CN111892648B - 偶联tlr7激动剂的新型冠状病毒多肽疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了偶联TLR7激动剂的新型冠状病毒多肽疫苗及其应用。具体地，本发明基于SARS‑CoV‑2的S蛋白的RBD序列和结构信息的解析研究，提供了新型冠状病毒肺炎的疫苗多肽，所述的疫苗多肽具有下式结构：Z‑(J‑U)n，式中，Z、J、U、n等如说明书中所定义。本发明还提供含有所述疫苗多肽的疫苗组合物及其应用。实验表明，本发明的疫苗多肽可使小鼠和食蟹猴启动较强的细胞和体液免疫作用，产生阻断RBD与ACE2结合的中和抗体，可用于防治新型冠状病毒肺炎。

Description

偶联TLR7激动剂的新型冠状病毒多肽疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及多肽药物和多肽疫苗领域，具体地，涉及偶联TLR7小分子激动剂的新型冠状病毒多肽疫苗及其应用。
背景技术
由冠状病毒SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease2019,COVID-19)具有极高的传染性，已在全球范围引起严重疫情，危及数百万人的生命安全。然而，目前尚缺乏针对COVID-19的明确有效的预防和治疗药物及措施，临床上暂以支持治疗和对症治疗为主。
通过疫苗建立起对SARS-CoV-2的群体免疫，是控制和阻断COVID-19疫情的最终途径。目前已有多种类型的COVID-19疫苗处于临床前和临床试验中，包括减毒活疫苗、灭活病毒疫苗、重组病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗和多肽疫苗等。
然而，目前开发的疫苗所产生的免疫保护作用有限，例如存在免疫原性低、病毒免疫逃逸等问题。
因此，本领域迫切需要开发新的高效激发人体产生针对SARS-CoV-2的免疫应答的疫苗，以便在接种者中产生阻断型的抗SARS-CoV-2抗体，从而提供有力的免疫保护作用。
发明内容
本发明目的就是提供一种新的高效激发人体产生针对SARS-CoV-2的免疫应答的疫苗，进而在接种者中产生阻断型的抗SARS-CoV-2抗体，从而提供有力的免疫保护作用。
在本发明的第一方面，提供了一种新型冠状病毒的疫苗多肽，所述的疫苗多肽包括抗原多肽以及任选地与所述抗原多肽偶联的TLR7激动剂。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽具有式V结构或包含式V结构的寡聚体：
Z-(U)n (V)
式中，
Z为抗原多肽，所述抗原多肽具有新型冠状病毒S蛋白的至少一个T细胞表位和/或至少一个B细胞表位；并且，所述的抗原多肽具有衍生自S蛋白的RBM区域的氨基酸序列；
U各自独立地为TLR7激动剂；
n为0或正整数；
“-”为化学键或接头或连接子。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽具有式I结构或包含式I结构的寡聚体：
Z-(J-U)n (I)
式中，
Z为抗原多肽，所述抗原多肽具有新型冠状病毒S蛋白的至少一个T细胞表位和/或至少一个B细胞表位；并且，所述的抗原多肽具有衍生自S蛋白的RBM区域的氨基酸序列；
U各自独立地为TLR7激动剂；
n为0或正整数；
J为化学键或连接子。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物和啮齿动物产生阻断RBD与ACE2结合的中和抗体。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物产生细胞免疫和体液免疫。
在另一优选例中，所述的灵长动物包括人、非人灵长类动物。
在另一优选例中，所述抗原多肽的长度为8-100个氨基酸，较佳地10-80个氨基酸。
在另一优选例中，所述的抗原多肽具有衍生自新型冠状病毒S蛋白的RBD区域的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗原多肽具有衍生自RBD区域的RBM区域的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的RBM区域指新型冠状病毒RBD蛋白的第438-506位氨基酸。
在另一优选例中，所述的抗原多肽“具有衍生自RBD蛋白的RBM区域的氨基酸序列”指所述抗原多肽的氨基酸序列与RBM区域的具有同源性(或同一性)，且所述同源性≥80％，较佳地≥85％，更佳地≥90％，最佳地≥95％。
在另一优选例中，所述的抗原多肽与新型冠状病毒的S蛋白竞争性结合人ACE2蛋白。
在另一优选例中，所述的“竞争性结合”指所述的抗原多肽与新型冠状病毒的S蛋白结合于相同或基本相同的人ACE2蛋白的结合域(或氨基酸区段)。
在另一优选例中，所述的抗原多肽与新型冠状病毒的S蛋白结合于人ACE2蛋白上的相同的结合区段。
在另一优选例中，所述的竞争性结合包括阻断性或非阻断性的竞争性结合。
在另一优选例中，所述的抗原多肽为人工合成的或重组的抗原多肽。
在另一优选例中，所述的抗原多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID No:1-12中任一所示的氨基酸序列的多肽；
(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
在另一优选例中，所述的“基本相同的功能”指所述的衍生多肽具有基本相同的激发免疫反应的免疫原性，与新型冠状病毒的S蛋白竞争性结合人ACE2蛋白的活性，和/或具有至少一个T细胞表位，和/或具有至少一个B细胞表位。
在另一优选例中，所述的抗原多肽的结构如式II所示：
X1-X-X2 (Ⅱ)，
式中，
(a)X为核心片段,其中，所述的核心片段的序列选自SEQ ID NO:1-12(见表A)中的一个或多个；
(b)X1、X2各自独立地为无、1、2或3个氨基酸，且X1和X2的氨基酸个数总和≤4，较佳地，3、2、1，更佳地为0或1；
(c)“-”表示肽键、肽接头、或其他连接子(即X1与X之间和/或X与X2之间，以肽键、肽接头(如1-15个氨基酸构成的柔性接头)或其他连接子相连)。
在另一优选例中，所述的抗原多肽选自表A：
表A抗原多肽
Figure BDA0002529579320000031
Figure BDA0002529579320000041
在另一优选例中，X1、X2各自独立地为无、K、C、G、L、A。
在另一优选例中，X1为无、K、或C。
在另一优选例中，X2为无、K、或C。
在另一优选例中，所述抗原多肽具有新型冠状病毒S蛋白RBD区的至少一个T细胞表位和/或至少一个B细胞表位。
在另一优选例中，所述抗原多肽具有新型冠状病毒S蛋白RBM区的至少一个T细胞表位和/或至少一个B细胞表位。
在另一优选例中，所述的抗原多肽具有至少一个T细胞表位，较佳地1、2、3或4个T细胞表位，更佳地1或2个T细胞表位。
在另一优选例中，所述的抗原多肽具有至少一个B细胞表位，较佳地1、2、3或4个B细胞表位，更佳地1或2个B细胞表位。
在另一优选例中，所述的抗原多肽具有1-2个T细胞表位和0-2个B细胞表位，较佳地1-2个T细胞表位和0-1个B细胞表位。
在另一优选例中，TLR激动剂的分子数n为1、2、3、4、5或6；较佳地为1，2，3或4。
在另一优选例中，所述的TLR7激动剂为小分子激动剂。
在另一优选例中，所述的TLR7激动剂包括：SZU-101:
Figure BDA0002529579320000042
在另一优选例中，TLR7激动剂(如SZU-101)连接于抗原多肽的末端氨基或侧链氨基。
在另一优选例中，TLR7激动剂(如SZU-101)连接于抗原多肽的巯基。
在另一优选例中，所述的SZU-101连接于抗原多肽的氨基，并形成S1所示结构：
Figure BDA0002529579320000051
或者
所述的SZU-101连接于抗原多肽的巯基，并形成S2所示结构：
Figure BDA0002529579320000052
在另一优选例中，所述的TLR7激动剂定点和/或随机地连接于所述的抗原多肽(即式I中，所述的U定点和/或随机地连接于Z)。
在另一优选例中，所述的U定点连接于Z。
在另一优选例中，所述的U定点连接于抗原多肽Z的选自下组的氨基酸位点：G、K、L、A、C或其组合。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽选自下组的偶联肽：
(S1)-GVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRK-(S1)
其中，SZU-101与氨基酸序列中G的N端氨基和K的侧链氨基通过S1结构连接；
(S1)2-KGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYR
其中，SZU-101与氨基酸序列中K的N端和侧链氨基通过S1结构连接；
(S1)-LFRK(-S1)SNLK(-S1)PFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT
NGVGYQPY
其中，SZU-101与氨基酸序列中L的N端氨基和K的侧链氨基通过S1结构连接；
GVEGFNC(-S2)YFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRK
其中，SZU-101与氨基酸序列中C上的巯基通过S2结构相连；
(S2)-CYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS
其中，SZU-101与多肽中C上的巯基通过S2结构相连；
(S2)-CYAWNRKRISN
其中，SZU-101与多肽中C上的巯基通过S2结构相连；
(S2)-CVADYSVLYNSASFSTFK
其中，SZU-101与多肽中C上的巯基通过S2结构相连；
并且S1和S2结构如上定义。
在另一优选例中，所述的偶联肽选自表B：
表B偶联肽
Figure BDA0002529579320000061
注：表中，S1和S2表示SZU－101的上述连接结构。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽选自下组：P-37或其与TLR7激动剂的偶联物、P-67-F1或其与TLR7激动剂的偶联物、P-71或其与TLR7激动剂的偶联物、LV54或其与TLR7激动剂的偶联物、或其组合。
在另一优选例中，所述的TLR7激动剂为SUZ-101。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的肽集合，所述的肽集合包括至少两种的本发明第一方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽。
在另一优选例中，所述的肽集合中至少含有2-20种(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种)所述的疫苗多肽。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第一方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或本发明第二方面所述的肽集合和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗组合物。
在另一优选例中，所述疫苗组合物为单价或多价。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有佐剂,首选各种铝佐剂。组合物中活性肽和佐剂(如铝)的摩尔数或重量比在1:100之间，优选为1:40到1:60之间。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液态、固体、或凝胶态。
在另一优选例中，所述的药物组合物用选自下组的方式施用：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化吸入。
在本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或第二方面所述的肽集合或第三方面所述的药物组合物的用途，它们被用于制备预防冠状病毒SARS-CoV-2感染或其相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述的冠状病毒SARS-CoV-2相关疾病选自下组：呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。
在另一优选例中，所述的冠状病毒SARS-CoV-2相关疾病为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
在本发明的第五方面，提供了一种细胞制剂，所述的细胞制剂包括(a)用本发明第一方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或本发明第二方面所述的肽集合免疫激活的免疫细胞；和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：树突状细胞、自然杀伤细胞NK、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的激活为体外激活。
在另一优选例中，所述的体外激活包括：在所述的疫苗多肽存在下，培养所述的免疫细胞一段时间(如6-48小时)，从而获得经免疫激活的免疫细胞。
在另一优选例中，所述的细胞制剂为含活细胞的液态制剂。
在另一优选例中，所述的细胞制剂通过静脉给药方式回输。
在本发明的第六方面，提供了一种产生针对冠状病毒SARS-CoV-2的免疫反应的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽、第二方面所述的肽集合或第三方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括非人灵长动物(如猴)。
在另一优选例中，所述方法在所述对象中诱导产生针对冠状病毒SARS-CoV-2的中和抗体。
在另一优选例中，所述中和抗体阻断冠状病毒SARS-CoV-2与人ACE2蛋白的结合。
在本发明的第七方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括载体蛋白以及与所述融合蛋白融合的本发明第一方面所述的疫苗多肽。
在另一优选例中，所述的融合蛋白具有式Ⅲa或Ⅲb结构：
P1-P2 (Ⅲa)
P2-P1 (Ⅲb)
式中，P1为本发明第一方面所述的疫苗多肽，P2为载体蛋白。
在另一优选例中，所述的P1可以是单个疫苗多肽，也可以是串联的多个相同或不同的疫苗多肽(或抗原多肽)。
在另一优选例中，所述的P1偶联于一个或多个TLR7激动剂。
在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，它包括(a)用本发明第七方面所述的融合蛋白或被其免疫激活的免疫细胞；和(b)药学上可接受的载体。
在本发明的第九方面，提供了本发明第七方面所述的融合蛋白或第八方面所述的药物组合物的用途，它们被用于制备预防冠状病毒SARS-CoV-2感染或其相关疾病的药物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列分析及RBD中与ACE2相互作用关键位点。
图2显示了SARS-CoV-2的S蛋白RBD区与人ACE2的相互作用结构与关键作用位点图。
图3显示了多肽P-37、P-67和P-71与24种主要人群HLAⅡ类分子等位基因类型分子结合的可能性综合分析图。
图4显示了BepiPred软件预测的S蛋白RBD所含线性B细胞表位及与多肽P-37、P-67和P-71的相对位置关系图。
图5显示了Discotope软件预测的S蛋白RBD所含构象B细胞表位结构图。
图6显示了多肽P-37、P-67、P-71和LY54在S蛋白RBD结构上的位置图。
图7显示了TLR7小分子激动剂SZU-101的化学结构。
图8显示了多肽P-71及其偶联SZU-101后的偶联肽引发体外小鼠脾淋巴细胞细胞因子释放结果。
图9显示了多肽P-71及其偶联SZU-101后的偶联肽引发体外小鼠脾淋巴细胞增殖结果。
图10显示了多肽P-37，P-71和P-67-F2及各自偶联SZU-101后的偶联肽(参见表B)单独或混合免疫BALB/c小鼠后，抗RBD抗体的产生情况。
图11显示了LY54、LY54-S1免疫食蟹猴后抗RBD抗体的产生情况，和多肽P-37，P-71和P-67-F2各自偶联SZU-101后的偶联肽(参见表B)混合免疫食蟹猴后抗RBD抗体的产生结果。
图12显示了LY54、LY54-S1及混合偶联肽(参见表B)免疫食蟹猴所产生的抗RBD抗体，具有阻断RBD与ACE2结合的中和活性。
图13显示了多肽P-37，P-71及LY54具有可与人ACE2较好结合的效果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，基于对SARS-CoV-2的S蛋白RBD的序列和结构解析研究，分析了S蛋白的CD4+T/CD8+T细胞表位、线性/构象B细胞表位、相互作用关键位点、表面特征、糖基化修饰位点及多肽理化性质等特征，首次筛选并确定可有效诱导哺乳动物机体产生针对冠状病毒SARS-CoV-2的免疫反应的疫苗多肽。实验表明，本发明的疫苗多肽可有效在啮齿类动物(如小鼠)和灵长类动物(如食蟹猴)中引发针对SARS-CoV-2的细胞免疫和体液免疫，从而产生阻断RBD与ACE2结合的较高滴度中和抗体，因而本发明在新型冠状病毒肺炎的预防或治疗有潜在的应用前景。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明基于对SARS-CoV-2的S蛋白的RBD序列和结构信息的解析，通过确定S蛋白的T/B细胞表位，并综合考虑S蛋白的结构表面特征、与ACE2的相互作用关键位点以及多肽理化性质等，筛选确定了表A中所示的12条抗原多肽，并将抗原多肽(包括P-37、P-67(包括P-67-F1和P-67-F2)、P-71和LY54)分别与TLR7小分子激动剂偶联，形成表B所示的偶联肽。实验表明，偶联后的多肽疫苗可使小鼠和食蟹猴启动较强的细胞和体液免疫作用，产生阻断RBD与ACE2结合的较高滴度中和抗体。
术语
冠状病毒SARS-CoV-2
冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，是一种有包膜的正链RNA病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四属。
目前已知的感染人的冠状病毒中，HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2均为β属冠状病毒。
2019年年底爆发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与SARS-CoV有约80％相似性、与MERS-CoV有40％的相似性，也属于β属冠状病毒。
该类病毒的基因组是一条单股正链RNA，是基因组最大的RNA病毒之一，编码包括复制酶、刺突蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制的初始阶段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白(Polyprotein)，随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如RNA聚合酶和解旋酶)和结构蛋白(如刺突蛋白)及辅助蛋白。
S蛋白是冠状病毒SARS-CoV-2的一种主要的结构蛋白，其结构示意图如图1所示，其中，RBD负责与人ACE2受体结构，而RBM区域含有与人ACE2结合的基序(motif)。一种典型的S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示。
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID No:13)
冠状病毒SARS-CoV-2的RBD区域位于S蛋白的第333-527位，一种代表性的氨基酸序列如SEQ ID No:13中第333-527位所示或图4所示。
>RBD(333-527)
TNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP(SEQ ID No:13中第333-527位)
冠状病毒SARS-CoV-2的RBM区域位于S蛋白的第438-506位，一种代表性的氨基酸序列如SEQ ID No:13中第438-506位或图1所示。
>RBM(438-506)
SNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQ(SEQ ID No:13第438-506位)
应理解，在本发明中，S蛋白、RBD区域和RBM区域均包括野生型和突变型。
疫苗多肽
在本发明中，“本发明表位肽”、“本发明疫苗多肽”、“本发明多肽”可互换使用，指符合本发明第一方面中所述的疫苗多肽，尤其是具有式I结构的多肽。应理解，所述术语不仅包括一种本发明疫苗多肽，还包括多种本发明的疫苗多肽所形成的肽集合(或肽组合)。
在本发明中，疫苗多肽还包括其他形式，例如药学上可接受的盐、偶联物、或融合蛋白。优选地，本发明的疫苗多肽是与TLR7激动剂偶联形成的偶联物(偶联肽)，尤其是偶联有一个或多个TLR7激动剂的偶联肽，例如，表B中所示的偶联物。
此外，在本发明中，优选的疫苗多肽具有式Ⅱ所示结构：
X1-X-X2 (Ⅱ)
(a)X为核心片段,其中，所述的核心片段的序列选自SEQ ID NO:1-12(见表A)中的一个或多个；
(b)X1、X2各自独立地为无、1、2或3个氨基酸，且X1和X2的氨基酸个数总和≤4，较佳地，3、2、1，更佳地为0或1；
其中，X1与X之间、X与X2之间以肽键、肽接头(如1-15个氨基酸构成的柔性接头)或其他连接子相连。
在本发明中，核心片段或疫苗多肽包括对SEQ ID No:1-12中任一序列进行一个或多个(如1-5个，优选地1-3个)氨基酸添加、一个或多个(如1-5个，优选地1-3个)氨基酸的取代和/或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
优选地，核心片段或疫苗多肽包括对SEQ ID No:1-12中任一序列经过1-3个氨基酸添加(优选添加在N端或C端)、和/或1-2个氨基酸的取代(优选保守性氨基酸替换)并仍具有与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
优选地，所述的保守性氨基酸替换根据表C进行氨基酸替换。
表C
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
如本文所用，术语“肽集合”所述的肽集合由至少两种本发明疫苗多肽或其衍生多肽构成。
优选地，本发明所述的肽集合中至少含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12种选自本发明第一方面所述的疫苗多肽或其衍生多肽(包括偶联肽)；更优选地，所述肽集合至少含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12种选自SEQ ID NO.:1-12的疫苗多肽或其衍生多肽。此外，所述的肽集合还包括可以除SEQ ID NO.:1-12以外的其他冠状病毒SARS-CoV-2的抗原肽或蛋白。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多肽是没有分离纯化的，但同样的多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的肽”是指本发明多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明多肽。基本上纯化的多肽(融合蛋白)在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、或合成多肽，优选合成多肽。
在本发明中，当疫苗多肽的序列较短(如≤70aa，更佳地≤60aa时)，可用化学方法直接合成相关肽序列。
当疫苗多肽的序列较长或以融合蛋白形式提供疫苗多肽时，也可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将编码所述抗原多肽或其融合蛋白的编码序列克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关的抗原多肽或融合蛋白。
药物组合物和给药方式
本发明还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物可以是治疗性的或预防性的(如疫苗)。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的疫苗多肽或肽集合、或用该疫苗多肽激活的免疫细胞(例如用本发明疫苗多肽致敏的树突状细胞或用树突状细胞诱导的T细胞)，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的相关疾病选自下组：呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。
在本发明中，这些(疫苗)组合物包含免疫性抗原(包括本发明疫苗多肽、肽集合或其衍生物)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体的例子包括(但并不限于)蛋白质、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
此外，本发明的(疫苗)组合物还可含有额外的佐剂。代表性的疫苗佐剂包括(但并不限于)以下种类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉内、肌内、腹膜内、皮下、皮内、口服、或局部给药。
使用(疫苗)组合物时，是将安全有效量的本发明疫苗多肽或肽集合施用于人，其中该安全有效量通常至少约1微克肽/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克肽/千克体重，较佳地该剂量是约1微克-1毫克肽/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明所采用的疫苗多肽(包括偶联多肽)能够在灵长动物等哺乳动物的机体内产生抗S蛋白RBD(受体结合区域)的中和抗体，所述中和抗体可阻断RBD与ACE2结合。
(b)与未经优化的多肽相比，本发明的经优化的多肽序列与TLR7小分子激动剂偶联所形成的偶联肽，具有优化的结构，能够高效产生抗SARS-CoV-2病毒的细胞免疫和体液免疫。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1基于S蛋白RBD的序列和结构解析的抗原多肽筛选
在本实施例中，本发明人以SARS-CoV-2的S蛋白中与人ACE2相互作用的RBD区域作为分析对象，确定了RBD中的相互作用关键位点，如图1和图2所示。
本发明人利用软件预测分析了RBD序列中的CD8+T细胞表位；利用AlleleFrequency Net Database数据库统计分析获得世界人群主要的HLAⅡ类分子等位基因类型；进一步分析预测了RBD序列中的HLAⅡ类分子结合肽，以此作为预测的CD4+T细胞表位；利用BepiPred和Discotope软件，预测了RBD序列中的线性和构象B细胞表位；利用Uniprot数据库获取RBD区的糖基化修饰位点；利用ProtParam软件预测候选多肽的理化性质。
综合以上分析结果和信息，本发明人最终筛选到12条多肽，氨基酸序列如下：
表A抗原多肽
Figure BDA0002529579320000151
进一步，根据综合特性，确定了P-37、P-67(包括P-67-F1和P-67-F2)、P-71和LY54。
多肽P-37、P-67和P-71的所含CD8+T细胞表位对应的HLA I类分子等位基因类型如表1所示，提示三条多肽有较好激发杀伤性T细胞抗病毒反应的潜能。
表1部分多肽所含CTL表位对应的HLAI类分子等位基因类型
Figure BDA0002529579320000152
三条多肽(P-37、P-67和P-71)与人群中24种主要的HLAⅡ类分型分子结合亲和力如表2和图3所示。这提示，三条多肽可被人群中主要的HLAⅡ分子提呈出来，从而激发广泛的CD4+T细胞效应，并促进B细胞产生抗病毒抗体的潜能。
表2多肽P-37、P-67和P-71与24种主要人群HLAI类分子等位基因类型分子结合亲和力的预测分析
Figure BDA0002529579320000161
进一步分析表明，三条多肽(P-37、P-67和P-71)与RBD的线性和构象B细胞表位有很好的交叉重叠(图4和图5)，这提示可有效激活B细胞免疫反应。
另外，三条多肽(P-37、P-67和P-71)不含糖基化修饰位点，且具有适合的理化性质。
LY54是同时包含P-37和P-71表位的长肽，其横跨在RBD与ACE2的作用界面上，如图6所示。
实施例2多肽的制备
在本实施例中，应用多肽合成仪，制备多肽P-37、P-67、P-71和LY54。
Figure BDA0002529579320000162
实施例3偶联肽的制备
将人工合成的多肽P-37、P-67(包括P-67-F1和P-67-F2)、P-71和LY54等，分别与TLR7小分子激动剂进行偶联，形成相应的偶联肽。
TLR7小分子激动剂用于偶联多肽的分子结构如下：
Figure BDA0002529579320000163
Figure BDA0002529579320000171
3.1偶联肽P-37-S2的制备
P-37肽(CYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS)与TLR7小分子激动剂偶联物的制备。称取18mg P-37肽，溶解于270μL H2O和180μL DMF的混合溶液中，加入4.88mg的SZU-101-Mal，同时加入终浓度30mM的NaHCO3，室温反应1小时后，通过C18制备柱分离产物，得到SZU-101与P-37肽偶联产物P-37-S2共15.5mg，HRMS[M+5H]5+740.9976。
3.2偶联肽P-67-F1-S2的制备
P-67-F1肽(CYAWNRKRISN)与TLR7小分子激动剂偶联物的制备。称取16.5mg的P-67-F1肽，溶解于330μL H2O中，加入9849μL溶解于DMF的SZU-101-Mal(称取20mg SZU-101-Mal，预先溶解于2mL DMF中，形成10mg/mL的储液)，同时加入终浓度30mM的NaHCO3，室温反应1小时后，通过C18制备柱分离产物，得到SZU-101与P-67-F1肽偶联产物P-67-F1-S2共9.3mg，HRMS[M+4H]4+494.2456。
3.3偶联肽P-67-F2-S2的制备
P-67-F2肽(CVADYSVLYNSASFSTFK)与TLR7小分子激动剂偶联物的制备。称取20mg的P-67-F2肽，溶解于的2mL含有0.1％三氟乙酸(TFA)的50％乙腈水溶液中，加入6759μL溶解于DMF的SZU-101-Mal(称取20mg SZU-101-Mal，预先溶解于2mL DMF中，形成10mg/mL的储液)，同时加入终浓度100mM的NaHCO3，室温反应1小时后，通过C18制备柱分离产物，得到SZU-101与P-67-F2-S2肽偶联产物P-67-F2-S2共13.5mg，HRMS[M+3H]3+861.4077。
3.4偶联肽P-71-S2的制备
P-71-C肽(GVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRK)与TLR7小分子激动剂偶联物的制备。称取20mg的P-71-C肽，溶解于的400μL H2O中，加入4619μL溶解于DMF的SZU-101-Mal(称取20mg SZU-101-Mal，预先溶解于2mL DMF中，形成10mg/mL的储液)，同时加入终浓度30mM的NaHCO3，室温反应1小时后，通过C18制备柱分离产物，得到SZU-101与P-71-C肽偶联产物P-71-S2共20mg，HRMS[M+4H]4+971.4554。
3.4偶联肽P-71-C-S1的制备
P-71-C肽(GVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRK)与TLR7小分子激动剂偶联物的制备(2)。称取18mg的P-71-C肽，溶解于360μL H2O中，加入850μL溶解于DMF的SZU-101-NHS(预先溶解于DMF中，形成20mg/mL的储液)，同时加入终浓度20mM的NaHCO3，室温反应1小时后，形成偶联3个SZU-101小分子的产物，加入终浓度5mM的DTT后置于37℃继续反应1小时，形成偶联2个SZU-101的产物，通过C18制备柱分离产物，得到SZU-101与P-71-C肽偶联产物P-71-C-S1共12mg，HRMS[M+4H]4+1042.9789。
3.5偶联肽P-71-N-S1的制备
P-71-N肽(KGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYR)与TLR7小分子激动剂偶联物的制备。称取22mg的P-71-N肽，溶解于440μL H2O中，加入1000μL溶解于DMF的SZU-101-NHS(预先溶解于DMF中，形成20mg/mL的储液)，同时加入终浓度20mM的NaHCO3，室温反应1小时后，形成偶联3个SZU-101小分子的产物，加入终浓度5mM的DTT后置于37℃继续反应1小时，形成偶联2个SZU-101的产物，通过C18制备柱分离产物，得到SZU-101与P-71-N肽偶联产物P-71-N-S1共19mg，HRMS[M+4H]4+1042.9789。
3.5偶联肽LY54-S1的制备
LY54肽(LFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPY)与TLR7小分子激动剂偶联物的制备。称取10mg LY54肽，溶解于200μL H2O中，加入442μL溶解于DMF的SZU-101-NHS(预先溶解于DMF中，形成20mg/mL的储液)，同时加入终浓度20mM的NaHCO3，室温反应1小时后，形成偶联5个SZU-101小分子的产物，加入终浓度5mM的DTT后置于37℃继续反应1小时，形成偶联3个SZU-101的产物，通过C18制备柱分离产物，得到SZU-101与LY54肽偶联产物LY54-S1共7.2mg，HRMS[M+6H]6+1035.0771。
实施例4体外小鼠脾淋巴细胞增殖和细胞因子释放实验
将实施例3中制备的P-37，P-67，P-71等多肽，以及偶联TLR7激动剂SZU-101后所形成的偶联肽加入从BALB/c小鼠脾脏中分离制备的原代脾淋巴细胞培养液中,包含1μM、10μM、30μM、60μM四个剂量组，刺激24h检测细胞因子IL-6、IL-12、IFN-γ，刺激72h检测细胞增殖。
以P-71及其对应的偶联肽为例，如图8和图9所示，结果表明：
(1)单独的多肽不能或较弱地引起脾淋巴细胞的细胞因子释放增多，偶联SZU-101后的偶联肽可有效地引发脾淋巴细胞的细胞因子释放增多，这提示与TLR7激动剂偶联后，可显著提高疫苗多肽诱导的免疫应答；
(2)单独的多肽不能或较弱地引起脾淋巴细胞增殖，偶联SZU-101后的偶联肽可有效地引发脾淋巴细胞的细胞因子增殖，这提示与TLR7激动剂偶联后，可显著提高疫苗多肽诱导的免疫应答。
实施例5偶联多肽疫苗的小鼠免疫实验
将实施例3中制备的P-37，P-67，P-71等多肽，以及偶联TLR7激动剂SZU-101后所形成的偶联肽单用或合用，合用时，混合比例为1:1:1(质量比)，以氢氧化铝为佐剂制成制剂后腹腔注射免疫BALB/c小鼠。
在首次免疫后29天和57天采集血清，采用基于桥接-ELISA方法(Bridging-ELISA)检测血清中(1:100倍稀释)的SARS-CoV-2的S蛋白RBD的抗体。
如图10所示，结果表明：
(1)在含有P-71-C-S1或P-71-S2的混合肽+佐剂组均可以显著产生针对RBD的抗体；
(2)单独的偶联物P-37-S2+佐剂组能够显著产生针对RBD的抗体。
(3)未偶联SZU-101的混合肽，虽然可诱导产生针对RBD的抗体，但是产生的抗体数量低于含有偶联肽的混合肽组，这提示与TLR7激动剂偶联后，可显著提高疫苗多肽诱导的免疫应答。
实施例6偶联多肽疫苗的食蟹猴免疫实验
在本实施例中，进一步在食蟹猴中验证偶联多肽疫苗对SARS-CoV-2的免疫效果。
以(a)P-37、P-67-F2、P-71偶联SZU-101的混合偶联肽(P-71-C-S1/P-71-N-S1/P-71-S2/P-37-S2/P-67-F2-S2)，(b)LY54，(c)LY54-S1，分别以TiterMax佐剂制备免疫制剂，食蟹猴皮下多点注射免疫，在第二次免疫后14天，采用Bridging-ELISA方法进行抗体滴度测定，并进行测定抗血清对RBD与ACE2结合的阻断能力。
中和抗体采用竞争ELISA方法检测，具体测定方法如下：10μg/mL的ACE2过夜包被酶标板，封闭后待用。以样品稀释缓冲液不同程度地稀释抗肽血清(1:128，1:64，1:32，1:16、1:8和1:4)，其后将不同程度稀释后的抗血清与12μg/mL的Bio-RBD在37℃温育1小时，随后将100μL的反应混合液加入到上述封闭好的ACE2包被酶标板上的孔中，37℃温育1小时后，洗板，再加入1:10000稀释的HRP-Streptavidin A，37℃温育1小时，洗板后，加入TMB显色，终止后在450nm波长下读板。
结果表明：所有动物均产生了针对RBD的抗体，且抗体滴度均较高(图11)。
此外，采用混合偶联肽、LY54，LY54-S1所产生的抗血清，均具有阻断RBD与ACE2结合的能力(图12)，即具有阻断SARS-CoV-2病毒的感染作用。
实施例7多肽与ACE2体外结合实验
在本实施例中，将空间结构位于RBD与ACE2作用界面上的多肽P-37，P-71，LY54标记生物素，通过ELISA法检测上述多肽与ACE2的结合能力。
具体测定方法如下：10ug/mL的ACE2过夜包被酶标板，封闭后加入不同浓度(1、0.5和0.25μg/mL)的生物素标记的多肽，37℃温育1.5小时后，加入1:5000稀释的HRP-Streptavidin A，37℃温育1小时，洗板后，加入TMB显色，终止后在450nm波长下读板。
结果表明，多肽P-37，P-71，LY54与ACE2存在较强的结合能力(图13)，提示多肽P-37，P-71和LY54本身即具有潜在的阻断作用。
讨论
多肽疫苗是从高免疫原性的蛋白中选取一个或多个抗原表位片段用于免疫。由于多肽疫苗的氨基酸链较短，得益于多肽合成技术的成熟，其便于快速且大量的体外合成和纯化，并易于确保每批产品的纯度和重复性。
同时，基于计算机辅助疫苗设计可快速对新型病毒等引起的突发公共卫生问题进行响应，预测并筛选合适的候选肽段用于疫苗开发。
另外，多肽疫苗相较于其他种类疫苗表位明确、稳定性好、纯度高且具有较好的安全性。然而，多肽疫苗由于氨基酸链长度较短，往往是10-30个氨基酸左右，其也面临免疫原性较低的问题，往往需要进行修饰或辅以佐剂以产生较好的免疫反应。
多肽疫苗的设计需借助计算机辅助疫苗设计技术，往往需要综合分析靶蛋白的T/B细胞表位以及结构和修饰信息。其中，CD8+T细胞表位可激活杀伤性T细胞来发挥抗病毒作用，CD4+T细胞表位主要激活辅助性T细胞去激活B细胞产生抗病毒抗体。线性和构象B细胞表位可直接激活B细胞产生抗体。
SARS-CoV-2通过其表面Spike glycoprotein(S蛋白)与人血管紧张素转换酶2(Angiotensin-convertion enzyme 2,ACE2)蛋白结合，实现侵入宿主细胞。因此，S蛋白是COVID-19疫苗设计的首选靶蛋白，以希望诱发体内产生具有阻断病毒入侵作用的中和抗体。然而，目前已知的疫苗难以有效引发机体产生针对冠状病毒SARS-CoV-2的免疫反应。
因此，激活针对SARS-CoV-2的高效抗原递呈细胞是开发SARS-CoV-2疫苗的关键。
本发明人通过研究，意外地发现，基于筛选和序列优化后的冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白的抗原多肽，并偶联TLR7小分子激动剂所形成的疫苗多肽，可在包括灵长类动物的机体内有效诱导产生针对S蛋白RBD区且有阻断作用的抗病毒抗体。此外，偶联的TLR7小分子激动剂SZU-101的疫苗多肽可高效激活抗原递呈细胞，克服多肽免疫原性低和病毒发生免疫逃逸的问题。
因此，本发明的偶联肽可用于开发新型冠状病毒多肽疫苗。在人体引发细胞免疫和体液免疫，从而用于预防和治疗冠状病毒SARS-CoV-2感染以及相关疾病，包括新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19)。
此外，本发明人将TLR7激动剂与特异性抗原多肽偶联形成的偶联多肽(尤其是与TLR7小分子激动剂SZU-101，如S1和/或S2结构方式偶联形成的偶联多肽)的策略，也适用于开发防治其他单链RNA病毒(ssRNA病毒)感染或其相关疾病的药物或疫苗，尤其是适用于开发针对各种不同的冠状病毒的疫苗，包括已知的SARS、MERS等冠状病毒和未知的冠状病毒。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
深圳大学
<120> 偶联TLR7激动剂的新型冠状病毒多肽疫苗及其应用
<130> P2020-1050
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
1 5 10 15
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
20 25
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
1 5 10 15
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
20 25
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 3
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
1 5 10 15
Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly
20 25
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
20 25
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Cys Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
1 5 10
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
1 5 10 15
Phe Lys
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 7
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
1 5 10 15
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
20 25
<210> 8
<211> 28
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 8
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
1 5 10 15
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
20 25
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 9
Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser
1 5 10 15
Phe Ser Thr Phe Lys Cys
20
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 10
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
1 5 10 15
Tyr Gly Val Ser Pro Thr
20
<210> 11
<211> 22
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 11
Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly
1 5 10 15
Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
20
<210> 12
<211> 54
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 12
Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr
1 5 10 15
Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe
20 25 30
Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly
35 40 45
Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
50
<210> 13
<211> 1273
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 13
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
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Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270

Claims (25)

1.一种新型冠状病毒的疫苗多肽，其特征在于，所述的疫苗多肽包括抗原多肽以及与所述抗原多肽偶联的TLR7激动剂，并且所述的疫苗多肽具有式I结构或包含式I结构的寡聚体：
Z-(J-U)n (I)
式中，
Z为抗原多肽，所述抗原多肽具有新型冠状病毒S蛋白的至少一个T细胞表位和/或至少一个B细胞表位；并且，所述的抗原多肽具有衍生自S蛋白的RBM区域的氨基酸序列，而且所述抗原多肽的长度为8-100个氨基酸；
U各自独立地为TLR7激动剂，并且所述的TLR7激动剂为小分子激动剂；
n为正整数1、2、3、4、5或6；
J为化学键或连接子；
并且所述的疫苗多肽可激发灵长动物和啮齿动物产生阻断RBD与ACE2结合的中和抗体；
并且，所述的抗原多肽的结构如式II所示：
X1-X-X2 (Ⅱ)，
式中，
(a)X为核心片段,其中，所述的核心片段的序列选自SEQ ID NO:1-12中的一个或多个；
(b)X1、X2各自独立地为无、1或2个氨基酸，且X1和X2的氨基酸个数总和为0、1或2；
(c)“-”表示肽键、肽接头、或连接子。
2.如权利要求1所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的疫苗多肽可激发灵长动物产生阻断RBD与ACE2结合的中和抗体。
3.如权利要求1所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的疫苗多肽可激发灵长动物产生细胞免疫和体液免疫。
4.如权利要求1所述的疫苗多肽，其特征在于，所述抗原多肽的长度为10-80个氨基酸。
5.如权利要求1所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的抗原多肽具有衍生自新型冠状病毒S蛋白的RBD区域的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的抗原多肽具有衍生自RBD区域的RBM区域的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的抗原多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID No:1-12中任一所示的氨基酸序列的多肽。
8.如权利要求1所述的疫苗多肽，其特征在于，X1和X2均为1。
9.如权利要求1所述的疫苗多肽，其特征在于，X1和X2的氨基酸个数总和为0或1。
10.如权利要求1所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的抗原多肽选自表A：
表A抗原多肽
Figure FDA0003731132090000021
11.如权利要求1所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的TLR7激动剂包括：SZU-101:
Figure FDA0003731132090000022
12.如权利要求11所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的SZU-101连接于抗原多肽的氨基，并形成S1所示结构：
Figure FDA0003731132090000031
或者
所述的SZU-101连接于抗原多肽的巯基，并形成S2所示结构：
Figure FDA0003731132090000032
13.如权利要求12所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的U定点连接于Z。
14.如权利要求13所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的疫苗多肽为选自下组的偶联肽：
(S1)-GVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRK-(S1)
其中，SZU-101与氨基酸序列中G的N端氨基和K的侧链氨基通过S1结构连接；
(S1)2-KGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYR
其中，SZU-101与氨基酸序列中K的N端和侧链氨基通过S1结构连接；
(S1)-LFRK(-S1)SNLK(-S1)PFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPY
其中，SZU-101与氨基酸序列中L的N端氨基和K的侧链氨基通过S1结构连接；
GVEGFNC(-S2)YFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRK
其中，SZU-101与氨基酸序列中C上的巯基通过S2结构相连；
(S2)-CYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS
其中，SZU-101与多肽中C上的巯基通过S2结构相连；
(S2)-CYAWNRKRISN
其中，SZU-101与多肽中C上的巯基通过S2结构相连；或
(S2)-CVADYSVLYNSASFSTFK
其中，SZU-101与多肽中C上的巯基通过S2结构相连。
15.如权利要求14所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的偶联肽选自表B：
表B偶联肽
Figure FDA0003731132090000041
表中，S1和S2表示SZU－101的如权利要求11中所述的连接结构。
16.如权利要求10所述的疫苗多肽，其特征在于，所述的疫苗多肽选自下组：P-37与TLR7激动剂的偶联物、P-67-F1与TLR7激动剂的偶联物、P-71与TLR7激动剂的偶联物、LV54与TLR7激动剂的偶联物、或其组合。
17.一种分离的肽集合，其特征在于，所述的肽集合包括至少两种权利要求1所述的新型冠状病毒的疫苗多肽。
18.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或权利要求17所述的肽集合和药学上可接受的载体。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还含有佐剂。
20.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为液态、固体、或凝胶态。
21.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用选自下组的方式施用：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化吸入。
22.一种权利要求1所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或权利要求17所述的肽集合或权利要求18所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备预防冠状病毒SARS-CoV-2感染或其相关疾病的药物。
23.一种细胞制剂，其特征在于，所述的细胞制剂包括(a)用权利要求1所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或权利要求17所述的肽集合免疫激活的免疫细胞；和(b)药学上可接受的载体。
24.如权利要求23所述的细胞制剂，其特征在于，所述的细胞制剂为含活细胞的液态制剂。
25.如权利要求23所述的细胞制剂，其特征在于，所述的细胞制剂通过静脉给药方式回输。
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