CN104817634B - 一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种草菇免疫调节蛋白FIP‑vvo98及其制备方法，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。制备方法包括：(1)采用重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导重组草菇免疫调节蛋白FIP‑vvo98的表达；(3)超声破碎获取所表达的草菇免疫调节蛋白FIP‑vvo98。根据本发明的对机体具有免疫调节作用的真菌免疫调节蛋白及其基因序列，可以制备出提高人体免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所导致的疾病的危害。

Description

一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98及其制备方法

技术领域

本发明属于真菌免疫调节蛋白领域，特别涉及一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98及其制备方法。

背景技术

利用大型真菌(蘑菇)及其活性物质治疗人类疾病在亚洲国家有着悠久的历史，可以追溯到公元前3000年，由于其在免疫调节和抗癌方面的出色表现，近十年来在西方国家也逐渐受到重视。过去对于大型真菌活性物质的研究多集中在多糖和三萜，对于蛋白质的研究相对较少，但随着生物技术在药物研究和开发中的应用，特别是对中草药中基因、蛋白和药理作用之间关系研究的逐渐深入，真菌蛋白逐步得到了重视，其中真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein，FIP)，由于其具有广泛的免疫生物活性，而备受国内外关注。

真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein，FIP)是从高等担子菌中分离得到的一类具有免疫调节活性的小分子蛋白质，其结构与功能与植物凝集素和免疫球蛋白重链可变区相似，具有促进淋巴细胞增殖、调控细胞周期、诱发细胞凋亡、影响细胞因子的表达、活化细胞粘附分子和抗过敏反应等免疫调节作用，拥有良好的临床应用前景和药用保健价值。自1989年，日本人Kino从灵芝(Ganoderma lucidum)子实体中分离到第一个真菌免疫调节蛋白，命名为Ling Zhi-8(LZ-8)，并对其基因序列，氨基酸顺序和免疫生理活性进行了测定。到目前为止，共有8种FIPs被分离纯化出来，它们来自于灵芝(Ganodermalucidium)，松杉灵芝(G.tsugae)，紫芝(G.japoncium)，小孢子灵芝(G.microsporum)，甜灵芝(G.sinense)拱状灵芝(G.fornicatum)，金针菇(Flammulina velutipes)和草菇(Volvariella volvacea)，分别被命名为LZ-8(FIP-glu),FIP-gts,FIP-gja(AY987985),FIP-gmi,FIP-sin,FIP-gfo，FIP-fve和FIP-vvo,共同组成了一个新的蛋白质家族–FIPs。在FIPs家族中除了金针菇免疫调节蛋白(FIP-fve)和草菇免疫调节蛋白(FIP-vvo)以外，其他的FIPs都是从不同种灵芝中分离得到的，这说明虽然都是灵芝但由于种类的不同，而具有不同的免疫调节蛋白，甚至同种灵芝中就存在多种免疫调节蛋白。例如叶波平等从灵芝(G.microsporum)中分离到3个蛋白质：LZP-1、LZP-2和LZP-3。体外实验表明3种灵芝蛋白具有较强的促进淋巴细胞增殖活性，而且SDS-PAGE表明其分子量与LZ-8不同，所以他们获得了3种新的灵芝免疫调节蛋白。这样的情况同样发生在草菇中。除了1997年Hsu,H.C.等人在草菇子子实体中通过分离纯化和验证，并经过直接氨基酸测序得到由112个氨基酸组成的分子量约为12.67KDa的一种草菇免疫调节蛋白(FIP-vvo)以外，还有可能存在其它种草菇免疫调节蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98及其制备方法，通过比较基因组等生物信息学方法筛选到一种同样来源于草菇，但基因序列和氨基酸序列都不同于FIP-vvo的具有免疫调节作用的免疫调节蛋白FIP-vvo98，其适用于在保健品和医药中使用。

本发明提供了一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。该草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98全长113个氨基酸，理论分子量为12.81kDa。

本发明还提供并合成了编码上述草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的基因。该基因cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过一对引物FIP-vvo98-F(NdeI 5’-CAT ATG TCT ACC GAT TTG A-3’)和FIP-vvo98-R(EcoRI 5’-CTT AAG TTA TTC CAT TGG GCA-3’)。用基因克隆的方法得到了这一草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的基因序列，DNA全序列分析结果表明，FIP-vvo98基因全长338bp。

该蛋白属于一种草菇免疫调节蛋白。将其cDNA序列在GenBank中进行BLAST比对，没有发现与其相似的基因序列，而将其氨基酸序列在NCBI的无冗余蛋白序列数据库(nr)中进行BLAST比对发现，该蛋白与来源于平盖灵芝(G.applanatum)免疫调节蛋白的相似性达到62％，与来源于赤芝(G.lucidum)免疫调节蛋白的相似性达到61％，与来源于小孢子灵芝(G.microsporum)免疫调节蛋白的相似性达到63％，与金针菇(F.velutipes)免疫调节蛋白FIP-fve为55％。说明FIP-vvo98是一种新的真菌免疫调节蛋白，其编码的基因是一个新的基因。并为此编码此蛋白的基因改造和在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因资源。

本发明还提供了包含上述草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98基因的重组载体，优先选为pET-28b(+)。将本发明的草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的方案，优选为将草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98基因插入到pET-28b(+)上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，得到重组大肠表达质粒pET-FIP-vvo98。

本发明还提供了包含了上述草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98基因的重组菌株，优选为重组菌株BL21-FIP-vvo98。

本发明还提供了一种制备草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的方法，包括以下步骤：

1.上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2.培养重组菌株，诱导重组草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的表达；

3.超声破碎获取所表达的草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞，优选将重组表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21-FIP-vvo98。运用基因工程手段来产业化生产草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98产品还未见报道。本发明首次提供了一个真菌免疫调节蛋白FIP-vvo98，可作应用于保健品和医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98。

本发明利用生物信息学的方法，在草菇基因组中发现了一种与已知草菇免疫调节蛋白(FIP-vvo)差异性达到5％即相似性为95％的新的草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98及其编码基因序列。并利用分子生物学和生物工程技术，构建高效表达这种草菇免疫调节蛋白的工程菌株，利用超声破碎得到重组草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98，对其进行了免疫学功能鉴定。本发明不仅丰富了FIPs的种类，而且为深入开展全新草菇免疫调节蛋白的开发及应用奠定基础。

有益效果

根据本发明的对机体具有免疫调节作用的真菌免疫调节蛋白及其基因序列，可以制备出提高人体免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所导致的疾病的危害。

附图说明

图1为本发明的草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析；其中，1为表达载体蛋白；2为分子量标准；3为重组菌株蛋白BL21-FIP-vvo98。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

1.细胞株：Jurkat细胞。

2.试剂盒、酶类、生化试剂和仪器：

试剂盒：ELISA KIT 96T Human IL-2试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。96孔培养板，血球计数板。

PCR引物合成和基因测序均由上海生工生物公司完成。

酶类：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。

仪器：离心机；振荡摇床；显微镜；酶标仪。

生化试剂：氨苄青霉素，卡那霉素，青霉素，链霉素,胎牛血清(FBS)。

3.培养基：RPMI-1640培养液(含10％的FBS，青霉素100U/mL,链霉素100U/mL,0.056％NaHCO₃,调节pH值至7.4),0.22μn滤膜过滤灭菌后4℃保存。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1

草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98编码基因fip-vvo98的筛选和克隆

将草菇所有基因序列在Pfam蛋白结构域数据库中搜索，得到9084个分为2970种的结构域数据信息，然后与灰盖鬼伞、双孢蘑菇、裂褶菌和糙皮侧耳等不含有免疫调节蛋白的食用真菌基因组的结构域数据相比对，发现草菇免疫调节蛋白FIP-vvo和一个未知蛋白具有相同的结构域，并且它们的GO注释(GO:0030246和GO:0002698)完全相同，GO注释信息显示这2个基因表达的蛋白都具有免疫调节功能。这个蛋白与草菇免疫调节蛋白FIP-vvo的相似性达到95％。因此，从草菇基因组出发，通过生物信息学方法，发现了一种具有免疫调节作用的草菇免疫调节蛋白基因fip-vvo98。根据得到的fip-vvo98基因序列设计了一对引物FIP-vvo98-F(NdeI 5’-CAT ATG TCT ACC GAT TTG A-3’)和FIP-vvo98-R(EcoRI 5’-CTTAAG TTA TTC CAT TGG GCA-3’)，用基因克隆的方法克隆了来源于菌株Volvariellavolvacea V23(其ACCC保藏号为：50897)的草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98基因，DNA全序列分析结果表明，FIP-vvo98全长338bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

重组草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的制备

将表达载体pET-28b(+)进行双酶切(EcoRI和NdeI)，同时将合成的编码草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的基因片段双酶切(EcoRI和NdeI)，切出编码成熟草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的基因片段与表达载体pET-28b(+)连接，获得含有草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98基因的重组质粒pET-FIP-vvo98并转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌株BL21-FIP-vvo98。

分别吸取1mL含有重组菌株BL21-FIP-vvo98菌株和含有表达载体pET-28b(+)的BL21菌株的37℃过夜摇好的新鲜菌液接种于100mL含有(50μg/mL)卡那霉素LB培养液中，37℃，250rpm/min，2h，OD≈0.3，加入200μL浓度为50mg/mL的IPTG，25℃，250rpm/min，诱导培养4h后，离心收集菌体。然后用于超声破碎(工作3s，间歇5s，工作电压300W，全程20-30min)，并离心收集上清。研究结果显示重组草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的表达量为118mg/L。SDS-PAGE结果表明，重组草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98在大肠杆菌中得到了表达。所表达的草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98含量达到电泳纯(图1)。

实施例3

重组草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的促细胞因子白介素IL-2分泌活性测定

通过ELISA方法检测重组免疫调节蛋白促进人白血病细胞Jurkat细胞分泌白介素(IL-2)的作用，以测定其免疫调节活性。

将Jurkat细胞悬浮液倒入15mL离心管中，1000rpm/min,离心3min，去除上清。加入2mL的RPMI-1640培养液(含10％的FBS，青霉素100U/mL,链霉素100U/mL,0.056％NaHCO₃，调节pH值至7.4)重新悬浮细胞。将细胞悬浮液转移至培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱内常规培养至对数生长期。

将对数生长期的Jurkat细胞悬浮液稀释至1×10⁷细胞/mL，按每孔200μL接种于96孔培养板，分别加上重组免疫调节蛋白和表达载体蛋白PBS溶液，使总蛋白终浓度为10μg/mL。另设阴性对照组(只加细胞和培养液，PBS取代样品)和阳性对照组(只加PMA、PHA、细胞和培养液，不加样品)。每个样品做3个平行孔。在37℃培养箱中培养48h。

吸出细胞培养液于1.5mL离心管中，1000rpm/min,离心3min，收集上清。根据ELISAKIT96T Human IL-2试剂盒的说明书进行白介素2的检测。

加入100μL样品、阴性对照组(只加细胞和培养液，PBS取代样品)和阳性对照组(只加PMA、PHA、细胞和培养液，不加样品)上清，同时取标准品人IL-2，分别稀释至终浓度为31.52、125、250、500pg/mL作为阳性对照和制作标准曲线，用PBS做阴性对照，加每个样品做2个平行孔。

放于37℃培养箱中培养90min，小心吸出上清液，每孔350μL洗涤液洗涤4次，倒置滤纸上，尽量空干液体，最后一次拍干。

每孔加入100μL生物素化抗体工作液，放于37℃培养箱中培养60min。洗涤液洗板同上。

每孔加入100μL酶结合物工作液，放于37℃培养箱中培养30min。洗涤液洗板同上。

每孔加入100μL显色液，放于37℃培养箱中暗反应10-20min。

每孔加入100μL终止液，立即放入酶标仪，于450nm测定吸光值并记录读数，5min内完成此步操作。制作标准曲线并计算样品中IL-2含量。

研究结果表明1μg重组免疫调节蛋白FIP-vvo98促进人白血病细胞Jurkat细胞分泌白介素2(IL-2)含量在129.237pg。

Claims (8)

1.一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种含如权利要求1所述的草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的重组载体。

3.根据权利要求2所述的一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的重组载体，其特征在于：所述重组载体为pET-28b(+)。

4.根据权利要求3所述的一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的重组载体，其特征在于：将草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98基因插入到pET-28b(+)上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，得到重组载体pET-FIP-vvo98。

5.一种含如权利要求1所述的草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的重组菌株。

6.根据权利要求5所述的一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株为BL21-FIP-vvo98。

7.一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的制备方法，包括：

(1)采用权利要求2或3的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导重组草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的表达；

(3)超声破碎获取所表达的草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98。

8.根据权利要求7所述的一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo98的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。