JP6621750B2

JP6621750B2 - ヒスチジン操作軽鎖抗体およびそれを生成するための遺伝子改変非ヒト動物

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Publication number: JP6621750B2
Application number: JP2016543984A
Authority: JP
Inventors: ジョンマクウィルター，; リンマクドナルド，; アンドリュージェイ．マーフィー，
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2019-12-18
Anticipated expiration: 2034-09-18
Also published as: SG11201601272YA; ES2738679T3; JP2016533768A; JP2019068850A; HK1225913A1; BR112016005912A2; MY191512A; EP3046412B1; SI3046412T1; CA2922892C; RU2016114306A; CA2922892A1; IL244226A0; RU2016114306A3; AU2014323527A1; EP3549437C0; LT3046412T; RU2019121863A; CY1121798T1; KR102150414B1

Description

発明の分野
ｐＨ依存的な様式で抗原への結合が可能な抗体を発現する、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）が提供される。非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に改変を施すための方法であって、改変が、軽鎖可変領域遺伝子内の残基、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）内の１つまたは複数のアミノ酸をコードするヌクレオチドの変異誘発を含んで、抗原へのｐＨ依存性結合を示す軽鎖ドメインを含む抗体のｉｎｖｉｖｏにおける発現を容易にする方法が提供される。ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体を作製するための方法もまた提供される。

発明の背景
抗体は、各重鎖モノマーが同一の軽鎖と会合しているホモダイマー重鎖成分を一般的に含む。ヘテロダイマー重鎖成分を有する抗体（例えば、二重特異性抗体）は、治療抗体として望ましい。しかし、二重特異性抗体の重鎖の各々と十分に会合することができる好適な軽鎖成分を有する二重特異性抗体を作製することには、問題があることが判明した。

１つの手法では、全ての軽鎖可変ドメインの使用統計値を調査し、ヒト抗体で最も頻繁に使用される軽鎖を同定し、その軽鎖を異なる特異性の２つの重鎖とｉｎｖｉｔｒｏで対合させることによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。

別の手法では、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ヒト軽鎖可変領域配列を含むファージディスプレイライブラリー、例えばヒトｓｃＦｖライブラリー）において軽鎖配列を観察し、最も一般的に用いられる軽鎖可変領域をライブラリーから選択することによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。次に、軽鎖を、目的の２つの異なる重鎖について試験することができる。

別の手法では、目的の両方の重鎖の重鎖可変配列をプローブとして用いて、軽鎖可変配列のファージディスプレイライブラリーを分析することによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。両方の重鎖可変配列と会合する軽鎖は、それら重鎖のための軽鎖として選択することができる可能性がある。

別の手法では、候補軽鎖を重鎖の関連軽鎖とアラインメントさせることができ、両方の重鎖の関連軽鎖に共通する配列特性により緊密に一致するように軽鎖が改変される。免疫原性の可能性を最小にする必要がある場合、改変は好ましくは、公知のヒト軽鎖配列に存在する配列をもたらし、ここで、タンパク分解プロセシングが、免疫原性の可能性を評価するための当技術分野で公知であるパラメータおよび方法（すなわち、ｉｎｓｉｌｉｃｏおよびウェットアッセイ）に基づいたＴ細胞エピトープを生成する可能性は低い。

上記の手法のいずれも、例えば配列同一性、特異的な前選択された重鎖と会合する能力などのいくつかのアプリオリ制限を含むｉｎｖｉｔｒｏの方法に依存する。共通する軽鎖を含むヒトエピトープ結合タンパク質を作製するための、ｉｎｖｉｔｒｏ条件における操作に頼らず、代わりにより生物学的で実用的な手法を使用する組成物および方法への必要性が当技術分野にある。

加えて、治療抗体、例えば、二重特異性治療抗体は、それらが、所望の有効性を達成するには、しばしば、高用量を必要とするという点で、ある限界を有する。これは、抗体−抗原複合体がエンドソームへと内部移行して、標的介在性クリアランスと呼ばれるプロセスにおけるリソソーム分解の標的とされるという事実に部分的に起因する。したがって、当技術分野には、より効率的な抗体リサイクリング、例えば、二重特異性抗体リサイクリングをもたらし、抗体の抗原に対する特異性および親和性を損なわずに、エンドソームコンパートメント内の抗体−抗原複合体の解離を促進することにより、抗体の分解を防止する方法および組成物に対する必要性がある。

発明の概要
一態様では、中性ｐＨでは、標的抗原に結合するが、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．０〜６．０）では、同じ抗原の結合の低減を示す抗体または抗体可変ドメインを生成するための生物学的系が提供される。生物学的系は、１つまたは複数のヒスチジン改変を含む、再構成された軽鎖配列（例えば、再構成されたＶ−Ｊ）を有する非ヒト動物、例えば、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）を含む。様々な態様では、１つまたは複数のヒスチジン改変は、軽鎖ＣＤＲ３コドンにおいてである。様々な態様では、非ヒト動物は、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座またはヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む。様々な態様では、非ヒト動物は、内在性非ヒト重鎖可変遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト重鎖Ｖ_Ｈセグメント、ヒト重鎖Ｄ_Ｈセグメント、およびヒト重鎖Ｊ_Ｈセグメントによる置きかえを含み、ここで、ヒトセグメントは、非ヒト免疫グロブリン定常領域に作動可能に連結されている。様々な態様では、非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を有する軽鎖可変ドメインを含む、ユニバーサル軽鎖を有する非ヒト動物が提供される。様々な態様では、これらのヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウス）を、ヒスチジン−ユニバーサル軽鎖マウス、ヒスチジン−ＵＬＣマウス、またはＨＵＬＣマウスと称する。

したがって、一態様では、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列を、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト動物は、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、内在性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。

一実施形態では、動物は、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、その生殖細胞系列内にさらに含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。

一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。一態様では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に含まれる、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントのＶκ配列は、上記ヒスチジン改変以外は、生殖細胞系列のＶκ１−３９配列またはＶκ３−２０配列である。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。別の実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるｔ_１／２の短縮は、約３０倍以上である。一実施形態では、このような富化は少なくとも約２倍である。

一実施形態では、動物は、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内で置換された少なくとも１つのコドンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する。一実施形態では、動物は、体細胞超変異にもかかわらず、発現するヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を保持する抗体を発現する。

一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウスである。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。したがって、一態様では、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子改変マウスもまた本明細書において提供される。一実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く。

一実施形態では、マウスの生殖細胞系列内の、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、ラットまたはマウスの免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウス配列である。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、内在性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。

さらなる実施形態では、マウスはまた、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座もその生殖細胞系列内に含む。一態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウス配列である。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内在性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。

一態様では、マウスは、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、ここで、置換は、ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドン、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンにある。一実施形態では、マウスの免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、例えば、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。一実施形態では、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。一実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。別の実施形態では、このような置きかえを、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。

別の実施形態では、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。一実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。別の実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。

一実施形態では、本明細書に記載されているマウスは、目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでの解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０分倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるｔ_１／２の短縮は約３０倍以上である。一実施形態では、抗体のこのような富化は少なくとも約２倍である。

一実施形態では、本明細書に記載されているマウスは、目的の抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、ここで、全ての抗体は、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、同じ、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、（ｂ）ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来する重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖とを含む。

本明細書では、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む非ヒト遺伝子座、例えば、マウス遺伝子座であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト遺伝子座もまた提供される。一実施形態では、遺伝子座は、非ヒト動物の生殖細胞系列内に含まれる。一実施形態では、遺伝子座は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、例えば、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む。遺伝子座内に存在する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５配列に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。遺伝子座内に存在する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１配列に由来する別の実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。様々な実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト遺伝子座は、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための、下記で記載される方法を用いて生成することができる。

さらに別の態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内在性免疫グロブリンの軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列をゲノムに配置するステップとを含む方法が本明細書において提供される。一実施形態では、このような方法は、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす。一実施形態では、ゲノムに配置される、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０、例えば、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。したがって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５に由来する実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１に由来する実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。

別の態様では、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、（ａ）本明細書に記載されているマウス（例えば、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、その再構成された軽鎖可変領域配列内に、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含むマウス）を生成するステップと、（ｂ）マウスを目的の抗原で免疫するステップと、（ｃ）中性ｐＨでは、目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップとを含む方法が本明細書において提供される。一実施形態では、方法は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下のｔ_１／２を示す抗体の生成を結果としてもたらす。一実施形態では、方法は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を提示する抗体の生成を結果としてもたらす。

他の態様では、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成するさらなる方法が本明細書において提供される。１つのこのような方法は、（ａ）目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体を選択するステップと、（ｂ）第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、（ｃ）第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、（ｄ）細胞内で発現した第二の抗体であって、中性ｐＨでは、目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップとを含む。一実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列は、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、第一の抗体を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来する免疫グロブリン軽鎖配列を含む非ヒト動物、例えば、マウスにおいて生成し、免疫グロブリン軽鎖の改変を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列内に施す。一実施形態では、第一の抗体を、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントのレパートリーに由来する免疫グロブリン重鎖配列をさらに含む非ヒト動物、例えば、マウスにおいて生成する。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列およびＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列から選択される。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５である実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の改変を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣＤＲ３コドンにおいて施す。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１である実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の改変を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣＤＲ３コドンにおいて施す。

一実施形態では、本明細書に記載されている、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を提示する抗体を結果としてもたらす。一実施形態では、抗体を生成する方法は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下のｔ_１／２を示す抗体を結果としてもたらす。

他の様々な態様では、マウス軽鎖定常領域またはラット軽鎖定常領域に作動可能に連結された、軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリー、例えば、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント、ならびに、非ヒト定常領域に作動可能に連結された、１つまたは複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された非ヒト動物、例えばマウスが本明細書において提供され、ここで、ヒト遺伝子セグメントは、再構成することが可能であり、抗体のヒト可変ドメインをコードすることが可能であるものであり、さらに、マウスは、免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含まない。一実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット定常領域またはマウス定常領域、例えば、ラットＣκ定常領域またはマウスＣκ定常領域である。一実施形態では、マウスは、５つのヒトＪκ遺伝子セグメント、例えば、Ｊκ１遺伝子セグメント、Ｊκ２遺伝子セグメント、Ｊκ３遺伝子セグメント、Ｊκ４遺伝子セグメント、およびＪκ５遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９、Ｖκ３−２０、およびこれらの組合せから選択され、例えば、２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０である。一実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、内在性軽鎖遺伝子座、例えば、内在性カッパ軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、マウスは、機能的なλ軽鎖遺伝子座を含む。別の実施形態では、マウスは、非機能的なλ軽鎖遺伝子座を含む。一実施形態では、１つまたは複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、マウスまたはラット重鎖定常領域配列に作動可能に連結する。

一部の実施形態では、ヒト可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーを含む非ヒト遺伝子座、例えば、免疫グロブリン定常領域配列（例えば、非ヒト免疫グロブリン定常領域配列、例えば、ラット配列またはマウス配列）に作動可能に連結された、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む非ヒト遺伝子座も本明細書において提供される。一実施形態では、遺伝子座は、５つのヒトＪκ遺伝子セグメント、例えば、Ｊκ１遺伝子セグメント、Ｊκ２遺伝子セグメント、Ｊκ３遺伝子セグメント、Ｊκ４遺伝子セグメント、およびＪκ５遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０、およびこれらの組合せから選択される（例えば、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０である）。様々な実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト遺伝子座は、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための、本出願を通して記載されている方法を用いて生成することができる。したがって、ヒト可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーを含む、例えば、免疫グロブリン定常領域配列（例えば、非ヒト免疫グロブリン定常領域配列、例えば、ラット配列またはマウス配列）に作動可能に連結された、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法も提供される。

様々な態様では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントのうちの１つおよび１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成から生成した免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスであって、全てまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリンＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンＶ_Ｈ、１つまたは複数のＤ_Ｈおよび１つまたは複数のＪ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえを含み、また、（ａ）λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中のＢ細胞の、（ｂ）κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中のＢ細胞に対する比が約１〜約１５を示す、マウスが提供される。一部の実施形態では、再構成はヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、再構成はヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、内在性免疫グロブリンＶ_Ｈ遺伝子セグメントの置きかえは、内在性免疫グロブリンＶ_Ｈ遺伝子座にある。一部の実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントは内在性免疫グロブリンＶκ遺伝子座にあり、一部の実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントにより全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントを置きかえる。一部の実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントは内在性免疫グロブリンＶκ遺伝子座にあり、一部の実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントにより全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメント、およびＪκ遺伝子セグメントを置きかえる。様々な実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントを、２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントに作動可能に連結する。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成される軽鎖を発現し、λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中の未熟Ｂ細胞の、κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する未熟Ｂ細胞に対する比は約１〜約１３である。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成される軽鎖を発現し、λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中の成熟Ｂ細胞の、κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する未熟Ｂ細胞に対する比は約１〜約７である。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成される軽鎖を発現し、また、例えば、細胞約２．５×１０^４個、３．０×１０^４個、３．５×１０^４個、４．０×１０^４個、４．５×１０^４個、５．０×１０^４個、５．５×１０^４個、６．０×１０^４個、６．５×１０^４個、７．０×１０^４個、７．５×１０^４個、８．０×１０^４個、８．５×１０^４個、９．０×１０^４個、９．５×１０^４個、１．０×１０^５個、または１．５×１０^５個を含む、細胞約２．５×１０^４〜約１．５×１０^５個の範囲内の、骨髄中のプロＢ細胞集団を有し、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．８８×１０^４個の、骨髄中のプロＢ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約６．４２×１０^４個の、骨髄中のプロＢ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約９．１６×１０^４個の、骨髄中のプロＢ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．１９×１０^５個の、骨髄中のプロＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている遺伝子改変マウスの骨髄中の例示的なプロＢ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ４３、ｃ−ｋｉｔおよび／またはその組合せの発現（例えば、ＣＤ１９^＋、ＣＤ４３^＋、ｃ−ｋｉｔ^＋）を特徴とする。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成される軽鎖を発現し、また、例えば、細胞約１．０×１０^６個、１．１×１０^６個、１．２×１０^６個、１．３×１０^６個、１．４×１０^６個、１．５×１０^６個、１．６×１０^６個、１．７×１０^６個、１．８×１０^６個、１．９×１０^６個、または２．０×１０^６個を含む、細胞約１×１０^６〜約２×１０^６個の範囲内の、骨髄中のプレＢ細胞集団を有し、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．２５×１０^６個の、骨髄中のプレＢ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４６×１０^６個の、骨髄中のプレＢ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．６４×１０^６個の、骨髄中のプレＢ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．０３×１０^６個の、骨髄中のプレＢ細胞集団を含む。本明細書に記載されている遺伝子改変マウスの骨髄中の例示的なプレＢ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ４３、ｃ−ｋｉｔおよび／またはその組合せの発現（例えば、ＣＤ１９^＋、ＣＤ４３⁻、ｃ−ｋｉｔ⁻）を特徴とする。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成される軽鎖を発現し、また、例えば、細胞約５．０×１０^５個、５．１×１０^５個、５．２×１０^５個、５．３×１０^５個、５．４×１０^５個、５．５×１０^５個、５．６×１０^５個、５．７×１０^５個、５．８×１０^５個、５．９×１０^５個、６．０×１０^５個、６．１×１０^５個、６．２×１０^５個、６．３×１０^５個、６．４×１０^５個、６．５×１０^５個、６．６×１０^５個、６．７×１０^５個、６．８×１０^５個、６．９×１０^５個、または７．０×１０^５個を含む、細胞約５×１０^５〜約７×１０^５個の範囲内の、骨髄中の未熟Ｂ細胞集団を有し、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約５．３３×１０^５個の、骨髄中の未熟Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約５．８０×１０^５個の、骨髄中の未熟Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約５．９２×１０^５個の、骨髄中の未熟Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、マウスは、細胞約６．６７×１０^５個の、骨髄中の未熟Ｂ細胞集団を含む。本明細書に記載されている遺伝子改変マウスの骨髄中の例示的な未熟Ｂ細胞は、ＩｇＭ、Ｂ２２０および／またはその組合せの発現（例えば、ＩｇＭ^＋、Ｂ２２０^ｉｎｔ）を特徴とする。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成される軽鎖を発現し、また、例えば、細胞約３．０×１０^４個、３．５×１０^４個、４．０×１０^４個、４．５×１０^４個、５．０×１０^４個、５．５×１０^４個、６．０×１０^４個、６．５×１０^４個、７．０×１０^４個、７．５×１０^４個、８．０×１０^４個、８．５×１０^４個、９．０×１０^４個、９．５×１０^４個、１．０×１０^５個、または１．５×１０^５個を含む、細胞約３×１０^４〜約１．５×１０^５個の範囲内の、骨髄中の成熟Ｂ細胞集団を有し、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．１１×１０^４個の、骨髄中の成熟Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．０９×１０^５個の、骨髄中の成熟Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．１６×１０^５個の、骨髄中の成熟Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４４×１０^５個の、骨髄中の成熟Ｂ細胞集団を含む。本明細書に記載されている遺伝子改変マウスの骨髄中の例示的な成熟Ｂ細胞は、ＩｇＭ、Ｂ２２０および／またはその組合せの発現（例えば、ＩｇＭ^＋、Ｂ２２０^ｈｉ）を特徴とする。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成される軽鎖を発現し、また、例えば、細胞約１．０×１０^６個、１．１×１０^６個、１．２×１０^６個、１．３×１０^６個、１．４×１０^６個、１．５×１０^６個、１．６×１０^６個、１．７×１０^６個、１．８×１０^６個、１．９×１０^６個、２．０×１０^６個、２．１×１０^６個、２．２×１０^６個、２．３×１０^６個、２．４×１０^６個、２．５×１０^６個、２．６×１０^６個、２．７×１０^６個、２．８×１０^６個、２．９×１０^６個、または２．０×１０^６個を含む、細胞約１×１０^６〜約３×１０^６個の範囲内の、骨髄中の総Ｂ細胞集団を有し、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．５９×１０^６個の、骨髄中の総Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．７５×１０^６個の、骨髄中の総Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．１３×１０^６個の、骨髄中の総Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．５５×１０^６個の、骨髄中の総Ｂ細胞集団を含む。本明細書に記載されている遺伝子改変マウスの骨髄中の例示的な総Ｂ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０および／またはその組合せの発現（例えば、ＣＤ１９^＋）を特徴とする。

一部の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリンＶκ／Ｊκ配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する遺伝子改変マウスであって、機能的な免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含み、また、Ｉｇλ^＋Ｂ細胞のＩｇκ^＋Ｂ細胞に対する比が約１〜約８、一部の実施形態では約１〜約５である脾臓Ｂ細胞集団を含む、マウスが提供される。一部の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリンＶκ／Ｊκ配列は、２つのヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントのうちの１つおよび１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成によって生成される。一部の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリンＶκ／Ｊκ配列は、ヒト免疫グロブリンＶκ１−３９遺伝子セグメント、およびＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびこれらの組合せから選択されるヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントの再構成によって生成される。一部の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリンＶκ／Ｊκ配列は、ヒト免疫グロブリンＶκ３−２０遺伝子セグメント、およびＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびこれらの組合せから選択されるヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントの再構成によって生成される。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約２．０×１０^６個、２．５×１０^６個、３．０×１０^６個、３．５×１０^６個、４．０×１０^６個、４．５×１０^６個、５．０×１０^６個、５．５×１０^６個、６．０×１０^６個、６．５×１０^６個、または７．０×１０^６個を含む、細胞約２×１０^６〜約７×１０^６個の範囲内のＣＤ１９^＋脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．７４×１０^６個のＣＤ１９^＋脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約４．３０×１０^６個のＣＤ１９^＋脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約５．５３×１０^６個のＣＤ１９^＋脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約６．１８×１０^６個のＣＤ１９^＋脾臓Ｂ細胞集団を含む。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約１．０×１０^６個、１．５×１０^６個、２．０×１０^６個、２．５×１０^６個、３．０×１０^６個、３．５×１０^６個、４．０×１０^６個を含む、細胞約１×１０^６〜約４×１０^６個の範囲内の、ＣＤ１９^＋、ＩｇＤ^ｈｉ、ＩｇＭ^ｌｏ脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約１．３０×１０^６個のＣＤ１９^＋、ＩｇＤ^ｈｉ、ＩｇＭ^ｌｏ脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．１３×１０^６個のＣＤ１９^＋、ＩｇＤ^ｈｉ、ＩｇＭ^ｌｏ脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．１５×１０^６個のＣＤ１９^＋、ＩｇＤ^ｈｉ、ＩｇＭ^ｌｏ脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．９３×１０^６個のＣＤ１９^＋、ＩｇＤ^ｈｉ、ＩｇＭ^ｌｏ脾臓Ｂ細胞集団を含む。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約９．０×１０^５個、９．２５×１０^５個、９．５×１０^５個、９．７５×１０^５個、１．０×１０^６個、１．２５×１０^６個、１．５０×１０^６個、１．７５×１０^６個、２．０×１０^６個を含む、細胞約９×１０^５〜約２×１０^６個の範囲内の、ＣＤ１９^＋、ＩｇＤ^ｌｏ、ＩｇＭ^ｈｉ脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約９．５２×１０^５個のＣＤ１９^＋、ＩｇＤ^ｌｏ、ＩｇＭ^ｈｉ脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．２３×１０^６個のＣＤ１９^＋、ＩｇＤ^ｌｏ、ＩｇＭ^ｈｉ脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４０×１０^６個のＣＤ１９^＋、ＩｇＤ^ｌｏ、ＩｇＭ^ｈｉ脾臓Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４２×１０^６個のＣＤ１９^＋、ＩｇＤ^ｌｏ、ＩｇＭ^ｈｉ脾臓Ｂ細胞集団を含む。

一部の実施形態では、２つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、免疫グロブリンκ軽鎖Ｖ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントの野生型相補体を含むマウスとほぼ同じである移行期（例えば、Ｔ１、Ｔ２およびＴ３）Ｂ細胞集団を含む末梢脾臓Ｂ細胞集団を含む、遺伝子改変マウスが提供される。本明細書に記載されている遺伝子改変マウスの脾臓中の例示的な移行期Ｂ細胞集団（例えば、Ｔ１、Ｔ２およびＴ３）は、ＩｇＭ、ＣＤ２３、ＣＤ９３、Ｂ２２０および／またはその組合せの発現を特徴とする。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約２．０×１０^６個、２．５×１０^６個、３．０×１０^６個、３．５×１０^６個、４．０×１０^６個、４．５×１０^６個、５．０×１０^６個、５．５×１０^６個、６．０×１０^６個、６．５×１０^６個、または７．０×１０^６個を含む、細胞約２×１０^６〜約７×１０^６個の範囲内の、脾臓中のＴ１Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３^＋、Ｂ２２０^＋、ＩｇＭ^ｈｉ、ＣＤ２３⁻）を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．１６×１０^６個の、脾臓中のＴ１Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．６３×１０^６個の、脾臓中のＴ１Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約３．９１×１０^６個の、脾臓中のＴ１Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約６．８３×１０^６個の、脾臓中のＴ１Ｂ細胞集団を含む。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約１．０×１０^６個、１．５×１０^６個、２．０×１０^６個、２．５×１０^６個、３．０×１０^６個、３．５×１０^６個、４．０×１０^６個、４．５×１０^６個、５．０×１０^６個、５．５×１０^６個、６．０×１０^６個、６．５×１０^６個、または７．０×１０^６個を含む、細胞約１×１０^６〜約７×１０^６個の範囲内の、脾臓中のＴ２Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３^＋、Ｂ２２０^＋、ＩｇＭ^ｈｉ、ＣＤ２３^＋）を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．３０×１０^６個の、脾臓中のＴ２Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．４６×１０^６個の、脾臓中のＴ２Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約３．２４×１０^６個の、脾臓中のＴ２Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約６．５２×１０^６個の、脾臓中のＴ２Ｂ細胞集団を含む。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約１．０×１０^６個、１．５×１０^６個、２．０×１０^６個、２．５×１０^６個、３．０×１０^６個、３．５×１０^６個、または４．０×１０^６個を含む、細胞約１×１０^６〜約４×１０^６個の範囲内の、脾臓中のＴ３Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３^＋、Ｂ２２０^＋、ＩｇＭ^ｌｏ、ＣＤ２３^＋）を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．０８×１０^６個の、脾臓中のＴ３Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．３５×１０^６個の、脾臓中のＴ３Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約３．３７×１０^６個の、脾臓中のＴ３Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．６３×１０^６個の、脾臓中のＴ１Ｂ細胞集団を含む。

一部の実施形態では、２つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメント、および１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメント、およびＪκ遺伝子セグメントの野生型相補体を含むマウスとほぼ同じである辺縁帯Ｂ細胞集団および辺縁帯前駆体Ｂ細胞集団を含む末梢脾臓Ｂ細胞集団を含む、遺伝子改変マウスが提供される。本明細書に記載されている遺伝子改変マウスの脾臓中の例示的な辺縁帯Ｂ細胞集団は、ＩｇＭ、ＣＤ２１／３５、ＣＤ２３、ＣＤ９３、Ｂ２２０および／またはその組合せの発現を特徴とする。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約１．０×１０^６個、１．５×１０^６個、２．０×１０^６個、２．５×１０^６個、または３．０×１０^６個を含む、細胞約１×１０^６〜約３×１０^６個の範囲内の、脾臓中の辺縁帯Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３⁻、Ｂ２２０^＋、ＩｇＭ^ｈｉ、ＣＤ２１／３５^ｈｉ、ＣＤ２３⁻）を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４７×１０^６個の、脾臓中の辺縁帯Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４９×１０^６個の、脾臓中の辺縁帯Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．２６×１０^６個の、脾臓中の辺縁帯Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．３３×１０^６個の、脾臓中の辺縁帯Ｂ細胞集団を含む。

一部の実施形態では、２つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメント、および１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメント、およびＪκ遺伝子セグメントの野生型相補体を含むマウスとほぼ同じである濾胞（例えば、ＦＯ−ＩおよびＦＯ−ＩＩ）Ｂ細胞集団（複数可）を含む末梢脾臓Ｂ細胞集団を含む、遺伝子改変マウスが提供される。本明細書に記載されている遺伝子改変マウスの脾臓中の例示的な濾胞Ｂ細胞集団（例えば、ＦＯ−ＩおよびＦＯ−ＩＩ）は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ２１／３５、ＣＤ９３、Ｂ２２０および／またはその組合せの発現を特徴とする。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞約３．０×１０^６個、３．５×１０^６個、４．０×１０^６個、４．５×１０^６個、５．０×１０^６個、５．５×１０^６個、６．０×１０^６個、６．５×１０^６個、７．０×１０^６個、７．５×１０^６個、８．０×１０^６個、８．５×１０^６個、９．０×１０^６個、９．５×１０^６個、１．０×１０^７個、または１．５×１０^７個を含む、細胞約３×１０^６〜約１．５×１０^７個の範囲内の、脾臓中の濾胞１型Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３⁻、Ｂ２２０^＋、ＣＤ２１／３５^ｉｎｔ、ＩｇＭ^ｌｏ、ＩｇＤ^ｈｉ）を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約３．５７×１０^６個の、脾臓中の濾胞１型Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約６．３１×１０^６個の、脾臓中の濾胞１型Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約９．４２×１０^６個の、脾臓中の濾胞１型Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．１４×１０^７個の、脾臓中の濾胞１型Ｂ細胞集団を含む。

一部の実施形態では、本発明のマウスは、例えば、細胞１．０×１０^６個、１．２５×１０^６個、１．５×１０^６個、１．７５×１０^６個、または２．０×１０^６個を含む、細胞約１×１０^６〜約２×１０^６個の範囲内の、脾臓中の濾胞２型Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３⁻、Ｂ２２０^＋、ＣＤ２１／３５^ｉｎｔ、ＩｇＭ^ｉｎｔ、ＩｇＤ^ｈｉ）を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．１４×１０^６個の、脾臓中の濾胞２型Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約１．４５×１０^６個の、脾臓中の濾胞２型Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、約１．８０×１０^６個の、脾臓中の濾胞２型Ｂ細胞集団を含み、一部の実施形態では、本発明のマウスは、細胞約２．０６×１０^６個の、脾臓中の濾胞２型Ｂ細胞集団を含む。

いくつかの他の様々な態様では、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変された非ヒト動物であって、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、非ヒト動物も本明細書において提供される。一実施形態では、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である。一実施形態では、非ヒト動物は、免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含まない。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、非ヒト軽鎖定常領域配列、例えば、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域配列、例えば、ラット配列またはマウス配列である。一実施形態では、動物は、免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない重鎖可変領域配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列、例えば、内在性非ヒト重鎖定常領域配列、例えば、ラット配列またはマウス配列である。一実施形態では、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域はＣκ領域である。一実施形態では、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドン（複数可）、例えば、３つまたは４つの非ヒスチジンコドン内にある。一実施形態では、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、例えば、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである。一実施形態では、動物は、齧歯類例えば、ラットまたはマウスである。一実施形態では、動物は、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列を含む抗体を発現し、抗体は、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの少なくとも１つのヒスチジンコドンによってコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持する。

一実施形態では、ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの限定されたレパートリー、例えば、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントの限定されたレパートリーを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変された非ヒト動物であって、ヒト軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーが、対応するヒト生殖細胞系列配列によってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、遺伝子改変された非ヒト動物も本明細書において提供される。一実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変された非ヒト動物であって、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、遺伝子改変された非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結する。一実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、Ｖκ遺伝子セグメント、およびＪκ遺伝子セグメントである。様々な実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である。一実施形態では、動物は、免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含まない。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、非ヒト免疫グロブリン定常領域配列、例えば、齧歯類配列、例えば、マウス配列またはラット配列である。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、内在性配列である。別の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、ヒト配列である。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、Ｃκ配列である。一実施形態では、非ヒト動物は、免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列、例えば、齧歯類配列、例えば、ラット配列またはマウス配列である。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列は、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である。一実施形態では、重鎖定常領域配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である。一実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、内在性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。

一実施形態では、本発明の非ヒト動物は、１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、５つのヒトＪκセグメント、例えば、ヒトＪκ１遺伝子セグメント、ヒトＪκ２遺伝子セグメント、ヒトＪκ３遺伝子セグメント、ヒトＪκ４遺伝子セグメント、およびヒトＪκ５遺伝子セグメントである。一実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである。一実施形態では、２つ以下のＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌセグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、または４つのコドン（例えば、３つまたは４つのコドン）の置換である。一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドン（複数可）においてである。２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである実施形態では、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々は、３つまたは４つのヒスチジンコドンの置換を含む。一実施形態では、３つまたは４つの置換は、ＣＤＲ３領域においてである。置換が、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換である一実施形態では、置換を、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。置換が、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換である別の実施形態では、置換を、１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。置換が、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換である別の実施形態では、置換を、１０５、１０６および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。置換がヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であるさらに別の実施形態では、置換を、１０５、１０６、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えば、マウスまたはラットである。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。一実施形態では、動物は、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つによってコードされるアミノ酸配列を含む抗体を発現し、抗体は、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントに導入された少なくとも１つのヒスチジンコドンによってコードされるアミノ酸位置において少なくとも１つのヒスチジン残基を保持する。一実施形態では、動物は抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、集団内の全ての抗体は、（ａ）２つ以下のＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のＪ_Ｌ遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、（ｂ）ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖とを含む。

一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、ｔ_１／２の短縮を示す抗体におけるこのような富化は、少なくとも約２倍である。

目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す抗体を生成する方法であって、本明細書に記載されている非ヒト動物、（例えば、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む非ヒト動物；例えば、ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの限定されたレパートリーを含む非ヒト動物；例えば、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物−ここで、前記動物の生殖細胞系列内に存在するヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む）を生成するステップと、前記動物を目的の抗原で免疫するステップと、中性ｐＨでは目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは目的の抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップとを含む方法も本明細書において提供される。

遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製する方法であって、（ａ）非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内在性免疫グロブリン軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、（ｂ）少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を、免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が免疫グロブリン定常領域配列に作動可能に連結されるように非ヒト動物のゲノムに配置するステップであって、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含むステップとを含む方法も本明細書において提供される。一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント（複数可）およびＪ_Ｌ遺伝子セグメント（複数可）は、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、内在性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。一実施形態では、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントであり、２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えば、マウスまたはラットである。一実施形態では、この方法は目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む非ヒト動物を結果としてもたらす。

一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域配列に作動可能に連結された、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座も本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒト可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーを含む非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、例えば、免疫グロブリン定常領域配列（例えば、非ヒト免疫グロブリン定常領域配列、例えば、ラット配列またはマウス配列）に作動可能に連結された、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む非ヒト遺伝子座であって、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、非ヒト遺伝子座も提供される。一実施形態では、遺伝子座は、５つのヒトＪκ遺伝子セグメント、例えば、Ｊκ１遺伝子セグメント、Ｊκ２遺伝子セグメント、Ｊκ３遺伝子セグメント、Ｊκ４遺伝子セグメント、およびＪκ５遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、ヒスチジン改変を有する２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０である。様々な実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト遺伝子座は、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための、本出願を通して記載されている方法を用いて生成することができる。したがって、少なくとも１つのＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む遺伝子改変された非ヒト動物、ヒト可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーを含む遺伝子改変された非ヒト動物、または、免疫グロブリン定常領域配列（例えば、非ヒト免疫グロブリン定常領域配列、例えば、ラット配列もしくはマウス配列）に作動可能に連結された２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つもしくは複数、例えば２つもしくはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、各ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法も提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された、少なくとも２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列であって、
該２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つが、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該少なくとも２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である、
組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目２）
各ヒトＶＬ遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目３）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、項目１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目４）
前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、項目３に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目５）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域がＣκ領域である、項目１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目６）
前記置換がＣＤＲ３コード配列内にある、項目２に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目７）
前記置換が３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換である、項目６に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目８）
２つ以下の、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む、項目１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目９）
前記２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目８に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１０）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目９に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１１）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目１０に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１２）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目１１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１３）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目１１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１４）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目１１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１５）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目１１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１６）
５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、該５つのヒトＪκ遺伝子セグメントが、Ｊκ１セグメント、Ｊκ２セグメント、Ｊκ３セグメント、Ｊκ４セグメント、およびＪκ５セグメントである、項目１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１７）
項目１から１６までのいずれか一項に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１８）
免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内在性ＶＬ遺伝子セグメントを含まない、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１９）
前記組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内にある、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２０）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、項目１９に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２１）
免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２２）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、項目２１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２３）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、項目２２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２４）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、項目２２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２５）
齧歯類である、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２６）
前記齧歯類が、ラットまたはマウスである、項目２５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２７）
前記齧歯類が、マウスである、項目２６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２８）
、前記少なくとも２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つによってコードされるアミノ酸配列を含む抗体を発現し、該抗体が、該ヒトＶＬ遺伝子セグメントの少なくとも１つの前記ヒスチジンコドンによってコードされるアミノ酸位置において少なくとも１つのヒスチジン残基を保持する、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２９）
抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、該集団内の全ての抗体が、
前記少なくとも２つのＶＬ遺伝子セグメント、および前記１つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、
ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖とを含む、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３０）
目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３１）
ｔ１／２の短縮を示す抗体の富化が少なくとも約２倍である、項目３０に記載の動物。
（項目３２）
目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す抗体を生成する方法であって、
項目１７〜３１のいずれか一項に記載の動物を目的の抗原で免疫するステップと、
中性ｐＨでは、該目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、該目的の抗原への結合の低減を提示するＢ細胞または結合タンパク質を選択するステップと
を含む方法。
（項目３３）
遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製する方法であって、
該非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内在性免疫グロブリン軽鎖ＶＬ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、
少なくとも２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を、免疫グロブリン定常領域配列に作動可能に連結されるように該非ヒト動物の該ゲノムに配置するステップであって、
各ヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つが、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、該少なくとも２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能であるステップと
を含む方法。
（項目３４）
目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む前記非ヒト動物を結果としてもたらす、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、前記内在性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内にある、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記動物が、齧歯類である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
前記２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、該５つのヒトＪκ遺伝子セグメントがＪκ１セグメント、Ｊκ２セグメント、Ｊκ３セグメント、Ｊκ４セグメント、およびＪκ５セグメントである、項目３３に記載の方法。
（項目４７）
項目１から１６までのいずれか一項に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列をそのゲノム内に含む、単離された細胞。
（項目４８）
免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内在性ＶＬ遺伝子セグメントを含まない、項目４７に記載の単離された細胞。
（項目４９）
前記組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内にある、項目４７に記載の単離された細胞。
（項目５０）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、項目４９に記載の単離された細胞。
（項目５１）
免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をそのゲノム内にさらに含む、項目４７に記載の単離された細胞。
（項目５２）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、項目５１に記載の単離された細胞。
（項目５３）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、項目５２に記載の単離された細胞。
（項目５４）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、項目５２に記載の単離された細胞。
（項目５５）
齧歯類細胞である、項目４７に記載の単離された細胞。
（項目５６）
前記齧歯類が、ラットまたはマウスである、項目５５に記載の単離された細胞。
（項目５７）
前記齧歯類が、マウスである、項目５５に記載の単離された細胞。
（項目５８）
項目１７から３１までのいずれか一項に記載の非ヒト動物に由来する細胞または組織。
（項目５９）
胚性幹細胞またはＢ細胞である、項目５８に記載の細胞。
（項目６０）
項目３３から４６までのいずれか一項に従って作製された非ヒト動物に由来する細胞または組織。
（項目６１）
胚性幹細胞またはＢ細胞である、項目６０に記載の細胞。
（項目６２）
５’側マウス相同性アーム、少なくとも２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントを含むヒト可変領域核酸配列、ならびに３’側マウス相同性アームを含むターゲッティングベクターであって、
該２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つが、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該少なくとも２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能であり、
再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントの各々が、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列およびヒトプロモーターまたはマウスプロモーターに作動可能に連結されており、
該相同性アームにより、該ベクターが、内在性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に向かい、それにより該ヒト可変領域核酸配列が、内在性マウス軽鎖定常領域配列に作動可能に連結される、
ターゲッティングベクター。
（項目６３）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域がＣκ領域である、項目６２に記載のターゲッティングベクター。
（項目６４）
各ヒトＶＬ遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目６２に記載のターゲッティングベクター。
（項目６５）
前記置換がＣＤＲ３コード配列内にある、項目６２に記載のターゲッティングベクター。
（項目６６）
前記置換が３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換である、項目６４に記載のターゲッティングベクター。
（項目６７）
２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む、項目６１に記載のターゲッティングベクター。
（項目６８）
２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目６７に記載のターゲッティングベクター。
（項目６９）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目６８に記載のターゲッティングベクター。
（項目７０）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目６９に記載のターゲッティングベクター。
（項目７１）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目７０に記載のターゲッティングベクター。
（項目７２）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目７０に記載のターゲッティングベクター。
（項目７３）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目７０に記載のターゲッティングベクター。
（項目７４）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目７０に記載のターゲッティングベクター。
（項目７５）
５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、該５つのヒトＪκ遺伝子セグメントが、Ｊκ１セグメント、Ｊκ２セグメント、Ｊκ３セグメント、Ｊκ４セグメント、およびＪκ５セグメントである、項目６２に記載のターゲッティングベクター。
（項目７６）
項目３２に記載の方法に従って生成される、目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す結合タンパク質。
（項目７７）
項目７６に記載の結合タンパク質の免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
（項目７８）
項目７７に記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目７９）
項目３２に記載の方法に従って生成される、目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示すＢ細胞。
（項目８０）
目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す結合タンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）第一の抗体の重鎖可変ドメインを含む第一の免疫グロブリン重鎖であって、該第一の抗体が、
（ａ）中性ｐＨで該目的の抗原に所望の親和性で結合し、
（ｂ）再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である、少なくとも２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変された非ヒト動物において生成され、
（ｃ）該少なくとも２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つのヒトＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つによってコードされる軽鎖成分を含む、
第一の免疫グロブリン重鎖
（ｉｉ）
（ａ）該第一の抗体の該軽鎖成分をコードする該少なくとも２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つのＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つに由来し、
（ｂ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変されている、
免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖
を細胞で共発現させるステップと、
中性ｐＨでは該目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性ｐＨでは該目的の抗原に対する結合の低減を提示する、該第一の免疫グロブリン重鎖および該免疫グロブリン軽鎖を含む該細胞において発現する結合タンパク質を選択するステップと
を含む方法。
（項目８１）
前記組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列が、２つ以下の、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記結合タンパク質が、完全ヒト重鎖および完全ヒト軽鎖を含む、項目８０に記載の方法。
（項目８４）
前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列が、前記生殖細胞系列核酸配列によってコードされない体細胞変異をコードする少なくとも１つのコドンをさらに含む、項目８０に記載の方法。
（項目８５）
前記結合タンパク質が、第一の完全ヒト免疫グロブリン重鎖および完全ヒト免疫グロブリン軽鎖を含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
項目８０に記載の方法に従って生成される、目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す結合タンパク質。
（項目８７）
目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す結合タンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）中性ｐＨで第一の目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体の第一の重鎖可変ドメインを含む第一の免疫グロブリン重鎖、
（ｉｉ）中性ｐＨで第二の目的の抗原に所望の親和性で結合する第二の抗体の第二の重鎖可変ドメインを含む第二の免疫グロブリン重鎖であって、
該第一の抗体および第二の抗体が、
（ａ）再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である、少なくとも２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変された非ヒト動物において生成され、
（ｂ）該少なくとも２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つのヒトＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つによってコードされる同じ軽鎖成分を含む、
第一の免疫グロブリン重鎖および第二の免疫グロブリン重鎖、
（ｉｉｉ）
（ａ）該第一の抗体および第二の抗体の該軽鎖成分をコードする該少なくとも２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つのＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つに由来し、
（ｂ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変されている、
免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖
を細胞で共発現させるステップと、
該第一の免疫グロブリン重鎖、該第二の免疫グロブリン重鎖および該免疫グロブリン軽鎖を含む該細胞において発現する結合タンパク質であって、該抗原（複数可）に対する所望の親和性およびｐＨ依存性抗原特性を保持する結合タンパク質を選択するステップと
を含む方法。
（項目８８）
前記組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列が、２つ以下の、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記結合タンパク質が、完全ヒト重鎖および完全ヒト軽鎖を含む、項目８７に記載の方法。
（項目９１）
前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列が、前記生殖細胞系列核酸配列によってコードされない体細胞変異をコードする少なくとも１つのコドンをさらに含む、項目８７に記載の方法。
（項目９２）
前記結合タンパク質が、第一の完全ヒト免疫グロブリン重鎖および完全ヒト免疫グロブリン軽鎖を含む、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
項目８７に記載の方法に従って生成される、目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す結合タンパク質。

本明細書に記載される実施形態および態様のいずれも、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、互いに一緒に用いることができる。他の実施形態は、後に続く記載の概観から当業者にとって明らかになる。

図１は、様々な抗原特異的抗体（Ａ〜Ｋ抗体、それぞれ、配列番号１３６〜１４６に対応する）からのヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のアミノ酸アラインメントを例示する。各軽鎖配列内に位置するヒスチジン（Ｈ）残基は、太字とする。様々な軽鎖領域（フレームワークおよびＣＤＲ）を、アラインメントの上方に表示する。

図２は、ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のＣＤＲ３領域内で、変異誘発により操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ヒスチジン残基の組合せおよび位置を例示する。対応する核酸配列を含める。変異誘発を介して導入されたヒスチジン残基および対応する核酸残基を太字で示す。アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev. Comp. Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されており、また、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）のウェブサイト上でも調べることができる、固有の番号付けに基づく。

図３は、５つの（１〜５の）異なる重鎖およびＣＤＲ３内の表示される位置（Ｘ軸を参照されたい）に操作したヒスチジン残基を有するＶκ１−３９に由来する軽鎖をコードする核酸をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上清中で検出される、ｎｇ／ｍＬ単位の抗体発現レベルを例示する。

図４は、ＣＨＯ細胞上清中の、ヒスチジン操作した軽鎖を含有する選択された抗原特異的ヒト抗体の発現を示すウェスタンブロットである。

図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。

図６は、表示される重鎖（２、３、および６）と対合させた、親のユニバーサル軽鎖またはヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖を含む抗体についての動力学的パラメータ（Ｋ_Ｄおよびｔ_１／２）を示す。ヒスチジン置換は、複数の抗体において強力なｐＨ依存性をもたらす。ＣＤＲ３内でヒスチジン置換を施して、配列_１０５ＱＱＳＹＳＴＰ_１１１（配列番号３）をカッコ内のヒスチジン改変ＣＤＲ３配列へと転換した。ＮＢ＝結合が検出されない（ＫＤ＞１０マイクロモル濃度）ことに注意されたい。

図７は、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ５軽鎖配列のＣＤＲ３へと操作するのに用いられる、選択された変異誘発プライマーの配列および特性（ＧＣ含量％、Ｎ、ミスマッチ％、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーの配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。

図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

図９は、二回目の採血における、ヒスチジンユニバーサル軽鎖（ＨＵＬＣ）についてヘテロ接合性のマウス（４カ所のＨｉｓ置換を有するマウス（ＨＵＬＣ１９２７マウス）；３カ所のＨｉｓ置換を有するマウス（ＨＵＬＣ１９３０マウス））および野生型動物からの、免疫原に対する抗血清力価を示す。

図１０は、ヘテロ接合性ＨＵＬＣ（１９２７対１９３０）マウスおよびＷＴマウスからのハイブリドーマ融合体から得られる、全抗原陽性クローンの数と、ｐＨ感受性抗原結合を提示する抗原陽性クローンの数との比較である。図は、各マウス種類（「マウス１」および「マウス２」）につき２匹ずつのマウスについてのデータを含む。

図１１Ａ〜１１Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ_１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表４を参照されたい）。図１１Ａ〜１１Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ_１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表４を参照されたい）。図１１Ａ〜１１Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ_１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表４を参照されたい）。

図１２は、ヒトＶκ３−２０に由来する軽鎖のＣＤＲ３領域内で、変異誘発により操作したヒスチジン残基の位置を示す。変異誘発を介して導入されたヒスチジン残基および対応する例示的な核酸残基を太字で示す。アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev. Comp. Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されている固有の番号付けに基づいており、また、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）のウェブサイト上でも調べることができる。

図１３は、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊκ１軽鎖配列のＣＤＲ３へと操作するのに用いられる、選択された変異誘発プライマーの配列および特性（ＧＣ含量％、Ｎ、ミスマッチ％、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーの配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。

図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

図１５は、マウスにおける免疫グロブリンκ軽鎖対立遺伝子のＶ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントの組換え、ならびに再構成前の軽鎖遺伝子座の構造（上）および再構成後の軽鎖遺伝子座の構造（下）の一般的な図解である。ここで示した再構成は、いくつかの可能性のある再構成事象のうちの１つにすぎない。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。

図１６Ａは、２つのユニバーサル軽鎖遺伝子座の概略図であり、一方は再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ５可変領域配列を含み（上）、もう一方は再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域配列を含む（下）。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特段示されない限り、塗りつぶされた描形はマウス配列を表し、白抜きの描形はヒト配列を表す。図１６Ｂは、２つの遺伝子改変された二重軽鎖（ｄｕａｌｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ）（ＤＬＣ）遺伝子座の例を示す。上の遺伝子座（ＤＬＣ−５Ｊ）は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する操作したヒトＤＮＡ断片を含有する。下の遺伝子座（ＤＬＣ−１Ｊ）は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する操作したヒトＤＮＡ断片を含有する。各遺伝子座は、再構成して内在性軽鎖定常領域（例えば、Ｃκ）に作動可能に連結されたヒトＶκ領域を形成することが可能である。全て上流（５’側）にＦｒｔ組換え部位を含有するネオマイシンカセットが隣接する、免疫グロブリンプロモーター（Ｐ、遺伝子座の上の白抜きの矢印）、リーダーエクソン（Ｌ、短い白抜きの矢印）および２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（長い白抜きの矢印）を示す。ヒト遺伝子セグメント（ＶκおよびＪκ）の各々を用いて操作した組換えシグナル配列を各遺伝子セグメントと並置した白抜きの楕円によって示す。ＤＬＣ−５Ｊ遺伝子座は、５つのＪκ遺伝子セグメントの各々と並置したＲＳＳを含有する。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。

図１７Ａ〜１７Ｃは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５）、ならびにマウスエンハンサーおよびＩｇκＣアームを含む免疫グロブリンカッパ遺伝子座を操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１７Ｄが、このターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１７Ｅは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。図１７Ａ〜１７Ｃは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５）、ならびにマウスエンハンサーおよびＩｇκＣアームを含む免疫グロブリンカッパ遺伝子座を操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１７Ｄが、このターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１７Ｅは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。図１７Ａ〜１７Ｃは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５）、ならびにマウスエンハンサーおよびＩｇκＣアームを含む免疫グロブリンカッパ遺伝子座を操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１７Ｄが、このターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１７Ｅは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。図１７Ａ〜１７Ｃは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５）、ならびにマウスエンハンサーおよびＩｇκＣアームを含む免疫グロブリンカッパ遺伝子座を操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１７Ｄが、このターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１７Ｅは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。図１７Ａ〜１７Ｃは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５）、ならびにマウスエンハンサーおよびＩｇκＣアームを含む免疫グロブリンカッパ遺伝子座を操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１７Ｄが、このターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１７Ｅは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。

図１８Ａ〜１８Ｄは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および１つのヒトＪκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の操作された部分のヌクレオチド配列（配列番号８２）を示す。ヌクレオチド配列は操作されたヒト配列にわたり、５’側末端と３’側末端の両方において約１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図１８Ｄの下は、様々な配列を示すために用いられる異なるフォントの説明である。図１８Ａ〜１８Ｄは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および１つのヒトＪκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の操作された部分のヌクレオチド配列（配列番号８２）を示す。ヌクレオチド配列は操作されたヒト配列にわたり、５’側末端と３’側末端の両方において約１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図１８Ｄの下は、様々な配列を示すために用いられる異なるフォントの説明である。図１８Ａ〜１８Ｄは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および１つのヒトＪκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の操作された部分のヌクレオチド配列（配列番号８２）を示す。ヌクレオチド配列は操作されたヒト配列にわたり、５’側末端と３’側末端の両方において約１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図１８Ｄの下は、様々な配列を示すために用いられる異なるフォントの説明である。図１８Ａ〜１８Ｄは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および１つのヒトＪκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の操作された部分のヌクレオチド配列（配列番号８２）を示す。ヌクレオチド配列は操作されたヒト配列にわたり、５’側末端と３’側末端の両方において約１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図１８Ｄの下は、様々な配列を示すために用いられる異なるフォントの説明である。

図１９Ａ〜１９Ｂは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および５つのヒトＪκセグメント、ならびにマウスエンハンサーおよびＩｇκＣアームを含む免疫グロブリンカッパ遺伝子座を操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１９Ｃが、このターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１９Ｄは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。図１９Ａ〜１９Ｂは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および５つのヒトＪκセグメント、ならびにマウスエンハンサーおよびＩｇκＣアームを含む免疫グロブリンカッパ遺伝子座を操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１９Ｃが、このターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１９Ｄは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。図１９Ａ〜１９Ｂは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および５つのヒトＪκセグメント、ならびにマウスエンハンサーおよびＩｇκＣアームを含む免疫グロブリンカッパ遺伝子座を操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１９Ｃが、このターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１９Ｄは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。図１９Ａ〜１９Ｂは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および５つのヒトＪκセグメント、ならびにマウスエンハンサーおよびＩｇκＣアームを含む免疫グロブリンカッパ遺伝子座を操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１９Ｃが、このターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１９Ｄは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。

図２０Ａ〜２０Ｄは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および５つのヒトＪκセグメントを含む、操作した免疫グロブリンκ遺伝子座のヌクレオチド配列（配列番号８３）を示す。ヌクレオチド配列は、操作した配列ならびに５’側末端および３’側末端の両方における約１００塩基対の内在性マウス配列にわたる。図２０Ｄの下は、様々な配列を示すために用いられる異なるフォントの説明である。図２０Ａ〜２０Ｄは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および５つのヒトＪκセグメントを含む、操作した免疫グロブリンκ遺伝子座のヌクレオチド配列（配列番号８３）を示す。ヌクレオチド配列は、操作した配列ならびに５’側末端および３’側末端の両方における約１００塩基対の内在性マウス配列にわたる。図２０Ｄの下は、様々な配列を示すために用いられる異なるフォントの説明である。図２０Ａ〜２０Ｄは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および５つのヒトＪκセグメントを含む、操作した免疫グロブリンκ遺伝子座のヌクレオチド配列（配列番号８３）を示す。ヌクレオチド配列は、操作した配列ならびに５’側末端および３’側末端の両方における約１００塩基対の内在性マウス配列にわたる。図２０Ｄの下は、様々な配列を示すために用いられる異なるフォントの説明である。図２０Ａ〜２０Ｄは、２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９およびｈＶκ３−２０）および５つのヒトＪκセグメントを含む、操作した免疫グロブリンκ遺伝子座のヌクレオチド配列（配列番号８３）を示す。ヌクレオチド配列は、操作した配列ならびに５’側末端および３’側末端の両方における約１００塩基対の内在性マウス配列にわたる。図２０Ｄの下は、様々な配列を示すために用いられる異なるフォントの説明である。

図２１Ａの上のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、Ｂ細胞およびＴ細胞について染色した骨髄（それぞれＣＤ１９^＋およびＣＤ３^＋）の代表的な等高線図を示す。下のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、ＣＤ１９^＋に対してゲートをかけ、ｃｋｉｔ^＋およびＣＤ４３^＋について染色した骨髄の代表的な等高線図を示す。プロＢ細胞およびプレＢ細胞を下のパネルの等高線図上に示す。

図２１Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の大腿骨から採取した骨髄中のプロＢ細胞（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３^＋ｃｋｉｔ^＋）およびプレＢ細胞（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３⁻ｃｋｉｔ⁻）の数を示す。

図２２Ａは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）およびＢ２２０について染色したシングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）に対してゲートをかけた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞およびプロ／プレＢ細胞を等高線図の各々に示す。

図２２Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の大腿骨から単離した骨髄中のＢ細胞（ＣＤ１９^＋）、未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋）および成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｈｉＩｇＭ^＋）の総数を示す。

図２３Ａは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）およびＢ２２０について染色したシングレットに対してゲートをかけた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞およびプロ／プレＢ細胞を等高線図の各々に示す。

図２３Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の大腿骨から単離した、Ｉｇλ発現およびＩｇκ発現について染色した未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋）および成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０^ｈｉＩｇＭ^＋）に対してゲートをかけた骨髄の代表的な等高線図を示す。

図２４Ａの上のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、シングレットに対してゲートをかけ、Ｂ細胞およびＴ細胞（それぞれＣＤ１９^＋およびＣＤ３^＋）について染色した脾細胞の代表的な等高線図を示す。下のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、ＣＤ１９^＋に対してゲートをかけ、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）について染色した脾細胞の代表的な等高線図を示す。成熟Ｂ細胞（ＷＴについては５４、ＤＬＣ−５Ｊについては５６．９）および移行期Ｂ細胞（ＷＴについては２３．６、ＤＬＣ−５Ｊについては２５．６）を等高線図の各々に示す。

図２４Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）から採取した脾臓中のＣＤ１９^＋Ｂ細胞、移行期Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｈｉＩｇＤ^ｌｏ）および成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｌｏＩｇＤ^ｈｉ）の総数を示す。

図２５Ａは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）由来の、ＣＤ１９^＋に対してゲートをかけたＩｇλ^＋脾細胞およびＩｇκ^＋脾細胞の代表的な等高線図を示す。

図２５Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）から採取した脾臓中のＢ細胞（ＣＤ１９^＋）、Ｉｇκ^＋Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋Ｉｇκ^＋）およびＩｇλ^＋Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋Ｉｇλ^＋）の総数を示す。

図２６Ａは、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウスにおける末梢Ｂ細胞への発生を示す。第一の（左端）等高線図は、未熟Ｂ細胞（３９．６）および成熟Ｂ細胞（５７．８）を示す、ＣＤ１９^＋に対してゲートをかけたＣＤ９３^＋およびＢ２２０^＋脾細胞を示す。第二の（中央上）等高線図は、Ｔ１Ｂ細胞集団（３３．７；ＩｇＤ⁻ＩｇＭ^＋ＣＤ２１^ｌｏＣＤ２３⁻）、Ｔ２Ｂ細胞集団（２１．２；ＩｇＤ^ｈｉＩｇＭ^ｈｉＣＤ２１^ｍｉｄＣＤ２３^＋）およびＴ３Ｂ細胞集団（２９．１）を示す、未熟Ｂ細胞におけるＩｇＭ^＋発現およびＣＤ２３^＋発現を示す。第三の（中央下）等高線図は、辺縁帯Ｂ細胞を生じる小集団（１４．８）および濾胞（ＦＯ）Ｂ細胞を生じる第二の集団（７０．５）を示す、成熟Ｂ細胞のＣＤ２１^＋（ＣＤ３５^＋）発現およびＩｇＭ^＋発現を示す。第四の（右上）等高線図は、辺縁帯Ｂ細胞集団（９０．５；ＭＺ）および辺縁帯前駆体Ｂ細胞集団（７．３；ＩｇＭ^ｈｉＩｇＤ^ｈｉＣＤ２１^ｈｉＣＤ２３^＋）を示す、成熟Ｂ細胞におけるＢ２２０^＋発現およびＣＤ２３^＋発現を示す。第五の（右下）等高線図は、ＦＯ−ＩＢ細胞集団（７９．０；ＩｇＤ^ｈｉＩｇＭ^ｌｏＣＤ２１^ｍｉｄＣＤ２３^＋）およびＦＯ−ＩＩＢ細胞集団（１５．１；ＩｇＤ^ｈｉＩｇＭ^ｈｉＣＤ２１^ｍｉｄＣＤ２３^＋）を示す、成熟Ｂ細胞におけるＩｇＤ^＋発現およびＩｇＭ^＋発現を示す。各ゲートをかけた領域内の細胞の百分率を示す。

図２６Ｂは、野生型マウスにおける末梢Ｂ細胞への発生を示す。第一の（左端）等高線図は、未熟Ｂ細胞（３１．１）および成熟Ｂ細胞（６４．４）を示す、ＣＤ１９^＋に対してゲートをかけたＣＤ９３^＋およびＢ２２０^＋脾細胞を示す。第二の（中央上）等高線図は、Ｔ１Ｂ細胞集団（２８．５；ＩｇＤ⁻ＩｇＭ^＋ＣＤ２１^ｌｏＣＤ２３⁻）、Ｔ２Ｂ細胞集団（２８．７；ＩｇＤ^ｈｉＩｇＭ^ｈｉＣＤ２１^ｍｉｄＣＤ２３^＋）およびＴ３Ｂ細胞集団（３０．７）を示す、未熟Ｂ細胞におけるＩｇＭ^＋発現およびＣＤ２３^＋発現を示す。第三の（中央下）等高線図は、辺縁帯Ｂ細胞を生じる小集団（７．６９）および濾胞（ＦＯ）Ｂ細胞を生じる第二の集団（７８．５）を示す、成熟Ｂ細胞のＣＤ２１^＋（ＣＤ３５^＋）発現およびＩｇＭ^＋発現を示す。第四の（右上）等高線図は、辺縁帯Ｂ細胞集団（７９．９；ＭＺ）および辺縁帯前駆体Ｂ細胞集団（１９．４；ＩｇＭ^ｈｉＩｇＤ^ｈｉＣＤ２１^ｈｉＣＤ２３^＋）を示す、成熟Ｂ細胞におけるＢ２２０^＋発現およびＣＤ２３^＋発現を示す。第五の（右下）等高線図は、ＦＯ−ＩＢ細胞集団（８３．６；ＩｇＤ^ｈｉＩｇＭ^ｌｏＣＤ２１^ｍｉｄＣＤ２３^＋）およびＦＯ−ＩＩＢ細胞集団（１３．１；ＩｇＤ^ｈｉＩｇＭ^ｈｉＣＤ２１^ｍｉｄＣＤ２３^＋）を示す、成熟Ｂ細胞におけるＩｇＤ^＋発現およびＩｇＭ^＋発現を示す。各ゲートをかけた領域内の細胞の百分率を示す。

図２７は、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の採取した脾臓中の移行期Ｂ細胞集団、辺縁帯Ｂ細胞集団および濾胞Ｂ細胞集団の総数を示す。

図２８は、内在性Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントのヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメント（Ｈκ）（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）マウスのヒト軽鎖）による置きかえについてホモ接合性のマウス、野生型マウス（ＷＴ）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）、ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−１Ｊ）における、Ｖκ３−２０遺伝子セグメントまたはＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブを使用した定量的ＰＣＲアッセイにおけるＶκ３−２０由来軽鎖およびＶκ１−３９由来軽鎖の骨髄（ｙ軸）における相対ｍＲＮＡ発現を示す。シグナルをマウスＣκの発現に対して正規化する。ＮＤ：検出されず。

図２９は、内在性Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントのヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメント（Ｈκ）（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）マウスのヒト軽鎖）による置きかえについてホモ接合性のマウス、野生型マウス（ＷＴ）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）、ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−１Ｊ）における、Ｖκ３−２０遺伝子セグメントまたはＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブを使用した定量的ＰＣＲアッセイにおけるＶκ３−２０由来軽鎖およびＶκ１−３９由来軽鎖の脾臓全体（ｙ軸）における相対ｍＲＮＡ発現を示す。シグナルをマウスＣκの発現に対して正規化する。ＮＤ：検出されず。

図３０は、４つのヒスチジン残基をヒトＶκ１−３９軽鎖配列およびヒトＶκ３−２０軽鎖配列のＣＤＲ３’に操作するために用いられる、選択された変異誘発プライマーの配列および特性（％ＧＣ含量、Ｎ、％ミスマッチ、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーについての配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。

図３１Ａは、それぞれが４つのヒスチジン残基（＊＊＊＊）で置換された２つのヒトＶκ軽鎖セグメントおよび５つのヒトＪκを含むターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図３１Ｂは、ＦＬＰｏ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。図３１Ａは、それぞれが４つのヒスチジン残基（＊＊＊＊）で置換された２つのヒトＶκ軽鎖セグメントおよび５つのヒトＪκを含むターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図３１Ｂは、ＦＬＰｏ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。

図３２は、３つのヒスチジン残基をヒトＶκ１−３９軽鎖配列およびヒトＶκ３−２０軽鎖配列のＣＤＲ３’に操作するために用いられる、選択された変異誘発プライマーの配列および特性（％ＧＣ含量、Ｎ、％ミスマッチ、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーについての配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。

図３３Ａは、それぞれが３つのヒスチジン残基（＊＊＊）で置換された２つのヒトＶκ軽鎖セグメントおよび５つのヒトＪκを含むターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図３３Ｂは、ＦＬＰｏ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。図３３Ａは、それぞれが３つのヒスチジン残基（＊＊＊）で置換された２つのヒトＶκ軽鎖セグメントおよび５つのヒトＪκを含むターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図３３Ｂは、ＦＬＰｏ酵素を使用したＥＳ細胞における選択カセットの欠失を示す。大多数の実施形態では、特段示されない限り、塗りつぶされた描形および実線はマウス配列を表し、白抜きの描形および二重線はヒト配列を表す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。

図３４Ａは、ヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０配列によってコードされるアミノ酸配列（下の配列）と、各々がＣＤＲ３配列において３つのヒスチジン残基で置換された２つのＶカッパセグメント（Ｖκ３−２０およびＶκ１−３９）を含むマウスにおいて発現した例示的なＩｇＭカッパ軽鎖可変配列のアミノ酸翻訳（上の配列）とのアラインメントを示す。アラインメントは、生殖細胞系列配列に導入された３つのヒスチジン置換の全てを保持するマウスにおいて発現したＩｇＭカッパ鎖可変配列を示す。図３４Ｂは、ヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９配列によってコードされるアミノ酸配列（各アラインメントにおける下の配列）と、各々がＣＤＲ３配列において３つのヒスチジン残基で置換された２つのＶカッパセグメント（Ｖκ３−２０およびＶκ１−３９）を含むマウスにおいて発現した例示的なＩｇＭカッパ軽鎖可変配列のアミノ酸翻訳（各アラインメントにおける上の配列）とのアラインメントを示す。上のアラインメントは、生殖細胞系列配列に導入された３つのヒスチジン改変の全てを保持するマウスにおいて発現したＩｇＭカッパ鎖可変配列を示し、下のアラインメントは、生殖細胞系列配列に導入された３つのヒスチジン改変のうちの２つを保持するマウスにおいて発現したＩｇＭカッパ鎖可変配列を示す。一部の実施形態では、Ｖκの最後の位置に導入されたヒスチジンはＶ−Ｊ再構成の間に失われ得る。

発明の詳細な説明
定義
本発明は、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒト抗体分子をコードするヌクレオチド配列（複数可）、例えば、ｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体をコードする、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列、例えば、ｐＨ依存性抗原結合、例えば、再構成されてｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体をコードする限定されたレパートリーのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列、をそれらのゲノム内、例えば、それらの生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）；これと同じ免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列を含む胚、細胞、および組織；これらを作製する方法；ならびにこれらを用いる方法を提供する。別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語および語句は、反対が明らかに示されるか、その用語または語句が用いられる文脈から明らかに明白でない限り、その用語および語句が当技術分野で獲得した意味を含む。

本明細書で用いる用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続する４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメインおよび重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存されている領域の間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略すことができ；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略すことができる）。用語「高親和性」抗体は、その標的エピトープに関して約１０^−９Ｍ以下のＫ_Ｄ（例えば、約１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍまたは約１×１０^−１２Ｍ）を有する抗体を指す。一実施形態では、Ｋ_Ｄは表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭによって測定され、別の実施形態では、Ｋ_ＤはＥＬＩＳＡによって測定される。

語句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は、２つの同一ではない重鎖を一般に含み、各重鎖は、２つの異なる分子上（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）または同じ分子上（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）の異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）に選択的に結合することが可能な場合、第一のエピトープに対する第一の重鎖の親和性は、第二のエピトープに対する第一の重鎖の親和性より少なくとも１桁から２桁、または３桁または４桁またはそれ超、一般に低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体が特異的に結合するエピトープは、同じか異なる標的の上（例えば、同じか異なるタンパク質の上）にあってよい。例示的な二重特異性抗体は、腫瘍抗原に対して特異的な第一の重鎖、および細胞傷害性マーカー、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩなど）またはＴ細胞のマーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を含む。さらに、第二の重鎖可変ドメインは、異なる所望の特異性を有する重鎖可変ドメインで置換することができる。例えば、毒素（例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を腫瘍細胞へと送達するように、腫瘍抗原に対して特異的な第一の重鎖および毒素に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を対合させることができる。他の例示的な二重特異性抗体は、活性化受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃαＲＩ、Ｔ細胞受容体など）に対して特異的な第一の重鎖および阻害性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａなど）に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を含む。細胞の活性化（例えば、アレルギーおよび喘息）と関連する治療条件のためには、このような二重特異性抗体を構築することができる。二重特異性抗体は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作ることができる。例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同じか異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合させることができ、そのような配列は免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる。一般的な二重特異性抗体は、各々３つの重鎖ＣＤＲと、続く（Ｎ末端からＣ末端にかけて）Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを有する２つの重鎖、ならびに、エピトープ結合特異性を付与しないが各重鎖と会合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ重鎖エピトープ結合領域が結合するエピトープの１つもしくは複数に結合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ一方もしくは両方のエピトープへの重鎖の一方もしくは両方の結合を可能にすることができる免疫グロブリン軽鎖を有する。同様に、用語「三重特異性抗体」（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ）は、３つ以上のエピトープに選択的に結合できる抗体を包含する。

用語「細胞」には、組換え核酸配列を発現させるのに適する任意の細胞が含まれる。細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．など）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合体、例えばハイブリドーマもしくはクアドローマが含まれる。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ細胞））。

語句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」には、通常（すなわち、野生型動物で）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域の２つのフレームワーク領域の間に現れる、生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系列配列または再構成されたか再構成されていない配列がコードすることができ、例えば、ナイーヴであるか成熟したＢ細胞またはＴ細胞がコードすることができる。ＣＤＲは体細胞変異してもよく（例えば、動物の生殖細胞系列でコードされている配列と異なる）、ヒト化、および／またはアミノ酸の置換、付加もしくは欠失で改変されてもよい。一部の状況（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）であって、（例えば、再構成されていない核酸配列において）不連続であるが、例えば、配列のスプライシングまたは接続の結果として（例えば、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えによって重鎖ＣＤＲ３を形成する）Ｂ細胞核酸配列において連続している、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）によってコードされてもよい。

保存的なアミノ酸置換を記載するために用いられる場合、用語「保存的」には、類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が含まれる。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能特性、例えば標的エピトープに所望の親和性で特異的に結合する可変領域の能力を実質的に変えない。類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリンおよびトレオニンなどの脂肪族ヒドロキシル側鎖；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミドを含む側鎖；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなどの芳香族の側鎖；リシン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖；ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄を含む側鎖が含まれる。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。一部の実施形態では、例えばアラニンスキャニング変異誘発で用いられるように、保存的アミノ酸置換は、アラニンによるタンパク質の任意の天然の残基の置換であってよい。一部の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔら（１９９２年）ＥｘｈａｕｓｔｉｖｅＭａｔｃｈｉｎｇｏｆｔｈｅＥｎｔｉｒｅＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６巻：１４４３〜４５頁に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を有する保存的置換がもたらされる。一部の実施形態では、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで置換が負ではない値を有するような適度に保存的な置換である。

一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖での残基位置は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能的断片（例えば、Ｂ細胞などからの発現および分泌を可能にする断片）における残基位置は、アミノ酸配列が本明細書に記載されている軽鎖と同一ではなく、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。

語句「エピトープ結合タンパク質」には、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープを選択的に認識することが可能な、例えばエピトープに約１マイクロモル以下のＫ_Ｄ（例えば、約１×１０^−６Ｍ、１×１０^−７Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍまたは約１×１０^−１２ＭのＫ_Ｄ）で結合することが可能であるタンパク質が含まれる。治療的なエピトープ結合タンパク質（例えば、治療的な抗体）は、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄをしばしば必要とする。

語句「機能的断片」には、発現、分泌させることができ、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄでエピトープに特異的に結合するエピトープ結合タンパク質の断片が含まれる。特異的な認識には、少なくともマイクロモルの範囲、ナノモルの範囲またはピコモルの範囲のＫ_Ｄを有することが含まれる。

免疫グロブリン核酸配列に関連する用語「生殖細胞系列」には、子孫に渡されることができる核酸配列が含まれる。

語句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン重鎖配列（免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む）が含まれる。特に明記しない限り、重鎖可変ドメインには３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにその組合せが含まれる。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端に向かって）Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片には、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄでエピトープを認識する）ことが可能で、細胞から発現および分泌させることが可能で、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、生殖細胞系列内に存在するＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントのレパートリーに由来する、Ｖ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントを一般に含む可変領域遺伝子配列によりコードされる。様々な生物体のＶ重鎖セグメント、Ｄ重鎖セグメント、およびＪ重鎖セグメントについての配列、位置、および命名法は、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍのウェブサイトのＩＭＧＴデータベースに見出すことができる。

配列に関連して用いられる場合、用語「同一性」には、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の同一性を測定するために用いることができる当技術分野で公知であるいくつかの異なるアルゴリズムで決定される同一性が含まれる。本明細書に記載される一部の実施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンドギャップペナルティを使用するＣｌｕｓｔａｌＷｖ．１．８３（スロー）アラインメントを用い、およびＧｏｎｎｅｔの類似度マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ^ＴＭ１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒＩｎｃ．、２００８）を用いて決定される。配列の同一性に関して比較される配列の全長は特定の配列に依存するが、軽鎖定常ドメインの場合、全長は、自己会合して正規の軽鎖定常ドメインを形成することが可能な、例えばベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびヒトまたはマウスの少なくとも１つのＣ_Ｈ１ドメインと相互作用することが可能な軽鎖定常ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。Ｃ_Ｈ１ドメインの場合、配列の全長は、ベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびマウスまたはヒトの少なくとも１つの軽鎖定常ドメインと相互作用することが可能なＣ_Ｈ１ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。

語句「免疫グロブリン分子」には、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖が含まれる。重鎖は同一であっても異なってもよく、軽鎖は同一であっても異なってもよい。

語句「軽鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限りヒトカッパおよびラムダ軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代わりの軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインには３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が一般に含まれる。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端にかけて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメインおよび軽鎖定常領域が含まれる。軽鎖可変ドメインは、生殖細胞系列内に存在するＶセグメントおよびＪセグメントのレパートリーに由来する、Ｖ_ＬセグメントおよびＪ_Ｌセグメントを一般に含む軽鎖可変領域遺伝子配列によりコードされる。様々な生物体のＶ軽鎖セグメントおよびＪ軽鎖セグメントについての配列、位置、および命名法は、www.imgt.orgのＩＭＧＴデータベースに見出すことができる。軽鎖には、例えば、軽鎖が現れるエピトープ結合タンパク質が選択的に結合する第一または第二のエピトープのいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖には、軽鎖が現れるエピトープ結合タンパク質が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープに結合し認識するものか、重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含まれる。共通軽鎖またはユニバーサル軽鎖はヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子に由来するものを包含し、それの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを包含する。二重軽鎖（ＤＬＣ）は２つ以下のヒトＶκセグメント、例えば、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む軽鎖遺伝子座に由来するものを包含し、それの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを包含する。

語句「マイクロモルの範囲」は、１〜９９９マイクロモルを意味するものとする。語句「ナノモルの範囲」は、１〜９９９ナノモルを意味するものとする。語句「ピコモルの範囲」は、１〜９９９ピコモルを意味するものとする。

語句「体細胞変異」には、クラススイッチングを経たＢ細胞からの核酸配列への言及が含まれ、ここで、クラススイッチングされたＢ細胞での免疫グロブリン可変領域の核酸配列（例えば、重鎖可変ドメインをコードするかまたは重鎖ＣＤＲもしくはＦＲ配列を含むヌクレオチド配列）は、クラススイッチングの前のＢ細胞の核酸配列に同一でなく、例えば、クラススイッチングを経ていないＢ細胞とクラススイッチングを経たＢ細胞との間のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列において差がある。「体細胞変異」には、親和性成熟していないＢ細胞での対応する免疫グロブリン可変領域配列（すなわち、生殖細胞系列細胞のゲノム中の配列）に同一ではない親和性成熟Ｂ細胞からの核酸配列への言及が含まれる。語句「体細胞変異」には、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の後のＢ細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含まれ、ここで、核酸配列は、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の前の対応する核酸配列と異なる。語句「体細胞変異」は、免疫原チャレンジに応じて動物で、例えばヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスで生成される、そのような動物で生得的に作動する選択プロセスから生じる抗体からの配列を指す。

核酸配列に関して用語「再構成されていない」には、動物細胞の生殖細胞系列に存在する核酸配列が含まれる。

語句「可変ドメイン」には、Ｎ末端からＣ末端（特に明記しない限り）の順序での以下のアミノ酸領域を含む免疫グロブリン軽鎖または重鎖（所望により改変される）のアミノ酸配列が含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。

用語「作動可能に連結した」は、作動可能に連結した成分が、それらの意図される様式で機能する関係を指す。１つの場合には、適正な転写調節を保持するように、タンパク質をコードする核酸配列を、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結することができる。１つの場合には、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列を免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結して、免疫グロブリン重鎖配列または免疫グロブリン軽鎖配列へと配列間の適正な組換えを可能とすることができる。

遺伝子置きかえに関連する用語「置きかえ」は、外因性遺伝物質を内在性遺伝子座に配置し、これにより、内在性遺伝子の全部または一部分を、オーソロガスな核酸配列または相同な核酸配列で置きかえることを指す。

本明細書で用いられる、例えば、機能的なポリペプチドに関連する「機能的な」は、天然のタンパク質と通常関連する少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドを含む。別の場合には、機能的な免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成された免疫グロブリン遺伝子配列を生成するための産生性の再構成が可能な可変遺伝子セグメントを含み得る。

「中性ｐＨ」は、約７．０〜約８．０の間のｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の間のｐＨ、例えば、約７．２〜約７．４の間のｐＨ、例えば、生理学的ｐＨを含む。「酸性ｐＨ」は、６．０以下のｐＨ、例えば、約５．０〜約６．０の間のｐＨ、約５．７５〜約６．０の間のｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントまたはリソソームコンパートメントのｐＨを含む。

免疫グロブリン軽鎖遺伝子内の操作したヒスチジン残基
本発明者らは、ｐＨ依存的な様式で抗原への結合が可能な抗体を発現する非ヒト動物を、軽鎖の配列に沿った１つまたは複数の位置において免疫グロブリン軽鎖可変領域の改変を施すことにより作製し得ることを発見した。動物が、抗体のＣＤＲ内でヒスチジンを発現するように、非ヒト動物の生殖細胞系列内に改変を施す方法が記載される。特に、マウスの生殖細胞系列内の免疫グロブリン軽鎖可変配列内に改変を施すための方法が記載される。例えば、軽鎖の可変領域配列は典型的に、可変領域配列に沿った体細胞超変異を示す。場合によって、このような変異は、ヒスチジン残基による置換（例えば、図１を参照されたい）を結果としてもたらし得る。このような変異は、抗原結合の一因となる可変ドメインの領域である相補性決定領域（ＣＤＲ）内でもなお生じ得る。場合によって、このような変異は、ｐＨ依存性の抗原結合を示す、例えば、酸性ｐＨにおける抗原結合の、中性ｐＨにおける抗原結合と比較した低減を示す抗体を結果としてもたらし得る。このようなｐＨ依存性の抗原結合が所望される。なぜなら、抗体が、細胞の外部の抗原に結合し、エンドソームへと内部移行すると、抗原を放出し、表面へと再度リサイクルされて、別の抗原に結合し、標的介在性クリアランスを回避することを可能とし得るからである。ランダムｈｉｓスキャニング変異誘発を用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体におけるｐＨ依存性の結合特性を操作することにより、ヒスチジン残基を導入して、この効果を達成するための手法が報告されている（ＵＳ２０１１／０１１１４０６Ａ１）。しかし、抗体残基のランダム変異誘発は、抗体の抗原への親和性の低下を結果としてもたらし得る。抗体配列内のヒスチジン置換を発現させるために遺伝子改変された非ヒト動物は、目的の抗原に応答する高親和性抗体であって、ヒスチジン改変（複数可）に起因して、ｐＨ依存性の抗原結合もまた提示する高親和性抗体の生成を可能とする。

したがって、様々な実施形態では、抗原にｐＨ依存的な様式で結合することが可能な抗体を発現する動物を結果としてもたらす改変を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）が本明細書において提供される。一実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドン（例えば、対応するヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌセグメント配列および／またはＪ_Ｌセグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドン）のヒスチジンコドンによる置換（場合によってまた、「ヒスチジン置換」、「ヒスチジンコドン置換」などとも称し得る）を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列（例えば、Ｖ_Ｌセグメント配列および／またはＪ_Ｌセグメント配列）内の改変を含む。一実施形態では、動物は、ｐＨ依存性抗体の収率を増大させるためには、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、Ｎ末端、ループ４およびさらにはフレームワーク領域におけるヒスチジン置換を可能にする生殖細胞系列を含む。一実施形態では、動物は、ヒト免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ；例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）のヌクレオチド配列内に、少なくとも１カ所の、非ヒスチジンコドン（例えば、対応するヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌセグメント配列および／またはＪ_Ｌセグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドン）のヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドンにおいてである。一実施形態では、軽鎖は、κ軽鎖である。一実施形態では、動物は、少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む免疫グロブリン軽鎖、例えば、軽鎖ＣＤＲ、例えば、軽鎖ＣＤＲ３を発現する。別の実施形態では、軽鎖は、λ軽鎖である。さらに別の実施形態では、マウスは、κ軽鎖内およびλ軽鎖内のいずれにおいても、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。

ヒスチジン残基は、２つの異なるコドン、ＣＡＴおよびＣＡＣ（デオキシリボ核酸残基）によりコードされる。したがって、非ヒスチジンコドンは、ＣＡＴまたはＣＡＣで置換することができる。置換は、その生殖細胞系列内の立体配置（すなわち、非体細胞変異状態）では、ヒスチジン残基をコードしないコドンにおいて操作する。したがって、ヌクレオチド配列は、対応するヒト生殖細胞系列軽鎖可変遺伝子セグメント（例えば、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌおよび／またはＪ_Ｌ遺伝子セグメント）によってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。

様々な実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物の軽鎖配列のヒスチジン改変は、様々なやり方でデザインすることができる。一部の実施形態では、ヒスチジン置換は、一塩基のみの変化が必要とされる位置に限定され得る。一部の実施形態では、ヒスチジン改変は、人工配列（例えば、人工Ｄ_Ｈセグメント、同定された抗体のＮ付加など）において行うことができ、これらの人工配列を軽鎖配列に挿入することができる。

一実施形態では、軽鎖は、ユニバーサル軽鎖（また、共通軽鎖とも称する）である。米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、同第１３／４１２，９３６号、同第１３／４８８，６２８号、および同第１３／７９８，３１０号（米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、同第２０１３／００４５４９２号、および同第２０１３／０１８５８２１号；全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている通り、複数の重鎖のために共通軽鎖を選択する非ヒト動物（例えば、マウス）は、実際的な有用性を有する。様々な実施形態では、共通の軽鎖だけを含む、非ヒト動物で発現される抗体は、同一であるか実質的に同一の軽鎖と会合して発現することができる重鎖を有する。これは、二重特異性抗体の作製で特に有益である。例えば、そのような動物は第一の免疫原で免疫して、第一のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。動物（または、遺伝的に同じ動物）は、第二の免疫原で免疫して、第二のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。重鎖可変領域はＢ細胞からクローニングすることができ、細胞中で同じ重鎖定常領域および同じ軽鎖（例えば、共通軽鎖）と共に発現されて二重特異性抗体を作製することができ、ここで、二重特異性抗体の重鎖成分は、同じ軽鎖成分と会合して発現するように動物によって選択される。記載される様々な実施形態では、遺伝子操作マウスの可変領域は、ヒト可変領域である。

別の実施形態では、軽鎖は、制限された（限定された）軽鎖可変セグメントレパートリー、例えば、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む軽鎖可変セグメントレパートリー（例えば、二重軽鎖または「ＤＬＣ」）に由来する。米国特許出願公開第２０１３／０１９８８８０号として公開された米国特許出願第１３／７９８，４５５号においてより詳細に記載されている通り、このような限定された軽鎖可変セグメントレパートリーは、二重特異性または他の多重特異性抗体を作製するために有用な抗体成分の生成にも役立つ限定された軽鎖レパートリーの生成を結果としてもたらす。

一部の実施形態では、二重軽鎖マウスは、より多様な軽鎖レパートリーを示し得る。一部の実施形態では、二重軽鎖マウスは、結合抗体のより多い収量を可能にし、多様性を限定すると同時に、単一の、再構成された軽鎖可変領域を含むマウス、例えば、ユニバーサル軽鎖マウスにおいて生成される重鎖との上首尾の対合を増加させる。一部の実施形態では、軽鎖は、それ自体が抗原結合特徴を示し得る。一部の実施形態では、それらの軽鎖に存在する抗原特異性を示す抗体を産生するようにマウスを誘導することができる（例えば、マウスの免疫グロブリン重鎖レパートリーを限定することによって、例えば、マウス重鎖遺伝子座を、単一の、再構成された重鎖可変領域を含む遺伝子座で置きかえることによって）。一部の実施形態では、このような動物において産生される抗体は、それらの軽鎖結合を通じて、特定の第一のエピトープ（例えば、エフェクター抗原、細胞傷害性分子、Ｆｃ受容体、毒素、活性化または阻害性受容体、Ｔ細胞マーカー、免疫グロブリン輸送体など）に特異的である。二重軽鎖マウスに由来するこのようなエピトープ特異的ヒト軽鎖を、限定された軽鎖レパートリーを有するマウス、例えば、ＵＬＣマウスに由来するヒト重鎖と共発現させることができ、ここで、重鎖は、第二のエピトープ（例えば、異なる抗原上の第二のエピトープ）に結合する能力に基づいて選択する。

したがって、以前に、ヒト可変領域が生殖細胞系列配列から逸脱する重鎖、例えば親和性成熟または体細胞変異可変領域を含む、重鎖のかなり多様なファミリーと好適に対合する免疫グロブリン軽鎖を生成することができるマウスが操作された。様々な実施形態では、マウスは、ヒト軽鎖可変ドメインが、体細胞変異を含むヒト重鎖可変ドメインと対合するように工夫され、このようにして、ヒト治療法として使用するのに適する高親和性結合タンパク質への経路を可能にする。

生物体における抗体選択の長く複雑なプロセスを介して、遺伝子操作マウスは、ヒト重鎖可変ドメインの多様なコレクションを限定された数のヒト軽鎖選択肢と対合させることにおいて、生物学的に適当な選択をする。これを達成するために、多様なヒト重鎖可変ドメイン選択肢と一緒に限定された数のヒト軽鎖可変ドメイン選択肢を提示するようにマウスは操作される。免疫原チャレンジに際して、マウスは免疫原に対する抗体を発生させるためにそのレパートリーにおける解法の数を最大にし、これは、そのレパートリーでの軽鎖選択肢の数によって大きく、またはそれ単独で制限される。様々な実施形態では、これは、軽鎖可変ドメインの好適で適合性の体細胞変異をマウスに達成させることを含み、該変異は、それにもかかわらず、特に体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、比較的多様なヒト重鎖可変ドメインに適合する。

米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、同第２０１３／００４５４９２号、同第２０１３／０１８５８２１号および同第２０１３／０１９８８８０号において記載されている、操作された共通軽鎖または限定された軽鎖レパートリーのマウスは、軽鎖選択肢の限定されたレパートリー、例えば、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、例えば、２つ以下のヒトＶ_Ｌセグメントを含む軽鎖、例えば、２つのヒトＶ_Ｌセグメントを含む二重軽鎖「ＤＬＣ」を含む、共通軽鎖またはユニバーサル軽鎖「ＵＬＣ」をコードする核酸配列を含んだ。このような限られたレパートリーを達成するために、天然のマウス軽鎖可変ドメインを作製または再構成する能力を、非機能的または実質的に非機能的にするようにマウスを操作する。１つの態様において、これは、例えば、マウスの軽鎖可変領域遺伝子セグメントを欠失させることによって達成された。以前に記載されたとおり、内在性マウス遺伝子座は、次に、外来性のヒト可変領域遺伝子セグメントが内在性マウス軽鎖定常領域遺伝子と組み合わさることができ、再構成されたリバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、マウス定常）を形成することができる方法で、選択された外来性の好適なヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（これは、内在性のマウス軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される）によって改変され得る。様々な実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞変異させることが可能である。様々な実施形態では、体細胞変異を得る軽鎖可変領域の能力を最大にするために、適切なエンハンサー（複数可）がマウスで保持される。１つの態様において、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントで内在性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントを置換するためにマウスκ軽鎖遺伝子座を改変することにおいて、マウスのκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーは機能的に維持されるか、破壊されない。

したがって、多様なリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）重鎖と会合する限られたレパートリーのリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）軽鎖を発現する遺伝子操作マウスが提供された。様々な実施形態では、内在性マウスκ軽鎖領域遺伝子セグメントが欠失し、内在性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結された単一の（または２つの）再構成されたヒト軽鎖領域で置換される。様々な実施形態では、内在性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントを欠失させ、ヒト軽鎖Ｊセグメント（Ｊ_Ｌセグメントのうちの１つまたは複数から選択される）と再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコードすることが可能な単一のヒトＶ_Ｌセグメントで置きかえ、ここで、単一のＶ_Ｌセグメントおよび１つまたは複数のＪ_Ｌセグメントは、内在性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結されている。他の様々な実施形態では、内在性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントを欠失させ、ヒト軽鎖Ｊセグメント（Ｊ_Ｌセグメント、例えば、２つまたはそれ超のＪ_Ｌセグメントのうちの１つまたは複数から選択される）と再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコードすることが可能な２つ以下のヒトＶ_Ｌセグメントで置きかえ、ここで、２つ以下のＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のＪ_Ｌセグメントは、内在性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結されている。他の実施形態では、カッパ軽鎖遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント）は、ヒトＣκ遺伝子に作動可能に連結されている。再構成されたヒト軽鎖領域の体細胞超変異を最大にするための実施形態では、マウスκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーが維持される。様々な実施形態では、マウスは非機能的なλ軽鎖遺伝子座、またはその欠失、またはその遺伝子座がλ軽鎖を作製できないようにする欠失をさらに含む。一部の特定の実施形態では、制限された軽鎖レパートリーを有する遺伝子操作マウスの遺伝子座は、図１６Ａおよび図１６Ｂに示されている遺伝子座と実質的に同一である。

軽鎖選択肢の限定されたレパートリーをコードする核酸配列を含む遺伝子操作マウス、例えば、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、例えば、２つ以下のヒトＶ_Ｌセグメントを含む軽鎖を含むＵＬＣマウス、例えば、２つのヒトＶ_Ｌセグメントを含むＤＬＣマウスでは、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は野生型免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とは異なる。

一部の実施形態では、軽鎖選択肢の限定されたレパートリーをコードする核酸配列を含むマウス（例えば、ＵＬＣマウス、例えば、ＤＬＣマウス）の軽鎖遺伝子座の構造は、少なくとも１つ、一部の実施形態では全てのマウスＶ_Ｌ遺伝子セグメントが１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントまたは２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントによって置きかえられているという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。一部の実施形態では、生殖細胞系列に単一のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントがヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントと再構成されて存在する。一部の実施形態では、マウスのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、抗体の免疫グロブリンＶ_Ｌドメインをコードするように２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つと再構成することが可能である。一部の実施形態では、本明細書に記載されているマウスの軽鎖遺伝子座のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント（複数可）を、２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントに作動可能に連結する。

一部の実施形態では、軽鎖選択肢の限定されたレパートリーをコードする核酸配列を含むマウス（例えば、ＵＬＣマウス、例えば、ＤＬＣマウス）の軽鎖遺伝子座の構造は、再構成前に内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含有しないという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。一部の実施形態では、このようなマウスの軽鎖遺伝子座の構造は、再構成前に内在性Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含有しないという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。一部の実施形態では、このようなマウスの軽鎖遺伝子座の構造は、再構成前に内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよび内在性Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含有しないという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。

一部の実施形態では、軽鎖選択肢の限定されたレパートリーをコードする核酸配列を含むマウス（例えば、ＵＬＣマウス、例えば、ＤＬＣマウス）の軽鎖遺伝子座の構造は、再構成後に内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含有しないという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。一部の実施形態では、このようなマウスの軽鎖遺伝子座の構造は、再構成後に内在性Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含有しないという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。一部の実施形態では、このようなマウスの軽鎖遺伝子座の構造は、再構成後に内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよび内在性Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含有しないという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。

一部の実施形態では、軽鎖選択肢の限定されたレパートリーをコードする核酸配列を含むマウス（例えば、ＵＬＣマウス、例えば、ＤＬＣマウス）の軽鎖遺伝子座の構造は、再構成前に２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含有するという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。一部の実施形態では、このようなマウスの軽鎖遺伝子座は、再構成前に２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含有するという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。

一部の実施形態では、軽鎖選択肢の限定されたレパートリーをコードする核酸配列を含むマウス（例えば、ＵＬＣマウス、例えば、ＤＬＣマウス）の軽鎖遺伝子座の構造は、再構成後に２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび５つまたはそれ未満（例えば、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つ）のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含有するという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。一部の実施形態では、このようなマウスの軽鎖遺伝子座は、再構成後に２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントと、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントとを含有するという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。一実施形態では、軽鎖選択肢の限定されたレパートリーをコードする核酸配列を含むマウス（例えば、ＵＬＣマウス、例えば、ＤＬＣマウス）の軽鎖遺伝子座の構造は、再構成後に１つのヒトＶ_Ｌおよび５つまたはそれ未満（例えば、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つ）のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含有するという点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。

様々な実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントはヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントである。様々な実施形態では、ヒトＶκセグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントから選択される。一部の実施形態では、ヒトＶκセグメントはヒトＶκ１−３９およびヒトＶκ３−２０である。一部の実施形態では、ヒトＪκセグメントは、Ｊκ１遺伝子セグメント、Ｊκ２遺伝子セグメント、Ｊκ３遺伝子セグメント、Ｊκ４遺伝子セグメント、Ｊκ５遺伝子セグメント、およびこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、ヒトＪκ遺伝子セグメントはヒトＪκ１、ヒトＪκ２、ヒトＪκ３、ヒトＪκ４およびヒトＪκ５である。

一部の実施形態では、軽鎖選択肢の限定されたレパートリーをコードする核酸配列を含むマウス（例えば、ＵＬＣマウス、例えば、ＤＬＣマウス）の軽鎖遺伝子座の構造は、再構成前に図１６Ａおよび図１６Ｂの構造のそれと実質的に同じ構造を含有する（例えば、図８Ｃ、図８Ｅ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１７Ｅ、図１９Ｄ、図３１および図３３の構造）という点で、図１５の参照構造のそれとは異なる。一部の実施形態では、再構成前の構造が図１６Ａおよび図１６Ｂの構造と同一である軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。

マウスゲノムにランダムに挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子座、可変領域および定常領域を含有するマウスが当技術分野で公知である。このようなマウスの最初の系統は、限定された数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含有するものであった。具体的には、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含有する少数の系統が、１つ、３つまたは４つのヒト免疫グロブリンＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび５つのヒト免疫グロブリンＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含有した（Taylorら、１９９２年、Nucleic Acids Research ２０巻（２３号）：６２８７〜６２９５頁；Fishwildら、１９９６年、Nature Biotechnology １４巻：８４５〜８５１頁；Lonbergら、１９９４年、Nature ３６８巻：８５６〜８５９頁；Greenら、１９９４年、Nature Genetics ７巻：１３〜２１頁；GreenおよびJakobovits １９９８年、J. Exp. Med. １８８巻（３号）：４８３〜４９５頁；Green １９９９年、J. Immunol. Methods ２３１巻：１１〜２３頁）。完全ヒト導入遺伝子の一部としてほんの少数のヒト免疫グロブリンＶ_Ｌ遺伝子セグメントがマウスゲノムにランダムに挿入されたこれらのマウスは、Ｂ細胞数の減少、Ｂ細胞発生の障害および他の免疫不全を明らかに示した。Ｂ細胞上でのヒトＣκの表面発現によって検出されるヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子の発現は、野生型と比較して、内在性κ軽鎖よりも低かった。驚いたことに、内在性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に１つまたは２つのヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントを含有するように操作されたマウスなどの、軽鎖選択肢の限定されたレパートリーを有するマウスは、ほぼ野生型のＢ細胞の数および発生を示す（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１９８８８０号および本実施例を参照されたい）。さらに、一部の実施形態では、これらのマウスは、抗原に応答するヒト可変軽鎖ドメインおよびヒト可変重鎖ドメインを含有するいくつかの高親和性リバースキメラ抗体を生成することができ、ここで、可変軽鎖ドメインは、各々が２つの可能性のあるヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つ、および５つの可能性のあるヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つを含有する（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１９８８８０号および本実施例を参照されたい）。したがって、ヒト免疫グロブリン軽鎖ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）（すなわち、限定された数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント）を用いて操作されたマウスの予備系統とは対照的に、限定された数のヒト免疫グロブリンＶ_Ｌ遺伝子セグメント（１つまたは２つ）および、一部の実施形態では２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒト免疫グロブリンＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含有するマウスでは、驚いたことに、正常なＢ細胞数、正常な免疫グロブリン軽鎖発現および正常なＢ細胞の発生を示す。さらに、このようなマウスでは、限定された免疫グロブリン軽鎖レパートリーの結果として複数の抗原に対するロバストな免疫応答を開始する能力の低下または障害も示されない。したがって、一部の実施形態では、２つ以下の、再構成されていないヒト免疫グロブリンＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のヒト免疫グロブリンＪ_Ｌ遺伝子セグメント、または２つ以下の、再構成されたヒトＶ_ＬＪ_Ｌセグメントを含むヒト化可変軽鎖遺伝子座を含むマウスは、野生型の数のＢ細胞集団を示し、野生型Ｂ細胞の発生を示した。

ユニバーサル軽鎖マウスまたは限定された軽鎖レパートリーを有するマウス（例えば、二重軽鎖マウス）において様々な抗原に応答して生成される抗体は、Ｖ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントの多様なレパートリーを含む重鎖可変領域配列の多様なレパートリーを使用することが可能である。このような遺伝子操作マウスにおいて生成される抗体は、二重特異性治療抗体をデザインするのに有用であるが、他の任意の抗体と同様に、各二重特異性抗体も、血漿中のその寿命の間に１つの標的だけに結合することが可能であり、その抗体は、エンドソームへと内部移行して、リソソーム分解の標的とされる。研究は、ＭＨＣクラスＩ様Ｆｃγ受容体であるＦｃＲｎが、免疫グロブリンを、ソーティングエンドソームから細胞表面へとリサイクリングして戻すことにより、リソソーム分解からレスキューすることが可能であることを示している（SimisterおよびMostov （１９８９年）、An Fc receptor structurally related to MHC class I antigens、Nature、３３７巻：１８４〜８７頁）。上記で説明した通り、抗体リサイクリングの効率を改善するには、抗体配列へのさらなる改変、例えば、酸性ｐＨ（例えば、エンドソームのｐＨ）では、抗原結合の低下を結果としてもたらすが、中性ｐＨ（例えば、生理学的ｐＨ）では、抗体−抗原の親和性および特異性を保持する改変が有益である。軽鎖配列内の非ヒスチジン残基をヒスチジン残基で置換した、本明細書に記載されている非ヒト動物は、ｐＨ依存性結合もまた提示する、例えば、酸性ｐＨにおける抗原への結合の、中性ｐＨにおける抗原への結合と対比した低減もまた提示する、ユニバーサル軽鎖フォーマットまたは限定された軽鎖レパートリー（例えば、ＤＬＣ）フォーマットに基づく高親和性抗体を産生することが可能であるために有益である。

したがって、一実施形態では、ヒト軽鎖可変領域の限定されたレパートリー、またはヒト軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーからの単一のヒト軽鎖可変領域をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）であって、ヒト軽鎖可変領域（複数可）が、少なくとも１カ所の、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物を、単一の軽鎖を発現する（または２つの軽鎖の一方もしくは両方を発現する）、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子（または２つの再構成された軽鎖可変領域遺伝子）を形成するように再構成する、単一の再構成されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（または２つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント）を含むように遺伝子操作し、ここで、軽鎖可変領域遺伝子（複数可）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。これらのヒスチジン置換した軽鎖可変領域遺伝子（複数可）によりコードされる、再構成されたヒト軽鎖可変ドメインは、動物により選択される、複数の親和性成熟させたヒト重鎖であって、重鎖可変領域が異なるエピトープに特異的に結合するヒト重鎖と対合することが可能である。様々な実施形態では、少なくとも１カ所の、非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換は、同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）重鎖と共に発現すると、その抗原にｐＨ依存的な様式で結合する、再構成されたヒト軽鎖を結果としてもたらす。

ヒト軽鎖可変ドメインの限定されたレパートリー、またはヒト軽鎖可変領域遺伝子配列の限定されたレパートリーからの単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作動物であって、可変領域遺伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子操作動物が提供される。いくつかの実施形態では、提供される動物を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、単一の軽鎖の可変領域を発現する（または２つの可変領域の一方もしくは両方を発現する）、単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列（または２つのＶ／Ｊ配列）を含むように遺伝子操作する。一態様では、可変配列を含む軽鎖は、動物によりクローン選択される、複数の親和性成熟させたヒト重鎖であって、重鎖可変領域が異なるエピトープに特異的に結合するヒト重鎖と対合させることが可能である。一実施形態では、抗体は、その抗原（複数可）にｐＨ依存的な様式で結合する。一実施形態では、単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される。一実施形態では、２つのＶ／Ｊ配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１である。一実施形態では、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０Ｊκ１配列は、再構成されたＶ／Ｊ配列である。

一態様では、ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪ_Ｌセグメントから選択される）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコードすることが可能な、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（例えば、対応するヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌ遺伝子および／またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンによる置換）を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。別の態様では、それらの各々が、ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪ_Ｌセグメントから選択される）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコードすることが可能な、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスであって、２つ以下のＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび／またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（例えば、対応するヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌ遺伝子および／またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換）を含む遺伝子改変マウスが提供される。一部のある特定の実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメント、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部のある特定の実施形態では、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである。

一態様では、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコードする単一の、再構成された（Ｖ／Ｊ）ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（すなわち、Ｖ_Ｌ／Ｊ_Ｌ領域）を含む遺伝子改変マウスであって、単一の、再構成された可変領域が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変マウスが提供される。別の態様では、マウスは、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコードすることが可能な２つ以下の、再構成されたヒト可変領域を含み、ここで、２つ以下の、再構成された可変領域は、それぞれが少なくとも１つのヒスチジンコドンの置換を含む。

それゆえ、本明細書では、ヒトＶ_Ｌ配列およびヒトＪ_Ｌ配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（例えば、対応するヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌ遺伝子および／またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンによる置換）を含む、遺伝子改変された非ヒト動物もまた提供される。一態様では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒスチジン置換（複数可）を除けば、ヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌ遺伝子配列およびＪ_Ｌ遺伝子配列に由来する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖は、ヒト免疫グロブリンκ鎖である。したがって、一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子配列は、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０から選択される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊ配列またはＶκ３−２０／Ｊ配列を含む。一実施形態では、ヒトＪ_Ｌ遺伝子配列は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。一実施形態では、ヒトＪ_Ｌ配列は、Ｊκ１およびＪκ５から選択される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される（例えば、ヒスチジン置換（複数可）を除けば）。代替的な実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖は、ヒトλ鎖である。

また、一実施形態では、限定されたレパートリー、例えば、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントをそのゲノム内、例えば、その生殖細胞系列内に含む遺伝子改変された非ヒト動物であって、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換、例えば、生殖細胞系列配列内に存在する少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が本明細書において提供される。別の実施形態では、限定されたレパートリー、例えば、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントをそのゲノム内、例えば、その生殖細胞系列内に含む遺伝子改変された非ヒト動物であって、各再構成されていないヒトＶ_Ｌ、および必要に応じてヒトＪ_Ｌ遺伝子配列（複数可）が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換、例えば、対応するヒト生殖細胞系列配列内に存在する少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が本明細書において提供される。したがって、一態様では、動物の生殖細胞系列内の可変遺伝子セグメント配列は、ヒスチジン置換（複数可）を除けば、ヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子配列および／またはＪ_Ｌ遺伝子配列である。ヒスチジン置換は、再構成の際、再構成された軽鎖配列が少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含有するようにデザインされるように位置づける。一実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖は、ヒト免疫グロブリンκ鎖である。したがって、一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子配列は、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０から選択される。したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、再構成されていないヒトＶκ１−３９および再構成されていないヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント、ならびに１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超の、再構成されていないヒトＪ_Ｌセグメント（例えば、Ｊκ１遺伝子セグメント、Ｊκ２遺伝子セグメント、Ｊκ３遺伝子セグメント、Ｊκ４遺伝子セグメント、および／またはＪκ５遺伝子セグメント）をそのゲノム内、例えば、その生殖細胞系列内に含み、ここで、Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントは、前記ヒトＪ_Ｌセグメントと共に再構成することが可能であり、生殖細胞系列内に存在する可変領域遺伝子セグメント配列の各々は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、例えば、生殖細胞系列配列内に存在する少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、再構成されていないヒトＶκ１−３９および再構成されていないヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント、ならびに１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超の、再構成されていないヒトＪ_Ｌセグメント（例えば、Ｊκ１遺伝子セグメント、Ｊκ２遺伝子セグメント、Ｊκ３遺伝子セグメント、Ｊκ４遺伝子セグメント、および／またはＪκ５遺伝子セグメント）をそのゲノム内、例えば、その生殖細胞系列内に含み、ここで、Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントは、前記ヒトＪ_Ｌセグメントと共に再構成することが可能であり、Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントは各々、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、必要に応じて、Ｊ_Ｌセグメントは、ヒスチジン置換（複数可）も含み得る。一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、Ｊκ１遺伝子セグメント、Ｊκ２遺伝子セグメント、Ｊκ３遺伝子セグメント、Ｊκ４遺伝子セグメント、およびＪκ５遺伝子セグメントを含む。したがって、一実施形態では、κ軽鎖遺伝子座のＶ_Ｌ配列、および必要に応じてＪ_Ｌ配列は、ヒスチジン置換（複数可）を除けば、基本的に生殖細胞系列配列である。

一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、軽鎖可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内にある。具体的な一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内にある。

一態様では、置換は、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３コドンにおける、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換である。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。非ヒト動物が、Ｖκ１−３９Ｊκ５可変領域である、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む実施形態または非ヒト動物が、２つ以下の再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、そのうちの１つがＶκ１−３９遺伝子セグメントである実施形態では、Ｖκ１−３９配列における、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえは、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ＣＤＲ３をコードする免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列内の位置における置きかえを含む。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０６位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。さらに別の実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。ヒスチジン置換したＣＤＲ３領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図２の配列アラインメントに示し、配列番号４〜３３にも示す。一実施形態では、野生型ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列（図２に示される）を、それぞれ、配列番号２および３に示す。ヒスチジン置換されたＣＤＲ３配列の核酸配列およびアミノ酸配列の他の実施形態は、本明細書および配列表全体を通して明らかになり、当業者には明白であるはずである。

非ヒト動物が、Ｖκ３−２０Ｊκ１可変領域である、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む実施形態、または非ヒト動物が、２つ以下の再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、そのうちの１つがＶκ３−２０遺伝子セグメントである実施形態では、Ｖκ３−２０配列における少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえは、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ＣＤＲ３領域をコードする免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列内の位置における置きかえを含む。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０６位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。別の実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。例示的な、ヒスチジン置換したＣＤＲ３領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図１２の配列アラインメントに示し、配列番号７６〜７９に示す。野生型ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列（図１２に示される）を、それぞれ、配列番号７４および７５に示す。ヒスチジン置換されたＣＤＲ３配列の核酸配列およびアミノ酸配列の他の実施形態が本明細書および配列表全体を通して明らかになり、当業者には明白であるはずである。

アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev. Comp. Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されている固有の番号付けに基づいており、また、www.imgt.org上でも調べることができる。

一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを、ヒトリーダー配列または非ヒトリーダー配列に作動可能に連結する。一実施形態では、リーダー配列は、非ヒトリーダー配列である。具体的な実施形態では、非ヒトリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。具体的な実施形態では、リーダー配列を、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、リーダー配列を、再構成されたヒトＶ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列に作動可能に連結する。したがって、具体的な一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、単一の、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５可変領域遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域遺伝子配列を、マウスＶκ３−７リーダー配列に作動可能に連結する。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、再構成されていないヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよび／またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントをマウスＶκ３−７リーダー配列に作動可能に連結する。さらに別の実施形態では、再構成されていないヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよび／またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントをヒトＶκリーダー配列に作動可能に連結する（lined）。一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、再構成されていないヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントをヒトＶκ１−３９リーダー配列に連結し、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、再構成されていないヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントをヒトＶκ３−２０リーダー配列に連結する。

一実施形態では、Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを、免疫グロブリンプロモーター配列に作動可能に連結する。一実施形態では、プロモーター配列は、ヒトプロモーター配列である。具体的な実施形態では、ヒト免疫グロブリンプロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモーターである。別の具体的な実施形態では、ヒト免疫グロブリンプロモーターは、ヒトＶκ１−３９またはＶκ３−２０プロモーターである。具体的な実施形態では、プロモーターを、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、プロモーターを、再構成されたヒトＶ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列に作動可能に連結する。したがって、具体的な一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、単一の、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５可変領域遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域遺伝子配列を、ヒトＶκ３−１５プロモーターに作動可能に連結する。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、再構成されていないヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよび／またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々をヒトＶκ３−１５プロモーターに作動可能に連結する。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、再構成されていないヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを、それぞれヒトＶκ１−３９プロモーターおよびヒトＶκ３−２０プロモーターに連結する。

一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、（ａ）５’側（Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントの転写方向に対して）でヒト免疫グロブリンプロモーターと隣接し、（ｂ）３’側でヒトＪ_Ｌセグメントと共に再構成するヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントと隣接した、リーダー配列を含み、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み；軽鎖遺伝子座は、リバースキメラ軽鎖の可変ドメインおよび内在性非ヒト軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む免疫グロブリン軽鎖をコードする。具体的な実施形態では、Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、非ヒトＶκ遺伝子座にあり、非ヒトＣ_Ｌは、非ヒトＣκ（例えば、マウスＣκ）である。具体的な一実施形態では、可変領域配列を、非ヒト定常領域配列、例えば、非ヒトＣκ遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、内在性非ヒト配列である。別の特定の実施形態では、Ｃ_ＬはヒトＣκである。一実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、Ｃκ遺伝子配列はマウスＣκ遺伝子配列である。一実施形態では、ヒトＪ_Ｌセグメントと共に再構成される、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、内在性非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（κ遺伝子座）にある。遺伝子座の例示的な実施形態を、図３１Ａおよび図３３Ａに示す。

一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、（ａ）５’側（Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントの転写方向に対して）でヒト免疫グロブリンプロモーターと隣接し、（ｂ）３’側で、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む再構成されたヒト可変領域配列（Ｖ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列）と隣接した、リーダー配列を含み、軽鎖遺伝子座は、リバースキメラ軽鎖の可変ドメインおよび内在性非ヒト軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む免疫グロブリン軽鎖をコードする。具体的な実施形態では、再構成されたヒトＶ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列は、非ヒトカッパ（κ）遺伝子座にあり、非ヒトＣ_Ｌは、非ヒトＣκである。具体的な一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む再構成されたヒト可変領域配列を、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列、例えば、非ヒトＣκ遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、内在性非ヒト配列である。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスであり、Ｃκ遺伝子配列は、マウスＣκ遺伝子配列である。一実施形態では、Ｃ_ＬはヒトＣ_Ｌである。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、内在性非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（κ遺伝子座）にある。遺伝子座の例示的な実施形態を、図８Ｃ、８Ｅ、１４Ｃ、および１４Ｄに提示する。

一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、マウスであり、マウスの可変領域遺伝子座は、κ軽鎖遺伝子座であり、κ軽鎖遺伝子座は、マウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’側エンハンサー、またはイントロンエンハンサーおよび３’側エンハンサーの両方を含む。

一実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）は、非機能的な免疫グロブリンラムダ（λ）軽鎖遺伝子座を含む。具体的な実施形態では、λ軽鎖遺伝子座は、遺伝子座の１つまたは複数の配列の欠失であって、λ軽鎖遺伝子座を再構成して、軽鎖遺伝子を形成することを不可能とする１つまたは複数の欠失を含む。別の実施形態では、λ軽鎖遺伝子座のＶ_Ｌ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを欠失させる。一実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域、例えば、内在性の、再構成されていない軽鎖可変領域を欠く。一実施形態では、再構成された、ヒスチジン置換したヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列により、内在性の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を置きかえる。別の実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）は、２つ以下のヒトＶ_Ｌセグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌセグメントを含み、ここで、２つ以下のヒトＶ_Ｌセグメントおよび必要に応じて１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌセグメントの各々は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、動物は、機能的な内在性非ヒト軽鎖可変領域を欠く。一実施形態では、ヒスチジン置換された配列により、内在性の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を置きかえる。別の実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）は、２つ以下のヒトＶ_Ｌセグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌセグメントを含み、ここで、２つ以下のヒトＶ_Ｌセグメントおよび／またはヒトＪ_Ｌセグメントの各々は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、動物は、機能的な内在性非ヒト軽鎖可変領域を欠く。一実施形態では、ヒスチジン置換された配列により、内在性の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を置きかえる。

一実施形態では、動物により、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むヒト可変領域配列に由来する体細胞変異可変ドメインを含む軽鎖を作製する。一実施形態では、軽鎖は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒト可変領域配列に由来する体細胞変異可変ドメイン、および非ヒトまたはヒトのＣκ領域を含む。一実施形態では、非ヒト動物は、λ軽鎖を発現しない。

当業者ならば、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換（複数可）を、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域へと遺伝子操作しても、体細胞超変異に起因して、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される全ての抗体が、このヒスチジン残基（複数可）を、操作された位置（複数可）において保有するわけではないことを十分に理解する。しかし、非ヒト動物における広範な抗体レパートリーの生成は、ｉｎｖｉｖｏにおいて生成される抗原特異的抗体であって、目的の抗原に対する高親和性を提示する一方で、生殖細胞系列へと導入され、好ましくは、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒスチジン改変を保持する抗原特異的抗体について選択することを可能とする。

したがって、一実施形態では、動物は、その可変領域遺伝子内の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換により導入される、少なくとも１つのヒスチジンアミノ酸を保持する。一実施形態では、動物は、その可変領域遺伝子へと導入された、その体細胞変異軽鎖可変ドメイン内の全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物はまた、Ｖ_Ｈ遺伝子セグメント配列、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列を含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域もそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む。一実施形態では、Ｖ_Ｈ遺伝子セグメント配列、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント配列、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列であり、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒト重鎖可変領域である。一実施形態では、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント配列、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列は、非ヒト重鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域配列は、内在性非ヒト重鎖定常領域配列である。別の実施形態では、重鎖定常領域配列は、ヒト重鎖定常領域配列である。一実施形態では、ヒト重鎖遺伝子セグメント配列は、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。一実施形態では、非ヒト動物に含まれるヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列はまた、対応する生殖細胞系列配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換も含む。

一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、非ヒト軽鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト軽鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択される非ヒト配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。

一実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択されるヒト配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。

動物が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、または、動物が、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子配列および必要に応じてヒトＪ_Ｌ遺伝子配列（複数可）の各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む（または再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子配列および／またはヒトＪ_Ｌ遺伝子配列の各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む）実施形態では、動物の生殖細胞系列内の前記可変領域配列またはヒトＶ_ＬセグメントおよびヒトＪ_Ｌセグメントは、内在性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。具体的な実施形態では、動物の生殖細胞系列内の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、内在性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における、全てまたは実質的に全ての内在性非ヒト軽鎖Ｖセグメント配列および内在性非ヒト軽鎖Ｊセグメント配列を置きかえる。別の特定の実施形態では、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントであって、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子配列および必要に応じてヒトＪ_Ｌ遺伝子配列（複数可）の各々が、動物の生殖細胞系列内に少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む（または再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子配列および／またはヒトＪ_Ｌ遺伝子配列の各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む）、遺伝子セグメントにより、内在性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における、全てまたは実質的に全ての内在性非ヒト軽鎖Ｖセグメント配列および内在性非ヒト軽鎖Ｊセグメント配列を置きかえる。

一実施形態では、非ヒト動物は、内在性Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえを含み、ここで、非ヒト動物がヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを再構成し、ヒトＶ_Ｈドメインおよび非ヒトＣ_Ｈを含むリバースキメラ免疫グロブリン重鎖を発現するように、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、非ヒトＣ_Ｈ領域遺伝子に作動可能に連結されている。一実施形態では、再構成されていない非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの９０〜１００％を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。具体的な実施形態では、内在性非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全て（例えば、９０〜１００％）を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１９、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１２の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、または少なくとも４３の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および少なくとも１つの、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、全ての、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および全ての、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。

ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の限定されたレパートリー、例えば、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（例えば、Ｖκ１−３９／Ｊκ５またはＶκ３−２０／Ｊκ１）、例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を有する、２つ以下の、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１または複数の（例えば、２またはそれより多くの）ヒトＪＬ遺伝子セグメント、、ならびに本明細書に記載されるとおりの、再構成されていないヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントの多様なレパートリーをそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む非ヒト動物、例えば、マウスは、再構成されていないヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントの様々な順列に由来する、重鎖可変領域配列によりコードされる、抗原結合タンパク質を生成することが可能であり、ここで、重鎖可変配列内に存在するＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントは、動物のゲノム内に存在する、全てまたは実質的に全ての機能的なヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントに由来する。本明細書に記載されている遺伝子改変動物の細胞、例えば、Ｂ細胞内で発現させた重鎖可変ドメイン配列（すなわち、様々な、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの組合せに由来する）の様々な利用可能性は、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号、同第２０１３／０１８５８２１号、および同第２０１３／０１９８８８０号において記載されている。様々な実施形態では、本明細書に記載される、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、または２つ以下の再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび１または複数の（例えば、２またはそれより多くの）ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント、ならびに再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列内に含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、それらの二重軽鎖遺伝子座によってコードされるエピトープ結合タンパク質の作製が可能である。

一実施形態では、ヒスチジン置換された単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方の１つのコピーを含む。別の実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方の２つのコピーを含む。したがって、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方について、ホモ接合性であってもよく、ヘテロ接合性であってもよい。

別の実施形態では、２つ以下のヒスチジン置換されたヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のＪ_Ｌセグメント（例えば、２つまたはそれ超のＪ_Ｌセグメント）を含む非ヒト動物は、２つの、ヒスチジン置換されたヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが動物のゲノム内に並置されるようにする。一部の実施形態では、非ヒト動物は、２つの、ヒスチジン置換されたヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが並置された遺伝子座の１つのコピーを含み、他の実施形態では、非ヒト動物は、２つの、ヒスチジン置換されたヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが並置された遺伝子座の２つのコピーを含む。したがって、一部の実施形態では、非ヒト動物は、２つ以下の並置されたヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座について、ホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかである。一部の実施形態では、２つの、ヒスチジン置換されたヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、動物のゲノム内の異なる遺伝子座にある（例えば、第一の軽鎖対立遺伝子に第一のヒスチジン置換されたヒトＶ_Ｌセグメントを含み、第二の軽鎖対立遺伝子に第二のヒスチジン置換されたヒトＶ_Ｌセグメントを含み、第一のヒトＶ_Ｌセグメントと第二のヒトＶ_Ｌセグメントが同一でない、ヘテロ接合体）。一部の実施形態では、動物はまた、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座についても、ヘテロ接合性であるかホモ接合性である。一部の実施形態では、２つのヒスチジン置換されたヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである。一実施形態では、ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５およびこれらの対での組合せからなる群から選択される。様々な実施形態では、提供される遺伝子操作された非ヒト動物は、内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含有する免疫グロブリン軽鎖を発現することができない。例えば、一部の実施形態では、提供される遺伝子操作された非ヒト動物は、内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントの一部または全部を不活化および／または除去する遺伝子改変を含有する。

少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）（例えば、軽鎖のＣＤＲ３内の）を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーを有する免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、例えば、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列、例えば、２つ以下のＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む配列）をそれらのゲノム内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物に加えて、本明細書では、発現した可変ドメインが、体細胞超変異にかけられない場合は、ヒスチジンである、さらなるアミノ酸（複数可）を含むように、ヒスチジンコドン（複数可）の１つまたは複数の付加／挿入を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物もまた提供される。一実施形態では、このようなヒスチジンコドンの付加は、ヒスチジン置換されたヒトＤ_Ｈ配列をマウスのヒト軽鎖遺伝子座に挿入することによって導入することができる。また、ヒスチジン改変をそれらの軽鎖可変ドメインに含む、本明細書に記載されている動物は、ヒスチジン改変をそれらの重鎖可変ドメインにも含有し得、例えば、動物は、ヒスチジン改変をヒト重鎖可変ドメインにも含有し得る。

本明細書に記載されている、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む遺伝子改変された非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択することができる。好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に利用可能でない非ヒト動物には、本明細書に記載されている方法とは異なる方法を用いて、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変するステップと、核移植を用いて、改変されたゲノムを、好適な細胞、例えば、卵母細胞へと導入するステップと、改変された細胞（例えば、改変卵母細胞）を、胚を形成するのに好適な条件下で、非ヒト動物に懐胎させるステップとを含む。別の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、四倍体相補（tetraploid complementation）を介して作製され得る。

一態様では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一態様では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の小型の哺乳動物である。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、齧歯動物は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラット、およびマウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ科（真性（ｔｒｕｅ）マウスおよびラット、アレチネズミ、トゲネズミ、タテガミネズミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリネズミ、イワネズミ、オジロキヌゲネズミ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄｒａｔ）、マダカスカルラットおよびマダカスカルマウス）、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ科（例えば、デバネズミ（mole rates）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から選択される科由来の動物である。具体的な実施形態では、遺伝子改変された齧歯動物は、真性マウスまたはラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲネズミ、およびタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、Ｍｕｒｉｄａｅ科由来のメンバーのマウスである。一実施形態では、動物は、齧歯動物である。具体的な実施形態では、齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。

具体的な実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される、１２９系統である（例えば、Festingら（１９９９年）、Revised nomenclature for strain 129 mice、Mammalian Genome、１０巻：８３６頁を参照されたい; Auerbachら（２０００年）、Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Linesもまた参照されたい）。具体的な実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統とのミックスである。別の具体的な実施形態では、マウスは、前述の１２９系統のミックスまたは前述のＢＬ／６系統のミックスである。具体的な実施形態では、ミックスの１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。さらに別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の前述の系統とのミックスである。

一実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋＡｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋＡｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の系統のミックスである。

したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、齧歯動物である。一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、ラットまたはマウスである。一実施形態では、動物は、マウスである。したがって、本発明の一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子配列およびヒトＪ_Ｌ遺伝子配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、対応するヒト生殖細胞系列配列によってコードされる少なくとも非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子改変マウスが本明細書において提供される。一実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く（例えば、機能的な、再構成されていないＶ遺伝子セグメント配列およびＪ遺伝子セグメント配列を欠く）。一実施形態では、ヒスチジンコドンの置換（複数可）を有する、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、Ｖκ１−３９／Ｊκ可変領域またはＶκ３−２０／Ｊκ可変領域である。一実施形態では、Ｊセグメント配列は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。一実施形態では、Ｊセグメント配列は、Ｊκ１またはＪκ５である。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にある。再構成された可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列である一実施形態では、ヒスチジン置換（複数可）を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置において発現するようにデザインする。再構成された可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列である別の実施形態では、ヒスチジン置換（複数可）を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置において発現するようにデザインする。一実施形態では、置換されたヒスチジンコドン（複数可）を有する、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域を、内在性のマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子配列（例えば、Ｃκ遺伝子配列）に作動可能に連結する。一実施形態では、マウスは、そのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域をさらに含む。一実施形態では、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントは、内在性のマウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、マウスの生殖細胞系列内に含まれる。

また、一部の実施形態では、限定されたレパートリー、例えば、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントをそのゲノム内、例えば、その生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換、例えば、対応するヒト生殖細胞系列配列内に存在する少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む、遺伝子改変マウスが本明細書において提供される。一部の実施形態では、限定されたレパートリー、例えば、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントをそのゲノム内、例えば、その生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび必要に応じてヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント（複数可）の各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換、例えば、対応するヒト生殖細胞系列配列内に存在する少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む遺伝子改変マウスが本明細書において提供される。一実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない内在性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く（例えば、機能的な、再構成されていない内在性免疫グロブリンＶ遺伝子セグメント配列およびＪ遺伝子セグメント配列を欠く）。一実施形態では、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントである。一実施形態では、Ｊセグメント配列は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にある。再構成されていないＶ_ＬセグメントがＶκ１−３９遺伝子セグメントである一実施形態では、ヒスチジン置換（複数可）を、１０５、１０６、１０８、１１１、およびこれらの組合せから選択される位置において発現するようにデザインする。再構成されていないＶ_ＬセグメントがＶκ３−２０セグメントである別の実施形態では、ヒスチジン置換（複数可）を、１０５、１０６、１０７、１０９、およびこれらの組合せから選択される位置において発現するようにデザインする。一実施形態では、ヒスチジンコドン（複数可）の置換（複数可）を含む、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を、内在性マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子配列（例えば、Ｃκ遺伝子配列）に作動可能に連結する。一実施形態では、ヒスチジンコドン（複数可）の置換（複数可）を含む、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列（例えば、Ｃκ遺伝子配列）に作動可能に連結する。一実施形態では、マウスは、ヒトＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域をそのゲノム内、例えば、その生殖細胞系列内にさらに含む。一実施形態では、ヒトＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントを、内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する。別の実施形態では、ヒトＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントを、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結する。様々な実施形態では、ヒスチジンコドン（複数可）の置換（複数可）を含む、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列はマウスの生殖細胞系列内に含まれる。

本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、マウスを生成するためのターゲッティングベクターもまた提供される。一態様では、ベクターのｄ：５’側マウス相同性アーム、ヒト免疫グロブリンプロモーターまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択されるヒト可変領域、および３’側マウス相同性アームを含む、ターゲッティングベクターが提供される。一実施形態では、５’側相同性アームおよび３’側相同性アームは、ベクターを、５’側に存在し、マウスＣκ遺伝子に対して近位である、エンハンサー配列に対して５’側の配列へとターゲッティングする。別の実施形態では、ターゲッティングベクターは、５’側マウス相同性アームに続いて、組換え部位により挟まれた選択カセット、ヒト免疫グロブリンプロモーターまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択されるヒト可変領域に続いて、マウスエンハンサーおよび定常領域（Ｃκ）配列を含む、３’側マウス相同性アームを含む。

別の態様では、５’側マウス相同性アーム；２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数（例えば、２つまたはそれ超、例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含むヒト可変領域であって、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント配列および必要に応じてヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント配列（複数可）の各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換、例えば、ヒト生殖細胞系列配列内に存在する少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含み、再構成されていないＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列およびヒトプロモーターまたはマウスプロモーターに作動可能に連結されている、ヒト可変領域；ならびに３’側マウス相同性アームを含むターゲッティングベクターが本明細書において提供される。一実施形態では、５’側相同性アームおよび３’側相同性アームは、マウスＣκ遺伝子に対して５’側に存在しその近位にあるエンハンサー配列に関して５’側の配列に対して、ベクターをターゲッティングする。別の実施形態では、ターゲッティングベクターは、５’側マウス相同性アームに続いて、組換え部位により挟まれた選択カセット；２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数（例えば、２つまたはそれ超、例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含むヒト可変領域であって、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント配列および必要に応じてヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント配列（複数可）の各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換、例えば、生殖細胞系列配列内に存在する少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含み、再構成されていないＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々は、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列およびヒトプロモーターまたはマウスプロモーターに作動可能に連結されている、ヒト可変領域；それに続いて、マウスエンハンサーおよび定常領域（Ｃκ）配列を含む３’側マウス相同性アームを含む。

選択カセットとは、目的の構築物を組み込んだ細胞（例えば、細菌細胞、ＥＳ細胞など）の選択を容易にするために、ターゲッティング構築物へと挿入されるヌクレオチド配列である。当技術分野では、いくつかの好適な選択カセットが公知である。一般に、選択カセットは、特定の抗生剤（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、Ｓｐｅｃなど）の存在下で、陽性選択を可能とする。加えて、選択カセットは、レコンビナーゼ酵素で処理したときに、選択カセットの欠失を可能とする、組換え部位で挟むことができる。一般に用いられる組換え部位は、Ｃｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素のそれぞれにより認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、当技術分野では、他の組換え部位も公知である。

一実施形態では、プロモーターは、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントプロモーターである。具体的な実施形態では、プロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、ヒトVκ１−３９またはVκ３−２０プロモーターである。一実施形態では、リーダー配列は、マウスリーダー配列である。具体的な実施形態では、マウスリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。別の実施形態では、リーダー配列は、ヒトリーダー配列である。具体的な実施形態では、ヒトリーダー配列は、ヒトＶκ１−３９またはＶκ３−２０リーダー配列である。単一の再構成されたヒト可変領域を含むターゲッティングベクターの例示的な実施形態を、図８Ｂおよび１４Ｂに提示する。２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および複数のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含むヒト可変領域を含むターゲッティングベクターの例示的な実施形態を図３１Ａおよび図３３Ａに示す。

一態様では、ターゲッティングベクターを、上記で記載した通りに提供するが、５’側マウス相同性アームの代わりに、ヒトプロモーターまたはマウスプロモーターに、５’側で、部位特異的レコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ）を隣接させ、３’側マウス相同性アームの代わりに、ヒトＶ_Ｌ領域に、３’側で、ＳＲＲＳを隣接させる。

本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製する方法もまた提供される。一態様では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための方法は、実施例において記載されている通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて作製されるターゲッティングベクターを使用し、構築物をＥＳ細胞へと導入し（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を用いて、ターゲッティングされたＥＳ細胞クローンをマウス胚へと導入する。ヒスチジン改変は、様々な分子生物学技法、例えば、部位特異的変異誘発またはデノボのＤＮＡ合成を用いて、ターゲッティングベクターへと導入することができる。遺伝子ターゲッティングが完了したら、遺伝子改変された非ヒト動物のＥＳ細胞をスクリーニングして、目的の外因性ヌクレオチド配列の組込みまたは外因性ポリペプチドの発現の成功を確認する。当業者には、数多くの技法が公知であり、サザンブロット法、長鎖ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を用いるリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学検査、免疫組織化学検査などが挙げられる（が、これらに限定されない）。一例では、目的の遺伝子改変を保有する非ヒト動物（例えば、マウス）は、Valenzuelaら（２００３年）、High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis、Nature Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁において記載されている、対立遺伝子アッセイの改変型を用いて、マウス対立遺伝子の喪失および／またはヒト対立遺伝子の獲得についてスクリーニングすることにより同定することができる。当業者には、遺伝子改変動物における具体的なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を同定する他のアッセイも公知である。

したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、動物における免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列（ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む）で置きかえるステップを含み、ここで、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ領域、例えば、ＣＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にある。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、動物における免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント配列およびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列で置きかえるステップを含み、ここで、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、対応するヒト生殖細胞系列配列によってコードされない少なくとも１つのヒスチジンを含み、例えば、ここで、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換、例えば、対応するヒト生殖細胞系列配列によってコードされる少なくとも１つのヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲコドンにおいてである。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、ヒト生殖細胞系列の、再構成された軽鎖可変領域配列に基づく。したがって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、Ｖκ１−３９Ｊκ５に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置において、ヒスチジンを発現するようにデザインする。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、Ｖκ３−２０κ１に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置において、ヒスチジンを発現するようにデザインする。

さらに別の実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、動物における免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数（例えば、２つまたはそれ超、例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列であって、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子配列および必要に応じてヒトＪ_Ｌ遺伝子配列（複数可）の各々が、対応するヒト生殖細胞系列可変遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンを含む、例えば、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子配列および必要に応じてヒトＪ_Ｌ遺伝子配列（複数可）の各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換、例えば、ヒト生殖細胞系列配列内に存在する少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む、免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列で置きかえるステップを含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲコドン内にある。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドン（複数可）の置換である。一実施形態では、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントである。一実施形態では、再構成されていないヒトＪ_Ｌセグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびこれらの組合せから選択される。したがって、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントがＶκ１−３９である一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを、１０５、１０６、１０８、１１１、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントがＶκ３−２０である一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを、１０５、１０６、１０７、１０９、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。

別の実施形態では、本明細書に記載されている（すなわち、本明細書に記載されている遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む）非ヒト動物を生成する方法は、非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内在性免疫グロブリン軽鎖Ｖセグメント、およびＪセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、（１）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列、または（２）２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数（例えば、２つまたはそれ超、例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）の、再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列であって、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子配列および必要に応じてヒトＪ_Ｌ遺伝子配列（複数可）の各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む（またはヒトＶ_Ｌ遺伝子配列および／またはヒトＪ_Ｌ遺伝子配列（複数可）の各々が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含む）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列をゲノムに配置するステップとを含む。一実施形態では、方法は、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列の、上記で記載したヒトＶ_Ｈ配列、ヒトＤ_Ｈ配列、およびヒトＪ_Ｈ配列の各々またはレパートリーのうちの少なくとも１つを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列による置きかえもまた含む動物において、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子領域配列で置きかえるステップを含む。一実施形態では、内在性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列による置きかえと、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列の、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列による置きかえとを含む、非ヒト動物を生成するために、軽鎖可変領域遺伝子配列の置きかえを有する動物を、重鎖可変領域遺伝子配列の置きかえを有する動物と交配させる。

発明者らは、本明細書において、１つまたは複数のヒスチジン改変を含むユニバーサル軽鎖、例えば、ヒトユニバーサル軽鎖（例えば、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域に由来する軽鎖）または制限（limited）もしくは限定（restricted）された可変セグメントレパートリーを有する（例えば、２つ以下の再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数の（例えば、２つまたはそれより多くの）再構成されたヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む）軽鎖を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を発現する、遺伝子操作非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）であって、抗原結合タンパク質が、標的抗原のｐＨ依存性の抗原結合を示す、遺伝子操作非ヒト動物を提供する。一部の実施形態では、動物は、１つまたは複数のヒスチジン改変を含む軽鎖ＣＤＲ３を含むように遺伝子操作する。様々な実施形態では、軽鎖ＣＤＲ３は、クラスター内に、２つ、３つ、または４つ以上のヒスチジン残基を含む。

一実施形態では、野生型動物と比較して、免疫グロブリン軽鎖内、例えば、免疫グロブリン可変ドメイン内、例えば、免疫グロブリンＣＤＲ内のヒスチジンの存在の増強を特徴とするＢ細胞集団を含む、遺伝子操作非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒスチジンの存在の増強は、約２〜４倍である。一実施形態では、ヒスチジンの増強は、約２〜１０倍である。

一実施形態では、軽鎖可変領域遺伝子配列内のコドン改変の結果として、ヒスチジン残基（複数可）を発現して、標的抗原のｐＨ依存性結合を提示する、抗原特異的抗体の集団を含む、遺伝子操作非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、これらの動物は、本明細書に記載されている免疫グロブリン軽鎖可変領域内に、ヒト生殖細胞系列配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含まない動物において生成される抗原特異的抗体の集団と比較して、ｐＨ依存性の結合特性（例えば、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）の、中性ｐＨにおけるｔ_１／２と対比した短縮）を提示する抗体、例えば、抗原特異的抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子操作動物において生成されるｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する抗原特異的抗体の富化は、軽鎖可変領域内にヒスチジン置換を含む同様の動物と比較して、約２倍を超える、例えば、約５倍を超え、例えば、約１０倍を超える。１つの実施形態では、富化は約２〜３倍である。したがって、本発明の遺伝子改変動物は、標的介在性クリアランスを低減し、ならびに、このような、ｉｎｖｉｖｏにおいて生成される抗体フォーマットに基づいて開発される治療用抗原結合タンパク質の用量および／または投与頻度を低減するのに所望される、抗体リサイクリング特性の改善を有する抗体が富化されている。

したがって、本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される抗原結合タンパク質であって、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、抗原特異的抗体である。一実施形態では、抗体は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントの再構成に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、この場合、生殖細胞系列遺伝子配列内の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンは、ヒスチジンコドンで置換され、抗体は、その発現したヒト軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、単一の、再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５の再構成またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１の再構成に由来する軽鎖を含み、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子配列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。別の実施形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内の、３つの非ヒスチジンコドンの３つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、３つのヒスチジン置換全てを保持する。一実施形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内の、４つの非ヒスチジンコドンの４つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、３または４つのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、ヒトＶκ１−３９／ＪまたはＶκ３−２０／Ｊ（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１）再構成に由来する軽鎖を含み、ヒトＶκ１−３９Ｊ遺伝子配列またはヒトＶκ３−２０Ｊ遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。別の実施形態では、抗体は、生殖細胞系列遺伝子座に存在する軽鎖可変領域遺伝子配列の再構成に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、生殖細胞系列遺伝子座に存在する軽鎖可変領域遺伝子配列は、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、１つまたは複数（例えば、２つまたはそれ超の）再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントおよび再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々および必要に応じてヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント（複数可）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに代えての置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、Ｊセグメントと共に再構成されたヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０に由来する軽鎖を含み、このような再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ遺伝子配列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。一部の実施形態では、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、その軽鎖可変ドメイン内に、全てのヒスチジン置換のうちの少なくとも５０％、少なくとも少なくとも６６％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を保持する。一実施形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列における３つの非ヒスチジンコドンの３つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、３つ全てのヒスチジン置換を保持する。別の実施形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列における３つの非ヒスチジンコドンの３つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、２つまたは３つのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列における４つの非ヒスチジンコドンの４つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、３つまたは４つのヒスチジン置換を保持する。他の実施形態では、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、１つ、２つ、３つ、４つ、および最大で全てのヒスチジン改変を保持する。

一実施形態では、抗体の軽鎖は、非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、内在性軽鎖定常領域のアミノ酸配列をさらに含む。加えて、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される抗体、例えば、抗原特異的抗体はまた、ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントの再構成に由来する、ヒト重鎖可変ドメインを含む重鎖も含む。ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントは、内在性非ヒト重鎖遺伝子座、例えば、少なくとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１つの機能的なＪセグメントに存在するヒト重鎖セグメントのレパートリー、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーから選択することができる。ヒト重鎖可変セグメントの例示的な、可能な再構成は、ＩＭＧＴデータベース内の機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの列挙、ならびに参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３０９号、および同第２０１３／００４５４９２号から収集することができる。さらに、一実施形態では、抗体の重鎖は、非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、内在性非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメイン、およびＣ_Ｈ３ドメインを含む。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＥアイソタイプ、ＩｇＤアイソタイプ、ＩｇＭアイソタイプ、またはＩｇＡアイソタイプである。

したがって、一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される結合タンパク質であって、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９からＪκの再構成（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５の再構成）に由来する軽鎖可変ドメインであり、軽鎖が、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する軽鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス軽鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ軽鎖を含み、ここで、軽鎖が、（ａ）ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの再構成に由来する重鎖可変ドメインであり、Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメントが、動物において存在するヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーから選択される重鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス重鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ重鎖と関連する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーは、少なくとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１つの機能的なＪセグメント、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態では、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインは、内在性の重鎖定常領域および軽鎖定常ドメインである。一実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、体細胞変異ドメインである。一実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。

別の実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される結合タンパク質であって、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ３−２０からＪκの再構成（例えば、Ｖκ３−２０Ｊκ１の再構成）に由来する軽鎖可変ドメインであり、軽鎖が、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する軽鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス軽鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ軽鎖を含み、ここで、軽鎖が、（ａ）ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの再構成に由来する重鎖可変ドメインであり、Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメントが、動物において存在するヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーから選択される重鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス重鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ重鎖と関連する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーは、少なくとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１つの機能的なＪセグメント、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態では、重鎖定常領域および軽鎖定常領域は、内在性の重鎖定常領域および軽鎖定常領域である。一実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、体細胞変異ドメインである。一実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。

一実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子改変動物のＢ細胞であって、ヒスチジン改変ヒト軽鎖可変領域配列、例えば、本明細書に記載されている、ヒスチジン改変、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列または２つ以下の再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび１つもしくは複数の（例えば、２つもしくはそれより多くの）再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含むヒスチジン改変されたヒト軽鎖可変領域配列を、その生殖細胞系列内に含み、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質を発現するＢ細胞もまた本明細書において提供される。一実施形態では、Ｂ細胞内で発現させた抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、生殖細胞系列へと導入された、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞内で発現させた抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、生殖細胞系列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン残基を保持し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。

様々な実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列、例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（またはヒスチジンコドンの生殖細胞系列配列への付加）を含む、ヒスチジン改変された、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１配列）または２つ以下の再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび１つもしくは複数の（例えば、２つもしくはそれより多くの）再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含むヒスチジン改変されたヒト軽鎖可変領域配列を含む。これらの付加または置換は、それらの抗原に対するｐＨ依存性の結合特性を有する、抗原結合タンパク質が富化されたＢ細胞集団を含む、非ヒト動物を結果としてもたらす。一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物において、抗原刺激に応答して生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨ、例えば、約７．０〜約８．０の間のｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の間のｐＨ、例えば、約７．２〜約７．４の間、例えば、生理学的ｐＨでは、抗原に対する高親和性を示して、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する。一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される、抗原結合タンパク質のその抗原に対する親和性は、１０^−６Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−９Ｍ未満、例えば、１０^−１０Ｍ未満、例えば、１０^−１１Ｍ未満、例えば、１０^−１２Ｍ未満である。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨ（例えば、６．０以下のｐＨ、例えば、約５．０〜約６．０の間のｐＨ、約５．７５〜約６．０の間のｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントまたはリソソームコンパートメントのｐＨ）で、その抗原に対する結合の低減を示す。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合を示さない。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物により生成される抗原結合タンパク質は、中性ｐＨにおける抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、酸性ｐＨで、解離半減期（ｔ_１／２）の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍への短縮を有する。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約１分間未満である。

平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）などの動力学的パラメータは、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋ_ｄ）として、動力学的速度定数から計算することができる。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ＦｃＲｎ分子への結合の増大を示す。上記で記載したＦｃＲｎとは、エンドソームコンパートメントの内部に存在する受容体であって、酸性ｐＨにおいて、免疫グロブリンに結合し、それらを表面へとリサイクリングして戻すことが可能な受容体である。本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物における抗体分子をスクリーニングすることにより、３つの有益なパラメータ：抗原に対する高親和性、ｐＨ依存性の抗原結合（酸性ｐＨでは抗原結合が弱い）、およびＦｃＲｎへの結合の増大を有する抗体について選択する固有の機会が提供される。

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生し、これらが富化された、抗原に応答するＢ細胞集団であって、治療剤へと再フォーマットされる場合に、治療用量を被験体へと投与されると、それらのヒト軽鎖可変領域遺伝子配列内にヒスチジン改変（複数可）を含まない非ヒト動物において同じ抗原に応答して産生される、同等なＢ細胞集団を凌駕する、血清半減期の延長を示すＢ細胞集団を含む。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において、目的の抗原に応答して産生される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、治療剤へと再フォーマットされる場合に、治療用量を被験体へと投与されると（治療剤へと再フォーマットされ、同じ治療用量で投与されるる場合）、そのヒト軽鎖可変領域遺伝子配列内にヒスチジン改変（複数可）を含まない非ヒト動物において同じ抗原に応答して産生された抗原結合タンパク質の血清半減期を凌駕する、血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、血清半減期の延長は、約２倍、例えば、約５倍、例えば、約１０倍、例えば、約１５倍、例えば、約２０倍、またはそれ超である。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒトに由来する多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞が提供される。具体的な実施形態では、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来する組織が提供される。一実施形態では、組織は、本明細書に記載されている、非ヒト動物の脾臓、リンパ節、または骨髄に由来する。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来する核が提供される。一実施形態では、核は、Ｂ細胞ではない二倍体細胞からの核である。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）から単離された非ヒト細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、ＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞は、リンパ球である。一実施形態では、リンパ球は、Ｂ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト重鎖遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含むキメラ重鎖と；生殖細胞系列内で少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、生殖細胞系列内で少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配列、またはこれらの組合せに由来する軽鎖とを発現し、ここで、軽鎖は、生殖細胞系列内でコードされる少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含み、重鎖可変ドメインは非ヒト重鎖定常領域またはヒト重鎖定常領域に融合し、軽鎖可変ドメインは非ヒト軽鎖定常領域またはヒト軽鎖定常領域に融合している。別の実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト重鎖遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含むキメラ重鎖と；生殖細胞系列内の少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、ヒトＶκ１−３９とヒトＪ配列との再構成に由来する、または、生殖細胞系列内の少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、ヒトＶκ３−２０とヒトＪ配列との再構成に由来する軽鎖であって、生殖細胞系列においてコードされる少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンに代えての置換を含む軽鎖を発現し、重鎖可変ドメインは、非ヒトまたはヒト重鎖定常領域と融合し、軽鎖可変ドメインが、非ヒト軽鎖定常領域またはヒト軽鎖定常領域と融合している。

一態様では、本明細書に記載されている、非ヒト動物のＢ細胞により作製されるハイブリドーマが提供される。具体的な実施形態では、Ｂ細胞は、目的のエピトープを含む免疫原で免疫された、本明細書に記載されているマウスからのＢ細胞であり、Ｂ細胞は、目的のエピトープに結合する結合タンパク質を発現し、結合タンパク質は、体細胞変異ヒト可変重鎖ドメインおよびマウスＣ_Ｈを有し、（１）再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５、（２）ヒトＶκ１−３９からヒトＪへの再構成、（３）再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１、または（４）ヒトＶκ３−２０からヒトＪへの再構成（生殖細胞系列内の少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を各々保有する）に由来するヒト可変軽鎖ドメイン、およびマウスＣ_Ｌを有し、ヒト軽鎖ドメインは、生殖細胞系列内でコードされる少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む。

本明細書に記載されている非ヒト動物において生成される抗原結合タンパク質を発現する細胞もまた提供される。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６^ＴＭ細胞）から選択される。

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来するドナーＥＳ細胞を含む非ヒト胚が提供される。

本明細書に記載されている非ヒト動物は、ヒスチジンをＣＤＲ３内に有する抗体を発現するＢ細胞を生成するのに有用である。ヒスチジンをＣＤＲ３に配置する動物は、抗体を作製するのに一般に有用であり、中性ｐＨまたはその近くでは、標的に十分な親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、同じ標的に結合しないかまたは弱く結合する抗体を開発するのに特に有用である。

非ヒト動物は、例えば、ヒスチジンをＣＤＲ３内に含むヒト免疫グロブリン可変ドメインによりそれらの標的に結合する、ヒト治療用結合タンパク質を作製するのに用いられ得る、抗体の可変領域を生成するのに有用である。治療剤は、細胞表面で標的に結合し、エンドソームへと内部移行し、治療剤がリサイクルされて、さらに別の標的の分子（例えば、別の細胞上または同じ細胞上の）に結合し得るように、エンドソーム内で標的からより容易にまたはより迅速に解離するため、より低いｐＨにおける結合が変化すれば、状況によっては、より迅速な代謝回転が可能となる。状況によっては、これにより、結果として、治療剤を低用量で投与するか、または治療剤を低頻度で投与することができる。これは、安全性または毒性の理由で、頻繁に投与することやある特定の投与量を上回って投与することが望ましくない場合に特に有用である。結果として、被験体へと投与される場合の抗体治療剤の血清半減期が延長される。

非ヒト動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラットは、１つまたは複数のヒスチジンをその中に有するＣＤＲ３を有する抗体可変領域を示す動物におけるＢ細胞の数を増大させるための方法において有用である。非ヒト動物は、ｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体配列を生成するのに有用である。非ヒト動物は、単回の免疫から、抗体がｐＨ依存性の抗原結合を示す、より多数の抗体配列を生成するのに有用である。

抗原結合タンパク質およびこれを生成する方法
一態様では、当技術分野で用いられる標準的な方法により、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物から、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒト抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法もまた本明細書において提供される。

抗体を生成するための複数の技法が記載されている。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載されているマウスにおいてキメラ抗体が産生される。抗体は、免疫したマウスのＢ細胞から直接単離することができ（例えば、Ｕ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１を参照されたい）、かつ／または免疫したマウスのＢ細胞を用いて、ハイブリドーマを作製することができる（KohlerおよびMilstein、１９７５年、Nature、２５６巻：４９５〜４９７頁）。本明細書に記載されている非ヒト動物からの抗体（ヒト重鎖および／またはヒト軽鎖）をコードするＤＮＡは、従来の技法を用いて、容易に単離および配列決定される。本明細書に記載されている非ヒト動物に由来するハイブリドーマおよび／またはＢ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れることができ、次いで、これを、他の形では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へとトランスフェクトして、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインのコード配列を、非ヒト配列の代わりに置換することにより改変することもできる。したがって、所望の特徴、例えば、親和性、エピトープ、ｐＨ依存性の抗原結合などを有する抗体の核酸配列が決定されたら、非ヒト定常領域遺伝子配列を、所望のヒト定常領域配列で置きかえて、非ＩｇＭアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含有する完全ヒト抗体を生成する。

したがって、一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す抗体を生成する方法であって、本明細書に記載されている非ヒト動物（例えば、マウス）を生成するステップと、マウスを目的の抗原で免疫するステップと、非ヒト動物に抗原への免疫応答を開始させるステップと、非ヒト動物において、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す、例えば、酸性ｐＨでは、中性ｐＨにおける場合より抗原への結合が弱い抗原特異的抗体を選択するステップとを含む方法が本明細書において提供される。

本明細書では、多重特異性抗原結合タンパク質、例えば、二重特異性または三重特異性の抗原結合タンパク質を作製する方法もまた提供される。これらは、複数のエピトープに高親和性で結合することが可能な分子である。本発明の利点には、その各々が単一の軽鎖と会合する好適に高い結合性の（例えば、親和性成熟した）重鎖免疫グロブリン鎖を選択できることが挙げられる。加えて、本発明の利点には、ｐＨ依存性の抗原結合を示す、多重特異性、例えば、二重特異性または三重特異性の抗原結合タンパク質を生成できることが挙げられる。本明細書中で記載される二重特異性抗体を使用する種々の局面はまた、三重特異性抗体または他の多重特異性抗体にも適用され得る。

二重特異性抗体の二重の性質（すなわち、１つのポリペプチドの異なるエピトープに特異的な場合もあり、複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有する場合もある；例えば、Tuttら、１９９１年、J. Immunol.、１４７巻：６０〜６９頁; Kuferら、２００４年、Trends Biotechnol.、２２巻：２３８〜２４４頁を参照されたい）のため、それらは、治療適用に有用な多くの利点をもたらす。例えば、二重特異性抗体は、方向転換された細胞傷害作用（例えば、腫瘍細胞を死滅させる）のために用いることもでき、ワクチンアジュバントとして用いることもでき、血栓溶解剤をクロットへと送達するために用いることもでき、標的部位（例えば、腫瘍）において酵素活性化型プロドラッグを転換するために用いることもでき、感染性疾患を処置するために用いることもでき、免疫複合体を細胞表面受容体へとターゲッティングするために用いることもでき、免疫毒素を腫瘍細胞へと送達するために用いることもできる。

本明細書に記載されている二重特異性抗体はまた、酵素イムノアッセイ、二部位イムノアッセイ、様々な疾患（例えば、がん）に対するｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおける免疫診断法、競合結合アッセイ、直接サンドイッチアッセイおよび間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなど、複数の治療的アッセイ法ならびに非治療的アッセイ法および／または診断的アッセイ法においても用いることができる。当業者には、二重特異性抗体の他の使用が明らかである。

二重特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から作製するための複数の技法が報告されている。しかし、二重特異性結合タンパク質の合成および発現は、２つの異なる重鎖と会合して発現し得る好適な軽鎖の同定と関連する問題に部分的に起因し、単離の問題にも部分的に起因して、問題含みであった。様々な実施形態では、本明細書に記載されている組成物および方法は、成分の安定性／相互作用を増大させることにより、従来の免疫グロブリン構造を維持するのに特殊な改変（複数可）を必要としない完全長の二重特異性抗体の利点を提供する。様々な実施形態では、このような改変（複数可）は、煩瑣であることがわかっており、二重特異性抗体技術の開発およびヒト疾患のための処置におけるそれらの潜在的な使用に対する障害として作用した。したがって、様々な実施形態では、複数の特異性という特性を付加した、天然の免疫グロブリン構造（すなわち、完全長）を提供することを介して、完全長の二重特異性抗体は、かつての二重特異性断片が欠いた、それらの極めて重要なエフェクター機能を維持し、半減期の延長という重要な薬物動態パラメータを明らかに示す治療剤をさらに提供する。

本明細書に記載される方法および組成物は、遺伝子改変マウスが、他の点では天然であるプロセスを介して、体細胞変異された（例えば、親和性成熟した）重鎖を含む複数の重鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を選択することを可能にし、ここで、この軽鎖は、抗原結合タンパク質にそのｐＨ依存性抗原結合特性をさらに付与する。リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変およびマウス定常）を有する親和性成熟抗体を発現する、本明細書に記載される免疫マウスの適するＢ細胞からのヒト重鎖および軽鎖の可変領域配列を同定して、適するヒト定常領域遺伝子配列（例えば、ヒトＩｇＧ１）を有する発現ベクターにインフレームでクローニングすることができる。２つのそのような構築物を調製することができ、ここで、各構築物は異なるエピトープに結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする。少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むヒト軽鎖可変領域の１つ（例えば、ヒトＶκ１−３９／ＪまたはヒトＶκ３−２０／Ｊ、例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１）は、適するヒト軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒトκ定常遺伝子）にインフレームで融合させることができる。これら３つの完全なヒトの重鎖および軽鎖構築物は、発現のために適する細胞に入れることができる。細胞は、２つの主要な種を発現する：同一の軽鎖を有するホモダイマー重鎖、および同一の軽鎖を有するヘテロダイマー重鎖。これらの主要な種の容易な分離を可能にするために、重鎖の１つはプロテインＡ結合決定基が削除されるように改変され、これにより、ヘテロダイマー結合タンパク質とは異なるホモダイマー結合タンパク質の親和性がもたらされる。この問題に対処する組成物および方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１として公開された、２０１０年６月２５日に出願された「ＲｅａｄｉｌｙＩｓｏｌａｔｅｄＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｉｔｈＮａｔｉｖｅＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＦｏｒｍａｔ」という名称のＵＳＳＮ１２／８３２，８３８に記載される。同一な軽鎖を有するヘテロ二量体重鎖を含む上記種が選択されたら、この二重特異性抗原結合タンパク質をスクリーニングして、そのｐＨ依存性の抗原結合特性の保持を確認することができる。

あるいは、二重特異性抗体または三重特異性抗体は、二重軽鎖遺伝子座、例えば、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント配列、および１つまたは複数（例えば、２つまたはそれ超の）ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント配列を含む軽鎖遺伝子座、ならびにヒト重鎖（例えば、単一の、再構成されたヒト重鎖可変領域）の限定されたレパートリーを含むマウスに由来する抗原特異的軽鎖を使用して調製することができる。このような、抗原特異的な、ヒスチジン改変された、リバースキメラ（ヒト可変マウス定常）軽鎖を使用して、適するヒト軽鎖定常領域配列を有する発現ベクターにインフレームでクローニングすることができる抗原特異的軽鎖可変領域配列を誘導することができる。ユニバーサル軽鎖遺伝子座、例えば、単一の、再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列を含む軽鎖遺伝子座を含むマウス由来の抗原特異的ヒト重鎖可変領域（複数可）（抗原特異的軽鎖と同じまたは異なる抗原上の異なるエピトープに特異的である）を、ヒト重鎖定常領域配列を含む発現ベクターにインフレームでクローニングすることができ、抗原特異的ヒト軽鎖および重鎖を好適な細胞において共発現させて、二重特異性ヒト抗体または三重特異性ヒト抗体を得ることができる。あるいは、予め選択した抗原特異的重鎖、例えば、二重軽鎖マウス遺伝子座において用いられるものと同じ可変領域遺伝子セグメントに由来する軽鎖を含む抗体由来の重鎖を、ヒト重鎖定常領域配列を含む発現ベクターにインフレームでクローニングすることができ、抗原特異的ヒト軽鎖および重鎖を好適な細胞において共発現させて、二重特異性ヒト抗体または三重特異性ヒト抗体を得ることができる。一実施形態では、このような抗体は、例えば、軽鎖におけるヒスチジン置換に起因して、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する。

一態様では、本明細書に記載されるエピトープ結合タンパク質が提供され、ここで、ヒト軽鎖および重鎖の可変領域配列は、目的のエピトープを含む抗原で免疫されている本明細書に記載される動物に由来する。

一実施形態では、第一および第二のポリペプチドを含むエピトープ結合タンパク質が提供され、第一のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第一のエピトープに選択的に結合する第一のエピトープ結合領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣ_Ｈ３領域を含む定常領域を含み；第二のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエピトープ結合領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３領域を含む定常領域を含み、第二のＣ_Ｈ３領域は、プロテインＡへの第二のＣ_Ｈ３ドメインの結合を低減または除去する改変を含む。様々なこのような改変は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１０／０３３１５２７号、および同第２０１１／０１９５４５４号において記載されている。

複数のエピトープに結合し、ｐＨ依存性のエピトープ結合特性を示すエピトープ結合タンパク質を作製するための１つの方法は、本発明に従い第一のマウスを、第一の目的のエピトープを含む抗原で免疫することであり、ここで、マウスは、（１）軽鎖を再構成して形成することが可能な内在性マウス軽鎖可変領域遺伝子配列を含有しない、内在性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座であって、内在性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座には、マウス内在性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域があり、一部の実施形態では、再構成されたヒト軽鎖可変領域が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、内在性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座と、（２）マウスにより作製される免疫グロブリン重鎖が、単独でまたは実質的にヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含む重鎖であるように、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで全体的または部分的に置きかえられた内在性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントとを含む。免疫すると、このようなマウスにより、２つのヒト軽鎖可変ドメインのうちの１つ（例えば、例えば、少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１のうちの１つ）だけを含むリバースキメラ抗体が作製される。一般に、生殖細胞系列配列へと導入された、置換されたヒスチジン残基の少なくとも一部は、リバースキメラ抗体内で保持される。目的のエピトープに結合する重鎖可変ドメインをコードするＢ細胞を同定し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す抗体を発現させたら、重鎖可変領域（そして、必要に応じて、軽鎖可変領域）のヌクレオチド配列を取り出し（例えば、ＰＣＲにより）、好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列に対してインフレームで、発現構築物へとクローニングすることができる。このプロセスを繰り返して、第二のエピトープに結合する第二の重鎖可変ドメインを同定し、第二の重鎖可変領域遺伝子配列を取り出し、第二の好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列とインフレームで、発現ベクターへとクローニングすることができる。定常領域遺伝子配列によりコードされる第一の免疫グロブリン定常ドメインと、第二の免疫グロブリン定常ドメインとは、同じアイソタイプであってもよく、異なるアイソタイプであってもよく、免疫グロブリン定常ドメインのうちの一方を、本明細書またはＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されている通りに改変することができ（しかし、他方は改変しない）、エピトープ結合タンパク質を、好適な細胞内で発現させ、そのプロテインＡに対する、例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１において記載されているホモ二量体のエピトープ結合タンパク質と比較した、示差的な親和性に基づき単離することができる。

したがって、様々な実施形態では、ＤＮＡの単離、ならびに所望の特異性／親和性を有する第一のヒト重鎖可変ドメインおよび第二のヒト重鎖可変ドメインをコードする第一の核酸配列および第二の核酸配列、ならびにヒト軽鎖ドメインをコードし、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む第三の核酸配列（本明細書に記載されている非ヒト動物から単離された、生殖細胞系列の再構成された配列または軽鎖配列）の選択に続き、当技術分野で広範に利用可能な組換え技法を用いて、分子をコードする３つの核酸配列を発現させて、二重特異性抗体を形成する。しばしば、二重特異性抗体が、適切にグリコシル化される（例えば、グリコシル化された抗体ドメインを含む二重特異性抗体の場合）ように、選り抜きの発現系は、哺乳動物細胞の発現ベクターおよび宿主を包含する。しかし、分子はまた、原核生物発現系において産生させることもできる。通常、宿主細胞は、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン、ヒト軽鎖ドメインの全てを、単一のベクター上または独立のベクター上でコードするＤＮＡにより形質転換される。しかし、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン、およびヒト軽鎖ドメイン（二重特異性抗体の成分）を、独立の発現系において発現させ、発現させたポリペプチドをｉｎｖｉｔｒｏにおいてカップリングさせることも可能である。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、例えば、ＣＤＲコドンにおける、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を除けば、生殖細胞系列配列に由来する。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、軽鎖ドメインの軽鎖可変配列内に、１カ所以下、２カ所以下、３カ所以下、４カ所以下、または５カ所以下の体細胞超変異を含む。いくつかの実施形態では、体細胞超変異は、軽鎖可変領域の生殖細胞系列配列へと導入された、少なくとも１つのヒスチジン残基の存在を変化させない。

様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンのヒスチジンによる置換を有する２つの重鎖および単一のヒト軽鎖をコードする核酸（複数可）（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）および／または発現のために、複製可能なベクターへと挿入する。多くのベクターが利用可能であり、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を一般に含むが、これらに限定されない。各成分は、個別に選択することもでき、宿主細胞の選択に基づき選択することもでき、実験により決定される他の基準に基づき選択することもできる。当技術分野では、各成分の複数の例が公知である。

発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物体により認識されるプロモーターを含有し、二重特異性抗体の各成分または全ての成分をコードする核酸配列に作動可能に連結される。様々な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制限酵素消化により供給源のＤＮＡからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列をベクターへと挿入することにより、二重特異性抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結する。

真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物体からの有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有し得る。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側非翻訳領域から一般に入手可能であり、必要に応じて、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの３’側非翻訳領域からも入手可能である。これらの領域は、二重特異性抗体成分をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。様々な実施形態に好適な発現ベクターは、二重特異性抗体をコードするＤＮＡの、哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを含む。宿主細胞が、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、発現ベクターによりコードされる高レベルの、所望のポリペプチドを合成するように、一般に、一過性発現は、宿主細胞内で効率的に複製することが可能な発現ベクターの使用を包含する。好適な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、第一のヒト重鎖可変ドメインまたは第二のヒト重鎖可変ドメインのホモ二量体を有する親抗体と比べて、クローニングされるＤＮＡによりコードされるポリペプチドの簡便な陽性同定、ならびに所望の結合特異性／親和性または所望のゲル移動特徴を有する二重特異性抗体の迅速なスクリーニングを可能とする。

様々な実施形態では、二重特異性抗体の成分をコードするＤＮＡが、上記で記載した所望のベクター（複数可）へとアセンブルされたら、それらを、発現および回収に好適な宿主細胞へと導入する。宿主細胞をトランスフェクトすることにより、選択された宿主細胞に適切な、当技術分野で公知の標準的な技法（例えば、エレクトロポレーション、核内マイクロインジェクション、インタクトの細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなど）を用いて達成することができる。

様々な実施形態では、成分を含有し、二重特異性抗体種の最も効率的で好適な産生を可能とする発現ベクターに最適な宿主細胞を選択する。発現のための例示的な宿主細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．など）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または例えばハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。種々の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。種々の実施形態では、細胞は、以下から選択される真核細胞である：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。種々の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ細胞））。

二重特異性抗体を産生するのに用いられる哺乳動物の宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）；Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）；Ｓｉｇｍａ）などの市販される培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。培地には、必要に応じて、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、バッファ（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ^ＴＭなど）、微量元素（通常マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにブドウ糖、または同等なエネルギー供給源を補充することができる。他の任意の補充物質もまた、当業者に公知の適切な濃度で含めることができる。様々な実施形態では、温度、ｐＨなどの培養条件は、発現について選択された宿主細胞で既に用いられた培養条件であり、当業者には明らかである。

二重特異性抗体は、分泌されるポリペプチドとして、培養培地から回収することができるが、分泌シグナルを伴わずに直接産生される場合は、宿主細胞溶解物からも回収することができる。二重特異性抗体が、膜結合型である場合は、好適な洗浄剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を用いて、膜から放出させることができる。

単離に続き、２つのヒト重鎖と、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０／κ１配列から選択される配列、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する、単一のヒト軽鎖とを含む二重特異性抗体を、その抗原の一方、好ましくは両方に対する、ｐＨ依存性結合を示すその能力についてスクリーニングする。その抗原に対し、中性ｐＨと酸性ｐＨとで結合が異なる二重特異性抗体の能力（例えば、酸性ｐＨにおいて、中性ｐＨにおける場合と比較してｔ_１／２の短縮を明らかに示すそれらの能力）は、当技術分野で利用可能な様々な技法により決定することができ、下記の実施例、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭアッセイにおいて記載されている。

２つ以上のエピトープに結合し、また、ｐＨ依存性のエピトープ結合特性を示す結合タンパク質を、ヒスチジン改変を有する、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント、および同じまたは異なるマウスに由来する重鎖（複数可）を含むマウス（例えば、ユニバーサル軽鎖マウス）に由来する軽鎖を使用することによって作製するための同様の方法も提供され、これは本開示から明らかである。簡単に述べると、本明細書に記載されているマウス（例えば、二重軽鎖遺伝子座を含むマウス）を、目的の抗原を用いてヒト化することができ、目的のエピトープに結合するＢ細胞に由来する軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメインを同定し、ヌクレオチド配列を、好適な定常領域を含むベクターにインフレームでクローニングすることができる。同じプロセスを繰り返して、目的の他の可変ドメインを得、上でより詳細に記載されている通り、可変ドメインを好適な細胞株において共発現させる。

ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗原結合タンパク質を生成するためのさらなる方法
本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する様々な方法が提供される。ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をｉｎｖｉｔｒｏにおいて生成する方法もまた提供される。このような方法は、抗原結合タンパク質の様々な成分を、遺伝子改変された非ヒト動物において、ｉｎｖｉｖｏで生成するステップと、次いで、それらを改変するステップと、生物体の外部において、ｉｎｖｉｔｒｏで、哺乳動物細胞培養物中で発現させるタンパク質複合体としてそれらを再アセンブルするステップとを包含し得る。

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方法は、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、同第２０１３／００４５４９２号、および同第２０１３／０１８５８２１号において記載されているマウスなどの「ユニバーサル軽鎖」マウスまたは「共通軽鎖」マウス（「ＵＬＣ」マウス）である、軽鎖可変領域のＶセグメントおよびＪセグメント、例えば、ヒト軽鎖可変領域のＶセグメントおよびＪセグメントの限定されたレパートリーを含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質配列、例えば、抗体配列を使用する。一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方法は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質配列を使用する。一実施形態では、方法は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質を使用する。別の実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特徴を有する抗原結合タンパク質を生成する方法では、限定された可変遺伝子セグメントマウス、例えば、二重軽鎖マウスにおいて生成された抗原結合タンパク質配列を使用する。

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法は、目的の抗原に結合する（例えば、目的の抗原に所望の親和性で結合する）第一の抗体を選択するステップと、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、細胞内で発現させた第二の抗体であって、中性ｐＨでは、目的の抗原への結合を保持し（例えば、目的の抗原に対する所望の親和性を保持し）、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップとを含む。

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法は、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含む抗体（例えば、非ヒト動物、例えば、マウス、例えば、ＵＬＣマウスから得られる）からの免疫グロブリン重鎖であって、抗体が目的の抗原に結合する（例えば、目的の抗原に所望の親和性で結合する）免疫グロブリン重鎖を選択するステップと；免疫グロブリン軽鎖の核酸配列を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと；選択された免疫グロブリン重鎖および少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換をその可変ドメイン内に含む免疫グロブリン軽鎖を発現させるステップと；中性ｐＨでは、目的の抗原への結合を保持する（例えば、目的の抗原への所望の親和性を保持する）が、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップとを含む。様々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメントおよびヒトＪセグメント）の再構成に由来する。

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法は、（１）単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列および再構成されていないヒト重鎖可変遺伝子セグメント（Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント）のレパートリーを含む非ヒト動物、例えば、マウスを、目的の抗原で免疫し、マウスに前記抗原に対する免疫応答を開始させるステップと、（２）非ヒト動物において、例えば、マウスにおいて、目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体を選択するステップと、（３）非ヒト動物から、例えば、マウスから、目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の免疫グロブリン重鎖のヌクレオチド配列を単離するステップと、（４）前記重鎖のヌクレオチド配列を決定するステップと、（５）単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含有する免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、（６）目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の免疫グロブリン重鎖およびヒスチジン改変を含む免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、（７）細胞内で発現した抗体が、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、結合の低減を提示するのかどうかを決定するステップとを含む。一実施形態では、細胞内で発現した抗体は、中性ｐＨにおいて、抗原への所望の親和性を示す。様々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメント）の再構成に由来する。別の実施形態では、ｐＨ依存性の結合特徴を有する抗原結合タンパク質を生成するための同様の方法であって、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列を含むマウスを免疫する代わりに、軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーを含むマウス、例えば、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および、複数、例えば２つまたはそれ超のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含むマウスを免疫することを含む方法も本明細書において提供される。

一実施形態では、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスは、例えば、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、同第２０１３／００４５４９２号、および同第２０１３／０１８５８２１号において記載されている、ユニバーサル軽鎖マウスまたは共通軽鎖マウスまたは「ＵＬＣ」マウスである。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列から選択される。

一実施形態では、目的の抗原は、可溶性抗原、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）、および細胞表面受容体から選択される。具体的な実施形態では、細胞表面受容体は、免疫グロブリン受容体である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン受容体は、Ｆｃ受容体である。

一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される、抗原に対する抗体の所望の親和性は、１０^−６Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−９Ｍ未満、例えば、１０^−１０Ｍ未満、例えば、１０^−１１Ｍ未満、例えば、１０^−１２Ｍ未満である。

上記で説明した通り、一実施形態では、ＵＬＣマウスは、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含み、抗原に応答して抗体を発現するが、この場合、抗体の抗原への親和性は、主にそれらの抗体の重鎖によって媒介される。これらのマウスは、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変配列に由来する軽鎖もまた含む抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードするように再構成する、ヒト重鎖可変（Ｖ、Ｄ、およびＪ）セグメントのレパートリーを含む。一実施形態では、抗原曝露により、これらのマウスは、多様なヒト重鎖可変（Ｖ、Ｄ、およびＪ）セグメントのレパートリーを使用して、抗原に対する親和性および特異性を有する抗体を生成する。したがって、抗原へと曝露したら、ＵＬＣマウスにおいて生成される抗体の免疫グロブリン重鎖のヌクレオチド配列を単離し、これを使用して、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列（例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列）に由来する免疫グロブリン軽鎖もまた含む、所望の結合タンパク質を生成することができる。

ＵＬＣマウスの一実施形態では、再構成されていない非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの９０〜１００％を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。具体的な実施形態では、内在性非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全て（例えば、９０〜１００％）を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１９、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１２の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、または少なくとも４３の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および少なくとも１つの、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、全ての、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および全ての、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。したがって、ＵＬＣマウスは、ヒト可変領域遺伝子セグメント（Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント）の多様なレパートリーを使用して、目的の抗原に応答する抗体を生成する。

目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の重鎖を決定したら、重鎖のヌクレオチド配列を単離および配列決定する。配列は、好適な宿主細胞、例えば、真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞における発現のためのベクターへとクローニングする。一実施形態では、ヒト重鎖定常領域の配列を、マウスから（例えば、ＵＬＣマウスから）単離されたヒト重鎖可変領域配列の下流にクローニングする。

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方法は、免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列、特に、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップを含む。当技術分野では、ヌクレオチド配列を改変するための様々な技法、例えば、部位特異的変異誘発が公知である。加えて、所望のヒスチジン置換を含むヌクレオチド配列は、デノボ合成することもできる。

一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のヒスチジン残基の発現を結果としてもたらす置換を含む。一実施形態では、置換（複数可）は、３つまたは４つのヒスチジン残基の発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換（複数可）は、免疫グロブリン軽鎖可変領域においてである。一実施形態では、置換（複数可）は、ＣＤＲコドン、例えば、ＣＤＲ１コドン、ＣＤＲ３コドン、および／またはＣＤＲ３コドンにおいてである。一実施形態では、置換（複数可）は、ＣＤＲ３コドンにおいてである。

免疫グロブリン軽鎖核酸配列がＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子配列を含み、置換（複数可）がＣＤＲ３コドンにおいてである一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０６位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０８および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、様々なヒスチジン置換を含むＶκ１−３９Ｊκ５のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列および核酸配列を、図２に示し、配列表にも含める。

免疫グロブリン軽鎖核酸配列がＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子配列を含み、置換（複数可）がＣＤＲ３コドンにおいてである一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０６位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０７および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。様々なヒスチジン置換を含むＶκ３−２０Ｊκ１のＣＤＲ３領域の選択されたアミノ酸配列および核酸配列を、図１２に示し、配列表にも含める。

免疫グロブリン軽鎖、例えば、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの配列を、ヒスチジン残基を所望の位置に含むように改変したら、軽鎖のヌクレオチド配列を、好適な宿主細胞、例えば、真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞における発現のためのベクターへとクローニングする。一実施形態では、ヒト軽鎖定常領域の配列を、ヒト可変領域の改変されたヌクレオチド配列の下流にクローニングする。

一実施形態では、改変されたヒト免疫グロブリン軽鎖および選択されたヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、好適な宿主細胞、例えば、真核生物の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞内で共発現させて、抗原結合タンパク質を生成する。当技術分野では、発現のために用い得る様々な宿主細胞が公知であり、本明細書を通して言及される。

宿主細胞において生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、細胞上清へと分泌させることができ、これを、中性ｐＨにおける適正な発現および元の抗原に対する親和性についてスクリーニングする。抗原結合タンパク質はまた、細胞溶解物からも回収することができ、膜結合型である場合は、好適な洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を用いて、膜から放出させることもできる。所望の特徴を有する抗原結合タンパク質は、精製することができる。

一実施形態では、ヒスチジン改変（複数可）を含む抗原結合タンパク質は、ヒスチジン改変（複数可）を含まない同じ（元の）抗原結合タンパク質の抗原に対する親和性と同等な、抗原に対する親和性を保持する。一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される、ヒスチジン改変抗原結合タンパク質の目的の抗原に対する親和性は、１０^−６Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−９Ｍ未満、例えば、１０^−１０Ｍ未満、例えば、１０^−１１Ｍ未満、例えば、１０^−１２Ｍ未満である。

一実施形態では、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す。一実施形態では、ヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質は、ヒスチジン改変を有さない同等な抗原結合タンパク質（ヒスチジン改変を除けば、同じアミノ酸配列の抗原結合タンパク質）を凌駕する、増強したｐＨ依存特性を保有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持する（例えば、中性ｐＨでは、抗原に対する所望の親和性を保持する）が、酸性ｐＨでは、結合の低減を提示する。一実施形態では、本明細書に記載されている、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合を示さない。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、中性ｐＨにおける抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、酸性ｐＨで、解離半減期（ｔ_１／２）の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約１分間未満である。

一実施形態では、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、治療用量を被験体へと投与すると、同等な治療用量の、ヒスチジン改変を含まない抗原結合タンパク質（例えば、ヒスチジン改変を含まない、元の抗原結合タンパク質）を投与したときの血清半減期と比較して、血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、ある用量の、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質を投与したときの血清半減期の、同じ用量の、ヒスチジン改変を含まない抗原結合タンパク質を投与したときの血清半減期に対する延長は、約２倍、例えば、約５倍、例えば、約１０倍、例えば、約１５倍、例えば、約２０倍、またはそれ超である。一実施形態では、血清半減期は、少なくとも約１日間、例えば、少なくとも約２日間、例えば、少なくとも約７日間、例えば、少なくとも約１４日間、例えば、少なくとも約３０日間、例えば、少なくとも約６０日間である。

上記で記載した、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をｉｎｖｉｔｒｏで生成するための方法に加えて、本明細書では、前記方法により生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体もまた提供される。加えて、前記方法は、マウスにおける共通（ユニバーサル）軽鎖に結合する、２つの異なるヒト免疫グロブリン重鎖を選択し、重鎖のヌクレオチド配列を決定し、ユニバーサル軽鎖を、上記で記載したヒスチジン置換を含むように改変し、単一の、ヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖を有する２つのヒト重鎖を宿主細胞内で共発現させることにより、多重特異性、例えば、二重特異性の抗原結合タンパク質を生成するのにも使用することができる。上記で記載した抗原結合タンパク質を生成するための様々なステップは、二重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法へも適用することができる。抗原（複数可）に対する所望の親和性およびｐＨ依存性の抗原結合特性を保有することが確認された二重特異性抗原結合タンパク質は、精製することができる。したがって、２つのヒト重鎖および、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むヒト可変領域遺伝子、例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５可変領域遺伝子またはＶκ３−２０Ｊκ１可変領域遺伝子によりコードされるヒト軽鎖可変ドメイン配列を含む単一のヒト軽鎖を含む二重特異性抗体が提供される。

一部の実施形態では、二重軽鎖マウスにおいて生成される軽鎖、例えば、抗原特異的軽鎖を使用して、ｐＨ依存性の結合特徴を有する抗原結合タンパク質を生成するための方法、ならびに、前記方法によって生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体も本明細書において提供される。前記方法によって生成される、このような方法および抗体は、本明細書から明らかである。

また一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖と、ヒスチジン置換を含むヒト免疫グロブリン軽鎖とを含む抗原結合タンパク質の作製において使用される構築物もまた提供される。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質、例えば、抗体を発現する宿主細胞もまた提供される。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製、使用する方法を当業者に説明するために提供され、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではない。用いる数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤差および逸脱があることが考慮されるべきである。実施例は、当業者に周知である、従来の方法（分子クローニング技法など）の詳細な記載を含まない。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示され、気圧は大気圧またはその近くである。

（実施例１）
抗原特異的ヒト軽鎖内のヒスチジン残基の同定
共通軽鎖マウス（例えば、Ｖκ１−３９共通軽鎖マウスまたはＶκ３−２０共通軽鎖マウス）の生成、およびこれらのマウスにおける抗原特異的抗体の生成は、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、および同第１３／４１２，９３６号（それぞれ、特許公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、および同第２０１２／０１９２３００号）において記載されている。手短には、マウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅｇｅｎｏｍｅｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照）を用いて、再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖ターゲッティングベクターが作製され、そして、ゲノム構築物を単一の再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域を含むように操作し、内在性κ可変および連結遺伝子セグメントを欠失させるために事前に改変しておいた内在性κ軽鎖遺伝子座に挿入した。再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１領域を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣＤＮＡを用いた。標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｉｃｅｔｈａｔａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｆｕｌｌｙｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｈｅｄｏｎｏｒｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄＥＳｃｅｌｌｓａｌｌｏｗｉｎｇｉｍｍｅｄｉａｔｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｅｓＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照）。特有な再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変型を用いる遺伝子タイピングによって、操作されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を同定した。

操作されたヒト生殖細胞系列の軽鎖遺伝子座を保有するマウス（ＵＬＣマウス）を、内在性マウス重鎖可変遺伝子座のヒト重鎖可変遺伝子座による置きかえを含有するマウス（ＵＳ６，５９６，５４１を参照されたい；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）と交配させた。
単一の、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、目的の抗原でチャレンジし、ユニバーサル軽鎖（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５）を含む抗体を単離および配列決定する。

抗原特異的ヒト抗体から選択された、Ｖκ１−３９を含む軽鎖（それぞれ、配列番号１３６〜１４６に対応する、Ａ〜Ｋ）のアミノ酸配列をアラインメントした。選択された数の抗原特異的ヒト抗体について、ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のＣＤＲ内のヒスチジン変異を同定した（図１）。生殖細胞系列のＶκ１−３９のアミノ酸配列をアラインメントの上方に示し、配列番号１にも示し、Ｖκ１−３９Ｊκ５についての完全な可変ドメインのアミノ酸配列を配列番号８０に示す。

（実施例２）
ヒスチジン置換したヒトユニバーサル軽鎖抗体の操作および特徴付け
（実施例２．１）
ヒスチジン残基の生殖細胞系列ヒト再構成軽鎖への操作
操作したヒスチジン残基を、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１位に導入するように特別にデザインされた部位特異的変異誘発プライマーを用いて、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖へと操作した。当技術分野で公知の分子技法（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩＸＬＳｉｔｅＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、部位特異的変異誘発を実施した。ＣＤＲ３内の操作された残基の位置を図２に示し、図２に示された、ヒスチジン置換したＣＤＲ３の核酸配列を、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に示す（対応するアミノ酸配列を、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３に示す）。生殖細胞系列の、再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２および３に示す。

（実施例２．２）
ヒスチジン操作した軽鎖の構築および発現
実施例２に従い作製された、生殖細胞系列の、操作したヒスチジン残基を含有するヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖を構築し、ヒト細胞表面受容体に特異的である、様々なヒト重鎖（１〜５と表示される）と対合させて、ＣＨＯ細胞における発現を解析した。ヒスチジン置換したＶκ１−３９に由来する軽鎖と対合させた、ヒト細胞表面受容体に特異的な５つのヒト重鎖は、単一の、再構成されたヒト軽鎖（ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５の再構成された軽鎖；ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１を参照されたい）を有するマウスから得た。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：ＣＨＯ細胞からの抗体の分泌は、ＦｃＥＬＩＳＡを用いて、５つの異なる重鎖を有する、表示されるヒスチジン改変を有する軽鎖について検出した。軽鎖配列および重鎖配列（改変を除く）は、単一の、再構成されたヒト軽鎖（例えば、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５の再構成された軽鎖；ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１を参照されたい）を有するマウスにおいて生成された。捕捉抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧであり、検出抗体は、ヤギ抗ヒト（Ｆｃガンマ特異的）−ＨＲＰであった。結果を図３に示す。ＵＬＣ＋重鎖：特異的重鎖および改変されていないヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖。図３に示される通り、発現は、ほぼ全ての変異体において検出された。

タンパク質イムノブロット：ＣＨＯ細胞の上清中の、ヒスチジン操作した軽鎖と対合させた抗原特異的重鎖の発現を、ウェスタンブロットによりさらに解析した。試料を、４〜１２％のトリス−グリシンゲル上で泳動させた。選択された重鎖（重鎖３）を用いた結果を、図４に示す。ＵＬＣとは、再構成されたヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖（上記で記載した）を指す。

（実施例２．３）
ヒスチジン操作した軽鎖の結合親和性の決定
選択された抗体上清についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）、解離半減期（ｔ_１／２）、および他の動力学的パラメータは、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭＴ２００装置（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）により決定した。キネティクスは、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５で測定した。結果を図５Ａ〜５Ｅに示す。

中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ５．７５）における、抗体の免疫原への結合についての動力学的結合特性（ｋｉｎｅｔｉｃｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｙ）（例えば、ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、ｔ_１／２など）の数値は、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＢｉａｃｏｒｅＴ２００）を用いて得た。ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップを、マウス抗ヒトＦｃ抗体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した。次いで、単一濃度（５０ｎＭ）の免疫原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、２．５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の、捕捉抗体からの解離を、８分間にわたりモニタリングした。会合動力学速度定数（ｋａ）および解離動力学速度定数（ｋｄ）は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ１．０を用い、データを処理して物質移動モデルによる１：１の結合へとフィッティングすることにより、決定した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）は、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝（ｌｎ２／（６０×ｋ_ｄ）として、動力学速度定数から計算した。

図５に示される通り、抗体の細胞表面受容体への結合アッセイでは、抗原特異的ヒト重鎖と対合させた、ヒスチジン改変共通軽鎖（Ｖκ１−３９／Ｊκ５軽鎖のヒスチジン改変ＣＤＲ３）を有する５つの抗体のうちの２つが、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５において、異なる親和性で、抗原へ（例えば、細胞表面受容体への）の結合を示した。ｐＨ７．４では、結合を保持するが、ｐＨ５．７５では、低度の結合を示すか、または検出可能な結合を示さない、ヒスチジン改変を有する抗体が望ましい。ｐＨ５．７５におけるｔ_１／２のｐＨ７．４におけるｔ_１／２と比較した短縮を示す、ヒスチジン改変を有する抗体が望ましい。

ヒスチジン改変共通軽鎖および３つの抗原特異的重鎖を含む３つの抗体（２、３、および６と表示される）についての、異なるｐＨにおける抗原結合データを、図６にさらにまとめる。例えば、ｐＨ５．７５におけるｔ_１／２の短縮または結合が検出されないことにより裏付けられる通り、これらの抗体は、ｐＨ５．７５において、ｐＨ７．４における抗原結合と比較した、抗原結合の有意な低下を示した。

（実施例３）
ヒスチジン置換したヒトＶκ１−３９Ｊκ５ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作および特徴付け
（実施例３．１）
再構成されたヒト軽鎖可変領域内のヒスチジン残基を操作するためのターゲッティングベクターの構築
当技術分野で公知の標準的な分子クローニング技法により作製されるターゲッティングベクターを用いて、ヒト軽鎖のＣＤＲ領域へと操作したヒスチジン残基を有する、再構成されたヒト軽鎖遺伝子を含有する遺伝子改変マウスを作製する。

手短には、マウスゲノムの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを、単一の、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を含有するように改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら（２００３年）、High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis、Nature Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）を用いて、様々な、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖ターゲッティングベクターを作製し、内在性κ可変遺伝子セグメントおよび内在性κ接合遺伝子セグメントを欠失させるように既に改変された内在性κ軽鎖遺伝子座へと挿入する。再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を、軽鎖の配列内の１つまたは複数のヌクレオチド位置において、生殖細胞系列配列のそれぞれの位置には通常存在しないヒスチジン残基をコードするように改変する。ターゲッティングベクターを、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞へとエレクトロポレーションし、定量的ＰＣＲアッセイ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ^ＴＭ）を用いて確認する。

具体的には、これらのターゲッティングベクターを構築するための戦略を、図８Ａ〜８Ｆに示す。共通（ユニバーサル）軽鎖マウス（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１において記載されている「ＵＬＣマウス」）のターゲッティングベクターを生成するために用いられるプラスミドであって、ｐＢＳ＋ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ＦＲＴ＋マウスＶκ３−７リーダー＋ヒトＶκ１−３９Ｊκ５を含有するプラスミドを、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩＸＬＫｉｔ）により、図７に示される部位特異的変異誘発プライマーを用いて、ＣＤＲ３領域内のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１、またはＱ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１を、ヒスチジン残基で置きかえるように改変した（この操作ステップについては、図８Ａを参照されたい）。結果として得られるベクター（Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１およびＨ１０６／１０８／１１１）をさらに改変し、マウスＩｇκ定常領域、マウスエンハンサー、マウス３’側相同性アーム、およびＳＰＥＣカセットを含むベクターへとライゲーションした（図８Ｂ）。さらなる改変は、５’側マウスアームを保有し、Ｆｒｔ−Ｕｂ−ＮＥＯ−Ｆｒｔカセットを含むベクターへのライゲーションを包含した（図８Ｂ）。結果として得られるターゲッティングベクターを、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞へとエレクトロポレーションした（図８Ｃ〜８Ｆ）。

陽性のＥＳ細胞クローンは、内在性κ軽鎖遺伝子座へと挿入される、操作されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域に対して特異的なプローブを用いる、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら）の改変型を用いることにより確認した。アッセイにおいて用いられるプライマーおよびプローブを、下記の表１に示し、配列表にも示し、プローブの位置を、図８Ｃ〜８Ｆに示す。

ターゲッティング構築物により導入されるＮＥＯ選択カセットは、ＥＳ細胞に、ＦＬＰを発現するプラスミドをトランスフェクトすることにより欠失させた（図８Ｃおよび８Ｅ）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰレコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることにより除去することもできる。必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。

上記で記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、８細胞期マウス胚へと導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号；およびPoueymirouら（２００７年）、F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses、Nature Biotech.、２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。配列に沿った１つまたは複数の位置において変異させたヒスチジン残基を含有する、操作されたヒト軽鎖遺伝子を独立に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、上記で記載した標的ＥＳ細胞から作製した。

仔マウスを遺伝子型決定し、操作された、ヒスチジン改変ヒト軽鎖についてヘテロ接合性の仔マウスを、軽鎖の発現および発現させた抗体の結合能を特徴づけるために選択した。３カ所の（Ｈ１０６／１０８／１１１；「１９３０」）ヒスチジン改変または４カ所の（Ｈ１０５／１０５／１０８／１１１；「１９２７」）ヒスチジン改変を有するユニバーサル軽鎖遺伝子を特異的に含むマウスを遺伝子型決定するためのプライマーおよびプローブを、下記の表２に列挙し、配列表にも示す。本明細書では、ヒスチジン改変をそれらのユニバーサル軽鎖内に含有するマウスを、「ＨＵＬＣ」マウス（ヒスチジンユニバーサル軽鎖マウス）と称する。

（実施例３．２）
ヒスチジン置換したヒトユニバーサル軽鎖を有するマウスにおける抗原への免疫応答の解析
細胞表面受容体（「抗原Ａ」）を、ＣＤＲ３内に４カ所のヒスチジン置換を有するＶκ１−３９およびＪκ５を使用して既定の（ｐｒｅ−ａｒｒａｎｇｅｄ）ヒトカッパ軽鎖の発現についてヘテロ接合性であるマウス（以下では、「ＨＵＬＣ１９２７」とする）、もしくはＣＤＲ３内に３カ所のヒスチジン置換を有するＶκ１−３９およびＪκ５を使用して既定のヒトカッパ軽鎖の発現についてヘテロ接合性であるマウス（以下では、「ＨＵＬＣ１９３０」とする）のいずれか、またはホモ接合性のＷＴマウスを免疫する免疫原として用いた。免疫を開始する前に、免疫前血清を、マウスから収集した。免疫原は、足蹠（ｆ．ｐ．）を介して、容量２５μｌ中に、アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）１０μｇと混合した、初回抗原刺激による免疫のためのタンパク質２．３５μｇを投与した。その後、３、６、１１、１３、１７、２０日目において、合計６回の追加免疫のために、マウスに、同じ経路を介して、２．３５μｇの抗原Ａを、アジュバントとしての１０μｇのＣｐＧおよび２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）と共に追加免疫した。それぞれ、４および６回目の追加免疫の後の１５および２２日目において、マウスから採血した。それらの抗血清を、抗原Ａに対する抗体力価についてアッセイした。

免疫原に対する抗体血清力価は、標準的なＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡを実施するために、９６ウェルマイクロ滴定プレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の２μｇ／ｍｌの抗原Ａにより、４℃で一晩にわたりコーティングした。翌日、プレートを、プレート洗浄機（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ−Ｔ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、４回にわたり洗浄した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２５０μｌでブロッキングし、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで４回にわたり洗浄した。免疫したマウスからの血清および免疫前血清を、０．５％のＢＳＡ−ＰＢＳ中に、１：３００または１：１０００で始めて３倍の系列希釈を行い、ブロッキングしたプレートへと二連で添加し、次いで、室温で１時間にわたりインキュベートした。最後の２つのウェルは、ブランクのまま放置して、二次抗体対照（バックグラウンド対照）として用いた。プレート洗浄機により、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで、４回にわたり再度洗浄した。次いで、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、１：５０００／１：１０，０００の希釈率でプレートへと添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで８回にわたり洗浄し、ＴＭＢ／Ｈ_２Ｏ_２を基質として用いて発色させた。基質を２０分間にわたりインキュベートし、２Ｎの硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４；ＶＷＲ、カタログ番号ＢＤＨ３５００−１）または１Ｎのリン酸（ＪＴＢａｋｅｒ、カタログ番号７６６４−３８−２）で反応を停止させた。プレートは、分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）において４５０ｎｍで読み取った。抗体力価は、ＧｒａｐｈｐａｄＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて計算した。

マウスにおいて、注入された免疫原に対して誘導された免疫応答は、抗原結合の吸光度がバックグラウンドの２倍となる最大の血清希釈率の逆数として定義される、抗体力価として表される。したがって、抗体力価数が大きいほど、免疫原に対する体液性免疫応答が大きくなる。免疫原に対して誘導された抗体力価は、ＨＵＬＣマウスの両方の系統でも、ＷＴマウスでも、極めて大きく、系統の間で有意差は観察されなかった（図９）。

（実施例３．３）
ｐＨ感受性モノクローナル抗体の生成
ＨＵＬＣマウス両方の系統でも、ＷＴマウスでも、免疫原に対する所望の免疫応答が達成されたら、各マウス系統からの脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成し、９６ウェルプレート内で成長させた。１０日間成長後、各ハイブリドーマ細胞含有ウェルからの上清を、免疫原特異的ＥＬＩＳＡを介してスクリーニングして、陽性の抗原結合試料を同定した。ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルマイクロ滴定プレートを、１ｕｇ／ｍＬの抗ｍｙｃポリクローナル抗体（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、番号ＮＢ６００−３４）により、４℃で一晩にわたりコーティングして、ｍｙｃタグ付けされた抗原を固定し、これに続いて、ＰＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ溶液でブロッキングした。プレートを洗浄し、抗原溶液を、１μｇ／ｍＬの濃度でプレートへと添加し、室温で１時間にわたり、コーティングしたプレートに結合させた。その後、ハイブリドーマ細胞からの上清を、１：５０の希釈率でウェルへと添加し、室温で１時間にわたり結合させた。プレートに結合した抗体は、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号１１５−０３５−１６４）を用いて検出した。ＴＭＢ基質を、プレート（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号５１−２６０６ＫＣ／５１−２６０７ＫＣ）へと添加し、製造元により推奨されるプロトコールに従い、比色シグナルを生じさせた。吸光度は、ＶｉｃｔｏｒＷａｌｌａｃプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで記録した。ＯＤが０．５以上（ベースラインのＯＤは約０．１）を有するとして定義される抗原陽性試料は、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ４０００）を用いて、親和性スクリーニングにかけた。

中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）における、抗体の免疫原への結合についての動力学的結合パラメータ（例えば、ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、ｔ_１／２など）を記録した。ＢｉａｃｏｒｅＣＭ４センサーチップを、ポリクローナルヤギ抗マウスＦｃ抗体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した。次いで、単一濃度（１００ｎＭ）の免疫原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、１．５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の、捕捉抗体からの解離を、２．５分間にわたりモニタリングした。会合動力学速度定数（ｋ_ａ）および解離動力学速度定数（ｋ_ｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ１．０を用い、データを処理して物質移動モデルによる１：１の結合へとフィッティングすることにより、決定した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）は、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋ_ｄ）として、動力学速度定数から計算した。ｐＨ６．０において、ｐＨ７．４における結合と比較して結合の低下を提示する試料のセット（ｐＨ感受性）、ならびにｐＨ７．４とｐＨ６．０との間で有意な速度の変化を提示しない対照試料のセット（ｐＨ非感受性の対照）を、クローン作製するために選択した。図１０は、全抗原陽性クローンの数と、ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスからのｐＨ感受性抗原結合を提示する抗原陽性クローンの数との比較を示す。

抗原陽性クローンのうち、２匹のヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスおよび２匹のＨＵＬＣ１９３０のそれぞれから単離された１８のクローンおよび７つのクローン、ならびにＷＴマウスからの１つのクローンは、モノクローナルとなった。モノクローナルハイブリドーマの上清を、中性ｐＨおよび低ｐＨにおける抗原解離速度（オフ速度）解析にかけ、細胞ペレットを軽鎖可変ドメインＤＮＡの配列決定に用いた。

（実施例３．４）
Ｖκ１−３９Ｊκ５に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスのＣＤＲ３領域における配列決定および体細胞超変異
ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスによるモノクローナルハイブリドーマからの細胞ペレットを、軽鎖可変ドメインＤＮＡの配列決定に用いた。２６のクローンがモノクローナルとなり（上記の実施例３．３を参照されたい）、これらを配列決定にかけ、１５のクローンを、ＨＵＬＣマウス軽鎖またはＷＴマウス軽鎖（ＭＭおよびＮＮ；表４を参照されたい）を用いて確認した。１４のクローンは、ＨＵＬＣヘテロ接合性マウス（１９２７マウスまたは１９３０マウス）に由来し、１つのクローンは、ＷＴマウスに由来した（ＯＯ；表４を参照されたい）。

ＨＵＬＣヘテロ接合性マウスに由来する１４の抗原陽性試料のうち、１２のモノクローナル抗体が、それらの対応するＨＵＬＣ軽鎖を使用したのに対し、２つのモノクローナル抗体は、ＷＴマウスの軽鎖を使用した。表３に示される通り、ＨＵＬＣを使用する抗体のうちの１つ（斜字体の抗体）を除く全ては、導入されたヒスチジン変異の全てを保持した。クローンＡＡを配列決定したところ、２つの異なるＨＵＬＣ配列がもたらされたが、表３では、これらを２つの項目で表す。

（実施例３．５）
Ｖκ１−３９Ｊκ５に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスにおいて生成されるモノクローナル抗体のｐＨ依存性結合
ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスから単離されたモノクローナル抗体のｐＨ依存性結合特徴をさらに評価するために、中性ｐＨにおいて抗体／抗原間の会合相を観察し、中性または酸性ｐＨにおいて抗体／抗原間の解離相を観察する、結合実験を実行した。

ＢｉａｃｏｒｅＣＭ４センサーチップを、ポリクローナルウサギ抗マウスＦｃ抗体で誘導体化した。モノクローナル抗体上清を抗マウスＦｃセンサー表面上に捕捉した。次いで、５０ｎＭ（二連で）および１６．７ｎＭという２つの濃度の免疫原を、モノクローナル抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、ｐＨ７．４で４分間にわたりモニタリングし、次いで、捕捉モノクローナル抗体からの抗原の解離を、ｐＨ７．４またはｐＨ６．０で１５分間にわたりモニタリングした。解離速度定数（ｋ_ｄ）は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒｖｅｒｓｉｏｎ２．０曲線フィッティングソフトウェアを用い、データを処理してフィッティングすることにより決定し、これを、表４に示す。解離半減期（ｔ_１／２）は、ｔ_１／２（分）＝（ｌｎ２／ｋ_ｄ）／６０として、解離速度定数から計算し、これを、表４に示す。表４に列挙される複数の抗体の、様々なｐＨ条件下における会合／解離特徴を示すセンサーグラムを、図１１にグラフで示す。各グラフ内の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記する。応答は、ＲＵ単位で測定する。

（実施例４）
ヒスチジン置換したヒトＶκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作
例えば、米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、同第１３／４１２，９３６号、および同第１３／４８８，６２８号（それぞれ、特許公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号）、ならびに上記の実施例１において記載されている通りに、共通Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖を含むマウスを生成した。生殖細胞系列のユニバーサルＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、配列番号５９に示す。

Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖マウス（ＨＵＬＣ１９２７およびＨＵＬＣ１９３０）について、上記の実施例３で記載した戦略と同様の戦略を用いて、ヒスチジン置換を、Ｖκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖のターゲッティングベクターへと導入し、このベクターからマウスを生成した。

手短には、ヒスチジン改変Ｖκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖ターゲッティングベクターを生成するための戦略を、図１４Ａ〜１４Ｄにまとめる。共通（ユニバーサル）軽鎖マウス（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１において記載されている「ＵＬＣマウス」）のためのターゲッティングベクターを生成するために用いられるプラスミドであって、ｐＢＳ＋ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ＦＲＴ＋マウスＶκ３−７リーダー＋ヒトＶκ３−２０Ｊκ１を含有するプラスミドを、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＬｉｇｈｔｎｉｎｇＫｉｔ）により、図１３に示される部位特異的変異誘発プライマーを用いて、ＣＤＲ３領域内のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０７、およびＳ１０９、またはＱ１０５、Ｑ１０６、およびＳ１０９（図１２のアラインメントを参照されたい）を、ヒスチジン残基で置きかえるように改変した（この操作ステップについては、図１４Ａを参照されたい）。結果として得られるベクター（Ｈ１０５／１０６／１０７／１０９およびＨ１０５／１０６／１０９）をさらに改変し、マウスＩｇκ定常領域、マウスエンハンサー、マウス３’側相同性アーム、およびＳＰＥＣカセットを含むベクターへとライゲーションした（図１４Ｂ）。さらなる改変は、５’側マウスアームを保有し、Ｆｒｔ−ＵＢ−ＮＥＯ−Ｆｒｔカセットを含むベクターへのライゲーションを包含した（図１４Ｂ）。結果として得られるターゲッティングベクターを、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞へとエレクトロポレーションした（図１４Ｃ〜１４Ｄ）。

陽性のＥＳ細胞クローンは、内在性κ軽鎖遺伝子座へと挿入される、操作されたＶκ３−２０κＪ１軽鎖領域に対して特異的なプローブを用いる、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら）の改変型を用いることにより確認した。アッセイにおいて用いられるプライマーおよびプローブを、下記の表５に示し、配列表にも示し、プローブの位置を、図１４Ｃ〜１４Ｄに示す。

ターゲッティング構築物により導入されるＮＥＯ選択カセットは、ＥＳ細胞を、ＦＬＰを発現するプラスミドでトランスフェクトすることにより欠失させる（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰレコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることにより除去することもできる。必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。

上記で記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、８細胞期マウス胚へと導入する（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号；およびPoueymirouら（２００７年）、F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses、Nature Biotech.、２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。配列に沿った１つまたは複数の位置において変異させたヒスチジン残基を含有する、操作されたヒト軽鎖遺伝子を独立に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、上記で記載した標的ＥＳ細胞から作製する。

仔マウスを遺伝子型決定し、操作された、ヒスチジン改変ヒト軽鎖についてヘテロ接合性の仔マウスを、軽鎖の発現および発現させた抗体の結合能を特徴づけるために選択する。３カ所の（Ｈ１０５／１０６／１０９；「６１８３」）ヒスチジン改変または４カ所の（Ｈ１０５／１０５／１０８／１１１；「６１８１」）ヒスチジン改変を有するユニバーサル軽鎖遺伝子を特異的に含むマウスを遺伝子型決定するためのプライマーおよびプローブを、下記の表６に列挙し、配列表にも示す。本明細書では、ヒスチジン改変をそれらのユニバーサル軽鎖内に含有するマウスを、「ＨＵＬＣ」マウス（ヒスチジンユニバーサル軽鎖マウス）と称する。

マウスを目的の抗原で免疫し、ｐＨ依存性結合を有する抗体を生成する能力について調べる。

（実施例５）
ヒスチジン置換したヒトユニバーサル軽鎖（ＨＵＬＣ）を含むマウスの交配
本実施例は、本明細書に記載されているヒトＨＵＬＣマウスのうちのいずれか１つと交配させて、多重の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を保有する、多重の遺伝子改変マウス系統を作製し得る、複数の他の遺伝子改変マウス系統について記載する。

内在性Ｉｇλノックアウト（ＫＯ）
操作された軽鎖遺伝子座の使用頻度を最適化するために、上記のＨＵＬＣ動物（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を含む）のうちの任意の１つを、内在性λ軽鎖遺伝子座に欠失を含む別のマウスと交配させ得る。この様式において、得られる子孫は、それらの唯一の軽鎖として、上記の実施例３および４に記載されるとおりの再構成されたヒスチジン置換したヒト生殖細胞系列軽鎖領域を発現する。交配は、当技術分野で認められる標準技術によって、あるいは商業的な繁殖家（例えば、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施される。操作されたヒスチジン置換した軽鎖遺伝子座、および内在性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス系統は、特有な軽鎖領域の存在および内在性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングされる。

ヒト化内在性重鎖遺伝子座
操作されたヒト生殖細胞系列軽鎖遺伝子座を有するマウス（ＨＵＬＣマウス）は、ヒト重鎖可変遺伝子の遺伝子座による内在性マウス重鎖可変遺伝子の遺伝子座の置換を含むマウスと交配させられる（ＵＳ６，５９６，５４１およびＵＳ８，５０２，０１８を参照；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、マウスが抗原刺激に応じてヒト重鎖可変ドメインおよびマウス重鎖定常領域を含む抗体を生成するように、内在性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域を含むゲノムを含む。

内在性マウス重鎖可変領域遺伝子座のヒト重鎖可変領域遺伝子座による置きかえ、および内在性κ軽鎖遺伝子座内に、ヒスチジン置換した、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域を保有するマウスを得る。目的の抗原で免疫すると、ヒスチジン置換した単一のヒト軽鎖（ＨＵＬＣ；ヒト軽鎖可変ドメインおよびマウスＣ_Ｌ）を有する体細胞変異重鎖（ヒト重鎖可変ドメインおよびマウスＣ_Ｈ）を含有するリバースキメラ抗体が得られる。このようなマウスにおいて生成されるｐＨ依存性ヒト抗体は、当技術分野で公知であるかまたは上記で記載した抗体の単離およびスクリーニング法を用いて同定する。抗体、例えば、ｐＨ感受性抗体を発現するＢ細胞の可変軽鎖領域および可変重鎖領域のヌクレオチド配列を同定し、好適な発現系で、可変重鎖領域および可変軽鎖領域のヌクレオチド配列を、ヒトＣ_Ｈヌクレオチド配列およびヒトＣ_Ｌヌクレオチド配列のそれぞれへと融合させることにより、完全ヒト抗体を作製する。

（実施例６）
ヒスチジン置換されたヒトユニバーサル軽鎖（ＨＵＬＣ）とヒト重鎖可変ドメインとを含むマウスにおいて生成された抗体のｐＨ依存性の結合
操作されたＶκ１−３９／Ｊκ５ＵＬＣ（１６３３）、または４つのヒスチジン置換（ＨＵＬＣ１９２７）もしくは３つのヒスチジン置換（ＨＵＬＣ１９３０）のいずれかを含むＶκ１−３９／Ｊκ５を保有するマウスを、内在性マウス重鎖可変領域遺伝子座のヒト可変領域遺伝子座による置きかえを含むマウスと交配させた（ＵＳ６，５９６，５４１およびＵＳ８，５０２，０１８参照、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。ヒト重鎖可変領域遺伝子座および操作されたＵＬＣ（「ＵＬＣ１６３３ｈｏ／ｈｕｍａｎｈｅａｖｙｈｏ」と表示される）、４つのヒスチジン置換を含むＶκ１−３９／Ｊκ５（「ＨＵＬＣ１９２７ｈｏ／ｈｕｍａｎｈｅａｖｙｈｏ」と表示される）、または３つのヒスチジン置換を含むＶκ１−３９／Ｊκ５（「ＨＵＬＣ１９３０ｈｏ／ｈｕｍａｎｈｅａｖｙｈｏ」と表示される）のいずれかの両方についてホモ接合性のマウスを得た。

その後、上記の、軽鎖遺伝子座と重鎖遺伝子座の両方における改変についてホモ接合性である遺伝子操作マウスを、サイトカイン受容体（「抗原Ｂ」）を用いた免疫のために用いた。３匹のＵＬＣ１６３３ｈｏ／ｈｕｍａｎｈｅａｖｙｈｏマウス、７匹のＨＵＬＣ１９２７ｈｏ／ｈｕｍａｎｈｅａｖｙｈｏマウスおよび６匹のＨＵＬＣ１９３０ｈｏ／ｈｕｍａｎｈｅａｖｙｈｏマウスを免疫のために用いた。

マウスを屠殺し、脾細胞を採取した。溶解によって赤血球を除去し、続いて採取した脾細胞をペレット化した。再懸濁した脾細胞を、抗原陽性Ｂ細胞の同定および単離を可能にし得る試薬のカクテルと一緒にインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ＩｇＧ陽性Ｂ細胞、ＩｇＭ陰性Ｂ細胞および抗原陽性Ｂ細胞の各々を選別し、３８４ウェルプレートの別々のウェルにまいた。個々のＢ細胞をＰＣＲに供して抗原特異的な重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを増幅した。増幅された重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含有する抗体ベクターにクローニングした。同じＢ細胞由来の重鎖可変配列および軽鎖可変配列を有する精製された組換えプラスミドを共トランスフェクトし、ＣＨＯ宿主細胞株において発現させた。

発現した抗体を、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ４０００）を用いて、親和性スクリーニングにかけた。中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）における、抗体の免疫原への結合についての動力学的結合パラメータ（例えば、ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、ｔ_１／２など）を記録した。ＢｉａｃｏｒｅＣＭ４センサーチップを、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した。次いで、単一濃度（１００ｎＭ）の免疫原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、１．５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の、捕捉抗体からの解離を、２．５分間にわたりモニタリングした。動力学的会合速度定数（ｋ_ａ）および解離速度定数（ｋ_ｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ１．０を用い、データを処理して物質移動モデルによる１：１の結合にフィッティングすることにより、決定した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）は、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋ_ｄ）として、動力学速度定数から計算した。

Ｂｉａｃｏｒｅ結合体を、測定可能なＫ_Ｄを有するあらゆる抗体と定義した。本実験では、ｐＨ依存性の結合体を、ｐＨ７．４におけるｔ_１／２のｐＨ６．０におけるｔ_１／２に対する比が約２超であるあらゆる抗体と定義した。

以下の表７に示されている通り、１９２７ＨＵＬＣマウスおよび１９３０ＨＵＬＣマウスでは、１６３３ＵＬＣマウスと比較してｐＨ依存性の抗原結合を提示する抗体の百分率が２〜３倍上昇した。

（実施例７）
２つのヒトＶセグメントを含むマウスの生成および分析
（実施例７．１）
２つのヒトＶセグメントを含むマウスを生成するためのターゲッティングベクターの構築
２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント）を含有する２つの操作された軽鎖遺伝子座を構築した（図１６Ｂ）。一方の操作された軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを再構成されていない配置で含有するものであった（ＤＬＣ−５Ｊ）。第二の操作された軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκ遺伝子セグメントを再構成されていない配置で含有するものであった（ＤＬＣ−１Ｊ）。２つの追加的な操作された軽鎖遺伝子座の各々について、Ｂ細胞におけるヒト遺伝子セグメントのｉｎｖｉｖｏにおける再構成を可能にするために、組換えシグナル配列の３’側にヒト遺伝子セグメントを隣接させた。

ＤＬＣ−１Ｊマウスの操作および生成。２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０）および１つのヒトＪκ遺伝子セグメント（Ｊκ５）を含む、あるいはＤＬＣ−１Ｊと称される軽鎖遺伝子座の生成を結果としてもたらす操作ステップを図１７に示す。具体的には、ヒトＶκ１−３９配列およびヒトＶκ３−２０配列を、ＰＣＲによってＢＡＣ鋳型（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅し、組換えシグナル配列（ｒｓｓ）およびヒトＪκ５セグメントを含有する、増幅された配列と一緒に、ＵＢ−ハイグロマイシン選択カセットを含有するプラスミドに４方向ライゲーションによってクローニングした（図１７Ａ）。図１７Ｂおよび図１７Ｃに示されている通り５’側アームおよび３’側アームを結合させた。

結果として得られるターゲッティング構築物を、図１６Ｂ（下の図；ＤＬＣ−１Ｊ）に、白抜きの楕円の組換えシグナル配列（ＲＳＳ）と共に示す。マウス配列（すなわち、内在性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の上流の配列および下流の配列）に作動可能に連結された、操作されたＤＬＣ−１Ｊ軽鎖遺伝子座の改変ＢＡＣＤＮＡクローンを、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する操作された軽鎖遺伝子座内の配列に位置するプライマーを用いたＰＣＲによって確認し、続いて、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞にエレクトロポレーションして（図１７Ｄ）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントのいずれかを発現するマウスを作製した。操作されたＤＬＣ−１Ｊ軽鎖遺伝子座を含有する陽性のＥＳ細胞クローンを、ＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニングおよび操作されたＤＬＣ−１Ｊ軽鎖遺伝子座に特異的なプローブを用いる核型分析によって確認した。ＤＬＣ−１ＪＥＳ細胞のＥＳ細胞スクリーニングのために用いられるプライマーおよびプローブの配列を以下の表８に示し、配列表に含める。

次いで、確認されたＥＳ細胞クローンを、雌マウスへの移植に使用して、ＤＬＣ−１Ｊ軽鎖遺伝子座を含み、マウスＣκドメインと融合したヒト軽鎖可変ドメインを発現する同腹仔マウスを生じさせた。仔マウスの遺伝子型決定のために用いられるプライマーおよびプローブの配列を上記の表８に列挙する。挿入される、操作された配列の上流および下流の約１００ヌクレオチドのマウス配列を含めた、操作されたＤＬＣ−１Ｊ遺伝子座を通した配列を図１８に示し、配列番号８２に記載する。

ターゲッティング構築物により導入されるＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、操作された軽鎖遺伝子座を保有するＥＳ細胞に、ＦＬＰを発現する構築物をトランスフェクトすることができる（図１７Ｅを参照されたい）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることによって除去する。必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。

ＤＬＣ−５Ｊマウスの操作および生成。２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０）および５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５）を含む、あるいはＤＬＣ−５Ｊと称される軽鎖遺伝子座を生成するために、５つのヒトＪκの全てを含む、２０００塩基対の増幅された配列を、図１７Ｂ（中央）に示されている、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκを含むベクターにライゲーションした（図１９Ａを参照されたい）。その後の操作ステップは、図１９Ｂに示されている通り、３’側アームおよび５’側アームの結合を包含した。

結果として得られるターゲッティング構築物を、図１６Ｂ（上の図；ＤＬＣ−５Ｊ）に、白抜きの楕円の組換えシグナル配列（ＲＳＳ）と共に示す。マウス配列（すなわち、内在性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の上流の配列および下流の配列）に作動可能に連結された、操作されたＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座の改変ＢＡＣＤＮＡクローンを、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する操作された軽鎖遺伝子座内の配列に位置するプライマーを用いるＰＣＲによって確認し、続いて、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞（図１９Ｃ）にエレクトロポレーションして、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントのいずれかを発現するマウスを作製した。操作されたＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座を含有する陽性のＥＳ細胞クローンを、ＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニング、および操作されたＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座に特異的なプローブを用いる核型分析によって確認した。ＤＬＣ−５ＪＥＳ細胞のＥＳ細胞スクリーニングのために用いられるプライマーおよびプローブの配列を以下の表９に示し、配列表に含める。

次いで、確認されたＥＳ細胞クローンを雌マウスへの移植に使用して、ＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座およびマウスＣκドメインと融合したヒト軽鎖可変ドメインを発現する同腹仔マウスを生じさせた。仔マウスの遺伝子型決定のために用いられるプライマーおよびプローブの配列を上記の表９に列挙する。挿入される、操作された配列の上流および下流の約１００ヌクレオチドのマウス配列を含めた、操作されたＤＬＣ−５Ｊ遺伝子座を通した配列を図２０に示し、配列番号８３に記載する。

ターゲッティング構築物により導入されるＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、操作された軽鎖遺伝子座を保有するＥＳ細胞に、ＦＬＰを発現する構築物をトランスフェクトすることができる（図１９Ｄを参照されたい）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることによって除去する。必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。

（実施例７．２）
２つのヒトＶセグメントを含むマウスの特徴づけ
フローサイトメトリー。ＤＬＣマウスにおけるＢ細胞集団およびＢ細胞の発生を脾細胞調製物および骨髄調製物のフローサイトメトリー分析によって検証した。２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ｎ＝４）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つのヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ｎ＝４）および野生型マウス（ｎ＝４）から標準の方法を用いて細胞懸濁物を作製し、蛍光標識された抗体で染色した。

簡単に述べると、細胞１×１０^６個を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤＰｈａｒｍｉｇｅｎ）と一緒に氷上で１０分にわたってインキュベートし、続いて、以下の抗体カクテルを用いて氷上で３０分にわたって標識した：ＡＰＣ−Ｈ７とコンジュゲートした抗マウスＣＤ１９（クローン１Ｄ３、ＢＤＰｈａｒｍｉｇｅｎ）、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅとコンジュゲートした抗マウスＣＤ３（クローン１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗マウスＩｇκ（クローン１８７．１、ＢＤＰｈａｒｍｉｇｅｎ）または抗マウスＣＤ４３（クローン１Ｂ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥとコンジュゲートした抗マウスＩｇλ（クローンＲＭＬ−４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）または抗マウスｃ−ｋｉｔ（クローン２Ｂ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗マウスＩｇＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ−Ｃｙ７とコンジュゲートした抗マウスＩｇＭ（クローンＩＩ／４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣとコンジュゲートした抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。染色後、細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒド中に固定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでデータの取得を実施し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて解析した。ゲーティング：総Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＣＤ３⁻）、Ｉｇκ^＋Ｂ細胞（Ｉｇκ^＋Ｉｇλ⁻ＣＤ１９^＋ＣＤ３⁻）、Ｉｇλ^＋Ｂ細胞（Ｉｇκ⁻Ｉｇλ^＋ＣＤ１９^＋ＣＤ３⁻）。骨髄コンパートメントについての結果を図２１Ａ〜２３Ｂに示す。脾臓コンパートメントについての結果を図２４Ａ〜図２７に示す。

本実施例において示されている通り、ＤＬＣ−５Ｊマウスは、脾臓コンパートメントおよび骨髄コンパートメント内に正常なＢ細胞集団を明らかに示す（図２１Ａ〜２７）。ＤＬＣ−５Ｊマウスは、骨髄コンパートメント内に、野生型同腹仔マウスにおいて観察されるものと実質的に同じである未熟Ｂ細胞集団、成熟Ｂ細胞集団およびプレ／プロＢ細胞集団を明らかに示した。実際、ＤＬＣ−５Ｊ遺伝子座は、内在性λ軽鎖遺伝子座と競合して、野生型マウスにおいて観察されるものと実質的に同じκ：λ比をもたらすことができた（図２５Ｂ）。また、ＤＬＣ−５Ｊマウスは、脾臓コンパートメントにおいて様々な段階（例えば、未熟、成熟、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、辺縁帯前駆体、辺縁帯、濾胞−Ｉ、濾胞−ＩＩなど）を経るＢ細胞の発達が、野生型マウスにおいて観察されるものと実質的に同じ様式で起こるので、正常な末梢Ｂ細胞への発生を明らかに示す（図２６Ａ〜２７）。対照的に、ＤＬＣ−１Ｊマウスは、より少ないＢ細胞の総数および操作されたκ軽鎖と比較して多くのλ軽鎖の使用を明らかに示した（データは示していない）。

二重軽鎖の発現。ホモ接合性のマウスにおける両方のヒトＶκ遺伝子セグメントの発現を、定量的ＰＣＲアッセイを用いて解析した。簡単に述べると、野生型マウス、マウス重鎖およびκ軽鎖可変遺伝子座の対応するヒト重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座による置きかえについてホモ接合性のマウス（Ｈκ）、ならびに、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントのいずれか（ＤＬＣ−５Ｊ）または１つのヒトＪκ遺伝子セグメント（ＤＬＣ−１Ｊ）を含有する操作されたκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスの骨髄および脾臓全体からＣＤ１９^＋Ｂ細胞を精製した。相対的な発現をマウスＣκ領域の発現に対して正規化した（群当たりｎ＝３〜５のマウス）。結果を図２８および図２９に示す。

再構成されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントまたはヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含有する軽鎖の発現がＤＬＣ−５ＪマウスおよびＤＬＣ−１Ｊマウスの骨髄および脾臓の両方で検出された（図２８および図２９）。骨髄コンパートメントでは、ＤＬＣマウスの両方の系統におけるヒトＶκ３−２０由来軽鎖およびヒトＶκ１−３９由来軽鎖の両方の発現が、マウスＶκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントの対応するヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントによる置きかえを含むマウスと比較して有意に高かった（Ｈκ；図２８）。ヒトＶκ３−２０由来軽鎖の発現はＨκマウスにおける発現よりも約６倍（ＤＬＣ−５Ｊ）〜１５倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高く観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスは、ヒトＶκ３−２０由来軽鎖に関してＤＬＣ−５Ｊマウスよりも約２倍高い発現を骨髄コンパートメントにおいて明らかに示した。ヒトＶκ１−３９由来軽鎖の発現はＨκマウスにおける発現よりも約６倍（ＤＬＣ−５Ｊ）〜１３倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高く観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスは、ヒトＶκ１−３９由来軽鎖に関してＤＬＣ−５Ｊマウスよりも約２倍高い発現を骨髄コンパートメントにおいて明らかに示した。

脾臓コンパートメントでは、ＤＬＣマウスの両方の系統におけるヒトＶκ３−２０由来軽鎖およびヒトＶκ１−３９由来軽鎖の両方の発現がＨκマウスと比較して有意に高かった（図２９）。ヒトＶκ３−２０由来軽鎖の発現はＨκマウスにおける発現よりも約４倍（ＤＬＣ−５Ｊ）および８倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高く観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスは、脾臓コンパートメントにおいて、ヒトＶκ３−２０由来軽鎖に関してＤＬＣ−５Ｊマウスよりも約２倍高い発現を明らかに示した。ヒトＶκ１−３９由来軽鎖の発現は、Ｈκマウスにおける発現よりも約４倍（ＤＬＣ−５Ｊ）〜５倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高く観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスは、脾臓コンパートメントにおいて、ヒトＶκ１−３９由来軽鎖に関して、ＤＬＣ−５Ｊマウスと比較して同様の発現を明らかに示した。

ＤＬＣ−５ＪマウスにおけるヒトＶ_Ｌ／Ｊ_Ｌの使用。２つの再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つの再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）を、脾臓Ｂ細胞におけるヒトＶκ／Ｊκ遺伝子セグメントの使用について逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。

簡単に述べると、ホモ接合性ＤＬＣ−５Ｊマウス（ｎ＝３）および野生型マウス（ｎ＝２）から脾臓を採取し、すりガラススライドを用いて１０％熱失活ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）１０ｍＬ中にメッシュで濾して（meshed）、単一細胞懸濁物を作製した。遠心分離機（１２００ｒｐｍで５分にわたって）を用いて脾細胞をペレット化し、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（ＧＩＢＣＯ）５ｍＬに３分にわたって溶解させた。脾細胞をＰＢＳ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈し、０．７μｍの細胞濾過器で濾過し、再度遠心分離して細胞をペレット化し、続いてこれを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。

ＡｌｌＰｒｅｐＤＮＡ／ＲＮＡｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の仕様書に従って使用して、ペレット化した脾細胞からＲＮＡを単離した。脾細胞ＲＮＡに対して、製造者の仕様書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、マウスＣκ遺伝子に特異的なプライマーを用いて５’ＲＡＣＥ（ＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）Ｓｙｓｔｅｍを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。マウスＣκ遺伝子に特異的なプライマーは、３’ｍＩｇκＣＲＡＣＥ１（ＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＣ；配列番号９０）およびｍＩｇκＣ３’−１（ＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ；配列番号９１）であった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡＣｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ベクター内の、クローニング部位を挟む位置に配置されるＭ１３フォワードプライマー（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ；配列番号９２）およびＭ１３リバースプライマー（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ；配列番号９３）を用いて配列決定した。各脾臓試料由来の１０のクローンについて配列決定した。配列を、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ参照ディレクトリーセットからのマウス免疫グロブリンおよびヒト免疫グロブリンのセットと比較して、Ｖκ／Ｊκの使用を決定した。表１０は、各脾細胞試料由来のＲＴ−ＰＣＲクローンにおいて観察された、選択されたクローンについてのＶκ／Ｊκ組合せを示す。表１１は、ＤＬＣ−５Ｊホモ接合性マウスから選択されたＲＴ−ＰＣＲクローンのヒトＶκ／ヒトＪκ接合部およびヒトＪκ／マウスＣκ接合部のアミノ酸配列を示す。小文字は、可変領域のアミノ酸配列の変異または組換えの間のＮおよび／もしくはＰ付加によって生じる非鋳型付加（non-template addition）を示す。

本実施例において示されている通り、マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結された、２つの再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つの再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）は、両方のヒトＶκ遺伝子セグメントを複数のヒトＪκ遺伝子セグメントと産生性に組み換えて、限定された免疫グロブリン軽鎖レパートリーを産生することができる。表１０に示されているＤＬＣ−５Ｊホモ接合性マウスにおける再構成の中で、Ｖκ１−３９／Ｊκ２（１）、Ｖκ１−３９／Ｊκ３（１）、Ｖκ３−２０／Ｊκ１（７）、Ｖκ３−２０／Ｊκ２（４）およびＶκ３−２０／Ｊκ３（１）について独特のヒトＶκ／Ｊκ再構成が観察された。さらに、このような独特の再構成は、発生の間にヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントの変異および／または組換えのいずれかによって生じる、軽鎖（表１１）ＣＤＲ３領域内の独特のアミノ酸の存在による接合部多様性を明らかに示した。全ての再構成がマウスＣκへの機能的なリードスルーを示した（表１１）。

総合すると、これらのデータは、どちらも再構成することが可能である（例えば、１つまたは複数、および、一部の実施形態では、最大５つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントと共に）２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの選択を示し、また、免疫グロブリン軽鎖のヒトＶ_Ｌドメインをコードするように操作されたマウスは、全ての態様においてほぼ野生型であるＢ細胞の数および発生を有することを明らかに示す。このようなマウスは、コレクション内に存在する２つの可能性のあるヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つを有する免疫グロブリン軽鎖を有する抗体のコレクションを産生する。この抗体のコレクションは、マウスが抗原による攻撃に応答することによって産生され、リバースキメラ（ヒト可変／マウス定常）重鎖の多様性に関連する。

（実施例８）
２つのヒスチジン置換されたヒト軽鎖を含むマウスの生成および特徴づけ
（実施例８．１）
それぞれが４つのヒスチジン置換を含有する２つのＶカッパセグメントを含むマウスの操作および生成
Ｖκ１−３９ＵＬＣマウスおよびＶκ３−２０ＵＬＣマウスについて、上記の二重軽鎖遺伝子座にヒスチジン置換を導入した。簡単に述べると、図１９Ａ（下）に示されているＤＬＣ配列を、図３０に示されているプライマーを用いて、部位特異的変異誘発にかけ、まずＶκ１−３９配列を改変し、その後、Ｖκ３−２０配列を改変した。結果として得られた二重軽鎖配列は、生殖細胞系列配列に、１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンが導入されたＶκ１−３９セグメント、生殖細胞系列配列に、１０５、１０６、１０７および１０９位においてヒスチジンが導入されたＶκ３−２０セグメント、ならびに５つのＪκセグメント（Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５）の全てを含有した。その後の操作ステップは、ＦＲＴ−ＵＢ−ＮＥＯ−ＦＲＴカセットを保有する５’側アームならびにマウスＩｇκエンハンサーおよび定常領域を保有する３’側アームを結合させることを包含した。図３１Ａに示されている通り（組換えシグナル配列、ＲＳＳはこの図では省略している）、このターゲッティングベクターをマウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。標的ＥＳ細胞を、表１、５、８および９において上記の領域を検出するプライマーおよびプローブ（具体的には、１６３３ｈ２、１６３５ｈ２、ｎｅｏ、Ｊｘｎ１−３９／３−２０、ｍＩｇＫｄ２およびｍＩｇＫｐ１５）、ならびに以下の表１２に列挙されている２つの追加的なプライマーおよびプローブのセットを用いて、上記の対立遺伝子アッセイの改変型によってスクリーニングした。これらの２つの追加的なプライマーおよびプローブのセットの配列は配列表に含まれる。

次いで、確認されたＥＳ細胞クローンを雌マウスへの移植に使用して、２つの存在するＶ_Ｌセグメント配列の各々において４つのヒスチジン改変を有するＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座を含み、マウスＣκドメインと融合したヒト軽鎖可変ドメインを発現する同腹仔マウスを生じさせた。ＥＳ細胞スクリーニングのために用いるものと同じ配列のいくつかを、仔マウスの遺伝子型決定にも用いる。

ターゲッティング構築物により導入されるＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、操作された軽鎖遺伝子座を保有するＥＳ細胞に、ＦＬＰを発現する構築物（例えば、ＦＬＰｏ）をトランスフェクトすることができる（図３１Ｂ参照、ＲＳＳはこの図では省いている）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることによって除去する。必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。

（実施例８．２）
それぞれが３つのヒスチジン置換を含有する２つのＶカッパセグメントを含むマウスの操作および生成
３つのヒスチジン置換を二重軽鎖マウスのＶκ１−３９およびＶκ３−２０の各々に導入した。簡単に述べると、図３２に示されているプライマーを用いて、図１９Ａ（下）に示されているＤＬＣ配列を部位特異的変異誘発にかけ、まずＶκ１−３９配列を改変し、その後、Ｖκ３−２０配列を改変した。結果として得られた二重軽鎖配列は、生殖細胞系列配列に、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンが導入されたＶκ１−３９セグメント、生殖細胞系列配列に、１０５、１０６および１０９位においてヒスチジンが導入されたＶκ３−２０セグメント、ならびに５つのＪκセグメント（Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５）の全てを含有した。その後の操作ステップは、ＦＲＴ−ＵＢ−ＮＥＯ−ＦＲＴカセットを保有する５’側アームならびにマウスＩｇκエンハンサーおよび定常領域を保有する３’側アームを結合させることを包含した。図３３Ａに示されている通り（この図ではＲＳＳは省いている）、このターゲッティングベクターをマウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。標的ＥＳ細胞を、表１、５、８および９において上記の領域を検出するプライマーおよびプローブ（具体的には、１６３３ｈ２、１６３５ｈ２、ｎｅｏ、Ｊｘｎ１−３９／３−２０、ｍＩｇＫｄ２およびｍＩｇＫｐ１５）、ならびに以下の表１３に列挙されている２つの追加的なプライマーおよびプローブのセットを用いて、上記の対立遺伝子アッセイの改変型によってスクリーニングした。これらの２つの追加的なプライマーおよびプローブのセットの配列は配列表に含まれる。

ターゲッティング構築物により導入されるＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、操作された軽鎖遺伝子座を保有するＥＳ細胞に、ＦＬＰを発現する構築物（例えば、ＦＬＰｏ）をトランスフェクトすることができる（図３３Ｂ参照、ＲＳＳはこの図では省いている）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることによって除去する。必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。

（実施例８．３）
ヒスチジン置換されたヒト二重軽鎖を含むマウスの交配
操作された、ヒスチジン置換されたヒト二重軽鎖遺伝子座を保有するマウスを、内在性λ軽鎖遺伝子座の欠失を含有するマウスと交配させて、それらの唯一の軽鎖として、二重軽鎖遺伝子座に由来する、操作された、ヒスチジン置換された軽鎖を発現する後代を生成する。

操作された、ヒスチジン置換されたヒト二重軽鎖遺伝子座を保有するマウスを、内在性マウス重鎖可変遺伝子座のヒト重鎖可変遺伝子座による置きかえを含有するマウスと交配させる（ＵＳ６，５９６，５４１およびＵＳ８，５０２，０１８を参照されたい；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。

本明細書に記載されている交配と同様の交配を上記の実施例７に記載の二重軽鎖マウスに対して開始する。

これらの交配方法ならびにヒト可変軽鎖および重鎖領域からの完全ヒト抗体の生成のさらなる詳細は、上記の実施例５に記載されている。

（実施例８．４）
各々が３つのヒスチジン置換を含有する２つのＶカッパセグメントを含むマウスから得た免疫グロブリン軽鎖におけるヒスチジン改変の検出
脾臓Ｂ細胞ｍＲＮＡ由来のＶカッパアンプリコンを、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびハイスループットスクリーニングを使用して調製した。

簡単に述べると、それぞれが３つのヒスチジン置換を含有する（カッパ遺伝子座が図３３に示されているマウス）２つのＶカッパセグメント（Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０）と、内在性マウス重鎖とを含むヘテロ接合性マウス５匹から脾臓を採取し、ガラススライドを用いて１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中にホモジナイズした。細胞を遠心分離機で（５００×ｇで５分にわたって）ペレット化し、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）に３分にわたって溶解させた。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、０．７μｍの細胞濾過器を用いて濾過した。ＣＤ１９に対するＭＡＣＳ磁気陽性選択（MACS magnetic positive selection）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて脾臓細胞からＢ細胞を単離した。ＲＮｅａｓｙＰｌｕｓｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてペレット化したＢ細胞から全ＲＮＡを単離した。ＯｌｉｇｏｔｅｘＤｉｒｅｃｔｍＲＮＡｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離した。

二本鎖ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴｅｒＰｉｃｏｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、５’ＲＡＣＥによって脾臓Ｂ細胞ｍＲＮＡから調製した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ逆転写酵素およびｄＮＴＰの代わりにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩおよびｄＮＴＰを用いた。免疫グロブリン軽鎖レパートリーをｃＤＮＡからＩｇＫ定常領域に特異的なプライマーおよびＳＭＡＲＴｅｒ５’ＲＡＣＥプライマー（表１４）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した（ｃｌｅａｎｕｐ）。第二ラウンドのＰＣＲを、同じ５’ＲＡＣＥプライマーおよびＩｇＫ定常領域に特異的なネステッド３’プライマーを用いて行った（表１５）。第二ラウンドＰＣＲ産物を、ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔＥ−ｇｅｌｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製した。第三のＰＣＲを、４５４アダプターおよびバーコードを付加するプライマーを用いて実施した。第三ラウンドのＰＣＲ産物を、ＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡＭＰｕｒｅＸＰＢｅａｄｓを使用して精製した。精製されたＰＣＲ産物を、ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＫＡＰＡＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＳＹＢＲ−ｑＰＣＲによって定量した。プールしたライブラリーを、４５４ＧＳＪｕｎｉｏｒＴｉｔａｎｉｕｍＳｅｒｉｅｓＬｉｂ−ＡｅｍＰＣＲＫｉｔ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いたエマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）およびＲｏｃｈｅ４５４ＧＳＪｕｎｉｏｒｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを製造者のプロトコールに従って用いた双方向的な配列決定にかけた。

バイオインフォマティクス解析のために、４５４配列読み取りを試料バーコード完全一致に基づいて選別し、品質に関してトリミングした。配列を、再構成されたＩｇ配列とヒト生殖細胞系列ＶおよびＪセグメントデータベースとのアラインメントに基づいて、ｉｇｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ、ｖ２．２．２５＋）のローカルインストールを用いてアノテートした。同一のスコアを有する複数のベストヒットが検出された場合には、配列を不明瞭であると印をつけ、解析から除いた。ｐｅｒｌスクリプトのセットを展開して結果を解析し、データをｍｙｓｑｌデータベースに記憶させる。カッパ軽鎖のＣＤＲ３領域を保存されたＣコドンとＦＧＸＧモチーフとの間と定義した。

図３４は、ヒト生殖細胞系列ＩＧＫＶ３−２０配列（図３４Ａ）またはＩＧＫＶ１−３９配列（図３４Ｂ）によってコードされるアミノ酸配列と、ヒスチジン改変されたＤＬＣ−５Ｊ（上記の通り、Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む軽鎖可変遺伝子座を含み、各セグメントは３つのヒスチジン改変を有する）を含むマウスにおいて生成された産生性に再構成された抗体から得た例示的なＶκ配列のアミノ酸翻訳とのアラインメントを表す。配列読み取りにより、大多数の産生性に再構成された軽鎖が、その生殖細胞系列ＣＤＲ３に導入された少なくとも１つのヒスチジンを保持することが示された。いくつかの場合には、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持するＶκ３−２０配列を含む、産生性に再構成されたヒト軽鎖の全てのうちの大多数において、それらの生殖細胞系列ＣＤＲ３に導入された３つのヒスチジン改変の全てが保持される（図３４Ａを参照されたい）。いくつかの場合には、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持するＶκ１−３９配列を含む、産生性に再構成されたヒト軽鎖では、軽鎖の約５０％が、それらの生殖細胞系列ＣＤＲ３に導入された３つのヒスチジンの全てを保持し（図３４Ｂ、上のアラインメントを参照されたい）、軽鎖の約５０％は、それらの生殖細胞系列ＣＤＲ３に導入された３つのヒスチジンのうち２つを保持する（図３４Ｂの下のアラインメントを参照されたい）。いくつかの場合には、Ｖセグメント配列の最後の位置にあるヒスチジンはＶ−Ｊ再構成に起因して失われ得る。

本明細書に開示されている本発明の非限定的な５９個の実施形態が以下に提供される。
１．免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された、少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、
各ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である、
遺伝子改変された非ヒト動物。
２．免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含まない、実施形態１に記載の動物。
３．前記免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、実施形態１に記載の動物。
４．前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、実施形態３に記載の動物。
５．前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、実施形態３に記載の動物。
６．免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、実施形態１に記載の動物。
７．前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、実施形態６に記載の動物。
８．前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、実施形態７に記載の動物。
９．前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、実施形態７に記載の動物。
１０．前記少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、内在性の前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、実施形態１に記載の動物。
１１．前記免疫グロブリン軽鎖定常領域がＣκ領域である、実施形態１に記載の動物。
１２．各ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、実施形態１に記載の動物。
１３．前記置換が、ＣＤＲ３コドン（複数可）においてである、実施形態１２に記載の動物。
１４．前記置換が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換である、実施形態１３に記載の動物。
１５．前記少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントである、実施形態１に記載の動物。
１６．２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、実施形態１５に記載の動物。
１７．齧歯類である、実施形態１に記載の動物。
１８．ラットまたはマウスである、実施形態１７に記載の齧歯類。
１９．マウスである、実施形態１８に記載の齧歯類。
２０．前記少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列を含む抗体を発現し、該抗体が該ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの少なくとも１つの前記ヒスチジンコドンによってコードされるアミノ酸位置において少なくとも１つのヒスチジン残基を保持する、実施形態１に記載の動物。
２１．目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、実施形態１に記載の動物。
２２．ｔ_１／２の短縮を示す抗体の富化が少なくとも約２倍である、実施形態２１に記載の動物。
２３．免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変された非ヒト動物であって、
該２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である、
遺伝子改変された非ヒト動物。
２４．免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含まない、実施形態２３に記載の動物。
２５．前記免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、実施形態２３に記載の動物。
２６．前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、実施形態２５に記載の動物。
２７．前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、実施形態２５に記載の動物。
２８．免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、実施形態２３に記載の動物。
２９．前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、実施形態２８に記載の動物。
３０．前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、実施形態２９に記載の動物。
３１．前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、実施形態２９に記載の動物。
３２．前記２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび前記１つまたは複数のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、前記内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、実施形態２３に記載の動物。
３３．前記免疫グロブリン軽鎖定常領域がＣκ領域である、実施形態２３に記載の動物。
３４．５つのヒトＪκセグメントを含み、該５つのヒトＪκセグメントが、ヒトＪκ１セグメント、Ｊκ２セグメント、Ｊκ３セグメント、Ｊκ４セグメント、およびＪκ５セグメントである、実施形態２３に記載の動物。
３５．前記２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、実施形態２３に記載の動物。
３６．前記２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、実施形態２３に記載の動物。
３７．前記置換が、ＣＤＲ３コドン（複数可）においてである、実施形態３６に記載の動物。
３８．前記置換が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換である、実施形態３７に記載の動物。
３９．前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、実施形態３５に記載の動物。
４０．前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、実施形態３９に記載の動物。
４１．前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、実施形態４０に記載の動物。
４２．前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、実施形態４０に記載の動物。
４３．前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、実施形態４０に記載の動物。
４４．前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、実施形態４０に記載の動物。
４５．齧歯類である、実施形態２３に記載の動物。
４６．ラットまたはマウスである、実施形態４５に記載の齧歯類。
４７．マウスである、実施形態４６に記載の齧歯類。
４８．前記２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つによってコードされるアミノ酸配列を含む抗体を発現し、該抗体が、前記ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの少なくとも１つの前記ヒスチジンコドンによってコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持する、実施形態２３に記載の動物。
４９．目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す抗体を生成する方法であって、
実施形態１に記載の動物を生成するステップと、
該動物を目的の抗原で免疫するステップと、
中性ｐＨでは該目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは該目的の抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップと
を含む方法。
５０．抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、該集団内の全ての抗体が、
前記２つ以下のＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび前記１つまたは複数のＪ_Ｌ遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、該２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、前記対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、
ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖
とを含む、実施形態２３に記載の動物。
５１．目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、実施形態２３に記載の動物。
５２．ｔ_１／２の短縮を示す抗体の富化が少なくとも約２倍である、実施形態５１に記載の動物。
５３．遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製する方法であって、
該非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内在性免疫グロブリン軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント、およびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、
少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を、該免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が免疫グロブリン定常領域配列に作動可能に連結されるように該非ヒト動物の該ゲノムに配置するステップとを含み、
各ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である、
方法。
５４．目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む前記非ヒト動物を結果としてもたらす、実施形態５３に記載の方法。
５５．前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、前記内在性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある、実施形態５３に記載の方法。
５６．前記動物が、齧歯類である、実施形態５３に記載の方法。
５７．前記齧歯類が、マウスまたはラットである、実施形態５６に記載の方法。
５８．前記少なくとも１つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントである、実施形態５３に記載の方法。
５９．前記２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、実施形態５８に記載の方法。

均等物
当業者は、日常的な程度の実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。

本出願を通して引用される全ての非特許文献、特許出願、および特許の全内容は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。

（項目１）
免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された、少なくとも２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列であって、
該２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つが、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該少なくとも２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つの再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である、
組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目２）
各ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目３）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、項目１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目４）
前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、項目３に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目５）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域がＣκ領域である、項目１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目６）
前記置換がＣＤＲ３コード配列内にある、項目２に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目７）
前記置換が３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換である、項目６に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目８）
２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む、項目１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目９）
前記２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目８に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１０）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目９に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１１）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目１０に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１２）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目１１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１３）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目１１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１４）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目１１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１５）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目１１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１６）
５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、該５つのヒトＪκ遺伝子セグメントが、Ｊκ１セグメント、Ｊκ２セグメント、Ｊκ３セグメント、Ｊκ４セグメント、およびＪκ５セグメントである、項目１に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列。
（項目１７）
項目１から１６までのいずれか一項に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１８）
免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含まない、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１９）
前記組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内にある、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２０）
免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、項目１９に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２１）
免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２２）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、項目２１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２３）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、項目２２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２４）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、項目２２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２５）
齧歯類である、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２６）
前記齧歯類が、ラットまたはマウスである、項目２５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２７）
前記齧歯類が、マウスである、項目２６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２８）
、前記少なくとも２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つによってコードされるアミノ酸配列を含む抗体を発現し、該抗体が、該ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの少なくとも１つの前記ヒスチジンコドンによってコードされるアミノ酸位置において少なくとも１つのヒスチジン残基を保持する、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２９）
抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、該集団内の全ての抗体が、
前記少なくとも２つのＶ_Ｌ遺伝子セグメント、および前記１つまたは複数のＪ_Ｌ遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、
ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖とを含む、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３０）
目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、項目１７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３１）
ｔ_１／２の短縮を示す抗体の富化が少なくとも約２倍である、項目３０に記載の動物。
（項目３２）
目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す抗体を生成する方法であって、
項目１７のいずれか一項に記載の動物を目的の抗原で免疫するステップと、
中性ｐＨでは、該目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、該目的の抗原への結合の低減を提示するＢ細胞または結合タンパク質を選択するステップと
を含む方法。
（項目３３）
遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製する方法であって、
該非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内在性免疫グロブリン軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、
少なくとも２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を、免疫グロブリン定常領域配列に作動可能に連結されるように該非ヒト動物の該ゲノムに配置するステップであって、
各ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つが、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該少なくとも２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能であるステップと
を含む方法。
（項目３４）
目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む前記非ヒト動物を結果としてもたらす、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、前記内在性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内にある、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記動物が、齧歯類である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
前記２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、該５つのヒトＪκ遺伝子セグメントがＪκ１セグメント、Ｊκ２セグメント、Ｊκ３セグメント、Ｊκ４セグメント、およびＪκ５セグメントである、項目３３に記載の方法。
（項目４７）
項目１から１６までのいずれか一項に記載の組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列をそのゲノム内に含む、単離された細胞。
（項目４８）
免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内在性Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含まない、項目４７に記載の単離された細胞。
（項目４９）
前記組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内にある、項目４７に記載の単離された細胞。
（項目５０）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、項目４９に記載の単離された細胞。
（項目５１）
免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をそのゲノム内にさらに含む、項目４７に記載の単離された細胞。
（項目５２）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、項目５１に記載の単離された細胞。
（項目５３）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、項目５２に記載の単離された細胞。
（項目５４）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、項目５２に記載の単離された細胞。
（項目５５）
齧歯類細胞である、項目４７に記載の単離された細胞。
（項目５６）
前記齧歯類が、ラットまたはマウスである、項目５５に記載の単離された細胞。
（項目５７）
前記齧歯類が、マウスである、項目５５に記載の単離された細胞。
（項目５８）
項目１７から３１までのいずれか一項に記載の非ヒト動物に由来する細胞または組織。
（項目５９）
胚性幹細胞またはＢ細胞である、項目５８に記載の細胞。
（項目６０）
項目３３から４６までのいずれか一項に従って作製された非ヒト動物に由来する細胞または組織。
（項目６１）
胚性幹細胞またはＢ細胞である、項目６０に記載の細胞。
（項目６２）
５’側マウス相同性アーム、少なくとも２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含むヒト可変領域核酸配列、ならびに３’側マウス相同性アームを含むターゲッティングベクターであって、
該２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つが、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該少なくとも２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つの再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能であり、
再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列およびヒトプロモーターまたはマウスプロモーターに作動可能に連結されており、
該相同性アームにより、該ベクターが、内在性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に向かい、それにより該ヒト可変領域核酸配列が、内在性マウス軽鎖定常領域配列に作動可能に連結される、
ターゲッティングベクター。
（項目６３）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域がＣκ領域である、項目６２に記載のターゲッティングベクター。
（項目６４）
各ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目６２に記載のターゲッティングベクター。
（項目６５）
前記置換がＣＤＲ３コード配列内にある、項目６２に記載のターゲッティングベクター。
（項目６６）
前記置換が３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換である、項目６４に記載のターゲッティングベクター。
（項目６７）
２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む、項目６１に記載のターゲッティングベクター。
（項目６８）
２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目６７に記載のターゲッティングベクター。
（項目６９）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、対応するヒト生殖細胞系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目６８に記載のターゲッティングベクター。
（項目７０）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、項目６９に記載のターゲッティングベクター。
（項目７１）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目７０に記載のターゲッティングベクター。
（項目７２）
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目７０に記載のターゲッティングベクター。
（項目７３）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目７０に記載のターゲッティングベクター。
（項目７４）
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、項目７０に記載のターゲッティングベクター。
（項目７５）
５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、該５つのヒトＪκ遺伝子セグメントが、Ｊκ１セグメント、Ｊκ２セグメント、Ｊκ３セグメント、Ｊκ４セグメント、およびＪκ５セグメントである、項目６２に記載のターゲッティングベクター。
（項目７６）
項目３２に記載の方法に従って生成される、目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す結合タンパク質。
（項目７７）
項目７６に記載の結合タンパク質の免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
（項目７８）
項目７７に記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目７９）
項目３２に記載の方法に従って生成される、目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示すＢ細胞。
（項目８０）
目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す結合タンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）第一の抗体の重鎖可変ドメインを含む第一の免疫グロブリン重鎖であって、該第一の抗体が、
（ａ）中性ｐＨで該目的の抗原に所望の親和性で結合し、
（ｂ）再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である、少なくとも２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変された非ヒト動物において生成され、
（ｃ）該少なくとも２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つによってコードされる軽鎖成分を含む、
第一の免疫グロブリン重鎖
（ｉｉ）
（ａ）該第一の抗体の該軽鎖成分をコードする該少なくとも２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つのＪ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つに由来し、
（ｂ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変されている、
免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖
を細胞で共発現させるステップと、
中性ｐＨでは該目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性ｐＨでは該目的の抗原に対する結合の低減を提示する、該第一の免疫グロブリン重鎖および該免疫グロブリン軽鎖を含む該細胞において発現する第二の抗体を選択するステップと
を含む方法。
（項目８１）
前記組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列が、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記第二の抗体が、完全ヒト重鎖および完全ヒト軽鎖を含む、項目８０に記載の方法。
（項目８４）
前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列が、前記生殖細胞系列核酸配列によってコードされない体細胞変異をコードする少なくとも１つのコドンをさらに含む、項目８０に記載の方法。
（項目８５）
前記第二の抗体が、第一の完全ヒト免疫グロブリン重鎖および完全ヒト免疫グロブリン軽鎖を含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
項目８０に記載の方法に従って生成される、目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す結合タンパク質。
（項目８７）
目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す結合タンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）中性ｐＨで第一の目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体の第一の重鎖可変ドメインを含む第一の免疫グロブリン重鎖、
（ｉｉ）中性ｐＨで第二の目的の抗原に所望の親和性で結合する第二の抗体の第二の重鎖可変ドメインを含む第二の免疫グロブリン重鎖であって、
該第一の抗体および第二の抗体が、
（ａ）再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である、少なくとも２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変された非ヒト動物において生成され、
（ｃ）該少なくとも２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つのヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つによってコードされる同じ軽鎖成分を含む、
第一の免疫グロブリン重鎖および第二の免疫グロブリン重鎖、
（ｉｉｉ）
（ａ）該第一の抗体および第二の抗体の該軽鎖成分をコードする該少なくとも２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つのＪ_Ｌ遺伝子セグメントのうちの１つに由来し、
（ｂ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変されている、
免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖
を細胞で共発現させるステップと、
中性ｐＨでは該目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性ｐＨでは該目的の抗原に対する結合の低減を提示する、該第一の免疫グロブリン重鎖および該免疫グロブリン軽鎖を含む該細胞において発現する第三の抗体を選択するステップと
を含む方法。
（項目８８）
前記組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列が、２つ以下の、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記２つの再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記第三の抗体が、完全ヒト重鎖および完全ヒト軽鎖を含む、項目８７に記載の方法。
（項目９１）
前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列が、前記生殖細胞系列核酸配列によってコードされない体細胞変異をコードする少なくとも１つのコドンをさらに含む、項目８７に記載の方法。
（項目９２）
前記第三の抗体が、第一の完全ヒト免疫グロブリン重鎖および完全ヒト免疫グロブリン軽鎖を含む、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
項目８７に記載の方法に従って生成される、目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す結合タンパク質。

Claims

免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された、２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列を含む核酸をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、
該２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、
該Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、
該Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントならびに該少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、該少なくとも１つのヒスチジンコドンによってコードされる少なくとも１つのヒスチジンを含む抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能であり、
該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの該非ヒスチジンコドンの置換が、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位のいずれかにおいてヒスチジンを発現するようにデザインされており、
該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの該非ヒスチジンコドンの置換が、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７および１０９位のいずれかにおいてヒスチジンを発現するようにデザインされており、
該非ヒト動物は齧歯類である、遺伝子改変された非ヒト動物。
免疫グロブリン軽鎖が形成されるように再構成することが可能な内在性ＶＬ遺伝子セグメントを含まない、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
前記組換え免疫グロブリン軽鎖核酸配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内にある、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域配列が、内在性免疫グロブリン軽鎖定常領域配列である、請求項３に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、齧歯類免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、請求項５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
前記齧歯類免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス配列またはラット配列である、請求項６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
前記齧歯類免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、内在性齧歯類免疫グロブリン重鎖定常領域配列である、請求項６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
前記齧歯類が、ラットまたはマウスである、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
前記齧歯類が、マウスである、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
前記２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つによってコードされるアミノ酸配列を含む抗体を発現し、該抗体が、該ヒトＶＬ遺伝子セグメントの少なくとも１つの前記ヒスチジンコドンによってコードされるアミノ酸位置において少なくとも１つのヒスチジン残基を保持する、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、該集団内の全ての抗体が、
前記２つのＶＬ遺伝子セグメント、および前記１つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、
ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と
を含む、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）が少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または少なくとも３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
ｔ１／２の短縮を示す抗体の富化が少なくとも２倍である、請求項１３に記載の動物。
目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す抗体を生成する方法であって、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の動物を目的の抗原で免疫するステップと、
中性ｐＨでは、該目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、該目的の抗原への結合の低減を提示するＢ細胞または結合タンパク質を選択するステップと
を含む方法。
遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製する方法であって、該方法は、
該非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内在性免疫グロブリン軽鎖ＶＬ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、
２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を、免疫グロブリン定常領域配列に作動可能に連結されるように該非ヒト動物の該ゲノムに配置するステップであって、
該２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、
該Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントが、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントならびに少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能であるステップと
を含み、該非ヒト動物が齧歯類であり、
該Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントならびに該少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントが、該少なくとも１つのヒスチジンコドンによってコードされる少なくとも１つのヒスチジンを含み、
該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの該非ヒスチジンコドンの置換が、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位のいずれかにおいてヒスチジンを発現するようにデザインされており、
該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの該非ヒスチジンコドンの置換が、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７および１０９位のいずれかにおいてヒスチジンを発現するようにデザインされている、方法。
目的の抗原へのｐＨ依存性の結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む前記非ヒト動物を結果としてもたらす、請求項１６に記載の方法。
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、前記内在性齧歯類免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内にある、請求項１６に記載の方法。
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項１６に記載の方法。
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む、請求項１６に記載の方法。
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、請求項２０に記載の方法。
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、請求項２１に記載の方法。
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、請求項２１に記載の方法。
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、請求項２１に記載の方法。
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、請求項２１に記載の方法。
５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、該５つのヒトＪκ遺伝子セグメントがＪκ１セグメント、Ｊκ２セグメント、Ｊκ３セグメント、Ｊκ４セグメント、およびＪκ５セグメントである、請求項１６に記載の方法。
請求項１から１４までのいずれか一項に記載の非ヒト動物に由来する胚性幹細胞。
請求項１６から２６までのいずれか一項に従って作製された非ヒト動物に由来する胚性幹細胞。
５’側マウス相同性アーム、２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントを含むヒト可変領域核酸配列、ならびに３’側マウス相同性アームを含むターゲッティングベクターであって、
該２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、
該２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つが、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該２つの再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび該少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントが、再構成することが可能であり、抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードすることが可能であり、
再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントの各々が、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列およびヒトプロモーターまたはマウスプロモーターに作動可能に連結されており、
該相同性アームにより、該ベクターが、内在性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に向かい、それにより該ヒト可変領域核酸配列が、内在性マウス軽鎖定常領域配列に作動可能に連結され、
該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子の各々が、対応するヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子セグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの該ヒスチジンコドンによる置換を含み、
該Ｖκ１−３９遺伝子セグメントおよびＶκ３−２０遺伝子セグメントならびに該少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＬ遺伝子セグメントが、該少なくとも１つのヒスチジンコドンによってコードされる少なくとも１つのヒスチジンを含み、
該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの該非ヒスチジンコドンの置換が、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位のいずれかにおいてヒスチジンを発現するようにデザインされており、
該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの該非ヒスチジンコドンの置換が、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７および１０９位のいずれかにおいてヒスチジンを発現するようにデザインされている、
ターゲッティングベクター。
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域がＣκ領域である、請求項２９に記載のターゲッティングベクター。
前記置換がＣＤＲ３コード配列内にある、請求項２９に記載のターゲッティングベクター。
前記置換が３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換である、請求項２９に記載のターゲッティングベクター。
２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む、請求項２９に記載のターゲッティングベクター。
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々が、３つまたは４つの非ヒスチジンコドンの前記ヒスチジンコドンによる置換を含む、請求項３３に記載のターゲッティングベクター。
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、請求項３４に記載のターゲッティングベクター。
前記置換が、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、請求項３４に記載のターゲッティングベクター。
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、請求項３４に記載のターゲッティングベクター。
前記置換が、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンの置換であり、該ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの１０５、１０６、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、請求項３４に記載のターゲッティングベクター。
５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、該５つのヒトＪκ遺伝子セグメントが、Ｊκ１セグメント、Ｊκ２セグメント、Ｊκ３セグメント、Ｊκ４セグメント、およびＪκ５セグメントである、請求項２９に記載のターゲッティングベクター。