JP2003310271A - エイズワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 組換え核酸配列技術を応用したエイズワクチ
ン作製用組換え核酸、それを用いて作製されるエイズワ
クチン等の提供。 【解決手段】 インフルエンザウイルスにエイズウイル
ス遺伝子の一部を挿入し、組換え型インフルエンザウイ
ルスを作製する。 【効果】 本発明のエイズワクチンは、例えば、（１）
生ワクチンとして経鼻接種が可能である、（２）発育鶏
卵を用いて、安価に大量生産できる、（３）サブタイプ
を変化させることによる追加免疫が可能である、（４）
ウイルス感染個体において免疫グロブリン、特にＩｇＡ
の誘導が可能である、（５）細胞性免疫反応の主体であ
るＣＴＬ活性誘導能がある、（６）感染が一過性である
ため、安全性が高い等の利点を有している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エイズワクチン作
製用組換え核酸、それを用いて作製されるエイズワクチ
ン等に関する。より詳しくは、本発明は、インフルエン
ザウイルスを用いて作製される組換え核酸、それを含有
する発現ベクター、その発現ベクターを用いて作製され
るエイズワクチン等に関する。

【０００２】

【従来の技術】エイズは、1981年に後天性免疫不全症候
群（Acquired Immunodeficiency Syndrome（ＡＩＤ
Ｓ））と命名された。ヒトにおけるエイズの原因ウイル
スはヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency V
irus、以下ＨＩＶと略す）と呼ばれ、レトロウイルス科
レンチウイルス亜科に分類される。ＨＩＶの感染からエ
イズ（ＡＩＤＳ）の発症までの期間は１０年と長く、
（１）急性期、（２）無症状キャリア期、（３）ＰＧＬ
期（全身のリンパ節の腫れ）、（４）エイズ関連症候群
の発症、（５）エイズ発症の５期に分けることができ
る。

【０００３】エイズが、末梢血リンパ球、中でもＣＤ４
(８)陽性Ｔリンパ球の減少をもたらすことは良く知られ
ている。その後、２つの細胞親和性、Ｔ細胞（ＳＩ株）
又はマクロファージ（ＮＳＩ株）に感染する性質がある
ことが分かってきた。

【０００４】ＨＩＶはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に大別さ
れ、直径が８０から１００ｎｍの球状のウイルスであ
る。ＨＩＶゲノムは約９．７ｋｂの線状単鎖ＲＮＡで、
逆転写酵素およびビリオンコアの構造タンパク質と複合
体を形成し、プライマーｔＲＮＡとともにウイルス粒子
中に内在する。ゲノムはｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等、合
計１０種の遺伝子で構成されている。ｇａｇ、ｐｏｌ、
ｅｎｖ遺伝子は、コアの構造タンパク質の前駆体、３種
の酵素（プロテアーゼ、逆転写酵素およびインテグラー
ゼ）の前駆体、エンベロープ糖タンパク質の前駆体をそ
れぞれコードしている。

【０００５】ＨＩＶがＴ細胞あるいはマクロファージに
感染する際に、それらの細胞のレセプターに結合するタ
ンパク質は分子量１２０キロダルトン（ｋＤａ）のｇｐ
１２０である。ｇｐ１２０はＨＩＶ感染細胞内でエンベ
ロープ糖タンパク質の前駆体である分子量１６０ｋＤａ
のｇｐ１６０タンパク質が特異的タンパク質分解酵素に
より分子量１２０ｋＤａのｇｐ１２０と分子量４１ｋＤ
ａのｇｐ４１に分解され生じる。

【０００６】ｇｐ１２０は、比較的安定しているＣ１〜
Ｃ５領域と、変異の頻度が高いＶ１〜Ｖ５領域から構成
される。Ｖ１/Ｖ２とＶ３はＣＤ４のＤ１部位に結合部
位を形成する。Ｖ３はケモカインレセプターとの結合部
位となっている。これらの領域のうち、Ｖ３領域はルー
プ構造をとり、免疫原性の主要エピトープ、すなわちＨ
ＩＶの中和エピトープおよび細胞傷害性Ｔリンパ細胞
（cytotoxic T lymphocyte（以下、ＣＴＬと略すことも
ある））エピトープとしての機能を有する。

【０００７】Ｍ親和性ウイルスはケモカインレセプター
ＣＣＲ５をコレセプターに、他方、Ｔ親和性ウイルス
は、ＣＸＣＲ４をコレセプターにして、その親和性の決
定に関与している。いずれにしても、ｇｐ１２０のＶ３
ループがＨＩＶ感染の親和性を決定している。

【０００８】従来、種々の抗エイズ薬が開発され、多く
のエイズ患者でその劇的な治療効果が得られるようにな
った。抗エイズ治療薬としては、例えば逆転写酵素阻害
剤（ＡＺＴ等）や前記タンパク質分解酵素阻害剤（ｇｐ
１６０からｇｐ１２０とｇｐ４１への分解を阻害）が挙
げられる。しかし、これらには薬剤投与による副作用や
薬剤投与に伴う多剤耐性株の出現といった弊害があっ
た。

【０００９】また、ＨＩＶに対するワクチンの開発も進
められているが、ＨＩＶ遺伝子の一部の遺伝子変異率が
極めて高い（点変異（一般に真核細胞ゲノムＤＮＡでは
１０ ^-10であるのに対し、ＨＩＶを代表例とする一部の
ＲＮＡをゲノムとしてもつウイルスでは１０^-3〜１０^-4
と高い））、遺伝的組換え、遺伝的再集合をするので、
一般的にはその効果が期待しにくいという問題がある。
また、エイズに対するワクチンの開発は、ウイルス感染
者の発症予防を目的としていた。そのため、安全性が危
惧される生ワクチンよりも、不活化ワクチンあるいは成
分ワクチンの開発が先行していた。前記不活化ワクチン
あるいは成分ワクチンとしてすでに前臨床試験あるいは
臨床試験に供されているものとしては、例えば、（１）
サブユニットワクチン、（２）合成ペプチドワクチン、
（３）粒子ワクチン、（４）ＤＮＡワクチン、（５）植
物生産ワクチン等があげられる。

【００１０】しかし、上記のようなワクチンはそれを接
種した個体に免疫グロブリンの産出（すなわち液性免
疫）を誘導するが、細胞性免疫を誘導できないため、ウ
イルス感染者の体内からウイルス感染細胞を排除できな
いという欠点を有している。すなわち、ＨＩＶに特異的
な液性および細胞性免疫の両者が誘導可能で、かつ安全
なエイズワクチンの実用化はなされていない。そこで、
エイズウイルスが有する遺伝子を、組換えＤＮＡ技術に
より、他のウイルスのゲノム中に組込んだ組換え型ウイ
ルスを用いたエイズに対する生ワクチンの開発が試みら
れた。

【００１１】感染個体に細胞性免疫を誘導することが知
られているワクシニアウイルスがまず用いられた（ＷＯ
９７／２７３１１号）。さらに、カナリア痘ウイルス
（米国特許第５，７６６，５９８号および米国特許第
５，８６３，５４２号）、アデノウイルス（欧州特許第
０６３８３１６号）、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウ
イルス等を用いた生ワクチンの開発が試みられた。しか
し、これらのワクチンでは、（１）変異エイズウイルス
の多様性に対応できない、（２）ウイルス自身に抗体産
生が誘導されるため、長期間にわたって再接種できな
い、（３）ワクチン株自身の毒性が高い場合がある、等
の問題点があった。一方、米国特許第５７８６１９９号
には、組換マイナス鎖ＲＮＡウイルス発現システム及び
それを用いるエイズワクチンが開示されている。このエ
イズワクチンは、変異インフルエンザウイルスによりＨ
ＩＶ由来のぺプチドを含んだ外来遺伝子産物がＨＩＶに
対して免疫反応を起こして防御されることを利用してい
る。しかし、このワクチンの場合、ＨＩＶ由来のペプチ
ドはわずか１２アミノ酸であり、効率よく細胞性および
液性の両免疫反応を誘導するのに十分であるとはいえな
い。さらに、ウイルスが宿主細胞に感染する際、レセプ
ターに結合するＨＡ（ヘマグルチニン）に変異を導入し
ているため、感染効率あるいは機能の低下が懸念され
る。また、ＨＡは宿主細胞の感染域を決定するいくつか
の亜型に分類されているので、一度作製するとワクチン
の感染できる宿主域を制御することが難しいという問題
がある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記問題点を
考慮してなされたもので、安全で、ＨＩＶの多様性に対
応しうるエイズワクチン、そのようなワクチンを作製す
るための組換え核酸などを提供する。

【００１３】すなわち、本発明は、遺伝子変異を起こす
ウイルスを用いて作製される組換え核酸であって、その
ウイルスの遺伝子変異を起こす領域の核酸配列に、ＨＩ
Ｖの遺伝子変異を起こす領域の核酸配列又はその部分配
列を組込むことにより作製されるエイズワクチン作製用
組換え核酸を提供する。ここで「核酸」とはＤＮＡまた
はＲＮＡを意味する。本発明の好ましい態様によれば、
上記遺伝子変異を起こすウイルスはインフルエンザウイ
ルスである。また、その遺伝子変異を起こす領域とし
て、好ましくは、インフルエンザＮＡストーク領域が選
択される。さらに、上記ＨＩＶの遺伝子変異を起こす領
域としては、好ましくはＶ３領域が選択される。

【００１４】本発明において前記ＮＡストーク領域に組
込まれる核酸配列は、好ましくは、（１）配列番号：１
で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列と同一、
もしくは実質的に同一である核酸配列、より好ましく
は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードする
核酸配列、（２）配列番号：２で表されるアミノ酸配列
をコードする核酸配列と同一、もしくは実質的に同一で
ある核酸配列、より好ましくは、配列番号：２で表され
るアミノ酸配列をコードする核酸配列、（３）配列番
号：３で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列と
同一、もしくは実質的に同一である核酸配列、より好ま
しくは、配列番号：３で表されるアミノ酸配列をコード
する核酸配列である。本発明の別の態様によれば、上記
組換え核酸によってコードされるキメラタンパク質、上
記組換え核酸を含有する発現ベクター、上記組換え核酸
をウイルスゲノムに含有することを特徴とする組換え型
ウイルスが提供される。

【００１５】また、本発明の別の態様によれば、上記組
換え型インフルエンザウイルスを含むエイズワクチン、
公知の手法に基づいて不活性化した本発明のエイズワク
チン、また、前記キメラタンパク質あるいは前記ウイル
スの表面抗原タンパク質を含むエイズワクチンが提供さ
れる。さらに、エイズワクチンと薬学的に許容できる担
体またはアジュバントとを含むエイズワクチン組成物が
提供される。本発明のエイズワクチン組成物は、好まし
くは生体に負荷がかからないように経鼻接種される。

【００１６】また、本発明の別の態様によれば、エイズ
ワクチン作製用組換えウイルスの製造方法であって、
（１）ウイルスの遺伝子変異を起こす領域の核酸配列
に、ＨＩＶの遺伝子変異を起こす領域の核酸配列又はそ
の部分配列を組込んだ発現ベクターからインフルエンザ
ウイルス遺伝子ＲＮＡを試験管内で作製する工程、及び
（２）ウイルスのポリメラーゼおよび核タンパク質存在
下で、ＲＮＡポリメラーゼと制限酵素処理した発現ベク
ターを用いて、試験管内での転写反応によりインフルエ
ンザキメラＲＮＰ複合体を作製する工程を含む、エイズ
ワクチン作製用組換えウイルスの製造方法が提供され
る。この製造方法は、通常は、さらに（３）得られたＲ
ＮＰ複合体をヘルパーウイルスと共にトランスフェクシ
ョン法を用いて細胞に感染させる工程、及び（４）産生
されたインフルエンザウイルスから組換え型インフルエ
ンザウイルスを選択する工程を含む。以下、本発明を詳
細に説明する。

【００１７】

【発明の実施の形態】（エイズワクチン作製用組換え核
酸）本発明のエイズワクチン作製用組換ＤＮＡは、遺伝
子変異を起こすウイルスの遺伝子変異を起こす領域の核
酸配列に、ＨＩＶ Ｖ３領域の核酸配列全てまたはその
一部を組込むことにより作製される。本発明において用
いられる遺伝子変異を起こすウイルスとしては、インフ
ルエンザウイルスに代表されるオルソミクソウイルス
科、センダイウイルスに代表されるパラミクソウイルス
科、水胞性口内炎ウイルスに代表されるラブドウイルス
科、Ｃ型肝炎ウイルスに代表されるフラビウイルス科に
属するウイルスなどが挙げられる。本発明において「ワ
クチン」とは、免疫応答を生じ得る物質をいう。安全性
の観点から細胞に対する感染が一過性であること、また
ＨＩＶの多様性に対応するために、変異を受けやすい領
域を表面抗原としてもつインフルエンザウイルスが好ま
しい。

【００１８】本発明において「インフルエンザウイル
ス」という用語は、最も広義のインフルエンザウイルス
を意味する。すなわち、インフルエンザウイルスは、一
般的には、インフルエンザウイルス属（これはさらにＡ
型とＢ型に分類される）とインフルエンザウイルスＣ型
属とに分類されるが、ここでは、「インフルエンザウイ
ルス」という用語は、これら全てを包含し、またこれら
のインフルエンザウイルスのあらゆる変異体をも含む。

【００１９】インフルエンザウイルスは、（１）生ワク
チンとして経鼻接種が可能である、（２）発育鶏卵を用
いて、安価に大量生産できる、（３）サブタイプを変化
させることによる追加免疫が可能である、（４）ウイル
ス感染個体において免疫グロブリン、特にＩｇＡの誘導
が可能である、（５）細胞性免疫反応の主体であるＣＴ
Ｌ活性誘導能がある、（６）感染が一過性であるため、
安全性が高いなどの特徴を有する。また、インフルエン
ザウイルス遺伝子の変異率は極めて高く、ＨＩＶ遺伝子
の変異率に匹敵することが知られている。以上のような
インフルエンザウイルスの特性を利用すれば、ＨＩＶと
の組換え型インフルエンザウイルスを作製した場合、導
入したＨＩＶの遺伝子部位に種々の変異が誘導でき、自
然界に存在するＨＩＶの多様性に対応できると考えられ
る。

【００２０】本発明においては、インフルエンザウイル
ス等の遺伝子変異を起こすウイルスの変異率の高い領域
にＨＩＶの特定の機能を発現する領域を組換えＤＮＡ技
術を用いて組込み、感染細胞内でＨＩＶの多様性に対応
できる組換え型ウイルスを作製する。本発明で用いるイ
ンフルエンザウイルスの変異を受けやすい遺伝子領域と
しては、ウイルスの表面抗原として既知の、例えばヘマ
グルチニン（ＨＡ）遺伝子領域、ニューラミニダーゼ
（ＮＡ）遺伝子領域が挙げられる。外来遺伝子を上記の
遺伝子に組込んだ場合にその活性に変化を生じることな
く、またウイルス複製能へも影響を生じないことが予想
される領域を有することが望ましい。さらに、外来遺伝
子を組み込んだインフルエンザウイルスの遺伝子分節は
ウイルス粒子内にランダムに取り込まれ、この際に野生
株の相同の分節のみが入れ代わったウイルス粒子を選択
的に得ることが好ましい。以上の点を考慮し、インフル
エンザウイルス遺伝子の第６分節にコードされるニュー
ラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質ストーク部位をコード
する遺伝子領域が特に好ましい。

【００２１】本発明の組換え型ウイルスに組込むＨＩＶ
の領域としてはＶ１〜Ｖ５領域から選択される。Ｖ１か
らＶ５で表される領域は、いずれも変異率の高い領域で
あるが、これらのうち、Ｖ３領域はＨＩＶの中和エピト
ープおよびＣＴＬエピトープを有し、Ｔ細胞に感染する
際に重要な機能を果たしているから、本発明では、Ｖ３
領域を用いるのが特に好ましい。ここで、「Ｖ３領域」
とは、ＨＩＶ−Ｉ ＩＩＢ ＢＨ１０株のＮ末端シグナ
ル配列が除かれた成熟産物としてのｇｐ１２０のアミノ
酸位置２６６〜３０１の配列に対応する領域をいう。な
お株種によって、そのアミノ酸番号は異なる場合がある
（例えば、Palker et al. (1989) ； Rusche J.R., Jav
aherian K., Mcdanal C., Petro J., Lynn D.L., Grima
lia R.,Langlois A.,Gallo R.C., Arthour L.O., Fisch
inger P.J., Bolognesi D.P., Putney S.D.and Matthew
s T.J. (1988). Antibodies that inhibit fusion of h
uman immunodeficiency virus-infected cells bind a
24-amino acid sequenceof the viral envelope, gp12
0. Proc. Acad. Sci. USA. 85:3198-3202参照）。

【００２２】本発明ではＶ３領域の全核酸配列を用いる
ことが好ましいが、発現されるキメラタンパク質がＨＩ
Ｖの抗原として利用できる限り、Ｖ３領域の部分配列で
あっても使用することができる。具体的には、インフル
エンザウイルスのＮＡストーク領域の核酸配列に組込ま
れる核酸配列としては、（１）配列番号１、２又は３に
記載のアミノ配列をコードする核酸配列；（２）配列番
号１、２又は３に記載のアミノ酸配列において１〜１０
個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、
さらに好ましくは１〜２個のアミノ酸残基が置換、欠
失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列をコー
ドする核酸配列などが用いられる。好ましくは、配列番
号１、配列番号２又は配列番号３で示されるアミノ酸配
列をコードする核酸配列が用いられる。

【００２３】なお、参考のために、図１（Ａ）に、イン
フルエンザウイルスＷＳＮのＮＡタンパク質とそれに対
応するｃＤＮＡの概略図を、図１（Ｂ）に、ＨＩＶ-１
のｇｐ１２０中のＶ１〜Ｖ５領域の位置、ＮＡストーク
領域に挿入されるＶ３領域のアミノ酸配列などを示す。
図１（Ａ）に示されるＮＡストーク領域はＮｓｉＩ切断
部位（１６３番目）とＳｎａＢＩ切断部位（１８２番
目）を有する。また、図１（Ｂ）に示されるＶ３領域
は、３５個のアミノ酸残基を有する。

【００２４】（発現ベクターの構築）本発明で用いられ
る好ましい発現ベクターには、少なくともプロモータ
ー、エイズＶ３領域の全てまたはその部分配列を含むイ
ンフルエンザウイルスＮＡキメラ遺伝子が含まれる。発
現ベクターは好ましくはプラスミドベクターである。発
現プラスミドの作製において有用なベクターとしては、
構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的
プロモーターなどのプロモーターを含むベクターなどが
挙げられる。

【００２５】構成性プロモーターの具体例としては、例
えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来、ラウス肉
腫ウイルス（ＲＳＶ）由来、シミアンウイルス−４０
（ＳＶ４０）由来、あるいは単純ヘルペスウイルス（Ｈ
ＳＶ）由来のプロモーターなどのウイルス由来の強力な
プロモーターが挙げられる。組織特異的プロモーターの
具体例としては、筋βアクチンプロモーターが挙げられ
る。誘導性あるいは調節性のプロモーターとしては、例
えば、成長ホルモン調節性プロモーター、ｌａｃオペロ
ン配列の制御下にあるプロモーター、あるいは抗生物質
誘導性プロモーター、あるいは亜鉛誘導性メタロチオネ
インプロモーターなどが挙げられる。本発明で用いるプ
ロモーターとしては、例えば、Ｔ３ ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーターが好ましい。

【００２６】本発明で用いるベクターは、プロモーター
（例えば、上記の構成性または誘導性プロモーター）Ｄ
ＮＡ配列を含む発現制御配列を含むことが好ましい。ベ
クターはさらに、エンハンサー、転写あるいはポリアデ
ニル化シグナルのスプライシングのためのイントロン配
列などのＲＮＡプロセシング配列、発現タンパク質分泌
のシグナル配列、あるいはＣｐＧモチーフとして知られ
ている免疫刺激ＤＮＡ配列などを含むことができる。

【００２７】本発明の一態様によれば、Enami, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第87巻、3802-3805頁
（1990）に記載されたインフルエンザウイルスＡ／ＷＳ
Ｎ／３３株由来のＮＡ遺伝子を含有するプラスミドｐＴ
３ＮＡｖから本発明の発現ベクターを構築する。該プラ
スミドはプロモーターとして、Ｔ３ ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーターを含む。例えば、（１）部位特異的変
異誘発法を用いて、プラスミドｐＴ３ＮＡｖに制限酵素
ＳｎａＢＩの切断部位を導入し、（２）ＨＩＶ−１の分
離株２０８８Ｅ３１２ｔ（Ｇｅｎｂａｎｋ）に由来する
Ｖ３領域およびその近傍の全ての配列、またはその部分
配列をＰＣＲ法にて増幅し、（３）得られたＰＣＲ断片
を前記プラスミドｐＴ３ＮＡｖのＮＡ遺伝子内の制限酵
素ＳｎａＢＩ切断部位へ挿入することにより、本発明の
発現ベクターとする。

【００２８】（組換え型インフルエンザウイルスの作
製）本発明の組換え型インフルエンザウイルスは公知の
手法に基づいて作製することができる。例えば、Enami,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第87巻、3802-
3805頁（1990）に記載された公知のＷＳＮ−ＨＫリアソ
ータント法を用いて、本発明の組換え型インフルエンザ
ウイルスを作製することができる。

【００２９】図２に本発明の一態様に係る組換え型イン
フルエンザウイルスの作製プロセスを示す。本発明の組
換え型インフルエンザウイルスは、図２に示されるよう
に、以下の工程（１）〜（４）を経て作製される。

【００３０】（１）インフルエンザウイルスのＮＡスト
ークス領域にＨＩＶのＶ３領域を挿入してなるエイズワ
クチン作製用組換え核酸（キメラ遺伝子）を組込んだ発
現ベクターからインフルエンザウイルス遺伝子ＲＮＡを
試験管内で作製する。

【００３１】（２）次に、インフルエンザウイルス核タ
ンパク質とゲノムＲＮＡ複合体（ＲＮＰ複合体）を作製
する。インフルエンザウイルスキメラＲＮＰ複合体は、
ウイルスのポリメラーゼおよび核タンパク質（ＮＰ）存
在下で、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼとＫｓｐ６３２Ｉで
切断した発現ベクターを用いて、試験管内での転写反応
により作製することができる。 （３）次いで、得られたＲＮＰ複合体をヘルパーウイル
スと共に公知のトランスフェクション法（Ciccarone, e
t al., Focus、第21巻、54-55頁（1994）参照）を用い
て細胞に感染させる。 （４）そして、最後に、産生されたインフルエンザウイ
ルスから公知の方法（例えば、Enami, et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA、第87巻、3802-3805頁（1990）参
照）により組換え型インフルエンザウイルスを選択す
る。

【００３２】上記工程（１）〜（４）は、具体的には、
次のようにして行うことができる。まず、Ｋｓｐ６３２
Ｉで切断したプラスミドと、Ｔ３ ＲＮＡポリメラー
ゼ、精製ウイルスＲＮＡポリメラーゼ／ＮＰ、ＮＴＰｓ
とをそれぞれ適量混合し、３７℃で、１０〜６０分間反
応させる。さらに、この反応混合物に、ＲＱ１ ＤＮａ
ｓｅＩを添加し、３７℃、３〜１５分間さらに反応させ
る。その後、この反応混合物に、適量のＯＰＴＩ−ＭＥ
Ｍとリポソーム溶液を混合し、室温で１０〜３０分間放
置し、所望のＲＮＰ複合体を得る。次いで、２４穴プレ
ートで培養したＭＤＢＫ細胞を血清を含まないＭＥＭ培
地で２〜３回洗浄する。ヘルパーウイルスをＭＯＩ０．
００１〜０．１で感染させ、３７℃、３０〜９０分放置
する。細胞を洗浄後、上記ＲＮＰ複合体を含有する溶液
を細胞に添加し、１〜３時間インキュベートする。その
後、上清を除去し、ウイルス増殖培地を適量添加し、３
７℃で、４０〜５０時間培養する。その後、公知の方法
により組換え型インフルエンザウイルスを選択する。

【００３３】上記のようにして得られた組換え型インフ
ルエンザウイルスは、ＲＴ−ＰＣＲ（Reversetranscrip
tase Polymerase Chain Reaction）法、ウェスタン・ブ
ロッティング法などにより確認することができる。例え
ば、該インフルエンザウイルスが感染細胞中に組み込ん
だ遺伝子長に応じたｖＲＮＡを産生することを、公知の
ＲＴ−ＰＣＲ法で確認することができる。プライマーと
しては、ウイルスゲノムの第６分節に由来する配列を含
有する合成ヌクレオチドが用いられる。本発明で用いら
れるプライマーとしては、配列番号：４および配列番
号：５で表される合成ヌクレオチドがあげられる。ま
た、ウェスタン・ブロッティング法による確認の際は、
まず、組換え型インフルエンザウイルス感染細胞の細胞
抽出液を公知の方法を用いて調製する。得られた細胞抽
出液に対して、Ｖ３領域に特異的な抗体を用いてウェス
タン・ブロッティング法を行い、抗体に反応するタンパ
ク質を検出することができる。

【００３４】（エイズワクチン組成物及びその使用方
法）本発明においては、上記のようにして作製された組
換え型ウイルスからなるエイズワクチン又はそれを含む
エイズワクチン組成物が提供される。本発明のワクチン
組成物は、通常、本発明のエイズワクチンと薬学的に許
容可能な担体（トランスフェクション試薬）またはアジ
ュバンドを含有する。本発明で用いる薬学的に許容可能
な担体とは、生体の細胞中にワクチンをトランスフェク
ションするのに適したものである。このような薬学的に
許容可能な担体としては、カチオン性リポソーム、フル
オロカーボンエマルジョン、蝸牛状、筒状剤、金粒子、
生体分解性ミクロスフェア、カチオン性ポリマーなどが
挙げられる。

【００３５】本発明のワクチン組成物を調製するために
用いることができる免疫用アジュバントとして、ワクチ
ン組成物を形成するための公知のアジュバントを用いる
ことができる。本発明で用いられるアジュバントとして
は、免疫用として用いられるＦｒｅｕｎｄの完全アジュ
バントあるいは不完全アジュバントがあげられる。本発
明において用いられるアジュバントとしては、免疫系を
活性化させる、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有す
るミョウバンまたはＤＮＡ分子などを用いることもでき
る。

【００３６】なお、本発明の組換え型インフルエンザウ
イルスは、生ワクチンとして用いることもできるし、不
活性化させた後、不活性ワクチンとして用いることもで
きる。不活性化手段としては、例えば、加熱処理（例え
ば、６０℃、１時間）、紫外線照射、フェノール、ホル
マリンのような化学物質による化学薬剤処理、凍結融解
などの公知の方法が挙げられる。

【００３７】本発明のワクチン組成物は、ヒト又は非ヒ
ト哺乳動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、イ
ヌ、ネコ、サル）に投与してエイズの予防または治療の
ために用いることができる。本発明のワクチンは、カプ
セル剤、懸濁液、エリキシル剤又は溶液のような任意の
投与形態で用いることができる。

【００３８】ワクチンを含む製剤を調製するために担体
物質と組み合わせるべきワクチンの量は、一般的には、
投与経路および投与方法、発現される抗原タンパク質あ
るいはペプチドの安定性および活性（免疫原性）、患者
の性別、年齢、体重、健康状態、予防または治療の対象
となるウイルス性疾患の種類などの種々の要因を考慮し
て決定される。

【００３９】本発明のエイズワクチンの投与は、経口投
与、経鼻投与、経皮投与、皮下注入、皮内導入、経皮圧
入及び他の投与法、例えば、腹腔内、静脈内又は吸入投
与、経口投与でも可能であり、投与経路は特に限定され
ない。経鼻投与（接種）は生体にとって負荷が少ないの
で、特に好ましい。また、追加免疫接種を行うことも可
能である。本発明の組換え型インフルエンザウイルスを
ワクチンとしてヒトに投与する場合、その投与量は、投
与経路、投与方法、発現される抗原タンパク質あるいは
ペプチドの安定性および活性（免疫原性）、患者の性
別、年齢、体重、健康状態、予防または治療の対象とな
るＨＩＶ株の種類などの種々の要因を考慮して決定され
る。本発明のエイズワクチンは、例えば、ＨＩＶ量（ｇ
ｐ１２０換算）として、１〜１０００μｇ、好ましく
は、１０〜５００μｇ、より好ましくは、１５〜５０μ
ｇを１〜２回、１４〜４８日間隔で投与する。

【００４０】本明細書の配列表の配列番号は以下の配列
を示す。 ［配列番号：１］ＮＡストーク部位へ組み込んだＶ３領
域３３アミノ酸の配列を示す。 ［配列番号：２］ＮＡストーク部位へ組み込んだＶ３領
域４４アミノ酸の配列を示す。 ［配列番号：３］ＮＡストーク部位へ組み込んだＶ３領
域５１アミノ酸の配列を示す。 ［配列番号：４］実施例２のＲＴ−ＰＣＲに用いたプラ
イマー１の塩基配列を示す。 ［配列番号：５］実施例２のＲＴ−ＰＣＲに用いたプラ
イマー２の塩基配列を示す。

【００４１】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をより詳細に説
明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【００４２】実施例 １ （１）組換えプラスミドの構築 プラスミドとして、配列番号：１で表されるＶ３領域の
３３アミノ酸配列（TRPNNNTRKSINIGPGRAFYATGEIIGDIRQA
H）および配列番号：３で表される５１アミノ酸配列（Q
LNESVEINCTRPNNNTRKSINIGPGRAFYATGEIIGDIRQAHCNISRAKW
NN）に該当するヌクレオチド配列をそれぞれインフルエ
ンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３株のＮＡストーク部位に
組み込んだプラスミドｐＴ３ＮＡｖＥＮＶ３３およびｐ
Ｔ３ＮＡｖＥＮＶ５１を作製した。これらのプラスミド
は、ＮＡ遺伝子の上流にＴ３ＲＮＡプロモーターを、下
流にＫｓｐ６３２Ｉ部位を含んでいた。具体的には、次
のようにしてプラスミドを構築した。

【００４３】組換えプラスミドを作製するための材料プ
ラスミドとして、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウイ
ルスのＮＡ遺伝子を有するｐＴ３ＮＡｖを用いた（Enam
i, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第87巻、380
2-3805頁（1990）参照）。ｐＴ３ＮＡｖ−ＥＮＶ３３を
構築するために、ｐＴ３ＮＡｖに部位特異的変異誘発法
によってＳｎａＢＩ切断部位を導入した。これによっ
て、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスのＮＡ遺
伝子の１６８番目の核酸位置においてＡがＴに置換され
た。次いで、ＨＩＶ−１分離株２０８８Ｅ３４ｔ（Genb
ank#AB002930）をＰＣＲによって増幅した。反応は、
（１）９４℃、１分、（２）５５℃、２分、７２℃、３
分を３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ断片
はＳｎａＢＩで切断され、ＳｎａＢＩ切断プラスミドに
挿入された。

【００４４】ｐＴ３ＮＡｖ−ＥＮＶ５１を構築するため
に、ｐＴ３ＮＡｖに部位特異的変異誘発法によってＮｓ
ｉＩ切断部位を導入した。これによって、インフルエン
ザＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスのＮＡ遺伝子の１８４番目
の核酸位置においてＣがＧに置換された。次いで、ＨＩ
Ｖ−１分離株２０８８Ｅ３４ｔ（Genbank#AB002930）を
ＰＣＲによって増幅した。反応は、（１）９４℃、１
分、（２）５５℃、２分、７２℃、３分を３０サイクル
の条件で行った。得られたＰＣＲ断片はＮｓｉＩで切断
され、ＮｓｉＩ切断プラスミドに挿入された。ｐＴ３Ｎ
Ａｖ−ＥＮＶ４４も上述した方法に準じて構築した。

【００４５】（２）ＨＩＶ−１のＶ３領域ペプチドを発
現する組換え型インフルエンザウイルスの作製 本実施例においては、上記のようにして得られた組換え
プラスミドを用い、図２に示すプロセスに従って組換え
型インフルエンザウイルスを作製した。

【００４６】まず、２５μｌの生理的条件の反応液中、
Ｋｓｐ６３２Ｉで切断した上記プラスミド２５０ｎｇ、
１５単位のＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ、精製ウイルスＲ
ＮＡポリメラーゼ／ＮＰ（３００ｎｇＮＰ等量／μｌ）
５μｌ、２５ｍＭ ＮＴＰｓを１μｌを混合し、３７
℃、１５分間反応を行った。次いで、この反応混合液
に、０．３単位のＲＱ１ ＤＮａｓｅＩを添加し、３７
℃、５分間さらに反応させた。その後、この反応混合液
に、２５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ、リポソーム溶液５０
μｌを混合し、室温で２０分間放置した。このようにし
て得られた反応溶液１００μｌを細胞へのトランスフェ
クションに用いた。

【００４７】次に、２４穴プレートで培養したＭＤＢＫ
（Madin-Darby bovine kidney）細胞を、血清を含まな
いＭＥＭ培地で２回洗浄した。ＷＳＮ−ＨＫヘルパーウ
イルスをＭＯＩ０．１で感染させ、３７℃、１時間放置
した。なお、ＷＳＮ−ＨＫヘルパーウイルスは、第６分
節ＮＡ遺伝子がインフルエンザＡ／ＨＫ／１／６８で、
その他の分節がＡ／ＷＳＮ／３３から由来している。上
記細胞を洗浄後、上記溶液１００μｌを細胞に添加し、
２時間インキュベートした。その後、上清を除去し、ウ
イルス増殖培地を３００μｌ添加し、３７℃、４６時間
培養した。

【００４８】その後、上記培養上清０．１、１、１０、
１００μｌをそれぞれ１％ ＢＳＡ−ＭＥＭ溶液で全量
３００μｌになるように希釈し、ウイルス液とする。６
穴プレートで培養したＭＤＢＫ細胞を血清を含まないＭ
ＥＭ培地で２回洗浄した後、上記ウイルス液を添加し、
３７℃で１時間放置した。ＭＥＭ培地で２回洗浄後、
０．８％アガロースを含むＭＥＭ培地（トリプシン不
含）を重層し、３７℃で４８〜７２時間放置した。生成
したウイルスプラークをかきとり、組換え型インフルエ
ンザウイルスを単離し、１ｍｌの１％ ＢＳＡ−ＭＥＭ
溶液に懸濁した。次に、１０ｃｍディッシュで培養した
ＭＤＢＫ細胞を血清を含まないＭＥＭ培地で２回洗浄し
た後、５ｍｌのウイルス増殖培地を入れた。そこに上記
ウイルスプラーク懸濁液３００μｌを添加し、３７℃で
４８〜７２時間放置し、さらに発育鶏卵に接種すること
により増殖、生育させた。

【００４９】その結果、（１）ｐＴ３ＮＡｖＥＮＶ３３
に由来する組換え型ウイルスが１株、ｐＴ３ＮＡｖＥＮ
Ｖ５１に由来する組換え型ウイルスが３株得られた。そ
の３株の内訳は、（２）ｐＴ３ＮＡｖＥＮＶ５１から予
測されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をもつ組換
え型ウイルス、（３）アミノ酸配列のうち、ＳＷＡＫＷ
ＮＮを欠失する配列番号：２で表されるアミノ酸配列を
もつ組換え型ウイルス、および（４）アミノ酸配列に一
部点置換変異をもつ組換え型ウイルスであった。（１）
〜（３）の組換え型ウイルスをそれぞれＥＮＶ３３、Ｅ
ＮＶ５１およびＥＮＶ４４と命名した。なお、ＥＮＶ３
３、ＥＮＶ５１およびＥＮＶ４４は、図１に示されるア
ミノ酸配列を含有している。

【００５０】（３）ＲＴ−ＰＣＲによる組換え型インフ
ルエンザウイルスの確認 前記３種の組換え型インフルエンザウイルスはそれぞれ
特定の長さのｖＲＮＡをつくることを、ウイルスゲノム
第６分節の情報に基づいて設計した配列特異的プライマ
ーであるＮＡＥＮＶ−ＮｄｅＩ（プライマー１、配列番
号：４）およびＮＡＥＮＶ−ＮａｒＩ（プライマー２、
配列番号：５）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法で確認した。組
換え型ウイルスおよび野生型ウイルスをＭＯＩ（多重感
染度）０．０７〜１で感染させた２×１０⁶個のＭＤＢ
Ｋ細胞および非感染細胞から全ＲＮＡを抽出し、全量を
２０μｌとした。そのうちの５μｌと１０ｐｍｏｌのプ
ライマー１を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成
した。このｃＤＮＡを鋳型として、プライマー１および
プライマー２を用いてＰＣＲ反応を行った。反応は、
（１）９４℃、３０秒、５５℃、１分、７２℃、１分３
０秒を２５サイクル、（２）４℃で冷却、の条件で行っ
た。コントロールとして、組換えに用いたプラスミドを
鋳型として、同様の条件でＰＣＲ反応を行った。得られ
たＲＴ−ＰＣＲの検出結果を図３に示す。

【００５１】図３に示したように、ＥＮＶ３３、ＥＮＶ
４４及びＥＮＶ５１それぞれに特定の長さのＰＣＲ産物
（それぞれ４４６ｂｐ、５３１ｂｐおよび５５２ｂｐ）
をアガロースゲル電気泳動にて検出した。この結果は、
挿入したアミノ酸数によりＮＡ遺伝子のサイズが異なる
組換えウイルスが、感染細胞内で複製していることを示
している。

【００５２】（４）キメラタンパク質の発現解析 上記のようにして得られた組換え型ウイルス（ＥＮＶ３
３、ＥＮＶ４４及びＥＮＶ５１）および野生型ウイルス
（ＷＳＮ）を感染させたＭＤＢＫ細胞ならびに非感染細
胞の細胞抽出液を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、Ｖ３領域に特異的な抗体を用いてウ
ェスタン・ブロッティング解析を行った。その結果を図
４に示す。図４に示されるように、Ｖ３抗体に反応する
タンパク質を検出した。さらに、この実験においても、
挿入アミノ酸数に応じたタンパク質のバンドのシフトが
観察された。

【００５３】（５）組換え型インフルエンザウイルスの
マウスへの接種実験 上記のようにして作製された組換え型ウイルス（ＥＮＶ
３３、ＥＮＶ４４及びＥＮＶ５１）をＢＡＬＢ／ｃマウ
ス（６〜１０週齢の雄Ｈ−２Ｋ^d）をエーテル麻酔し、
ＰＢＳ（―）で希釈したウイルス液３０μｌ、対照には
ＰＢＳ（−）３０μｌ（１５μｌ／鼻孔）を経鼻接種
し、免疫誘導能の解析を行った。血清はウイルス感染４
週間後にマウスより公知の方法により得た。この血清と
ウイルスのビリオンより精製したＨＡ画分との反応性を
次に示すＥＬＩＳＡ法により解析した。

【００５４】（ＥＬＩＳＡ法）９６ウェルのマイクロタ
イタープレートにウェルあたり１２５ｎｇの抗原をコー
トし、１％ ＢＳＡを含む緩衝液でブロッキング後、５
０倍希釈したウイルス感染マウス血清と反応させた。ア
ルカリホスファターゼ結合抗マウス抗ＩｇＡまたは抗Ｉ
ｇＧ抗体（１０００倍希釈）と反応後、基質液（例え
ば、ｐ−ニトロフェニルホスフェート）を添加すること
により発色させ、波長４０５ｎｍおよび６５０ｎｍにお
ける吸光度を測定した。この測定を２回繰り返し、その
平均値を算出した。得られた結果を図５に示す。

【００５５】図５に示したように、感染マウスの血清中
にＩｇＡが観察され、特に、ＥＮＶ４４の場合、２回接
種の際に、Ｖ３特異的ＩｇＡの産生量が極めて高いもの
であった。

【００５６】（６）ＨＩＶ−１感染の中和活性の検出 ＥＮＶ４４免疫マウスで産生されるＶ３特異的ＩｇＡが
ＨＩＶ−１感染を中和するかを確認した。すなわち、Ｈ
ＩＶ−１ ＩＩＩＢを、組換え型インフルエンザウイル
スＥＮＶ４４を感染させたマウスから得た抗血清と共に
予めインキュベートしてから、ＭＴ−４細胞に感染させ
ることによって確認した。試料とした血液は、切断した
尻尾から採取し、室温で４６時間放置した後、４℃で一
晩インキュベートし、その後、４℃で１０分間、６００
０ｒｐｍで２回遠心分離して得た。得られた試料は、使
用に供するまで−２０℃で保存しておいた。中和活性の
試験をする前に、血清試料を５６℃で３０分処理した。
血清試料（２６μｌ）はＰＢＳ中のＨＩＶ−１溶液２６
μｌに混合し、ＣＯ₂インキュベーター内で３７℃で１
時間インキュベートした。試料の連続希釈液(各ウエル
に１００μｌ)を、２０％ＦＢＳ（１×１０⁴細胞／ウエ
ル）を含有するＲＰＭＩ培地中で、１００μｌのＭＴ−
４細胞に混合した。ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃
で７日間インキュベートした後、ＣＰＥ（細胞変性効
果；cytopathic effect）が現れるか調べた。その結果
を表１に示す。

【００５７】

【表１】 血清番号 血清なし No. 1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 TCID₅₀/ml 4.68x10⁴ - 4.68x10⁴ - 5.20x10³ 1.56x10⁴ 1.56x10⁴ OD_405-650 - 2.35 0.35 2.93 0.68 0.48 0.06

【００５８】表１中、ＴＣＩＤ₅₀は培養細胞に感染させ
たときに、該細胞の５０％に変性効果を生じるウイルス
量を表す。ＯＤ_405-650は波長４０５ｎｍの基質液の吸
光度から波長６５０ｎｍのバックグラウンドを差し引い
た値を示す。また、表中の値で−は、計測範囲外で算出
できなかったことを示す。血清６検体中２検体（血清Ｎ
ｏ．１及びＮｏ．３）は比較的高レベルでＶ３特異的Ｉ
ｇＡを含んでおり、表１に示されるように、これらは比
較的高い中和活性が検出された。この結果は、ＥＮＶ４
４−組換え型インフルエンザウイルスがエイズワクチン
として使用可能であることを示す。

【００５９】（７）Ｖ３特異的ＣＴＬ活性の検出 Ｖ３特異的ＣＴＬ活性を生体内で評価するために、ＢＡ
ＬＢ／ｃマウス（６〜１０週齢の雄Ｈ−２Ｋ^d）を上記
組み換え型インフルエンザウイルス（ＥＮＶ３３、ＥＮ
Ｖ４４及びＥＮＶ５１）に感染させた。感染２週間後の
マウスより脾臓細胞を無菌的に摘出した。ペプチドを前
記細胞懸濁液に添加し、完全培地で全量を２０ｍｌと
し、２ｍｌずつ１２穴プレートに蒔き、６日間、３７℃
で培養したものをエフェクター細胞として用いた。ペプ
チドパルスした標的細胞（ＬＢ２７．４細胞）を⁵¹Ｃｒ
標識した。ペプチドパルスにはＰＲ８ ＨＡおよびＶ３
に対する免疫優位Ｈ−２Ｋ^d拘束性ＣＴＬエピトープ（D
eng Y., et al., 1997 J. Immunol. 158: 1507）の合成
ペプチドを用いた。エフェクター細胞を比率（Ｅ：Ｔ）
が１００：１〜３：１になるように添加し、４時間反応
後にγ線放出を以下の式にて算出した。

【００６０】

【式１】⁵¹Ｃｒ遊離（％）＝１００×［（試料からの遊
離）−（自然遊離）］／［（最大遊離）−（自然遊
離）］

【００６１】式１中、最大遊離および自然遊離は１％
ＮＰ−４０を含有する培地にて標的細胞を培養し算出し
た。

【００６２】得られた結果を、図６に示す。図６に示さ
れるように、ＥＮＶ３３，ＥＮＶ４４及びＥＮＶ５１の
いずれの組換え型ウイルスに感染されたマウスにおいて
も有意のＣＴＬ活性が検出された。

【００６３】

【発明の効果】本発明のエイズワクチンは、ＨＩＶ感染
を中和させることができるので、新規なエイズワクチン
として有効に使用することができる。また本発明のエイ
ズワクチンは、インフルエンザウイルスを利用して作製
した場合には、（１）生ワクチンとして経鼻接種が可能
である、（２）発育鶏卵を用いて、安価に大量生産でき
る、（３）サブタイプを変化させることによる追加免疫
が可能である、（４）ウイルス感染個体において免疫グ
ロブリン、特にＩｇＡの誘導が可能である、（５）細胞
性免疫反応の主体であるＣＴＬ活性誘導能がある、
（６）感染が一過性であるため、安全性が高い、などの
多くの利点を有する。

【００６４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tsukuba Univ. <120> AIDS vaccine <130> P02-0053 <160> 5 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> HIV-1 <400> 1 Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Asn Ile Gly Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala 20 25 30 His <210> 2 <211> 44 <212> PRT <213> HIV-1 <400> 2 Leu Asn Glu Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr 1 5 10 15 Arg Lys Ser Ile Asn Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly 20 25 30 Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Asn 35 40 <210> 3 <211> 51 <212> PRT <213> HIV-1 <400> 3 Leu Asn Glu Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr 1 5 10 15 Arg Lys Ser Ile Asn Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly 20 25 30 Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala 35 40 45 Lys Trp Asn 50 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NAENV-NdeI <400> 4 agctagcata tgaatccaaa ccag 24 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NAENV-NarI <400> 5 cttgtcattc agtaaggc 18

【図面の簡単な説明】

【図１】 （Ａ）はインフルエンザウイルスＷＳＮ株の
ＮＡタンパク質とそれに対応するｃＤＮＡの概略図であ
る。（Ｂ）はＨＩＶ-１のｇｐ１２０中のＶ１〜Ｖ５領
域の位置、ＮＡストーク領域に挿入されるＶ３領域のア
ミノ酸配列などを示す概略図である。

【図２】 本発明の組換え型インフルエンザウイルスの
作製方法の概略を示す。図中、Ｔ３はＴ３ ＲＮＡポリ
メラーゼのプロモーター配列を、ＮＣＳはウイルスの非
コード配列を表す。

【図３】 本発明の組換え型インフルエンザウイルスＥ
ＮＶ３３、ＥＮＶ４４、ＥＮＶ５１のｖＲＮＡを鋳型と
したＲＴ−ＰＣＲの検出結果を示す。

【図４】 実施例の（１）で得られた組換え型ウイルス
を感染させた細胞の抽出液を用いたウェスタン・ブロッ
ティングの結果を示す。インフルエンザウイルス・マト
リックス（Ｍ１）タンパク質を抗ＰＲ８抗体で、またＮ
Ａ−Ｖ３キメラタンパク質を抗Ｖ３抗体で検出した。

【図５】 組換え型インフルエンザウイルス感染マウス
のＩｇＡ産生についてのＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図６】 組換え型インフルエンザウイルスのＶ３特異
的ＣＴＬ活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 渡辺 健 長崎県長崎市本尾町27番地26号 スプリン グヒルズ202 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA35 CA02 EA02 4B065 AA95 AB01 BA02 CA45 4C085 AA03 BA55 BB11 BB23 GG10 4H045 AA10 AA30 BA18 BA19 BA20 CA01 CA05 DA86 EA31

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子変異を起こすウイルスを用いて作
   製される組換え核酸であって、そのウイルスの遺伝子変
   異を起こす領域の核酸配列に、エイズウイルスの遺伝子
   変異を起こす領域の核酸配列又はその部分配列を組込む
   ことにより作製されるエイズワクチン作製用組換え核
   酸。
2. 【請求項２】 遺伝子変異を起こすウイルスがインフル
   エンザウイルスである、請求項１に記載の組換え核酸。
3. 【請求項３】 遺伝子変異を起こす領域がインフルエン
   ザＮＡストーク領域である、請求項１に記載の組換え核
   酸。
4. 【請求項４】 エイズウイルスの遺伝子変異を起こす領
   域がＶ３領域である、請求項３に記載の組換え核酸。
5. 【請求項５】 前記ＮＡストーク領域に組込まれる核酸
   配列が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコード
   する核酸配列と同一、もしくは実質的に同一である、請
   求項４に記載の組換え核酸。
6. 【請求項６】 前記ＮＡストーク領域に組込まれる核酸
   配列が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコード
   する核酸配列である、請求項４に記載の組換え核酸。
7. 【請求項７】 前記ＮＡストーク領域に組込まれる核酸
   配列が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコード
   する核酸配列と同一、もしくは実質的に同一である、請
   求項４に記載の組換え核酸。
8. 【請求項８】 前記ＮＡストーク領域に組込まれる核酸
   配列が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコード
   する核酸配列である、請求項４に記載の組換え核酸。
9. 【請求項９】 前記ＮＡストーク領域に組込まれる核酸
   配列が、配列番号：３で表されるアミノ酸配列をコード
   する核酸配列と同一、もしくは実質的に同一である、請
   求項４に記載の組換え核酸。
10. 【請求項１０】 前記ＮＡストーク領域に組込まれる核
    酸配列が、配列番号：３で表されるアミノ酸配列をコー
    ドする核酸配列である、請求項４に記載の組換え核酸。
11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれかに記載の組
    換え核酸によってコードされるキメラタンパク質。
12. 【請求項１２】 請求項１〜１０のいずれかに記載の組
    換え核酸を含有する発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１０のいずれかに記載の組
    換え核酸をウイルスゲノムに含有することを特徴とする
    組換え型ウイルス。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載のウイルスを含むエ
    イズワクチン。
15. 【請求項１５】 不活性化させた請求項１４に記載のエ
    イズワクチン。
16. 【請求項１６】 請求項１１に記載のキメラタンパク質
    を含むエイズワクチン。
17. 【請求項１７】 請求項１３に記載のウイルスの表面抗
    原タンパク質を含むエイズワクチン。
18. 【請求項１８】 請求項１４〜１７のいずれかに記載の
    エイズワクチンと薬学的に許容できる担体またはアジュ
    バンドとを含むエイズワクチン組成物。
19. 【請求項１９】 経鼻接種される、請求項１８に記載の
    エイズワクチン組成物。
20. 【請求項２０】 エイズワクチン作製用組換えウイルス
    の製造方法であって、（１）ウイルスの遺伝子変異を起
    こす領域の核酸配列に、エイズウイルスの遺伝子変異を
    起こす領域の核酸配列又はその部分配列を組込んだ発現
    ベクターからインフルエンザウイルス遺伝子ＲＮＡを試
    験管内で作製する工程、及び（２）ウイルスのポリメラ
    ーゼおよび核タンパク質存在下で、ＲＮＡポリメラーゼ
    と制限酵素処理した発現ベクターを用いて、試験管内で
    の転写反応によりインフルエンザキメラＲＮＰ複合体を
    作製する工程を含む、エイズワクチン作製用組換えウイ
    ルスの製造方法。
21. 【請求項２１】 さらに、（３）得られたＲＮＰ複合体
    をヘルパーウイルスと共にトランスフェクション法を用
    いて細胞に感染させる工程、及び（４）産生されたイン
    フルエンザウイルスから組換え型インフルエンザウイル
    スを選択する工程を含む、請求項２０記載のエイズワク
    チン作製用組換えウイルスの製造方法。