MXPA06005941A - Anticuerpos ip-10 y sus usos. - Google Patents

Anticuerpos ip-10 y sus usos.

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MXPA06005941A
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Abstract

La presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales aislados, particularmente anticuerpos humanos, que unen al IP-10 con alta afinidad, inhiben la union de IP-10 a su receptor, inhiben el flujo de calcio inducido por IP-10 e inhiben la migracion de celulas que inducen IP-10. Tambien se proporcionan las moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos de la invencion, vectores de expresion, celulas huesped, y metodos para expresar los anticuerpos de la invencion. Tambien se proporcionan las moleculas bioespecificas, inmunoconjugadas y composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos de la invencion. La invencion tambien proporciona metodos para inhibir la actividad IP-10 utilizando los anticuerpos de la invencion, incluyendo metodos para tratar diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunes.

Description

ANTICUERPOS IP-10 Y SUS USOS Antecedentes de la Invención La proteina inducible interferón gamma 10 (IP-10) (también conocida como CXCL10) es una quimiocina lOkDa gue se identificó originalmente con base en la expresión del gen IP- 10 en células tratadas con interferón gamma (IFN-gamma) (Luster, A.D. et al . (1985) Nature 315: 672-676) . IP-10 muestra homología a proteínas que tienen actividad quimiotáctica, tal como plaqueta del factor 4 y beta-tromboglobulina, y a proteínas que tienen actividad mitogénica, tales como péptido III de activación de tejido conectivo (Luster, A.D. et al . (1987) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 84: 2868-2871) . La IP-10 se secreta por una variedad de células, incluyendo células endoteliales, monocitos, fibroblastos y keratinocitos, en respuesta a IFN-gamma (Luster, A.D. y Ravetch, J.V. (1987) J. Exp . Med . 166: 1084-1097) . La IP-10 ha demostrado también que está presente en macrófagos dérmicos y células endoteliales en respuestas a hipersensibilidad del tipo retardado (DTH) en la piel humana (Kaplan, G. et al . (1987) J". Exp . Med . 166 : 1098-1108) : Aunque identificada originalmente con base en su existencia inducida por IFN-gamma, la IP-10 puede ser también inducida por IFN-alfa, por ejemplo, en células dendríticas (Padovan, E. et al . (2002) J. Leukoc . Biol . 71: 669-676). La expresión de la IP-10 puede inducirse también en células del sistema nervioso central, tales como astrocitos y microglia, por estímulo con IFN-gamma, virus y lipopolisacáridos (Vanguri , . y Farber, J.M. (1994) ". Immunol . 152 : 1411-1418; Ren, L.Q. et al . (1998) Brain Res . Mol . Brain Res . 59: 256-263). La inmunobiología de la IP-10 se evalúa en Neville, L.F. et al . (1997) Cytokine Growth Factor Rev. 8 : 207-219. El receptor para la IP-10 se ha identificado como CXCR3 , un receptor de siete transmembranas (Loetscher, M. et al . (1996) J. Exp. Med. 184: 963-969) . CXCR3 ha demostrado que se expresa en los linfocitos T activados, pero no en linfocitos T inactivos, ni en linfocitos B, monocitos o granulocitos (Loetscher, M. et al . , supra) . La expresión de CXCR3 ha demostrado que se sobre-regula en las células NK por estimulación con TGF-beta (Inngjerdingen, M. et al . (2001) Blood 91_ : 367-375) . Dos diferentes ligandos para CXCR3 se han identificado también: MIG (Loetscher, M. et al . , supra) e ITAC (Colé, K.E. et al . (1998) J. Exp . Med . 187: 2009-2021) . El enlace de IP-10 a CXCR3 ha demostrado que media la movilización del calcio y la quimiotaxis en células T activadas (Loetscher, M. et al . , supra) . La quimiotaxis y la movilización de calcio intracelular se induce también por el enlace de IP-10 a CXCR3 en células NK activadas (Maghazachi, A.A. et al . (1997) FASEB J. 11: 765-774)). Dentro del timo, IP-10 ha demostrado que es un quimioatrayente para células TCRa/?+ CD8+ T, células TCR?d+ T y células del tipo NK (Romagnani, P. et al . (2001) Blood 97: 601-607) . IP-10 o su receptor CXCR3 han sido identificados en una variedad de condiciones inflamatorias y autoinmunes, incluyendo esclerosis múltiple (véase por ejemplo., Sorensen, T.L. et al . (1999) ". Clin . Invest . 103 : 807-815), artritis reumatoide (véase por ejemplo, Patel, D.D. et al . (2001) Clin . Immunol . 98 : 39-45), colitis ulcerativa (véase por ejemplo, Uguccioni, M. et al. (1999) Am. J. Pathol . 155 : 331-336), hepatitis (véase por ejemplo, Narumi, S. et al . (1997) J". I munol . 158 : 5536-5544), daño de médula espinal (véase por ejemplo, McTigue, D.M. et al . (1998) J". Neurosci . Res . 53 : 368-376; González et al . 2003. Exp. Neurol . 184: 456-463), lupus eritematoso sistémico (véase por ejemplo, Narumi, S. et al. (2000) Cytojfc±ne 12: 1561-1565), rechazo de transplante (véase por ejemplo, Zhang, Z. et al . (2002) J. Iwmunol . 168 : 3205-3212), síndrome de Sjogren (véase por ejemplo, Ogawa, N. et al . (2002) Arthritis Rheum . 46_: 2730-2741) . Por consiguiente, son deseables los agentes terapéuticos que inhiben la actividad, en particular agentes que son adecuados para uso en seres humanos .
Compendio de la Invención La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se enlazan a IP-10 y que exhiben numerosas propiedades deseables. Estas propiedades incluyen el enlace de alta afinidad al IP-10 humano, así como la reactividad cruzada con IP-10 de mono rhesus, pero carece de reactividad cruzada sustancial con cualquiera de MIG humano o ITAC humano o IP-10 de ratón. Además, los anticuerpos inhiben el enlace de IP-10 a su receptor, CXCR3 , inhibe el flujo de calcio inducido por IP-10 en células que expresan el receptor e inhiben IP-10 inducido por la migración celular (quimiotaxis) . No obstante además, los anticuerpos de la invención han demostrado que se enlazan a IP-10 en secciones del cerebro de un sujeto humano diagnosticado con esclerosis múltiple . En las modalidades preferidas de la invención, el IP-10 humano comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en la SEC. DE IDENT. NO.: 121 [Genbank No. de Acceso NP_001556] ; el CXCR3 comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en la SEC. DE IDENT. NO.: 122 [Genbank No. de Acceso NP_001495] : el IP-10 del mono rhesus comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC. DE IDENT. NO.: 123 [Genbank No. de Acceso AAK95955] ; el IP-10 de ratón comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en la SEC. DE IDENT. NO.: 124 [Genbank No. de Acceso NP 067249]; el MIG humano comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 125 [Genbank No. de Acceso NP_002407] ; y/o el ITAC humano comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 126 [Genbank No. de Acceso NP_005400] . En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a IP-10 y comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de, o se deriva de un gen de línea germinal VH humano seleccionado a partir del grupo que consiste de un gen VH 3-33 humano, un gen VH 3-30.3 humano, un gen VH 5-51 humano y un gen VH 4-61 humano. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a IP-10 y comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva a partir de un gen de línea germinal V humano seleccionado del grupo que consiste de un gen Vk A27, un gen Vk L15 humano, un gen Vk L6 humano y un gen Vk L18 humano. En aún otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo enlaza específicamente IP-10 y comprende: (a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen de línea germinal VH humano seleccionado del grupo que consiste del gen VH 3-33 humano, un gen VH 3-30.3 humano, un gen VH 5-51 humano y un gen VH 4-61 humano ; y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen de línea germinal V? humano seleccionado del grupo que consiste de un gen Vk A27 humano, un gen V? L15 humano, un gen Vk L6 humano y un gen V? L18 humano . En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen VH 3-33 humano; y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk humano seleccionado del grupo que consiste de un Vk A27 humano, un gen Vk L15 humano y un gen Vk L6 humano, en donde el anticuerpo enlaza específicamente IP- 10. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada que es el producto de, o se deriva de un gen VH 3-30.3 humano; y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk L6 humano; en donde el anticuerpo enlaza específicamente IP-10. En aún otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen VH 5-51 humano, y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk L18 humano; en donde el anticuerpo enlaza específicamente IP-10. En aún otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen VH 4-61 humano; y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk A27 humano; en donde el anticuerpo enlaza específicamente IP- 10. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl , CDR2 y CDR3 , en donde : (a) la secuencia CDR3 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácido de las SEC. DE IDENT. NOS. : 24-34, y las modificaciones conservadoras del mismo, (b) la secuencia CDR3 de la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de las SEC. DE 1DENT. NOS. : 73-83, y las modificaciones conservadoras del mismo, (c) el anticuerpo enlaza específicamente IP-10, y (d) el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales : (i) el anticuerpo inhibe el enlace de IP-10 a CXCR3 ; (ii) el anticuerpo inhibe el flujo de calcio inducido por IP-10; (iii) el anticuerpo inhibe migración celular inducida por IP-10; (iv) el anticuerpo reacciona cruzado con el IP-10 de mono rhesus ; (v) el anticuerpo reacciona no cruzado con el IP-10 de ratón; (vi) el anticuerpo reacciona no cruzado con MIG humano ; (vii) el anticuerpo reacciona no cruzado con ITAC humano . En una modalidad preferida, la secuencia CDR2 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. NOS.: 13-23, y las modificaciones conservadoras del mismo, y la secuencia CDR2 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. NOS.: 62-72, y las modificaciones conservadoras del mismo. En otra modalidad preferida, la secuencia CDRl de la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácido de las SEC. DE IDENT . NOS.: 1-12, y las modificaciones conservadoras del mismo; y la secuencia CDRl de la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEC. DE IDENT'. NOS.: 51-61, y las modificaciones conservadoras del mismo. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde : (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 35-46, (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 84-94, (c) el anticuerpo enlaza específicamente IP-10, y (d) el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales: (i) el anticuerpo inhibe el enlace de IP-10 a CXCR3 ; (ü) el anticuerpo inhibe el flujo de calcio inducido por 1P-10; (iii) el anticuerpo inhibe la migración celular inducida por 1P-10; (iv) el anticuerpo reacciona cruzado con el IP-10 de mono rhesus; (v) el anticuerpo reacciona no cruzado con el IP-10 de ratón; (vi) el anticuerpo reacciona no cruzado con MIG humano ; (vii) el anticuerpo reacciona no cruzado con ITAC humano . El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. En las modalidades preferidas de la invención, el anticuerpo monoclonal aislado o la porción de enlace de antígeno del mismo comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 1-12; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 13-23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 24-34; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 51-61; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT . NOS.: 62-72; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 73-83; en donde el anticuerpo enlaza específicamente IP- 10. En otras modalidades preferidas, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 35-46; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 84-94; en donde el anticuerpo enlaza específicamente IP-10. En otro aspecto de la invención, los anticuerpos, o porciones de enlace de antígeno de los mismos, se proporcionan de manera que compiten por el enlace a IP-10 con cualquiera de los anticuerpos antes mencionados. Los anticuerpos de la invención pueden ser por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, por ejemplo de un isotipo IgGl o IgG4. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab o Fab' 2 o anticuerpos de cadena sencilla. La invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención, o una porción de enlace de antígeno del mismo, unida a un agente terapéutico, tal como una citotoxina o un isótopo radioactivo. La invención proporciona también una molécula biespecífica que comprende un anticuerpo, o una porción de enlace de antígeno de la misma, de la invención, unida a una segunda porción funcional que tiene una especificidad de enlace diferente que el anticuerpo, o la porción de enlace de antígeno del mismo. Se proporcionan también composiciones que comprenden un anticuerpo, o una porción de enlace de antígeno del mismo o una molécula inmunoconjugada o biespecífica de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Las moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos, o porciones de enlace de antígeno de las mismas, de la invención se abarcan también por la invención, así como los vectores de expresión que comprenden tales ácidos nucleicos y células huéspedes que comprenden tales vectores de expresión. Además, la invención proporciona un ratón transgénico que comprende transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en donde el ratón expresa un anticuerpo de la invención, así como hibridomas preparados de tal ratón, en donde el hibridoma produce el anticuerpo de la invención.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir una respuesta inflamatoria o autoinmune mediada por las células T o las células NK activadas gue comprende poner en contacto las células T o las células NK con el anticuerpo o una porción de enlace de antígeno del mismo, de la invención, de manera que se inhibe la respuesta inflamatoria o autoinmune . En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad inflamatoria o autoinmune en un sujeto con necesidad del tratamiento que comprende administrar al sujeto el anticuerpo o una porción de enlace de antígeno del mismo, de la invención, de manera que la enfermedad inflamatoria o autoinmune en el sujeto se trata. La enfermedad puede ser, por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad de inflamación del intestino (por ejemplo, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn), lupus eritematoso sistémico, diabetes del tipo I, trastornos inflamatorios de la piel (por ejemplo, psoriasis, liquen plano), enfermedad autoinmune de la tiroides (por ejemplo, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto) , síndrome de Sjogren, inflamación pulmonar (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, sarcoidosis pulmonar, alveolitis linfocítica) , rechazo de transplante, daño de la médula espinal, daño cerebral (por ejemplo, apoplejía), enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson), gingivitis, inflamación inducida por terapia genética, enfermedades de angiogénesis, enfermedad de inflamación de riñon (por ejemplo, neuropatía de IgA, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis rápidamente progresiva) y aterosclerosis. En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar una infección viral o bacterial que implica actividad de IP-10 indeseada en un sujeto con necesidad del tratamiento, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo, o una porción de enlace de antígeno del mismo, de la invención, de manera que la infección viral o bacterial en el sujeto se trata. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse para tratar meningitis viral, encefalitis viral o meningitis bacterial. La infección viral que se trata por el método de la invención puede mediarse por, por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de la hepatitis C (VHC) , virus del herpes simple del tipo I (VHS-1) o el virus del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS) . La invención proporciona también métodos para realizar anticuerpos anti-IP-10 de "segunda generación" basados en las secuencias de los anticuerpos anti-IP-10 provistos en la presente. Por ejemplo, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-IP-10 que comprende : (a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia CDRl seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 1-12, una secuencia CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 13-23 y/o una secuencia CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 24-34; e (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia CDRl seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 51-61, una secuencia CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 62-72 y/o una secuencia CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 73-83; (b) alterar al menos un residuo aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpos de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpos de región variable de cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpos alterada; y (c) expresar la secuencia de anticuerpos alterada como una proteína. Otras características y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos que no deben interpretarse como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, informaciones de Genbank, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan abiertamente para referencia.
Breve Descripción, de los Dibujos La Figura la muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 99) y la secuencia de aminoácidos (SEC.
DE IDENT. NO.: 35) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 1D4. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. N0.:1), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 13) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO. : 24) se delinean y las desviaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura IB muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 110) y la secuencia de aminoácidos (SEC.
DE IDENT. NO.: 84) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 1D4. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 51), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 62) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 73) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO . : 100) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO.: 36) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 1E1. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO. : 2) , CDR2 (SEC. DE IDENT. NO . : 14) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO. : 25) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican.
La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 111) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO. : 85) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 1E1. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 52), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 63) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO. : 74) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO . : 101) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO . : 37) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2G1. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 3), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 15) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 26) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 112) y la secuencia de aminoácidos (SEC.
DE IDENT. NO. : 86) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 2G1. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 53), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO.: 64) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 75) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 102) y la secuencia de aminoácidos (SEC.
DE IDENT . NO. : 38) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 3C4. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO. : 4) , CDR2 (SEC. DE IDENT . NO. : 16) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO. : 27) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 113) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO.: 87) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 3C4. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 54), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO.: 65) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 76) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO.: 103) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO. : 39) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 6A5. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 5), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 17) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO. : 28) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO.: 114) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO . : 88) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 6A5. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 55), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 66) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO. : 77) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 104) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO. : 40) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 6A8. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 6), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 18) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 29) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO.: 115) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO. : 89) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 6A8. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 56), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO.: 67) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO. : 78) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 7A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 105) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO. : 41) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 6B10. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 7), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 19) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 30) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 7B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO . : 116) y la secuencia de aminoácidos (SEC.
DE IDENT. NO.: 90) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 6B10. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 57), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 68) y CDR3 (SEC.
DE IDENT. NO.: 79) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 8A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 106) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO . : 42) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 7C10. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 8), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 20) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 31) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 8B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO.: 117) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO. : 91) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 7C10. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 58), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 69 ) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 80) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 9A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO . : 107) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO. : 43) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 8F6. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO. : 9) , CDR2 (SEC. DE IDENT . NO. : 21) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO. : 32) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 9B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO.: 118) y la secuencia de aminoácidos (SEC.
DE IDENT. NO. : 92) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 8F6. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 59), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 70) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 81) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 10A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 108) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO.: 44) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 10A12. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 10), CDR2 (SEC. DE IDENT. NO.: 22) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 33) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. Alternativamente, el residuo 32 de aminoácidos dentro de CDRl puede mutarse a partir de la cisteína a la serina (SEC. DE IDENT. NO.: 11), que conduce a la secuencia VH de la SEC. DE IDENT. NO.: 45. La Figura 10B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO. : 119) y la secuencia de aminoácidos (SEC.
DE IDENT. NO.: 93) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 10A12. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO . : 60) , CDR2 (SEC. DE IDENT . NO . : 71) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO . : 82) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura HA muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO.: 109) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT . NO.: 46) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 13C4. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 12), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 23) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 34) se delinean y las derivaciones de línea germinal V, D y J se indican. La Figura 11B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC. DE IDENT. NO.: 120) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO. : 94) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 13C4. Las regiones CDRl (SEC. DE IDENT. NO.: 61), CDR2 (SEC. DE IDENT . NO.: 72) y CDR3 (SEC. DE IDENT. NO.: 83) se delinean y las derivaciones de línea germinal V y J se indican. La Figura 12 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8 , 7C10 y 10A12 con la secuencia de aminoácidos VH 3-33 de línea germinal humana (SEC. DE IDENT. NO. : 47) . La Figura 13 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 6B10 y 8F6 con la secuencia de aminoácidos VH 3-30.3 de línea germinal humana (SEC. DE IDENT. NO.: 48). La Figura 14 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 3C4 con la secuencia de aminoácidos VH 5-51 de línea germinal humana (SEC. DE IDENT. NO. : 49) . La Figura 15 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 13C4 con la secuencia de aminoácidos VH 4-61 (SEC. DE IDENT. NO. : 50) . La Figura 16 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 1D4 , 2G1, 6A5, 6A8, 10Al2 y 13C4 con la secuencia de aminoácidos V? A27 de línea germinal humana (SEC. DE IDENT. NO. : 95) . La Figura 17 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 1E1, 6B10 y 8F6 con la secuencia de aminoácidos V L6 de línea germinal humana (SEC. DE IDENT. NO. : 96) . La Figura 18 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 3C4 con la secuencia de aminoácidos Vk L18 de línea germinal humana (SEC. DE IDENT. NO.: 97). La Figura 19 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 7C10 con la secuencia de aminoácidos Vk L15 de línea germinal humana (SEC. DE IDENT. NO.: 98).
Descripción Detallada de la Invención La presente invención se relaciona a anticuerpos monoclonales aislados, particularmente anticuerpos monoclonales humanos, que se enlazan específicamente a IP-10 y que inhiben propiedades funcionales de IP-10. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se derivan de secuencias de línea germinal de cadena pesada y ligera particulares y/o comprenden características estructurales particulares tales como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácidos particulares . La invención proporciona anticuerpos aislados, métodos para hacer tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden tales anticuerpos y composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. La invención se relaciona también a métodos para utilizar los anticuerpos que inhiben respuestas inflamatorias o autoinmunes, por ejemplo en el tratamiento de varias enfermedades inflamatorias o autoinmunes, así como métodos para tratar infecciones virales que implican actividad IP-10 indeseada. A fin de que la presente invención pueda ser más fácilmente entendida, ciertos términos se definen primero. Las definiciones adicionales se establecen a través de toda la descripción detallada. Los términos "proteína 10 inducible interferón gamma" "IP-10" , y "CXCL10" se utilizan intercambiablemente, e incluyen variantes, isoformas y especies de homólogos de IP-10 humano. Por consiguiente, los anticuerpos humanos de la invención pueden, en ciertos casos, hacerse reactivar cruzados con IP-10 a partir de especies diferentes de las humanas. En otros casos, los anticuerpos pueden ser completamente específicos para IP-10 humano y pueden no exhibir especies u otros tipos de reactividad cruzada. La secuencia de aminoácidos completa de IP-10 humano tiene número de acceso Genbank NP_001556 (SEC. DE IDENT. NO.: 121) . La secuencia de aminoácidos completa de mono rhesus IP-10 tiene un número de acceso Genbank AAK95955 (SEC. DE IDENT. NO.: 123) . La secuencia de aminoácidos completa de ratón IP-10 tiene un número de acceso Genbank NP_067249 (SEC. DE IDENT. NO. : 124) . El término "CXCR3" se refiere al receptor para IP-10 (CXCL10) . La secuencia de aminoácidos completa de CXCR3 humano tiene el número de acceso Genbank NP_001495 (SEC. DE IDENT. NO. : 122) . El término "MIG" se refiere a un ligando para CXCR3 , también conocido como monocina inducida por interferón gamma, es decir distinto de IP-10. La secuencia de aminoácidos completa de MIG humano tiene el número de acceso Genbank NP_002407 (SEC. DE IDENT. NO. : 125) . El término "ITAC" se refiere a un ligando para CXCR3 , también conocido como quimioatrayente alfa de célula T inducible de interferón, es decir distinto de IP-10. La secuencia de aminoácidos completa de ITAC humano tiene un número de acceso Genbank NP_005400 (SEC. DE IDENT. NO. : 126) . El término "respuesta inmune" se refiere a la acción de por ejemplo, linfocitos, células que presentan antígeno, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles, producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citoquinas y complemento) que resultan en daño selectivo a, la destrucción de, o la eliminación del cuerpo humano para invadir patógenos, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas o en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células humanas normales o tej idos . Una "trayectoria de transducción de señal" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señal que juegan un papel en la transmisión de una señal a partir de una porción de una célula a otra porción de una célula. Como se utiliza en la presente, la frase "receptor de superficie celular" incluye por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de tal señal a través de la membrana de plasma de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es el CXCR3 al cual se une la molécula IP-10. El término "anticuerpo" como se refiere en la presente incluye, anticuerpos completos y cualquier fragmento de enlace de antígeno (es decir, "porción de enlace de antígeno") o cadenas sencillas del mismo. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de enlace de antígeno del mismo. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se comprende de tres dominios, CH?, CH y CH3. Cada cadena ligera comprende de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende de un dominio CL- Las regiones VH y V pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones que determinan la complementariedad (CDR) , entremezcladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones de estructura (FR) . Cada VH y VL se compone de tres CDRs y de cuatro FRs, dispuestas del término amino al extremo Carboxi en el siguiente orden: FR1 , CDRl, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 , FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a tejidos huéspedes o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo") como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad para enlazarse específicamente a un antígeno (por ejemplo IP-10) . Se ha demostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud total. Ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo incluye (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de dominios VL, VH, CL y CH?; (ii) un fragmento F(ab')2.- un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH?; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al . , (1989) Nature 341: 544-546), el cual consiste de un dominio VH; y (vi) una región que determina la complementariedad aislada (CDR) . Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por los genes separados, estos pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, por un conector sintético que les permite generarse como una cadena de proteína sencilla en donde el par de regiones VL y VH que forman moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv) ; véase por ejemplo . , Bird et al . (1988) Science 242 : 423-426; y Huston et al . (1988) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 85: 5879-5883).
Tales anticuerpos de cadena sencilla se pretenden también para abarcarse dentro del término "porción que une el antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos con experiencia en la técnica, y los fragmentos se clasifican para utilidad en la misma manera como los son los anticuerpos intactos . Un "anticuerpo aislado" , como se utiliza en la presente, se pretende para referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislados que se enlaza específicamente a IP-10 está sustancialmente libre de anticuerpos que enlazan específicamente antígenos diferentes de IP-10) . Un anticuerpo aislado que enlaza específicamente IP-10 puede, sin embargo tener reactividad cruzada a otros antígenos, tales como moléculas IP-10 a partir de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede ser sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpos de una composición molecular sencilla. Una composición de anticuerpos monoclonal despliega una especificidad de enlace sencilla y una afinidad para un epítopo particular.
El término "anticuerpo humano" como se utiliza en la presente, se pretende para incluir anticuerpos que tienen regiones variables en donde tanto la estructura como las regiones CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante se deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados para secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o sitio-específicas in vi tro o por mutación somática in vivo) . Sin embargo, el término "anticuerpo humano" como se utiliza en la presente, no se pretende para incluir anticuerpos en donde las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tales como un ratón, se han injertado sobre las secuencias de estructura humana. El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que despliegan una especificidad de enlace sencillo la cual tiene regiones variables en donde tanto la estructura como las regiones CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluyen una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humano y un transgen de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada. El término "anticuerpo humano recombinante" como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aislan por medios recombinantes, tal como (a) anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transeromosomal para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo (descrito además posteriormente) , (b) anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfecto a, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpo humano combinatorial, recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualesquiera otros medios que implican el empalme de secuencias genéticas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en donde la estructura y las regiones CDR se derivan de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humanas. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vi tro (o, cuando un animal transgénico para secuencias Ig humanas se utiliza, mutagénesis somáticas in vivo) y de este modo las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y V de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras se derivan de y se relacionan a partir de las secuencias VH y VL de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo . Como se utiliza en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgGl) que se codifica por los genes de región constante de cadena pesada. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan intercambiablemente en la presente con el término "un anticuerpo el cual se enlaza específicamente a un antígeno" . Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "se enlaza específicamente a IP-10 humano" se pretende para referirse a un anticuerpo el cual se enlaza a IP-10 humano con un KD de 5 x 10~9 M o menos, más preferiblemente 2 x 10"9 M o menos, y aún más preferiblemente 1 x 10"10 M o menos. Un anticuerpo que "reacciona cruzado con el mono rhesus IP-10" se pretende para referirse a un anticuerpo el cual se enlaza al mono rhesus IP-10 con un KD de 0.5 x 10"8 M o menos, más preferiblemente 5 x 10~9 M o menos, y aún más preferiblemente 2 x 10"9 M o menos. Un anticuerpo que "no reacciona cruzado con IP-10 de ratón" o "no reacciona cruzado con MIG humano" o "no reacciona con ITAC humano" se pretende para referirse a un anticuerpo que se enlaza a IP-10 de ratón, MIG humano o ITAC humano con un KD de 1.5 x 10 M o mayor, más preferiblemente un KD de 5-10 x 10~8 M o mayor y aún más preferiblemente 1 x 10~7 M o mayor. En ciertas modalidades, tales anticuerpos que no reaccionan cruzados con IP-10 de ratón, MIG humano y/o ITAC humano exhiben el enlace esencialmente indetectable contra estas proteínas en ensayos de enlace estándar. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "inhibe el enlace de IP-10 a CXCR3" se pretende para referirse a un anticuerpo que inhibe el enlace de IP-10 a CXCR3 con un K¿ de 1 nM o menos, más preferiblemente 0.75 nM o menos, aún más preferiblemente 0.5 nM o menos y aún más preferiblemente 0.25 nM o menos. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "inhibe el flujo de calcio inducido por IP-10" se pretende para referirse a un anticuerpo que inhibe el flujo de calcio inducido por IP-10 con un IC50 de 10 nM o menos; más preferiblemente 7.5 nM o menos, aún más preferiblemente 5 nM o menos y aún más preferiblemente 2.5 nM o menos. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "inhibe la migración celular inducida por IP-10" se pretende para referirse a un anticuerpo que inhibe la migración celular inducida por IP-10 humano con un IC50 de 2 µg/ml o menos, más preferiblemente 1 µg/ml o menos, aún más preferiblemente 0.5 µg/ml o menos y aún más preferiblemente 0.25 µg/ml o menos. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "inhibe el flujo de calcio inducido por IP-10" se pretende para referirse a un anticuerpo que inhibe el flujo de calcio inducido por IP-10 con un IC50 de 10 nM o menos, más preferiblemente 7.5 nM o menos, aún más preferiblemente 5 nM o menos y aún más preferiblemente 2.5 nM o menos. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "inhibe la migración celular inducida por IP-10" se pretende para referirse a un anticuerpo que inhibe la migración celular inducida por IP-10 humana con un IC50 de 2 µg/ml o menos, más preferiblemente 1 µg/ml o menos, aún más preferiblemente 0.5 µg/ml o menos y aún más preferiblemente 0.25 µg/ml o menos. El término "Kassoc" o "Ka" como se utiliza en la presente, se pretende para referirse a la velocidad de asociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "Kais" o "K^" , como se utiliza en la presente, se pretende para referirse a la velocidad de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. El término "KD" , como se utiliza en la presente, se pretende para referirse a la disociación constante, la cual se obtiene de la relación de Ka a Ka (es decir, y se expresa como una concentración molar (M) . Los valores KD para los anticuerpos pueden determinarse utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar el KD de un anticuerpo es utilizar la resonancia de plasmón superficial, de preferencia utilizar un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®. Como se utiliza en la presente, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene un KD de 10-8 M o menos, más preferiblemente 10-9 M o menos y aún más preferiblemente 10"10 M o menos para un antígeno objetive. Sin embargo, el enlace de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, el enlace de "alta afinidad" para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene un KD de 10-7 M o menos, más preferiblemente 10"8 o menos. Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier ser humano o animal no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Varios aspectos de la invención se describen en detalle adicional en las siguientes sub-secciones .
Anticuerpos Anti-IP-10 Los anticuerpos de la invención se caracterizan por características o propiedades funcionales particulares de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se enlazan específicamente a IP-10 humano. Adicionalmente, los anticuerpos pueden reaccionar cruzados con IP-10 a partir de uno o más primates no humanos, tales como monos rhesus. De preferencia, los anticuerpos no reaccionan cruzados con ratones IP-10. Además, aunque MIG e ITAC son también ligandos para el receptor CXCR3 , los anticuerpos de la invención no reaccionan de preferencia cruzados con MIG humano o ITAC humano . De preferencia, un anticuerpo de la invención se enlaza a IP-10 con alta afinidad, por ejemplo, con un KD de 10~8 M o. menos o 10-9 M o menos o aún 10-10 o menos. Además, los anticuerpos de la invención son capaces de inhibir una o más actividades funcionales de IP-10. Por ejemplo, en una modalidad, los anticuerpos inhiben el enlace de IP-10 a CXCR3. En otra modalidad, los anticuerpos inhiben el flujo de calcio inducido por IP-10. En aún otra modalidad, los anticuerpos inhiben la migración celular inducida por IP-10 (quimiotaxis) . Ensayos estándares para evaluar la capacidad de enlazar los anticuerpos hacia IP-10 de varias especies y/o MIG o ITAC se conocen en la técnica, incluyendo por ejemplo, los ELISA, transferencias Western y las RÍA. Ensayos adecuados se describen en detalle en los Ejemplos. Las cinéticas de enlace (por ejemplo, afinidad de enlace) de los anticuerpos pueden evaluarse por ensayos estándares conocidos en la técnica, tales como por análisis Biacore. Los ensayos para evaluar los efectos de los anticuerpos en propiedades funcionales de IP-10 (por ejemplo, enlace receptor, flujo de calcio, quimiotaxis) se describen en detalle adicional en los Ejemplos . Por consiguiente, un anticuerpo que "inhibe" una o más de estas propiedades funcionales IP-10 (por ejemplo, actividades bioquímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas u otras biológicas, o similares) como se determinan de acuerdo a las metodologías conocidas en la técnica y se describen en la presente, se entenderán para relacionarse a ia disminución estadísticamente significativa en la actividad particular con relación a aquella vista en la ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o cuando un anticuerpo control de especificidad irrelevante se presente) . De preferencia un anticuerpo que inhibe una actividad de IP-10 efectúa tal disminución estadísticamente significativa por al menos 10% del parámetro medido, más preferiblemente por al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% y en ciertas modalidades preferidas un anticuerpo de la invención puede inhibir más de 92%, 94%, 95%, 97%, 98% o 99% de una actividad funcional IP-10.
Anticuerpos monoclonales 1D4 , 1E1 , 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 Los anticuerpos preferidos de la invención son anticuerpos 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 monoclonales humanos, aislados y estructuralmente caracterizados como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Otra modalidad preferida es 10A12S, en donde el residuo 32 de aminoácidos de la cadena pesada de 10A12 (dentro de CDRl de VH) se ha mutado a partir de una cisteína a una serina. Las secuencias de aminoácido VH de 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10 , 8F6, 10A12, 10A12S y 13C4 se muestran en las SEC. DE IDENT. NOS.: 35-46, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos VL de 1E1 , 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 se muestran en las SEC. DE IDENT. NOS.: 84-94, respectivamente. Dado que cada uno de estos anticuerpos pueden enlazarse a IP-10, las secuencias VH y VL pueden "mezclarse y acoplarse" para crear otras moléculas de enlace anti-IP-10 de la invención. El enlace IP-10 de tales anticuerpos "mezclados y acoplados" puede probarse utilizando los ensayos de enlace descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, los ELISA) . De preferencia, cuando las cadenas VH y VL se mezclan y se acoplan, una secuencia VH de una conexión VH/VL se reemplaza con una secuencia VH estructuralmente similar. Así mismo, de preferencia una secuencia VL a partir de una conexión VH/VL se reemplaza con una secuencia VL estructuralmente similar. Por ejemplo, las secuencias VH/VL de 1D4, 2G1, 6A5, 6A8 , 10A12 ó 10A12S son particularmente sensibles para mezclado y acoplamiento, ya que estos anticuerpos utilizan secuencias VH y VL derivadas de las mismas secuencias de línea germinal (VH 3-33 y Vk A27) y de este modo exhiben similaridad estructural. Así mismo, las secuencias VH y VL de 6B10 y 8F6 también son particularmente sensibles a mezclado y acoplamiento, ya que utilizan también secuencias VH y VL derivados de las mismas secuencias de línea germinal (VH 3-30.3 y VkL6) y de este modo exhiben similaridad estructural. Alternativamente, por ejemplo, la secuencia VH de 1D4 , 2G1, 6A5 , 6A8 , 10A12 o 10A12S puede aparearse con la VL de 13C4, ya que las secuencias VH de 1D4 , 2G1, 6A5, 6A8 , 10A12 y 10A12S apareadas originalmente con una secuencia VL de la línea germinal Vk A27 y la secuencia VL de 13C4 también se derivan de la línea germinal Vk A27. Así mismo, la secuencia VL de 7C10 o 1E1 puede aparearse con la VH de 1D4, 2G1, 6A5 , 6A8 , 10A12 o 10A12S, ya que las secuencias VL de 7C10 y 1E1 originalmente apareadas con una secuencia VH de la línea germinal VH 3-33 y las secuencias VH de 1D4 , 2G1, 6A5, 6A8 , 10A12 y 10A12S se derivan también de la línea germinal VH 3-33. Será fácilmente evidente para un técnico ordinariamente calificado que otra conexión de VH/VL de secuencias estructuralmente similares puede crearse a partir de las secuencias VH y VL descritas en la presente para anticuerpos monoclonales, anticuerpos 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 35-46; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia 'de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 84-94; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a IP-10. Las combinaciones de cadena pesada y ligera preferidas incluyen: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT.
NO.: 35; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 84; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT.
NO.: 36; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 85; O (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT.
NO.: 37; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 86; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT.
NO.: 38; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 87; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT.
NO.: 39; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 88; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT.
NO. : 40; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 89; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT.
NO.: 41; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 90; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT.
NO. : 42; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 91; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT.
NO.: 43; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 92; O (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 44 ó 45; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 93; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO.: 46; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. : 94. En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden las CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y de cadena ligera, de 1D4 , 1E1 , 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S y 13C4 o combinaciones de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de las CDRl de VH de 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S y 13C4 se muestran en las SEC. DE IDENT. NOS.: 1-12. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VH de 1D4 , 1E1 , 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 se muestran en las SEC. DE IDENT. NOS.: 13-23. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 se muestran en las SEC. DE IDENT. NOS.: 24-34. Las secuencias de aminoácidos de las CDRl de V de 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 se muestran en las SEC. DE IDENT. NOS.: 51-61. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de V? de 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 se muestran en las SEC. DE IDENT . NOS.: 62-72. Las secuencias de aminoácidos de las CDRl de Vk de 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 6F6, 10A12 y 13C4 se muestran en las SEC. DE IDENT. NOS.: 73-83. Las regiones CDR se delimitan utilizando el sistema Kabat (Kabat, E. A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) . Dado que cada uno de estos anticuerpos pueden enlazarse a IP-10 y que la especificidad de enlace del antígeno se proporciona principalmente por las regiones CDRl, 2 y 3, las secuencias CDRl, 2 y 3 de VH y las secuencias de CDRl, 2 y 3 de V pueden "mezclarse y acoplarse" (es decir, las CDR a partir de diferentes anticuerpos pueden mezclarse y acoplarse, aunque cada anticuerpo debe contener una CDRl, 2 y 3 de VH y una CDRl, 2 y 3 de VL) para crear otras moléculas de enlace anti-IP-10 de la invención. El enlace IP-10 de tales anticuerpos "mezclados y acoplados" puede probarse utilizando los ensayos de enlace descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, los ELISA) . De preferencia, cuando las secuencias CDR de VH se mezclan y acoplan, las secuencias CDRl, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VH particular se reemplaza con una o unas secuencias CDR estructuralmente similares. Así mismo, cuando las secuencias CDR de VL se mezclan y se acoplan, la secuencia CDRl, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VL particular se reemplaza de preferencia con una o unas secuencias CDR estructuralmente similares. Por ejemplo, las CDRl de VH de 1D4 , 1E1, 2G1, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 10A12S comparten alguna símilaridad estructural y por lo tanto son sensibles al mezclado y acoplamiento, mientras que las CDRl de VH de 3C4 y 13C4 no son estructuralmente similares a las CDRl de VH de 1D4 , 1E1, 2G1, 6A5, 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 10A12S y de este modo no deben mezclarse y acoplarse con éstas. Será fácilmente aparente por un técnico ordinariamente calificado que las secuencias VH y VL pueden crearse sustituyendo una o más secuencias de la región CDR de VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares a partir de las secuencias CDR descritas en la presente para anticuerpos monoclonales 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo que comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 1-12; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 13-23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 24-34; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 51- 61; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.-. 62- 72; (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 73-83; En donde el anticuerpo se enlaza específicamente a IP-10. En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 1; (b) una. CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 13; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 24; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 51; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 62; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 73. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 2 ; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 14; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 25; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 52; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 63; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 74. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC . DE IDENT . NO . : 3 ; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 15; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 26; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 53; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 64; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 75. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 4 ; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 16; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 27; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 54; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 65; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 76. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 5; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 17; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 28; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 55; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 66; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 77. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 6; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 18; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 29; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 56; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 67; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 78. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 7; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 19; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 30; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 57; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 68; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 79. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC . DE IDENT . NO . -. 8 ; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 20; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 31; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 58; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 69 ; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 80. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 9 ; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 21; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC . DE IDENT. NO.: 32; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 59; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 70; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 81. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 10 u 11; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT . NO.: 22; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 33; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 60; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 71; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 82. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO. : 12; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 34; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 61; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 72; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC. DE IDENT. NO.: 83.
Anticuerpos que Tienen Secuencias de Línea Germinal Particular En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada a partir de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de línea germinal particular y/o una región variable de cadena ligera a partir de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de línea germinal particular. Como se demuestra en la presente, se han preparado anticuerpos humanos específicos de IP-10 los cuales comprenden una región variable de cadena pesada que es el producto de o se derivan de un gen VH 3-33 de línea germinal humana, gen VH 3-30.3, gen VH 5-51 o gen VH 4-61. Por consiguiente, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen de línea germinal VH seleccionado a partir del grupo que consiste de: VH 3-33, VH 3-30.3, VH 5-51 y VH 4-61. De preferencia, el anticuerpo es específico para un polipéptido IP-10 humano (por ejemplo, comprendiendo la secuencia del No. de Acceso Genbank NP_001556) . También como se demostró en la presente, se han preparado anticuerpos humanos específicos para IP-10 que comprenden una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk A27 de línea germinal humana, gen Vk L15, gen Vk L6 o gen Vk L18. Por consiguiente, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen de línea germinal Vk humano seleccionado a partir del grupo que consiste de: Vk A27, Vk L15, Vk L6 y Vk L18. De preferencia, el anticuerpo es específico para un polipéptido IP-10 humano (por ejemplo, comprendiendo la secuencia del No. de Acceso Genbank NP_001556) . Los anticuerpos preferidos de la invención son aquellos que comprenden una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de uno de los genes VH de línea germinal humana listada anteriormente y que comprende también una región variable de cadena ligera la cual es el producto de o se deriva de uno de los genes Vk de línea germinal humana listada anteriormente. Por consiguiente, en otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen de línea germinal VH humano seleccionado a partir del grupo que consiste de: VH 3-33, VH 3-30.3, VH 5-51 y VH 4-61; y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen de línea germinal Vk humano seleccionado a partir del grupo que consiste de: Vk A27, Vk L15, Vk L6 y Vk L18. De preferencia, el anticuerpo es específico para un polipéptido IP-10 humano (por ejemplo, que comprende la secuencia del No. de Acceso Genbank NP_001556) . La invención proporciona también anticuerpos que comprenden combinaciones preferidas de regiones variables de cadena pesada y ligera que son el producto de o se derivan de genes de línea germinal VH y Vk particular. Por ejemplo, en una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen VH 3-33 humano (el cual codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO.: 47); (b) comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk A27, L15 o L6 humano (el cual codifica las secuencias de aminoácido establecidas en las SEC. DE IDENT. NOS.: 95, 98 y 97, respectivamente) ; y (c) se enlaza específicamente a IP-10. En una modalidad, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk A27 humano. Ejemplos de anticuerpos que tienen VH y V de VH 3-33 y Vk A27, respectivamente, incluyendo 1D4 , 2G1, 6A5 , 6A8 , 10A12 y 10A12S. En otra modalidad, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk L15 humano. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene VH y V? de VH 3-33 y Vk L15, respectivamente, es 7C10. En otra modalidad, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera de un gen Vk L6 humano. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene VH y V? de VH 3-33 y Vk L6, respectivamente es 1E1. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antigeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) comprende una región variable de cadena pesada de o se deriva de un gen 3-30.3 VH humano (el cual codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO. : 48) ; (b) comprende una región variable de cadena ligera de o se deriva de un gen Vk L6 humano (el cual codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO. : 96) ; y (c) se enlaza específicamente a IP-10. Ejemplos de anticuerpos que tienen VH y V? de VH 3- 30.3 y Vk L6, respectivamente, incluyen 6B10 y 8F6. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) comprende una región variable de cadena pesada de o se deriva de un gen 5-51 VH humano (el cual codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO. : 49) ; (b) comprende una región variable de cadena ligera de o se deriva a partir de un gen Vk L18 (el cual codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO. : 97) ; y (c) se enlaza específicamente a IP-10. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene VH y V? de VH 5-51 y Vk L18, respectivamente, es 3C4.
En aún otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígenos del mismo, en donde el anticuerpo: (a) comprende una región variable de cadena pesada de o se deriva de un gen VH 4-61 (el cual codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT. NO. : 50) ; (b) comprende una región variable de cadena ligera de o se deriva de un gen Vk A27 (el cual codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. DE IDENT . NO. : 95) ; y (c) se enlaza específicamente a IP-10. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene V y V de VH 4-61 y Vk A27, respectivamente, es 13C4. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia de línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema el cual utiliza genes de inmunoglobulina de línea germinal humana. Tales sistemas incluyen inmunizar un ratón transgénico que porta genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o clasifican una biblioteca del gen de inmunoglobulina humana desplegada en el fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano a las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas de línea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana que está más cercana en la secuencia (es decir, % mayor de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos cuando se compara a la secuencia de la línea germinal, debido a, por ejemplo, mutaciones somáticas de origen natural o la introducción intencional de mutación sitio-dirigida. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado normalmente es al menos 90% idéntico a la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como siendo humano cuando se compara a las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de línea germinal de murino) . En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 95%, o aún al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado a partir de una secuencia de línea germinal humana particular desplegará no más de 10 diferencias de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede desplegar no más de 5 , o aún no más de 4 , 3 , 2 ó 1 diferencias de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal .
Anticuerpos Homólogos En aún otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogos a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-IP-10 de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígenos del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde: (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 35-46; (b) una región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 84-94; (c) el anticuerpo se enlaza específicamente a IP-10, y (d) el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales : (i) el anticuerpo inhibe el enlace de IP-10 a CXCR3 ; (ii) en anticuerpo inhibe el flujo de calcio inducido por IP-30; (iii) el anticuerpo inhibe la migración celular inducida por IP-10; (iv) el anticuerpo reacciona cruzado con el IP-10 del mono rhesus; (v) el anticuerpo reacciona no cruzado con IP-10 de ratón; (vi) el anticuerpo reacciona no cruzado con el MIG humano ; (vii) el anticuerpo reacciona no cruzado con el ITAC humano. En varias modalidades, el anticuerpo puede exhibir uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más o seis o más de las propiedades funcionales listadas como (d) a (j ) anteriormente. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico . En otra modalidad, las secuencias de aminoácido VH y/o VL pueden ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homologas a las secuencias establecidas anteriormente. Un anticuerpo que tiene regiones VH y VL que tienen homología elevada (es decir, 80% o mayor) a las regiones VH y VL de las SEC. DE IDENT. NOS.: 35-46 y 84-94, respectivamente, pueden obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis sitio-dirigida o mediada por PCR) de las moléculas del ácido nucleico que codifican las SEC. DE IDENT. NOS.: 35-46 y/o 84-94, seguidas por la prueba del anticuerpo alterado codificado para una función retenida (es decir, las funciones establecidas en (c) a (j ) anteriormente) utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. Como se utiliza en la presente, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100) , teniendo en cuenta el número de aberturas y la longitud de cada abertura, la cual necesita introducirse para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias pueden lograrse utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes siguientes . El porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Millar ( Comput . Appl . Biosci . , 4_: 11-17 (1998) ) el cual se ha incorporado dentro del programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla residual de peso PAM120, una penalidad de longitud de abertura de 12 y una penalidad de abertura de 4. Además, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo Needleman y Wunsch [ J. Mol . Biol . 48: 444-453 (1970) ) el cual se ha incorporado dentro del programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando ya sea un matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de abertura de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de l, 2, 3, 4, 5 ó 6. Adicional o alternativamente, las secuencias de proteína de la presente invención pueden utilizarse además como una "secuencia de búsqueda" para realizar una investigación contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales investigaciones pueden realizarse utilizando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al . (1990) J. Mol . Biol . 215 : 403-10. Las investigaciones de búsqueda BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener las secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de anticuerpo de la invención. Para obtener alineaciones de abertura para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al . , (1997) Nucleic Acids Res . 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse parámetros predefinidos de los programas respectivos (per ejemplo, XBLAST y NBLAST) . Véase http : //www. nebi . nlm.nih . gov.
Anticuerpos con Modificaciones Conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 , en donde una o más de estas secuencias CDR comprende secuencias de aminoácidos específicas basadas en los anticuerpos preferidos descritos en la presente (por ejemplo, 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S o 13C4) o las modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseados de los anticuerpos anti-IP-10 de la invención. Por consiguiente, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 , en donde : (a) la secuencia CDR3 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. NOS. : 24-34, y modificaciones conservadoras del mismo; (b) una secuencia CDR3 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. NOS. : 73-83, y modificaciones conservadoras del mismo; (c) el anticuerpo se enlaza específicamente a IP-10, y (d) el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales : (i) el anticuerpo inhibe el enlace de IP-10 a CXCR3 ; (ii) el anticuerpo inhibe el flujo de calcio inducido por IP-10; (iii) el anticuerpo inhibe la migración celular inducida por IP-10; (iv) el anticuerpo reacciona cruzado con el IP-10 del mono rhesus; (v) el anticuerpo reacciona no cruzado con el IP-10 de ratón; (vi) el anticuerpo reacciona no cruzado con el MIG humano ; (vii) el anticuerpo reacciona no cruzado con el ITAC humano. En una modalidad preferida, la secuencia CDR2 de región variable ie cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. NOS.: 13-23, y modificaciones conservadoras del mismo; y la secuencia CDR2 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. NOS.: 62- 72, y modificaciones conservadoras del mismo. En otra modalidad preferida, la secuencia CDR3 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. NOS.: 1-12, y modificaciones conservadoras del mismo; y la secuencia CDR3 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. NOS.: 51-61, y modificaciones conservadoras del mismo. En varias modalidades, el anticuerpo puede exhibir una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más o seis o más de las propiedades funcionales listadas como (d) a (j ) anteriormente. Tales anticuerpos pueden ser por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos . Como se utiliza en la presente, el término "modificaciones conservadoras de secuencia" se pretende para referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de enlace del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoácidos . Las modificaciones pueden introducirse dentro de un anticuerpo de la invención por técnicas estándares conocidas en el arte, tales como mutagénesis sitio-dirigidas y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas en donde el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acídicas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptofano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina , leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). De este modo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención pueden reemplazarse con otros residuos de aminoácidos a partir de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado puede probarse para función retenida (es decir, las funciones establecidas en (c) a (j) anteriormente) utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.
Anticuerpos que se Unen al Mismo Epítopo como Anticuerpos Anti-IP-10 de la Invención En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítopo como lo hacen los diversos anticuerpos anti-IP-10 de la invención provistos en la presente, tales como otros anticuerpos humanos que se unen al mismo epítopo como los anticuerpos 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S o 13C4 descritos en la presente. Tales anticuerpos adicionales pueden identificarse con base en su capacidad para competencia cruzada (por ejemplo, para inhibir competitivamente el enlace de, en una manera estadísticamente significativa) con otros anticuerpos de la invención, tales como 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S o 13C4 en ensayos de enlace IP-10 estándar. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir el enlace de por ejemplo, 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S o 13C4 a IP-10 humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con ese anticuerpo para enlazarse a IP-10 humano; tal anticuerpo puede, de acuerdo a la teoría no limitante, enlazarse al mismo o un epítopo relacionado (por ejemplo, uno estructuralmente similar o espacialmente próximo) en IP-10 humano como el anticuerpo con el cual compite. En una modalidad preferida, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en el IP-10 humano como 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S o 13C4 es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse como se describe en los Ejemplos .
Anticuerpos Diseñados y Modificados Un anticuerpo de la invención puede prepararse además utilizando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias VH y/o VL descritas en la presente como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas a partir del anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede diseñarse al modificar uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL) por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones de esquema. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede diseñarse al modificar los residuos dentro de la o las regiones constantes, por ejemplo, para alterar la o las funciones ejecutadoras del anticuerpo. Un tipo de ingeniería de región variable que puede realizarse es el injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con antígenos objetivo predominantemente a través de residuos aminoácidos que se ubican en las seis regiones que determinan complementariedad de cadena pesada y ligera (las CDR) . Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias CDR son responsables para mayores interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos de origen naturales específicas al construir vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR a partir del anticuerpo de origen natural específico injertado dentro de las secuencias de estructura a partir de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véase, por ejemplo, Riechmann, L, et al . (1998) Nature 332 : 323-327; Jones, P. et al. (1986) .Nature 321: 522-525; Queen, C. et al . ' (1989) Proc . Nati . Acad . Véase U. S. A . _86: 10029-10033; Patente Norteamericana No. 5,225,539 para Winter, y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et al . ) Por consiguiente, otra modalidad de la invención pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 1-12, SEC DE IDENT . NOS.: 13-23 y SEC DE IDENT. NOS.: 24-34, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 51-61, SEC DE IDENT. NOS.: 62-72 y SEC DE IDENT. NOS.: 73-83, respectivamente. De este modo, tales anticuerpos contienen las secuencias CDR de VH y VL de anticuerpos monoclonales 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S o 13C4 aún pueden contener secuencias de estructura a partir de estos anticuerpos . Tales secuencias de estructura pueden obtenerse a partir de las bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias genéticas de anticuerpos de línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de línea germinal para genes de región variable de cadena pesada y ligera humana pueden encontrarse en la base de datos de secuencia de línea germinal humana "VBase" (disponible en la Internet en ww .mrc-cpe . cam. ac .uk/vbase) , así como en Kabat, E. A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I.M., et al . (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveáis about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol . Biol . 227: 776-798; y Cox, J. P. L. et al . (1994)" A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveáis a Strons Bias in their Usage" Eur. J. Immunol . 24 : 827-836; los contenidos de cada una de las cuales se incorporan expresamente en la presente para referencia. Las secuencias de estructura preferidas para uso en los anticuerpos de la invención son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de estructura utilizadas por anticuerpos seleccionados de la invención, por ejemplo, similar a las secuencias VH 3-33, 3-30.3, 4-61 ó 5-51 [SEC DE IDENT. NOS.: 47-50] y/o secuencias de estructura Vk A27, L6, L18 o L15 [SEC DE IDENT. NOS.: 95-98] utilizadas por anticuerpos monoclonales preferidos de la invención. Las secuencias CDRl, 2 y 3 de VH y las secuencias CDRl, 2 y 3 de VL, pueden injertarse sobre las regiones de estructura que tienen la secuencia idéntica como aquella encontrada en el gen de inmunoglobulina de línea germinal a partir de la cual se deriva la secuencia de estructura, o las secuencias de CDR pueden inj ertarse sobre las regiones de estructura que contienen una o más mutaciones cuando se compara a las secuencias de línea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertos casos, es benéfico mutar residuos dentro de las regiones de estructura para mantener o mejorar la capacidad de enlace de antígenos del anticuerpo (véase por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et al) . Otro tipo de modificación de región variable es mutar residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDRl, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o VL por lo que se mejora una o más propiedades de enlace (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. La mutagénesis sitio-dirigida o la mutagénesis mediada por PCR puede realizarse para introducir la o las mutaciones y el efecto en el enlace de anticuerpos, u otra propiedad funcional de interés, puede evaluarse en ensayos in vi tro o in vivo como se describe en la presente y se proporciona en los Ejemplos. Las modificaciones preferiblemente conservadoras (como se discute anteriormente) se introducen. Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos, pero son de preferencia sustituciones. Además, normalmente no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región de CDR se alteran. Por consiguiente, en otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos monoclonales anti-IP-10 aislados, o porciones de enlace de antígenos de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDRl de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las S?C. DE IDENT. NOS.: 1-12, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos cuando se compara a las SEC DE IDENT. NOS.: 1-12; (b) una región CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 13-23, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos cuando se compara a las SEC DE IDENT. NOS.: 13-23; (c) una región de CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 24-34 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos cuando se compara a las SEC DE IDENT. NOS.: 24-34; (d) una región CDRl de V que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 51-61, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos cuando se compara a las SEC DE IDENT. NOS. : 51-61; (e) una región CDR2 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 62-72, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos cuando se compara a las SEC DE IDENT. NOS.: 62-72; y (f) una región CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 73-83, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos cuando se compara a las SEC DE IDENT. NOS. : 73-83. Una mutación de sustitución preferida de la invención es la sustitución de un residuo serina para el residuo cisteína en la posición 32, dentro de CDRl de la cadena VH de 10Al2 mAb. Esta forma modificada de 10Al2 se refiere en la presente como 10A12S. La secuencia de aminoácidos de la cadena VH de 10Al2 se muestra en la SEC DE IDENT. NO. : 44 y la secuencia de aminoácidos de la cadena VH de 10A12S se muestra en la SEC DE IDENT. NO.: 45.
Los anticuerpos diseñados de la invención incluyen aquellos en donde las modificaciones se han hecho para residuos de estructura dentro de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, tales modificaciones de estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un método es "mutar de nuevo" uno o más residuos de estructura a la secuencia de línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha experimentado mutación somática puede contener residuos de estructura que difieren de la secuencia de línea germinal a partir de la cual el anticuerpo se deriva. Tales residuos pueden identificarse al comparar las secuencias de estructura del anticuerpo a las secuencias de línea germinal a partir de las cuales se deriva el anticuerpo. Por ejemplo, para 6A5, el residuo #2 de aminoácidos (dentro de FR1) de VH es una metionina mientras que este residuo en la secuencia de línea germinal VH 3-33 correspondiente es una valina (véase la Figura 12) . Para regresar las secuencias de región de estructura a su configuración de línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "mutarse de nuevo" a la secuencia de línea germinal por, por ejemplo, mutagénesis sitio dirigida o mutagénesis mediada por PCR (por ejemplo, el residuo 2 de VH de 6A5 puede "mutarse de nuevo" a partir de metionina a valina) . Tales anticuerpos "mutados de nuevo" se pretenden también para abarcarse por la invención. Otro tipo de modificación de estructura implica mutar uno o más residuos dentro de la región de estructura, o aún dentro de una o más regiones CDR, para remover los epítopos de la célula T por lo que se reduce la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este método se refiere también como "desinmunízación" y se describe en detalle adicional en la Publicación de Patente Norteamericana No. 20030153043 por Carr et al . Además o alternativo a las modificaciones hechas dentro de la estructura o regiones de CDR, los anticuerpos de la invención pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como vida media en suero, fijación del complemento, enlace del receptor Fc y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, una o más porciones químicas pueden unirse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe en detalle adicional posteriormente. La numeración de residuos en la región Fc es aquella del índice EU de Kabat . En una modalidad, la región de bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de residuos de cisteína en la región de bisagra se altere, por ejemplo, se incremente o se disminuya. Este método se describe además en la Patente Norteamericana No. 5,677,425 por Bodmer et al . El número de residuos de cisteína en la región de bisagra de CH1 se altera para por ejemplo, facilitar el ensamble de las cadenas ligeras y pesadas o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo. En otra modalidad, la región de bisagra Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, una o más mutaciones de aminoácidos se introducen dentro de la región de interfase de dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra Fc de manera que el anticuerpo ha deteriorado el enlace de la proteína A de estafilococo (Spa) con relación al enlace de SpA de dominio de bisagra Fc nativa. Este método se describe en detalle adicional en la Patente Norteamericana No. 6,165,745 para Ward et al . En otra modalidad, el anticuerpo se modifica para incrementar su vida media biológica. Varios métodos son posibles. Por ejemplo, una o más de las siguientes mutaciones pueden introducirse: T252L, T254S, T256F como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,277,375 para Ward. Alternativamente, para incrementar la vida media biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de enlace de receptor salvaje tomado a partir de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,869,046 y 6,121,022 por Presta et al . ?n aún otras modalidades, la región Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoácidos con un diferente residuo de aminoácidos para alterar la o las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados a partir de los residuos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 de aminoácidos pueden reemplazarse con un diferente residuo de aminoácidos de manera que el anticuerpo tiene una afinidad alterada para un ligando efector pero retiene la capacidad de enlace de antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector al cual se altera la afinidad puede ser por ejemplo, un receptor Fc o el componente Cl del complemento. Este método se describe en detalle adicional en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,624,821 y 5,648,260, ambas para Winter et al . En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados a partir de los residuos 329, 331 y 322 de aminoácidos pueden reemplazarse con un diferente residuo de aminoácidos de manera que el anticuerpo tiene un enlace Clq alterado y/o una citotoxicidad dependiente de complemento reducida o suprimida (CDC) . Este método se describe en detalle adicional en la Patente Norteamericana No. 6,194,551 para Idusogie et al .
En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las posiciones 231 y 239 de aminoácidos se alteran por lo que se altera la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este método se describe además en la Publicación PCT WO 94/29351 por Bodmer et al . En aún otro ejemplo, la región Fc se modifica para incrementar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para incrementar la afinidad del anticuerpo para un receptor Fc? modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ó 439. Este método se describe además en la Publicación de PCT WO 00/42072 por Presta. Además, los sitios de enlace en la IgGl humano para Fc?Rl, Fc?RII, Fc?RIII y FcRN han sido mapeados y las variantes con el enlace mejorado se han descrito (véase Shields, R.L. et al . (2001) J. Biol . Chem . 276: 6591-6604). Las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 se mostraron para mejorar el enlace a Fc?RIII. Adicionalmente, se mostraron los siguientes mutantes de combinación para mejorar el enlace Fc?RIII : T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A. En aún otra modalidad, la glicosilación de un anticuerpo se modifica. Por ejemplo, puede hacerse un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación) . La glicosilación puede alterarse para por ejemplo, incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de carbohidrato pueden lograrse por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden hacerse una o más sustituciones de aminoácidos lo que resulta en la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de estructura de región variable por lo que se elimina la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tal método se describe en detalle adicional en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,714,350 y 6,350,861 por Co et al . Adicional o alternativamente, puede hacerse un anticuerpo que tiene un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras GlcNac bisectadas incrementadas . Se ha demostrado que tales patrones de glicosilación alterados incrementan la capacidad de ADCC de los anticuerpos . Tales modificaciones del carbohidrato pueden lograrse por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria de glicosilación alterada. Las células con maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la técnica y pueden utilizarse como células huéspedes en donde expresan anticuerpos recombinantes de la invención por lo que se produce un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, EP 1,176,195 por Hanai et al . describen una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente interrumpido, el cual codifica una fucosil transferasa, de manera que los anticuerpos expresados en tal línea celular exhiben hipofucosilación. La Publicación PCT WO 03/035835 por Presta describe una línea de células CHO variante, células Lecl3 , con capacidad reducida para unir mucosa a carbohidratos unidos a Asn(297), resultando también en hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol . Chem . 277 : 26733-26740) . La publicación PCT WO 99/54342 por U ana et al . describe líneas celulares diseñadas para expresar glicosil transferasas que modifican la glicoproteína (por ejemplo, beta (1 , 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas exhiben estructuras GlcNac bisectadas incrementadas las cuales resultan en actividad ADCC incrementada de los anticuerpos (véase también Umana et al . (1999) Nat . Biotech . 17: 176-180) .
Otra modificación de los anticuerpos en la presente la cual se contempla por la invención es la pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado para, por ejemplo, incrementar la vida media biológica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar normalmente con polietilenglicol (PEG) , tal como un éster reactivo o derivado aldehido del PEG, bajo condiciones en donde uno o más grupos PEG vuelven a unirse al anticuerpo o fragmento de anticuerpos. De preferencia, la pegilación se lleva a cabo a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) . Como se utiliza en la presente, el término "polietilenglicol" se pretende para abarcar cualquiera de las formas de PEG que han sido utilizadas para derivar otras proteínas, tales como monoalcoxi de C1-C10 o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que se pegila es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invención. Véase por ejemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al . y EP 0 401 384 por Ishikawa et al .
Métodos para Diseñar Anticuerpos Como se discute anteriormente, los anticuerpos anti-IP-10 que tienen secuencias VH y VL descritos en la presente pueden utilizarse para crear nuevos anticuerpos anti-IP-10 al modificar las secuencias VH y/o VL, o la o las regiones constantes unidas a las mismas. De este modo, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo anti-IP-10 de la invención, por ejemplo, 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S ó 13C4 se utilizan para crear anticuerpos anti-IP-10 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como el enlace a un IP-10 humano y un IP-10 de mono rhesus, pero no del IP-10 de ratón o MIG humano o ITAC humano y también inhibiendo una o más propiedades funcionales de IP-10 (por ejemplo, enlace de CXCR3 , flujo de calcio, quimiotaxis). Por ejemplo, una o más regiones CDR de 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S o 13C4 o mutaciones de las mismas, pueden obtenerse de modo recombinante con regiones de estructura conocidas y/u otras CDR para crear anticuerpos anti-IP-10, recombinantemente diseñadas de la invención, como se discute anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellas descritas en la sección previa. El material de partida para el método de ingeniería es una o más de las secuencias VH y/o VL provistas en la presente, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias VH y/o VL provistas en la presente, o una o más regiones CDR de las mismas. Más bien, la información contenida en la o las secuencias se utiliza como el material de partida para crear una secuencia o secuencias de "segunda generación" derivadas de la o las secuencias originales y luego la o las secuencias de "segunda generación" se preparan y expresan como una proteína. Por consiguiente, en otra modalidad, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-IPlO que comprende : (a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia CDRl seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 1-12, una secuencia CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE 1DENT. NOS.: 13-23 y/o una secuencia CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 24-34; e (ii) una secuencia de anticuerpos de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia CDRl seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 51-61, una secuencia CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS.: 62-72 y/o una secuencia CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 73-83; (b) alterar al menos un residuo de aminoácidos dentro de la secuencia de anticuerpos de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpos de región variable de cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpos alterada; y (c) expresar la secuencia de anticuerpos alterada como una proteína. Pueden utilizarse técnicas de biología molecular estándares para preparar y expresar la secuencia de anticuerpos alterada. De preferencia, el anticuerpo codificado por la o las secuencias de anticuerpos alteradas es aquella que retiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-1P-10 descritos en la presente, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a: (i) enlazar específicamente al IP-10 humano; (ii) inhibir el enlace de IP-10 a CXCR3 ; (iii) inhibir el flujo de calcio inducido por IP-10; (iv) inhibir la migración celular inducida por IP- 10; (v) reaccionar cruzado con el IP-10 de mono rhesus; (vi) no reaccionar cruzado con el IP-10 de ratón; (vii) no reaccionar cruzado con el MIG humano; y (viii) no reaccionar cruzado con el ITAC humano.
El anticuerpo alterado puede exhibir una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más o siete o más de las propiedades funcionales establecidas como (i) a (viii) anteriormente. Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden evaluarse utilizando ensayos estándares disponibles en la técnica y/o se describen en la presente, tales como aquellos establecidos en los Ejemplos (por ejemplo, los ELISA, ensayos de flujo de calcio, ensayos de quimiotaxis) . En ciertas modalidades de los métodos de los anticuerpos diseñados de la invención, pueden introducirse mutaciones aleatoria o selectivamente a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación de anticuerpos anti-IP-10 y los anticuerpos anti-IP-10 modificados resultantes pueden seleccionarse para actividad de enlace y/u otras propiedades funcionales como se describe en la presente. Los métodos mutacionales se han descrito en la técnica. Por ejemplo, la Publicación PCT WO 02/092780 por Short describe métodos para crear y seleccionar mutaciones de anticuerpos utilizando mutagénesis de saturación, ensamble de ligación sintética o una combinación de los mismos. Alternativamente, la Publicación PCT WO 03/074679 por Lazar et al. describe métodos para utilizar métodos de selección computacionales para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos .
Moléculas de Ácido Nucleico que Codifican Anticuerpos de la Invención Otro aspecto de la invención se relaciona a moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden presentarse en células completas, en un lisato celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aisla" o "se describe sustancialmente puro" cuando se purifica lejos de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, por técnicas estándares, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, agrupado de CsCl , cromatografía en columna, electroforesis de gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Véase F. Ausubel, et al . , ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, New York. Un ácido nucleico de la invención puede ser por ejemplo, ADN o ARN y puede o no puede contener secuencias intrónicas . En una modalidad preferida, el ácido nucleico es una molécula de ADNc. Los ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse utilizando técnicas de biología molecular estándares. Para anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que portan genes de ínmunoglobulina humanos como se describe posteriormente además) , los ADNc que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo hechas por el hibridoma pueden obtenerse por amplificación de PCR estándar o técnicas de clonación de ADNc. Para anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca genética de inmunoglobulina (por ejemplo, utilizando técnicas de despliegue de fago), el ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede recuperarse a partir de la biblioteca. Las moléculas de los ácidos nucleicos preferidas de la invención son aquellas que codifican las secuencias VH y VL de los anticuerpos monoclonales 1D4 , 1E1 , 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 o 13C4. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias VH de 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 se muestran en las SEC DE IDENT. NOS.: 99-109, respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias VL de 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 se muestran en las SEC DE IDENT. NOS.: 110-120, respectivamente. Una vez que se obtienen fragmentos de ADN que codifican segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden manipularse además por técnicas de ADN recombinantes estándares, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable de los genes de cadena de anticuerpo de longitud total, a genes de fragmento Fab o a un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpos o un conector flexible. El término "operativamente unido", como se utiliza en este contexto, se pretende para significar que los dos fragmentos de ADN se unen de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco . El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse a un gen de cadena pesada de longitud total uniendo operativamente el ADN de codificación de VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3) . Las secuencias de los genes de la región constante de cadena pesada humanas se conocen en la técnica (véase por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de AND que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgA, IgE, IgM o IgD, pero más preferiblemente es una región constante IgGl o IgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN de codificación de VH puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifica sólo la región constante CH1 de cadena pesada. El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse a un gen de cadena ligera de longitud total (así como un gen de cadena ligera Fab) uniendo operativamente el ADN de codificación VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL . Las secuencias de los genes de región constante de cadena ligera humana se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A. et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edítion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero más preferiblemente es una región constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN de codificación de VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un conector flexible, por ejemplo, codificando la secuencia de aminoácido (Gly-Ser)3, de manera que las secuencias VH y VL puedan expresarse como una proteína de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por el conector flexible (véase por ejemplo, Bird et al . (1988) Science 242 : 423-426; Huston et al . (1988) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 85: 5879-5883; McCafferty et al, (1990) ?Yature 348: 552-554).
Producción de Anticuerpos Monoclonales de la Invención Pueden producirse anticuerpos monoclonales (mAbs) de la presente invención por una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpos monoclonales convencionales por ejemplo, la técnica de hibridización celular somática estándar de Kohler y Milstein (1975) Nature 256 : 495. Aunque se prefieren los procedimientos de hibridízación celular somática, en principio, otras técnicas para producir anticuerpo monoclonal pueden emplearse, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y las técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión se conocen en la técnica. Los compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma de murino) y procedimientos de fusión se conocen también. Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención pueden prepararse con base en la secuencia del anticuerpo monoclonal de murino preparada como se describe anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera pueden obtenerse a partir del hibridoma de murino de interés y diseñarse para contener secuencias de inmunoglobulina no murinas (por ejemplo, humanas) utilizando técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino pueden unirse a regiones constantes humanas utilizando métodos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,816,567 para Cabilly et al . ) Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR de murino pueden insertarse dentro de una estructura humana utilizando métodos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,225,539 para Winter, y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et al . ) . En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra IP-10 pueden generarse utilizando ratones transgénicos o trasncromosómicos que transportan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en la presente como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se refieren colectivamente en la presente como "ratones Ig humanos" . El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene un mini-emplazamiento del gen de inmunoglobulina humano que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y ligera ic humana no redispuesta, junto con mutaciones objetivo que inactivan el emplazamiento de cadena µ y K endógeno (véase por ejemplo, Lonberg, et al . (1994) Nature 368(6474) : 856-859) . Por consiguiente, los ratones exhiben expresión reducida de IgM o K de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humana introducidos, experimentan mutación de conversión y somática de clase para generar IgG? humana de alta afinidad monoclonal (Lonberg, N. et al . (1994), supra; revisada en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113 : 49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern . Rev. Inmuno 1 . 1_3: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann . N. Y. Acad. Sci . 764 : 536-546) . La preparación y el uso de ratones HuMab, y las modificaciones genómicas transportadas por tales ratones, se describe además en Taylor, L. et al . (1992) Nucleic Acids Research 2_0: 6287-6295; Chen, J. et al . (1993) International Immunology 5_: 647-656; Tuaillon et al . (1993) Proc . Nati . Acad . Sci . USA 90: 3720-3724; Choi et al . (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al . (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al . (1994) J". Immunol . 152: 2912-2920; Taylor, L. et al . (1994) International Immunology 6_ : 519-591 ; y Fishwild, D. et al . (1996) Nature Biotechnology 14: 845- 851, los contenidos de todas las cuales se incorporan específicamente por consiguiente para referencia en su totalidad. Véanse además las Patentes Norteamericanas Nos. ,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas para Lonberg y Kay; la Patente Norteamericana No. 5,545,807 para Surani et al . ; Publicaciones PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas para Lonberg y Kay; y la Publicación PCT No. WO 01/14424 para Korman et al . En otra modalidad, los anticuerpos humanos de la invención pueden incrementarse utilizando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana o transgenes y transcromosomas, tales como un ratón que porta un transgen de cadena pesada humano y un transcromosoma de cadena ligera humano. Tales ratones, referidos en la presente como "ratones KM" , se describen en detalle en la Publicación PCT WO 02/43478 para Ishida et al . Aún además, los sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y pueden utilizarse para incrementar los anticuerpos anti-IP-10 de la invención. Por ejemplo, un sistema transgénico alternativo referido como el Xeno-ratón (Avenix, Inc.) puede utilizarse; tales ratones se describen en por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963 para Kucherlapati et al . Además, los sistemas del animal transcromosómico alternativo que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y pueden utilizarse para incrementar anticuerpos anti-IP-10 de la invención. Por ejemplo, los ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humano como un transcromosoma de cadena ligera humano, referidos como "ratones TC" pueden utilizarse; tales ratones se describen en Tomizuka et al . (2000) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 97: 722-727. Además, vacas que portan transcromosomas de cadena ligera y cadena pesada humanos se han descrito en la técnica (Juroiwa et al . (2002) Nature Biotechnology 2_0: 889-894) y pueden utilizarse para incrementar anticuerpos anti-IP-10 de la invención. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden prepararse también utilizando métodos de despliegue de fago para seleccionar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humanos. Tales métodos de despliegue de fago para aislar anticuerpos humanos se establecen en la técnica. Véase por ejemplo: Patentes Norteamericanas Nos. 5,223,409; 5,403,484; y 5,571,698 para Ladner et al . ; Patentes Norteamericanas Nos. 5,427,908 y 5,580,717 para Dower et al . ; Patentes Norteamericanas Nos. 5,969,108 y 6,172,197 para McCafferty et al . ; y Patentes Norteamericanas Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 para Griffiths et al . Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden prepararse también utilizando ratones SCID dentro de los cuales se han reconstituido las células inmunes humanas de manera que una respuesta de anticuerpo humano puede generarse en la inmunización. Tales ratones se describen en por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,476,996 y 5,698,767 para Wilson et al .
Inmunización de Ratones Ig Humanos Cuando se utilizan ratones Ig humanos para incrementar anticuerpos humanos de la invención, tales ratones pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida del antígeno de IP-10 y/o IP-10 recombinante, o una proteína de fusión de IP-10, como se describe por Lonberg, N. et al . (1994) Nature 368 (6474) : 856-859; Fishwild, D. et al . (1996) Nature Biotechnology 14 : 845-851; y la Publicación PCT WO 98/24884 y WO 01/14424. De preferencia, los ratones tendrán 6-16 semanas de edad en la primera infusión. Por ejemplo, una preparación purificada o recombinante (5-50 µg) del antígeno IP-10 puede utilizarse para inmunizar los ratones Ig humanos intraperitonealmente . Los procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos para IP-10 se describen en el Ejemplo 1 posteriormente. La experiencia acumulativa con varios antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos responden cuando se inmunizan inicialmente de modo intraperitoneal (IP) con antígeno en adyuvante de Freund completo, seguido por inmunizaciones IP cada semana alterna (hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante de Freund incompleto. Sin embargo, los adyuvantes diferentes del de Freund se encuentran que son también efectivos. Además, las células completas en la ausencia del adyuvante se encuentran que son altamente inmunogénicas . La respuesta inmune puede monitorearse durante el curso del protocolo de inmunización con muestras en plasma que se obtienen por sangrados retroorbitales . El plasma puede analizarse por ELISA (como se describe posteriormente) , y los ratones con suficientes cantidades de inmunoglobulina humana anti-IP-10 pueden utilizarse para fusiones. Los ratones pueden sobrealimentarse intravenosamente con el antígeno, 3 días antes del sacrificio y la remoción del bazo. Se espera que puedan realizarse 2-3 fusiones para cada inmunización. Entre 6 y 24 ratones se inmunizan normalmente para cada antígeno. Usualmente, se utilizan las cepas HCo7 y HCol2. Además, tanto el transgen HCo7 como el HCol2 pueden reproducirse juntos en un solo ratón teniendo dos diferentes transgenes de cadena pesada humanos (HCo7/HCol2) .
Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Humanos de la Invención Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención, los esplenocitos y/o las células del nodulo linfático a partir de ratones inmunizados pueden aislarse y combinarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden seleccionarse para la producción de anticuerpos específicos de antígenos. Por ejemplo, las suspensiones de células sencillas de linfocitos esplénicos a partir de ratones inmunizados pueden combinarse a un sexto del número de células de mieloma de ratón no secretados P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50% de PEG. Las células se forman en placas de aproximadamente 2 x 105 en una placa microtituladora de fondo plano, seguida por una incubación de dos semanas en un medio selectivo, que contiene 20% de suero de Clon fetal, 18% de medio condicionado "653", 5% de origen (IGEN) , 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 5 mM de HEPES, 0.055 mM de 2-mercaptoetanol , 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y IX de HAT (Sigma; el HAT se agrega 24 horas después de la fusión) . Después de aproximadamente dos semanas, las células pueden cultivarse en un medio en donde el HAT se reemplaza con HT. Los pozos individuales pueden entonces seleccionarse por ELISA para anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos. Una vez que ocurre el crecimiento extenso de hibridomas, el medio puede observarse usualmente después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpos pueden volverse a colocar en placas, seleccionarse de nuevo y si aún es positivo para la IgG humana, los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse al menos dos veces limitando la dilución. Los subclones estables pueden cultivarse entonces in vi tro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en un medio de cultivo de tejido para caracterización. Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, los hibridomas seleccionados pueden cultivarse en matraces de centrifugación de dos litros para purificación de anticuerpos monoclonales . Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografía por afinidad con la proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida puede verificarse por electroforesis ángel y cromatografía líquida de rendimiento elevado para asegurar pureza. La solución del tampón puede intercambiarse dentro del PBS, y la concentración puede determinarse por OD280 utilizando 1.43 del coeficiente de extinción. Los anticuerpos monoclonales pueden pro-ratearse y almacenarse a -80°C.
Generación de Transfectomas que Producen Anticuerpos Monoclonales de la Invención Los anticuerpos de la invención pueden producirse también en un transfectoma de célula huésped, por ejemplo, una combinación de las técnicas de ADN recombinante y los métodos de transfección genética como se conoce bien en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, los ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas de longitud total, pueden obtenerse por técnicas de biología molecular estándares (por ejemplo, amplificación PCR o clonación de ADNc utilizando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN pueden insertarse dentro de los vectores de expresión de manera que los genes se unen operativamente a las secuencias de control transcripcional y de traducción. En este contexto, el término "unido operativamente" se pretende para significar que un gen de anticuerpo se liga dentro de un vector de manera que las secuencias control transcripcional y de traducción dentro del vector desempeñan su función pretendida al regular la transcripción y la traducción del gen de anticuerpos. El vector de expresión y las secuencias control de expresión se eligen para ser compatible con la célula huésped de expresión utilizada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse dentro de un vector separado o más normalmente, ambos genes se insertan dentro del mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan dentro del vector de expresión por métodos estándares (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento y el vector del gen del anticuerpo, o la ligación de extremo redondeado si no se presentan sitios de restricción) . Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente pueden utilizarse para crear genes de anticuerpos de longitud total de cualquier isotipo de anticuerpos insertándolos dentro de los vectores de expresión que codifican ya las regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera del isotipo deseado de manera que el segmento VH se une operativamente al o los segmentos CH dentro del vector y el segmento VL se une operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpos puede clonarse dentro del vector de manera que el péptido de señal se une en marco al término amino del gen de cadena del anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal a partir de una proteína sin inmunoglobulina) . Además de los genes de cadena de anticuerpos, los vectores de expresión de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpos en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpos. Tales secuencias reguladoras se describen por ejemplo, en Goeddle (Gene Expresión Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)) . Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de tales factores como la elección de la célula huésped que se transforma, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de la célula huésped de mamíferos incluye elementos virales que dirigen niveles elevados de la expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o mejoradores derivados de citomegalovirus (CMV) , Virus 40 de Simio (SV40) , adenovirus (por ejemplo, el mayor promotor tardío de adenovirus (AdMLP) y el polioma.
Alternativamente, pueden utilizarse secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de /3-globina. Aún además, los elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, el cual contiene secuencias a partir del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia de célula T humana del tipo 1 (Takebe, Y. et al . (1988) Mol . Cell . Biol .8: 466-472). Además de los genes de cadena de anticuerpos y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huéspedes (por ejemplo, orígenes de replicación) y los genes marcadores elegibles. El gen marcador elegible facilita la selección de las células huéspedes dentro de la cual el vector se ha introducido (véanse por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017 todas por Axel et al . ) Por ejemplo, normalmente, el gen marcador elegible confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato en una célula huésped dentro de la cual el vector se ha introducido. Los genes marcadores elegibles preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huéspedes dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección G418) . Para expresión de las cadenas ligera y pesada, el o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan dentro de una célula huésped por técnicas estándares. Las diversas formas del término "transfección" se pretenden para abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción del ADN exógeno dentro de una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células huéspedes tanto procarióticas como eucarióticas, la expresión de los anticuerpos en células eucarióticas y más preferiblemente células huéspedes de mamíferos, es la más preferida debido a que tales células eucarióticas y en particular células de mamífero, son más probables de ensamblar que las células procarióticas y secretan un anticuerpo apropiadamente plegado e inmunológicamente activo. La expresión procariótica de los genes del anticuerpo se ha reportado que son inefectiva para la producción de rendimientos elevados del anticuerpo activo (Boss, M. A. y Word, C.R. (1985) Immunology Today 6: 12-13) . Las células huéspedes preferidas de mamíferos para expresar los anticuerpos recombínantes de la invención incluyen Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 11_ : 4216-4220, utilizada con un marcador elegible DHFR por ejemplo, como se describe en R.J. Kaufman y P.A. Sharp (1982) Mol . Biol . 159 : 601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para el uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión genética GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338,841. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican los genes del anticuerpo se introducen dentro de las células huéspedes de mamíferos, los anticuerpos se producen cultivando las células huéspedes durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huéspedes, o más preferiblemente, la secreción del anticuerpo dentro del medio de cultivo en donde las células huéspedes se desarrollan. Los anticuerpos pueden recuperarse a partir del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas estándares. Caracterización de Enlace de Anticuerpos al Antígeno Los anticuerpos de la invención pueden probarse para el enlace a IP-10, por ejemplo, por ELISA estándar. En breve, las placas microtituladoras se recubren con IP-10 purificado a 0.25 µg/ml en PBS, y luego se bloquean con 5% de albúmina de suero de bovino en PBS . Las diluciones del anticuerpo (por ejemplo, diluciones de plasma a partir de ratones IP-10 inmunizados) se agregan a cada pozo y se incuban durante 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween y luego se incuban con un reactivo secundario (por ejemplo para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal específicos de Fc IgG anti-humano de cabra) conjugado a fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37°C. Después del lavado, las placas se desarrollan con sustrato de pNPP (1 mg/ml) y se analizan en OD de 405-650. De preferencia, los ratones los cuales desarrollan las cantidades más elevadas se utilizarán para fusiones . Un ensayo ELISA como se describe anteriormente puede utilizarse también para seleccionar hibridomas que muestran reactividad positiva con el inmunógeno IP-10. Los hibridomas que se unen con avidez elevada a IP-10 se subclonan y se caracterizan además. Un clon de cada hibridoma, el cual retiene la reactividad de las células progenitoras (por ELISA) puede elegirse efectuando un banco celular de 5-10 frascos almacenado a -140°C, y para purificación de anticuerpos. Para purificar los anticuerpos anti-IP-10, los hibridomas seleccionados pueden desarrollarse en matraces de centrifugación de dos litros para purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografía por afinidad con la proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . La IgG eluida puede verificarse por electroforesis en gel y cromatografía líquida de rendimiento elevado para asegurar pureza. La solución del tampón puede intercambiarse en PBS, y la concentración puede determinarse por OD2so utilizando el coeficiente de extinción 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden formarse en alícuotas y almacenarse a -80°C. Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-IP-10 se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo puede biotinilarse utilizando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL) . Los estudios de competición que utilizan anticuerpos monoclonales no etiquetados y anticuerpos monoclonales biotinilados pueden realizarse utilizando placas de ELISA recubiertas con IP-10 como se describe anteriormente. El enlace de mAb biotinilado puede detectarse con una sonda de fosfatasa alcalina de estreptavidina . Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, los ELISA del isotipo pueden realizarse utilizando reactivos específicos para anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, pozos de placas microtituladoras pueden recubrirse con 1 µg/ml de inmunoglobulina anti-humana durante la noche a 4°C. Después del bloqueo con 1% de BSA, las placas se hacen reaccionar con 1 µg/ml o menos de los anticuerpos monoclonales de prueba o los controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante una a dos horas . Los pozos pueden hacerse reaccionar entonces con cualesquiera sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específica de IgGl humana o IgM humana. Las placas se desarrollan y analizan como se describe anteriormente. Los IgG humanos anti-IP-10 pueden probarse además para la reactividad con el antígeno IP-10 por transferencia Western. En breve, el IP-10 puede prepararse y someterse a electroforesis de gel de poliacrilamida de dodeciisulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con 10% de suero de ternero fetal y se sondean con los anticuerpos monoclonales que se prueban. El enlace de IgG humano puede detectarse utilizando fosfatasa alcalina de IgG anti-humano y se desarrolla con las tabletas del sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co . , St . Louis, Mo . ) .
Inmunoconjugados En otro aspecto, la presente invención exhibe un anticuerpo anti-IP-10, o un fragmento del mismo, conjugado a una porción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales conjugados se refieren en la presente como "inmunoconjugados" . Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se refieren como "inmunotoxinas" . Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial a (por ejemplo, aniquila) células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mítomicina, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol y puromícina y análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos incluyen también por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracildecarbazina) , agentes de alquilación (por ejemplo, mecloretamina, clorambucilo de tioepa, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfán, díbromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina de platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) ) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que pueden conjugarse en un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maytansinas y auristatinas y derivados de las mismas. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpos de caliqueamicina está comercialmente disponible (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst) . Las citoxinas pueden conjugarse a los anticuerpos de la invención utilizando tecnología de conectador disponible en la técnica. Ejemplos de tipos de conectador que se han utilizado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, esteres, disulfuros y conectadores que contienen péptidos. Un conectador puede elegirse, el cual es por ejemplo, susceptible al desdoblamiento por pH bajo dentro del compartimiento lisosomal o es susceptible a desdoblamiento por proteasas, tal como proteasas expresadas de preferencia en tejido tumoral tal como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D) . Para discusión adicional de tipos de citotoxinas, los conectadores y métodos para conjugar agentes terapéuticos a anticuerpos, véase también Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55_: 199-215; Trail, P.A. et al . (2003) Cáncer Inmuno 1 . I munother. 52_: 328-337; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3: 207-212; Alien, T.M. (2002) JNTat. .Rev. Cáncer 2 : 750-763; Pastan, I. y Kreitman, R.J. (2002) Curr. Opin . Investig. Drugs 3_: 1089-1091; Senter, P.D. y Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264. Los anticuerpos de la presente invención también pueden conjugarse a un isótopo radioactivo para generar radiofarmacéuticos citotóxicos, también referidos como radioinmunoconjugados . Ejemplos de isótopos radioactivos que pueden conjugarse a anticuerpos para uso de diagnóstico o terapéuticamente incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. El método para preparar radioinmunoconjugados se establece en la técnica. Ejemplos de radioinmunoconjugados están comercialmente disponibles, incluyendo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) , y los métodos similares pueden utilizarse para preparar radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la invención. Los conjugados de anticuerpos de la invención pueden utilizarse para modificar una respuesta biológica dada, y la porción del fármaco no se interpreta como que limita a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción del fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina seudomonas o toxina de difteria; una proteína tal como un factor de necrosis tumoral o interferón-?; o modificadores de respuesta biológica tales como por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1") , interleucina-2 ("IL-2") , interleucina- 6 ("IL-6") , factor que estimula la colonia de macrófagos de granulocitos ("GM-CSF") , factor que estimula la colonia de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento. Se conocen bien las técnicas para conjugar tal porción terapéutica a los anticuerpos, véase por ejemplo, Arnon et al . , "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy" , en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al . (eds.) , pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985) ; Hellstrom et al . , "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al . (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , in Monoclonal Antibodies ' 84 : Biological And Clinical Applications, Pinchera et al . (eds.), pp . 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy" , en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp . 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al . , "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev., 62: 119-58 (1982).
Moléculas Biespecíficas En otro aspecto, la presente invención exhibe moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-IP-10, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o porciones de enlace de antígeno del mismo, pueden derivarse o unirse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos diferentes sitios de enlace o moléculas objetivo. El anticuerpo de la invención puede de hecho derivarse o unirse a más de otra molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos diferentes sitios de enlace y/o moléculas objetivo; tales moléculas multiespecíficas se pretenden también para abarcarse por el término "molécula biespecífica" como se utiliza en la presente. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede unirse de modo funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, por fusión genética, por asociación no covalente o de otra manera) a una o más moléculas de enlace, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de manera que resulta una molécula biespecífica. Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de enlace para IP-10 y una segunda especificidad de enlace para un segundo epítopo objetivo. En una modalidad particular de la invención, el segundo epítopo objetivo es un receptor Fc, por ejemplo, un Fc?RI (CD64) o un receptor Fca humano (CD89) . Por lo tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas capaz de unir tanto a las células efectoras que expresan Fc?R, FcaR o FceR (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (los PMN)), y a células objetivo que expresan IP-10. Estas moléculas biespecíficas concentran IP-10 que expresa células a la célula efectora y accionan actividades de la célula efectora mediada por el receptor Fc , tal como fagocitosis de una IP-10 que expresa células, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) , liberación de citosina o la generación de anión superóxido. En una modalidad de la invención, en donde la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir además una tercera especificidad de enlace, además de una especificidad de enlace anti-Fc y una especificidad de enlace anti-IP-10. En una modalidad, la tercera especificidad de enlace es una porción del factor anti-mejoramiento (EF) , por ejemplo una molécula que se une a una proteína superficial implicada en la actividad citotóxica y por lo tanto se incrementa la respuesta inmune contra el dianocito. La "porción del factor anti-mejoramiento" puede ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpos funcional o un ligando que se une a una molécula dada, por ejemplo, un antígeno o un receptor, y por consiguiente resulta en un mejoramiento del efecto de las determinantes de enlace para el receptor Fc o el antígeno de dianocito. La "porción del factor anti-mejoramiento" puede unir un receptor Fc o un antígeno de díanocito. Alternativamente, la porción del factor anti-mejoramiento puede unirse a una entidad que es diferente de la entidad a la cual se unen la primera y la segunda especificidades de enlace. Por ejemplo, la porción del factor anti-mejoramiento puede unir una célula T citotóxica (por ejemplo, a través de CD2 , CD3 , CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que resulta en una respuesta inmune incrementada contar el dianocito) . En una modalidad, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como una especificidad de enlace al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o una cadena Fv sencilla. El anticuerpo puede también ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción de cadena sencilla como se describe en Ladner et al . La Patente Norteamericana No. 4,946,778, los contenidos de la cual se incorporan expresamente para referencia. En una modalidad, se proporciona la especificidad de enlace para un receptor Fc? por un anticuerpo monoclonal, el enlace del cual no se bloquea por inmunoglobulina G humana (IgG) . Como se utiliza en la presente, el término "receptor IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de la cadena ? ubicados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas del receptor de transmembrana o soluble los cuales se agrupan en tres clases del receptor Fc?: Fc?RI (CD64) , Fc?RII (CD32) y Fc?RIII (CD16) . En una modalidad preferida, el receptor Fc? un Fc?RI de afinidad elevada humano. El Fc?RI humano es una molécula de 72 kDa, la cual muestra alta afinidad para la IgG monomérica (108 - 10 M"1) . La producción y caracterización de ciertos anticuerpos monoclonales anti-Fc? preferidos se describen por Fanger et al . en la Publicación PCT WO 88/00052 y en la Patente Norteamericana No. 4,954,617, las enseñanzas las cuales se incorporan totalmente para referencia en la presente. Estos anticuerpos se unen a un epítopo de Fc?RI , Fc?RII o Fc?RIII en un sitio el cual es distinto del sitio de enlace Fc? del receptor y, de este modo, su enlace no se bloquea sustancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos anti-Fc?RI específicos útiles en esta invención son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce Ab 32 está disponible de the American Type Culture Collection, No. de Acceso ATCC HB9469. En otras modalidades, el anticuerpo receptor anti-Fc? es una forma humanizada del anticuerpo 22 monoclonal (H22) . La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R.F. et al . (1995) ". I munol 155 (10) : 4996-5002 y la Publicación PCT WO 94/10332. El anticuerpo H22 que produce la línea celular se depositó en the American Type Culture Collection bajo la designación HA022CL1 y tiene el número de acceso CRL 11177. En aún otras modalidades preferidas, la especificidad de enlace para un receptor Fc se proporciona por un anticuerpo que se unen a un receptor IgA humano, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89) ) , el enlace del cual no se bloque de preferencia por inmunoglobulina humana A (IgA) . El término "receptor IgA" se pretende para incluir el producto genético de un gen (FcaRI) ubicado en el cromosoma 19. Este gen se conoce para codificar varias isoformas de transmembrana alternativamente empalmado de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinofílicos y neutrofílicos, pero no en poblaciones de células no efectoras. FcaRI tiene afinidad media (« 5 x 107 M"1) tanto para IgAl como I A2 , la cual se incrementa en la exposición a las citocinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H.C. et al . (1996) Critical Reviews in I munology 16: 423-440) . Cuatro anticuerpos monoclonales específicos de FcaRI , identificados como A3 , A59, A62 y A77, los cuales se unen FcaRI fuera del dominio de enlace del ligando IgA, han sido descritos (Monteiro, R.C. et al . (1992) J. I munol . 148: 1764) . FcaRI y Fc? son receptores de accionamiento preferidos para uso en las moléculas biespecíficas de la invención debido a que (1) se expresan principalmente en células efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, los PMN, macrófagos y células dendríticas; (2) se expresan en niveles elevados (por ejemplo, 5,000-100,000 por célula); (3) son mediadores de actividad citotóxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis) ; (4) median la presentación del antígeno mejorada de antígenos, incluyendo auto-antígenos, orientándolos . Aunque se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos los cuales pueden emplearse en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos de murino, quiméricos y monoclonales humanizados. Las moléculas biespecíficas de la presente invención pueden prepararse conjugando las especificidades de enlace constituyentes, por ejemplo, las especificidades de enlace anti-FcR y anti-IP-10, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de enlace de la molécula biespecífica puede generarse de forma separada y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de enlace son proteínas o péptidos, una variedad de agentes de acoplamiento o reticulación pueden utilizarse para conjugación covalente. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen la proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5 , 5 ' -dítiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) , o-fenilendimaleimida (oPDM) , N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) y 4- (N-melimidometil) ciclohaxan-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfa-SMCC) (véase por ejemplo, Karpovsky et al . (1984) J". Exp . Med. 160: 1686; Liu, MA et al . (1985) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 8^: 8648) . Otros métodos incluyen aquellos descritos en Paulus (1985) Behring Inst . Mitt . No. 78, 118-132; Brennan et al . (1985) Science 229: 81-83), Y Glennie et al . (1987) J. Inmuno 1 . 139 : 2367-2375) . Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfa-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) . Cuando las especificidades de enlace son anticuerpos, éstas pueden conjugarse a través de la unión de sulfhidrilo de las regiones de bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la región de bisagra se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, de preferencia uno, antes de la conjugación. Alternativamente, ambas especificidades de enlace pueden codificarse en el mismo vector y se expresan y ensamblan en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión mAb x Ab, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y una determinante de enlace, o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de enlace. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena sencilla. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana Número 5,260,203; Patente Norteamericana Número 5,455,030; Patente Norteamericana Número 4,881,175; Patente Norteamericana Número 5,132,405; Patente Norteamericana Número 5,091,513; Patente Norteamericana Número 5,476,786; Patente Norteamericana Número 5,013,653; Patente Norteamericana Número 5,258,498; y Patente Norteamericana Número 5,482,858. El enlace de las moléculas bíespecíficas a sus objetivos específicos puede confirmarse por ejemplo, por enzimoinmunoanálisis absorbente (ELISA) , radioinmunoensayo (RÍA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición de crecimiento) , o ensayo de Transferencia Western. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular empleando un reactivo etiquetado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de anticuerpo FcR pueden detectarse utilizando por ejemplo, un anticuerpo unido a enzima o fragmento de anticuerpo el cual reconoce y une específicamente a los complejos de anticuerpo FcR. Alternativamente, los complejos pueden detectarse utilizando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede etiquetarse radioactivamente y utilizarse en un radioinmunoensayo (RÍA) (véase por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, la cual se incorpora para referencia en la presente) . El isótopo radioactivo puede detectarse por tales medios como el uso de un contador ? o un contador de centello o por autoradiografía.
Composiciones Farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o una porción o porciones de enlace de antígenos de los mismos, de la presente invención, formuladas junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación de anticuerpos (por ejemplo, dos o más diferentes), o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecíficos) que se une a diferentes epítopos en el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias . Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden también administrarse en terapia de combinación, es decir, combinarse con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-IP-10 de la presente invención combinado con al menos otro agente anti-inflamatorio o inmunosupresivo . Ejemplos de agentes terapéuticos que pueden utilizarse en terapia de combinación se describen en mayor detalle posteriormente en la sección en usos de los anticuerpos de la invención. Como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. De preferencia, el portador es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, -espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión) . Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo es decir, anticuerpo, inmunoconjugado, o molécula biespecífica puede recubrirse en un material para proteger el compuesto a partir de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto. Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables: Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto progenitor y no imparte ningunos efectos toxicológicos indeseados (véase por ejemplo, Berge, S.M., et al . (1977) J. Pharm . Sci . 6_6: 1-19) . Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas a partir de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares . Las sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N' -dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaina y similares. Una composición farmacéutica de la invención puede también incluir un anti-oxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol , y similares; y (3) agentes de quelación metálica, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacético (EDTA) , sorbítol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares. Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos) aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones, y por el uso de agentes tensioactivos. Estas composiciones pueden contener también adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto para procedimientos de esterilización, supra , como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol , ácido fenolsórbico, y similares. Puede ser también deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares dentro de las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse por la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto suponiendo que como cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención se contempla. Los compuestos suplementarios activos pueden también incorporarse en las composiciones. Las composiciones terapéuticas deben ser normalmente estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura organizada adecuada a la concentración elevada del fármaco. El portador puede ser un medio solvente o de dispersión que contiene por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglícol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiere, seguidos por microfiltración por esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo dentro de un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son deshidratación al vacío y deshidratación por congelamiento (liofilización) que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada previamente estéril del mismo. La cantidad del ingrediente activo el cual puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosis sencilla variará dependiendo del sujeto que se trata, y el modo particular de administración. La cantidad del ingrediente activo el cual puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosis sencilla generalmente será aquella cantidad de la composición la cual produce un efecto terapéutico. Generalmente, de entre un ciento por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0.01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento del ingrediente activo, de preferencia desde aproximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, más preferiblemente desde aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento del ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Los regímenes de dosis se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un bolo sencillo puede administrarse, varias dosis divididas pueden administrarse con el tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosis para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La forma de unidad de dosis como se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuada como dosis unitarias para los sujetos que se tratan; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosis de la invención se estipulan por y dependen directamente de (a) las únicas características del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se consigue, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de composición, tal compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos . Para administración del anticuerpo, los límites de dosis desde aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser 0.3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal , 3 mg/kg de peso corporal , 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del límite de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosis preferidos para un anticuerpo anti-IP-10 de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal a través de administración intravenosa, con el anticuerpo que se da utilizando uno de los siguientes horarios de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, luego cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguida por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de enlace se administran al mismo tiempo, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado cae dentro de los límites indicados. El anticuerpo se administra usualmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosis sencillas pueden ser por ejemplo, semanal, mensual, cada tres meses o una vez al año. Los intervalos pueden ser también irregulares como se indica al medir los niveles sanguíneos de anticuerpo al antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 µg/ml y en algunos métodos aproximadamente 25-300 µg/ml. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere menos administración frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguida por anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosis y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja en intervalos relativamente infrecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes continúan para recibir un tratamiento para el resto de sus vidas. En las aplicaciones terapéuticas, una dosis relativamente elevada en intervalos relativamente cortos se requiere algunas veces hasta que el avance de la enfermedad se reduce o termina, y de preferencia hasta que el paciente muestra una mejora completa o parcial de los síntomas de la enfermedad. Más adelante, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico. Los niveles de dosis actuales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse de manera que se obtiene una cantidad del ingrediente activo, la cual es efectiva para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición y modo de administración, sin ser tóxico al paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticas que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleada, o el éster, la sal o la amida de la misma, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, la salud general y el historial médico anterior del paciente que se trata, y los factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Una "dosis terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-iP-10 de la invención resulta de preferencia en una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un incremento en la frecuencia y la duración de los periodos libres de los síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o la incapacidad debidos a la aflicción de la enfermedad. En el caso de Artritis Reumatoide (RA) , una dosis terapéuticamente efectiva evita de preferencia el deterioro adicional de síntomas físicos asociados con RA, tales como por ejemplo, dolor, fatiga, rigidez matinal (tardando más de una hora) , dolencias musculares difusas, pérdida de apetito, debilidad, dolor de articulaciones con calor, hinchazón, blandura y rigidez de una articulación después de la inactividad. Una dosis terapéuticamente efectiva evita también de preferencia o retarda el inicio de la RA, tal como puede ser deseado cuando signos tempranos o preeliminares de la enfermedad se presentan. Así mismo, se incluye el progreso crónico dilatorio asociado con RA. Las pruebas de laboratorio utilizadas en el diagnóstico de RA incluyen químicas (incluyendo la medición de los niveles de IP-10) , hematología, serología y radiología. Por consiguiente, cualquier ensayo clínico o bioquímico que monitorea cualquiera de lo anterior puede utilizarse para determinar si un tratamiento particular es una dosis terapéuticamente efectiva para tratar RA. Alguien de experiencia ordinaria en la técnica sería capaz de determinar tales cantidades basadas en tales factores como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto, y la composición particular o ruta de administración seleccionada. Una composición de la presente invención puede administrarse a través de una o más rutas de administración utilizando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como se apreciará por el técnico calificado, la ruta y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las rutas preferidas de administración para los anticuerpos de la invención incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras rutas de administración parenterales, por ejemplo, por inyección o por infusión. La frase "administración parenteral" como se utiliza en la presente significa modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluye sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraquinoidea, intraespinal , epidural e intraesternal . Alternativamente, un anticuerpo de la invención puede administrarse a través de una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópicamente.
Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados . Pueden utilizarse polímeros bíocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones se patentan o se conocen generalmente por aquellos expertos en la técnica. Véase por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ó 4,596,556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: La Patente Norteamericana No. 4,487,603, la cual describe una bomba de microinfusión implantable para distribuir medicamento a una velocidad controlada; la Patente Norteamericana No. 4,486,194, la cual describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente Norteamericana No. 4,447,233, la cual describe una bomba de infusión de medicamento para el suministro de medicamento a una velocidad de infusión precisa; la Patente Norteamericana No. 4,447,224,1a cual describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para suministro de fármaco continuo; la Patente Norteamericana No. 4,439,196, la cual describe un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimientos de cámara múltiple; y la Patente Norteamericana No. 4,475,196, la cual describe un sistema de suministro de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan en la presente para referencia. Muchos otros implantes, sistemas de suministro, y módulos se conocen por aquellos expertos en la técnica. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden formularse para asegurar la distribución apropiada in vivo . Por ejemplo, la barrera de sangre-cerebro (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea) pueden formularse por ejemplo, en liposomas. Para métodos para fabricar liposomas, véase por ejemplo, las Patentes Norteamericanas 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones las cuales se transportan selectivamente dentro de las células u órganos específicos, mejorando de este modo el suministro de fármaco objetivo (véase por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol . 2_9: 685). Las porciones objetivo ejemplares incluyen folato o biotina (véase por ejemplo, la Patente Norteamericana 5,416,016 para Low et al . ) ; manosidas (Umezawa et al . , (1988) Biochem . Biophys . Res . Commun . 153 : 1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al . (1995) FEBS Lett . 357 : 140; M. Owais et al . (1995) Antimicrob . Agents Chemother. 39 : 180) ; receptor de la proteína A tensioactiva (Briscoe et al . (1995) Am. J. Physiol . 1233 : 134); pl20 (Schreier et al . (1994) J\ Biol . Chem. 269: 9090); véase también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett . 346: 123, J.J Killion; I.J.
Fídler (1994) Immunomethods 4: 273.
Usos y Métodos de la Invención Los anticuerpos (e inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la presente invención tienen utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vi tro e in vivo . Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a las células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, evitar o diagnosticar una variedad de trastornos. El término "sujeto" como se utiliza en la presente se pretende para incluir animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles. Los métodos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que tienen un trastorno asociado con la expresión IP-10 aberrante. Cuando los anticuerpos a IP-10 se administran junto con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o al mismo tiempo. En una modalidad, los anticuerpos (e inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la invención pueden utilizarse para detectar niveles de IP-10, o niveles de células que contienen IP-10. Esto puede lograrse, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra (tal como una muestra in vi tro) y una muestra control con un anticuerpo anti-IP-10 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y el IP-10. Cualesquiera complejos formados entre el anticuerpo y el IP-10 se detectan y comparan en la muestra y el control. Por ejemplo, los métodos de detección estándar, bien conocidos en la técnica, tales como ELISA y ensayos citométicos de flujo, pueden realizarse utilizando las composiciones de la invención. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona además métodos para detectar la presencia de IP- 10 (por ejemplo, un antígeno IP-10 humano) en una muestra, o midiendo la cantidad de IP-10 que comprende poner en contacto la muestra, y una muestra control, con un anticuerpo de la invención, o una porción de enlace de antígeno del mismo, el cual se une específicamente a IP-10 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o una porción del mismo y el IP-10. La formación de un complejo se detecta entonces, en donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra comparada a la muestra control es indicativa de la presencia de IP-10 en la muestra. También dentro del alcance de la invención están equipos que comprenden las composiciones (por ejemplo, anticuerpos, anticuerpos humanos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la invención e instrucciones para uso. El equipo puede contener además al menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo que tiene una actividad complementaria la cual se une a un epítopo en el antígeno objetivo distinto del primer anticuerpo) . Los equipos incluyen normalmente una etiqueta que indica el uso pretendido de los contenidos del equipo . El término etiqueta incluye cualquier material escrito o registrado suministrado en o con el equipo , o el cual de otra manera acompaña el equipo . El IP-10 se conoce por tener un efecto quimioatrayente en las células T y las células NK activadas y para reclutar tales células a sitios de respuestas de inflamación y aucoinmunes. Por consiguiente, los anticuerpos anti-IP-10 (e inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la invención pueden utilizarse para inhibir respuesta inflamatoria o autoínmune mediada por células T y/o células NK activadas en una variedad de indicaciones clínicas. La invención, por lo tanto, proporciona un método para inhibir una respuesta inflamatoria o autoinmune mediada por células T y/o células NK activadas que comprenden poner en contacto las células T o las células NK con un anticuerpo, o una porción de enlace de antígeno del mismo, de la invención (o un inmunoconjugado o molécula biespecífica de la invención) de manera que se inhibe la respuesta inflamatoria o autoinmune. Ejemplos específicos de las condiciones inflamatorias o autoinmunes en donde los anticuerpos de la invención pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: A. Esclerosis Múltiple y otras Enfermedades Desmielinizantes Se ha mostrado que la expresión del ARNm de IP-10 se incrementa en encefalomielitis alérgica experimental en murinos (EAE) , un modelo de ratón de esclerosis múltiples (Godiska, R. et al . (1995) J". Neuroimmunol . 53: 167-176).
Además, los niveles incrementados de IP-10 han sido encontrados en el fluido cerebroespinal de pacientes con MS durante casos de desmielinización aguda (Sorensen, T.L. et al . (1999) ". Clin . Invest . 103 : 807-815; Franciotta et al . (2001) J. Neuroimmunol . 115 : 192-198). Se ha mostrado que el IP-10 también se expresa por astrositos en lesiones de MS , pero no en materia blanca no afectada (Balashov, K.E. et al . (1999) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 96: 6873-6878) y se expresa por macrófagos dentro de placas de MS y por astrositos reactivos en el parenquima circundante (Simpson, J.E. et al . (2000) Neuropathol. Appl . Neurobiol .26 : 133-142). La Publicación de patente PCT WO 02/15932 mostró la administración de anticuerpos anti-IP-10 en un modelo de virus de hepatitis de ratón (MHV) de MS resultado en linfocito T reducido e invasión de macrófago, progresión inhibida de desmielinización, remielización incrementada y función neurológica mejorada (véase también Liu, M.T. et al. (2001) J". Immunol . 167 : 4091-4097) . Se ha mostrado que la administración de anticuerpos anti-IP-10 de murino disminuye la incidencia y la severidad de enfermedades clínicas e histológicas en EAE de murinos (Fife, B.T. et al . (2001) ". I munol . 166: 7617-7624). En vista de lo anterior, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de MS y otras enfermedades de desmielinización administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes anti-MS, tal como interferón beta-la (por ejemplo, Avonex®, Rebíf-1) , interferón beta-Ib (por ejemplo, Betaseron®) , acetato de glatirámero (por ejemplo, Copaxone®) y/o mitoxantrona (por ejemplo, Novantrone®) .
B. Artritis Reumatoide Se ha mostrado que los niveles de IP-10 son significativamente elevados en fluido sinovial, tejido sinovial y suero de pacientes con artritis reumatoide (RA) (Patel, D.D. et al. (2001) Clin . Im unol . :98: 39-45; Hanaoka, R. et al . (2003) Arthri tis Res . And Therapy 5: R74-R81) . Se ha mostrado que el receptor de IP-10, CXCR3 , se expresa de preferencia en mastocitos dentro del tejido sinovial a partir de pacientes con RA (Ruschpler, P. et al . (2003) Arthritis Res . Ther. 5 : R241-R252) . En un modelo de rata con artritis inducido con adyuvante (AA) , se ha reportado una respuesta de auto-anticuerpo detectable contra IP-10 mismo (Salomón, I. et al . (2002) J. immunol . 169: . 2685-2693). Además, la administración de una vacuna de ADN que codifica el IP-10 aumentó la producción de anticuerpos anti-IP-10 neutralizantes dentro de las ratas, y estos auto-anticuerpos 1P-10 podrían transferir adoptivamente resistencia a AA a ratas nativas (Salomón, I. et al., supra) . En vista de lo anterior, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de artritis reumatoide administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes anti-RA, tales como fármacos anti-inflamatorios sin esferoides (los NSAID) , analgésicos, corticoesteroides (por ejemplo, prednisona, hidrocortisona) , inhibidores de TNF (incluyendo adilimumab (Humira®) , etanercepto (Enbrel®) e infliximab (Remicade®) ) , fármacos anti-reumáticos que modifican la enfermedad (incluyendo metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, auranofina, azatioprina, tiomalato de sodio de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, minociclina, penicilamina y sulfasalazina) , medicamentos para fibromialgia, medicamentos para osteoporosis y medicamentos para gota.
C. Enfermedad Inflamatoria de los Intestino Se ha mostrado que la expresión de IP-10 se mejora significativamente en células que infiltran la lámina propia de biopsias colónicas tomadas a partir de pacientes con colitis ulcerativa (Uguccioni, M. et al . (1999) Am. J.
Pathol . 155 : 331-336) . Además, se ha mostrado que la neutralización de IP-10 protege a ratones de ulceración epitelial en colitis aguda y que mejora la supervivencia de células criptográficas (Sasaki, S. et al . (2002) Eur. J.
Immunol . 3^2: 3197-3205). También, en ratones -/- IL-10, los cuales desarrollan colitis similar a enfermedad de Crohn en seres humanos, el tratamiento con anticuerpos anti-IP-10 conduce a la mejora en la clasificación de inflamación (Singh, U.P. et al . (2003) J. Im unol . 171: 1401-1406) . En vista de lo anterior, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria de los intestinos (IBD) , incluyendo colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes anti-IBD, tales como fármacos que contienen mesalamina (incluyendo sulfasalazina y otros agentes que contienen ácido 5-aminosalicílico (5 -ASA) , tal como olsalazina y balsalazida) , fármacos anti-inflamatorios sin esteroides (Los NSAID) , analgésicos, corticoesteroides (por ejemplo, prednisona, hidrocortisona) , inhibidores de TNF (incluyendo adilimumab (Hu ira®) , etanercepto (Enbrel®) e infliximab (Remicade®) ) , inmunosupresivos (tales como 6-mercaptopurina, azatioprina y ciclosporina A) , y antibióticos .
D. Lupus Eritematoso Sistémico Se ha mostrado que los niveles de IP-10 en suero se incrementa marcadamente en pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE) y se ha mostrado que los niveles se correlacionan con actividad de enfermedades (véase por ejemplo, Narumi, S., et al . (2000) Cytokine 12: 1561-1565).
Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de SLE administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes anti-SLE, tales como fármacos anti-inflamatorios sin esteroides (Los NSAID) , analgésicos, corticoesteroides (por ejemplo, predinisona, hidrocortisona), inmunosupresivos (tales como ciclofosfamida, azatioprina y metotrexato) , antimalariales (tales como hidroxicloroquina) y fármacos biológicos que inhiben la producción de anticuerpos ADNds (por ejemplo, LJP 394) .
E. Diabetes del Tipo 1 Se han demostrado niveles de IP-10 en suero que se elevan en pacientes con diabetes del Tipo I, particularmente aquellos con enfermedad inicial reciente, y los niveles se mostraron para correlacionarse con el número de células T que producen gamma-interferón reactivas con GAD en pacientes positivos con auto-anticuerpos GAD (Shimada, A. et al . (2001) Diabetes Care 2? : 510-515) . En un estudio separado, los niveles de IP-10 en suero se encontraron que se incrementaron en pacientes con una enfermedad recientemente diagnosticada y en pacientes con riesgo elevado para la enfermedad, y concentraciones de IP-10 correlacionada con niveles IFN-gamma (Nicoletti, F. et al . (2002) Diabetologia 45: 1107-1110).
Además, se han demostrado células beta que secretan IP-10, conduciendo a quimioatracción de células T, y se han mostrado ratones deficientes en CXCR3 al inicio retrasado de diabetes del Tipo I (Frigerio, S. et al . (2002) Nature Medicine 8: 1414-1420) . Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de diabetes del Tipo I administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes anti-diabéticos, tales como insulina.
F. Trastornos de Inflamación de Piel Se ha mostrado que la expresión de IP-10 se asocia con una variedad de trastornos inflamatorios de piel. Por ejemplo, IP-10 se ha detectado en keratinocitos y el infiltrado dérmico a partir de placas psoriáticas activas (Gottlieb, A.B. et al . (1988) J. Exp. Med. 168: 941-948).
Además, CXCR3 se expresa por linfocitos CD3+ dérmicos, sugiriendo que CXCR3 se implica en el tráfico de linfocitos T a la dermis psoriática (Rottman, J. B. et al . (2001) Lab. Invest. 81: 335-347). Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de psoriasis al administrar a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes o tratamientos, tales como tratamientos tópicos (por ejemplo, esteroides, brea de carbón, calcipotrieno, tazaroteno, antralina, ácido salicílico) , fototerapia, medicaciones sistémicas (por ejemplo, metotrexato, retinoides orales, ciclosporina, esteres del ácido fumárico) y/o fármacos biológicos (por ejemplo, alefacept, efalizumab) . Se ha mostrado que el liquen plano, una enfermedad inflamatoria crónica de la piel y la mucosa oral, se asocia con las células T CD4+ y CD8+ infiltrantes que expresan CXCR3 , y además, las células T citolíticas infiltrantes CD8+ tienen que mostrar que tienen IP-10 en sus granulos citolíticos y se ha mostrado que los keratinocitos lesiónales sobreexpresan IP-10 (Iijima, W. et al . (2003) Am. ". Pathol . 163 : 261-268) . Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de liquen plano administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes o tratamientos, tales como agentes anti-inflamatorios, anti-histaminas, corticoesteroides y fototerapia. Se ha mostrado que la expresión de IP-10 se eleva en otros trastornos inflamatorios de la piel, tales como lupus eritematoso discoide crónico y la infiltración linfocítica de Jessner de la piel (Flier, J. et al . (2001) J.
Pathol . 194 : 398-405). Por consiguiente, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de estos trastornos inflamatorios de piel administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes o tratamientos, como se describe anteriormente.
G. Enfermedad Autoinmune de la Tiroide Se ha mostrado que tanto IP-10 como CXCR3 se expresan en la glándula tiroidea de los pacientes que sufren de la enfermedad de Graves (GD) , pero no se expresan (o se expresan deficientemente) en tejido tiroideo normal, y la expresión fue más elevada en pacientes con GD inicial reciente (Romagnani, P. et al . (Am. J. Pathol. 161: 195-206) . Se ha mostrado que el IP-10 se expresa en el tejido tiroideo de pacientes que sufren de tiroiditis de Hashimoto (Kemp, E. H. et al . (2003) Clin. Endocrinol. 59: 207-213). Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de la enfermedad autoinmune de la tiroide, incluyendo la enfermedad de Graves y tiroiditis de Hashimoto, administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes o tratamientos, tales como fármacos anti-tiroide, yodo radioactivo y tiroidectomía subtotal .
H. Síndrome de Sjogren Se ha mostrado que la expresión del ARNm de IP-10 se sobre-regula significativamente en las glándulas salivales de pacientes con síndrome de Sjogren (SS) , con la expresión que es más prominente en el epitelio ductal adyacente a los infiltrados linfoides (véase por ejemplo, Ogawa, N. et al . (2002) Arthrítis .Rheum. 46: 2730-2741) . Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento del Síndrome de Sjogren administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes anti-SS, tales como lubricantes artificiales (por ejemplo, gotas artificiales libres de conservadoras, salivas artificiales, soluciones desodorízadas para la piel, rocíos nasales salinos y lubricantes vaginales) , Lacriserts® para el tratamiento de ojos secos, clorhidrato de pilocarpina (Salagen®) y ceyimelina (Eyoxac®) para el tratamiento de la boca seca, fármacos anti-inflamatorios sin esteroides (Los NSAID) , esteroides y fármacos inmunosupresivos.
I . Inflamación Pulmonar La expresión de IP-10 ha sido examinada en un modelo de ratón de asma alérgico, con los resultados que demuestran que IP-10 se sobre-regula en los pulmones después del desafío del alérgeno y que la sobre-expresión del IP-10 se asoció con la hiperactividad de las vías respiratorias incrementada, eosinofilia, los niveles incrementados de IL-4 y el reclutamiento de linfocitos CD8+ (Medoff, B.D. et al . (2002) J. Immunol . 168 : 5278-5286). Además, los fumadores quienes desarrollan enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) han mostrado que expresan IP-10 en su epitelio bronquiolar (Saetta, M. et al . (2002) Am . J. Respir. Cri t . Care Med. 165 : 1404-1409) . Aún además, se han demostrado niveles elevados de IP-10 en el fluido de lavado broncoalveolar de pacientes con sarcoidosis pulmonar y alveolitis linfocítica (Agostini, C. et al . (1998) J". Immunol . 161: 6413-6420) . Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de la enfermedad caracterizada por inflamación pulmonar, tal como asma, COPD, sarcoidosis pulmonar o alveolitis linfosítica, administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes para reducir inflamación pulmonar, tal como cromolino de sodio, nedocromilo de sodio, corticoesteroides inhalados, corticoesteroides sistémicos (por ejemplo, orales), antagonistas beta de acción corta, broncodilatadores de acción corta, antagonistas o agonistas beta de acción prolongada (orales o inhalados) , modificadores de leucotrieno, teofilina y terapia con oxígeno.
J. Rechazo de Transplante Se ha mostrado que el IP-10 juega un papel en el rechazo del tejido transplantado. Por ejemplo, el tratamiento de ratones con anticuerpos anti-IP-10 neutralizantes incrementa la supervivencia de aloinjertos de intestino delgado y la acumulación reducida de células T y células NK huéspedes en la lámina propia (Zhang, Z. et al . (2002) J. Immunol . 168 : 3205-3212) . Además, en ratones que reciben aloinjertos de isleta pancreática, el tratamiento con anticuerpos ant?-IP-10 resultó también en la superficie incrementada de aloinjertos y la infiltración disminuida de injertos linfocíticos (Baker, M.S. et al . (2003) Surgery 134 : 126-133) . Adicionalmente, los aloinjertos cardiacos, pero no de corazones normales, se mostraron que expresan IP-10 y CXCR3 , y los niveles de IP-10 elevados se asociaron con vasculopatía de aloinjertos cardiacos (Zhao, D.X. et al . (2002) J. Immunol . 169: 1556-1560) . CXCR3 e IP-10 han mostrado también que se expresan por células inflamatorias que se infiltran en los aloinjertos del pulmón (Agostini, C. et al . (2001) Am. J. Pathol . 158: 1703-1711). La neutralización de CXCR3 o IP-10 in vivo se mostró que atenúa el síndrome de bronquiolitis obliterada (BOS) , la mayor limitación de supervivencia para receptores de transplante de pulmón, en modelo de transplante de pulmón en murinos (Belperio, J.A. et al . (2002) J. Immunol . 169: 1037-1049). En vista de lo anterior, la invención proporciona también un método para inhibir el rechazo de transplante administrando un anticuerpo anti-IP-10 de la invención a un receptor de transplante con necesidad del tratamiento. Ejemplos de transplantes de tejido que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan al, hígado, pulmón (por ejemplo, el tratamiento de BOS) , riñon, corazón, intestino delgado y células de isletas pancreáticas. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes para inhibir rechazo de transplante, tal como agentes inmunosupresivos (por ejemplo, ciclosporina, azatioprina, metilprednisolona, prednisolona, predinisona, micofenolato de mofetilo, sirilimus, rapamicina, tacrolimus) , agentes antiinfectivos (por ejemplo, aciclovir, clotrimazol, ganciclovir, nistatina, trimetoprimsulfarnetoxazol) , diuréticos (por ejemplo, bumetanida, furosemida, metolazona) y medicamentos para úlceras (por ejemplo, cimetidina, farnotidina, lansoprazol, omeprazol, ranitidina, sucralfato) . K. Daño de Médula Espinal El daño traumático a la médula espinal conduce a la infiltración de células inflamatorias. Se ha mostrado que el IP-10 juega un papel central en la degeneración secundaria siguiendo el daño de la médula espinal (González et al . (2003) Exp . Neurol . 184 : 456-463; véase ' también la publicación de patente PCT WO 03/06045) . Se ha mostrado que el IP-10 se eleva significativamente en las médulas espinales de ratas magulladas 6 y 12 horas después del daño (McTigue, D.M. et al . (1998) J. Neurosci . Res . 53 : 368-376) y en la médula espinal dañada 6 horas después del daño (González et al . (2003) supra) . Por consiguiente, la inhibición de la actividad de IP-10 después del daño a la médula espinal ha mostrado que es útil para reducir infiltración de células inflamatorias y reduce de este modo el daño de tejido secundario a la inflamación. La inhibición puede reducir también la infiltración de células inflamatorias, disminuir la degeneración secundaria y mejorar la recuperación después del daño traumático al cerebro y la apoplejía. De este modo, la invención proporciona un método para tratar daño a médula espinal y daño cerebral (por ejemplo, apoplejía) en un sujeto con necesidad del tratamiento que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-lP-10 de la invención. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes, tales como otros agentes anti-inflamatorios. L. Enfermedades Neurodegenerativas La expresión del IP-10 y CXCR3 dentro del sistema nervioso central se ha encontrado que se sobre-regula en asociación con los cambios patológicos asociados con la Enfermedad de Alzheimer (AD) (Xia, M.Q. y Hyman, D.T. (1999) ". Neurovirol . 5: 32-41) . Dentro de los cerebros con AD, el CXCR3 se mostró que se expresa constitutivamente en las neuronas y los procesos neuronales en varias regiones corticales y sub-corticales y el IP-10 mostró que se expresa en astrositos y su nivel se elevó marcadamente cuando se compara a los cerebros normales (Xia, M.Q. et al . (2000) ". Neuro immunol . 108 : 227-235). Por consiguiente, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson, administrando a un sujeto con necesidad del tratamiento el anticuerpo anti-IP-10, solo o en combinación con otros agentes terapéuticos. Ejemplos de agentes con los cuales el anticuerpo anti-IP-10 puede combinarse para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer incluyen inhibidores de colinesterasa (donepezil, rivastigmina, galantamina, tacrina) y la vitamina E. Un ejemplo de un agente con el cual el anticuerpo anti-?P-10 puede combinarse es levodopa para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
M. Gingivitis La periodontitis marginal se asocia con el tejido gingival inflamado. Las células que producen IP-10 han sido encontradas en el tejido gingival humano inflamado, así como en células que expresan el receptor CXCR3 (Kabashima, H. et al . (2002) Cytokine 2_0: 70-77). Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de gingivitis administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes o tratamientos, tales como enjuagues bucales anti-gingivales (por ejemplo, enjuagues bucales antibióticos), raspado periodontal y alisado radicular y cirugía periodontal .
N. Inflamación Asociada con Terapia Genética Los adenovirus deficientes de replicación, utilizados como vectores adenovirales, utilizados en terapia genética, pueden provocar daño agudo e inflamación en tejidos infectados por los vectores virales. Se ha mostrado que tales vectores adenovirales inducen la expresión de IP-10 a través de la activación dependiente de cápside de NFkB (Borgland, S.L. et al . (2000) J. Virol . 74: 3941-3947). Por consiguiente, los anticuerpos anti-lP-10 de la invención pueden utilizarse, para inhibir daño y/o inflamación inducida por IP-10 durante el tratamiento de terapia genética que utiliza un vector viral, tal como un vector adenoviral, que estimula la producción indeseada de IP-10.
O. Enfermedades de Angiogénesis Se ha mostrado que el IP-10 inhibe la angiogénesis in vi tro e in vivo (Strieter et al . (1995) Biochem . Biophys . Rhes . Commun . 210 : 51-57; Angiolillo et al . (1995) J. Exp . Med. 182: 155-162; Luster et al . (1995) J. Exp . Med. 182: 219-231) . La angíogénesis juega un papel crucial en muchos procesos de enfermedad, tales como la respuesta curativa al trauma. Por ejemplo, la vasculatura dentro de la médula espinal dañada permanece en estado de remodelación activo hasta al menos 28 días después del daño (Popovich et al . (1997) ". Comp . Neuro 1 . 377: 443-464) . El IP-10 se piensa que ejerce sus efectos angiostáticos a través de la inhibición del crecimiento de células endoteliales y la quimiotaxis. Esto lo hace a través de su motivo de enlace a la heparina así como a través de un mecanismo mediado por receptor. A través de su motivo de enlace a la heparina evita los factores angiogénicos FGF-2 y VEFG165 a partir del enlace a sus receptores. También ejerce sus efectos a través del proceso mediado por el receptor. El receptor para IP-10, CXCR3 , se empalma alternativamente para producir las dos variaciones conocidas CXCR3A y CXCR3B . El enlace de 1P-10 al receptor CXCR3A conduce a la proliferación y la quiomiotaxis del díanocito, mientras que el enlace de IP-10 al receptor CXCR3B tiene el efecto opuesto de inhibición del crecimiento y la quimiotaxis. Es a través del receptor CXCR3B que el IP-10 actúa como un factor angiostático (Lasagni et al . (2003) J". Exp . Med . 197 : 1537-1549) . En vista de lo anterior, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades que requieren angiogénesis, por ejemplo, cuando el comportamiento angiostático de IP-10 retrasa o evita la sanación y agrava el proceso de enfermedad. Tales enfermedades incluyen: 1) neovascularización fisiológica aberrante, la cual puede impactar la sanación de heridas, el ciclo femenino de estro, embarazo, hipertrofia inducida por ejercicio y similares; 2) indicaciones que pueden requerir la estimulación de neovascularización, incluyendo la inducción de la formación del recipiente colateral (incluyendo isquemia miocardial, isquemia periférica, isquemia cerebral), enfermedad de arterias coronarias, enfermedad vascular periférica, apoplejía, sanación de heridas, injerto subsecuente a un transplante de órgano tal como un transplante de célula de isleta, reparación de fractura y tendones, cirugía reconstructiva, ingeniería de tejido, restenosis, caída de cabello, úlceras del cubito y estasis, úlceras gastrointestinales, insuficiencia placentaria, necrosis aséptica, hipertensión pulmonar y sistémica, demencia vascular, Enfermedad de Alzheimer, arteriopatía dominante autosomal cerebral con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL) ; psuedocyst de la tiroides y linfoedema; y 3) indicaciones que pueden requerir remodelación vascular, incluyendo malformaciones vasculares, psoriasis y pre-eclampsia. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes que inducen angiogénesis .
P. Enfermedad Inflamatoria del Riñon El receptor de CXCR3 ha sido reportado para expresarse por células mesangiales de pacientes con neuropatía IgA, glomerulonefritis membranoproliferativa o glomerulonefritis rápidamente progresiva (Romagnani, P. et al . (1999) J. Am. Soc. Nephrol . 10: 2518-2526) . Además, en un modelo de ratón de nefritis nefrotóxica, los niveles de ARNm IP-10 se incrementaron seis veces en la corteza de los ríñones nefríticos 7 días después de la inducción de nefritis (Schadde, E. et al . (2000) Nephrol . Dial . Transplant . 15: 1046-1053) . Aún además, niveles elevados de la expresión de IP-10 se observaron en especímenes de biopsia en riñon de pacientes humanos con glomerulonefritis cuando se comparan a ríñones normales (Romagnani, P. et al . (2002) J. Am. Soc. Nephrol . 13_: 53-64). Por consiguiente, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedad inflamatoria renal, incluyendo nefropatía de IgA, glomerulonefritis membranoproliferativa y glomerulonefritis rápidamente progresiva. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes o tratamientos utilizados en el tratamiento de glomerulonefritis, tales como antibióticos, diuréticos, medicamentos para presión sanguínea elevada y diálisis.
Q. Aterosclerosis Se ha mostrado que el IP-10 es un factor mitogénico y quimiotáctico para músculo liso vascular, los cuales son rasgos importantes de las células de músculo liso para su contribución a la patogénesis de aterosclerosis (Wang, X. et al . (1996) J. Biol . Chem . 271: 24286-24293) . Se ha mostrado que el IP-10 se induce en las células del músculo liso después del tratamiento con LPS o gamma interferón, y se indujo también en la arteria carótida de la rata después de angioplastia de balón (Wang, X. et al . (1996) supra) . Además, se ha mostrado que el IP-10 se expresa en células endoteliales asociadas con ateroma, células del músculo liso y macrófagos, sugiriendo un papel para el IP-10 en el reclutamiento y la retención de células T activadas que se han observado dentro de las lesiones de la pared vascular durante la aterogénesis (Mach, F. et al . (1999) J. Clin . Jrzvest. 104 : 1041-1050) . Por consiguiente, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento o la prevención de aterosclerosis. Los anticuerpos pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes o tratamientos utilizados en el tratamiento de aterosclerosis, tales como medicamentos de presión sanguínea elevada y fármacos que disminuyen el colesterol .
R. Infecciones Virales El IP-10 puede sobre-regularse en varias infecciones virales y puede jugar un papel benéfico al reclutar células T activadas para combatir la infección viral. En ciertos casos, sin embargo, la producción de IP-10 durante la infección viral puede conducir a efectos perjudiciales y de este modo, la actividad de IP-10 puede ser indeseada y puede ser deseable para inhibir la actividad de IP-10 en tales infecciones virales utilizando un anticuerpo anti-IP-10 de la invención. Por ejemplo, Se ha mostrado que el IP-10 estimula la replicación del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en macrófagos derivados de monocitos y linfocitos de sangre periférica (Lañe, B.R. et al . (2003) Virology 307: 122-134) . Además, los niveles de IP-10 son elevados en fluido cerebroespinal y el cerebro de pacientes infectados con VIH y el sistema nervioso central de ratones gpl20-transgénicos con VIH (Asensio, V.C. et al . (2001) J. Virol . 75: 7067-7077) .
Se ha mostrado que se elevan los niveles de IP-10 en pacientes con el virus de la hepatitis C (HCV) persistente y crónica y en pacientes con hepatitis activa crónica (Narumi, S. et al . (1997) J. Immunol . 158: 5536-5544) . En hígados infectados con HCV, se mostró que el IP-10 se expresa por hepatocitos, pero no por otros tipos de células dentro del hígado, y se encontró una proporción significativamente más elevada de células T positivas CXCR3 en el hígado cuando se compara a la sangre (Harvey, CE. et al . (2003) J. Leukoc . Biol . l : 360-369) . Se ha mostrado que la secreción incrementada del IP-10 se asocia con la respuesta inflamatoria por infección de virus del herpes simple del tipo I (HSV-1) ocular agudo en ratones, y se mostró que el tratamiento de ratones infectados con HSV-1 con anticuerpos anti-IP-10 reduce la infiltración celular mononuclear dentro del estroma corneal, reduce la patología corneal e inhibe el progreso del virus a partir del estroma corneal a la retina durante la infección aguda (Carr, D.J. et al . (2003) J. Virol . 77: 10037-10046) . Se ha mostrado también que la expresión del IP-10 se expresa en meningitis viral. Se demostró que el IP-10 se presenta en el CSF de los pacientes con meningitis viral y es responsable de actividad quimiotáctica en neutrófilos, células mononucleares de sangre periférica y en células T activadas (Lahrtz, F. et al . (1997) Eur. J. Inmuno 1 . 27: 2484-2489; Lahrtz, F. et al . (1998) J. Neuro immunol . 85: 33-43) . En vista de lo anterior, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de infecciones virales que implican actividad IP-10 indeseada administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. Ejemplos no limitantes de infecciones virales que pueden tratarse incluyen VIH (por ejemplo, encefalitis inducida por VIH) , HCV, HSV-1, meningitis viral y Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS) . El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes antivirales, tales como para infección por VIH, inhibidores de la transcriptasa inversa del nucleósido/nucleótido, inhibidores de la transcriptasa inversa sin nucleósidos y/o inhibidores de la proteasa (y combinaciones de los mismos) para infección por HCV, interferón alfa 2a, interferón alfa 2a pegilado, y/o ribavirina, y para infección por HSV-1, aciclovir, valaciclovir y/o famciclovir.
S. Infecciones Bacterianas La producción de IP-10 induce infecciones bacterianas en células afectadas (véase Gasper, N.A. et al. (2002) Infect Immun . 10_ : 4075-82) . La meningitis bacteriana se conoce también específicamente que implica la expresión de IP-10 (Lapinet, J.A. et al . (2000) Infect Immun . 68: 6917-23) . IP-10 se produce también por células somáticas testiculares de túmulos seminíferos, en un modelo de infección bacteriana, indicando fuertemente un probable papel de estas quimiocianas en la acumulación de neutrófilos y linfocitos T durante la inflamación testicular, la cual se observa clásicamente en la patogénesis de infecciones bacterianas (Aubi^y, F. et al . (2000) Eur Cytokine Netw. 22: 690-8) . En vista de lo anterior, los anticuerpos anti-IP-10 de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de infecciones bacterianas que implican la actividad indeseada del IP-10 administrando el anticuerpo a un sujeto con necesidad del tratamiento. Ejemplos de infecciones bacterianas incluyen, pero no se limitan a, meningitis bacteriana y neumonía bacteriana. El anticuerpo puede utilizarse solo o en combinación con otros agentes antibacterianos, tales como antibióticos. La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos los cuales no deben interpretarse además como limitantes. Los contenidos de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a través de esta solicitud se incorporan expresamente en la presente para referencia. Ejemplo 1: Generación de Anticuerpos Monoclonales Humanos Contra IP-10 Antígeno El IP10 humano recombinante purificado derivado de E. coli (Pepro Tech, Inc., Cat. Número: 300-12), o el IP10 humano recombinante purificado conjugado a la hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) , se utilizó como el antígeno.
Ratones HuMab y KM Transgénicos Se prepararon anticuerpos monoclonales totales humanos a IP10 utilizando cepas HCo7, HCol2 y HCol7 de ratones transgénicos HuMab y la cepa KM de los ratones transcromosómicos, transgénicos, cada una de las cuales expresa genes de anticuerpos humanos . En cada una de estas cepas de ratón, el gen de cadena ligera kappa de ratón endógeno ha sido interrumpido homozigosámente como se describe en Chen et al . (1993) EMBO J.12 : 811-820 y el gen de cadena pesada de ratón endógeno se ha interrumpido homozigosámente como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación PCT WO 01/09187. Cada una de estas cepas de ratón porta un transgen de cadena ligera kappa humano, KCo5 como se describe en Fishwild et al . (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. La cepa HCo7 porta el transgen de cadena pesada humano HCo7 como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,806; 5,625,825; y 5,545,807. La cepa HCol2 porta el transgen de cadena pesada humano HCol2 como se describe en el Ejemplo 2 de la Publicación PCT WO 01/09187. La cepa HCol7 porta el transgen de cadena pesada humano HCol7 como se describe en el Ejemplo 8 posteriormente. La cepa KM contiene el transcromosoma SC20 como se describe en la Publicación PCT WO 02/43478.
Inmunizaciones HuMab y KM: Para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos a IP10, ratones HuMab y ratones KM fueron inmunizados con IP10 recombinante purificado derivado de E. coli o IP10- KLH conjugado como antígeno. Los esquemas de inmunización generales para ratones HuMab se describen en Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al . (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y la Publicación PCT WO 98/24884. Los ratones tenían 6-16 semanas de edad hasta la primera infusión del antígeno . Una preparación recombinante purificada (5-50 µg) del antígeno de IP10 (por ejemplo, purificada a partir de células E. coli transfectadas que expresan IP10) se utilizó para inmunizar ratones HuMab y ratones KM intraperitoneal, subcutáneamente (Se) o a través de inyección en el cojinete plantar. Se inmunizaron a ratones transgénicos dos veces con el antígeno en adyuvante de Freund completo o en adyuvante Ribi ya sea intraperitonealmente (IP) , subcutáneamente (Se) o a través del cojinete plantar (FP) , seguido por 3-21 días de inmunización IP, Se o FP (hasta un total de 11 inmunizaciones) con el antígeno en adyuvante de Freund o Ribi incompleto. Se monitoreo la respuesta inmune por sangrados retroorbitales . El plasma se analizó por ELISA (como se describe posteriormente) y los ratones con suficientes cantidades de inmunoglobulina humana anti-IPlO se utilizaron para fusiones. Se sobrealimentaron intravenosamente a ratones con antígeno 3 y 2 días antes del sacrificio y de la remoción del bazo. Normalmente, se realizaron 10-35 fusiones para cada antígeno. Varias docenas de ratones se inmunizaron para cada antígeno. Un total de 82 ratones de las cepas de ratones HCo7, HCol2, HCol7 y KM se inmunizaron con IPÍO .
Selección de Ratones HuMab o KM que Producen Anticuerpos Anti-IPlO: Para seleccionar ratones HuMab o KM que producen anticuerpos que unen IP10, se probó el suero a partir de ratones inmunizados por ELISA como se describe por Fishwild, D. et al . (1996) . Brevemente, se recubrieron placas microtituladoras con IP10 recombinante a partir de E. coli en 1-2 µg/ml en PBS, 50 µl/pozo se incubaron a 4°C durante la noche, luego se bloquearon con 200 µl/pozo de 5% de suero de pollo en PBS/Tween (0.05%). Las diluciones de plasma a partir de ratones inmunizados con IP10 se agregaron a cada pozo y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y luego se incubaron con un anticuerpo políclonal IgG Fc anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se cultivaron con sustrato de ABTS (Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml) y se analizaron por espectrofotómetro en OD 415-495. Los ratones que desarrollaron las cantidades más elevadas de anticuerpos anti-IPlO se utilizaron para las fusiones. Las fusiones se realizaron como se describe posteriormente y los sobrenadantes de hibridoma se probaron para actividad anti-IP10 por ELISA.
Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Humanos a IP10 : Los esplenocitos de ratón, aislados a partir de ratones HuMab y ratones KM, se combinaron con PEG a una línea celular de mieloma de ratón basada en los protocolos estándares. Los hibridomas resultantes se seleccionaron entonces para la producción de anticuerpos específicos de antígenos. Las suspensiones celulares sencillas de los linfocitos esplénicos a partir de ratones inmunizados se combinaron a un cuarto del número de células de mieloma de ratón no secretadas SP2/0 (ATCC, CRL 1581) con 50% de PEG (Sigma) . Las células se colocaron en placas en aproximadamente lxl05/pozo en una placa microtituladora de fondo plano, seguida por aproximadamente dos semanas de incubación en un medio selectivo conteniendo 10% de suero de bovino fetal, 10% de P388D1, un medio condicionado (ATCC, CRL TIB-63) , 3-5% de origen (IGEN) en DMEM (Mediatech, CRL 10013, con glucosa elevada, L-glutamina y piruvato de sodio) más 5 mM de HEPES, 0.055 mM de 2-mercaptoetanol , 50 mg/ml de gentamicina y 1 x HAT (Sigma, CRL P-7185) . Después de 1-2 semanas, las células se cultivaron en un medio en donde el HAT se reemplazó con HT. Los pozos individuales se analizaron entonces por ELISA (descritos anteriormente) para anticuerpos IgG monoclonales anti-IPlO humanos. Una vez que ocurrió el crecimiento extenso de hibridomas, el medio se monitoreo usualmente después de 10-14 días. Se volvieron a colocar en placas los hibridomas que secretan anticuerpos, se analizaron de nuevo y, si aún son positivos para los anticuerpos monoclonales anti-IPlO de IgG humano se subclonaron al menos dos veces limitando la dilución. Los subclones estables se cultivaron entonces in vi tro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en un medio de cultivo de tejido para caracterización adicional. Los clones de hibridoma 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 se seleccionaron para análisis adicional . Ejemplo 2; Caracterización Estructural de Anticuerpos Monoclonales Humanos Contra IP-10 Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales 1D4 , 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 , 6A8 , 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 y 13C4 se obtuvieron a partir de los hibridomas correspondientes utilizando técnicas de PCR estándares y se secuenciaron utilizando técnicas de secuenciación de ADN estándares. En casos en donde la secuenciación de ADN sola no fue suficiente para determinar ambiguamente la estructura de anticuerpos, se realizó también el análisis de proteínas (por ejemplo, análisis de aminoácidos N-terminal y la espectroscopia de masa) y se compararon los resultados al análisis de secuencia de ADN por lo que se determina la estructura correcta de anticuerpos . Los resultados del análisis estructural son como sigue: Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 1D4 se muestran en la Figura ÍA y en las SEC DE IDENT. NOS.: 99 y 35, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 1D4 se muestran en la Figura IB y en las SEC DE IDENT. NOS.: 110 y 84, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 1E1 se muestran en la Figura 2A y en las SEC DE IDENT. NOS.: 100 y 36, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 1E1 se muestran en la Figura 2B y en las SEC DE IDENT. NOS.: 111 y 85, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 2G1 se muestran en la Figura 3A y en las SEC DE IDENT. NOS.: 101 y 37, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 2G1 se muestran en la Figura 3B y en las SEC DE IDENT. NOS.: 112 y 86, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 3C4 se muestran en la Figura 4A y en las SEC DE IDENT. NOS.: 102 y 38, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 3C4 se muestran en la Figura 4B y en las SEC DE IDENT. NOS.: 113 y 87, respectivamente . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 6A5 se muestran en la Figura 5A y en las SEC DE IDENT. NOS.: 103 y 39, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 6A5 se muestran en la Figura 5B y en las SEC DE IDENT. NOS.: 114 y 88, respectivamente . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 6A8 se muestran en la Figura 6A y en las SEC DE IDENT. NOS.: 104 y 40, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 6A8 se muestran en la Figura 6B y en las SEC DE IDENT. NOS.: 115 y 89, respectivamente . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 6B10 se muestran en la Figura 7A y en las SEC DE IDENT. NOS.: 105 y 41, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 6B10 se muestran en la Figura 7B y en las SEC DE IDENT. NOS.: 116 y 90, respectivamente . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 7C10 se muestran en la Figura 8A y en las SEC DE IDENT. NOS.: 106 y 42, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 7C10 se muestran en la Figura 8B y en las SEC DE IDENT. NOS.: 117 y 91, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 8F6 se muestran en la Figura 9A y en las SEC DE IDENT. NOS.: 107 y 43, respectivamente. Las secuencias de nucleótídos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 8F6 se muestran en la Figura 9B y en las SEC DE IDENT. NOS.: 118 y 92, respectivamente . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 10A12 se muestran en la Figura 10A y en las SEC DE IDENT. NOS.: 108 y 44, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 10A12 se muestran en la Figura 10B y en las SEC DE IDENT. NOS.: 119 y 93, respectivamente . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 13C4 se muestran en la Figura HA y en las SEC DE IDENT. NOS.: 109 y 46, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 13C4 se muestran en la Figura 11B y en las SEC DE IDENT. NOS.: 120 y 94, respectivamente . La comparación de las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada 1D4, 1E1, 2G1, 6A5 , 6A8 , 7C10 y 10A12 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida demostró que estas cadenas pesadas del anticuerpo utilizan un segmento VH a partir de la línea germinal humana VH 3-33. La alineación de las secuencias VH 1D4, 1E1, 2G1, 6A5 , 6A8 , 7C10 y 10A12 a la secuencia VH 3-33 de línea germinal (SEC DE IDENT. NO. : 47) se muestra en la Figura 12. El análisis adicional de las secuencias VH 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8 , 7C10 y 10A12 que utiliza el sistema Kabat de la determinación de región CDR conduce a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 1A, 2A, 3A, 5A, 6A, 8A y 10A, respectivamente. La comparación de las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada 6B10 y 8F6 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida demostró que estas cadenas pesadas de anticuerpos utiliza un segmento VH a partir de la línea germinal VH 3-30.3 humana. La alineación de las secuencias VH 6B10 y 8F6 a la secuencia VH 3-33 de línea gex"minal (SEC DE IDENT. NO. : 48) se muestra en la Figura 13. El análisis adicional de las secuencias VH 6B10 y 8F6 que utilizan el sistema Kabat de la determinación de región CDR conduce a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 7A y 9A, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada 3C4 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida demostró que esta cadena pesada de anticuerpos utiliza un segmento VH a partir de la línea germinal VH 5-51 humana. La alineación de la secuencia VH de 3C4 a la secuencia VH 5-51 de línea germinal (SEC DE IDENT. NO.: 49) se muestra en la Figura 14. El análisis adicional de la secuencia VH de 3C4 que utiliza el sistema Kabat de la determinación de región CDR conduce a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en la Figura 4A. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada 13C4 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida demostró que esta cadena pesada de anticuerpos utiliza un segmento VH a partir de la línea germinal VH 4-61 humana. La alineación de la secuencia VH de 13C4 a la secuencia VH 4-61 de línea germinal (SEC DE 1DENT. NO.: 50) se muestra en la Figura 15. El análisis adicional de la secuencia VH de 13C4 que utiliza el sistema Kabat de la determinación de región CDR conduce a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada, como se muestra en la Figura HA. La comparación de las secuencias de inmunoglobulina de cadena ligera 1D , 2G1, 6A5 , 6A8 , 10A12 y 13C4 a las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida demostró que estas cadenas ligeras de anticuerpos utiliza un segmento VL a partir de la línea germinal V? A27 humana. La alineación de las secuencias VL de 1D4, 2G1, 6A5, 6A8 , 10A12 y 13C4 a la secuencia V? A27 de la línea germinal (SEC DE IDENT. NO. : 95) se muestra en la Figura 16. El análisis adicional de las secuencias VL de 1D4 , 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 y 13C4 que utiliza el sistema Kabat de la determinación de región CDR conduce a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras IB, 3B, 5B, 6B, 10B y 11B, respectivamente . La comparación de las secuencias de inmunoglobulina de cadena ligera 1E1, 6B10 y 8F6 a las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas demostró que estas cadenas ligeras de anticuerpos utilizan un segmento VL a partir de una línea germinal V? L6 humana. La alineación de las secuencias VL de 1E1, 6B10 y 8F6 a la secuencia V? L6 de la línea germinal (SEC DE IDENT. NO. : 96) se muestra en la Figura 17. El análisis adicional de las secuencias VL de 1E1, 6B10 y 8F6 que utiliza el sistema Kabat de la determinación de región CDR conduce a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 2B, 7B y 9B, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 3C4 a las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida demostró que la cadena ligera 3C4 utiliza un segmento VL a partir de la línea germinal V? L18 humana. La alineación de la secuencia VL de 3C4 a la secuencia V? L18 de la línea germinal (SEC DE IDENT. NO.: 97) se muestra en la Figura 18. El análisis adicional de la secuencia VL de 3C4 que utiliza el sistema Kabat de la determinación de región CDR conduce a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 4B . La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 7C10 a las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocida demostró que la cadena ligera 7C10 utiliza un segmento VL a partir de la línea germinal V? L15 humana. La alineación de la secuencia VL 7C10 a la secuencia V? L15 de la línea germinal (SEC DE IDENT. NO.: 98) se muestra en la Figura 19. El análisis adicional de la secuencia VL de 7C10 que utiliza el sistema Kabat de la determinación de región CDR conduce a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en la Figura 8B.
Ejemplo 3; Caracterización de Especificidad de Enlace y Cinéticas de Enlace de los Anticuerpos Monoclonales Humanos Anti-IP-10 En este ejemplo, la afinidad de enlace, cinéticas de enlace y especificidad de enlace de los anticuerpos anti- IP-10 se examinaron por análisis Biacore . También, la especificidad de enlace y la competición cruzada se examinó por ELISA.
Análisis Biacore Se caracterizaron anticuerpos anti-IP-10 para afinidades y cinéticas de enlace por análisis Biacore (Biacore AB, Uppsala, Suecia) . Se acopló el IP-10 humano recombinante purificado, expresado con E. coli (R & D Systems) al chip sensor CM5 @ 97 RU utilizando el protocolo de acoplamiento EDC/NHS provisto por Biacore AB. Se midió el enlace por el flujo del anticuerpo en tampón de HBS EP (provisto por Biacore AB) en concentraciones de 33-267 nM en una velocidad de flujo de 40 µl/minutos. Las cinéticas de asociación del antígeno-anticuerpo se siguieron durante 5 minutos y las cinéticas de disociación se siguieron durante 8 minutos. Las curvas de asociación y disociación se establecieron en un modelo de enlace Langmuir 1: 1 utilizando software BIAevaluation (Biacore AB) . Los datos que corresponden a las pocas docenas de segundos iniciales para las fases de asociación y disociación se consideraron sólo para ajuste de curva para minimizar el efecto de avidez. Se realizaron experimentos a 25°C y 37°C. Los valores de a, Kacivado y Kaesactiado que se determinaron se muestran en la Tabla 1 para el enlace a 25°C y en la Tabla 2 para el enlace a 37°C.
Tabla 1: Caracterización de Enlace a 25°C con IP-10 Humano *Lote 2 de 6A5 es una muestra independiente del anticuerpo purificado a partir del sobrenadante de híbridoma 6A5 cuando se compara a la muestra 6A5.
Tabla 2: Caracterización de Enlace a 37°C con IP-10 Humano La vida media de los anticuerpos (en horas) como se define por el tiempo tomado para la disociación de la mitad del complejo de anticuerpo-antígeno durante la fase de disociación, se midió a 25°C y 37°C. Los valores se determinaron por la extensión de las curvas de disociación para conseguir el tiempo requerido para el 50% de reducción del eje Y del sensograma de disociación. Los resultados se muestran posteriormente en la Tabla 3 : Tabla 3: Vida Media de los Anticuerpos a 25°C y 37°C La reactividad cruzada de los anticuerpos, a 25°C, con IP-10 de mono rhesus, MIG humano, ITAC humano e IP-10 de ratón se determinó por análisis Biacore utilizando los mismos métodos como se describe anteriormente para IP-10 humano. Se obtuvieron MIG humano, IP-10 humano e IP-10 de ratón comercialmente (Pepro Tech, Rocky Hill, NJ) , mientras se hizo el IP-10 de mono rhesus por expresión recombinante y se purificó por métodos estándares. Se conjugaron los antígenos al chip sensor CM5 @ 140 RUs (IP-10 del mono rhesus) , 457 RUs (MIG humano) , 206 RUs (ITAC humano) y 150 RUs (IP-10 de ratón) . Se obtuvieron sensogramas de asociación al fluir anticuerpos en tampón HBS EP en una concentración de 133 nM durante 5 minutos. El flujo se detuvo entonces y la disociación se monitoreo durante 5 minutos. Las curvas de asociación y disociación se establecieron a un modelo de enlace Langmuir utilizando el software BIAevaluation (Biacore, AB) . Los resultados de los experimentos de reactividad cruzada se resumen posteriormente en la Tabla 4 : Tabla 4: Reactividad Cruzada Anti-IP-10 con Varios Ligandos CXCR3 Análisis de ELISA Se realizaron experimentos adicionales utilizando un ensayo de ELISA para examinar la reactividad cruzada antigénica de los anticuerpos anti-IP-10 para MIG humano, IP-10 de mono rhesus o IP-10 de ratón. Los procedimientos utilizados para la ELISA fueron como se describió anteriormente en el Ejemplo 1, excepto que las placas microtituladoras recubiertas con 1 µg/ml del IP-10 humano recombinante, MIG humano (Pepro Tech, cat. No. 300-26), IP-10 de ratón (Pepro Tech, cat. No. 250-16) o el IP-10 del mono rhesus recombinante. Los resultados, expresados como valores EC50 (en ng/ml) se resumen posteriormente en la Tabla 5: Tabla 5: Reactividad Cruzada Anti-IP-10 por ELISA con Varios Ligandos CXCR3 Los estudios de competición cruzada entre los diversos anticuerpos anti-IP-10 se realizaron también por ELISA utilizando formas biotiniladas de 6A5 y 2G1 para determinar si los anticuerpos reconocen diferentes epítopos en IP-10. El procedimiento para la competición de ELISA fue similar a la ELISA descrita anteriormente en el Ejemplo 1. Brevemente, las placas microtituladoras se recubrieron con IP-10 recombinante purificado a partir de E. coli a 0.2 µg/ml en PBS, 50 µl/pozo y se incubaron a 4°C durante la noche. Los pozos se bloquearon entonces con 200 µl/pozo de 5% de suero de pollo en PBS/Tween (0.05%) . Las diluciones de los anticuerpos IP-10 anti-humano, humanos purificados (de 2 µg/ml a 3.91 ng/ml) se agregaron a cada pozo e incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y luego se incubaron con 0.1 µg/ml de biotina-6A5 o biotina-2Gl durante 30 minutos. Las placas se lavaron entonces tres veces con PBS/Tween. Después del lavado, se agregó estreptavidina etiquetada con fosfatasa (KPL, Cat. No. 15-30-00) en una dilución de 1: 2000 en 5% de suero de pollo a cada pozo e incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se cultivaron con sustrato p-NPP (Moss, Inc, lote 10274021) y se analizaron por un espectrofotómetro en OD 405. Como se espera, 2G1 no etiquetado pudo competir con la biotina-2Gl para el enlace a IP-10 y, además, los 6A5 , 7C10, 10A12, 10A12S, 6B10, 8F6 y 1D4 no etiquetados fueron cada uno capaz de competir el enlace de la biotina-2Gl a IP-10 humano. De manera similar 6A5 no etiquetado compite con la biotina 6A5 para el enlace de IP-10 y, además, 2G1, 7C10, 10A12, 10A12S, 6B10, 8F6 y 1D4 no etiquetados fueron capaces de competir cada uno el enlace de la biotina-6A5 al IP-10 humano. Estos resultados indican que cada uno de estos anticuerpos tiene una especificidad de enlace para el mismo epítopo (o grupo de epítopo) del IP-10 humano.
Ejemplo 4; Inhibición del Enlace de IP-10 a CXCR3 En este ejemplo, se examinó la capacidad de los anticuerpos anti-IP-10 para inhibir el enlace del IP-10 humano a su receptor, CXCR3 , en las células que expresan el receptor. En primer lugar, se realizó un análisis Scatchard para el enlace de 125I-IP-10 a 300.19 células transfectadas para expresar CXCR3. Las células se cultivaron en un medio RPMl conteniendo 10% de FCS y selección G418. Antes del uso, las células se lavaron dos veces con Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS) a 4°C y se ajustaron a 4 x 107 células/ml. Las placas de fibra de vidrio (Millipore MultiScreen®, Cat. No. MAFBN0B50) se bloquearon con 200 µl de una solución de polietilenimina al 0.1% un día antes del experimento. En el día del estudio, se extrajo el fluido del tampón de bloqueo utilizando un múltiple Millipore. Las placas se lavaron tres veces con 200 µl del tampón de enlace (50 mM de HEPES, pH 7.2, 1 mM de CaCl2, 5 mM de MgCl2, 0.5% de BSA) . Veinticinco microlitros del tampón de enlace se agregó a cada pozo seguido ya sea por 25 µl de 1000 veces del IP-10 no etiquetado en exceso o el tampón de enlace. Veinticinco microlitros de 125I-IP-10 (Amersham, Cat. NO. IM332-25 µCi) en concentraciones incrementadas se agregó, seguido por 25 µl de células en una densidad de 1 x 106 células por pozo. Las placas se incubaron en un agitador de placas durante 60 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con tampón de lavado (10 mM de HEPES, pH 7.2 , 0.5 M de NaCl , 0.5% de BSA) en un volumen de 200 µl por lavado. Las placas se secaron, 25 µl de centelleo se agregó y las placas se contaron en un Contador Microbeta Wallac. Se analizaron los datos utilizando software Prism y se calculó el KD. Un KD promedio de 0.231 nM se determinó para el enlace receptor. Después, se examinó la capacidad de los anticuerpos anti-IP-10 para inhibir el enlace de 100 pM-125I-hIP-10 a las células que expresan CXCR3. Los ensayos de competición se activaron en una manera similar al experimento descrito anteriormente. Brevemente, 25 µl del tampón de enlace se agregó a las placas de filtro de fibra de vidrio, seguido por 25 µl de concentraciones incrementadas de anticuerpos anti-IP-10. Veinticinco microlitros de 125I-IP-10 se agregó a una concentración final de 0.100 nM. Finalmente, 25 µl de células en una densidad de 1 x 10s células por pozo se agregaron y las placas se incubaron en un agitador de placas durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron y contaron como se describe anteriormente . Los valores EC50 se calcularon utilizando software Prism. Los valores Ki (en nM) se determinaron utilizando la fórmula: Ki = EC5o 1 + [L]/KD Los resultados se resumen posteriormente en la Tabla 6 Tabla 6: Inhibición del Enlace IP-10 a CXCR3 Ejemplo 5; Inhibición del Flujo de Calcio Inducido por IP-10 En este ejemplo, la capacidad de los anticuerpos anti-IP-10 para inhibir el flujo de calcio inducido por IP-10 se examinó utilizando ya sea 300.19 células transfectadas que expresan CXCR3 o linfocitos de sangre periférica humanos activados anti-CD3 (los PBL) que expresan CXCR3. Para preparar los PBL, se purificó la sangre humana normal por separación Ficoll estándar. Los PBL humanos purificados se estimularon agregando las células a placas recubiertas con 3 µg/ml de anticuerpo anti-CD3 y se cultivaron en RPMl con 10% de FBS. Después de tres días de incubación, las células se mantuvieron en un medio de crecimiento que contiene 500 U/ml de IL-2. En el día del estudio, las células se lavaron y se volvieron a suspender en un medio en una densidad de 2.5 x 107 células/ml. Las 300.19 células transfectadas que expresan CXCR3 se cultivaron en RPMl conteniendo 10% de FBS. Las 300.19 células se volvieron a suspender en un medio de crecimiento a 2 x 106 células/ml. Para realizar el ensayo, se agregó 100 µl de la suspensión celular en una placa de 96 pozos de fondo transparente, con lados negros la cual se recubrió con Poli-D-Lisina (Corning/Costar, cat. No. 3667). 100 microlitros del equipo de tinte de carga de Calcio 3 (FlexStation™, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA) se agregó a cada pozo, las placas se hicieron girar a 1100 RPM durante 4 minutos y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Al utilizar la placa del reactivo de 96 pozos, se diluyó IP-10 humano (Pepro tech, cat. NO. 300-12) en Solución Salina Equilibrada de Hank con 20 mM de HEPES y 1% de FBS (800 pM para 300.19 células y 1200 pM para los PBL humanos) . Los anticuerpos se diluyeron serialmente en las placas reactivas que contienen IP-10. Los pozos control que contienen tampón solo o IP-10 solo se incluyeron. Veintidós microlitros de solución de IP-10/anticuerpo se agregaron por pozo a las placas conteniendo las células etiquetadas con tinte y se determinó el flujo de calcio monitoreando la fluorescencia del Calcio 3 utilizando el instrumento FlexStation™ de acuerdo a las instrucciones del fabricante, durante un periodo de tiempo de 200 segundos. El área bajo la curva (AUC) se calculó por la integración del flujo de calcio entre 20-100 segundos de acuerdo a los protocolos estándares (véase por ejemplo, Smart D. et al . (1999) Br. J. Pharmacol . 128 : 1-3). Los datos se analizaron utilizando software Prism™ (Molecular Devices, Inc.) y los valores IC50 (en nM) se determinaron. Los resultados se resumen posteriormente en la Tabla 7 : Tabla 7: Inhibición del Flujo de Calcio Inducido por IP-10 Ejemplo 6: Inhibición de Migración Celular Inducida por IP-10 La capacidad de los anticuerpos anti-IP-10 para inhibir la migración celular inducida por IP-10 se examinó en un ensayo de quimiotaxis in vi tro . En estos experimentos, las células 300.19 que expresan CXCR3 se utilizaron y se estimularon con ya sea: (i) 100 ng/ml de IP-10 humano recombinante (rhIP-10) ; (ii) sobrenadante de células THP-1 estimuladas con IFN gamma (el cual induce la secreción de IP-10 nativo y MIG) , en donde IP-10 derivado de THP-1 estuvo en una concentración de 16 ng/ml y la actividad de MIG se bloqueó por la adición de anti-MIG (R&D Systems) a 2.5 µg/ml; o (iii) 100 ng/ml del IP-10 de macaco rhesus recombinante (rrmIP-10) . La inhibición de la migración celular se evaluó utilizando varias concentraciones de anticuerpos y se determinó un índice quimiotáctico . Específicamente, se evaluó la inhibición de quimiotaxis utilizando un ensayo de placas de 96 pozos estándar (placas Multiscreen MIC (Millipore) ) . Se utilizó un filtro de 5 µm para líneas de células transfectadas; y se utilizó un filtro de 3 µm para células primarias. Las células de respuesta (300.19 CXCR3+; células PBMC humanas específicas de MBP) se volvieron a suspender en tampón de quimiotaxis (RPMl + 1% de BSA o FBS) a lxlO6 células/ml. Se agregó 100 µl de la suspensión celular al pozo superior y se dejó para incubar durante 30 minutos a 37 °C. Se aplicó 5% de C02 antes de la adición al pozo de fondo. Se preparó el IP-10 humano y del macaco rhesus a 100 ng/ml; para IP-10 derivado de THP-1, las células THP1 se estimularon con IFN-? (0.2 ng/ml) y el sobrenadante se recolectó: Se utilizó IP-10 derivado de MS CSF nítido. El ligando se preparó en 150 µl de tampón de quimotaxis y se colocó en una cámara inferior. Para ensayos de inhibición de quimiotaxis, el ligando se pre-incubó con concentraciones variables del anticuerpo anti-IP-10 indicado (5 µg/ml, 2.5 µg/ml, 1.25 µg/ml, 0.613 µg/ml, 0.3 µg/ml, 0.015 µg/ml) durante 30 minutos a 37°C en 5% de C02 antes del ensayo. La cámara superior se colocó sobre los pozos, y los pozos se incubaron durante 2 horas a 37°C en 5% de C02. En el final de la incubación, a las células de respuesta se les extrajo el flujo a partir de la cámara superior. La cámara superior se removió cuidadosamente . Las células se contaron en 4 campos/pozo aleatorios en ampliación de 400x. Los datos se promediaron a través de tres pozos y se presentaron como un índice de quimiotaxis (es decir, la migración de doblez en respuesta al ligando sobre el medio solo) . Los resultados expresados como valores 1C50 se resumen posteriormente en la Tabla 8 : Tabla 8: Inhibición de Migración Celular Inducida por IP-10 La capacidad de los anticuerpos anti-IP-10 para inhibir la migración de células 300.19 que expresan CXCR3 en respuesta al fluido cerebroespinal (CSF) a partir de pacientes con esclerosis múltiple (MS) se examinó también. De nuevo, el anticuerpo anti-MIG en 2.5 µg/ml se agregó a la muestra de CSF para neutralizar la actividad de MIG. Los resultados a partir de dos experimentos, expresados como valores IC50 se resumen posteriormente en la Tabla 9 : Tabla 9: Inhibición de Migración Celular Inducida por MS-CSF Expt. 1 Expt.2 ID del Clon IC^j g/inl) ¡Csfl µg/ l) 6A5 (Lote 2) 0.100 0.236 10A12S 0.562 0.577 Se realizaron también estudios de migración celular utilizando células 300.19 que expresan CXCR3 y MIG humano recombinante (R&D Systems) a 200 ng/ml, para examinar la capacidad de los anticuerpos anti-IP-10 para inhibir la migración celular inducida por MIG. Los anticuerpos anti-IP-10 6B10, 8F6, 1D , 6A5 de lote 2, 10A12 y 10A12S se probaron individualmente en 1 µg/ml y se encontraron que no inhiben la migración celular inducida por MIG.
Ejemplo 7; Enlace de Anticuerpos a la Sección del Cerebro de los Pacientes con MS En este ejemplo, se examinó la capacidad de los anticuerpos anti-IP-10 a las secciones de mancha del cerebro a partir de un paciente con esclerosis múltiple (MS) . Se obtuvieron las secciones del cerebro a partir de un paciente con MS, femenino de 57 años 19.8 horas post-mortem y mostraron una placa periventricular de forma irregular (1.3 cm x 1.0 cm) con numerosas placas más pequeñas adicionales presentes a través de la materia blanca restante. La tinción con LFB mostró desmielinización completa. Se realizó la inmunohistoquímica en las secciones utilizando los anticuerpos anti-IP-10 6A5 (lote 2) y 10A12S, así como anti-GFAP y anti-CD68, como controles positivos, y un anticuerpo de control negativo. Se empleo un protocolo de inmunohistoquímica estándar para tinción antí-IP-10 de las secciones. Las secciones se bloquearon utilizando 2%-10% de suero. Se agregó 100 µl/sección del anticuerpo primario (por ejemplo, 6A5) diluido 1: 100 en 2% de suero, luego se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Opcionalmente, se incubaron las secciones durante la noche a 4°C y se lavaron. El anticuerpo biotinilado anti-humano secundario (diluido en 2% de suero (100 µl/sección) ) se agregó entonces y se incubó durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. Se removieron las peroxidasas endógenas agregando H202 diluida en MeOH. Luego, se agregó la solución de ABC (Vector Labs) , 100 µl/sección y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se preparó la solución del sustrato de DAB inmediatamente antes del uso. Se aplicó 100 µl por sección a los portaobjetos antes de incubarse en la oscuridad durante 10-20 minutos (cuando es necesario para el desarrollo) . Los portaobjetos se contra-tiñeron entonces con tinción nuclear de Hematoxilina durante 3 minutos (se verificó el progreso después de 1 minuto) . Finalmente, se incubaron los portaobjetos en 2% de bicarbonato de sodio durante 45 segundos para producir el color. Los resultados mostraron que tanto 6A5 como 10A12S pudieron unirse a IP-10 in si tu en las secciones del cerebro del paciente MS, con tinción 6A5 que es más intensa que la tinción 10A12S.
Ejemplo 8: Construcción de Cepa HCol7 de Ratones Transgénicos Se generó la cepa de ratón transgénico HCol7 por co-inyección del inserto de 80 kb de pHC2 (Taylor et al . - (1994) Int . Im unol . 6 : 579-591), el inserto de 25 Kb de pVX6 y un fragmento de cromosoma artificial de levadura de ~460 kb del cromosoma yIgH2 . La construcción pHC2 sola es capaz totalmente de volverse a disponer in vivo para formar un lugar de inmunoglobulina de cadena pesada humana funcional; pVX6 e yIgH24 se agregaron para contribuir a la diversidad de VH de línea germinal adicional . Los componentes individuales de la mezcla de ADN utilizada para producir HCol7 se describen posteriormente. El inserto pHC2 descrito anteriormente contiene cuatro segmentos del gen VH de línea germinal humana funcional: 1-69 (DP-10) , 5-51 (DP-73), 4-34 (DP-63) y 3-30.3 (DP-46) . Además, esta construcción contiene también secuencias genómicas humanas que comprenden 15 segmentos D funcionales, todos los segmentos 6 J, así como segmentos de región constantes µ y ?l y una región de interrupción µ-?l funcional . El inserto pVX6 contiene 3 segmentos VH de línea germinal humana, VH1-18 (DP-14) , VH5-51 (DP-73) y VH3-23 (DP- 47) . Un fragmento de ADN HindIIl/SalI de 8.5 kb que comprende el gen VH1-18 humano de línea germinal (DP-14) , junto con aproximadamente 2.5 kb de 5' flanqueo y 5 kb de la secuencia genómica de 3' flanqueo, se subclonó dentro del vector plásmido pSP72 (Promega, Madison, Wis.) para generar el plásmido p343.7.16. Un fragmento de ADN BamHI/Hindi de 7 kb, que comprende el gen VH5-51 humano de linea germinal (DP-73) , junto con aproximadamente 5 kg de 5' flanqueo y 1 kb de la secuencia genómica de 3' flanqueo se clonó dentro del vector pGPlf de clonación de plásmido basado en PBR322 (Taylor et al . (1992) Nucleic Acids Res . 20: 6287-6295), para generar el plásmido p251f . Un nuevo vector de clonación derivado de pGPlf, pGPlk se digirió con EcoRV/BamHI , y se ligó a un fragmento de ADN EcoRV/BamHI de 10 kb que comprende el gen VH3-23 humano de línea germinal (DP47) , junto con aproximadamente 4 kb de 5' flanqueo y de la secuencia genómica de 3' flanqueo y 5 kb. El plásmido resultante, pll2.2RR.7 se digirió con BamHI/SalI y se ligó con el inserto BamHl/SalI purificado con 7 kb de p251f. El plásmido resultante pVx4 , se digirió con Soy y se ligó con el inserto Soy/Salí 8.5 kb de p343.7.16. Un clon se obtuvo con el gen VH1-18 en la misma orientación como los otros dos genes V. Este clon, designado pVx6, se digirió entonces con Notl para la preparación del inserto. Se identificó originalmente el cromosoma yIgH24 artificial de levadura (YAC) por selección de PCR utilizando los cebadores específicos de la familia VH3 y VH4 y se mapea al cromosoma 14 humano por el contenido de VH. Se estableció que el yIgH24 contiene segmentos VH incluyendo miembros de las familias VH, VH1 , VH2 , VH3 , VH4 y VH5 , y en particular al menos VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH2-26, VH3-30, V3-30.5, VH3-30.3, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH4-28, VH4-30, VH4-30.4, VH4-30.3, VH4-31, VH4-34, 4-39 y VH5-51. Los insertos purificados a partir de pVX6 (26 kb) , pHC2 (80 kb) e yIgH24 (~460 kb) se combinaron en una relación molar 1: 1: 1, y se micro-inyectaron dentro del pro-núcleo de embriones F2 de medio día (C57BL/6J x DBA/2J) como se describe por Hogan et al . (B. Hogan et al . , Manipulating the MouseEmbryo, A Laboratory Manual, 2a edición, 1994, Cold Spring Harbor Laboratoy Press, Plainview, N.Y.). Una línea fundadora de ratones transgénicos, que comprende secuencias de pVx6, HC2 e y!gH24, se estableció a partir de ratones que se desarrollaron de embriones inyectados. Esta línea se designó 25950 (HCol7) . La línea 25950 (HCol7) se reprodujo entonces con ratones que comprenden la mutación CMD (descrita en el Ejemplo 1 de la Publicación PCT WO 01/09187) , la mutación JKD (Chen et al . (1993) EMBO J. 12 : 811-820) y el transgen 9272 (KCo5) (Fishwild et al . (1996) Nature Biotechnology 1 : 845- 851) . Los ratones resultantes que expresan transgenes de cadena ligera kappa y pesada de inmunoglobulina humanos en un antecedente homocigoto para la interrupción de lugar de cadena ligera kappa y pesada de ratón endógeno.
RESUMEN DE LA LISTA DE SECUENCIAS Equivalentes Aquellos expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar, utilizando no más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descritos en la presente. Tales equivalentes se pretenden para abarcarse por las siguientes reivindicaciones.

Claims (66)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo se une específicamente a IP-10 humano y exhibe al menos una de las siguientes propiedades : (a) inhibir el enlace de IP-10 a CXCR3 ; (b) inhibir el flujo de calcio inducido por IP-10; (c) inhibir la migración celular inducida por IP-10; (d) reaccionar cruzado el IP-10 del mono rhesus ; (e) no reaccionar cruzado con el IP-10 de ratón; (f) no reaccionar cruzado con el MIG humano ,- (g) no reaccionar cruzado con el ITAC humano.
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1, el cual es el anticuerpo de longitud total de un isotipo IgGl o IgG4.
  3. 3. El anticuerpo de la reivindicación 1, el cual es un fragmento de anticuerpos o un anticuerpo de una sola cadena .
  4. 4. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígenos del mismo, en donde el anticuerpo se une específicamente a IP-10 y comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen de línea germinal VH humano seleccionado a partir del grupo que consiste de un gen VH 3-33 humano, un gen VH 3-30.3 humano, un gen VH 5-51 humano y un gen VH 4-61 humano.
  5. 5. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígenos del mismo, en donde el anticuerpo se une específicamente a IP-10 y comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen de línea germinal V? seleccionado a partir del grupo que consiste de un gen Vk A27 humano, un gen Vk L15 humano, un gen V? L6 humano y un gen V? L18 humano.
  6. 6. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígenos del mismo, en donde el anticuerpo se une específicamente a IP-10 y comprende: (a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen de línea germinal V humano seleccionado a partir del grupo que consiste de un gen VH 3-33, un gen VH 3-30.3 humano, un gen VH 5-51 humano y un gen VH 4-61 humano; y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen de línea germinal Vk humano seleccionado a partir del grupo que consiste de un gen V? A27 humano, un gen V? L15 humano, un gen V? L6 humano y un gen V? L18 humano.
  7. 7. El anticuerpo de la reivindicación 6, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen VH 3-33 humano; y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen de línea germinal Vk humano seleccionado del grupo que consiste de un gen Vk A27 humano, un gen Vk L15 humano y un gen Vk L6 humano.
  8. 8. El anticuerpo de la reivindicación 7, el cual comprende una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen Vk A27 humano.
  9. 9. El anticuerpo de la reivindicación 7, el cual comprende una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen Vk L15 humano .
  10. 10. El anticuerpo de la reivindicación 7, el cual comprende una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen Vk L6 humano.
  11. 11. El anticuerpo de la reivindicación 6, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen VH 3-30.3 humano; y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk L6 humano.
  12. 12. El anticuerpo de la reivindicación 6, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 5-51; y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen Vk L18 humano.
  13. 13. El anticuerpo de la reivindicación 6, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen VH 4-61; y (b) una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen Vk A27 humano.
  14. 14. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 4-13, en donde el IP-10 es IP-10 humano.
  15. 15. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígenos del mismo, que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 ; y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 , en donde: (a) la secuencia CDR3 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC DE IDENT. NOS.: 24-34, y modificaciones conservadoras del mismo, (b) la secuencia CDR3 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de las SEC DE IDENT. NOS.: 73-83, y modificaciones conservadoras del mismo, (c) el anticuerpo se une específicamente a IP-10, y (d) el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales : (i) el anticuerpo inhibe el enlace de IP-10 a CXCR3 ; (ii) ei anticuerpo inhibe el flujo de calcio inducido por IP-10; (iii) el anticuerpo inhibe la migración celular inducida por IP-10; (iv) el anticuerpo reacciona cruzado con IP-10 de mono rhesus; (v) el anticuerpo no reacciona cruzado con IP-10 de ratón; (vi) el anticuerpo no reacciona cruzado con MIG humano ; (vii) el anticuerpo no reacciona cruzado con ITAC humano.
  16. 16. El anticuerpo de la reivindicación 15, en donde la secuencia CDR2 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC. DE IDENT NOS.: 13-23, y modificaciones conservadoras del mismo, y la secuencia CDR2 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC DE IDENT. NOS.: 62-72, y modificaciones conservadoras del mismo.
  17. 17. El anticuerpo de la reivindicación 16, en donde la secuencia CDRl de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC DE IDENT. NOS.: 1-12, y modificaciones conservadoras del mismo; y la secuencia CDRl de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de las SEC DE IDENT. NOS.: 51-61 y modificaciones conservadoras del mismo.
  18. 18. El anticuerpo de la reivindicación 15, el cual es un anticuerpo humano.
  19. 19. El anticuerpo de la reivindicación 15, el cual es un anticuerpo humanizado o quimérico.
  20. 20. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde: (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 35-46, (b) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 84-94, (c) el anticuerpo se une específicamente a IP-10, y (d) el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales: (i) el anticuerpo inhibe el enlace de IP-10 a CXCR3 ; (ii) el anticuerpo inhibe el flujo de calcio inducido por IP-10; (iii) el anticuerpo inhibe la migración celular inducida por IP-10; (iv) el anticuerpo reacciona cruzado con IP-10 de mono rhesus; (v) el anticuerpo no reacciona cruzado con IP-10 de ratón; (vi) el anticuerpo no reacciona cruzado con MIG humano ; (vii) el anticuerpo no reacciona cruzado con ITAC humano .
  21. 21. El anticuerpo de la reivindicación 20, el cual es un anticuerpo humano.
  22. 22. El anticuerpo de la reivindicación 20, el cual es un anticuerpo humanizado o quimérico.
  23. 23. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígenos del mismo, que comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 1-12; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 13-23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 24-34; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 51-61; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 62-72; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 73-83; en donde el anticuerpo une específicamente a IP-10.
  24. 24. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 1; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 13; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 24; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 51; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 62; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 73.
  25. 25. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 2; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 14; (c) una CDR3 de región variable de • cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 25; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT . NO.: 52; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 63; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 74.
  26. 26. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 3 ; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 15; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 26; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 53; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 64; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 75.
  27. 27. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 4; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 16; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 27; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 54; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 65; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 76.
  28. 28. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 5; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 17; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 28; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 55; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 66; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 77.
  29. 29. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 6 ,- (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 18; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 29; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 56; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 67; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 78.
  30. 30. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 7; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 19; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 30; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 57; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 68; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 79.
  31. 31. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 8; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 20; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 31; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 58; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 69; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 80.
  32. 32. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 9; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 21; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 32; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 59; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 70; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 81.
  33. 33. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 10 u 11; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 22; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 33; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 60; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO. : 71; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 82.
  34. 34. El anticuerpo de la reivindicación 23, el cual comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 12; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 34; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 61; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 72; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC DE IDENT. NO.: 83.
  35. 35. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígenos del mismo, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 35-46; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 84-94; en donde el anticuerpo se une específicamente a IP-10.
  36. 36. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 35; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 84.
  37. 37. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO . : 36; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 85.
  38. 38. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 37; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT . NO. : 86.
  39. 39. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 38; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 87.
  40. 40. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 39; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 88.
  41. 41. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 40; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 89.
  42. 42. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 41; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 90.
  43. 43. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 42; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 91.
  44. 44. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 43; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 92.
  45. 45. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 44 Ó 45; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 93.
  46. 46. El anticuerpo de la reivindicación 35, el cual comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 46; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE IDENT. NO. : 94.
  47. 47. Un anticuerpo humano aislado, o una porción de enlace de antígenos del mismo, que compite para el enlace a IP-10 con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-46.
  48. 48. Una composición que comprende el anticuerpo, o una porción de enlace de antígenos del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-46, y un portador farmacéuticamente aceptable .
  49. 49. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo, o una porción de enlace de antígenos del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-46 unidas a un agente terapéutico.
  50. 50. El inmunoconjugado de la reivindicación 49, en donde el agente terapéutico es una citotoxina.
  51. 51. El inmunoconjugado de la reivindicación 49, en donde el agente terapéutico es un isótopo radioactivo.
  52. 52. Una composición que comprende el inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 49-51 y un portador farmacéuticamente aceptable.
  53. 53. Una molécula biespecífica que comprende el anticuerpo, o una porción de enlace de antígenos de la misma, o cualquiera de las reivindicaciones 1-46, unidas a una segunda porción funcional que tiene una especificidad de enlace diferente que el anticuerpo, o la porción de enlace de antígenos del mismo.
  54. 54. Una composición que comprende la molécula biespecífica de la reivindicación 53 , y un portador farmacéuticamente aceptable.
  55. 55. Una molécula del ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo, o una porción de enlace de antígenos del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-46.
  56. 56. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 55.
  57. 57. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 56.
  58. 58. Un ratón transgénico que comprende transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en donde el ratón expresa el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-46.
  59. 59. Un hibridoma preparado a partir del ratón de la reivindicación 58, en donde el hibridoma produce tal anticuerpo .
  60. 60. Un método para inhibir una respuesta inflamatoria o autoinmune mediada por células T activadas o células NK que comprenden poner en contacto las células T o la células NK con el anticuerpo, o una porción de enlace de antígenos del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-46, de manera que la respuesta inflamatoria o autoínmune se inhibe .
  61. 61. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria o autoinmune en un sujeto con necesidad del tratamiento que comprende administrar al sujeto el anticuerpo, o porción de enlace de antígenos del mismo, o cualquiera de las reivindicaciones 1-46, de manera que la enfermedad inflamatoria o autoinmune en el sujeto se trata.
  62. 62. El método de la reivindicación 61, en donde la enfermedad es esclerosis múltiple.
  63. 63. El método de la reivindicación 61, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria de los intestinos (por ejemplo, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn), lupus eritematoso sistémico, diabetes del Tipo 1, trastornos inflamatorios de la piel (por ejemplo, psoriasis, liquen plano), enfermedad autoinmune de la tiroides (por ejemplo, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto), síndrome de Sjogren, inflamación pulmonar (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, sarcoidosis pulmonar, alveolitis linfocítica) , rechazo de transplante, daño de médula espinal, daño cerebral (por ejemplo, apoplejía), enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson), gingivitis, inflamación inducida por terapia genética, enfermedades de angiogénesis, enfermedad inflamatoria del riñon (por ejemplo, neuropatía IgA, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis rápidamente progresiva) y aterosclerosis.
  64. 64. Un método para tratar una infección viral o bacteriana que implica actividad IP-10 indeseada en un sujeto con necesidad del tratamiento que comprende administrar al sujeto el anticuerpo, o una porción de enlace de antígenos del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-46, de manera que la infección viral o bacteriana en el sujeto se trata.
  65. 65. El método de la reivindicación 64, en donde la infección viral se media por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de hepatitis C (VHC) , virus del herpes simple Tipo I (VHS-1) o el virus del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS) .
  66. 66. Un método para preparar un anticuerpo anti-IP- 10, que comprende: (a) proporcionar: (i) : una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia CDRl seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 1-12, una secuencia CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 13-23 y/o una secuencia CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de 'las SEC DE IDENT. NOS.: 24-34; y (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia CDRl seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 51-61, una secuencia CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 62-72 y/o una secuencia CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC DE IDENT. NOS.: 73-83; (b) alterar al menos un residuo aminoácido dentro de al menos una secuencia de anticuerpos de región variable, la secuencia se selecciona de la secuencia de anticuerpos de región variable de cadena pesada y la secuencia de anticuerpos de región variable de cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpos alterada; y (c) expresar la secuencia de anticuerpos alterada como una proteína .
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