CN107118263B - 重组灵芝免疫调节蛋白突变体及其应用 - Google Patents

重组灵芝免疫调节蛋白突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

重组灵芝免疫调节蛋白突变体及其应用。本发明是在发现rLZ‑8蛋白结构中所存在的抗‑EGFR结构区域，特别是该结构区域通过其正电势特征诱导一种对EGFR异常表达肿瘤的杀伤作用。在以上科学发现的基础上，利用计算机模拟技术获得了具有更强抗肿瘤作用的rLZ‑8突变体蛋白。

Description

重组灵芝免疫调节蛋白突变体及其应用
技术领域
在本发明技术领域包括计算机模拟技术对蛋白质的突变所进行的优化和改造。
背景技术
人表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）分子量为170kDa的跨膜受体，其由原癌基因编码，并且显示固有的酪氨酸激酶活。表皮生长因子（EGF），转化生长因子-α（TGF-α），双调蛋白，肝素结合EGF和β动物纤维素等均为与EGFR结合的配体。EGFR经配体激活后，经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、程序性细胞死亡等。
已有大量研究表明，EGFR虽然在正常组织的细胞中表达，但表达量很低，而在许多癌症细胞表面的EGFR异常过量表达，包括肺癌、乳腺癌、直肠结肠癌等。针对EGFR表达过量后，其经由配体激活引发了癌细胞增殖分化这一现象特点，目前已上市的小分子和抗体药物是针对靶向EGFR胞外部分的EGF结合位点或胞内部分的酪氨酸激酶活性位点。小分子酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼能够阻断EGFR的自磷酸化，抑制下游信号的传导。另一方面，单克隆抗体，靶向EGFR的胞外部分，阻断配体结合并由此抑制下游通路的激活如细胞增殖。抗体所引发的EGFR内化正逐渐被本领域研究者关注。对于EGFR内化的研究为以EGFR为靶点的生物药提供了新的开发策略。
从上世纪开始，EGFR的内化行为得到了广泛研究。EGFR的内吞主要有网格蛋白依赖和网格蛋白非依赖两种方式，当低浓度EGF作用时，EGFR以网格蛋白介导的方式内吞；当使用高浓度EGF时，EGFR主要以非网格蛋白方式内吞，包括小窝和巨胞饮。就内吞机制来说，近年争论焦点在于内吞是否依赖于EGFR的二聚化，激酶活性，氨基酸位点的磷酸化，泛素化，以及碳端的模体（motif）。
当同时使用两种抗EGFR 第三结构域抗体时，EGFR 不形成活性二聚体，络氨酸位点无明显磷酸化，这与使用单种抗体时，EGFR发生的现象是一致的。索尔金等人认为,不论高低剂量的EGF作用，EGFR的内吞与EGFR的激酶活性、主要的络氨酸位点的磷酸化有很大程度的相关性。可见，若依赖磷酸化机制入胞，抗体的内吞现象并不能得以解释。皮埃尔等人认为，高浓度EGF作用时，EGFR的泛素化修饰能促进其内吞。泛素化是否能促进EGFR的内吞，存在广泛争议，低浓度EGF作用时，EGFR以网格蛋白方式内吞，泛素化程度低，并不依赖于泛素化；但当EGFR胞内域全切除时，融合于EGFR末端的单个泛素分子确能帮助EGFR以小窝的方式入胞。Yosef Yarden的数据表明，当使用两种抗体作用于EGFR时，EGFR能发生泛素化修饰，但泛素化在抗体作用的EGFR内吞机制中扮演的角色尚不清楚。Zhixiang Wang等人认为， EGFR的入胞并不依赖于EGFR激酶活性，主要赖氨酸的磷酸化修饰，以及EGFR胞内域碳末端的大部分区域。但这种机制依然不能解释抗体的内吞行为，Yosef Yarden等在2004年时指出，同时使用抗Her-2的赫赛汀和L26单抗时，EGFR的内化不依赖于EGFR的胞内域，甚至是跨膜区。Paul M. P. van Bergen en Henegouwen等人在研究抗EGFR的具有非重叠表位的双特异性抗体分子内吞机制时发现，EGFR以网格蛋白方式内吞，即使切除EGFR的胞内域部分，EGFR仍然发生大量内化，内化量甚至超过胞内域完整的EGFR，但其指出，EGFR的跨膜区N端的二聚化对于完整的EGFR的内化十分重要。因此，当抗体与EGFR作用时，EGFR的入胞行为难以用EGF作用时EGFR的入胞模式来解释。我们认为，抗体作用时，EGFR的内吞机制与其特殊的内吞方式有关。Espen Stang等人发现，共同使用Cetuximab以及抗Cetuximab的IGg抗体，EGFR以巨胞饮的方式发生大量内吞，不依赖磷酸化，而依赖肌动蛋白的聚合。Yosef Yarden 等人猜测，这种入胞行为与抗体在细胞表面形成的抗体-受体复合物大小相关。当使用抗体对时，由于表位的非重叠性，使得大量的EGFR得以被动聚集，从而在细胞膜上形成巨大分子量的抗体-受体复合物，这是单独使用一种抗体或者使用两种表位竞争的抗体所不能引起的。有质谱实验数据表明，具有两个非重叠表位的抗HER-2双特异性抗体，能在细胞膜上形成1716KDa的复合物。这在一定程度上证实了以上猜测，但促使EGFR以巨胞饮方式入胞的机制并不清楚，且这种入胞方式伴随受体的大量降解。
有文献表明，网格蛋白除了参与内吞，还能促进内吞体胞内循环，且以不依赖泛素化的机制进行降解；而以巨胞饮方式内吞，能极大提高内吞效率以及降解效率。
高浓度EGF作用下，EGFR 依然可以发生巨胞饮，并且可以促进EGFR在膜上发生聚集，形成EGFR聚合体。与使用两种非竞争抗体促进EGFR聚合形成复合物所不同的是，EGF作用下，EGFR的聚集是一种主动的依赖于磷酸化以及肌动蛋白聚集的行为。我们认为，当两种抗体共同使用时，在EGFR发生被动聚集的过程中，引起了细胞膜的局部流动，微丝的重聚，促进EGFR以巨胞饮的方式入胞，这是不依赖于胞内域的模体以及EGFR胞内域修饰的入胞行为。以上的研究都是针对免疫球蛋白结构的抗体进行的内吞以及其内吞机制的研究。
灵芝免疫调节蛋白背景知识及其前期研究。本发明中的蛋白药物，由于其蛋白结构与传统的免疫球蛋白抗体完全不同, 该蛋白质来源于灵芝免疫蛋白。在1989年，Kino等人从赤灵芝菌丝体提取物中分离纯化得到灵芝免疫调节蛋白（Immunoregulatory proteinof Ganoderma lucidium），并测定其氨基酸顺序和免疫生理活性，命名该蛋白质为Lingzhi-8(LZ-8)。LZ-8由110个氨基酸残基组成，氨基端乙酰化，分子量为12.4KDa，等电点为4.4。
但Kino等人提取的天然LZ-8含有1.3%的多糖，我们通过基因工程技术手段，在毕赤酵母中重组表达获得与天然LZ-8氨基酸序列相同、活性相似、纯度高于99%的重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8。而后又通过动物药效学的实验证明了重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）具有抗肿瘤作用（CN 101475632）。荷瘤小鼠实验表明，rLZ-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤细胞S180和移植性肝癌细胞H22在体内生长。通过蛋白荧光标记实验表明，其抗肿瘤作用是通过与肿瘤细胞膜特异性结合诱导其凋亡而杀伤或杀死肿瘤细胞。可见，找到rLZ-8自身的抗肿瘤结构域以及在肿瘤细胞上的靶受体将可能为癌症治疗带来新的技术。
灵芝免疫调节蛋白的N端是重要的形成的二聚体结构域，C端是一个FNIII 结构域。N端由一个α-螺旋（由14个氨基酸组成，氨基酸序列为2-SDTALIFRLAWDVK-15）和一个β-折叠（由5个氨基酸组成，氨基酸序列为16-KLSFD-20），其中在α螺旋上的Ser残基被乙酰化。N端的一个α螺旋和一个β折叠组成了二聚体中的一个单体，与另一个相同单体通过结构域交互，形成哑铃状的二聚体。C端的FNIII 结构域属于免疫球蛋白相似的三明治结构。C端由β-平面I 和β-平面II组成，其中β-平面I 和β-平面II分别由β-折叠A-B-E和β-折叠G-F-C-D构成。
计算机分子模拟在蛋白质类药物的研发中也发挥着极为重要的作用。计算机分子模拟技术：首先利用计算机分子模拟技术可以根据蛋白质药物的晶体结构预测其活性结构域，通过模拟蛋白质药物与其作用靶点（如受体与配体）间的相互作用，可以预测其结合形式和结合部位，并且计算其结合能力。利用计算机分子模拟软件可以对结合能力突出或位置结构特殊的氨基酸残基进行突变，从而分析该位置的变化对蛋白质药物与靶点结合能力的影响，进而分析出发挥活性的关键结构域及关键氨基酸残基。通常情况下，选择将关键氨基酸残基突变为丙氨酸（Ala）进行突变分析，丙氨酸是突变分析中最常用的一种氨基酸，其侧链只有一个甲基，体积小，无其他官能团，同时还可以避免甘氨酸α-C，没有手性基团对结构产生较大影响的问题。通过将目标氨基酸突变为丙氨酸可以分析原有氨基酸对结构和功能产生的作用。通过计算机分子模拟技术还可以对原有蛋白质药物进行设计和改造。如通过计算和分析静电相互作用，对关键位置氨基酸进行电性的改造就是一种常见的改造策略。通过将原来产生静电排斥的氨基酸改成相反电性的氨基酸，可以减少该位置与靶点之间的排斥作用，从而增加蛋白质药物与靶点的结合能力，得到优化的蛋白质药物。此外，还有很多设计和改造策略，如根据蛋白质药物关键位置氨基酸残基的结构和侧链特点从空间上进行改造等等。
计算机模拟技术的另一大优势在于通过计算机分子模拟技术，期待可以优化改造已知的蛋白质，使其应具有理想的抗-EGFR抗体的一个或更多的特点，包括证明其在以EGFR为靶点作为抗肿瘤机制有十分突出的活性，可以十分有效的阻止或延缓病人的肿瘤生长。证明其阻止或延缓病人的肿瘤生长中有十分突出的活性，可以抗衡其他的治疗药物及其治疗方案用于单独抗肿瘤治疗，如厄洛替尼、顺铂、阿霉素、曲妥单抗、西妥昔等。可以对其结构进行工程化改造，以降低其表面疏水性，并且可以提高其工业生产（比如易于纯化和定量、热力学和化学稳定性、溶解度、均一性）、制剂的稳定性、良好的药代动力学特点（如：减少体内非特异性结合的清除率），同时保持或提高其对EGFR的亲和力。另外，可以证明其在体内的稳定性、良好的物理化学稳定性，包括但是不局限于在肿瘤治疗中可接受的热力学和化学稳定性、溶解度、药代动力学特点。
发明内容
说明书
本发明是在发现rLZ-8蛋白结构中所存在的抗-EGFR结构区域，特别是该结构区域通过其正电势特征诱导一种对EGFR异常表达肿瘤的杀伤作用。在以上科学发现的基础上，利用计算机模拟技术获得了具有更强抗肿瘤作用的rLZ-8突变体蛋白。
本发明中，所揭示的rLZ-8抗肿瘤机制为，rLZ-8与细胞膜表面过量表达的EGFR结合后，通过巨胞饮的方式进行了强烈的内化，含有rLZ-8的细胞膜并未循环会细胞膜表面，细胞强烈内吞rLZ-8后，依次发生皱缩、变圆，最后膜结构循环受阻导致细胞崩解死亡。
通过使用不同内吞方式的抑制剂，确认了rLZ-8通过巨胞饮的方式入胞。
根据已报道的巨胞饮的机制特点，对rLZ-8内化的细节与特点进行了进一步研究。与阴性对照组结构完整的纤维状肌动蛋白（F-actin）相比，rLZ-8作用后细胞腹部无法观察到贯穿状F-actin结构，说明F-actin参与了rLZ-8的内化，重组后的碎片化肌动蛋白参与了内吞体的组成。rLZ-8与巨胞饮的标记物——高分子量的糖苷（Dextran）在细胞内有明显共定位现象。另外，随着rLZ-8的内化，巨胞饮相关的伪足，皱缩以及囊泡均可在电镜结果中观察到。
已有报道认为巨胞饮是一个胆固醇依赖的过程，而rLZ-8的内化效率可以被一种胆固醇抑制剂—— mβCD抑制50%。由于GTP酶（GTPase）参与调节了巨胞饮过程，我们研究了其对rLZ-8内化的影响。随着rLZ-8和牛血清蛋白（BSA）的内化, ras GTP、Arf6 GTP、Rac1GTP均被激活，BSA引发的激活在内化1小时后回复到最初的水平，而rLZ-8持续保持着高活性状态。综上，rLZ-8应该是通过巨胞饮的方式内化进入肿瘤细胞，而这种内化方式可能与rLZ-8的肿瘤细胞毒性有关。
本发明还通过大量的研究工作来揭示rLZ-8内化与其所诱导的细胞死亡之间的关系。100μg/mL rLZ-8作用5小时后，Hep G2细胞发生了皱缩与胀破死亡。
通过实时动态观察细胞依次发生皱缩，变圆，最后由于细胞膜的缺乏导致细胞崩
解死亡。为更好的展现细胞死亡过程，更低剂量的rLZ-8（10μg/mL）应用于下述实验。rLZ-8作用6小时后被撤走，更换正常培养基培养24小时后，核周红色荧光囊泡依然存在，内化的rLZ-8似乎并未被溶酶体降解。与之相对应的是，BSA培养20分钟后即被降解。但若rLZ-8作用4小时后，再进行BSA的孵育，BSA并未被降解，而是与rLZ-8存在明确共定位现象。
根据以上结果，结合内吞体与溶酶体分别在BSA降解中的作用，相关活性与细胞成像应用于rLZ-8内化的降解研究。作用于细胞10分钟后，rLZ-8与Rab5开始出现共定位现象，30分钟后共定位现象逐渐消失，随之而来，rLZ-8与Rab7的共定位现象开始出现，并持续维持下去，而整个内化过程中，rLZ-8始终未与Lamp1发生共定位。上述结果表明rLZ-8的内化滞留于晚期内吞体阶段，且不与溶酶体发生融合。这可能导致rLZ-8大量积累在晚期内吞体阶段。Luzio等报道通过调控Ca2+的释放能够抑制LE与溶酶体的融合，再加入足够CaCl2可以恢复两者融合。本研究中，CaCl2的加入并未引起包含rLZ-8的LE与溶酶体融合。因此，接下来的研究集中于rLZ-8内化过程中Rab7活性的检测。图15结果显示，随着rLZ-8的内化，Rab7活性维持在较低水平，而相对的是BSA的内化中，Rab7活性增高，表明含有BSA的LE与溶酶体发生融合。
根据上述结果可以初步推断含有rLZ-8的晚期内吞体未与溶酶体发生融合的原因。更重要的是，LE的不断积累对整个细胞膜转运会造成何影响，我们通过研究rLZ-8内化过程中细胞膜的循环来考察这一影响。选用两种细胞膜标志物——EGFR和转铁蛋白受体（TfR），随着rLZ-8 1小时, 2小时, 4小时及6小时的进入，rLZ-8始终与标志物保持高度的共定位现象。另一个体现晚期内吞体异常滞留的重要现象是rLZ-8与介导巨胞饮体形成的肌动蛋白一直维持明确共定位。因此可以看出，随着rLZ-8的内化，含有rLZ-8的细胞膜并未循环回细胞膜表面。综上，rLZ-8通过巨胞饮的过度内化导致细胞膜循环的阻断，这可能是细胞皱缩与死亡的诱因。
在本发明的前期实验中，由于rLZ-8的分子量仅为12.4KDa，在体内半衰期较短，为了提高其体内半衰期以及肾清除率等，通过对重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）修饰物的研究，构建了单甲氧基聚乙二醇丙琥珀酰亚安酯（mPEG-SPA-rLZ-8），在动物药效学实验中发现该修饰物的抗肿瘤效果有所下降。这说明修饰物存在的位置与rLZ-8的抗肿瘤重要区域有极大的关联性。因此运用了分子对接技术，对mPEG可能形成的空间位阻的位置进行了计算。
首先以rLZ-8的晶体结构为基础，构建了mPEG-SPA-rLZ-8的结构模型，利用分子对接计算mPEG聚合物所形成的空间位阻，由于mPEG链柔性强，计算量是普通大型工作站无法承受的，仅截取所用mPEG-SPA（分子量：5000Da）的十分之一进行计算，因而其计算结构的准确性未知。将截取的PEG16链在Discovery Studio 2.5中通过CDODOCKER操作方法，对接到rLZ-8可能的活性位点上。而后对所有可能影响rLZ-8的氨基酸位置进行一个或多个定点突变，产生的突变体用Amber进行分子动力学模拟的稳定性分析。最后共得到两个对rLZ-8抗肿瘤和与EGFR结合可能性最大的区域：第一个区域由第6位-20位氨基酸组成，第二个区域为第41—74位氨基酸组成。选取其中5个具有代表性位置的氨基酸，为了探究这九个氨基酸每个氨基酸对于抗肿瘤热点区的影响和作用，将九个氨基酸进行排列组合后，分别设计将这九个氨基酸中的部分氨基酸突变为丙氨酸，重新构建质粒、在毕赤酵母表达系统中重组表达突变后的氨基酸序列，按照rLZ-8的纯化工艺进行制备，获得了重组表达的突变体，用重组表达的突变体在与EGFR的亲和力、动物药效学实验中，
对5个突变位点所代表的两个关键性区域（图1）进行分析。rLZ-8的氨基酸序列如附件中氨基酸序列所示。
所选取代表氨基酸为第一个区域（第6位-20位氨基酸）中，由第九位的精氨酸(R9)、第16位赖氨酸（K16），第十八位丝氨酸（S18）。第二个区域（第41—74位氨基酸组成）中的第41位赖氨酸（K41），第55位天冬氨酸（D55）。共得到五个突变体，分别为rLZ-8(K16A/S18A/K41A/D45A)、rLZ-8（K16A/K41A）、rLZ-8（D45A）、rLZ-8（S18A）和rLZ-8（R9A）。
这五个突变体与EGFR的亲和力测试结果显示，rLZ-8(K16A/S18A/K41A/D45A)、rLZ-8（K16A/K41A）、rLZ-8（D45A）和rLZ-8（S18A）这四个突变体的亲和力下降明显，其中rLZ-8(K16A/S18A/K41A/D45A)和rLZ-8（K16A/K41A）几乎与EGFR无亲和力，亲和力常数（KD）仅分别为和。而仅改变一个氨基酸后，rLZ-8（D45A）和rLZ-8（S18A）的亲和力也下降了两个数量级至。rLZ-8（R9A）的亲和力并未有任何明显改变。
在体外细胞活性实验中表明，即使剂量高达100μg/mL，除rLZ-8（R9A）外，其余四种突变体与HepG2细胞膜结合和进入细胞的效率大幅下降，特别是rLZ-8(K16A/S18A/K41A/D45A)，与HepG2细胞膜结合量非常少，而且几乎观察不到其进入细胞。rLZ-8是否入胞是其肿瘤杀伤的重要因素，因此证明了所预测的这两个区域是rLZ-8抗肿瘤和与EGFR结合的重要区域。
在肝癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌动物药效学实验中表明，rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A）、rLZ-8（K16A/K41A）、rLZ-8（D45A）和rLZ-8（S18A）组与阴性对照组相比，肿瘤质量差异不显著，几乎无抑瘤效果。说明所预测的这两个区域，对rLZ-8的抗肿瘤效果起到了决定性作用。当无法与EGFR结合后，其入胞和抗肿瘤药效均显著下降。
通过丙氨酸突变体rLZ-8(K16A/S18A/K41A/D45A)与rLZ-8比较发现，rLZ-8中由这四个位置的氨基酸所组成的区域表面呈正电势，而突变成丙氨酸后，该区域表面呈中性而失去与EGFR结合和抗肿瘤的能力。同时对比其相同家族结构相似的金针菇免疫调节蛋白（FIP-fve），FIP-fve结构中所在相同区域呈负电势而同样不具有与EGFR结合和抗肿瘤的能力。
因此，以增强该区域正电势或减弱其周围负电势作为开发rLZ-8突变体的策略，通过计算机模拟技术的计算，对该区域及其周围负电势区域进行定点突变，定点突变位置为：第6-9位氨基酸（6-LIFR-9）、第16-20位氨基酸（16-KLSFD-20）、第41-46为氨基酸（41-KVLTD-46）和第68-74位氨基酸（68-ESKGSQK-74）。在这些位置中，选取7个突变体作为代表进行重组表达纯化，对该突变策略进行验证。包括rLZ-8丙氨酸突变体在内的所有突变体均通过与rLZ-8相同的发酵纯化工艺，进行质粒构建、蛋白重组表达纯化获得。
经验证，7个突变体经过单个定点突变或者多个定点突变后，除rLZ-8(K41D/K46E/K74E)外，与EGFR的亲和力均有明显提高。其中rLZ-8（D70K）和rLZ-8（L17K/D70K）与rLZ-8相比，亲和力平衡常数分别提高了4倍和6倍。而rLZ-8(K41D/K46E/K74E)由于破坏了rLZ-8关键的结构域，使其亲和力反而下降。
在肝癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌动物药效学实验中表明，rLZ-8（D70K）和rLZ-8（L17K/D70K）组较rLZ-8对照组抑瘤效果显著增强，其余突变体抑瘤效果接近或略好于rLZ-8对照组，并且能在一定程度上显著或者略微延长小鼠的存活率。
说明通过对关键的两个结构区域进行该区域正电势增强或者减弱其周围负电势作为策略得到的定点突变的突变体，同rLZ-8相比，具有显著的对于EGFR亲和力的提高和对EGFR表达异常癌症的抗肿瘤药效的提高。
基于理性设计和对rLZ-8抗肿瘤机制的深入研究，进而对其关键的EGFR结合和抗肿瘤结构域进行定点突变，最终所得到的突变体具有显著优于rLZ-8的抗肿瘤作用。
附图说明
图1 灵芝免疫调节蛋白的关键性区域展示
图2 灵芝免疫调节蛋白及其突变体BL21（DE3）原核表达Western blot鉴定
图注：S为rLZ-8标准品，第1泳道为rLZ-8，第2泳道为rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A），第3泳道为rLZ-8（K16A/K41A），第4泳道为rLZ-8（D45A），第5泳道为rLZ-8（S18A），第6泳道为rLZ-8（R9A），第7泳道为rLZ-8（D70K），第8泳道为rLZ-8（L17K/D70K），第9泳道为rLZ-8（D20H/D68K），第10泳道为rLZ-8（D20H），第11泳道为rLZ-8（L17K），第12泳道为rLZ-8（K41D/K46E/K74E），第13泳道为rLZ-8（K46E/K74E），第14泳道为rLZ-8（K46E）。
图 3 灵芝免疫调节蛋白及其突变体X33毕赤酵母表达Western blot鉴定
图注：S为rLZ-8标准品，第1泳道为rLZ-8，第2泳道为rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A），第3泳道为rLZ-8（K16A/K41A），第4泳道为rLZ-8（D45A），第5泳道为rLZ-8（S18A），第6泳道为rLZ-8（R9A），第7泳道为rLZ-8（D70K），第8泳道为rLZ-8（L17K/D70K），第9泳道为rLZ-8（D20H/D68K），第10泳道为rLZ-8（D20H），第11泳道为rLZ-8（L17K），第12泳道为rLZ-8（K41D/K46E/K74E），第13泳道为rLZ-8（K46E/K74E），第14泳道为rLZ-8（K46E）。
图 4 灵芝免疫调节蛋白及其突变体CHO-S哺乳动物细胞表达Western blot鉴定
图注：S为rLZ-8标准品，第1泳道为rLZ-8，第2泳道为rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A），第3泳道为rLZ-8（K16A/K41A），第4泳道为rLZ-8（D45A），第5泳道为rLZ-8（S18A），第6泳道为rLZ-8（R9A），第7泳道为rLZ-8（D70K），第8泳道为rLZ-8（L17K/D70K），第9泳道为rLZ-8（D20H/D68K），第10泳道为rLZ-8（D20H），第11泳道为rLZ-8（L17K），第12泳道为rLZ-8（K41D/K46E/K74E），第13泳道为rLZ-8（K46E/K74E），第14泳道为rLZ-8（K46E）。
图 5 灵芝免疫调节蛋白及其突变体的免疫印迹检测结果
图注：S为rLZ-8标准品，第1泳道为rLZ-8，第2泳道为rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A），第3泳道为rLZ-8（K16A/K41A），第4泳道为rLZ-8（D45A），第5泳道为rLZ-8（S18A），第6泳道为rLZ-8（R9A），第7泳道为rLZ-8（D70K），第8泳道为rLZ-8（L17K/D70K），第9泳道为rLZ-8（D20H/D68K），第10泳道为rLZ-8（D20H），第11泳道为rLZ-8（L17K），第12泳道为rLZ-8（K41D/K46E/K74E），第13泳道为rLZ-8（K46E/K74E），第14泳道为rLZ-8（K46E），第15泳道为rLZ-8（L17K）。
图6灵芝免疫调节蛋白及其突变体的电泳检测
图注：M为标记物，S为rLZ-8标准品，第1泳道为rLZ-8，第2泳道为rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A），第3泳道为rLZ-8（K16A/K41A），第4泳道为rLZ-8（D45A），第5泳道为rLZ-8（S18A），第6泳道为rLZ-8（R9A），第7泳道为rLZ-8（D70K），第8泳道为rLZ-8（L17K/D70K）。
图7 灵芝免疫调节蛋白及突变体电泳检测结果
图注：M为标记物，S为rLZ-8标准品，第1泳道为rLZ-8，第2泳道为rLZ-8（D20H/D68K），第3泳道为rLZ-8（D20H），第4泳道为rLZ-8（L17K），第5泳道为rLZ-8（K41D/K46E/K74E），第6泳道为rLZ-8（K46E/K74E），第7泳道为rLZ-8（K46E），第8泳道为rLZ-8（L17）。
图8 rLZ-8纯化过程中各阶段样品的电泳检测结果
图注：M为标记物，第1泳道为rLZ-8标准品，第2泳道为阳离子层析后30%的流动相B洗脱样品，第3泳道为60%流动相B洗脱峰2，第4泳道为阳离子层析的流穿样品，第6泳道为终样。
图 9 灵芝免疫调节蛋白30%流动相洗脱样品的HPLC检测
图 10 灵芝免疫调节蛋白60%流动相洗脱样品的HPLC检测
图 11 灵芝免疫调节蛋白纯化终样的HPLC检测
图 12 灵芝免疫调节蛋白通过巨胞饮的方式入胞
图 13 灵芝免疫调节蛋白与EGFR共定位观察
图 14 灵芝免疫调节蛋白与其他膜受体的共定位观察
图 15 灵芝免疫调节蛋白与Rab5、Rab7、Lamp1的共定位现象
图 16 灵芝免疫调节蛋白入胞后细胞变化实时观察
图 17 灵芝免疫调节蛋白撤走后对细胞死亡的影响
图 18 灵芝免疫调节蛋白冻干工艺曲线
具体实施例
本发明中实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
实施例1重组灵芝免疫调节蛋白及其突变体的原核与真核表达
本实施例中“目的蛋白”代表“rLZ-8及其突变体”，“目的基因”代表“rLZ-8及其突变体基因”。
重组灵芝免疫调节蛋白及其突变体的原核表达菌株构建与表达
本实施例采用原核表达系统中具有代表性的大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行目的蛋白表达。目的蛋白基因经密码子优化，并按照pET-28a载体T7启动子方向，在目的基因5’端添加Xba I酶切位点和核糖体结合位点DNA序列，3’端添加终止密码子和Xho I酶切位点进行全基因合成。经Xba I和XhoI双酶切并与pET-28a原核表达载体连接，构建重组表达质粒。经测序验证后，热激转化BL21(DE3)菌株，卡那霉素抗性筛选阳性克隆，得到含有重组表达载体的基因工程菌。将所得基因工程菌置于37℃下培养至OD600≈0.6时，采用IPTG在30 ℃条件下诱导目的蛋白表达，收集菌体破碎后，离心取上清液进行Western blot鉴定。图2结果表明，本发明中rLZ-8及其突变体在原核表达菌株BL21(DE3)中得到表达。rLz-8及其突变体组成型毕赤酵母菌株构建与表达目的蛋白基因按照毕赤酵母密码子偏爱性进行密码子优化，按照组成型表达载体pGAPZα A质粒中GAP启动子方向，在目的基因5’端添加Xho I酶切位点和Kex2、Ste13水解酶位点DNA序列，3’端添加终止密码子和Xba I酶切位点进行全基因合成。通过酶切连接的方法构建重组表达载体，并测序验证。按照Invitrogen公司pGAPZαA质粒说明书，电转化X33毕赤酵母，经Zeocin抗性筛选，获得组成型重组目的蛋白X33毕赤酵母表达菌株。将所得基因工程菌置于30 ℃下培养至OD600≈6，继续培养48小时使目的蛋白分泌表达，离心取上清液进行Western blot鉴定。图3结果表明，本发明中rLZ-8及其突变体在毕赤酵母X33中得到表达。
重组灵芝免疫调节蛋白及其突变体在哺乳动物细胞中的表达
采用Invitrogen公司FreeStyle™ MAX CHO Expression System进行目的蛋白表达。对目的基因密码子进行优化，并添加Asc I和Xho I酶切位点进行全基因合成。
通过酶切连接的方法将目的基因转入pSecTag2 A表达载体中，获得重组目的基因
表达载体。使用FreeStyle™ MAX Reagent将重组目的蛋白表达载体转染导入CHO-S细胞中，利用潮霉素B抗性筛选，获得重组目的蛋白细胞株。在37℃ 8% CO2 135 rpm条件下分泌表达目的蛋白，离心收集上清液Western blot鉴定目的蛋白表达情况。图4结果表明，本发明中rLZ-8及其突变体在哺乳动物细胞CHO-S中得到表达。
实施例2 利用发酵工程技术制备rLZ-8及其突变体
灵芝免疫调节蛋白及其突变体均采用相同的表达载体和菌株进行构建和表达筛选。该实施例中采用由毕赤酵母进行基因组重组构建获得，所获得的菌株经过前期摇瓶培养，筛选可用于发酵罐规模制备使用的工程菌株，以下叙述中使用“目的蛋白”代表rLZ-8及其突变体。
发酵工艺的具体流程
复苏工作种子：从-80℃冰箱取出组成型工作种子，室温缓慢溶解，取出10μL分别接入10mL YPD液体培养基的100mL摇瓶中，28.5℃ 225rpm震荡培养24h。
组成型种子液培养：复苏的工作种子菌液OD值在2-6之间，取菌液1mL，加入2L三角烧瓶内含400mL YPD培养基内， 28.5℃，225rpm，振荡培养，至菌液OD值≈6，可作为上罐用种子液。
罐上培养阶段
①调校设备：校准发酵罐的pH电极（在发酵罐灭菌前用pH校正液进行pH6.86和4.00校正）、溶氧电极（在发酵罐内培养基灭菌并冷却后校正，培养条件的最大通气量、最适温度、最适pH值、最高转数搅拌30min以上校正溶氧电极），并进行蠕动泵的流量校准。
②配制3.5L BSM基础盐培养基加入7.5L发酵罐，4mL消泡剂（可灭菌），121℃，30min高压灭菌培养基、发酵罐及管路。
③待发酵罐内培养基灭菌并冷却后，设置以下参数：温度（29℃），转速为800rpm，通气量8L/min，培养基的pH值为6.0。无菌操作补加0.22μm过滤膜除菌8mL Biotin及17mLPTM1微量元素。
④无菌操作将发酵罐接种口和种子液补料口连接，然后将上述2L三角烧瓶内含有400mL YPD菌液，利用蠕动泵补加进入发酵罐，总体积为3.9L进行发酵培养，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800rpm，温度29℃，维持DO值（溶解氧）在20% 左右，必要时通入纯氧。
⑤此阶段每6h取样1次，测OD600、细胞湿重及细胞干重，分析酵母菌生长状态，
肉眼和镜下观察菌液，排除杂菌污染，并留上清。
⑥按照每升12mL/L PTM1微量元素加入高压灭菌后冷却的50% 甘油中混匀后，用蠕动泵补加进培养基中，补加甘油过程中，DO值不能低于20%，可以通过提高搅拌转速和通纯氧保证氧供给。
⑦对每个菌株各个时间点取样进行SDS-PAGE电泳，以检测其表达量，分析组成型
rLZ-8发酵上清液。
⑧当本次发酵进行到126h时，向罐中补加20mL磷酸，以使一定量的氨水进入培养
液中，作为氮源继续支持发酵，并150h停止培养。
结果及分析
由图5可见，根据Western Blot检测，rLZ-8及其突变体均标成功制备，且表达量较高。如图6所示，rLZ-8及其丙氨酸突变体，均成功表达，并且分子量与第2泳道的标准品保持一致。如图6和7所示，rLZ-8及其经过表面电势优化后的突变体，均成功表达，并且分子量与第1泳道的标准品保持一致。本发明中构建出组成型蛋白的毕赤酵母表达系统，无需给予甲醇诱导即可表达所需蛋白，以甘油作为碳源，其生长速率相比甲醇诱导更满足其表达需要，可同时进行生长与表达，提高发酵效率和效果。
实施例3 灵芝免疫调节蛋白及其突变体的分离纯化工艺
1. 实验方法
经过实验摸索，对发酵液按照微滤、超滤、阳离子交换层析和疏水作用层析的顺序进行rLZ-8及其突变体的分离纯化。由于rLZ-8与其突变体之间理化性质差别较小，因而纯化工艺相似，使用rLZ-8的纯化工艺均可成功制备突变体，并非每种突变体的最佳分离纯化工艺，本实施例中未对任何一种突变体的纯化工艺进行优化。以下文字为对rLZ-8的纯化工艺细节的详尽叙述。
①发酵液微滤处理工艺
用3L注射用水清洗已经保存完好的0.7m2中空纤维微滤柱，清洗去除微滤柱里的50ppm次氯酸钠保护液，用5L含有2000ppm次氯酸钠的0.5M氢氧化钠溶液来清洗柱子，测定pH值及检测内毒素含量。
微滤：离心后的上清液检测电导值和pH值，用微滤柱处理，蠕动泵速率40转/分钟
，1挡。压力表上下都控制在≤0.1Mpa。微滤后用注射用水洗柱，收集洗柱液与样品合并，总体积增加至少为发酵原液体积的0.25倍。
清洗微滤柱，配制5L含有2000ppm次氯酸钠的0.5M氢氧化钠溶液清洗柱子，用10L注射用水清洗至pH值至中性，再用一定量的50ppm次氯酸钠进行保存柱子。
发酵离心上清原液、微滤后样品分别取样，进行SDS电泳检测，发酵离心上清原液
进行细菌内毒素检测。
②发酵液超滤处理工艺
用2L注射用水清洗已经保存完好的0.6 m2膜包，清洗去除膜包中的0.1M氢氧化钠保护液，用1M氢氧化钠3L清洗膜包，再用酸性洗液清洗至pH为中性，测定pH值，水通量。
超滤：微滤处理后的样品用切向流过滤系统浓缩、除盐。设定选择CONC-DIFI-CONC程序进行浓缩，加入20注射用水进行除盐，最后浓缩，根据蛋白的含量确定浓缩的5倍。
超滤结束后，检测样品终pH值，终电导值。
清洗膜包及保存：膜包处理样品后，用5L的1M氢氧化钠进行清洗至初始的水通量，洗至中性，再用0.1M氢氧化钠碱液进行保存。
超滤后的样品进行SDS电泳检测。
③阳离子层析纯化工艺
将粗纯超滤后收集的目的蛋白5L加入阳离子层析的流动相A母液（pH为3.6的0.02M无水醋酸钠溶液）中，进行调节pH值，用冰醋酸调节至pH 到3.6，并用0.22μm滤膜通过板式滤器过滤，准备上样。
平衡色谱柱：用填料Capto S装BPG(140/500)柱，装1.5L填料，用6L注射用水清洗至柱内20%乙醇和0.2M 乙酸钠保护液完全去除，做内毒素检测结果小于0.25EU/ml后方可使用。用流动相A平衡6个柱体积，流速30L/h，设定仪器保护压为2bar，测定电导值，pH值和电导值达到流动相A的相应值即可。
上样：过滤后的样品通过A3泵上样，流速20L/h，上样完成后，收集流穿峰，测定
pH值，电导值范围，280nm紫外吸收值范围，洗脱未结合用8L A相缓冲液进行洗脱，流速30L/h，洗至未结合峰达到起始的紫外吸收值即可，收集未结合峰，测定电导值范围。
洗脱：根据保护压力设定流速，进行阶段性洗脱，10%的流动相B（pH为3.6的含有0.02M无水醋酸钠和1.5M氯化钠溶液）冲洗12L，30%的流动相B冲洗6L，分别洗脱至洗脱峰达到起始的紫外吸收值即可，收集每步洗脱峰。检测电导值范围，280nm紫外吸收值范围，收集的洗脱峰体积，取出一定量做SDS电泳、高效液相（HPLC）检测。各阶段的含有目的蛋白的洗脱峰纯度低于50%则弃掉。
④疏水层析纯化工艺
样品处理：将阳离子超滤后收集的目的蛋白2L按体积加入HIC 的B相母液，进行调
节pH值，用醋酸调节至pH 到5.0，并用0.22μm膜板式过滤，准备上样。
平衡色谱柱：用填料Capto Phenyl装BPG(140/500)柱，装1.0L填料，用5L注射用水清洗至柱内20%乙醇保护液完全去除，再用6L 1M氢氧化钠碱液清洗，再用注射用水清洗至pH值至中性，做内毒素检测，合格后可使用。用流动相B平衡8个柱体积，流速30L/h，设定仪器保护压为2 bar。
上样：过滤后的样品通过上样泵上样，流速20 L/h，上样完成后，收集流穿峰，测定pH值，电导值范围，洗脱未结合用6 L 流动相B缓冲液进行洗脱，流速20 L/h，洗至未结合峰达到起始的紫外吸收值即可，收集未结合峰，测定电导值范围及电泳。
洗脱：设定流速为30L/h进行阶段性洗脱，60%B相洗脱25L，30%B相洗脱6L。分别洗脱至洗脱峰达到起始的紫外吸收值即可，收集每步洗脱峰。检测电导值范围，280nm紫外吸收值范围，收集的洗脱峰体积，取出一定量做SDS电泳、HPLC检测。
各阶段的含有目的蛋白的洗脱峰纯度低于90%则弃掉。
结果与分析
通过rLZ-8对纯化结果进行验证，根据图8中的电泳结果表明，经过阳离子层析30%的流动相B洗脱样品（泳道4）、60%的流动相B中峰2洗脱样品（泳道2）、60%的流动相B中峰1洗脱样品（泳道3）和纯化终样（泳道6），均与标准品（泳道1）中出现的明显条带位置一致，其中30%的流动相B洗脱样品（泳道4）、60%的流动相B中峰1洗脱样品（泳道3）还有明显的杂带，而60%的流动相B中峰2洗脱样品（泳道2）、纯化终样（泳道6）的明显且不含杂带证明纯化方法可行。
而后对相同样品进行液相检测，30%的流动相B洗脱样品（图9）中主峰（峰6）高度突出，但存在7个左右杂峰，根据峰面积计算，纯度约为91%左右。如图10和11所示，60%的流动相B中峰2洗脱样品和纯化终样均只含一个主峰，纯度为100%，液相结果与电泳结果保持一致。
实施例4 灵芝免疫调节蛋白通过巨胞饮的方式入胞
1. 实验方法
借助超高分辨成像系统，通过抑制剂实验、共定位实验等筛查rLZ-8的入胞方式。
①灵芝免疫调节蛋白入胞形态学观察
使用Alexa Fluor 568荧光探针标记rLZ-8，然后将10µg/mL荧光标记rLZ-8作用于Hep G2细胞3h，之后使用超高分辨成像系统观察rLZ-8是否入胞，并使用Imaris图像分析软件对所得图像进行重构拟合与进一步分析。
②抑制剂筛查
选用不同内化方式的抑制剂，EIPA（巨胞饮抑制剂）、Wortmannin/LY294002（PI3K抑制剂）、Nystatin+Progesterone（小窝抑制剂）、Chlorpromazine（网格蛋白抑制剂）等分别作用于Hep G2细胞，来观察其对rLZ-8入胞的抑制效果。
③灵芝免疫调节蛋白入胞对微丝的影响
由于巨胞饮入胞过程中微丝起到重要的作用，能够发生断裂重组，因此考察了rLZ-8入胞对微丝的影响，从而判断其是否为巨胞饮入胞。
④巨胞饮标志物Dextran和BSA分别与rLZ-8的共定位研究
Dextran和BSA为巨胞饮入胞方式的经典标志物，为考察rLZ-8的入胞方式，将rLZ-8和Dextran/BSA共同作用于Hep G2细胞，观察是否有共定位现象。
2. 实验结果
按上述方法对rLZ-8的入胞方式进行了研究，结果如图12所示。
由图12.a可知，rLZ-8能够内化进入细胞，并在细胞核周围形成中空状囊泡，说明rLZ-8是通过某种内化的方式进入细胞的。接下来的抑制剂筛查发现（图12.b和12.c），只有巨胞饮的抑制剂EIPA有效地抑制了rLZ-8的内化，而其他内化方式的抑制剂并未产生抑制效果，这说明rLZ-8极有可能通过巨胞饮入胞。进而根据巨胞饮的特点，对rLZ-8内化过程中微丝的变化进行了观察（图12.d），发现该过程中细胞腹部贯穿状的微丝发生了断裂，这说明微丝参与了rLZ-8的内化。而rLZ-8又与巨胞饮的典型标志物Dextran和BSA存在高度的共定位现象（图12.e）。以上结果表明rLZ-8是通过巨胞饮内化进入细胞的。
实施例5 灵芝免疫调节蛋白与EGFR结合后入胞
1. 实验方法
鉴于rLZ-8的高内化强度可能是由于与细胞膜上受体结合后内化导致，因此对rLZ-8与细胞膜上的受体进行了筛查。使用免疫荧光的方法对细胞膜上不同受体与rLZ-8的关系进行了检测，分别使用EGFR、c-Met、PDGFR、N-cadherin以及LDLR的抗体对其进行荧光标记，分别观察其与rLZ-8的共定位情况。
实验结果
免疫荧光结果如图13所示。从图13中可以看出，随着rLZ-8内化的进行，rLZ-8与EGFR始终保持了高度的共定位现象。而如图14，rLZ-8与其他内化相关的膜受体却始终没有发生共定位现象。因此说明rLZ-8是通过与细胞膜表面EGFR结合，然后发生高强度巨胞饮内化入胞的。
实施例6 灵芝免疫调节蛋白内化后不与溶酶体发生融合
1. 实验方法
正常的巨胞饮内化过程中，内吞物经早期内吞体、晚期内吞体后会与溶酶体发生融合，然后被降解，因此考察了rLZ-8内化入胞后是否同样经历了该过程。通过免疫荧光的方法，分别对Rab5（早期内吞体标志物）、Rab7（晚期内吞体标志物）和Lamp1（溶酶体标志物）进行荧光标记，观察其与rLZ-8的共定位现象。
2. 实验结果
灵芝免疫调节蛋白分别与Rab5、Rab7、Lamp1的共定位现象如图15所示。
由图15.a可知，作用于细胞10min后，rLZ-8与Rab5开始出现共定位现象，30min后共定位现象逐渐消失，随之而来，rLZ-8与Rab7的共定位现象开始出现（图15.b），并持续维持下去，而整个内化过程中，rLZ-8始终未与Lamp1发生共定位（图15.c）。上述结果表明rLZ-8的内化滞留于晚期内吞体阶段，且不与溶酶体发生融合。这可能导致rLZ-8大量积累在晚期内吞体阶段。
实施例7 灵芝免疫调节蛋白内化后引起大量膜占用导致肿瘤细胞死亡
1. 实验方法
使用超高分辨成像系统，实时观察rLZ-8内化后细胞变化的全过程，并结合前面的各项研究，判断出rLZ-8引起肿瘤细胞死亡的原因。
实验结果
实时动态观察结果如图13所示。由图13可知，rLZ-8作用于细胞后，细胞依次发生皱缩，变圆，最后细胞崩解死亡。结合实施例8中rLZ-8入胞后不与溶酶体结合发生降解，而是始终与晚期内吞体发生融合的结果进行分析，rLZ-8内化入胞时形成巨胞饮体的细胞膜会随rLZ-8一起入胞，而由于未被溶酶体降解，该部分细胞膜将不会被重新降解循环回细胞膜表面又由于rLZ-8的持续高强度内化，更多的细胞膜会被不停地带入胞内，从而引起细胞膜的大量占用，细胞会因此发生皱缩，进而崩解死亡。
若确实是这一作用机制，当rLZ-8进入停止后，细胞应不会继续皱缩死亡。
由图17所示，一旦rLZ-8被撤走，其内化行为停止，细胞不但不会继续发生死亡，反而会重新贴壁生长，恢复正常状态。综上，rLZ-8对细胞的杀伤机制为通过与细胞膜上EGFR结合，发生高强度的巨胞饮内化入胞，并滞留在晚期内吞体中，不与溶酶体发生融合，从而引起大量的细胞膜占用，导致细胞发生皱缩、变圆，最终崩解死亡。
实施例8 灵芝免疫调节蛋白突变体对人肝癌细胞原位移植瘤模型小鼠的影响
1、实验方法
①实验材料与试剂
选用6-8周龄的NOG小鼠，体重18-22g，购自于北京维通利华，在东北师范大学SPF级条件下饲养，实验期间控制温度在（20 ± 2）℃，湿度48%，12小时交替照明。人肝癌HepG2细胞株，DMEM培养基，胎牛血清，PBS，胰酶-EDTA，DMSO， 0.05%胰蛋白酶，rLZ-8，rLZ-8突变体，阳性对照药为索拉菲尼。
②仪器设备与器具
二氧化碳恒温培养箱，全自动细胞计数分析仪，台式离心机，电子天平，微量移液器，培养瓶，移液管、固定架，注射器，剪刀，镊子等。
③实验步骤
人肝癌细胞Hep G2细胞选用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2恒温箱中培养。将处于对数生长期的Hep G2细胞经胰酶消化，以无血清DMEM培养液洗涤，调整活细胞浓度为 1×108个/mL，取20 µL细胞悬液（DMEM培养基：Matrigel=1：1）接种于NOG小鼠肝脏原位，建立NOG小鼠Hep G2肝癌细胞原位移植瘤模型。2周后，将模型小鼠随机分组，每组10只。给药方式为尾静脉注射，每天一次，连续注射28天（qd×28, i.v.），阴性对照组注射生理盐水，rLZ-8和其突变体按照0.5 mg/kg的剂量给药，索拉菲尼对照组按照50 mg/kg剂量给药。对实验中途死亡小鼠，在死亡当天称量体重并取出肿瘤组织称重；对给药28天后依然存活的小鼠，经脱颈处死小鼠取出肿瘤组织并称重。详细记录各个实验组中小鼠的死亡时间和死亡数量，分析实验组和对照组的小鼠生存情况计算存活率，存活率=（小鼠总数-死亡小鼠数量）/小鼠总数。
2、实验结果
①灵芝免疫调节蛋白突变体对小鼠体重影响分析
小鼠经尾静脉注射连续给药28天，阴性对照组与索拉菲尼对照组小鼠体重明显降低，rLZ-8对照组小鼠体重无明显变化；rLZ-8突变体中，rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A）、rLZ-8（K16A/K41A）、rLZ-8（D45A）和rLZ-8（S18A）组小鼠体重较实验前出现显著降低，rLZ-8（D70K）和rLZ-8（L17K/D70K）组小鼠体重较实验前略有增加。以上结果表明， rLZ-8和其突变体能调节小鼠的身体状态。而两个突变体（D70K）和rLZ-8（L17K/D70K）与索拉菲尼的联用同样显示出较好的效果。
表格1灵芝免疫调节蛋白突变体对Hep G2肝癌移植瘤模型小鼠体重的影响
Figure 868282DEST_PATH_IMAGE001
② 灵芝免疫调节蛋白突变体对小鼠肿瘤重量的影响
瘤体重量方面：剥离下来的瘤体称重后，每个组计算瘤体重的平均数，可以看出给药28天后，rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A）、rLZ-8（K16A/K41A）、rLZ-8（D45A）和rLZ-8（S18A）组与阴性对照组相比，肿瘤质量差异不显著，几乎无抑瘤效果； rLZ-8（D70K）和rLZ-8（L17K/D70K）组较rLZ-8对照组抑瘤效果显著增强，其余突变体抑瘤效果接近或略好于rLZ-8对照组。以上结果表明：K16/S18/K41/D45为影响rLZ-8抗肿瘤活性的关键氨基酸，在rLZ-8结构上与此区域临近的正电势增强突变或周围负电势的减弱表现出了更好的抗肿瘤效果。而两个突变体（D70K）和rLZ-8（L17K/D70K）与索拉菲尼的联用同样显示出较好的效果。
表格2 灵芝免疫调节蛋白 突变体对Hep G2肝癌移植瘤小鼠肿瘤重量的影响
Figure 785423DEST_PATH_IMAGE002
③灵芝免疫调节蛋白突变体对小鼠存活率的影响
实验结果表明，rLZ-8抗肿瘤活性结构域附近的正电势增强突变体，如rLZ-8（D70K）、rLZ-8（L17K/D70K）等对于延长小鼠存活时间能够起到一定作用。
表格3 灵芝免疫调节蛋白突变体对Hep G2肝癌移植瘤小鼠存活率的影响
Figure 565160DEST_PATH_IMAGE003
综上所述，rLZ-8抗肿瘤活性结构域附近的正电势增强突变体，如rLZ-8（D70K）、rLZ-8（L17K/D70K）等，对人肝癌细胞原位移植瘤模型小鼠表现出了相对于rLZ-8更加良好的抗肿瘤活性，并且对于延长荷瘤小鼠存活时间能够起到一定作用。而突变体与索拉菲尼的联用同样显示出较好的效果。
实施例9灵芝免疫调节蛋白突变体对人肺癌细胞原位移植瘤模型小鼠的影响
1、实验方法
①实验材料与试剂
人肺癌A549细胞株，选用6-8周龄的NOG小鼠，体重18-22g，购自于北京维通利华，在东北师范大学SPF级条件下饲养，实验期间控制温度在（20 ± 2）℃，湿度48%，12小时交替照明。DMEM培养基，胎牛血清，PBS，胰酶-EDTA，DMSO， 0.05%胰蛋白酶，rLZ-8，rLZ-8突变体。
②仪器设备与器具
二氧化碳恒温培养箱，全自动细胞计数分析仪，台式离心机，电子天平，微量移液器，培养瓶，移液管、固定架，注射器，剪刀，镊子等。
③实验分组及给药方式
人肺癌A549细胞选用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、CO2恒温箱中培养。将处于对数生长期的A549细胞经胰酶消化，以无血清DMEM培养液洗涤，调整活细胞浓度为 1×108个/mL，取20 µL细胞悬液接种于NOG小鼠肺原位，2周后，建立NOG小鼠A549肺癌细胞原位移植瘤模型。
2、实验结果
①灵芝免疫调节蛋白突变体对小鼠体重影响分析
灵芝免疫调节蛋白和其突变体能调节A549肺癌移植瘤模型小鼠的身体状态，其中rLZ-8抗肿瘤活性结构域附近的正电势增强突变体对小鼠体重的增加具有一定的正向调节作用。
表格4 灵芝免疫调节蛋白突变体对A549癌移植瘤模型小鼠体重的影响
Figure 524151DEST_PATH_IMAGE004
②灵芝免疫调节蛋白突变体对小鼠肿瘤重量的影响
可以看出给药28天后，rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A）、rLZ-8（K16A/K41A）、rLZ-8（D45A）和rLZ-8（S18A）组与阴性对照组相比，肿瘤质量差异不显著，几乎无抑瘤效果；rLZ-8（D70K）和rLZ-8（L17K/D70K）等突变体组较rLZ-8对照组抑瘤效果显著增强，其余突变体抑瘤效果接近或略好于rLZ-8对照组。
表格5灵芝免疫调节蛋白突变体对A549肺癌移植瘤小鼠肿瘤重量的影响
Figure 338523DEST_PATH_IMAGE005
③灵芝免疫调节蛋白突变体对小鼠存活率的影响
rLZ-8抗肿瘤活性结构域附近的正电势增强突变体，如rLZ-8（D70K）、rLZ-8（L17K/D70K）等相对于rLZ-8可显著延长A549肺癌移植瘤小鼠的存活时间。
表格6 灵芝免疫调节蛋白突变体对A549肺癌移植瘤小鼠存活率的影响
Figure 223303DEST_PATH_IMAGE007
实施例10灵芝免疫调节蛋白突变体对人乳腺癌细胞原位移植瘤模型小鼠的影响
1、实验方法
①实验材料与试剂
人乳腺癌MCF7细胞株，17β雌二醇缓释片，BALB/c雌性裸鼠，DMEM培养基，胎牛血清，PBS，胰酶-EDTA，DMSO， 0.05%胰蛋白酶，rLZ-8，rLZ-8突变体。
②仪器设备与器具
二氧化碳恒温培养箱，全自动细胞计数分析仪，台式离心机，电子天平，微量移液器，培养瓶，移液管、固定架，注射器剪刀，镊子等。
③实验分组及给药方式
人乳腺癌MCF7细胞选用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、CO2恒温箱中培养。实验前 1天在 BALB/c裸鼠颈部皮下埋植 0.5 mg 17β雌二醇缓释片。将处于对数生长期的MCF7细胞经胰酶消化，以无血清DMEM培养液洗涤，将 5×106个MCF7细胞接种于BALB/c裸鼠左侧第二乳房垫内，建立BALB/c裸鼠MCF7乳腺癌细胞原位移植瘤模型。
、实验结果
给药28天后，rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A）、rLZ-8（K16A/K41A）、rLZ-8（D45A）和rLZ-8（S18A）组与阴性对照组相比，肿瘤质量差异不显著，几乎无抑瘤效果； rLZ-8（D70K）和rLZ-8（L17K/D70K）组较rLZ-8对照组抑瘤效果显著增强。
表格7 灵芝免疫调节蛋白突变体对MCF7乳腺癌移植瘤小鼠肿瘤重量的影响
Figure 490336DEST_PATH_IMAGE009
实施例11 灵芝免疫调节蛋白突变体对人结肠癌细胞移植瘤模型小鼠的影响
1、实验方法
①实验材料与试剂
人结肠癌SW480细胞株，BALB/c雄性裸鼠，RPMI1640培养基，DMEM培养基，胎牛血清，PBS，胰酶-EDTA，DMSO， 0.05%胰蛋白酶，rLZ-8，rLZ-8突变体。
②仪器设备与器具
二氧化碳恒温培养箱，全自动细胞计数分析仪，台式离心机，电子天平，微量移液器，培养瓶，移液管、固定架，注射器，剪刀，镊子等。
③实验分组及给药方式
人结肠癌SW480细胞选用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37 ℃、CO2恒温箱中培养。将处于对数生长期的细胞经胰酶消化，以无血清RPMI1640培养液洗涤，将 2×106个细胞接种于BALB/c裸鼠背部皮下，待观察瘤块成型，直径大于0.5 cm时，随机分组，建立人结肠癌SW480细胞移植瘤BALB/c裸鼠模型。
2、实验结果
给药28天后，rLZ-8（K16A/S18A/K41A/D45A）、rLZ-8（K16A/K41A）、rLZ-8（D45A）和rLZ-8（S18A）组与阴性对照组相比，肿瘤质量差异不显著，几乎无抑瘤效果； rLZ-8（D70K）和rLZ-8（L17K/D70K）组较rLZ-8对照组抑瘤效果显著增强。
表格8 灵芝免疫调节蛋白突变体对SW480结肠癌移植瘤小鼠肿瘤重量的影响
Figure 751553DEST_PATH_IMAGE011
实施例12 亲和力测定实验
1. 实验方法
选用Biacore T200仪器（GE公司），通过表面等离子共振技术，对rLZ-8及其突变体对EGFR胞外结构域的亲和力测试。采用CM5芯片作为亲和力测定芯片。
①偶联pH筛选
以EGFR胞外结构域（氨基酸序列25~645）作为配体偶联，将1mgEGFR冻干粉用HEPES缓冲液溶液稀释为浓度400µg/mL待用。准备三个1.5mlEP管，分别取10µL配体，加入90µL不同pH(pH4.5, 5.0, 5.5 )的10mM 醋酸钠,充分混匀，配体最终浓度为40µg/ml。另取1个1.5mlEP管，加入200µL 50mM醋酸钠。结果显示选择pH 5.0的条件进行配体偶联。
②偶联配体
配体分子量是70KDa，分析物分子量（rLZ-8为12.4KDa），每个rLZ-8 抗体理论上可以结合1个EGFR，因此化学计量比Sm等于1.通过下面的公式进行配体偶联量RL的计算。
Figure 420432DEST_PATH_IMAGE012
即
Figure 476112DEST_PATH_IMAGE013
Figure 230442DEST_PATH_IMAGE014
通过实验经验摸索，设定最佳试剂偶联量为3*RL，因此偶联量设定为1700RU。EGFR胞外结构域成功偶联在CM5芯片上。
③待检测样品的准备
在亲和力测试中，为了排除不同浓度对亲和力的影响，每个rLZ-8或者其突变体选用8个浓度进行测试，其中7浓度为梯度浓度，第8个浓度为测试参比浓度，具体浓度如下述表格9所示。
表格9 待检测样品的梯度浓度
Figure 528306DEST_PATH_IMAGE016
2. 实验结果
经过对结果曲线进行拟合和计算后，所测试rLZ-8及其突变体的亲和力结果如下表10。
表格10 灵芝免疫调节蛋白及其突变体的亲和力
名称
Figure 51691DEST_PATH_IMAGE017
)
Figure 481535DEST_PATH_IMAGE018
Figure 785478DEST_PATH_IMAGE019
rLZ-8
Figure 60601DEST_PATH_IMAGE020
Figure 766389DEST_PATH_IMAGE021
Figure 101555DEST_PATH_IMAGE022
rLZ-8(K16A/S18A/K41A/D45A)
Figure 892794DEST_PATH_IMAGE023
Figure 971608DEST_PATH_IMAGE024
Figure 33368DEST_PATH_IMAGE025
rLZ-8(K16A/K41A)
Figure 805014DEST_PATH_IMAGE026
Figure 817970DEST_PATH_IMAGE027
Figure 700475DEST_PATH_IMAGE028
rLZ-8(D45A)
Figure 115276DEST_PATH_IMAGE029
Figure 57824DEST_PATH_IMAGE030
Figure 495759DEST_PATH_IMAGE031
rLZ-8(S18A)
Figure 978693DEST_PATH_IMAGE032
Figure 451262DEST_PATH_IMAGE033
Figure 119705DEST_PATH_IMAGE034
rLZ-8(R9A)
Figure 44935DEST_PATH_IMAGE035
Figure 331560DEST_PATH_IMAGE036
Figure 393057DEST_PATH_IMAGE037
rLZ-8(D70K)
Figure 739725DEST_PATH_IMAGE038
Figure 152252DEST_PATH_IMAGE039
Figure 242567DEST_PATH_IMAGE040
rLZ-8(L17K/D70K)
Figure 424150DEST_PATH_IMAGE041
Figure 177605DEST_PATH_IMAGE042
Figure 77427DEST_PATH_IMAGE043
rLZ-8(D20H/E68K)
Figure 705855DEST_PATH_IMAGE044
Figure 7523DEST_PATH_IMAGE045
Figure 368097DEST_PATH_IMAGE046
rLZ-8(D20H)
Figure 817533DEST_PATH_IMAGE047
Figure 187335DEST_PATH_IMAGE048
Figure 140247DEST_PATH_IMAGE049
rLZ-8(L17K)
Figure 937302DEST_PATH_IMAGE050
Figure 546138DEST_PATH_IMAGE051
Figure 280482DEST_PATH_IMAGE052
rLZ-8(K41D/K46E/K74E)
Figure 291164DEST_PATH_IMAGE053
Figure DEST_PATH_IMAGE054
Figure DEST_PATH_IMAGE055
rLZ-8(K46E/K74E)
Figure DEST_PATH_IMAGE056
Figure DEST_PATH_IMAGE057
Figure DEST_PATH_IMAGE058
共对12种突变体进行亲和力测定，结果显示对于关键的抗肿瘤结合区域进行的丙氨酸隐性突变体（rLZ-8(K16A/S18A/K41A/D45A)、rLZ-8(K16A/K41A)、rLZ-8(D45A)、rLZ-8(S18A)），亲和力下降明显，下降了两到三个数量级。
而通过对蛋白质表面电势的计算，选择几个代表性的突变位置（如第70位、20位等），对极大可能增强表面正电势的氨基酸进行的突变，结果显示突变体rLZ-8(D70K)、rLZ-8(L17K/D70K)、rLZ-8(D20H/E68K)的亲和力分别提高了2.3倍、6倍和1.4倍。
实施例 13 灵芝免疫调节蛋白及其突变体的冻干粉剂型
1.实验方法
选用美国VirTis Wizard 2.0冻干机对rLZ-8及其突变体的冻干处方、冻干工艺进行摸索和确定。
①灵芝免疫调节蛋白及其突变体的冻干处方
通过单因素实验的考察，对影响冻干处方剂型的稳定剂、表面活性剂进行考察，确定添加不同的辅料对于蛋白质含量、纯度、不溶性微粒和活性的影响。其中主要活性物质与稳定剂采用质量比1：5，主要活性物质与稳定剂采用质量比20：1。
通过处方组合后进行的筛选，确定最佳的冻干处方。基础处方设计如下表。
表格11 灵芝免疫调节蛋白及其突变体的处方设计
Figure DEST_PATH_IMAGE060
②灵芝免疫调节蛋白及其突变体的冻干工艺
通过对冻干过程中生化干燥温度选取-23 ℃、-25 ℃、-27 ℃、-29 ℃、-31 ℃、-33 ℃六个水平，真空度选取100mTorr、150 mTorr、200 mTorr、250 mTorr、300 mTorr、350mTorr六个水平，冻干时间选取50h、60h、70h、80h、90h、100h六个水平，以性状为考察指标分别进行单因素实验。解析干燥温度选取25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃六个水平，干燥时间选取15h、20h、25h、30h、35h、40 h六个水平，真空度选取100mTorr、150 mTorr、200mTorr、250 mTorr、300 mTorr、350 mTorr六个水平，以水分为考察指标分别进行单因素实验。
实验结果
① rLZ-8及其突变体的冻干处方
根据表13的数据结果显示，在高温条件下，各个稳定剂对rLZ8的影响，10天与0天对比各指标降幅较小，均可应用于处方筛选的后续工作中。
表格12 稳定剂对灵芝免疫调节蛋白的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE061
根据表13的数据结果显示，在高温条件下，各个表面活性剂对灵芝免疫调节蛋白的影响，10天与0天对比各指标降幅较小，可应用于处方筛选的后续工作中。
表格13表面活性剂对灵芝免疫调节蛋白的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE062
处方组合筛选实验结果见表14，数据表明，处方3、6、9在放样过程中各个数据指标变化较大，1、2与4、5、7、8相比不溶性微粒量及变化量无明显差别，处方4、5、7、8中含有表面活性剂，可能会对后续毒性实验差生影响。处方1、2均可用作备用处方，但由于处方2中注射级乳糖来源较为困难，因此选用处方1作为冻干处方。
表格14 灵芝免疫调节蛋白的冻干处方筛选结果
Figure DEST_PATH_IMAGE063
②灵芝免疫调节蛋白及其突变体的冻干工艺
经过冻干条件摸索后，确定最佳冻干工艺为升华干燥条件确定为温度-30℃，真空度300mTorr，干燥时间90h，解析干燥温度40℃，真空度250mTorr，干燥时间30h。图18为冻干曲线，在此条件下的冻干样品性状水分均达到合格要求。
灵芝免疫调节蛋白的突变体在相同冻干处方和冻干工艺条件上，同样可以得到冻干性状和水分合格的冻干粉。
SEQUENCE LISTING
<110> Changchun Intellicrown Pharmaceutical Co.LTD
张, 喜田
孙, 非
<120> 重组灵芝免疫调节蛋白突变体及其应用
<130> 2019102501223240
<140> CN 201710226093.3
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<151> 2017-04-08
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant K16A/S18A/K41A/D45A
<400> 1
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1 5 10 15
Leu Ala Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn
20 25 30
Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Ala Val Leu Thr Ala Lys Ala Tyr
35 40 45
Thr Tyr Arg Val Ala Val Ser Gly Arg Asn Leu Gly Val Lys Pro Ser
50 55 60
Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val
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Val Asp Pro Asp Thr Asn Asn Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn
100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant K16A/K41A
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1 5 10 15
Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn
20 25 30
Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Ala Val Leu Thr Asp Lys Ala Tyr
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant D45A
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20 25 30
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<213> Artificial Sequence
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35 40 45
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50 55 60
Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val
85 90 95
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant K41D/K46E/K74E
<400> 11
Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Phe Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn
20 25 30
Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Asp Val Leu Thr Asp Glu Ala Tyr
35 40 45
Thr Tyr Arg Val Ala Val Ser Gly Arg Asn Leu Gly Val Lys Pro Ser
50 55 60
Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Lys Glu Val Asn Phe Leu Glu
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe
85 90 95
Val Val Asp Pro Asp Thr Asn Asn Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn
100 105 110
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant K46E/K74E
<400> 12
Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Phe Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn
20 25 30
Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Lys Val Leu Thr Asp Glu Ala Tyr
35 40 45
Thr Tyr Arg Val Ala Val Ser Gly Arg Asn Leu Gly Val Lys Pro Ser
50 55 60
Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Glu Val Asn Phe Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val
85 90 95
Val Asp Pro Asp Thr Asn Asn Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn
100 105 110
<210> 13
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant K46E
<400> 13
Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Phe Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn
20 25 30
Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Lys Val Leu Thr Asp Glu Ala Tyr
35 40 45
Thr Tyr Arg Val Ala Val Ser Gly Arg Asn Leu Gly Val Lys Pro Ser
50 55 60
Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val
85 90 95
Val Asp Pro Asp Thr Asn Asn Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn
100 105 110

Claims (9)

1.一种具有癌症治疗用途的蛋白质突变体，其特征在于，所述突变体来自于对重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）的人为突变，其氨基酸序列选自以下任意一种；
所述的突变体氨基酸序列如SEQ NO:5所示;
所述的突变体氨基酸序列如SEQ NO:6所示;
所述的突变体氨基酸序列如SEQ NO:7所示;
所述的突变体氨基酸序列如SEQ NO:9所示;
所述的突变体氨基酸序列如SEQ NO:10所示;
所述的突变体氨基酸序列如SEQ NO:12所示;
所述的突变体氨基酸序列如SEQ NO:13所示。
2.如权利要求1所述的突变体，可由以下任意一种基因工程技术所得的重组表达系统获得，包括原核表达系统、真菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
3.权利要求1所述突变体在制备治疗EGFR表达异常的肿瘤的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，所述肿瘤为肝癌。
5.如权利要求3所述的应用，所述肿瘤为肺癌。
6.如权利要求3所述的应用，所述肿瘤为乳腺癌。
7.如权利要求3所述的应用，所述肿瘤为直肠结肠癌。
8.如权利要求5所述的应用，所述药物的剂型为冻干粉、注射液、片剂或吸入剂。
9.如权利要求3所述的应用，所述药物可单独应用或与其他药物联用。
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