ES2902787T3 - Vacunas de ADNi y procedimientos para utilizar las mismas - Google Patents

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Abstract

Un vector plasmídico que comprende: (a) ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso que codifica un alfavirus atenuado; y (b) un promotor de la ARN polimerasa eucariota; en el que el ADN que codifica la molécula de ARN infeccioso está unido de forma operativa al promotor de la ARN polimerasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas de ADNi y procedimientos para utilizar las mismas
INTERESES DEL GOBIERNO
Los inventores recibieron material relacionado con la materia de esta solicitud del gobierno de los Estados Unidos en virtud de un acuerdo conforme al 15 U.S.C. § 3710a, por lo que el gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre la materia.
CAMPO
Diversas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a vacunas virales vivas atenuadas y a sistemas y procedimientos para fabricar y administrar dichas vacunas.
ANTECEDENTES
En la discusión que sigue, se hace referencia a ciertas estructuras y/o procedimientos. Sin embargo, las siguientes referencias no deben interpretarse como una admisión de que estas estructuras y/o procedimientos constituyen el estado de la técnica. Los solicitantes se reservan expresamente el derecho a demostrar que dichas estructuras y/o procedimientos no se consideran parte del estado de la técnica.
Muchos virus de ARN, incluido el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), son patógenos humanos peligrosos. La VEE es un patógeno prioritario de categoría B según la clasificación del NIH/NIAID.
El virus VEE es un arbovirus de ARN monocatenario positivo que pertenece al género Alphavirus de la familia Togaviridae . El virus se transmite principalmente por los mosquitos, que pican a un animal infectado y luego pican y se alimentan de otro animal o de un ser humano. En la actualidad, la VEE es poco frecuente en Estados Unidos. En Texas se produjo una importante epizootia en caballos, pero sólo se han documentado aproximadamente 100 casos confirmados en laboratorio en humanos. Sin embargo, el cambio de clima puede favorecer el establecimiento del virus en zonas más cálidas de EE.UU. Además, la VEE es un arma biológica potencial y un agente de bioterrorismo. Los virus vivos atenuados se han desarrollado para servir como vacunas para muchos virus de ARN, como los de la EVE y la FV, la poliomielitis, la gripe, el sarampión, las paperas, la rabia y la rubéola. Las vacunas tradicionales de virus vivos atenuados comprenden virus vivos atenuados de ARN que se inyectan en el receptor de la vacuna. El virus inyectado introduce su genoma de ARN en las células, lo que da lugar a la producción de antígenos virales, así como de virus atenuados progenitores en los tejidos del receptor de la vacuna. Esto conduce a la obtención de una respuesta inmunitaria que protege contra el virus homólogo no atenuado.
SUMARIO
La materia para la que se solicita protección es la definida en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona un vector plasmídico que comprende:
(a) ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso que codifica un alfavirus atenuado; y
(b) un promotor de la ARN polimerasa eucariota;
en el que el ADN que codifica la molécula de ARN infeccioso está unido de forma operativa al promotor de la ARN polimerasa.
La presente invención también proporciona una vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del vector de la invención, que opcionalmente comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona un procedimiento para preparar alfavirus vivos atenuados clonalmente puros, en el que el procedimiento comprende transfectar el vector de la invención en una célula eucariota y aislar virus infecciosos clonalmente puros de un medio de cultivo que comprende la célula eucariota transfectada, obteniendo así virus vivos atenuados clonalmente puros.
La presente invención también proporciona un procedimiento para preparar una vacuna para inmunizar a un mamífero contra un alfavirus infeccioso, en el que el procedimiento comprende transfectar el vector de la invención en una célula eucariota y aislar virus infecciosos clonalmente puros de un medio de cultivo que comprende la célula eucariota transfectada, obteniendo así una vacuna.
La presente invención también proporciona un procedimiento para preparar una célula eucariota transfectada, en el que el procedimiento comprende transfectar el vector de la invención en una célula eucariota para obtener una célula eucariota transfectada.
La presente invención también proporciona una célula eucariota transfectada aislada que comprende el vector de la invención.
La presente solicitud también proporciona vectores que comprenden ADN que codifica una molécula de ARN infecciosa y un promotor de ARN polimerasa eucariota, donde el ADN que codifica una molécula de ARN infecciosa está unido de forma operable al promotor de ARN polimerasa eucariota y la molécula de ARN infecciosa codifica un virus de la encefalitis equina venezolana (VEE). En ciertas realizaciones, el virus VEE no es patógeno. También se describen vacunas para la encefalitis equina venezolana (VEE) que comprenden los vectores descritos anteriormente, y procedimientos para utilizar las vacunas para inmunizar contra un virus de VEE. Aunque no forma parte de la invención, también se divulgan virus vivos atenuados homogéneos y purificados clonalmente, preparados a partir de células cultivadas transfectadas con el vector, vacunas contra la EVE que comprenden los mismos, y procedimientos para utilizar las vacunas para inmunizar contra un virus de la EVE.
La presente solicitud también proporciona vectores que comprenden un ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso y un promotor de la ARN polimerasa del citomegalovirus (CMV), en el que el ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso está unido de forma operativa al promotor de la ARN polimerasa del CMV, el promotor de la ARN polimerasa del CMV está situado entre aproximadamente 12 y aproximadamente 18 residuos de ácido nucleico corriente arriba del extremo 5' de dicho a D n que codifica una molécula de ARN infeccioso, y la molécula de ARN infeccioso codifica un virus de ARN atenuado. El virus de ARN atenuado es un alfavirus.
Esta solicitud también divulga procedimientos para atenuar un virus de ARN, que comprenden la inserción de dos promotores de ARN dependientes en el ADNc que codifica el virus de ARN, por lo que la nucleocápside y las glicoproteínas se expresan por separado a partir de promotores independientes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Representación esquemática de las vacunas VEE TC-83 basadas en el ADNi. (A) El ADNc de longitud completa correspondiente al genoma del ARN TC-83 se clona en el ADN que contiene el promotor funcional de la ARN polimerasa dependiente del ADN, por ejemplo el promotor del CMV. Se muestra la ubicación del promotor del CMV, el promotor del 26S, la poli-A, la terminación de la transcripción y las secuencias de ribozima (opcional). (B) Ejemplo de la vacuna TC-83 modificada, basada en ADNi, en la que los genes de la cápside y de la glicoproteína TC-83 se expresan a partir de promotores independientes. Se muestra la ubicación de los promotores. El sitio de inicio de la transcripción puede modificarse variando la distancia entre el extremo 3' del promotor del CMV y el extremo 5' de la secuencia codificadora del TC-83.
Figura 2. Administración de la vacuna de ADNi del TC-83 en células in vitro o in vivo. Se muestra la inyección de la vacuna de ADNi del TC-83 bajo el control del promotor de la ARN polimerasa dependiente del ADN (véase la figura 1) en células in vitro o in vivo. Como resultado de la administración de la vacuna de ADNi del TC-83, se genera la vacuna de virus vivo atenuado TC-83. Si se administra in vivo, la producción de la vacuna TC-83 en los tejidos del paciente provoca una respuesta inmunitaria a la vacuna TC-83.
Figura 3. Representación esquemática de la vacuna YF17D basada en ADNi. El ADNc de longitud completa correspondiente al genoma del ARN 17D se clona en el ADN que contiene el promotor funcional de la ARN polimerasa, por ejemplo el promotor del CMV. Se muestra la ubicación del promotor del CMV, el poli A, la terminación de la transcripción y las secuencias de ribozimas.
Figura 4. Administración de la vacuna recombinante YF17D ADNi en células in vitro o in vivo. Se muestra la inyección de la vacuna 17D ADNi que contiene YF17D ADNc bajo el control del promotor de la ARN polimerasa dependiente de ADN en células in vitro o in vivo. Como resultado de la administración de la vacuna 17D ADNi, se genera la vacuna de virus vivos atenuados 17D. Si se administra in vivo a los tejidos del receptor de la vacuna, la producción de la vacuna YF17D en los tejidos del paciente conduce a la elicitación de la respuesta inmunitaria a la vacuna 17D.
Figura 5. Ensayo de inmunofluorescencia (IFA) de células CHO transfectadas con (A) la vacuna VEE ADNi del TC-83, Clon 13-2 (Figura 6); y (B) el A d N p3-10 que expresa las proteínas estructurales del TC-83 (control). En el panel (A) es visible un foco de células positivas al TC-83, mientras que el panel (B) muestra células individuales positivas al TC-83. Las células se transfectan con la vacuna de ADN utilizando el reactivo de transfección Fugene 6 o un procedimiento de transferencia de genes similar. Las células transfectadas se incuban a 37°C en un incubador con un 5% de CO2. Tras 24 horas de incubación, las células se fijan con acetona fría y se realiza la IFA con un anticuerpo de conejo específico para el antígeno TC-83. A continuación, se incuban las células con un anticuerpo conjugado con rodamina para IgG de conejo y se observan mediante microscopía fluorescente.
Figura 6. Fragmento de secuencia de ADNi del plásmido pAA_TC83 (Clones #13-1; 13-2) que contiene el ADNc de TC-83 corriente abajo del promotor de c M v (SEQ ID NO: 1). Se indican las ubicaciones del promotor del CMV, del promotor del 26 S y del sitio poliA.
Figura 7. Fragmento de secuencia de ADNi del plásmido pAA_TC-83_C_GP modificado (Clon #12) que contiene dos promotores TC-83 26S (SEQ ID NO: 2). Se indican las ubicaciones del promotor CMV, los promotores 26S y el sitio poliA.
Figura 8. Fragmento de secuencia de ADNi de pCMV_YF17D que contiene el ADNc de YF17D corriente abajo del promotor de CMV y los casetes de terminación de la transcripción del ribozima de la hepatitis a y de poliadenilación de BGH corriente abajo del extremo 3' de la secuencia de YF17D (SEQ ID NO: 3).
Figura 9. Optimización de la distancia entre el extremo 3' del promotor del CMV y el extremo 5' del ADNc del TC-83 mediante un ensayo de encapsulamiento utilizando vectores HA- o N- y auxiliares c de ADN.
Figura 10. La transfección de células CHO con ADNi del TC-83 #13-1 (tipo salvaje) da lugar a una rápida expresión del antígeno TC-83 en las células CHO.
Figura 11. La transfección de células CHO con ADNi del TC-83 #12 (doble promotor 26S) da lugar a una expresión retardada del antígeno TC-83 en las células CHO.
Figura 12. Los virus TC-83 generados a partir de clones infecciosos in vitro son avirulentos en ratones BALB/c. Los virus TC-83 clonados se generaron por transfección de células CHO mediante electroporación con los clones de ADNc de la vacuna TC-83 infecciosa #12 y #13-1. Los virus se inocularon en ratones según el protocolo estándar del USAMRIID (Dr. Michael Parker, USAMRIID, Ft. Detrick, MD).
Figura 13. Oligonucleótidos sintéticos de diferentes longitudes (SEQ ID NOS: 4-14, de arriba a abajo) para crear una serie de plásmidos de "ADNi de cápside" en los que la distancia entre el promotor y el ADNi varía de 8 a 25 pares de bases (véase el ejemplo 8). La A en mayúsculas y en negrita muestra el extremo 5' de la secuencia VEE (en el TC-38, el codón de inicio es ATA en lugar de ATG; véanse los nucleótidos ATA en las posiciones 704-706 de la SEQ ID NO: 1).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En el presente documento se describen composiciones para provocar una respuesta inmunitaria o una inmunidad protectora contra los virus de la encefalitis equina venezolana (VEE). En una realización, las composiciones comprenden vacunas para prevenir y/o tratar las enfermedades asociadas al virus de la VEE. También se describen procedimientos de fabricación, uso y prueba de los mismos.
La vacuna TC-83 viva atenuada, derivada de cultivos celulares, para la EVE ha sido desarrollada previamente. El TC-83 contiene mutaciones atenuantes (Kinney et al., 1993). La actual vacuna TC-83 está plenamente autorizada para su uso veterinario en caballos y se utilizó con éxito durante la epizootia de Texas de 1970-1971. La vacuna también ha sido aprobada para su uso en personas como nuevo fármaco de investigación (IND). La vacuna TC-83 proporciona protección contra muchas cepas epizoóticas. La vacuna TC-83 se ha utilizado como parte de los programas de seguridad y ha sido importante para proteger a las personas que trabajan con animales infectados y preparaciones de virus. Hasta la fecha, la vacuna se ha administrado a -9.000 personas. Otra vacuna IND humana, la C-84, se ha preparado a partir de la vacuna TC-83 inactivada con formalina. Debido a la historia de su uso exitoso como vacuna en personas, la vacuna TC-83 es también un vector vacunal prometedor, que puede ser utilizado como portador de genes terapéuticos o relevantes para la vacuna (Pushko P., Solicitud de patente de EE.UU. n° 2006/0198854, Plataformas vectoriales derivadas de las vacunas contra el alfavirus).
En el presente documento se describen moléculas de ADNi que expresan el genoma de ARN de virus vivos atenuados y procedimientos para utilizarlas. En ciertas realizaciones, cuando el ADNi se inyecta en las células cultivadas in vitro, el ARN del virus vivo atenuado se genera en las células por transcripción in vivo. Esto inicia la producción de virus atenuados progenie en el medio de las células cultivadas. Estos virus vivos atenuados homogéneos y clonalmente puros pueden utilizarse para la vacunación como vacuna viva atenuada mejorada y homogénea. En otras realizaciones, cuando el ADNi se inyecta en las células de un receptor de la vacuna, el ARN del virus vivo atenuado se genera por transcripción in vivo en los tejidos. Esto inicia la producción de progenie de virus atenuados en los tejidos del receptor de la vacuna, así como la provocación de una respuesta inmunitaria eficaz al virus vivo atenuado. Al igual que cualquier ADN, el ADNi puede fabricarse en células bacterianas y representa una molécula estable.
En ciertas realizaciones, las moléculas de ADNi son vectores que comprenden ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso, donde la molécula de ARN infeccioso codifica a su vez un virus VEE. El ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso puede estar vinculado de forma operativa a un promotor de ARN polimerasa eucariota, y generalmente se modifica para codificar un virus de VEE no patógeno (atenuado).
En ciertas realizaciones, las moléculas de ADNi (ADN infeccioso) comprenden el ADNc de VEE TC-83. Por ejemplo, una vacuna ejemplar contra la EVE basada en el ADNi comprende una molécula de ADN que contiene la copia completa de ADNc del genoma de ARN del virus vivo atenuado TC-83. En esta molécula de ADNi, el ADNc del TC-83 se coloca a continuación de un promotor de la ARN polimerasa eucariota, como el promotor del CMV. Cuando dicha molécula de ADNi se introduce en las células in vitro, el ARN viral TC-83 se genera en las células. El ARN TC-83 resultante es "infeccioso" e inicia la producción de la vacuna de virus vivo atenuado TC-83 en las células. Dicha vacuna del virus TC-83 puede obtenerse a partir de células cultivadas y utilizarse para la vacunación de acuerdo con las prácticas actuales. En ciertas realizaciones, la vacuna que se genera a partir del ADNi del TC-83 representa una progenie viral homogénea generada a partir del mismo ADN estable y bien caracterizado. Debido a que se utiliza el mismo ADNi purificado clonalmente para la producción de los lotes de vacunas, dicha vacuna tendrá, en ciertas realizaciones, una mayor uniformidad y consistencia de lote a lote en comparación con las vacunas actuales, que pueden acumular mutaciones durante los pasajes del virus.
Alternativamente, la vacuna de ADNi que contiene el ADNc de TC-83 puede ser administrada al receptor de la vacuna directamente. Esta administración de ADNi al receptor de la vacuna inicia la producción de la vacuna del virus TC-83 en los tejidos del paciente in vivo, lo que proporciona una vacunación exitosa contra la EVE.
El ADNc del TC-83 puede modificarse para asegurar una atenuación suficiente y/o para introducir otras características, manteniendo la infectividad y el efecto terapéutico deseado. En ciertas realizaciones, el ADNc se modifica mediante la inserción, la supresión y/o la sustitución de uno o más de los nucleótidos de la secuencia del ADNc del TC-83. Por ejemplo, el ADNc modificado puede tener al menos un 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de identidad de secuencia con la secuencia TC-83, tal como al menos un 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia.
Los ejemplos de ADNc modificados incluyen un ADN que tiene un promotor 26S adicional en el clon 12 de ADNi del TC-83 modificado (véase el ejemplo 3, Tabla I). Esta modificación ralentiza el desarrollo de los focos positivos al TC-83, lo que es un signo de la atenuación adicional causada por la inserción del promotor 26S adicional en este constructo (Figura 1, B). Esta atenuación adicional puede mejorar la vacuna TC-83 y reducir los efectos adversos asociados a esta vacuna. En este ejemplo, se podría insertar un promotor 26S adicional para que la nucleocápside del TC-83 y las glicoproteínas se generen a partir de promotores independientes (Figura 1B). Así, el promotor TC-83 26S se duplica, y la cápside y las glicoproteínas se generan a partir de los dos promotores 26S. Se pueden realizar otras modificaciones para aumentar la estabilidad del ADNi en E.coli o en las células diana, o para aumentar la estabilidad del ADNi en las células E.coli.
Adicionalmente, otros genes o fragmentos de genes, incluyendo material genético de otros alfavirus, o de fuentes no relacionadas como otros virus, bacterias, microorganismos, otros organismos, plantas, animales o/y humanos podrían ser insertados en el ADNi. En estos casos, el ADNi del TC-83 modificado podría servir como vector para la expresión de genes heterólogos in vitro o in vivo.
En el presente documento se describen vectores especializados para la preparación de vacunas de ADNi. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán que el ADNi descrito en el presente documento puede formarse utilizando cualquier vector adecuado. En general, un vector es una molécula de ácido nucleico (normalmente ADN o ARN) que sirve para transferir una secuencia de ácido nucleico pasajera (es decir, ADN o ARN) a una célula huésped. Tres tipos comunes de vectores son los plásmidos, los fagos y los virus. En una realización ejemplar, el vector es un plásmido. Las presentes vacunas de ADNi pueden estar compuestas por ADN que se produce como un plásmido que puede introducirse en el tejido animal y en el que se expresa por las células animales para producir una molécula de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de aproximadamente el tamaño del genoma de la VEE, que se traduce para producir poliproteínas virales. Las poliproteínas virales, a su vez, son procesadas por la maquinaria celular para proporcionar un conjunto completo de proteínas de VEE que son capaces de iniciar la replicación del transcrito de ARN primario anterior y, por lo tanto, iniciar el ciclo de replicación del virus en el tejido animal en el que se introdujo el plásmido de ADN anterior.
Los vectores plasmídicos adecuados y ejemplares que se han utilizado en las vacunas de ADN convencionales incluyen, pero no se limitan a pBR322 (At Cc # 31344); pUC19 (ATCC# 37254); pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad Calif.
92008; Cat. NO. V385-20); pNGVL (National Gene Vector Laboratory, University of Michigan, Mich.); p414cyc (ATCC# 87380), p414GALS (ATCC# 87344), pBAD18 (ATCC# 87393), pBLCAT5 (ATCC# 77412), pBluescriptIIKS, (ATCC# 87047), pBSL130 (ATCC# 87145), pCM182 (ATCC# 87656), pCMVtkLUC (ATCC# 87633), pECV25 (ATCC#77187), pGEM-7zf (ATCC# 87048), pGEX-KN (ATCC# 77332), pJC20 (ATCC# 87113, pUB110 (ATCC# 37015), pUB18 (ATCC# 37253).
El ADNi descrito en el presente documento también está bajo el control de un promotor eucariota adecuado. Para la expresión eucariota, algunos ejemplos de promotores adecuados son el promotor temprano del citomegalovirus ("CMV"), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous ("RSV") y el promotor SV40.
A continuación se describen procedimientos ejemplares para fabricar vectores y vacunas de ADNi:
El fragmento de ADNc correspondiente al ARN de TC-83 de longitud completa se obtiene mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) utilizando el ARN viral de TC-83 y los cebadores oligonucleótidos específicos de TC-83. El ARN viral del TC-83 se extrae de la vacuna TC-83 mediante la extracción con fenol u otros procedimientos. Los cebadores de oligonucleótidos específicos del TC-83 pueden contener elementos funcionales adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, sitios de enzimas de restricción, terminadores de transcripción, señales de poliadenilación, ribozimas, etc.
Alternativamente, se generan dos o más fragmentos de ADNc que abarcan todo el ARN del TC-83 mediante RT-PCR. A continuación, dichos fragmentos de ADNc se ensamblan dentro de un único plásmido, de modo que comprenden el ADNc de longitud completa correspondiente al ARN TC-83 de longitud completa, como se describe en el párrafo anterior.
Alternativamente, el ADNc del TC-83, como se describe en los párrafos anteriores, se genera utilizando la síntesis química o una combinación de síntesis química o/y PCR o/y RT-PCR.
El fragmento de ADNc correspondiente al ARN de longitud completa se clona en el ADN que contiene un promotor funcional de la ARN polimerasa, por ejemplo el promotor del CMV (Figura 1A). Se muestra un ejemplo de dicha secuencia de ADNi recombinante resultante (Figura 6). Como resultado de la transcripción in vitro o in vivo de dicho ADNi, se genera un ARN infeccioso funcional de TC-83 que contiene una o más mutaciones atenuantes. La distancia entre el promotor y el ADNc del TC-83 puede optimizarse para garantizar el nivel deseado de expresión del ARN. En ciertas realizaciones, la distancia entre el extremo 3' de GAGCTC del promotor del CMV (indicado en el nucleótido (nt) 687 con una flecha en la Figura 6), y el extremo 5' del ADNc del TC-83 (indicado en el nucleótido 703 con otra flecha en la Figura 6), es de 15(±3) pares de bases (pb). Esto permite una transcripción y producción eficiente del ARN TC-83. A modo de comparación, según Invitrogen, el sitio de inicio de la transcripción del CMV estaría situado en el nt 697, que se encuentra a 9 nt del extremo GAGCTC 3' del promotor del CMV dentro del plásmido pcDNA3.1(-). Del mismo modo, el extremo 3' del ADNc del TC-83 puede ser seguido por ribozimas, secuencias de terminación de la transcripción, poli-A, así como otros nucleótidos y señales para asegurar la producción óptima de ARN funcionalmente activo. En una realización preferida, la distancia entre el extremo 3' del ADNc TC-82 (nt 12170, Figura 6) y el sitio poli-A es de 184 pb y puede variar entre 0 a aproximadamente 500 pb.
Alternativamente, la nucleocápside del TC-83 y las glicoproteínas se expresan a partir de promotores independientes (Figura 1B).
El plásmido ADNi recombinante resultante que contiene el ADNc del TC-83 bajo el control del promotor de la ARN polimerasa (Figura 1A,B) se genera y purifica a partir de células E. coli. A continuación, el ADNi purificado se introduce en células eucariotas cultivadas, por ejemplo en células de ovario de hámster chino (CHO), riñón de hámster bebé (BHK-21) u otras células susceptibles (Figura 2). El ADN se administra a las células por inyección, pistola de genes, electroporación, transfección de liposomas u otro procedimiento de transferencia de genes. En las células, el ARN infeccioso de TC-83 de longitud completa se genera por transcripción, lo que inicia la producción del virus vivo atenuado TC-83 en las células cultivadas y la liberación del virus TC-83 en el medio (Figura 2). El virus TC-83 se extrae de los cultivos celulares, se formula y se utiliza como vacuna contra la VEE según la práctica actual.
Alternativamente, el ADNi recombinante que contiene el ADNc del TC-83 (Figura 1) se introduce en el receptor de la vacuna directamente in vivo. El ADNi se administra en los tejidos receptores de la vacuna mediante inyección, electroporación, transfección con liposomas, pistola de genes u otro procedimiento de transferencia genética. En los tejidos del receptor de la vacuna, el ARN infeccioso de TC-83 de longitud completa se genera por transcripción, lo que inicia la producción del virus vivo atenuado TC-83 in vivo. Los antígenos del virus TC-83 se liberan de las células in vivo en los tejidos, lo que inicia la inducción de una respuesta inmunitaria eficaz a la vacuna TC-83.
En ciertas realizaciones de la divulgación, los procedimientos descritos en el presente documento comprenden la administración de una composición o una vacuna de ADN que comprende ADNi que codifica para un virus VEE atenuado en un portador farmacéutico aceptable a un sujeto que lo necesita.
La cantidad de ADNi presente en las composiciones o en las vacunas de ADN descritas en el presente documento es preferentemente una cantidad terapéutica o farmacéuticamente eficaz. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de ADNi es la cantidad necesaria para que la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de VEE desempeñe su función inmunológica sin causar efectos excesivamente negativos en el huésped al que se administra la composición. La cantidad exacta de plásmido que se utilizará y la composición/vacuna que se administrará variará en función de factores como la fuerza de los promotores transcripcionales y traslacionales utilizados, el tipo de afección que se trate, el modo de administración, así como los demás ingredientes de la composición. En una realización, la composición o la formulación de la vacuna comprende desde aproximadamente 1 ng hasta aproximadamente 1 mg de plásmido.
La inmunogenicidad de las vacunas de ADN y las composiciones farmacéuticas puede modificarse mediante la formulación con uno o más adyuvantes o inmunoestimulantes farmacéuticamente aceptables, como el interferón alfa beta-interferón, gamma-interferón, factor estimulador de colonias de macrófagos de granulocitos ("GM-CSF"), factor estimulador de colonias de macrófagos ("M-CSF"), interleucina 2 ("IL-2"), interleucina 12 ("IL-12") y oligonucleótidos CpG. Para preparar dichas composiciones, se pueden utilizar procedimientos bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, el ADNi se genera en las células de E.coli como un ADN plasmídico, que contiene motivos CpG no metilados y constituye en sí mismo una molécula inmunoestimulante que activa el sistema inmunitario a través de los receptores tipo Toll.
También son adecuadas la inyección subcutánea, la introducción intradérmica, la impresión a través de la piel y otros modos de administración, como la administración intraperitoneal, intravenosa, oral o por inhalación. Por ejemplo, los vectores que contienen el ADNi pueden introducirse en el huésped deseado mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, la transfección, la electroporación, la microinyección, las micropartículas, las microcápsulas, la transducción, la fusión celular, el dextrano DEAE, la precipitación de fosfato de calcio, la lipofección (fusión de liposomas), el uso de un cañón de genes (bombardeo de partículas) o un transportador de vectores de ADN (véase, por ejemplo, Wu etal., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967 Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624).
Tal y como se utiliza en este documento, el término "tratar", "tratamiento" y similares se utilizanen el presente documento para significar generalmente la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado, y se refieren a un proceso por el cual los síntomas de una enfermedad asociada a la VEE se eliminan completamente o se mejoran en cualquier grado clínico y/o cuantitativamente medible. El término "prevenir" se refiere a un proceso por el cual se obstruye y/o retrasa una enfermedad asociada a la VEE. Las composiciones y vacunas descritas en el presente documento comprenden ADNi (ADNi) capaz de producir un virus vivo atenuado. En una realización, el virus vivo atenuado se produce in vivo.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "respuesta inmunitaria" incluye una respuesta de células T, un aumento de los niveles séricos de anticuerpos contra un antígeno, la presencia de anticuerpos neutralizantes contra un antígeno (como un polipéptido de VEE) o combinaciones de los mismos. El término "protección" o "inmunidad protectora" incluye la capacidad de los anticuerpos séricos o la respuesta de las células T inducida durante la inmunización para proteger (parcial o totalmente) contra la enfermedad o la muerte causada por los virus de la VEE.
El "sujeto" es un vertebrado, como un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, a los seres humanos, otros primates, roedores, animales de granja, animales deportivos (caballos, etc.) y mascotas. En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano o un caballo. En otras realizaciones, los procedimientos encuentran su uso en animales de experimentación (como todas las especies de monos), en aplicación veterinaria y/o en el desarrollo de modelos animales para enfermedades. En ciertas realizaciones, la vacuna es una vacuna contra la EVE (como la TC-83) y el sujeto es un caballo. Un "sujeto que lo necesita" se refiere a cualquier sujeto, paciente o individuo que pueda beneficiarse de los procedimientos descritos en el presente documento.
El término "dosis terapéuticamente (o "farmacéuticamente") eficaz" o "cantidad terapéuticamente (o "farmacéuticamente") eficaz" significa una dosis o cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La dosis exacta dependerá de la finalidad del tratamiento y podrá ser determinada por un experto en la materia mediante técnicas conocidas.
El término "farmacéuticamente aceptable" significa que ha sido aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o que figura en la Farmacopea de los Estados Unidos o en otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente, en humanos.
El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el ADNi. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como el agua y los aceites, incluidos los de origen petrolero, animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite mineral, el aceite de sésamo, combinaciones de los mismos y similares. Entre los excipientes farmacéuticos adecuados se encuentran el almidón, la glucosa, la lactosa, la sacarosa, la gelatina, la malta, el arroz, la harina, la tiza, el gel de sílice, el estearato de sodio, el monoestearato de glicerol, el talco, el cloruro de sodio, la leche desnatada en polvo, el glicerol, el propileno, el glicol, el agua, el etanol, combinaciones de los mismos y similares. La composición, si se desea, puede contener también pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tampones del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, combinaciones de las mismas y similares. La composición puede formularse como supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales como los triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir portadores estándar como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, combinaciones de los mismos, etc. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin.
Por lo tanto, tal como se utiliza en el presente documento, el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa, pero no se limita a, un vehículo para contener el ADNi que puede ser inyectado en un huésped mamífero sin efectos adversos. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, partículas de oro, agua estéril, solución salina, glucosa, dextrosa o soluciones tamponadas, combinaciones de las mismas y similares. Los portadores pueden incluir agentes auxiliares que incluyen, pero no se limitan a, diluyentes, estabilizadores (es decir, azúcares y aminoácidos), conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes tampones del pH, aditivos que mejoran la viscosidad, colores, combinaciones de los mismos y similares.
Tal y como se utilizan en el presente documento, las formas singulares "un", "una, uno" y "el, la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "vacuna" incluye una pluralidad de tales vacunas y la referencia a "la doficiación" incluye la referencia a una o más dosificaciones y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, etc.
Las publicaciones comentadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo expuesto en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la presente divulgación no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una divulgación anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas reales de publicación, que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Aunque la divulgación se ha descrito en detalle con referencia a ciertas realizaciones de la misma, será evidente para un experto en la materia que se pueden hacer varios cambios, y emplear equivalentes, sin apartarse del alcance de la divulgación. Además, los siguientes ejemplos son ilustrativos de los procedimientos descritos en el presente documento y no deben considerarse como una limitación de la divulgación anterior de ninguna manera.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Preparación de ADNi del TC-83. El ARN total se extrae de la vacuna TC-83 mediante extracción con fenol. El ADNc correspondiente al ARN del TC-83 de longitud completa se obtiene mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) utilizando el ARN viral del TC-83 extraído y los cebadores oligonucleótidos específicos de la secuencia del TC-83.
El fragmento de ADNc correspondiente al ARN TC-83 de longitud completa se clona en el vector plasmídico pASP5 que contiene un promotor CMV funcional (Figura 1A, Figura 6), que produce el ADNi del TC-83, clon 13-1 y clon 13­ 2. La distancia entre el extremo 3' del promotor del CMV y el extremo 5' del ADNc del TC-83 es de 15 pb, como se muestra en la Figura 6. Tras la transcripción de dicho ADNi del TC-83 in vitro o in vivo por la maquinaria de transcripción celular, se generan ARN infecciosos funcionales del TC-83 y virus del TC-83.
El ADNi del TC-83 puede ser fácilmente modificado para optimizar las características funcionales, por ejemplo, el nivel de atenuación. Por ejemplo, el ADNc TC-83 modificado, clon 12, se genera duplicando el promotor 26S y colocando el segundo promotor 26S corriente arriba de los genes de la glicoproteína TC-83 (Figura 1B, Figura 7). En dicho constructo, el ARN que se genera a partir del promotor del CMV expresa la cápside del TC-83 y las glicoproteínas a partir de promotores 26S independientes. Para asegurar la expresión de las proteínas TC-83 a partir de dicho ARN TC-83 modificado, se realizan los cambios adecuados, por ejemplo, se introduce el codón ATG en el extremo 5' de los genes de la glicoproteína. El ARN de longitud completa que codifica el ADNc del TC-83 modificado (clon 12) se introduce en el vector plasmídico reivindicado pASP5 que contiene el promotor funcional del CMV (Figura 1B, Figura 7), La distancia entre el extremo 3' del promotor del CMV y el extremo 5' del ADNc del TC-83 modificado es de 15 pb, como se muestra en la Figura 7.
Ejemplo de referencia 2. Preparación del ADNi YF17D. El ARN total se extrae de la vacuna YF17D mediante la extracción con fenol o un procedimiento similar. El ADNc correspondiente al ARN de 17D de longitud completa se obtiene por transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) utilizando el ARN viral de 17D extraído y los cebadores oligonucleótidos específicos de la secuencia de 17D. Alternativamente, el ADNc de YF17D de longitud completa se ensambla a partir de dos o más plásmidos.
El fragmento de ADNc correspondiente al ARN de longitud completa se transfiere al vector plasmídico reivindicado pASP5 que contiene un promotor CMV funcional (Figura 3), lo que da lugar al ADNi YF17D (Figura 8). La distancia entre el extremo 3' del promotor del CMV y el extremo 5' del ADNc del YF17D es de 15 pb, como se muestra en la Figura 8 y se ha descrito anteriormente para las construcciones del TC-83. Tras la transcripción del ADNi de YF17D en células in vitro o in vivo, se generan ARN infecciosos funcionales de YF17D y virus de YF17D.
Ejemplo 3. Transfección de células CHO con la vacuna de ADNi del TC-83. El ADN del plásmido que contiene ADNi del TC-83 se transfecta en células CHO utilizando el reactivo de transfección Fugene 6 (Roche Applied Sciences). En resumen, las células CHO se cultivan en frascos de 75 cm2, luego se enjuagan con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se tripsinizan. Se transfiere una alícuota de la suspensión de células CHO a placas de cultivo celular de 6 pocillos. A continuación, se añade la mezcla de ADN plasmídico y el reactivo Fugene 6 según las instrucciones del fabricante. Como ADN plasmídico, se utilizan los siguientes constructos:
(1) ADNi del TC-83 modificado de VEE , clon 12 (Figura 1B, Figura 7);
(2) VEE ADNi del TC-83, Clon 13-1 (Figura 1A, Figura 6);
(3) VEE ADNi del TC-83, Clon 13-2 (Figura 1A, Figura 6);
(4) Como control, se utiliza el ADN p3-10 que expresa únicamente las proteínas estructurales TC-83.
Como control adicional, se utilizan células CHO no transfectadas (5). Los ADNi (1) a (3) contienen el ADNc completo del TC-83 y se espera que generen virus vivos del TC-83. Como se ha descrito anteriormente, el ADNi del clon 12 (1) contiene un promotor 26S duplicado para expresar la cápside del TC-83 y las glicoproteínas de dos promotores 26S independientes (Figura 1B). Por el contrario, el ADN (4) sólo contiene un fragmento de TC-83 correspondiente únicamente a los genes estructurales del TC-83 y no se espera que genere virus TC-83 vivos.
Una alícuota (0,3 ml) de células CHO transfectadas de placas de 6 pocillos se siembra en portaobjetos de 8 pocillos. Las células CHO transfectadas se incuban a 37°C en un 5% de CO2. La mortalidad celular se determina diariamente en placas de 6 pocillos mediante microscopía visual. El ensayo de inmunofluorescencia (IFA) se realiza a las 24 horas después de la transfección utilizando portaobjetos de cámara de 8 pocilios con antisuero que reconoce los antígenos TC-83, según el procedimiento descrito en Pushko et al. (1997). Los resultados se muestran en la Tabla I. Las células transfectadas con ADNis (1) a (3) mueren en los 5 días posteriores a la transfección, mientras que las células CHO con transfecciones de control (4) y (5) permanecen vivas. Además, se detectan focos de células que expresan antígenos TC-83 mediante IFA a las 24 horas post-tansfección en las células transfectadas con los ADNs (2) y (3), indicando así la presencia del virus TC-83 vivo (Figura 5). El resultado indica que la introducción de vacunas TC-83 basadas en ADNi en células cultivadas dio lugar a la producción de virus TC-83 vivos.
Tabla I. Transfección de células CHO con el ADNi de la vacuna TC-83
Figure imgf000009_0001
Ejemplo de referencia 4. Transfección de células BHK-12 con la vacuna YF17D ADNi. En resumen, el ADN plasmídico que contiene ADNi de YF17D se transfecta en células cultivadas (CHO, BHK-21, o líneas celulares similares) y se ensaya utilizando procedimientos estándar como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla II. El ensayo de placa se utiliza para determinar el título del virus YF17D vivo generado en las células transfectadas con el plásmido ADNi. Estos resultados indican que la introducción de la vacuna 17D basada en el ADNi en células cultivadas da lugar a la síntesis de ARN específico del virus y a la producción de virus YF17D vivos (Tabla II).
Tabla II. Transfección de células BHK-21 con ADN plasmídico que contiene YF17D ADNi
Figure imgf000009_0002
Ejemplo 5. Infección de células CHO con el virus TC-83 derivado de células transfectadas con ADNi. Para confirmar que el virus TC-83 vivo se genera en las células transfectadas con el ADN del plásmido que contiene el ADNc TC-83 completo, se recoge el medio de las células transfectadas (véase el ejemplo 3) y se utiliza para infectar células CHO frescas. Las células CHO frescas se infectan en portaobjetos de cámara de 8 pocillos con medios diluidos a 100 veces cosechados de las células transfectadas, y la expresión de los antígenos TC-83 se detecta por IFA a las 24 horas postinfección (Tabla III). Los resultados indican que los medios de las células transfectadas con vacunas TC-83 basadas en ADNi contienen virus TC-83 vivos e infecciosos.
Tabla III. Infección de células CHO frescas con medio recogido de células CHO transfectadas con ADNi que contiene el ADNc de longitud completa de la vacuna TC-83 a partir del promotor del CMV*
Figure imgf000010_0001
Ejemplo 6. Vacunación de ratones con la vacuna de ADNi del TC-83. Los ratones experimentales (BALB/c, C57BL/6, Swiss Webster no consanguíneos u otra cepa susceptible) se inyectan por vía intramuscular, subcutánea e intradérmica con una dosis de cada vacuna de ADNi del TC-83 (clones 12, 13-1, 13-2, como se indica en la Tabla I) que oscila entre 1 ng y 1 mg. Las vacunas ADNi del TC-83 se aíslan de E.coli como ADN plasmídico mediante el procedimiento de aislamiento de ADN libre de Endo de Promega. En 30 días, los animales reciben una segunda dosis idéntica de la vacuna de ADNi del TC-83. Las muestras de suero de los animales anestesiados se toman del seno retroorbital en los días 0, 30 y 60. La respuesta inmunitaria se determina mediante procedimientos inmunológicos estándar, incluida la determinación de los anticuerpos séricos contra los antígenos del TC-83 en el suero de los animales vacunados mediante ELISA. Se detectan anticuerpos séricos contra los antígenos del TC-83, lo que sugiere una vacunación exitosa con la vacuna de ADNi del TC-83.
Ejemplo de referencia 7. Vacunación de ratones con la vacuna YF17D ADNi. Los ratones experimentales (BALB/c, C57BL/6, Swiss Webster no consanguíneos u otra cepa susceptible) se inyectan por vía intramuscular, subcutánea e intradérmica con una dosis de cada vacuna de ADNi 17D (véase la secuencia de ADN en la figura 7) que oscila entre 1 ng y 1 mg. La vacuna de ADNi 17D se aísla de E.coli como ADN plasmídico mediante el procedimiento de aislamiento de ADN libre de Endo de Promega. En 30 días, los animales reciben una segunda dosis idéntica de la vacuna 17D ADNi. Las muestras de suero de los animales anestesiados se toman del seno retroorbital en los días 0, 30 y 60. La respuesta inmunitaria se determina mediante procedimientos inmunológicos estándar, incluida la determinación de los anticuerpos séricos contra los antígenos YF 17D en el suero de los animales vacunados mediante ELISA. Se detectan anticuerpos séricos contra los antígenos de YF, lo que sugiere una vacunación exitosa con la vacuna de ADNi YF17D.
Ejemplo 8. Optimización de la distancia entre el extremo 3' del promotor del CMV y el extremo 5' del ADNc mediante el ensayo de encapsidación utilizando vectores HA o N y los auxiliares c de ADN .
Para que el ADNi funcione con éxito, es importante conseguir una transcripción eficiente del ARN TC-83 funcional y de longitud completa a partir del plásmido de ADNi. Por lo tanto, es importante optimizar la transcripción incluyendo la distancia entre el final del promotor y el inicio del ADNc, con el fin de maximizar la eficacia de la síntesis del ARN funcional. Construimos un "pequeño ADNi" que codifica únicamente el gen de la cápside del virus TC-83, incluyendo las regiones reguladoras. Todos los demás genes TC-83 se eliminan de dicho "ADNi de la cápside". A continuación, insertamos oligonucleótidos sintéticos de distintas longitudes (véase la figura 13) entre el promotor del CMV y el "ADNi de la cápside" utilizando el sitio SacI en el extremo 3' del promotor del CMV. Así, se fabrica una serie de plásmidos de "ADNi de la cápside" en los que la distancia entre el promotor y el ADNi varía de 8 a 25 pares de bases. Cada constructo de ADNi de la cápside se transfecta por electroporación en células CHO junto con (1) ARN de la GP y (2) ARN del vector HA. El ARN auxiliar de GP codifica las glicoproteínas TC-83, mientras que el ARN del vector de HA codifica el gen HA de la gripe. En las células CHO cotransfectadas, la cápside TC-83 y las proteínas GP encapsulan el vector HA en partículas de un solo ciclo. Mediante la valoración de dichas partículas utilizando el ensayo de inmunofluorescencia (IFA) y el antisuero de HA, se detecta el título de las partículas. En este sistema, el nivel de expresión de la cápside a partir del "ADNi de la cápside" es un factor limitante y afecta al título de las partículas.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un vector plasmídico que comprende:
(a) ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso que codifica un alfavirus atenuado; y
(b) un promotor de la ARN polimerasa eucariota;
en el que el ADN que codifica la molécula de ARN infeccioso está unido de forma operativa al promotor de la ARN polimerasa.
2. El vector de la reivindicación 1, en el que la molécula de ARN codifica un virus no patógeno.
3. El vector de la reivindicación 1, en el que la molécula de ARN codifica un virus atenuado de la encefalitis equina venezolana (VVEE)
4. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el promotor de la ARN polimerasa es un promotor del citomegalovirus (CMV), opcionalmente en el que el promotor del CMV está situado de aproximadamente 12 a aproximadamente 18 residuos de ácido nucleico corriente arriba del extremo 5' del ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso.
5. El vector de la reivindicación 4, en el que el promotor del CMV está situado 15 residuos de ácido nucleico corriente arriba del extremo 5' del ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso, opcionalmente en el que el vector es el vector pASP5.
6. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el vector comprende una cola poli-A corriente abajo del ADN que codifica la molécula de ARN infeccioso, opcionalmente en el que la cola poli-A está situada entre 0 a aproximadamente 500 residuos de ácido nucleico corriente abajo del extremo 3' del ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso.
7. Una vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que opcionalmente comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
8. Un procedimiento para preparar virus vivos atenuados clonalmente puros, en el que el procedimiento comprende transfectar el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en una célula eucariota y aislar virus infecciosos clonalmente puros de un medio de cultivo que comprende la célula eucariota transfectada, obteniendo así virus vivos atenuados clonalmente puros.
9. La vacuna de la reivindicación 7 para su uso en la inmunización de un mamífero contra un alfavirus infeccioso.
10. La vacuna para su uso según la reivindicación 9, en la que el mamífero es un humano o un caballo.
11. Un procedimiento de preparación de una vacuna para inmunizar a un mamífero contra un alfavirus infeccioso, en el que el procedimiento comprende transfectar el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en una célula eucariota y aislar virus infecciosos clonalmente puros de un medio de cultivo que comprende la célula eucariota transfectada, obteniendo así una vacuna.
12. Un procedimiento para preparar una célula eucariota transfectada, en el que el procedimiento comprende transfectar el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en una célula eucariota para obtener una célula eucariota transfectada.
13. Una célula eucariota aislada transfectada que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
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