CN100486594C - 粘质沙雷氏菌菌苗在制备治疗肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了粘质沙雷氏菌菌苗在制备治疗肺纤维化药物中的应用。动物试验表明，粘质沙雷氏菌菌苗对治疗肺纤维化具有显著的作用，通过对多种肺纤维化动物模型的研究发现，粘质沙雷氏菌菌苗能明显促进TH1型IFN-γ的分泌，促使细胞因子由TH2型向TH1型漂移，完全阻止细胞因子引起的肺纤维化动物呼吸道肺泡炎症和肺纤维化，抑制肺部及全身的Th2型免疫应答，降低变应原诱生的IL-4水平及IL-5合成。更重要的是粘质沙雷氏菌菌苗与激素相比，具有无可比拟的安全性。因而粘质沙雷氏菌菌苗具有对肺纤维化疾病的预防及治疗的前景。

Description

粘质沙雷氏菌菌苗在制备治疗肺纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及粘质沙雷氏菌菌苗的用途，尤其涉及粘质沙雷氏菌菌苗在制药领域中的用途。

背景技术

粘质沙雷菌菌苗的菌学特性以及有关的资料，在CN02111996.1专利公开的文件中，已经有详细的描述。

该菌苗为革兰氏阴性杆菌，周身鞭毛，有动力，无夹膜及芽胞，该菌在一般需氧条件下，37℃普通培养基上生长良好，在普通琼脂平板上，菌落光滑湿润，凸起，边缘整齐，呈圆形，生化反应：能发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇、苦杏仁甙，产酸不产气。不发酵鼠李糖、阿拉伯糖、密二糖。能产生胞外脱氧核糖核酸酶。菌种编号：CGMCCNo.0744，分类命名：粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens。

CN02111996。1还公开了粘质沙雷氏菌的药物作用。它具有抗肿瘤作用，主要作用机理为直接杀伤肿瘤细胞的作用，灭活后仍保持中等的直接细胞毒作用。菌苗或其粗提物(细胞膜性结构及其核糖体等)可以制成抗肿瘤的免疫调节剂。用粘质沙雷氏菌制备的药物或免疫制剂的治疗范围包括：肿瘤、癌性胸腹水、免疫调节、辅助放化疗、升高白细胞、牛皮癣、尖锐湿疣、红斑狼疮的发热及皮肤红斑和白塞氏综合症等等。

肺纤维化(pulmonary fibrosis disease)是一种原因不明的以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病，分特发性和继发性两种，临床主要以特发性多见。本病病因及发病机制尚不十分明确，其发病率日趋增高，临床主要表现为咳嗽咯痰、进行性呼吸困难、紫绀、杵状指等，一般预后较差。

目前关于本病尚无有效治疗方法，西医一般以控制肺泡炎症为目的，多选用糖皮质激素和对症治疗。由于激素应用时间要求长，用量要足，且长时间应用可出现一定的副作用，停药后或常有复发趋势，给治疗康复带来一定困难。

目前新的研究表明，肺纤维化发生时，辅助T细胞2型(Th2)细胞因子、白细胞介素4(IL-4)和IL-5等相对优势表达，而T细胞1型(Th1)细胞因子、γ干扰素(IFN-γ)和IL-12等表达相对减少。研究发现IL-2细胞因子IL-4和IL-5、TGF-β在体内外具有明显的促纤维化及促胶原合成的作用。研究发现IL-2细胞因子IL-4和IL-5、TGF-β在体内外具有明显的促纤维化及促胶原合成的作用。本发明致力于如何促进Th0细胞向Th1细胞分化、抑制Th2型细胞因子的产生从而控制肺纤维化反应发生、发展。尽管也有科学家致力于研究直接应用Th1细胞因子或Th2型细胞因子的拮抗剂以期用于肺纤维化防治，均因作用过于单一，效果不尽如人意。显然，对于这样一种由多种炎性介质和细胞因子共同参与发病的疾病而言，阻断某一种细胞因子难以对整个网络造成太大影响。寻找一种强有力的能改善整体Th1/Th2失衡状态的免疫调节物质成为肺纤维化防治的希望所在。

粘质沙雷氏菌菌苗能高效地激活细胞免疫和体液免疫，在机体内形成多因子介导的细胞免疫效应。粘质沙雷氏菌菌苗含有一些特殊的脊椎动物或植物的DNA所罕见的碱基序列，这些特殊的序列称为“CpG结构”。研究表明CpG DNA具有广泛的免疫调节作用，能活化NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原提呈细胞，使之产生IFN-γ和IL-12等Th1细胞因子，从而抑制Th2细胞因子IL-4、IL-5的产生，诱导Th2反应向Th1反应转变，并促使Th0细胞向Th1分化。Th1型细胞因子如IL-12、γ干扰素(IFN-γ)等参与Th细胞分化的调节，能够抑制Th2型细胞因子IL-4和IL-5的产生，并阻断IgE的合成，从而有效抑制反应原诱导的肺泡炎及纤维化的高反应性。

发明内容

本发明的目的在于提供粘质沙雷氏菌菌苗新用途，即在制药中的新用途，具体地说是提供其在制备治疗药物中的应用。

将粘质沙雷氏菌菌苗用于制备治疗肺纤维化药物时，可采用常规的方法对粘质沙雷氏菌菌苗进行培养，并通过常规的方法从培养物中收集粘质沙雷氏菌菌苗。常规培养方法如下：采用固体培养生产用工作种子。于营养琼脂培养基中接种生产用工作种子后，连续1—2次传代接种，最后接种于科氏瓶营养琼脂培养基斜面，经35—37℃需氧培养18—20小时，不超过4代。采集前逐瓶镜检，有杂菌污染者废弃。采集的菌苔置于灭菌的注射用生理盐水中充分混匀，四层绸布过滤。按中国细菌浊度标准测定，按标准比浊管浓度稀释成400-600亿菌/ml，采集之菌体加入不超过0.5％(ml/ml)甲醛溶液杀菌48小时后进行无菌试验，不得有任何菌生长。培养时，对培养条件，并无十分的要求，以适宜粘质沙雷氏菌菌苗的生长为准，其pH范围为2-9，温度为4-40℃。

采用上述方法获得的培养物，通过适当的分离方法，可获得粘质沙雷氏菌菌苗。所说的适当的分离方法，可是从营养琼脂上刮菌后，用生理盐水加以洗涤，12000转/分钟离心，收集细菌在生理盐水中。

发明人发现，粘质沙雷氏菌菌苗对肺纤维化具有明显的治疗作用。动物试验证明，该菌苗即使在大量使用时，动物的行为也没有任何异常，急性毒性、慢性毒性的安全性研究证明粘质沙雷氏菌菌苗没有毒性，已通过国家新药审评，在恶性胸腹水治疗方面已于2000年获新生物制品I类新药证书。

可以将粘质沙雷氏菌菌苗与医药学上可接受的任何载体以组合物的形式施加于需要治疗的患者，一般的剂量为0.016mg/公斤·天，具体可根据患者的年龄、病情等进行变化。

所说的载体是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂水等，粘质沙雷氏菌菌苗与上述载体构成的组合物，可以通过静脉注射或皮下注射的形式施加于需要这种治疗的患者。

制剂中，粘质沙雷氏菌菌苗的重量含量为0.1-99.9％，优选的含量为0.5-90％。

动物试验证明，粘质沙雷氏菌菌苗对肺纤维化具有明显的治疗作用，更重要的是粘质沙雷氏菌菌苗与糖皮质激素相比，没有激素的副作用，且因为其为灭活的菌苗，具有无可比拟的安全性。停药后一般没有复发趋势，因而粘质沙雷氏菌菌苗具有肺纤维化的预防及治疗的前景。

为了更好地理解本发明的实质，以下将用粘质沙雷氏菌菌苗的药理试验及其结果来说明其在制药领域中的新用途。

具体实施方式

实施例1

粘质沙雷氏菌菌苗的培养和采集：

采用固体培养生产用工作种子。于营养琼脂培养基中接种生产用工作种子后，连续2次传代接种，最后接种于科氏瓶营养琼脂培养基斜面，经37℃需氧培养19小时，不超过4代。培养时，对培养条件，并无十分的要求，以适宜粘质沙雷氏菌菌苗的生长为准，其pH范围为2-9，温度为4-40℃。本实验pH值为6，温度为20℃。采集前逐瓶镜检，有杂菌污染者废弃。采集的菌苔置于灭菌的注射用生理盐水中充分混匀，四层绸布过滤。按中国细菌浊度标准测定，按标准比浊管浓度稀释成450亿菌/ml，采集之菌体加入不超过0.5％(ml/ml)甲醛溶液杀菌48小时后进行无菌试验，不得有任何菌生长。

取1000ml无热源去离子的纯净蒸馏水将32mg粘质沙雷氏菌菌苗溶解，混合均匀，消毒配置成0.32g/ml的注射剂，装瓶制成成品。

实施例2

取1000ml无热源去离子的纯净蒸馏水将640mg粘质沙雷氏菌菌苗溶解，混合均匀，消毒配置成0.64mg/ml的注射剂，装瓶制成成品。

实施例3

具体实验和结果分述如下：

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器博莱霉素(天津河北制药厂生产盐酸平阳霉素，以下简称BLM)，以生理盐水溶解配制成5mg/ml。

1.2 动物分组与处理方法健康SD大鼠80只(第二军医大学实验动物学部提供)，雌雄不拘，体重(220±28)g。其中48只气管内一次性注入BLMA55mg/kg后随机分组，①模型组(24只)：模型制备后次日开始每只每天鼻腔滴入生理盐水0.3ml；②粘质沙雷氏菌菌苗组(24只)：模型制备后次日开始每只每天鼻腔滴入粘质沙雷氏菌菌苗0.3ml(0.01mg/kg)共28天；③正常对照组(24只)。3组置于同一房间饲养，自由饮水摄食。模型组及粘质沙雷氏菌菌苗组均在连续给药的第3天、7天、14天、28天分批处死，每次每组6只。于实验的第0、7、14天分别称量大鼠体重、肺重；第14天处死动物时，收获支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织，计算肺系数[肺重(mg)/体重(g)]。右肺经4％多聚甲醛固定，进行苏木精—伊红(HE)染色和Masson三色染色；左肺在液氮中保存供测羟脯氨酸(HYP)用，BALF于-70℃保存，供测IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-5含量用。

1.3 肺组织病理分析

1.3.1 常规病理：肺组织经不同浓度酒精常规脱水、石蜡包埋、切片后，分别予以HE、Masson三色染色。

1.3.2 肺泡炎、肺纤维化评分方法：根据中华医学会呼吸病学会在《中华结核和呼吸杂志》上发表的《特发性肺纤维化诊断和治疗指南(草案)》(2002；25：387-389)，依照Szapiel法确定肺泡炎和肺纤维化的程度。

1.4 肺组织HYP含量测定

参照李今朝等在《中华结核病杂志》上发表的《实验性肺纤维化细胞凋亡及Fas/FasL基因变化》(2005；28(3)：184-187)，用酸解法测定肺组织中HYP含量。即肺组织匀浆后，在高温条件下用6mol/L HCl酸解，酸解液先后与枸橼酸缓冲液(pH6.0)、氯胺T溶液和伊里克(Ehrilich)溶液反应，经550nm波长记录吸光度(A值)。根据HYP标准品浓度标准曲线计算每克肺中的HYP含量(μg/g)。

1.5 BALF中细胞因子含量测定

细胞因子测定：采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定，具体方法按照ELISA试剂盒内说明书操作。IFN-γ、IL-4、IL-5，试剂盒购自Pharmingen公司，试剂盒灵敏度为28pg/mL。

1.6 统计学处理

应用SPSS 10.0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示，用t检验检测组间差异，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 粘质沙雷氏菌菌苗滴鼻给药对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型体重和肺系数的作用

实验小鼠自给予博莱霉素第7天起，模型组大鼠的体重比给药前或正常对照组明显减轻(P<0.01)，而粘质沙雷氏菌菌苗组在为期2周的整个实验过程中体重无明显变化(P>0.05)，而且大部分大鼠体重略有增加趋势。

大鼠肺系数可间接反映肺组织纤维化的程度。滴鼻给药粘质沙雷氏菌菌苗组大鼠肺系数与模型组组相比明显增加(P<0.05)。

2.2 粘质沙雷氏菌菌苗滴鼻给药对博莱霉素大鼠肺纤维化模型肺组织病理形态学的影响

参照Szapiel评分法，对模型组大鼠、粘质沙雷氏菌菌苗组大鼠肺泡炎及纤维化进行评估。与正常对照组比较，模型组大鼠均有不同程度的肺泡炎和肺纤维化改变，其评分结果与正常对照组比较具有显著性差别(P<0.01)；粘质沙雷氏菌菌苗组有轻度的肺泡炎、肺纤维化改变，但其评分结果与正常对照组模型组大鼠相比无显著性差异(P＝0.09)；说明粘质沙雷氏菌菌苗能有效抑制肺泡炎及纤维化的发生(见表2)。

2.3 粘质沙雷氏菌菌苗滴鼻给药对肺组织HYP含量的影响

模型组大鼠肺组织中HYP含量较正常对照组明显升高(P<0.01)，说明肺组织中胶原的含量明显增多，与组织病理表现一致；粘质沙雷氏菌菌苗组较正常对照组之间差异无显著性(见表2)。

2.4 粘质沙雷氏菌菌苗滴鼻给药对肺泡灌洗液细胞因子影响：

实验结果表明模型组大鼠可见细胞因子以TH2型IL-4、IL-5为主。粘质沙雷氏菌菌苗滴鼻给药可明显促进TH1型IFN-γ的分泌，促使细胞因子由TH2型向TH1型漂移(见表3)。

表1 各组动物体重变化情况及肺系数x±s)

^**P<0.01

表2 各组动物肺泡炎及纤维化评分和肺组织中HYP含量(x±s)

^**P<0.01

表3 肺泡灌洗液细胞因子检测(x±s)

 

分组	鼠数	IFN-γ(pg/mL)	IL-12(pg/mL)	IL-4(pg/mL)	IL-5(pg/mL)
						模型组	24	141.32±56	75.32±32	435.32±62<sup>**</sup>	498.68±54<sup>**</sup>
粘质沙雷氏菌苗组	24	895.00±102<sup>**</sup>	354.23±42<sup>**</sup>	124.30±52	125.32±48
						正常对照组	24	385.87±38	164.65±38	131.20±32<sup>**</sup>	162.42±38

^**P<0.01

Claims (1)

1.粘质沙雷氏菌菌苗在制备治疗肺纤维化药物中的应用。