CN105695365B - 一株粘质沙雷氏菌及其在抑制肿瘤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株粘质沙雷氏菌,该菌株分类命名为沙雷氏菌Serratia sp.已于2016年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.11987。本发明的粘质沙雷氏菌,对A549非小细胞肺癌和S180腹水瘤的抑制效果明显,疗效非常突出,因此,可以以该粘质沙雷氏菌为原料制备用于抑制肿瘤的药物,比如:培养该菌获得培养物,并添加或不添加其它药物、辅料等加工制备成菌剂。本发明为研究沙雷氏菌的抑制肿瘤机制、用途、药物开发等提供了优良的菌种资源。
Description
技术领域
本发明涉及一株粘质沙雷氏菌,及其在抑制肿瘤中的应用,属于生物技术领域。
背景技术
WHO《全球癌症报告2014》数据显示,2012年全球癌症患者和死亡病例都在增加,新增病例近一半出现在亚洲,其中大部分在中国、印度。在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中,中国新增病例和死亡人数均居世界首位。手术治疗有效,但多数患者就诊时已经错过手术时机,只能依赖化疗、放疗,疗效不佳。寻找新机制的治疗方法是领域内不懈的追求。二十世纪八十年代,有人发现细菌感染者的皮肤癌、淋巴癌和白血病患病几率较低,且发现这些细菌注入动物体内会导致肿瘤萎缩,从此细菌及其产物治疗肿瘤成为热门课题之一。
沙雷氏菌是众多具有抑瘤效果的细菌之一。有关沙雷氏菌治疗恶性肿瘤实验研究和临床研究均不乏报道,1997年靳小青等发现粘质沙雷氏菌S311抑制小鼠艾氏腹水癌,小鼠P388白血病,小鼠B16黑色素瘤肺转移和小鼠Lewis肺癌肿瘤细胞;2003年靳小青采用小鼠模型研究粘质沙雷氏菌苗的抑制肿瘤的效果,提示腹腔注射可明显抑制小鼠HCA的原发灶和转移灶、抑制肿瘤转移和复发。1993年Havas HF首先将粘质沙雷氏菌复方制剂用至临床11例难治性恶性肿瘤,发现1例轻微反应,1例部分反应,4例病情暂时稳定,5例病情进展,其中一例艾滋病Kaposi's肉瘤患者病情得到改善。有关粘质沙雷氏菌治疗肿瘤的报道资料国内多于国外,1999年徐永茂等通过胸、腹腔内注射观察了粘质沙雷氏菌S311的疗效,发现在5例癌性胸水患者中4例完全缓解,在9例癌性腹水患者中5例完全缓解。2000年顾建庆将粘质沙雷氏菌S311制剂进行了Ⅰ期临床试验,结果提示制剂对胸水有效。2000年张沂平临床资料报道粘质沙雷氏菌S311制剂对恶性胸腔积液有效率为88.6%,完全缓解率48.6%,尤其对少、中量积液疗效较好。2001年朱允中在Ⅱ临床试验中对241恶性胸水做了观察,总有效率92.1%,且部分胸水癌细胞转阴。2002年茅国新报道粘质沙雷氏菌制剂控制癌性胸腔积液有效率达90.6%,生活质量改善率为84.4%,0.5年、1年、1.5年生存率分别是:93.8%、62.5%、40.6%,毒副反应为胸痛(18.8%)和发热(15.6%)。2007年王庆蓉对18例脑神经胶质细胞瘤术后患者进行观察,采用化疗囊瘤内注射,发现1、2、4年的生存率分别为72.2%、55.68%、55.68%,高于对照组。2002年何晓文采用改良端粒重复序列扩增(TRAP)-银染方法检测20例膀胱移行上皮细胞癌肿瘤组织粘质沙雷氏菌制剂灌注前后的端粒酶活性,发现粘质沙雷氏菌制剂可使肿瘤组织端粒酶活性降低。
有关沙雷氏菌的抑瘤现象已被诸多实验资料证实,但是其疗效机制至今研究不明;综合诸多资料,其抑瘤机制可归纳为两个主要途径,抑瘤机制之一是粘质沙雷氏菌胞壁含有多种对肿瘤细胞直接细胞毒活性,具有直接杀伤肿瘤细胞的作用,比如1994年赵虎等人发现粘质沙雷氏菌能够直接杀伤体外培养的SMMC-7721细胞株、HeLa细胞株、KM3细胞株、S0肉瘤细胞株等肿瘤细胞,对正常组织细胞无明显的影响作用。还有些人认为粘质沙雷氏菌抑制肿瘤的疗效与其在28℃产生的灵菌红素有关,且进行了提纯,新合成的PG衍生物GX15-070,作为多种癌症的治疗药物,已进入临床Ⅱ期研究。根据NIC公布的数据,灵菌红素对人60个常见癌细胞株的平均IC50值约为2.1μM,灵菌红素NSC编号为47147-F。抑瘤机制之二则认为粘质沙雷氏菌的抑瘤效果与免疫调节机制有关。资料提示,粘质沙雷氏菌制剂具有巨噬细胞及T淋巴系统刺激活性,可诱导巨噬细胞吞噬功能增强和分泌肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、白介素1(IL-1)及IL-2等免疫因子,可增强NK细胞杀伤活性,可抑制肿瘤转移相关基因nm23-1和Tiam-1的表达。比如粘质沙雷氏菌DNA含有的“CpG结构”,具有强大的免疫调节作用,能活化NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原提呈细胞,使之产生IFN和IL-12等Th1细胞因子,从而抑制Th2细胞因子IL-4、IL-5的产生,并阻断IgE的合成,从而有效抑制反应原诱导的高反应性及变态反应性改变,改善免疫功能的紊乱。同时粘质沙雷氏菌可以提高外周血及局部灌注周围组织的T细胞亚群的功能,CD4+和CD8+细胞增加,改善机体免疫功能低下,激活免疫系统,纠正细胞免疫及体液免疫的异常,从而促进疾病的恢复。
总之,对于粘质沙雷氏菌,前人虽然已做了许多研究,也公开过多个专利资料,但终因疗效不够突出至今没有发展成真正的临床药物,一直停留在实验室研究阶段。
发明内容
针对上述现有技术,为了获得更加突出的抑瘤效果的沙雷氏菌,本发明对引自中国菌种库的沙雷氏菌进行了紫外诱变,并采用抑瘤实验、观察抑瘤效果,筛选获得了一株对A549实体瘤和S180腹水瘤疗效非常突出的粘质沙雷氏突变菌株,而且疗效是在不产生灵菌红素的情况下产生的。经16S rDNA测序、比对,确定所筛选菌株为粘质沙雷氏菌。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一株粘质沙雷氏菌,该菌株分类命名为沙雷氏菌Serratia sp.,已于2016年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNO.11987。
所述粘质沙雷氏菌的16S rDNA序列,经与Genbank中其它菌的16S rDNA序列相比对,此菌株与Genbank中Serratia sp.CH-B17同源性为99.79%;与Serratiasp.EBL4相似率99.78%,Serratia marcescens strainTCCC11387相似率99.77%,Serratia marcescensstrainAU1209相似率99.76%,Serratia marcescens strain SER1相似率99.437%,这些菌株同属于粘质沙雷氏菌。
所述粘质沙雷氏菌,经实验证明,对A549实体瘤和S180腹水瘤的抑制效果明显,疗效非常突出,因此,可以以该粘质沙雷氏菌为原料制备用于抑制肿瘤的药物,比如:培养该菌获得培养物,并添加或不添加其它药物、辅料等加工制备成菌剂。本发明为研究沙雷氏菌的抑制肿瘤机制、用途、药物开发等提供了优良的菌种资源。
附图说明
一株粘质沙雷氏菌SM-1,该菌株分类命名为沙雷氏菌Serratia sp.,已于2016年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNO.11987,保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编:100101。
图1:正常对照组动物腹腔洗液涂片(200×)。
图2:正常对照组动物腹腔洗液涂片(400×)。
图3:模型组动物腹水涂片(200×)。
图4:模型组动物腹水涂片(400×)。
图5:多西他赛对照组动物腹水涂片(200×)。
图6:多西他赛对照组动物腹水涂片(400×)。
图7:A群链球菌对照组动物腹水涂片(200×)。
图8:A群链球菌对照组动物腹水涂片(400×)。
图9:SM1组组动物腹水涂片(200×)。
图10:SM1组动物腹水涂片(400×)。
图11:模型对照组长出肿瘤的小鼠图。
图12:模型组死亡的小鼠。
图13:接种A549细胞各组小鼠的肿瘤照片,其中,A为模型对照组,B为多西他赛治疗组,C为A群链球菌治疗组,D为SM3组,E为SM1,F为SM5组。
图14:实验组脾脏组织增大。
图15:进化树示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等,可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法,检测方法等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规实验方法,检测方法等。
实施例1 菌种诱变
(一)菌种诱变方法
1.菌种扩增
菌种源自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的粘质沙雷氏菌,保藏号:CGMCC1.0589。无菌条件下,取原菌种10倍梯度稀释后分别涂布在LB斜面培养基上37℃培养24h。选择菌落数目约为20个的平板,挑取较大、界限清晰、呈乳白色长势良好的单菌落作为紫外诱变的出发菌株,取其菌体于生理盐水和玻璃珠的三角瓶中制成无菌菌悬液500mL,30℃、250rpm水浴4h,制备成106CFU/mL的诱变菌悬液,备用。
2.菌株诱变
紫外灯预热25min,分别取菌悬液10mL置于多个平板(D=9cm)中,均匀放置紫外灯下25cm处照射不同的时间(0,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60s),然后分别从每个平板中取出1mL的菌悬液以生理盐水定容至10mL,逐级稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍,取各个梯度的稀释液100μL在暗处涂布于平板固体培养基上,37℃培养24h;取出,挑取长势良好的菌落,试管斜面固体培养基保存,进行高产菌株的筛选。同时,用未照射的菌悬液做空白对照,计算紫外诱变致死率。
致死率=紫外诱变菌悬液的菌落数/未诱变菌悬液的菌落数。
3.菌株选择——根据细菌生长状况选择
3.1.平板初筛
根据紫外诱变选取照射30s的诱变菌悬液生理盐水稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍,分别涂布于平板固体培养基,37℃培养24h。以菌落大小和生长状态为观测指标选取单菌落35株,试管斜面传代3次后,稳定生长的共6株,分别命名为SM1~6。
3.2.摇瓶复筛
①菌种:SM1、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6。
②方法步骤:将上述菌株与出发菌株SM0分别采用10%的接种量置于装有LB液体培养基的三角瓶(25mL/100mL)中、37℃培养21h,摇床转速180rpm。
③菌体浓度的测定
计数比较细菌生长情况。
4.菌种保藏
经过复筛所得粘质沙雷氏菌高产优良菌株加10%甘油保存于-80℃冰箱。
(二)菌种诱变结果
1.菌种诱变
1.1紫外致死率
粘质沙雷氏菌菌悬液于紫外灯下25cm处照射不同的时间,得到诱变时间与致死率的关系,见表1。
表1紫外诱变与致死结果
从表1中可以看出,本实验采用25~30s紫外照射照射范围内,粘质沙雷氏菌致死率为70~80%。
1.2.稳定菌株筛选
经紫外诱变,获取35株菌落。经稳定性传代,最后获得6株稳定菌株,分别命名为SM1、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6,与出发菌株SM0同时进行摇瓶比较(结果如表2所示),发现6株菌均比出发菌生长迅速,其中SM1生长最为迅速,细菌数达到10.65亿/mL。将SM1~6扩增后分别分装100冻存管,加10%甘油于-80℃冰柜保藏,被用于采用抑瘤实验筛选优秀菌种。
表2六株粘质沙雷氏菌摇瓶细菌计数结果
实施例2 粘质沙雷氏菌菌苗注射液的制备
粘质沙雷氏菌注射液的制备方法如下:
(1)传斜面菌种:将粘质沙雷氏菌(实施例1筛选得到的菌株SM-1)接种于克氏瓶LB琼脂培养基(pH7.2),37℃培养21h。取出,置-80℃冰箱中贮存备用。
(2)培养发酵:从粘质沙雷氏菌的原斜面菌种上,取3个单菌落,混匀,接种于装在三角瓶中的LB液体培养基上,培养发酵。条件为:LB液体培养基pH7.2,10%的接种量,通气量75%,温度37℃,21h,转速180rpm。
(3)集菌杀菌洗涤:集菌前进行粘质沙雷氏菌形态学特性等纯种检查,4000-6000rpm离心30min,弃上清,沉淀以0.5%甲醛溶液于37℃悬浮灭活48h;将灭活的沙雷氏菌以5000rpm离心30min,弃上清;用无菌生理盐水洗沙雷氏菌(去除甲醛残余)2遍,弃上清,沉淀称重。
(4)配制灌装:取l000ml注射用水将320mg粘质沙雷氏菌菌苗悬浮,混合均匀,消毒配置成0.32mg/ml的注射剂,比浊法测沙雷氏菌浓度介于1×109CFU/ml±10%,装瓶灌装制成成品,置4℃保存备用。
实施例3 菌种筛选
采用抑瘤效果观察法。将6株细菌(SM1、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6)用于治疗小鼠荷瘤模型,设原菌株SM0、阳性药物多西他赛、A链球菌制剂对照,以瘤组织大小、腹水形成情况作为观察指标,确定6株菌中抑瘤疗效最为突出的菌株。
1.菌株对S180腹水瘤的抑制效果观察
1.1实验方法
动物分组:
将110只昆明小鼠随机分为11组,每组10只,分别为正常对照组、模型对照组、SM0对照组、SM1实验组、SM2实验组、SM3实验组、SM4实验组、SM5实验组、SM6实验组、阳性药物多西他赛对照组、阳性药物A链球菌对照组。
1.2.模型建立及治疗干预
(1)模型对照组:腹腔注射S180细胞,治疗组给药时腹腔注射同体积无菌生理盐水;
(2)阳性药物多西他赛对照组:腹腔接种S180细胞3天后开始,尾静脉注射多西他赛,一周一次,剂量为0.62ml/只/次(稀释至0.9mg/ml);
(3)阳性药物A链球菌对照组:腹腔接种S180细胞3天后开始,腹腔注射A链球菌制剂(第4、7、10、13天)。剂量为:1KE稀释至50ml,第一次0.13ml/只,第二次0.26ml/只,第三、四次0.65ml/只/次;
(4)SM1实验组:腹腔接种S180细胞3天后开始腹腔注射粘质沙雷氏菌制剂SM1,3日一次,5×108cfu/只/次;
(5)SM2~6实验组:接种S180细胞和注射雷氏菌制剂方法同SM1;
(6)正常对照组:正常喂养,治疗组给药时腹腔注射同体积无菌生理盐水。各组动物于动物饲养柜中饲养,每日按计划给药并观察动物一般情况。
1.2实验结果
1.2.1.一般情况检查:腹水量、脾重、体重、死亡动物解剖
(1)正常对照组:活动力强,皮毛顺滑,无弓背,腹部形态正常。
(2)模型组:活动力差,皮毛较顺滑,腹部明显膨大,弓背,1只动物腹部暗紫。死亡4只,称取体重后进行解剖。死亡动物有2只腹部极度胀大且腹部暗紫。
死亡动物和处死动物腹水量大,为乳白色或血性腹水,肠系膜、脏器表面、腹膜表面长满1mm~3mm的瘤组织。
(3)阳性对照药物两组阳性药物对照组动物活动力差,皮毛较顺滑,弓背,腹部明显膨大。分别死亡7只(多西他赛组)和4只(A群链球菌制剂),死亡动物和处死动物解剖情况同模型组。
(4)实验组
①SM1~6动物均表现为活动力差,但腹部膨大不明显(提示腹水少)。分别死亡1、5、3、7、3、4只。死亡动物和处死动物解剖未见明显腹水或少量淡黄色腹水,未见明显肿瘤组织,无出血。部分可见腹腔纤维组织增生,有腹腔粘连现象。
各组动物死亡统计见表3。各组动物腹水量见表4。
表3各组动物死亡情况一览表
表4各组动物腹水情况
注:﹡与模型对照组、多西他赛组、A群链球菌组比较有显著性差异(p<0.01)
1.2.2动物腹水镜检
将存活动物脱臼处死,取腹水、无腹水者加生理盐水冲洗获得洗液20μL涂片,HE染色后镜下观察肿瘤细胞。
(1)正常对照组:
正常对照组腹腔洗液可见腹腔巨噬细胞,见图1、2。
(2)模型对照组:
动物腹腔涂片可见大量肿瘤细胞,表现为分裂活跃、细胞大小不一、核大,染色体深染,不规则,核异型,胞浆少。有的可见明显红细胞。见图3、4。
(3)多西他赛组:
该组动物腹水图片也见大量肿瘤细胞,细胞形态与肿瘤模型组一致,有动物也出现血性腹水,镜下可观察到红细胞。见图5、6。
(4)A群链球菌制剂对照组:
该组动物腹水图片也见大量肿瘤细胞,细胞形态与模型组一致,有动物也出现血性腹水,镜下可观察到红细胞。但是有的腹水图片肿瘤细胞少,且可观察到胞浆。见图7、8。
(5)沙雷氏菌SM1~6组:
镜下观察采用沙雷氏菌做治疗的SM1~6组动物腹水均明显少,多不能抽出腹水,只能注射PBS洗出后涂片观察。偶尔见尚存腹水动物,其肿瘤细胞尚谓密集,其余动物腹水图片可见少量肿瘤细胞,镜下未见红细胞,见图9、10。
1.3结果分析
(1)模型成功
模型组动物可见明显的腹水,截止造模15d,死亡4只,且解剖客家乳白色或血性腹水,腹水平均达到14.37±1.7714mL(统计数据见表),且腹腔内肠系膜、肝脏表面和肠道表面以及腹膜上布满瘤组织,腹水图片可见大量肿瘤细胞,有些可见红细胞,故造模是成功的。
(2)阳性对照
1)多西他赛阳性药物对照组,解剖情况与模型组基本一致,死亡7只,腹水量为12.55±2.7184mL,与模型组比较,t=1.774,p=0.093,无统计学意义,提示疗效欠佳。
2)A群链球菌制剂对照组,解剖情况与模型组基本一致,死亡4只,腹水量为12.45±2.5074mL,与模型组比较,t=1.978,p=0.063,无统计学意义,提示疗效欠佳。
(3)实验组
从腹水量分析,SM1~6腹水量均明显少于模型对照组,甚至未生长出腹水,与模型组、阳性药物对照组比较,p<0.001,具有极为显著性意义。6株菌制剂相比虽然统计学无显著性差异,但是腹水量也略有不同,依次为:SM1(0.060)<SM2(0.270)<SM4(0.560)<SM5(0.650)<SM6(0.770)<SM3(0.920),提示SM1效果最为佳,而SM3在6株菌中效果最差。
从死亡率分析,沙雷氏菌各组动物均有死亡,死亡率依次为SM1(10%)<SM3、SM5(30%)<SM6(40%)<SM2(50%)<SM4(70%),提示,SM1最佳,其余相对差。解剖所有死亡动物发现,这些病死动物腹水量并不大,而且腹腔内也未见大量肿瘤组织生长,而是观察到腹腔有纤维样组织增生,有粘连发生,显然动物不是死于肿瘤,可能与肠黏连有关。提示,这些动物的死亡与过度炎性反应有关。
综合上述结果,SM6、SM2、SM4动物死亡率分别为40%、50%、70%,故该三个诱变菌株丢弃,SM1毒性小、疗效突出,SM1为优秀菌株。另外SM3、SM5动物死亡率低于模型对照组,为次优秀株,可进一步研究和筛选。
2.菌株对A549实体瘤的疗效观察
将S180腹水疗效模型确定的优秀株SM1和次优秀株SM3、SM5采用BALB/c裸鼠荷瘤模型进一步筛选,以选出抑瘤效果最优秀细菌株。
2.1实验方法
(1)动物分组:将70只BALB/c裸鼠随机分为7组,每组10只,分别为正常对照组、模型对照组、SM1、SM3、SM5、阳性药物对照组1(多西他赛)、阳性药物对照组2(注射用A链球菌)。
(2)模型建立及干预治疗:
具体实验方案如下:
①模型对照组:皮下注射A549细胞,治疗组给药时腹腔注射同体积无菌生理盐水;
②阳性药物对照组1(多西他赛):皮下接种A549细胞5天后开始,尾静脉注射进行治疗,一周一次,稀释至0.9mg/ml,0.62ml/只/次;
③阳性药物对照组2(注射用A链球菌):皮下接种A549细胞5天后开始,腹腔注射,每周2-3次(第1、4、7、10、13天)。1KE稀释至50ml,第一次0.13ml/只,第二次0.26ml/只,以后0.65ml/只/次;
④实验组:皮下接种A549细胞5天后开始,腹腔注射编号分别为SM1、SM3、SM5制剂,隔日一次,5×108CFU/只/次;
⑤正常对照组:正常喂养,治疗组给药时腹腔注射同体积无菌生理盐水。
各组动物于IVC-II型(智能型)独立送风隔离笼具中饲养,每日按计划给药并观察动物一般情况。
2.2实验结果
①一般情况
动物接种A549细胞后,每天观察动物情况。从第4天开始除正常对照组外,其余各组小鼠陆续在接种部位长出米粒大小的突起。模型对照组动物肿瘤组织生长迅速,见图11。模型组中有一只腹腔肿大,至第12天该小鼠腹腔呈现黑紫,模型组有1只小鼠腹腔肿大且呈现黑紫色,此小鼠于第15天死亡(图12);实验第20天终止实验时,荷瘤组动物瘤体巨大,活动少、倦怠,反应性弱,有3只动物呼吸频率快、不活动。而实验组动物与正常对照组比较活性和反应性也出现减弱。
②瘤组织组间比较
将各组小鼠脱颈臼处死,解剖小鼠取肿瘤组织称重,结果发现治疗和预防组动物瘤体组织明显比模型组小,计算瘤指数(瘤重/体重×100)、将各组瘤指数与模型组做两两比较(T检验)发现,实验组的瘤指数分别是模型对照组的1/4、1/12和1/4。提示受试药物具有显著的抑瘤效果。见表5。
表5各组小鼠体重及瘤重
注:﹡表示与模型对照组相比有显著性差异(p<0.01)
将各解剖瘤体组织拍照见图13。
③腹腔观察
打开腹腔,发现实验组动物腹腔纤维样组织增生,有的腹腔有粘连,而其它对照组均未见纤维样组织增生现象。
④脾脏
肉眼观察发现模型组动物脾脏较正常对照组增大,多西他赛和A群链球菌组动物与模型组脾组织大小相仿,而三组实验组动物脾脏显著增大,见图14。
将脾脏称重、计算脾指数(脾重/体重×100),结果见表6。
表6各组小鼠体重及脾重
注:*与正常对照组比较,脾重有显著性差异(p<0.05);#与模型对照组比较,脾重有显著性差异(p<0.05)
结论:
(1)造模成功
A549细胞为人非小细胞肺癌的体外传代细胞。裸鼠皮下注射A549细胞后,接种部位逐渐长出瘤体,至20d平均瘤重为0.768±0.552,通过图3也直观显示出造模情况,提示造模成功。
(2)阳性对照药物
实验设计了多西他赛和A群链球菌制剂作为对照,结果提示,多西他赛组动物出现了体重下降(较对照组),而瘤体均重超出模型组40%,提示疗效欠佳;A群链球菌对照组动物瘤体组织比模型组动物下降了42.15%,提示A群链球菌制剂对非小细胞肺癌鼠模型有一定疗效。
(3)实验组
于造模5天后(已经长出在皮下可见和可触及的小瘤体)开始注射SM1、SM3、SM5制剂。结果发现,对比模型对照组,SM1、SM3、SM5实验组的瘤指数显著下降,p<0.01,具有显著性差异。且瘤指数分别是模型对照组的1/12、1/4和1/4,效果显著。同时伴有脾脏肿大、腹腔有结缔组织增生,有些动物甚至发生腹腔粘连,因此推论如下:
推论1:受试药物SM1、SM3、SM5具有显著的抑瘤效果,根据瘤体指数推测,其中SM1效果最为突出,与S180实验结果基本一致,故确定SM1为最为优秀菌株;
推论2:实验组动物脾脏普遍增大,其疗效可能与调节免疫机制相关。但是,该模型属为T淋巴细胞缺陷、B淋巴细胞低能状态,因此,其疗效机制值得探索。
实施例4 SM1 16S rDNA测序
为了确定经过诱变后的菌株突变程度、确定SM1为粘质沙雷氏菌,将SM1菌种进行了16S rDNA测序(委托公司为华大基因),测序结果如下(如SEQ ID NO.1所示):
TATTATGTTCCTTGTCGTAAGCGCCCTCCCGAGGTTAAGCTAACTACTTCTTTTAGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGC CTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTCGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACGAGACTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATTGATGAACGTATTAAGTTCACCACCTTCCTCCTCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCTGATGGCAAGAGGCCCGAAGGTCCCCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGTCACCCAGGGAGCAAGCTCCCCTGTGCTACCGCTCGACGAGCACGGAAGCGTACTAAGCCAA。
将上述16SrDNA序列做同源性比较,绘制进化树如图15所示。用blast比较SM1菌株的16S rDNA序列与Genbank中其它菌的16S rDNA序列。经比对,此菌株与Genbank中Serratia sp.CH-B17同源性为99.79%;与Serratiasp.EBL4相似率99.78%,Serratiamarcescens strainTCCC11387相似率99.77%,Serratia marcescens strainAU1209相似率99.76%,Serratia marcescens strain SER1相似率99.437%,这些菌株同属于粘质沙雷氏菌。
16S rDNA是细菌的保守序列,被称作“活化石”序列。通过序列测定、序列比对结果提示:诱变筛选菌株SM1为粘质沙雷氏菌。申请人对该菌株进行了保藏,分类命名为沙雷氏菌Serratia sp.,已于2016年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.11987。
Claims (2)
1.一株对非小细胞肺癌细胞有显著抑制作用的粘质沙雷氏菌,其特征在于:该菌株分类命名为沙雷氏菌Serratia sp.,已于2016年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.11987。
2.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌在制备抑制非小细胞肺癌或腹水瘤的药物中的应用。
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