CN105311032B

CN105311032B - Tlr7激动剂与酪氨酸激酶抑制剂联用在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN105311032B
Application number: CN201510755384.2A
Authority: CN
Inventors: 靳广毅; 高宁宁; 王竹林
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2015-11-09
Publication date: 2018-09-25
Anticipated expiration: 2035-11-09
Also published as: CN105311032A

Abstract

本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，具体公开了TLR7激动剂与酪氨酸激酶抑制剂联用在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的TLR7激动剂具有式(Ⅰ)所示的结构；所述的酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼，具有(II)所示的结构。实施例中的实验结果表明TLR7激动剂联合拉帕替尼治疗小鼠乳腺癌模型呈现了显著的协同治疗效果。

Description

TLR7激动剂与酪氨酸激酶抑制剂联用在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，具体涉及TLR7激动剂与酪氨酸激酶抑制剂联用在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

肿瘤治疗不仅是世界性的难题，同时也是医学界面临的一项重大挑战。临床中应用的肿瘤治疗主要是去除肿瘤固体块，通过外科手术、物理治疗和化学治疗。物理治疗和化学治疗在杀伤大量癌细胞的同时，也使得机体的正常细胞大量被杀伤，且严重破坏免疫系统，这让患者抗癌能力大大降低，剩余的耐药性癌细胞会变得更加疯狂增殖，且有继发性的可能。同时放、化疗不仅会给患者带来巨大痛苦，还会引起一系列的毒副反应。这些传统的治疗方法，在肿瘤治疗历史上具有重要的作用，但随着科学飞速发展，其局限性也日渐凸显，对于新的肿瘤诊疗方法的探求迫在眉睫。

最近，在对肿瘤发病机制的深入了解中促进了一种新的治疗方案，如肿瘤免疫治疗联合靶向药物治疗。肿瘤免疫治疗分为三种类型：非特异性免疫疗法、主动免疫疗法及被动免疫疗法，机理都是一种通过增强和激发机体的免疫功能，来达到杀灭和控制肿瘤细胞的免疫疗法。但是，对于晚期实体肿瘤疗效来说，单纯的免疫疗法的治疗方式可行性存在异议，因为其只能清除少量、离散的肿瘤细胞。而靶向药物治疗是通过与肿瘤发生、发展过程中的特定分子靶点的作用来阻止肿瘤细胞的生长。但肿瘤容易出现耐药变异，导致疾病逐渐进展。免疫治疗是刺激宿主的免疫反应，达到长期的肿瘤抑制，而靶向治疗是抑制维持肿瘤生长的至关重要的分子通路。因此，两者联合十分有可能有效的改善临床结果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中抗肿瘤药物治疗的不足，提供TLR7激动剂与酪氨酸激酶抑制剂联用在肿瘤治疗中的应用。

本发明所要解决的技术问题，通过以下技术方案予以实现：

本发明提供一种TLR7激动剂与酪氨酸激酶抑制剂联用在肿瘤治疗中的应用，所述的TLR7激动剂具有式(Ⅰ)所述的结构；所述的酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼，具有(II)所示的结构：：

本发明发明人通过反复摸索和大量实验，令人惊奇地发现，将式(Ⅰ)所示的TLR7激动剂与拉帕替尼联用，具有很好的协同抗肿瘤作用。

所述的拉帕替尼(Lapatinib，LA)，中文名称为二对甲苯磺酸，中文别名为N-(3-氯-4-((3-氟苯基)甲氧基)苯基)-6-(5-(((2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲基)-2-呋喃基)-4-喹唑啉胺二对甲苯磺酸盐。所述的拉帕替尼的结构式如式(II)所示。

本发明还提供一种TLR7激动剂与酪氨酸酶抑制剂联用在治疗肿瘤中的应用，所述的酪氨酸酶抑制剂为拉帕替尼，所述的TLR7激动剂具有式(Ⅰ)所示的结构。

本发明还提供一种TLR7激动剂与酪氨酸激酶抑制剂联用作为NF-κB信号通路激活剂的应用，所述的酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼，所述的TLR7激动剂具有式(Ⅰ)所示的结构。

本发明还提供一种TLR7激动剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的TLR7激动剂具有式(Ⅰ)所示的结构。其作用机理为激活细胞内的受体TLR7，进而触发下游的免疫反应。

本发明再提供一种抗肿瘤药物组合物，所述的组合物含有TLR7激动剂和酪氨酸激酶抑制剂，所述的酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼，所述的TLR7激动剂具有式(Ⅰ)所示的结构。

优选地，在所述的抗肿瘤药物组合物中，TLR7激动剂与拉帕替尼的质量比为1～100:1～100。

进一步优选地，TLR7激动剂与拉帕替尼的质量比为1～50:1～50。

更进一步优选地，，TLR7激动剂与拉帕替尼的质量比为1～25:1～25。

最优选地，TLR7激动剂与拉帕替尼的质量比为1:10～25。

优选地所述的抗肿瘤药物组合物，还包含可接受的药用载体，制成各种药学上可接受的制剂。

优选地，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、食管癌、大肠癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、肾癌、或头颈癌。

附图说明

图1为TLR7激动剂(T7)与两种TKI(拉帕替尼，LA、舒尼替尼,Suni)联合治疗小鼠肿瘤的效果图。(*表示p<0.05，**表示0.05<p<0.01)

图2为TLR7激动剂(T7)与两种TKI(拉帕替尼，LA、舒尼替尼,Suni)联合刺激小鼠脾淋巴细胞诱导TLR7蛋白水平表达变化和NF-κB信号通路的胞浆中P65、IκBα及胞核中P65蛋白水平表达变化图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1TLR7激动剂与酪氨酸激酶抑制剂联合的抗肿瘤实验

(1)实验动物及其饲养

雌性4周龄Balb/c近交系小鼠(体重16±20g)，购自广东省实验动物中心。实验过程中，小鼠饲养于深圳大学医学部SPF级动物房。

(2)构建小鼠乳腺癌模型

1)取对数期生长的4T1细胞，用0.25％胰酶消化细胞，加入10％FBS的完全培养基终止消化，然后用完全培养基制成细胞悬液，调整细胞浓度为2×l0⁶个/ml。

2)取30只健康Babl/c纯系小鼠，雌性，4周龄，体重(16±20g)，将2×10⁵个(0.1ml)4T1小鼠乳腺癌细胞皮下注射接种于每只小鼠大腿部位，3-5天全部小鼠可触及皮下结节，1周左右肿瘤长至时认200mm³为模型成功，开始抑瘤实验。

(3)小鼠随机分组，抑瘤实验开始

将30只小鼠随机分组，每组5只。实验动物组：1)T7联合拉帕替尼组:T7,5mg/kg/3天、拉帕替尼，40mg/kg/天；2)T7联合舒尼替尼组:T7,5mg/kg/3天、舒尼替尼，10mg/kg/2天；3)阴性对照组：0.1ml/PBS/天；4)T7组：5mg/kg/3天；5)拉帕替尼组：40mg/kg/天；6)舒尼替尼组：10mg/kg/2天。(上述T7是本发明式Ⅰ所示TLR7激动剂的简称，下同)。

抑瘤实验开始时，所有动物给予自由饮食、饮水，每天观察动物活动、毛发、其他一般状况及瘤大小。

实验结果：随着抑瘤实验的进行后，开始时小鼠活动状态基本无明显变化，肿瘤多为圆形或椭圆形，大小均一，后期药物干预后肿瘤开始逐渐不规则，且大小不一，其中对照组肿瘤体积增长最为迅速，抑瘤结果如(图1)所示，发现所有治疗组中T7联合拉帕替尼组的肿瘤大小为最有疗效组(差异有统计学意义，p<0.05)，比其单药组肿瘤小很多，呈现了显著的协同治疗效果，而T7联合舒尼替尼组的肿瘤比其单药组肿瘤大，呈现拮抗的治疗效果。

实施例2Western blot检测TLR7激动剂与酪氨酸激酶抑制剂联合刺激小鼠免疫细胞后TLR7蛋白水平的表达及NF-κB信号通路的活化实验

实验共分7组，空白对照组和阳性对照组(R848)、T7(10μM)组、T7(10μM)联合拉帕替尼(2μM)组、T7(10μM)联合舒尼替尼(5μM)组、拉帕替尼(附图中简写成LA)(2μM)组、苏尼替尼(附图中简写成Suni)(5μM)组，并且每个实验重复3次。

接种细胞：取4-6周Balb/c小鼠，脱颈处死在700mL的75％乙醇中浸泡5min，无菌条件下分离出小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，调整细胞数为5×l0⁶个/孔置于6孔培养板中，每孔体积为5ml。

药物作用：实验组加入T7组终浓度为10μM、T7联合拉帕替尼组T7终浓度为10μM，拉帕替尼终浓度为2μM、T7联合舒尼替尼组中T7终浓度为10μM，舒尼替尼终浓度为5μM、拉帕替尼组终浓度为2μM、舒尼替尼组终浓度为5μM，同时设立空白对照组。

培养细胞：将24孔培养板移入CO₂培养箱中，37℃、5％CO₂条件下培养24h。

蛋白提取、定量：24h后终止培养，收集细胞，用PBS清洗一遍。依照细胞核与细胞浆蛋白抽提试剂盒步骤提取出胞核蛋白、胞浆蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，蛋白样品于-80℃保存备用。

Western blot步骤：

1)蛋白提取、定量：24h后终止培养，收集细胞，用PBS清洗一遍。用细胞抽提试剂盒提取细胞总蛋白，-80℃保存备用(BCA法测定蛋白浓度)。

2)制备10％分离胶：超纯水(1.9ml)，30％丙烯酰胺(1.7ml)，1.5mol/L/PH＝8.8的Tris-HCl(1.3ml),10％SDS(0.05ml),10％过硫酸铵(0.05ml)，TEMED(0.002ml)。所有液体混匀后向胶模内缓慢注入分离胶，预留2cm左右的空间给浓缩胶，上层覆盖无水乙醇。静置约20至25min。

3)制备5％浓縮胶：超纯水(1.4ml),30％丙烯酰胺(0.33ml)，1mol/L/PH＝6.8的Tris-HCl(0.25ml,),10％SDS(0.02ml),10％过硫酸铵(0.02ml)，TEMED(0.002ml)用枪吹打混匀后向分离胶上端缓慢注入浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，注意勿产生气泡，静置约15至20min。浓缩胶凝固后，轻轻用手将梳子拔出。用超纯水冲洗一遍，以去除加样孔残留的丙烯酰胺。

4)SDS-PAGE电泳：将凝胶放入电泳槽，上下槽内注入电泳液，将上样缓冲液(6×)与前述的蛋白样品混匀，沸水中煮5min使蛋白变性，蛋白上样量为50μg/孔(加样孔的最大体积限度为20μl)，然后开始凝胶电泳(浓缩胶电压60V，分离胶110V)，电泳至溴酚蓝条带跑出后终止，进行转膜。

5)转膜：根据凝胶大小切1张PVDF膜(甲醇浸润1min)、准备6张定性滤纸(厚度为3mm)和凝胶一起浸入转膜液中5min。转膜夹中的顺序：滤纸(3张)—膜—凝胶——滤纸(3张)叠好，确保无气泡(若有，轻轻用玻棒擀去气泡)，将夹子放入转膜槽中，使夹子的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。于冰浴恒流300mA电转2h。

6)丽春红染色与脱色：转完后将做好标记PVDF膜用1×丽春红染液染5min，呈现红色蛋白条带后用TBST洗涤至脱色。

7)封闭：将洗涤好的PVDF膜置于5％BSA中，摇床孵育90min。

8)孵育一抗：倒掉封闭液，用TBST洗涤10min，重复洗3次，加入1:1000稀释的一抗，4℃过夜或摇床孵育4h。

9)孵育二抗：弃掉一抗，PVDF膜用TBST洗涤3次，每次10min，加入含过氧化物酶标记的二抗，稀释度1:1000，摇床孵育90min。

10)显色：弃掉二抗，PVDF膜用TBST洗涤3次，每次10min，加入化学发光剂作用1min，于化学发光成像系统一体机自动曝光。

实验结果：拉帕替尼、舒尼替尼分别与T7联合刺激小鼠脾淋巴细胞24h后，抽提胞浆、胞核蛋白，经Western blot检测胞核中P65及胞浆中TLR7、P65、IκBα蛋白表达水平如图2所示，发现T7诱导脾淋巴细胞中TLR7蛋白表达水平明显增加，T7联合拉帕替尼后，TLR7蛋白表达水平与T7组相比无明显变化，但舒尼替尼的引入，抑制了T7诱导脾淋巴细胞中TLR7蛋白表达；机理方面，T7促进NF-κB三聚体的整体表达水平，所以其活化程度大大高于空白对照组，T7联合拉帕替尼组跟空白对照组相比，促进了NF-κB三聚体的整体表达水平，活化程度相应升高，T7联合舒尼替尼抑制TLR7表达，并抑制NF-κB信号通路的活化。

Claims

1.TLR7激动剂与酪氨酸激酶抑制剂联用在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为乳腺癌，所述的TLR7激动剂具有式(Ⅰ)所示的结构；所述的酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼，具有式(II)所示的结构：

2.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤为乳腺癌，含有TLR7激动剂和酪氨酸激酶抑制剂，所述的酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼，所述的TLR7激动剂具有式(Ⅰ)所示的结构：

3.根据权利要求2所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，TLR7激动剂与拉帕替尼的质量比为1～100:1～100。

4.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，TLR7激动剂与拉帕替尼的质量比为1～50:1～50。

5.根据权利要求4所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，TLR7激动剂与拉帕替尼的质量比为1:10～25。

6.根据权利要求2所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的组合物还包含可接受的药用载体，制成各种药学上可接受的制剂。