CN114525225B - 一种对鱼类具有强致病力和强耐药性的黏质沙雷氏菌yp1和应用 - Google Patents
一种对鱼类具有强致病力和强耐药性的黏质沙雷氏菌yp1和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种对鱼类具有强致病力和强耐药性的黏质沙雷氏菌YP1和应用。所属菌株作为病原菌首次分离于海水牙鲆病灶处，该菌对海水和淡水鱼类等具有强致病力，且具有强耐药性。该菌株有助于开发更加精准的免疫防控产品(疫苗)，指导养殖生产高效、全面、有效的防控黏质沙雷氏菌传播和流行。另外，该菌株可以为黏质沙雷氏菌毒力相关基因及致病机制的研究提供研究材料；为黏质沙雷氏菌耐药基因的研究提供研究材料；为鱼类腹水病的防治研究提供理论基础；对于鱼类抗病种质的筛选、抗病品种的选育均有重要意义，并为其他动物的黏质沙雷氏菌感染疾病防治研究提供研究思路。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种对鱼类具有强致病力和强耐药性的黏质沙雷氏菌YP1和应用。
背景技术
黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、沙雷氏菌属(SerratiaBizio)，广泛分布于食品、呼吸道、泌尿道、胃肠道等，曾一度被认为是一种无害的环境细菌，但近年来有文献报道该菌可引起的感染情况甚至比很多常见的致病菌都要严重，由于该菌具有侵袭性并对许多常用抗菌药有耐药性，现已成为一种重要的条件病原菌。黏质沙雷菌能引起心内膜炎、脑膜炎、肺炎、伤口感染、眼部感染、败血症、输血和外科术后感染及泌尿道感染等疾病。随着患者的抵抗力降低以及侵入性治疗手段的不断增多，粘质沙雷菌已成为医院感染的一种重要病原菌，近年来临床分离率及其耐药性都有增加趋势。该菌除了在临床上导致人类致病外，在各种动物中也被作为病原菌被报道，如山羊(Capra hircus)、柞蚕(Antheraeapernyi)、牦牛(Bos mutus)、白蚁(Odontotermesformosanus)、中华鳖(Trionyn sinensis)、水貂(Neovison vison)等。在鱼类中，该致病菌仅在淡水鱼地图鱼(Astronotus ocellatus)、草金鱼(Goldfish)的病灶中被分离得到，在海水鱼中未见作为潜在致病菌的相关报道。该菌对植物也具有致病性，如向日葵等。以上报道说明黏质沙雷氏菌对人类、哺乳动物、爬行动物、两栖动物、昆虫、淡水鱼类甚至植物，都具有极强的致病力，其在海水养殖环境中广泛分布，如果对海水鱼也具有致病性，且具有强耐药性，不仅会对养殖生产造成经济损失，可能还会对养殖生产从业者造成一些潜在的公共卫生风险，应引起足够的重视。此外，黏质沙雷氏菌对多种抗生素的耐药性正逐渐增强，而目前还没有针对黏质沙雷氏菌的有效疫苗问世。
因此，针对对海、淡水鱼类均具有强致病力、且具有强耐药性的黏质沙雷氏菌菌株开展研究，有助于开发更加精准的免疫防控产品，指导养殖生产高效、全面、有效的防控该菌传播和流行。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种对鱼类具有致病力的黏质沙雷氏菌YP1和应用。本发明提供的黏质沙雷氏菌YP1对海、淡水鱼类均具有强致病力，且具有强耐药性，利用所述黏质沙雷氏菌YP1制备成黏质沙雷氏菌疫苗，可以有效的防控黏质沙雷氏菌传播和流行。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种对鱼类具有强致病力和强耐药性的黏质沙雷氏菌株(Serratiamarcescens)YP1，所述黏质沙雷氏菌株YP1的保藏编号为：CCTCC NO：M 20211340。
优选的，所述鱼类包括海水鱼和/或淡水鱼。
优选的，所述海水鱼包括牙鲆。
优选的，以牙鲆的体重计，所述菌株对牙鲆的7天半数致死量为3.44×107CFU/g。
优选的，所述淡水鱼包括斑马鱼。
优选的，以斑马鱼的体重计，所述菌株对斑马鱼的7天半数致死量为6.29×105CFU/g。
优选的，所述菌株对哌拉西林/他唑、多西环素、氟苯尼考和链霉素等原本敏感的药物，已产生较强耐药性。
本发明还提供了上述黏质沙雷氏菌YP1在制备黏质沙雷氏菌疫苗中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种对鱼类具有强致病力，且具有强耐药性的黏质沙雷氏菌株(Serratia marcescens)YP1，所述黏质沙雷氏菌株YP1的保藏编号为：CCTCC NO：M20211340。该菌株首次作为海水鱼病原菌被分离研究，该菌株对海、淡水鱼类均具有强致病力，且具有强耐药性，有助于开发更加精准的免疫防控产品(疫苗)，指导养殖生产高效、全面、有效的防控黏质沙雷氏菌传播和流行。另外，该菌株可以为黏质沙雷氏菌毒力相关基因及致病机制的研究提供研究材料；为黏质沙雷氏菌耐药基因的研究提供研究材料；为鱼类腹水病的防治研究提供理论基础；对于鱼类抗病种质的筛选、抗病品种的选育均有重要意义，并为其他动物的黏质沙雷氏菌感染疾病防治研究提供研究思路。
附图说明
图1为YP1菌株形态结果，其中a：菌落形态；b：革兰氏染色鉴定结果(×100)；
图2为YP1菌株16S rDNA基因序列与相关菌株的系统发育树；
图3为注射菌株YP1后实验牙鲆出现腹水症状；其中a：腹水、脱肛；b：鳃变白；c：黄色腹水；d：红色腹水、肝失血；e：血红色花肝；f：肾脏肿大；g(1～3)：心脏出血；
图4为注射菌株YP1后实验斑马鱼出现腹水症状；其中a：对照组斑马鱼；b：患病斑马鱼。
生物保藏说明
黏质沙雷氏菌YP1，拉丁名为Serratia marcescens，于2021年11月01日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO：M 20211340。
具体实施方式
本发明提供了一种对鱼类具有强致病力，并具有强耐药性的黏质沙雷氏菌株(Serratia marcescens)，所述黏质沙雷氏菌YP1的保藏编号为：CCTCC NO：M 20211340。
在本发明中，所述鱼类优选包括海水鱼和/或淡水鱼，更优选包括牙鲆和/或斑马鱼。在本发明中，以鱼的体重计，所述黏质沙雷氏菌YP1对牙鲆的7天半数致死量优选为3.44×107CFU/g，对斑马鱼的7天半数致死量优选为6.29×105CFU/g。在本发明中，所述黏质沙雷氏菌YP1主要导致牙鲆腹水，同时伴有呼吸急促、摄食减弱、脱肛、白便、鳃缺血及多脏器膨大出血等症状，对牙鲆鳃、肠、肝、脾、肾、心均造成损伤；所述黏质沙雷氏菌YP1主要导致斑马鱼腹水，同时伴有摄食减弱等症状。
在本发明中，所述菌株对哌拉西林/他唑、多西环素、氟苯尼考和链霉素等原本敏感的药物，已产生较强耐药性。
本发明还提供了上述技术方案所述的黏质沙雷氏菌YP1在制备黏质沙雷氏菌疫苗中的应用。本发明对所述疫苗的制备方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的制备方法即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种对鱼类具有强致病力和强耐药性的黏质沙雷氏菌YP1和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一株黏质沙雷氏菌菌株，拉丁名称为Serratia marcescens，实验室编号为YP1，分离自患病牙鲆皮肤溃疡病灶处，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO：M 20211340。
1.菌株的分离过程
该菌株是从河北省乐亭县某养殖场患腹水、溃疡病牙鲆(体重：555.27±83.32g)体表溃疡处病灶的组织中分离获得。具体分离过程为：无菌采集患病牙鲆体表溃疡病变处组织，进行组织匀浆。用无菌棉签蘸取组织匀浆，划线接种于营养琼脂固体培养基，30℃培养24h后，用一次性无菌接种环挑取培养基上优势菌落的一个单菌落，转接至另一个新的营养琼脂培养基再次划线培养24h，挑取一个新的菌落再次转接至一个新的营养琼脂培养基，培养温度均为30℃。连续进行单菌落纯化培养3次后，获得的纯培养物即是本发明所述菌株。
2.菌株的鉴定过程
形态学观察：
在无菌环境下，使用一次性无菌环沾新鲜菌液后在营养琼脂培养基上进行平板划线，30℃培养24h，观察独立菌落形态；选取YP1单菌落转接到LB液体培养基中，用恒温振荡器30℃、200r/mim培养18h后，革兰氏染色并在显微镜下观察细菌形态和染色反应。
生理生化鉴定：
将YP1菌株划线于营养琼脂平板上，30℃培养18h后，使用无菌接种环挑取单菌落接种于生化鉴定管中，置于30℃恒温培养箱中培养，观察反应变化，具体操作参照生化鉴定管说明书进行。参照《常见细菌系统鉴定手册》，对其进行鉴定。
分子生物学鉴定：
4℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，变性到延伸35个循环；72℃修复延伸5min。16S rDNA基因测序由生物工程(上海)股份有限公司完成。
测得基因序列通过NCBI数据库进行Blast比对。用ClustalW软件将NCBI数据库中获得的相似度较高的序列和其他种属的序列进行多序列比对，利用MEGA-X软件采用邻接法(neighbor-joining method,NJ)构建系统发育树，并通过bootstrap进行置信度检测，bootstrap重采样1,000次。
结果如下：
细菌形态学结果：
该菌株YP1在营养琼脂平板上形成圆形菌落，白色，略透明，表面光滑，隆起，边缘整齐(图1中的a)。该菌株经革兰氏染色后呈红色近球型短杆状(图1中的b)，为革兰氏阴性杆菌。
分子生物学鉴定结果：
将测序获得的序列在NCBI上进行核苷酸同源性比对，结果显示，其与嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)及黏质沙雷氏菌新菌(Serratia surfactantfaciens)相似率99％。选取部分Blast结果相似菌株及牙鲆细菌病常见菌株，采用邻接法构建系统发育树，结果(图2)显示，菌株YP1与黏质沙雷氏菌聚在同一分支，亲缘关系最近。测序结果上传至国家微生物科学数据中心NMDC(http://nmdc.cn/)后获得核酸序列正式编号：NMDCN0000Q2C。
生理生化鉴定结果：
菌株YP1的生理生化特征如表1所示，对照《常见细菌系统鉴定手册》，结果与黏质沙雷氏菌相符。
表1菌株YP1的主要生理生化指标检测结果
注:“+”表示阳性反应,“－”表示阴性反应,“R”为抗性,“S”为敏感。
结合细菌形态学、生理生化、分子生物学结果综合鉴定细菌YP1为黏质沙雷氏菌。
实施例2
致病力检测
1.牙鲆感染实验
用于人工回感实验的健康牙鲆(体重：25.20±5.0g)为中国水产科学研究院北戴河中心实验站，经人工诱导雌核发育家系获得，具有高纯合度和遗传相似度。
随机取牙鲆(体重：25.20±5.0g)210尾，分成7组，每组30尾，养殖在300L的圆形玻璃钢水槽中，水温21±1℃，每日换水量50％，正常饲养三天后开始实验。注射菌液的制备方法参照王磊等(王磊,陈松林,张英平,范彩霞,刘洋,田永胜,邓寒,刘寿堂,孙德强,谢明树,李文龙.牙鲆连续三代抗鳗弧菌病家系的筛选与分析.中国水产科学,2013,20(5):990-996.)所述，挑取实施例1得到的YP1单菌落接种于LB肉汤液体培养基中，30℃培养18h，8000r/min离心15min，倒掉上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)进行吹洗，吹洗完再用同样的步骤重复2次，最后用微量紫外分光光度计测定菌液OD600。通过血细胞计数器和比浊法的结合定量计算细菌计数，并通过平板计数进行验证。配成1×1010CFU/mL菌悬液后10倍梯度稀释至1×105CFU/mL，共6个浓度。实验组腹腔注射0.2mL不同浓度的菌悬液，对照组注射同等体积的无菌PBS。连续观察并记录实验鱼的发病特征和死亡情况，采集濒死鱼病变组织和腹水进行病原菌分离和鉴定。采用Bliss法计算7天内菌株YP1的半数致死量。
2.斑马鱼感染实验
用于人工感染实验的健康斑马鱼为中国水产科学研究院北戴河中心实验站培育的AB型斑马鱼(Danio rerio)(体重：0.83±0.19g)家系。
取健康斑马鱼(体重：0.83±0.19g)80尾，每10尾养殖在1000mL玻璃杯中，共8组，每天饲喂2次、每日换水量100％，暂养3天后开始实验。实验组腹腔注射浓度为连续稀释10倍(1×109CFU/mL～1×103CFU/mL)的YP1菌悬液0.015mL，对照组注射相同剂量的PBS。观察并记录7天内斑马鱼的死亡情况和发病症状，并采用Bliss法计算7天内菌株YP1的半数致死量。
结果如下：
回归感染牙鲆的症状及半数致死量：实验组牙鲆在注射菌液后表现出活力下降、摄食减少或停食，以注射菌液浓度为1010、109、108CFU/mL的实验组最为明显，同时伴有明显白便。第2天开始出现死亡，第3天为死亡高峰期，7天后牙鲆从发病到死亡过程出现相同的规律，即出现呼吸加快、腹水、脱肛的症状(图3中的a)后2～3天死亡。对照组牙鲆无异常。
同时，从感染的患病牙鲆中分离的优势菌与菌株YP1的生理生化结果一致，且16SrDNA序列比对结果与YP1的一致性为100％。
牙鲆腹腔注射细菌YP1感染后，7天内死亡率见表2，人工回感牙鲆LD50为3.44×107CFU/g。
表2菌株YP1感染牙鲆实验
由以上结果可知，YP1为牙鲆腹水病的病原，主要导致腹水、脱肛、白便；鳃缺血；肝、脾、肾、心多器官肿大出血，累及全身器官。
人工感染斑马鱼临床症状及半数致死量：斑马鱼在注射感染后摄食减少，以注射菌液浓度为109、108、107的实验组最为明显，同时出现了腹水的症状(图4中的b)。对照组正常。
斑马鱼腹腔注射细菌YP1感染后，7天内死亡率见表3。
表3菌株YP1感染斑马鱼实验
由表3可以得出，根据7天内半致死量实验结果，人工感染斑马鱼LD50为6.29×105CFU/g。
实施例3
药物敏感试验：
据卫生部临床检验中心(NCCL)实验操作标准，采用纸片扩散K-B法检测实施例1得到的菌株YP1对药物的敏感性，取100μL菌悬液(浓度约为108CFU/mL)涂布于MHA培养基上，5min后用无菌镊子将药敏片贴于培养基上。于30℃下培养18h后，观察并测量抑菌圈直径，并确定病原菌株对抗生素的耐药性。
菌株YP1对检测的32种抗生素的敏感性结果见表4。
表4YP1药敏试验结果
注:S:高度敏感；I:中度敏感；R:耐药。
从表4中可以得出，相较其他鱼类、哺乳类等动物源菌株(黏质沙雷氏菌)，菌株YP1对哌拉西林/他唑、多西环素、氟苯尼考和链霉素等原本敏感的药物，已产生较强耐药性。
综上所述，本发明提供的菌株YP1对海、淡水鱼类均具有强致病力、并具有强耐药性，有助于开发更加精准的免疫防控产品(疫苗)，指导养殖生产高效、全面、有效的防控黏质沙雷氏菌传播和流行。另外，该菌株可以为黏质沙雷氏菌毒力相关基因及致病机制的研究提供研究材料；为黏质沙雷氏菌耐药基因的研究提供研究材料；为鱼类腹水病的防治研究提供理论基础；对于鱼类抗病种质的筛选、抗病品种的选育均有重要意义，并为其他动物的黏质沙雷氏菌感染疾病防治研究提供研究思路。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (2)
1.一种对鱼类具有强致病力和强耐药性的黏质沙雷氏菌株(Serratia marcescens)YP1，其特征在于，所述黏质沙雷氏菌株YP1的保藏编号为：CCTCCNO：M 20211340。
2.权利要求1所述黏质沙雷氏菌株YP1在制备黏质沙雷氏菌疫苗中的应用。
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