DE112014004537T5 - Tiermodelle und therapeutische Moleküle - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung offenbart Verfahren zur Erzeugung von chimären human-nichthumanen Antikörpern und chimären Antikörperketten, wobei so produzierte Antikörper und Antikörperketten und Derivate davon vollständig humanisierte Antikörper einschließen; Zusammensetzungen, welche die Antikörper, Antikörperketten und Derivate umfassen, sowie Zellen, nicht-humanen Säugetieren und Vektoren, die zur Verwendung in den Verfahren geeignet sind.

Description

  • Hintergrund
  • Die vorliegende Erfindung betrifft unter anderem nicht-humane Tiere und Zellen, welche ausgestaltet sind, um exogene DNA, wie humane Immunglobulin-Gen-DNA zu enthalten, ihre Verwendung in der Medizin und der Untersuchung von Krankheiten, Verfahren zur Herstellung nicht-humaner Tiere und Zellen sowie durch solche Tiere produzierte Antikörper und Antikörperketten und Derivate davon.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Alle Nukleotidkoordinaten für die Maus sind diejenigen, entsprechend NCBI m37 für den Maus-C57BL/6J-Stamm, z. B. April 2007 ENSEMBL Release 55.37h, z. B. NCBI37 Juli 2007 (NCBI Build 37) (z. B. UCSC Version mm9, siehe World Wide Web (www) genome.ucsc.edu und World Wide Web (www) genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html), außer es ist anderweitig angegeben. Humane Nukleotidkoordinaten sind jene, entsprechend GRCh37 (z. B. UCSC Version hg 19, World Wide Web (www) genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html), Feb 2009 ENSEMBL Release 55.37, oder sind jene, die NCBI36, Ensemble Release 54, entsprechen, außer es ist anderweitig angegeben. Ratten-Nukleotide sind jene, entsprechend RGSC 3.4 Dec 2004 ENSEMBL Release 55.34w oder Baylor College of Medicine HGSC v3.4 Nov 2004 (z. B. UCSC rn4, siehe World Wide Web (www) genome.ucsc.edu und World Wide Web (www) genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html), außer anderweitig angegeben. Die Bezugnahme auf Arbeiten in Mäusen hierin ist lediglich beispielartig und die Bezugnahme auf Mäuse versteht sich als einschließlich einer Bezugnahme auf alle nicht-humanen Säugetiere, außer es ist anderweitig aus der Offenbarung ersichtlich, wobei Mäuse als das nicht-humane Säugetier bevorzugt werden.
  • Die Offenbarungen von US2012/0204278 und PCT/GB2013/050682 sind hierin durch den Bezug darauf einbezogen. Alle in US2012/0204278 und PCT/GB2013/050682 offenbarten Definitionen sind speziell und ausdrücklich hierin offenbart.
  • Die Bezugnahme auf humane Gensegmente hierin beinhaltet sowohl die humane Keimbahngensegment-Sequenz oder die rekombinierte Form des Gensegments, das ein oder mehrere Mutationen relativ zur humanen Keimbahngensegment-Sequenz einschließen kann, zum Beispiel Allele, die in der IMGT-Datenbank und ”1000 Genomes”-Datenbank sowie in WO2013041844 offenbart sind (wobei solche Allele und deren Sequenzen hierin durch den Bezug darauf ausdrücklich einbezogen sind).
  • Alle hierin bezeichneten Gensegmente können unter Verwendung von standardmäßiger Sequenzanalyse durch Vergleich zu humanen Keimbahngensegment-Sequenzen, gegebenenfalls unter Bezugnahme auf die öffentlichen Sequenzdatenbanken, wie die IMGT oder ”1000 Genomes”-Datenbank, identifiziert werden.
  • In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder Zelle, dessen bzw. deren Genom humane VH-, D- und JH-Gensegmente stromaufwärts einer konstanten Region an einem Schwerkettelocus und/oder humane VL- und JL-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente funktionsfähig verbunden sind mit der Konstantregion davon, so dass das Wirbeltier oder die Zelle zum Exprimieren von Immunglobulin-Schwerketten und/oder -Leichtketten, umfassend humane VH- bzw. VL-Domänen, imstande ist, wobei der Schwerkettelocus ein humanes 01-Allel-VH-Gensegment umfasst, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen D- und JH-Gensegment unter Erzeugung einer VH-Domäne, wobei der Leichtkettelocus ein humanes 01-Allel-VL-Gensegment umfasst, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen JL-Gensegment unter Erzeugung einer VL-Domäne, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Schwer- und/oder Leichtketten exprimiert.
  • Wie in den nachstehenden Beispielen weiter erläutert, haben die Erfinder überraschend gezeigt, dass humane 01-Allele verwendet werden können, um antigenspezifische Bindungsstellen herzustellen, wobei diese in einem nicht-humanen Wirbeltier zweckdienlich rekombiniert werden, junktionale und somatische Mutationen aufzeigen und zweckdienlich exprimiert und isoliert werden können.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier oder Zelle (z. B. eine Mauszelle oder Rattenzelle), dessen bzw. deren Genom umfasst (a) humanes JH2*01 und/oder humanes JH6*01 oder JH6*02 und/oder JH3*02, ein oder mehrere humane VH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und/oder (b) humanes Jκ2*01 und/oder humanes Jκ4*01 und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig verbunden sind mit der Konstantregion davon, so dass das Wirbeltier oder die Zelle zum Herstellen einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette und eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH2*01- und/oder JH6*01- oder JH6*02-Segments und/oder JH3*02 mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert wird und die Leichtkette durch Rekombination des humanen Jκ2*01- und/oder Jκ4*01-Segments mit einem Vκ-Segment produziert wird. In einem Beispiel umfasst das Genom humanes JH2*01. In einem Beispiel umfasst das Genom humanes JH2*01 und JH6*01. In einem Beispiel umfasst das Genom humanes JH2*01, JH6*01 und JH3*02. In einem Beispiel umfasst das Genom humanes JH6*01. In einem Beispiel umfasst das Genom humanes JH6*01 und JH3*02. In einem Beispiel umfasst das Genom humanes JH3*02. In einem Beispiel wird die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH2*01-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert. In einem Beispiel wird die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH6*01-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert. In einem Beispiel wird die Schwerkette produziert durch Rekombination des humanen JH6*02-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment. In einem Beispiel wird die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH3*02-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein nicht-humanes Wirbeltier, dessen Genom (i) humanes JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 und/oder JH6*01 oder JH6*02, ein oder mehrere humane VH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und/oder (ii) humanes Jκ1*01, Jκ2*01, Jκ3*01, Jκ4*01 und/oder Jκ5*01 und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass das Wirbeltier oder die Zelle zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette und/oder eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH1*01-, JH2*01, JH3*02-, JH4*02-, JH5*02- und/oder JH6*01 oder JH6*02-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert wird, und die Leichtkette durch Rekombination des humanen Jκ1*01-, Jκ2*01-, Jκ3*01-, Jκ4*01- und/oder Jκ5*01-Segments mit einem Vκ-Segment produziert wird. In einem Beispiel umfasst das Genom humanes JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 und JH6*01. In einem Beispiel umfasst das Genom humanes JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 und JH6*02. In einem Beispiel wird die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH2*01-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert. In einem Beispiel wird die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH6*01-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert. In einem Beispiel wird die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH6*02-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert. In einem Beispiel wird die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH3*02-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert. Zusätzlich oder alternativ zu diesen Schwerkette-Beispielen, wird in einem Beispiel die Leichtkette durch Rekombination des humanen Jκ2*01-Segments mit einem Vκ-Segment produziert.
  • In einer Ausführungsform umfasst das nicht-humane Wirbeltier ferner ein oder mehrere der VH-Gensegmente und/oder ein oder mehrere der D-Gensegmente aus der Tabelle 7 und/oder ein oder mehrere Vκ-Gensegmente aus der Tabelle 12. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das nicht-humane Wirbeltier ferner die VH-Gensegmente und D-Gensegmente aus der Tabelle 3 und/oder die Vκ-Gensegmente aus Tabellle 10 oder 11.
  • Von den hierin beschriebenen Segmenten haben die Erfinder identifiziert, dass sie in breitem Umfang und in hohem Maße quer über diverse humane ethnische Populationen hinweg benutzt werden, und daher für Antikörpererzeugung und Effektivität in Menschen im Allgemeinen weithin toleriert werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein nicht-humanes Wirbeltier oder eine nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Mauszelle oder Rattenzelle), dessen bzw. deren Genom ein oder mehrere humane VH-Gensegmente, ein oder mehrere humane JH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und ein oder mehrere humane JL-Gensegmente und ein oder mehrere humane VL-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass das Wirbeltier oder die Zelle zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette und eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei das eine oder die mehreren humanen VH-Gensegmente des Schwerkettelocus ein, mehrere oder alle der humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 und VH3-9*01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein nicht-humanes Wirbeltier oder eine nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Mauszelle oder Rattenzelle), dessen bzw. deren Genom ein oder mehrere humane VH-Gensegmente, ein oder mehrere humane JH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und ein oder mehrere humane Jκ-Gensegmente und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass das Wirbeltier oder die Zelle zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette und eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei die ein oder mehreren humanen Vκ-Gensegmente ein, mehrere oder alle der humanen Vκ-Gensegmente, ausgewählt aus der aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein nicht-humanes Wirbeltier oder eine nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Mauszelle oder Rattenzelle), dessen bzw. deren Genom humanes JH2*01 und/oder humanes JH6*02, ein oder mehrere humane VH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und/oder humanes Jκ2*01 und/oder humanes Jκ4*01 und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass die Zelle oder das Wirbeltier zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette und eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH2*01- und/oder JH6*02-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert wird und/oder die Leichtkette durch Rekombination des humanen Jκ2*01- und/oder Jκ4*01-Segments mit einem Vκ-Segment produziert wird;
    wobei das eine oder die mehreren humanen VH-Gensegmente des Schwerkettelocus ein, mehrere oder alle der humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 und VH3-20*d01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen, und/oder
    wobei das eine oder die mehreren humanen Vκ-Gensegmente ein, mehrere oder alle der humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen.
  • Wahlweise handelt es sich bei einer Bezugnahme auf ein humanes Gensegment hierin um die rekombinierte Form des Gensegments.
  • Wie in den nachstehenden Beispielen weiter erläutert, haben die Erfinder überraschend gezeigt, dass Schwer- und/oder Leichtketten, produziert gemäß der Erfindung, zum Herstellen antigenspezifischer Bindungsstellen verwendet werden können, wobei diese in einem nicht-humanen Wirbeltier zweckdienlich rekombiniert werden, junktionale und somatische Mutationen aufzeigen und zweckdienlich exprimiert und isoliert werden können.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder Zelle, dessen bzw. deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgelenkte Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in ein oder mehrere endogene Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion umfasst, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente ausgewählt werden aus einem, mehreren oder allen der Segmente der Tabelle 18 und durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers oder der Zelle bereitgestellt wurden, wobei das Wirbeltier Immunglobulin-Leichtketten umfasst, umfassend Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten), oder die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Immunglobulin-Leichtketten exprimiert, wobei die Lambda-Leichtketten Immunglobulin-Leichtketten umfassen, die Lambda-Variabelregionen-Rekombinanten von einem, mehreren oder allen der humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente der Tabelle 18 umfassen.
  • Endogene Leichtkette-Inaktivierung & Hohe Expression von humanen Lambda-Variabelregionen in transgenen nicht-humanen Wirbeltieren & Zellen
  • Wie in den nachstehenden Beispielen weiter erläutert, haben die Erfinder überraschend sehr hohe Expressionsniveaus von Leichtketten, umfassend humane Lambda-Variabelregionen (wenigstens 70 oder 80% humane V-lambda), aus transgenen Leichtketteloci beobachtet, die durch zielgerichtete Insertion von humanen Lambda-Gensegmenten in endogene nicht-humane Wirbeltier-Leichtketteloci produziert werden. Dies ist sogar in Anwesenheit von endogenen nicht-humanen Wirbeltier-V- und -J-Gensegmenten im Wirbeltiergenom möglich. Ebenfalls werden die überraschend hohen Niveaus der Expression erzielt, wenn die Insertion humaner Lambda-Gensegmente in dem endogenen Kappa- oder Lambda-Locus erfolgt. Solche hohen Niveaus vermittels zielgerichteter Insertion sind im Stand der Technik bislang noch nicht veröffentlicht worden.
  • Zudem beobachteten die Erfinder überraschenderweise, dass endogene Kappa-Kette-Expression vollständig durch zielgerichtete Insertion von humaner Lambda-Gensequenz in den endogenen Kappa-Locus inaktiviert werden kann, wie es in den Beispielen weiter erläutert ist.
  • Die zielgerichtete Insertion von humanen Gensegmenten in endogene Ig-Loci ist vorteilhaft, weil sie die funktionsfähige Lokalisierung von inserierten humanen Ig-Sequenzen in Bezug auf endogene Ig-Konstantregionen und endogene Steuerungsregionen, wie zum Beispiel Enhancern und anderen Locus-Steuerungsregionen, ermöglicht. Daher ermöglicht es die zielgerichtete Insertion, endogene Steuerung zu nutzen, die bei einem oder mehreren von Ig-Gensegment-Rekombination, allelischer Exklusion, Affinitätsreifung, Klassen-Switching, Ig-Expression-Niveaus und wünschenswerter Entwicklung des B-Zellkompartiments wichtig ist. Als solches ist zielgerichtete Insertion früheren Ansätzen im Stand der Technik zum Erzeugen transgener Ig-Loci und Expression überlegen, wobei diese Ansätze auf der Einbringung von Vektoren, wie humane Ig-Gensegmente tragenden YACs, in nicht-humane Wirbeltierzellen beruhten. YACs werden zufallsmäßig in das Wirbeltierzellgenom integriert, so dass es schwierig ist, die durch zielgerichtete Insertion bereitgestellte Steuerung und die Begleitvorteile, welche mit Bezug auf die Nutzung endogener Steuerungs- bzw. Kontrollmechanismen wahrgenommen werden, zu erreichen. Darüber hinaus führt eine zufallsmäßige Insertion oft dazu, dass die inserierten humanen Ig-Gensegmente unter die Steuerung von heterologen Steuerelementen und/oder epigenetischen chromosomalen Modifikationen, wie Methylierung und Chromatin-Konformationen, geraten, von denen jegliches in Hinsicht auf zweckdienliche Ig-Gensegmentrekombination, allelische Exklusion, Affinitätsreifung, Klassen-Switching, Niveaus der Ig-Expression und wünschenswerte Entwicklung des B-Zellkompartiments abträglich sein kann. Eine zufallsmäßige Insertion führt typischerweise dazu, dass 2 oder mehr Kopien des eingebrachten Transgens vorliegen, was chromosomale Instabilität verursachen kann und deshalb zu einer ungünstigen Nachzucht-Leistung der Tiere führt, zusätzlich zu abträglichen Auswirkungen auf zweckdienliche Ig-Gensegment-Rekombination, allelische Exklusion, Affinitätsreifung, Klassen-Switching, Ig-Expression-Niveaus und wünschenswerte Entwicklung des B-Zell-Kompartiments. Somit hatten Ansätze des Stands der Technik unter Verwendung zufallsmäßiger Insertion die Tendenz, zu ungünstiger B-Zell-Entwicklung, relativ kleinen B-Zell-Kompartimenten und niedrigerer Ig-Expression und einhergehender Schwierigkeit beim Isolieren eines Antikörpers mit einer gewünschten Charakteristik zu führen.
  • Die Erfindung stellt daher die folgenden Aspekte bereit:-
  • Expression humaner Lambda-Variabel-Regionen
  • Jede Ausführungsform der hierin offenbarten Erfindung kann mit einem spezifischen Lambda-Allel, offenbart in Tabelle 18, oder jedweder Kombination davon, in die Praxis umgesetzt werden. Falls hierin Gensegmente ohne Bezugnahme auf ein spezielles Allel aufgeführt sind, kann es sich bei diesen gegebenenfalls um die speziellen Allele handeln, die in einer beliebigen der Tabellen 1 bis 18 offenbart sind.
    • 1. Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in ein oder mehrere endogene Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion umfasst, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers bereitgestellt wurden, wobei das Wirbeltier Immunoglobulin-Leichtketten, umfassend Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten) exprimiert, wobei die Lambda-Leichtketten Immunoglobulin-Leichtketten umfassen, die aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitete Lambda-Variabelregionen umfassen.
  • Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in ein oder mehrere endogene Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion umfasst, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers bereitgestellt wurden, wobei das Wirbeltier Immunoglobulin-Leichtketten, umfassend Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten) exprimiert, und wobei wenigstens 70 oder 80% der Variabelregionen der von dem Wirbeltier exprimierten Lambda-Leichtketten abgeleitet sind aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten. Dies wird in den nachstehenden Beispielen verdeutlicht.
  • Zum Beispiel sind wenigstens 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99% oder 100% der Variabelregionen der von dem Wirbeltier exprimierten Lambda-Leichtketten aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet. Dies wird in den nachstehenden Beispielen verdeutlicht.
  • In Ausführungsformen wird bereitgestellt
  • Eine nicht-humane Wirbeltier-ES-Zelle (z. B. eine Maus-ES-Zelle oder Ratten-ES-Zelle), deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire umfasst, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in einen oder mehrere endogene Ig-Loci, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion umfasst, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus der Wirbeltierzelle bereitgestellt wurden, wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das Immunoglobulin-Leichtketten, umfassend Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten) exprimiert, wobei die Lambda-Leichtketten Immunoglobulin-Leichtketten umfassen, die Lambda-Variabelregionen umfassen, welche aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet sind.
  • Eine nicht-humane Wirbeltier-ES-Zelle (z. B. eine Maus-ES-Zelle oder Ratten-ES-Zelle) deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire umfasst, produziert durch zielgerichtete Insertion humaner Ig-Gensegmente in einen oder mehrere endogene Ig-Loci, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion umfasst, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus der Wirbeltierzelle bereitgestellt wurden, wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das Immunglobulin-Leichtketten, umfassend Lambda-Variabelregionen, (Lambda-Leichtketten) exprimiert, und wobei wenigstens 70 oder 80% (zum Beispiel wenigstens 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99% oder 100%) der Variabelregionen der von dem Wirbeltier exprimierten Lambda-Leichtketten aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet sind.
  • In einem Beispiel wird überraschend eine Expression von Immunglobulin-Leichtketten, umfassend Lambda-Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten, erzielt, sogar wenn das Genom endogene nicht-humane Wirbeltier-Lambda-Variabelregion-Gensegmente (z. B. endogene Vλ- und/oder Jλ-Gensegmente, gegebenenfalls ein komplettes endogenes Repertoire von Vλ- und Jλ-Gensegmenten) umfasst. So umfasst, in einem Beispiel, das Genom endogene nicht-humane Wirbeltier-Lambda-Variabelregion-Gensegmente (z. B. endogene Vλ- und/oder Jλ-Gensegmente, gegebenenfalls ein komplettes endogenes Repertoire von Vλ- und Jλ-Gensegmenten). In einem anderen Beispiel sind solche endogenen Gensegmente bei dem Genom abwesend.
    • 2. Das Wirbeltier oder die Zelle von Aspekt 1, wobei gegebenenfalls die humane Vλ- und Jλ-Insertion wenigstens die funktionellen humanen V- und J-Gensegmente (gegebenenfalls auch humanes Cλ) umfasst, die von einem humanen Lambdakette-Ig-Locus von Vλ2-18 bis Cλ7 beinhaltet sind. In einem Beispiel umfasst die Insertion auch Lambda-Intergen-Segmentsequenzen. Diese sind humane Sequenzen oder sie können Sequenzen von der nicht-humanen Wirbeltierspezies sein (falls z. B. das Wirbeltier eine Maus ist, können Sequenzen zwischen entsprechenden Maus-Lambda-Gensegmenten verwendet werden).
  • In einer Ausführungsform sind die V- und J-Gensegmente die Allele der Tabelle 18. In einer weiteren Ausführungsform sind die Cλ-Gensegmente die Allele, die in der Tabelle 18 offenbart sind.
    • 3. Das Wirbeltier oder die Zelle von Aspekt 1 oder 2, wobei gegebenenfalls das Genom homozygot für die humane Vλ- und Jλ-Gensegmentinsertion ist und die endogene Kappakette-Expression in dem Wirbeltier im wesentlichen oder komplett inaktiv ist. In einem Beispiel werden weniger als 10, 5, 4, 3, 2, 1 oder 0,5% Leichtketten durch endogene Kappa-Ketten (d. h., Kappa-Ketten, deren Variabelregionen abgeleitet sind aus der Rekombination nicht-humaner Wirbeltier-V- und J-Gensegmente) bereitgestellt.
    • 4. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei gegebenenfalls der endogene Locus ein endogener Kappa-Locus ist.
    • 5. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei gegebenenfalls der endogene Locus ein endogener Lambda-Locus ist. ≥ 60% aller Leichtketten weisen humane Lambda-V-Regionen auf.
    • 6. Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in einen oder mehrere endogene Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom (i) humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente bereitgestellt wurden durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers, und (ii) Kappa-V-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion umfasst, wobei das Wirbeltier Immunglobulin-Leichtketten, umfassend humane Lambda-Variabelregionen (humane Lambda-Leichtketten) exprimiert, und wobei wenigstens 60% der von dem Wirbeltier exprimierten Leichtketten von den humanen Lambda-Leichtketten bereitgestellt werden. Dies wird in den nachstehenden Beispielen verdeutlicht.
  • Zum Beispiel werden wenigstens 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99% oder 100% der vom Wirbeltier exprimierten Leichtketten durch die humanen Lambda-Leichtketten bereitgestellt. Zum Beispiel werden wenigstens 84% der vom Wirbeltier exprimierten Leichtketten durch die humanen Lambda-Leichtketten bereitgestellt. Zum Beispiel werden wenigstens 95% der vom Wirbeltier exprimierten Leichtketten durch die humanen Lambda-Leichtketten bereitgestellt. Dies wird in den nachstehenden Beispielen verdeutlicht.
  • In einer Ausführungsform wird eine nicht-humane Wirbeltier-ES-Zelle (z. B. eine Maus-ES-Zelle oder Ratten-ES-Zelle) vorgesehen, deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgerichtete Insertion humaner Ig-Gensegmente in einen oder mehrere endogene Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom (i) humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente bereitgestellt wurden durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers, und (ii) kappa-V-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion umfasst, wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das Immunglobulin-Leichtketten umfassend humane Lambda-Variabelregionen (humane Lambda-Leichtketten) exprimiert, und wobei wenigstens 60% der vom Wirbeltier exprimierten Leichtketten durch die humanen Lambda-Leichtketten bereitgestellt werden.
    • 7. Nicht-humanes Wirbeltier oder nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Maus, Ratte, Mauszelle oder eine Rattenzelle), dessen bzw. deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgerichtete Insertion humaner Ig-Gensegmente in einen oder mehrere endogene Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom eine zielgerichtete Insertion humaner Immunglobulin-Vλ- und Jλ-Gensegmente in einen endogenen nicht-human-Wirbeltier-Leicht-Kappa- oder Lambdakettelocus stromabwärts der endogenen VL- und JL-Gensegmente zur Expression von Leichtketten umfasst, die humane Lambda-Variabelregionen umfassen; wobei die humane Vλ- und Jλ-Insertion wenigstens die funktionellen humanen V- und J-(und gegebenenfalls auch funktionelle humane Cλ-)Gensegmente umfasst, die von einem humanen Lambdakette-Ig-Locus von Vλ2-18 bis Cλ7 beinhaltet sind.
  • Wie in den Beispielen gezeigt, ist die endogene Leichtketteexpression von dem Locus aus inaktiviert, und zudem überwiegt humane Lambda-Variabelregion-Expression gegenüber endogener Lambda-Variabelregion-Expression.
  • Mit ”stromabwärts” ist eine Lage 3' von den Gensegmenten auf demselben Chromosom gemeint. In einem Beispiel werden die endogenen V- und J-Gensegmente in Bezug auf die humanen Gensegmente invertiert und gegebenenfalls aus dem endogenen Leichtkettelocus heraus verschoben. In einem Beispiel sind die humanen Gensegmente stromabwärts von allen der endogenen V- und J-Segmente des Kappa- oder Lambda-Locus. Die Möglichkeit des Beibehaltens der endogenen V-J Sequenzen und intergenischen Sequenzen ist vorteilhaft, da eingebettete Steuerregionen und/oder Gene beibehalten werden, was in dem Wirbeltier wünschenswert sein kann.
  • Gegebenenfalls umfasst die Insertion auch Lambda-Intergen-Segmentsequenzen. Diese sind humane Sequenzen oder sie können Sequenzen der nicht-humane Wirbeltierspezies sein (falls z. B. das Wirbeltier eine Maus ist, können Sequenzen zwischen entsprechenden Maus-Lambda-Gensegmenten verwendet werden).
  • Expression von VJCλ-Lambda-Ketten
    • 8. Ein nicht-humanes Wirbeltier oder eine nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Maus, Ratte, Mauszelle oder eine Rattenzelle), dessen bzw. deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire umfasst, produziert durch zielgerichtete Insertion humaner Ig-Gensegmente in einen oder mehrere endogene Ig-Loci, wobei das Genom umfasst eine zielgerichtete Insertion humaner Immunglobulin-Vλ-, Jλ- und Cλ-Gene in einen endogenen nicht-human-Wirbeltier-Kappa- oder Lambda-Leichtkettelocus stromaufwärts einer endogenen nicht-human-Wirbeltier-Kappa oder -Lambda-Konstantregion zur Expression einer humanen VJC-Leichtkette; wobei gegebenenfalls die humane VJC-Insertion wenigstens die funktionellen humanen V-, J- und C-Gensegmente umfasst, die von einem humanen Lambdakette-Ig-Locus von Vλ3-1 bis Cλ7 beinhaltet sind (z. B. beinhaltet von einem humanen Lambdakette-Ig-Locus von 2-18 bis Cλ7).
  • In einer Ausführungsform sind die V- und J-Gensegmente die Allele der Tabelle 18. In einer weiteren Ausführungsform sind die Cλ-Gensegmente die in der Tabelle 18 offenbarten Allele.
  • Wie in den Beispielen gezeigt, überwiegt humane Lambda-Variable-Region-Expression gegenüber endogener Kappa-Variable-Region-Expression. Die endogene Kappa-Kette-Expression vom endogenen Locus aus kann inaktiviert sein.
  • Gegebenenfalls umfasst die Insertion auch Lambda-Intergen-Segmentsequenzen. Diese sind humane Sequenzen oder sie können Sequenzen von der nicht-humanen Wirbeltierspezies sein (falls z. B. das Wirbeltier eine Maus ist, können Sequenzen zwischen entsprechenden Maus-Lambda-Gensegmente verwendet werden).
    • 9. Ein nicht-humanes Wirbeltier oder eine nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Maus, Ratte, Mauszelle oder eine Rattenzelle), dessen bzw. deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire umfasst, produziert durch zielgerichtete Insertion humaner Ig-Gensegmente in einen oder mehrere endogene Ig-Loci, wobei das Genom eine zielgerichtete Insertion von wenigstens den funktionellen humanen Vλ- und Jλ-(und gegebenenfalls humanen funktionellen Cλ-)Gensegmenten, die von einem humanen Lambdakette-Ig-Locus von Vλ3-1 bis Cλ7 beinhaltet sind (gegebenenfalls von Vλ2-18 bis Cλ7, ferner gegebenenfalls die speziellen Allele der Tabelle 18), in einen endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Kappa-Leichtkettelocus stromabwärts der Maus-Vκ und -Jκ-Gensegmente zur Expression einer eine humane Lambda-Variabelregion umfassenden Leichtkette umfasst, wobei in Gegenwart der Insertion die Expression endogener, von den Maus-Vκ und -Jκ-Gensegmenten abgeleiteten, Kappa-Leichtketten im wesentlichen oder komplett inaktiviert wird.
  • In einem Beispiel werden weniger als 10, 5, 4, 3, 2, 1 oder 0,5% Leichtketten durch endogene Kappa-Ketten bereitgestellt (d. h., Kappa-Ketten, deren Variabelregionen aus der Rekombination von nicht-humanen Wirbeltier-Vκ- und Jκ-Gensegmenten abgeleitet sind).
  • Gegebenenfalls umfasst die Insertion auch Lambda-Intergen-Segmentsequenzen. Diese sind humane Sequenzen oder sie können Sequenzen von der nicht-humanen Wirbeltierspezies sein (falls z. B. das Wirbeltier eine Maus ist, können Sequenzen zwischen entsprechenden Maus-Lambda-Gensegmente verwendet werden).
    • 10. Nicht-humanes Wirbeltier oder eine nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Maus, Ratte, Mauszelle oder eine Rattenzelle), wobei in dem Genom davon das Maus-IgK-VJ weg von dem Maus-Eκ-Enhancer bewegt wurde, wodurch endogene IgK-VJ-Regionen inaktiviert sind. Dies wird in den Beispielen gezeigt.
    • 11. Wirbeltier oder Zelle von Aspekt 10, wobei gegebenenfalls das IgK-VJ weg von dem Maus-Eκ-Enhancer bewegt wurde durch Insertion humaner VL- und JL-Gensegmente zwischen dem Maus IgK-VJ und dem Eκ-Enhancer; wobei gegebenenfalls die Insertion eine Insertion, wie zitiert in jedwedem vorangehenden Aspekt 1–9, oder eine Insertion von humanen Vκ- und Jκ-Gensegmenten ist.
    • 12. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei gegebenenfalls die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente innerhalb 100, 75, 50, 40, 30, 20, 15, 10 oder 5 kb von einem endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Leichtkette-Enhancer inseriert wurden. In einem Beispiel ist der Enhancer ein Lambda-Enhancer (z. B. Maus-Eλ2-4, Eλ4-10 oder Eλ3-1), wenn die Insertion in einen endogenen Lambda-Locus erfolgt. In einem Beispiel ist der Enhancer ein Kappa-Enhancer (z. B. iEκ oder 3'Eκ), wenn die Insertion in einen endogenen Kappa-Locus erfolgt.
    • 13. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei gegebenenfalls die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente in dem Genom durch die zielgerichtete Insertion von wenigstens 10 humanen Vλ-Gensegmenten mit humanen Jλ-Gensegmenten stromaufwärts einer endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Leichtkette-Konstantregion des Leichtkettelocus bereitgestellt werden. Zum Beispiel werden die humanen Gensegmente bereitgestellt durch Insertion wenigstens eines Abschnitts eines humanen Ig-Lambdakettelocus von Vλ2-18 bis Vλ3-1; oder wenigstens eines Abschnitts eines humanen Ig-Lambdakettelocus von Vλ2-18 bis Vλ3-1, inseriert mit Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 und Jλ7; oder wenigstens eines Abschnitts eines humanen Ig-Lambdakettelocus von Vλ2-18 bis Cλ7 (gegebenenfalls unter Ausschluss von Jλ4Cλ4 und/oder Jλ5Cλ5).
  • Gegebenenfalls werden wenigstens 2, 3, 4 oder 5 humane Jλ inseriert. In einer Ausführungsform sind die inserierten Jλs voneinander verschieden. Zum Beispiel werden humane Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 und Jλ7 inseriert, gegebenenfalls als Teil von jeweiligen humanen JλCλ-Clustern.
  • Gegebenenfalls wird ein humaner Leichtkette-Enhancer, z. B. Eλ, inseriert. Zum Beispiel erfolgt die Insertion von humanem Eλ zwischen den humanen Jλ-Segmenten und der endogenen Konstantregion; oder zwischen humanen Cλ-Gensegmenten (wenn diese inseriert werden) und der endogenen Konstantregion.
    • 14. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei gegebenenfalls die Lambda-Leichtketten ein Repertoire von humanen Lambda-Variabelregionen, abgeleitet von humanen Vλ-Gensegmenten Vλ3-1 und gegebenenfalls einem oder mehreren von Vλ2-18, Vλ3-16, V2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8 und Vλ4-3, bereitstellen, die im Genom durch zielgerichtete Insertion in den Leichtkettelocus bereitgestellt wurden.
  • Dies ist nützlich, weil Vλ3-1 ein sehr häufig verwendetes Lambda-Gensegment in Menschen ist (59; Ignatovich et al. 1997) und es daher wünschenswert ist, dass Zellen und Wirbeltiere der Erfindung den Einschluss von Lambda-Variabelregionen, basierend auf diesem Gensegment, zur Selektion gegen Antigen, insbesondere für die Entwicklung von Antikörpertherapeutika zum Gebrauch beim Menschen, vorsehen.
    • 15. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei optional die Lambda-Leichtketten ein Repertoire von humanen Lambda-Variabelregionen, abgeleitet von humanen Vλ-Gensegmenten Vλ2-14 und einem oder mehreren von Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 und Vλ3-1, bereitstellen, die im Genom durch zielgerichtete Insertion in den Leichtkettelocus bereitgestellt wurden.
  • Dies ist nützlich, weil Vλ2-14 ein sehr häufig verwendetes Lambda-Gensegment in Menschen ist und es daher wünschenswert ist, dass Zellen und Wirbeltiere der Erfindung den Einschluss von Lambda-Variabelregionen, basierend auf diesem Gensegment, zur Selektion gegen Antigen, insbesondere für die Entwicklung von Antikörpertherapeutika zum Gebrauch beim Menschen, vorsehen.
  • Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei optional die Lambda-Leichtketten ein Repertoire von humanen Lambda-Variabelregionen, abgeleitet von humanen Vλ-Gensegmenten Vλ2-8 und einem oder mehreren von Vλ2-18, Vλ3-16, V2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 und Vλ3-1, bereitstellen, die im Genom durch zielgerichtete Insertion in den Leichtkettelocus bereitgestellt wurden.
  • Dies ist nützlich, weil Vλ2-8 ein sehr häufig verwendetes Lambda-Gensegment in Menschen ist und es daher wünschenswert ist, dass Zellen und Wirbeltiere der Erfindung den Einschluss von Lambda-Variabelregionen, basierend auf diesem Gensegment, zur Selektion gegen Antigen, insbesondere für die Entwicklung von Antikörpertherapeutika zum Gebrauch beim Menschen, vorsehen.
  • Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei optional die Lambda-Leichtketten ein Repertoire von humanen Lambda-Variabelregionen, abgeleitet von humanen Vλ-Gensegmenten Vλ3-10 und einem oder mehreren von Vλ2-18, Vλ3-16, V2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ2-14, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 und Vλ3-1 1 bereitstellen, die im Genom durch zielgerichtete Insertion in den Leichtkettelocus bereitgestellt wurden.
  • Dies ist nützlich, weil Vλ3-10 ein sehr häufig verwendetes Lambda-Gensegment in Menschen ist und es daher wünschenswert ist, dass Zellen und Wirbeltiere der Erfindung den Einschluss von Lambda-Variabelregionen, basierend auf diesem Gensegment, zur Selektion gegen Antigen, insbesondere für die Entwicklung von Antikörpertherapeutika zum Gebrauch beim Menschen, bereitstellen.
    • 16. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei optional die humanen Vλ-Gensegmente das funktionelle Vλ umfassen, beinhaltet von einem humane Lambdakette-Ig-Locus von Vλ2-18 bis Vλ3-1.
  • Zum Beispiel umfassen die humanen Vλ-Gensegmente wenigstens humanes V-Gensegment Vλ3-1 oder wenigstens Segmente Vλ2-18, Vλ3-16, V2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 und Vλ3-1.
    • 17. Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei optional das Wirbeltier mehr Lambda-Ketten als Kappa-Ketten exprimiert. Lambda-Ketten umfassen Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination von Vλ- und Jλ-Gensegmenten – zum Beispiel exprimiert mit einer Lambda-Konstantregion. Kappa-Ketten umfassen Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination von Vκ- und Jκ-Gensegmente – zum Beispiel exprimiert mit einer Kappa-Konstantregion.
    • 18. Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei optional das Wirbeltier keine endogenen kappa-Ketten exprimiert. Zum Beispiel kann endogene Kappa-Kette-Expression inaktiviert sein durch beliebige von den hierin beschriebenen Verfahrensweisen, wie etwa durch Inversion der Gesamtheit oder eines Teils der endogenen Kappa-VJ-Region oder durch Insertion eines Markers (z. B. neo) oder einer sonstigen interferierenden bzw. störenden Sequenz in einem endogenen Kappa-Locus (einem Locus, der nicht humane Lambda-Gensegmente gemäß der Erfindung umfasst).
    • 19. Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei in dem Wirbeltier optional die Kappa-Kette-Expression im wesentlichen oder vollständig inaktiv ist. In einem Beispiel werden weniger als 10, 5, 4, 3, 2, 1 oder 0,5% Leichtketten durch Kappa-Ketten bereitgestellt.
    • 20. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei optional ein humaner Eλ-Enhancer in dem endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Locus inseriert ist. Zum Beispiel wird eine humane 5' MAR und humaner Eλ (und gegebenenfalls die humane 3' MAR) in Keimbahnkonfiguration inseriert. Zum Beispiel wird eine Sequenz entsprechend der humanen Lambda intronischen Region, unmittelbar 3' von humanem Jλ7-Cλ7, an und einschließlich wenigstens den humanen Eλ (und gegebenenfalls auch die humane 3' MAR) inseriert – gegebenenfalls einschließlich wenigstens 30 kb von intronischer Region 3' des humanen Eλ.
    • 21. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei gegebenenfalls wenigstens humane JC-Gensegmente Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 und Jλ7-Cλ7 inseriert sind, zusätzlich zu den anderen humanen Gensegmenten.
    • 22. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei gegebenenfalls die inserierten humanen Gensegmente in Keimbahnkonfiguration sind; gegebenenfalls mit den humanen Intergen-Segmentsequenzen oder den entsprechenden endogenen Intergen-Segmentsequenzen des nicht-humanen Wirbeltiers.
    • 23. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei gegebenenfalls ein endogener nicht-human-Wirbeltier-Leichtkette-Enhancer im endogenen Locus beibehalten wird; gegebenenfalls in Keimbahnkonfiguration. Wenn der endogene Locus zum Beispiel ein Kappa-Locus ist, wird ein endogener Kappa-Enhancer beibehalten. Hierbei kann es sich um den iEκ und/oder den 3'Ek, gegebenenfalls in Keimbahnkonfiguration hinsichtlich einer endogenen Leichtkette-Konstantregion, handeln. Dies kann zweckdienlich sein, um die Steuerung von Leichtkette-Expression in dem/der nicht-humanen Wirbeltier oder Zelle zu unterstützen.
    • 24. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei optional das Genom heterozygot ist für die humane Lambda-Insertion an dem endogenen Locus. Zum Beispiel heterozygot für die humane VJ- oder VJC-Insertion an einem endogenen Kappa(z. B. Maus- oder Ratte-kappa)-Locus. Dies unterstützt und vereinfacht die Nachzucht der Wirbeltiere, da der andere endogene Locus (z. B. der andere Kappa-Locus) verwendet werden kann zum Bereitstellen eines unterschiedlichen transgenen Ig-Locus, wie einem transgenen Kappa-Locus, umfassend humane Kappa-V- und -J-Gensegmente entweder stromaufwärts der endogenen Maus-Kappa-Konstantregion oder stromaufwärts einer Human-Kappa-Konstantregion. In diesem Fall können die Kappa-Enhancer (iEκ und/oder der 3'Eκ) in diesem Kappa-Locus beibehalten werden, um die Expression in dem Wirbeltier durch Nutzen endogener Kontrollmechanismen zu unterstützen.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier oder Zelle gemäß jeglichem vorangehenden Aspekt vorgesehen, wobei
    • (a) der endogene Locus ein endogener Lambda-Locus (z. B. in einer Maus) ist, das Genom heterozygot für die Insertion am Lambda-Locus ist, weshalb ein Allel des Lambda-Locus die humane Vλ- und Jλ-Gensegmentinsertion umfasst (gegebenenfalls mit der humanen Cλ-Gensegmentinsertion; gegebenenfalls mit der humanen Eλ-Insertion) wie oben beschrieben;
    • (b) das andere endogene Lambda-Allel eine Vielzahl von humanen Vκ-Gensegmenten und ein oder mehrere humane Jκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion (z. B. einer Kappa-Konstantregion der nicht-humanen Wirbeltierspezies; einer humanen Kappa-Konstantregion; der endogenen Lambda-Konstantregion; oder einer humanen Lambda-Konstantregion) umfasst; gegebenenfalls mit einem oder mehreren Kappa-Enhancern (z. B. iEκ und/oder dem 3'Eκ, z. B. von der nicht-humanen Wirbeltierspezies); und
    • (c) endogene Lambda- und Kappa-Kette-Expression inaktiviert worden ist.
  • Somit, gibt es keine Expression von Leichtketten, umfassend Variabelregionen abgeleitet aus der Rekombination von endogenen V- und J-Regionen, sondern es gibt die Expression von humanen Lambda- und humanen Kappa-Leichtketten aus den Allelen am endogenen Lambda-Locus. Dies ist nutzbringend, da die Gestaltung die Konstruktion und Zucht von Wirbeltiere erheblich unterstützt durch Vermeiden der Notwendigkeit der Bereitstellung transgener Loci an beiden, den endogenen Lambda- als auch Kappa-Loci. Der endogene Kappa-Locus (und somit endogene Kappa-Kette-Expression) kann durch Inversion, Deletion von Kappa-Gensegmenten (z. B. endogenen V- und/oder J- und/oder C-kappa) und/oder durch Insertion einer unterbrechenden Sequenz, wie einem Marker (z. B. neo), in den endogenen Kappa-Locus inaktiviert werden.
  • Die humane Kappa-Segment-Insertion in das endogene Lambda kann zum Beispiel durch Inserieren einer Sequenz, entsprechend einem Abschnitt von einem humanen Kappa-Locus, umfassend in Keimbahnkonfiguration alle funktionellen humanen Vκ und Jκ (d. h., gegebenenfalls unter Ausschluss von Pseudogenen und ORFs; Siehe die IMGT Datenbank); und gegebenenfalls auch eines humanen iEκ, durchgeführt werden.
    • 25. Das Wirbeltier oder die Zelle von Aspekt 24, wobei optional das Genom die humane Lambda-Gensegmentinsertion an einem endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Kappa-Locus-Allel umfasst, und wobei das andere endogene Kappa-Locusallel eine Insertion von humanen Kappaimmunoglobulin-V- und -J-Genen stromaufwärts von einer endogenen nicht-humanen Wirbeltier Kappa-Konstantregion umfasst; wobei optional ein endogener Kappa-Leichtkette-Enhancer in einem oder beiden Kappa-Locus; gegebenenfalls in Keimbahnkonfiguration, beibehalten wird.
  • Das Wirbeltier oder die Zelle von Aspekt 24, wobei optional das Genom die humane Lambda-Gensegmentinsertion an einem endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Lambda-Locus-Allel umfasst, und wobei das andere endogene Lambda-Locus-Allel eine Insertion von humanen Kappaimmunglobulin-V- und -J-Genen stromaufwärts einer endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Kappa-Konstantregion umfasst; wobei optional ein endogener Lambda-Leichtkette-Enhancer in einem oder beiden Lambda-Locus; gegebenenfalls in Keimbahnkonfiguration, beibehalten wird.
    • 26. Das Wirbeltier oder die Zelle von Anspruch 24, wobei optional das Genom die humane Lambda-Gensegment-Insertion an einem endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Lambda-Locus-Allel umfasst, und wobei das andere endogene Lambda-Locus-Allel eine Insertion von humanen Kappa-Immunoglobulin V- und J-Genen stromaufwärts einer endogenen nicht-humanen Wirbeltier-kappa-Konstantregion umfasst; wobei optional ein endogener Lambda-Leichtkette-Enhancer in einem oder beiden Kappa-Locus; gegebenenfalls in Keimbahnkonfiguration, beibehalten wird.
    • 27. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 1 bis 23, wobei gegebenenfalls das Genom homozygot ist für die humane Lambda-Insertion an dem endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Locus.
    • 28. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 1 bis 23, wobei gegebenenfalls das Genom homozygot ist für eine humane Lambda-Gensegment-Insertion an den endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Kappa- und -Lambda-Loci.
    • 29. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 1 bis 23 und 28, wobei gegebenenfalls das Genom homozygot ist für eine humane Lambda-Gensegment-Insertion an den endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Lambda-Loci, wobei ein endogenes Kappa-Locus-Allel eine humane Lambda-Gensegment-Insertion umfasst und das andere endogene Kappa-Locus-Allel eine Insertion einer Vielzahl von humanen Vκ- und Jκ-Gensegmenten stromaufwärts einer Cκ-Region umfasst, für die Expression von Kappa-Leichtketten, umfassend humane Kappa-Variabelregionen. Humane Kappa-Variabelregionen sind diejenigen, die aus der Rekombination von humanen Vκ und Jκ abgeleitet sind.
    • 30. Das Wirbeltier oder die Zelle von Aspekt 27 oder 28, wobei optional die humanen Lambda-Gensegment-Insertionen an den Kappa- und Lambda-Loci Insertionen von demselben Repertoire humaner Lambda-Gensegmente sind.
    • 31. Das Wirbeltier oder die Zelle von Aspekt 27 oder 28, wobei optional die humanen Lambda-Gensegment-Insertionen an den Kappa-Loci verschieden sind von den humanen Lambda-Gensegment-Insertionen an den Lambda-Loci. Dies ist zweckdienlich für das Erweitern des potentiellen Repertoires an Variabelregionen für anschließende Selektion gegen Antigen.
    • 32. Nicht-humanes Wirbeltier oder nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Maus, Ratte, Mauszelle oder eine Rattenzelle), dessen bzw. deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in einen oder mehrere endogene Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom die folgende Leichtkette-Loci-Anordnung umfasst (a) L an einem endogenen Kappakette-Allel und K an dem anderen endogenen Kappakette-Allel; oder (b) L an einem endogenen Lambdakette-Allel und K an dem anderen endogenen Lambdakette-Allel; oder (c) L an beiden endogenen Kappakette-Allelen; (d) L an beiden endogenen Lambdakette-Allelen; (e) L an einem endogenen Kappakette-Allel und wobei das andere endogene Kappakette-Allel inaktiviert worden ist; oder (f) L an einem endogenen Lambdakette-Allel und wobei das andere endogene Lambda-Kette-Allel inaktiviert worden ist; wobei L eine humane Lambda-Gensegment-Insertion von wenigstens den funktionellen humanen Vλ und Jλ (gegebenenfalls auch Cλ-Gensegmenten) repräsentiert, beinhaltet von einem humane Lambdakette-Ig-Locus von Vλ3-1 bis Cλ7 (z. B. beinhaltet von einem humane Lambdakette-Ig-Locus von 2-18 bis Cλ7); und K eine humane Vκ- und Jκ-Insertion repräsentiert; wobei in dem Genom die humanen Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion inseriert sind zur Expression von Leichtketten, umfassend Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination von humanen V- und J-Gensegmenten.
    • 33. Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß Aspekt 32, wobei optional das Genom umfasst das Arrangement bzw. die Anordnung (a) und L an einem oder beiden endogenen Lambdakette-Allelen; oder (a) und K an einem oder beiden endogenen Lambdakette-Allelen; oder (a) und L an einem endogenen Lambdakette-Allel und K an dem anderen endogenen Lambdakette-Allel; oder (b) und L an einem oder beiden endogenen Kappakette-Allelen; oder (b) und K an einem oder beiden endogenen Kappakette-Allelen; oder (b) und L an einem endogenen Kappakette-Allel und K an dem anderen endogenen Kappakette-Allel; oder (c) und K an einem oder beiden endogenen Lambdakette-Allelen; oder (c) und L an einem oder beiden endogenen Lambdakette-Allelen; oder (c) und L an einem endogenen Lambdakette-Allel und K an dem anderen endogenen Lambdakette-Allel; oder (c) und beide endogenen Lambdakette-Allele inaktiviert worden sind; oder (d) und L an einem oder beiden endogenen Kappakette-Allelen; oder (d) und K an einem oder beiden endogenen Kappakette-Allelen; oder (d) und L an einem endogenen Kappakette-Allel und K an dem anderen endogenen Kappakette-Allel; oder (d) und beide endogenen Kappakette-Allele inaktiviert worden sind.
    • 34. Das Wirbeltier oder die Zelle von Aspekt 32 oder 33, wobei optional die endogene Kappakette-Expression im wesentlichen oder vollständig inaktiviert ist. Endogene Kappaketten sind Kappa-Leichtketten, umfassend Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination von endogenen (nicht-humanen Wirbeltier) Vκ- und Jκ-Gensegmenten.
    • 35. Das Wirbeltier oder die Zelle von Aspekt 32, 33 oder 34, wobei optional endogene Lambdakette-Expressionis im wesentlichen oder vollständig inaktiv ist. Endogene Lambdaketten sind Lambda-Leichtketten, umfassend Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination von endogenen (nicht-humanen Wirbeltier) Vλ- und Jλ-Gensegmenten.
    • 36. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 35, wobei gegebenenfalls jede L-Insertion stromaufwärts von einer endogenen Lambda- oder Kappa-Konstantregion ist.
    • 37. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 36, wobei gegebenenfalls jede L-Insertion in einen Lambda-Locus stromaufwärts von einer endogenen Lambda-Konstantregion ist.
    • 38. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 36, wobei gegebenenfalls jede L-Insertion in einen Kappa-Locus stromaufwärts von einer endogenen Kappa-Konstantregion ist.
    • 39. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 35, wobei gegebenenfalls jede L-Insertion in einen Lambda-Locus stromaufwärts von einer humanen Lambda-Konstantregion ist.
    • 40. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 35, wobei gegebenenfalls jede L-Insertion in einen Kappa-Locus stromaufwärts von einer humanen Kappa-Konstantregion ist.
    • 41. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 40, wobei gegebenenfalls jede K-Insertion stromaufwärts von einer endogenen Lambda- oder Kappa-Konstantregion ist.
    • 42. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 41, wobei gegebenenfalls jede K-Insertion in einen Lambdalocus stromaufwärts von einer endogenen Lambda-Konstantregion ist.
    • 43. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 42, wobei gegebenenfalls jede K-Insertion in einen Kappalocus stromaufwärts von einer endogenen Kappa-Konstantregion ist.
    • 44. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 40, wobei gegebenenfalls jede K-Insertion in einen Lambda-Locus stromaufwärts einer humanen Lambda-Konstantregion ist.
    • 45. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 40 und 44, wobei gegebenenfalls jede K-Insertion in einen Kappa-Locus stromaufwärts von einer humanen Kappa-Konstantregion ist.
    • 46. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 45, wobei gegebenenfalls die Insertionen in Übereinstimmung mit einem beliebigen der Aspekte 1 bis 9, 11 bis 16 und 20 bis 31 sind.
    • 47. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 46, wobei gegebenenfalls jede humane Lambda-Insertion in Übereinstimmung mit einem beliebigen der Aspekte 1 bis 9, 11 bis 16 und 20 bis 31.
    • 48. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 47, wobei gegebenenfalls jede humane Kappa-Insertion in Übereinstimmung mit einem beliebigen der Aspekte 1 bis 9, 11 bis 16 und 20 bis 31.
    • 49. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 48, wobei gegebenenfalls jede humane Lambda-Insertion das Repertoire von humanen Vλ- und Jλ(und gegebenenfalls Cλ)-Gensegmenten umfasst.
    • 50. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 48, wobei gegebenenfalls erste und zweite (und gegebenenfalls dritte) humane Lambda-Insertionen vorgenommen werden und die Insertionen verschiedene Repertoires von humanen Vλ- und Jλ(und gegebenenfalls Cλ)-Gensegmenten umfassen.
    • 51. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 50, wobei gegebenenfalls jede humane Kappa-Insertion das Repertoire von humanen Vκ und Jκ(und gegebenenfalls Cκ)-Gensegmenten umfasst.
    • 52. Das Wirbeltier oder die Zelle von einem beliebigen der Aspekte 32 bis 50, wobei gegebenenfalls erste und zweite (und gegebenenfalls dritte) humane Kappa-Insertionen vorgenommen werden und die Insertionen verschiedene Repertoires von humanen Vκ- und Jκ-(und gegebenenfalls Cκ)-Gensegmenten umfassen.
    • 53. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei gegebenenfalls das Genom einen Immunoglobulin-Schwerkettelocus umfasst, umfassend humane VH-Gensegmente, z. B. einen Schwerkettelocus wie hierin beschrieben, der humane V-, D- und J-Gensegmente umfasst.
    • 54. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder einer Leichtkette, umfassend eine Lambda-Variabelregion, spezifisch für ein gewünschtes Antigen, wobei das Verfahren das Immunisieren eines Wirbeltiers gemäß einem beliebigen vorangehenden Aspekt mit dem gewünschten Antigen und das Gewinnen des Antikörpers oder der Leichtkette oder das Gewinnen einer Zelle, die den Antikörper oder die Leichtkette produziert, umfasst.
    • 55. Verfahren zur Herstellung eines/einer vollständig humanisierten Antikörpers oder Antikörperleichtkette, umfassend das Ausführen des Verfahrens von Aspekt 54 zum Erhalten eines Antikörpers oder einer Leichtkette, umfassend eine Lambdakette-Konstantregion des nicht-humanen Wirbeltiers, und das Ersetzen der nicht-humanen Wirbeltier-Konstantregion mit einer Human-Konstantregion, gegebenenfalls durch Konstruieren der Nukleinsäure, welche den Antikörper oder die Leichtkette codiert.
    • 56. Humanisierte(r) Antikörper oder Antikörperleichtkette, produziert gemäß Aspekt 54, oder ein Derivat davon; gegebenenfalls zur Verwendung in der Medizin.
    • 57. Verwendung eines humanisierten Antikörpers oder einer humanisierten Kette, produziert gemäß Aspekt 54, oder eines Derivats davon in der Medizin.
    • 58. Verfahren zur Inaktivierung von endogenen Ig-VJ-Regionen im Genom eines nicht-humanen Wirbeltiers oder einer nicht-humanen Wirbeltierzelle (z. B. einer Maus, Ratte, Mauszelle oder einer Rattenzelle), wobei das Verfahren das Inserieren von humanen Immunoglobulin-Gensegmenten (z. B. V- und J-Gensegmente) in dem Genom zwischen den endogenen Ig-VJ und einem endogenen Enhancer oder einer endogenen Konstantregion umfasst, um das endogene Ig-VJ weg von dem Enhancer oder der Konstantregion zu bewegen, wodurch endogene Ig-VJ-Regionen inaktiviert werden.
  • In einer Ausführungsform sind die endogenen Ig-VJ Schwerkette-Gensegmente, der Enhancer ist ein endogener Schwerkette-Enhancer, die Konstantregion ist eine endogene Schwerkette-Konstantregion und die humanen Ig-Gensegmente umfassen humane VH-, DH- und JH-Gensegmente.
  • In einer Ausführungsform sind die endogenen Ig-VJ Lambda-Leichtkette-Gensegmente, der Enhancer ist ein endogener Lambdakette-Enhancer, die Konstantregion ist eine endogene Lambdakette-Konstantregion und die humanen Ig-Gensegmente umfassen humane Vλ- und Jλ-Gensegmente.
  • In einer Ausführungsform sind die endogenen Ig-VJ Kappa-Leichtkette-Gensegmente, der Enhancer ist ein endogener Kappa-Kette-Enhancer, die Konstantregion ist eine endogene Kappa-Kette-Konstantregion und die humanen Ig-Gensegmente umfassen humane Vκ- und Jκ-Gensegmente.
  • Verfahren zur Inaktivierung von endogenen IgK-VJ-Regionen im Genom eines nicht-humanen Wirbeltiers oder einer nicht-humanen Wirbeltierzelle (z. B. einer Maus, Ratte, Mauszelle oder einer Rattenzelle), wobei das Verfahren das Inserieren von humanen Immunglobulin-Gensegmenten im Genom zwischen dem endogenen IgK-VJ und dem Eκ-Enhancer umfasst, um das endogene IgK-VJ weg von dem Eκ-Enhancer zu bewegen, wodurch endogene IgK-VJ-Regionen inaktiviert werden.
    • 59. Verfahren von Aspekt 58, wobei gegebenenfalls die humanen Gensegmente humane VL- und JL-Gensegmente umfassen; wobei gegebenenfalls die Insertion eine Insertion, wie zitiert in einem beliebigen der Aspekte 1 bis 9, 11 bis 16 und 20 bis 31, oder eine Insertion von humanen Vκ- und Jκ-Gensegmenten ist.
    • 60. Verfahren zum Exprimieren von Immunglobulin-Leichtketten in einem nicht-humanen Wirbeltier (z. B. einer Maus oder Ratte), wobei die Leichtketten Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten) umfassen, wobei wenigstens 70 oder 80% (zum Beispiel wenigstens 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99%) der Variabelregionen von den durch das Wirbeltier exprimierten Lambda-Leichtketten aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet sind, wobei das Verfahren das Bereitstellen im Genom des Wirbeltiers eines Ig-Gensegmentrepertoires, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in einen oder mehrere endogene Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion umfasst, wobei das Verfahren das Inserieren von wenigstens den funktionellen humanen Vλ- und Jλ-(gegebenenfalls auch humane Cλ)-Gensegmenten (und gegebenenfalls Intergen-Segmentsequenzen), beinhaltet von einem humanen Lambdakette-Ig-Locus von Vλ2-18 bis Cλ7, in einen endogenen Leichtkettelocus von dem Wirbeltier umfasst, wobei wenigstens 70 oder 80% (zum Beispiel wenigstens 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99%) der Variabelregionen von den durch das Wirbeltier exprimierten Lambda-Leichtketten aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet sind; wobei das Verfahren das Exprimieren der Leichtketten in dem Wirbeltier und gegebenenfalls das Isolieren von einer oder mehreren der Leichtketten (z. B. als Teil eines 4-kettigen Antikörpers) umfasst.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Isolieren einer Lambda-Leichtkette, umfassend eine aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitete Variabelregion, aus dem Wirbeltier. In einem Beispiel umfasst das Verfahren das Immunisieren der Maus mit einem Antigen (z. B. einem humanen Antigen) vor dem Isolieren der Lambda-Leichtkette. In einem Beispiel ist die Leichtkette Teil von einem Antikörper, z. B. einem Antikörper, der spezifisch das Antigen bindet.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Verwendung ferner das Isolieren von Milzgewebe (z. B. der Milz) aus der Maus; gegebenenfalls gefolgt von Isolieren von wenigstens einer antigenspezifischen B-Zelle aus dem Gewebe, wobei die B-Zelle(n) die Lambda-Leichtkette exprimiert. Zum Beispiel wird die Lambda-Leichtkette durch einen Antikörper, der spezifisch ein vorbestimmtes Antigen (z. B. ein humanes Antigen) bindet, bereitgestellt. In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Immunisieren der Maus mit dem Antigen (z. B. einem humanen Antigen) vor dem Isolieren des Milzgewebes oder der Lambda-Leichtkette. In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Isolieren der Lambda-Leichtkette, die durch die B-Zelle (oder durch ein Hybridom, hergestellt durch Fusion der B-Zelle mit einer Myelomzelle) produziert wird. In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Herstellen eines Hybridoms aus einer B-Zelle, die aus dem Milzgewebe isoliert wurde, wobei das Hybridom die Lambda-Leichtkette oder ein Derivat davon exprimiert. Gegebenenfalls umfasst die Verwendung das Herstellen eines Derivats von dem isolierten Antikörper oder der Lambda-Leichtkette. Beispiele von Derivat-Antikörpern (gemäß jedwedem Aspekt hierin) sind Antikörper, die eine oder mehrere Mutationen verglichen mit dem isolierten Antikörper aufweisen (z. B. zum Verbessern der Antigenbindungs-Affinität und/oder zum Verstärken oder Inaktivieren der Fc-Funktion). Solche Mutanten binden spezifisch das Antigen. Eine Mutation oder Adaptation zum Produzieren eines Derivats beinhaltet z. B. eine Mutation zur Herbeiführung von Fc-Verstärkung oder -Inaktivierung. Ein Derivat kann ein Antikörper im Anschluss an Konjugation an eine toxische Nutzlast oder einen Reporter oder eine Markierung oder eine sonstige aktive Einheit sein. In einem anderen Beispiel wird ein(e) chimäre(r) Antikörperkette oder Antikörper, welche(r) aus einer Zelle eines Wirbeltiers der Erfindung isoliert wird, durch Ersetzen von einer oder allen humanen Konstantregionen davon durch eine entsprechende humane Konstantregion modifiziert. Zum Beispiel werden alle Konstantregionen von einem aus einer solchen Zelle oder einem solchen Wirbeltier isolierten Antikörper mit humanen Konstantregionen ersetzt, um einen vollständig humanen Antikörper (d. h. umfassend humane Variabel- und Konstantregionen) zu produzieren. Solch ein Antikörper ist nützlich zur Verabreichung an humane Patienten, um die Anti-Antikörper-Reaktion seitens des Patienten zu reduzieren.
    • 61. Verfahren zum Exprimieren von Immunglobulin-Leichtketten in einem nicht-humanen Wirbeltier (z. B. einer Maus oder Ratte), wobei wenigstens 60% (zum Beispiel wenigstens 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99%) von den Leichtketten, exprimiert durch das Wirbeltier, bereitgestellt werden von humanen Lambda-Leichtketten, wobei das Verfahren das Bereitstellen eines Ig-Gensegmentrepertoires, das durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in einen oder mehrere endogene Ig-Loci produziert wird, im Genom des Wirbeltiers umfasst, wobei das Genom umfasst (i) humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente durch Inserieren wenigstens der funktionellen humanen Vλ- und Jλ-(gegebenenfalls auch humanen Cλ)-Gensegmente (und gegebenenfalls Intergen-Segmentsequenzen), beinhaltet von einem humane Lambdakette Ig-Locus von Vλ2-18 bis Cλ7, in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers bereitgestellt werden, und (ii) Kappa-V-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion, wobei das Wirbeltier Immunglobulin-Leichtketten, umfassend humane Lambda-Variabelregionen (humane Lambda-Leichtketten), exprimiert und wenigstens 60% (zum Beispielmehr als 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99%) der durch das Wirbeltier exprimierten Leichtketten von den humanen Lambda-Leichtketten bereitgestellt werden; wobei das Verfahren das Exprimieren der Leichtketten in dem Wirbeltier und gegebenenfalls das Isolieren einer oder mehrerer der Leichtketten (z. B. als Teil eines 4-kettigen Antikörpers) umfasst.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Isolieren einer Lambda-Leichtkette, umfassend eine aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitete Variabelregion, aus dem Wirbeltier. In einem Beispiel umfasst das Verfahren das Immunisieren der Maus mit einem Antigen (z. B. einem humanen Antigen) vor dem Isolieren der Lambda-Leichtkette. In einem Beispiel ist die Leichtkette Teil von einem Antikörper, z. B. einem Antikörper, der spezifisch das Antigen bindet.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Verwendung ferner das Isolieren von Milzgewebe (z. B. der Milz) aus der Maus; gegebenenfalls gefolgt von Isolieren von wenigstens einer antigenspezifischen B-Zelle aus dem Gewebe, wobei die B-Zelle(n) die Lambda-Leichtkette exprimiert. Zum Beispiel wird die Lambda-Leichtkette durch einen Antikörper, der spezifisch ein vorbestimmtes Antigen (z. B. ein humanes Antigen) bindet, bereitgestellt. In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Immunisieren der Maus mit dem Antigen (z. B. einem humanen Antigen) vor dem Isolieren des Milzgewebes oder der Lambda-Leichtkette. In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Isolieren der Lambda-Leichtkette, produziert durch die B-Zelle (oder durch ein Hybridom, hergestellt durch Fusion der B-Zelle mit einer Myelomzelle). In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Herstellen eines Hybridoms aus einer B-Zelle, die aus dem Milzgewebe isoliert wurde, wobei das Hybridom die Lambda-Leichtkette oder ein Derivat davon exprimiert. Gegebenenfalls umfasst die Verwendung das Herstellen eines Derivats von dem isolierten Antikörper oder der Lambda-Leichtkette. Beispiele von Derivat-Antikörpern (gemäß jedwedem Aspekt hierin) sind Antikörper, die eine oder mehrere Mutationen verglichen mit dem isolierten Antikörper aufweisen (z. B. zum Verbessern der Antigenbindungs-Affinität und/oder zum Verstärken oder Inaktivieren der Fc-Funktion). Solche Mutanten binden spezifisch das Antigen.
    • 62. Verfahren zum Exprimieren humaner Immunoglobulin-VJC-Leichtketten in einem nicht-humanen Wirbeltier (z. B. einer Maus oder Ratte), wobei das Verfahren das Bereitstellen eines Ig-Gensegmentrepertoires, das durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in einen oder mehrere endogene Ig-Loci produziert wird, im Genom des Wirbeltiers umfasst, wobei das Verfahren das Inserieren von wenigstens den funktionellen humanen Vλ-, Jλ- und Cλ-Gensegmenten (und gegebenenfalls Intergen-Segmentsequenzen), beinhaltet von einem humanen Lambdakette-Ig-Locus von Vλ3-1 bis Cλ7 (z. B. beinhaltet von einem humanen Lambdakette-Ig-Locus von 2-18 bis Cλ7), in einen endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Kappa-Leichtkettelocus stromaufwärts von einer endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Kappa-Konstantregion zur Expression einer humanen VJC-Leichtkette umfasst; wobei das Verfahren das Exprimieren der Leichtketten in dem Wirbeltier und gegebenenfalls das Isolieren einer oder mehrerer der Leichtketten (z. B. als Teil eines 4-kettigen Antikörpers) umfasst.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Isolieren einer Lambda-Leichtkette, die eine aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitete Variabelregion umfasst, aus dem Wirbeltier. In einem Beispiel umfasst das Verfahren das Immunisieren der Maus mit einem Antigen (z. B. einem humanen Antigen) vor dem Isolieren der Lambda-Leichtkette. In einem Beispiel ist die Leichtkette Teil von einem Antikörper, z. B. ein Antikörper, der spezifisch das Antigen bindet.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Verwendung ferner das Isolieren von Milzgewebe (z. B. der Milz) aus der Maus; gegebenenfalls gefolgt von Isolieren von wenigstens einer antigenspezifischen B-Zelle aus dem Gewebe, wobei die B-Zelle(n) die Lambda-Leichtkette exprimiert. Zum Beispiel wird die Lambda-Leichtkette bereitgestellt durch einen Antikörper, der spezifisch ein vorbestimmtes Antigen (z. B. ein humanes Antigen) bindet. In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Immunisieren der Maus mit dem Antigen (z. B. einem humanen Antigen) vor dem Isolieren des Milzgewebes oder der Lambda-Leichtkette. In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Isolieren der durch die B-Zelle (oder durch ein Hybridom, hergestellt durch Fusion der B-Zelle mit einer Myelomzelle) produzierten Lambda-Leichtkette. In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Herstellen eines Hybridoms aus einer B-Zelle, die aus dem Milzgewebe isoliert wurde, wobei das Hybridom die Lambda-Leichtkette oder ein Derivat davon exprimiert. Gegebenenfalls umfasst die Verwendung das Herstellen eines Derivats von dem isolierten Antikörper oder der Lambda-Leichtkette. Beispiele von Derivat-Antikörpern (gemäß jedwedem Aspekt hierin) sind Antikörper, die eine oder mehrere Mutationen verglichen mit dem isolierten Antikörper aufweisen (z. B. zum Verbessern der Antigenbindungs-Affinität und/oder zum Verstärken oder Inaktivieren der Fc-Funktion). Solche Mutanten binden spezifisch das Antigen.
    • 63. Verfahren von einem beliebigen der Aspekte 38 bis 40, wobei gegebenenfalls das Wirbeltier in Übereinstimmung mit einem beliebigen der anderen Aspekte ist.
    • 64. Antikörperleichtkette, isoliert gemäß dem Verfahren von einem beliebigen der Aspekte 58 bis 63, oder ein Derivat davon oder ein Antikörper, umfassend eine solche Leichtkette oder ein solches Derivat; gegebenenfalls zur Verwendung in der Medizin.
    • 65. Verwendung einer Antikörperleichtkette, isoliert gemäß dem Verfahren von einem beliebigen der Aspekte 58 bis 63, oder eines Derivats davon (oder eines Antikörpers, umfassend eine solche Leichtkette oder Derivat) in der Medizin.
    • 66. Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) gemäß einem beliebigen der Aspekte 1 bis 53 zum Exprimieren von Leichtketten, umfassend Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten), wobei wenigstens 70 oder 80% (zum Beispiel wenigstens 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99% oder 100%) von den Variabelregionen der durch das Wirbeltier exprimierten Lambda-Leichtketten aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet sind.
  • Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) gemäß einem beliebigen der Aspekte 1 bis 53, das Leichtketten exprimiert, umfassend Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten), wobei wenigstens 70 oder 80% (zum Beispielwenigstens 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99% oder 100%) von den Variabelregionen der durch das Wirbeltier exprimierten Lambda-Leichtketten aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet sind.
    • 67. Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) gemäß einem beliebigen der Aspekte 1 bis 53, zum Exprimieren von Leichtketten, wobei wenigstens 60% (zum Beispiel mehr als 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99% oder 100%) der durch das Wirbeltier exprimierten Leichtketten von humanen Lambda-Leichtketten bereitgestellt werden.
  • Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) gemäß einem beliebigen der Aspekte 1 bis 53, das Leichtketten exprimiert, wobei wenigstens 60% (zum Beispiel mehr als 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99% oder 100%) der durch das Wirbeltier exprimierten Leichtketten von humanen Lambda-Leichtketten bereitgestellt werden.
    • 68. Nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) gemäß Aspekt 7 zum Exprimieren von Leichtketten, umfassend Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten), wobei die Expression von Lambda-Leichtketten, umfassend humane Lambda-Variabelregionen, gegenüber der Expression von Lambda-Leichtketten, umfassend endogene nicht-humane Wirbeltier-Lambda-Variabelregionen, überwiegt: und gegebenenfalls zum Inaktivieren der Expression von endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Lambda-Variabelregionen aus dem endogenen Leichtkettelocus.
  • Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) gemäß Aspekt 7, das Leichtketten, umfassend Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten) exprimiert, wobei die Expression von Lambda-Leichtketten, umfassend humane Lambda-Variabelregionen, gegenüber der Expression von Lambda-Leichtketten, umfassend endogene nicht-humane Wirbeltier-Lambda-Variabelregionen, überwiegt: und gegebenenfalls zum Inaktivieren der Expression von endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Lambda-Variabelregionen aus dem endogenen Leichtkettelocus.
    • 69. Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) gemäß Aspekt 7, 8, 9 oder 10 zum Inaktivieren der Expression von endogenen nicht-humanen Wirbeltier-Lambda-Variabelregionen aus dem endogenen Leichtkettelocus.
  • Der Prozentsatz der Expression oder Expressionsspiegel von Antikörperketten kann auf der Ebene von Leichtkette-mRNA-Transkripten in B-Zellen (z. B. Lymphozyten des peripheren Bluts) bestimmt werden. Alternativ oder zusätzlich wird der Prozentsatz der Expression auf der Ebene der Antikörperleichtketten im Serum oder Blut der Wirbeltiere bestimmt. Zusätzlich oder alternativ kann die Expression durch FACS(Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung)-Analyse von B-Zellen bestimmt werden. Zum Beispiel durch Untersuchen der Maus-C-Kappa- oder Human-C-Lambda-Expression auf der Zelloberfläche, wenn die humanen Lambda-Variabelregionen mit Maus-C-Kappa- bzw. Human-C-Lambda-Regionen exprimiert werden.
  • Der Ausdruck ”eine Lambda-Leichtkette” in diesen Aspekten bezieht sich auf eine Leichtkette, umfassend eine Variabelregion-Sequenz (auf RNA- oder Aminosäure-Ebene), die aus der Rekombination von Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet ist. So ist ”humane Lambda-Variabelregion” zum Beispiel eine Variabelregion, die aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet ist. Die Konstantregion kann eine Kappa- oder Lambda-Konstantregion, z. B. eine Human- oder Maus-Konstantregion, sein.
  • Das Wirbeltier in diesen Aspekten ist zum Beispiel naïv (d. h., nicht immunisiert mit einem vorbestimmten Antigen, wie der Begriff im Fachgebiet verstanden wird; zum Beispiel ein derartiges Wirbeltier, das in einer relativ sterilen Umgebung gehalten worden ist, wie bereitgestellt durch eine Tierhaltungseinrichtung, die für R&D bzw. Forschung & Entwicklung verwendet wird). In einem anderen Beispiel wurde das Wirbeltier mit einem vorbestimmten Antigen immunisiert, z. B. einem Antigen, das ein humanes Epitop trägt.
  • Die Bezugnahme auf ”funktionelle” humane Gensegmente anerkennt, dass in einem humanen Ig-Lambda-Locus manche V-Gensegmente nicht-funktionelle Pseudogene sind (z. B. Vλ3-17, Vλ3-15, Vλ3-13, Vλ3-7, Vλ3-6, Vλ2-5, Vλ3-4, Vλ3-2; Siehe die IMGT-Datenbank: unter World Wide Web (www) imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&group=IGL. Zudem sind Jλ4-Cλ4 und Jλ5-Cλ5 in Menschen nicht funktionell. Der Begriff ”funktionell” bei Bezugnahme auf Gensegmente schließt Pseudogene aus. Ein Beispiel von funktionellen humanen Vλ-Gensegmenten ist die Gruppe Vλ2-18, Vλ3-16, V2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 und Vλ3-1. Ein Beispiel von funktionellen humanen Jλ-Gensegmenten ist die Gruppe Jλ1, Jλ2 und Jλ3; oder Jλ1, Jλ2 und Jλ7; oder Jλ2, Jλ3 und Jλ7; oder Jλ1, Jλ2, Jλ3 und Jλ7. Ein Beispiel von funktionellen humanen Cλ-Gensegmenten ist die Gruppe Cλ1, Cλ2 und Cλ3; oder Cλ1, Cλ2 und Cλ7; oder Cλ2, Cλ3 und Cλ7; oder Cλ1, Cλ2, Cλ3 und Cλ7.
  • In einer Ausführungsform bilden die Lambda-Leichtketten, zusammen mit Schwerketten, die in den Zellen oder Wirbeltieren der Erfindung exprimiert werden, Antikörper aus. Die Schwerketten können von einem transgenen Schwerkettelocus aus exprimiert werden, wie hierin beschrieben. Zum Beispiel umfasst das Genom der Zelle oder des Wirbeltiers einen Schwerkettelocus, in dem ein chimärer Immunglobulin-Schwerkettelocus vorliegt, umfassend ein oder mehrere humane V-Gensegmente, ein oder mehrere humane D-Gensegmente und ein oder mehrere humane J-Gensegmente stromaufwärts von einer mu-Konstantregion von der nicht-humanen Spezies; wobei endogene Schwerkette-Expression im wesentlichen inaktiviert worden ist; und der Schwerkettelocus einen Eμ-Enhancer aus der nicht-humanen Wirbeltierspezies umfasst.
  • In einer Ausführungsform von dem Wirbeltier oder der Zelle, sind alle endogenen Enhancer aus dem endogenen Locus, in dem die humanen Gensegmente inseriert werden, deletiert. Somit, wenn ein humaner Enhancer (z. B. Eλ) inseriert wird, steuert dieser den transgenen Locus in Abwesenheit der Wirkung von anderen, endogenen, Enhancern (zum Beispiel Kappa-Enhancern, falls der Locus ein endogener Kappa-Enhancer ist). Dies kann zur Vermeidung von nicht-humanen Wirbeltier-artigen Kappa:Lambda-Expressionsverhältnissen zweckdienlich sein (z. B. zum Lenken der Expression auf ein höheres Verhältnis von Lambda:Kappa in Mäusen).
  • Wenn endogene Leichtkette(z. B. kappa oder lambda)-Expression im wesentlichen inaktiv oder inaktiviert ist, wie hierin beschrieben, werden weniger als 10, 5, 4, 3, 2, 1 oder 0,5% von solchen endogenen Leichtketten exprimiert oder exprimierbar sein. In einem Beispiel herrscht eine vollständige Inaktivierung, so dass gar keine solchen Leichtketten exprimiert werden oder exprimierbar sind.
  • Gegebenenfalls ist das Wirbeltier der Erfindung naïv. Somit ist das Wirbeltier nicht mit einem vorbestimmten Antigen immunisiert worden.
  • Falls, zum Beispiel, eine Zelle der Erfindung eine ES-Zelle oder sonstige IPS-Stammzelle oder eine andere pluripotente Stammzelle ist, kann die Zelle sich zu einem Wirbeltier der Erfindung entwickeln. Zum Beispiel kann die Zelle gemäß Standardtechniken in eine Blastocyste aus einer Leihmutter implantiert und zu einem Embryo und Tier entwickelt werden.
  • In einer Ausführungsform, worin humane Kappa-Gensegmente inseriert werden, umfasst jede Insertion humane Kappa-Gensegmente
    • (i) Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ1-8 und Vκ1-9 (und gegebenenfalls Vκ5-2 und Vκ4-1); oder
    • (ii) Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ3-20 (und gegebenenfalls Vκ2-24 und/oder Vκ1-13); oder
    • (iii) Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ3-20, Vκ2-24, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-30 und Vκ1-33 (und gegebenenfalls Vκ2-29 und/oder Vκ2-40 und/oder Vκ1-39); und gegebenenfalls
    • (iv) Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 und Jκ5.
  • In einer Ausführungsform umfasst die humane Kappa-Insertion auch einen humanen iEκ und/oder humanen 3'Eκ stromabwärts von den humanen J-Gensegmenten in dem Locus.
  • Transgene Mäuse der Erfindung, die im wesentlichen ausschließlich humane Schwerkette-Variabelregionen exprimieren, entwickeln normale Milz- und BM-Kompartimente & normale Ig-Expression, wobei die Ig humane Schwerkette-Variabelregionen umfassen
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung beobachteten überraschenderweise normale Ig-Subtypexpression & B-Zell-Entwicklung in transgenen Mäusen der Erfindung, die Antikörper mit humanen Schwerkette-Variabelregionen im wesentlichen in der Abwesenheit von endogener Schwer- und Kappa-Kette-Expression exprimieren. Siehe nachstehendes Beispiel 16.
  • Die Erfinder beobachteten, dass die Inaktivierung von endogener Schwerkette-Variabelregion-Expression in Gegenwart von humaner Variabelregion-Expression überraschenderweise das Verhältnis von B-Zellen im Milz-Kompartiment (66) oder Knochenmark-B-Progenitor-Kompartiment (67) nicht verändert und die Immunglobulin-Niveaus in Serum normal sind und die korrekten Ig-Subtypen exprimiert werden (68). Diese Daten verdeutlichen, dass inserierte humane Schwerkette-Gensegmente gemäß der Erfindung (z. B. eine Insertion von wenigstens humanen VH-Gensegmenten VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1 und allen der humanen D- und JH-Gensegmenten D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 und 7-27; und J1, J2, J3, J4, J5 und J6, gegebenenfalls die Allele der Tabelle 7) vollständig funktionell sind in Bezug auf VDJ-Gensegment-Rearrangement aus dem transgenen Schwerkettelocus heraus, in Bezug auf B-Zellrezeptor(BCR)-Signalgebung und ordnungsgemäße B-Zell-Reifung.
  • Die Erfindung sieht daher die folgenden Aspekte vor (Nummerierung beginnend mit Aspekt 70):-
    • 70. Eine Maus, welche Human-Variabelregionen umfassende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert oder zum Exprimieren dieser gestaltet ist, wobei die von der Maus exprimierten Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten sind; und die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten als Teil von Serum-IgG1-, -IgG2b- und -IgM(und gegebenenfalls IgG2a)-Antikörpern in der Maus exprimiert werden; wobei die Maus einen Immunglobulin-Schwerkettelocus umfasst, der humane VH-, OH- und JH-Gensegmente stromaufwärts von einer Maus-Konstantregion (z. B. C-mu und/oder C-delta und/oder C-gamma; wie (in einer 5'-nach-3'-Orientierung) Maus-C-mu und Maus-C-delta und Maus-C-gamma) umfasst, wobei (a) die Maus zum Exprimieren von Human-Variabelregionen umfassenden Immunglobulin-Schwerketten imstande ist, und die von der Maus exprimierten Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die humane Variabelregionen umfassenden Schwerketten sind; und (b) die Maus Serum-IgG1-, IgG2b- und IgM(und gegebenenfalls IgG2a)-Antikörper, welche besagte Schwerketten umfassen, exprimiert.
  • Ig-Isotypen können bestimmt werden, zum Beispiel unter Verwendung von Isotypangeglichenen Werkzeug-Antikörpern, wie es dem Fachmann ohne weiteres geläufig sein wird (und wie in Beispiel 16 veranschaulicht).
  • In einer Ausführungsform ist die Maus naïv.
    • 71. Die Maus von Aspekt 70 zum Exprimieren eines normalen relativen Anteils von Serum-IgG1-, IgG2a-, IgG2b- und IgM-Antikörpern.
  • Mit ”normal” ist vergleichbar zur Expression in einer Maus (z. B. einer naiven Maus) gemeint, welche nur Maus-Antikörperketten exprimiert, z. B. eine Maus, deren Genom nur funktionelle Wildtyp-Ig-Schwer- und Leichtkette-Loci umfasst, z. B. eine Wildtyp-Maus.
    • 72. Die Maus von Aspekt 70 oder 71, wobei die Maus folgendes exprimiert: einen normalen relativen Anteil von Serum-IgG1-, IgG2a-, IgG2b- und IgM-Antikörpern.
  • Mit ”normal” ist vergleichbar zur Expression in einer Maus (z. B. einer naiven Maus) gemeint, welche nur Maus-Antikörperketten exprimiert, z. B. eine Maus, deren Genom nur funktionelle Wildtyp-Ig-Schwer- und Leichtkette-Loci umfasst, z. B. eine Wildtyp-Maus.
  • 73. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 72, zum Exprimieren in der Maus:
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 25–350 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–200 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 30–800 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–300 μg/ml; oder
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 10–600 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–500 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 20–700 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–700 μg/ml;
    wie bestimmt durch Ig-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation (z. B. für eine Stunde bei RT, z. B. für eine Stunde bei 20°C) mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen markierten Antikörpern und Quantifizierung von Ig unter Verwendung der Markierung (z. B. unter Verwendung von Anti-Maus-Ig-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils konjugiert an Merrettichperoxidase, konjugiert in einem Verhältnis von 1/10000 in PBS mit 0,1% TweenTM, gefolgt von der Entwicklung der Markierung mit Tetramethylbenzidin-Substrat (TMB) für 4–5 Minuten in der Dunkelheit bei Raumtemperatur (z. B. 20°C), unter Zugabe von Schwefelsäure, um die Entwicklung der Markierung zu stoppen, und Ablesen der Markierung bei 450 nm).
  • Zum Beispiel die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 72, zum Exprimieren in der Maus:
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 25–150 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–200 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 30–300 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–200 μg/ml; oder
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 10–200 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–500 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 20–400 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–700 μg/ml;
    wie bestimmt durch Ig-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation (z. B. für eine Stunde bei RT, z. B. für eine Stunde bei 20°C) mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen markierten Antikörpern und Quantifizierung von Ig unter Verwendung der Markierung (z. B. unter Verwendung von Anti-Maus-Ig-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils konjugiert an Merrettichperoxidase, konjugiert in einem Verhältnis von 1/10000 in PBS mit 0,1% TweenTM, gefolgt von der Entwicklung der Markierung mit Tetramethylbenzidin-Substrat (TMB) für 4–5 Minuten in der Dunkelheit bei Raumtemperatur (z. B. 20°C), unter Zugabe von Schwefelsäure, um die Entwicklung der Markierung zu stoppen, und Ablesen der Markierung bei 450 nm).
  • Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 72, zum Exprimieren von Ig in der Maus in folgenden relativen Anteilen:
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 25–350 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–200 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 30–800 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–300 μg/ml; oder
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 10–600 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–500 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 20–700 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–700 μg/ml;
    wie bestimmt durch Ig-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation (z. B. für eine Stunde bei RT, z. B. für eine Stunde bei 20°C) mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen markierten Antikörpern und Quantifizierung von Ig unter Verwendung der Markierung (z. B. unter Verwendung von Anti-Maus-Ig-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils konjugiert an Merrettichperoxidase, konjugiert in einem Verhältnis von 1/10000 in PBS mit 0,1% TweenTM, gefolgt von der Entwicklung der Markierung mit Tetramethylbenzidin-Substrat (TMB) für 4–5 Minuten in der Dunkelheit bei Raumtemperatur (z. B. 20°C), unter Zugabe von Schwefelsäure, um die Entwicklung der Markierung zu stoppen, und Ablesen der Markierung bei 450 nm).
  • Zum Beispiel die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 72, zum Exprimieren von Ig in der Maus in folgenden relativen Anteilen:
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 25–150 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–200 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 30–300 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–200 μg/ml; oder
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 10–200 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–500 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 20–400 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–700 μg/ml;
    wie bestimmt durch Ig-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation (z. B. für eine Stunde bei RT, z. B. für eine Stunde bei 20°C) mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen markierten Antikörpern und Quantifizierung von Ig unter Verwendung der Markierung (z. B. unter Verwendung von Anti-Maus-Ig-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils konjugiert an Merrettichperoxidase, konjugiert in einem Verhältnis von 1/10000 in PBS mit 0,1% TweenTM, gefolgt von der Entwicklung der Markierung mit Tetramethylbenzidin-Substrat (TMB) für 4–5 Minuten in der Dunkelheit bei Raumtemperatur (z. B. 20°C), unter Zugabe von Schwefelsäure, um die Entwicklung der Markierung zu stoppen, und Ablesen der Markierung bei 450 nm).
  • 74. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 73, wobei die Maus folgendes exprimiert:
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 25–350 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–200 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 30–800 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–300 μg/ml; oder
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 10–600 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–500 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 20-700 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–700 μg/ml;
    wie bestimmt durch Ig-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation (z. B. für eine Stunde bei RT, z. B. für eine Stunde bei 20°C) mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen markierten Antikörpern und Quantifizierung von Ig unter Verwendung der Markierung (z. B. unter Verwendung von Anti-Maus-Ig-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils konjugiert an Merrettichperoxidase, konjugiert in einem Verhältnis von 1/10000 in PBS mit 0,1% TweenTM, gefolgt von der Entwicklung der Markierung mit Tetramethylbenzidin-Substrat (TMB) für 4–5 Minuten in der Dunkelheit bei Raumtemperatur (z. B. 20°C), unter Zugabe von Schwefelsäure, um die Entwicklung der Markierung zu stoppen, und Ablesen der Markierung bei 450 nm).
  • Zum Beispiel die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 72, wobei die Maus folgendes exprimiert:
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 25–150 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–200 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 30–300 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–200 μg/ml; oder
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 10-200 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0-500 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 20–400 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50-700 μg/ml;
    wie bestimmt durch Ig-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation (z. B. für eine Stunde bei RT, z. B. für eine Stunde bei 20°C) mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen markierten Antikörpern und Quantifizierung von Ig unter Verwendung der Markierung (z. B. unter Verwendung von Anti-Maus-Ig-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils konjugiert an Merrettichperoxidase, konjugiert in einem Verhältnis von 1/10000 in PBS mit 0,1% TweenTM, gefolgt von der Entwicklung der Markierung mit Tetramethylbenzidin-Substrat (TMB) für 4–5 Minuten in der Dunkelheit bei Raumtemperatur (z. B. 20°C), unter Zugabe von Schwefelsäure, um die Entwicklung der Markierung zu stoppen, und Ablesen der Markierung bei 450 nm).
  • Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 73, wobei die Maus folgendes exprimiert: Ig in den relativen Anteilen von
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 25–350 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0-200 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 30-800 μg/ml;und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–300 μg/ml; oder
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 10–600 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–500 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 20–700 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–700 μg/ml;
    wie bestimmt durch Ig-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation (z. B. für eine Stunde bei RT, z. B. für eine Stunde bei 20°C) mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen markierten Antikörpern und Quantifizierung von Ig unter Verwendung der Markierung (z. B. unter Verwendung von Anti-Maus-Ig-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils konjugiert an Merrettichperoxidase, konjugiert in einem Verhältnis von 1/10000 in PBS mit 0,1% TweenTM, gefolgt von der Entwicklung der Markierung mit Tetramethylbenzidin-Substrat (TMB) für 4 – 5 Minuten in der Dunkelheit bei Raumtemperatur (z. B. 20°C), unter Zugabe von Schwefelsäure, um die Entwicklung der Markierung zu stoppen, und Ablesen der Markierung bei 450 nm).
  • Zum Beispiel die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 72, wobei die Maus Ig in den folgenden relativen Anteilen exprimiert:
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 25–150 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–200 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 30–300 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–200 μg/ml; oder
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 10–200 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–500 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 20–400 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50-700 μg/ml;
    wie bestimmt durch Ig-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation (z. B. für eine Stunde bei RT, z. B. für eine Stunde bei 20°C) mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen markierten Antikörpern und Quantifizierung von Ig unter Verwendung der Markierung (z. B. unter Verwendung von Anti-Maus-Ig-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils konjugiert an Merrettichperoxidase, konjugiert in einem Verhältnis von 1/10000 in PBS mit 0,1% TweenTM, gefolgt von der Entwicklung der Markierung mit Tetramethylbenzidin-Substrat (TMB) für 4–5 Minuten in der Dunkelheit bei Raumtemperatur (z. B. 20°C), unter Zugabe von Schwefelsäure, um die Entwicklung der Markierung zu stoppen, und Ablesen der Markierung bei 450 nm).
    • 75. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 74 zum Exprimieren der Schwerketten aus Milz-B-Zellen in einer Maus, die einen normalen Anteil oder Prozentsatz an reifen Milz-B-Zellen produziert, z. B. wie durch FACS bestimmt.
  • Mit ”normal” ist vergleichbar zur reifen Milz-B-Zelt-Produktion in einer Maus (z. B. einer naïven Maus) gemeint, welche nur Maus-Antikörperketten exprimiert, z. B. eine Maus, deren Genom nur funktionelle Wildtyp-Ig-Schwer- und Leichtkette-Loci umfasst, z. B. eine Wildtyp-Maus.
  • Zum Beispiel sind wenigstens 40, 50, 60 oder 70% der gesamten Milz-B-Zellen, die von der Maus der Erfindung produziert werden, reife B-Zellen. Milz-B-Zellen sind B220+ und exprimieren B220 bei relativ hohen Niveaus, wie der Fachmann wissen wird. Reife Milz-B-Zellen exprimieren B220 und IgD, beides auf relativ hohen Niveaus, wie der Fachmann wissen wird. IgM-Expression ist in reifen Milz-B-Zellen relativ niedrig, wiederum, wie allgemein im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel J Exp Med. 1999 Jul 5; 190(1):75-89; ”B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals”; Loder F et al.
  • Gegebenenfalls produziert die Maus ein normales Verhältnis von T1, T2 und reifen Milz-B-Zellen, z. B. wie durch FACS bestimmt. Zum Beispiel produziert die Maus der Erfindung etwa 40–70% reife Milz-B-Zellen, 15–35% Milz-T1-Zellen; und 5–10% Milz-T2-Zellen (Prozentsatz in Bezug auf die gesamte Milz-B220-positive (hohe) Population). Zum Beispiel etwa 40–60% reife Milz-B-Zellen, 15–30% Milz-T1-Zellen; und 5–10% Milz-T2-Zellen. Mit ”normal” ist vergleichbar zu einem T1/T2/reife Milz-B-Zellen-Proportionsanteil in einer Maus (z. B. einer naiven Maus) gemeint, welche nur Maus-Antikörperketten exprimiert, z. B. eine Maus, deren Genom nur funktionelle Wildtyp-Ig-Schwer- und Leichtkette-Loci umfasst, z. B. eine Wildtyp-Maus.
    • 76. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 75, wobei die Maus einen normalen Anteil oder Prozentsatz von reifen Milz-B-Zellen produziert, z. B. wie durch FACS bestimmt.
    • 77. Eine Maus, welche humane Variabelregionen umfassende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert oder zum Exprimieren dieser gestaltet ist, wobei die von der Maus exprimierten Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten sind; und in einer Maus exprimiert werden, welche einen normalen Anteil oder Prozentsatz von reifen Milz-B-Zellen produziert (z. B. wie durch FACS bestimmt); wobei die Maus einen humane VH-, DH- und JH-Gensegmente stromaufwärts von einer Maus-Konstantregion (z. B. C-mu und/oder C-delta und/oder C-gamma; wie (in einer 5'-nach-3'-Orientierung)) umfassenden Immunglobulin-Schwerkettelocus umfasst, und wobei die Maus einen normalen Anteil oder Prozentsatz an reifen Milz-B-Zellen produziert. Mit ”normal” ist vergleichbar zu einer Produktion reifer Milz-B-Zellen in einer Maus (z. B. einer naiven Maus) gemeint, welche nur Maus-Antikörperketten exprimiert, z. B. eine Maus, deren Genom nur funktionelle Wildtyp-Ig-Schwer- und Leichtkette-Loci umfasst, z. B. eine Wildtyp-Maus.
  • Zum Beispiel sind wenigstens 40, 50, 60 oder 70% der gesamten Milz-B-Zellen, die von der Maus der Erfindung produziert werden, reife B-Zellen. Milz-B-Zellen sind B220+ und exprimieren B220 bei relativ hohen Niveaus, wie der Fachmann wissen wird. Reife Milz-B-Zellen exprimieren B220 und IgD, beides auf relativ hohen Niveaus, wie der Fachmann wissen wird. IgM-Expression ist in reifen Milz-B-Zellen relativ niedrig, wiederum, wie allgemein im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel J Exp Med. 1999 Jul 5;190(1): 75-89; ”B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals”; Loder F et al.
  • Gegebenenfalls produziert die Maus ein normales Verhältnis von T1, T2 und reifen Milz-B-Zellen, z. B. wie durch FACS bestimmt. Zum Beispiel produziert die Maus der Erfindung etwa 40–70% reife Milz-B-Zellen, 15–35% Milz-T1-Zellen; und 5–10% Milz-T2-Zellen (Prozentsatz in Bezug auf die gesamte Milz-B220-positive (hohe) Population). Zum Beispiel etwa 40–60% reife Milz-B-Zellen, 15–30% Milz-T1-Zellen; und 5–10% Milz-T2-Zellen. Mit ”normal” ist vergleichbar zu einem T1/T2/reife Milz-B-Zellen-Proportionsanteil in einer Maus (z. B. einer naiven Maus) gemeint, welche nur Maus-Antikörperketten exprimiert, z. B. eine Maus, deren Genom nur funktionelle Wildtyp-Ig-Schwer- und Leichtkette-Loci umfasst, z. B. eine Wildtyp-Maus.
    • 78. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 77 zum Exprimieren der Schwerketten in einer Maus, die einen normalen Anteil oder Prozentsatz von Knochenmark-B-Zelle-Progenitor-Zellen produziert (z. B. wie durch FACS bestimmt).
  • In einer Ausführungsform ist die Maus zum Exprimieren der Schwerketten in einer Maus ausgestaltet, die einen normalen Anteil oder Prozentsatz von Knochenmark-prä-, -pro- und -präpro-B-Zellen produziert (z. B. wie durch FACS bestimmt). Siehe J Exp Med. 1991 May 1;173(5):1213-25; ”Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bonemarrow”; Hardy RR et al., für eingehendere Erörterungen zu Progenitorzellen.
  • Mit ”normal” ist vergleichbar zur Knochenmark-B-Zellproduktion in einer Maus (z. B. einer naiven Maus) gemeint, welche nur Maus-Antikörperketten exprimiert, z. B. eine Maus, deren Genom nur funktionelle Wildtyp-Ig-Schwer- und Leichtkette-Loci umfasst, z. B. eine Wildtyp-Maus.
    • 79. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 78, wobei die Maus einen normalen Anteil oder Prozentsatz von Knochenmark-B-Zell-Progenitorzellen produziert (z. B. wie durch FACS bestimmt).
  • In einer Ausführungsform produziert die Maus einen normalen Anteil oder Prozentsatz von Knochenmark-prä-, -pro- und -präpro-B-Zellen (z. B. wie durch FACS bestimmt).
  • Mit ”normal” ist vergleichbar zur Knochenmark-B-Zellproduktion in einer Maus (z. B. einer naiven Maus) gemeint, welche nur Maus-Antikörperketten exprimiert, z. B. eine Maus, deren Genom nur funktionelle Wildtyp-Ig-Schwer- und Leichtkette-Loci umfasst, z. B. eine Wildtyp-Maus.
    • 80. Eine Maus, welche Human-Variabelregionen umfassende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert oder zum Exprimieren dieser gestaltet ist, wobei die von der Maus exprimierten Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten sind; und exprimiert werden in einer Maus, welche einen normalen Anteil oder Prozentsatz von Knochenmark-B-Zell-Progenitorzellen produziert (z. B. wie durch FACS bestimmt), wobei die Maus einen Immunglobulin-Schwerkettelocus, umfassend humane VH-, DH- und JH-Gensegmente stromaufwärts von einer Maus-Konstantregion (z. B. C-mu und/oder C-delta und/oder C-gamma; wie in einer 5'-nach-3'-Orientierung) umfasst, und wobei die Maus einen normalen Anteil oder Prozentsatz von Knochenmark-B-Zell-Progenitorzellen produziert.
  • In einer Ausführungsform ist die Maus zum Exprimieren der Schwerketten in einer Maus ausgestaltet, die einen normalen Anteil oder Prozentsatz von Knochenmark-prä-, -pro- und -präpro-B-Zellen produziert (z. B. wie durch FACS bestimmt).
  • Mit ”normal” ist vergleichbar zur Knochenmark-B-Zellproduktion in einer Maus (z. B. einer naiven Maus) gemeint, welche nur Maus-Antikörperketten exprimiert, z. B. eine Maus, deren Genom nur funktionelle Wildtyp-Ig-Schwer- und Leichtkette-Loci umfasst, z. B. eine Wildtyp-Maus.
    • 81. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 80, wobei wenigstens 90% der Schwerketten Human-Variabelregionen umfassende Schwerketten sind.
  • Zum Beispiel umfassen wenigstens 90, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% oder 100% der Schwerketten Human-Variabelregionen, d. h., Variabelregionen, die aus der Rekombination von humanen VH- mit humanen D- und JH-Gensegmenten abgeleitet sind.
    • 82. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 81, wobei die Maus-Konstantregion eine Maus-C-mu-Region, eine C-delta-Region und eine C-gamma-Region umfasst.
  • In einer Ausführungsform ist jede von den C-Regionen eine endogene Maus-C-Region. In einer Ausführungsformwenigstens sind die C-mu- und die C-delta-Regionen Maus-C-Regionen. Dies ist nützlich zur Ausnutzung der endogenen Steuermechanismen, die an der Entwicklung der diversen B-Zelltypen und Progenitoren in der Milz und im Knochenmark beteiligt sind.
  • In einer Ausführungsform ist die C-gamma-Region eine humane C-gamma-Region. Dies ist vorteilhaft zur Herstellung von Klassen-getauschten Gamma-Typ-Schwerketten in der Maus, wobei im wesentlichen alle der exprimierten Schwerketten humane Variabelregionen und humane Konstantregionen aufweisen.
    • 83. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 82, wobei ein Maus-Schwerkette-Enhancer zwischen den humanen Gensegmenten und der Maus-Konstantregion vorhanden ist. Dies ist nützlich zur Ausnutzung der endogenen Maus-Antikörper- und B-Zell-Entwicklungs-Steuermechanismen.
    • 84. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 83, wobei ein Maus S-mu-Switch zwischen den humanen Gensegmenten und der Maus-Konstantregion vorhanden ist.
    • 85. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 84, wobei das Genom der Maus endogene Maus-Schwerkettelocus-V-, -D- und -J-Gensegmente stromaufwärts von den humanen Gensegmenten umfasst.
    • 86. Maus von Aspekt 85, wobei die Maus-V-, -D- und -J-Gensegmente zusammen mit den endogenen Intergen-Segmentsequenzen vorhanden sind.
    • 87. Maus von Aspekt 85 oder 86, wobei die Maus-Gensegmente in invertierter Orientierung vorliegen. Somit, sind sie invertiert in Bezug auf die Wildtyp-Orientierung in einem Mausgenom. Sie sind somit invertiert relativ zur Orientierung der Maus-Konstantregion.
    • 88. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 87, wobei die Maus folgendes exprimiert: Leichtketten, umfassend Human-Variabelregionen (z. B. Kappa-Leichtketten, umfassend humane Kappa-Variabelregionen). Dabei sind die humanen Variabelregionen der Rekombination von humanen VL- und JL-Gensegmenten, z. B. humanem Vκ und humanem Jκ, abgeleitet aus.
    • 89. Die Maus von Aspekt 88, umfassend humane Vκ- und Jκ-Gensegmente stromaufwärts von einem Maus-CL (z. B. endogenem Cκ); wobei gegebenenfalls die humanen Vκ- und Jκ-Gensegmente Vκ2-24, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-13, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2, Vκ4-1, Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 und Jκ5 umfassen. Dabei sind die Gensegmente gegebenenfalls die Allele der Tabelle 12.
    • 90. Die Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 89, wobei die humanen VH-, DH- und JH-Gensegmente humane VH-Gensegmente VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1 und alle der humanen D- und JH-Gensegmente D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 und 7-27; und J1, J2, J3, J4, J5 und J6 umfassen. Zum Beispiel umfassen die humanen VH-, DH- und JH-Gensegmente humane VH-Gensegmente VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1 und alle der humanen D- und JH-Gensegmente D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 3-10, 4-11, 5-12, 6-13, 1-14, 2-15, 3-16, 4-17, 5-18, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 4-23, 5-24, 6-25, 1-26 und 7-27; und J1, J2, J3, J4, J5 und J6. Dabei sind die Gensegmente gegebenenfalls die Allele der Tabelle 7.
    • 91. Verwendung der Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 90 zum Exprimieren von Immunglobulin-Schwerketten, umfassend humane Variabelregionen, wobei die von der Maus exprimierten Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten sind; und die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten als Teil von Serum-IgG1-, IgG2b- und IgM(und gegebenenfalls IgG2a)-Antikörpern in der Maus exprimiert werden. Die Verwendung ist eine nicht-therapeutische, nicht-diagnostische und nicht-chirurgische Verwendung.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Verwendung das Immunisieren der Maus mit einem Antigen (z. B. einem humanen Antigen) und das Isolieren eines IgG1-Antikörpers, der das Antigen spezifisch bindet.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Verwendung das Immunisieren der Maus mit einem Antigen (z. B. einem humanen Antigen) und das Isolieren eines IgG2a-Antikörpers, der das Antigen spezifisch bindet.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Verwendung das Immunisieren der Maus mit einem Antigen (z. B. einem humanen Antigen) und das Isolieren eines IgG2b-Antikörpers, der das Antigen spezifisch bindet. Gegebenenfalls umfasst die Verwendung das Herstellen eines Derivats von dem isolierten Antikörper. Beispiele von Derivat-Antikörpern (gemäß einem beliebigen Aspekt hierin) sind Antikörper, die ein oder mehrere Mutationen verglichen mit dem isolierten Antikörper aufweisen (z. B. zum Verbessern der Antigenbindungsaffinität und/oder zum Verstärken oder Inaktivieren der Fc-Funktion). Solche Mutanten binden spezifisch das Antigen.
    • 92. Verwendung der Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 90 zum Exprimieren von Human-Variabelregionen umfassenden Immunglobulin-Schwerketten, wobei die von der Maus exprimierten Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten sind und in einer Maus exprimiert werden, welche einen normalen Anteil oder Prozentsatz von reifen Milz-B-Zellen produziert. Die Verwendung ist eine nicht-therapeutische, nicht-diagnostische und nicht-chirurgische Verwendung.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Verwendung ferner das Isolieren von Milzgewebe (z. B. der Milz) aus der Maus; gegebenenfalls gefolgt von dem Isolieren von wenigstens einer antigenspezifischen B-Zelle aus dem Gewebe, wobei die B-Zelle(n) einen Antikörper exprimiert, der ein vorbestimmtes Antigen spezifisch bindet. In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Immunisieren der Maus mit dem Antigen vor dem Isolieren des Milzgewebes. In einem Beispiel umfasst die Verwendung das Isolieren eines Antikörpers, der durch die B-Zelle (oder durch ein Hybridom, hergestellt durch Fusion der B-Zelle mit einer Myelomzelle) produziert wird. Gegebenenfalls umfasst die Verwendung das Herstellen eines Derivats des isolierten Antikörpers. Beispiele von Derivat-Antikörpern (gemäß einem beliebigen Aspekt hierin) sind Antikörper, die eine oder mehrere Mutationen verglichen mit dem isolierten Antikörper aufweisen (z. B. zum Verbessern der Antigenbindungsaffinität und/oder zum Verstärken oder Inaktivieren der Fc-Funktion). Solche Mutanten binden spezifisch das Antigen.
    • 93. Verwendung der Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 90 zum Exprimieren von Human-Variabelregionen umfassenden Immunglobulin-Schwerketten, wobei die von der Maus exprimierten Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten sind und in einer Maus exprimiert werden, welche einen normalen Anteil oder Prozentsatz von Knochenmark-B-Zell-Progenitorzellen produziert. Die Verwendung ist eine nicht-therapeutische, nicht-diagnostische und nicht-chirurgische Verwendung.
    • 94. Verwendung der Maus von einem beliebigen der Aspekte 70 bis 90 für den Zweck, der in einem oder mehreren der Aspekte 70, 71, 73, 75 und 78 aufgeführt ist.
  • Die Expression (z. B. prozentmäßige Expression oder Expressionsanteil oder -niveau) von Ig kann auf der Ebene von Antikörperkette-mRNA-Transkripten in B-Zellen (z. B. Lymphozyten des peripheren Bluts) bestimmt werden. Alternativ oder zusätzlich wird der Prozentsatz der Expression auf der Antikörper-Ebene im Serum oder Blut der Wirbeltiere bestimmt. Zusätzlich oder alternativ kann die Expression durch FACS-Analyse von B-Zellen bestimmt werden.
  • In diesen Aspekten bedeutet ”Human-Variabelregionen umfassende Schwerketten” Variabelregionen, die aus der Rekombination von humanen VH-, D- und JH-Gensegmenten abgeleitet sind.
  • ”Im wesentlichen ausschließlich” umfassen die exprimierten Schwerketten Human-Variabelregionen, d. h. es gibt nur einen relativ sehr geringen oder sogar keine endogene Maus-Schwerkette-Variabelregion-Expression. Zum Beispiel sind wenigstens 90, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% oder 100% der Schwerketten Human-Variabelregionen umfassende Schwerketten. In einer Ausführungsformwenigstens sind 90% der Schwerketten Human-Variabelregionen umfassende Schwerketten. Die prozentmäßige Expression kann auf der Ebene von Schwerkette-mRNA-Transkripten in B-Zellen (z. B. Lymphozyten des peripheren Bluts) bestimmt werden. Alternativ oder zusätzlich wird der Prozentsatz der Expression auf der Ebene von Schwerketten oder Antikörpern im Serum oder Blut der Mäuse bestimmt. Zusätzlich oder alternativ kann die Expression durch FACS-Analyse von B-Zellen bestimmt werden.
  • Die Maus kann jedweden endogenen Schwerkettelocus umfassen, in dem humane V-, D- und J-Gensegmente vorhanden sind, wie hierin beschrieben. In einem Beispiel umfasst das Mausgenom einen Maus-Schwerkettelocus, in dem wenigstens humane VH-Gensegmente VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1 und alle der humanen D- und JH-Gensegmente D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 und 7-27; und J1, J2, J3, J4, J5 und J6 stromaufwärts der Maus-Konstantregion vorliegen.
  • Das Wirbeltier in diesen Aspekten ist zum Beispiel naïv (d. h., nicht immunisiert mit einem vorbestimmten Antigen, wie der Begriff im Fachgebiet verstanden wird; zum Beispiel ein derartiges Wirbeltier, das in einer relativ sterilen Umgebung gehalten worden ist, wie bereitgestellt durch eine Tierhaltungseinrichtung, die für Forschung & Entwicklung verwendet wird). In einem anderen Beispiel wurde das Wirbeltier mit einem vorbestimmten Antigen immunisiert, z. B. einem Antigen, das ein humanes Epitop trägt.
  • In einer Ausführungsform bilden die Schwerketten, zusammen mit Leichtketten, exprimiert in den Mäusen der Erfindung, Antikörper (Ig) aus. Die Leichtketten können von irgendeinem transgenen Leichtkettelocus exprimiert werden, wie hierin beschrieben. Zum Beispiel umfasst das Genom der Maus einen Schwerkettelocus, in dem ein chimärer Immunglobulin-Schwerkettelocus vorliegt, umfassend ein oder mehrere humane V-Gensegmente, ein oder mehrere humane D-Gensegmente und ein oder mehrere humane J-Gensegmente stromaufwärts von einer mu-Konstantregion der nicht-humanen Spezies; wobei endogene Schwerkette-Expression im wesentlichen inaktiviert worden ist; und der Schwerkettelocus einen Eμ-Enhancer aus der nicht-humanen Wirbeltierspezies umfasst.
  • In einer Ausführungsform von jedwedem Aspekt ist endogene Leichtkette(z. B. kappa und/oder lambda)-Expression im wesentlichen inaktiv oder inaktiviert, zum Beispiel unter Verwendung eines Verfahrens, wie hierin beschrieben. In diesem Fall werden weniger als 10, 5, 4, 3, 2, 1 oder 0,5% von solchen endogenen Lambda-Leichtketten exprimiert oder sind exprimierbar. Zusätzlich oder alternativ werden weniger als 10, 5, 4, 3, 2, 1 oder 0,5% von solchen endogenen Kappa-Leichtketten exprimiert oder sind exprimierbar. In einem Beispiel herrscht eine vollständige Inaktivierung von endogener Kappa- und/oder Lambda-Expression, so dass gar keine solchen Leichtketten exprimiert werden oder exprimierbar sind.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Genom der Maus humane Kappa-Gensegmente (gegebenenfalls die Allele der Tabelle 12)
    • (i) Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ1-8 und Vκ1-9 (und gegebenenfalls Vκ5-2 und Vκ4-1); oder
    • (ii) Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ3-20 (und gegebenenfalls Vκ2-24 und/oder Vκ1-13); or
    • (iii) Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ3-20, Vκ2-24, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-30 und Vκ1-33 (und gegebenenfalls Vκ2-29 und/oder Vκ2-40 und/oder Vκ1-39); und gegebenenfalls
    • (iv) Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 und Jκ5.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Genom auch (i) wenigstens humane VH-Gensegmente VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1 und alle von den humanen D- und JH-Gensegmenten D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 und 7-27; und J1, J2, J3, J4, J5 und J6 (gegebenenfalls die Allele der Tabelle 7) und (ii) wenigstens die humanen Gensegmente Vκ2-24, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-13, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2, Vκ4-1, Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 und Jκ5 (gegebenenfalls die Allele der Tabelle 12). Wie in Beispiel 16 demonstriert, sind solche Mäuse vollständig funktionell in Hinsicht auf Rearrangement, BCR-Signalgebung und B-Zell-Reifung. Mehr als 90% der von den Mäusen exprimierten Antikörper umfassten humane Schwerkette-Variabelregionen und humane Kappa-Leichtkette-Variabelregionen. Diese Mäusen sind deshalb sehr nützlich für die Selektion von Human-Variabelregionen aufweisenden Antikörpern, die spezifisch humanes Antigen nach der Immunisierung der Mäuse mit einem solchen Antigen binden. Im Anschluss an die Isolation eines solchen Antikörpers kann der Fachmann die Maus-Konstantregionen mit humanen Konstantregionen unter Verwendung herkömmlicher Techniken ersetzen, um zu vollständig humanen Antikörpern zu gelangen, welche als Arzneistoffkandidaten zur Verabreichung an Menschen (gegebenenfalls im Anschluss an Mutation oder Adaptation zur Erzeugung eines weiteren Derivats, z. B. mit Fc-Verstärkung oder -Inaktivierung, oder im Anschluss an Konjugation an eine toxische Nutzlast oder einen Reporter oder eine Markierung oder eine sonstige aktive Einheit) nützlich sind.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Genom auch einen humanen iEκ und/oder humanen 3'Eκ stromabwärts von den humanen J-Gensegmenten in dem Locus.
  • Die Erfindung beinhaltet auch die folgenden Klauseln:
  • Klausel 1. Eine Maus, die Human-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert,
    wobei die Maus ein Genom umfasst, das einen Immunglobulin-Schwerkettelocus, umfassend humane VH-, DH- und JH-Gensegmente, positioniert stromaufwärts einer Maus-Konstantregion, einschließt;
    wobei die Maus folgendes exprimiert: Immunglobulin-Schwerketten, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 90% der von der Maus exprimierten Immunglobulin-Schwerketten eine humane Variabelregion umfassen; und
    wobei die Maus folgendes exprimiert: Serum-IgG1-, -IgG2b- und -IgM-Antikörper, umfassend die eine Human-Variabelregion enthaltenden Schwerketten.
  • Klausel 2. Maus, welche Human-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert,
    wobei die Maus ein Genom umfasst, das einen Immunglobulin-Schwerkettelocus einschließt, umfassend humane VH-, DH- und JH-Gensegmente, welche stromaufwärts einer Maus-Konstantregion positioniert sind;
    wobei die Maus folgendes exprimiert: Immunglobulin-Schwerketten, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 90% der von der Maus exprimierten Immunglobulin-Schwerketten eine Human-Variabelregion umfassen; und
    wobei die Maus einen normalen Anteil von reifen Milz-B-Zellen produziert;
    wobei der normale Anteil ein Anteil von reifen Milz-B-Zellen ist, produziert von einer Maus, die Maus-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert und nicht Human-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert.
  • Klausel 3. Maus, welche Human-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert,
    wobei die Maus ein Genom umfasst, das einen Immunglobulin-Schwerkettelocus einschließt, umfassend humane VH-, DH- und JH-Gensegmente, welche stromaufwärts einer Maus-Konstantregion positioniert sind;
    wobei die Maus folgendes exprimiert: Immunglobulin-Schwerketten, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 90% der von der Maus exprimierten Immunglobulin-Schwerketten eine Human-Variabelregion umfassen; und
    wobei die Maus einen normalen Anteil von Knochenmark-B-Zell-Progenitorzellen produziert;
    wobei der normale Anteil ein Anteil von Knochenmark-B-Zell-Progenitorzellen ist, produziert von einer Maus, die Maus-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert und nicht Human-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert.
  • Klausel 4. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei die Maus folgendes exprimiert: einen normalen Anteil von IgG1, IgG2b und IgM in einer Probe von Serum, die aus der Maus erhalten wurde;
    wobei der normale Anteil ein Anteil so ist, wie produziert von einer Maus, die Maus-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert und nicht Human-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert.
  • Klausel 5. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei es sich bei der Maus-Konstantregion um C-mu, C-delta und/oder C-gamma handelt.
  • Klausel 6. Maus von Klausel 5, wobei die Maus-Konstantregion wenigstens C-mu, C-delta und C-gamma ist.
  • Klausel 7. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei die Maus-Konstantregion eine endogene Maus-C-Region ist.
  • Klausel 8. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei die Maus eine humane C-Gamma-Region exprimiert.
  • Klausel 9. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei die Maus eine naïve Maus ist.
  • Klausel 10. Maus von Klausel 1, wobei die Maus folgendes exprimiert: Serum-IgG2a, umfassend die Schwerketten, die eine Human-Variabelregion enthalten.
  • Klausel 11. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei die Maus folgendes exprimiert: Ig-Subtypen in einem relativen Anteil von
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 25–350 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–200 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 30–800 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–300 μg/ml; oder
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 10–600 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–500 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 20–700 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–700 μg/ml;
    wie bestimmt durch Immunglobulin-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils umfassend eine Markierung, und Quantifizierung von jedem Immunglobulin basierend auf dem Spiegel von jeder Markierung.
  • Klausel 12. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei die Maus folgendes exprimiert: Ig-Subtypen in einem relativen Anteil von
    • (i) Gesamtserum-IgG und -IgM in einer Konzentration von etwa 200–2500 μg/ml; und
    • (ii) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 100–800 μg/ml;
    wie bestimmt durch Immunglobulin-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils umfassend eine Markierung, und Quantifizierung von jedem Immunglobulin basierend auf dem Spiegel von jeder Markierung.
  • Klausel 13. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei die Maus folgendes exprimiert: besagte Immunglobulin-Schwerketten aus Milz-B-Zellen, und wobei die Maus einen normalen Anteil von reifen Milz-B-Zellen in Gesamt-Milzzellen, umfassend reife B-Zellen und Milz-T1- und -T2-Zellen, produziert.
  • Klausel 14. Maus von einer beliebigen der Klauseln 1-3, wobei wenigstens 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% der von der Maus exprimierten Immunglobulin-Schwerketten Humane-Variabelregionen umfassende Immunglobulin-Schwerketten sind.
  • Klausel 15. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei ein Maus-Immunglobulin-Schwerkette-Enhancer in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus zwischen den humanen VH-, DH- und JH-Gensegmenten und der Maus-Konstantregion positioniert ist.
  • Klausel 16. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei ein Maus-S-mu-Switch in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus zwischen den humanen VH-, DH- und JH-Gensegmenten und der Maus-Konstantregion positioniert ist.
  • Klausel 17. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei endogene Maus-Immunglobulin-Schwerkette-V-, -D- und -J-Gensegmente in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus stromaufwärts der humanen VH-, DH- und JH-Gensegmente positioniert sind.
  • Klausel 18. Maus von Klausel 17, wobei die Maus-Immunglobulin-Schwerkette-V-, -D- und -J-Gensegmente in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus mit endogenen Intergen-Segment-Sequenzen vorhanden sind.
  • Klausel 19. Maus von Klausel 17 oder 18, wobei die Maus-Immunglobulin-Schwerkette-V-, -D- und J-Gensegmente in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus in einer Orientierung positioniert sind, welche invertiert ist relativ zu seiner natürlichen endogenen Orientierung.
  • Klausel 20. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei die Maus humane Kappa-Variabelregionen enthaltende Leichtketten exprimiert.
  • Klausel 21. Maus von Klausel 20, wobei die Maus Immunglobulin-Leichtketten exprimiert, die aus der Rekombination von Vκ mit humanem Jκ abgeleitet sind.
  • Klausel 22. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei die Maus humane Lambda-Variabelregionen enthaltende Leichtketten exprimiert.
  • Klausel 23. Maus von Klausel 22, wobei die Maus Immunglobulin-Leichtketten exprimiert, die aus der Rekombination von Vλ mit humanem Jλ abgeleitet sind.
  • Klausel 24. Maus von Klausel 21, umfassend ein Genom, das humane Vκ und Jκ-Gensegmente, positioniert in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus stromaufwärts einer Maus CL, einschließt.
  • Klausel 25. Maus von Klausel 24, wobei das Maus-CL ein endogenes Cκ ist.
  • Klausel 26. Maus der Klauseln 24 oder 25, wobei die humanen Vκ und Jκ-Gensegmente Vκ2-24, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-13, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2, Vκ4-1, Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 und Jκ5 umfassen.
  • Klausel 27. Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln, wobei die humanen VH-, DH- und JH-Gensegmente enthalten
    humane VH-Gensegmente: VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1;
    humane DH-Gensegmente: D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 und 7-27; und
    humane JH-Gensegmente: J1, J2, J3, J4, J5 und J6.
  • Klausel 28. Verfahren zum Erhalten von einer oder mehreren Human-Variabelregionen enthaltenden Immunglobulin-Schwerketten, umfassend das Bereitstellen der Maus von beliebigen der vorangehenden Klauseln und das Isolieren von einer oder mehreren Immunglobulin-Schwerketten.
  • Klausel 29. Das Verfahren der Klausel 28, wobei jede Immunglobulin-Schwerkette in einem Antikörper eingeschlossen ist.
  • Klausel 30. Das Verfahren der Klausel 29, wobei die Schwerkette und/oder der Antikörper, enthaltend die Schwerkette, nach dem Isolieren modifiziert wird.
  • Klausel 31. Das Verfahren der Klausel 28, wobei ein Schritt des Immunisierens der Maus mit einem Antigen vor dem Schritt des Isolierens der Immunglobulin-Schwerketten durchgeführt wird.
  • Klausel 31a. Das Verfahren der Klausel 30, wobei das Antigen ein humanes Antigen ist.
  • Klausel 32. Das Verfahren der Klausel 30, 31 oder 31a, wobei die Immunglobulin-Schwerketten eingeschlossen sind in einem IgG1-Antikörper, -Antikörperfragment oder -Antikörperderivat, welches spezifisch das Antigen bindet.
  • Klausel 33. Das Verfahren der Klausel 30, 31 oder 31a, wobei die Immunglobulin-Schwerketten eingeschlossen sind in einem IgG2a-Antikörper, -Antikörperfragment oder -Antikörperderivat, welches spezifisch das Antigen bindet.
  • Klausel 34. Das Verfahren der Klausel 30, 31 oder 31a, wobei die Immunglobulin-Schwerketten eingeschlossen sind in einem IgG2b-Antikörper, -Antikörperfragment oder -Antikörperderivat, welches spezifisch das Antigen bindet.
  • Klausel 35. Das Verfahren der Klausel 30, 31 oder 31a, wobei die Immunglobulin-Schwerketten eingeschlossen sind in einem IgM-Antikörper, -Antikörperfragment oder -Antikörperderivat, welches spezifisch das Antigen bindet.
  • Klausel 36. Antikörper oder Immunglobulin-Schwerkette, isoliert in dem Verfahren von einem beliebigen der Klauseln 28 bis 35, oder ein antigenbindendes Fragment oder Derivat von dem Antikörper oder der Schwerkette.
  • Klausel 37. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper, das Antikörperfragment oder das Antikörperderivat von Klausel 36 und ein pharmazeutisch annehmbares Trägermittel, Exzipiens oder Verdünnungsmittel.
  • Klausel 38. Verfahren zum Isolieren von Milzgewebe, umfassend das Bereitstellen der Maus von 1 bis 27,
    Gewinnen einer Milz oder eines Teils davon aus der Maus, und Erhalten von Gewebe aus der Milz oder dem Teil.
  • Klausel 39. Das Verfahren der Klausel 38, ferner umfassend das Isolieren von wenigstens einer antigenspezifischen B-Zelle aus dem Milzgewebe, wobei die B-Zelle eine Schwerkette exprimiert, die eine humane Variabelregion enthält.
  • Klausel 40. Das Verfahren der Klausel 38 oder 39, wobei ein Schritt des Immunisierens der Maus mit einem Antigen vor dem Schritt des Gewinnens einer Milz aus der Maus durchgeführt wird.
  • Klausel 41. Das Verfahren der Klausel 40, wobei das Antigen ein humanes Antigen ist.
  • Klausel 42. Das Verfahren der Klausel 40 oder 41, wobei die wenigstens eine antigenspezifische B-Zelle einen IgG1-, IgG2a-, IgG2b- oder IgM-Antikörper produziert, der die Schwerkette umfasst, wobei der Antikörper das Antigen spezifisch bindet.
  • Klausel 43. Das Verfahren der Klauseln 38 bis 42, wobei die wenigstens eine antigenspezifische B-Zelle, welche die Schwerkette produziert, mit einer immortalen Myelomzelle unter Bildung einer Hybridomzelle fusioniert wird.
  • Klausel 44. Das Verfahren der Klauseln 38 bis 43, ferner umfassend einen Schritt des Isolierens einer Immunglobulin-Schwerkette aus der B-Zelle oder der Hybridomzelle.
  • Klausel 45. Ein Antikörper oder eine Immunglobulin-Schwerkette, isoliert in dem Verfahren der Klausel 44, oder ein antigenbindendes Fragment oder Derivat des Antikörpers oder der Schwerkette.
  • Klausel 46. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper, das Antikörperfragment oder das Antikörperderivat der Klausel 45 und ein pharmazeutisch annehmbares Trägermittel, Exzipiens oder Verdünnungsmittel.
  • Klausel 47. Verfahren zum Erhalten eines humanisierten Antikörpers, umfassend
    Auswählen einer Maus, die Human-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert,
    wobei die Maus ein Genom umfasst, das einen Immunglobulin-Schwerkettelocus einschließt, der humane VH-, DH- und JH-Gensegmente, positioniert stromaufwärts einer Maus-Konstantregion, umfasst,
    wobei die Maus folgendes exprimiert: Immunglobulin-Schwerketten, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 90% der von der Maus exprimierten Immunglobulin-Schwerketten eine Human-Variabelregion enthaltende Immunglobulinschwerketten sind,
    wobei die Maus folgendes exprimiert: Serum-IgG1-, -IgG2b- und -IgM-Antikörper, umfassend die eine Human-Variabelregion enthaltenden Schwerketten,
    wobei die Maus einen normalen Anteil von reifen Milz-B-Zellen produziert,
    wobei die Maus einen normalen Anteil von Knochenmark-B-Zell-Progenitorzellen produziert, und
    wobei die Maus einen normalen Anteil von IgG1, IgG2a, IgG2b und IgM in einer Probe von aus der Maus erhaltenem Serum exprimiert, und
    wobei jeder besagte normale Anteil ein Anteil ist, produziert durch eine Maus, die Maus-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert und nicht Human-Variabelregionen enthaltende Immunglobulin-Schwerketten exprimiert;
    Entnehmen von Serum aus der Maus; und
    Erhalten eines Pools von humanisierten Antikörpern, umfassend IgG1-, IgG2b- und IgM-Antikörper, aus dem Serum.
  • Klausel 48. Das Verfahren der Klausel 47, umfassend einen Schritt des Immunisierens der Maus mit einem Antigen vor dem Schritt des Entnehmens von Serum aus der Maus.
  • Klausel 49. Das Verfahren der Klausel 48, ferner umfassend Schritte des Kontaktierens des Pools von humanisierten Antikörpern mit dem Antigen;
    Bindens des Antigens mit einem humanisierten Antikörper in dem Pool von humanisierten Antikörpern; und
    Isolierens des humanisierten Antikörpers, der an das Antigen bindet.
  • Klausel 50. Das Verfahren der Klausel 49, ferner umfassend Schritte des
    Kontaktierens des humanisierten Antikörpers, der an das Antigen bindet, mit einem Isotyp-spezifischen Antikörper, wobei der isotypspezifische Antikörper IgG1, IgG2a, IgG2b oder IgM erkennt; und
    Isolieren des humanisierten Antikörpers, der an den isotypspezifischen Antikörper bindet.
  • Klausel 51. Das Verfahren der Klausel 48, ferner umfassend die Schritte des
    Entnehmens der Milz oder Gewebe davon aus der Maus,
    Isolierens von B-Zellen aus Milzgewebe,
    Fusionierens der B-Zellen mit immortalen Myelomzellen unter Erzeugung von Hybridomzellen, die einen Pool von humanisierten Antikörpern exprimieren, umfassend IgG-Antikörper aus dem Serum, wobei der Pool von Antikörpern in dem Verfahren von Klausel 48 verwendet wird.
  • Klausel 52. Das Verfahren von beliebigen der Klauseln 47–51, wobei die ausgewählte Maus Maus-Immunglobulin-Schwerkette-V-, D- und J-Gensegmente umfasst, welche in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus in einer Orientierung positioniert sind, welche relativ zu seiner natürlichen endogenen Orientierung invertiert ist.
  • Klausel 53. Das Verfahren von beliebigen der Klauseln 47–52, wobei die Maus Ig-Subtypen exprimiert, in einem relativen Anteil von
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 25–350 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–200 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 30–800 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–300 μg/ml; oder
    • (i) Serum-IgG1 in einer Konzentration von etwa 10–600 μg/ml;
    • (ii) Serum-IgG2a in einer Konzentration von etwa 0–500 μg/ml;
    • (iii) Serum-IgG2b in einer Konzentration von etwa 20–700 μg/ml; und
    • (iv) Serum-IgM in einer Konzentration von etwa 50–700 μg/ml;
    wie bestimmt durch Immunglobulin-Einfang auf einer Platte, gefolgt von einer Inkubation mit Anti-Maus-Isotyp-spezifischen Antikörpern, jeweils umfassend eine Markierung, und Quantifizierung von jedem Immunglobulin basierend auf dem Spiegel von jeder Markierung.
  • Klausel 54. Das Verfahren von einer beliebigen der Klauseln 47 bis 53, wobei wenigstens 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% der von der Maus exprimierten Immunglobulin-Schwerketten Human-Variabelregionen umfassende Immunglobulin-Schwerketten sind.
  • Klausel 55. Das Verfahren von beliebigen Klauseln 47–54, wobei ein Maus-Immunglobulin-Schwerkette-Enhancer in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus zwischen den humanen VH-, DH- und JH-Gensegmenten und der Maus-Konstantregion positioniert ist.
  • Klausel 56. Das Verfahren von beliebigen der Klauseln 47–55, wobei ein Maus-S-mu-Switch in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus zwischen den humanen VH-, DH- und JH-Gensegmenten und der Maus-Konstantregion positioniert ist.
  • Klausel 57. Das Verfahren von beliebigen der Klauseln 47–56, wobei endogene Maus-Immunglobulin-Schwerkette-V-, -D- und -J-Gensegmente in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus stromaufwärts der humanen VH-, DH- und JH-Gensegmente positioniert sind.
  • Klausel 58. Das Verfahren der Klausel 57, wobei die Maus-Immunglobulin-Schwerkette-V-, -D- und -J-Gensegmente in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus mit endogenen Intergen-Segment-Sequenzen vorhanden sind.
  • Klausel 59. Das Verfahren der Klausel 57 oder 58, wobei die Maus-Immunglobulin-Schwerkette-V-, -D- und -J-Gensegmente in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus in einer Orientierung positioniert sind, die relativ zu seiner natürlichen endogenen Orientierung invertiert ist.
  • Klausel 60. Das Verfahren von beliebigen der Klauseln 47–59, wobei die Maus humane Kappa-Variabelregionen enthaltende Leichtketten exprimiert.
  • Klausel 61. Das Verfahren der Klausel 60, wobei die Maus folgendes exprimiert: Immunglobulin-Leichtketten enthaltend humane Jκ.
  • Klausel 62. Das Verfahren einer beliebigen der Klauseln 47–51, wobei die Maus folgendes exprimiert: Leichtketten enthaltend humane Lambda-Variabelregionen.
  • Klausel 63. Das Verfahren der Klausel 62, wobei die Maus folgendes exprimiert: Immunglobulin-Leichtketten enthaltend humane Jλ.
  • Klausel 64. Das Verfahren der Klausel 61, umfassend ein Genom, das humane Vκ- und Jκ-Gensegmente einschließt, die in dem Maus-Schwerkette-Immunglobulinlocus stromaufwärts von einer Maus CL positioniert sind.
  • Klausel 65. Die Maus der Klausel 64, wobei das Maus-CL ein endogenes Cκ ist.
  • Klausel 66. Die Maus der Klauseln 64 oder 65, wobei die humanen Vκ- und Jκ-Gensegmente Vκ2-24, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-13, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2, Vκ4-1, Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 und Jκ5 umfassen.
  • Klausel 67. Das Verfahren von beliebigen der Klauseln 47–51, wobei die humanen VH-, DH- und JH-Gensegmente folgendes enthalten:
    humane VH-Gensegmente: VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1;
    humane DH-Gensegmente: D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 und 7-27; und
    humane JH-Gensegmente: J1, J2, J3, J4, J5 und J6.
  • Nicht-humane Wirbeltiere, die Kappa- & Lambda-Variabelregionen exprimieren
  • (i) K- und L-Ketten, produziert in zum Menschen ähnlichen Verhältnissen
  • Dieser Aspekt der Erfindung ist nützlich zum Produzieren von Leichtketten, die nicht auf Nichtmensch-ähnliche Verhältnisse vorgeneigt sind. Zum Beispiel überwiegen in Mäusen Kappa-Typ-Leichtketten bei weitem gegenüber Lambda-Typ-Leichtketten (typischerweise in einer Größenordnung von 95% Kappa-Leichtketten: 5% Lambda-Leichtketten in einer Wildtypmaus). Menschen zeigen dahingegen typischerweise etwa 60% Kappa: etwa 40% Lambda. Daher ist die Lambda-Expression viel höher, als in einer Maus vorgefunden. Es wäre wünschenswert, ein nicht-humanes Wirbeltier, wie eine Maus oder eine Ratte, bereitzustellen, in welchem ein höherer Anteil von Lambda-Typ-Leichtketten exprimiert werden kann. Dies ist nützlich, wenn das Wirbeltier Leichtketten, die humane Lambda-Variabelregionen tragen, und andere Leichtketten, die humane Kappa-Variabelregionen tragen, exprimiert. Zu diesem Zweck haben die Erfinder erstmalig ein derartiges Wirbeltier präsentiert, welches vermehrte Lambda-Leichtketten exprimiert, und somit stellt die Erfindung folgendes bereit:-
    Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in ein oder mehrere endogene Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente umfasst, bereitgestellt durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers stromaufwärts von einer Konstantregion, wobei das Genom humane Vκ- und Jκ-Gensegmente umfasst, bereitgestellt durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers stromaufwärts von einer Konstantregion, wobei das Wirbeltier Immunglobulin-Leichtketten, umfassend Kappa-Leichtkette-Variabelregionen, und Immunglobulin-Leichtketten, umfassend Lambda-Leichtkette-Variabelregionen, exprimiert, wobei mehr als 20% von den durch das Wirbeltier exprimierten Leichtketten Lambda-Variabelregionen umfassen (z. B. wie durch FACS von Milz-B Zellen bestimmt).
  • Die übrigen Leichtketten exprimieren Kappa-Variabelregionen.
  • WO03047336 (ehrt die Erwünschtheit des Produzierens von menschenähnlichen Kappa:Lambda-Verhältnissen, aber darin wird keine befähigende oder plausible Offenbarung angegeben, wie man dies bewirken könnte.
  • (ii) K- und L-Ketten, produziert mit normalen B-Zellkompartimenten
  • Die Erfinder haben erfolgreich nicht-humane Wirbeltiere erzeugt, enthaltend die zielgerichtete Insertion von humanen V- und J-Lambda-Gensegmenten, um die Expression von humane Lambda-Variabelregionen umfassenden Leichtketten durch normale (d. h. vergleichbar mit Wildtyp-Wirbeltier-) B-Zell-Kompartimente zu ermöglichen. Hierfür haben die Erfinder derartige Wirbeltiere bereitgestellt, die in zweckdienlicher Weise solche Leichtketten mit guten Repertoires und zuverlässiger produzieren können als transgene nicht-humane Wirbeltiere des Stands der Technik, welche eingefasste B-Zell-Kompartimente von reduzierter Größe und Reife aufweisen und welche eigentlich noch nicht einmal humane Lambda-Variabelregionen beinhaltende Leichtketten produzieren können. Somit stellt die Erfindung folgendes bereit:-
    Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in ein oder mehrere endogene Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente, bereitgestellt durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers stromaufwärts von einer Konstantregion, umfasst, wobei das Genom humane Vκ- und Jκ-Gensegmente, bereitgestellt durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers stromaufwärts von einer Konstantregion, umfasst, wobei das Wirbeltier Immunglobulin-Leichtketten, umfassend Kappa-Leichtkette-Variabelregionen, und Immunglobulin-Leichtketten, umfassend Lambda-Leichtkette-Variabelregionen, exprimiert, und wobei das Wirbeltier einen normalen Anteil oder Prozentsatz von reifen Milz-B-Zellen (z. B. wie durch FACS von Milz-B Zellen bestimmt) produziert.
  • In Bezug auf die nicht-humanen Wirbeltiere (i) und (ii) werden die folgenden Ausführungsformen in Betracht gezogen (wenn nicht anderslautend angegeben, gilt jede Ausführungsform für (i) oder (ii)):-
    In einer Ausführungsform umfasst die humane Vλ- und Jλ-Insertion wenigstens die funktionellen humanen V- und J-Gensegmente, beinhaltet von einem humanen Lambdakette-Ig-Locus von Vλ3-27 bis Cλ7.
  • In einer Ausführungsform umfasst die humane Vλ- und Jλ-Insertion wenigstens humane V-Gensegmente Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 und Vλ3-1, gegebenenfalls die Allele der Tabelle 18.
  • In einer Ausführungsform umfasst die humane Vλ- und Jλ-Insertion ein, mehrere oder alle der humanen J-Gensegmente Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 und Jλ7.
  • In einer Ausführungsform umfasst die humane Vλ- und Jλ-Insertion eine Insertion von einem humanen Jλ-Cλ-Cluster, wobei der Cluster die J- und C-Gensegmente von Jλ1 bis Cλ7 umfasst.
  • In einer Ausführungsform umfasst die humane Vλ- und Jλ-Insertion eine Insertion von einem humanen Eλ-Enhancer. Zum Beispiel wird der Eλ-Enhancer in Keimbahnkonfiguration in Bezug auf ein humanes Jλ7 bereitgestellt, das auch von der Insertion beinhaltet ist. Zum Beispiel wird der Eλ-Enhancer in Keimbahnkonfiguration in Bezug auf einen humanen Jλ-Cλ-Cluster bereitgestellt, der auch von der Insertion beinhaltet ist, wobei der Cluster Jλ1 bis Cλ7 in humaner Keimbahnkonfiguration umfasst. In einer humanen Keimbahnkonfiguration liegt der Eλ-Enhancer 3' von dem Jλ-Cλ-Cluster.
  • In einer Ausführungsform oder Wirbeltier (i) oder (ii) wird die humane Vλ- und Jλ-Insertion durch eine Insertion von einer Sequenz, entsprechend den Koordinaten 22886217 bis 23327884 von humanem Chromosom 22, bereitgestellt.
  • In einer Ausführungsform oder Wirbeltier (ii), wird die humane Vλ- und Jλ-Insertion durch eine Insertion von einer Sequenz, entsprechend den Koordinaten 23064876 bis 23327884 von humanem Chromosom 22, bereitgestellt.
  • In einer Ausführungsform umfasst die humane Vκ- und Jκ-Insertion wenigstens die funktionellen humanen V- und J-Gensegmente, beinhaltet von einem humanen Kappa-Kette-Ig-Locus von Vκ1-33 bis Jκ5.
  • In einer Ausführungsform umfasst die humane Vκ- und Jκ-Insertion wenigstens humane V-Gensegmente Vκ1-33, Vκ2-30, Vκ2-29, Vκ2-28, Vκ1-27, Vκ2-24, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-13, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2 und Vκ4-1, gegebenenfalls die Allele der Tabelle 12.
  • In einer Ausführungsform umfasst die humane Vκ- und Jκ-Insertion ein, mehrere oder alle der humanen J-Gensegmente Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 und Jκ5, gegebenenfalls die Allele der Tabelle 12.
  • In einer Ausführungsform umfassen mehr als 30, 35, 40, 45 oder 50% der von dem Wirbeltier exprimierten Leichtketten Lambda-Variabelregionen.
  • In einer Ausführungsform umfassen 20 bis 40, 45 oder 50% der von dem Wirbeltier exprimierten Leichtketten Lambda-Variabelregionen. In einer Ausführungsform umfassen 30 bis 40, 45 oder 50% der von dem Wirbeltier exprimierten Leichtketten Lambda-Variabelregionen.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei den Kappa-Leichtkette-Variabelregionen um humane Kappa-Leichtkette-Variabelregionen.
  • In einer Ausführungsform sind die humanen Vκ- und Jκ-Gensegmente in einem endogenen Kappa-Leichtkettelocus des Wirbeltiers stromaufwärts von einer Kappa-Konstantregion vorhanden.
  • In einer Ausführungsform sind die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente in einem endogenen Kappa-Leichtkettelocus des Wirbeltiers vorhanden.
  • In einer Ausführungsform sind die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente in einem endogenen Lambda-Leichtkettelocus des Wirbeltiers vorhanden.
  • In einer Ausführungsform exprimiert das Wirbeltier Leichtketten, umfassend humane Kappa-Variabelregionen, und exprimiert Leichtketten, umfassend humane Lambda-Variabelregionen. In einem Beispiel ist endogene (nicht-humane Wirbeltier) Kappa-Kette-Expression im wesentlichen inaktiv oder ist inaktiv, und/oder endogene (nicht-humane Wirbeltier) Lambda-Kette-Expression ist im wesentlichen inaktiv oder ist inaktiv. Falls das Wirbeltier eine Maus ist, ist die Maus-Lambda-Kette-Expression typischerweise sehr niedrig (ungefähr 5% oder weniger), und in diesem Fall kann es nicht notwendig sein, das Mausgenom zu manipulieren, um endogene Lambda-Kette-Expression weiter zu inaktivieren. Somit, falls das Wirbeltier eine Maus ist, ist endogene Kappa-Kette-Expression im wesentlichen inaktiv oder ist inaktiv, und die Maus-Lambda-Kette-Expression beläuft sich auf 5% oder weniger von der gesamten Leichtkette-Expression.
  • In einer Ausführungsform produziert das Wirbeltier einen normalen Anteil oder Prozentsatz von reifen Milz-B-Zellen. Zum Beispiel kann dies durch FACS von aus dem Wirbeltier isolierten Milz-B-Zellen bestimmt werden.
  • In einer Ausführungsform produziert das Wirbeltier ein normales Verhältnis von T1-, T2- und reifen Milz-B-Zellen. Zum Beispiel kann dies durch FACS von aus dem Wirbeltier isolierten Milz-B-Zellen bestimmt werden.
  • In einer Ausführungsform sind wenigstens 40, 50, 60 oder 70% der gesamten von dem Wirbeltier produzierten Milz-B-Zellen reife B-Zellen. Zum Beispiel kann dies durch FACS von aus dem Wirbeltier isolierten Milz-B-Zellen bestimmt werden.
  • Weitere Feststellungen der Erfindung
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung folgendes:
    Ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder Wirbeltierzelle, dessen bzw. deren Genom humane VH-, D- und JH-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und/oder humane VL- und JL-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente mit der Konstantregion davon funktionsfähig verbunden sind, so dass das Wirbeltier oder die Zelle zum Exprimieren von Immunglobulin-Schwerketten und/oder -Leichtketten, umfassend humane VH- bzw. VL-Domänen, in der Lage ist, wobei der Schwerkettelocus ein humanes VH-Gensegment umfasst, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen D- und JH-Gensegment unter Erzeugung einer VH-Domäne, wobei der Leichtkettelocus ein humanes VL-Gensegment umfasst, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen JL-Gensegment unter Erzeugung einer VL-Domäne, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Schwer- und Leichtkette-Variabeldomänen exprimiert.
  • Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder eine nicht-humane Wirbeltierzelle, dessen bzw. deren Genom humane VH-, D- und JH-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente mit der Konstantregion davon funktionsfähig verbunden sind, so dass das Wirbeltier oder die Zelle zum Exprimieren von humane VH-Domänen umfassenden Immunglobulin-Schwerketten imstande ist, wobei der Schwerkettelocus ein humanes 01-Allel-VH-Gensegment umfasst, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen D- und JH-Gensegment unter Erzeugung einer VH-Domäne, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Schwerkette-Variabeldomäne exprimiert.
  • Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder eine nicht-humane Wirbeltierzelle, dessen bzw. deren Genom VL- und JL-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente mit der Konstantregion davon funktionsfähig verbunden sind, so dass das Wirbeltier oder die Zelle zum Exprimieren von humane VL-Domänen umfassenden Immunglobulin-Leichtketten imstande ist, wobei der Leichtkettelocus ein humanes 01-Allel-VL-Gensegment umfasst, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen JL-Gensegment unter Erzeugung einer VL-Domäne, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Leichtkette-Variabeldomäne exprimiert.
  • Gegebenenfalls besitzt das Wirbeltier oder die Zelle ein Genom, das den Schwerkettelocus und den Leichtkettelocus, die oben definiert sind, umfasst und deshalb einen Schwerkettelocus, umfassend ein humanes 01-Allel-VH-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen D- und JH-Gensegment unter Erzeugung einer VH-Domäne, und einen Leichtkettelocus, umfassend ein humanes 01-Allel-VL-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen JL-Gensegment unter Erzeugung einer VL-Domäne, umfasst.
  • In einer alternativen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier oder Wirbeltierzelle (z. B. eine Mauszelle oder Rattenzelle), dessen bzw. deren Genom ein oder mehrere humane VH-Gensegmente, ein oder mehrere humane JH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einer Schwerkette umfasst, wobei die Gensegmente mit der Konstantregion davon funktionsfähig verbunden sind, so dass die Zelle oder das Wirbeltier zum Produzieren einer Antikörperschwerkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette exprimiert, wobei die ein oder mehreren humanen VH-Gensegmente des Schwerkettelocus ein, mehrere oder alle der humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 und VH3-9*01, umfassen oder daraus bestehen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung sind die VH-Gensegmente aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 und VH3-20*d01 bestehenden Gruppe ausgewählt.
  • Für Ausführungsformen der Erfindung, welche zum Beispiel nur humane Schwerkette-Gensegmente definieren, kann der Leichtkettelocus rearrangierte oder nicht-rearrangierte VL- und JL-Gensegments umfassen, z. B. ein einzelnes rearrangiertes VJ (wie ein einzelnes rearrangiertes Vκ1-39/J). Zusätzlich oder alternativ kann der Leichtkettelocus zufallsmäßig integriert werden. In einer anderen Ausführungsform sind die VL- und JL-Segmente stromaufwärts von einem endogenen konstanten Leicht-Gensegment.
  • In einer weiteren alternativen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier oder Wirbeltierzelle (z. B. eine Mauszelle oder Rattenzelle), dessen bzw. deren Genom ein oder mehrere humane Jκ-Gensegmente und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente mit der Konstantregion davon funktionsfähig verbunden sind, so dass die Zelle oder das Wirbeltier zum Produzieren einer Antikörperleichtkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei die ein oder mehreren humanen Vκ-Gensegmente ein, mehrere oder alle der humanen Vκ-Gensegmente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01, umfassen oder daraus bestehen.
  • In einer alternative Ausführungsform betrifft die Erfindung ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder Wirbeltierzelle, dessen bzw. deren Genom humane VH-, D- und JH-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus umfasst, wobei die JH-Gensegmente JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 und/oder JH6*01 oder JH6*02 umfassen und die Gensegmente mit der Konstantregion davon funktionsfähig verbunden sind, so dass das Wirbeltier oder die Zelle zum Exprimieren von humane VH-Domänen umfassenden Immunglobulin-Schwerketten imstande ist, wobei der Schwerkettelocus ein humanes VH-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen D und einem der JH-Gensegmente unter Erzeugung einer VH-Domäne, umfasst, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Schwerkette-Variabeldomäne exprimiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die JH-Gensegmente JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 und JH6*02. In einer anderen Ausführungsform sind die JH-Gensegmente JH1*01, JH2*01, JH3*02, JH4*02, JH5*02 und JH6*01.
  • In einer Ausführungsform umfasst das nicht-humane Wirbeltier ferner ein oder mehrere von den VH-Gensegmenten und/oder ein oder mehrere von den D-Gensegmenten der Tabelle 7. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das nicht-humane Wirbeltier ferner die VH-Gensegmente und D-Gensegmente der Tabelle 3.
  • Ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder Wirbeltierzelle, dessen bzw. deren Genom VL- und JL-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die JL-Gensegmente Jκ1*01, Jκ2*01, Jκ3*01, Jκ4*01 und/oder Jκ5*01 umfassen und die Gensegmente mit der Konstantregion davon funktionsfähig verbunden sind, so dass das Wirbeltier oder die Zelle zum Exprimieren von humane VL-Domänen umfassenden Immunglobulin-Leichtketten imstande ist, wobei der Leichtkettelocus ein humanes VL-Gensegment umfasst, befähigt zum Rekombinieren mit einem von den humanen JL-Gensegmenten unter Erzeugung einer VL-Domäne, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Leichtkette-Variabeldomäne exprimiert.
  • In einer Ausführungsform umfasst das nicht-humane Wirbeltier ferner ein oder mehrere oder alle Vκ-Gensegment(e) der Tabelle 12. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das nicht-humane Wirbeltier ferner die Vκ-Gensegmente der Tabelle 10 oder 11.
  • Gegebenenfalls besitzt das Wirbeltier oder die Zelle ein Genom, umfassend den Schwerkettelocus und den Leichtkettelocus, die oben definiert sind, und umfasst daher einen Schwerkettelocus, umfassend ein humanes VH-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen D und einem von den JH-Gensegmenten unter Erzeugung einer VH-Domäne, und einen Leichtkettelocus, umfassend ein humanes VL-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren mit einem von den humanen JL-Gensegmenten unter Erzeugung einer VL-Domäne.
  • Es wird vorgesehen, dass in allen Ausführungsformen der Erfindung das Genom der Zelle oder des Wirbeltiers in Übereinstimmung mit der Erfindung nicht ein zweites humanes Allel von einem, mehreren oder allen der humanen Gensegment(e) umfassen kann.
  • In allen Ausführungsformen der Erfindung können die humanen JH-Gensegmente, D-Gensegmente und VH-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Schwerkettelocus sein, und/oder die humanen Jκ-Gensegmente und Vκ-Gensegmente können stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Leichtkettelocus sein.
  • In einer Ausführungsform ist der endogene Leichtkettelocus der endogene Kappa-Locus und in einer anderen Ausführungsform ist er der endogene Lambda-Locus.
  • Allelkombinationen
  • In einer Ausführungsform ist das Allel von dem Gensegment ein d01-Allel, gegebenenfalls ein d01-Allel, das in der Tabelle 7, Tabelle 12 oder Tabelle 18 offenbart ist.
  • In einer Ausführungsform besitzt das Wirbeltier oder die Zelle ein Genom, das ferner ein 02-, 03-, 04-, 05-, 10-, 12-, 18- oder d03-Allel umfasst, das offenbart in Tabelle 7, Tabelle 12 oder Tabelle 18 ist.
  • Die bevorzugten Allele der Erfindung sind in den Tabellen 1 bis 18 dargelegt, wie folgt: Tabelle 1: IgH-Allele #1 – S1-Allele
    Allel
    JH6 02
    JH5 02
    JH4 02
    JH3 02
    JH2 01
    JH1 01
    D7-27 02
    D1-26 01
    D6-25 01
    D5-24 01
    D4-23 01
    D3-22 01
    D2-21 02
    D1-20 01
    D6-19 01
    D5-18 01
    D4-17 01
    D3-16 02
    D2-15 01
    D1-14 01
    D6-13 01
    D5-12 01
    D4-11 01
    D3-10 01
    D3-9 01
    D2-2 02
    D1-1 01
    VH6-1 01
    VH1-2 02 oder 04
    VH1-3 01
    VH4-4 02
    VH7-4 01
    VH2-5 01 oder 10
    In einer alternativen Tabelle 1, kann das JH6-Allel JH6*01 sein. Tabelle 2: IgH-Allele #2 – S2-Allele
    ID
    JH6 02
    JH5 02
    JH4 02
    JH3 02
    JH2 01
    JH1 01
    D7-27 02
    D1-26 01
    D6-25 01
    D5-24 01
    D4-23 01
    D3-22 01
    D2-21 02
    D1-20 01
    D6-19 01
    D5-18 01
    D4-17 01
    D3-16 02
    D2-15 01
    D1-14 01
    D6-13 01
    D5-12 01
    D4-11 01
    D3-10 01
    D3-9 01
    D2-2 02
    D1-1 01
    VH6-1 01
    VH1-2 02 oder 04
    VH1-3 01
    VH4-4 02
    VH7-4 01
    VH2-5 01 oder 10
    VH3-7 01
    VH1-8 01
    VH3-9 01
    VH3-11 01
    VH3-13 01
    In einer alternativen Tabelle 2 kann das JH6-Allel JH6*01 sein. Tabelle 3: IgH-Allele #3 – S3-Allele
    ID Allel
    JH6 02
    JH5 02
    JH4 02
    JH3 02
    JH2 01
    JH1 01
    D7-27 02
    D1-26 01
    D6-25 01
    D5-24 01
    D4-23 01
    D3-22 01
    D2-21 02
    D1-20 01
    D6-19 01
    D5-18 01
    D4-17 01
    D3-16 02
    D2-15 01
    D1-14 01
    D6-13 01
    D5-12 01
    D4-11 01
    D3-10 01
    D3-9 01
    D2-2 02
    D1-1 01
    VH6-1 01
    VH1-2 02 oder 04
    VH1-3 01
    VH4-4 02
    VH7-4 01
    VH2-5 01 oder 10
    VH3-7 01
    VH1-8 01
    VH3-9 01
    VH3-11 01
    VH3-13 01
    VH3-15 01
    VH1-18 01
    VH3-20 01 oder d01
    VH3-21 01 oder 03
    VH3-23 04
    VH1-24 01 oder d01
    VH2-26 01 oder d01
    In einer alternativen Tabelle 3 kann das JH6-Allel JH6*01 sein. Tabelle 4: IgH-Allele #4 – S4-Allele
    ID Allel
    JH6 02
    JH5 02
    JH4 02
    JH3 02
    JH2 01
    JH1 01
    D7-27 02
    D1-26 01
    D6-25 01
    D5-24 01
    D4-23 01
    D3-22 01
    D2-21 02
    D1-20 01
    D6-19 01
    D5-18 01
    D4-17 01
    D3-16 02
    D2-15 01
    D1-14 01
    D6-13 01
    D5-12 01
    D4-11 01
    D3-10 01
    D3-9 01
    D2-2 02
    D1-1 01
    VH6-1 01
    VH1-2 02 oder 04
    VH1-3 01
    VH4-4 02
    VH7-4 01
    VH2-5 01 oder 10
    VH3-7 01
    VH1-8 01
    VH3-9 01
    VH3-11 01
    VH3-13 01
    VH3-15 01
    VH1-18 01
    VH3-20 01 oder d01
    VH3-21 01 oder d03
    VH3-23 04
    VH1-24 01 oder d01
    VH2-26 01 oder d01
    VH4-28 05
    VH3-30 18
    VH4-31 03
    VH3-33 01
    VH4-34 01
    VH4-39 01
    In einer alternativen Tabelle 4 kann das JH6-Allel JH6*01 sein. Tabelle 5: IgH-Allele #5 – S5-Allele
    ID Allel
    JH6 02
    JH5 02
    JH4 02
    JH3 02
    JH2 01
    JH1 01
    D7-27 02
    D1-26 01
    D6-25 01
    D5-24 01
    D4-23 01
    D3-22 01
    D2-21 02
    D1-20 01
    D6-19 01
    D5-18 01
    D4-17 01
    D3-16 02
    D2-15 01
    D1-14 01
    D6-13 01
    D5-12 01
    D4-11 01
    D3-10 01
    D3-9 01
    D2-2 02
    D1-1 01
    VH6-1 01
    VH1-2 02 oder 04
    VH1-3 01
    VH4-4 02
    VH7-4 01
    VH2-5 01 oder 10
    VH3-7 01
    VH1-8 01
    VH3-9 01
    VH3-11 01
    VH3-13 01
    VH3-15 01
    VH1-18 01
    VH3-20 01 oder d01
    VH3-21 01 oder 03
    VH3-23 04
    VH1-24 01 oder d01
    VH3-26 01 oder d01
    VH4-28 05
    VH3-30 18
    VH4-31 03
    VH3-33 01
    VH4-34 01
    VH4-39 01
    VH3-43 01
    VH1-45 02
    VH1-46 01
    VH3-48 01
    In einer alternativen Tabelle 5 kann das JH6-Allel JH6*01 sein. Tabelle 6: IgH-Allele #6 – S6-Allele
    ID Allel
    JH6 02
    JH5 02
    JH4 02
    JH3 02
    JH2 01
    JH1 01
    D7-27 02
    D1-26 01
    D6-25 01
    D5-24 01
    D4-23 01
    D3-22 01
    D2-21 02
    D1-20 01
    D6-19 01
    D5-18 01
    D4-17 01
    D3-16 02
    D2-15 01
    D1-14 01
    D6-13 01
    D5-12 01
    D4-11 01
    D3-10 01
    D3-9 01
    D2-2 02
    D1-1 01
    VH6-1 01
    VH1-2 02 oder 04
    VH4-4 02
    VH7-4 01
    VH2-5 01 oder 10
    VH3-7 01
    VH1-8 01
    VH3-9 01
    VH3-11 01
    VH3-13 01
    VH3-15 01
    VH1-18 01
    VH3-20 01 oder d01
    VH3-21 01 oder 03
    VH3-23 04
    VH1-24 01 oder d01
    VH2-26 01 oder d01
    VH4-28 05
    VH3-30 18
    VH4-31 03
    VH3-33 01
    VH4-34 01
    VH4-39 01
    VH3-43 01
    VH1-45 02
    VH1-46 01
    VH3-48 01
    VH3-49 05
    VH5-51 01
    VH3-53 01
    VH1-58 01
    VH4-59 01 oder 05
    VH4-61 01
    VH3-64 02
    VH3-66 03
    VH1-69 12
    In einer alternativen Tabelle 6 kann das JH6-Allel JH6*01 sein. Tabelle 7: IgH-Allele #7 – S7-Allele (ein komplettes Repertoire von funktionellen IgH-Gensegmenten)
    ID Allel
    1 JH6 02
    2 JH5 02
    3 JH4 02
    4 JH3 02
    5 JH2 01
    6 JH1 01
    7 D7-27 02
    8 D1-26 01
    9 D6-25 01
    10 D5-24 01
    11 D4-23 01
    12 D3-22 01
    13 D2-21 02
    14 D1-20 01
    15 D6-19 01
    16 D5-18 01
    17 D4-17 01
    18 D3-16 02
    19 D2-15 01
    20 D1-14 01
    21 D6-13 01
    22 D5-12 01
    23 D4-11 01
    24 D3-10 01
    25 D3-9 01
    26 D2-2 02
    27 D1-1 01
    28 VH6-1 01
    29 VH1-2 02 oder 04
    30 VH1-3 01
    31 VH4-4 02
    32 VH7-4 01
    33 VH2-5 01 oder 10
    34 VH3-7 01
    35 VH1-8 01
    36 VH3-9 01
    37 VH3-11 01
    38 VH3-13 01
    39 VH3-15 1.1 01
    40 VH1-18 01
    41 VH3-20 01 oder d01
    42 VH3-21 01 oder 03
    43 VH3-23 04
    44 VH1-24 01 oder d01
    45 VH2-26 01 oder d01
    46 VH4-28 05
    47 VH3-30 18
    48 VH4-31 03
    49 VH3-33 01
    50 VH4-34 01
    51 VH4-39 01
    52 VH3-43 01
    53 VH1-45 02
    54 VH1-46 01
    55 VH3-48 01
    56 VH3-49 05
    57 VH5-51 01
    58 VH3-53 01
    59 VH1-58 01
    60 VH4-59 01 oder 05
    61 VH4-61 01
    62 VH3-64 02
    63 VH3-66 03
    64 VH1-69 12
    65 VH2-71 04
    66 VH3-72 01
    67 VH3-73 02
    68 VH3-74 01
    In einer alternativen Tabelle 7 kann das JH6-Allel JH6*01 sein. Tabelle 8: Igκ-Allele #1 – K1-Allele
    ID Allel
    Jκ5 01
    Jκ4 01
    Jκ3 01
    Jκ2 01 oder 04
    Jκ1 01
    Vκ4-1 01
    Vκ5-2 01 oder d01
    Vκ1-5 03
    Vκ1-6 01
    Vκ1-8 01
    Vκ1-9 01 oder d01
    Tabelle 9: Igκ-Allele #2 – K2-Allele
    1.2 ID Allel
    Jκ5 01
    Jκ4 01
    Jκ3 01
    Jκ2 01 oder 04
    Jκ1 01
    Vκ4-1 01
    Vκ5-2 01 oder d01
    Vκ1-5 03
    Vκ1-6 01
    Vκ1-8 01
    Vκ1-9 01 oder d01
    Vκ3-11 01
    Vκ1-12 01
    Vκ1-13 01
    Vκ3-15 01
    Vκ1-16 02
    Vκ1-17 01
    Vκ3-20 01
    Vκ6-21 01
    Vκ2-24 01
    Tabelle 10: Igκ-Allele #3 – K3-Allele
    1.3 ID Allel
    Jκ5 01
    Jκ4 01
    Jκ3 01
    Jκ2 01 oder 04
    Jκ1 01
    Vκ4-1 01
    Vκ5-2 01 oder d01
    Vκ1-5 03
    Vκ1-6 01
    Vκ1-8 01
    Vκ1-9 01 oder d01
    Vκ3-11 01
    Vκ1-12 01
    Vκ1-13 01
    Vκ3-15 01
    Vκ1-16 02
    Vκ1-17 01
    Vκ3-20 01
    Vκ6-21 01
    Vκ2-24 01
    Vκ1-27 01
    Vκ2-28 01
    Vκ2-29 01
    Vκ2-30 01
    Vκ1-33 01
    Vκ1D-39 01
    Vκ2D-40 01
    Tabelle 11: Igκ-Allele #4 – K4-Allele
    1.4 ID Allel
    Jκ5 01
    Jκ4 01
    Jκ3 01
    Jκ2 01 oder 04
    Jκ1 01
    Vκ4-1 01
    Vκ5-2 01 oder d01
    Vκ1-5 03
    Vκ1-6 01
    Vκ1-8 01
    Vκ1-9 01 oder d01
    Vκ3-11 01
    Vκ1-12 01
    Vκ1-13 01
    Vκ3-15 01
    Vκ1-16 02
    Vκ1-17 01
    Vκ3-20 01
    Vκ6-21 01
    Vκ2-24 01
    Vκ1-27 01
    Vκ2-28 01
    Vκ2-29 01
    Vκ2-30 01
    Vκ1-33 01
    Vκ1D-39 01
    Vκ2D-40 01
    Vκ3D-7 01
    Vκ1D-8 01 oder d01
    Vκ1D-43 01
    Vκ3D-11 01 oder d01
    Vκ1D-12 02
    Vκ1D-13 d01
    Vκ3D-15 d01
    Vκ1D-16 01
    Vκ1D-17 01
    Vκ3D-20 01
    Tabelle 12: Igκ-Allele #5 – K5-Allele (ein komplettes Repertoire an funktionellen humanen kappa-Gensegmenten)
    1.5 ID Allel
    Jκ5 01
    Jκ4 01
    Jκ3 01
    Jκ2 01 oder 04
    Jκ1 01
    Vκ4-1 01
    Vκ5-2 01 oder d01
    Vκ1-5 03
    Vκ1-6 01
    Vκ1-8 01
    Vκ1-9 01 oder d01
    Vκ3-11 01
    Vκ1-12 01
    Vκ1-13 01
    Vκ3-15 01
    Vκ1-16 02
    Vκ1-17 01
    Vκ3-20 01
    Vκ6-21 01
    Vκ2-24 01
    Vκ1-27 01
    Vκ2-28 01
    Vκ2-29 01
    Vκ2-30 01
    Vκ1-33 01
    Vκ1D-39 01
    Vκ2D-40 01
    Vκ3D-7 01
    Vκ1D-8 01 oder d01
    Vκ1D-43 01
    Vκ3D-11 01 oder d01
    Vκ1D-12 02
    Vκ1D-13 d01
    Vκ3D-15 d01
    Vκ1D-16 01
    Vκ1D-17 01
    Vκ3D-20 01
    Vκ2D-26 01 oder d01
    Vκ2D-28 01 oder d01
    Vκ2D-29 01
    Vκ2D-30 01
    Vκ1D-33 01
    Vκ1D-39 01
  • In einem Aspekt der Tabelle 12 ist kein Vκ1D-39-Gensegment im Genom vorhanden.
  • Zum Ausschließen von Zweifeln kann jedwede Bezugnahme auf die Tabelle 12 hierin, einschließlich in den Ansprüchen, mit der oder ohne die Einschränkung verstanden werden, dass, in einem Aspekt der Tabelle 12, kein Vκ1D-39-Gensegment im Genom vorhanden ist.
  • In einer alternativen Tabelle 12 ist das Vκ2D-26-Allel Vκ2D-26*d02. Tabelle 13: Igλ-Allele #1 – L1- oder P1-Allele
    ID Allel
    Cλ7 01
    Jλ7 01
    Cλ6 04
    Jλ6 01
    Cλ3 03
    Jλ3 02
    Cλ2 02
    Jλ2 01
    Cλ1 02
    Jλ1 01
    Vλ3-1 01
    Tabelle 14: Igλ-Allele #2 – L2- oder P2-Allele
    ID Allel
    Cλ7 01
    Jλ7 01
    Cλ6 04
    Jλ6 01
    Cλ3 03
    Jλ3 02
    Cλ2 02
    Jλ2 01
    Cλ1 02
    Jλ1 01
    Vλ3-1 01
    Vλ4-3 01
    Vλ2-8 01
    Vλ3-9 01
    Vλ3-10 01
    Vλ2-11 01
    Vλ3-12 02
    Vλ2-14 01
    Vλ3-16 01
    Vλ2-18 01
    Tabelle 15: Igλ-Allele #3 – L3- oder P3-Allele
    ID Allel
    Cλ7 01
    Jλ7 01
    Cλ6 04
    Jλ6 01
    Cλ3 03
    Jλ3 02
    Cλ2 02
    Jλ2 01
    Cλ 1 02
    Jλ1 01
    Vλ3-1 01
    Vλ4-3 01
    Vλ2-8 01
    Vλ3-9 01
    Vλ3-10 01
    Vλ2-11 01
    Vλ3-12 02
    Vλ2-14 01
    Vλ3-16 01
    Vλ2-18 01
    Vλ3-19 01
    Vλ3-21 01 oder d01
    Vλ3-22 01
    Vλ2-23 02 oder d02
    Vλ3-25 01 oder d03
    Vλ3-27 01
    Tabelle 16: Igλ-Allele #4 – L4- oder P4-Allele
    ID Allel
    Cλ7 01
    Jλ7 01
    Cλ6 04
    Jλ6 01
    Cλ3 03
    Jλ3 02
    Cλ2 02
    Jλ2 01
    Cλ1 02
    Jλ1 01
    Vλ3-1 01
    Vλ4-3 01
    Vλ2-8 01
    Vλ3-9 01
    Vλ3-10 01
    Vλ2-11 01
    Vλ3-12 02
    Vλ2-14 01
    Vλ3-16 01
    Vλ2-18 01
    Vλ3-19 01
    Vλ3-21 01 oder d01
    Vλ3-22 01
    Vλ2-23 02 oder d02
    Vλ3-25 01 oder d03
    Vλ3-27 01
    Vλ1-36 01
    Vλ5-37 01
    Vλ5-39 01
    Vλ1-40 01
    Vλ7-43 01
    Vλ1-44 01
    Vλ5-45 03
    Vλ7-46 01
    Tabelle 17: Igλ-Allele #5 – L5- oder P5-Allele
    ID Allel
    Cλ7 01
    Jλ7 01
    Cλ6 04
    Jλ6 01
    Cλ3 03
    Jλ3 02
    Cλ2 02
    Jλ2 01
    Cλ1 02
    Jλ1 01
    Vλ3-1 01
    Vλ4-3 01
    Vλ2-8 01
    Vλ3-9 01
    Vλ3-10 01
    Vλ2-11 01
    Vλ3-12 02
    Vλ2-14 01
    Vλ3-16 01
    Vλ2-18 01
    Vλ3-19 01
    Vλ3-21 01 oder d01
    Vλ3-22 01
    Vλ2-23 02 oder d02
    Vλ3-25 01 oder d03
    Vλ3-27 01
    Vλ1-36 01
    Vλ5-37 01
    Vλ5-39 01
    Vλ1-40 01
    Vλ7-43 01
    Vλ1-44 01
    Vλ5-45 03
    Vλ7-46 01
    Vλ1-47 01
    Vλ9-49 01
    Vλ1-51 01
    Vλ5-52 01
    Vλ1054 02
    Tabelle 18: Igλ-Allele #6 – L6- oder P6-Allele (ein komplettes Repertoire an funktionellen humanen Lambda-Allelen)
    1.6 ID Allel
    Cλ7 01
    Jλ7 01
    Cλ6 04
    Jλ6 01
    Cλ3 03
    Jλ3 02
    Cλ2 02
    Jλ2 01
    Cλ1 02
    Jλ1 01
    Vλ3-1 01
    Vλ4-3 01
    Vλ2-8 01
    Vλ3-9 01
    Vλ3-10 01
    Vλ2-11 01
    Vλ3-12 02
    Vλ2-14 01
    Vλ3-16 01
    Vλ2-18 01
    Vλ3-19 01
    Vλ3-21 d01
    Vλ3-22 01
    Vλ2-23 02 oder d02
    Vλ3-25 01 or d03
    Vλ3-27 01
    Vλ1-36 01
    Vλ5-37 01
    Vλ5-39 01
    Vλ1-40 01
    Vλ7-43 01
    Vλ1-44 01
    Vλ5-45 03
    Vλ7-46 01
    Vλ1-47 01
    Vλ9-49 01
    Vλ1-51 01
    Vλ5-52 01
    Vλ10-54 02
    Vλ6-57 01
    Vλ4-60 03 oder d03
    Vλ8-61 01
    Vλ4-69 01
  • In Bezug auf die Tabelle 18 ist, in einem Aspekt, kein Cλ6- oder Jλ6-Gensegment im Genom vorhanden. In einem anderen Aspekt ist, zusätzlich oder alternativ, kein Vλ3-22- und/oder Vλ5-39- und/oder Vλ10-54-Gensegment vorhanden.
  • Zum Ausschließen von Zweifeln kann jedwede Bezugnahme auf die Tabelle 18 hierin, einschließlich in den Ansprüchen, mit der oder ohne die Einschränkung verstanden werden, dass, in einem Aspekt der Tabelle 18, kein Cλ6 oder Jλ6 vorhanden ist, sowie mit der oder ohne die Einschränkung, dass kein Vλ3-22- und/oder Vλ5-39- und/oder Vλ10-54-Gensegment vorhanden ist.
  • Die Offenbarung von WO2013/041844 ist hierin durch den Bezug darauf einbezogen. Die Beispiele von Gensegmenten in WO2013/041844 sind hierin spezifisch einbezogen als ob diese speziell und explizit hierin als mögliche Gensegmente in Bezug auf die vorliegende Erfindung und zum möglichen Einschluss in einem oder mehreren Ansprüchen hierin offenbart wären.
  • Jede(r) hierin beschriebene Aspekt, Ausführungsform, Klausel oder Besimmung kann kombiniert werden in einem nicht-humanen Wirbeltier, das zum Exprimieren eines oder mehrerer humaner, in WO2013/041844 offenbarten und/oder hierin beschriebenen, Gensegmente oder einer Bindungsstelle oder eines Antikörpers imstande ist, welche(r) ein Produkt der Rekombination von einem oder mehreren humanen Gensegmenten ist, die in WO2013/041844 offenbart und/oder hierin beschrieben sind, wie zutreffend.
  • Die in den Tabellen 1–7 von WO2013/041844 offenbarten Gensegmente sind hierin als mögliche Gensegment-Sequenzen in Bezug auf die vorliegende Erfindung und zum möglichen Einschluss in einem oder mehreren Ansprüchen hierin speziell und explizit offenbart. Die Sequenzen sind in der mit dieser Anmeldung eingereichten Sequenzauflistung dargelegt.
  • Weitere Beispiele von Sequenzen von Gensegmenten zur Verwendung im Kontext der Erfindung sind in den Sequenzen, die am Ende der Beschreibung eingeschlossen sind, dargelegt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Genom von dem Wirbeltier oder der Zelle der Erfindung ein oder mehrere Gensegmente aus einer beliebigen der Tabellen 1 bis 18. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Genom von dem Wirbeltier oder der Zelle der Erfindung eine Kombination von beliebigen zwei Gensegmenten aus einer beliebigen der Tabellen 1 bis 18. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Genom von dem Wirbeltier oder der Zelle der Erfindung eine Kombination von beliebigen drei Gensegmenten aus einer beliebigen der Tabellen 1 bis 18.
  • In der am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst das Genom von dem Wirbeltier oder der Zelle der Erfindung eine Kombination von beliebigen vier Gensegmenten aus einer beliebigen der Tabellen 1 bis 18. Vorzugsweise wird ein VH- und ein JH-Schwerkettesegment der Tabelle 7 ausgewählt, und ein VL- und ein JL-Leichtkettesegment wird aus der Tabelle 12 oder Tabelle 18 ausgewählt. Gegebenenfalls wird ein D-Schwerkettesegment der Tabelle 7 ausgewählt.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder Zelle, dessen bzw. deren Genom humane VL- und JL-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Leichtkettelocus umfasst, wobei das Wirbeltier oder die Zelle Human-Variabelregionen umfassende Immunglobulin-Leichtketten exprimiert oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Leichtketten exprimiert, wobei die Immunglobulin-Leichtketten Leichtketten umfassen, die humane Variabelregionen umfassen, abgeleitet aus der Rekombination von (i) humanen Vκ- und Jκ-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vκ- und Jκ-Gensegmenten aus einer beliebigen der Tabellen 8 bis 12, oder (ii) humane Vλ- und Jλ-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vλ- und Jλ-Gensegmenten aus einer beliebigen der Tabellen 12 bis 18.
  • In einer Ausführungsform exprimiert das Wirbeltier oder die Zelle der Erfindung Leichtketten, umfassend humane Lambda-Variabelregionen, und wobei wenigstens 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95% der Variabelregionen von solchen Leichtketten aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet sind.
  • Gegebenenfalls werden die Leichtketten als IgG-Antikörper, zum Beispiel IgG1 oder IgG2b, gegebenenfalls IgG2a, exprimiert.
  • Die Konstantregion kann eine Kappa- oder Lambda-Konstantregion; gegebenenfalls Human-, Maus- oder Ratte-Konstantregion, sein. Der endogene Leichtkettelocus kann ein Kappa- oder Lambda-Locus sein; wobei gegebenenfalls das Genom wenigstens die V- und J-Gensegmente der Tabelle 8 an einem endogenen Leichtkettelocus, zum Beispiel dem Kappa-Locus, und/oder wenigstens die V- und J-Gensegmente der Tabelle 13 an einem endogenen Leichtkettelocus, zum Beispiel dem Lambda- oder Kappa-Locus, umfasst.
  • Die Leichtketten können Immunglobulin-Leichtketten umfassen, die humane Variabelregionen umfassen, die abgeleitet sind aus der Rekombination von (ii), wobei jede solche Variabelregion mit einer Konstantregion exprimiert wird, welche von einem Cλ-Gensegment codiert wird, das aus der aus den Cλ-Gensegmenten der Tabelle 18 bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
  • In dieser Ausführungsform der Erfindung, kann das Wirbeltier oder die Zelle Leichtketten exprimieren, die humane Lambda-Variabelregionen umfassen, und wenigstens 60%, 70% oder 80% der Variabelregionen von solchen Leichtketten können aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten, zum Beispiel den in der Tabelle 18 aufgelisteten V- und J-Segmenten, abgeleitet sein. Eine Erfindung betrifft auch ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder Zelle, dessen bzw. deren Genom humane VH-, D- und JH-Gensegmente stromaufwärts einer Konstantregion an einem endogenen Schwerkettelocus umfasst, wobei das Wirbeltier oder die Zelle Immunglobulin-Schwerketten, die humane Variabelregionen umfassen, exprimiert oder die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Schwerketten exprimiert, oder wobei die Zelle humane Variabelregionen umfassende Immunglobulin-Schwerketten exprimieren kann, wobei die Immunglobulin-Schwerketten Schwerketten umfassen, die humane Variabelregionen umfassen, abgeleitet aus der Rekombination von (iii) humanen VH-, D- und JH-Gensegmenten, ausgewählt aus der aus VH-, D- und JH-Gensegmenten der Tabelle 7 bestehenden Gruppe.
  • In einer Ausführungsform werden die Leichtketten mit den Schwerketten unter Erzeugung von Antikörpern, z. B. IgG-Antikörpern, co-exprimiert.
  • Ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder Zelle, dessen bzw. deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire umfasst, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in einen oder mehrere endogene(n) Ig-Loci, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion umfasst, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente bereitgestellt wurden durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers oder der Zelle, wobei das Wirbeltier Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten) umfassende Immunglobulin-Leichtketten umfasst oder die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Immunglobulin-Leichtketten exprimiert, wobei die Lambda-Leichtketten Immunglobulin-Leichtketten umfassen, die Lambda-Variabelregionen umfassen, die abgeleitet sind aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten; wobei wenigstens 60%, 70%, 80% oder 90% der Variabelregionen der Lambda-Leichtketten, welche von dem Wirbeltier exprimiert werden, abgeleitet sind aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten; wobei gegebenenfalls das Wirbeltier oder die Zelle jedwede(s) Wirbeltier oder Zelle ist, welche(s) hierin offenbart ist.
  • Eine variable Domäne oder Region, die aus der Rekombination humaner Gensegmente abgeleitet ist oder als Ergebnis davon produziert wird, wird hierin auch als eine Rekombinante der Gensegmente bezeichnet.
  • Die Gensegmente im Schwer- und/oder Leicht-Locus sind funktionsfähig mit der Konstantregion verbunden, so dass das Wirbeltier zum Produzieren einer Antikörper-Schwer- oder -Leichtkette, produziert durch Rekombination der Gensegmente, imstande ist.
  • In einer Ausführungsform besitzt die Zelle oder das nicht-humane Wirbeltier ein Genom, umfassend die Kappa-Segmente der Tabelle 8 oder Tabelle 9 oder Tabelle 10, Tabelle 11 oder Tabelle 12 oder jedweder Kombination davon.
  • In einer Ausführungsform besitzt die Zelle oder das nicht-humane Wirbeltier ein Genom, umfassend die Lambda-Segmente der Tabelle 13 oder Tabelle 14 oder Tabelle 15 oder Tabelle 16 oder Tabelle 17 oder Tabelle 18 oder jedweder Kombination davon.
  • In einer Ausführungsform besitzt die Zelle oder das nicht-humane Wirbeltier ein Genom umfassend die Schwerkette-Segmente der Tabelle 1 oder Tabelle 2 oder Tabelle 3 oder Tabelle 4 oder Tabelle 5 oder Tabelle 6 oder Tabelle 7 oder jedweder Kombination davon.
  • In einer Ausführungsform kann die Zelle oder das nicht-humane Wirbeltier der Erfindung Leichtketten exprimieren, umfassend humane Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination (d. h. Rekombinanten) von (i) humanen Vκ- und Jκ-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Vκ- und Jκ-Gensegmenten der Tabelle 8 oder Tabelle 9 oder Tabelle 10 oder Tabelle 11 oder Tabelle 12 oder jedweder Kombination davon.
  • In einer Ausführungsform kann die Zelle oder das nicht-humane Wirbeltier der Erfindung Leichtketten exprimieren, umfassend humane Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination (d. h. Rekombinanten) von (ii) humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vλ- und Jλ-Gensegmenten der Tabelle 13 oder Tabelle 14 oder Tabelle 15 oder Tabelle 16 oder Tabelle 17 oder Tabelle 18 oder jedweder Kombination davon.
  • In einer Ausführungsform kann die Zelle oder das nicht-humane Wirbeltier der Erfindung Schwerketten exprimieren, umfassend humane Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination (d. h. Rekombinanten) von humanen VH-, D- und JH-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus VH-, D- und JH-Gensegmenten der Tabelle 1 oder Tabelle 2 oder Tabelle 3 oder Tabelle 4 oder Tabelle 5 oder Tabelle 6 oder Tabelle 7 oder jedweder Kombination davon.
  • Die Erfindung schließt ferner die folgenden Bestimmungen ein:
  • Bestimmung 1 – Das Wirbeltier oder die Zelle der Erfindung besitzt ein Genom, welches ein oder mehrere Allele umfasst, das bzw. die aus Allelen mit den Nummern 1 bis 68 in Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 2 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß der Bestimmung 1, umfassend Allelnummer 1 der Tabelle 1 und ein oder mehrere Allele, die von Allelen mit den Nummern 2 bis 68 der Tabelle 7 gewählt sind.
  • Bestimmung 3 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 2 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, die von Allelen mit den Nummern 3 bis 68 der Tabelle 7 gewählt sind.
  • Bestimmung 4 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 3 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 4 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 5 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 4 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 5 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 6 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 5 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 6 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 7 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 6 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 7 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 8 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 7 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 8 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 9 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 8 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 9 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 10 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 9 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 10 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 11 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 10 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 11 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 12 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 11 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 12 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 13 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 12 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 13 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 14 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 13 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 14 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 15 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 14 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 15 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 16 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 15 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 16 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 17 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 16 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 17 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 18 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 17 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 18 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 19 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 18 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 19 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 20 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 19 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 20 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 21 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 20 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 21 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 22 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 21 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 22 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 23 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 22 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 23 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 24 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß bis any vorangehende Bestimmung umfassend 4allele number 23 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 24 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 25 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 24 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 25 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 26 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 25 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 26 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 27 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 26 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 27 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 28 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 27 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 28 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 29 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 28 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 29 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 30 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 29 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 30 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 31 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 30 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 31 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 32 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 31 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 32 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 33 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 32 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 33 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 34 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 33 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 34 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 35 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 34 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 35 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 36 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 35 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 36 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 37 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 36 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 37 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 38 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 37 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 38 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 39 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 38 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 39 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 40 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 39 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 40 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 41 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 40 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 41 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 42 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 41 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 42 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 43 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 42 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 43 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 44 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 43 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 44 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 45 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 44 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 45 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 46 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 45 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 46 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 47 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 46 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 47 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 48 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 47 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 48 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 49 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 48 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 49 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 50 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 49 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 50 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 51 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 50 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 51 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 52 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 51 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 52 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 53 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 52 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 53 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 54 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 53 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 54 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 55 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 54 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 55 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 56 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 56 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 57 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 57 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 57 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 58 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 58 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 58 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 59 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 59 Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 59 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 60 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 60 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 60 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 61 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 61 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 61 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 62 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 62 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 62 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 63 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 63 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 63 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 64 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 64 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 64 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 65 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 65 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 65 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 66 bis 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 66 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 66 der Tabelle 7 und ein oder mehrere Allele, das bzw. die von Allelen mit den Nummern 67 oder 68 der Tabelle 7 gewählt ist bzw. sind.
  • Bestimmung 67 – Das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorstehenden Bestimmung, umfassend Allelnummer 67 der Tabelle 7 und Allelnummer 68 der Tabelle 7.
  • In einem Beispiel umfasst das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen vorangehenden Bestimmung ein oder mehrere oder alle der JH-Allele der Tabelle 7, z. B. JH2*02 und/oder wenigstens JH6*02 (was zum Produzieren von langen HCDR3 V-Domänen zum therapeutischen Gebrauch beim Menschen nützlich ist, wie in den Beispielen gezeigt).
  • Somit ist jedes Allel, kombiniert mit jedwedem anderen Allel in der Tabelle 7, explizit hierin offenbart. Die gleiche Struktur von Kombinationen ist offenbart in Bezug auf die Allele der Tabelle 12 und Tabelle 18. Deshalb ist jedes Allel in Tabelle 7, kombiniert mit jedwedem anderen Allel in Tabelle 12 oder Tabelle 18, offenbart, und jedes Allel in Tabelle 12 ist in Kombination mit jedem anderen Allel in Tabelle 12 offenbart, und jedes Allel in Tabelle 18 ist in Kombination mit jedem anderen Allel in Tabelle 18 offenbart.
  • In einem Beispiel umfasst das Wirbeltier oder die Zelle gemäß jedweder vorangehenden Bestimmung ein oder mehrere oder alle Jκ-Allele der Tabelle 12, z. B. wenigstens Jκ2*01 und/oder Jκ4*01 (was zum Produzieren von Vκ-Domänen zum therapeutischen Gebrauch beim Menschen nützlich ist, wie in den Beispielen gezeigt).
  • In einer Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH3-23*04, JH2*01, VK4-1*01 und/oder JK2*01 umfasst.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH3-7*01, JH6*02, VK2-28*01 und/oder JK4*01 umfasst.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH7-4-1*01, JH6*02, VK2-28*01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-16*02.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH4-4-1*02, JH6*02, VK1D-13*01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-10*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH1-3*01, JH6*02, VK1-12*01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-10*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH3-13*01, JH6*02, VK1D-12*02 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-9*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH4-4*02, JH6*02, VK1D-13*01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-10*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH3-13*01, JH6*02, VK3-20*01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-10*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH3-23*04, JH6*02, VK1-17*01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-22*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH3-7*01, JH6*02, VK1D-39*01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-9*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH3-13*01, JH6*02, VK1D-39*01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-10*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH3-13*01, JH6*02, VK3-11*01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-10*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH4-4*02, JH6*02, VK1D-16*01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-9*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Gensegmente VH3-20*d01, JH6*02, VK1-9*d01 und/oder JK4*01 umfasst. Gegebenenfalls umfasst das Genom des weiteren D3-10*01.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches das humane Gensegment VH3-23*04 umfasst. Zusätzlich oder alternativ sind Schwerkette-Variabeldomänen des Antikörpers der Erfindung von (i) humanen VH3-23*04-, D- und JH-Segmenten codiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches das humane Gensegment VH3-9*01 umfasst. Zusätzlich oder alternativ sind Schwerkette-Variabeldomänen des Antikörpers der Erfindung von (i) humanen VH3-9*01-, D- und JH-Segmenten codiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches das humane Gensegment Vκ1-12*02 oder Vκ1D-12*02 umfasst. Zusätzlich oder alternativ sind Leichtkette-Variabeldomänen des Antikörpers der Erfindung von (i) humanen Vκ1-12*02- oder Vκ1D-12*02- und Jκ-Segmenten codiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches das humane Gensegment Vκ2-28*01 umfasst. Zusätzlich oder alternativ sind Leichtkette-Variabeldomänen des Antikörpers der Erfindung von (i) humanen Vκ2-28*01- und Jκ-Segmenten codiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches das humane Gensegment Vκ4-1*01 umfasst. Zusätzlich oder alternativ sind Leichtkette-Variabeldomänen des Antikörpers der Erfindung von (i) humanen Vκ4-1*01- und Jκ-Segmenten codiert. In einer weiteren Ausführungsform hat die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung ein Genom, welches die Kombination von oben beschriebenen Gensegmenten mit JH6*01 anstelle von JH6*02 umfasst.
  • In allen hierin beschriebenen Ausführungsformen, können die Schwerkette-V- und J-Region gegebenenfalls miteinander und mit einer hierin definierten D-Region unter Bildung einer Schwerkette-Variabeldomäne rekombiniert werden. Darüber hinaus können die Leichtkette-V- und J-Regionen gegebenenfalls unter Bildung einer Leichtkette-Variabeldomäne rekombiniert werden.
  • Die Erfindung erstreckt sich auf einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment, das humane Variabeldomänen umfasst, produziert oder abgeleitet aus der Rekombination von beliebigen der obensthenden Kombinationen von Gensegmenten.
  • Von Antikörpern oder Fragmenten gemäß der Erfindung wird in den Beispielen gezeigt, zum Produzieren produktiver Gensegment-Rekombination in vivo, welche junktionale Mutation und somatische Mutation zeigen und Domänen erzeugen, die Antigen bei guten Bindungskinetiken spezifisch binden können, nützlich zu sein.
  • Die Erfindung schließt Antikörper oder antigenbindende Fragmente davon ein, welche durch Rekombination, in vivo in einer Maus, einem Säuger oder Wirbeltier der Erfindung im Anschluss an Immunisierung, von einem oder mehreren D-Gensegmenten, einem oder mehreren VH-Gensegmenten und einem oder mehreren der humanen JH-Gensegmente JH2*01 und JH6*02 erhalten werden oder erhältlich sind.
  • In einer Ausführungsform kann die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung Schwerketten exprimieren, umfassend humane Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination von einem oder mehreren D-Gensegmenten, einem oder mehreren JH-Gensegmenten und einem oder mehreren der folgenden VH-Gensegmente: VH3-20*d01, VH1-24*d01 und VH2-26*d01.
  • Deshalb schließt die Erfindung Antikörper oder antigenbindende Fragmente davon ein, welche durch Rekombination, in vivo in einer Maus, einem Säuger oder Wirbeltier der Erfindung im Anschluss an Immunisierung, von einem oder mehreren D-Gensegmenten, einem oder mehreren JH-Gensegmenten und einem oder mehreren der humanen VH-Gensegmente VH3-20*d01, VH1-24*d01 und VH2-26*d01 erhalten werden oder erhältlich sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung zusätzlich oder alternativ Leichtketten exprimieren, umfassend humane Variabelregionen, die aus der Rekombination von einem oder mehreren Jκ-Gensegmenten und einem oder mehreren der humanen Vκ-Gensegmente Vκ5-2*d01, Vκ1-9*d01, Vκ1D-8*d01, Vκ3D-11*d01, Vκ1D-13*d01, Vκ3D-15*d01, Vκ2D-26*d01 und Vκ2D-28*d01 oder der Rekombination von einem oder mehreren Jλ-Gensegmenten und einem oder mehreren der humanen Vλ-Gensegmente Vλ2-22*d01, Vλ2-23*d02, Vλ3-25*d03 und Vλ4-60*d03 abgeleitet sind.
  • Deshalb schließt die Erfindung Antikörper oder antigenbindende Fragmente davon ein, welche durch Rekombination, in vivo in einer Maus, einem Säuger oder Wirbeltier der Erfindung im Anschluss an Immunisierung, von einem oder mehreren Jκ-Gensegmenten und einem oder mehreren der humanen Vκ-Gensegmente Vκ5-2*d01, Vκ1-9*d01, Vκ1D-8*d01, Vκ3D-11*d01, Vκ2D-26*d01 und Vκ2D-28*d01 oder von einem oder mehreren Jλ-Gensegmenten und einem oder mehreren der humanen Vλ-Gensegmente Vλ2-22*d01, Vλ2-23*d02, Vλ3-25*d03 und Vλ4-60*d03 erhalten werden oder erhältlich sind.
  • In allen Aspekten der Erfindung kann die Zelle eine Hybridomzelle, eine B-Zelle, gegebenenfalls eine immortalisierte B-Zelle oder eine embryonale Stammzelle sein.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Wirbeltier oder die Zelle eine Konstantregion, welche eine Kappa- oder Lambda-Konstantregion; gegebenenfalls eine Maus- oder Ratte-Konstantregion, ist. In einer Ausführungsform kann die Konstantregion eine humane Konstantregion sein.
  • In einer Ausführungsform umfasst das hierin offenbarte Wirbeltier oder die hierin offenbarte Zelle einen endogenen Leichtkettelocus, der ein Kappa- oder Lambda-Locus ist; wobei das Genom gegebenenfalls wenigstens die V- und J-Gensegmente der Tabelle 8, 9 oder 10 an einem endogenen Leichtkettelocus, z. B. dem Kappa-Locus, und/oder wenigstens die V- und J-Gensegmente der Tabelle 13 oder 14 an einem endogenen Leichtkettelocus, z. B. entweder dem Lambda- oder Kappa-Locus, umfasst.
  • In einer Ausführungsform umfasst das hierin offenbarte Wirbeltier oder die hierin offenbarte Zelle Immunglobulin-Leichtketten, umfassend humane Variabelregionen, die abgeleitet sind aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vλ- und Jλ-Gensegmenten der Tabelle 18, wobei jede solche Variabelregion mit einer Konstantregion exprimiert wird, codiert von einem Cλ-Gensegment, das aus der Gruppe bestehend aus den Cλ-Gensegmenten der Tabelle 18 ausgewählt ist.
  • In einer Ausführungsform umfassen die Leichtketten humane Variabelregionen, abgeleitet aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vλ- und Jλ-Gensegmenten der Tabelle 18.
  • In allen Ausführungsformen der Erfindung können die VH- und VL-Domänen gegebenenfalls eine Antigenbindungsstelle bilden.
  • Die Zelle von jedwedem Aspekt der Erfindung kann eine Hybridomzelle oder eine B-Zelle sein, gegebenenfalls eine immortalisierte B-Zelle. Die Zelle kann auch eine ES-Zelle sein. Die ES-Zelle kann ein Teil von einer Population von wenigstens 90, 150 oder mehr als 200 Zellen sein. In einem Beispiel ist die Population von Zellen enthalten auf einer oder mehreren Multiwellplatten (z. B. 96-Well-Platten) und kann zum Beispiel eine sortierte Population sein, worin einzelne Zellen von unterschiedlichen jeweiligen Wells einer Platte enthalten sind. Das Wirbeltier von jedwedem Aspekt kann innerhalb eines Behälters enthalten sein, umfassend gefilterte Luft, gegebenenfalls umfassend einen Luftfilter.
  • In einer Ausführungsform ist die Innenraum-Umgebung des Behälters steril, z. B. wie es mithilfe eines standardmäßigen Tierbehälters möglich ist, z. B. eines TechniplastTM Mouse Loft (http://www.tecniplast.it/us/product/mouse-loft.html). In einem Beispiel weist der Behälter einen Kunststoff-Körper, z. B. einen transluzenten oder transparenten Körper, auf.
  • Der die Wirbeltiere enthaltende Behälter kann ein Volumen von nicht mehr als vier, 3, 2 oder 1 Meter3 aufweisen. Der Behälter kann eine Vielzahl von Wirbeltieren umfassen, z. B. ein Männchen und ein Weibchen (z. B. ein fertiles Paar).
  • In einer Ausführungsform sind die Wirbeltiere der Erfindung wenigstens 3,5 Wochen alt, z. B. 4 Wochen, 5 Wochen, 6 Wochen, 7 Wochen alt.
  • Die Verwendung der Gensegmente, wie beansprucht, speziell wie in den Tabellen 1–18 angezeigt, sieht die Vorteile vor, welche in den Beispielen ersichtlich sind.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragments davon, wobei das Verfahren das Immunisieren eines Wirbeltiers der Erfindung mit einem Antigen und das Gewinnen des Antikörpers oder Fragments oder Gewinnen einer Zelle, die den Antikörper oder das Fragment produziert, umfasst; wobei der isolierte Antikörper oder das Fragment gegebenenfalls so modifiziert ist, dass er bzw. es humane Konstantregionen umfasst.
  • Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragments davon ein, wobei das Verfahren das Isolieren eines Antikörpers oder antigenbindenden Fragments davon aus einer Zelle der Erfindung; und gegebenenfalls das Modifizieren des isolierten Antikörpers oder Fragments, so dass er bzw. es humane Konstantregionen umfasst, umfasst.
  • Rekombinante DNA-Technologie kann verwendet werden, um eine modifizierte Nukleotidsequenz zu produzieren, die den modifizierten Antikörper oder das modifizierte Fragment codiert.
  • Das Verfahren kann folgendes umfassen
    • (a) Isolieren einer B-Zelle, die einen Antikörper codiert, der das Antigen bindet, aus dem Wirbeltier,
    • (b) Identifizieren oder Kopieren einer Nukleotidsequenz der B-Zelle, die eine VH-Domäne des Antikörpers codiert, und/oder Identifizieren oder Kopieren einer Nukleotidsequenz der B-Zelle, die eine VL-Domäne des Antikörpers codiert; und
    • (c) Verwenden der Sequenz(en) zur Herstellung eines isolierten Antikörpers, der die VH- und/oder VL-Domäne umfasst; wobei der isolierte Antikörper gegebenenfalls humane Konstantregionen umfasst. Die Erfindung schließt ein Verfahren zur Herstellung eines vollständig humanisierten Antikörpers ein, umfassend das Immunisieren eines Wirbeltiers, wie hierin offenbart, und dann das Ersetzen der nicht-humanen Wirbeltier-Konstantregion von einem, spezifisch mit dem Antigen reaktiven, Antikörper durch eine Human-Konstantregion, geeigneterweise durch Manipulieren der Nukleinsäure, die den Antikörper codiert.
  • Die Erfindung betrifft auch einen humanisierten Antikörper, der gemäß jedeweden hierin offenbarten Verfahren produziert wird, und die Verwendung eines so produzierten humanisierten Antikörpers in der Medizin. In einerweiteren Ausführungsform schließt die Erfindung das Isolieren eines IgG1-, IgG2b- und/oder IgM-Antikörpers ein, der das Zielantigen spezifisch bindet.
  • Ein isolierter Antikörper der Erfindung kann durch Expression aus einer Wirtszelle, gewählt aus einer CHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zelle, produziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein Antikörper, der durch Expression aus einer CHO-Zelle produziert wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann der isolierte Antikörper oder das isolierte Fragment mit einem Verdünnungsmittel, Träger, Exzipiens oder einem Arzneistoff formuliert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zum humanmedizinischen Gebrauch herzustellen. Gegebenenfalls kann der formulierte Antikörper in einem sterilen Behälter verpackt werden, zum Beispiel einem Gefäß, einem Röhrchen, einem IV-Beutel oder einer Spritze, wobei ferner gegebenenfalls ein Kit hergestellt wird, umfassend das Kombinieren der Packung mit einem Etikett oder Anleitungen, die die Anwendung der Antikörper-Zusammensetzung zur humanmedizinischen Verwendung angeben; wobei das Etikett oder die Anleitung gegebenenfalls eine Arzneistoff-Chargennummer und/oder eine Markt-Zulassungsnummer, ferner gegebenenfalls eine EMA- oder FDA-Markt-Zulassungsnummer, umfasst. In einem Beispiel wird der isolierte Antikörper (z. B. produziert durch eine CHO-Zelle) (i) mit einem Verdünnungsmittel, Träger, Exzipiens oder einem Arzneistoff formuliert, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zum humanmedizinischen Gebrauch herzustellen, (ii) der formulierte Antikörper wird in einem sterilen Behälter verpackt, mit einem Etikett oder Anleitungen kombiniert, die die Anwendung der Antikörperzusammensetzung zur humanmedizinischen Verwendung angeben; wobei das Etikett oder die Anleitung gegebenenfalls eine Arzneistoff-Chargennummer und/oder eine Markt-Zulassungsnummer (z. B. eine EMA- oder FDA-Markt-Zulassungsnummer) umfasst. In einer Ausführungsform von einem solchen Beispiel bindet der Antikörper spezifisch humanes PCSK9, und die Verwendung ist für die Behandlung oder Verhinderung von Hyperlipidämie oder für die Senkung von Cholesterin in einem Menschen bestimmt. In einer Ausführungsform von einem solchen Beispiel bindet der Antikörper spezifisch humanes IL6Ra, und die Verwendung ist für die Behandlung oder Verhinderung eines entzündlichen Zustands oder von rheumatoider Arthritis in einem Menschen bestimmt. In einer Ausführungsform von einem solchen Beispiel bindet der Antikörper spezifisch humanes IL4Ra, und die Verwendung ist für die Behandlung oder Verhinderung einer atopischen Erkrankung, atopischer Dermatitis oder Asthma in einem Menschen bestimmt.
  • Die Erfindung betrifft den Antikörper oder das Fragment, produziert durch das Verfahren der Erfindung, zum humanmedizinischen Gebrauch, und die Verwendung von dem isolierten Antikörper oder Fragment, produziert durch das Verfahren der Erfindung, in der Herstellung eines Medikaments zum humanmedizinischen Gebrauch.
  • Das Medikament kann eine Zusammensetzung oder ein Kit sein, die hierin offenbart sind.
  • Die Erfindung beinhaltet Antikörper und antigenbindende Fragmente davon, umfassend humane variable Domänen, die aus der Rekombination von jedweder Kombination von hierin offenbarten Gensegmenten produziert oder abgeleitet werden, wobei der Antikörper und die Fragmente gegebenenfalls durch Rekombination in vivo in einer Maus, einem Säuger oder einem sonstigen Wirbeltier der Erfindung im Anschluss an eine Immunisierung erhalten werden oder erhältlich sind.
  • In einer Ausführungsform sind die von der Zelle oder dem Wirbeltier exprimierten Immunglobulin-Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die humane Variabelregionen umfassenden Schwerketten; und die humane Variabelregionen umfassenden Schwerketten werden als Teil von Serum-IgG-Antikörpern, gegebenenfalls IgG1-, IgG2a- oder IgG2b- oder IgM-Antikörpern exprimiert.
  • In einer Ausführungsform exprimiert die Zelle oder das Wirbeltier der Erfindung einen IgG-Antikörper, gegebenenfalls einen IgG1-, IgG2a- oder IgG2b-Antikörper oder einen IgM-Antikörper, umfassend Schwerketten, wie hierin definiert, wobei der Antikörper spezifisch ein Zielantigen bindet.
  • Die Erfindung betrifft ferner:
    den Antikörper, gegebenenfalls, produziert durch ein Verfahren der Erfindung, umfassend
    • (a) eine humane Schwerkette-Variabeldomäne, abgeleitet aus der Rekombination von humanen VH-, D- und JH-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VH-, D- und JH-Gensegmenten von einer beliebigen der Tabellen 1-7; und
    • (b) eine humane Leichtkette-Variabeldomäne, abgeleitet aus der Rekombination von humanen V- und J-Gensegmenten, beide ausgewählt aus den V- und J-Gensegmenten von einer beliebigen der Tabellen 8–18.
  • Ein isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, gegebenenfalls erhalten oder erhältlich durch das Verfahren der Erfindung, wobei eine Variabelregion des Antikörpers oder Fragments ein oder mehrere somatische Mutationen des Maus- oder Ratte-Aktivierungs-induzierte Deaminase(AID)-Musters und/oder junktionale Mutationen des Maus- oder Ratte-Terminale-Desoxynucleotidyl-Transferase(TdT)-Musters umfasst.
  • Die erfindungsgemäße variable Schwer- oder Leicht-Domäne oder -Region kann bis zu 10, einschließlich 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9, junktionale Mutationen umfassen.
  • In einerweiteren Ausführungsform kann die erfindungsgemäße variable Schwer- oder Leicht-Domäne oder -Region zusätzlich oder alternativ bis zu 9, einschließlich 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 8, einschließlich 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7, somatische Mutationen umfassen.
  • In einer weiteren Ausführungsform beinhaltet die Erfindung einen isolierten Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon, gegebenenfalls erhalten oder erhältlich durch das Verfahren der Erfindung, der bzw. das einen Gamma-Rezeptor und ferner gegebenenfalls eine humane Konstant-Leichtkette bindet. In einer Ausführungsform umfasst der Fc humane Gamma-Konstantdomänen, z. B. humane IgG1-, IgG2-, IgG3- oder IgG4-Konstantdomänen.
  • Ein isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, gegebenenfalls erhalten oder erhältlich durch das Verfahren der Erfindung, wobei der Antikörper OHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zell-Glykosylierung umfasst.
  • Ein Antikörper oder Fragment der Erfindung kann spezifisch ein humanes Enzym binden.
  • Ein Antikörper oder Fragment der Erfindung kann spezifisch die folgenden humanen Ziele bzw. Targets binden: Proprotein-Convertase PC9, Proprotein-Convertase Subtilisin Kexin-9 (PCSK9), CD126, IL-4, IL-4-Rezeptor, IL-6, IL-6-Rezeptor, IL-13, IL-18-Rezeptor, Erbb3, Zell-ASIC1, ANG2, GDF-8, Angiopoietinligand-2, Delta-like Protein-Ligand 4, Immunglobulin G1, PDGF-Ligand, PDGF-Rezeptor oder NGF-Rezeptor, Toxin A oder Toxin B von Clostridium difficile, Relaxin, CD48, Cd20, Glucagon-Rezeptor, Protease-aktivierter Rezeptor 2, TNF-like-Ligand 1A (TL1A), Angiopoietin-related-2 (AR-2), Angiopoietin-like Protein 4, RANKL, Angiopoietin-like Protein 3 (ANGPTL3), Delta-like-Ligand 4 (DLL4), ”Big Endothelin-1” (ET-1), Activin A, Rezeptortyrosinkinasen, zum Beispiel humane AR-1 und Tyrosinkinase mit Ig- und EGF-Homologiedomänen (TIE) oder TIE-2-Rezeptor. In einem Beispiel ist das Target PCSK9. In einem Beispiel ist das Target der IL-6 Rezeptor (z. B. IL6Ra). In einem Beispiel ist das Target IL-4 Rezeptor (z. B. IL4Ra).
  • Bevorzugte Aspekte der Erfindung beinhalten:
    Die Verwendung des Antikörpers oder Fragments davon in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Lindern oder Hemmen einer IL-4Ra-vermittelten Krankheit oder Störung in einem Menschen. IL-4Ra-vermittelte oder -bedingte Störungen, welche durch den Ligand, Antikörper oder Fragment der Erfindung behandelt werden, schließen zum Beispiel Arthritis (einschließlich septischer Arthritis), Herpetiformis, chronische idiopathische Urticaria, Sklerodermie, hypertrophe Vernarbung, Whipple-Erkrankung, gutartige Prostatahyperplasie, Lungenstörungen, wie mildes, moderates oder schweres Asthma, Entzündungskrankheiten, wie entzündliche Darmerkrankung, allergische Reaktionen, Kawasaki-Krankheit, Sichelzellkrankheit, Churg-Strauss-Syndrom, Morbus Basedow, Prä-Eklampsie, Sjögren-Syndrom, autoimmunes lymphoproliferatives Syndrom, autoimmune hämolytische Anemie, Barrett-Ösophagus, autoimmune Uveitis, Tuberlulose und Nephrose ein.
  • Weitere IL-4Ra-vermittelte oder -bedingte Störungen, welche durch den Ligand, Antikörper oder Fragment der Erfindung behandelt werden, schließen zum Beispiel Asthma, COPD (z. B. chronische Bronchitis, Erkrankung der kleinen Atemwege oder Emphysem), entzündliche Darmerkrankung, einen fibrotischen Zustand (z. B. systemische Sklerose, Lungenfibrose, Parasiten-induzierte Leberfibrose oder zystische Fibrose), Allergie (zum Beispiel atopische Dermatitis, Staubmilbenallergie, Haustier-Allergie oder Lebensmittelallergie), Transplationstherapie zum Verhindern von Transplantabstoßung, Unterdrückung einer Hypersensitivität vom verzögerten Typ oder einer Kontakt-Hypersensitivitätsreaktion, als Adjuvans bei Allergie-Immuntherapie oder als ein Impfstoffadjuvans, ein.
  • Ferner wird von der Erfindung die Verwendung des Antikörpers oder Fragments davon in der Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von einer IL-4Ra-vermittelten oder -bedingten Störung abgedeckt, wobei die Krankheit oder Erkrankung ein entzündlicher Krankheits oder Erkrankungszustand; eine atopische Krankheit oder Erkrankung; eine respiratorische Krankheit oder Erkrankung; eine mit erhöhtem IgE verbundene Krankheit oder Erkrankung; oder eine mit erhöhter IL-4- und/oder IL-13-Aktivität verbundene Krankheit oder Erkrankung ist.
  • Ferner wird von der Erfindung die Verwendung des Antikörpers oder Fragments davon in der Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von einer IL-4Ra-vermittelten oder -verwandten Krankheit oder Erkrankung abgedeckt, wobei die Krankheit oder Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer entzündlichen Krankheit oder Erkrankung der Atemwege, chronischer obstruktiver Lungenkrankheit, Asthma, Pneumonie, Hypersensitivitätspneumonitis, pulmonalen Infiltraten mit Eosinophilie, Umweltlungenkrankheit, Pneumonie, Bronchiektasen, zystischer Fibrose, interstitieller Lungenerkrankung, primärer pulmonaler Hypertonie, pulmonaler Thromboembolie, Störungen der Pleura, Störungen des Mediastinum, Störungen des Zwerchfells, Hypoventilation, Hyperventilation, Schlaf-Apnoe, akutem Atemnotsyndrom, Mesotheliom, Sarkom, Transplantatabstoßung, Graft-versus-Host-Krankheit, Lungenkrebs, allergischer Rhinitis, Allergie, Asbestose, Aspergillom, Aspergillose, Bronchiektasie, chronischer Bronchitis, Emphysem, eosinophiler Pneumonie, idiopathischer Lungenfibrose, invasiver Pneumokokken-Erkrankung, Influenza, Nicht-Tuberkulose-Mycobakterien, Pleuraerguss, Pneumokoniose, Pneumocystis, Pneumonie, Lungen-Aktinomykose, Lungen-Alveolarproteinose, Lungenmilzbrand, Lungenödem, Lungenembolie, Lungenentzündung, Lungen-Histiozytose X, pulmonaler Hypertonie, Lungen-Nocardiose, Lungentuberkulose, Lungen Venen-Verschlusskrankheit, rheumatoider Lungenerkrankung, Sarkoidose und Wegener-Granulomatose.
  • Ferner wird von der Erfindung ein Anti-IL-4Ra-Antikörper oder Fragment davon abgedeckt, wie hierin offenbart, zur Prävention oder Behandlung von jedweder hierin offenbarten Krankheit oder Störung.
  • Ferner von der Erfindung abgedeckt ist die Verwendung von einem Anti-IL-4Ra-Antikörper oder Fragment davon in einem Verfahren der medizinischen Behandlung von einer hierin offenbarten Krankheit oder Störung.
  • Ferner von der Erfindung abgedeckt ist die Verwendung von dem Ligand, Antikörper oder Fragment der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Linderung oder Hemmung einer PCSK9-vermittelten Krankheit oder Störung in einem Menschen. Nicht-einschränkende Beispiele von solchen Krankheiten oder Zuständen können, zum Beispiel eine Lipidstörung, Hyperlipoproteinämie, Hyperlipidämie; Dyslipidämie; Hypercholesterinämie, einen Herzinfarkt, einen Schlaganfall, koronare Herzkrankheit, Atherosklerose, periphere arterielle Verschlusskrankheit, Claudicatio, Diabetes vom Typ II, Bluthochdruck und eine kardiovaskuläre Krankheit oder Erkrankung einschließen.
  • Ferner wird von der Erfindung ein Anti-PCSK9-Antikörper oder Fragment davon, wie hierin offenbart, zur Prävention oder Behandlung von jedweder hierin offenbarten Krankheit oder Störung abgedeckt.
  • Ferner von der Erfindung abgedeckt ist die Verwendung eines Anti-PCSK9-Antikörpers oder Fragments davon in einem Verfahren der medizinischen Behandlung von einer hierin offenbarten Krankheit oder Störung.
  • Ferner von der Erfindung abgedeckt ist die Verwendung von dem Ligand, Antikörper oder Fragment der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Linderung oder Hemmung einer IL-6Ra-vermittelten Krankheit oder Störung in einem Menschen.
  • Bei der IL-6Ra-vermittelten Krankheit oder Störung kann es sich um eine entzündliche Krankheit oder Erkrankung handeln. Die IL-6Ra-vermittelte Krankheit oder Erkrankung kann aus der aus einer entzündlichen Darmerkrankung (IBD), Morbus Crohn, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, Bronchiolitis, Gingivitis, Transplantatabstoßung, allogener Transplantat-Abstoßung, Graft-versus-Host-Disease (GvHD), Asthma, ”Adult Respiratory Distress-Syndrom” (ARDS), septischem Schock, ulzerativer Kolitis, Sjögren-Syndrom, Atemwegsentzündung, Castleman-Krankheit, Periodontitis, atopischer Dermatitis, systemischem Lupus erythematosus und koronarer Herzerkrankung bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
  • Ferner wird von der Erfindung ein Anti-IL-6Ra-Antikörper oder Fragment davon, wie hierin offenbart, zur Prävention oder Behandlung von jedweder hierin offenbarten Erkrankung oder Krankheit abgedeckt.
  • Ferner von der Erfindung abgedeckt ist die Verwendung eines Anti-IL-6Ra-Antikörpers oder Fragments davon, in einem Verfahren der medizinischen Behandlung einer hierin offenbarten Erkrankung oder Störung.
  • In einerweiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die folgenden Aspekte:
    • 1. Ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier oder Wirbeltierzelle (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen bzw. deren Genom humane JH2*01 und/oder humane JH6*02, ein oder mehrere humane VH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Schwerkettelocus und/oder humane Jκ2*01 und/oder humane Jκ4*01 und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass die Zelle oder das Wirbeltier zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette und eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH2*01- und/oder JH6*02-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert wird, und/oder die Antikörperleichtkette durch Rekombination von dem humanen Jκ2*01- und/oder Jκ4*01-Segment mit einem Vκ-Segment produziert wird, wobei das eine oder die mehreren humane(n) VH-Gensegmente des Schwerkettelocus ein, mehrere oder alle der humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 und VH3-20*d01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen, oder wobei das eine oder die mehreren humane(n) Vκ-Gensegmente ein, mehrere oder alle der humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen. Gegebenenfalls ist das humane Gensegment die rekombinierte Form von dem Gensegment, das ein oder mehrere Mutationen relativ zur Keimbahn-Human-Gensegmentsequenz einschließt.
    • 2. Die Zelle oder das Wirbeltier von Aspekt 1, wobei das Genom humane JH2*01 und/oder humane JH6*02, ein oder mehrere humane VH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Schwerkettelocus und/oder humane Jκ2*01 und/oder humane Jκ4*01 und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Leichtkettelocus umfasst.
    • 3. Die Zelle oder das Wirbeltier von Aspekt 2, wobei das eine oder die mehreren humanen VH-Gensegmente des Schwerkettelocus ein, mehrere oder alle der humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 und VH3-20*d01, umfassen oder daraus bestehen, und wobei das eine oder die mehreren humanen Vκ-Gensegmente ein, mehrere oder alle der humanen VH-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01, umfassen oder daraus bestehen.
    • 4 Die Zelle oder das Wirbeltier von Aspekt 1–3, wobei das Genom VH3-23*04 umfasst, wobei gegebenenfalls die Schwerkette produziert wird durch Rekombination von einem humanen JH-Segment mit einem D-Segment und besagtem VH-Segment.
    • 5 Die Zelle oder das Wirbeltier von Aspekt 1–4, wobei das Genom Vκ4-1*01 umfasst, wobei gegebenenfalls die Schwerkette produziert wird durch Rekombination von einem humanen JH-Segment mit einem D-Segment und besagtem VH-Segment.
    • 6 Die Zelle oder das Wirbeltier von Aspekt 1–5, wobei das Genom Vκ2-28*01 umfasst, wobei gegebenenfalls die Schwerkette durch Rekombination von einem humanen JH-Segment mit einem D-Segment und besagtem VH-Segment produziert wird.
    • 7 Die Zelle oder das Wirbeltier von Aspekt 1 – 6, wobei das Genom Vκ1-12*01 umfasst, wobei gegebenenfalls die Schwerkette durch Rekombination von einem humanen JH-Segment mit einem D-Segment und besagtem VH-Segment produziert wird.
    • 8 Die Zelle oder das Wirbeltier von Aspekt 1 – 7, wobei das Genom JH2*01 und Jκ2*01 umfasst.
    • 9 Die Zelle oder das Wirbeltier von Aspekt 1 – 8, wobei das Genom JH6*02 und Jκ4*01 umfasst.
    • 10 Die Zelle oder das Wirbeltier von Aspekt 1 – 9, wobei der Schwerkettelocus VH3-23*04 rekombiniert mit JH2*01; oder VH3-7*01 rekombiniert mit JH6*02 umfasst.
    • 11 Die Zelle oder das Wirbeltier von Aspekt 1 – 10, wobei der Leichtkettelocus Vκ4-1*01 rekombiniert mit Jκ2*01; oder Vκ2-28*01 rekombiniert mit Jκ4*01 umfasst.
    • 12 Die Zelle oder das Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei das Genom VH3-23*04, JH2*01 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem VH3-23*04), Vκ4-1*01 und Jκ2*01 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem Vκ4-1*01) umfasst.
    • 13 Die Zelle oder das Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei das Genom VH3-7*01, JH6*02 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem VH3-7*01), Vκ2-28*01 und Jκ4*01 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem Vκ2-28*01) umfasst.
    • 14 Die Zelle oder das Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei der Schwerkettelocus ferner ein oder mehrere zusätzliche Schwerkette-Gensegmente der Tabelle 7 umfasst.
    • 15 Die Zelle oder das Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei der Schwerkettelocus alle von den Gensegmenten der Tabelle 1, alle von den Gensegmenten der Tabelle 2, alle von den Gensegmenten der Tabelle 3, alle von den Gensegmenten der Tabelle 4, alle von den Gensegmenten der Tabelle 5, alle von den Gensegmenten der Tabelle 6 oder alle von den Gensegmenten der Tabelle 7 umfasst.
    • 16 Die Zelle oder das Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei der Leichtkettelocus ferner ein oder mehrere zusätzliche Leichtkettesegmente der Tabelle 12 umfasst.
    • 17 Die Zelle oder das Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei der Leichtkettelocus alle von den Gensegmenten der Tabelle 8, alle von den Gensegmenten der Tabelle 9, alle von den Gensegmenten der Tabelle 10, alle von den Gensegmenten der Tabelle 11 oder alle von den Gensegmenten der Tabelle 12 umfasst.
    • 18 Die Zelle oder das Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei die Zelle eine Hybridom- oder eine B-Zelle (z. B. eine immortalisierte B-Zelle) ist.
    • 19 Das Wirbeltier oder die Zelle von jedwedem vorangehenden Aspekt, wobei die von der Maus exprimierten Immunglobulin-Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten sind; und die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten als Teil von Serum-IgG1-, IgG2b- und IgM-(und gegebenenfalls IgG2a-)Antikörpern exprimiert werden.
    • 20 Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragments davon, wobei das Verfahren das Immunisieren eines Wirbeltiers der Aspekte 1 bis 19 mit einem Antigen und das Gewinnen des Antikörpers oder Fragments oder das Gewinnen einer den Antikörper oder das Fragment produzierenden Zelle umfasst; wobei gegebenenfalls der bzw. das produzierte Antikörper oder Fragment so modifiziert ist, dass er bzw. es humane Konstantregionen umfasst, wobei die Variabeldomänen des Antikörper codiert werden von humanen Gensegmenten JH2*01 oder JH6*02 und einem oder mehreren humanen VH-Gensegmenten und einem oder mehreren humanen D-Gensegmenten; wobei das humane VH-Gensegment ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 und VH3-20*d01, und (b) humanen Gensegmenten Jκ2*01 oder Jκ4*01 und einem oder mehreren humanen Vκ-Gensegmenten, wobei das humane Vk-Gensegment ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01.
    • 21 Verfahren gemäß Aspekt 20, wobei das Antigen ein humanes Multi-Untereinheit-Protein, ein bakterielles Zytotoxin oder ein Protein, das als ein Transmembranprotein auf humanen Zellen exprimiert wird, ist.
    • 22 Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragments davon, wobei das Verfahren umfasst: das Isolieren eines Antikörpers oder antigenbindenden Fragments davon aus einer Zelle gemäß einem beliebigen der Aspekte 1 bis 20; und gegebenenfalls das Modifizieren des isolierten Antikörpers oder Fragments, so dass er bzw. es humane Konstantregionen umfasst.
    • 23 Das Verfahren von Aspekt 20, ferner umfassend (a) Isolieren einer B-Zelle, die einen Antikörper codiert, der das Antigen bindet, aus dem Wirbeltier, (b) Identifizieren oder Kopieren einer Nukleotidsequenz aus der B-Zelle, die eine VH-Domäne des Antikörpers codiert, und/oder Identifizieren oder Kopieren von Nukleotidsequenz aus der B-Zelle, die eine VL-Domäne des Antikörpers codiert; und (c) Verwenden der Sequenz(en) zum Herstellen eines isolierten Antikörpers oder Fragments, umfassend die VH- und/oder VL-Domäne; wobei der bzw. das isolierte Antikörper oder Fragment gegebenenfalls humane Konstantregionen umfasst.
    • 24 Das Verfahren von einem beliebigen der Aspekte 20–23, wobei der Antikörper oder das Fragment durch Expression aus einer Wirtszelle, die aus einer CHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zelle ausgewählt ist, produziert wird.
    • 25 Das Verfahren von Aspekt 24, wobei der Antikörper oder das Fragment durch Expression aus einer CHO-Zelle produziert wird.
    • 26 Das Verfahren von einem beliebigen der Aspekte 20–25, ferner umfassend das Formulieren des Antikörpers oder Fragments mit einem Verdünnungsmittel, Träger, Exzipiens oder einem Arzneistoff, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zum humanmedizinischen Gebrauch herzustellen, gegebenenfalls ferner umfassend das Verpacken der Zusammensetzung in einem sterilen Behälter, zum Beispiel einem Gefäß, einem Röhrchen, einem IV-Beutel oder einer Spritze, wobei ferner gegebenenfalls ein Kit hergestellt wird, was das Kombinieren der Packung mit einem Etikett oder Anleitungen umfasst, die die Anwendung der Antikörper-Zusammensetzung zum humanmedizinischen Gebrauch angeben; wobei das Etikett oder die Anleitung gegebenenfalls eine Arzneistoff-Chargennummer und/oder eine Markt-Zulassungsnummer, ferner gegebenenfalls eine EMA- oder FDA-Markt-Zulassungsnummer, umfasst.
    • 27 Das Verfahren von einem beliebigen der Aspekte 20 – 26, wobei das Wirbeltier gemäß einem beliebigen der Aspekte 1 bis 19 ausgestaltet ist, und der bzw. das durch das Verfahren produzierte Antikörper oder Fragment folgendes umfasst (a) eine humane Schwerkette-Variabeldomäne, die eine Rekombinante von humanem JH2*01 oder humanem JH6*02, einem oder mehreren humanen VH-Gensegmenten und einem oder mehreren humanen D-Gensegmenten ist; und (b) eine humane Leichtkette-Variabeldomäne, die eine Rekombinante von humanem JK2*01 oder humanem JK4*01 und einem oder mehreren humanen Vκ-Gensegmenten ist.
    • 28 Das Verfahren von Aspekt 27, wobei der bzw. das durch das Verfahren produzierte Antikörper oder Fragment eine humane Schwerkette-Variabeldomäne-Rekombinante von VH3-23*04 und JH2*01 und eine humane Leichtkette-Variabeldomäne-Rekombinante von Vκ4-1*01 und Jκ2*01 umfasst.
    • 29 Das Verfahren von Aspekt 27, wobei der bzw. das durch das Verfahren produzierte Antikörper oder Fragment eine humane Schwerkette-Variabeldomäne-Rekombinante von VH3-7*01 und JH6*02 und eine humane Leichtkette-Variabeldomäne-Rekombinante von Vκ2-28*01 und Jκ4*01 umfasst.
    • 30 Isolierter Antikörper oder Fragment oder Kit, produziert durch das Verfahren von einem beliebigen der Aspekte 20–29.
    • 31 Ein isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon oder Kit, produziert durch das Verfahren der Aspekte 20–29, wobei der Antikörper humanisiert ist.
    • 32 Zusammensetzung, umfassend ein(en) Antikörper oder Fragment oder Kit, produziert durch das Verfahren der Aspekte 20–29, worin der Antikörper oder das Fragment das einzige therapeutische Agens ist.
    • 33 Zusammensetzung, umfassend ein(en) Antikörper oder Fragment oder Kit, produziert durch das Verfahren der Aspekte 20–29, ferner umfassend ein weiteres therapeutisches Agens, zum Beispiel einen Anti-Hypercholesterinämie-Arzneistoff.
    • 34 Isolierter Antikörper oder Fragment oder Kit, produziert durch das Verfahren von einem beliebigen der Aspekte 20–29, zum humanmedizinischen Gebrauch.
    • 35 Verwendung von dem isolierten Antikörper oder Fragment, produziert durch das Verfahren von einem beliebigen der Aspekte 20–29, in der Herstellung eines Medikaments zum humanmedizinischen Gebrauch.
    • 36 Die Verwendung von Aspekt 35, wobei das Medikament von einer Zusammensetzung oder einem Kit, wie zitiert in Aspekt 26, beinhaltet ist.
    • 37 Isolierter Antikörper oder Fragment oder Kit gemäß Aspekt 30–34 oder Verwendung gemäß Aspekt 35–36, welche(r) spezifisch ein humanes Target binden kann, ausgewählt aus: Proprotein-Convertase PC9, Proprotein-Convertase Subtilisin Kexin-9 (PCSK9), CD126, IL-4, IL-4-Rezeptor, IL-6, IL-6-Rezeptor, IL-13, IL-18-Rezeptor, Erbb3, Zell-ASIC1, ANG2, GDF-8, Angiopoietinligand-2, Delta-like Protein-Ligand 4, Immunglobulin G1, PDGF-Ligand, PDGF-Rezeptor oder NGF-Rezeptor, Toxin A oder Toxin B von Clostridium difficile, Relaxin, CD48, Cd20, Glucagon-Rezeptor, Proteaseaktivierter Rezeptor 2, TNF-Like-Ligand 1A (TL1A), Angiopoietin-related-2 (AR-2), Angiopoietin-like-Protein 4, RANKL, Angiopoietin-like-Protein 3 (ANGPTL3), Delta-like-Ligand 4 (DLL4), ”Big Endothelin-1” (ET-1), Activin A, Rezeptortyrosinkinasen, zum Beispiel humane AR-1 und Tyrosinkinase mit Ig- und EGF-Homologiedomänen (TIE) und TIE-2-Rezeptor.
    • 38 Isolierter Antikörper oder Fragment oder Kit gemäß Aspekt 30–34 oder Verwendung gemäß Aspekt 35–36, zur Verwendung in der Behandlung eines Menschen, der dessen bedarf, wobei die Behandlung das Zuführen einer wirksame Menge eines Antikörpers oder Fragments umfasst, der bzw. das an ein Virus oder ein Antigen, ausgewählt aus einem humanen Cytokin, Wachstumsfaktor, Hormon, Enzym und einem Serumprotein, spezifisch bindet.
    • 39 Eine Wirtszelle, zum Beispiel eine CHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zelle, die ein(en) Antikörper oder Fragment exprimiert, produziert durch das Verfahren von einem beliebigen der Aspekte 20–29.
  • In den oben beschriebenen Aspekten kann JH6*02 mit JH6*01 ersetzt werden.
  • In einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung die folgenden Klauseln ein:
  • KLAUSELN
    • 1. Eine nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Mauszelle oder Rattenzelle), deren Genom humane JH2*01 und/oder humane JH6*02, ein oder mehrere humane VH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Schwerkettelocus und humane Jκ2*01 und/oder humane Jκ4*01 und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass die Zelle imstande ist zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette und eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH2*01- und/oder JH6*02-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert wird, und die Leichtkette durch Rekombination des humanen Jκ2*01- und/oder Jκ4*01-Segments mit einem Vκ-Segment produziert wird.
    • 2. Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen Genom humane JH2*01 und/oder humane JH6*02, ein oder mehrere humane VH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Schwerkettelocus und humane Jκ2*01 und/oder humane Jκ4*01 und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass das Wirbeltier imstande ist zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette, wobei die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH2*01- und/oder JH6*02-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert wird, und die Antikörperleichtkette durch Rekombination des humanen Jκ2*01- und/oder Jκ4*01-Segments mit einem Vκ-Segment produziert wird.
    • 3. Die Zelle von Klausel 1 oder das Wirbeltier von Klausel 2, wobei das Genom JH2*01 und Jκ2*01 umfasst.
    • 4. Die Zelle von Klausel 1 oder 3 oder das Wirbeltier von Klausel 2 oder 3, wobei das Genom JH6*02 und Jκ4*01 umfasst.
    • 5. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Klausel, wobei das eine oder die mehreren humanen VH-Gensegmente des Schwerkettelocus ein, mehrere oder alle der humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 und VH3-20*d01, umfassen oder daraus bestehen.
    • 6. Die Zelle oder das Wirbeltier von Klausel 5, wobei der Schwerkettelocus VH3-23*04 rekombiniert mit JH2*01; oder VH3-7*01 rekombiniert mit JH6*02, umfasst.
    • 7. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Klausel, wobei das eine oder die mehreren humanen Vκ-Gensegmente ein, mehrere oder alle der humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01, umfassen oder daraus bestehen.
    • 8. Die Zelle oder das Wirbeltier von Klausel 5, wobei der Leichtkettelocus Vκ4-1*01 rekombiniert mit Jκ2*01; oder Vκ2-28*01 rekombiniert mit Jκ4*01, umfasst.
    • 9. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Klausel, wobei das Genom VH3-23*04, JH2*01 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem VH3-23*04), Vκ4-1*01 und Jκ2*01 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem Vκ4-1*01) umfasst.
    • 10. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Klausel, wobei das Genom VH3-7*01, JH6*02 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem VH3-7*01), Vκ2-28*01 und Jκ4*01 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem Vκ2-28*01) umfasst.
    • 11. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Klausel, wobei der Schwerkettelocus ferner ein oder mehrere zusätzliche Schwerkettegensegmente der Tabelle 7 umfasst.
    • 12. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Klausel, wobei der Schwerkettelocus alle von den Gensegmenten der Tabelle 1, alle von den Gensegmenten der Tabelle 2, alle von den Gensegmenten der Tabelle 3, alle von den Gensegmenten der Tabelle 4, alle von den Gensegmenten der Tabelle 5, alle von den Gensegmenten der Tabelle 6 oder alle von den Gensegmenten der Tabelle 7 umfasst.
    • 13. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Klausel, wobei der Leichtkettelocus ferner ein oder mehrere zusätzliche Leichtkettesegmente der Tabelle 12 umfasst.
    • 14. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Klausel, wobei der Leichtkettelocus alle von den Gensegmenten der Tabelle 8, alle von den Gensegmenten der Tabelle 9, alle von den Gensegmenten der Tabelle 10, alle von den Gensegmenten der Tabelle 11 oder alle von den Gensegmenten der Tabelle 12 umfasst.
    • 15. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Klausel, wobei die Zelle eine Hybridom- oder eine B-Zelle (z. B. eine immortalisierte B-Zelle) ist.
    • 16. Das Wirbeltier oder die Zelle von jedweder vorangehenden Klausel, wobei die von der Maus exprimierten Immunglobulin-Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten sind; und die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten als Teil von Serum-IgG1-, IgG2b- und IgM-(und gegebenenfalls IgG2a-)Antikörpern exprimiert werden.
    • 17. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragments davon, wobei das Verfahren das Immunisieren eines Wirbeltiers der Klauseln 2 bis 16 mit einem Antigen und das Gewinnen des Antikörpers oder Fragments oder das Gewinnen einer den Antikörper oder das Fragment produzierenden Zelle umfasst; wobei gegebenenfalls der bzw. das produzierte Antikörper oder Fragment so modifiziert ist, dass er bzw. es humane Konstantregionen umfasst.
    • 18. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragments davon, wobei das Verfahren das Isolieren eines Antikörpers oder antigenbindenden Fragments davon aus einer Zelle gemäß einer beliebigen der Klauseln 1 und 3 bis 16 umfasst; und gegebenenfalls das Modifizieren des isolierten Antikörpers oder Fragments, so dass er bzw. es humane Konstantregionen umfasst.
    • 19. Das Verfahren der Klausel 17 oder Klausel 18, ferner umfassend (a) Isolieren einer B-Zelle, die einen Antikörper codiert, der das Antigen bindet, aus dem Wirbeltier, (b) Identifizieren oder Kopieren einer Nukleotidsequenz aus der B-Zelle, die eine VH-Domäne des Antikörpers codiert, und/oder Identifizieren oder Kopieren von Nukleotidsequenz aus der B-Zelle, die eine VL-Domäne des Antikörpers codiert; und (c) Verwenden der Sequenz(en) zum Herstellen eines isolierten Antikörpers oder Fragments, umfassend die VH- und/oder VL-Domäne; wobei der bzw. das isolierte Antikörper oder Fragment gegebenenfalls humane Konstantregionen umfasst.
    • 20. Das Verfahren von einer beliebigen Klauseln 17–19, wobei der Antikörper oder das Fragment durch Expression aus einer Wirtszelle produziert wird, die aus einer CHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zelle ausgewählt wird.
    • 21. Das Verfahren von einer beliebigen der Klauseln 17–20, ferner umfassend das Formulieren des Antikörpers oder Fragments mit einem Verdünnungsmittel, Träger, Exzipiens oder einem Arzneistoff, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zum humanmedizinischen Gebrauch herzustellen, gegebenenfalls ferner umfassend das Verpacken der Zusammensetzung in einem sterilen Behälter, zum Beispiel einem Gefäß, einem Röhrchen, einem IV-Beutel oder einer Spritze, wobei ferner gegebenenfalls ein Kit hergestellt wird, umfassend das Kombinieren der Packung mit einem Etikett oder Anleitungen, die die Anwendung der Antikörper-Zusammensetzung zum humanmedizinischen Gebrauch angeben; wobei das Etikett oder die Anleitung gegebenenfalls eine Arzneistoff-Chargennummer und/oder eine Markt-Zulassungsnummer, ferner gegebenenfalls eine EMA- oder FDA-Markt-Zulassungsnummer, umfasst.
    • 22. Das Verfahren von einer beliebigen der Klauseln 17–21, wobei das Wirbeltier gemäß einer beliebigen der Klauseln 2 bis 16 ist, und der Antikörper oder das Fragment, produziert durch das Verfahren, folgendes umfasst (a) eine humane Schwerkette-Variabeldomäne, die eine Rekombinante von humanem JH2*01 oder humanem JH6*02, einem oder mehreren humanen VH-Gensegmenten und einem oder mehreren humanen D-Gensegmenten ist; und (b) eine humane Leichtkette-Variabeldomäne, die eine Rekombinante von humanem JK2*01 oder humanem JK4*01 und einem oder mehreren humanen Vκ-Gensegmenten ist.
    • 23. Das Verfahren der Klausel 22, wobei der Antikörper oder das Fragment, produziert durch das Verfahren, eine humane Schwerkette-Variabeldomäne-Rekombinante von VH3-23*04 und JH2*01 und eine humane Leichtkette-Variabeldomäne-Rekombinante von Vκ4-1*01 und Jκ2*01 umfasst.
    • 24. Das Verfahren der Klausel 22, wobei der Antikörper oder das Fragment, produziert durch das Verfahren, eine humane Schwerkette-Variabeldomäne-Rekombinante von VH3-7*01 und JH6*02 und eine humane Leichtkette-Variabeldomäne-Rekombinante von Vκ2-28*01 und Jκ4*01 umfasst.
    • 25. Ein isolierter Antikörper oder isoliertes antigenbindendes Fragment davon, erhalten oder erhältlich durch das Verfahren von einer beliebigen der Klauseln 17 – 24, wobei eine Schwer- und/oder Leichtkette-Variabeldomäne des Antikörpers oder Fragments eine oder mehrere somatische Mutationen des Maus- oder Ratte-Aktivierungs-induzierte Deaminase(AID)-Musters und/oder junktionale Mutationen des Maus- oder Ratte-Terminale-Desoxynucleotidyl-Transferase(TdT)-Musters umfasst.
    • 26. Ein isolierter Antikörper oder isoliertes antigenbindendes Fragment davon, erhalten oder erhältlich durch das Verfahren von einer beliebigen der Klauseln 17–24, oder ein Antikörper gemäß Klausel 25, umfassend ein Human-Schwerkette-Fc-Fragment, das gegebenenfalls einen Gamma-Rezeptor und ferner gegebenenfalls eine humane Konstant-Leichtkette bindet.
    • 27. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, erhalten oder erhältlich durch das Verfahren von einer beliebigen der Klauseln 17–24 oder, ein Antikörper gemäß Klausel 25 oder Klausel 26, umfassend eine antigenbindende Stelle, die zum spezifischen Binden an ein Virus oder ein Antigen, ausgewählt aus einem humanen Cytokin, Wachstumsfaktor, Hormon, Enzym und einem Serumprotein, imstande ist.
    • 28. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, erhalten oder erhältlich durch das Verfahren von einer beliebigen der Klauseln 17–24, oder ein Antikörper gemäß einer beliebigen von Klauseln 25–27, wobei der Antikörper oder das Fragment glykosyliert ist, gegebenenfalls umfassend CHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zell-Glykosylierung.
    • 29. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, wobei die Variabeldomänen des Antikörpers codiert sind durch (a) humane Gensegmente JH2*01 oder JH6*02 und ein oder mehrere humane VH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente; und (b) humane Gensegmente Jκ2*01 oder Jκ4*01 und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente.
    • 30. Der Antikörper von Klausel 29, wobei die Variabeldomänen durch die humanen Gensegmente (i) JH2*01 und VH3-23*04 für die VH-Domäne und (ii) Vκ4-1*01 und Jκ2*01 für die VL-Domäne codiert sind.
    • 31. Der Antikörper von Klausel 29, wobei die Variabeldomänen durch die humanen Gensegmente (i) JH6*02 und VH3-7*01 für die VH-Domäne und (ii) Vκ2-28*01 und Jκ4*01 für die VL-Domäne codiert sind.
    • 32. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon von einer beliebigen der Klauseln 25–31, wobei der Antikörper humanisiert ist.
    • 33. Eine Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper oder ein Fragment von einer beliebigen der Klauseln 25–32, wobei der Antikörper oder das Fragment das einzige therapeutische Agens ist.
    • 34. Eine Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper oder ein Fragment von einer beliebigen der Klauseln 25–32, ferner umfassend ein zusätzliches therapeutisches Agens, zum Beispiel einen Anti-Hypercholesterinämie-Arzneistoff.
    • 35. Isolierter Antikörper oder Fragment, produziert durch das Verfahren von einer beliebigen der Klauseln 17–24, oder der isolierte Antikörper oder das Fragment von einer beliebigen der Klauseln 25 bis 34 zum humanmedizinischen Gebrauch.
    • 36. Verwendung des isolierten Antikörpers oder Fragments, produziert durch das Verfahren von einer beliebigen der Klauseln 17–24, oder des isolierten Antikörpers oder Fragments von einer beliebigen der Klauseln 25–34 in der Herstellung eines Medikaments zum humanmedizinischen Gebrauch.
    • 37. Die Verwendung von Klausel 36, wobei das Medikament von einer Zusammensetzung oder einem Kit, wie zitiert in Klausel 21, beinhaltet ist.
    • 38. Verfahren zur medizinischen Behandlung, umfassend die Zuführung einer wirksamen Menge von isoliertem Antikörper oder Fragment davon gemäß Klauseln 25–34 an einen Menschen, der dessen bedarf.
    • 39. Wirtszelle, zum Beispiel eine CHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zelle, die einen Antikörper oder ein Fragment exprimiert, wie in einer beliebigen der Klauseln 25–34 definiert.
  • In den oben beschriebenen Klauseln kann JH6*02 durch JH6*01 ersetzt sein.
  • In einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung die folgenden Bestimmungen ein:
    • 1. Eine nicht-humane Wirbeltier-(z. B. eine Maus oder Ratten-)Zelle, deren Genom humane VH-, D- und JH-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Schwerkettelocus und humane VL- und JL-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass die Zelle zum Exprimieren von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten, umfassend humane VH- bzw. VL-Domänen, imstande ist, wobei der Schwerkettelocus ein humanes 01-Allel-VH-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen D- und JH-Gensegment unter Erzeugung einer VH-Domäne, umfasst, wobei der Leichtkettelocus ein humanes 01-Allel-VL-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen JL-Gensegment unter Erzeugung einer VL-Domäne, umfasst oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die VH- und VL-Domänen exprimiert.
    • 2. Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen Genom humane VH-, D- und JH-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Schwerkettelocus und humane VL- und JL-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass das Wirbeltier zum Exprimieren von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten, umfassend humane VH- bzw. VL-Domänen, imstande ist, wobei der Schwerkettelocus ein humanes 01-Allel-VH-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen D- und JH-Gensegment unter Erzeugung einer VH-Domäne, umfasst und wobei der Leichtkettelocus ein humanes 01-Allel-VL-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen JL-Gensegment unter Erzeugung einer VL-Domäne, umfasst.
    • 3. Die Zelle von Bestimmung 1 oder das Wirbeltier von Bestimmung 2, wobei eines oder beide von den 01-Allelen ein d01-Allel ist.
    • 4. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei die VH- und VL-Domänen eine antigenbindende Stelle bilden.
    • 5. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei der Schwerkettelocus kein zweites humanes Allel von dem VH-Gensegment umfasst.
    • 6. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei der Leichtkettelocus kein zweites humanes Allel von dem VL-Gensegment umfasst.
    • 7. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei der Schwerkettelocus ein humanes 01-Allel-D-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen JH-Gensegment und dem humanen VH-Segment unter Erzeugung der VH-Domäne, umfasst; wobei gegebenenfalls der Schwerkettelocus kein zweites humanes Allel von dem D-Gensegment umfasst.
    • 8. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei der Schwerkettelocus ein humanes 02-Allel-JH-Gensegment (z. B. JH6*02), befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen D-Gensegment und dem humanen VH-Segment unter Erzeugung der VH-Domäne, umfasst; wobei gegebenenfalls der Schwerkettelocus kein zweites humanes Allel von dem JH-Gensegment umfasst.
    • 9. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei der Leichtkettelocus ein humanes 01-Allel-JL-Gensegment, befähigt zum Rekombinieren des humanen VL-Segments unter Erzeugung der VL-Domäne, umfasst; wobei gegebenenfalls der Leichtkettelocus kein zweites humanes Allel von dem JL-Gensegment umfasst.
    • 10. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei das Genom VH3-23*04, JH2*01 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem VH3-23*04), Vκ4-1*01 und Jκ2*01(gegebenenfalls rekombiniert mit dem Vκ4-1*01) umfasst.
    • 11. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei das Genom VH3-7*01, JH6*02 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem VH3-7*01), Vκ2-28*01 und Jκ4*01 (gegebenenfalls rekombiniert mit dem Vκ2-28*01) umfasst.
    • 12. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei der Leichtkettelocus ein, mehrere oder alle humanen VL-Gensegmente, ausgewählt aus der aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01 bestehenden Gruppe, umfasst oder daraus besteht.
    • 13. Die Zelle oder das Wirbeltier von einer beliebigen der Bestimmungen 1 bis 9, wobei der Leichtkettelocus ein, mehrere oder alle humanen VL-Gensegmente, ausgewählt aus der aus Jκ4*01 und Jκ2*01 bestehenden Gruppe, umfasst oder daraus besteht.
    • 14. Die Zelle oder das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei der Schwerkettelocus ein, mehrere oder alle humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 und VH3-20*d01 bestehenden Gruppe, umfasst oder daraus besteht.
    • 15. Die Zelle oder das Wirbeltier von einer beliebigen der Bestimmungen 1 bis 9 oder 14, wobei die Leichtkettelocus Jλ2*01 umfasst.
    • 16. Die Zelle oder das Wirbeltier von einer beliebigen der Bestimmungen 1 bis 6, wobei die VH-Domäne eine Rekombinante von humanen VH-, D- und JH-Segmenten ist, wobei das VH aus der Gruppe bestehend aus einem, mehreren oder allen 01-Allel-Gen-VH-Segmenten der Tabelle 7 ausgewählt ist, und/oder die VL-Domäne eine Rekombinante von (i) humanen Vκ- und Jκ-Gensegmenten, wobei das Vκ aus der Gruppe bestehend aus einem, mehreren oder allen 01-Allel-Vκ-Gensegmenten der Tabelle 12 ausgewählt ist, oder von (ii) humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten ist, wobei das Vλ aus der Gruppe bestehend aus einem, mehreren oder allen 01-Allel-Vλ-Gensegmenten der Tabelle 18 ausgewählt ist; wobei gegebenenfalls die VH- und/oder VL-Domänen als IgG-Antikörper exprimiert werden.
    • 17. Die Zelle oder das Wirbeltier von einer beliebigen der Bestimmungen 1 bis 6 und 16, wobei die VH-Domäne eine Rekombinante der humanen VH-, D- und JH-Segmenten der Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4, Tabelle 5, Tabelle 6 oder Tabelle 7 ist, und/oder die VL-Domäne eine Rekombinante (i) der humanen Vκ- und Jκ-Gensegmente der Tabelle 8, Tabelle 9, Tabelle 10, Tabelle 11 oder Tabelle 12; oder (ii) der humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente der Tabelle 13, Tabelle 14, Tabelle 15, Tabelle 16, Tabelle 17 oder Tabelle 18 ist.
    • 18. Das Wirbeltier von einer beliebigen der Bestimmungen 2 bis 17, wobei (a) der Schwerkettelocus die humanen VH-, D- und JH-Segmente von einer Tabelle, ausgewählt aus der Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4, Tabelle 5, Tabelle 6 und Tabelle 7, umfasst und/oder (b) der Leichtkettelocus (i) die humanen Vκ- und Jκ-Gensegmente von einer Tabelle, ausgewählt aus der Tabelle 8, Tabelle 9, Tabelle 10, Tabelle 11 und Tabelle 12; oder (ii) die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente von einer Tabelle, ausgewählt aus der Tabelle 13, Tabelle 14, Tabelle 15, Tabelle 16, Tabelle 17 und Tabelle 18, umfasst; und wobei das Wirbeltier eine oder eine Vielzahl von VH-Domänen exprimiert, die jeweils eine Rekombinante von humanen VH-, D- und JH-Segmenten aus einer ausgewählten Tabelle von (a) ist, und/oder eine oder eine Vielzahl von VL-Domänen exprimiert, die jeweils eine Rekombinante von humanen VL- und JL-Segmenten aus einer ausgewählten Tabelle von (b) ist; wobei gegebenenfalls solche VH-Domänen und VL-Domänen antigenbindende Stellen bilden.
    • 19. Ein nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen Genom humane VH-, D- und JH-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Schwerkettelocus und humane VL- und JL-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass das Wirbeltier imstande ist zum Exprimieren von Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten, umfassend humane VH- bzw. VL-Domänen, wobei (a) der Schwerkettelocus die humanen VH-, D- und JH-Segmente von einer Tabelle, ausgewählt aus der Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4, Tabelle 5, Tabelle 6 und Tabelle 7, umfasst, und/oder (b) der Leichtkettelocus (i) die humanen Vκ- und Jκ-Gensegmente von einer Tabelle, ausgewählt aus der Tabelle 8, Tabelle 9, Tabelle 10, Tabelle 11 und Tabelle 12; oder (ii) die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente von einer Tabelle, ausgewählt aus der Tabelle 13, Tabelle 14, Tabelle 15, Tabelle 16, Tabelle 17 und Tabelle 18, umfasst; und wobei das Wirbeltier eine oder eine Vielzahl von VH-Domänen exprimiert, die jeweils eine Rekombinante von humanen VH-, D- und JH-Segmenten aus einer ausgewählten Tabelle von (a) ist, und/oder eine oder eine Vielzahl von VL-Domänen exprimiert, die jeweils eine Rekombinante von humanen VL- und JL-Segmenten aus einer ausgewählten Tabelle von (b) ist; wobei gegebenenfalls solche VH-Domänen und VL-Domänen antigenbindende Stellen bilden.
    • 20. Die Zelle von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei die Zelle eine ES-Zelle, eine Hybridomzelle oder eine immortalisierte B-Zelle ist.
    • 21. Das Wirbeltier von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei das Wirbeltier innerhalb eines einen Luftfilter aufweisenden Behälters untergebracht ist.
    • 22. Eine Population von wenigstens 90 Zellen, wobei die Zellen gemäß einer beliebigen von Bestimmungen 1 bis 17, 19 oder 20 sind.
    • 23. Die Zelle, das Wirbeltier oder die Population von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei die Leichtkettelocus-Konstantregion eine Kappa- oder Lambda-Konstantregion; gegebenenfalls eine Maus- oder Ratte-Konstantregion, ist.
    • 24. Die Zelle, das Wirbeltier oder die Population von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei der Schwerkettelocus eine Maus- oder Ratte-Konstantregion (z. B. umfassend ein Gamma-Konstant-Gensegment) ist.
    • 25. Die Zelle, das Wirbeltier oder die Population von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei der endogene Leichtkettelocus ein Kappa- oder Lambda-Locus ist; wobei das Genom gegebenenfalls wenigstens die V- und J-Gensegmente der Tabelle 8 an einem endogenen Leichtkettelocus und/oder wenigstens die V- und J-Gensegmenten der Tabelle 13 an einem endogenen Leichtkettelocus umfasst.
    • 26. Die Zelle, das Wirbeltier oder die Population von einer beliebigen der Bestimmungen 1 bis 9 oder 14 bis 23, wobei die Leichtketten Immunglobulin-Leichtketten umfassen, umfassend Human-Variabelregionen. die abgeleitet sind aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vλ- und Jλ-Gensegmenten der Tabelle 18, wobei gegebenenfalls jede solche Variabelregion mit einer Konstantregion exprimiert wird, die von einem Cλ-Gensegment codiert ist, ausgewählt aus der aus den Cλ-Gensegmenten der Tabelle 18 bestehenden Gruppe.
    • 27. Die Zelle, das Wirbeltier oder die Population von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei es sich bei dem Wirbeltier um einen C57BI/6J-, 129S5- oder 129Sv-Mausstamm oder eine Kreuzung zwischen C57BI/6J und einem 129S5- oder 129Sv-Stamm handelt.
    • 28. Die Zelle, das Wirbeltier oder die Population von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei die von der Zelle oder dem Wirbeltier exprimierten Immunglobulin-Schwerketten im wesentlichen ausschließlich die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten sind; und die Human-Variabelregionen umfassenden Schwerketten as Teil von Serum-IgG1-, IgG2b- und IgM-(und gegebenenfalls IgG2a-)Antikörpern exprimiert werden.
    • 29. Die Zelle, das Wirbeltier oder die Population von jedweder vorangehenden Bestimmung, wobei das Wirbeltier humane Lambda-Variabelregionen umfassende Leichtketten exprimiert, und wenigstens 60%, 70% oder 80% von den Variabelregionen solcher Leichtketten aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitet sind.
    • 30. Ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder Zelle, dessen bzw. deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in einen oder mehrere endogene(n) Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion umfasst, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmente durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers oder der Zelle bereitgestellt wurden, wobei das Wirbeltier Immunglobulin-Leichtketten, umfassend Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten) umfasst, oder die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Immunglobulin-Leichtketten exprimiert, wobei die Lambda-Leichtketten Immunglobulin-Leichtketten umfassen, umfassend aus der Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten abgeleitete Lambda-Variabelregionen; wobei wenigstens 80% von den Variabelregionen der von dem Wirbeltier exprimierten Lambda-Leichtketten humane Vλ- und Jλ-Gensegmentrekombinanten sind; wobei das Wirbeltier oder die Zelle gemäß einer beliebigen der Bestimmungen 1 bis 9 oder 14 bis 29 ausgestaltet ist.
    • 31. Ein(e) nicht-humane(s) Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte) oder Zelle, dessen bzw. deren Genom ein Ig-Gensegmentrepertoire, produziert durch zielgerichtete Insertion von humanen Ig-Gensegmenten in einen oder mehrere endogene(n) Ig-Loci, umfasst, wobei das Genom humane Vλ- und Jλ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion umfasst, wobei die humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenteare ausgewählt sind aus einem, mehreren oder allen der Segmente der Tabelle 18 und bereitgestellt wurden durch Insertion in einen endogenen Leichtkettelocus des Wirbeltiers oder der Zelle, wobei das Wirbeltier Immunglobulin-Leichtketten, umfassend Lambda-Variabelregionen (Lambda-Leichtketten) umfasst, oder die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die Immunglobulin-Leichtketten exprimiert, wobei die Lambda-Leichtketten Immunglobulin-Leichtketten umfassen, umfassend Lambda-Variabelregion-Rekombinanten von einem oder einer Vielzahl von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmentpaaren, wobei jedes Gensegment aus den humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten der Tabelle 18 ausgewählt ist.
    • 32. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragments davon, wobei das Verfahren das Immunisieren eines Wirbeltiers von einer beliebigen der Bestimmungen 2 bis 19, 21 oder 23 bis 31 mit einem Antigen und das Gewinnen des Antikörpers oder Fragments oder das Gewinnen einer den Antikörper oder das Fragment produzierenden Zelle umfasst; gegebenenfalls unter Modifizieren des produzierten Antikörpers oder Fragments, so dass er bzw. es humane Konstantregionen umfasst.
    • 33. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragments davon, wobei das Verfahren umfasst: das Isolieren eines Antikörpers oder antigenbindenden Fragments davon aus einer Zelle gemäß einer beliebigen der Bestimmungen 1, 3 bis 17, 19 und 23 bis 31; und gegebenenfalls das Modifizieren des isolierten Antikörpers oder Fragments, so dass er bzw. es humane Konstantregionen umfasst.
    • 34. Das Verfahren von Bestimmung 33, ferner umfassend (a) Isolieren einer B-Zelle, die einen Antikörper codiert, der das Antigen bindet, aus dem Wirbeltier, (b) Identifizieren oder Kopieren einer Nukleotidsequenz der B-Zelle, die eine VH-Domäne des Antikörpers codiert, und/oder Identifizieren oder Kopieren von Nukleotidsequenz der B-Zelle, die eine VL-Domäne des Antikörpers codiert; und (c) Verwendung der Sequenz(en) zum Herstellen eines isolierten Antikörpers oder Fragments, umfassend die VH- und/oder VL-Domäne; wobei gegebenenfalls der isolierte Antikörper oder das isolierte Fragment humane Konstantregionen umfasst.
    • 35. Das Verfahren von einer beliebigen der Bestimmungen 32 bis 34, wobei der Antikörper oder das Fragment durch Expression aus einer Wirtszelle, ausgewählt aus einer CHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zelle, produziert wird.
    • 36. Das Verfahren der Bestimmung von einer beliebigen der Bestimmungen 32 bis 35, ferner umfassend das Formulieren des Antikörpers oder Fragments mit einem Verdünnungsmittel, Träger, Exzipiens oder einem Arzneistoff, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zum humanmedizinischen Gebrauch herzustellen, gegebenenfalls ferner umfassend das Verpacken der Zusammensetzung in einem sterilen Behälter, zum Beispiel einem Gefäß, einem Röhrchen, einem IV-Beutel oder einer Spritze, ferner gegebenenfalls das Herstellen eines Kits, umfassend das Kombinieren der Packung mit einem Etikett oder Anleitungen, die die Anwendung der Antikörper-Zusammensetzung zum humanmedizinischen Gebrauch angeben; wobei das Etikett oder die Anleitung gegebenenfalls eine Arzneistoff-Chargennummer und/oder eine Markt-Zulassungsnummer, ferner gegebenenfalls eine EMA- oder FDA-Markt-Zulassungsnummer, umfasst.
    • 37. Das Verfahren von einer beliebigen der Bestimmungen 32 bis 35, wobei das Wirbeltier gemäß jedweder vorangehenden Bestimmung ausgestaltet ist, und der Antikörper oder das Fragment, produziert durch das Verfahren, folgendes umfasst (a) eine humane Schwerkette-Variabeldomäne-Rekombinante von humanen VH-, D- und JH-Gensegmenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VH-, D- und JH-Gensegmenten der Tabelle 7; und (b) eine humane Leichtkette-Variabeldomäne-Rekombinante von humanen V- und J-Gensegmenten, ausgewählt aus den V- und J-Gensegmenten der Tabelle 12 oder ausgewählt aus den V- und J-Gensegmenten der Tabelle 18.
    • 38. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, erhalten oder erhältlich durch das Verfahren von einer beliebigen der Bestimmungen 32 bis 35, wobei eine Schwer- und/oder Leichtkette-Variabeldomäne des Antikörpers oder Fragments ein oder mehrere somatische Mutationen des Maus- oder Ratte-Aktivierungs-induzierte Deaminase(AID)-Musters und/oder junktionale Mutationen des Maus- oder Ratte-Terminale-Desoxynucleotidyl-Transferase(TdT)-Musters umfasst.
    • 39. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, erhalten oder erhältlich durch das Verfahren von Bestimmung 32 bis 35, oder ein Antikörper gemäß Bestimmung 38, umfassend ein humanes Schwerkette-Fc-Fragment, das gegebenenfalls einen Gamma-Rezeptor und ferner gegebenenfalls eine humane Konstant-Leichtkette bindet.
    • 40. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, erhalten oder erhältlich durch das Verfahren von einer beliebigen der Bestimmungen 32 bis 35, oder ein Antikörper gemäß Bestimmung 38 oder Bestimmung 39, umfassend eine antigenbindende Stelle, die zum spezifischen Binden an ein Virus oder ein Antigen, das aus einem humanen Zytokin, Wachstumsfaktor, Hormon, Enzym und einem Serumprotein ausgewählt wird, imstande ist.
    • 41. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, erhalten oder erhältlich durch das Verfahren von einer beliebigen der Bestimmungen 32 bis 35, oder ein Antikörper gemäß einer beliebigen der Bestimmungen 38 bis 40, wobei der Antikörper oder das Fragment glykosyliert ist, gegebenenfalls umfassend CHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zell-Glykosylierung.
    • 42. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, wobei die variablen Domänen des Antikörpers durch (i) humane VH-, D- und JH-Segmente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jeglichem Gensegment der Tabelle 7, und/oder (i) humane Vκ- und Jκ-Gensegmente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jeglichen Vκ- und Jκ-Gensegmenten der Tabelle 12, oder (ii) humane Vλ- und Jλ-Gensegmente, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus jeglichen Vλ- und Jλ-Gensegmenten der Tabelle 18, codiert sind.
    • 43. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon von einer beliebigen der Bestimmungen 38 bis 42, wobei der Antikörper oder das Fragment an ein Virus oder ein Antigen spezifisch bindet, das aus einem humanen Zytokin, Wachstumsfaktor, Hormon, Enzym und einem Serumprotein ausgewählt ist.
    • 44. Isolierter Antikörper, oder antigenbindendes Fragment davon, von einer beliebigen der Bestimmungen 38 bis 43, wobei der Antikörper humanisiert ist.
    • 45. Zusammensetzung, die einen Antikörper oder ein Fragment von einer beliebigen der Bestimmungen 38 bis 44 umfasst, wobei der Antikörper oder das Fragment das einzige therapeutische Agens ist.
    • 46. Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper oder ein Fragment von einer beliebigen der Bestimmungen 38 bis 44, ferner umfassend ein zusätzliches therapeutisches Agens, zum Beispiel einen Antirheuma-Arzneistoff, wie einen eine Erkrankung modifizierenden Antirheuma-Arzneistoff, oder einen Antikrebs-Arzneistoff oder einen Anti-Hypercholesterinämie-Arzneistoff.
    • 47. Der isolierte Antikörper oder Fragment, produziert durch das Verfahren einer beliebigen der Bestimmungen 32 bis 35, oder der isolierte Antikörper oder das Fragment von einer beliebigen der Bestimmungen 38 bis 46, zum humanmedizinischen Gebrauch.
    • 48. Verwendung von dem isolierten Antikörper oder Fragment, produziert durch das Verfahren einer beliebigen der Bestimmungen 32 bis 35, oder dem isolierten Antikörper oder Fragment von Bestimmung 38 bis 46 in der Herstellung eines Medikaments zum humanmedizinischen Gebrauch.
    • 49. Die Verwendung von Bestimmung 48, wobei das Medikament von einer Zusammensetzung oder einem Kit beinhaltet ist, wie in Bestimmung 36 aufgeführt.
    • 50. Verfahren der medizinischen Behandlung, umfassend das Zuführen einer wirksamen Menge von isoliertem Antikörper oder Fragment davon gemäß der Bestimmungen 38 bis 46 an einen Menschen, der dessen bedarf.
    • 51. Wirtszelle, zum Beispiel eine CHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zelle, die einen Antikörper oder ein Fragment exprimiert, wie in einer beliebigen der Bestimmungen 38 bis 43 definiert.
  • In den oben beschriebenen Bestimmungen kann JH6*02 mit JH6*01 ersetzt werden.
  • Die folgenden Definitionen gelten für jedwede Konfiguration, jedweden Aspekt, jedwede Klausel, jedwede Bestimmung, jedwedes Beispiel oder jedwede Ausführungsform der Erfindung.
  • ”Abgeleitet von” wird im gewöhnlichen Sinn des Begriffs verwendet. Exemplarische Synonyma beinhalten ”produziert als”, ”resultierend aus”, ”gewonnen aus”, ”erhalten von”, ”ein Produkt von”, ”Folge von” und ”modifiziert aus”. Zum Beispiel kann eine Human-Variabelregion einer Schwerkette aus der Rekombination von humanen VH-, D- und JH-Gensegmenten abgeleitet sein, und dies reflektiert die In-vivo-Rekombination dieser Gensegmente in, zum Beispiel, einem transgenen Schwerkettelocus gemäß der Erfindung mit jedweder einhergehenden Mutation (z. B. junktionalen Mutation).
  • Proben, aus denen man B-Zellen erhalten kann, schließen, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Blut, Serum, Milz, Milzgewebe, Knochenmark, Lymphe, Lymphknoten, Thymus und Blinddarm ein. Antikörper und Immunglobulin-Ketten können aus jeder der vorstehend erwähnten Proben, und auch aus der nachfolgenden nicht-einschränkenden Liste von B-Zellen, Ascitesfluid, Hybridomen und Zellkulturen erhalten werden.
  • ”Vielzahl” wird im gewöhnlichen Sinne des Begriffes verwendet und bedeutet ”wenigstens ein” oder ”mehr als eins”.
  • Der Begriff ”Keimbahnkonfiguration” bezieht sich auf eine genomische Keimbahnkonfiguration. Zum Beispiel sind humane Immunglobulin-Gensegmente von einem transgenen Immunglobulin-Locus in einer Keimbahnkonfiguration, wenn die relative Abfolge der Gensegmente die gleiche ist wie die Abfolge entsprechender Gensegmente in einem humanen Keimbahngenom. Wenn der transgene Locus ein Schwerkettelocus der Erfindung ist, der die hypothetischen humanen Immunglobulin-Gensegmente A, B und C umfasst, würden diese beispielsweise in dieser Reihenfolge (5' nach 3' in dem Locus) bereitgestellt sein, wenn die entsprechenden Gensegmente eines humanen Keimbahngenoms die Anordnung 5'-A-B-C-3' umfassen. In einem Beispiel, wenn Elemente von einem humanen Immunglobulin-Locus (z. B. Gensegmente, Enhancer oder andere regulatorische Elemente) in einem transgenen Immunglobulin-Locus gemäß der Erfindung bereitgestellt werden, sind die humanen Ig-Locus-Elemente in Keimbahnkonfiguration, wenn die relative Reihenfolge der Gensegmente die gleiche ist wie die Reihenfolge entsprechender Gensegmente in einem humanen Keimbahngenom und humane Sequenzen zwischen den Elementen enthalten sind, entsprechend solchen Sequenzen zwischen entsprechenden Elementen im humanen Keimbahngenom. Somit umfasst, in einem hypothetischen Beispiel, der transgene Locus humane Elemente in dem Arrangement bzw. in der Anordnung 5'-A-S1-B-S2-C-S3-3', wobei A, B und C humane Immunglobulin-Gensegmente sind und 51-S3 humane Intergen-Segmentsequenzen sind, wobei die entsprechende Anordnung 5'-A-S1-B-S2-C-S3-3' in einem humanen Keimbahngenom vorhanden ist. Zum Beispiel kann dies bewirkt werden durch Bereitstellen, in einem transgenen Immunglobulin-Locus der Erfindung, eines DNA-Inserts, entsprechend der DNA-Sequenz von A bis C in einem humanen Keimbahngenom (oder des Inserts, umfassend die DNA-Sequenz von A bis C). Die Anordnungen in humanen Keimbahngenomen und Immunglobulin-Loci sind im Stand der Technik bekannt (z. B. siehe IMGT im World Wide Web (siehe oben), Kabat und andere Antikörper-Ressourcen, auf die hierin verwiesen wird).
  • Der Begriff ”Antikörper” schließt monoklonale Antikörper (einschließlich Volllänge-Antikörpern, die eine Immunglobulin-Fc-Region aufweisen), Antikörperzusammensetzungen mit Polyepitop-Spezifität, Multi-Antikörper (z. B. bispezifische Antikörper), Diabodies und einkettige Moleküle sowie Antikörperfragmente (z. B. dAb, Fab, F(ab')2 und Fv) ein. Der Begriff ”Antikörper” schließt auch H2-Antikörper ein, welche ein Dimer von einer Schwerkette (5'-VH-(optional Gelenk)-CH2-CH3-3') umfassen und denen eine Leichtkette fehlt (ähnlich zu natürlich vorkommenden H2-Antikörpern; Siehe z. B. Nature., 3. Juni 1993; 363(6428): 446-8; Naturally occurring antibodies devoid of light chains; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R). Somit codiert, in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, RNA, die von dem transgenen Schwerkettelocus aus produziert wird, für Schwerketten, die frei von einem CH1-Gensegment sind und keine funktionelle Antikörperleichtkette umfassen. In einem Beispiel codiert von dem transgenen Schwerkettelocus aus produzierte RNA für VH-Einzel-Variabeldomänen(dAbs; Domäne-Antikörper). Diese können gegebenenfalls einen Konstantregion umfassen.
  • Der Begriff ”Immunglobulin” (Ig) wird hierin austauschbar mit ”Antikörper” verwendet.
  • Ein ”isolierter” Antikörper ist ein solcher, der identifiziert, abgetrennt und/oder von einer Komponente seiner Produktionsumgebung (z. B. natürlich oder rekombinant) gewonnen bzw. aufgereinigt wurde. Vorzugsweise ist das isolierte Polypeptid frei von Vergesellschaftung mit allen anderen Komponenten aus seiner Produktionsumgebung, z. B. so dass der Antikörper zu einem seitens der FDA zulässigen oder anerkannten Standard isoliert worden ist. Kontaminanten-Komponenten aus seiner Produktionsumgebung, wie diejenigen, die aus rekombinanten transfizierten Zellen resultieren, sind Materialien, die typischerweise Forschungs-, Diagnostik- oder Therapie-Anwendungen für die Antikörper stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid aufgereinigt: (1) zu mehr als 95 Gew.-% an Antikörper, wie bestimmt durch, zum Beispiel, das Lowry-Verfahren, und in einigen Ausführungsformen, zu mehr als 99 Gew.-%; (2) zu einem ausreichenden Grad, um wenigstens 15 Reste von N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz unter Verwendung eines ”Spinning-Cup”-Sequenators zu erhalten, oder (3) zur Homogenität mittels SOS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau- oder vorzugsweise Silberfärbung. ”Isolierter Antikörper” beinhaltet den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da wenigstens eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden sein wird. Normalerweise wird jedoch ein isoliertes Polypeptid oder ein isolierter Antikörper durch wenigstens einen Reinigungsschritt erzeugt werden.
  • Ein ”Antikörperfragment” umfasst einen Abschnitt von einem intakten Antikörper, vorzugsweise die Antigenbindungs- und/oder die Variabel-Region des intakten Antikörpers. Beispiele von Antikörperfragmenten schließen dAb, Fab, Fab', F(ab')2 und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper; Einzelketten-Antikörpermoleküle und multispezifische Antikörper, die aus Antikörperfragmenten gebildet sind, ein.
  • Ein Antikörper, der ”spezifisch bindet an” oder ”spezifisch ist für” ein bestimmtes Polypeptid, Antigen oder Epitop, ist ein solcher, der an dieses bestimmte Polypeptid, Antigen oder Epitop bindet, ohne im wesentlichen an andere Polypeptide, Antigene oder Epitope zu binden. Zum Beispiel ist das Binden an das Antigen oder Epitop spezifisch, wenn der Antikörper mit einem KD von 100 μM oder weniger, 10 μM oder weniger, 1 μM oder weniger, 100 nM oder weniger, z. B. 10 nM oder weniger, 1 nM oder weniger, 500 pM oder weniger, 100 pM oder weniger oder 10 pM oder weniger bindet. Die Bindungsaffinität (KD) kann mithilfe von Standardverfahren bestimmt werden, wie es dem Fachmann bekannt ist, z. B. Bindung im ELISA und/oder Affinitätsbestimmung mithilfe von Oberflächenplasmonresonanz (z. B. BiacoreTM oder KinExATM-Lösungsphasen-Affinitätsmessung, die bis zu fM-Affinitäten detektieren kann (Sapidyne Instruments, Idaho)).
  • ”Pharmazeutisch akzeptabel” bezieht sich auf genehmigt oder zulässig seitens einer Aufsichtsbehörde der US-Bundes- oder einer US-Einzelstaatregierung, oder aufgeführt in der US Pharmacopeia oder einer anderen allgemein anerkannten Pharmakopöe für den Gebrauch bei Tieren, einschließlich Menschen. Ein ”pharmazeutisch akzeptables Trägermittel, Exzipiens oder Adjuvans” bezieht sich auf einen Träger, einen Exzipienten oder ein Adjuvans, der bzw. das einem Patienten zusammen mit einen Agens, z. B. jedwedem Antikörper oder jedweder Antikörperkette, die hierin beschrieben sind, verabreicht werden kann und der bzw. das die pharmakologische Aktivität davon nicht zerstört und nicht toxisch ist, wenn er bzw. es in Dosen verabreicht wird, die ausreichen, um eine therapeutische Menge von dem Agens zuzuführen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Die 1, Teil 1, veranschaulicht die ersten und zweiten BACs, verwendet zur Insertion in endogene Maus-Leichtkette-Loci. Die humane DNA in jedem BAC ist gezeigt. Teil 2 von 1 zeigt den Insertionspunkt von humaner Lambda-Ig-Locus-DNA in den endogenen Maus-Kappa-Kette Locus. Teil 3 von 1 zeigt den Insertionspunkt von humaner Lambda-Ig-Locus-DNA in den endogenen Maus-Lambdakette-Locus.
  • Die 2 zeigt die Ergebnisse einer FACS-Analyse zur Bestimmung der Maus- und Human-Cλ-Expression (und somit entsprechenderweise der Maus- und Human-Variabelregion-Expression) in B220+-Milz-B-Zellen aus P1-homozygoten Mäusen (P1/P1), verglichen mit Wildtypmäusen (WT).
  • Die 3A zeigt die Ergebnisse von FACS-Analyse zum Bestimmen von Maus-Cκ- und -Oλ-Expression in B220+-Milz-B-Zellen aus P2-homozygoten Mäusen (P2/P2) verglichen mit Wildtypmäusen (WT). Es wurde keine nachweisbare Maus-Cκ-Expression gesehen.
  • Die 3B zeigt die Ergebnisse einer FACS-Analyse zum Bestimmen von humaner Cλ-Expression (und somit entsprechenderweise der Human-Variabelregion-Expression) in B220+-Milz-B-Zellen aus P2-homozygoten Mäusen (P2/P2) verglichen mit Wildtypmäusen (WT).
  • Die 4 zeigt die humane Vλ-Nutzung in P2-homozygoten Mäusen (P2/P2) und die typische Vλ-Nutzung in Menschen (Teilbild).
  • Die 5 zeigt die humane Jλ-Nutzung in P2-homozygoten Mäusen (P2/P2) und die typische Jλ-Nutzung in Menschen (Teilbild).
  • Die 6 zeigt, dass die Vλ-Nutzung in P2-homozygoten Mäusen (P2/P2) sehr hoch ist.
  • Die 7 zeigt die Verteilung von Maus-Vκ- und Human-Vλ-Gensegment-Nutzung aus dem chimären Kappa-Locus in P2-homozygoten Mäusen (P2/P2).
  • Die 8 veranschaulicht das RSS-Arrangement in Lambda- und Kappa-Loci.
  • Die 9A zeigt die Ergebnisse einer FACS-Analyse zum Bestimmen von Maus- und Human-Cλ-Expression (und somit entsprechenderweise der Maus- und Human-Variabelregion-Expression) in B220+-Milz-B-Zellen aus L2-homozygoten Mäusen, in denen endogene Kappa-Kette-Expression inaktiviert wurde (L2/L2; KA/KA), verglichen mit Mäusen, bei denen keine humane Lambda-DNA inseriert ist und in denen endogene Kappa-Kette-Expression inaktiviert wurde (KA/KA). Es wurde eine sehr hohe Human-Vλ-Nutzung in den L2/L2; KA/KA)-Mäusen festgestellt, beinahe unter Ausschluss der Maus-Vλ-Nutzung.
  • 9B: Milz-B-Zellkompartiment-Analyse. Diese Figur zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse an Milz-B-Zellen aus transgenen L2/L2; KA/KA-Mäusen (L2-Homozygote; homozygot für humane Lambda-Gensegmentinsertion in endogene Lambda-Loci; wobei endogene Kappa-Kette-Expression inaktiviert worden ist), verglichen mit Milz-B-Zellen aus Mäusen, die nur Maus-Antikörper exprimieren (KA/KA-Mäuse). Die Ergebnisse zeigen, dass die Milz-B-Zellkompartimente in den Mäusen der Erfindung normal sind (d. h., äquivalent zu den Kompartimenten von Mäusen, die nur Maus-Antikörperketten exprimieren).
  • 10: B-Zellentwicklung und Marker in den Knochenmark- und Milz-Kompartimenten.
  • 11A: Milz-B-Zellkompartiment-Analyse. Diese Figur zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse an Milz-B-Zellen aus transgenen S1F/HA, KA/+-Mäusen der Erfindung, die Schwerkette-Variabelregionen exprimieren, welche vollständig human sind (wobei endogene Schwerkette-Expression durch Inversion inaktiviert worden ist), verglichen mit Milz-B-Zellen aus Mäusen, die nur Maus-Antikörper exprimieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Milz-B-Zellkompartimente in den Mäusen der Erfindung normal sind (d. h., äquivalent zu den Kompartimenten von Mäusen, die nur Maus-Antikörper-Ketten exprimieren).
  • S1F/HA, +/KA = (i)S1F – erstes endogenes Schwerkette-Allel hat eine Human-Schwerkettelocus-DNA-Insertion, endogene Maus-VDJ-Region wurde inaktiviert durch Inversion und Verschieben nach stromaufwärts auf dem Chromosom; (ii) HA – zweites endogenes Schwerkette-Allel wurde inaktiviert (durch Insertion einer endogenen unterbrechenden Sequenz); (iii) + – erstes endogene Kappa-Allel ist ein Wildtyp-kappa-Allel; und (iv) KA – das zweite endogene Kappa-Allel wurde inaktiviert (durch Insertion einer endogenen unterbrechenden Sequenz). Dieses Arrangement codiert ausschließlich für Schwerketten aus dem ersten endogenen Schwerkette-Allel.
  • 11B: Milz-B-Zellkompartiment-Analyse. Diese Figur zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse an Milz-B-Zellen aus transgenen S1F/HA, K2/KA-Mäusen der Erfindung, die Schwerkette-Variabelregionen, welche vollständig human sind (wobei endogene Schwerkette-Expression durch Inversion inaktiviert worden ist) und humane Kappa-Kette-Variabelregionen exprimieren, verglichen mit Milz-B-Zellen aus +/HA, K2/KA-Mäusen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Milz-B-Zell-Kompartimente in den Mäusen der Erfindung normal sind.
  • S1F/HA, K2/KA = (i)K2 – das erste endogene Kappa-Allel hat zwei Kappa-Kette-Locus-DNA-Insertionen zwischen dem am meisten 3' gelegenen endogenen Jκ und dem Maus-Cκ, unter Bereitstellung einer Insertion von 14 humanen Vκ und Jκ1–Jκ5; und (ii) KA – das zweite endogene Kappa-Allel wurde inaktiviert (durch Insertion einer endogenen unterbrechenden Sequenz). Dieses Arrangement codiert ausschließlich für Schwerketten, umfassend humane Variabelregionen, und im wesentlichen Kappa-Leichtketten aus dem ersten endogenen Kappa-Allel.
  • +/HA, K2/KA – dieses Arrangement codiert für Maus-Schwerketten und humane Kappa-Ketten.
  • 12A: Knochenmark-B-Progenitor-Kompartiment-Analyse. Diese Figur zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse von Knochenmark(BM)-B-Zellen aus transgenen S1F/HA, KA/+ Mäusen der Erfindung, die Schwerkette-Variabelregionen exprimieren, welche vollständig human sind (wobei endogene Schwerkette-Expression durch Inversion inaktiviert worden ist), verglichen mit BM-B-Zellen aus Mäusen, die nur Maus-Antikörper exprimieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die BM B-Zellkompartimente in den Mäusen der Erfindung normal sind (d. h., äquivalent zu den Kompartimenten von Mäusen, die nur Maus-Antikörper-Ketten exprimieren).
  • 12B: Knochenmark-B-Progenitor-Kompartiment-Analyse. Diese Figur zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse von Knochenmark(BM)-B-Zellen aus transgenen S1F/HA, K2/KA-Mäusen der Erfindung, die Schwerkette-Variabelregionen, welche vollständig human sind (wobei endogene Schwerkette-Expression durch Inversion inaktiviert worden ist) und humane Kappa-Kette-Variabelregionen exprimieren, verglichen mit BM B-Zellen aus +/HA, K2/KA-Mäusen. Die Ergebnisse zeigen, dass die BM B-Zell-Kompartimente in den Mäusen der Erfindung normal sind.
  • 13: zeigt die Ig-Quantifizierung hinsichtlich Subtyp und Gesamt-Ig in verschiedenen Mäusen:
    • S1F/HA, KA/+ = (i)S1F – erstes endogenes Schwerkette-Allel hat eine humane Schwerkettelocus-DNA-Insertion, endogene Maus-VDJ-Region wurde inaktiviert durch Inversion und Verscheiben nach stromaufwärts auf dem Chromosom; (ii) HA – zweites endogenes Schwerkette-Allel wurde inaktiviert (durch Insertion einer endogenen unterbrechenden Sequenz); (iii) KA – das erste endogene Kappa-Allel wurde inaktiviert (durch Insertion einer endogenen unterbrechenden Sequenz); und (iv)+ – zweites endogenes Kappa-Allel ist ein Wildtyp-Kappa-Allel. Dieses Arrangement codiert ausschließlich für Schwerketten aus dem ersten endogenen Schwerkette-Allel.
    • S1F/HA, K2/KA = (i)K2 – das erste endogene Kappa-Allel hat zwei Kappa-Kette-Locus-DNA-Insertionen zwischen dem am meisten 3' gelegenen endogenen Jκ und dem Maus-Cκ, unter Bereitstellung einer Insertion von 14 humanen Vκ und Jκ1–Jκ5; und (ii) KA – das zweite endogene Kappa-Allel wurde inaktiviert (durch Insertion einer endogenen unterbrechenden Sequenz). Dieses Arrangement codiert ausschließlich für Schwerketten, umfassend humane Variabelregionen, und im wesentlichen Kappa-Leichtketten aus dem ersten endogenen Kappa-Allel.
    • +/HA, K2/+ – dieses Arrangement codiert für Maus-Schwerketten und sowohl Maus- als auch Human-Kappaketten.
    • +/HA, +/KA – dieses Arrangement codiert für Maus-Schwer- und Kappaketten.
  • In dieser Figur ist ”Summe Ig” die Summe von IgG- und IgM-Isotypen.
  • 14: zeigt die Ig-Quantifizierung hinsichtlich Subtyp und Gesamt-Ig in verschiedenen Mäusen:
    • S1F/HA, K2/KA(n = 15) und 12 Mäuse, die nur Maus-Antikörperketten (+/HA, +/KA (n = 6) exprimierten, und Wildtypmäuse (WT; n = 6)).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Es versteht sich, dass bestimmte hierin beschriebene Ausführungsformen lediglich zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkungen der Erfindung dargestellt sind. Die Hauptmerkmale dieser Erfindung können in verschiedenen Ausführungsformen eingesetzt werden, ohne vom Schutzbereich der Erfindung abzuweichen. Fachleute auf dem Gebiet werden zahlreiche Äquivalente zu den hierin beschriebenen speziellen Verfahrensweisen erkennen oder fähig sein, diese unter Verwendung von nicht mehr als routinemäßigen Untersuchungen zu ermitteln. Solche Äquivalente sind als innerhalb des Schutzbereichs dieser Erfindung liegend zu betrachten und sind durch die Ansprüche abgedeckt.
  • Die Verwendung des Wortes ”ein” oder ”eine”, wenn in Verbindung mit dem Begriff ”umfassend” in den Ansprüchen und/oder der Beschreibung verwendet, kann ”eins” bedeuten, aber sie ist ebenfalls konsistent mit der Bedeutung von ”eine oder mehrere”, ”wenigstens einer” und ”eines oder mehr als eins”. Der Gebrauch des Begriffs ”oder” in den Ansprüchen wird verwendet, um ”und/oder” zu bedeuten, sofern er sich nicht ausdrücklich nur auf Alternativen bezieht, oder die Alternativen sich gegenseitig ausschließen, obwohl die Offenbarung eine Definition unterstützt, die sich auf alleinige Alternativen sowie ”und/oder” bezieht. Durchgängig wird in dieser Anmeldung der Begriff ”etwa” verwendet, um anzuzeigen, dass ein Wert die inhärente Fehler-Variation für das Merkmal einschließt, wobei das Verfahren verwendet wird um den Wert oder die Variation, die unter den Studiensubjekten existiert, zu bestimmen.
  • Wie in dieser Beschreibung und Ansprüch(en) verwendet, sind die Worte ”umfassend” (und jedwede Form von umfassend, wie ”umfassen” und ”umfasst”), ”aufweisend” (und jedwede Form von aufweisend, wie ”aufweisen” und ”hat”), ”einschließlich” (und jedwede Form von einschließlich, wie ”beinhaltet” und ”einschließen”) oder ”enthaltend” (und jedwede Form von enthaltend, wie ”enthält” und ”enthalten”) inklusive oder offenendig und schließen zusätzliche, nicht aufgeführte Elemente oder Verfahrensschritte nicht aus.
  • Der Begriff ”oder Kombinationen davon”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf alle Permutationen und Kombinationen der aufgeführten Elemente, die dem Begriff vorangehen. Zum Beispiel soll ”A, B, C oder Kombinationen davon” wenigstens eines einschließen von: A, B, C, AB, AC, BC oder ABC, und sofern die Reihenfolge in einem besonderen Kontext von Bedeutung ist, auch BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC oder CAB. Mit diesem Beispiel fortfahrend, sind Kombinationen ausdrücklich eingeschlossen, die Wiederholungen von einem oder mehreren Element oder Begriff beinhalten, wie BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB und so fort. Der Fachmann wird verstehen, dass typischerweise keine Einschränkung hinsichtlich der Anzahl der Elemente oder Begriffe in jeglicher Kombination besteht, wenn es nicht aus dem Zusammenhang anderweitig ersichtlich ist.
  • Als eine Quelle für Antikörpergensegment-Sequenzen wird der Fachmann auch die folgenden verfügbaren Datenbanken und Resourcen (einschließlich Aktualisierungen davon) kennen, deren Inhalte hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind:
    • The Kabat Database (G. Johnson und T. T. Wu, 2002; World Wide Web (www) kabatdatabase.com). Erstellt durch E. A. Kabat und T. T. Wu im Jahre 1966, veröffentlicht die Kabat Datenbank alignierte Sequenzen von Antikörpern, T-Zell-Rezeptoren, Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Klasse I- und II-Molekülen und anderen Proteinen von immunologischem Interesse. Eine duchsuchbare Benutzerschnittstelle wird durch das Seghuntll-Tool bereitgestellt, und eine Auswahl an Dienstprogrammen steht für Sequenzalignment, Sequenzuntergruppen-Klassifizierung und die Erstellung von Variabilitäts-Plots zur Verfügung. Siehe auch Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K. und Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Ausg., NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD, das hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, insbesondere in Bezug auf humane Gensegmente zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
    • KabatMan (A. C. R. Martin, 2002; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs/simkab.html). Dies ist eine Internet-Schnittstelle zum Durchführen einfacher Suchen in der Kabat-Sequenzdatenbank.
    • IMGT (das Internationale ImMunoGeneTics Information System®; M.-P. Lefranc, 2002; World Wide Web (www) imgt.cines.fr). IMGT ist ein integriertes Informationssystem, das auf Antikörper, T-Zell-Rezeptoren und MHC-Moleküle aus allen Wirbeltierspezies spezialisiert ist. Es bietet ein gemeinsames Portal zu standardisierten Daten, welche Nukleotid- und Proteinsequenzen, Oligonucleotidprimer, Genkarten, genetische Polymorphismen, Spezifitäten und zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) Strukturen einschließen. IMGT schließt drei Sequenzdatenbanken (IMGT/LIGM-DB, IMGT/MHC-DB, IMGT/PRIMERDB), eine Genomdatenbank (IMGT/GENE-DB), eine 3D-Strukturdatenbank (IMGT/3Dstructure-DB) und eine Palette von Netzresourcen (”IMGT Marie-Paule page”) und interaktiven Tools ein.
    • V-BASE (I. M. Tomlinson, 2002; World Wide Web (www) mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase). V-BASE ist ein umfangreiches Verzeichnis von allen humanen Antikörper-Keimbahn-Variabelregion-Sequenzen, zusammengestellt aus mehr als tausend veröffentlichten Sequenzen. Es beinhaltet eine Version der Alignmentsoftware DNAPLOT (entwickelt von Hans-Helmar Althaus und Werner Müller), welche die Zuordnung von rearrangierten Antikörper-V-Genen zu ihren ähnlichsten Keimbahngensegmenten erlaubt.
    • Antibodies-Structure and Sequence (A. C. R. Martin, 2002; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs). Diese Webseite fasst nützliche Informationen über Antikörperstruktur und -sequenz zusammen. Sie bietet eine Suchschnittstelle zu den Kabat-Antikörpersequenzdaten, generelle Information zu Antikörpern, Kristallstrukturen und Sprungverweise zu anderen Antikörper-bezogenen Informationen. Sie liefert auch eine automatisierte Zusammenfassung von allen Antikörperstrukturen, die in der Protein-Databank (PDB) hinterlegt sind. Von besonderem Interesse ist eine gründliche Beschreibung und der Vergleich der diversen Nummerierungsschemata für Antikörper-Variabelregionen.
    • AAAAA (A Ho's Amazing Atlas of Antibody Anatomy; A. Honegger, 2001; World Wide Web (www) unizh.ch/~antibody). Diese Resource schließt Werkzeuge für Strukturanalyse, Modellerstellung und Engineering ein. Sie wendet ein Vereinheitlichungs-Schema zum umfassenden Strukturalignment von Antikörper- und T-Zell-Rezeptor-Sequenzen an und beinhaltet Excel-Makros zur Antikörperanalyse und grafischen Darstellung.
    • WAM (Web Antibody Modeling; N. Whitelegg und A. R. Rees, 2001; World Wide Web (www) antibody.bath.ac.uk). Bereitgehalten seitens des ”Centre for Protein Analysis and Design” an der University von Bath, Großbritannien. Auf Basis des AbM-Pakets (früher vermarktet von Oxford Molecular) zum Konstruieren von 3D-Modellen von Antikörper-Fv-Sequenzen unter Verwendung einer Kombination von etablierten theoretischen Methoden, beinhaltet diese Webseite auch die neuesten Antikörper-Strukturinformationen.
    • Mike's Immunoglobulin Structure/Function Page (M. R. Clark, 2001; World Wide Web (www) path.cam.ac.uk/mrc7/mikeimages.html) Diese Seiten liefern Lehrmaterialien über Immunglobulin-Struktur und -Funktion und sind durch zahlreiche Farbbilder, Modelle und Animationen illustriert. Zusätzliche Information kann erhalten werden zu Antikörperhumanisierung und zum ”Mike Clark's Therapeutic Antibody Human Homology Project”, das das Korrelieren von klinischer Wirksamkeit und Anti-Immunglobulin-Antwortreaktionen mit Variabelregion-Sequenzen therapeutischer Antikörper zum Ziel hat.
    • The Antibody Resource Page (The Antibody Resource Page, 2000; World Wide Web (www) antibodyresource.com). Diese Webseite beschreibt sich selbst als den ”kompletten Führer für Antikörper-Forschung und Hersteller”. Links zu Aminosäure-Sequenzierungs-Tools, Nukleotid-Antikörpersequenzierungs-Tools und Hybridom/Zellkultur-Datenbanken sind bereitgestellt.
    • Humanization bY Design (J. Saldanha, 2000; World Wide Web (www) people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s). Diese Resource liefert einen Überblick über Antikörper-Humanisierungstechnologie. Das nützlichste Feature ist eine durchsuchbare Datenbank (nach Sequenz und Volltext) von mehr als 40 veröffentlichten humanisierten Antikörpern, einschließlich Informationen über Design-Probleme, Rahmengerüstwahl, Rahmengerüst-Mutationen und Bindungsaffinität der humanisierten Konstrukte.
    • Siehe auch Antibody Engineering Methods and Protocols, Hrsg. Benny K C Lo, Methods in Molecular BiologyTM, Human Press. Auch im World Wide Web (www) blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody--engineeringmethods-and-protocols.pdf
  • Jeglicher Teil dieser Offenbarung kann in Kombination mit jedwedem anderen Teil der Offenbarung aufgefasst werden, sofern nichts anderes aus dem Kontext hervorgeht.
  • Alle Zusammensetzungen und/oder Verfahren, die hierin offenbart und beansprucht werden, können angesichts der vorliegenden Offenbarung ohne übermäßiges Experimentieren hergestellt und ausgeführt werden. Wenngleich die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung in Hinsicht auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurden, wird es dem Fachmann offensichtlich sein, dass Variationen auf die Zusammensetzungen und/oder Verfahren sowie in den Schritten oder in der Abfolge von Schritten des hierin beschriebenen Verfahrens angewendet werden können, ohne vom Konzept, Wesen und Schutzbereich der Erfindung abzuweichen. Alle solchen ähnlichen Substitute und Modifikationen, die Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sind, gelten als innerhalb des Wesens, Schutzbereichs und Konzepts der Erfindung liegend, wie durch die beigefügten Ansprüche definiert.
  • Die folgenden Beispiele sind dargelegt, um dem Durchschnittsfachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung zu geben, wie man die Erfindung bewerkstelligt und anwendet, und sind nicht zur Einschränkung des Schutzumfangs von dem, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen, beabsichtigt.
  • Beispiele
  • Beispiel 1:
  • Hohe Human-Lambda-Variabelregion-Expression in transgenen Mäusen, die Human-Lambda-Gensegmente inseriert in endogenen Kappa-Locus umfassen
  • Die Insertion von humanen Lambda-Gensegmenten aus einem 1. IGL-BAC in den IGK-Locus von Maus-AB2.1 ES-Zellen (Baylor College of Medicine) wurde durchgeführt zum Erzeugen eines chimären Leichtkette-Allels, das als das P1-Allel bezeichnet wird (1). Die inserierte humane Sequenz entspricht der Sequenz von humanem Chromosom 22 von der Position 23217291 bis zur Position 23327884 und umfasst funktionelle Lambda-Gensegmente Vλ3-1, Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 und Jλ7-Cλ7 (die Allele der Tabelle 13). Die Insertion erfolgte zwischen Positionen 70674755 und 706747756 auf dem Mauschromosom 6, was stromaufwärts von der Maus-Cκ-Region und vom 3'Eκ (d. h. innerhalb 100 kb von dem endogenen Leichtkette-Enhancer) ist, wie es in der 1 gezeigt wird. Die Maus-Vκ- und -Jκ-Gensegmente wurden im chimären Locus, unmittelbar stromaufwärts der inserierten Human-Lambda-DNA, beibehalten. Die Maus-Lambda-Loci wurden intakt gelassen. Mäuse, die homozygot für den chimären P1-Locus waren, wurden aus den ES Zellen mithilfe standardmäßiger Prozeduren erzeugt.
  • Ein zweiter Typ von Mäusen wurde produziert (P2-Mäuse), in denen mehr humane funktionelle Vλ-Gensegmente stromaufwärts (5') des humanen Vλ3-1 inseriert wurden mittels der sequentiellen Insertion der BAC1-Human-DNA und dann der BAC2-DNA, wodurch man das P2-Allel erzeugte (die Allele von Tabelle 14). Die inserierte humane Sequenz aus BAC2 entspricht der Sequenz von humanem Chromosom 22 von Position 23064876 bis Position 23217287 und umfasst funktionelle Lambda-Gensegmente Vλ2-18, Vλ3-16, V2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8 und Vλ4-3. Mäuse, die homozygot für den chimären P2-Locus waren, wurden aus den ES-Zellen mithilfe standardmäßiger Prozeduren erzeugt.
  • Die FACS-Analyse von Milz-B-Zellen aus den P1- und P2-Homozygoten wurde durchgeführt, um die Lambda- versus Kappa-Expression und Human-Lambda- versus Maus-Lambda-Expression in den transgenen Mäusen zu beurteilen.
  • Standardmäßige 5'-RACE wurde durchgeführt, um RNA-Transkripte aus den Leichtkette-Loci in P2-Homozygoten zu analysieren.
  • Leichtkette-Expression- & FACS-Analyse
  • Zum Erhalten einer Einzelzellsuspension aus Milz, wurde die Milz vorsichtig durch ein 30-μm-Zellsieb geleitet. Einzelzellen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die mit 3% hitzeinaktiviertem Fötalkälberserum (FCS) ergänzt war, resuspendiert.
  • Die folgenden Antikörper wurden zur Färbung verwendet:
    Ratte-Anti-Maus-lambda (mCλ) Phycoerythrin(PE)-Antikörper (Southern Biotech), Ratte-Anti-Maus-Kappa (mCκ) (BD Pharmingen, Klon 187.1)-Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Anti-Human-Lambda (hCλ) (eBioscience, Klon 1-155-2)-Phycoerythrin (PE), Anti-B220/CD45R(eBioscience, Klon RA3-6B2)-Allophycocyanin (APC). NB: Bei Leichtketten, die humane Cλ tragen, wurde erwartet, dass sie Variabelregionen aufweisen, die aus dem Rearrangement von inserierten Human-Vλ und Human-Jλ abgeleitet sind. Von Leichtketten, die Maus-Cλ tragen, wurde erwartet, Variabelregionen aufzuweisen, die aus dem Rearrangement von Maus-Vλ und -Jλ aus den endogenen Lambda-Loci abgeleitet sind.
  • 5 × 106 Zellen wurden den einzelnen Röhrchen zugesetzt, abzentrifugiert, um überschüssiges Fluid zu entfernen, und in frischen 100 μl von PBS + 3% FCS resuspendiert. Zu jedem einzelnen Röhrchen wurden die folgenden Antikörper zugesetzt:
    Zur Färbung von mλ versus mκ, wurde 1 μl von jedem Antikörper zugesetzt, zusätzlich zu 1 μl B220/CD45R Antikörper. Zum Nachweis von B-Zellen, die humane Lambda-Leichtkette exprimieren, wurde der mλ-Antikörper substituiert mit hλ-Antikörper. Zellen wurden in der Dunkelheit bei 6°C während 15 Minuten inkubiert, gefolgt von mehreren Waschungen mit frischem PBS + 3% FCS zum Entfernen von ungebundenem Antikörper. Zellen wurden unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten-Zellsortierung(FACS)-Analysators von Miltenyi Biotech analysiert.
  • Lebende Milzzellen wurden unter Verwendung von Seitenstreuung (SSC) und Vorwärtsstreuung (FSC) Gatter-sortiert. Innerhalb der SSC- und FSC-sortierten Population, wurde eine Subpopulation von B220/CD45R (Maus B-Zellen) mithilfe des APO-Fluorochroms detektiert. Einzelpositive B220/CD45R-Population wurde weiter bis zu einer Zelle unterteilt, welche entweder mλ- oder hλ-PE-Fluorochrom in Konjunktion mit mκ-FITC-Fluorochrom trägt. Der Prozentsatz von jeder Population wurde unter Verwendung eines Gating-Systems berechnet.
  • Überraschenderweise zeigte die FACS-Analyse von Milz-B-Zellen aus den P1-Homozygoten keine detektierbare Maus-Cκ-Expression (2), was darauf hinweist, dass die Insertion der Human-Lambda-Locus-DNA aus BAC1 die Expression der endogenen IGK-Kette unterbricht.
  • Die starke Expression von endogenem Cλ und schwache Expression von Human-Cλ in den Milz-B-Zellen, gruppiert durch FACS-Analyse (Maus-Cλ:Human-Cλ = 65:32) bei diesen Mäusen legt nahe, dass inserierte humane IGL-Sequenz, obwohl sie die IGK-Aktivität unterbricht, nicht vollkommen mit den endogenen IGL-Genen kompetieren kann.
  • Die FACS-Analyse zeigte wiederum überraschend keine detektierbare Maus-Cκ-Expression in den P2-Homozygoten (3A & B). Jedoch prädominiert das humane Cλ erheblich in exprimierten B-Zellen, gruppiert als Maus- oder Human-Cλ, nach der FACS-Analyse (Maus-Cλ:Human-Cλ = 15:80, entsprechend einem Verhältnis von 15 Maus-Lambda-Variabelregionen:80 Human-Lambda-Variabelregionen, d. h. 84% Hhuman-Lambda-Variabelregionen in Bezug auf die gruppierten B-Zellen – was 80% der gesamten B-Zellen entspricht) aus den P2-Homozygoten. Wenngleich es nicht gewünscht wird, durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, schlagen wir vor, dass die inserierte humane Lambda-Locus-Sequenz aus dem 2. BAC einige Vorteile beim Kompetieren mit Endogen-Lambda-Gensegment-Rearrangement oder -Expression bietet.
  • Wir analysierten die Nutzung von Human-Vλ und -Jλ in den P2-Homozygoten. Siehe 4, welche die Human-Vλ-Nutzung in P2-Homozygoten darstellt. Die beobachtete Nutzung war ähnlich zu jener, die in Menschen festzustellen ist (wie gemäß J Mol Biol. 1997 Apr 25; 268(1): 69-77; ”The creation of diversity in the humane immunoglobulin V (lambda) repertoire”; Ignatovich O et al). Ferner war die Human-Jλ-Nutzung ähnlich zu jener, die in Menschen festzustellen ist (5). Die Analyse der Vλ- versus Vκ-Nutzung von Human-Cλ-Transkripten durch Sequenzieren von nicht-vorgeneigten 5'-RACE (Rasche Amplifikation von cDNA-Enden) PCR-Klonen zeigte, dass unter 278 Klonsequenzen nur eine Vκ für das Rearrangement an Jλ (Human-Jλ) nutzte, und alle anderen (277 Klone) Human-Vλ nutzten (6 & 7; Vλ2-5 wurde auf der RNA-Transkript-Ebene detektiert, aber dies ist ein Pseudogen, das auf der Proteinebene üblicherweise nicht bei der Nutzung herausgelesen bzw. erfasst wird). Wenngleich es nicht gewünscht wird, durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, schlagen wir vor, dass die beibehaltenen Maus-Vκ-Gensegmente im wesentlichen nicht effizient mit den inserierten humanen Jλ-Gensegmenten rearrangieren können, weil sie den gleichen Typ von RSSs (Rekombinationssignalsequenzen; siehe nachstehende Erklärung) aufweisen und für das Rearrangieren inkompatibel sind (8). Dieses Resultat zeigt zudem, dass die Inaktivierung der endogenen IGK-Aktivität und vorwiegende Expression der inserierten Human-Lambda-Sequenz ohne weitere Modifikation des IGK-Locus erzielt werden kann, wobei zum Beispiel Deletion oder Inversion von endogenen Kappa-Loci-Gensegmenten nicht notwendig ist, was die Erzeugung von nützlichen transgenen Mäusen erheblich vereinfacht, die Leichtketten exprimieren, welche humane Lambda-Variabelregionen (d. h., Variabelregionen, produziert durch Rekombination von humanen Vλ- und Jλ-Gensegmenten) tragen.
  • Das Arrangement von Rekombinations-Signal-Sequenzen (RSSs), die V(D)J-Rekombination in vivo vermitteln, ist z. B. in Cell. 2002 Apr; 109 Suppl: S45-55; ”The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination”; Bassing CH, Swat W, Alt FW (deren Offenbarung hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist) erläutert. Zwei RSS-Element-Typen sind identifiziert worden: eine ”Einzel-Umkehrschleife”- bzw. ”Ein-Turn”-RSS (12-RSS) und eine ”Zwei-Turn”-RSS (23-RSS). Bei der natürlichen VJ-Rekombination im Lambda-Leichtkettelocus wird Rekombination zwischen einer Zwei-Turn-RSS, die 3' von einem V-Lambda liegt, und einer Ein-Turn-RSS, die 5' von einem J-lambda liegt, wobei die RSSs in entgegengesetzter Orientierung sind, bewirkt. Bei der natürlichen VJ-Rekombination im Kappa-Leichtkettelocus wird Rekombination zwischen einer Ein-Turn-RSS, die 3' von einem V-Kappa liegt, und einer Zwei-Turn-RSS, die 5' von einem J-kappa liegt, wobei die RSSs in entgegengesetzter Orientierung sind, bewirkt. Somit ist im Allgemeinen eine Zwei-Turn-RSS mit einer Ein-Turn-RSS in der entgegengesetzten Orientierung kompatibel.
  • Damit haben die Erfinder verdeutlicht, wie man (i) endogene Kappa-Kette-Expression durch Insertion von Human-Lambda-Gensegmenten in den Kappa-Locus inaktiviert; und (ii) wie man sehr hohe Human-Lambda-Variabelregion-Expression (womit brauchbare Leichtkette-Repertoires zur Selektion gegen Zielantigen bereitgestellt werden) – selbst in Gegenwart von endogenen Lambda- und Kappa-V-Gensegmenten, erreicht. So zeigten die Erfinder, wie man V-Gensegment-Kompetition, und somit endogene Leichtkette-Expression, signifikant beseitigt (lambda) oder völlig beseitigt (kappa), und zwar durch die Insertion von wenigstens den funktionellen Human-Lambda-Gensegmenten, die von den BACs 1 und 2 beinhaltet sind. In diesem Beispiel wurde überraschend ein sehr hoher Spiegel von Human-Lambda-Variabelregion-Expression erreicht (84% der gesamten Lambda-Ketten und gesamten Leichtketten, wie oben erklärt).
  • Beispiel 2:
  • Hohe Human-Lambda-Variabelregion-Expression in transgenen Mäusen, die Human-Lambda-Gensegmente inseriert in endogenen Lambda-Locus umfassen
  • Die Insertion von humanen Lambda-Gensegmenten aus den 1. und 2. IGL-BACs in den Lambda-Locus von Maus AB2.1-ES-Zellen (Baylor College of Medicine) wurde durchgeführt zum Erzeugen eines Lambda-Leichtkette-Allels, das als das L2-Allel bezeichnet wird (1). Die inserierte humane Sequenz entspricht der Sequenz von humanem Chromosom 22 von Position 23064876 bis Position 23327884 und umfasst funktionelle Lambda-Gensegmente Vλ2-18, Vλ3-16, V2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 und Jλ7-Cλ7. Die Insertion erfolgte zwischen den Positionen 19047551 und 19047556 auf dem Mauschromosom 16, was stromaufwärts von der Maus-Cλ-Region und zwischen Eλ4-10 und Eλ3-1 ist (d. h. innerhalb 100 kb von den endogenen Leichtkette-Enhancern), wie in 1 dargestellt. Die Maus-Vλ- und -Jλ-Gensegmente wurden im Locus, unmittelbar stromaufwärts von der inserierten humanen Lambda-DNA, beibehalten. Die Maus-Kappa-Loci wurden inaktiviert, um Kappa-Kette-Expression zu verhindern. Mäuse, die homozygot für den L2-Locus waren, wurden aus den ES Zellen mithilfe standardmäßiger Prozeduren erzeugt.
  • Unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens zu jenem von Beispiel 1 wurde eine FACS-Analyse von Milz-B-Zellen aus den L2-Homozygoten durchgeführt, um Lambda- versus Kappa-Expression und Human-Lambda- versus Maus-Lambda-Expression in den transgenen Mäusen zu beurteilen.
  • Leichtkette-Expression & FACS-Analyse
  • Die FACS-Analyse von Milz-B-Zellen in L2-Homozygoten unter dem IGK-Knockout-Hintergrund (in welchen Vκ- und Jκ-Gensegmente beibehalten wurden) zeigte überraschend, dass die Expression von humanem Cλ erheblich in B-Zellen prädominiert, eingruppiert als Maus- oder Human-Cλ nach der FACS-Analyse (Maus-Cλ:Human-Cλ = 5:93, entsprechend einem Verhältnis von 5 Maus-Lambda-Variabelregionen:93 Human-Lambda-Variabelregionen, d. h. 95% Human-Lambda-Variabelregionen in Bezug auf die gruppierten B-Zellen – was 93% der gesamten B-Zellen entspricht) (9A), was verdeulicht, dass inserierte humane IGλ-Gensegmente innerhalb des endogenen IGλ-Locus das bzw. die endogene IGλ-Gensegment-Rearrangement oder -Expression auskompetieren können.
  • Daher haben die Erfinder verdeutlicht, wie man sehr hohe Human-Lambda-Variabelregion-Expression (womit brauchbare Leichtkette-Repertoires zur Selektion gegen Zielantigen bereitgestellt werden) – selbst in Gegenwart von endogenen Lambda- und Kappa-V-Gensegmenten, erreicht. So haben die Erfinder gezeigt, wie man endogene Lambda-V-Gensegment-Kompetition und somit endogene Lambda-Leichtkette-Expression signifikant beseitigt durch die Insertion von wenigstens den funktionellen humanen Lambda-Gensegmenten, beinhaltet von den BACs 1 und 2. In diesem Beispiel wurde überraschend ein sehr hoher Spiegel von Human-Lambda-Variabelregion-Expression erreicht (95% der gesamten Lambda-Ketten und gesamten Leichtketten, wie oben erklärt).
  • Diese Daten weisen darauf hin, dass Mäuse, die entweder P-(Beispiel 1) oder L (Beispiel 2)-Allele tragen, produziert durch zielgerichtete Insertion der von BAC1 und BAC2 bereitgestellten funktionellen Gensegmente, hinsichtlich Rearrangement und Expression in reifen B-Zellen funktionell sein können. Diese zwei Typen von Allelen sind sehr nützlich zur Bereitstellung transgener Mäuse, die humane Ig-Lambda-Ketten für therapeutische Antikörper-Ermittlung und als Forschungs-Werkzeuge produzieren.
  • Transgene Mäuse der Erfindung, die Human-Lambda-Variabelregionen exprimieren, entwickeln normale Milz-Kompartimente
  • In der Milz werden B-Zellen als unreif (T1 und T2) und reif (M) charakterisiert, basierend auf den Niveaus von Zelloberflächenmarkern, IgM und IgD. T1-Zellen besitzen hohes IgM und niedriges IgD. T2-Zellen besitzen mittlere Niveaus von beiden von diesen. M-Zellen besitzen niedriges IgM aber hohes IgD (10). Siehe auch J Exp Med. 1999 Jul 5; 190(1): 75-89; ”B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals”; Loder F et al.
  • Unter Verwendung ähnlicher Verfahren zu jenen, die nachstehend im Beispiel 3 beschrieben sind, wurden Milz-B-Zellen aus den Tieren hinsichtlich IgD- und IgM-Expression mithilfe von FACS bewertet. Wir verglichen Kontrollmäuse KA/KA (in denen endogene Kappa-Kette-Expression, aber nicht endogene Lambda-Kette-Expression, inaktiviert wurde) mit L2/L2; KA/KA-Mäusen (L2-Homozyote). Die L2-Homozygoten zeigten überraschend zu den Kontrollmäusen vergleichbare Milz-B-Zellkompartimente (9B).
  • Beispiel 3:
  • Beurteilen von B-Zell- und Ig-Entwicklung in transgenen Mäusen der Erfindung
  • Wir beobachteten normale Ig-Subtypexpression & B-Zellentwicklung in transgenen Mäusen der Erfindung, die Antikörper mit humanen Schwerkette-Variabelregionen im wesentlichen in Abwesenheit von endogener Schwer- und Kappa-Kette-Expression exprimierten.
  • Unter Verwendung von ES-Zellen und den genomischen RMCE-Manipulations-Verfahren, die oben beschrieben sind, wurden Mäuse mit Kombinationen der folgenden Ig-Locus-Allele konstruiert:- S1F/HA, +/KA = (i)S1F – erstes endogene Schwerkette-Allel hat eine humane Schwerkettelocus-DNA-Insertion, endogene Maus-VDJ-Region wurde inaktiviert durch Inversion und Verschieben nach stromaufwärts auf dem Chromosom (siehe die oben stehende Beschreibung, wobei dieses Allel als S1inv1 bezeichnet wird); (ii) HA–zweites endogenes Schwerkette-Allel wurde inaktiviert (durch Insertion einer endogenen unterbrechenden Sequenz); (iii)+ – erstes endogenes Kappa-Allel ist ein Wildtyp-Kappa-Allel und (iv) KA – das zweite endogene Kappa-Allel wurde inaktiviert (durch Insertion einer endogenen unterbrechenden Sequenz). Dieses Arrangement codiert ausschließlich für Schwerketten aus dem ersten endogenen Schwerkette-Allel.
    • S1F/HA, K2/KA = (i)K2 – das erste endogene Kappa-Allel hat zwei Kappa-Kette-Locus-DNA-Insertionen zwischen dem am meisten 3' gelegenen endogenen Jκ und dem Maus-Cκ, unter Bereitstellung einer Insertion von 14 humanen Vκ und Jκ1–Jκ5; und (ii) KA – das zweite endogenen Kappa-Allel wurde (durch Insertion einer endogenen unterbrechenden Sequenz) inaktiviert. Dieses Arrangement codiert ausschließlich für Schwerketten, umfassend humane Variabelregionen und im wesentlichen Kappa-Leichtketten aus dem ersten endogenen Kappa-Allel.
    • +/HA, K2/KA – Dieses Arrangement codiert für Maus-Schwerketten und Human-Kappa-Ketten.
    • +/HA, +/KA–Dieses Arrangement codiert für Maus-Schwer- und -Kappa-Ketten–die Mäuse produzieren nur Maus-Schwer- und -Leichtketten.
  • In Knochenmark werden B-Progenitor-Populationen basierend auf ihren Oberflächenmarkern, B220 und CD43, charakterisiert. PräProB-Zellen tragen Keimbahn-IGH- und -IGK/L-Konfiguration und besitzen wenig B220 und viel CD43 auf ihrer Zelloberfläche. ProB-Zellen beginnen das Initiieren der VDJ-Rekombination im IGH-Locus und tragen mittlere Niveaus von B220 als auch CD43. PräB-Zellen tragen den rearrangierten IGH-VDJ-Locus und beginnen das Initiieren des Leichtkette-VJ-Rearrangements und besitzen hohes B220 aber niedriges CD43. In der Milz sind B-Zellen als unreif (T1 und T2) und reif (M) charakterisiert, basierend auf den Niveaus von Zelloberflächenmarkern, IgM und IgD. T1-Zellen besitzen hohes IgM und niedriges IgD. T2-Zellen besitzen mittlere Niveaus von beiden von diesen. M-Zellen besitzen niedriges IgM aber hohes IgD (10). Siehe auch J Exp Med., 1. Mai 1991; 173(5): 1213-25; ”Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow”; Hardy RR et al., und J Exp Med., 5. Juli 1999; 190(1): 75-89; ”B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals”; Loder F et al.
  • Transgene Mäuse der Erfindung entwickeln normale Milz- und BM-Kompartimente
  • (a) Analyse des Milz-Kompartiments
  • Für jede Maus wurde die Milz, zum Erhalten einer Einzelzellsuspension aus Milz, vorsichtig durch ein 30-μm-Zellsieb geleitet. Einzelzellen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die mit 3% hitzeinaktiviertem Fötalkälberserum (FCS) ergänzt war, resuspendiert. 5 × 106 Zellen wurden den einzelnen Röhrchen zugesetzt, abzentrifugiert, um überschüssiges Fluid zu entfernen, und in frischen 100 μl von PBS + 3% FCS resuspendiert. Zu jedem einzelnen Röhrchen wurden die folgenden Antikörper zugesetzt: Anti-B220/CD45R(eBioscience, Klon RA3-6B2)-Allophycocyanin (APC), Antikörper gegen IgD-Rezeptor, konjugiert mit Phycoerythrin (PE) (eBioscience, Klon 11-26) und Antikörper gegen IgM-Rezeptor, konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) (eBioscience, Klon 11/41).
  • Für die Färbung von IgM vs IgD wurden 5 × 106 Zellen für jede Färbung verwendet. In jedes Splenozyten enthaltende Gefäß wurde ein Cocktail von Antikörpern zugesetzt, bestehend aus: Anti-IgD (PE), Anti-IgM (FITC) und Anti-B220/CD45R (APC). Zellen wurden bei 6°C während 15 Minuten inkubiert, zum Entfernen von ungebundenen Antikörpern gewaschen und unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten-Zellsortierung(FACS)-Analysators von Miltenyi Biotech analysiert. B-Zellen wurden sortiert als B220HIGH IgMHIGH IgDLow (d. h., B220+ IgM+ IgD–) für die T1-Population, B220HIGH IgMHIGH IgDHIGH (B220+ IgM+ IgD+) für die T2-Population und B220HIGH IgMlow IgDHIGH(B220+ IgM– IgD+) für die M-Population. Der Prozentsatz an Zellen wurde unter Verwendung eines Gating-Systems berechnet. Wir verwendeten ”Gates” bzw. Sortiergatter zum Identifizieren und Definieren von Untergruppen von Zellpopulationen auf Graphiken im logarithmischen Maßstab. Bevor Sortiergatter zum Einsatz kommen, wird ein Einzelfärbungs-Antikörper für jedes Fluorochrom verwendet, um zwischen einer positiven (Hochintensitäts-Fluorochrom) und negativen (kein nachweisbares Intensitätsfluorchrom) Population zu unterscheiden. Gattersortierungen werden basierend auf Fluorochrom-Intensitäten in der gleichen Weise auf alle Proben angewandt. Bei den Einzelfärbungen handelte es sich um:
    IgqD-PE
    IgM-FITC
    B220-APC
  • Lebende Milzzellen wurden unter Verwendung von Seitenstreuung (SSC) und Vorwärtsstreuung (FSC) Gatter-sortiert. Innerhalb der SSC- und FSC-sortierten Population, wurde eine Subpopulation von B220/CD45R-positiven Zellen (Maus B-Zellen) mithilfe des APC-Fluorochroms detektiert. Die einzelpositive B220/CD45R-Population wurde weiter bis zu einer Zelle unterteilt, welche entweder IgM-Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) oder IgD-Fluorochrom in Konjunktion mit mκ-FITC-Fluorochrom trägt. Der Prozentsatz von jeder Population wurde unter Verwendung eines Gating-Systems berechnet. Die Milz-B-Zellkompartimente in den Mäusen der Erfindung sind normal (d. h., äquivalent zu den Kompartimenten von Mäusen, die nur Maus-Antikörperketten exprimieren).
  • (b) Knochenmark-B-Progenitor-Analyse
  • Zum Erhalten einer Einzelzellsuspension aus Knochenmark für jede Maus wurden der Femur und die Tibia mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die mit 3% hitzeinaktiviertem Fötalkälberserum (FCS) ergänzt war, ausgespült. Die Zellen wurden ferner durch ein 30-μm-Zellsieb geleitet, um Knochenstücke oder Zellklumpen zu entfernen. Zellen wurden in kaltem PBS, die mit 3% Serum ergänzt war, resuspendiert. 2 × 106 Zellen wurden in einzelne Röhrchen gegeben, zum Entfernen von überschüssigem Puffer abzentrifugiert und in frischem 100 μl PBS + 3% FCS resuspendiert. In jedes einzelne Röhrchen wurden die folgenden Antikörper zugesetzt: Anti-Leukosialin(CD43)-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (eBioscience, Klon eBioR2/60) und Anti-B220/CD45R(eBioscience, Klon RA3-6B2)-Allophycocyanin (APC). Zellen wurden in der Dunkelheit bei 6°C während 15 Minuten inkubiert, gefolgt von mehreren Waschungen mit frischem PBS +3% FCS zum Entfernen von ungebundenem Antikörper. Zellen wurden unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten-Zellsortierung (FACS)-Analysators von Miltenyi Biotech analysiert. Lebendige Knochenmark-Zellen wurden unter Verwendung von Seitenstreuung (SSC) und Vorwärtsstreuung (FSC) Gattersortiert. Wir verwendeten ”Gates” bzw. Sortiergatter zum Identifizieren und Definieren von Untergruppen von Zellpopulationen auf Graphiken bzw. Auftragungen im logarithmischen Maßstab. Bevor Sortiergatter zum Einsatz kommen, wird ein Einzelfärbungs-Antikörper für jedes Fluorochrom verwendet, um zwischen einer positiven (Hochintensitäts-Fluorochrom) und negativen (kein nachweisbares Intensitäts-Fluorchrom) Population zu unterscheiden. Gattersortierungen werden basierend auf Fluorochrom-Intensitäten in der gleichen Weise auf alle Proben angewandt. Bei den Einzel-Färbungen handelte es sich um:
    B220-APC
    CD43-FITC
  • Innerhalb der lebenden Population wurde eine Doppel-Population von B220/CD45R- und CD43-positiven Zellen als prä-B, pro-B- und prä-pro-B-Zellen identifiziert. Die Milz-B-Zellkompartimente in den Mäusen der Erfindung sind normal (d. h., äquivalent zu den Kompartimenten von Mäusen, die nur Maus-Antikörperketten exprimieren).
  • Transgene Mäuse der Erfindung entwickeln normale Ig-Expression
  • Quantifizierung von Serum-IgM und IgG
  • 96-Well-NUNC-Platten wurden zuerst mit einem Einfang-Antikörper (Ziege-Anti-Maus-Fab-Antikörper bei 1 μg/ml) über Nacht bei 4°C) beschichtet. Die IgG-Platten verwendeten Anti-Fab (M4155 Sigma), und die IgM-Platten verwendeten Anti-Fab (OBT1527 AbD Serotec). Nach drei Waschungen mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,1% v/v Tween20, wurden die Platten mit 200 μl PBS, enthaltend 1% w/v Rinderserumalbumin (BSA), während 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen, wie oben, und dann wurden 50 μl von Standards (Kontrollmaus-Isotyp-Antikörper, IgG1 (M9269 Sigma), IgG2a (M9144 Sigma), IgG2b (M8894 Sigma), IgM (M3795 Sigma) oder Serumproben, verdünnt in PBS mit 0,1% BSA, in jede Mulde zugesetzt und 1 Stunde lang bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen, wie oben, wurden 100 μl Nachweisantikörper (Ziege-Anti-Maus-Isotyp-spezifischer, Antikörper, Meerettichperoxidase-konjugiert, 1/10000 in PBS mit 0,1% Tween) Anti-Maus-IgG1 (STAR132P AbD Serotec), Anti-Maus-IgG2a (STAR133P AdD Serotec), Anti-Maus-IgG2b (STAR134P AbD Serotec) und Anti-Maus-IgM (ab97230 Abcam) in jede Mulde zugesetzt und 1 Stunde lang bei RT inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen, wie oben, und unter Verwendung von Tetramethylbenzidin-Substrat (TMB, Sigma) während 4–5 Minuten in der Dunkelheit bei RT entwickelt. Die Entwicklung wurde durch Zugeben von 50 μl/Mulde von 1 M Schwefelsäure gestoppt. Die Platten wurden mit einem Biotek Synergy HT Platten-Lesegerät bei 450 nm abgelesen.
  • Schlussfolgerung:
  • Die Inversion von endogenen VH-D-JH nach der Human-IGH-BAC-Insertion führt zur Inaktivierung des Rearrangements von endogenem VH an inserierte humane D-JH. Die Erfinder beobachteten jedoch, dass überraschend die Inaktivierung von endogener Schwerkette-Expression nicht das Verhältnis von B-Zellen im Milzkkompartiment (11) oder Knochenmark-B-Progenitor-Kompartiment (12) ändert, und die Immunglobulin-Niveaus in Serum normal sind, und die korrekten Ig-Subtypen exprimiert werden (13). Dies wurde gezeigt in Mäusen, die Human-Schwerkette-Variabelregionen mit Maus-Leichtketten exprimieren (11A und 12A), sowie in Mäusen, die sowohl Human-Schwerkette-Variabelregionen als auch Human-Leichtkette-Variabelregionen exprimieren (11B und 12B). Diese Daten beweisen, dass inserierte humane IGH-Gensegmente (eine Insertion von wenigstens humanen VH-Gensegmenten VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1 und allen der humanen D- und JH-Gensegmenten D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 und 7-27; und J1, J2, J3, J4, J5 und J6) vollständig funktionell sind in Hinsicht auf Rearrangement, BCR-Signalleitung und B-Zellreifung. Die Funktionalität wird beibehalten, auch wenn humane Leichtkette-VJ-Gensegmente inseriert werden, unter Bereitstellung transgener Leichtketten, wie bei der zum Erzeugen des K2-Allels verwendeten Insertion. Diese Insertion ist eine Insertion, umfassend humane Gensegmente Vκ2-24, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-13, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2, Vκ4-1, Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 und Jκ5. Mehr als 90% der Antikörper, exprimiert von den S1F/HA; K2/KA Mäusen, umfassten humane Schwerkette-Variabelregionen und humane Kappa-Leichtkette-Variabelregionen. Diese Mäuse sind daher äußerst nützlich für die Selektion von humane Variabelregionen aufweisenden Antikörpern, die spezifisch humanes Antigen binden, im Anschluss an die Immunisierung der Mäuse mit einem solchen Antigen. Nach der Isolierung eines solchen Antikörpers kann der Fachmann mithilfe herkömmlicher Techniken die Maus-Konstantregionen durch humane Konstantregionen ersetzten, wodurch man zu vollständig humanen Antikörpern gelangt, die als Arzneistoffkandidaten für die Verabreichung an Menschen brauchbar sind (gegebenenfalls nach Reifung oder Adaptation zum Erzeugen eines weiteren Derivats, z. B. mit Fc-Verstärkung oder -Inaktivierung oder nach Konjugation an eine toxische Nutzlast oder einen Reporter oder eine Markierung oder sonstige aktive Einheit).
  • Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt, um die IgG- und IgM-Niveaus und relativen Anteile in transgenen Mäusen der Erfindung zu beurteilen, welche Antikörper exprimieren, die humane Schwer- und Leicht(kappa)-Variabelregionen aufweisen (S1F/HA, K2/KA-Mäuse; n = 15). Diese wurden gegen 12 Mäuse, die nur Maus-Antikörperketten exprimierten (+/HA, +/KA) (n = 6), und Wildtypmäuse (WT; n = 6)) verglichen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabellenform dargestellt (Tabelle 19) und in der 14 gezeigt.
  • Es kann ersehen werden, dass die Mäuse der Erfindung, in denen im wesentlichen alle Schwerkette-Variabelregionen humane Schwerkette-Variabelregionen sind, normale Anteile von IgM- und IgG-Subtypen exprimierten, und auch das Gesamt-IgG relativ zu IgM war normal. Tabelle 19:
    Figure DE112014004537T5_0002
    Figure DE112014004537T5_0003
  • Beispiel 4:
  • Untersuchen von Kappa: Lambda-Verhältnis & Milz-B-Zell-Kompartimenten in transgenen Mäusen der Erfindung
  • Es wurden die folgenden Genome umfassende Mäuse erhalten.
    • WT/WT = Wildtyp;
    • KA/KA = jedes endogene Kappa-Allel wurde inaktiviert; und die endogenen Lambda-Loci werden intakt gelassen;
    • K3F/K3F = jedes endogene Kappa-Allel hat drei Kappa-Kette-Locus-DNA-Insertionen zwischen dem am meisten 3' gelegenen endogenen Jκ und dem Maus-Cκ, unter Bereitstellung einer Insertion von humanen V-Gensegmenten VK2-40, VK1-39, Vκ1-33, Vκ2-30, Vκ2-29, Vκ2-28, Vκ1-27, Vκ2-24, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-13, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2 und Vκ4-1 und humanen J-Gensegmenten Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 und Jκ5 (wobei die humanen V-Gensegmente 5' von den humanen J-Gensegmenten liegen); jedes endogene Kappa-VJ wurde durch Inversion und Verschieben nach stromaufwärts auf dem Chromosom inaktiviert; und die endogenen Lambda-Loci werden intakt gelassen;
    • L2/L2 = wie beschrieben in Beispiel 2 (L2-Homozygote, worin humane Lambda-Variabelregion-DNA in die endogenen Lambda-Loci inseriert wurde; die endogenen Kappa-Loci werden intakt gelassen);
    • L2/L2; KA/KA = wie L2/L2, aber die endogenen Kappa-Allele wurden inaktiviert (durch Insertion von einer endogenen unterbrechenden Sequenz = KA);
    • L3/L3; KA/KA = wie L2/L2; KA/KA, aber ergänzt durch eine dritte humane Lambda-Variabelregion-DNA-Insertion 5' von der zweiten Lambda-DNA-Insertion in den endogenen Lambda-Loci, so dass die folgenden humanen Lambda-Gensegmente zwischen dem am meisten 3' gelegenen endogenen Jλ und dem Maus-Cλ inseriert sind: humane V-Gensegmente Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 und Vλ3-1, humane J- und C-Gensegmente Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 und Jλ7-Cλ7 (nicht-funktionale Segmente Jλ4-Cλ4, Jλ5-Cλ5 waren auch eingeschlossen), womit eine Insertion bereitgestellt wurde, entsprechend den Koordinaten 22886217 bis 23327884 von humanem Chromosom 22, inseriert unmittelbar nach der Position 19047551 auf dem Mauschromosom 16;
    • S3F/HA; KA/KA; L3/L3 = erstes endogenes Schwerkette-Allel hat drei humane Schwerkette-Variabelregion-DNA-Insertionen zwischen dem am meisten 3' gelegenen endogenen JH und dem Eμ, unter Bereitstellung einer Insertion von humanen Gensegmenten VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, D1-1, D2-2, D3-9, D3-10, D4-11, D5-12, D6-13, D1-14, D2-15, D3-16, D4-17, D5-18, D6-19, D1-20, D2-21, D3-22, D4-23, D5-24, D6-25, D1-26, D7-27, JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 und JH6 (in der Reihenfolge: humane V-Gensegmente, humane D-Gensegmente und humane J-Gensegmente); die endogene Schwerkette-VDJ-Sequenz wurde durch Inversion und Verschieben nach stromaufwärts auf dem Chromosom inaktiviert; und die endogenen Lambda-Loci werden intakt gelassen; das zweite endogene Schwerkette-Allel wurde inaktiviert durch Insertion einer endogenen unterbrechenden Sequenz = HA); die endogenen Kappa-Allele wurden inaktiviert (= KA/KA); und die endogenen Lambda-Allele wurden modifiziert durch Insertion von humaner Lambda-Variabelregion-DNA (= L3/L3);
    • P2/WT = P2-Allel (humane Lambda-Variabelregion-DNA, wie in Beispiel 1 beschrieben) an einem endogenen Kappa-Locus; wobei der andere endogene Kappa-Locus unversehrt gelassen wurde; beide endogenen Lambda-Loci wurden unversehrt gelassen;
    • P2/P2 = Siehe Beispiel 14; beide endogenen Lambda-Loci wurden unversehrt gelassen;
    • P2/K2 = P2-Allel an einem endogenen Kappa-Locus; wobei der andere endogene Kappa-Locus zwei DNA-Insertionen zwischen dem am meisten 3' gelegenen endogenen Jκ und dem Maus-Cκ aufweist, unter Bereitstellung einer Insertion von humanen V-Gensegmenten Vκ2-24, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-13, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2 und Vκ4-1 und humanen J-Gensegmenten Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 und Jκ5 (wobei die humanen V-Gensegmente 5' von den humanen J-Gensegmenten liegen); beide endogenen Lambda-Loci wurden unversehrt gelassen; P3/K3F = als ein endogener Kappa-Locus, aufweisend eine Insertion zwischen den folgenden humanen Lambda-Gensegmenten, die inseriert sind zwischen dem am meisten 3' gelegenen endogenen Jκ und dem Maus-Cκ, unter Bereitstellung einer Insertion von humanen V-Gensegmenten Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 und Vλ3-1, humanen J- und C-Gensegmenten Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3, Jλ6-Cλ6 und Jλ7-Cλ7 (nicht-funktionale Segmente Jλ4-Cλ4, Jλ5-Cλ5 waren auch eingeschlossen), womit eine Insertion bereitgestellt wurde, entsprechend den Koordinaten 22886217 bis 23327884 von Human-Chromosom 22, inseriert unmittelbar nach der Position 70674755 auf dem Mauschromosom 6; wobei der andere endogene Kappa-Locus das oben beschriebene K3F-Allel (humane V- und J-Kappa-Gensegmente inseriert) aufweist; beide endogenen Lambda-Loci wurden unversehrt gelassen;
    • P2/P2; L2/WT = Wie P2/P2, wobei aber ein endogener Lambda-Locus das L2-Allel (humane Lambda-V- und -J-Gensegmente inseriert) aufweist, und der andere endogene Lambda-Locus Wildtyp ist; und
    • P2/P2; L2/L2 = homozygot für P2- und L2-Allele an endogenen Kappa- bzw. Lambda-Loci.
  • Die FACS-Analyse von Milz-B-Zellen (wie oben beschrieben) wurde durchgeführt, und Anteile der Leichtkette-Expression wurden bestimmt. Wir bestimmten auch die Anteile an T1-, T2- und reifen (M) Milz-B-Zellen und verglichen mit Wildtyp-Mäusen, um zu untersuchen, ob, oder ob nicht, wir normale Milz-B-Zellkompartimente in den transgenen Mäusen erhielten. Die Ergebnisse sind in Tabellen 20 und 21 gezeigt. Wir untersuchten auch den Anteil an B220-positiven Zellen als eine Anzeige für den Anteil an B-Zellen in den Milzzellproben.
  • Tabelle 20: Vergleiche mit Mäusen mit Human-Lambda-Variabelregion-Inserts am endogenen Lambda-Locus
    Figure DE112014004537T5_0004
    Figure DE112014004537T5_0005
    Tabelle 21: Mäuse mit Human-Lambda-Variabelregion-Inserts am endogenen Kappa-Locus
    Figure DE112014004537T5_0006
    Figure DE112014004537T5_0007
  • Schlussfolgerungen
  • Wie verdeutlichten durch L2/L2; KA/KA und L3/L3; KA/KA, dass die Human-Lambda-Variabelregion-DNA-Insertionen am endogenen Lambda-Locus (mit einem endogenen Kappa-Knockout) eine vorherrschende Expression von Leichtketten aufwiesen, welche humane Lambda-Variabelregionen tragen (gezeigt durch die Expression von Cλ-positiven Ketten bei ungefähr 93%). Dies tritt überraschend auf, selbst obwohl endogene Maus-Lambda-Variabelregion-DNA noch vorhanden ist, was darauf hinweist, dass die inserierte humane Lambda-Variabelregion-DNA das endogene IGλ-Rearrangement auskompetieren kann.
  • Darüber hinaus produzieren Mäuse, bei denen die humanen V- und J-Gensegmente in der homozygoten L3-Insertion vorhanden sind, B-Zellen (B220-positive Zellen) bei einem Anteil, der ähnlich zum Wildtyp ist, und produzieren außerdem einen normalen Anteil oder Prozentsatz von reifen Milz-B-Zellen (d. h. ähnlich zum Wildtyp). Dies wird nicht nur durch die L3/L3; KA/KA-Mäuse bestätigt, sondern wurde ebenfalls für S3F/HA; KA/KA; L3/L3, das ebenfalls einen chimären (Mensch-Maus) IgH-Locus umfasst, beobachtet.
  • Des Weiteren beobachteten wir, dass Mäuse, bei denen die humanen V- und J-Gensegmente in der homozygoten K3F-Insertion vorhanden sind, B-Zellen (B220 positive-Zellen) bei einem Anteil, der ähnlich zum Wildtyp ist, produzieren und außerdem einen normalen Anteil oder Prozentsatz an reifen Milz-B-Zellen (d. h. ähnlich zum Wildtyp) produzieren.
  • Mäuse, bei denen die humanen V- und J-Gensegmente in der homozygoten P2-Insertion am endogenen Kappa-Locus vorhanden sind, zeigen eine hohe Expression von Leichtketten, die humane Lambda-Variabelregionen umfassen (wie angezeigt durch einen beobachteten Anteil von 76%). Wir konnten eine Verschiebung zu einem noch höheren insgesamten Prozentsatz bewirken durch Kombinieren der Insertion von humanen Lambda V- und J-Gensegmenten an beiden der endogenen Kappa- als auch Lambda-Loci (siehe P2/P2; L2/WT zu ungefähr 94% und P2/P2; L2/L2 zu ungefähr 95%). Darüber hinaus produzieren Mäuse, umfassend das humane V- und J-Gensegment-Arrangement von P2/P2; L2/L2, einen normalen Anteil oder Prozentsatz an reifen Milz-B-Zellen (d. h., ähnlich zum Wildtyp).
  • Wenn humane Lambda-V- und J-Gensegmente an einem endogenen Kappa-Locus inseriert waren, und der andere endogene Kappa-Locus eine Insertion von humanen Kappa-V- und J-Gensegmenten umfasste, erhielten wir Mäuse, die Lambda-Variabelregionen umfassende Leichtketten und auch Kappa-Variabelregionen umfassende Leichtketten exprimieren konnten. Überraschenderweise stellten wir fest, dass wir den Anteil an Lambda-Variabelregionen umfassenden Leichtketten über denjenigen erhöhen konnten, der in einer Wildtypmaus beobachtet wird, worin typischerweise nur 5% oder weniger der Leichtketten Lambda-Variabelregionen umfassen. Wir beobachteten einen Anteil von etwa 22% für den P2/K2-Genotyp und etwa 31% für den P3/K3F-Genotyp. Der mit dem letztgenannten Genotyp beobachtete Anteil kommt jenem nahe, der in einem Mensch beobachtet wird, wo typischerweise ungefähr 60% der Leichtketten Kappa-Variabelregionen umfassen und ungefähr 40% der Leichtketten Lambda-Variabelregionen umfassen. Auch in den P2/K2- und P3/K3F-Fällen produzierten die Mäuse einen normalen Anteil an B-Zellen im Vergleich zu Wildtypmäusen. Darüber hinaus produzieren Mäuse, die das humane V- und J-Gensegment-Arrangement von P3/K3F umfassen, einen normalen Anteil oder Prozentsatz von reifen Milz-B-Zellen (d. h. ähnlich zum Wildtyp).
  • Beispiel 5:
  • Es wurden Mäuse erzeugt, die die spezifischen IgH-Allele, die in der Tabelle 3 aufgelistet sind; und die spezifischen IgL-Allele, die in den Tabellen 10 oder 11 aufgelistet sind, umfassten. Mäuse wurden mit Target- bzw. Zielantigenen immunisiert, und antigenspezifische Antikörper wurden isoliert. Antikörper wurden hinsichtlich Bindungsspezifität, Reifung (d. h. Ausmaß von junktionaler und somatischer Mutation versus Keimbahngensegment-Sequenzen) und Bindungskinetik untersucht. Entsprechende B-Zellen wurden ebenfalls erhalten, und in manchen Fällen Hybridome produziert, welche die ausgewählten Antikörper exprimierten.
  • Ausgewählte Antikörper sind in der Tabelle 22 zusammengefasst. Bindungskinetiken von einigen von diesen wurden wie folgt bestimmt.
  • Bestimmung der Bindungskinetik
  • Eine Anti-Maus-IgG-Einfangoberfläche wurde auf einem GLM BiosensorTM Chip mittels Primäramin-Kopplung unter Verwendung von GE Healthcare Anti-Maus IgG (BR-1008-38) erzeugt. Testantikörper, wie in der Tabelle 22 dargestellt, wurden auf dieser Oberfläche eingefangen, und das jeweilige Antigen wurde bei den angegebenen Konzentrationen über den eingefangenen Ab geleitet. Eine Injektion von Puffer (d. h. 0 nM Antigen) wurde als Doppelreferenz für die Bindungskurven verwendet, und die Daten wurden an das 1:1-Modell angepasst, das in der ProteOn XPR36TM Analysesoftware eingebunden ist. Die Regeneration der Einfangoberfläche wurde mithilfe von 10 mM Glycin, pH 1,7, durchgeführt. Der Assay wurde bei 25°C und unter Verwendung von HBS-EP als Laufpuffer durchgeführt.
    • Target 1: ein Multi-Untereinheit-Humanprotein
    • Target 2: ein bakterielles Zytotoxin
    • Target 3: ein anderes Multi-Untereinheit-Humanprotein
    • sTarget 4: ein Protein, exprimiert als ein Transmembranprotein auf humanen Zellen
  • Target 1 mAb1.1
  • Einzelkonzentration TARGET 1 (256 nM), Anti-Maus-Einfang
    ka kd KD
    3,85E+05 3,22E–05 83 pM
    (Scheinbare Affinität, da Multi-Untereinheit-Ziel)
  • Target 2 mAb2.1
  • TARGET 2 bei 256, 64, 16, 4 und 1 nM; Ergebnisse von 3 Experimenten:- Experiment 1:
    ka kd KD
    1,40E+04 1,83E–05 1,300 nM
    Experiment 2:
    ka kd KD
    2,76E+04 3,23E–05 1,170
  • Experiment 3:
  • Die Ablöse-Rate konnte nicht aufgeklärt werden – was auf eine extrem feste Bindung jenseits der Nachweisgrenze hindeutet.
  • Target 3 mAb3.1
  • TARGET 3 bei 256, 64, 16, 4 und 1 nM
    ka kd KD
    4,00E+05 2,34E–04 0,59 nM
    (Scheinbare Affinität, da Multi-Untereinheit-Ziel)
  • Target 3 mAb3.2
  • TARGET 3 bei 256, 64, 16, 4 und 1 nM
    ka kd KD
    3,86E+05 2,57E–04 0,67
    (Scheinbare Affinität, da Multi-Untereinheit-Ziel)
  • Target 3 mAb3.3
  • TARGET 3 bei 256, 64, 16, 4 und 1 nM
    ka kd KD
  • Die Ablöse-Rate konnte nicht aufgeklärt werden, extrem feste Bindung
  • (Scheinbare Affinität, da Multi-Untereinheit-Ziel)
  • Zusammenfassend, liefert die vorliegende Erfindung in-vivo affinitätsgereifte Antikörper mit humanen variablen Domänen, welche in In-vivo-Systemen exprimiert werden können, und Zielantigene mit sehr guten Affinitäten, Eintritts- und Ablöse-Raten spezifisch binden. Die Erfindung sieht daher Antikörper, welche für die Humanmedizin nützlich sind, sowie nicht-humane Wirbeltiere, Zellen (z. B. B-Zellen und Hybridome) zur Herstellung solcher Antikörper vor.
  • Beispiel 6:
  • Die S(Schwer)-, K-(kappa in den Kappa-Locus), L-(lambda in den Lambda-Locus) und P(lambda in den Kappa-Locus)-Linien, die zum Erzeugen der Daten in den Beispielen verwendet wurden, nutzten die Allele der Tabellen 1 bis 18 und demonstrierten, dass solche Kollektionen von Allelen die gezeigten überraschenden Ergebnisse hervorbringen können (z. B. gute B-Zell-Kompartimente, hohe humane Lambda-V-Region-Expression, wünschenswertes Lambda:Kappa-Verhältnis in einer Maus und normales Repertoire von IgH-Isotypen). Die isolierten Antikörper basierten sämtlich auf den Allelen, die in den obigen Tabellen 1 bis 18 aufgelistet sind. Alle wiesen V-Domänen mit Maus-AID- und -TdT-Muster-Mutation auf.
  • Andere Ausführungsformen
  • Aus der vorangehenden Beschreibung wird es ersichtlich sein, dass Variationen und Modifikationen an der hierin beschriebenen Erfindung vorgenommen werden können, um sie an verschiedene Zwecke und Umstände anzupassen. Solche Ausführungsformen liegen ebenfalls innerhalb des Schutzbereichs der folgenden Ansprüche.
  • Das Zitieren einer Auflistung von Elementen in jedweder Definition von einer Variablen hierin beinhaltet Definitionen von dieser Variable als ein beliebiges einzelnes Element oder eine Kombination (oder Teilkombination) von aufgelisten Elementen. Das Zitieren einer Ausführungsform hierin schließt diese Ausführungsform als beliebige einzelne Ausführungsform oder in Kombination mit jedweden anderen Ausführungsformen oder Teilen davon ein.
  • Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in der Beschreibung erwähnt sind, zeigen den Kenntnisstand des Fachmanns auf dem Gebiet an, zu dem diese Erfindung gehört. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin durch den Bezug darauf im gleichen Ausmaß einbezogen, als ob jede einzelne Veröffentlichung und Patentanmeldung speziell und individuell als zur Bezugnahme einbezogen ausgewiesen wäre.
    Figure DE112014004537T5_0008
    Figure DE112014004537T5_0009
    Figure DE112014004537T5_0010
  • Sequenzen als Beispiel von Gensegmenten in Übereinstimmung mit der Erfindung sind unten stehend dargelegt.
  • Figure DE112014004537T5_0011
  • Figure DE112014004537T5_0012
  • Figure DE112014004537T5_0013
  • Figure DE112014004537T5_0014
  • Figure DE112014004537T5_0015
  • Figure DE112014004537T5_0016
  • Figure DE112014004537T5_0017
  • Figure DE112014004537T5_0018
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  • Figure DE112014004537T5_0029
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Claims (53)

  1. Nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Mauszelle oder Rattenzelle), deren Genom ein oder mehrere humane VH-Gensegmente, ein oder mehrere humane JH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und ein oder mehrere humane JL-Gensegmente und ein oder mehrere humane VL-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass die Zelle zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette und eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei das eine oder die mehreren humanen VH-Gensegmente des Schwerkettelocus ein, mehrere oder alle humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 und VH3-9*01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen.
  2. Nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen Genom ein oder mehrere humane VH-Gensegmente, ein oder mehrere humane JH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und ein oder mehrere humane JL-Gensegmente und ein oder mehrere humane VL-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass das Wirbeltier zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, wobei das eine oder die mehreren humanen VH-Gensegmente des Schwerkettelocus ein, mehrere oder alle humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 oder VH3-9*01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen,
  3. Zelle oder Wirbeltier von Anspruch 1 oder 2, wobei die Schwerkette produziert wird durch Rekombination eines humanen JH-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 und VH3-9*01.
  4. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das Genom humanes JH2*01 und/oder humanes JH6*02 umfasst und die Schwerkette produziert wird durch Rekombination von humanem JH2*01 oder humanem JH6*02 mit einem D-Segment und einem VH-Segment, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 und VH3-9*01.
  5. Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das Wirbeltier ein Repertoire an humanen Antikörperschwerkette-Variabel-Domänen produziert, umfassend variable Domänen, die durch Rekombination von humanen VH3-23*04-, VH7-4-1*01-, VH4-4*02-, VH1-3*01-, VH3-13*01-, VH3-7*01-, VH3-20*d01- und VH3-9*01-Gensegmenten produziert werden.
  6. Nicht-humane Wirbeltierzelle (z. B. eine Mauszelle oder Rattenzelle), deren Genom ein oder mehrere humane VH-Gensegmente, ein oder mehrere humane JH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und ein oder mehrere humane Jκ-Gensegmente und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass die Zelle zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette und eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei das eine oder die mehreren humanen Vκ-Gensegmente ein, mehrere oder alle humanen Vκ-Gensegmente, ausgewählt aus der aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen.
  7. Nicht-humanes Wirbeltier (z. B. eine Maus oder Ratte), dessen Genom ein oder mehrere humane VH-Gensegmente, ein oder mehrere humane JH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und ein oder mehrere humane Jκ-Gensegmente und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass das Wirbeltier zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, wobei das eine oder die mehreren humanen Vκ-Gensegmente ein, mehrere oder alle humanen Vκ-Gensegmente, ausgewählt aus der aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen.
  8. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das Genom humanes Jκ2*01 und/oder humanes Jκ4*01 umfasst, und die Leichtkette durch Rekombination von humanem Jκ2*01 oder humanem Jκ4*01 mit einem Vκ-Segment produziert wird.
  9. Zelle oder Wirbeltier von Anspruch 8, wobei das Vκ-Segment ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01.
  10. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei die Leichtkette durch Rekombination eines humanen Jκ-Segments mit Vκ-Segment, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01, produziert wird.
  11. Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das Wirbeltier ein Repertoire von humanen Antikörperleichtkette-Variabel-Domänen produziert, umfassend variable Domänen, produziert durch Rekombination von humanen Vκ4-1*01-, Vκ2-28*01-, Vκ1D-13*d01-, Vκ1-12*01-, Vκ1D-12*02-, Vκ3-20*01-, Vκ1-17*01-, Vκ1D-39*01-, Vκ3-11*01-, Vκ1D-16*01- und Vκ1-9*d01-Gensegmenten.
  12. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei die humanen Jκ-Gensegmente und Vκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Leichtkettelocus sind und/oder die humanen JH-Gensegmente, D-Gensegmente und VH-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem endogenen Schwerkettelocus sind.
  13. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, deren bzw. dessen Genom humanes JH2*01 und/oder humanes JH6*02, ein oder mehrere humane VH-Gensegmente und ein oder mehrere humane D-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und humane Jκ2*01 und/oder humane Jκ4*01 und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente in jedem Locus funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass die Zelle oder das Wirbeltier zum Produzieren einer Antikörperschwerkette und einer Antikörperleichtkette imstande ist, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das eine Antikörperschwerkette und eine Antikörperleichtkette exprimiert, wobei die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH2*01- und/oder JH6*02-Segments mit einem D-Segment und einem VH-Segment produziert wird, und die Leichtkette durch Rekombination des humanen Jκ2*01- und/oder Jκ4*01-Segments mit einem Vκ-Segment produziert wird.
  14. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das eine oder die mehreren humanen VH-Gensegmente humanes VH3-23*04 umfassen, wobei optional die Schwerkette durch Rekombination eines humanen JH-Segments mit einem D-Segment und dem VH-Segment produziert wird.
  15. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das eine oder die mehreren humanen VH-Gensegmente humanes VH3-9*01 umfassen, wobei optional die Schwerkette durch Rekombination eines humanen JH-Segments mit einem D-Segment und dem VH-Segment produziert wird.
  16. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem von Anspruch 6–12, wobei das eine oder die mehreren humanen Vκ-Gensegmente humanes Vκ1D-12*02 umfassen, wobei optional die Leichtkette durch Rekombination eines humanen Jκ-Segments mit dem Vκ-Segment produziert wird.
  17. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem von Anspruch 6–12, wobei das eine oder die mehreren humanen Vκ-Gensegmente humanes Vκ1-12*01 umfassen, wobei optional die Leichtkette durch Rekombination eines humanen Jκ-Segments mit dem Vκ-Segment produziert wird.
  18. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem von Anspruch 6–12, wobei das eine oder die mehreren humanen Vκ-Gensegmente humanes Vκ2-28*01 umfassen, wobei optional die Leichtkette durch Rekombination eines humanen Jκ-Segments mit dem Vκ-Segment produziert wird.
  19. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem von Anspruch 6–12, wobei das eine oder die mehreren humanen Vκ-Gensegmente humanes Vκ4-1*01 umfassen, wobei optional die Leichtkette durch Rekombination eines humanen Jκ-Segments mit dem Vκ-Segment produziert wird.
  20. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das eine oder die mehreren humanen JH-Gensegmente humanes JH6*02 umfassen, wobei optional die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH-Segments mit einem humanen D- und VH-Segment produziert wird.
  21. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das eine oder die mehreren humanen JH-Gensegmente humanes JH6*01 umfassen, wobei optional die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH-Segments mit einem humanen D- und VH-Segment produziert wird.
  22. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das eine oder die mehreren humanen JH-Gensegmente humanes JH2*01 umfassen, wobei optional die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH-Segments mit einem humanen D- und VH-Segment produziert wird.
  23. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das eine oder die mehreren humanen JH-Gensegmente humanes JH3*02 umfassen, wobei optional die Schwerkette durch Rekombination des humanen JH-Segments mit einem humanen D- und VH-Segment produziert wird.
  24. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem von Anspruch 6 – 12, wobei das eine oder die mehreren humanen Jκ-Gensegmente humanes Jκ2*01 umfassen, wobei optional die Leichtkette durch Rekombination des humanen Jκ-Segments mit einem humanen Vκ-Segment produziert wird.
  25. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem von Anspruch 6 – 12, wobei das eine oder die mehreren humanen Jκ-Gensegmente humanes Jκ4*01 umfassen, wobei optional die Leichtkette durch Rekombination des humanen Jκ-Segments mit einem humanen Vκ-Segment produziert wird.
  26. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das eine oder die mehreren humanen VH-Gensegmente der Schwerkette ein, mehrere oder alle humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 und VH3-9*01, umfassen oder daraus bestehen, und das eine oder die mehreren humanen VL-Gensegmente ein, mehrere oder alle humanen VL-Gensegmente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01, umfassen oder daraus bestehen.
  27. Zelle oder Wirbeltier von jedwedem vorangehenden Anspruch, wobei das eine oder die mehreren VH-Gensegmente ausgewählt sind aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 und VH3-20*d01 bestehenden Gruppe.
  28. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragments davon, wobei das Verfahren das Immunisieren eines Wirbeltiers von einem beliebigen der Ansprüche 2–5 und 7–27 mit einem Antigen und das Gewinnen des Antikörpers oder Fragments oder das Gewinnen einer Zelle, die den Antikörper oder das Fragment herstellt, umfasst; wobei gegebenenfalls der/das produzierte Antikörper oder Fragment so modifiziert ist, dass er bzw. es humane Konstantregionen umfasst, wobei die variablen Domänen des Antikörpers codiert werden durch ein oder mehrere humane JH-Gensegmente, ein oder mehrere humane D-Gensegmente und ein oder mehrere humane VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 und VH3-9*01 bestehenden Gruppe, und/oder ein oder mehrere humane Jκ-Gensegmente und ein oder mehrere humane Vκ-Gensegmente, ausgewählt aus der aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01 bestehenden Gruppe.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei das eine oder die mehreren VH-Gensegmente ausgewählt sind aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 und VH3-20*d01 bestehenden Gruppe.
  30. Verfahren gemäß Anspruch 28 oder 29, wobei das Antigen ein Multi-Untereinheit-Humanprotein, ein bakterielles Zytotoxin oder ein als ein Transmembranprotein auf humanen Zellen exprimiertes Protein ist.
  31. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragments davon, wobei das Verfahren das Isolieren eines Antikörpers oder antigenbindenen Fragments davon aus einer Zelle gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1, 3–4, 6 und 8–27 umfasst; und gegebenenfalls das Modifizieren des isolierten Antikörpers oder Fragments, so dass er bzw. es humane Konstantregionen umfasst.
  32. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 28–31, wobei die Schwer- oder Leichtkette des isolierten Antikörpers wie in einem beliebigen der Ansprüche 14–25 zitiert ist.
  33. Verfahren von Anspruch 31 oder 32, ferner umfassend (a) Isolieren einer B-Zelle aus dem Wirbeltier, die einen Antikörper codiert, der das Antigen bindet, (b) Identifizieren oder Kopieren einer Nukleotidsequenz der B-Zelle, die eine VH-Domäne des Antikörpers codiert und/oder Identifizieren oder Kopieren einer Nukleotidsequenz der B-Zelle, die eine VL-Domäne des Antikörpers codiert; und (c) Verwenden der Sequenz(en) zur Herstellung eines isolierten Antikörpers oder Fragments, umfassend die VH- und/oder VL-Domäne; wobei optional der isolierte Antikörper oder das Fragment humane Konstantregionen umfasst.
  34. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 28–33, wobei der Antikörper oder das Fragment durch Expression aus einer Wirtszelle, ausgewählt aus einer CHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe(z. B. Picchia)-Zelle, produziert wird.
  35. Verfahren von Anspruch 34, wobei der Antikörper oder das Fragment durch Expression aus einer CHO-Zelle produziert wird.
  36. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 28–35, ferner umfassend das Formulieren des Antikörpers oder Fragments mit einem Verdünnungsmittel, Träger, Exzipienten oder einem Arzneistoff, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Humanmedizin herzustellen, gegebenenfalls ferner umfassend das Verpacken der Zusammensetzung in einem sterilen Behälter, zum Beispiel einem Gefäß, einem Röhrchen, einem IV-Beutel oder einer Spritze, ferner gegebenenfalls das Herstellen eines Kits, umfassend das Kombinieren der Packung mit einem Etikett oder Anleitungen, die die Anwendung der Antikörper-Zusammensetzung zum humanmedizinischen Gebrauch angeben; wobei das Etikett oder die Anleitung gegebenenfalls eine Arzneistoff-Chargennummer und/oder eine Markt-Zulassungsnummer, ferner gegebenenfalls eine EMA- oder FDA-Markt-Zulassungsnummer, umfasst.
  37. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 28–36, wobei das Wirbeltier gemäß einem beliebigen der Ansprüche 2–5 und 7–27 ist, und der bzw. das durch das Verfahren produzierte Antikörper oder Fragment umfasst (a) eine humane Schwerkette-Variabeldomäne, die eine Rekombinante von VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 und VH3-9*01, einem humanen JH-Gensegment und einem humanen D-Gensegment ist; und/oder (b) eine humane Leichtkette-Variabeldomäne, die eine Rekombinante von Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01 und einem humanen Jκ-Gensegment ist.
  38. Verfahren von Anspruch 37, wobei der bzw. das durch das Verfahren produzierte Antikörper oder Fragment eine humane Schwerkette-Variabeldomäne-Rekombinante von JH2*01, JH6*02, JH6*01 oder JH3*02, einem D-Segment und einem der VH-Segmente umfasst.
  39. Verfahren von Anspruch 37, wobei der bzw. das durch das Verfahren produzierte Antikörper oder Fragment eine humane Leichtkette-Variabeldomäne-Rekombinante von Jκ4*01 oder Jκ2*01 mit einem der Vκ-Segmente umfasst.
  40. Verfahren von Anspruch 37, wobei der bzw. das durch das Verfahren produzierte Antikörper oder Fragment eine Schwerkette-Variabeldomäne-Rekombinante von Anspruch 38 und eine Leichtkette-Variabeldomäne-Rekombinante von Anspruch 39 umfasst.
  41. Verfahren von Anspruch 37, wobei der bzw. das durch das Verfahren produzierte Antikörper oder Fragment eine humane Schwerkette-Variabeldomäne-Rekombinante von VH3-23*04 und JH2*01 und eine humane Leichtkette-Variabeldomäne-Rekombinante von Vκ4-1*01 und Jκ2*01 umfasst.
  42. Verfahren von Anspruch 37, wobei der bzw. das durch das Verfahren produzierte Antikörper oder Fragment eine humane Schwerkette-Variabeldomäne-Rekombinante von VH3-7*01 und JH6*02 und eine humane Leichtkette-Variabeldomäne-Rekombinante von Vκ2-28*01 und Jκ4*01 umfasst.
  43. Isolierter Antikörper oder Fragment oder Kit, produziert durch das Verfahren eines beliebigen der Ansprüche 28–42.
  44. Isolierter Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, oder Kit, produziert durch das Verfahren der Ansprüche 28–42, wobei der Antikörper humanisiert ist.
  45. Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper oder ein Fragment oder ein Kit, produziert durch das Verfahren der Ansprüche 28–42, wobei der Antikörper oder das Fragment das einizige therapeutische Agens ist.
  46. Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper oder ein Fragment oder ein Kit, produziert durch das Verfahren der Ansprüche 28–42, ferner umfassend ein zusätzliches therapeutisches Agens, zum Beispiel einen Anti-Hypercholesterinämie-Arzneistoff.
  47. Isolierter Antikörper oder Fragment oder Kit, produziert durch das Verfahren eines beliebigen der Ansprüche 28–42 zur Verwendung in der Humanmedizin.
  48. Verwendung des isolierten Antikörpers oder Fragments, produziert durch das Verfahren eines beliebigen der Ansprüche 28–42, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Humanmedizin.
  49. Verwendung von Anspruch 48, wobei das Medikament von einer Zusammensetzung oder einem Kit, wie zitiert in Anspruch 36 oder 46, beinhaltet ist.
  50. Isolierter Antikörper oder Fragment oder Kit gemäß Anspruch 43–46, oder Verwendung gemäß Anspruch 47–49, welcher spezifisch ein humanes Ziel binden kann, ausgewählt aus: Proprotein-Convertase PC9, Proprotein-Convertase Subtilisin Kexin-9 (PCSK9), CD126, IL-4, IL-4 Rezeptor, IL-6, IL-6 Rezeptor, IL-13, IL-18-Rezeptor, Erbb3, Zell-ASIC1, ANG2, GDF-8, Angiopoietin-Ligand-2, Delta-Like-Protein-Ligand 4, Immunglobulin G1, PDGF-Ligand, PDGF-Rezeptor oder NGF-Rezeptor, Toxin A oder Toxin B von Clostridium difficile, Relaxin, CD48, Cd20, Glucagon-Rezeptor, Protease-aktivierter Rezeptor 2, TNF-Like-Ligand 1A (TL1A), Angiopoietin-related-2 (AR-2), Angiopoietin-like-Protein 4, RANKL, Angiopoietin-like-Protein 3 (ANGPTL3), Delta-like Ligand 4 (DLL4), ”Big Endothelin-1” (ET-1), Activin A, Rezeptortyrosinkinasen, zum Beispiel humane AR-1 und Tyrosinkinase mit Ig- und EGF-Homologiedomänen (TIE) und TIE-2 Rezeptor.
  51. Isolierter Antikörper oder Fragment oder Kit gemäß Anspruch 43–46 oder Verwendung gemäß Anspruch 47–49, zur Verwendung in der Behandlung eines Menschen, der Bedarf daran hat, wobei die Behandlung das Zuführen einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder Fragments umfasst, der bzw. das spezifisch ein Virus oder ein Antigen bindet, ausgewählt aus einem humanen Zytokin, Wachstumsfaktor, Hormon, Enzym und einem Serumprotein.
  52. Wirtszelle, zum Beispiel eine OHO-, HEK293-, Cos- oder Hefe (z. B. Picchia)-Zelle, die einen Antikörper oder ein Fragment exprimiert, produziert durch das Verfahren eines beliebigen der Ansprüche 29–42.
  53. Nicht-humane Wirbeltier(z. B. eine Maus oder Ratten)-Zelle, deren Genom humane VH-, D- und JH-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Schwerkettelocus und humane VL- und JL-Gensegmente stromaufwärts von einer Konstantregion an einem Leichtkettelocus umfasst, wobei die Gensegmente funktionsfähig mit der Konstantregion davon verbunden sind, so dass die Zelle imstande ist zum Exprimieren von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten, umfassend humane VH- bzw. VL-Domänen, wobei der Schwerkettelocus ein humanes 01-Allel-VH-Gensegment umfasst, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen D- und JH-Gensegment zum Erzeugen einer VH-Domäne, wobei der Leichtkettelocus ein humanes 01-Allel-VL-Gensegment umfasst, befähigt zum Rekombinieren mit einem humanen JL-Gensegment zum Erzeugen einer VL-Domäne, oder wobei die Zelle sich zu einem Wirbeltier entwickeln kann, das die VH- und VL-Domänen exprimiert; wobei das eine oder die mehreren humanen VH-Gensegmente des Schwerkettelocus ein, mehrere oder alle humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01, VH3-20*d01 und VH3-9*01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen, oder wobei das eine oder die mehreren humanen Vκ-Gensegmente ein, mehrere oder alle humanen VH-Gensegmente, ausgewählt aus der aus Vκ4-1*01, Vκ2-28*01, Vκ1 D-13*d01, Vκ1-12*01, Vκ1D-12*02, Vκ3-20*01, Vκ1-17*01, Vκ1D-39*01, Vκ3-11*01, Vκ1D-16*01 und Vκ1-9*d01 bestehenden Gruppe, umfassen oder daraus bestehen.
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