CN1436841A

CN1436841A - 从虫草体分离培养的细棒束孢sx－1及其分离培养方法和用途

Info

Publication number: CN1436841A
Application number: CN 02103669
Authority: CN
Inventors: 刘玉成; 苏琳; 邹元生; 王岳; 聂勇
Original assignee: SHENXING SEA-BUCKTHORN INST HEBEI
Current assignee: Ren Liansheng
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2003-08-20
Anticipated expiration: 2022-02-08
Also published as: CN1212387C

Abstract

本发明公开了一种从天然冬虫夏草中分离培养的新菌株及其人工分离培养方法和用途。菌种保藏号为CGMCC NO.0706，其形态特征为：在PDA培养基上25℃培养10天，菌落圆形，平铺，局限，有环纹及皱折，最初白色，后灰白色，直径1.5～2.2cm，背面灰褐色至紫褐色；菌丝无色，分枝，具隔膜，宽1～2.5μm；孢梗束白色，分枝，高0.5～3.5cm,直径0.2－1.5mm。本发明的干燥物品具有抑制肿瘤的作用，因此可用于制备抗肿瘤药物。本发明为人们提供了一个新的可工业化生产的菌株，其菌株稳定，具有抗肿瘤活性，同时具有与天然冬虫夏草相近的活性成分。它为人们提供了一种可选用的新品种，也为抗癌药物提供了一种新原料。

Description

从虫草体分离培养的细棒束孢SX-1 及其分离培养方法和用途

本发明涉及虫草菌及其人工分离培养方法和用途，具体地说是属于从天然冬虫夏草中分离培养的新菌株及其人工分离培养方法和用途。

冬虫夏草(简称虫草)为麦角菌科植物冬虫夏草菌(Cordyceps sincesis(Berk.)Sace.)的子座及其寄主蝙蝠蛾科昆虫虫草蝙蝠蛾(Hepialus armoricanusOberthur)的幼虫尸体的复合物，它主要含有氨基酸、多糖类、虫草素、虫草酸、麦角甾醇、腺苷类、超氧歧化苷素及微量元素。其中腺苷含量的高低，已作为药品质量控制的主要依据(见《中华人民共和国药典(2000版)》一部P499：金水宝胶襄，发酵虫草菌粉的质控标准)。现代药理学研究表明，冬虫夏草具有镇静、抗惊厥、降温、祛痰平喘、抗心肌缺血、抗心律失常、抗应激、抗衰老、抗炎、抗菌、抗肿瘤及提高机体免疫力等诸多作用。天然冬虫夏草是由冬虫夏草菌在秋季时以孢子感染蝙蝠蛾幼虫，伴随蝙蝠蛾幼虫钻入土中，虫草孢子利用虫体的营养、长成菌丝体，并在冬季形成菌核，造成虫体的死亡(此时为完整的虫体外型)，等到夏季时，冬虫夏草的子座即从虫体的头部冒出，如草一般，而形成菌虫复合体，即为冬虫夏草子实体。由于蝙蝠蛾对生态环境的要求相当苛刻，每500只蝙蝠蛾幼虫只可产生2只冬虫夏草。故天然冬虫夏草产量极低，它远远不能满足人们的实际需求。现在人工大规模培育冬虫夏草尚无先例，其主要原因是蝙蝠蛾幼虫繁殖困难，且在接种技术及生态仿真技术等方面还存在许多难以克服的问题。为尽快满足人类对冬虫夏草的实际需求，人们开始设想利用人工发酵方式进行工业化生产以解决天然虫草资源不足之问题。例如CN85102231B公开的虫草菌种814选育及其发酵工艺，即为人们提供了一种冬虫夏草代用品。

本发明的目的之一是为充分满足人类对冬虫夏草的需求而提供一种从虫草体分离培养的新菌株，以作为冬虫夏草的代用品。本发明的目的之二是提供一种相应的菌株分离培养方法。本发明的目的之三是提供一种该菌株的用途。

本发明的目的是这样实现的：

本发明提供的细棒束孢(Isaria felina)SX-1是从天然冬虫夏草中经菌种分离培养获得的一种可工业化生产的新菌株，其已于2002年1月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.0706。

本发明细棒束孢SX-1的形态特征为在PDA培养基上25℃培养10天，菌落圆形，平铺，局限，有环纹及皱折，最初白色，后灰白色，直径1.5～2.2cm，背面灰褐色至紫褐色；菌丝无色，分枝，具隔膜，宽1～2.5μm；孢梗束白色，分枝，高0.5～3.5cm，直径0.2-1.5mm；产孢细胞弯颈瓶形呈圆柱形，无色，弯曲，4.8～8.5×1～2.2μm；分生孢子椭圆形至卵圆形，单孢、无色、平滑，2.5～4.3×2～3μm。

鉴定本发明细棒束孢SX-1形态特征的方法参考下述文件：

Petch，Trans.Brit.Mycol.Soc.19：34，1934

Hoog，Stud.Mycol.I.1972

Samson，Stud.Mycol.VI.1974

本发明细棒束孢SX-1的分离培养方法：包括有菌种分离、菌种传代。其中菌种分离是要选择生长正常、健壮、无病虫害的冬虫夏草子实体为种源，在分离前要对冬虫夏草(以下简称虫草)组织进行表面消毒处理，表面消毒剂可选用0.1～0.2％的升汞溶液，也可以选用75％的酒精或5％的福尔马林，或3％的过氧化氢等消毒液。消毒时，先用棉球浸蘸消毒液迅速涂擦虫草表面，擦拭3-5次，每次不超过1min。因为擦拭次数太少、时间太短可导致分离不纯，而擦拭次数太多、时间太长会影响虫草菌的活力。对虫草擦拭完毕后，用无菌水冲洗3-5次，置于有盖的无菌平皿中，将消毒后的虫草用无菌滤纸吸去表面水分，用无菌镊子从虫体前端背部撕开，用无菌接种针挑取组织数块(此时应避免用虫体内的肠道，以减少杂菌的生长)，将挑取的组织分别接种于蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏、琼脂培养基或乳蛋白、葡萄糖、酵母浸膏培养基或PSA培养基上，置20-23℃的培养箱中，湿度保持在80％以上培养，定时观察并及时淘汰杂菌，培养3-10天后，从虫草组织块上长出白色菌丝，及时将其移植到斜面试管上再培养10-13天，收菌丝冷冻贮藏即为母种。

菌种分离中所用的蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏培养基的具体配方可选用：

多性蛋白胨10g、葡萄糖30g、酵母浸膏1g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，PH值6.0-6.5；

菌种分离中所用的乳蛋白、葡萄糖、酵母浸膏培养基的具体配方可选用：

水解乳蛋白10g、葡萄糖50g、酵母浸膏1g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，PH值6.0-6.5；

菌种分离所用的PSA培养基的具体配方为：

马铃薯(去皮)200g，琼脂18g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml，PH值6.0--6.5；

这三种培养基均可用于本发明细棒束孢SX-1的菌种分离，在进行分离时可选用长势较好的菌丝移植到斜面试管上再培养。

完成菌种分离后，进行菌种传代，即将分离培养出的母种置于蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏培养基中，在23-27℃条件下培养1.5-50天，取菌液或菌丝种于纯净的培养基中，循环往复操作，从而实现了菌种的传代。

在进行菌种传代时，培养基可选用液体培养基，也可选用固态培养基。选用液态培养基，其培养时的条件最好控制在23-27℃，180～200转/分，培养时间36-72小时。液态培养基的配方最好是蛋白胨6份、酵母浸膏12份、蔗糖24份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾1份，蒸馏水1000份，PH值6.0-7.0；液态培养基的配方还可选用蛋白胨6份、酵母粉10份、蔗糖20份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾1份，蒸馏水1000份，PH值6.5-7.0。

在进行液体培养时，必须严格控制温度，温度过高时会造成菌丝死亡，过低时会引起菌丝生长缓慢，影响收率。PH值也要严格控制在6.0-7.0的范围内，以保证菌丝生长的均一性。

选用固态培养基其培养条件最好控制在温度为23-25℃，培养时间40-50天，固态培养基的配方最好是米(大米、小米均可)20份、蔗糖1份、硫酸镁0.025份、磷酸二氢钾0.05份，蒸馏水50份，PH值6.0-7.0；

固态培养基的又一优选配方是：蛋白胨5份、酵母浸膏10份、蔗糖20份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾1份、琼脂20份、蒸馏水1000份，PH值6-7。

菌种传代技术的完成使本发明实现工业化生产成为可能。

本发明用于工业化生产时，其液体发酵工艺流程为：

斜面菌种(母种)在23-27℃，培养6-9天；接入一级种子，在26-27℃摇瓶中，培养2-3天；接入二级种子，在26-27℃，培养2-3天；接入种子罐在26-27℃，扩大种子培养2-3天；接入发酵罐，在26-27℃，培养2-3天；质检。

为使传代后的菌种具备良好的长势，在菌种传代中最好进行菌种的复壮处理，即取待复壮的菌丝少量，直接接种到谷粒、蔗糖培养基(与菌种传代所用谷粒、蔗糖培养基相同)上，在20-23℃、相对湿度40-50％条件下，培养9-13天，每日观察待菌丝长到约1cm左右时，选择粗壮者收集冻存即可。如菌丝不够粗壮，可重复培养直到复壮为止。

本发明的干燥物品具有抑制肿瘤的作用，因此可用于制备抗肿瘤药物。

本发明的干燥物品具有与天然虫草相近的活性成份，其内含甘露醇类物质≥8％、多糖类16-18％，腺苷2.5～3.5mg/g其中测定甘露醇类采用硫代硫酸钠滴定法测定，测定多糖时采用硫酸—苯酚法进行测定，腺苷类采用高效液相色谱法。

本发明毒性较低，其毒性实验未能测出LD₅₀，其毒性小的特点经SX-1灌胃给药最大耐受量的测定实验得到进一步的证实。其实验和结果如下：

实验选用动物：用I级昆明健康小鼠，6周龄，体重18-22g。(北京医科大学实验动物部提供。合格证书：医动字第01-3049号)。

一日给药两次，灌胃给药。观察受试动物一天给予大剂量药物后所产生的毒性反应和死亡情况。小白鼠体重在18-22g。小白鼠禁食(12-16小时)，不禁水，实验组给SX-1，按25g/kg体重计算，为人体推荐量的150倍。对照组给等体积的蒸馏水。动物给予150倍人临床用量的SX-1后，连续观察7日，其行为活动、精神状态、大小便、皮毛等均正常，体重无影响，7天内无动物死亡。

结果表明SX-1无急性毒性。

本发明干燥物品所具有的抗肿瘤活性，通过SX-1对小鼠三种移植性肿瘤实验，得到了证实。

SX-1干燥物品对小鼠三种移植性肿瘤实验：

实验材料为：

动物

昆明种小鼠，体重20±2g，雌雄兼用。由北医实验动物部提供。

试品来源：

SX-1干燥物品河北神兴沙棘研究院

环磷酰胺山西泰盛制药有限公司批号：000909

生理盐水大同市惠达药业有限公司批号：000692

瘤源

S₁₈₀肉瘤，Lewis肺癌，H₂₂肝癌瘤株，由北京天坛药物研究所提供。

给药剂量

实验组采用SX-1干燥物品，给药方法及给药剂量为：

实验组1 每天灌胃一次，每次0.5ml/20g(体重)，浓度为30mg/ml。

实验组2 每天灌胃一次，每次0.5ml/20g(体重)，浓度为60mg/ml。

实验组3 每天灌胃一次，每次0.5ml/20g(体重)，浓度为120mg/ml。

阳性对照组

阳性对照组采用环磷酰胺。所用剂量为30mg/kg。每次灌胃0.5ml/20g体重。

空白对照组：等体积的生理盐水。

实验方法：

将生长良好的小鼠S₁₈₀、Lewis肺癌、肝癌组织瘤块，在无菌条件下加生理盐水，用消毒的玻璃研磨制成所需浓度和细胞悬液，过滤后分别接种于小鼠右下腋皮下，每只0.2ml，次日按体重随机分为五组，空白对照组，阳性对照组，实验组1、实验组2、实验组3，雌雄兼用，每组10只，于接种24小时开始灌胃给药，连续给药10天，于末次给药次日处死小鼠称重，剥离瘤块称湿重，所得数据经统计学处理，求出瘤重抑制率(％)，实验结果见表1-3。

实验结果：

SX-1干燥物品对S₁₈₀小鼠的作用表1组别动物数体重(g) 瘤重(g) 抑瘤率

开始结束 X±SD空白对照组 10 21.86±1.59 27.41±2.16 2.87±0.61阳性对照组 10 21.25±1.39 24.01±3.67 0.75±0.40 73.86％^**实验组1 10 21.35±1.94 26.16±2.68 2.80±0.57 2.43％实验组2 10 22.29±1.51 27.07±1.95 1.87±0.54 34.84％^**实验组3 10 20.65±1.83 26.47±0.97 1.52±0.29 47.03％^**与空白组相比，^*表示P＜0.05，^**表示P＜0.01

SX-1干燥物品对Lewis小鼠的作用表2组别动物数体重(g) 瘤重(g) 抑瘤率

开始结束 X±SD空白对照组 10 20.49±1.43 28.20±2.15 1.18±0.15阳性对照组 10 20.36±0.92 26.26±2.41 0.37±0.12 68.64％^**实验组1 10 20.73±2.35 27.29±1.27 0.89±0.16 24.57％实验组2 10 22.09±1.40 28.33±2.41 0.75±0.14 36.44％^**实验组3 10 22.10±1.63 27.83±1.48 0.67±0.21 43.22％^**与空白组相比，^*表示P＜0.05，^**表示P＜0.01

SX-1干燥物品对肝癌(H₂₂)小鼠的作用表3组别动物数体重(g) 瘤重(g) 抑瘤率

开始结束 X±SD空白对照组 10 20.13±2.55 29.28±4.94 1.96±0.48阳性对照组 10 20.62±1.64 25.86±3.42 0.68±0.33 65.31％^**实验组1 10 19.76±1.17 28.92±2.91 1.72±0.62 12.24％实验组2 10 20.80±1.17 30.98±2.80 1.41±0.46 28.06％实验组3 10 19.45±1.42 29.73±3.26 1.25±0.27 36.22％^**

与空白组相比，^*表示P＜0.05，^**表示P＜0.01

实验表明：通过三种小鼠移植性肿瘤的实验研究证明，本发明SX-1干燥物品具有抑制肿瘤作用，对S₁₈₀恶性肿瘤、肺癌、肝癌等均有显著疗效。

本发明经9年传30代次，未发现菌株变异，完全可以进行工业化生产应用。

本发明为人们提供了一个新的可工业化生产的菌株，其菌株稳定，具有抗肿瘤活性，同时具有与天然冬虫夏草相近的活性成分。它为人们提供了一种可选用的新品种，也为抗癌药物提供了一种新原料。

本发明细棒束孢SX-1适应性强，可在多数真菌培养基(如PDM培养基、查氏培养基、MDA培养基等)上生长，其最大耐受温度为28℃，超过此温度时菌株会在数日内死亡。该菌生长后期如营养耗尽，菌丝及孢子均会自行解体，此时培养基PH值会升到8以上。该菌生成需要氧气，缺氧会造成该菌种的死亡。

实施例1：

本菌种(细棒束孢SX-1)在PDA培养基上25℃培养10天，菌落圆形，平铺，局限，有环纹及皱折，最初白色，后灰白色，直径1.5～2.2cm，背面灰褐色至紫褐色；菌丝无色，分枝，具隔膜，宽1～2.5μm；孢梗束白色，分枝，高0.5～3.5cm直径0.2-1.5mm；产孢细胞弯颈瓶形呈圆柱形，无色，弯曲，4.8～8.5×1～2.2μm；分生孢子椭圆形至卵圆形，单孢、无色、平滑，2.5～4.3×2～3μm。

实施例2：

母种分离培养

制备PSA培养基：

马铃薯(去皮)200g，琼脂18g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml、PH值6-6.5；

取马铃薯，洗净去皮切块，加水1200ml，文火煮沸20分钟，过滤取汁，补足水量至1000ml，加琼脂、蔗糖、待充分溶解后，调PH值到6-6.5，121℃蒸汽灭菌30分钟，取出后趁热倒入无菌平皿或试管中，冷却凝固后，置25-28℃条件下，空白培养1-2天，检查无污染即可使用。

选用四川阿坝地区冬虫夏草为种源，对虫草表面用75％的酒精涂擦3次，每次0.8min，用无菌水冲洗4次，置于有盖的无菌平皿中；用无菌滤纸吸去表面水分，用无菌镊子从虫体前端背部撕开，用无菌接种针挑取组织数块，接种于PSA培养基上，置20±1℃的培养箱中培养，湿度控制在85％，定时观察并及时淘汰杂菌，4天后，组织块上长出白色菌丝，将白色菌丝移植到斜面试管上再培养10天，收斜面菌丝(即母种)放入无菌的冷冻保藏管中，直接放入-30℃以下冰箱或液氮中保存。

实施例3：

制备细棒束孢SX-1干燥物品。

将母种置于培养基中制备成一级种子，培养基的配方为蛋白胨36克、酵母浸膏72克、蔗糖144克、硫酸镁3克、磷酸二氢钾6克，蒸馏水6000毫升、调PH值6.5。培养基调配好后，于130℃蒸汽灭菌20分钟，冷却到26±0.5℃时接种。

接种：无菌条件下将上述培养基分别装入6只容量为3000毫升的三角瓶中，每瓶中接入一级种50ml。将三角瓶置于旋转式摇床中培养，温度26±0.5℃，转速180转/分钟，培养48小时。

收获：外观培养液浓稠，测培养基PH值为6，镜检无杂菌，于2000转/分离心20分钟，分别收集上清及沉淀物(菌丝)置80摄氏度烘干，得干燥物品207.2克。

干燥物可用于制备抗肿瘤药品。

实施例4：

制备细棒束孢SX-1干燥物品

将母种置于培养基中，培养基的配方为：大米200克、蔗糖10克、硫酸镁250毫克、磷酸二氢钾500毫克，蒸馏水500毫升，PH值6.0-7.0。

培养基的配制方法：

将除稻米外的各种配料溶于水中，调整PH值到6.0-7.0，加热煮沸后放入稻米，继续加热并不断搅拌，待成固体状后，停止加热，分别装入10个500ml容量的广口瓶中，以一层牛皮纸封口。在高压蒸气灭菌锅中130℃，灭菌20分钟，取出凉至27℃以下，备用。

接种培养：

在无菌条件下打开培养瓶封口，将母种挑出，接种到培养基上，再将瓶口原样封好，上面加盖一层大小适当的经过消毒的塑料薄膜，(塑料薄膜中心剪一个1平方厘米大小的孔，以利气体交换)。将接种后的培养基放置24-25℃，相对湿度为40-50％，通风良好的环境中培养45天，将长好的培养物取出，搅拌均匀，立即在60-80℃条件下干燥，得到干燥物品130克。

实施例5：

培养基的配方及制备方法与实施例4相同。

取出实施例4中在培养基中培养40天的待复壮的菌丝，接种到上述培养基表面，在22℃，相对湿度45％条件下，培养10天，菌丝长到1cm时，选择粗壮者收集冻存。

Claims

1、一种从虫草体分离培养的细棒束孢SX-1，菌种保藏号为CGMCC NO.0706，其形态特征为：在PDA培养基上25℃培养10天，菌落圆形，平铺，局限，有环纹及皱折，最初白色，后灰白色，直径1.5～2.2cm，背面灰褐色至紫褐色；菌丝无色，分枝，具隔膜，宽1～2.5μm；孢梗束白色，分枝，高0.5～3.5cm直径0.2-1.5mm；产孢细胞弯颈瓶形呈圆柱形，无色，弯曲，4.8～8.5×1～2.2μm；分生孢子椭圆形至卵圆形，单孢、无色、平滑，2.5～4.3×2～3μm。

2、一种从虫草体分离培养细棒束孢SX-1的方法，其特征在于它包括以下步骤：

a、菌种分离：

以冬虫夏草为种源，对冬虫夏草组织进行表面消毒，先用消毒液涂擦虫体组织表面3-5次，每次小于1min，后用无菌水冲洗3-5次，置无菌平皿中待用；

用接种针从虫体前端背部挑取组织块，接种于蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏、琼脂培养基或乳蛋白、葡萄糖、酵母膏培养基或PSA培养基上，置于20-23℃培养箱中，湿度控制在80％以上，培养3-10天；

将长出的菌丝移植到斜面管上再培养10-13天，收菌丝冷冻贮藏；

b、菌种传代：

将分离的菌丝置于蛋白胨、酵母、蔗糖培养基或谷粒、蔗糖培养基中，在23-27℃温度下培养1.5-50天，取菌液或菌丝接种于纯净培养基上，循环往复操作。

3、根据权利要求2所述的从虫草体分离培养细棒束孢SX-1的方法，其特征在于所说的步骤包括有菌种复壮，即取待复壮的菌丝，直接接种到谷粒、蔗糖培养基上，在20-23℃温度下，相对湿度40-50％，培养9-13天，待菌丝长至1cm左右时，选择粗壮者收集冻存。

4、根据权利要求1所述的从虫草体分离培养的细棒束孢SX-1的方法，其特征在于所说的菌种传代中的蛋白胨、酵母、蔗糖培养基为液态培养基，其培养条件为温度23-27℃，180-200转/分，时间36-72小时。

5、根据权利要求4所述的从虫草体分离培养细棒束孢SX-1的方法，其特征在于所说的液态培养基组分重量配比是蛋白胨6份、酵母浸膏12份、蔗糖24份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾1份，蒸馏水1000份，PH值6-7。

6、根据权利要求2所述的从虫草体分离培养细棒束孢SX-1的方法，其特征在于所说的菌种传代中的蛋白胨、酵母、蔗糖培养基为固态培养基，培养条件为温度控制在23-25℃，时间40-50天。

7、根据权利要求6所述的从虫草体分离培养的细棒束孢SX-1，其特征在于所说的固态培养基的组分重量配比是米20份、蔗糖1份、硫酸镁0.025份、磷酸二氢钾0.05份，蒸馏水50份，PH值6.0-7.0。

8、根据权利要求6所述的从虫草体分离培养细棒束孢SX-1的方法，其特征在于所说的固态培养基的组分重量配比是蛋白胨5份、酵母浸膏10份、蔗糖20份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾1份、琼脂20份、蒸馏水1000份，PH值6.0-7.0。

9、一种从虫草体分离培养的细棒束孢SX-1的用途，其特征在于它用于制备抗肿瘤药物。