으며 감염의 10 시간 주기를 따라 모두 감염성 바이러스의 유사한 역가로 생성되었다(도 4A 및 도 4C). 그러나, rVSVInd, rVSVNJ-G21E/L111F 및 rVSVInd-G21E/L111F/M51R의 돌연변이는 37℃에서 야생형 또는 rVSVInd의 M51R 돌연변이에 비해 상당히 낮은 역가로 복제되었다. 야생형과 새로운 돌연변이 rVSVInd-G21E/L111F/M51R 사이의 감염성 입자의 생성에서의 차이는 4 로그만큼 컸다(도 4B 및 도 4D). 도 4에서 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. rVSVInd-WT의 역가와 비교해서 얻은 감염 후 4 시간, 6 시간, 8 시간 및 10 시간에서의 rVSVInd-G21E/L111F/M51R의 바이러스 역가에 대한 P 값은 도 4B에서 p<0.0001, p=0.0055, p=0.0040 및 p=0.0015이다. rVSVInd-WT의 역가와 비교해서 얻은 감염 후 4 시간, 6 시간, 8 시간 및 10 시간에서의 rVSVInd-G21E/L111F의 바이러스 역가에 대한 P 값은 도 4B에서 p<0.0001, p=0.0055, p=0.0041 및 p=0.0016이다. 도 4D에서의 P 값은 <0.005이다. P 값은 양측 독립 t 테스트를 이용하여 계산하였다.
실시예 3: rVSV NJ 의 M 유전자에서의 돌연변이 G22E 및 L110F 는 37℃에서 rVSV NJ 의 방출량을 감소시키지 않는다.
BHK 21 세포를 rVSVNJ의 야생형 및 M 유전자 돌연변이의 3 MOI로 감염시킨 후 37℃(반-허용 온도) 및 31℃(허용 온도)에서 배양하였다. 배양 배지에서 각각의 바이러스의 바이러스 역가를 Vera E6 세포를 이용하여 플라크 검정에 의해 결정하였다. 복제 샘플로부터의 평균 바이러스 역가를 표에 나타내었다. rVSVNJ의 야생형 및 모든 M 돌연변이는 37℃ 및 31℃ 모두에서 동일하게 잘 복제되었으며, 이는 rVSVNJ의 M 유전자로의 G22E 및. L110F의 도입이 37℃에서 바이러스의 조립과 방출에 영향을 주지 않았음을 나타낸다. 도 5의 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
실시예 4: rVSV Ind 의 M 유전자에서 L111F 돌연변이에 의한 반-허용 온도에서의 조립 결함은 VSV 단백질의 발현에 영향을 주지 않는다.
BHK21 세포를 rVSVInd 및 rVSVNJ의 야생형 및 M 유전자 돌연변이의 6 MOI로 감염시켰다. 감염된 세포를 6 시간 동안 37℃ 및 31℃ 모두에서 배양하였다. 감염된 세포를 감염 6 시간 이후 용해시킨 후, 총 단백질의 5 μg을 SDS-PAGE 겔에 로딩하였고, rVSV 단백질을 VSVInd 및 VSVNJ(1:5000 희석)에 대한 토끼 항혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출하였다. 결과는, 37℃에서 rVSVInd(G21E/L111F 및 G21E/L111F/M51R에서의 L111F)의 방출량을 감소시킨 돌연변이에도 불구하고, VSV 단백질 발현 수준이 야생형 rVSVInd와 비슷하다는 것을 나타낸다(도 6B).
실시예 5: rVSV Ind 의 M 유전자에서 결합된 돌연변이 G21E / L111F / M51R 은 BHK21 세포 및 인간 신경아세포종 세포 SH - SY5Y 에서 세포병원성을 감소시켰다.
세포병원성(cytopathogenicity)에 대한 rVSVInd의 M 유전자의 L111F 및 M51R 돌연변이의 영향을 확인하기 위해, 본 발명자들은 rVSVInd의 0.1 MOI로 BHK21 세포(도 7)와 인간 신경아세포종 세포(도 8)를 감염시켰다. VSV에 의한 일반적인 병원성 효과는 감염된 세포의 모음과 세포 용해이다. 감염 20 시간 이후, rVSVInd-G21E/L111F/M51R에 의한 세포변성 효과를 다른 rVSVInd에 의한 것과 비교하였다. rVSVInd-G21E/L111F/M51R 돌연변이와의 감염 20 시간에서 37℃에서 모아진 세포가 없거나 소수였으므로 대부분 감소된 세포변성 효과를 나타냈으며, 돌연변이 L111F와 M51R의 결합(도 7N 및 도 8L)은 BHK21 및 SH-SY5Y 세포 모두 각각에서 단일 돌연변이에 비해 바이러스의 세포병원성을 더 약화시켰다.
실시예 6: M 유전자 돌연변이 G22E /48R+ M51R 및 G22E / L110F / M48R + M51R 를 갖는 rVSV NJ 에 의한 BHK21 세포에서의 감소된 세포변성 효과
세포병원성에 대한 rVSVNJ의 M 유전자의 G22E, L110F 및 M48R+M51R 돌연변이의 영향을 확인하기 위해, 본 발명자들은 rVSVNJ의 0.1 MOI로 BHK21 세포와 인간 신경아세포종 세포를 감염시켰다. 감염 20 이후, 본 발명자들은 rVSVNJ와 다른 M 돌연변이에 의한 세포변성 효과(세포 모음 및 용해)를 비교하였다. rVSVInd-G21E/L111F/M51R 돌연변이 및 G22E/L110F/M48R+M51R 돌연변이와의 감염 20 시간에서 37℃에서 최소의 세포변성 효과를 나타냈으며, 돌연변이 G22E와 M48R+M51R의 결합은 BHK21(도 9L 및 도 9N) 및 SH-SY5Y 세포(도 10L 및 도 10N) 모두에서 rVSVNJ의 세포병원성을 더 약화시켰다.
실시예 7: M 단백질 내에서 G21E / L111F / M51R 돌연변이를 갖는 rVSV Ind 와 G22E/M48R+M51R 및 G22E / L110F / M48R + M51R 돌연변이를 갖는 rVSV NJ 는 뇌에 바이러스를 주입한 쥐가 신경 증상 또는 체중 감소와 같은 다른 증상을 보이지 않을 정도로 약독화되었다 .
VSV는 피부 찰과상이나 모래파리 또는 모기 물림을 통한 자연 감염시 숙주 동물에서 향신경성(neurotropism)을 나타내지 않는다. 그럼에도 불구하고, 야생형 VSV가 쥐나 원숭이의 코 또는 뇌에 직접 주입될 때, 동물은 신경 증상을 보인다. VSV의 M 돌연변이의 신경독성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 스위스 웹스터 마우스의 뇌의 측면 심실로 1x106 PFU의 변이 VSV와 1x103 PFU의 야생형 VSV를 주입하였다. 본 발명자들은 Charles River Laboratory사로부터 측면 심실 임플란트를 갖는 5 주령 스위스 웹스터 마우스를 구입하였다. 동물 시설로 도착한 후 1 주 이후 세 마우스군에 바이러스를 주입하였다. 바이러스 주입 이후, 마우스를 신경 증상에 대해 관찰하였고 4 주 동안 이틀마다 칭량하였다. 1x103 PFU의 야생형 rVSVInd를 주입한 마우스는 주입 이후 4 일 이내에 사망하였다(도 11B). 1x106 PFU의 rVSVInd-M51R를 주입한 두 마리 마우스(도 11C)는 주입 이후 6 일째 체중의 대략 20%가 감소되었으며 주입 이후 대략 14일째 정상 체중으로 회복되었다. rVSVInd-M51R를 주입한 한 마리 마우스는 실험 내내 체중이 감소되지 않았다. rVSVInd-G21E/L111F/M51R를 주입한 세 마리 마우스 모두는 희생될 때까지 4 주 동안 질병의 증상을 보이지 않았고 체중 감소도 없었으며(도 11D), 이는 돌연변이 G21E/L111F와 M51R의 결합이 rVSVInd를 크게 약독화시켰고 마우스에서 신경독성을 잃게 하였음을 나타낸다. rVSVNJ-WT를 주입한 한 마리 마우스는 뒷다리 모두에서 마비를 보였고 주입 후 6일째 희생시켰다(도 12A). rVSVNJ-WT를 주입한 마우스와 rVSVNJ-M48R+M51R, rVSVNJ-G22E/M48R+M51R, 또는 rVSVNJ-G22E/L110F/M48R+M51R를 주입한 마우스 두 마리는 주입 후 4 주 동안 질병의 증상을 보이지 않았고 체중 감소도 없었다(도 12B, 도 12C 및 도 12D). 오류 도 11 및 도 12의 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
실시예 8: 관심 있는 유전자로서 HIV -1 Gag 단백질을 발현하는 rVSV 의 생성; HIV-1 Gag 단백질은 31℃ 및 37℃ 모두에서 동일하게 잘 발현된다.
새롭게 생성된 M 돌연변이, 즉, rVSVInd의 G21E/L111F/M51R 돌연변이와 rVSVNJ의 G22E/M48+M51R 및 G22E/L110F/M48R+M51R 돌연변이는 감소된 세포병원성 및 37℃에서 야생형 rVSV와 비교할 만한 단백질 발현을 나타냈다. 백신 벡터로 사용되기 위해서, rVSV의 새로운 M 단백질은 양호한 면역 반응, 즉 체내에서 체액성 및 세포성 면역 반응을 모두 유도해야 한다. 세포에서 단독으로 발현될 때, HIV-1 gag 단백질은 바이러스 유사 입자를 생성하고, 상기 바이러스 유사 입자는 세포에서 분비된다. 따라서, gag 단백질은 세포성 및 체액성 면역 반응 모두를 확인하기 위해 rVSV의 새로운 M 단백질에서 발현하기에 적합한 단백질이다. 또한, CD8+ 세포독성 T 세포 에피토프인 HIV-1 Gag에서의 H-2Kd-제한 펩타이드(NH2-AMQMLKETI-COOH, 서열 번호 33)는 Balb/c 마우스에서 잘 연구된다. 본 발명자들은 보전적 인간 CD8+ T 세포 에피토프에 결합된 전장 HIV-1gag 단백질을 HIV-1(Gag-En)의 gp41, gp120 및 nef 단백질로부터 삽입하였다. 야생형(WT)의 전장 cDNA 클론과 rVSVInd과 야생형의 G21E/L111F/M51R(GLM), rVSVNJ의 G22E/M48R+M51R GM) 및 G22E/L110F/M48R+M51R(GLM) 내의 G 유전자와 L 유전자의 접합부에 Gag-En 유전자를 삽입하였다. rVSV는 도 3에서 설명한 바와 같이 역유전학에 의해 cDNA 클론에서 회수하였으며, rVSV에서의 Gag-En의 발현은 HIV-1 p24에 대한 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, BHK21 세포를 rVSV의 6 MOI로 감염시켰고 31℃ 및 37℃에서 배양하였으며, 세포 용해물을 감염 6 시간 이후 준비하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 5 μg의 총 단백질을 SDS-PAGE에 로딩하였다. rVSVInd(GLM)-Gag-En, rVSVNJ(GM)-Gag-En, 및 rVSVNJ(GLM)-Gag-En은 반-허용 온도(37℃, FIG. 13C)에서 Gag-En 단백질(64 kDa)를 잘 발현하였고, 발현 수준은 허용 온도(31℃, FIG. 13B)에서와 비슷했다.
실시예 9: 마우스에서 rVSV 의 백신접종 방법
접종군당 여섯 마리의 Balb/c 마우스를 도 14에 도시한 프라임-부스트 요법으로 접종하였다. 백신 벡터 유형(야생형 대 돌연변이)과 방법, 예를 들어, rVSV의 동일한 혈청형을 이용한 프라이밍과 부스팅 또는 프라이밍과 부스트에 대해 두 가지 혈청형을 교대로 하는 방법에 따라 마우스를 분류하였다. 6 주령 마우스에 5x106 PFU의 rVSV를 근육내 프라임 접종하였다. 프라이임 3 주 이후, 마우스에 프라임 백신접종과 동일한 투여량의 rVSV를 부스트 접종하였다. 부스터 주입 1 주 이후, 비장세포와 혈청을 수거하여 HIV-1 Gag 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응과 체액성 면역 반응을 검출하였다.
실시예 10: rVSV Ind ( GLM )- HIV -l Gag - En 을 이용한 프라이밍 및 rVSV NJ ( GLM )-HIV-l Gag - En 을 이용한 부스터는 HIV -1 Gag 에 대해 강력한 CD8 + T 세포 면역 반응을 유도한다.
펩타이드가 로딩된 세포를 제공하는 항원 상에서 MHC I 분자와의 상호작용에 의해 자극된 T 세포는 인터페론-γ(IFN-γ)의 분비를 향상시키며, 이는 항원 특이적 T 세포 면역 반응을 나타낸다. 증가된 세포 내 IFN-γ를 갖는 CD8+ T 세포에 대해 비장세포를 FITC-항-CD8 및 APC-항-IFN-γ를 이용하여 이중 염색하였다. HIV-1 Gag 단백질 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응을 확인하기 위해 비장세포를 분리하였고, 1x106의 세포를 H-2Kd-제한 HIV-1 Gag 펩타이드인 NH2-AMQMLKETI-COOH(서열 번호 33)로 자극하였으며, 세포를 CD8 분자에 대해 FITC 쥐 항-마우스 CD8로 염색하였고 세포 내 IFN-γ에 대해 APC 쥐 항-마우스 IFN-γ로 염색하였다. 세포를 염색하기 전에 IFN-γ의 분비를 브레펠딘 A(Brefeldin A)를 이용하여 차단하였다. VSV 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응을 뉴클레오캡시드 특이적 펩타이드인 IN275: NH2-MPYLIDFGL-COOH (서열 번호 32)의 사용을 통해 확인하였다. 펩타이드 특이적 CD8+-IFN-γ+ T 세포를 유세포 분석기인 FACSCalibur를 사용하여 계산하였다. DMSO(펩타이드용 용매, 도 15)로 처리된 비장세포는 CD8+ T 세포를 자극하지 않았으며, 이는 VSV N 펩타이드와 HTV-1 Gag 펩타이드로 비장세포를 처리하면 CD8+ T 세포를 특이적으로 자극하는 것을 나타낸다(도 16 및 도 17). rVSV(WT) 또는 rVSV(GLM) 돌연변이의 두 가지 혈청형을 교대로 한 프라임 및 부스트 면역화는, 접종군 1, 2, 5, 6, 9 및 10에서 알 수 있듯이 프라임 및 부스트 백신접종을 위한 rVSV의 단일 혈청형을 사용하는 것보다, VSV뿐만 아니라 HIV-1 Gag 단백질에 대해 강력한 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도했다(도 16 및 도 17). 새로운 M 단백질 또는 rVSV를 이용한 백신접종을 통해서, 마우스를 프라이밍에 대해 rVSVInd(GLM)-Gag로 그리고 부스팅에 대해 rVSVNJ(GLM)-Gag로 접종했을 때가 반대로 했을 때보다 HIV-1 Gag 단백질에 대한 CD8+ T 세포 반응이 더욱 양호하게 유도되었다(도 17, 접종군 6 대 접종군 10). 도 17의 접종군 6에서의 P 값은 양측 독립 표본 t 테스트를 이용하여 계산하였고, 결과를 접종군 10에서의 결과와 비교하였다. 도 16 및 도 17에서의 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
실시예 11: HIV -1 Gag 특이적 체액성 면역 반응
HIV-1 Gag 특이적 항체의 형성을 부스트 면역화 1 주 이후 수집된 혈청으로 확인하였다. Gag 특이적 항체 역가를 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)로 결정하였다. ELISA를 위해, 96-웰 ELISA 플레이트를 125 ng/웰의 농도로 재조합 p55로 코팅하였다. 마우스 혈청을 1:100로 희석하였다. 항체는 항원에 결합하였고, p55를 이차 항체인 양 항-마우스 IgG-HPP로 검출하였다. HRP의 효소 활성은 기질인 과산화수소 및 테트라메틸벤지딘의 혼합물을 첨가하여 검출하였다. 각 샘플의 OD를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450의 파장에서 검출하였다. HIV-1 Gag에 대한 체액성 면역 반응(HIV-1 Gag에 대한 항체의 형성)은 새로운 M 돌연변이로 접종된 마우스에서 잘 유도되었으며, rVSV(WT) 또는 rVSV(GLM)의 두 가지 혈청형을 프라임 및 부스터 주입에 대해 교대로 사용했을 때 HIV-1 Gag에 대한 최상의 체액성 면역 반응이 유도되었다(도 18, 접종군 5, 6,9 및 10). 이질 단백질에 대해 체액성 면역 반응을 유도하기 위한 새로운 M 돌연변이의 사용에 대해, rVSVInd(GLM)-Gag를 이용한 프라이밍 및 rVSVNJ(GLM)-Gag를 이용한 부스터는 그 반대로 했을 때보다 더 양호하게 작용했다(도 18, 접종군 6 대 접종군 10). 도 18에서 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
실시예 12: 백신접종을 위한 rVSV Ind ( GLM ), rVSV NJ ( GM ), 및 rVSV NJ ( GLM )의 투여량 증가는 마우스에서 강력한 면역 반응을 유도했다.
도 17 및 도 18에서 설명한 바와 같이, 마우스를 rVSVInd(GLM)-Gag를 이용하여 프라임 접종시키고 rVSVNJ(GLM)-Gag를 이용하여 부스터 접종시켰을 때 강력한 HIV-1 Gag 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응과 체액성 면역 반응이 유도되었다. 그러나, 면역 반응은 rVSVInd(WT)-Gag 및 rVSVNJ(WT)-Gag로 유도된 것만큼 강력하지는 않았다. 따라서, 본 발명자들은, rVSVInd(GLM)-Gag 및 rVSVNJ(GLM)-Gag의 투여량을 증가했을 때, 면역 반응을 증가시킬 수 있을지에 대해 확인하고 싶었다. 접종군당 6 마리의 6 주령의 Balb/c 마우스를 프라이밍에 대해 rVSVInd(GLM)-Gag로 그리고 부스터에 대해 rVSVNJ(GLM)-Gag 또는 rVSVNJ(GM)-Gag로 접종하였다. rVSVNJ(GM)은 체외 및 체내에서 rVSVNJ(GLM)와 같이 약독화되므로, 본 발명자들은 부스터 바이러스로 rVSVNJ(GM)-Gag를 포함시켰고 면역 반응을 rVSVNJ(GLM)-Gag에 의해 유도된 것과 비교하였다. 마우스군을 다양한 투여량의 rVSVInd(GL M)-Gag, rVSVNJ(GLM)-Gag, 및 rVSVNJ(GLM)-Gag; 즉 5x106 PFU/마우스, 5x107 PFU/마우스, 5x108 PFU/마우스 및 5x109 PFU/마우스로 접종하였다(표 1).
마우스를 도 14에 나타난 스케줄에 따라 접종하였으며 비장세포 및 혈청에 대한 부스터 백신접종 1 주 이후에 희생시켰다. 증가된 세포 내 IFN-γ를 갖는 CD8+ T 세포에 대해 비장세포를 FITC-항-CD8 및 APC-항-IFN-γ를 이용하여 이중 염색하였다. HIV-1 Gag 단백질 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응을 확인하기 위해 비장세포를 분리하였고, 1x106의 세포를 H-2Kd-제한 HIV-1 Gag 펩타이드인 NH2-AMQMLKETI-COOH(서열 번호 33)로 자극하였으며, 세포를 CD8 분자에 대해 FITC 쥐 항-마우스 CD8로 염색하였고 세포 내 IFN-γ에 대해 APC 쥐 항-마우스 IFN-γ로 염색하였다. 세포를 염색하기 전에 IFN-γ의 분비를 브레펠딘 A를 이용하여 차단하였다. VSV 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응을 뉴클레오캡시드 특이적 펩타이드인 IN275: NH2-MPYLIDFGL-COOH (서열 번호 32)의 사용을 통해 확인하였다. 펩타이드 특이적 CD8+-IFN-γ+ T 세포를 유세포 분석기인 FACSCalibur를 사용하여 계산하였다.
VSV N 단백질에 대한 CD8+ T 세포 면역 반응은 다양한 투여량의 rVSVInd(GLM)-Gag, rVSVNJ(GLM)-Gag, 또는 rVSVNJ(GM)-Gag로 처리한 모든 백신접종군에서 유사했다(도 19). rVSVInd(GLM)-Gag를 이용한 프라이밍 백신접종 및 rVSVNJ(GLM)-Gag를 이용한 부스터 이후의 HIV-1 Gag 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응은 백신 투여량이 증가되었을 때 약간 증가하는 것으로 보이지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(도 20, 접종군 2, 3, 4, 5). 그러나, 마우스가 rVSVInd(GLM)-Gag로 프라임 접종되고 rVSVNJ(GM)-Gag로 부스터 접종되었을 때, HIV-1 Gag 특이적 CD8+ T 세포의 빈도는 5x108 PFU의 투여량의 증가와 함께 상당히 증가되었다. HIV-1 Gag 특이적 CD8+ T 세포 반응은 5x108 PFU/마우스로 접종한 접종군에서 가장 강력했다(도 20, 접종군 6, 7, 8, 9). 도 20의 접종군 8 및 9에서의 P 값은 양측 독립 표본 t 테스트를 이용하여 계산하였고, 접종군 9의 결과를 접종군 8에서의 결과와 비교하였다. 도 19 및 도 20에서의 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
HIV-1 Gag 단백질에 대한 항체의 형성은 프라이밍에 대해 rVSVInd(GLM)-Gag 그리고 부스터에 대해 rVSVNJ(GLM)-Gag 또는 rVSVNJ(GM)-Gag의 투여량의 증가와 함께 증가되었다(도 21). rVSVNJ(GLM)-Gag 또는 rVSVNJ(GM)-Gag를 이용한 부스터 백신접종은 다양한 투여량의 바이러스에서 유사한 수준의 Gag 특이적 항체를 생성하였다. 도 21에서의 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
실시예 13: HIV -1 단백질, Gag , Pol , Env . 및 RT으르 발현하는 rVSV Ind ( GLM ) 및 rVSV NJ ( GM )의 생성
백신 벡터로서 rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)을 이용하는 HIV-1 백신에 대해, 본 발명자들은 기능성 단백질인 Gag 및 Env 및 효소 활성을 갖는 단백질(pol 유전자 산물)로 절단되는 대부분의 대형 다단백질을 암호화하는 HIV 유전자를 포함시켰다. 또한, HIV-1 gag 유전자를 인간의 T 세포 및 B 세포에 대한 펩타이드 에피토프를 암호화하는 뉴클레오티드에 연결시켰다. 본 발명자들은 다수의 바이러스 클레이드에서 유래된 HIV Env 단백질로부터의 B 세포 에피토프에 연결된 HIV-1 Gag를 암호화하는 카세트를 갖는 rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)을 생성하였다(도 22). 본 발명자들은 gag 유전자 및 Nef, p120, 및 Gp41에서 T 세포 펩타이드 에피토프를 발현하는 rVSVInd(GLM)-Gag-En 및 rVSVNJ(GM)-Gag-En을 생성하였다(도 23). 본 발명자들은 RT, Tat, 및 Rev 단백질로부터의 펩타이드 에피토프를 갖는 gag 단백질을 암호화하는 HIV-1 Gag-RT를 갖는 rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)을 생성하였다(도 23). 또한, 본 발명자들은 각각 pol 유전자 및 env 유전자를 갖는 rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)을 생성하였다(도 23). 이전에, 본 발명자들은 HIV-1 외피 단백질의 신호 펩타이드를 꿀벌 멜리틴(honeybee melittin) 신호 펩타이드로 대체하면 Gp120 발현, 당화 및 분비율을 상당히 증가시키는 것을 입증하였다(Yan Li et al., PNAS, 93: 9606-9611, 1996). Gp120의 발현 및 분비의 증가는 HIV-1 gp120에 대한 T 세포 및 B 세포 면역 반응의 유도를 향상시킬 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명자들은 멜리틴 신호 서열(gp160mss)을 갖는 HIV-1 env 유전자를 포함하는 rVSV를 생성하였다. HIV-1 단백질을 갖는 재조합 VSV를 플라크 정제하였고 스톡 바이러스를 위해 증폭시켰다. 변이 VSV에서의 31℃ 및 37℃에서의 HIV-1 단백질의 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다. 다양한 HIV-1 단백질로부터의 T 세포 및 B 세포 에피토프가 붙은 Gag 단백질은 31℃ 및 37℃ 모두에서 rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)에서 잘 발현되었다(도 24 및 도 25). rVSV 게놈 내의 클로닝된 HIV-1 pol 유전자는 다단백질을 암호화하며, 이는 프로테아제(PR, p1), 역전사효소(RT, p66/p51), 및 인테그라아제(IN, p31)로 절단된다. 본 발명자들은 RT 산물의 두 개의 서브유닛, 즉, p66 및 p51을 검출하였다. p51은 카르복시 말단의 p15의 절편의 단백질 가수분해 절단에 의해 p66 으로부터 생성된다. RT 산물인 p66 및 p51은 31℃ 및 37℃ 모두에서 rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)에서 동일하게 잘 발현되었다(도 26). env 유전자는 당단백질 Gp160을 암호화하며, 이는 수용체 결합 단백질의 Gp120 및 융합 유도 세포질 및 막관통 단백질 gp41로 절단된다. Gp160은 세포내 트랜스-골지 잔기 프로테아제 페투인(fetuin)에 의해 절단된다. rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)으로부터 BHK21 세포에서 발현된 Gp160는 Gp120과 Gp41로 절단되지 않았거나 절단은 매우 효율적이지 못하였지만, 발현 수준은 31℃ 및 37℃ 모두에서 양호했다(도 27). BHK21 세포에서의 Gp120의 발현 및 Gp120과 Gp41로의 절단에 대한 본 발명자들의 이전 데이터는 프로세싱이 매우 효율적이지 않았음을 입증하였다(Kunyu Wu et al., Journal of General Virol., 90:1135-1140, 2009).
실시예 14: HIV -1 단백질 Gag , Gp160 및 RT 을 갖는 rVSV Ind ( GLM ) 및 rVSV NJ (GM)를 이용한 마우스에서의 면역화 연구
새로운 M 돌연변이 rVSV, rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)를 이용한 예비 프라임-부스트 면역화 연구는 마우스를 rVSVInd(GLM)로 프라이밍하고 rVSVNJ(GM)로 부스팅함으로써 다른 방법에 비해 외래 유전자에 대해 양호한 CD8+ T 세포 면역 반응(도 17) 및 체액성 면역 반응(도 18)을 유도하였음을 입증하였다. rVSVInd(GLM)-Gag 프라이임과 rVSVNJ(GLM)-Gag 부스팅으로 인해, 각각의 바이러스의 5x108 pfu의 투여량은 낮은 투여량에 비해 양호한 Gag 특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도하였지만, Gag에 대한 B 세포 반응은 낮은 투여량으로 유도된 것과 유사하였다(도 20 및 도 21). 본 발명자들은 HIV-1 Gag, Gp160, 및 RT를 발현하는 rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)를 이용한 면역화 연구에 대한 투여량으로서 5x108 pfu를 선택하였다.
본 발명자들은 Balb/c 마우스를, 표 6에 나타낸 바와 같이, HIV-1 단백질을 발현하는 rVSVInd(GLM)으로 프라임 면역화하였고 이후 3 주 후에 HIV-1 단백질을 발현하는 rVSVNJ(GM)으로 부스트 면역화하였다. 본 발명자들은 각각의 주입 또는 별도의 단백질을 발현하는 세 개의 다른 바이러스의 혼합된 주입에 의해 각각의 HIV-1 단백질에 대한 면역 반응이 어떻게 유도되는지를 확인하였다. 부스트 면역화 1 주 후, 본 발명자들은 비장세포와 혈청을 얻기 위해 면역화된 마우스를 희생시켰다. 1x106의 비장세포를 H-2Kd-제한 HIV-1 단백질 특이적 펩타이드인 Gag, Env P18, RT354, RT464, 및 RT472로 자극시켰다. 펩타이드 서열을 도 29에 나타냈다. 자극된 비장세포를 세포 표면 CD8 분자 및 T 세포의 세포 내 IFN-γ에 대해 FITC 쥐 항-마우스 CD8 및 APC 쥐 항-마우스 IFN-γ로 이중 염색하였다. rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)를 이용한 프라임-부스트 면역화 요법은 본 발명자들이 자극을 위해 사용한 펩타이드에 따라 서로 다른 수준으로 펩타이드 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도하였다. Env 펩타이드에 대한 CD8+ T 세포는 CD8+ T 세포를 평균 CD8+ T 세포의 최대 19% 내지 23% 자극하였다(도 28, G3 및 G5). CD8+ T 세포의 대략 4.5% 또는 3%가 Gag만을 발현하는 rVSV(도 28, G2)로 면역화되거나 HIV-1 Gp120 및 Gp41의 다양한 B 및 T 세포 에피토프와 결합된 Gag A, Gag B 및 Gag C를 발현하는 혼합된 세 개의 rVSV로 면역화된 마우스에서 Gag 단백질에 반응하였다(도 28, G6). pol 유전자를 갖는 rVSV를 주입한 마우스의 대략 2%의 CD8+ T 세포에서 RT 특이적 CD8+ T 세포가 생성되었다(도 28, G4). 각각의 HIV-1 단백질, Gag 및 RT에 대한 CD8+ T세포 반응은, 마우스에 하나의 단백질을 발현하는 혼합 rVSV를 주입했을 때(도 28, G5)보다, 각각의 단백질을 발현하는 단일 rVSV를 주입했을 때 더 강력했다(도 28, G2 및 G4). Env 특이적 CD8+ T 세포 반응은 단일 및 혼합 주입 모두에서 가장 강력했으며 유사했다. Env 펩타이드 에피토프에 대한 CD8+ T세포 반응은, Balb/c 마우스에서 면역우성이다. 현재, 본 발명자들은 Gag, Env 및 RT를 발현하는 세 개의 다른 rVSV를 포함하는 혼합 주입이 단일 바이러스 주입보다 VSV N, gag 및 RT에 대한 비교적 낮은 CD8+ T 세포 반응을 유도하는지 그 이유가 불확실하다. 혼합 바이러스 주입에서 세포를 제공하는 항원에 대한 각각의 바이러스의 경쟁이 Gag 및 RT에 대한 CD8+ T 세포 반응을 낮추는 것은 가능하다. rVSV는 단일 rVSV 또는 혼합 rVSV를 주입한 마우스에서 HIV-1 단백질에 대한 공통 벡터이므로, VSV N는 혼합 주입에서 유사하거나 양호한 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 것으로 추정된다. 그러나, 마우스에서 VSV N에 대한 CD8+ T 세포 반응은, 혼합 주입에서 그러하듯이(도 28, G5), Env가 발현될 때(도 28, G3) 단일 주입에서 조차 낮다. 따라서, Balb/c 마우스에서 Env 단백질의 면역 우성의 결과일 수 있으며, 이는 Env가 함께 발현될 때 CD8+ T 세포에 대한 다른 단백질의 제공에 대해 부정적인 영향을 미친다. 마우스에서의 결합된 면역화를 위해, 세 개의 rVSV 모두를 단일 부위에 주입하였고, 이는 동일한 항원 제공 세포에서 항원 제공에 대해 다른 단백질의 경쟁을 유발할 수 있다. 본 발명자들은 CD8+ T 세포 반응을 유도하기 위해 하나 이상의 주입 부위에서 혼합 주입을 이용한 면역화를 시험할 것이다.
세포에서 발현된 HIV-1 Gag 단백질은 바이러스 유사 입자(virus like particle, VLP)를 생성할 수 있고, 상기 VLP는 세포에서 방출될 수 있다. 방출된 VLP는 Gag 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다. HIV-1 env 유전자는 당화 표면 단백질을 암호화하며, 이들은 적절히 접히고 막관통 서브유닛 Gp41과 표면 유닛 Gp120으로 절단되도록 하는 ER-골지 네트워크를 통해 처리된다. Gp41 및 Gp120은 비공유결합에 의해 결합되고 성숙되어 Gp41의 트라이머와 Gp120 헤테로다이머를 형성한다. Gp41와 Gp120의 성숙된 트라이머는 세포 표면으로 전달된다. Gp120은 Gp41과 Gp120 간의 약한 결합으로 인해 세포 표면에서 떨어져 나가는 경향이 있다. 따라서, Gp120에 대한 항체는 세포 표면 Gp120 또는 떨어져 나간 Gp120으로 유도될 수 있다. HIV-1 Gag 단백질 및 Gp120에 대한 항체 역가는 ELISA에 의해 결정하였다. Gag 항체를 위해, 마이크로플레이트를 125 ng/웰의 재조합 p55(Pierce Biotechnology, RP-4921)로 코팅하였으며 50 μl의 마우스 혈청을 1:100, 1:200, 및 1:400 희석해서 시험하였다. Gag 항체는 rVSV Gag-En만을 주입한 마우스(도 30A, G2) 그리고 rVSV-Gag A+rVSV Gag B+rVSV Gag C 혼합 바이러스를 주입한 마우스(도 30A, G6)에서 생산하였다. Gp120 ELISA를 위해, 96-웰 마이크로플레이트를 클레이드 B(NIH AIDS 시약 프로그램, cat# 12026)로부터의 250 ng/웰의 HIV-1 SF162 Gp140 트라이머로 코팅하였다. 마우스 혈청을 1:100, 1:200, 및 1:400로 희석하였고, 50 μl의 희석된 혈청을 ELISA를 위한 플레이트에 첨가하였다. Gp120에 특이적인 항체를 rVSV-HIV-1 Gp160만을 주입한 마우스 그리고 Gag, Gp160, 및 RT의 각각의 단백질을 발현하는 혼합 바이러스를 주입한 마우스에서 생성하였다(도 30B, G3 및 G5). Gp120의 역가는 Gp160을 발현하는 단일 바이러스를 주입한 마우스에서보다 혼합 바이러스를 주입한 마우스에서 약간 낮았지만, 통계적으로 유의하지 않았다.
rVSV, rVSVInd(GLM) 및 rVSVNJ(GM)의 새롭게 형성된 M 돌연변이는 마우스에 단일 단백질을 발현하는 각각의 바이러스를 주입하거나 다양한 HIV-1 단백질을 발현하는 혼합 바이러스를 주입한 후 벡터에서 발현된 다양한 HIV-1 단백질에 대한 CD8+ T 세포 및 체액성 면역 반응을 유도하였다.
실시예 15: C형 간엽 바이러스 구조 단백질을 이용한 rVSV Ind ( GLM ), rVSV NJ (GM) 및 rVSV NJ ( GLM )의 형성
일반적으로, 체액성 면역 반응은 임의의 병원균에 대한 적응 면역 반응이 매개하는 방어의 최일선이다. HCV에 대한 체액성 면역 반응과 HCV 감염의 방지를 위한 이의 역할에 대해서는 HCV 특이적 세포성 면역 반응에 비해 잘 연구되지 않았지만, HCV 특이적 항체를 유도할 수 있는 백신을 포함시키는 것은 가치 있는 일이다. 뉴클레오캡시드 단백질 코어와 표면 당단백질 E1 및 E2가 세포에서 방출될 수 있는 바이러스-유사 입자(VLP)를 형성하는 것으로 입증되었다(Blanchard, E. et al., J. Virol. 76:4073-4079, 2002). 또한, ER 막에서 이온 채널을 형성하는 바이로포린(viroporin)인 HCV 단백질 p7이 감염된 세포에서 HCV 입자를 방출하는데 참여하는 것이 입증되었다(Steinmann, E. et al., PLoS Pathogens 3:962-972, 2007). 또 다른 HCV 막관통 단백질 NS4B는 주로 ER 막으로 이루어진 세포막 거미줄(membranous web) 구조를 형성한다. NS4B에 의해 형성된 세포막 거미줄은 자손 HCV의 생성을 위한 미세구조이다. HCV의 복제에서 NS4B가 가진 기능은 잘 알려져 있지 않지만, 다른 HCV 단백질, 코어, E1, E2, P7가 국소화되는 ER의 세포막 구조를 형성하는 NS4B의 특성으로 인해 NS4B를 백신 후보로 포함시키는 것은 흥미로운 일이다. 따라서, 코어, E1, E2, P7 및 NS4B를 모두 백신에 포함시키는 것은 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다.
새로운 돌연변이 rVSV를 사용하는 HCV 구조 단백질 백신을 위해, 본 발명자들은 HCV 핵심 유전자, E1E2P7 및 NS4B 유전자를 함께(VSV 유전자 접합 서열에 의해 연결됨) 및 CoreE1E2P7 및 NS4B 유전자를 함께(VSV 유전자 접합 서열에 의해 연결됨) VSV G 유전자 및 L 유전자의 접합에 삽입하였다(도 31). rVSV; rVSVInd(GLM)-FC, rVSVInd(GLM)-CE1E2P7/NS4B, rVSVNJ(GM)-FC, 및 rVSVNJ(GLM)- E1E2P7/NS4B를 역유전학에 의해 생성하였다. 본 발명자들은 플라스미드 DNA로부터 CE1E2P7/NS4B를 갖는 rVSVNJ(GM)를 생성하는데 곤란을 겪었고, 따라서, 본 발명자들은 코어를 제거하고 E1E2P7 NS4B를 rVSVNJ(GLM)에 클로닝해서 rVSVNJ(GLM)-E1E2P7/NS4B를 생성하였다. 31℃ 및 37℃에서 재조합 VSV로부터의 코어, E1, E2 및 NS4B의 발현은 각각의 단백질에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다(도 32). 단백질은 두 가지 온도 모두에서 유사한 양으로 발현하였다. 코어(도 32A), E1(도 32B), 및 E2(도 32C)는 rVSVInd(GLM)-CE1E2P7/NS4B에서 잘 발현하였지만, NS4B의 발현은 다른 단백질보다 낮았다(도 32D).
실시예 16: HCV 비구조 단백질을 이용한 rVSV Ind ( GLM ), rVSV NJ ( GM ), 및 rVSV NJ (GLM)의 생성
본 발명자들은 다수의 단백질에 HCV 특이적 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 면역 반응을 유도하기 위해 코어, E1, E2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B 단백질을 포함하는 대부분의 HCV 단백질을 목표로 하고자 한다. HCV 비구조(NS) 단백질인 NS3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B는 HCV 다단백질의 절반 이상을 포함한다. NS 단백질은 NS4A의 도움으로 NS3에 의해 각각의 단백질로 절단된다. 몇 가지 연구는 급성 HCV 감염에서 회복된 환자가 NS3 단백질에서 다수의 에피토프에 대한 강력한 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 반응으로 발전한다는 것을 보여주고 있으며(Diepolder, H. M. J. Virol. 71:6011-6019, 1997; Lamonaca, V. et al. Hepatology 30:1088-1098, 1999; Shoukry, N. H. et al. J. Immunol. 172:483- 492, 2004), 이는 NS3를 백신 후보에 포함시키는 것은 HCV에 대한 성공적인 세포성 면역 반응을 유도하는데 중요하다는 것을 나타낸다. 세린 프로테아제 및 RNA 헬리카제(helicase)인 NS3 단백질은 NS4A와 결합하고 ER 막에 존재한다(Sato, S. et al. J. Virol. 69:4255-4260, 1995; Failla, C. et al. J. Virol. 69:1769-1777, 1995). 인단백질인 NS5A 단백질은 RNA 의존성 RNA 중합효소인 NS5B와 함께 HCV RNA 합성에 관여하는 것으로 여겨진다(Shirota, Y. et at., J. Biol. Chem., 277:11149-11155, 2002; Shimakami, et al. J. Virol. 78:2738-2748, 2004). NS5B 단백질은 양성 센스 HCV 게놈 RNA뿐만 아니라 중간 음성 센스 게놈 RNA를 합성하는 RNA 의존성 RNA 중합효소이다(Beherens, S. E. EMBO J. 15:12-22, 1996). NS5B 단백질은 꼬리 고정 단백질(tail-anchored protein)이며 카르복시 말단의 20 개 아미노산을 통해 ER 막과 결합한다(Y amashita, T. J. Biol. Chem. 273:15479-15486, 1998; Hagedom, C. H. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 242:225-260, 2000).
본 발명자들은 단일 단백질에 대한 유전자로서 또는 2 개 또는 3 개의 NS 단백질의 다단백질에 대한 유전자로서 HCV NS 유전자를 클로닝하였다. NS 유전자인 NS3, NS34AB, NS5A, NS5B, NS5AB를 pVSVInd(GLM) 및 pVSVNJ(GM)의 G 유전자 및 L 유전자의 접합부로 클로닝하였다(도 33). 본 발명자들은 rVSVInd(GLM)-NS3, rVSVInd(GLM)-NS34AB, rVSVInd(GLM)-NS5A, rVSVInd(GLM)-NS5B, 및 rVSVInd(GLM)-NS5AB를 생성하였고, 31℃ 및 37℃에서의 NS 단백질의 발현을 각각의 NS 단백질에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다(도 34). 본 발명자들은 rVSVNJ(GM)-NS3, rVSVNJ(GM)-NS4B, rVSVNJ(GM)-NS34AB, rVSVNJ(GM)-NS5A, rVSVNJ(GM)-NS5B, 및 rVSVInd(GM)-NS5AB를 생성하였다. 37℃에서의 rVSVNJ 벡터로부터의 각각의 단백질의 발현을 각각의 NS 단백질에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다(도 35). rVSVInd 및 rVSVNJ로부터의 NS 단백질의 발현 수준이 다르기는 하지만, 이들을 HCV 백신으로 사용하기에는 충분히 양호하였다.
표 1: 마우스 백신접종군 및 방법
Figure 112014068632655-pct00001

표 2: VSV 인디애나 혈청형, 야생형(서열 번호 1) 및 돌연변이 G21E/L111F/M51R(서열 번호 2)의 M 유전자들의 염기 서열 비교
Figure 112014068632655-pct00002
Figure 112014068632655-pct00003

표 3: VSV 인디애나 혈청형, 야생형(서열 번호 3) 및 돌연변이 G21E/L111F/M51R(서열 번호 4)의 M 유전자들의 아미노산 서열 비교
Figure 112014068632655-pct00004

표 4: VSV 뉴저지 혈청형, 야생형(서열 번호 5) 및 돌연변이 G22E/M48R+M51R (서열 번호 6) 및 G22E/L110F/M48R+M51R (서열 번호 7)의 M 유전자들의 염기 서열 비교
Figure 112014068632655-pct00005
Figure 112014068632655-pct00006
Figure 112014068632655-pct00007

표 5: VSV 뉴저지 혈청형, 야생형(서열 번호 8) 및 돌연변이 G22E/M48R+M51R (서열 번호 9) 및 G22E/L110F/M48R+M51R (서열 번호 10)의 M 유전자들의 아미노산 서열 비교
Figure 112014068632655-pct00008

표 6: 광범위한 CD8+ T 세포 반응 및 HIV-1 단백질에 대한 체액성 면역 반응에 대한 마우스에서의 백신접종 연구
Figure 112014068632655-pct00009
<110> KANG, Chil-Yong KIM, Gyoung Nyoun <120> VESICULAR STOMATITIS VIRUS FOR PRIME BOOST VACCINES <130> 118494.97 <150> US 61/579,902 <151> 2011-12-23 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Genes of VSV Indiana serotype, Wild Type <400> 1 atgagttcct taaagaagat tctcggtctg aaggggaaag gtaagaaatc taagaaatta 60 gggatcgcac caccccctta tgaagaggac actaacatgg agtatgctcc gagcgctcca 120 attgacaaat cctattttgg agttgacgag atggacactc atgatccgca tcaattaaga 180 tatgagaaat tcttctttac agtgaaaatg acggttagat ctaatcgtcc gttcagaaca 240 tactcagatg tggcagccgc tgtatcccat tgggatcaca tgtacatcgg aatggcaggg 300 aaacgtccct tctacaagat cttggctttt ttgggttctt ctaatctaaa ggccactcca 360 gcggtattgg cagatcaagg tcaaccagag tatcacgctc actgtgaagg cagggcttat 420 ttgccacaca gaatggggaa gacccctccc atgctcaatg taccagagca cttcagaaga 480 ccattcaata taggtcttta caagggaacg gttgagctca caatgaccat ctacgatgat 540 gagtcactgg aagcagctcc tatgatctgg gatcatttca attcttccaa 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gtcctggatt ctgtcagcca cttcaaatga 690 <210> 3 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: VSV Indiana serotype Wild Type <400> 3 Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15 Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Asn 20 25 30 Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val 35 40 45 Asp Glu Met Asp Thr His Asp Pro His Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile 85 90 95 Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Leu Gly 100 105 110 Ser Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln 115 120 125 Pro Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg 130 135 140 Met Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg 145 150 155 160 Pro Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Val Glu Leu Thr Met Thr 165 170 175 Ile Tyr Asp Asp Glu 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130 135 140 Met Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg 145 150 155 160 Pro Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Val Glu Leu Thr Met Thr 165 170 175 Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His 180 185 190 Phe Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Asp Lys Ala Leu Met Phe 195 200 205 Gly Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser 210 215 220 Val Ser His Phe Lys 225 <210> 5 <211> 686 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: VSV New Jersey serotype Wild Type <400> 5 atgagttcct tcaaaaagat tctgggattt tcttcaaaaa gtcacaagaa atcaaagaaa 60 ctaggcttgc cacctcctta tgaggaatca agtcctatgg agattcaacc atctgcccca 120 ttatcaaatg acttcttcgg aatggaggat atggatttat atgataagga ctccttgaga 180 tatgagaagt tccgctttat gttgaagatg actgttagag ctaacaagcc cttcagatcg 240 tatgatgatg tcaccgcagc ggtatcacaa tgggataatt catacattgg aatggttgga 300 aagcgtcctt tctacaagat aattgctctg attggctcca gtcatctgca agcaactcca 360 gctgtgttgg cagacttaaa tcaaccagag 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tttcagaaaa 480 ccattcaata ttgggatata caaagggact ctcgacttca cctttacagt ttcagatgat 540 gagtctaatg aaaaagtccc tcatgtttgg gaatacatga acccaaaata tcaatctcag 600 atccaaaaag aagggcttaa attcggattg attttaagca agaaagcaac gggaacttgg 660 gtgttagacc aattgagtcc gtttaa 686 <210> 7 <211> 686 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: G22E/L110F/M48R+M51R <400> 7 atgagttcct tcaaaaagat tctgggattt tcttcaaaaa gtcacaagaa atcaaagaaa 60 ctagaattgc cacctcctta tgaggaatca agtcctatgg agattcaacc atctgcccca 120 ttatcaaatg acttcttcgg aagggaggat agggatttat atgataagga ctccttgaga 180 tatgagaagt tccgctttat gttgaagatg actgttagag ctaacaagcc cttcagatcg 240 tatgatgatg tcaccgcagc ggtatcacaa tgggataatt catacattgg aatggttgga 300 aagcgtcctt tctacaagat aattgctttt attggctcca gtcatctgca agcaactcca 360 gctgtgttgg cagacttaaa tcaaccagag tattatgcca cactaacagg tcgttgtttt 420 cttcctcacc gactcggatt gatcccaccg atgtttaatg tgtccgaaac tttcagaaaa 480 ccattcaata ttgggatata caaagggact ctcgacttca cctttacagt ttcagatgat 540 gagtctaatg aaaaagtccc tcatgtttgg gaatacatga acccaaaata tcaatctcag 600 atccaaaaag aagggcttaa attcggattg attttaagca agaaagcaac gggaacttgg 660 gtgttagacc aattgagtcc gtttaa 686 <210> 8 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: VSV New Jersey serotype Wild Type <400> 8 Met Ser Ser Phe Lys Lys Ile Leu Gly Phe Ser Ser Lys Ser His Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Lys Leu Gly Leu Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ser Ser Pro 20 25 30 Met Glu Ile Gln Pro Ser Ala Pro Leu Ser Asn Asp Phe Phe Gly Met 35 40 45 Glu Asp Met Asp Leu Tyr Asp Lys Asp Ser Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Phe Met Leu Lys Met Thr Val Arg Ala Asn Lys Pro Phe Arg Ser 65 70 75 80 Tyr Asp Asp Val Thr Ala Ala Val Ser Gln Trp Asp Asn Ser Tyr Ile 85 90 95 Gly Met Val Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Ile Ala Leu Ile Gly 100 105 110 Ser Ser His Leu Gln Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Leu Asn Gln 115 120 125 Pro Glu Tyr Tyr Ala Thr Leu Thr Gly Arg Cys Phe Leu Pro His Arg 130 135 140 Leu Gly Leu Ile Pro Pro Met Phe Asn 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Claims (77)

  1. 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)의 변형된 기질(matrix, M) 단백질에 있어서, 상기 변형된 M 단백질은 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3; 및 (ii) 다음의 치환: G22E/M48R/M51R을 포함하는 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 변형된 M 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 변형된 M 단백질은 (ii) 다음의 치환: G22E/M48R/M51R 및 다음의 치환: L110F를 더 포함하는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 변형된 M 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 변형된 M 단백질은 서열번호 4, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 변형된 M 단백질.
  4. 재조합 VSV(rVSV)에 있어서, 상기 rVSV는 변형된 기질(M) 단백질을 포함하고, 상기 변형된 M 단백질은 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3; 및 (ii) 다음의 치환: G22E/M48R/M51R을 포함하는 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 rVSV.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 rVSV는 외부 병원균의 단백질을 발현하는 키메라(chimeric) rVSV이고, 상기 외부 병원균은 바이러스성, 곰팡이성, 세균성 또는 기생성 병원균인 것을 특징으로 하며, 상기 키메라 rVSV는 상기 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 rVSV.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 rVSV는 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 rVSV:
    (a) 재조합 수포성 구내염 바이러스의 인디애나 혈청형(rVSVInd)이고, 상기 변형된 M 단백질은 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 rVSV, 및
    (b) 재조합 수포성 구내염 바이러스의 뉴저지 혈청형(rVSVNJ)이고, 상기 변형된 M 단백질은 다음의 치환: G22E/M48R/M51R을 포함하는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 rVSV.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 rVSVInd의 변형된 M 단백질은 서열번호 2의 염기 서열로 표시되는 유전자에 의해 암호화되고, 상기 rVSVNJ의 변형된 M 단백질은 서열번호 6 또는 서열번호 7의 염기 서열로 표시되는 유전자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 rVSV.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 rVSV는 rVSVNJ이고, 상기 변형된 M 단백질은 다음의 치환: L110F를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 rVSV.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 변형된 M 단백질은 서열번호 7의 염기 서열로 표시되는 유전자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 rVSV.
  10. 백신에 있어서, 상기 백신은 하나 이상의 약독화(attenuated) rVSV의 유효량을 포함하고, 상기 하나 이상의 약독화 rVSV는 변형된 기질(M) 단백질을 포함하며, 상기 변형된 M 단백질은 (i) 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3; 및 (ii) 다음의 치환: G22E/M48R/M51R을 포함하는 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 백신.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 rVSV는 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신:
    (a) 재조합 수포성 구내염 바이러스의 인디애나 혈청형(rVSVInd)이고, 상기 변형된 M 단백질은 다음의 치환: G21E/L111F/M51R을 포함하는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 rVSV, 및
    (b) 재조합 수포성 구내염 바이러스의 뉴저지 혈청형(rVSVNJ)이고, 상기 변형된 M 단백질은 다음의 치환: G22E/M48R/M51R을 포함하는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 rVSV.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 rVSV는 rVSVNJ이고, 상기 변형된 M 단백질은 다음의 치환: L110F를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 rVSV는 외부 병원균의 단백질을 발현하는 키메라 rVSV이고, 상기 외부 병원균은 렌티바이러스(lentivirus)성, C형 간염 바이러스(hepatitis C virus)성, 곰팡이성, 세균성 또는 기생성 병원균인 것을 특징으로 하며, 상기 키메라 rVSV는 상기 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신.
  14. 프라임 부스트 복합 백신(prime boost combination vaccine)에 있어서, 상기 프라임 부스트 복합 백신은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 제 1 변형된 M 단백질을 갖는 하나의 혈청형의 약독화 rVSV를 포함하는 백신의 유효량; 및 (b) 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 제 2 변형된 M 단백질을 갖는 다른 하나의 혈청형의 rVSV를 포함하는 백신의 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 프라임 부스트 복합 백신.
  15. 제 14 항에 있어서,
    (a)는 프라이밍(priming) 백신이고 (b)는 부스터(booster) 백신인 것을 특징으로 하는 프라임 부스트 복합 백신.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 두 개의 rVSV는 외부 병원균의 단백질을 발현하는 키메라 rVSV이고, 상기 외부 병원균은 렌티바이러스(lentivirus)성, C형 간염 바이러스(hepatitis C virus)성, 곰팡이성, 세균성 또는 기생성 병원균인 것을 특징으로 하며, 상기 두 개의 키메라 rVSV는 상기 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 프라임 부스트 복합 백신.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 (a)의 혈청형은 인디애나이고 상기 백신 (b)의 혈청형은 뉴저지인 것을 특징으로 하는 프라임 부스트 복합 백신.
  18. (a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 변형된 M 단백질을 갖는 rVSVInd를 포함하는 백신의 유효량의 1회 투여량; 및 (b) 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 변형된 M 단백질을 갖는 rVSVNJ를 포함하는 백신의 유효량의 1회 투여량을 포함하는 키트.
  19. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 개체에서 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한, 백신.
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