CN104940898A

CN104940898A - 重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN104940898A
Application number: CN201510330513.3A
Authority: CN
Inventors: 孙非; 梁重阳; 张喜田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2015-09-30
Also published as: CN104043105A; WO2015192663A1

Abstract

本发明涉及重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在治疗肺癌，喉癌和脑胶质瘤中的应用。本发明分别通过尾静脉注射方法建立了肺癌小鼠模型、皮下移植瘤方法建立了喉癌及脑胶质瘤的裸鼠动物模型研究rLZ-8的体内抗肿瘤作用，治疗结果表明rLZ-8对肺癌、喉癌及脑胶质瘤有明显的抗肿瘤作用。

Description

重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，重点涉及重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在抗肺癌、喉癌以及脑胶质瘤的生长的治疗作用，提高改善荷瘤小鼠生活状态及提高荷瘤小鼠存活率。

背景技术

肺癌是来源于支气管或细支气管表皮细胞的恶性肿瘤，占肺实质恶性肿瘤的90-95%。肺癌是肺部最常见的原发性恶性肿瘤。世界卫生组织调查报告，许多国家和地区，肺癌的发病率占恶性肿瘤的首位。本病多在40多岁以上发病，发病年龄高峰在60-79岁之间。男女患病率为2.3:1。肺癌起源于支气管粘膜上皮，局限于基底膜内者成为原位癌，可向支气管腔内或/和临近的肺组织生长，并可通过淋巴血行或经支气管转移扩散。肺癌主要有两大基本类型，即小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。其中非小细胞肺癌（NSCLC）发生更多，约80%的肺癌患者属于这种类型。目前小细胞肺癌患者主要用化学疗法治疗，外科治疗对这种类型肺癌患者并不起主要作用。外科治疗主要适用于非小细胞肺癌患者。

肺癌的主要原因是由于外界环境危险因素暴露的逐渐增加，如吸烟和被动吸烟人群的大范围存在、呼吸系统疾病（肺结核、慢性阻塞性肺疾患、哮喘等）的增加、城市大气污染的增加、厨房油烟的不完全处理、新鲜蔬菜和水果摄入量减少等。目前肺癌治疗方面尚未做到早期发现，早期诊断及早期治疗，多数病人在第一次外科诊断时病变已属晚期。所以，尽快开发和研究出肺癌的有效治疗药物是目前科学研究的一个重大而又艰巨的任务。

喉癌（Laryngocarcinoma）为消化系统癌症的一种。大多数的喉癌都是鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC），所占比例约95%左右，可见喉癌主要是于喉上皮的鳞状上皮细胞上形成。喉癌可以在喉的任何一个位置形成，而喉癌的康复率很受癌细胞位置的影响。喉癌主要可分为三个基本类型：声门型（声带），声门上型（声襞）和声门下型。喉癌以声门型最为普遍，其次是声门上型，而最少出现的就是声门下型。据统计资料，喉癌占全身恶性肿瘤的1.2-1.6%，占头颈恶性肿瘤的3.3-8.1%。喉癌具有高发病率、高复发率的特点，男性发病居多，每年新发病人为3.5-5.5/10 万，女性为0.6/10万，发达国家发病率较高，死亡率约为2.4/10万，女性为0.3/10万。呼吸道肿瘤中，喉癌发病率居第2位。

目前喉癌的治疗主要是通过手术、放疗、化疗、生物治疗手段的合理应用，以达到最大程度消灭肿瘤、保留喉功能、提高患者生存率。其中手术治疗是喉癌的首选治疗方法，但是手术治疗不可避免地造成喉部损害，同时也会影响病人的生活质量。喉癌的放疗适用于病变＞1cm、表浅、无转移的声门上型喉癌，且全身情况差，不宜手术者。但是喉癌细胞对辐射的灵敏度不同，有些抗辐射的细胞即使在高强度的照射下也会存活。喉癌的诱导化疗对器官保留有重要作用，目前临床试验结果显示，化疗可以提高保喉率，减少远处转移，对患者总的生存率并无提高。

脑胶质瘤（Glioma）是胶质瘤的一种，胶质瘤是一种始于脑部或者脊柱的肿瘤，它被称为胶质瘤的原因是其由胶质细胞癌变产生，其中脑部的胶质瘤是最常见的。脑部肿瘤与中枢神经系统原发性和转移性的异质群体有关，是一种危及生命，存活率较低的疾病。原发性恶性脑瘤的年发病率大约是24000例。恶性神经胶质瘤是发生于神经胶质部位的肿瘤，发生率占脑瘤的70%。

目前脑胶质瘤的治疗方法主要包括手术治疗、放疗和化疗。脑胶质瘤的特点是呈弥漫性、侵袭性向周围脑组织浸润生长, 与周围组织无明显界限，故手术不能完全切除肿瘤，还可能激活处于休眠期的瘤细胞，使之迅速浸入增殖期，导致切除后易复发，多于瘤床2cm范围内复发, 治疗效果较差。放疗在治疗脑胶质瘤方面，作用十分有限，当放射剂量达到73-80Gy时，才能对胶质瘤细胞形成有效杀伤，而正常脑组织所能耐受剂量仅有60Gy，而且部分恶性脑瘤需进行大范围脑部放射线治疗或全颅及脊椎放射治疗，故放疗对病人学习和记忆能力均会造成一定的损伤。目前由于脑胶质瘤对化疗药物产生一定的耐药性并且大部分治疗脑胶质瘤的化疗药物具有较强的毒副作用，故脑胶质瘤的化疗药物的疗效较低。

灵芝（Ganodermalucidum）是一种药用真菌，作为中药材已有数千年的药用历史，据报道，灵芝有免疫调节以及抗肿瘤作用。灵芝中的活性成分之一灵芝免疫调节蛋白（LZ-8）是从赤灵芝中提取的真菌免疫调节蛋白，本论文提供的重组灵芝免疫调节蛋白（Recombinant Ganodermalucidumimmunoregulatory protein，rLZ-8）是重新设计编码并全合成LZ-8基因，并通过毕赤酵母表达系统重组表达并纯化获得的蛋白样品，以往研究表明，rLZ-8也具有一定的抗肿瘤活性，例如，rLZ-8可有效杀伤人肺腺癌肿瘤细胞（A549），人胃腺癌细胞（SGC7901）等肿瘤细胞株，但关于rLZ-8对肺癌、喉癌及脑胶质瘤的治疗作用尚未见报道。本发明提出rLZ-8对肺癌、喉癌及脑胶质瘤均有显著的治疗效果。

发明内容

本发明涉及rLZ-8在制备治疗肺癌、喉癌及脑胶质瘤药物中的应用，通过一系列的实验手段及结果表明rLZ-8对肺癌、喉癌及脑胶质瘤均具有显著的抑制作用，具体发明内容如下：

（1）采用健康灵活C57BL/6小鼠建立了肺癌转移瘤模型。设计了rLZ-8体内抗肺癌实验分组，其中包括正常对照组、模型组、rLZ-8低剂量组、rLZ-8中剂量组、rLZ-8高剂量组在内的5个实验组，各组用药剂量详见实施例1，以荷瘤小鼠生存时间作为考察对象，分别给药30天与给药60天后，统计各组小鼠肺结节数和生存情况，计算rLZ-8对荷瘤小鼠肿瘤抑制率以及荷瘤小鼠存活率。

（2）采用健康灵活的BALB/c-nude裸鼠建立喉癌裸鼠皮下移植瘤模型。其中，rLZ-8体内抗喉癌研究设计了包括模型对照组（生理盐水）、rLZ-8低剂量组、rLZ-8中剂量组、rLZ-8高剂量组在内的4个实验组，其中rLZ-8低、中、高剂量组的剂量分别为125μg/kg、250 μg/kg、500 μg/kg，给药时间为60天与90天。治疗效果指标主要记录体重、瘤重、瘤体积并以瘤重为依据计算肿瘤抑制率等。分别将数据进行了统计学分析得出rLZ-8在治疗喉癌的效果显著。

（3）采用健康灵活的BALB/c-nude裸鼠建立脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型。设计了包括模型对照组（生理盐水）、rLZ-8低剂量组、rLZ-8中剂量组、rLZ-8高剂量组在内的4个实验组，其中，rLZ-8低、中、高剂量组的剂量分别为125μg/kg、250 μg/kg、500 μg/kg。给药天数为60天与90天。治疗效果指标主要记录体重、瘤重、瘤体积并以瘤重为依据计算肿瘤抑制率等。分别将数据进行了统计学分析得出rLZ-8在治疗脑胶质瘤的效果显著。

经过一系列rLZ-8对肺癌、喉癌及脑胶质瘤皮下移植瘤小鼠实验动物模型的药效学实验结果表明， rLZ-8能够改善荷瘤小鼠的生存状态，抗肿瘤效果显著。

本发明有益效果：本发明采用体内试验方式验证rLZ-8在治疗肺癌、喉癌及脑胶质瘤的应用，通过一系列的药效学实验，结果表明，rLZ-8治疗肺癌、喉癌及脑胶质瘤效果显著，其中，rLZ-8在肺癌的治疗中不仅提高了肿瘤抑制率延长荷瘤小鼠的存活时间，而且出现了一定比例的肺癌结节数消失的荷瘤小鼠模型，这是发明人意想不到的；同时在治疗喉癌及脑胶质瘤的应用中同样出现了皮下实体瘤消失的效果。

具体实施方式

实施例1rLZ-8对肺转移小鼠（LLC）肿瘤抑制率及其荷瘤小鼠存活率的影响

1药物配制

将rLZ-8蛋白原液的浓度为1mg/ml分别配置成rLZ-8低剂量（250μg/kg）31.25μg/ml溶液，rLZ-8中剂量（500μg/kg）62.5μg/ml溶液，为rLZ-8高剂量（1000μg/kg）125μg/ml溶液。

肺癌小鼠模型的建立

收集对数生长期的LLC细胞，1000r/min离心5min，除去上清液，将细胞悬浮于生理盐水溶液中，调整细胞浓度为8.5×10⁶/ml。取细胞悬液尾静脉接种于小鼠体内，接种细胞数为1.7×10⁶个/只，接种体积为0.2ml/只。

实验分组及给药方法

健康灵活的C57BL/6小鼠90只，随机分为5组，每组18只，每组选出9只作为30天给药组，剩余9只作为60天给药组。第1天小鼠造模结束后开始给药，分别给药治疗30天与给药60天，考察给药周期对治疗效果的影响。具体分组及给药方式见表1。

表1实验分组及给药方法（包括给药30天与给药60天）

4观察指标

4.1rLZ-8对LLC肺转移小鼠肿瘤抑制率与生存时间的影响

LLC小鼠肺癌细胞静脉接种于动物后，多数肿瘤细胞转移至肺部引起动物死亡，通过记录肺转移结节数，计算出LLC肺转移小鼠肿瘤抑制率，考察rLZ-8对LLC肺转移小鼠肿瘤抑制率的影响，以及通过比较动物生存时间来评价药物的治疗作用。

对LLC肺转移小鼠中位生存期及其荷瘤存活率的影响

当累积生存率为0.5时所对应的生存时间，表示有且只有50%的个体可以活过这个时间。荷瘤存活率ILS=（MSTT/MSTV-1）×100%

（MSTT和MSTV分别代表治疗组和对照组小鼠存活天数的中值MST； MST=1/2（X+Y），X=半数动物死亡天数，Y=（半数+1）动物死亡天数）。

实验结果与分析

rLZ-8对LLC细胞肺转移小鼠肿瘤抑制率与生存时间的影响。

给药60天后，通过记录肺转移结节数，计算出LLC肺转移小鼠肿瘤抑制率，考察rLZ-8对LLC肺转移小鼠肿瘤抑制率的影响，具体实验数据见表2。

表2 rLZ-8对LLC细胞肺转移小鼠肿瘤抑制率的影响（n=9）

注：*与模型组比较具有显著性差异p<0.05。

以上数据显示，rLZ-8对小鼠LLC肺癌细胞肺转移模型有一定的治疗效果，其中，rLZ-8中剂量组与模型组比较存在明显差异，具有统计学意义（p<0.05）。

实施例2：rLZ-8对裸鼠喉癌模型及裸鼠脑胶质瘤模型的肿瘤形态及抑瘤率影响

实验方法

（1）实验材料与试剂

选用4-6周龄的BALB/c-nude雄性裸鼠，体重18-22g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证编号：SCXK京2009-0004。在SPF级无菌条件下饲养。实验期间控制室温在 ( 20±2) ℃，湿度48%，12小时交替照明。裸鼠饮用水以及其裸鼠饲料均为无菌，实验操作均在超净台内完成，保证环境处于无菌状态。人喉细胞癌细胞株Hep-2，大鼠脑胶质瘤细胞株9L，均由药学院实验室保存。DMEM、胎牛血清、PBS、胰酶、DMSO、0.9%NaCl溶液、pH7.6Tris-HCl缓冲液洗涤、0.05%胰蛋白酶、rLZ-8。

（2）仪器设备与器具

CO₂恒温培养箱、倒置显微镜、移液器、镊子、超净工作台、低速离心机、超低温冷冻储存柜、电子天平、保鲜柜、冰箱、灭菌锅、水浴锅。流式细胞仪，一次性医用无菌手套、医用无菌棉花、50 ml离心管、枪头、冻存管、10 cm细胞培养板、培养瓶、1.5 mlEP管、细胞计数板。一次性1 ml注射器、小鼠垫料、鼠粮。

（3）实验分组及给药方式

动物模型建立：收集对数生长期的Hep-2细胞、9L脑胶质瘤细胞，分别1000r/min离心5min，除去上清液，将细胞悬浮于无血清的DMEM培养基溶液中，调整细胞浓度为2.5×10⁷/ml。取细胞悬液接种于小鼠右侧肋部皮下，接种细胞数为5×10⁶个/只，接种体积为0.2ml/只，建立裸鼠皮下移植瘤模型，24小时后分组给药。

rLZ-8抗裸鼠喉癌体内研究分组给药方式为：健康灵活BALB/C-nude裸鼠80只，体重18-22g，随即分为4组，每组20只，每组随机选出10只，作为60天给药组，其余10只作为90天给药组，分为模型对照组、rLZ-8低、中、高剂量治疗组，其中，给药方式分别为：模型对照组尾静脉注射生理盐水，每天一次；rLZ-8低、中、高剂量组分别尾静脉注射剂量为125μg/kg、250 μg/kg、500 μg/kg的rLZ-8溶液，每天一次；给药时间为60天与90天。

rLZ-8抗裸鼠脑胶质瘤体内研究分组给药方式为：健康灵活BALB/C-nude裸鼠80只，体重18-22g，随即分为4组，每组20只，每组随机选出10只，作为60天给药组，其余10只作为90天给药组，分为模型组，rLZ-8低、中、高剂量治疗组；给药方式分别为：模型对照组尾静脉注射生理盐水，每天一次；rLZ-8低、中、高剂量组分别尾静脉注射剂量为125μg/kg、250 μg/kg、500 μg/kg的rLZ-8溶液，每天一次；给药天数为60天与90天。

实验期间观察小鼠的生活状态，每天称量体重，每周测量肿瘤体积2次。实验结束时剥离瘤体，把瘤体放到天平上称重并记录；按照公式肿瘤生长抑制率=（生理盐水组瘤体重的平均值－给药组瘤体重的平均值）/生理盐水组瘤体重的平均值，计算rLZ-8对原位肿瘤生长的抑制率。

实验结果

rLZ-8对喉癌裸鼠皮下移植瘤瘤体积的影响：人喉癌细胞Hep-2接种后，各组肿瘤体积均呈增长趋势，分析其肿瘤体积随时间的变化可知，各组肿瘤体积均小于阴性对照组，其中rLZ-8中、高剂量组对喉癌皮下移植瘤瘤体积与模型组相比均有显著性差异。

rLZ-8对喉癌裸鼠皮下移植瘤瘤重的影响：肿瘤细胞接种后给药60天与给药90天后处死，将肿瘤组织剥离出来，称重，比较瘤重间的差异，计算肿瘤抑制率（见表3）。

表3 rLZ-8对喉癌模型裸鼠肿瘤重量的影响（n=10）

*与模型组比较具有显著性差异p<0.05；

实验结果表明，随着治疗时间的推移，除模型组外其余各治疗组肿瘤瘤重都出现逐渐较少的趋势，其中，rLZ-8的趋势最为明显，给药60天抑瘤率达到91.12%，分别与模型组比较具有显著性差异p<0.05；在给药90天抑瘤率达到了96.14%，分别于模型组比较均具有显著地差异，具有统计学意义。同时rLZ-8中剂量组出现了3只皮下移植瘤瘤体消失的小鼠模型，这是本发明意想不到的。

对脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤瘤体积的影响：大鼠脑胶质瘤9L细胞接种后，各组肿瘤体积均呈增长趋势，分析其肿瘤体积随时间的变化可知，各治疗组肿瘤体积均小于模型对照组，且各组肿瘤体积与模型对照组相比均有极显著性差异，rLZ-8中剂量组的抑制作用最为显著。

rLZ-8对脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤瘤重的影响：肿瘤细胞接种后给药60天与给药90天后处死，将肿瘤组织剥离出来，称重，比较瘤重间的差异，计算对肿瘤的抑制率（见表4）。

表4rLZ-8对脑胶质瘤模型裸鼠肿瘤重量的影响（n=10）

**与模型组相比p＜0.01。

实验结果表明：各组瘤重均小于模型对照组，与模型对照组相比存在差异。其中rLZ-8中剂量组与模型组的抑瘤率存在显著差异，具有统计学意义，同时rLZ-8中剂量组出现了4只皮下移植瘤瘤体消失的小鼠模型，这是本发明意想不到的，可以看出，rLZ-8更具有临床治疗价值。

Claims

1.重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于脑胶质瘤的发生部位包括脑部或者脊柱。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于该药物制剂核心成分是由权利要求1所述的重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8和任选的药学可接受的辅剂组成。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于该药物的给药途径为口服或非肠道给药，其中，口服包括口服液，片剂，丸剂和胶囊；非肠道给药包括外用药和注射剂。