CN105820973B - 一种粘质沙雷氏菌菌苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌菌苗，其活性成分为粘质沙雷氏菌的生物学纯培养物；所述粘质沙雷氏菌已于2016年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.11987。本发明还公开了该粘质沙雷氏菌菌苗的制备方法，由上述粘质沙雷氏菌的生物学纯培养物通过适当的分离方法获得；所述的适当的分离方法为：4000‑6000rpm离心30‑60min，弃上清，将沉淀进行灭活处理，再离心，弃上清，洗涤，离心沉淀，配制即得。采用本发明的制备方法生产的产品，得率稳定，重现性好，抑瘤作用强，脾激活强，其它各项指标均符合质量标准要求。本发明提供的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)菌苗对各类实体瘤具有明显的预防和治疗作用；而且该粘质沙雷氏菌菌苗为灭活的菌苗，安全无毒副作用。

Description

一种粘质沙雷氏菌菌苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种粘质沙雷氏菌菌苗及其制备方法与应用，具体涉及该粘质沙雷氏菌菌苗的制备及其在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

背景技术

WHO《全球癌症报告2014》数据显示，2012年全球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，2012年全世界共新增1400万癌症病例并有820万人死亡。预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，2025年将达到1900万人，2035年将达到2400万人。新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位。

中国肿瘤登记中心2014年数据显示，我国癌症发病人数占全世界1/5，中国肿瘤死亡人数占1/4；每分钟有6人诊断为癌症，有5人死于癌症。2012年中国每年新增癌症病例约350万，约有270万人死亡。在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)又称灵杆菌，是一种产生鲜红色素的细菌，其形态多样，广泛分布于自然界中，是水和土壤中的常居菌群。国内外对粘质沙雷氏菌的研究较早，研究大多以粘质沙雷氏菌作为工程菌，用于灵菌红素的制备。还有一些报道(专利2012103989308)将粘质沙雷氏菌用于防治白蚁；以及利用粘质沙雷氏菌制备生物染料(专利2012101038897)；但在抗肿瘤方面并不属于粘质沙雷氏菌的热门研究领域，目前有关粘质沙雷氏菌的研究主要有：1997年靳小青等发现粘质沙雷氏菌S311抑制小鼠艾氏腹水癌，小鼠P388白血病，小鼠B16黑色素瘤肺转移和小鼠Lewis肺癌肿瘤细胞；2003年靳小青采用小鼠模型研究粘质沙雷氏菌苗的抑制肿瘤的效果，提示腹腔注射可明显抑制小鼠HCA的原发灶和转移灶、抑制肿瘤转移和复发。1993年Havas HF首先将粘质沙雷氏菌复方制剂用至临床11例难治性恶性肿瘤，发现1例轻微反应，1例部分反应，4例病情暂时稳定，5例病情进展，其中一例艾滋病Kaposi's肉瘤患者病情得到改善。1999年徐永茂等通过胸、腹腔内注射观察了粘质沙雷氏菌S311的疗效，发现在5例癌性胸水患者中4例完全缓解，在9例癌性腹水患者中5例完全缓解。2000年顾建庆将粘质沙雷氏菌S311制剂进行了Ⅰ期临床试验，结果提示制剂对胸水有效。2000年张沂平临床资料报道粘质沙雷氏菌S311制剂对恶性胸腔积液有效率为88.6％，完全缓解率48.6％，尤其对少、中量积液疗效较好。2001年朱允中在Ⅱ临床试验中对241恶性胸水做了观察，总有效率92.1％，且部分胸水癌细胞转阴。2002年茅国新报道粘质沙雷氏菌制剂控制癌性胸腔积液有效率达90.6％，生活质量改善率为84.4％，0.5年、1年、1.5年生存率分别是：93.8％、62.5％、40.6％，毒副反应为胸痛(18.8％)和发热(15.6％)。2007年王庆蓉对18例脑神经胶质细胞瘤术后患者进行观察，采用化疗囊瘤内注射，发现1、2、4年的生存率分别为72.2％、55.68％、55.68％，高于对照组。2002年何晓文采用改良端粒重复序列扩增(TRAP)-银染方法检测20例膀胱移行上皮细胞癌肿瘤组织粘质沙雷氏菌制剂灌注前后的端粒酶活性，发现粘质沙雷氏菌制剂可使肿瘤组织端粒酶活性降低。

但上述诸多的研究却终因疗效不够突出，或具有一定的毒副作用，或受限于菌株的扩大培养工艺无法实现工业化，至今也没有发展成为真正的临床药物，而一直停留在基础研究阶段，严重制约了粘质沙雷氏菌在抗肿瘤方面的临床应用。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种粘质沙雷氏菌菌苗及其制备方法与应用。

本发明是基于发明人的前期研究，以源自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的粘质沙雷氏菌(保藏号：CGMCC1.0589)作为出发菌株，经紫外诱变获得一株新菌株(保藏号为CGMCC NO.11987)，研究发现其具有广谱的抗肿瘤活性，并以该菌株作为研究的基础，进行了一系列的技术扩展研究。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种粘质沙雷氏菌菌苗，其活性成分为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的生物学纯培养物。

本发明的沙雷氏菌(Serratia sp.)SM-1，已于2016年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.11987。

该菌株的形态学特征为：革兰氏阴性杆菌，大小为1.5～0.6um，周身鞭毛，有动力，无荚膜及芽孢。普通肉汤琼脂培养基(pH7.2-7.4)生长良好，菌落乳白色，无异味，呈圆形、光滑、隆起、边缘整齐。

生理生化特性为：发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷，产酸不产气；不发酵鼠李糖、阿拉伯糖、蜜二糖，能产生胞外脱氧核糖核酸酶。

4～28℃培养产生红色色素，但37℃培养不产生色素，而把培养温度从37℃降低到28℃培养又可产生红色色素。

根据本发明的第二方面，提供上述粘质沙雷氏菌菌苗的制备方法，由粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的生物学纯培养物通过适当的分离方法获得。

所述的适当的分离方法可以为：4000-6000rpm离心30-60min，弃上清，将沉淀进行灭活处理，再离心，弃上清，洗涤，离心沉淀，配制即得。

所述灭活处理的方法为：以0.5％甲醛溶液于37℃悬浮灭活48h。

再离心的转速为5000rpm，离心时间为30min。

所述洗涤采用的是无菌生理盐水，目的是去除甲醛残余。

上述方法中，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的生物学纯培养物的制备方法为：将粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)斜面菌种的单菌落接种于LB液体培养基上，摇床发酵培养；发酵培养的条件为：LB液体培养基pH6.0-8.0，接种量为8-15％，通气量40-90％，培养温度32-39℃，培养时间16-26h，转速120-200rpm。

优选的，LB液体培养基pH7.2-7.4，接种量为10％，通气量75％，培养温度37℃，培养时间21h，转速180rpm。

所述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)斜面菌种的制备方法为：将保藏号为CGMCC NO.11987的粘质沙雷氏菌菌种接种于克氏瓶LB琼脂培养基(pH6.0-8.0)上，连续1-2次传代接种，菌种传代不超过5代，32-39℃培养16-26h。

优选的，克氏瓶LB琼脂培养基pH7.2-7.4，37℃培养21h。取出，置-80℃冰箱中贮存备用。

根据本发明的第三方面，提供一种组合物，其包含本发明第一方面的粘质沙雷氏菌菌苗。

上述组合物，可以进一步包含药物学上可接受的载体。

所说的载体是指药学领域常规的载体，如稀释剂、分散剂、稳定剂等。

上述组合物可以以常规的方法制备成各种剂型，优选的为：注射液制剂或冻干粉针。

上述注射液制剂中，粘质沙雷氏菌菌苗的重量含量为0.1-99.9％，优选的含量为0.5-90％。

根据本发明的第四方面，提供上述粘质沙雷氏菌或菌苗或组合物在制备预防和/或治疗下述之一或更多的疾病的制剂中的应用；

所述疾病包括：喉癌、骨肉瘤、胃癌、肺腺癌、肺癌、胰腺癌、腹腔间皮瘤、卵巢癌、多发性肝转移瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、鼻咽癌、卵巢囊腺癌、食道癌、恶性黑色素瘤、膀胱癌、恶性神经胶质瘤、肺小细胞未分化癌、肺鳞癌、肝癌、大肠癌、胸腺癌、甲状腺癌、淋巴瘤和纵膈肿瘤。

本发明的粘质沙雷氏菌菌苗的作用机理为：

粘质沙雷氏菌的细胞壁拥有直接细胞毒(DCX)类脂物质，可以诱导肌体内产生高水平的肿瘤坏死因子TNF、干扰素IFN、白介素IL-1、白介素IL-2及粒细胞刺激因子GCSF等多种免疫调节因子，对单核巨噬系统具有广泛的激活作用，是一种很好的人体免疫调节剂；可以充分调动病人自身抵抗力以达到积极治疗的效果。该制剂与其他菌苗类内源性免疫调节剂的一个根本性区别，就在于该制剂细胞壁含有其他菌株没有的直接细胞毒(DCX)，对肿瘤细胞和其他异变细胞有很强的亲和作用，经过网状淋巴系统的吞噬、转化、释放，产生直接杀灭癌细胞作用，而不损伤正常细胞。具体从以下三个方面说明：

(1)直接杀伤癌细胞

大量的研究表明，在粘质沙雷氏菌的细胞壁含有其他菌株所没有的细胞毒物质(DCX)，局部注射后与肿瘤细胞接触并通过吞噬、转化作用，破坏癌细胞的RNA合成过程，使肿瘤组织软化，随后崩裂坏死。临床上可见注射部位癌细胞膨胀、空泡化、软化，并呈现崩死状态。

(2)抗癌活性高

在与多种菌苗的比较中发现，L-天门冬酰胺酶、56KD蛋白酶、核酸酶、核糖核酸酶及直接细胞毒DCX类脂物质，是粘质沙雷氏菌抗癌菌苗所特有的，抗癌活性高。脂多糖诱导吞噬细胞活性、TNF、IL-2、IFN-r、NK细胞活性，通过诱导内源性免疫活性物质起到抗肿瘤的作用。纯化的DCX对肿瘤的体外杀伤可以达到ng级水平。56KD蛋白酶瘤内注射可以使肿瘤完全退化，动物试验可全部获得长期存活。

(3)宿主中介作用

粘质沙雷氏菌抗癌菌苗的临床效果，主要是通过宿主中介作用即非特异性免疫增强作用产生的。当其注入体内之后，通过宿主中介作用，启动体内的细胞免疫和体液免疫，使体内肿瘤坏死因子、干扰素、白细胞介素等细胞因子水平显著提高，包围、浸润和牢固地粘附在肿瘤细胞上，使肿瘤细胞变性和凋亡坏死。同时由于肿瘤细胞RNA合成过程受到活化了的炎症细胞有意义的抑制，当局部注射药后，注射部位产生炎症反应后随着炎症的消退，可看到肿瘤缩小。这些被激活了的免疫系统和炎症细胞等一起从免疫学方面有效地抑制肿瘤细胞的增加，并使之破坏，同时在病人的预后方面有着重要意义。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种新的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)抗癌菌苗，选择粘质沙雷氏菌的优质菌种，根据细菌生长快，无荚膜及芽孢，易于培养繁殖的生物学特性，确定了粘质沙雷氏菌的生物学纯培养物的制备方法，并对制备方法的各个环节，包括传斜面条件、培养发酵条件、各阶段的培养基、发酵液、C、N源及其比例、pH变化、温度时间、通气量、转速和方式等，均进行了优化研究，采用本发明的制备方法生产的产品，得率稳定，重现性好，抑瘤作用强，脾激活强，其它各项指标均符合质量标准要求，实现了将新型粘质沙雷氏菌由基础研究阶段向临床应用的突破。

附图说明

图1：进化树示意图。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：菌株的筛选

1.出发菌株筛选

菌种源自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的粘质沙雷氏菌，保藏号：CGMCC1.0589，无菌条件下，取原菌种10倍梯度稀释后分别涂布在LB斜面培养基上37℃培养24h。选择菌落数目约为20个的平板，挑取较大、界限清晰、呈乳白色长势良好的单菌落作为紫外诱变的出发菌株，取其菌体于生理盐水和玻璃珠的三角瓶中制成无菌菌悬液500mL，30℃、250rpm水浴4h，制备成10⁶CFU/mL的诱变菌悬液，备用。

2.菌株诱变及致死率的确定

紫外灯预热25min，分别取诱变菌悬液10mL置于多个平板(D＝9cm)中，均匀放置紫外灯下25cm处照射不同的时间(0，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60s)，然后分别从每个平板中取出1mL的菌悬液以生理盐水定容至10mL，逐级稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍，取各个梯度的稀释液100uL在暗处涂布于平板固体培养基上，37℃培养24h后取出，挑取长势良好的菌落，试管斜面固体培养基保存，进行高产菌株的筛选。同时，用未照射的菌悬液做空白对照，计算紫外诱变致死率。

致死率＝紫外诱变菌悬液的菌落数/未诱变菌悬液的菌落数。

3.高产菌株的筛选

3.1.平板初筛

根据紫外诱变选取照射25-30s的诱变菌悬液生理盐水稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍，分别涂布于平板固体培养基，37℃培养24h。以菌落大小和生长状态为观测指标选取单菌落35株，试管斜面传代3次后，稳定生长的共6株，分别命名为SM1-6。

3.2.摇瓶复筛

①菌种：SM1、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6。

②方法：将上述菌株与出发菌株SM0分别按10％的接种量，置于装有LB液体培养基的三角瓶(25mL/100mL)中，37℃培养21h，摇床转速180rpm。

3.3.菌体浓度的测定

采用比浊法测定菌体浓度，取1mL发酵液用无菌蒸馏水稀释10倍，以未接种的培养基做等量稀释作对照，在650nm波长处测定细胞悬浮液的光密度(OD)值。

3.4.菌种保藏

经过复筛所得粘质沙雷氏菌高产优良菌株试管斜面保存于-80℃冰箱。

4.结果分析

4.1.菌种诱变结果

粘质沙雷氏菌菌悬液于紫外灯下25cm处照射不同的时间，得到诱变时间与致死率的关系，见表1。

表1紫外诱变与致死结果

据文献报道，紫外诱变通常在偏低剂量中出现正突变，偏高剂量中出现负突变。前人研究多倾向于低剂量处理细胞，一般致死率控制在70-80％之间。本实验采用的照射时间为0-60s，结果表明：粘质沙雷氏菌在紫外照射25-30s范围内致死率为70-80％。

4.2.高产菌株稳定性筛选结果

经紫外诱变筛选的SM1、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6稳定性较好的六株菌，与出发菌株SM0同时进行摇瓶复筛，其中菌株SM1摇瓶发酵得到菌体生物量(细菌数)为10.65亿/mL，高于其他菌株；并于冰箱-80℃中保藏，定期传代(25d传代一次)。

表2六株粘质沙雷氏菌摇瓶复筛菌体生物量比较结果

4.3.传代稳定性

将菌株SM-1连续传60代，仍符合粘质沙雷氏菌特性，说明菌株SM-1具有传代稳定性。

4.4. 16S rDNA测序

对菌株SM-1的16S rDNA进行测序(委托公司为华大基因)，测序结果如SEQ IDNO.1所示。

TATTATGTTCCTTGTCGTAAGCGCCCTCCCGAGGTTAAGCTAACTACTTCTTTTAGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTCGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACGAGACTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATTGATGAACGTATTAAGTTCACCACCTTCCTCCTCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCTGATGGCAAGAGGCCCGAAGGTCCCCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGTCACCCAGGGAGCAAGCTCCCCTGTGCTACCGCTCGACGAGCACGGAAGCGTACTAAGCCAA。(SEQ ID NO.1)

将上述16SrDNA序列做同源性比较，绘制进化树如图1所示。用blast比较SM-1菌株的16S rDNA序列与Genbank中其它菌的16S rDNA序列。经比对，此菌株与Genbank中Serratia sp.CH-B17同源性为99.79％；与Serratiasp.EBL4相似率99.78％,Serratiamarcescens strainTCCC11387相似率99.77％,Serratia marcescens strainAU1209相似率99.76％，Serratia marcescens strain SER1相似率99.437％，这些菌株同属于粘质沙雷氏菌。

16S rDNA是细菌的保守序列，被称作“活化石”序列。通过序列测定、序列比对结果提示：诱变筛选菌株SM-1为粘质沙雷氏菌。申请人对该菌株进行了保藏，该菌株分类命名为沙雷氏菌Serratia sp.，已于2016年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.11987。

实施例2：粘质沙雷氏菌菌苗制备工艺优化

研究过程中发现，LB琼脂培养基pH、斜面培养时间、斜面培养温度、LB液体培养基pH、接种量、通气量、发酵温度和时间及转速对细菌生长繁殖影响较大，因此，对粘质沙雷氏菌菌苗制备工艺进行了优化，具体如下：

1.传斜面菌种用LB琼脂培养基pH的筛选

按照筛选好的LB琼脂培养基配方，其他组分用量不变，粘质沙雷氏菌在不同pH的LB琼脂培养基上37℃培养21h。

结果表明菌体可在pH6.0-8.0的琼脂培养基上生长繁殖；因菌体在生长代谢过程中会产生各类酸性代谢产物，粘质沙雷氏菌杆菌的生长需要偏碱性环境，细菌的最适生长环境为pH7.2-7.4，细菌生长良好，增值较快，菌落光滑湿润，凸起。

2.斜面培养时间的筛选

对粘质沙雷氏菌进行不同梯度时间(h)的培养，主要观察细菌生物学特性和生长状态。结果斜面培养16-26h细菌生长良好，以20-21h的更优，菌落呈圆形，乳白色，大而饱满，长势旺，边缘整齐。36h菌落较小，长势较差，边缘不规则。

3.斜面培养温度的筛选

对粘质沙雷氏菌进行不同温度的培养，细菌生长特性结果表明当温度从32-39℃之间变化时，菌体生物量随着温度的升高而增加，当温度超过39℃时，菌体生物量随着温度的降低而减少，过高或过低的温度都会影响细菌的生长。因此，粘质沙雷氏菌斜面培养的适宜温度为37℃。

4.发酵时间的优化

按照筛选好的培养基配方，其他组分用量不变，对粘质沙雷氏菌先液体发酵12h后，再进行不同梯度时间(h)的发酵培养，每隔30min测定菌液的吸光值，每组3个平行样，取平均值进行比较，见表3。

表3菌液在不同时间的吸光值

注：OD值以菌数(1×10⁸个/mL)计算。

表3可以看出菌种在1-4小时内处于对数生长期，4小时以后达到平稳期，9小时菌体生物量最大。9-12小时菌体生物量最大，略有反复；14小时后菌体生物量明显降低。因此，粘质沙雷氏菌发酵培养的最佳时间为21h。

5.发酵温度的优化

按照筛选好的培养基配方，其他组分用量不变，分别选择28、30、32、35、37、39、40℃，按LB液体培养基pH7.2-7.4，10％的接种量，通气量75％，温度37℃，转速180rpm发酵21h后，在650nm下测发酵液的OD值，每组3个平行样，取平均值进行比较，确定发酵的最佳温度，见表4。

表4菌液在不同温度的吸光值

注：OD值以菌数(1×10⁸个/mL)计算。

从表4可以看出，温度是限制粘质沙雷氏菌生长的一个关键因子，在一定的温度范围内粘质沙雷氏菌的生长速率随温度的升高而加快，菌液浓度也随温度升高而增大，过高的温度会抑制粘质沙雷氏菌的生长。当温度从24-37℃之间变化时，菌体生物量随着温度的升高而增加，当温度超过37℃时，菌体生物量随着温度的降低而减少。因此，粘质沙雷氏菌发酵的适宜温度为37℃。过高或过低的温度都会影响细菌的生长，而适宜的温度不仅能缩短菌液的发酵周期还能提高菌液的活菌浓度。

6.液体培养基pH的优化

用稀盐酸将培养基分别调至pH6.0、6.3、6.5、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0，每个pH处理3个重复。按10％的接种量，通气量75％，温度37℃，转速180rpm发酵后，当所测吸光度值有所下降终止试验。

pH 7.2-7.4的处理吸光度值最大，菌数为12.13×10⁸个/mL，其次为pH7.6的处理，菌数为12.02×10⁸个/mL，pH 8.0的吸光度值最低，菌数为7.36×10⁸个/mL。这说明粘质沙雷氏菌最适生长的pH值范围为7.2-7.4，pH值偏高或偏低对其生长有一定的抑制作用。

7.接种量对菌体生长的影响

当接种量在10％时，菌体生长达到最大值，菌数为12.89×10⁸个/mL。接种量过小，菌体生长缓慢，延长了发酵周期。接种量过大，菌体增长过快，对营养物质消耗巨大，影响后期菌体的生长。因此，粘质沙雷氏菌发酵培养的最佳接种量为10％。

8.装液量对菌体生长的影响

当装液量小于250mL(装在1L三角烧瓶中)时，菌体生长随着装液量的升高而增加，当接种量超过250mL(装在1L三角烧瓶中)时，菌体生长随着装液量的降低而减少。装液量过小，产率过低。装液量过大，发酵液中溶氧不足，影响到粘质沙雷氏菌的快速增殖，进一步影响后期DCX的生产。培养基中保持适当的溶解氧有利于细菌的生长，不仅可以缩短菌液的发酵周期还可以提高菌液的最终浓度。因此，粘质沙雷氏菌发酵培养的适宜装液量为250mL(装在1L三角烧瓶中)。

9.摇床转速对菌体生长的影响

在摇床转速达到180rpm之前，菌体生物量随着摇床转速的增加而升高，当转速超过180rpm时，菌体生物量随着摇床转速的降低而保持稳定。转速过低，发酵液溶氧不足，菌体生长缓慢，延长了发酵周期。因此，粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素的适宜摇床转速为180rpm。

综上，经优化得到的粘质沙雷氏菌菌苗的制备工艺条件为：

(1)传斜面菌种：

新菌种接种于克氏瓶LB琼脂培养基(pH6.0-8.0；优选pH7.2-7.4)上，连续1-2次传代接种，菌种传代不超过5代。32-39℃培养16-26h。优选37℃培养21h。取出，置-80℃冰箱中贮存备用；

(2)培养发酵：

从粘质沙雷氏菌的原斜面菌种上，取1-5个单菌落，优选3个单菌落，混匀，接种于装在三角瓶中的LB液体培养基上，如培养液量增大，依此比例扩大，即可上摇床培养发酵。条件为：LB液体培养基pH6.0-8.0，8-15％的接种量，通气量40-90％，温度32-39℃，时间16-26h，转速120-200rpm。优选LB液体培养基pH7.2-7.4，10％的接种量，通气量75％，温度37℃，21h，转速180rpm。

(3)集菌杀菌洗涤

集菌前进行粘质沙雷氏菌形态学特性等纯种检查，4000-6000rpm离心30min，弃上清，沉淀以0.5％甲醛溶液于37℃悬浮灭活48h；将灭活的沙雷氏菌以5000rpm离心30min，弃上清；用无菌生理盐水洗沙雷氏菌(去除甲醛残余)2遍，弃上清，沉淀称重，配制即得粘质沙雷氏菌菌苗。

实施例3：粘质沙雷氏菌菌苗注射液的制备

粘质沙雷氏菌注射液的制备方法如下：

(1)传斜面菌种：将粘质沙雷氏菌(实施例1筛选得到的菌株SM-1)接种于克氏瓶LB琼脂培养基(pH7.2)，37℃培养21h。取出，置-80℃冰箱中贮存备用。

(2)培养发酵：从粘质沙雷氏菌的原斜面菌种上，取3个单菌落，混匀，接种于装在三角瓶中的LB液体培养基上，培养发酵。条件为：LB液体培养基pH7.2，10％的接种量，通气量75％，温度37℃，21h，转速180rpm。

(3)集菌杀菌洗涤：集菌前进行粘质沙雷氏菌形态学特性等纯种检查，4000-6000rpm离心30min，弃上清，沉淀以0.5％甲醛溶液于37℃悬浮灭活48h；将灭活的沙雷氏菌以5000rpm离心30min，弃上清；用无菌生理盐水洗沙雷氏菌(去除甲醛残余)2遍，弃上清，沉淀称重。

(4)配制灌装：取l000ml注射用水将320mg粘质沙雷氏菌菌苗悬浮，混合均匀，消毒配置成0.32mg/ml的注射剂，比浊法测沙雷氏菌浓度介于1×10⁹CFU/ml±10％，装瓶灌装制成成品，置4℃保存备用。

为了验证上述工艺流程和生产条件是否科学可行，3年间发明人采用这些条件连续生产了6批产品，并对每批产品进行了质量考察，包括细菌形态，得率、脾激活、浓度、毒性、抑瘤作用和无菌等指标。同时对其稳定性进行了考察，结果表明，用新工艺生产的产品，得率稳定，重现性好，抑瘤作用强，脾激活强，其它各项指标均符合质量标准要求。

实施例4：急性毒性实验

(1)动物分组：将40只昆明小鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组、急性毒性大剂量组、急性毒性中剂量组、急性毒性小剂量组。

(2)给药剂量：实施例3制备的粘质沙雷氏菌注射液的正常实验剂量按委托方提供的剂量，即2.5×10⁸cfu/只，急性毒性实验大、中、小剂量分别为正常剂量的50倍、30倍、10倍，即1.25×10¹⁰、7.5×10⁹、2.5×10⁹cfu/只，一次性腹腔注射给药，各组动物死亡情况见表5。

表5急性毒性实验各组动物死亡情况

从上表可以看出，该制剂的半数致死量接近中剂量，提示采用低于中剂量10倍剂量是安全的。

临床试验：

经过多年数千例临床应用观察，本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗具有确切疗效且无明显副作用；是一种广谱抗肿瘤生物制剂，调动和激发人体免疫系统，对所有实体肿瘤具有抑制作用；尤其对肝癌，肺癌，胃癌，乳腺癌，脑癌，喉癌，鼻咽癌和骨肉瘤等肿瘤的抑瘤率高达90％。经临床观察研究证实，本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗临床使用安全可靠。

典型病例：

1、吴某某，男，88岁，离休干部(广西桂林狮子岭干休所)，患喉癌扩散。1999年在157医院手术，放疗。停止其他治疗，开始使用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗，沿用至今，未复发。已康复。至今仍健在。

2、曲某某，女，36岁，妇产科医生(现住青岛市)，患骨肉瘤，已扩散至双肺、双扁桃体、甲状腺、子宫左附件，未手术、放疗、化疗。2014年7月28日开始使用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗(实施例3制备的粘质沙雷氏菌菌苗注射液)治疗，已完成基础疗程、加强疗程，目前正在做巩固疗程治疗。(已注射70针)各项检查指标正常。未有新结节。原发癌扩散得到充分抑制。能正常生活。

3、曲某某，女，50岁，财务人员(现住湖南衡阳市)，患胃癌，已扩散，未手术、放疗、化疗。2015年10月中旬开始使用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗注射液治疗，已完成基础疗程治疗，现正进行加强疗程治疗，(已注射40针)各项治疗后检查指标明显改善，未有新结节。原发癌扩散得到充分抑制。能正常生活。

4、方某某，63岁，退休干部(现住安徽合肥市)，患浸润性肺腺癌，已扩散至肝脏。未手术、放疗、化疗。2014年10月下旬开始使用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗注射液治疗，已完成基础疗程治疗，正继续加强疗程治疗。(已注射50针)各项检查指标正常。未有新结节。原发癌扩散得到充分抑制。能正常生活。

5、陈某某，男61岁，退休干部(现住安徽六安市)，患肺癌，晚期，2014年9月14日确诊。到2015年3月5日止已做过六次化疗。2016年1月初开始使用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，目前正在做基础疗程治疗。(已注射15针)患者目前能正常生活。正在治疗观察中。

6、车某某，女，41岁，护士长(现住湖北荆门市)，患腹腔间皮瘤，腹腔广泛转移，无法进食、恶病质。多次手术，治疗无效。2014年10月开始腹腔内及腋下使用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，腹水很快消失，食欲明显好转，体质增强，可以上班工作。使用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗后一直没用化疗。

7、郭某某，女，78岁，患卵巢癌，腹腔广泛转移，大量腹水。未手术、放疗、化疗。2014年12月8日开始接受本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，已完成基础疗程治疗。治疗后患者腹胀缓解，纳食好转，尿量增加至每日1,500ml以上，双下肢浮肿消失。复查B超示“微量腹水”。T细胞亚群CD3由40％升至45％，CD8由60％降至45％，二者比值由0.67升至1.00。病情稳定，正常生活。正在治疗观察中。

8、何某某，男性，77岁，患多发性肝转移瘤，胸片(8月20日)示“肺转移”，月14日)示“肺转移瘤较前明显增大”。曾予化疗、干扰素等治疗，未见疗效。2015年10月14日～11月17日接受本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，治疗后患者腹痛缓解，停用止痛剂，咳嗽次数减少。体检：二肺呼吸音粗，右上腹压痛(—)。11月18日复查B超示“多发性肝转移瘤5枚中2枚消失，其余不同程度缩小”；11月19日复查胸片“10月7日片无明显变化。”症状稳定四周。

9、宋某某，女性，51岁，患乳腺癌，左乳腺癌术后复发患者，在化疗间歇期行本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，现乳腺部位未发现肿块。

10、李某某，男，69岁，患前列腺癌，骨盆转移及盆腔淋巴结转移。未做化疗及手术。2015年6月开始用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，连续使用2个月。治疗2周后病人疼痛缓解，停用止痛药，夜尿由十几次减少到3次，1个月后恢复正常活动。2个月后做核磁共振检查，前列腺癌明显缩小，骨盆及盆腔淋巴结转移灶消失，耻坐骨转移灶缩小。

11、崔某某，男性，19岁，战士，患肾癌，伴有胸壁及双肺转移，左前第4肋、6肋骨质破坏。手术后采用LAK治疗、干扰素及化疗或动脉插管介入治疗，未见疗效。2014年5月采用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗注射，共二个疗程32次，病人疼痛及自觉症状明显改善，停用止痛药。复查胸片，病灶及骨质破坏无好转也无加重。

12、胡某某，男性，33岁，患鼻咽癌，颈、胸、腰椎转移。采用VER+CTX+PYM联合化疗三个疗程，褥疮换药抗菌素治疗无效，出现双下肢疼痛，不能入睡，采用吗啡止痛，症状逐渐加重。2014年6月18日开始采用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗，双腋下及双腹股沟淋巴结皮下注射共16次，病人自感疼痛明显减轻，不服止痛药能入睡，体重增加、褥疮面积明显缩小至6×2.5×0.3cm，双下肢感觉及大小便恢复正常。

13、范某某，男，42岁，患脑胶质瘤，术后复发，肿瘤为5×6cm，放疗及化疗均无效，眼底乳头血管水肿，出血明显，脑压高，剧烈头痛，呕吐，每天用甘露醇1,000ml仍头痛无法忍受，病人最后失语、昏迷。2015年6月20日使用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗一个月左右甘露醇停用，神志清醒，可说简单语言，进食正常，CT检查肿瘤略缩小，病人眼底趋于正常。

14、金某某，女，56岁，大学教师，患卵巢囊腺癌腹腔广泛转移，出现大量血性腹水，放化疗效果不显著。2015年8月19日采用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗腹腔内给药治疗，首次疗程后，患者腹胀厌食浮肿等症状即缓解，超声检查示腹腔肿瘤缩小或消失，盆腔仅探及少量液性暗区，厚32mm，在超声引导下取出腹水，颜色为淡黄色，离心做病理检查未见癌细胞。

15、凌某某，男，51岁，合肥钢铁公司职工，患食道癌，已扩散，手术、放疗、化疗无效。2014年9月予本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗在胸腔内给药，第一疗程结束，患者心慌胸闷症状缓解，食欲增加，全身情况好转，超声检查示左侧胸腔积液局限性包裹，并可见许多分隔光带，最大液暗区厚1.8cm，胸水颜色变浅，混浊度降低，胸膜明显增厚，于2015年5月30日在增厚的胸膜处予以组织活检，病理示：少量淋巴细胞浸润，未见肿瘤细胞。到目前为止，患者已进行了5个疗程治疗，全身情况好，生活基本自理，不活动时，无心慌气喘症状，超声及CT检查全身未见转移病灶。

16、郑某某，女，68岁，患癌性腹水，腹膜间皮瘤，2015年8月予本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗腹腔注射，每周1次，三次后腹水减少到中等量，腹胀减轻，呼吸困难消失。

17、向某某，女，62岁，湖北省沙市，患恶性神经胶质瘤，2014年11月30日在全麻下行肿瘤全切除，病理诊断为星形细胞瘤Ⅳ级，并侵及硬脑膜，术后第11天开始第一个疗程，每2天注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗注射液一次，共5次，用药后病人无明显不适，无特殊不良反应，仅有2次低热及轻微头痛，对症治疗后症状消失，第2至第4疗程在当地注射，现病人情况良好，生活自理，无明显不适，经头颅MRI检查未见肿瘤复发。

18、陈某某，女，52岁。江苏姜堰市，患恶性神经胶质瘤，2015年脑瘤大部切除术和瘤床局部免疫疗法。术后使用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗注射液进行治疗，说话功能恢复，迄今健康。

19、魏某某，男，65岁，患胃癌，右侧胸膜转移，大量血性胸水，应用化疗无好转，胸水生长迅速，注入本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗0.32mg，胸水消失，病人于半年后因肿瘤全身广泛转移死亡，但胸水一直未再出现。

20、柳某，男，30岁，患右肺小细胞未分化癌，伴胸膜转移，大量胸水，放、化疗治疗无效，后经抽水后胸膜腔内注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗0.32mg一次，胸水即消失，至今已4个月B超复查无胸水生长。

21、王某某，女，52岁，患右肺鳞癌，右锁骨上淋巴结肿大转移，约3.5×3cm大小，局部淋巴结内注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗0.16mg，每周一次，共两次，至目前已二月余，原肿大淋巴结消失。

22、李某某，女，54岁，患右肺腺癌右锁骨上淋巴结肿大转移，经本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗0.16mg局部注射2次，肿大淋巴结消失。

23、周某某，男，67岁，患右肺鳞癌伴有锁骨上淋巴结转移，给予肿大淋巴结内注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗。每次5亿，5天1次，共4次。一个月后，锁骨上淋巴结缩小至1.2cm×1.8cm大小，持续2个月未见增大。

24、黄某某，男61岁，总政师职干部(现住北京市)，患胰腺癌，已扩散、晚期。2015年8月10日在301做了手术(胰腺、胆囊一并摘除)、放疗、化疗和抗生素治疗。治疗无效。于2015年10月27日出院，尝试开始使用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，供注射13针，未完成基础疗程。于11月26日病逝。

25、胡某某，男性，75岁，患腹腔间皮瘤，广泛性腹水，恶病质，化疗，常规支持、利尿治疗三周未见疗效。2013年10月18日开始接受本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗。治疗后病人腹胀、腹痛明显好转，尿量增加至1,300ml以上。体检：腹软，移浊(±)。B超显示微量腹水，腹围98cm，双下肢压迹(±)。

26、郑某某，女，68岁，患癌性腹水，腹膜间皮瘤2015年8月予本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗腹腔注射，每周1次，三次后腹水减少到中等量，腹胀减轻，呼吸困难消失。

27、何某某，男性，77岁，患多发性肝转移瘤胸片(8月20日)示“肺转移”，月14日)示“肺转移瘤较前明显增大”。曾予化疗、干扰素等治疗，未见疗效。2015年10月14日～11月17日接受本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，治疗后患者腹痛缓解，停用止痛剂，咳嗽次数减少。体检：二肺呼吸音粗，右上腹压痛(—)。11月18日复查B超示“多发性肝转移瘤5枚中2枚消失，其余不同程度缩小”；11月19日复查胸片“10月7日片无明显变化。”症状稳定四周。

28、阮某某，男，67岁，患肝癌伴大量腹水呼吸困难，予腹腔注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗0.32mg同时予利尿剂40mg，一周后腹水减少，经3次用药，在不用利尿剂的情况下，腹水得到控制。

29、郁某某，男性，63岁，患原发性肝癌伴大量腹水化疗及常规支持、利尿治疗未见疗效。2013年11月18日开始接受本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗。每周一次，每次0.32mg，总量0.32mg。治疗后病人腹胀、腹痛明显好转，B超显示微量腹水，腹围103cm，双下肢压迹(±)。

30、宋某某，女性，51岁，患乳腺癌，左乳腺癌术后复发患者，在化疗间歇期行本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，现乳腺部位未发现肿块。

31、苏某某，女，50岁，患乳腺癌晚期，淋巴结转移。2013年11月行右侧乳腺癌手术切除，2014年5月发现右侧腋窝及锁骨下淋巴结肿大，伴右上肢剧烈疼痛。淋巴结内注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗0.32mg/次，每周2次，共四周，淋巴结转移灶消退2个，腋窝淋巴结由鸽蛋大缩小至黄豆大。右上肢疼痛明显好转。后每月巩固治疗1次，共4次。目前病人健康。

32、王某，女，53岁，患左乳腺癌，左胸壁转移，给予本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗肿块内注射，每次5亿+生理盐水2ml，多点注射，5天1次，经注射3次后肿块明显缩小，约1.2cm×1.4cm大小，持续2个月，肿块大小未见增大。

33、李某某，男，69岁，患前列腺癌，骨盆转移及盆腔淋巴结转移。未做化疗及手术。2015年6月开始用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，连续使用2个月。治疗2周后病人疼痛缓解，停用止痛药，夜尿由十几次减少到3次，1个月后恢复正常活动。2个月后做核磁共振检查，前列腺癌明显缩小，骨盆及盆腔淋巴结转移灶消失，耻坐骨转移灶缩小。

34、凌某某，男，51岁，合肥钢铁公司职工，患食道癌已扩散，手术、放疗、化疗无效。2014年9月予本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗在胸腔内给药，第一疗程结束，患者心慌胸闷症状缓解，食欲增加，全身情况好转，超声检查示左侧胸腔积液局限性包裹，并可见许多分隔光带，最大液暗区厚1.8cm，胸水颜色变浅，混浊度降低，胸膜明显增厚，于2015年5月30日在增厚的胸膜处予以组织活检，病理示：少量淋巴细胞浸润，未见肿瘤细胞。到目前为止，患者已进行了5个疗程治疗，全身情况好，生活基本自理，不活动时，无心慌气喘症状，超声及CT检查全身未见转移病灶。

35、匡某某，女，56岁，患食道癌，已扩散到背部，给予本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗局部注射治疗，第1次肿块注入2.5亿，2天后见肿块红肿，在第5天、第10天分别再注入本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗10亿，2周后肿块渐缩小，至4周肿块消失。持续5个月，未见肿块复发。

36、向某某，女，62岁，湖北省沙市，患星形细胞瘤Ⅳ级，并侵及硬脑膜，2014年11月30日在全麻下行肿瘤全切除，术后第11天通过Omaya化疗囊进行瘤腔内直接注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗第一个疗程，每2天注射一次共5次，用药后病人无明显不适，无特殊不良反应，对症治疗后症状消失，第2至第4疗程在当地注射，现病人情况良好，生活自理，无明显不适，经头颅MRI检查未见肿瘤复发。

37、刘某某，女，33岁。安徽省来安县，患恶性神经胶质瘤2015年10月17日进行胶质瘤大部切除术和通过Omaya化疗囊进行瘤腔内直接注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，每年治疗一个疗程。目前无任何症状，能参加劳动，近期CT复查：正常。

38、周某某，男，52岁。南京市白下区，患左额颞叶脑胶质瘤Ⅲ级，2014年7月13日进行胶质瘤大部切除和通过Omaya化疗囊进行瘤腔内直接注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗。治疗后症状全部消失，CT显示肿瘤不存在。

39、俞某某，女，58岁。江苏省武进市，患左枕部胶质瘤Ⅲ级1996年作了脑瘤大部切除和通过Omaya化疗囊进行瘤腔内直接注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗。治疗后5年CT显示肿瘤不存在，目前症状消失，一直在当地招待所内担任服务员，直到两年前退休。

40、赵某，男，56岁，患大肠癌(结肠溃疡型低分化腺癌)，2014年5月16日进行左半结肠癌根治手术和本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗。已完成基础疗程治疗，现正进行加强疗程治疗，(已注射40针)各项治疗后检查指标明显改善，能正常生活，超声及CT检查全身未见转移病灶。

41、李某，女，64岁，患胸腺癌，放、化疗治疗无效，2014年9月20日进行根治性切除手术和本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗。注射本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗0.16mg，每周一次，共两次。治疗后病人胸痛，胸闷气短明显好转，微量胸水，目前已病情稳定，未见淋巴结肿大，正常生活。

42、徐某，男，74岁，患膀胱癌，化疗治疗无效，2015年3月19日进行本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗膀胱灌注治疗。目前已病情稳定，已无血尿，腹水消失，尿路刺激症状消失，未见淋巴结肿大，正常生活。

43、孙某，女，53岁，患甲状腺癌伴淋巴结转移，手术治疗联合本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，2014年7月26日开始采用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，双腋下及双腹股沟淋巴结皮下注射共16次，治疗后颈部表面甲状腺肿块突起已不明显，原有肿大的淋巴结消失，未见新的淋巴结肿大。

44、周某，男，68岁，患恶性黑色素瘤化疗治疗无效，手术治疗联合本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗。2015年4月26日开始采用本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，双腋下淋巴结皮下注射共40次，目前已病情稳定，皮肤溃疡消失，未见淋巴结肿大，正常生活。

45、吴某，女，61岁，患弥漫大B细胞淋巴瘤Ⅲ期，放化疗无效，2014年9月11日进行本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗双腋下淋巴结皮下注射共50次。已完成基础疗程治疗，正继续加强疗程治疗。骨髓涂片已转阴，目前已病情稳定，正常生活。

46、钱某，男，56岁，患纵膈肿瘤，化疗无效，进行手术治疗联合本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗治疗，2015年3月18日进行本发明制备的粘质沙雷氏菌菌苗双腋下及双腹股沟淋巴结皮下注射共40次目前病情稳定，胸闷，胸痛，咳嗽等症状明显改善，肿大的颈部或锁骨上淋巴结已萎缩，正常生活。

Claims (5)

1.一种粘质沙雷氏菌菌苗，其特征在于，其活性成分为粘质沙雷氏菌的生物学纯培养物；

所述粘质沙雷氏菌已于2016年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11987；

所述的粘质沙雷氏菌菌苗的制备方法是由保藏号为CGMCC NO.11987的粘质沙雷氏菌的生物学纯培养物通过适当的分离方法获得；

所述的适当的分离方法为：4000-6000rpm离心30-60min，弃上清，将沉淀进行灭活处理，再离心，弃上清，洗涤，离心沉淀，配制即得；

其中，粘质沙雷氏菌的生物学纯培养物的制备方法为：将粘质沙雷氏菌斜面菌种的单菌落接种于LB液体培养基上，摇床发酵培养；发酵培养的条件为：LB液体培养基pH6.0-8.0，接种量为8-15％，通气量40-90％，培养温度32-39℃，培养时间16-26h，转速120-200rpm；

LB液体培养基pH7.2-7.4，接种量为10％，通气量75％，培养温度37℃，培养时间21h，转速180rpm；

所述粘质沙雷氏菌斜面菌种的制备方法为：将保藏号为CGMCC NO.11987的粘质沙雷氏菌菌种接种于pH为6.0-8.0的LB琼脂培养基上，连续1-2次传代接种，菌种传代不超过5代，32-39℃培养16-26h。

2.一种组合物，其包含权利要求1所述的粘质沙雷氏菌菌苗。

3.如权利要求2所述的组合物，其进一步包含药物学上可接受的载体。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，其为注射剂或冻干粉针。

5.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌菌苗或权利要求4所述的组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途；所述肿瘤为喉癌、骨肉瘤、胃癌、肺腺癌、肺癌、胰腺癌、腹腔间皮瘤、卵巢癌、多发性肝转移瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、鼻咽癌、卵巢囊腺癌、食道癌、恶性黑色素瘤、膀胱癌、恶性神经胶质瘤、肺小细胞未分化癌、肺鳞癌、肝癌、大肠癌、胸腺癌、甲状腺癌、淋巴瘤和纵膈肿瘤。