ES2962489T3

ES2962489T3 - Anticuerpos de cadena ligera diseñados genéticamente con histidina y animales no humanos modificados genéticamente para generar los mismos

Info

Publication number: ES2962489T3
Application number: ES19159475T
Authority: ES
Inventors: John Mcwhirter; Lynn Macdonald; Andrew Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2034-09-18
Also published as: HUE044747T2; WO2015042250A9; EP3549437B1; HK1225913A1; EP3046412B1; EP3046412A1; KR102150414B1; CN105722387A; DK3046412T3; KR20160049018A; ES2738679T3; RU2016114306A3; LT3046412T; MX2016003638A; EP3549437C0; RU2694728C2; IL244226B; RU2019121863A; PT3046412T; KR20200103882A

Abstract

Se proporciona un animal no humano genéticamente modificado, en el que el animal no humano expresa un repertorio de anticuerpos capaz de unirse a antígenos en función del pH tras la inmunización. Se proporciona un animal no humano genéticamente modificado que expresa dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana derivados de un repertorio limitado de segmentos de genes variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana que comprenden modificaciones de histidina en su secuencia de línea germinal. Se proporcionan métodos para producir animales no humanos que expresan anticuerpos que comprenden residuos de histidina codificados por codones de histidina introducidos en secuencias de nucleótidos de cadena ligera de inmunoglobulina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos de cadena ligera diseñados genéticamente con histidina y animales no humanos modificados genéticamente para generar los mismos

Campo de la invención

Se describe un animal no humano modificado genéticamente (por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón o rata) que expresa anticuerpos capaces de unirse a un antígeno de una manera dependiente del pH. Se describe un método para producir modificaciones en la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de un animal no humano, en donde las modificaciones incluyen la mutagénesis de los restos dentro del gen de la región variable de la cadena ligera, por ejemplo, nucleótidos que codifican uno o más aminoácidos dentro de una región determinante de la complementariedad (CDR), para facilitar la expresiónin vivode anticuerpos que comprenden dominios de cadena ligera que muestran unión a antígenos dependiente del pH. También se describen métodos para producir anticuerpos con unión a antígeno dependiente del pH.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos comprenden generalmente un componente de cadena pesada homodimérico, en el que cada monómero de cadena pesada está asociado con una cadena ligera idéntica. Los anticuerpos que tienen un componente de cadena pesada heterodimérico (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) son deseables como anticuerpos terapéuticos. Pero la producción de anticuerpos biespecíficos que tienen un componente de cadena ligera adecuado que puede asociarse satisfactoriamente con cada una de las cadenas pesadas de un anticuerpo biespecífico ha resultado ser problemática.

En un enfoque, se puede seleccionar una cadena ligera mediante el estudio de las estadísticas de uso para todos los dominios variables de cadena ligera, identificando la cadena ligera empleada con más frecuencia en anticuerpos humanos y emparejando esa cadena ligerain vitrocon las dos cadenas pesadas de diferente especificidad.

En otro enfoque, se podría seleccionar una cadena ligera observando secuencias de cadena ligera en una biblioteca de presentación en fagos (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos que comprende secuencias de región variable de cadena ligera humana, por ejemplo, una biblioteca de scFv humano) y seleccionando la región variable de cadena ligera más utilizada comúnmente de la biblioteca. La cadena ligera se puede probar entonces sobre las dos cadenas pesadas diferentes de interés.

En otro enfoque, podría seleccionarse una cadena ligera analizando una biblioteca de presentación en fagos de secuencias variables de cadena ligera utilizando las secuencias variables de cadena pesada de ambas cadenas pesadas de interés como sondas. Podría seleccionarse una cadena ligera que se asocia con ambas secuencias variables de cadena pesada como una cadena ligera para las cadenas pesadas.

En otro enfoque, una cadena ligera candidata podría alinearse con las cadenas ligeras afines de las cadenas pesadas, y se realizan modificaciones en la cadena ligera para que se empareje más estrechamente a las características de secuencia comunes a las cadenas ligeras afines de ambas cadenas pesadas. Si es necesario minimizar las posibilidades de inmunogenicidad, las modificaciones dan como resultado preferentemente secuencias que están presentes en secuencias de cadenas ligeras humanas conocidas, de modo que es improbable que el procesamiento proteolítico genere un epítopo de linfocitos T basándose en parámetros y métodos conocidos en la técnica para evaluar la probabilidad de inmunogenicidad (es decir,in silicoasí como ensayos en húmedo).

Todos los enfoques anteriores se basan en métodosin vitroque incluyen una serie de restriccionesa priori,por ejemplo, la identidad de secuencia, la capacidad de asociarse con cadenas pesadas preseleccionadas específicas, etc. Existe una necesidad en la técnica de composiciones y métodos que no se basen en la manipulación de condicionesin vitro,sino que empleen enfoques más sensibles biológicamente para producir proteínas de unión a epítopos humanos que incluyan una cadena ligera común.

Además, los anticuerpos terapéuticos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos terapéuticos, tienen algunas limitaciones porque, con frecuencia, requieren altas dosis para lograr la eficacia deseada. Esto se debe en parte al hecho de que los complejos de antígeno-anticuerpo se internalizan en el endosoma, y se dirigen a la degradación lisosómica en un proceso llamado aclaramiento mediado por la diana. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos y composiciones que conduzcan a un reciclaje de anticuerpos más eficaz, por ejemplo, el reciclaje de anticuerpos biespecíficos, y eviten la degradación del anticuerpo promoviendo la disociación de complejos anticuerpo-antígeno en el compartimento endosómico sin comprometer la especificidad y afinidad del anticuerpo hacia el antígeno.

El documento WO 2013/046722 describe una biblioteca de moléculas de unión dependiente de la concentración de iones. El documento WO 2007/117410 describe animales transgénicos que expresan anticuerpos quiméricos para su uso en la preparación de anticuerpos humanos.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones independientes. Otros aspectos y realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización o ejemplo de la presente divulgación que no esté comprendido en el ámbito de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona únicamente a título ilustrativo.

La presente invención proporciona un roedor modificado genéticamente que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos V<k>humanos no reordenados y al menos un segmento génico J<k>humano no reordenado operativamente unidos a una secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina,

en donde cada uno de los no más de dos segmentos génicos Vk humanos no reordenados codifica al menos una histidina en una región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) que no está codificada por el segmento génico Vk de la línea germinal humana correspondiente,

en donde los no más de dos segmentos génicos V<k>humanos no reordenados y el al menos un segmento génico Jk humano no reordenado se reordenan en los linfocitos B durante el desarrollo de los linfocitos B de manera que el roedor comprende una pluralidad de secuencias génicas Vk/Jk de cadena ligera humana reordenadas, cada una de las cuales codifica un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina distinto y comprende la al menos una histidina en la CDR3 que no está codificada por el segmento génico Vk de la línea germinal humana correspondiente, y

en donde el roedor expresa una población de anticuerpos específicos de antígeno en respuesta a un antígeno, en donde cada anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la al menos una histidina en una CDR3 que no está codificada por el segmento génico V<k>de la línea germinal humana correspondiente y presenta unión dependiente del pH a un antígeno de interés.

La presente invención proporciona además un método de generación de un anticuerpo que presenta unión dependiente del pH a un antígeno de interés que comprende inmunizar al roedor de la invención con un antígeno de interés, permitir que el roedor monte una respuesta inmunitaria al antígeno de interés y seleccionar un anticuerpo que se une al antígeno de interés con una afinidad deseada a un pH neutro mientras muestra una unión reducida al antígeno de interés a un pH ácido.

La presente invención proporciona adicionalmente un método de fabricación de un roedor de la invención, comprendiendo el método:

modificar un genoma del roedor para eliminar o generar segmentos génicos V<k>y J<k>de cadena ligera de inmunoglobulina endógena no funcionales en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina, y

colocar en el genoma del roedor una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos Vk humanos no reordenados y al menos un segmento génico Jk humano no reordenado, de modo que la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina esté unida operativamente a una secuencia de la región constante de inmunoglobulina, opcionalmente, en donde la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina se encuentra en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógena,

en donde cada segmento génico Vk humano no reordenado codifica al menos una histidina en una región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) que no está codificada por el correspondiente segmento génico Vk de la línea germinal humana,

en donde los no más de dos segmentos génicos V<k>humanos no reordenados y al menos un segmento génico J<k>humano no reordenado se reordenan en los linfocitos B durante el desarrollo de los linfocitos B, de modo que el roedor comprende una pluralidad de secuencias génicas V<k>/J<k>de cadena ligera humana reordenadas, cada una de las cuales codifica un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina distinto y comprende al menos una histidina en la región determinante de la complementariedad CDR3 que no está codificada por el segmento génico Vk de la línea germinal humana correspondiente, y

en donde el roedor expresa una población de anticuerpos específicos de antígeno en respuesta a un antígeno, en donde cada anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la al menos una histidina en una CDR3 que no está codificada por el segmento génico Vk de la línea germinal humana correspondiente y presenta unión dependiente del pH a un antígeno de interés.

En un aspecto, se describe un sistema biológico para generar un anticuerpo o un dominio variable de anticuerpo que se une a un antígeno diana a un pH neutro pero que muestra una unión reducida del mismo antígeno a un pH ácido (por ejemplo, pH 5,0-6,0). El sistema biológico comprende un animal no humano, por ejemplo, un roedor(por ejemplo,un ratón o una rata) que tiene una secuencia de cadena ligera reordenada (por ejemplo, un V-J reordenado) que comprende una o más modificaciones con histidina. En diversos aspectos, la una o más modificaciones con histidina están en el codón de CDR3 de la cadena ligera. En diversos aspectos, el animal no humano comprende un locus de inmunoglobulina de cadena pesada humana o humanizada. En diversos aspectos, el animal no humano comprende un reemplazo de segmentos génicos variables de cadena pesada no humana endógenos con uno o más segmentos de Vh, Dh y Jh de cadena pesada humana, en donde los segmentos humanos están operativamente unidos a una región constante de inmunoglobulina no humana. En diversos aspectos, se describen animales no humanos con cadenas ligeras universales que comprenden dominios variables de cadena ligera con sustituciones de restos no histidina por restos de histidina. En diversos aspectos, a estos animales no humanos con cadena ligeras universales modificadas con histidina (por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones) se les denomina ratones de cadena ligera universal de histidina, ratones uLC-histidina o ratones HULC.

Por tanto, en un aspecto, en el presente documento, se describe un animal no humano modificado genéticamente que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de segmentos V<l>y J<l>humanos, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. En un aspecto, la secuencia de la región variable de inmunoglobulina humana reordenada única está unida operativamente a una secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana es una secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina endógena. En un aspecto, el animal no humano carece de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenada funcional. En un aspecto, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina está en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógeno.

En un aspecto, el animal comprende además en su línea germinal un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada que comprende segmentos de Vh, Dh y Jh humanos operativamente unidos a una secuencia génica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia génica de la región constante de cadena pesada no humana. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena pesada no humana es una secuencia génica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno.

En un aspecto, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina está en la secuencia de nucleótidos que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR). En un aspecto, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina está en la secuencia de nucleótidos que codifica una CDR3. En un aspecto, la sustitución es de uno, dos, tres, cuatro o más codones de CDR3. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única comprendida en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina deriva de un segmento del gen Vk1-39 o Vk3-20 humano. En un aspecto, la secuencia Vk del segmento del gen Vk1-39 o Vk3-20 humano es una secuencia de Vk1-39 o Vk3-20 de la línea germinal, pero para las modificaciones con histidina. En un aspecto, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de una secuencia del gen V<k>1-39/J<k>5 o V<k>3-20/J<k>1 reordenada. En un aspecto, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de una secuencia del gen V<k>1-39/J<k>5 reordenada, y la secuencia del gen Vk1-39/Jk5 comprende un reemplazo de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina diseñado para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de los mismos. En otro aspecto, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de una secuencia del gen Vk3-20/Jk1 reordenada, y la secuencia del gen Vk3-20/Jk1 comprende un reemplazo de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina diseñado para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el animal no humano descrito en el presente documento, comprende una población de linfocitos B en respuesta a un antígeno de interés que está enriquecido para anticuerpos que muestran una disminución en la semivida disociativa (t-io) a un pH ácido en comparación con un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos<aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces. En un aspecto, la disminución en t-i>/2<a un pH>ácido en comparación con un pH neutro es de aproximadamente 30 veces o más. En un aspecto, dicho<enriquecimiento es al menos aproximadamente>2<veces.>

En un aspecto, el animal expresa un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana con una sustitución de al menos un resto no histidina con un resto de histidina en una posición de aminoácido codificada por el al menos un codón sustituido en la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, el animal expresa un anticuerpo que conserva una sustitución de al menos un resto de no histidina con un resto de histidina en un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana expresado, a pesar de las hipermutaciones somáticas.

En un aspecto, el animal no humano es un mamífero. En un aspecto, el mamífero es un roedor, por ejemplo, una rata o un ratón. En un aspecto, el animal no humano es un ratón. Por tanto, en un aspecto, también se describe, en el presente documento, un ratón modificado genéticamente que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de segmentos Vl y Jl humanos, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. En un aspecto, el ratón carece de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenada funcional.

En un aspecto, la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada única en la línea germinal del ratón está unida operativamente a una secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina se selecciona de una secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de rata o de ratón. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia de ratón. En un aspecto, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina está en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógeno.

En un aspecto adicional, el ratón también comprende en su línea germinal un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada que comprende segmentos de Vh, Dh y Jh humanos operativamente unidos a una secuencia génica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia génica de la región constante de cadena pesada de rata o de ratón. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia de ratón. En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno.

En un aspecto, el ratón comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina en donde la sustitución está en la secuencia de nucleótidos que codifica una CDR. En un aspecto, la sustitución es en un codón de CDR3, por ejemplo, en uno, dos, tres, cuatro o más codones de CDR3. En un aspecto, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina del ratón comprende la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única derivada de un segmento del gen V<k>1-39 o V<k>3-20 humano, por ejemplo, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada única deriva de una secuencia del gen Vk1-39/Jk5 o Vk3-20/Jk1 reordenada. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada única deriva de una secuencia del gen Vk1-39/Jk5 reordenada, y la secuencia del gen Vk1-39/Jk5 comprende un reemplazo de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina diseñado para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de los mismos. En un aspecto, dicho reemplazo está diseñado para reemplazar las histidinas en las posiciones 105, 106, 108 y 111. En otro aspecto, dicho reemplazo está diseñado para reemplazar las histidinas en las posiciones 106, 108 y 111.

En otro aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada única deriva de una secuencia del gen V<k>3-20/J<k>1 reordenada, y la secuencia del gen V<k>3-20/J<k>1 comprende un reemplazo de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina diseñado para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de los mismos. En un aspecto, dicho reemplazo está diseñado para reemplazar las histidinas en las posiciones 105, 106, 107 y 109. En otro aspecto, dicho reemplazo está diseñado para reemplazar las histidinas en las posiciones 105, 106 y 109.

En un aspecto, el ratón descrito en el presente documento, comprende una población de linfocitos B en respuesta a un antígeno de interés que está enriquecido para anticuerpos que muestran una disminución en la semivida disociativa (t-io) a un pH ácido en comparación con un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos<aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces. En un aspecto, la disminución en t-i>/2<a un pH>ácido en comparación con un pH neutro es de aproximadamente 30 veces o más. En un aspecto, dicho enriquecimiento de anticuerpos es al menos aproximadamente 2 veces.

En un aspecto, el ratón descrito en el presente documento, expresa una población de anticuerpos específicos de antígeno en respuesta a un antígeno de interés en donde todos los anticuerpos comprenden (a) dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina derivados de la misma secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada única que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, y (b) cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden dominios variables de cadena pesada derivados de un repertorio de segmentos V, D y J de cadena pesada humana.

También se describe en el presente documento, un locus no humano, por ejemplo, locus de ratón, que comprende una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de segmentos VL y JL humanos, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. En un aspecto, el locus está comprendido en la línea germinal de un animal no humano. En un aspecto, el locus comprende la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única derivada de un segmento del gen V<k>1-39 o V<k>3-20 humano, por ejemplo, derivada de una secuencia del gen V<k>1-39/J<k>5 o V<k>3-20/J<k>1 reordenada. En un aspecto, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única presente en el locus deriva de la secuencia de V<k>1-39/J<k>5 reordenada, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de las mismas. En otro aspecto, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única presente en el locus deriva de la secuencia de V<k>3-20/J<k>1 reordenada, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de las mismas. En diversos aspectos, los loci no humanos descritos en el presente documento, pueden generarse utilizando los métodos descritos a continuación para producir un animal no humano modificado genéticamente.

En otro aspecto más, en el presente documento se describe un método para producir un animal no humano que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina genéticamente modificado en su línea germinal, en donde el método comprende modificar un genoma de un animal no humano para eliminar o generar segmentos V y J de cadena ligera de inmunoglobulina endógena no funcionales en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina, y colocar en el genoma una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada única que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. En un aspecto, dicho método da como resultado un animal no humano modificado genéticamente que comprende una población de linfocitos B enriquecidos por anticuerpos que muestran una unión a antígeno de interés dependiente del pH. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada localizada en el genoma deriva de Vk1-39 o Vk3-20 humano, por ejemplo, una secuencia del gen Vk1-39/Jk5 o Vk3-20/Jk1 reordenada. Por tanto, en el aspecto en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única en él deriva de un V<k>1-39/J<k>5 reorganizado, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de las mismas. En un aspecto en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de un V<k>3-20/J<k>1 reordenado, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de las mismas.

En otro aspecto, en el presente documento se describe un método para generar un anticuerpo que muestra una unión a un antígeno de interés dependiente del pH que comprende (a) generar un ratón descrito en el presente documento, (por ejemplo, un ratón que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de segmentos Vl y Jl humanos y una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina en su secuencia de región variable de cadena ligera reordenada), (b) inmunizar el ratón con un antígeno de interés, y (c) seleccionar un anticuerpo que se una al antígeno de interés con una afinidad deseada a un pH neutro mientras muestra una unión reducida al antígeno a un pH ácido. En un aspecto, el método da como resultado<una generación de un anticuerpo que muestra t-i>/2<a pH ácido y 37 °C de aproximadamente 2 minutos o menos. En un>aspecto, el método da como resultado una generación de un anticuerpo que muestra una disminución en la semivida disociativa (t-io) a un pH ácido en comparación con un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces.

En otros aspectos, en el presente documento se describen métodos adicionales para generar un anticuerpo que muestra una unión a un antígeno de interés dependiente del pH. Uno de tales métodos comprende (a) seleccionar un primer anticuerpo que se une a un antígeno de interés con una afinidad deseada, (b) modificar una secuencia de nucleótidos de cadena ligera de inmunoglobulina del primer anticuerpo para comprender una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, (c) expresar una cadena pesada de inmunoglobulina del primer anticuerpo y la cadena ligera de inmunoglobulina modificada en una célula, y (d) seleccionar un segundo anticuerpo expresado en la célula que conserva una afinidad deseada por el antígeno de interés a pH neutro y presenta unión reducida al antígeno de interés a un pH ácido. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de inmunoglobulina del primer anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única. En un aspecto, el primer anticuerpo se genera en un animal no humano, por ejemplo, un ratón, comprendiendo una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina derivada de una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única, y la modificación de la cadena ligera de inmunoglobulina se produce en la secuencia de la región variable de inmunoglobulina humana reordenada única. En un aspecto, el primer anticuerpo se genera en un animal no humano, por ejemplo, un ratón, comprendiendo además una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina derivada de un repertorio de segmentos Vh, Dh y Jh humanos. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única se selecciona de una secuencia de los genes V<k>1-39/J<k>5 y V<k>3-20/J<k>1. En un aspecto, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única es Vk1-39/Jk5, la modificación en la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de inmunoglobulina del primer anticuerpo se produce en el codón de CDR3 en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111, y una combinación de las mismas. En un aspecto en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única es Vk3-20/Jk1, la modificación en la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de inmunoglobulina del primer anticuerpo se produce en el codón de CDR3 en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109, y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el método para generar un anticuerpo que muestra una unión a un antígeno de interés dependiente del pH descrito en el presente documento, da como resultado un anticuerpo que muestra una disminución en la<semivida disociativa (ti/>2<) a un pH ácido en comparación con un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al>menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces. En un aspecto, el método de generar el anticuerpo<da como resultado un anticuerpo que muestra una t i>/2<a pH ácido y 37 °C de aproximadamente 2 minutos o menos.>

En otros aspectos diversos, en el presente documento se describe un animal no humano modificado genéticamente, por ejemplo, un ratón, que comprende un repertorio limitado de segmentos génicos variables de cadena ligera, por ejemplo, no más de dos segmentos génicos Vl humanos y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos operativamente unidos a una región constante de cadena ligera de ratón o rata, y uno o más segmentos génicos Vh humanos, uno o más de Dh humanos, y uno o más de Jh humanos, operativamente unidos a una región constante no humana; en donde los segmentos de genes humanos son capaces de reordenar y codificar dominios variables humanos de un anticuerpo, y además en donde el ratón no comprende un segmento de gen Vl endógeno que es capaz de reorganizarse para formar una cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, la región constante de cadena ligera es una región constante de rata o ratón, por ejemplo, una región constante C<k>de rata o ratón. En un aspecto, el ratón comprende cinco segmentos génicos J<k>humanos, por ejemplo, los segmentos génicos J<k>I, J<k>2, J<k>3, J<k>4 y J<k>5. En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos V<l>humanos se seleccionan de un V<k>1-39, V<k>3-20 humanos, y una combinación de los mismos, por ejemplo, los dos segmentos génicos V<l>humanos son V<k>1-39 y V<k>3-20. En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos Vl humanos y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos están presentes en el locus de cadena ligera endógeno, por ejemplo, locus de la cadena kappa endógeno. En un aspecto, el ratón comprende un locus de cadena ligera A funcional. En otro aspecto, el ratón comprende un locus de cadena ligera A no funcional. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos V<h>humanos, uno o más de Dh humanos, y uno o más de Jh humanos están operativamente unidos a una secuencia de región constante de cadena pesada de ratón o rata.

En algunos aspectos, en el presente documento también se describe un locus no humano que comprende un repertorio limitado de segmentos génicos variables humanos, por ejemplo, un locus no humano que comprende no más de dos segmentos génicos Vl humanos y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos operativamente unidos a una secuencia de región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, una secuencia de región constante de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, una secuencia de rata o ratón). En un aspecto, el locus comprende cinco segmentos génicos J<k>humanos, por ejemplo, los segmentos génicos J<k>1, J<k>2, J<k>3, J<k>4 y J<k>5. En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos Vl humanos se seleccionan de Vk1-39 y Vk3-20, y una combinación de los mismos (por ejemplo, no más de dos segmentos génicos Vl humano son Vk1-39 y Vk3-20). En diversos aspectos, los loci no humanos descritos en el presente documento, pueden generarse utilizando los métodos descritos a lo largo de esta solicitud para producir animales no humanos genéticamente modificados. Por tanto, también se describe un método para producir un animal no humano genéticamente modificado que comprende un repertorio limitado de segmentos génicos Variables humanos, por ejemplo, que comprende no más de dos segmentos génicos Vl humanos y uno o más, por ejemplo, dos o más, dos o más segmentos génicos J<l>humanos operativamente unidos a una secuencia de región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, una secuencia de región constante de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, una secuencia de rata o ratón).

En diversos aspectos, se describe un ratón que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina generada a partir de un reordenamiento de uno de dos segmentos génicos Vk humanos y uno de i, 2, 3, 4 o 5 segmentos génicos Jk humanos, en donde el ratón comprende un reemplazo de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh de la inmunoglobulina endógena con uno o más segmentos génicos V<h>, uno o más de D<h>, y uno o más de J<h>de inmunoglobulina humana, y el ratón muestra una proporción de (a) linfocitos B en la médula ósea que expresa una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A, a (b) linfocitos B en la médula ósea que expresa una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k, de aproximadamente i a aproximadamente 15. En algunos aspectos, el reordenamiento incluye un segmento del gen Vk1-39 humano. En algunos aspectos, el reordenamiento incluye un segmento del gen V<k>3-20 humano. En algunos aspectos, el reemplazo de los segmentos génicos V<h>de la inmunoglobulina endógena se realiza en un locus Vh de la inmunoglobulina endógena. En algunos aspectos, los dos segmentos génicos Vk humanos están en un locus Vk de inmunoglobulina endógena y, en algunos aspectos, los dos segmentos génicos Vk humanos reemplazan todos o sustancialmente todos los segmentos génicos V<k>de inmunoglobulina de ratón. En algunos aspectos, los dos segmentos génicos V<k>humanos están en un locus V<k>de inmunoglobulina endógena y, en algunos aspectos, los dos segmentos génicos Vk humanos reemplazan todos o sustancialmente todos los segmentos de los genes V<k>y J<k>de inmunoglobulina de ratón. En diversos aspectos, los dos segmentos génicos V<k>humanos están operativamente unidos a dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5) segmentos génicos J<k>humanos.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento, expresa una cadena ligera generada a través de un reordenamiento de un segmento del gen Vk1-39 humano o un segmento del gen Vk3-20 humano y uno de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos génicos Jk humanos y la proporción de linfocitos B inmaduros en la médula ósea que expresa una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A a linfocitos B inmaduros que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k es de aproximadamente i a aproximadamente 13.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento, expresa una cadena ligera generada a través de un reordenamiento de un segmento del gen Vk1-39 humano o un segmento del gen Vk3-20 humano y uno de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos génicos Jk humanos, y la proporción de linfocitos B maduros en la médula ósea que expresa una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A a linfocitos B inmaduros que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k es de aproximadamente 1 a aproximadamente 7.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento, expresa una cadena ligera generada a través de un reordenamiento de un segmento del gen V<k>1-39 humano o un segmento del gen V<k>3-20 humano y uno de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos génicos J<k>humanos, y tiene una población de linfocitos pro B en la médula<ósea dentro del intervalo de aproximadamente 2,5x10>4<a aproximadamente 1,5x10>5<células, inclusive, por ejemplo,>aproximadamente 2,5x104, 3,0x104, 3,5x104, 4,0x104, 4,5x104, 5,0x104, 5,5x104, 6,0x104, 6,5x104, 7,0x104, 7,5x104,<8,0x104, 8,5x104, 9,0x104, 9,5x104, 1,0x105, or 1,5x10>5<células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos pro B en la médula ósea de aproximadamente 2,88x10>4<células; en>algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos pro B en la médula ósea de aproximadamente 6,42x104 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos pro B en la médula ósea de aproximadamente 9,16x104 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos pro B en la médula ósea de aproximadamente 1,19x105 células. Los linfocito pro B ejemplares en la médula ósea de ratones modificados genéticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresión de CD19, CD43, c-kit y/o una combinación de los mismos (p.ej., CD19+, CD43+, c-kit+).

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento, expresa una cadena ligera generada a través de un reordenamiento de un segmento del gen Vk1-39 humano o un segmento del gen Vk3-20 humano y uno de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos génicos Jk humanos, y tiene una población de linfocitos pro B en la médula<ósea dentro del intervalo de aproximadamente>1<x>106<a aproximadamente>2<x>106<células, inclusive, por ejemplo, aproximadamente 1,0x106, 1,1x106, 1,2x106, 1,3x106, 1,4x106, 1,5x106, 1,6x106, 1,7x106, 1,8x106, 1,9x106, o 2,0x10>6 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos pre B en la médula ósea de aproximadamente 1,25x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos pre B en la médula ósea de aproximadamente 1,46x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos pre B en la médula ósea de aproximadamente 1,64x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos pre B en la médula ósea de aproximadamente 2,03x106 células. Los linfocitos pre B ejemplares en la médula ósea de ratones modificados genéticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresión de CD19, CD43, c-kit y/o una combinación de los mismos (p.ej., CD19+, CD43-, c-kit-).

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento, expresa una cadena ligera generada a través de un reordenamiento de un segmento del gen Vk1-39 humano o un segmento del gen Vk3-20 humano y uno de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos génicos Jk humanos, y tiene una población de linfocitos pro B inmaduros en<la médula ósea dentro del intervalo de aproximadamente 5x10>5<a aproximadamente 7x10>5<células, inclusive, por>ejemplo, aproximadamente 5,0x105, 5,1x105, 5,2x105, 5,3x105, 5,4x105, 5,5x105, 5,6x105, 5,7x105, 5,8x105, 5,9x105,<6,0x105, 6,1x105, 6,2x105, 6,3x105, 6,4x105, 6,5x105, 6,6x105, 6,7x105, 6,8x105, 6,9x105, o 7,0x10>5<células; en algunos>aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B inmaduros en la médula<ósea de aproximadamente 5,33x10>5<células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento>comprende una población de linfocitos B inmaduros en la médula ósea de aproximadamente 5,80x105 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B inmaduros en la médula ósea de aproximadamente 5,92x105 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B inmaduros en la médula ósea de aproximadamente 6,67x105 células. Los linfocitos B inmaduros ejemplares en la médula ósea de ratones modificados genéticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresión de IgM, B220 y/o una combinación de los mismos (p.ej., IgM+, B220int).

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento, expresa una cadena ligera generada a través de un reordenamiento de un segmento del gen Vk1-39 humano o un segmento del gen Vk3-20 humano y uno de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos génicos J<k>humanos, y tiene una población de linfocitos B maduros en la<médula ósea dentro del intervalo de aproximadamente 3x10>4<a aproximadamente 1,5x10>5<células, inclusive, por>ejemplo, aproximadamente 3,0x104, 3,5x104, 4,0x104, 4,5x104, 5,0x104, 5,5x104, 6,0x104, 6,5x104, 7,0x104, 7,5x104,<8,0x104, 8,5x104, 9,0x104, 9,5x104, 1,0x105, o 1,5x10>5<células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B maduros en la médula ósea de aproximadamente 3,11x10>4 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B maduros en la médula ósea de aproximadamente 1,09x105 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B maduros en la médula ósea de aproximadamente 1,16x105 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de<linfocitos B maduros en la médula ósea de aproximadamente 1,44x10>5<células. Los linfocitos B maduros ejemplares>en la médula ósea de ratones modificados genéticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresión de IgM, B220 y/o una combinación de los mismos (p.ej., IgM+, B220hi).

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento, expresa una cadena ligera generada a través de un reordenamiento de un segmento del gen Vk1-39 humano o un segmento del gen Vk3-20 humano y uno de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos génicos Jk humanos, y tiene una población total de linfocitos B en la médula<ósea dentro del intervalo de aproximadamente 1x10>6<a aproximadamente 3x10>6<células, inclusive, por ejemplo>aproximadamente 1,0x106, 1,1x106, 1,2x106, 1,3x106, 1,4x106, 1,5x106, 1,6x106, 1,7x106, 1,8x106, 1,9x106, 2,0x106,<2,1x106, 2,2x106, 2,3x106, 2,4x106, 2,5x106, 2,6x106, 2,7x106, 2,8x106, 2,9x10>6<o 2,0x10>6<células; en algunos aspectos,>un ratón descrito en el presente documento comprende una población total de linfocitos B en la médula ósea de<aproximadamente 1,59x10>6<células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población total de linfocitos B en la médula ósea de aproximadamente 1,75x10>6<células; en algunos aspectos, un ratón>descrito en el presente documento comprende una población total de linfocitos B en la médula ósea de aproximadamente 2,13x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una<población total de linfocitos B en la médula ósea de aproximadamente 2,55x1o>6<células. Un total de linfocitos B>ejemplar en la médula ósea de ratones modificados genéticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresión de CD19, CD20 y/o una combinación de los mismos (p.ej., CD19+).

En algunos aspectos, se describe un ratón modificado genéticamente que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia Vk/Jk de inmunoglobulina humana reordenada, en donde el ratón comprende un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina funcional, y en donde el ratón comprende una población de linfocitos B esplénicos que comprende una proporción de linfocitos B IgA+ a linfocitos B IgK+ que es de<aproximadamente 1 a aproximadamente>8<; en algunos aspectos, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5. En>algunos aspectos, la secuencia Vk/Jk de inmunoglobulina humana reordenada se genera a través de un reordenamiento de uno de los dos segmentos génicos Vk de inmunoglobulina humana y uno de los 1,2, 3, 4 o 5 segmentos génicos Jk de la inmunoglobulina humana. En algunos aspectos, la secuencia Vk/Jk de inmunoglobulina humana reordenada se genera a través de un reordenamiento de un segmento del gen Vk1-39 de inmunoglobulina humana y un segmento génico Jk de inmunoglobulina humana seleccionado de Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5 y una combinación de los mismos. En algunos aspectos, la secuencia Vk/Jk de inmunoglobulina humana reordenada se genera a través de un reordenamiento de un segmento del gen Vk3-20 de inmunoglobulina humana y un segmento génico Jk de inmunoglobulina humana seleccionado de Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5 y una combinación de los mismos.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos<CD19+ dentro del intervalo de aproximadamente 2x10>6<a aproximadamente 7x1o>6<células, inclusive, por ejemplo aproximadamente 2,0x106, 2,5x106, 3,0x106, 3,5x106, 4,0x106, 4,5x106, 5,0x106, 5,5x106, 6,0x106, 6,5x106, o 7,0x10>6 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B<esplénicos CD19+ en la médula ósea de aproximadamente 2,74x10>6<células; en algunos aspectos, un ratón descrito>en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos CD19+ de aproximadamente 4.30xl06células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de<linfocitos B esplénicos CD19+ de aproximadamente 5,53x10>6<células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el>presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos CD19+ de aproximadamente 6,18x106 células.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos<CD19+, IgDhi, IgMlD dentro del intervalo de aproximadamente 1x10>6<a aproximadamente 4x10>6<células, inclusive, por ejemplo, aproximadamente>1<,>0<x>10<6, 1,5x106,>2<,>0<x>10<6, 2,5x106, 3,0x106, 3,5x106, 4,0x10>6<células; en algunos aspectos,>un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos CD19+, IgDhi, IgMlD de aproximadamente 1,30x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos CD19+, IgDhi, IgMlD de aproximadamente 2,13x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos CD19+, IgDhi, IgMlD de aproximadamente 3,15x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento<comprende una población de linfocitos B esplénicos CD19+, IgDhi, IgMlD de aproximadamente 3,93x10>6<células.>

En algún aspecto, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos<CD19+, IgDlD, IgMhi dentro del intervalo de aproximadamente 9x10>5<a aproximadamente 2x10>6<células, inclusive, por ejemplo aproximadamente 9,0x105, 9,25x105, 9,5x105, 9,75x105, 1,0x106, 1,25x106, 1,50x106, 1,75x106, 2,0x10>6 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos CD19+, IgDlD, IgMhi de aproximadamente 9,52x105; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos CD19+, IgDo IgMhi de aproximadamente 1,23x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos CD19+, IgDlD, IgMhi de aproximadamente 1,40x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B esplénicos CD19+, IgDlc, IgMhi de aproximadamente 1,42x106 células.

En algunos aspectos, se describe un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende dos segmentos génicos Vk de inmunoglobulina humana no reordenados y dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos génicos Jk humanos no reordenados, y en donde el ratón comprende una población de linfocitos B esplénicos periféricos que comprende poblaciones de linfocitos B transicionales (por ejemplo, T1, T2 y T3) que son aproximadamente iguales a las de ratón que comprende un complemento de tipo silvestre de los segmentos de los genes V y J de la cadena ligera k de inmunoglobulina. Las poblaciones de linfocitos B transicionales ejemplares (por ejemplo, T1, T2 y T3) en el bazo de un ratón modificado genéticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresión de IgM, CD23, CD93, B220 y/o una combinación de los mismos.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B T1 en el<bazo (por ejemplo, CD93+, B220+, IgMhi, CD23-)dentro del intervalo de aproximadamente 2x10>6<a aproximadamente 7x10>6<células, inclusive, por ejemplo aproximadamente 2,0x106, 2,5x106, 3,0x106, 3,5x106, 4,0x106, 4,5x106, 5,0x106, 5,5x106, 6,0x106, 6,5x106, o 7,0x10>6<células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento>comprende una población de linfocitos B T1 en el bazo de aproximadamente 2,16x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B T1 en el bazo de aproximadamente 3,63x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B T1 en el bazo de aproximadamente 3,91x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito<en el presente documento comprende una población de linfocitos B T1 en el bazo de aproximadamente 6,83 x10>6 células.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B T2 en el<bazo (por ejemplo, CD93+, B220+, IgMhi, CD23+)dentro del intervalo de aproximadamente 1x10>6<a aproximadamente 7x10>6<células, inclusive, por ejemplo aproximadamente 1,0x106, 1,5x106, 2,0x106, 2,5x106, 3,0x106, 3,5x106, 4,0x106, 4,5x106, 5,0x106, 5,5x106, 6,0x106, 6,5x106, o 7,0x10>6<células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente>documento comprende una población de linfocitos B T2 en el bazo de aproximadamente 1,30x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B T2 en el bazo de aproximadamente 2,46x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B T2 en el bazo de aproximadamente 3,24x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B T2 en el bazo de aproximadamente 6,52x106 células.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B T3 en el<bazo (por ejemplo, CD93+, B220+, IgMlD, CD23+)dentro del intervalo de aproximadamente 1x10>6<a aproximadamente 4x10>6<células, inclusive, por ejemplo, aproximadamente 1,0x106, 1,5x106, 2,0x106, 2,5x106, 3,0x106, 3,5x106, o 4,0x10>6 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B T3 en el bazo de aproximadamente 1,08x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento<comprende una población de linfocitos B T3 en el bazo de aproximadamente 1,35x10>6<células; en algunos aspectos,>un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B T3 en el bazo de<aproximadamente 3,37x10>6<células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una>población de linfocitos B T1 en el bazo de aproximadamente 3,63x106 células.

En algunos aspectos, se describe un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende dos segmentos génicos Vk de inmunoglobulina humana no reordenados y 1, 2, 3, 4 o 5 segmentos génicos J<k>de inmunoglobulina humana no reordenados, y en donde el ratón comprende una población de linfocitos B esplénicos periféricos que comprende poblaciones de linfocitos B precursores de zona y la zona marginal que son aproximadamente iguales a las de un ratón que comprende un complemento de tipo silvestre de los segmentos de los genes V<k>y J<k>de inmunoglobulina. Las poblaciones de linfocitos B de zona marginal ejemplares en el bazo de un ratón modificado genéticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresión de IgM, CD21/35, CD23, CD93, B220 y/o una combinación de los mismos.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B de zona marginal en el bazo (por ejemplo, CD93-, B22o+, IgMhi, CD21/35hi, CD23-)dentro del intervalo de aproximadamente 1<x>10<6a aproximadamente 3x l0>6<células, inclusive, por ejemplo, aproximadamente>1<,>0<x>10<6, 1,5x106, 2,0x106, 2,5x106, o 3,0x10>6<células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B de zona marginal en el bazo de aproximadamente 1,47x10>6<células; en algunos aspectos, un ratón descrito>en el presente documento comprende una población de linfocitos B de zona marginal en el bazo de aproximadamente<1,49x10>6<células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de>linfocitos B de zona marginal en el bazo de aproximadamente 2,26x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B de zona marginal en el bazo de aproximadamente<2,33x10>6<células.>

En algunos aspectos, se describe un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende dos segmentos génicos Vk de inmunoglobulina humana no reordenados y 1, 2, 3, 4 o 5 segmentos génicos Jk de inmunoglobulina humana no reordenados, y en donde el ratón comprende una población de linfocitos B esplénicos periféricos que comprende población(es) de linfocitos B foliculares (por ejemplo, FO-I y FO-II) que son aproximadamente iguales a las de un ratón que comprende un complemento de tipo silvestre de los segmentos de los genes V<k>y J<k>de inmunoglobulina. Las poblaciones ejemplares de linfocitos B foliculares (por ejemplo, FO-I y FO-II) en el bazo de un ratón modificado genéticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresión de IgM, IgD, CD21/35, CD93, B220 y/o una combinación de los mismos.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B foliculares tipo 1 en el bazo (por ejemplo, CD93<->, B220<+>, CD21/35<int>, IgM<lD>IgD<hi>) dentro del intervalo de aproximadamente 3x10<6>a aproximadamente 1,5x10<7>células, inclusive, por ejemplo, aproximadamente 3,0x10<6>, 3,5x10<6>, 6,0x10<6>, 6,5x10<6>, 7,0x10<6>, 7,5x10<6>, 6,0x10<6>, 6,5x10<6>, 7,0x10<6>, 7,5x10<6>, 8,0x10<6>, 8,5x10<6>, 9,0x10<4>, 9,5x10<4>, 1,0x10<5>, o 1,5x10<5>células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B foliculares tipo 1 en el bazo de aproximadamente 3,57x10<6>células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B foliculares tipo 1 en el bazo de aproximadamente 6,31x10<6>células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B<foliculares tipo>1<en el bazo de aproximadamente 9,42x106 células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el>presente documento comprende una población de linfocitos B foliculares tipo 1 en el bazo de aproximadamente 1,14x10<7>células.

En algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B foliculares tipo 2 en el bazo (por ejemplo, CD93<->, B220<+>, CD21/35<int>, IgM<int>, IgD<hi>)dentro del intervalo de aproximadamente 1x10<6>a aproximadamente 2x10<6>células, inclusive, por ejemplo, 1,0x10<6>, 1,25x10<6>, 1,5x10<6>, 1,75x10<6>, o 2,0x10<6>células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B foliculares tipo 2 en el bazo de aproximadamente 1,14x10<6>células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B foliculares tipo 2 en el bazo de aproximadamente 1,45x10<6>células; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B foliculares tipo 2 en el bazo de aproximadamente 1,80x10<6>; en algunos aspectos, un ratón descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B foliculares tipo 2 en el bazo de aproximadamente 2,06x10<6>células.

En algunos otros aspectos diversos, en el presente documento, también se describe un animal no humano modificado genéticamente que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende al menos un segmento génico Vl humano y al menos un segmento génico Jl humano unido operativamente a una secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina, en donde cada uno de los al menos un segmento génico V<l>humano comprende al menos un codón de histidina que no está codificado por el correspondiente segmento génico Vl de la línea germinal humana. En un aspecto, el al menos un segmento génico Vl humano y el al menos un segmento génico Jl humano son capaces de reordenar y codificar un dominio variable de cadena ligera humana de un anticuerpo. En un aspecto, el animal no humano no comprende un segmento génico V<l>endógeno que es capaz de reordenarse para formar una cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, una secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina endógena, por ejemplo, una secuencia de rata o ratón. En un aspecto, el animal comprende además en su línea germinal un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada no reordenada que comprende segmentos génicos V<h>, D<h>y J<h>humanos operativamente unidos a una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, una secuencia de la región constante de cadena pesada no humana endógena, por ejemplo, una secuencia de rata o ratón. En un aspecto, el al menos un segmento génico Vl humano y el al menos un segmento génico J<l>humano están presentes en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógena. En un aspecto, la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es una región Ck. En un aspecto, el al menos un segmento génico V<l>humano comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina codificado por una secuencia de segmento génico Vl de línea germinal humana correspondiente con el codón de histidina. En un aspecto, la sustitución es en el codón o los codones de CDR3, por ejemplo, tres o cuatro codones de no histidina. En un aspecto, el al menos un segmento génico V<l>humano es dos segmentos génicos V<l>humanos, por ejemplo, segmentos de los genes V<k>1-39 y Vk3-20 humanos. En un aspecto, el animal es un roedor, por ejemplo, una rata o un ratón. En un aspecto, el animal expresa un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el al menos un segmento génico Vl humano y el anticuerpo conserva al menos un resto de histidina en una posición de aminoácido codificada por el al menos un codón de histidina del segmento génico V<L>humano.

En un aspecto, en el presente documento, también se describe un animal no humano modificado genéticamente que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un repertorio limitado de segmentos génicos de región variable de cadena ligera humana, por ejemplo, un repertorio limitado de segmentos génicos Vl y Jl humanos, en donde el repertorio limitado de segmentos génicos variables de cadena ligera humana comprende al menos un codón de histidina que no está codificado por la correspondiente secuencia de la línea germinal humana. En un aspecto, en el presente documento, se describe un animal no humano modificado genéticamente que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos V<l>y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos J<l>humanos, en donde cada uno de los no más de dos segmentos génicos Vl humanos comprende al menos un codón de histidina que no está codificado por el correspondiente segmento génico V<l>de la línea germinal humana. En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos V<L>humanos y el uno o más, por ejemplo, los dos o más, segmentos génicos J<L>humanos están operativamente unidos a una secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos V<l>humanos y el uno o más, por ejemplo, los dos o más, segmentos génicos J<l>humanos son segmentos génicos V<k>y J<k>. En diversos aspectos, los segmentos génicos V<l>humanos y los segmentos génicos Jl humanos son capaces de reordenar y codificar un dominio variable de cadena ligera humana de un anticuerpo. En un aspecto, el animal no comprende un segmento génico Vl endógeno que es capaz de reordenarse para formar una cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia de la región constante de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, una secuencia de roedor, por ejemplo, una secuencia de ratón o rata. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana es una secuencia endógena. En otro aspecto, la secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia humana. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia Ck. En un aspecto, el animal no humano comprende además en su línea germinal un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada que comprende segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos operativamente unidos a una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, una secuencia de roedor, por ejemplo, una secuencia de rata o ratón. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana es una secuencia de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena pesada es una secuencia de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos V<l>humanos y el uno o más, por ejemplo, los dos o más, segmentos génicos J<l>humanos están presentes en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógeno.

En un aspecto, el animal no humano descrito en el presente documento comprende uno o más, por ejemplo, dos o más segmentos génicos Jl humanos y el uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos son cinco segmentos Jk humanos, por ejemplo, segmentos de los genes Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5 humanos. En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos Vl humanos se seleccionan de los segmentos de los genes Vk1-39, Vk3-20 humanos, y una combinación de los mismos. En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos Vl humanos son segmentos de los genes Vk1-39 y Vk3-20 humanos. En un aspecto, cada uno de los no más de dos segmentos génicos Vl comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina codificado por una secuencia de segmento génico Vl de línea germinal humana correspondiente con un codón de histidina. En un aspecto, la sustitución es de uno, dos, tres o cuatro codones (por ejemplo, tres o cuatro codones). En un aspecto, la sustitución es en el codón o los codones de CDR3. En un aspecto, en el presente documento, los no más de dos segmentos génicos V<l>humanos son segmentos de los genes Vk1-39 y Vk3-20 humanos, cada uno de los segmentos de los genes Vk1-39 y Vk3-20 humanos comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina codificado por un segmento correspondiente del gen V<l>de la línea germinal humana con el codón de histidina. En un aspecto, cada uno de los segmentos de los genes Vk1-39 y Vk3-20 humanos comprende una sustitución de tres o cuatro codones de histidina. En un aspecto, las tres o cuatro sustituciones están en la región CDR3. En un aspecto, en donde la sustitución es de tres codones de no histidina del segmento del gen Vk1-39 humano, la sustitución se diseña para expresar histidinas en las posiciones 106, 108 y 111. En otro aspecto, en donde la sustitución es de cuatro codones de no histidina del segmento del gen V<k>1-39 humano, la sustitución se diseña para expresar las histidinas en las posiciones 105, 106, 108 y 111. En otro aspecto, en donde la sustitución es de tres codones de no histidina del segmento del gen Vk3-20 humano, la sustitución se diseña para expresar histidinas en las posiciones 105, 106 y 109. En otro aspecto más, en donde la sustitución es de cuatro codones de no histidina del segmento del gen Vk3-20 humano, la sustitución se diseña para expresar las histidinas en las posiciones 105, 106, 107 y 109. En un aspecto, el animal no humano es un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata. En un aspecto, el animal no humano es un ratón. En un aspecto, el animal expresa un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por uno de los no más de dos segmentos génicos Vl humanos y el anticuerpo conserva al menos un resto de histidina en una posición de aminoácido codificada por el al menos un codón de histidina introducido en el segmento génico Vl humano. En un aspecto, el animal expresa una población de anticuerpos específicos de antígeno en respuesta a un antígeno en donde todos los anticuerpos en la población comprenden (a) dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina derivados de un reordenamiento de no más de dos segmentos génicos Vl y el uno o más, por ejemplo, los dos o más, segmentos génicos J<L>en donde cada uno de los no más de dos segmentos génicos V<L>humanos comprende al menos un codón de histidina que no está codificado por el correspondiente segmento génico Vl de la línea germinal humana y (b) cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden dominios variables de cadena pesada humana derivados de un repertorio de segmentos V, D y J pesados humanos.

En un aspecto, el animal descrito en el presente documento, comprende una población de linfocitos B en respuesta a un antígeno de interés que está enriquecido para anticuerpos que muestran una disminución en la semivida disociativa (t-<i/2>) a un pH ácido en comparación con un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces. En un aspecto, tal enriquecimiento en anticuerpos que muestran una disminución en t-<i/2>es al menos aproximadamente 2 veces.

En el presente documento también se describe un método para generar un anticuerpo que muestra una unión a un antígeno de interés dependiente del pH que comprende generar el animal no humano descrito en el presente documento (por ejemplo, el animal no humano que comprende al menos un segmento génico V<L>humano y al menos un segmento génico Jl humano; por ejemplo, el animal no humano que comprende un repertorio limitado de segmentos génicos de región variable de cadena ligera humana; por ejemplo, el animal no humano modificado genéticamente que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos Vl y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos - en donde cada uno de los segmentos génicos Vl humanos presentes en la línea germinal de dicho animal comprende al menos un codón de histidina que no está codificado por el segmento génico V<l>correspondiente de la línea germinal humana, inmunizar dicho animal con un antígeno de interés, y seleccionar un anticuerpo que se una al antígeno de interés con una afinidad deseada a un pH neutro mientras muestra una unión reducida al antígeno de interés a un pH ácido.

En el presente documento también se describe un método para producir un animal no humano que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina genéticamente modificado en su línea germinal, comprendiendo el método (a) modificar un genoma de un animal no humano para eliminar o generar segmentos de los genes Vl y Jl de cadena ligera de inmunoglobulina endógena no funcionales en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina, y (b) colocar en el genoma del animal no humano, una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende al menos un segmento génico Vl humano y al menos un segmento génico Jl humano, de modo que la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina esté unida operativamente a una secuencia de la región constante de inmunoglobulina; en donde cada uno de los al menos un segmento génico Vl humano comprende al menos un codón de histidina que no está codificado por el correspondiente segmento génico V<l>de la línea germinal humana. En un aspecto, los segmentos génicos V<l>humanos y los segmentos génicos J<l>humanos son capaces de reordenar y codificar un dominio variable de cadena ligera humana de un anticuerpo. En un aspecto, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina está en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógeno. En un aspecto, el al menos un segmento génico V<l>humano es dos segmentos génicos V<l>humanos, y donde los dos segmentos génicos Vl humanos son segmentos de los genes Vk1-39 y Vk3-20 humanos. En algunos aspectos, el animal no humano es un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata. En un aspecto, este método da como resultado el animal no humano que comprende una población de linfocitos B enriquecidos por anticuerpos que muestran una unión a antígeno de interés dependiente del pH.

En algunos aspectos, en el presente documento, también se describe un locus de cadena ligera de inmunoglobulina no humana que comprende al menos un segmento génico V<l>humano y al menos un segmento génico J<l>humano unido operativamente a una secuencia de región constante de inmunoglobulina, en donde cada uno de los al menos un segmento génico V<l>humano comprende al menos un codón de histidina que no está codificado por el correspondiente segmento génico Vl de la línea germinal humana. En algún aspecto, en el presente documento también se describe un locus de cadena ligera de inmunoglobulina no humano que comprende un repertorio limitado de segmentos génicos variables humanos, por ejemplo, un locus no humano que comprende no más de dos segmentos génicos Vl humanos y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos operativamente unidos a una secuencia de región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, una secuencia de región constante de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, una secuencia de rata o ratón), en donde cada uno de los no más de dos segmentos génicos Vl humanos comprende al menos un codón de histidina que no está codificado por el correspondiente segmento génico V<l>de la línea germinal humana. En un aspecto, el locus comprende cinco segmentos génicos Jk humanos, por ejemplo, segmentos de los genes Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5. En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos Vl humanos con modificaciones con histidina son Vk1-39 y Vk3-20. En diversos aspectos, los loci no humanos descritos en el presente documento, pueden generarse utilizando los métodos descritos a lo largo de esta solicitud para producir animales no humanos genéticamente modificados. Por tanto, también se describe un método para producir animales no humanos modificados genéticamente que comprende al menos un segmento génico V<l>y al menos un segmento génico J<l>; que comprende un repertorio limitado de segmentos génicos variables humanos; o que comprende no más de dos segmentos génicos Vl humanos y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos J<l>humanos, operativamente unidos a una secuencia de región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, una secuencia de región constante de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, una secuencia de rata o ratón), en donde cada segmento génico Vl humano comprende al menos un codón de histidina que no está codificado por el correspondiente segmento génico V<l>de la línea germinal humana.

Cualquiera de las realizaciones y aspectos descritos en el presente documento pueden utilizarse juntos entre sí, salvo que se indique otra cosa o sea evidente a partir del contexto. Otras realizaciones serán evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de una revisión de la siguiente descripción.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 ilustra una alineación de aminoácidos de las cadenas ligeras derivadas de V<k>1-39 humano de diversos anticuerpos específicos de antígeno (anticuerpos A-K, correspondientes a las SEQ ID NO: 136-146, respectivamente). Los restos de histidina (H) ubicados dentro de cada secuencia de cadena ligera están en negrita. Varias regiones de cadena ligera (Marco y CDR) se indican sobre la alineación.

La FIG. 2 ilustra las combinaciones y ubicaciones de los restos de histidina diseñados genéticamente en la región CDR3 de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39 humano por mutagénesis. Se incluyen las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes. Los restos de histidina introducidos por mutagénesis y los correspondientes restos de ácido nucleico se muestran en negrita. Las posiciones de los aminoácidos (l05, 106, etc.) se basan en una numeración única descrita en Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77, y también puede verse en el sitio web del Sistema Internacional de Información sobre Inmunogenética (IMGT).

La FIG. 3 ilustra el nivel de expresión de anticuerpos en ng/ml detectado en los sobrenadantes de células CHO transfectadas con ácidos nucleicos que codifican cinco (1-5) cadenas pesadas diferentes y cadenas ligeras derivadas de V<k>1-39 que tienen restos de histidina diseñados genéticamente en los lugares indicados (véase X eje) en la CDR3.

La FIG. 4 es una transferencia Western que muestra la expresión de anticuerpos humanos específicos de antígeno seleccionados que contienen cadenas ligeras diseñadas genéticamente con histidina en sobrenadantes de células CHO.

Las FIG. 5A-5E muestran la cinética de unión para cadenas pesadas seleccionadas (1-5) de anticuerpos específicos de antígeno emparejados con varias cadenas ligeras diseñadas genéticamente con histidina a un pH<neutro (7,4) y ácido (5,75). Se muestran varios parámetros cinéticos que incluyen a, kd, Kd y t i>/2<. NB = sin unión.>

<La FIG. 6 muestra los parámetros cinéticos (Kd and t i>/2<) para los anticuerpos que comprenden la cadena ligera>universal precursora o la cadena ligera universal modificada con histidina emparejadas con las cadenas pesadas indicadas (2, 3 y 6). Las sustituciones de histidina conducen a una fuerte dependencia del pH en varios anticuerpos.<Las sustituciones de histidina se realizaron en CDR3 para convertir la secuencia>105<QQSYSTP>111<(SEQ ID NO:3)>en la secuencia de CDR3 modificada con histidina entre paréntesis. Téngase en cuenta que NB = sin unión detectada (KD> 10 micromolar).

La FIG. 7 muestra la secuencia y las propiedades (% de contenido de GC, N, % de desapareamiento, Tm) de los cebadores de mutagénesis seleccionados utilizados para diseñar restos de histidina en CDR3 de una secuencia de cadena ligera de V<k>1-39/J<k>5 humano reordenada. Las SEQ ID NO para estos cebadores utilizados en el Listado de Secuencias se incluyen en la Tabla a continuación. F= cebador directo, R= cebador inverso.

Las FIG. 8A a 8B muestran una estrategia general para la construcción de vectores de direccionamiento para el diseño de restos de histidina en una secuencia de región variable de cadena ligera humana reordenada derivada de la región variable de V<k>1-39/J<k>5 para producir un ratón modificado genéticamente que expresa anticuerpos que contienen la cadena ligera humana modificada. Las FIG. 8C-8D muestran la introducción del vector de direccionamiento para las sustituciones ULC-H105/106/108/111 en células ES y la generación de ratones heterocigotos a partir de los mismos; mientras que las FIG. 8E-8F muestran la introducción del vector de direccionamiento para sustituciones ULC-H106/108/111 en células ES y generación de ratones heterocigotos a partir de los mismos. Los diagramas no se presentan a escala. A menos que se indique otra cosa, las formas rellenas y las líneas continuas representan la secuencia del ratón, las formas vacías y las líneas dobles representan la secuencia humana.

La FIG. 9 muestra títulos de antisuero contra inmunógeno de ratones heterocigotos para la cadena ligera universal de histidina (HULC) (con 4 sustituciones de His-ratones HULC 1927; con 3 sustituciones de His - ratones HULC 1930) y animales de tipo silvestre en una segunda hemorragia.

La FIG. 10 es una comparación del número de clones positivos para el antígeno total y el número de clones positivos para el antígeno que muestran una unión a antígeno sensible al pH obtenidos de fusiones de hibridomas de HULC heterocigotos (1927 frente a 1930) y ratones TS. La figura incluye datos de dos ratones para cada tipo de ratón ("ratón 1" y "ratón 2").

Las FIG. 11A-11C muestran sensogramas de experimentos de unión de resonancia de plasmón de superficie en los cuales se permitió que los anticuerpos monoclonales (AA, BB, CC, DD, HH, GG, NN y OO) de ratones HULC heterocigotos o TS se asociaran con el inmunógeno a pH neutro (pH 7,4) seguido de un cambio a tampón con pH de 7,4 o 6,0 para la fase de disociación. Las líneas individuales en cada gráfico representan las respuestas de unión a diferentes concentraciones de los respectivos anticuerpos. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C. Los valores de semivida disociativa (t1/2) se indican sobre los respectivos sensogramas, y el cambio de veces en la t1^ se incluye a la derecha de cada sensograma. Los anticuerpos AA, BB, CC, DD, HH y GG eran de ratones HULC 1927 heterocigotos que utilizan cadenas ligeras sustituidas con His, NN es de ratones HULC 1927 heterocigotos que usan cadenas ligeras de TS y OO es de un ratón TS (véase Tabla 4 para aclaración).

La FIG. 12 ilustra las posiciones de los restos de histidina diseñados genéticamente en la región CDR3 de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 humano por mutagénesis. Los restos de histidina introducidos por mutagénesis y los correspondientes restos de ácidos nucleicos ejemplares se muestran en negrita. Las posiciones de los aminoácidos (105, 106, etc.) se basan en una numeración única descrita en Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77, y también puede verse en el sitio web del Sistema Internacional de Información sobre Inmunogenética (IMGT).

La FIG. 13 muestra la secuencia y las propiedades (% de contenido de GC, N, % de desapareamiento, Tm) de los cebadores de mutagénesis seleccionados utilizados para diseñar restos de histidina en CDR3 de una secuencia de cadena ligera de Vk3-20/Jk1 humano reordenada. Las SEQ ID NO para estos cebadores utilizados en el Listado de Secuencias se incluyen en la Tabla a continuación. F= cebador directo, R= cebador inverso.

Las FIG. 14A a 14B muestran una estrategia general para la construcción de vectores de direccionamiento para el diseño de restos de histidina en una secuencia de región variable de cadena ligera humana reordenada derivada de la región variable de cadena ligera de V<k>3-20/J<k>1 para producir un ratón modificado genéticamente que expresa anticuerpos que contienen la cadena ligera humana modificada. La FIG 14C muestra la introducción del vector de direccionamiento para las sustituciones ULC-Q105H/Q106H/Y107H/S109H en células ES y la generación de ratones heterocigotos a partir de los mismos; mientras que la FIG. 14D muestra la introducción del vector de direccionamiento para sustituciones ULC-Q105H/Q106H/S109H en células ES y generación de ratones heterocigotos a partir de los mismos. Los diagramas no se presentan a escala. A menos que se indique otra cosa, las formas rellenas y las líneas continuas representan la secuencia del ratón, las formas vacías y las líneas dobles representan la secuencia humana.

La FIG. 15 es una ilustración general de la recombinación de un segmento de genes V y J de un alelo de cadena ligera k de inmunoglobulina en un ratón y la estructura del locus de la cadena ligera antes del reordenamiento (arriba) y después del reordenamiento (abajo). El reordenamiento representado aquí es solo uno de los diferentes eventos de reordenamiento posibles. Los diagramas no se presentan a escala.

La FIG. 16A es una representación esquemática de dos loci de cadena ligera universal, uno que comprende una secuencia de región variable de Vk1-39/Jk5 humano reordenada (arriba), y uno que comprende una secuencia de región variable de Vk3-20/Jk1 humano reordenado (abajo). Los diagramas no se presentan a escala. A menos que se indique otra cosa, las formas rellenas representan la secuencia del ratón y las formas vacías representan la secuencia humana. La FIG. 16B muestra ejemplos de dos loci de cadena ligera doble (DLC) modificados genéticamente. El locus en la parte superior (DLC-5J) contiene un fragmento de ADN humano diseñado genéticamente que contiene dos segmentos génicos V<k>humanos y cinco segmentos génicos J<k>humanos. El locus en la parte inferior (DLC-1J) contiene un fragmento de ADN humano diseñado genéticamente que contiene dos segmentos génicos V<k>humanos y un segmento génico J<k>humano. Cada locus es capaz de reordenarse para formar una región V<k>humana operativamente unida a una región constante de cadena ligera endógena (por ejemplo, una C<k>). Se muestra los promotores de inmunoglobulinas (P, flecha abierta encima del locus), los exones líderes (L, flechas cortas abiertas) y los dos segmentos génicos V<k>humanos (flechas largas abiertas), todos flanqueados cadena arriba (5 ') por un casete de neomicina que contiene sitios de recombinación Frt. Las secuencias de señal de recombinación diseñadas genéticamente con cada uno de los segmentos de genes humanos (Vk y Jk) se indican mediante óvalos abiertos yuxtapuestos con cada segmento génico. El locus DLC-5J contiene una RSS yuxtapuesta con cada uno de los cinco segmentos génicos Jk. En la mayoría de las realizaciones, a menos que se indique lo contrario, las formas rellenas y las líneas continuas representan secuencias de ratón, y las formas abiertas y las líneas dobles representan secuencias humanas. Los diagramas no se presentan a escala.

Las FIG. 17A-17C muestran una estrategia general para la construcción de un vector de direccionamiento para el diseño de un locus kappa de inmunoglobulina que comprende dos segmentos V<k>humanos (hVKl-39 y hVK3-20) y un segmento J<k>humano (J<k>5), así como potenciadores y brazo IgKC de ratón. La FIG. 17D muestra la introducción del vector de direccionamiento en células ES y generación de ratones heterocigotos con los mismos; mientras que la FIG. 17E muestra la eliminación del casete de selección en células ES utilizando la enzima FLP. En la mayoría de las realizaciones, a menos que se indique lo contrario, las formas rellenas y las líneas continuas representan secuencias de ratón, y las formas abiertas y las líneas dobles representan secuencias humanas. Los diagramas no se presentan a escala.

Las FIG. 18A-18D muestran la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 82) de la porción diseñada genéticamente del locus k de inmunoglobulina que comprende dos segmentos Vk humanos (hVKl-39 y hVK3-20) y un segmento Jk humano; la secuencia de nucleótidos abarca la secuencia humana diseñada genéticamente y comprende aproximadamente 100 pares de bases de secuencia de ratón endógena en los extremos 5 'y 3'. La parte inferior de la FIG. 18D explica las diferentes fuentes utilizadas para representar diversas secuencias.

Las FIG. 19A-19B muestran una estrategia general para la construcción de un vector de direccionamiento para el diseño de un locus kappa de inmunoglobulina que comprende dos segmentos V<k>humanos (hVKl-39 y hVK3-20) y cinco segmentos J<k>humanos, así como potenciadores y brazo IgKC de ratón. La FIG. 19C muestra la introducción del vector de direccionamiento en células ES y generación de ratones heterocigotos con los mismos; mientras que la FIG. 19D muestra la eliminación del casete de selección en células ES utilizando la enzima FLP. En la mayoría de las realizaciones, a menos que se indique lo contrario, las formas rellenas y las líneas continuas representan secuencias de ratón, y las formas abiertas y las líneas dobles representan secuencias humanas. Los diagramas no se presentan a escala.

Las FIG. 20A-20D muestran la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 83) del locus k de inmunoglobulina diseñado genéticamente que comprende dos segmentos V<k>humanos (hVKl-39 y hVK3-20) y cinco segmentos J<k>humanos;<la secuencia de nucleótidos abarca la secuencia diseñada genéticamente y aproximadamente>100<pares de bases>de secuencia de ratón endógena en los extremos 5 'y 3'. La parte inferior de la FIG. 20D explica las diferentes fuentes utilizadas para representar diversas secuencias.

La FIG. 21A, en el panel superior, muestras gráficas de contorno representativas de la médula ósea teñida para linfocitos B y T (CDÍ9+ y CD3+, respectivamente) de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para dos segmentos génicos V<k>humanos y cinco J<k>humanos (DLC-5J). El panel inferior muestra gráficas de contorno representativas de la médula ósea seleccionadas por CD19+ y teñidas para ckit+ y CD43+ de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco Jk humanos (DLC-5J). Los linfocitos Pro y Pre B se indican en los gráficos de contorno del panel inferior.

La FIG. 21B muestra el número de linfocitos Pro (CD19+CD43+ckit+) y Pre (CD19+CD43'ckit) B en médula ósea recogida de fémures de ratones de tipo silvestre (TS) y ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco J<k>humanos (DLC-5J).

La FIG. 22A muestra gráficas de contorno representativas de médula ósea seleccionadas por singuletes teñidos para inmunoglobulina M (IgM) y B220 de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para dos segmentos génicos V<k>humanos y cinco J<k>humanos (DLC-5J). Se observan linfocitos B inmaduros, maduros y pro/pre en cada una de las gráficas de contorno.

La FIG. 22B muestra el número total de linfocitos B (CD19 ), B inmaduros (B220intIgM+) y B maduros (B220hiIgM+) en médula ósea aislada de los fémures de ratones de tipo silvestre (TS) y ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco Jk humanos (DLC-5J).

La FIG. 23A muestra gráficas de contorno representativas de médula ósea seleccionadas por singuletes teñidos para inmunoglobulina M (IgM) y B220 de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco Jk humanos (DLC-5J). Se observan linfocitos B inmaduros, maduros y pro/pre en cada una de las gráficas de contorno.

La FIG. 23B muestra gráficas de contorno representativas de médula ósea seleccionadas por linfocitos B inmaduros (B220intIgM+) y maduros (B220hiIgM+) teñidos para la expresión de IgA e IgK aislada de los fémures de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco Jk humanos (DLC-5J).

La FIG. 24A, en el panel superior, muestras gráficas de contorno representativas de esplenocitos seleccionados por singuletes y teñidos para linfocitos B y T (CD19+ y CD3+, respectivamente) de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para dos segmentos génicos V<k>humanos y cinco J<k>humanos (DLC-5J). El panel inferior muestra gráficas de contorno representativas de esplenocitos seleccionados por CD19+ y teñidos para inmunoglobina D (lgD) e inmunoglobina M (lgM) de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco Jk humanos (DLC-5J). Los linfocitos B maduros (54 para TS, 56,9 para DLC-5J) y transicionales (23,6 para TS, 25,6 para DLC-5J) se observan en cada una de las gráficas de contorno.

La FIG.24B muestra el número total de linfocitos B CD19+B, linfocitos B transicionales (CD19+IgMhiIgDlD) y linfocitos B maduros (CD19+IgMloIgDhi) en bazos recogidos de ratones de tipo silvestre (TS) y ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco Jk humanos (DLC-5J).

La FIG. 25A muestra gráficas de contorno representativas de esplenocitos seleccionados por CD19+ de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para dos segmentos génicos V<k>humanos y cinco J<k>humanos (DLC-5J).

La FIG. 25B muestra el número total de linfocitos B (CD19 ), linfocitos B IgK+ (CD19+IgK+) y linfocitos B IgA+ (CD19+IgA+) en bazos recogidos de ratones de tipo silvestre (TS) y ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco Jk humanos (DLC-5J).

La FIG. 26A muestra el desarrollo de linfocitos B periféricos en ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco Jk humanos. La primera gráfica de contorno (extremo izquierdo) muestra los esplenocitos CD93+ y B220+ seleccionados por CD19+, lo que indica linfocitos B inmaduros (39,6) y maduros (57,8). La segunda gráfica de contorno (medio superior) muestra la expresión de IgM+ y CD23+ en linfocitos B inmaduros que indican poblaciones de linfocitos B T1 (33,7; IgD-IgM+CD21 loCD23-), T2 (21,2; IgDhiIgMhiCD21MidCD23+) y T3 (29,1. La tercera gráfica de contorno (medio inferior) muestra la expresión de CD21+ (CD35+) e IgM+ de linfocitos B maduros que indica una pequeña población (14,8) que da lugar a linfocitos B de zona marginal y una segunda población (70,5) que da lugar a linfocitos B foliculares (FO). La cuarta gráfica de contorno (superior derecha) muestra la expresión de B220+ y CD23+ en linfocitos B maduros que indican poblaciones de linfocitos B de zona marginal (90,5; MZ) y precursores de zona marginal (7.3; IgMhiIgDhiCD21hiCD23+). La quinta gráfica de contorno (inferior derecha) muestra la expresión de IgD+ y IgM+ en linfocitos B maduros que indican poblaciones de linfocitos B FO-I (79,0; IgDhiIgMloCD21MidCD23+) y FO-II (15,1; IgDhiIgMhiCD21MidCD23+). Se muestra el porcentaje de células dentro de cada región seleccionada.

La FIG. 26B muestra el desarrollo de linfocitos B periféricos en ratones de tipo silvestre. La primera gráfica de contorno (extremo izquierdo) muestra los esplenocitos CD93+ y B220+ seleccionados por CD19+, lo que indica linfocitos B inmaduros (31,1) y maduros (64,4). La segunda gráfica de contorno (medio superior) muestra la expresión de IgM+ y CD23+ en linfocitos B inmaduros que indican poblaciones de linfocitos B T1 (28,5; IgD-IgM+CD21 loCD23-), T2 (28.7; IgDhiIgMhiCD21MidCD23+) y T3 (30,7). La tercera gráfica de contorno (medio inferior) muestra la expresión de CD21+ (CD35+) e IgM+ de linfocitos B maduros que indica una pequeña población (7,69) que da lugar a linfocitos B de zona marginal y una segunda población (78,5) que da lugar a linfocitos B foliculares (FO). La cuarta gráfica de contorno (superior derecha) muestra la expresión de B220+ y CD23+ en linfocitos B maduros que indican poblaciones de linfocitos B de zona marginal (79,9; MZ) y precursores de zona marginal (19.4; IgMhiIgDhiCD21hiCD23+). La quinta gráfica de contorno (inferior derecha) muestra la expresión de IgD+ y IgM+ en linfocitos B maduros que indican poblaciones de linfocitos B FO-1 (83,6; IgDhiIgMloCD21MidCD23+) y f O-II (13,1; IgDhiIgMhiCD21MidCD23+). Se muestra el porcentaje de células dentro de cada región seleccionada.

La FIG. 27 muestra el número total de poblaciones de linfocitos B transicionales, de zona marginal y foliculares en bazos recogidos de ratones de tipo silvestre (TS) y homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco Jk humanos (DLC-5J).

La FIG. 28 muestra la expresión relativa de ARNm en la médula ósea (eje y) de las cadenas ligeras derivadas de V<k>3-20 y derivadas de V<k>1-39 en un ensayo de PCR cuantitativa que utiliza sondas específicas para los segmentos génicos V<k>3-20 o V<k>1-39 en ratones homocigotos para un reemplazo de los segmentos de los genes V<k>y J<k>endógenos con los segmentos de los genes V<k>y J<k>humanos (Hk) (cadena ligera humana de un ratón VELOCIMMUNE ™), ratones de tipo silvestre (TS), ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco Jk humanos (DLC-5J) y ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y un segmento Jk humano (DLC-1J). Las señales se normalizan a la expresión de Ck de ratón. ND: no detectado.

La FIG. 29 muestra la expresión relativa de ARNm en bazos completos (eje y) de las cadenas ligeras derivadas de V<k>3-20 y derivadas de V<k>1-39 en un ensayo de PCR cuantitativa que utiliza sondas específicas para los segmentos génicos V<k>3-20 o V<k>1-39 en ratones homocigotos para un reemplazo de los segmentos de los genes V<k>y J<k>endógenos con los segmentos de los genes Vk y Jk humanos (Hk) (cadena ligera humana de un ratón VELOCIMMUNE ™), ratones de tipo silvestre (TS), ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco J<k>humanos (DLC-5J) y ratones homocigotos para dos segmentos génicos V<k>humanos y un segmento J<k>humano (DLC-1J). Las señales se normalizan a la expresión de Ck de ratón. ND: no detectado.

La FIG. 30 muestra la secuencia y las propiedades (% de contenido de GC, N, % de desapareamiento, Tm) de los cebadores de mutagénesis seleccionados utilizados para diseñar cuatro restos de histidina en CDR3 de secuencia de cadena ligera de V<k>1-39 y V<k>3-20 humanos. Las SEQ ID NO para estos cebadores utilizados en el Listado de Secuencias se incluyen en la Tabla a continuación. F= cebador directo, R= cebador inverso.

La FIG. 31A muestra la introducción de un vector de direccionamiento que comprende dos segmentos de cadena ligera de Vk humano, cada uno de ellos sustituido con cuatro restos de histidina (****) y cinco Jk humanos en células ES y la generación de ratones heterocigotos con el mismo; mientras que la FIG. 31B muestra la eliminación del casete de selección en células ES utilizando la enzima FLPo. En la mayoría de las realizaciones, a menos que se indique lo contrario, las formas rellenas y las líneas continuas representan secuencias de ratón, y las formas abiertas y las líneas dobles representan secuencias humanas. Los diagramas no se presentan a escala.

La FIG. 32 muestra la secuencia y las propiedades (% de contenido de GC, N, % de desapareamiento, Tm) de los cebadores de mutagénesis seleccionados utilizados para diseñar tres restos de histidina en CDR3 de secuencia de cadena ligera de Vk1-39 y Vk3-20 humanos. Las SEQ ID NO para estos cebadores utilizados en el Listado de Secuencias se incluyen en la Tabla a continuación. F= cebador directo, R= cebador inverso.

La FIG. 33A muestra la introducción de un vector de direccionamiento que comprende dos segmentos de cadena ligera de Vk humano, cada uno de ellos sustituido con tres restos de histidina (***) y cinco Jk humanos en células ES y la generación de ratones heterocigotos con el mismo; mientras que la FIG. 33B muestra la eliminación del casete de selección en células ES utilizando la enzima FLPo. En la mayoría de las realizaciones, a menos que se indique lo contrario, las formas rellenas y las líneas continuas representan secuencias de ratón, y las formas abiertas y las líneas dobles representan secuencias humanas. Los diagramas no se presentan a escala.

La Fig. 34A muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia Vk3-20 de la línea germinal humana (secuencia inferior) con la traducción de aminoácidos de la secuencia variable de la cadena kappa ligera de IgM expresada en un ratón que comprende dos segmentos V kappa (V<k>3-20 y V<k>1-39), cada uno sustituido con 3 restos de histidina en la secuencia de CDR3 (secuencia superior); la alineación muestra la secuencia variable de la cadena kappa de IgM expresada en un ratón que conservó las tres sustituciones de histidina introducidas en la secuencia de la línea germinal. La FIG. 34B muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia V<k>1-39 de la línea germinal humana (secuencia inferior en cada alineación) con la traducción de aminoácidos de la secuencia variable de la cadena kappa ligera de IgM ejemplar expresada en un ratón que comprende dos segmentos V kappa (Vk3-20 y Vk1-39), cada uno sustituido con 3 restos de histidina en la secuencia de CDR3 (secuencia superior en cada alineación); la alineación superior muestra la secuencia variable de la cadena kappa de IgM expresada en un ratón que conservó las tres modificaciones con histidina introducidas en la secuencia de la línea germinal, la alineación inferior muestra la secuencia variable de la cadena kappa de IgM expresada en un ratón que conservó dos de las tres modificaciones con histidina introducidas en la secuencia de la línea germinal. En algunas realizaciones, la histidina introducida en la última posición del V<k>puede perderse durante el reordenamiento V-J.

Descripción detallada

Definiciones

En el presente documento se describen animales no humanos genéticamente modificados (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, hámsteres, etc.) que comprenden en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, secuencia(s) de nucleótidos que codifican moléculas de anticuerpos humanos que muestran unión a antígeno dependiente del pH, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que codifica anticuerpos que muestran unión a antígeno dependiente del pH, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un repertorio limitado de segmentos génicos V<l>y J<l>humanos que reordenan y codifican anticuerpos que muestran unión a antígeno dependiente del pH; embriones, células y tejidos que comprenden los mismos; métodos para producir los mismos; así como métodos de uso de los mismos. Salvo que se defina de otro modo, todos los términos y frases utilizadas en el presente documento incluyen los significados que los términos y las frases han adquirido en la técnica, salvo que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se usa el término o frase.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende un dominio de región variable de cadena pesada y una<región constante de cadena pesada (Ch). La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch>1<, Ch>2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende un dominio de región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera (C<L>). Los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, de sus siglas en inglés). Cada dominio variable de cadena pesada y ligera comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, Fr 2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (las CDR de cadena pesada pueden abreviarse como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de cadena ligera pueden abreviarse como LCDR1, LCDR2 y LCDR3). La expresión "anticuerpo de alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una K<d>con respecto<a su epítopo diana de aproximadamente>10<-9 M o inferior (por ejemplo, aproximadamente>1<x>10<-9 M,>1<x>10<-10 M,>1<x>10<-11 M, o aproximadamente>1<x>10<-12 M). En un aspecto, Kd se mide mediante resonancia de plasmón de superficie,>por ejemplo, BIACORE™; en otro aspecto, Kd se mide mediante ELISA.

La frase "anticuerpo biespecífico" incluye un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a dos o más epítopos. Los anticuerpos biespecíficos generalmente comprenden dos cadenas pesadas no idénticas, y cada cadena pesada se une específicamente a un epítopo diferente en dos moléculas diferentes (por ejemplo, diferentes epítopos en dos inmunógenos diferentes) o en la misma molécula (por ejemplo, diferentes epítopos en el mismo inmunógeno). Si un anticuerpo biespecífico es capaz de unirse selectivamente a dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la afinidad de la primera cadena pesada por el primer epítopo generalmente será de al menos uno a dos o tres o cuatro o más órdenes de magnitud más baja que la afinidad de la primera cadena pesada para el segundo epítopo, y viceversa. Los epítopos específicamente unidos por el anticuerpo biespecífico pueden estar en la misma diana o en una diana diferente (por ejemplo, en la misma proteína o en otra diferente). Los anticuerpos biespecíficos ejemplares incluyen aquellos con una primera cadena pesada específica para un antígeno tumoral y una segunda cadena pesada específica para un marcador citotóxico, por ejemplo, u receptor Fc (p.ej., FcyRI, FcyRII, FcyRIII, etc.) o un marcador de linfocito T (p.ej., CD3, CD28, etc.). Además, el segundo dominio variable de cadena pesada puede sustituirse con un dominio variable de cadena pesada que tenga una especificidad deseada diferente. Por ejemplo, se puede emparejar un anticuerpo biespecífico con una primera cadena pesada específica para un antígeno tumoral y una segunda cadena pesada específica para una toxina para suministrar una toxina (por ejemplo, saporina, alcaloide de la vinca,etc.)a una célula tumoral. Otros anticuerpos biespecíficos ejemplares incluyen aquellos con una primera cadena pesada específica para un receptor activador (por ejemplo, receptor de linfocitos B, FcyRI, FcyRIIA, FcyRNIA, FcaRI, receptor de linfocitos T,etc.)y una segunda cadena pesada específica para un receptor inhibidor (por ejemplo, FcyRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a, etc.). Dichos anticuerpos biespecíficos pueden construirse para afecciones terapéuticas asociadas con la activación celular (por ejemplo, alergia y asma). Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, mediante la combinación de cadenas pesadas que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias variables de cadena pesada que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno pueden fusionarse con secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones constantes de la cadena pesada iguales o diferentes, y dichas secuencias pueden expresarse en una célula que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina. Un anticuerpo biespecífico típico tiene dos cadenas pesadas, cada una con tres CDR de cadena pesada, seguidas de un dominio Ch1 (N-terminal a C<terminal), una bisagra, un dominio Ch>2<y un dominio Ch3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que no confiere>especificidad de unión a epítopo pero que puede asociarse con cada cadena pesada, o que puede asociarse con cada cadena pesada y que puede unirse a uno o más de los epítopos unidos por las regiones de unión al epítopo de la cadena pesada, o que pueden asociarse con cada cadena pesada y permitir la unión de una o ambas cadenas pesadas a uno o ambos epítopos. De manera similar, la expresión "anticuerpo triespecífico" incluye un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a tres o más epítopos.

El término "célula" incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las de procariotas y eucariotas (de una sola célula o de múltiples células), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobacterias, células fúngicas, células de levadura (por ej., S.cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica,etc.), células vegetales,<células de insectos (por ejemplo, s F-9, SF->21<, células de insectos infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etc.),>células animales no humanas, células humanas o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunos aspectos, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En algunos aspectos, la célula es eucariota y se selecciona de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de la retina, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunos aspectos, la célula comprende uno o más genes virales, p. ej.<una célula retiniana que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C>6<™).>

La frase "región determinante de complementariedad", o el término "CDR," incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de unos genes de inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir, en un animal de tipo silvestre) aparece entre dos regiones marco en una región variable de una cadena ligera o pesada de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de linfocitos T). Una CDR puede codificarse mediante, por ejemplo, una secuencia de línea germinal o una secuencia reordenada o no reordenada, y, por ejemplo, por un linfocito B o un linfocito T natural o maduro. Una CDR puede estar mutada somáticamente (por ejemplo, variar de una secuencia codificada en la línea germinal de un animal), humanizada y/o modificada con sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden estar codificadas por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de la línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia de ácido nucleico no reordenada) pero son contiguas en una secuencia de ácido nucleico de linfocitos B, por ejemplo, como resultado de cortar y empalmar o conectar las secuencias (por ejemplo, recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

El término "conservativa", cuando se usa para describir una sustitución conservativa de aminoácido, incluye la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R de la cadena secundaria con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de una región variable para unirse específicamente a un epítopo diana con una afinidad deseada. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas laterales hidroxil alifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/arginina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunos aspectos, una sustitución de aminoácidos conservativa puede ser una sustitución de cualquier resto natural en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, mutagénesis por barrido de alanina. En algunos aspectos, se realiza una sustitución conservativa que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. En algunos aspectos, la sustitución es una sustitución moderadamente conservativa en la que la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

En algunos aspectos, las posiciones de los restos en una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina difieren en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos aspectos, las posiciones de los restos en una cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma (por ejemplo, un fragmento que permite la expresión y la secreción de, por ejemplo, por ejemplo, un linfocito B) no son idénticas a una cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos se enumera en el presente documento, pero difiere en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas.

La frase "proteína de unión a epítopo" incluye una proteína que tiene al menos una CDR y que es capaz de reconocer selectivamente un epítopo, por ejemplo, es capaz de unir un epítopo con una Kd que es aproximadamente un<micromolar o inferior (por ejemplo, una KD eso es alrededor de 1 x 10-6 M, 1 x 10>'7<M, 1 x 10>'9<M, 1 x 10>'9<M, 1 x 10'1° M, 1 x 10>'11<M, o aproximadamente 1 x 10>'12<M). Las proteínas de unión a epítopos terapéuticas (por ejemplo,>anticuerpos terapéuticos) con frecuencia requieren una K<d>que se encuentre en el intervalo nanomolar o picomolar.

La frase "fragmento funcional" incluye fragmentos de proteínas de unión a epítopo que pueden expresarse, secretarse y unirse específicamente a un epítopo con una K<d>en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar. El reconocimiento específico incluye tener una Kd que esté al menos en el intervalo micromolar, el intervalo nanomolar o el intervalo picomolar.

La expresión "línea germinal" en referencia a una secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina incluye una secuencia de ácido nucleico que puede pasarse a la progenie.

La expresión “cadena pesada”, o "cadena pesada de inmunoglobulina" incluye una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, de cualquier organismo. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres CDR de cadena pesada y cuatro regiones FR, a menos que se especifique otra cosa. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen c Dr , Cd R y FR y combinaciones de los mismos. Una cadena pesada típica tiene, siguiendo el dominio variable (de N-terminal a C-terminal), un dominio C<h>1, una bisagra, un dominio C<h>2 y un dominio C<h>3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer específicamente un epítopo (por ejemplo, reconocer el epítopo con una Kd en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar), que es capaz de expresarse y secretarse a partir de una célula, y que comprende al menos una CDR. Un dominio variable de cadena pesada está codificado por una secuencia génica de región variable, que generalmente comprende los segmentos Vh, Dh y Jh derivados de un repertorio de segmentos Vh, Dh y Jh presentes en la línea germinal. Las secuencias, localizaciones y nomenclatura para los segmentos de cadena pesada V, D y J para diversos organismos se pueden encontrar en la base de datos de IMGT, el sitio web del International Immunogenetics Information System.

El término "identidad" cuando se usa en relación con la secuencia, incluye la identidad determinada por una serie de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos. En algunos aspectos descritos en el presente documento, se determinan las identidades usando un alineamiento ClustalW v. 1.83 (lento) que emplea una penalización por apertura de hueco de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,1, y que utiliza una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). La longitud de las secuencias comparadas con respecto a la identidad de las secuencias dependerá de las secuencias concretas, pero en el caso de un dominio constante de cadena ligera, la longitud debe contener una secuencia de longitud suficiente para plegarse en un dominio constante de cadena ligera que sea capaz de asociarse consigo mismo para formar un dominio constante de cadena ligera canónico, por ejemplo, capaz de formar dos láminas beta que comprenden hebras beta y capaces de interactuar con al menos un dominio C<H>1 de un ser humano o un ratón. En el caso del dominio Ch1, la longitud de la secuencia debe contener una secuencia de longitud suficiente para<plegarse en un dominio Ch>1<que sea capaz de formar dos láminas beta que comprendan cadenas beta y que pueda>interactuar con al menos un dominio constante de cadena ligera de un ratón o un ser humano.

La frase "molécula de inmunoglobulina" incluye dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas pueden ser idénticas o diferentes, y las cadenas ligeras pueden ser idénticas o diferentes.

La frase "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo y, a menos que se especifique otra cosa, incluye cadenas ligeras kappa y lambda humanas y una VpreB, así como cadenas ligeras sustitutas. Los dominios variables de cadena ligera incluyen generalmente tres CDR de cadena pesada y cuatro) regiones (FR, a menos que se especifique otra cosa. Generalmente, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo, un dominio variable que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y una región constante de cadena ligera. Un dominio variable de cadena ligera está codificado por una secuencia génica de región variable de cadena ligera, que generalmente comprende segmentos Vl y Jl, derivados de un repertorio de segmentos V y J presentes en la línea germinal. Las secuencias, localizaciones y nomenclatura para los segmentos de cadena ligera V y J para diversos organismos se pueden encontrar en la base de datos de IMGT, www.imgt.org. Las cadenas ligeras incluyen aquellas, por ejemplo, que no se unen selectivamente a un primer o segundo epítopo unido selectivamente por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras también incluyen aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada a unirse y el reconocer, uno o más epítopos unidos de forma selectiva por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras comunes o universales incluyen aquellas derivadas de un gen V<k>1-39J<k>5 humano o un gen V<k>3-20J<k>1 humano, e incluyen versiones mutadas somáticamente (por ejemplo, maduradas por afinidad) de las mismas. Las cadenas ligeras duales (DLC) incluyen aquellas derivadas de un locus de cadena ligera que comprende no más de dos segmentos Vk humanos, por ejemplo, un segmento del gen Vk1-39 humano y un segmento del gen Vk3-20 humano, e incluyen versiones mutadas somáticamente (por ejemplo, maduración por afinidad) de las mismas.

La frase "intervalo micromolar" pretende significar 1-999 micromolar; la frase "intervalo micromolar" pretende significar 1-999 nanomolar; la frase "intervalo micromolar" pretende significar 1-999 picomolar.

La frase "mutado somáticamente" incluye una referencia a una secuencia de ácido nucleico de un linfocito B que ha sufrido un cambio de clase, en donde la secuencia de ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina (por ejemplo, secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable de cadena pesada o que incluye una CDR de cadena pesada o secuencia de FR) en el linfocito B con cambio de clase no es idéntica a la secuencia de ácido nucleico en el linfocito B antes del cambio de clase, tal como, por ejemplo, una diferencia en una secuencia de ácido nucleico de CDR o marco entre un linfocito B que no haya sufrido una cambio de clase y un linfocito B que haya sufrido un cambio de clase. "Mutada somáticamente" incluye una referencia a secuencias de ácidos nucleicos de linfocitos B madurados por afinidad que no son idénticas a las correspondientes secuencias de la región variable de inmunoglobulina en linfocitos B que no están madurados por afinidad (es decir, secuencias en el genoma de células de la línea germinal). La frase "mutada somáticamente" también incluye una referencia a una secuencia de ácido nucleico de la región variable de inmunoglobulina de un linfocito B después de la exposición del linfocito B a un epítopo de interés, en donde la secuencia de ácido nucleico difiere de la secuencia de ácido nucleico correspondiente antes de la exposición del linfocito B al epítopo de interés. La frase "mutada somáticamente" se refiere a secuencias de anticuerpos que se han generado en un animal, por ejemplo, un ratón que tiene secuencias de ácidos nucleicos de región variable de inmunoglobulina humana, en respuesta a una exposición a inmunógeno, y que resultan de los procesos de selección inherentemente operativos en tal un animal.

El término "no reordenada", con respecto a secuencias de ácidos nucleicos, incluye secuencias de ácidos nucleicos que existen en la línea germinal de una célula animal.

La frase "dominio variable" incluye una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (modificada según se desee) que comprende las siguientes regiones de aminoácidos, en secuencia de N-terminal a C-terminal (a menos que se indique lo contrario): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

La expresión "unido operativamente" se refiere a una relación en la que los componentes operativamente unidos funcionan de la manera deseada. En un caso, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína puede unirse operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia silenciadora, etc.) con el fin de conservar la regulación de la transcripción adecuada. En un caso, una secuencia de ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina (o segmentos V (D) J) puede unirse operativamente a una secuencia de ácido nucleico de una región constante de inmunoglobulina para permitir la recombinación adecuada entre las secuencias en una secuencia de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina.

El término "reemplazo", en referencia al reemplazo de genes se refiere a colocar material genético exógeno en un locus genético endógeno, reemplazando por tanto la totalidad o una porción del gen endógeno con una secuencia de ácido nucleico ortóloga u homóloga.

"Funcional" como se usa en el presente documento, por ejemplo, en referencia a un polipéptido funcional, incluye un polipéptido que conserva al menos una actividad biológica normalmente asociada con la proteína natural. En otro caso, un segmento génico de inmunoglobulina funcional puede incluir un segmento génico variable que es capaz de un reordenamiento productivo para generar una secuencia génica de inmunoglobulina reordenada.

"pH neutro" incluye un pH entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0, por ejemplo, pH entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,4, por ejemplo, entre aproximadamente 7,2 y aproximadamente 7,4, por ejemplo, pH fisiológico. "pH ácido" incluye un pH de 6,0 o inferior, por ejemplo, pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0, pH entre aproximadamente 5,75 y aproximadamente 6,0, por ejemplo, pH de los compartimentos endosómico o lisosómico.

Restos de Histidina Diseñados en Genes de Cadenas Ligeras de Inmunoglobulinas

Los inventores han descubierto que los animales no humanos que expresan anticuerpos que son capaces de unirse a un antígeno de una manera dependiente del pH se pueden producir mediante modificaciones de una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina en una o más posiciones a lo largo de la secuencia de la cadena ligera. Se describen métodos para realizar modificaciones en la línea germinal de un animal no humano para que el animal exprese histidinas en las CDR de anticuerpos. En particular, se describen métodos para realizar modificaciones en una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina en la línea germinal de ratones. La secuencia de la región variable, por ejemplo, de cadenas ligeras, por lo general, muestran una hipermutación somática a lo largo de la secuencia de la región variable y, en algunos casos, tales mutaciones pueden dar como resultado una sustitución de restos de histidina (véase, por ejemplo, la FIG. 1). Dichas mutaciones pueden ocurrir incluso en regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que son las regiones de dominios variables responsables de la unión a antígeno. En algunos casos, tales mutaciones pueden dar como resultado anticuerpos que presentan una unión a antígeno dependiente del pH, por ejemplo, una unión reducida al antígeno a un pH ácido en comparación con la unión a antígeno a un pH neutro. Dicha unión a antígeno dependiente del pH se desea porque puede permitir que el anticuerpo se una al antígeno fuera de la célula y, cuando se internaliza en un endosoma, libera el antígeno y lo recicla de nuevo a la superficie para unirse a otro antígeno, evitando el aclaramiento mediado por la diana. Se han informado enfoques para introducir restos de histidina para lograr este efecto mediante el uso de una mutagénesis de barrido de hisaleatoria<para diseñar propiedades de unión dependientes del pH en anticuerpos anti-IL->6<R (US 2011/0111406 A1). Sin>embargo, la mutagénesis aleatoria de los restos de anticuerpos puede dar como resultado una disminución de la afinidad del anticuerpo al antígeno. Un animal no humano genéticamente modificado para expresar una sustitución de histidina en la secuencia del anticuerpo permite la generación de anticuerpos de alta afinidad en respuesta a un antígeno de interés que, debido a la(s) modificación(es) con histidina, también presentaría la unión del antígeno dependiente del pH.

Por tanto, en varios aspectos, en el presente documento se describe un animal no humano modificado genéticamente (por ejemplo, roedor, por ejemplo, un ratón o una rata) que comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana que comprende modificaciones que dan como resultado que el animal exprese anticuerpos capaces de unirse a antígenos de una manera dependiente del pH. En un aspecto, el animal no humano comprende modificaciones en la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana (por ejemplo, la secuencia del segmento V<l>y/o J<l>) que comprende sustituciones en al menos un codón de no histidina (por ejemplo, al menos un codón de no histidina codificado por la secuencia del segmento V<l>y/o J<l>de la línea germinal humana correspondiente) con un codón de histidina (en algunos casos, también puede denominarse "sustitución de histidina" "sustitución de codón de histidina", o similares). En un aspecto, el animal comprende una modificación de la línea germinal que permite las sustituciones de histidina en CDR1, CDR2, CDR3, N terminal, bucle 4 e incluso regiones marco de la cadena ligera para aumentar el rendimiento de los anticuerpos dependientes del pH. En un aspecto, el animal comprende al menos una sustitución de un codón de no histidina (por ejemplo, al menos un codón de no histidina codificado por la secuencia del segmento V<l>y/o J<l>de la línea germinal humana correspondiente) con un codón de histidina en una secuencia de nucleótidos de una región determinante de la complementariedad (CDR; por ejemplo, CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una cadena ligera de inmunoglobulina humana. En un aspecto, la sustitución es en un codón de CDR3. En un aspecto, la cadena ligera es una cadena ligera k. En un aspecto, el animal expresa una cadena ligera de inmunoglobulina, por ejemplo, una CDR de cadena ligera, por ejemplo, una CDR3 de cadena ligera, que comprende una sustitución de la menos un aminoácido con una histidina. En otro aspecto, la cadena ligera es una cadena ligera A. En otro aspecto más, el ratón comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina en ambas cadenas k y A.

El resto de histidina está codificado por dos codones diferentes, CAT y CAC (restos de ácido desoxirribonucleico). Por tanto, un codón de no histidina puede estar sustituido con un CAT o un CAC. La sustitución se diseña en un codón que en su configuración de línea germinal (es decir, en estado mutado no somático) no codifica un resto de histidina. Por tanto, la secuencia de nucleótidos comprende al menos un codón de histidina que no está codificado por un segmento génico variable de la cadena ligera de la línea germinal humana correspondiente (por ejemplo, el segmento génico Vl y/o Jl de la línea germinal humana correspondiente).

En diversos aspectos, las modificaciones con histidina en la secuencia de la cadena ligera del animal no humano modificado genéticamente pueden diseñarse de varias maneras. En algunos aspectos, las sustituciones de histidina pueden limitarse a aquellas posiciones que requieren un solo cambio de nucleótido. En algunos aspectos, las modificaciones con histidina se pueden hacer en secuencias artificiales (por ejemplo, segmentos de D<h>artificiales, adiciones de N de anticuerpos identificados, etc.) y estas secuencias artificiales se pueden insertar en la secuencia de la cadena ligera.

En un aspecto, una cadena ligera es una cadena ligera universal (también denominada cadena ligera común). Tal como se describe en las Solicitudes de Patente de EE. UU. Números 13/022.759, 13/093.156, 13/412.936, 13/488.628 y 13/798.310 (publicaciones de solicitud de EE. UU. Números 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0045492, y 2013/0185821), un animal no humano (por ejemplo, un ratón) que selecciona una cadena ligera común para una pluralidad de cadenas pesadas tiene una utilidad práctica. En diversos aspectos, los anticuerpos expresados en un animal no humano que comprende solo una cadena ligera común tendrán cadenas pesadas que pueden asociarse y expresarse con una cadena ligera idéntica o sustancialmente idéntica. Esto es particularmente útil en la producción de anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, un animal de este tipo puede inmunizarse con un primer inmunógeno para generar un linfocito B que expresa un anticuerpo que se une específicamente a un primer epítopo. El animal (o un animal genéticamente igual) se puede inmunizar con un segundo inmunógeno para generar un linfocito B que expresa un anticuerpo que se une específicamente al segundo epítopo. Las regiones de cadena pesada variables pueden clonarse a partir de linfocitos B y expresarse con la misma región constante de cadena pesada y la misma cadena ligera (por ejemplo, una cadena ligera común) en una célula para producir un anticuerpo biespecífico, en donde el componente de cadena pesada del anticuerpo biespecífico ha sido seleccionado mediante un animal para asociarse y expresarse con el mismo componente de la cadena ligera. En varios aspectos descritos, las regiones variables de los ratones modificados por ingeniería genética son regiones variables humanas.

En otro aspecto, una cadena ligera deriva de un repertorio de segmentos variables de cadena ligera restringido (limitado), por ejemplo, repertorio de segmentos variables de cadena ligera que comprende no más de dos segmentos génicos V<L>humanos (por ejemplo, una cadena ligera doble o "DLC"). Como se describe con más detalle en la Solicitud de Patente de EE. Uu . N.° 13/798.455, publicada como Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2013/0198880, tal repertorio de segmentos variables de cadena ligera limitado da como resultado la generación de un repertorio de cadenas ligeras limitado que también ayuda en la generación de componentes de anticuerpos útiles para producir anticuerpos biespecíficos u otros anticuerpos multiespecíficos.

En algunos aspectos, el ratón de cadena ligera doble puede mostrar un repertorio de cadenas ligeras más diverso. En algunos aspectos, el ratón de cadena ligera doble permite un mayor rendimiento de anticuerpos de unión y limita la diversidad, al mismo tiempo que aumenta el emparejamiento exitoso con cadenas pesadas generadas en un ratón que comprende una única región variable de cadena ligera reordenada, por ejemplo, un ratón con cadena ligera universal. En algunos aspectos, las cadenas ligeras pueden mostrar propiedades de unión a antígeno. En algunos aspectos, se puede inducir al ratón a producir anticuerpos que muestran especificidad de antígeno que reside en su cadena ligera (por ejemplo, limitando el repertorio de cadenas pesadas de inmunoglobulina del ratón, por ejemplo, reemplazando el locus de la cadena pesada del ratón con un locus que comprende una única región variable de cadena pesada reordenada). En algunos aspectos, los anticuerpos producidos en dichos animales serán específicos para un primer epítopo particular (por ejemplo, antígenos efectores, moléculas citotóxicas, receptores Fc, toxinas, receptores activadores o inhibidores, marcadores de linfocitos T, transportadores de inmunoglobulinas, etc.) a través de su unión a la cadena ligera. Dichas cadenas ligeras humanas específicas de epítopo derivadas de ratones con cadena ligera doble pueden expresarse conjuntamente con cadenas pesadas humanas derivadas de un ratón con un repertorio de cadenas ligeras limitado, por ejemplo, un ratón ULC, en donde la cadena pesada se selecciona en función de su capacidad para unir un segundo epítopo (por ejemplo, un segundo epítopo sobre un antígeno diferente).

Por tanto, previamente se diseñaron ratones que son capaces de generar cadenas ligeras de inmunoglobulina que se emparejarán adecuadamente con una familia bastante diversa de cadenas pesadas, incluidas las cadenas pesadas cuyas regiones variables humanas se separan de las secuencias de la línea germinal, por ejemplo, las regiones variables maduradas por afinidad o mutadas somáticamente. En diversos aspectos, los ratones están ideados para emparejar dominios variables de cadena ligera humana con dominios variables de cadena pesada humana que comprenden mutaciones somáticas, permitiendo así una ruta a proteínas de unión de alta afinidad adecuadas para su uso como agentes terapéuticos humanos.

El ratón modificado por ingeniería genética, a través del largo y complejo proceso de selección de anticuerpos dentro de un organismo, toma decisiones biológicamente apropiadas al emparejar una colección diversa de dominios variables de cadena pesada humana con un número limitado de opciones de cadena ligera humana. Con el fin de lograr esto, el ratón está diseñado para presentar un número limitado de opciones de dominio variable de cadena ligera humana junto con una amplia variedad de opciones de dominio variable de cadena pesada humana. Al exponerle con un inmunógeno, el ratón maximiza el número de soluciones en su repertorio para desarrollar un anticuerpo para el inmunógeno, limitado en gran parte o únicamente por el número o las opciones de cadena ligera en su repertorio. En diversos aspectos, esto incluye permitir que el ratón logre mutaciones somáticas adecuadas y compatibles del dominio variable de la cadena ligera que, sin embargo, serán compatibles con una variedad relativamente grande de dominios variables de la cadena pesada humana, incluidos en particular dominios variables de la cadena pesada humana mutados somáticamente.

Los ratones de repertorio de cadenas ligeras comunes o cadenas ligeras limitadas de diseñados descritos en las publicaciones de solicitud de EE. UU. Números 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0045492, 2013/0185821 y 2013/0198880 comprendían secuencias de ácidos nucleicos que codificaban un repertorio limitado opciones de cadena ligera, por ejemplo, cadena ligera común o universal "ULC" que comprendía una única secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada, por ejemplo, una cadena ligera que comprendía no más de dos segmentos Vl humanos, por ejemplo, una cadena ligera doble "DLC" que comprendía dos segmentos Vl humanos. Para lograr tal repertorio limitado, los ratones se diseñaron para hacer no funcional o sustancialmente no funcional su capacidad para producir, o reordenar, un dominio variable de cadena ligera de ratón natural. En un aspecto, esto se logró, por ejemplo, eliminando los segmentos génicos de la región variable de cadena ligera del ratón. Como se ha descrito anteriormente, el locus del ratón endógeno puede modificarse después mediante segmentos génicos de la región variable de la cadena ligera humana exógenos adecuados, operativamente unidos al dominio constante de la cadena ligera del ratón endógeno, de manera tal que los segmentos génicos de la región variable humana exógenos se puedan combinar con el gen de la región constante de la cadena ligera de ratón exógeno y formar un gen de cadena ligera quimérico inverso reordenado (variable humana, constante de ratón). En diversos aspectos, la región variable de la cadena ligera es capaz de ser mutada somáticamente. En diversos aspectos, para maximizar la capacidad de la región variable de la cadena ligera para adquirir mutaciones somáticas, se conservan en el ratón los potenciadores apropiados. En un aspecto, al modificar un locus de cadena ligera k de ratón para reemplazar segmentos génicos de cadena ligera k de ratón endógenos con segmentos génicos de cadena ligera k humana, el potenciador intrónico k de ratón y el potenciador 3' k de ratón se mantienen, o no se interrumpen funcionalmente.

Por tanto, se describió un ratón modificado por ingeniería genética que expresa un repertorio limitado de cadenas ligeras quiméricas inversas (variable humana, constante de ratón) asociadas con una diversidad de cadenas pesadas quiméricas inversas (variable humana, constante de ratón). En diversos aspectos, los segmentos del gen de la cadena ligera k de ratón endógenos se eliminan y se reemplazan con una sola (o dos) región o regiones de la cadena ligera humana reordenada, unida operativamente al gen C<k>de ratón endógeno. En diversos aspectos, los segmentos génicos de la cadena ligera k del ratón endógenos se eliminan y se reemplazan con un solo segmento Vl humano que es capaz de reordenarse con un segmento J de la cadena ligera humana (seleccionado de uno o varios segmentos J<l>) y codifica un dominio variable humano de una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde el V<l>único y uno o una pluralidad de segmentos J<l>están operativamente unidos al gen C<k>de ratón endógeno. En otros aspectos diversos, los segmentos génicos de la cadena ligera k de ratón endógenos se eliminan y se reemplazan con no más de dos segmentos Vl humanos que son capaces o se reordenan con un segmento J de la cadena ligera humana (seleccionado de uno o varios segmentos J<l>, por ejemplo, dos o más segmentos J<l>) y codifican un dominio variable humano de una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde los no más de dos segmentos génicos Vl y uno o una pluralidad de segmentos J<l>están operativamente unidos al gen C<k>de ratón endógeno. En otros aspectos, los segmentos del gen de la cadena ligera kappa (por ejemplo, los segmentos de los genes Vl y Jl humanos) están operativamente unidos al gen C<k>humano. En aspectos para maximizar la hipermutación somática de la región de la cadena ligera humana reordenada, se mantienen el potenciador intrónico k de ratón y el potenciador 3' k de ratón. En diversos aspectos, el ratón también comprende un locus de cadena ligera A no funcional, o una eliminación del mismo o una eliminación que hace que el locus sea incapaz de formar una cadena ligera A. En algunos aspectos específicos, el locus de los ratones modificado por ingeniería genéticas con repertorios de cadenas ligeras restringidos es sustancialmente idéntico a los loci representados en las FIGs. 16A y 16B.

En ratones modificados genéticamente que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican un repertorio limitado de opciones de cadena ligera, por ejemplo, ratones ULC que comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única, por ejemplo, una cadena ligera que comprende no más de dos segmentos Vl humanos, por ejemplo, ratones DLC que comprenden dos segmentos Vl humanos, el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina difiere del locus de la cadena ligera de inmunoglobulina de tipo silvestre.

En algunos aspectos, la estructura del locus de la cadena ligera del ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un repertorio limitado de opciones de cadena ligera (por ejemplo, un ratón ULC, por ejemplo, un ratón DLC) es diferente del de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que al menos uno, y en algunos aspectos todos, los segmentos génicos Vl de ratón están reemplazados por un segmento génico Vl humano o no más de dos segmentos génicos V<l>humanos. En algunos aspectos, un único segmento génico V<l>humano está presente en la línea germinal reordenada en un segmento génico J<l>humano. En algunos aspectos, los segmentos génicos V<l>humanos de un ratón son capaces de reordenarse en uno de dos o más segmentos génicos J<l>humanos para codificar un dominio Vl de inmunoglobulina de un anticuerpo. En algunos aspectos, el (los) segmento(s) génico(s) Vl humano(s) de un locus de cadena ligera de un ratón como se describe en el presente documento está/están unido(s) operativamente a dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) segmentos génicos J<L>humanos.

En algunos aspectos, la estructura del locus de la cadena ligera del ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un repertorio limitado de opciones de cadena ligera (por ejemplo, un ratón ULC, por ejemplo, un ratón DLC) es diferente de la de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que no contiene una secuencia de nucleótidos antes del reordenamiento que codifica un segmento génico V<l>endógeno. En algunos aspectos, la estructura del locus de la cadena ligera de dicho ratón es diferente de la de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que no contiene una secuencia de nucleótidos antes del reordenamiento que codifica un segmento génico Jl endógeno. En algunos aspectos, la estructura del locus de la cadena ligera de dicho ratón es diferente de la de la estructura de referencia de la FIG. 15 en el sentido de que no contiene una secuencia de nucleótidos antes del reordenamiento que codifica los segmentos de los genes V<L>y J<L>endógenos.

En algunos aspectos, la estructura del locus de la cadena ligera del ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un repertorio limitado de opciones de cadena ligera (por ejemplo, un ratón ULC, por ejemplo, un ratón DLC) es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que no contiene una secuencia de nucleótidos después del reordenamiento que codifica un segmento génico Vl endógeno. En algunos aspectos, la estructura del locus de la cadena ligera de dicho ratón es diferente del de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que no contiene una secuencia de nucleótidos después del reordenamiento que codifica un segmento génico J<l>endógeno. En algunos aspectos, la estructura del locus de la cadena ligera de dicho ratón es diferente de la de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que no contiene una secuencia de nucleótidos después del reordenamiento que codifica los segmentos de los genes V<L>y J<L>endógenos.

En algunos aspectos, la estructura del locus de la cadena ligera del ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un repertorio limitado de opciones de cadena ligera (por ejemplo, un ratón ULC, por ejemplo, un ratón DLC) es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que contiene no más de dos segmentos génicos V<l>humanos endógenos y uno o más, por ejemplo, dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco ) segmentos génicos Jl humanos antes del reordenamiento. En algunos aspectos, el locus de la cadena ligera de dicho un ratón es diferente del de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que contiene no más de dos segmentos génicos V<l>humanos y cinco segmentos génicos Jl humanos antes del reordenamiento.

En algunos aspectos, la estructura del locus de la cadena ligera del ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un repertorio limitado de opciones de cadena ligera (por ejemplo, un ratón ULC, por ejemplo, un ratón DLC) es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que contiene no más de dos segmentos génicos V<l>humanos endógenos y cinco o menos (por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1) segmentos génicos J<l>humanos después del reordenamiento. En algunos aspectos, el locus de la cadena ligera de dicho un ratón es diferente del de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que contiene no más de dos segmentos génicos V<l>humanos y uno, dos, tres, cuatro o cinco segmentos génicos J<l>humanos después del reordenamiento. En un aspecto, la estructura del locus de la cadena ligera del ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un repertorio limitado de opciones de cadena ligera (por ejemplo, un ratón ULC, por ejemplo, un ratón DLC) es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que contiene un Vl humano y cinco o menos (por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1) segmentos génicos Jl humanos después del reordenamiento.

En diversos aspectos, los segmentos de los genes V<L>y J<L>humanos son segmentos génicos Vk y Jk humanos. En diversos aspectos, los segmentos V<k>humanos se seleccionan de un segmento del gen V<k>1-39 humano y un segmento del gen Vk3-20 humano. En algunos aspectos, los segmentos Vk humanos son Vk1-39 humano y Vk3-20 humano. En algunos aspectos, los segmentos Jk humanos se seleccionan de un segmento de gen Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5, y una combinación de los mismos. En algunos aspectos, los segmentos génicos Jk humanos son Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5 humanos.

En algunos aspectos, la estructura del locus de la cadena ligera del ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un repertorio limitado de opciones de cadena ligera (por ejemplo, un ratón ULC, por ejemplo, un ratón DLC) es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 15 en que contiene una estructura que es sustancialmente la misma que la estructura de las Figuras 16A y 16B antes del reordenamiento (por ejemplo, las<estructuras en las FIGS.>8<C,>8<E, 14C, 14D, 17E, 19D, 31 y 33). En algunos aspectos, se describe un ratón, que>comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es idéntica a la estructura de la FIG. 16A y 16B antes del reordenamiento.

Los ratones que contienen loci de inmunoglobulinas humanas, regiones variables y constantes insertadas aleatoriamente en el genoma del ratón, son conocidos en la técnica. Las cepas iniciales de tales ratones contenían un número limitado de segmentos génicos de inmunoglobulinas humanas. Específicamente, un puñado de cepas que contienen segmentos del gen de la cadena ligera de inmunoglobulina humana contenían uno, tres o cuatro segmentos génicos Vl de inmunoglobulina humana y cinco segmentos génicos Jl de inmunoglobulina humana (Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Research 20(23): 6287-6295; Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851; Lonberg et al.

1994, Nature 368: 856-859; Green et al. 1994, Nature Genetics 7:13-21; Green y Jakobovits 1998, J. Exp. Med. 188(3): 483-495; Green 1999, J. Immunol. Methods 231: 11-23). Estos ratones que contenían solo unos pocos segmentos génicos V<l>de inmunoglobulina humana como parte de transgenes completamente humanos insertados al azar en el genoma del ratón demostraron un número comprometido de linfocitos B, un desarrollo deficiente de linfocitos B y otras deficiencias inmunitarias. La expresión de los genes de la región variable de inmunoglobulinas humanas, según se detectó por la expresión en la superficie de Ck humano en los linfocitos B, fue menor que la cadena ligera k endógena en comparación con la de tipo silvestre. Sorprendentemente, ratones con repertorio limitado de opciones de cadena ligera, como ratones diseñados para contener en los loci de cadena ligera k de inmunoglobulinas endógenas uno o dos segmentos génicos V<k>de inmunoglobulina humana, presentan números de linfocitos B y desarrollo que fue casi de tipo silvestre (véase, p.ej., la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Número 2013/0198880 y ejemplos actuales. Además, en algunos aspectos, estos ratones pueden generar varios anticuerpos quiméricos inversos de alta afinidad que contienen dominios de cadena ligera y pesada variables humanos en respuesta al antígeno, en donde cada uno de los dominios de cadena ligera variable contiene uno de dos posibles segmentos génicos V<l>humanos y uno de cinco posibles segmentos génicos J<l>humanos (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. Número 2013/0198880, y ejemplos actuales). Así, a diferencia de las cepas preliminares de ratones diseñados con miniloci de cadena ligera de inmunoglobulina humana (es decir, un número limitado de segmentos del gen de inmunoglobulinas humanas), ratones que contienen un número limitado de segmentos génicos V<l>de inmunoglobulina humana (uno o dos) y, en algunos aspectos, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5) segmentos génicos J<l>de inmunoglobulina humana, sorprendentemente muestran números de linfocitos B normales, expresión de cadena ligera de inmunoglobulina normal y desarrollo de linfocitos B normal. Además, dichos ratones tampoco muestran una capacidad reducida o deteriorada para montar respuestas inmunitarias fuertes a múltiples antígenos como resultado de un repertorio limitado de cadenas ligeras de inmunoglobulinas. Por consiguiente, en algunos aspectos, ratones que comprenden un locus de cadena ligera variable humanizada que comprende no más de dos segmentos génicos Vl de inmunoglobulina humana no reordenados y dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos génicos Jl de inmunoglobulina humana, o no más de dos segmentos VlJl humanos reordenados muestran poblaciones de linfocitos B de tipo silvestre en número y muestran un desarrollo de linfocitos B de tipo silvestre.

Los anticuerpos generados en los ratones de cadena ligera universal o ratones con repertorio de cadenas ligeras limitado (p. ej., Ratones de cadena ligera doble) en respuesta a diversos antígenos son capaces de utilizar un repertorio diverso de secuencias de región variable de cadena pesada, que comprenden un repertorio diverso de segmentos Vh, Dh y Jh. Los anticuerpos generados en tales ratones modificado por ingeniería genéticas son útiles para diseñar anticuerpos terapéuticos biespecíficos; sin embargo, como con cualquier otro anticuerpo, cada anticuerpo biespecífico solo puede unirse a una diana durante su vida en el plasma; el anticuerpo se internaliza en un endosoma y se dirige a degradación por lisosomas. Los estudios han demostrado que el receptor Fcy tipo MHC de clase I, FcRn, es capaz de rescatar las inmunoglobulinas de la degradación lisosómica al reciclarlas de nuevo en la superficie celular del endosoma de clasificación. Simister y Mostov (1989) An Fc receptor structurally related to MHC class I antigens. Nature 337: 184-87. Tal y como se ha explicado anteriormente, para mejorar la eficacia del reciclaje de anticuerpos, las modificaciones adicionales a las secuencias de anticuerpos, por ejemplo, las modificaciones que dan como resultado una unión a antígeno disminuida a pH ácido (por ejemplo, el pH del endosoma), al tiempo que conservan la afinidad y especificidad del anticuerpo-antígeno a pH neutro (por ejemplo, pH fisiológico) son beneficiosas. Los animales no humanos descritos en el presente documento, en los que los restos de histidina se sustituyen por restos de no histidina en la secuencia de la cadena ligera son beneficiosos porque son capaces de producir anticuerpos de alta afinidad basados en formato de repertorio de cadena ligera universal o cadena restringida (por ejemplo, DLC) que también presenta unión dependiente del pH, por ejemplo, presenta una unión reducida al antígeno a pH ácido frente a neutro. Por tanto, en un aspecto, en el presente documento se describe un animal no humano ( por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata) que comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, un repertorio limitado de regiones variables de cadena ligera humana, o una región variable de cadena ligera humana única, de un repertorio limitado de segmentos génicos variables de cadena ligera humana, en donde la región o regiones variables de la cadena ligera humana comprenden al menos una sustitución de un codón de no histidina por un codón de histidina. En algunos aspectos, los animales no humanos descritos están modificados por ingeniería genética para incluir un solo segmento génico de la región variable de cadena ligera humana no reordenada (o dos segmentos génicos de la región variable de cadena ligera humana) que se reordena para formar un gen de la región variable de cadena ligera humana reordenada (o dos genes de la región variable de cadena ligera reordenada genes de la región) que expresan una única cadena ligera (o que expresan una o ambas cadenas ligeras), en donde el o los genes de la región variable de cadena ligera comprenden una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. Los dominios variables de cadena ligera humana reordenados codificados por estos genes de región variable de cadena ligera sustituidos con histidina son capaces de emparejarse con una pluralidad de cadenas pesadas humanas maduradas por afinidad seleccionadas por los animales, en donde las regiones variables de cadena pesada se unen específicamente a diferentes epítopos. En diversos aspectos, la al menos una sustitución de un resto de no histidina con un resto de histidina da como resultado una cadena ligera humana reordenada que, cuando se expresa con una cadena pesada afín, se une a su antígeno en una forma dependiente del pH.

Se describen animales modificados genéticamente que expresan un repertorio limitado de dominios variables de cadena ligera humana, o un único dominio variable de cadena ligera humana, de un repertorio limitado de secuencias de genes de región variable de cadena ligera humana, en donde las secuencias de genes de región variable comprenden al menos una sustitución de un codón de no histidina con un codón de histidina. En algunos aspectos, los animales descritos se obtienen por ingeniería genética para incluir una única secuencia de cadena ligera humana V/J (o dos secuencias V/J) que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y expresa una región variable de una sola cadena ligera (o que expresa una o las dos regiones variables). En un aspecto, una cadena ligera que comprende la secuencia variable es capaz de emparejarse con una pluralidad de cadenas pesadas humanas maduradas por afinidad seleccionadas de manera clonal por el animal, en donde las regiones variables de cadena pesada se unen específicamente a diferentes epítopos. En un aspecto, el anticuerpo se une a su(s) antígeno(s) en una forma dependiente del pH. En un aspecto, la secuencia de la cadena ligera humana V/J única se selecciona de Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1. En un aspecto, las dos secuencias V/J son Vk1-39Jk5 y Vk3-20J<k>1. En un aspecto, las secuencias V<k>1-39J<k>5 y V<k>3-20J<k>1 son secuencias V/J reordenadas.

En un aspecto, se describe un animal no humano genéticamente modificado que comprende un único segmento génico V<l>de cadena ligera de inmunoglobulina humana que es capaz de reordenarse con un segmento génico J<l>humano (seleccionado de uno o una pluralidad de segmentos Jl) y codificar un dominio variable humano de un cadena ligera de inmunoglobulina, en donde el segmento génico V<l>de la cadena ligera de inmunoglobulina humana y/o el segmento génico Jl humano comprenden una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina (por ejemplo, la sustitución de al menos un codón de no histidina codificado por el correspondiente segmento de los genes Vl y/o Jl de la línea germinal humana con una histidina). En otro aspecto, se describe un ratón modificado genéticamente que comprende no más de dos segmentos génicos Vl humanos, cada uno de los cuales es capaz de reordenarse con un segmento génico J<l>humano (seleccionado de uno o una pluralidad de segmentos J<l>) y que codifica un dominio variable humano de una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde cada uno de los no más de dos segmentos génicos V<l>y/o el segmento génico J<l>comprenden una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina (por ejemplo, la sustitución de al menos un codón de no histidina codificado por el correspondiente segmento de los genes Vl y/o Jl de la línea germinal humana con una histidina). En algunos aspectos determinados, se seleccionan no más de dos segmentos génicos V<l>humanos del grupo que consiste en un segmento del gen Vk1-39 humano, un segmento del gen Vk3-20 humano y una combinación de los mismos. En algunos aspectos determinados, los no más de dos segmentos génicos V<l>humanos son un segmento del gen V<k>1-39 humano y un segmento del gene Vk3-20 humano.

En un aspecto, se describe un ratón modificado genéticamente que comprende una única región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana reordenadas (V/J) (es decir, una región Vl/Jl) que codifica un dominio variable humano de una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde la única región variable reordenada comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. En otro aspecto, el ratón comprende no más de dos regiones variables humanas reordenadas que son capaces de codificar un dominio variable humano de una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde cada una de las no más de dos regiones variables reordenadas comprende una sustitución de al menos un codón de histidina.

Por tanto, en el presente documento se describe un animal no humano modificado genéticamente que comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, una secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias V<l>y J<l>humanas en donde la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina (p. ej., sustitución de al menos un codón de no histidina codificado por el segmento génico V<l>y/o J<l>de la línea germinal humana con una histidina). En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de secuencias de genes Vl y Jl de la línea germinal humana, pero para las sustituciones de histidina. En un aspecto, la cadena ligera de inmunoglobulina humana es una cadena k de inmunoglobulina humana. Por tanto, en un aspecto, los segmentos génicos Vl humanos se seleccionan de V<k>1-39 y V<k>3-20. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada comprende la secuencia Vk1-39/J o Vk3-20/J reordenada. En un aspecto, la secuencia del gen Jl humano se selecciona de Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5. En un aspecto, la secuencia Jl humana se selecciona de Jk1 y Jk5. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única se selecciona de V<k>1-39J<k>5 y V<k>3-20J<k>1 (por ejemplo, pero para las sustituciones de histidina). En un aspecto alternativo, la cadena ligera de inmunoglobulina humana es una cadena A humana.

Asimismo, en un aspecto, en el presente documento se describe un animal no humano modificado genéticamente que comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, un repertorio limitado, por ejemplo, no más de dos, segmentos génicos V<l>humanos reordenados y uno o más, por ejemplo, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5), segmentos génicos J<l>humanos no reordenados en donde cada segmento génico V<l>humano reordenado y/o J<l>humano comprende la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina, por ejemplo, al menos un codón de no histidina presente en la secuencia de la línea germinal por un codón de histidina. En otro aspecto, en el presente documento se describe un animal no humano modificado genéticamente que comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, un repertorio limitado, por ejemplo, no más de dos, segmentos génicos Vl humanos reordenados y uno o más, por ejemplo, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5), segmentos génicos Jl humanos no reordenados en los que cada Vl humano no reordenado y, opcionalmente, la secuenciaA del gen Jl humano), comprende la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina, por ejemplo, al menos un codón de no histidina presente en la secuencia de la línea germinal humana correspondiente por un codón de histidina. Por tanto, en un aspecto, la secuencia de segmento génico variable en la línea germinal de un animal es una secuencia génica Vl y/o Jl de línea germinal humana, pero para las sustituciones de histidina. Las sustituciones de histidina se colocan de manera tal que, en el reordenamiento, la secuencia de la cadena ligera reordenada se diseña para contener una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. En un aspecto, la cadena ligera de inmunoglobulina humana es una cadena k de inmunoglobulina humana. Por tanto, en un aspecto, los segmentos génicos Vl humanos se seleccionan de Vk1-39 y Vk3-20. Por tanto, en un aspecto, el animal no humano genéticamente modificado comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, unos segmentos génicos V<k>1-39 humano no reordenados y del gen V<k>3-20 humano no reordenados y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos no reordenados (p.ej., los segmentos génicos Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y/o Jk5), en donde los segmentos de los genes Vk1-39 y Vk3-20 son capaces de reordenarse con dichos segmentos Jl humanos, y en donde cada una de las secuencias de segmentos génicos de región variable presentes en la línea germinal comprenden una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, por ejemplo, al menos un codón de no histidina presente en la secuencia de la línea germinal con un codón de histidina. En otro aspecto, el animal no humano genéticamente modificado comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, unos segmentos génicos V<k>1-39 humano no reordenados y del gen V<k>3-20 humano no reordenados y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos J<l>humanos no reordenados (p.ej., los segmentos génicos J<k>1, J<k>2, J<k>3, J<k>4 y/o JK5), en donde los segmentos de los genes Vk1-39 y Vk3-20 son capaces de reorganizarse con dichos segmentos Jl humanos, y en donde cada uno de los segmentos de los genes Vk1-39 y Vk3-20 comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y, opcionalmente, los segmentos J<l>también pueden comprender sustituciones de histidina. En un aspecto, el animal no humano modificado genéticamente comprende los segmentos génicos Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5. Por tanto, en un aspecto, las secuencias Vl y, opcionalmente, Jl en el locus de la cadena ligera k son esencialmente secuencias de la línea germinal, pero para las sustituciones de histidina.

En un aspecto, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina está en la secuencia de nucleótidos que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR) del dominio variable de cadena ligera. En un aspecto, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina está en la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1, CDR2 o CDR3 del dominio variable de cadena ligera. En un aspecto específico, la sustitución está en la secuencia de nucleótidos que codifica CDR3.

En un aspecto, la sustitución es de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina en el codón de CDR3 de la secuencia del gen de la región variable de la cadena ligera humana. En un aspecto, la sustitución es de uno, dos, tres, cuatro o más codones de CDR3. En el aspecto en donde el animal no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que es una región variable Vk1-39Jk5 o el animal no humano comprende no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados uno de los cuales es un segmento del gen Vk1-39, el reemplazo en la secuencia Vk1-39 de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina comprende un reemplazo en una posición en la secuencia del gen de la cadena ligera de inmunoglobulina que codifica CDR3 diseñado para expresar una histidina en la posición seleccionada de 105, 106, 108, 111, y una combinación de los mismos. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105 y 106. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105 y 111. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105 y 108. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105, 108 y 111. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105, 106 y 108. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 106 y 108. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 106 y 111. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 108 y 111. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 106, 108 y 111. En otro aspecto más, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 106, 108 y 111. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105, 106 y 111. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar las histidinas en las posiciones 105, 106, 108 y 111. En un aspecto, las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de las regiones CDR3 sustituidas con histidina se representan en la alineación de secuencias de la FIG. 2 y se exponen en las SEQ ID NO: 4-33. En un aspecto, las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de CDR3 de tipo silvestre (representadas en la Figura 2) se exponen en las SEQ ID NO: 2 y 3, respectivamente. Otros aspectos de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de las secuencias de c DR3 sustituidas con histidina aparecen a lo largo de la memoria descriptiva y el Listado de secuencias, y deberían estar claros para los expertos en la materia.

En el aspecto en donde el animal no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que es una región variable V<k>3-20J<k>1 o el animal no humano comprende no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados uno de los cuales es un segmento del gen V<k>3-20, el reemplazo en la secuencia V<k>3-20 de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina comprende un reemplazo en una posición en la secuencia del gen de la cadena ligera de inmunoglobulina que codifica la región CDR3 que está diseñado para expresar una histidina en la posición seleccionada de 105, 106, 107, 109, y una combinación de los mismos. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105 y 106. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105 y 107. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105 y 109. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 106 y 107. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 106 y 109. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 107 y 109. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105, 106 y 107. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105, 107 y 109. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 106, 108 y 111. En un aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar histidinas en las posiciones 105, 106 y 109. En otro aspecto, el reemplazo está diseñado para expresar las histidinas en las posiciones 105, 106, 107 y 109. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de las regiones CDR3 sustituidas con histidina ejemplares se representan en la alineación de secuencias de la FIG.

12 y se exponen en las SEQ ID NO: 76-79. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de CDR3 de tipo silvestre (representadas en la Figura 12) se exponen en las SEQ ID NO: 74 y 75, respectivamente. Otros aspectos de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de las secuencias de CDR3 sustituidas con histidina aparecen a lo largo de la memoria descriptiva y el Listado de secuencias, y deberían estar claros para los expertos en la materia.

Las posiciones de los aminoácidos (105, 106, etc.) se basan en una numeración única descrita en Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55-77, y también se pueden ver en www.imgt.org.

En un aspecto, el segmento génico Vl humano está unido operativamente a una secuencia líder humana o no humana. En un aspecto, la secuencia líder es una secuencia líder no humana. En un aspecto específico, la secuencia líder no humana es una secuencia líder Vk3-7 de ratón. En un aspecto específico, la secuencia líder está unida operativamente a un segmento génico V<l>humano no reordenado. En un aspecto específico, la secuencia líder está operativamente unida a una secuencia V<l>/J<l>humana reordenada. Por tanto, en un aspecto específico, la secuencia génica de la región variable de Vk1-39/Jk5 o Vk3-20/Jk1 reordenada única que comprende al menos una sustitución de histidina está unida operativamente a una secuencia líder V<k>3-7 de ratón. En otro aspecto específico, los segmentos de los genes V<k>1-39 y/o V<k>3-20 humanos no reordenados que comprenden al menos una sustitución de histidina están operativamente unidos a una secuencia líder Vk3-7 de ratón. En otro aspecto más, los segmentos de los genes Vk1-39 y/o V<k>3-20 humanos no reordenados están alineados operativamente a una secuencia líder de V<k>humana. En un aspecto, el segmento del gen Vk1-39 humano no reordenado que comprende al menos una sustitución de histidina está unido a una secuencia líder de Vk1-39 humano, y el segmento del gen Vk3-20 humano no reordenado que comprende al menos una sustitución de histidina está unido a una secuencia líder de V<k>3-20 humano.

En un aspecto, el segmento génico V<l>humano está unido operativamente a una secuencia promotora de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia promotora es una secuencia promotora humana. En un aspecto específico, el promotor de inmunoglobulina humana es un promotor V<k>3-15 humano. En otro aspecto específico, el promotor de inmunoglobulina humana es un promotor Vk1-39 o Vk3-20 humano. En un aspecto específico, el promotor está unido operativamente a un segmento génico V<l>humano no reordenado. En un aspecto específico, el promotor está operativamente unido a una secuencia V<l>/J<l>humana reordenada. Por tanto, en un aspecto específico, la secuencia génica de la región variable de V<k>1-39/J<k>5 o V<k>3-20/J<k>1 reordenada única que comprende al menos una sustitución de histidina está unida operativamente al promotor V<k>3-15 humano. En otro aspecto específico, los segmentos de los genes V<k>1-39 y/o V<k>3-20 humanos no reordenados que comprenden al menos una sustitución de histidina cada uno está unido operativamente al promotor Vk3-15 humano. En otro aspecto específico, los segmentos de los genes V<k>1-39 y V<k>3-20 humanos no reordenados que comprenden al menos una sustitución de histidina están unidos a los promotores V<k>1-39 y V<k>3-20 humanos, respectivamente.

En un aspecto, el locus de la cadena ligera comprende una secuencia líder (a) 5 ' flanqueada (con respecto a la dirección transcripcional de un segmento génico Vl) con un promotor de inmunoglobulina humana y (b) 3' flanqueada con un segmento génico V<l>humano que se reordena con un segmento JL humano y comprende la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina; y el locus de la cadena ligera codifica una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio variable de una cadena ligera quimérica inversa y una región constante (C<l>) de cadena ligera no humana endógena. En un aspecto específico, los segmentos de los genes V<l>y J<l>están en el locus V<k>no humano, y la C<l>no humana es una C<k>no humana (por ejemplo, C<k>de ratón). En un aspecto específico, la secuencia de la región variable está unida operativamente a la secuencia de la región constante no humana, por ejemplo, la secuencia del gen Ck no humano. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana es una secuencia no humana endógena. En otro aspecto específico, la Cl es una Ck humana. En un aspecto, el animal no humano es un ratón y la secuencia del gen Ck es una secuencia del gen Ck de ratón. En un aspecto, el segmento génico V<l>humano que se reordena con un segmento J<l>humano y comprende la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina está en el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina no humana (por ejemplo, ratón) endógeno (locus k). Los aspectos ejemplares del locus se presentan en las FIGS. 31A y 33A.

En un aspecto, el locus de la cadena ligera comprende una secuencia líder (a) 5'flanqueada (con respecto a la dirección transcripcional de un segmento génico Vl) con un promotor de inmunoglobulina humana y (b) 3'flanqueada en con una secuencia de región variable humana reordenada (secuencia Vl/Jl ) que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y el locus de la cadena ligera codifica una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio variable de una cadena ligera quimérica inversa y una región constante (Cl) de cadena ligera no humana endógena. En un aspecto específico, la secuencia Vl/Jl humana reordenada está en el locus kappa (k) no humano, y la C<l>no humana es una C<k>no humana. En un aspecto específico, la secuencia de la región variable humana reordenada que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina está unida operativamente a la secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana, por ejemplo, la secuencia del gen Ck no humano. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana es una secuencia no humana endógena. En un aspecto, el animal no humano es un ratón y la secuencia del gen Ck es una secuencia del gen Ck de ratón. En un aspecto, la Cl es una Cl humana. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina se encuentra en el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina no humana (por ejemplo, ratón)<endógeno (locus k). Los aspectos ejemplares del locus se presentan en las FIGS.>8<C,>8<E, 14C y 14D.>

En un aspecto, el animal no humano modificado genéticamente es un ratón, y el locus de la región variable del ratón es un locus de cadena ligera k, y el locus de la cadena ligera k comprende un potenciador intrónico k de ratón, un potenciador 3 ' k de ratón, o ambos un potenciador intrónico y un potenciador 3 '.

En un aspecto, el animal no humano (p. ej., un roedor, por ejemplo, una rata o un ratón) comprende un locus de cadena ligera lambda (A) de inmunoglobulina no funcional. En un aspecto específico, el locus de la cadena ligera A comprende una eliminación de una o más secuencias del locus, en donde la una o más deleciones hacen que el locus de la cadena ligera A sea incapaz de reordenarse para formar un gen de cadena ligera. En otro aspecto, se elimina la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos Vl del locus de la cadena ligera A. En un aspecto, el animal no humano (p. ej., roedor, p.ej. ratón o rata) comprende una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, y carece de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina funcional no reordenada, por ejemplo, región variable de la cadena ligera no reordenada endógena. En un aspecto, la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana sustituida con histidina reordenada, reemplaza la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenada endógena. En otro aspecto, el animal no humano (p. ej., roedor, por ejemplo, ratón o rata) comprende no más de dos V<l>humanos y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos Jl humanos en donde cada uno de los no más de dos Vl humanos y, opcionalmente, uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos Jl humanos comprenden una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón histidina, y en donde el animal carece de una región variable de cadena ligera no humana endógena funcional; en un aspecto, la secuencia sustituida con histidina reemplaza la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógena no reordenada. En otro aspecto, el animal no humano (p. ej., roedor, por ejemplo, ratón o rata) comprende no más de dos Vl humanos y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos Jl humanos en los que cada uno de los no más de dos Vl humanos y/o segmentos Jl humanos comprenden una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, y en donde el animal carece de una región variable de cadena ligera no humana endógena funcional; en un aspecto, la secuencia sustituida con histidina reemplaza la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógena no reordenada.

En un aspecto, el animal produce una cadena ligera que comprende un dominio variable mutado somáticamente derivado de una secuencia de región variable humana que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. En un aspecto, la cadena ligera comprende un dominio variable mutado somáticamente derivado de una secuencia de región variable humana que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y una región Ck no humana o humana. En un aspecto, el animal no humano no expresa una cadena ligera A.

Un experto en la materia apreciaría que, aunque la sustitución o sustituciones de al menos un resto de no histidina con un resto de histidina se modifica por ingeniería genética en la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana, debido a las hipermutaciones somáticas, no todos los anticuerpos que se generan en el animal no humano modificado genéticamente albergarán estos restos de histidina en las posiciones diseñada genéticamente. Sin embargo, la generación de un amplio repertorio de anticuerpos en el animal no humano permitirá seleccionar los anticuerpos específicos de antígeno generadosin vivoque presentan una alta afinidad por un antígeno de interés mientras conservan las modificaciones con histidina introducidas en la línea germinal y, preferentemente, muestran unión a antígeno dependiente del pH.

Por tanto, en un aspecto, el animal conserva al menos un aminoácido de histidina introducido mediante la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina en su gen de región variable. En un aspecto, el animal conserva todas o sustancialmente todas las sustituciones de histidina en su dominio variable de cadena ligera somáticamente mutado que se introdujeron en su gen de región variable.

En un aspecto, el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento también comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada que comprende secuencias de segmentos génicos Vh, Dh y Jh. En un aspecto, las secuencias de los segmentos de los genes Vh, Dh y Jh son secuencias de los segmentos de los genes Vh, Dh y Jh humanos, y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada es una región variable de la cadena pesada humana. En un aspecto, las secuencias del segmento de los genes Vh, Dh y Jh humanos están unidas operativamente a la secuencia de la región constante de cadena pesada no humana. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena pesada no humana es una secuencia endógena de la región constante de cadena pesada no humana. En otro aspecto, la secuencia de la región constante de cadena pesada es una secuencia de la región constante de cadena pesada humana. En un aspecto, las secuencias del segmento del gen de la cadena pesada humana están en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprendida en un animal no humano también comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina codificado por la correspondiente secuencia de la línea germinal por un codón de histidina.

En un aspecto, el animal no humano descrito en el presente documento expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región constante de cadena ligera no humana. En un aspecto, el animal no humano expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región constante de cadena ligera humana.

En un aspecto, el animal no humano descrito en el presente documento expresa una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia no humana seleccionada de una secuencia C<h>1, una secuencia<bisagra, una secuencia Ch>2<, una secuencia Ch3 y una combinación de las mismas.>

En un aspecto, el animal no humano expresa una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia<humana seleccionada de una secuencia Ch1, una secuencia bisagra, una secuencia Ch>2<, una secuencia Ch3 y una>combinación de las mismas.

En el aspecto donde el animal comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, o en donde el animal comprende no más de dos segmentos del gene Vl humano no reordenados y uno o más, por ejemplo, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5), segmentos génicos Jl humanos no reordenados en los que cada Vl humano no reordenado y, opcionalmente, la secuencia o secuencias del gen J<l>humano, comprenden la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina (o en donde cada secuencia de los genes Vl humano y/o Jl humano no reordenada comprende la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina), dicha secuencia de región variable o los segmentos V<l>y J<l>humanos en la línea germinal del animal están en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógeno. En un aspecto específico, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina en la línea germinal del animal reemplaza todas o sustancialmente todas las secuencias de los segmentos V y J de cadena ligera no humana endógena en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógeno. En otro aspecto específico, los no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados y uno o más, por ejemplo, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5), segmentos génicos J<L>humanos no reordenados en los que cada V<L>humano no reordenado y, opcionalmente, la secuencia o secuencias del gen J<L>humano, comprenden la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina (o en donde cada secuencia de los genes V<l>humano y/o J<l>humano no reordenada comprende la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina) en la línea germinal del animal reemplazan todas o sustancialmente todas las secuencias de los segmentos V y J de la cadena ligera no humana en el locus endógeno de cadena ligera de inmunoglobulina no humana.

En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo de segmentos génicos V<h>endógenos con uno o más segmentos génicos Vh humanos, en donde los segmentos génicos Vh humanos están operativamente unidos a un gen de una región C<h>no humana, de modo que el animal no humano reordena los segmentos génicos V<h>humanos y expresa una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica inversa que comprende un dominio V<h>humano y una C<h>no humana. En un aspecto, el 90-100% de los segmentos génicos Vh no humanos no reordenados se reemplazan con al menos un segmento génico V<h>humano no reordenado. En un aspecto específico, todos o sustancialmente todos (por ejemplo, 90-100%) de los segmentos génicos Vh no humanos endógeno se reemplazan con al menos un segmento génico V<h>humano no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con al menos 19, al menos 39 o al menos 80 u 81 segmentos génicos Vh humanos no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con al menos 12 segmentos funcionales del gen V<h>humano no reordenado, al menos 25 segmentos funcionales del gen V<h>humano no reordenado, o al menos 43 segmentos funcionales del gen Vh humano no reordenado. En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo de todos los segmentos Dh y Jh no humanos con al menos un segmento Dh humano no reordenado y al menos un segmento Jh humano no reordenado. En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo de todos los segmentos Dh y Jh no humanos por todos los segmentos Dh humanos no reordenados y todos los segmentos Jh humanos no reordenados.

Un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, un repertorio limitado de regiones variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana, por ejemplo, una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única (por ejemplo, V<k>1-39/J<k>5 o V<k>3-20/J<k>1), por ejemplo, no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados y uno o más (por ejemplo, dos o más) segmentos génicos Jl humanos, con una sustitución o sustituciones de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y un repertorio diverso de segmentos Vh, Dh y Jh, descrito en el presente documento, es capaz de generar proteínas de unión a antígeno codificadas por secuencias de región variable de cadena pesada derivadas de varias permutaciones de los segmentos Vh, Dh y Jh humanos no reordenados, en donde los segmentos Vh, Dh y Jh presentes en las secuencias variables de cadena pesada derivan de todos o sustancialmente todos los segmentos V<h>, Dh y Jh humanos funcionales presentes en el genoma del animal. Varias posibilidades disponibles para secuencias de dominio variable de cadena pesada expresadas en las células, por ejemplo, linfocitos B, de los animales modificados genéticamente descritos en el presente documento (es decir, derivados de combinaciones de varios segmentos V, D y J humanos funcionales) se describen en las Publicaciones de Solicitud de EE. UU. números 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 y 2013/0045492, 2013/0185821, y 2013/0198880. En varios aspectos, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada o no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos J<l>humanos que comprenden sustituciones de al menos un codón de no histidina con una codón de histidina descrito en el presente documento, y la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana no reordenada están comprendidos en la línea germinal del animal no humano. En algún aspecto, los animales no humanos descritos en el presente documento son capaces de generar proteínas de unión a epítopos codificadas por su locus de cadena ligera doble.

En un aspecto, el animal no humano que comprende las secuencias de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única sustituidas con histidina comprende una copia de una o ambas de la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende una o más sustituciones de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada. En otro aspecto, el animal no humano comprende dos copias de una o ambas de la secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que comprende una o más sustituciones de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada. Por tanto, el animal no humano puede ser homocigoto o heterocigoto para una o ambas de la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que comprende una o más sustituciones de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y la secuencia de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada.

En otro aspecto, el animal no humano que comprende no más de dos segmentos génicos V<l>humanos sustituido con histidina y uno o una pluralidad de segmentos J<l>(por ejemplo, dos o más segmentos J<l>) es tal que los dos segmentos génicos Vl humanos sustituidos con histidina están yuxtapuestos en el genoma del animal. En algunos aspectos, el animal no humano comprende una copia del locus en donde los dos segmentos génicos V<l>humanos sustituidos con histidina están yuxtapuestos; en otros aspectos, el animal no humano comprende dos copias del locus en donde los dos segmentos génicos Vl humanos sustituidos con histidina están yuxtapuestos. Por tanto, en algunos aspectos, el animal no humano es homocigoto o heterocigoto para un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos Vl humanos yuxtapuestos. En algunos aspectos, los dos segmentos génicos Vl humanos sustituidos con histidina están en diferentes loci (por ejemplo, un heterocigoto, que comprende un primer segmento Vl humano sustituido con histidina en un primer alelo de cadena ligera, y un segundo segmento Vl humano sustituido con histidina en un segundo alelo de cadena ligera, en donde el primer y el segundo segmentos Vl humanos no son idénticos) en el genoma del animal. En algunos aspectos, el animal también es heterocigoto u homocigoto para el locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada. En algunos aspectos, los dos segmentos génicos Vl humanos sustituidos con histidina son un segmento del gen Vk1-39 humano y un segmento del gene V<k>3-20 humano. En un aspecto, el segmento génico J<l>humano se selecciona del grupo que consiste en J<k>1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5 y/o combinaciones por pares de los mismos. En diversos aspectos, un animal no humano modificado por ingeniería genética descrito es incapaz de expresar una cadena ligera de inmunoglobulina que contiene un segmento de gen V<l>endógeno. Por ejemplo, en algunos aspectos, un animal no humano modificado por ingeniería genética descrito contiene una modificación genética que inactiva y/o elimina parte o la totalidad de un segmento génico Vl endógeno.

Además de los animales no humanos modificados genéticamente que comprenden en su genoma una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, una secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con un repertorio limitado de segmentos génicos variables de cadena ligera, por ejemplo, una ola secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada única, por ejemplo, una secuencia que comprende no más de dos segmentos génicos Vl y uno o una pluralidad de segmentos génicos J<l>) que comprenden sustituciones de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina (por ejemplo, en la CDR3 de la cadena ligera), en el presente documento también se describen animales no humanos modificados genéticamente que comprenden una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con una o más adiciones/inserciones de codón(es) de histidina, de manera que el dominio variable expresado comprende uno o más aminoácidos adicionales que, si no están sujetos a hipermutación somática, son una histidina. En un aspecto, tales adiciones de codones de histidina pueden introducirse insertando la secuencia D<h>sustituida con histidina humana en el locus de cadena ligera humana del ratón. Asimismo, los animales descritos en el presente documento que comprenden modificaciones con histidina en sus dominios variables de cadena ligera también pueden contener modificaciones con histidina en sus dominios variables de cadena pesada, por ejemplo, los animales también pueden contener modificaciones con histidina en los dominios variables de cadena pesada humana.

El animal no humano genéticamente modificado que comprende una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana con una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina descrito en el presente documento puede seleccionarse de un grupo que consiste en un ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, un gato, un perro, hurón, primate (por ejemplo, tití común, macaco). Para los animales no humanos cuyas células ES genéticamente modificables adecuadas no estén fácilmente disponibles, se emplean métodos distintos de los descritos en el presente documento para producir un animal no humano que comprende la modificación genética. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, modificar el genoma de una célula no ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear la transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una célula adecuada, por ejemplo, un oocito, y gestar la célula modificada (por ejemplo, el oocito modificado) en un animal no humano en las condiciones adecuadas para formar un embrión. En otro aspecto, un animal no humano descrito en el presente documento puede generarse mediante complementación tetraploide.

En un aspecto, el animal no humano es un mamífero. En un aspecto, el animal no humano es un pequeño mamífero, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. En un aspecto, el animal genéticamente modificado es un roedor. En un aspecto, el roedor se selecciona entre un ratón, una rata, y un hámster. En un aspecto, el roedor se selecciona de la superfamilia Muroidea. En un aspecto, el animal genéticamente modificado es de una familia seleccionada entre Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratones), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del nuevo mundo, campañoles), Muridae (ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas con cresta), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de abazón de las rocas, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirón espinoso), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas del bambú, y zokores). En un aspecto específico, el roedor genéticamente modificado se selecciona entre un ratón o rata auténtico (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso, y una rata con cresta. En un aspecto, el ratón genéticamente modificado es un miembro de la familia Muridae. En un aspecto, el animal es un roedor. En un aspecto específico, el roedor se selecciona entre un ratón y una rata. En un aspecto, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto específico, el animal no humano es un roedor que es un ratón de una cepa C57BL seleccionada entre C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/Ola. En otro aspecto, el ratón es una cepa 129 seleccionada entre el grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, por ejemplo, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, véasetambién,Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). En un aspecto específico, el ratón modificado genéticamente es una mezcla de una cepa 129 anteriormente mencionada y una cepa C57BL/6 anteriormente mencionada. En otro aspecto específico, el ratón es una mezcla de<las cepas 129 anteriormente mencionadas, o una mezcla de las cepas BL>/6<anteriormente mencionadas. En un>aspecto específico, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En otro aspecto, el ratón es una cepa BALB, por ejemplo, cepa BALB/c. En otro aspecto más, el ratón es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa anteriormente mencionada.

En un aspecto, el animal no humano es una rata. En un aspecto, la rata se selecciona entre una rata Wistar, una cepa<LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F>6<y Dark Agouti. En un aspecto, la cepa de la rata es una>mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344,<F>6<y Dark Agouti.>

Por tanto, en un aspecto, el animal no humano genéticamente modificado es un roedor. En un aspecto, el animal no humano genéticamente modificado es una rata o un ratón. En un aspecto, el animal es un ratón. Por tanto, en un aspecto, en el presente documento se describe un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de los genes V<l>y J<l>humanos, en donde la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única comprende una sustitución de al menos codón de no histidina codificado por la secuencia de línea germinal humana correspondiente con un codón de histidina. En un aspecto, el ratón carece de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina funcional no reordenada (por ejemplo, carece de secuencias de segmentos de los genes V y J no reordenados funcionales). En un aspecto, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada con sustituciónA) de codón de histidina es la región variable de Vk1-39/Jk o Vk3-20/Jk. En un aspecto, la secuencia del segmento J se selecciona de Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5. En un aspecto, la secuencia del segmento J es Jk1 o Jk5. En un aspecto, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina está en la secuencia de nucleótidos que codifica una región CDR3. En un aspecto, en donde la secuencia de la región variable reordenada es la secuencia V<k>1-39/J<k>5, la sustitución o sustituciones de histidina está(n) diseñada(s) para expresarse en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de las mismas. En otro aspecto, en donde la secuencia de la región variable reordenada es la secuencia V<k>3-20/J<k>1, la sustitución o sustituciones de histidina está(n) diseñada(s) para expresarse en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de las mismas. En un aspecto, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada con uno o más codones de histidina sustituidos está unida operativamente a una secuencia génica de la región constante de inmunoglobulina de ratón endógena (por ejemplo, la secuencia del gen Ck). En un aspecto, el ratón comprende además en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada que comprende de segmentos de Vh, Dh y Jh humanos. En un aspecto, los segmentos Vh, Dh y Jh humanos están operativamente unidos a una secuencia génica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógena. En diversos aspectos, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que comprende una o más sustituciones de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y la secuencia de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada están comprendidas en la línea germinal del ratón.

Asimismo, en algunos aspectos, en el presente documento se describe un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, un repertorio limitado, por ejemplo, no más de dos, segmentos génicos V<l>humanos reordenados y uno o más, por ejemplo, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5), segmentos génicos J<l>humanos no reordenados en donde cada segmento génico V<l>humano reordenado y/o J<l>humano comprende la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina, por ejemplo, al menos un codón de no histidina presente en la secuencia de la línea germinal humana correspondiente por un codón de histidina. En algunos aspectos, en el presente documento se describe un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, un repertorio limitado, por ejemplo, no más de dos, segmentos génicos V<l>humanos reordenados y uno o más, por ejemplo, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5), segmentos génicos Jl humanos no reordenados en los que cada Vl humano no reordenado y, opcionalmente, los segmentos génicos Jl humanos) comprenden la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina, por ejemplo, al menos un codón de no histidina presente en la secuencia de la línea germinal humana correspondiente por un codón de histidina. En un aspecto, el ratón carece de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógena no reordenada funcional (por ejemplo, carece de secuencias de segmentos de los genes V y J de inmunoglobulina endógena no reordenada funcional). En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos Vl humanos no reordenados son segmentos de los genes Vk1-39 y Vk3-20 humanos. En un aspecto, la secuencia del segmento J se selecciona de Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5 y combinaciones de las mismas. En un aspecto, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina está en la secuencia de nucleótidos que codifica una región CDR3. En un aspecto, en donde el segmento V<l>no reordenado es un segmento del gen V<k>1-39, la sustitución o sustituciones de histidina está(n) diseñada(s) para expresarse en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de las mismas. En otro aspecto, en donde el segmento de V<l>no reordenado es un segmento de Vk3-20, la sustitución o sustituciones de histidina está(n) diseñada(s) para expresarse en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de las mismas. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos Vl y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos, que comprende la sustitución a) de codón o codones de histidina, está unida operativamente a una secuencia génica de la región constante de inmunoglobulina de ratón endógena (por ejemplo, secuencia del gen C<k>). En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos Vl y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos, que comprende una o más sustituciones de codón o codones de histidina, está unida operativamente a una secuencia génica de la región constante de inmunoglobulina humana (por ejemplo, secuencia del gen Ck). En un aspecto, el ratón comprende además en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada que comprende de segmentos de V<h>, D<h>y J<h>humanos. En un aspecto, los segmentos Vh, Dh y Jh humanos están operativamente unidos a una secuencia génica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógena. En otro aspecto, los segmentos V<h>, D<h>y J<h>humanos están operativamente unidos a una secuencia de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En diversos aspectos, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos Vl y uno o más, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos, que comprende una o más sustituciones de codón o codones de histidina y la secuencia de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada están comprendidas in la línea germinal del ratón.

En el presente documento también se describen vectores de direccionamiento para generar animales no humanos modificados genéticamente, por ejemplo, ratones, descritos en el presente documento. En un aspecto, se describe un vector de direccionamiento que comprende, d del vector: un brazo de homología de ratón 5', un promotor de inmunoglobulina humana o de ratón, una secuencia líder humana o de ratón, una región variable humana seleccionada de un Vk1-39Jk5 humano reordenado o un Vk3-20Jk1 humano reordenado y que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y un brazo de homología de ratón 3'. En un aspecto, los brazos de homología 5 'y 3' dirigen el vector a una secuencia 5' con respecto a una secuencia potenciadora que está presente en 5' y proximal al gen Ck de ratón. En otro aspecto, el vector de direccionamiento comprende un brazo de homología de ratón 5' seguido de un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación, promotor de inmunoglobulina humana o de ratón, secuencia líder humana o de ratón, una región variable humana seleccionada de un Vk1-39Jk5 humano reordenado o un Vk3-20Jk1 humano reordenado y que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, seguido por el brazo de homología de ratón 3' que comprende potenciadores de ratón y secuencias de región constante (CK).

En otro aspecto, en el presente documento se describe un vector de direccionamiento que comprende: un brazo de homología de ratón 5'; una región variable humana que comprende no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados y uno o una pluralidad (por ejemplo, dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) de segmentos génicos J<l>humanos no reordenados en los que cada V<l>humano no reordenado y, opcionalmente, la secuencia o secuencias del gen J<l>humano, comprenden la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina, por ejemplo, al menos un codón de no histidina presente en la secuencia de la línea germinal humana por un codón de histidina, y en donde cada segmento génico V<l>no reordenado está unido operativamente a una secuencia líder humana o de ratón y un promotor humano o de ratón; y un brazo de homología de ratón 3'. En un aspecto, los brazos de homología 5 'y 3' dirigen el vector a una secuencia 5' con respecto a una secuencia potenciadora que está presente en 5' y proximal al gen C<k>de ratón. En otro aspecto, el vector de direccionamiento comprende: un brazo de homología de ratón 5' seguido de un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación; una región variable humana que comprende no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados y uno o una pluralidad (por ejemplo, dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) de segmentos génicos J<l>humanos no reordenados en los que cada V<l>humano no reordenado y, opcionalmente, la secuencia o secuencias de segmentos génicos J<l>humanos comprenden la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina, por ejemplo, al menos un codón de no histidina presente en la secuencia de la línea germinal por un codón de histidina, y en donde cada segmento génico Vl no reordenado está unido operativamente a una secuencia líder humana o de ratón y un promotor humano o de ratón; seguido por el brazo de homología de ratón 3' que comprende potenciadores de ratón y secuencias de región constante (CK).

Un casete de selección es una secuencia de nucleótidos insertada en una construcción de direccionamiento para facilitar la selección de células (por ejemplo, células bacterianas, células ES, etc.) que han integrado la construcción de interés. Un número de casetes de selección adecuados son conocidos en la técnica. De manera habitual, un casete de selección permite la selección positiva en presencia de un antibiótico concreto (por ejemplo, Neo, Hyg, Pur, CM, Spec, etc.). Además, un casete de selección puede estar flanqueado por sitios de recombinación, que permiten la deleción del casete de selección tras el tratamiento con enzimas recombinasa. Los sitios de recombinación normalmente utilizados sonloxPyFrt,reconocidos por las enzimas Cre y Flp, respectivamente, pero se conocen otros en la técnica.

En un aspecto, el promotor es un promotor del segmento génico de la región variable de inmunoglobulina humana. En un aspecto específico, el promotor es un promotor V<k>3-15 humano. En otro aspecto, el promotor es un promotor Vk1-39 o Vk3-20 humano. En un aspecto, la secuencia líder es una secuencia líder de ratón. En un aspecto específico, la secuencia líder de ratón es una secuencia líder Vk3-7 de ratón. En otro aspecto, la secuencia líder es una secuencia líder humana. En un aspecto específico, la secuencia líder humana es una secuencia líder Vk1-39 o Vk3-20 humana. Los aspectos ejemplares de los vectores de direccionamiento que comprenden una región variable humana<reordenada única se presentan en las FIGS.>8direccionamiento que comprenden una región variable humana que comprende no más de dos segmentos génicos VL humanos no reordenados y una pluralidad de segmentos génicos J<l>humanos en la FIG. 31A y 33A.

En un aspecto, un vector de direccionamiento es como se describe anteriormente, pero en lugar del brazo de homología de ratón 5', el promotor humano o de ratón está 5' flanqueado con un sitio de reconocimiento de recombinasa específica de sitio (SRRS), y en lugar del brazo de homología de ratón 3', la región de V<l>humano está 3' flanqueada con un SRRS.

También se describen métodos para preparar animales no humanos genéticamente modificados (por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas) descritos en el presente documento. En un aspecto, el método para producir un animal no humano modificado genéticamente descrito en el presente documento utiliza un vector de direccionamiento, producido utilizando tecnología VELOCIGENE®, introduciendo la construcción en las células ES, e introduciendo los clones de células ES dirigidas en un embrión de ratón utilizando la tecnología VELOCIMOUSE®, tal como se describe en los Ejemplos. Las modificaciones con histidina se pueden introducir en el vector de direccionamiento utilizando una variedad de técnicas de biología molecular, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o síntesis de novo de ADN. Tras completar el direccionamiento del gen, las células ES de los animales no humanos modificados genéticamente se analizan para confirmar la incorporación correcta de la secuencia de nucleótidos exógena de interés o la expresión del polipéptido exógeno. Los expertos en la materia conocen numerosas técnicas que incluyen (pero sin limitación) transferencia Southern, PCR larga, PCR cuantitativa (por ejemplo, PCR en tiempo real usando<t>A<q>MAN®), hibridaciónin situfluorescente, transferencia Northern, citometría de flujo, análisis Western, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, etc. En un ejemplo, los animales no humanos (por ejemplo, ratones) que contienen la modificación genética de interés pueden identificarse mediante exploración para la pérdida de alelos del ratón y/o la ganancia de alelos humanos utilizando una modificación del ensayo de alelos descrito en Valenzuela y col. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21 (6):652-659. Los expertos en la materia conocen otros ensayos que identifican una secuencia de nucleótidos o aminoácidos específica en los animales modificados genéticamente.

Por tanto, en un aspecto, el método para generar animales no humanos modificados genéticamente comprende reemplazar una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina en el animal con una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana (que comprende los segmentos de los genes Vl y Jl humanos) en donde la secuencia génica de la región variable de inmunoglobulina humana comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. En un aspecto, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina está en la secuencia de nucleótidos que codifica una región CDR, por ejemplo, una región CDR3.

En un aspecto, el método para generar animales no humanos modificados genéticamente descrito en el presente documento comprende reemplazar una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina en el animal con una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de segmentos de los genes Vl y Jl humanos, en donde la secuencia génica de la región variable de inmunoglobulina humana reordenada única comprende al menos una histidina que no está codificada por la secuencia de la línea germinal humana correspondiente, por ejemplo, en donde la secuencia génica de la región variable de inmunoglobulina humana reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, por ejemplo, al menos un codón de histidina codificado por la secuencia de la línea germinal humana correspondiente con un codón de histidina. En un aspecto, la sustitución es en un codón de CDR. En un aspecto, la sustitución es de uno, dos, tres, cuatro o más codones de CDR3. En un aspecto, la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única se basa en la secuencia de la región variable de cadena ligera reordenada de la línea germinal humana seleccionada de Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1. Por tanto, en un aspecto, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de Vk1-39Jk5, el reemplazo de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en posiciones seleccionadas entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de las mismas. En un aspecto, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de V<k>3-20<k>1, el reemplazo de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de las mismas.

En otro aspecto más, el método para generar animales no humanos modificados genéticamente descrito en el presente documento comprende reemplazar una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina en el animal con una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados, dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) de segmentos génicos J<l>humanos no reordenados en los que cada V<l>humano no reordenado y, opcionalmente, la secuencia o secuencias del gen Jl humano comprenden al menos una histidina que no está codificada por los segmentos génicos variables de la línea germinal humana correspondientes, por ejemplo, en donde cada V<l>humano no reordenado y, opcionalmente, la secuencia o secuencias del gen J<l>humano comprenden una sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina, por ejemplo, al menos un codón de no histidina presente en la secuencia de la línea germinal humana por un codón de histidina. En un aspecto, la sustitución es en un codón de CDR. En un aspecto, la sustitución es de uno, dos, tres, cuatro o más codones de CDR3. En un aspecto, los no más de dos segmentos génicos Vl humanos no reordenados son segmentos de los genes Vk1-39 y Vk3-20 humanos. En un aspecto, los segmentos génicos J<l>humanos no reordenados se seleccionan de J<k>1, J<k>2, J<k>3, J<k>4, J<k>5 y combinaciones de las mismas. Por tanto, en un aspecto, en donde el segmento génico Vl humano no reordenado es Vk1-39, el reemplazo de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en posiciones seleccionadas entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de las mismas. En un aspecto, en donde el segmento génico Vl humano no reordenado es Vk3-20, el reemplazo de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de las mismas.

En otro aspecto, el método para generar un animal no humano descrito en el presente documento (es decir, que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina genéticamente modificado descrito en este documento) comprende modificar un genoma de un animal no humano para eliminar o generar segmentos V y J de cadena ligera de inmunoglobulina endógena no funcionales en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina, y colocar en el genoma<(>1<) una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada única que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina o (>2<) una secuencia génica variable de>cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados y uno o una pluralidad (por ejemplo, dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) de segmentos génicos J<l>humanos no reordenados en los que cada Vl humano no reordenado y, opcionalmente, la secuencia o secuencias del gen Jl humano comprenden la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina (o en donde cada secuencia de los genes Vl humano y/o Jl humano comprende la sustitución de al menos un codón de no histidina por un codón de histidina). En un aspecto, el método da como resultado un animal no humano modificado genéticamente que comprende una población de linfocitos B enriquecidos por anticuerpos que muestran una unión a un antígeno de interés dependiente del pH.

En algunos aspectos, los métodos para generar animales no humanos modificados genéticamente descritos en el presente documento comprenden reemplazar una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia génica de región variable de gen de cadena ligera de inmunoglobulina humana que comprende una o más sustituciones de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina en el animal que también comprende un reemplazo de la secuencia génica de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena con una secuencia génica de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que comprende al menos uno de cada uno o un repertorio de secuencias de V<h>, D<h>y J<h>humanas, como se describe anteriormente. En un aspecto, con el fin de generar un animal no humano que comprende un reemplazo de la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógena con la secuencia génica de la región variable de cadena ligera humana que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina y un reemplazo de la secuencia génica de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena con una secuencia génica de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, el animal con el reemplazo de la secuencia génica de la región variable de cadena ligera se cruza con un animal con el reemplazo de la secuencia génica de la región variable de cadena pesada.

Los inventores actualmente describen animales no humanos modificados por ingeniería genética (por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratas o ratones) que expresan proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, que comprenden una cadena ligera universal, por ejemplo, una cadena ligera universal humana (por ejemplo, una cadena ligera derivada de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única), o una cadena ligera con repertorio de segmentos variables limitado o restringido (por ejemplo, que comprende no más de dos segmentos génicos Vl humanos no reordenados y uno o una pluralidad (por ejemplo, dos o más) segmentos génicos J<l>humanos no reordenados) que comprende una o más modificaciones con histidina, en donde las proteínas de unión a antígeno muestran una unión a antígeno dependiente del pH de un antígeno diana. En algunos aspectos, los animales se modifican por ingeniería genética para incluir una CDR3 de cadena ligera que comprende una o más modificaciones con histidina. En diversos aspectos, la CDR3 de cadena ligera comprende dos, tres o cuatro restos de histidina en un grupo.

En un aspecto, en el presente documento se describe un animal no humano modificado por ingeniería genética (por ejemplo, un ratón o una rata) que comprende una población de linfocitos B caracterizada por una presencia potenciada de histidinas en las cadenas ligeras de inmunoglobulina, por ejemplo, dominios variables de inmunoglobulina, por ejemplo, CDR de inmunoglobulina, en comparación con el animal de tipo silvestre. En un aspecto, la potenciación de la presencia de histidina es de aproximadamente 2 a 4 veces. En un aspecto, la potenciación de histidinas es de<aproximadamente>2<a>10<veces.>

En un aspecto, en el presente documento se describe un animal no humano modificado mediante ingeniería genética que comprende una población de anticuerpos específicos de antígeno que expresan restos de histidina como resultado de modificaciones de codones en la secuencia génica de la región variable de cadena ligera, y presentan una unión del antígeno diana dependiente del pH. En un aspecto, estos animales comprenden una población de linfocitos B que están enriquecidos por anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos específicos de antígeno, que presentan propiedades de unión dependientes del pH (p. ej., semivida disociativa disminuida (t-io), a pH ácido frente a pH neutro) en comparación con una población de anticuerpos específicos de antígeno generados en animales que no comprenden una sustitución de al menos un codón de no histidina codificado por la secuencia de la línea germinal humana con un codón de histidina en la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina descrita en el presente documento. En un aspecto, el enriquecimiento de los anticuerpos específicos de antígeno que presentan las propiedades de unión a antígeno dependientes del pH generados en los animales modificados por ingeniería genética descritos en el presente documento en comparación con animales similares que sí comprenden sustituciones de histidina en la región variable de cadena ligera es mayor de aproximadamente 2 veces, por ejemplo, mayor de aproximadamente 5 veces, por ejemplo, mayor de aproximadamente 10 veces. En un aspecto, el enriquecimiento es aproximadamente 2-3 veces. Por tanto, los animales modificados genéticamente descritos en el presente documento están enriquecidos por anticuerpos con propiedades mejoradas de reciclaje de anticuerpos, lo que se desea para reducir el aclaramiento mediado por la diana, así como para reducir la dosis y/o la frecuencia de dosificación de una proteína terapéutica de unión a antígeno desarrollada basándose en dicho formato de anticuerpo generadoin vivo.

Por tanto, en el presente documento se describe una proteína de unión a antígeno, generada en animales no humanos modificados genéticamente descritos en el presente documento, en donde la proteína de unión a antígeno presenta unión a antígeno dependiente del pH. En un aspecto, la proteína de unión a antígenos es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo específico de antígeno. En un aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera humana derivado de un reordenamiento de los segmentos génicos variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana donde al menos un codón de no histidina estaba sustituido por un codón de histidina en la secuencia del gen de la línea germinal, y en donde el anticuerpo conserva al menos una sustitución de histidina en su dominio variable de la cadena ligera humana expresada. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera humana derivado de una secuencia génica de la región variable de cadena ligera humana reordenada única, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, y en donde el anticuerpo conserva al menos una sustitución de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En un aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera derivada de un reordenamiento de Vk139/J o Vk3-20/J humano (por ejemplo, Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1), en donde la secuencia del gen Vk1-39J o Vk3-20J humano comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, y en donde el anticuerpo conserva al menos una sustitución de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera humana derivado de un reordenamiento de la secuencia génica de la región variable de cadena ligera presente ene l locus de la línea germinal, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera presente en el locus de la línea germinal comprende no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados y uno o una pluralidad (por ejemplo, dos o más) segmentos génicos Jl humanos no reordenados y cada segmento génico Vl humano no reordenado y, opcionalmente, el o los segmentos génicos Jl humanos, comprenden una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, y en donde el anticuerpo conserva al menos una sustitución de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En un aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera derivada de un V<k>1-39/J o V<k>3-20/J humano reordenado con un segmento J, en donde dicha secuencia del gen V<k>1- 39J<k>o V<k>3- 20J<k>humano reordenada comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, y en donde el anticuerpo conserva al menos una sustitución de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En algunos aspectos, el anticuerpo conserva todas o sustancialmente todas las sustituciones de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En un aspecto, el anticuerpo conserva al menos el<50%, al menos el>66<%, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99%>de todas las sustituciones de histidina en su dominio variable de cadena ligera. En un aspecto, la sustitución es de tres codones de no histidina con tres codones de histidina en la secuencia de nucleótidos que codifica CDR3 de la secuencia génica de la región variable de cadena ligera, y el anticuerpo conserva las tres sustituciones de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En otro aspecto, la sustitución es de tres codones de no histidina con tres codones de histidina en la secuencia de nucleótidos que codifica CDR3 de la secuencia génica de la región variable de cadena ligera, y el anticuerpo conserva dos o tres sustituciones de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En un aspecto, la sustitución es de cuatro codones de no histidina con cuatro codones de histidina en la secuencia de nucleótidos que codifica CDR3 de la secuencia génica de la región variable de cadena ligera, y el anticuerpo conserva tres o cuatro sustituciones de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En otros aspectos, el anticuerpo conserva una, dos, tres, cuatro, y hasta todas las modificaciones con histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado.

En un aspecto, la cadena ligera del anticuerpo comprende además una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena ligera no humana, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena ligera endógena. Además, el anticuerpo, por ejemplo, el anticuerpo específico de antígeno, generado en un animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento también comprende una cadena pesada que comprende un dominio variable de cadena pesada humana derivado de un reordenamiento de los segmentos V, D y J de cadena pesada humana. Los segmentos V, D y J de la cadena pesada humana pueden seleccionarse de un repertorio de segmentos de cadena pesada humana presentes en el locus endógeno de cadena pesada no humana, por ejemplo, al menos un segmento V funcional, al menos un D funcional y al menos un J funcional, por ejemplo, hasta un repertorio completo de segmentos V, D y J humanos funcionales. Los posibles reordenamientos ejemplares de los segmentos variables de cadena pesada humana se pueden extraer de una lista de segmentos V, D y J humanos funcionales en la base de datos de IMGT, y de las Publicaciones de Solicitud de EE. UU. Números 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192309 y 2013/0045492. Además, en un aspecto, la cadena pesada del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada no humana, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada no humana endógena. En un aspecto, la región constante de cadena pesada no humana comprende dominios C<h>1, bisagra, C<h>2, y C<h>3. En un aspecto, el anticuerpo es un isotipo IgG, IgE, IgD, IgM o IgA.

Por tanto, en un aspecto, en el presente documento se describe una proteína de unión generada en los animales no humanos modificados genéticamente descritos en el presente documento, en donde la proteína de unión comprende una cadena ligera quimérica inversa que comprende (a) un dominio variable de cadena ligera derivado de un reordenamiento de V<k>1-39 a J<k>humanos (por ejemplo, reordenamiento de V<k>1-39J<k>5) que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, en donde la cadena ligera conserva al menos una sustitución de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado y (b) una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena ligera no humana, por ejemplo, de ratón, en donde la cadena ligera está asociada con una cadena pesada quimérica inversa que comprende (a) un dominio variable de cadena pesada derivado de un reordenamiento de segmentos V, D y J humanos, en donde los segmentos V, D y J se seleccionan de un repertorio de segmentos V, D y J humanos presentes en el animal, y (b) una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada no humana, por ejemplo, de ratón. En un aspecto, el repertorio de segmentos V, D y J humanos comprende al menos un segmento V funcional, al menos un D funcional y al menos un J funcional, por ejemplo, hasta un repertorio completo de segmentos V, D y J humanos funcionales. En un aspecto, los dominios constantes de cadena pesada y ligera son dominios constantes de cadena ligera y pesada endógenos. En un aspecto, los dominios constantes de cadena pesada y ligera son dominios mutados somáticamente. En un aspecto, el dominio de cadena ligera mutado somáticamente conserva al menos una sustitución de histidina introducida en la secuencia de la línea germinal. En algunos aspectos, el dominio de cadena ligera mutado somáticamente conserva todas o sustancialmente todas las sustituciones de histidina introducidas en la secuencia de la línea germinal. En un aspecto, en la proteína de unión a antígeno presenta propiedades de unión a antígeno dependientes del pH.

En otro aspecto, en el presente documento se describe una proteína de unión generada en los animales no humanos modificados genéticamente descritos en el presente documento, en donde la proteína de unión comprende una cadena ligera quimérica inversa que comprende (a) un dominio variable de cadena ligera derivado de un reordenamiento de Vk3-20 humano a Jk (por ejemplo, reordenamiento de Vk3-20Jk1) que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, en donde la cadena ligera conserva al menos una sustitución de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado y (b) una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena ligera no humana, por ejemplo, de ratón, en donde la cadena ligera está asociada con una cadena pesada quimérica inversa que comprende (a) un dominio variable de cadena pesada derivado de un reordenamiento de los segmentos V, D y J humanos, en donde los segmentos V, D y J se seleccionan de un repertorio de segmentos V, D y J humanos presentes en el animal, y (b) una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada no humana, por ejemplo, de ratón. En un aspecto, el repertorio de segmentos V, D y J humanos comprende al menos un segmento V funcional, al menos un D funcional y al menos un J funcional, por ejemplo, hasta un repertorio completo de segmentos V, D y J humanos funcionales. En un aspecto, las regiones constantes de cadena pesada y ligera son regiones constantes de cadena pesada y ligera endógenas. En un aspecto, los dominios constantes de cadena pesada y ligera son dominios mutados somáticamente. En un aspecto, el dominio de cadena ligera mutado somáticamente conserva al menos una sustitución de histidina introducida en la secuencia de la línea germinal. En algunos aspectos, el dominio de cadena ligera mutado somáticamente conserva todas o sustancialmente todas las sustituciones de histidina introducidas en la secuencia de la línea germinal. En un aspecto, en la proteína de unión a antígeno presenta propiedades de unión a antígeno dependientes del pH.

En un aspecto, también se describe en el presente documento un linfocito B del animal modificado genéticamente descrito en el presente documento, que comprende en su línea germinal una secuencia de la región variable de cadena ligera humana modificada con histidina, por ejemplo, una secuencia de la región variable de cadena ligera humana reordenada única modificada con histidina o una secuencia de la región variable de cadena ligera humana modificada con histidina que comprende no más de dos segmentos génicos V<l>humanos no reordenados y uno o una pluralidad (por ejemplo, dos o más) segmentos génicos J<l>humanos no reordenados, descritas en el presente documento y expresa una proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, expresado en el linfocito B conserva al menos un resto de histidina introducido en la línea germinal y presenta propiedades de unión a antígeno dependientes del pH. En algunos aspectos, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, expresado en el linfocito B conserva todos o sustancialmente todos los restos de histidina introducidos en la línea germinal y presenta propiedades de unión a antígeno dependientes del pH.

En diversos aspectos, el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana, por ejemplo, una secuencia génica de la región variable de cadena ligera humana reordenada única modificada con histidina (p. ej., secuencia V<k>1-39J<k>5 o V<k>3-20J<k>1) o una secuencia de la región variable de cadena ligera humana modificada con histidina que comprende no más de dos segmentos del gen V<l>humano no reordenados y uno o un pluralidad (por ejemplo, dos o más) segmentos génicos Jl humanos no reordenados, que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina (o una adición de un codón de histidina en la secuencia de la línea germinal). Estas adiciones o sustituciones dan como resultado un animal no humano que comprende una población de linfocitos B enriquecidos por proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión para sus antígenos dependientes del pH. En un aspecto, proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, generadas en los animales no humanos descritos en el presente documento en respuesta a la estimulación con antígenos presenta una unión a antígeno dependiente del pH mientras muestra una alta afinidad por el antígeno a pH neutro, por ejemplo, pH entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0, por ejemplo, pH entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,4, por ejemplo, entre aproximadamente 7,2 y aproximadamente 7,4, por ejemplo, pH fisiológico. En un aspecto, la afinidad de la proteína de unión a antígeno a su antígeno, expresada como una constante de disociación (Kd) a un pH neutro es menos de<10>-6<M, por ejemplo, menos de 10>-8<M, por ejemplo, menos de 10>-9<M, por ejemplo, menos de 10>-10<M, por ejemplo, menos de>10-11<M, por ejemplo, menos de>10-12<M.>

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, generada en el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, muestra una unión reducida a su antígeno en pH ácido (por ejemplo, pH de 6,0 o inferior, por ejemplo, pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0, pH entre aproximadamente 5,75 y aproximadamente 6,0, por ejemplo, pH de los compartimentos endosómico o lisosómico) en comparación con el pH neutro. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, el anticuerpo, generada en el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, no muestra unión a antígeno en pH ácido, mientras conserva unión a antígeno a pH a neutro. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno generada por el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, tiene una<disminución en la semivida disociativa (ti/>2<) a un pH ácido en comparación con la semivida disociativa (ti/>2<) de la>proteína de unión a antígeno a un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno expresada por el<animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, tiene una t i>/2<a un pH ácido y 37 °C>de aproximadamente 2 minutos o menos. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno expresada por el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento tiene una t1/2 a un pH ácido y 37 °C de menos de aproximadamente 1 min. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno expresada por el animal no<humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, tiene una t-i>/2<a un pH ácido y 25 °C de>aproximadamente 2 minutos o menos. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno expresada por el animal no<humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, tiene una t-i>/2<a un pH ácido y 25 °C de menos de aproximadamente>1<min.>

Los parámetros cinéticos, tales como las constantes de disociación en equilibrio(Kd)y las semividas disociativas (ty2)<se pueden calcular a partir de la constante de velocidad cinética como: Kd (M) = kd/k¿ y ty>2<(min) = ln2/(60*kd).>

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, generada en los animales no humanos genéticamente modificados descritos en el presente documento, muestran una unión aumentada a la molécula FcRn. Como se describe anteriormente, FcRn es un receptor presente dentro del compartimento endosómico que es capaz de unirse a las inmunoglobulinas a un pH ácido y reciclarlas de nuevo a la superficie. La exploración de las moléculas de anticuerpos en los animales no humanos modificados genéticamente descritos en el presente documento presenta una oportunidad única para seleccionar anticuerpos con tres parámetros beneficiosos: alta afinidad por un antígeno, unión a antígeno dependiente del pH (con una unión a antígeno más débil a pH ácido) y una unión a FcRn aumentada.

En un aspecto, un animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B en respuesta a un antígeno que produce y está enriquecida por proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, que, cuando se transforman en agentes terapéuticos, muestran una semivida en suero aumentada tras la administración de una dosis terapéutica a un sujeto sobre una población de linfocitos B equivalente producida en respuesta al mismo antígeno en los mismos animales no humanos que no comprenden modificaciones con histidina en sus secuencias génicas de la región variable de cadena ligera humana. Por tanto, en un aspecto, una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, producida en respuesta a un antígeno de interés en un animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, cuando se transforman en un agente terapéutico, muestra una semivida en suero aumentada tras la administración de una dosis terapéutica a un sujeto durante una semivida en suero de una proteína de unión a antígeno (cuando se transforma en un agente terapéutico y se administra a la misma dosis terapéutica) que se produjo en respuesta al mismo antígeno en una animal no humano que no comprende modificaciones con histidina en su secuencia génica de la región variable de cadena ligera humana.<En algunos aspectos, la semivida en suero aumentada es aproximadamente>2<veces, por ejemplo, aproximadamente>5 veces, por ejemplo, aproximadamente 10 veces, por ejemplo, aproximadamente 15 veces, por ejemplo,<aproximadamente>20<veces o más.>

En un aspecto, se describe una célula pluripotente, pluripotente inducida o totipotente derivada de un no humano como se describe en el presente documento. En un aspecto específico, la célula es una célula madre embrionaria (ES, por sus siglas en inglés).

En un aspecto, se describe un tejido derivado de un animal no humano como se describe en el presente documento. En un aspecto, el tejido deriva de bazo, ganglio linfático o médula ósea de un animal no humano como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe un núcleo derivado de un animal no humano como se describe en el presente documento. En un aspecto, el núcleo es de una célula diploide que no es un linfocito B.

En un aspecto, se describe una célula no humana que se aísla de un animal no humano (por ejemplo, un roedor, por ejemplo, ratón o rata) descrito en el presente documento. En un aspecto, la célula es una célula ES. En un aspecto, la célula es un linfocito. En un aspecto, el linfocito es un linfocito B. En un aspecto, el linfocito B expresa una cadena pesada quimérica que comprende un dominio variable derivado de un segmento génico de cadena pesada humana; y una cadena ligera derivada de una secuencia Vk1-39/J humana reordenada con una sustitución de al menos un codón de no histidina en la línea germinal con un codón de histidina, una secuencia V<k>3-20/J humana reordenada con una sustitución de al menos un codón de no histidina en la línea germinal con codón de histidina, o una combinación de las mismas en donde la cadena ligera comprende una sustitución de al menos un aminoácido codificado en la línea germinal por una histidina; en donde el dominio variable de cadena pesada se fusiona con una región constante de cadena pesada no humana o humana y el dominio variable de cadena ligera se fusiona con una región constante de cadena ligera no humana o humana. En otro aspecto, el linfocito B expresa una cadena pesada quimérica que comprende un dominio variable derivado de un segmento génico de cadena pesada humana; y una cadena ligera derivada de un reordenamiento de una secuencia V<k>1-39 humana a J humana con una sustitución de al menos un codón de no histidina en la línea germinal con un codón de histidina o derivada de un reordenamiento de una secuencia Vk3-20 humana a J humana con una sustitución de al menos un codón de no histidina en la línea germinal con un codón de histidina en donde la cadena ligera comprende una sustitución de al menos un aminoácido codificado en la línea germinal por histidina; en donde el dominio variable de cadena pesada se fusiona con una región constante de cadena pesada no humana o humana y el dominio variable de cadena ligera se fusiona con una región constante de cadena ligera no humana o humana.

En un aspecto, se describe un hibridoma, en donde el hibridoma se produce con un linfocito B de un animal no humano como se describe en el presente documento. En un aspecto específico, el linfocito B es de un ratón como se describe en el presente documento que se ha inmunizado con un inmunógeno que comprende un epítopo de interés, y el linfocito B expresa una proteína de unión que se une al epítopo de interés, la proteína de unión tiene un dominio de cadena pesada variable humana somáticamente mutado y una Ch de ratón; y tiene un dominio de cadena ligera variable humano derivado de (1) un V<k>1-39J<k>5 humano reordenado, (2) un reordenamiento de V<k>1-39 humano a J humano, (3) un reordenamiento de V<k>3-20J<k>1 humano, o (4) un reordenamiento de V<k>3-20 humano a J humano, conteniendo cada uno una sustitución de al menos un codón de no histidina en la línea germinal con un codón de histidina y una Cl de ratón; en donde el dominio de la cadena ligera humana comprende una sustitución de al menos un aminoácido codificado en la línea germinal con una histidina.

También se describe una célula que expresa una proteína de unión a antígeno generada en los animales no humanos descritos en el presente documento. En un aspecto, la célula se selecciona entre CHO, COS, 293, HeLa, y una célula<retiniana que expresa una secuencia de ácido nucleico vírico (por ejemplo, una célula PERC.>6<™).>

En un aspecto, se describe un embrión no humano, en donde el embrión comprende una célula ES donante que deriva de un animal no humano como se describe en el presente documento.

Los animales no humanos descritos en el presente documento, son útiles para generar linfocitos B que expresan anticuerpos que tienen histidinas en una CDR3. Un animal que coloca histidinas en una CDR3 es útil para producir anticuerpos en general, y en particular es útil para desarrollar anticuerpos que se unen a una diana con suficiente afinidad en o alrededor de un pH neutro, pero que no se unen o que se unen más débilmente a la misma diana a un pH ácido.

El animal no humano es útil para generar regiones variables de anticuerpos que se pueden usar para producir, por ejemplo, proteínas de unión terapéuticas humanas que unen sus dianas por los dominios variables de inmunoglobulina humana que comprenden las histidinas en una CDR3. La unión alterada a un pH más bajo permitirá, en algunas circunstancias, una renovación más rápida debido a que el agente terapéutico se unirá a una diana en la superficie de la célula, se internalizará en un endosoma y se disociará más fácilmente o más rápidamente de la diana en el endosoma, de modo que agente terapéutico se puede reciclar para unirse a otra molécula más de la diana (por ejemplo, en otra célula o la misma célula). En algunas circunstancias, esto dará como resultado la capacidad de dosificar el agente terapéutico en una dosis más baja, o dosificar el agente terapéutico con menos frecuencia. Esto es particularmente útil cuando no es deseable dosificar frecuentemente, o administrar por encima de una cierta dosis, por razones de seguridad o toxicidad. Como resultado, aumentará la semivida sérica del anticuerpo terapéutico cuando se administra a un sujeto.

El animal no humano, por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón o rata, es útil en un método para aumentar el número de linfocitos B en un animal que muestra una región variable de anticuerpo que tiene una CDR3 con una o más histidinas en ella. El animal no humano es útil para generar secuencias de anticuerpos que mostrarán unión a antígeno dependiente del pH. El animal no humano es útil para generar un mayor número de secuencias de anticuerpos, resultantes de una única inmunización, en donde los anticuerpos mostrarán una unión a antígeno dependiente del pH.

Proteínas de Unión a Antígeno y Métodos para Generar las Mismas

En un aspecto, en el presente documento también se describen métodos para generar proteínas de unión a antígeno humanas, por ejemplo, anticuerpos, que muestran unión a antígeno dependiente del pH, a partir de los animales no humanos genéticamente modificados descritos en el presente documento con métodos convencionales usados en la técnica.

Se han descrito varias técnicas para producir anticuerpos. Por ejemplo, en diversos aspectos, se producen anticuerpos quiméricos en ratones como se describe en el presente documento. Los anticuerpos pueden aislarse directamente de los linfocitos B de un ratón inmunizado (por ejemplo, véase el documento U.S. 2007/0280945A1) y/o los linfocitos B del ratón inmunizado se pueden usar para producir hibridomas (Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:495-497). El ADN que codifica los anticuerpos (cadenas pesadas y/o ligeras humanas) a partir de animales no humanos como se describe en el presente documento se aísla y secuencia fácilmente usando técnicas convencionales. Los hibridomas y/o linfocitos B derivados de animales no humanos como se describe en el presente documento sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que se transfectan después en células hospedadoras que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera humana en lugar de las secuencias no humanas. Por tanto, una vez que se determinan las secuencias de ácidos nucleicos de los anticuerpos con características deseadas, por ejemplo, afinidad, epítopo, unión a antígeno dependiente del pH, etc., las secuencias de genes de la región constante no humana se reemplazan con unas secuencias de la región constante humana deseadas para generar un anticuerpo completamente humano que contiene un isotipo no IgM, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Por tanto, en un aspecto se describe en el presente documento un método para generar un anticuerpo que muestra propiedades de unión a antígeno dependientes del pH que comprende generar un animal no humano (por ejemplo, un ratón) como se describe en el presente documento, inmunizar un ratón con un antígeno de interés, permitir a un animal no humano montar una respuesta inmunitaria al antígeno, y seleccionar en el animal no humano un anticuerpo específico de antígeno que muestra propiedades de unión a antígeno dependientes del pH, por ejemplo, unión más débil al antígeno a un pH ácido que a neutro.

En el presente documento también se describen métodos para producir proteínas de unión a antígeno multiespecíficas, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno biespecíficas o triespecíficas. Estas son moléculas capaces de unirse a más de un epítopo con alta afinidad. Las ventajas incluyen la capacidad de seleccionar adecuadamente cadenas de inmunoglobulinas de cadena pesada de unión elevada (por ejemplo, maduradas por afinidad), cada una de las cuales se asociará con una sola cadena ligera. Además, las ventajas incluyen la capacidad de generar una proteína de unión a antígeno multiespecífica, por ejemplo, biespecífica o triespecífica que muestra una unión a antígeno dependiente del pH. Varios aspectos del uso de anticuerpos biespecíficos descritos en el presente documento a continuación también pueden ser aplicables a anticuerpos triespecíficos u otros anticuerpos multiespecíficos.

Debido a la naturaleza dual de los anticuerpos biespecíficos (es decir, pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244), ofrecen muchas ventajas útiles para la aplicación terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden usar para citotoxicidad redirigida (por ejemplo, para destruir células tumorales), como adyuvante de vacuna, para suministrar agentes trombolíticos a coágulos, para convertir profármacos activados por enzimas en un sitio diana (por ejemplo, un tumor), para tratar enfermedades infecciosas, dirigiendo los complejos inmunitarios a los receptores de la superficie celular, o para suministrar inmunotoxinas a células tumorales.

Los anticuerpos biespecíficos descritos en el presente documento también se pueden usar en varios métodos de ensayo terapéuticos y no terapéuticos y/o de diagnóstico, tal como, inmunoensayos enzimáticos, inmunoensayos de dos sitios, inmunodiagnósticoin vitrooin vivode diversas enfermedades (por ejemplo, cáncer), ensayos de unión competitiva, ensayos de tipo sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Otros usos para los anticuerpos biespecíficos serán evidentes para los expertos en la materia.

Se han informado varias técnicas para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos a partir de cultivos de células recombinantes. Sin embargo, la síntesis y expresión de proteínas de unión biespecíficas ha sido problemática, en parte debido a problemas asociados con la identificación de una cadena ligera adecuada que puede asociarse y expresarse con dos cadenas pesadas diferentes, y en parte debido a problemas de aislamiento. En diversos aspectos, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento proporcionan la ventaja de los anticuerpos biespecíficos de longitud completa que no requieren modificaciones especiales para mantener la estructura de inmunoglobulina tradicional al aumentar la estabilidad/interacción de los componentes. En diversos aspectos, tales modificaciones han resultado ser engorrosas y han servido como un obstáculo para el desarrollo de la tecnología de anticuerpos biespecíficos y su uso potencial en el tratamiento de enfermedades humanas. Por tanto, en varios aspectos, al proporcionar una estructura de inmunoglobulina natural (es decir, de longitud completa) que tiene la propiedad añadida de múltiples especificidades, los anticuerpos biespecíficos de longitud completa mantienen sus funciones efectoras críticas de las que carecían los fragmentos biespecíficos anteriores, y además brindan agentes terapéuticos que demuestran el importante parámetro farmacocinético de una semivida más larga.

Los métodos y composiciones descritos en el presente documento, permiten que un ratón genéticamente modificado seleccione, mediante procesos naturales, una cadena ligera adecuada que pueda asociarse y expresarse con más de una cadena pesada, incluidas las cadenas pesadas que están mutadas somáticamente (por ejemplo, maduradas por afinidad), en donde la cadena ligera confiere además a la proteína de unión a antígeno su propiedad de unión a antígeno dependiente del pH. Las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera humana de linfocitos B adecuados de ratones inmunizados como se describe en el presente documento que expresan anticuerpos madurados por afinidad que tienen cadenas pesadas quiméricas inversas (es decir, variable humana y constante de ratón) se pueden identificar y clonar en marco en un vector de expresión con una secuencia génica de la región constante humana adecuada (por ejemplo, una IgG 1 humana). Se pueden preparar dos construcciones de este tipo, en donde cada construcción codifica un dominio variable de cadena pesada humana que se une a un epítopo diferente. Una de las regiones variables de cadena ligera humana (por ejemplo, Vk1-39/J humano o Vk3-20/J humano, por ejemplo, V<k>1-39J<k>5 o V<k>3-20J<k>1 humano), que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, se puede fusionar en el marco de un gen de la región constante de cadena ligera humana adecuado (por ejemplo, un gen de la constante k humana). Estas tres construcciones pesadas y ligeras completamente humanas pueden colocarse en una célula adecuada para la expresión. La célula expresará dos especies principales: una cadena pesada homodimérica con la cadena ligera idéntica, y una cadena pesada heterodimérica con la cadena ligera idéntica. Para permitir una separación fácil de estas especies principales, una de las cadenas pesadas se modifica para omitir un determinante de unión a la proteína A, lo que da como resultado una afinidad diferencial de una proteína de unión homodimérica a partir de una proteína de unión heterodimérica. Las composiciones y los métodos que abordan este problema se describen en el documento USSN 12/832.838, presentado el 25 de junio de 2010, titulado "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format," publicado como US 2010/0331527A1. Una vez que se selecciona la especie que comprende una cadena pesada heterodimérica con una cadena ligera idéntica, esta proteína de unión a antígeno biespecífica puede analizarse para confirmar la conservación de su propiedad de unión a antígeno dependiente del pH.

Como alternativa, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos o triespecíficos utilizando una cadena ligera específica de antígeno derivada de un ratón que comprende un locus de cadena ligera doble, por ejemplo, un locus de cadena ligera que comprende no más de dos secuencias de segmentos del gen V<l>humanos y una o una pluralidad (por ejemplo, dos o más) del gen Jl humano, y un repertorio limitado de cadenas pesadas humanas (por ejemplo, una región variable de cadena pesada humana reordenada única). Dicha cadena ligera, específica de antígeno, modificada con histidina, quimérica inversa (variable humana, constante de ratón) se puede usar para derivar la secuencia de la región variable de la cadena ligera específica de antígeno que se puede clonar en marco en un vector de expresión con una región constante de cadena ligera humana adecuada secuencia. Una o unas regiones variables de cadena pesada humana específica de antígeno (específica para un epítopo diferente en el mismo o diferente antígeno que la cadena ligera específica de antígeno) de un ratón que comprende un locus de cadena ligera universal, por ejemplo, un locus de cadena ligera que comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera reordenada única, se puede clonar en marco en un vector de expresión que comprende una secuencia de región constante de cadena pesada humana, y las cadenas ligera y pesada humanas específicas de antígeno pueden expresarse conjuntamente en una célula adecuada para obtener un anticuerpo biespecífico o triespecífico humano. Como alternativa, una cadena pesada específica de antígeno seleccionada previamente, por ejemplo, una cadena pesada de un anticuerpo que comprende una cadena ligera derivada del mismo segmento génico de la región variable que la utilizada en el locus de ratón de cadena ligera doble puede clonarse en un marco en un vector de expresión que comprende la secuencia de la región constante de la cadena pesada humana, y las cadenas ligera y pesada humanas específicas de antígeno pueden expresarse conjuntamente en una célula adecuada para obtener un anticuerpo biespecífico o triespecífico humano. En un aspecto, dicho anticuerpo presenta unión a antígeno dependiente del pH, por ejemplo, debido a las sustituciones de histidina en la cadena ligera.

En un aspecto, es una proteína de unión a epítopo como se describe en el presente documento, en la que las secuencias de la región variable de cadena ligera y cadena pesada humanas derivan de animales descritos en el presente documento que se han inmunizado con un antígeno que comprende un epítopo de interés.

En un aspecto, se describe una proteína de unión a epítopo que comprende un primer y un segundo polipéptido, el primer polipéptido que comprende, desde el extremo N al extremo C, una primera región de unión al epítopo que se une selectivamente a un primer epítopo, seguida de una región constante que comprende una primera región Ch3 de una IgG humana seleccionada de IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas; y, un segundo polipéptido que comprende, desde el extremo N al extremo C, una segunda región de unión a epítopo que se une selectivamente a un segundo epítopo, seguida de una región constante que comprende una segunda región Ch3 de una IgG humana seleccionada de IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas, en donde la segunda región Ch3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión del segundo dominio Ch3 a la proteína A. Varias de estas modificaciones se describen en, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de EE.UU. n.° 2010/0331527 y 2011/0195454.

Un método para producir una proteína de unión a epítopo que se une a más de un epítopo y muestra una propiedad de unión a epítopo dependiente del pH es inmunizar a un primer ratón de acuerdo con la invención con un antígeno<que comprende un primer epítopo de interés, en donde el ratón comprende (>1<) un locus de región variable de cadena>ligera de inmunoglobulina endógena que no contiene una secuencia génica de región variable de cadena ligera de ratón endógena que es capaz de reordenar y formar una cadena ligera, en donde en el locus de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógena se encuentra una región variable de cadena ligera humana reordenada única operativamente unida al gen de la región constante de cadena ligera endógena de ratón, y, en algunos aspectos, la región variable de la cadena ligera humana reordenada se selecciona de un V<k>1-39J<k>5 humano y un Vk3-20Jk1 humano que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de<histidina, y (>2<) se han reemplazado los segmentos del gen Vh de ratón endógenos en su totalidad o en parte con>segmentos del gen Vh humano, de modo que las cadenas pesadas de inmunoglobulina producidas por el ratón son única o sustancialmente cadenas pesadas que comprenden dominios variables humanos y dominios constantes de ratón. Cuando se inmunice, dicho ratón producirá un anticuerpo quimérico inverso, que comprenderá solo uno de los dos dominios variables de cadena ligera humana (por ejemplo, uno de Vk1-39Jk5 humano o Vk3-20Jk1 humano, por ejemplo, que comprende una sustitución de al menos un aminoácido con una histidina). De manera habitual, al menos algunos de los restos de histidina sustituidos introducidos en la secuencia de la línea germinal se conservarán en el anticuerpo quimérico inverso. Una vez que se identifica un linfocito B que codifica un dominio variable de cadena pesada que se une al epítopo de interés y expresa un anticuerpo que muestra propiedades de unión a antígeno dependientes del pH, la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (y, opcionalmente, la región variable de cadena ligera) puede recuperarse (por ejemplo, mediante PCR) y clonarse en una construcción de expresión en marco con una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana adecuada. Este proceso puede repetirse para identificar un segundo dominio variable de cadena pesada que se une a un segundo epítopo, y puede recuperarse una segunda secuencia génica de región variable de cadena pesada y clonarse en un vector de expresión en marco a una segunda secuencia adecuada de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana adecuada. El primer y el segundo dominio constante de inmunoglobulina codificados por la secuencia génica de la región constante pueden ser el mismo isotipo o uno diferente, y uno de los dominios constantes de inmunoglobulina (pero no el otro) puede modificarse como se describe en el presente documento o en el documento US 2010/0331527A1, y la proteína de unión a epítopo puede expresarse en una célula adecuada y aislarse en función de su afinidad diferencial por la proteína A en comparación con una proteína de unión a epítopo homodimérica, por ejemplo, como se describe en el documento US 2010/0331527A1.

Por tanto, en varios aspectos, después del aislamiento del ADN y la selección de la primera y la segunda secuencia de ácido nucleico que codifican el primer y segundo dominio variable de cadena pesada humana que tienen las especificidades/afinidades deseadas, y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de cadena ligera humana (una secuencia de la línea germinal reordenada o una secuencia de cadena ligera aislada de un animal no humano como se describe en el presente documento) y comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, las tres secuencias de ácidos nucleicos que codifican las moléculas se expresan para formar el anticuerpo biespecífico utilizando técnicas recombinantes que están ampliamente disponibles en la técnica. A menudo, el sistema de expresión de elección involucrará un vector de expresión de células de mamífero y un hospedador, de modo que el anticuerpo biespecífico esté adecuadamente glicosilado (por ejemplo, en el caso de anticuerpos biespecíficos que comprenden dominios de anticuerpos que están glicosilados). Sin embargo, las moléculas también se pueden producir en sistemas de expresión procariotas. Normalmente, la célula hospedadora se transformará con el ADN que codifica el primer dominio variable de cadena pesada humana, el segundo dominio variable de cadena pesada humana, el dominio de cadena ligera humana en un solo vector o vectores independientes. Sin embargo, es posible expresar el primer dominio variable de cadena pesada humana, el segundo dominio variable de cadena pesada humana y el dominio de cadena ligera humana (los componentes del anticuerpo biespecífico) en sistemas de expresión independientes y acoplar los polipéptidos expresadosin vitro.En diversos aspectos, el dominio de cadena ligera humana deriva a partir de una secuencia de línea germinal pero para la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, por ejemplo, en un codón de CDR. En diversos aspectos, el dominio de cadena ligera humana comprende no más de uno, no más de dos, no más de tres, no más de cuatro, o no más de cinco hipermutaciones somáticas dentro de la secuencia variable de cadena ligera del dominio de cadena ligera. En algunos aspectos, las hipermutaciones somáticas no alteran la presencia de al menos un resto de histidina introducido en la secuencia de la línea germinal de la región variable de cadena ligera.

En diversos aspectos, el (los) ácido(s) nucleico(s) (p. ej., ADNc o ADN genómico) que codifican las dos cadenas pesadas y la cadena ligera humana única con una sustitución de al menos una no histidina con una histidina se inserta en un vector replicable para su posterior clonación (amplificación del ADN) y/o para expresión. Muchos vectores están disponibles, y generalmente incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. Cada componente puede seleccionarse individualmente o basarse en una elección de célula hospedadora u otro criterio determinado experimentalmente. Se conocen varios ejemplos de cada componente en la técnica.

Los vectores de expresión y clonación generalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está operativamente unido a las secuencias de ácido nucleico que codifican cada uno o todos los componentes del anticuerpo biespecífico. Se conoce bien un gran número de promotores, reconocidos por una diversidad de células hospedadoras potenciales. Estos promotores están operativamente unidos a ADN que codifica anticuerpos biespecíficos eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora aislada en el vector.

Los vectores de expresión utilizados en células hospedadoras eucariotas (células de levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, nucleadas o humanas de otros organismos multicelulares) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones 5' y, ocasionalmente 3', no traducidas de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica los componentes del anticuerpo biespecífico. Los vectores de expresión adecuados para diversos aspectos incluyen aquellos que proporcionan la expresión transitoria en células de mamíferos de ADN que codifica el anticuerpo biespecífico. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que puede replicarse de manera eficaz en una célula hospedadora, de manera que la célula hospedadora acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula hospedadora, permiten la identificación positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADN clonados, así como la exploración rápida de anticuerpos biespecíficos que tienen especificidades/afinidades de unión deseadas o las características de migración en gel deseadas en relación con los anticuerpos precursores que tienen homodímeros del primer o segundo dominio variable de cadena pesada humana.

En diversos aspectos, una vez que el ADN que codifica los componentes del anticuerpo biespecífico se ensambla en el (los) vector(es) deseado(s) como se describe anteriormente, se introducen en una célula hospedadora adecuada para la expresión y recuperación. La transfección de células hospedadoras se puede lograr utilizando técnicas convencionales conocidas en la técnica apropiadas para la célula hospedadora seleccionada (por ejemplo, electroporación, microinyección nuclear, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina,etc.).

Se elige una célula hospedadora, en varios aspectos, que mejor se adapte al vector de expresión que contiene los componentes y permite la producción más eficaz y favorable de las especies de anticuerpos biespecíficos. Las células hospedadoras ejemplares para la expresión incluyen aquellas de procariotas y eucariotas (unicelulares o de múltiples células), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli,Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.),células de micobacterias, células fúngicas, células de levadura (por ejemplo, S.cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.),células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectadas por baculovirus,Trichoplusia ni, etc.),células de animales no humanos, células humanas o fusiones de células tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En diversos aspectos, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En diversos aspectos, la célula es una célula eucariota seleccionada entre CHO ( por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula retiniana, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral y una línea celular derivada de una célula anteriormente mencionada. En diversos aspectos, la célula comprende uno o más genes víricos, p. ej.<una célula retiniana que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PER.C>6<™).>

Las células hospedadoras de mamíferos utilizadas para producir un anticuerpo biespecífico pueden cultivarse en diversos medios. Los medios comercialmente disponibles tales como de Ham F10 (Sigma), Medio Mínimo Esencial ((MEM, Sigma, RPMI-1640 (Sigma), medio Eagle Modificado de Dulbecco ((DMe M), Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Los medios pueden completarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir otros suplementos a concentraciones apropiadas conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tal como la temperatura, pH y similares, son, en varios aspectos, las utilizadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la materia.

El anticuerpo biespecífico puede recuperarse del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse del lisado de la célula hospedadora cuando se produce directamente sin una señal secretora. Si el anticuerpo biespecífico está unido a la membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100).

Tras el aislamiento, un anticuerpo biespecífico que comprende dos cadenas pesadas humanas y una única cadena ligera humana derivada de una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada, la secuencia seleccionada de las secuencias de V<k>1-39J<k>5 y V<k>3-20J<k>1 que comprenden una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, se analiza por su capacidad para mostrar una unión dependiente del pH a uno, preferentemente a sus dos antígenos. La capacidad de los anticuerpos biespecíficos para unirse a sus antígenos<de manera diferente a pH neutro y ácido (por ejemplo, su capacidad para demostrar una t i>/2<disminuida a pH ácido en>comparación con pH neutro) puede determinarse mediante una variedad de técnicas disponibles en la técnica y descritas en los siguientes ejemplos, por ejemplo, ensayo BIACORE™.

Un método similar para producir una proteína de unión que se une a más de un epítopo y muestra propiedades de unión al epítopo dependientes del pH, utilizando una cadena ligera derivada de un ratón que comprende no más de dos segmentos del gen V<l>humano y uno o más, por ejemplo, dos o más, del gen J<l>humano con modificaciones de histidina y la(s) cadena(s) pesada(s) derivada(s) del mismo ratón o diferente (por ejemplo, un ratón de cadena ligera universal) también se describe, y sería evidente a partir de la presente divulgación. En resumen, los ratones descritos en el presente documento (por ejemplo, los ratones que comprenden un locus de cadena ligera doble) pueden humanizarse con un antígeno de interés y se puede identificar un dominio variable de cadena ligera y/o cadena pesada de un linfocito B que se une al epítopo de interés, y la secuencia de nucleótidos clonada en marco en un vector que comprende una región constante adecuada; se repite el mismo proceso para obtener otros dominios variables de interés, y los dominios variables se expresan conjuntamente en una línea celular adecuada como se describe con más detalle anteriormente.

Métodos Adicionales para Generar Proteínas de Unión a Antígeno con Unión a Antígeno Dependiente del pH

Se describen varios métodos para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH en animales no humanos modificados genéticamente descritos en el presente documento. También se describen métodos para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes del pHin vitro.Dichos métodos pueden implicar la generación de diversos componentes de las proteínas de unión a antígenoin vivoen animales no humanos modificados genéticamente, y después modificarlos y reensamblarlosin vitrofuera de un organismo como complejos de proteínas expresados en cultivos de células de mamíferos.

En un aspecto, el método para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH utiliza una secuencia de proteína de unión a antígeno, por ejemplo, una secuencia de anticuerpo, que se genera en un ratón que comprende un repertorio limitado de segmentos V y J de región variable de cadena ligera, por ejemplo, ratón con segmentos V y J de región variable de cadena ligera humana, "cadena ligera universal" o "cadena ligera común" (ratón "ULC"), como el ratón descrito en las Publicaciones de Solicitud de EE. UU. números 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/01923002013/0045492 y 2013/0185821. En un aspecto, el método para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes de pH utiliza una secuencia de proteína de unión a antígeno que se genera en un ratón que comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada única. En un aspecto, el método utiliza una proteína de unión a antígeno generada en un ratón que comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada única seleccionada entre Vk1-39Jk5 humano y Vk3-20Jk1 humano. En otro aspecto, el método para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes de pH utiliza una secuencia de proteína de unión a antígeno generada en un ratón con segmento de gen variable limitado, por ejemplo, un ratón con cadena ligera doble.

En un aspecto, el método para generar una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH comprende seleccionar un primer anticuerpo que se une a un antígeno de interés (por ejemplo, se une a un antígeno de interés con una afinidad deseada), modificar una secuencia de nucleótidos de cadena ligera de inmunoglobulina del primer anticuerpo para comprender una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, expresar una cadena pesada de inmunoglobulina del primer anticuerpo y la cadena ligera de inmunoglobulina modificada en una célula, y seleccionar un segundo anticuerpo expresado en la célula que conserva la unión a antígeno de interés ( por ejemplo, conserva una afinidad deseada por el antígeno de interés) a pH neutro y presenta unión reducida al antígeno de interés a un pH ácido.

En un aspecto, el método para generar una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH comprende seleccionar una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo (por ejemplo, obtenido de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, por ejemplo, un ratón ULC) que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única en donde el anticuerpo se une a un antígeno de interés (por ejemplo, se une a un antígeno de interés con una afinidad deseada); modificar la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera de inmunoglobulina de modo que la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina; expresar la cadena pesada de inmunoglobulina y la cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada que comprende la sustitución de al menos un aminoácido con una histidina en su dominio variable; y seleccionar un anticuerpo que conserve la unión a antígeno de interés a un pH neutro (por ejemplo, conserve la afinidad deseada al antígeno de interés) mientras presenta una unión reducida al antígeno de interés a un pH ácido. En diversos aspectos, la cadena pesada de inmunoglobulina deriva de un reordenamiento de segmentos génicos variables de cadena pesada humana (segmentos V, D y J humanos).

En un aspecto, el método para generar una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH comprende (1) inmunizar a un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que comprende una secuencia génica de la región variable de cadena ligera humana reordenada única y un repertorio de segmentos génicos variables de la cadena pesada humana no reordenados (segmentos V, D y J) con un antígeno de<interés y que permite a un ratón montar una respuesta inmunitaria a dicho antígeno, (>2<) seleccionar en el animal no>humano, por ejemplo, en el ratón, un anticuerpo que se une al antígenos de interés con una afinidad deseada, (3) aislar, a partir del animal no humano, por ejemplo, a partir del ratón, una secuencia de nucleótidos de una cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo que se une al antígeno de interés con una afinidad deseada, (4) determinar la secuencia de nucleótidos de dicha cadena pesada, (5) modificar una secuencia de nucleótidos de una cadena ligera de inmunoglobulina que contiene la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única<para comprender una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina, (>6<) expresar la>cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo que se une al antígeno de interés con la afinidad deseada y la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la modificación con histidina en una célula, y (7) determinar si el anticuerpo expresado en la célula conserva la unión a antígeno a un pH neutro mientras presenta una unión reducida a un pH ácido. En un aspecto, el anticuerpo expresado en la célula muestra la afinidad deseada al antígeno a pH neutro. En diversos aspectos, la cadena pesada de inmunoglobulina deriva de un reordenamiento de segmentos génicos variables de cadena pesada humana (segmentos V, D y J humanos). En otro aspecto, en el presente documento también se describe un método similar para generar una proteína de unión a antígeno con propiedades de unión dependientes del pH, en donde en lugar de inmunizar a un ratón que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera humana reordenada única, el método comprende inmunizar un ratón que comprende un repertorio limitado de segmentos génicos variables de cadena ligera, por ejemplo, un ratón que comprende no más de dos segmentos del gen Vl humano y una pluralidad, por ejemplo, dos o más, segmentos génicos Jl humanos.

En un aspecto, el ratón que comprende una secuencia génica de la región variable de cadena ligera humana reordenada única es un ratón con cadena ligera universal o con cadena ligera común "ULC" descrito en, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de EE.UU n.° 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0045492, y 2013/0185821. En un aspecto, la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de humana reordenada única se selecciona de una secuencia de Vk1-39Jk5 humano y Vk3- 20Jk1 humano.

En un aspecto, el antígeno de interés se selecciona de un antígeno soluble, un antígeno de superficie celular (por ejemplo, un antígeno tumoral) y un receptor de superficie celular. En un aspecto específico, el receptor de superficie celular es un receptor de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el receptor de inmunoglobulina es un receptor de Fc.

En un aspecto, la afinidad deseada de un anticuerpo para un antígeno expresado como una constante de disociación<(Kd) a un pH neutro es menos de 10>-6<M, por ejemplo, menos de 10>-8<M, por ejemplo, menos de 10>-9<M, por ejemplo, menos de 10>-10<M, por ejemplo, menos de 10>-11<M, por ejemplo, menos de 10>-12<M.>

Tal y como se ha explicado anteriormente, el ratón ULC, en un aspecto, comprende una secuencia génica variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única, y expresa anticuerpos en respuesta al antígeno, donde la afinidad de los anticuerpos al antígeno está mediada principalmente a través de las cadenas pesadas de sus anticuerpos. Estos ratones comprenden un repertorio de segmentos variables de cadena pesada humana (V, D y J), que se reordenan para codificar un dominio variable de cadena pesada humana de un anticuerpo que también comprende la cadena ligera derivada de la secuencia variable de cadena ligera humana reordenada única. En un aspecto, tras la exposición con el antígeno, estos ratones utilizan el repertorio diverso de segmentos variables de cadena pesada humana (V, D y J) para generar un anticuerpo con afinidad y especificidad por el antígeno. Por tanto, tras la reexposición al antígeno, la secuencia de nucleótidos de una cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo generado en los ratones ULC se puede aislar y utilizar para generar una proteína de unión deseada que también comprende una cadena ligera de inmunoglobulina derivada de la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única (por ejemplo, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única con una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina).

En un aspecto de los ratones ULC, el 90-100% de los segmentos génicos Vh no humanos no reordenados se reemplazan con al menos un segmento génico Vh humano no reordenado. En un aspecto específico, todos o sustancialmente todos (por ejemplo, 90-100%) de los segmentos génicos Vh no humanos endógenos se reemplazan con al menos un segmento génico Vh humano no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con al menos 19, al menos 39 o al menos 80 u 81 segmentos del gen V<h>humano no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con al menos 12 segmentos funcionales del gen V<h>humano no reordenado, al menos 25 segmentos funcionales del gen V<h>humano no reordenado, o al menos 43 segmentos funcionales del gen Vh humano no reordenado. En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo de todos los segmentos D<h>y J<h>no humanos con al menos un segmento D<h>humano no reordenado y al menos un segmento J<h>humano no reordenado. En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo de todos los segmentos D<h>y J<h>no humanos por todos los segmentos D<h>humanos no reordenados y todos los segmentos Jh humanos no reordenados. Por tanto, el ratón ULC utiliza un repertorio diverso de segmentos génicos de regiones variables humanas (segmentos V, D y J) para generar un anticuerpo en respuesta al antígeno de interés.

Una vez que se determina la cadena pesada del anticuerpo que se une al antígeno de interés con la afinidad deseada, la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada se aísla y secuencia. La secuencia se clona en un vector para la expresión en células hospedadoras adecuadas, por ejemplo, células eucariotas, por ejemplo, células CHO. En un aspecto, la secuencia de una región constante de cadena pesada humana se clona cadena abajo de la secuencia de la región variable de cadena pesada humana aislada del ratón (por ejemplo, del ratón ULC).

En un aspecto, el método de generar una proteína de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH comprende modificar una secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de inmunoglobulina, en particular la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única, para comprender una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. Se conocen en la técnica diversas técnicas para modificar una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. Además, una secuencia de nucleótidos que comprende la sustitución de histidina deseada puede sintetizarse de novo.

En un aspecto, la sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina comprende una sustitución que da como resultado la expresión de uno, dos, tres, cuatro o más restos de histidina. En un aspecto, la sustitución o las sustituciones dan como resultado la expresión de tres o cuatro restos de histidina. En un aspecto, la sustitución o las sustituciones se encuentran en la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, la sustitución o sustituciones son en el codón de CDR, por ejemplo, CDR1, CDR3 y/o codón de CDR3. En un aspecto, la sustitución o sustituciones son en el codón de CDR3.

En un aspecto, en donde la secuencia del ácido nucleico de la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia del gen V<k>1-39J<k>5, y la sustitución o sustituciones están en el codón de CDR3, la sustitución da como resultado la expresión de una histidina en la posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111, y combinaciones de las mismas. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105, 106, 108 y 111. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105 y 106. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105 y 108. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105 y 111. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 106 y 108. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 106 y 111. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 108 y 111. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105, 106 y 108. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105, 106 y 111. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105, 108 y 111. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 106, 108 y 111. En un aspecto, las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de las regiones CDR3 de Vk1-39Jk5 que comprenden varias sustituciones de histidina se representan en la FIG. 2 e incluido en el listado de secuencias.

En un aspecto, en donde la secuencia del ácido nucleico de la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia del gen Vk3-20Jk1, y la sustitución o sustituciones están en el codón de CDR3, la sustitución da como resultado la expresión de una histidina en la posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109, y combinaciones de las mismas. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105, 106, 107 y 109. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105 y 106. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105 y 107. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105 y 109. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 106 y 107. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 106 y 109. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 107 y 109. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105, 106 y 107. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105, 106 y 109. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 105, 107 y 109. En un aspecto, las sustituciones dan como resultado la expresión de histidinas en las posiciones 106, 107 y 109. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos seleccionadas de las regiones CDR3 de Vk3-20Jk1 que comprenden varias sustituciones de histidina se representan en la FIG. 12 e incluyen en el listado de secuencias.

Una vez que la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina, por ejemplo, el dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana, se modifica para incluir restos de histidina en las posiciones deseadas, la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera se clona en un vector para la expresión en células hospedadoras adecuadas, por ejemplo, células eucariotas, por ejemplo, células CHO. En un aspecto, La secuencia de una región constante de cadena ligera humana se clona cadena abajo de la secuencia de nucleótidos modificada de la región variable humana.

En un aspecto, los vectores que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina humana modificada y la cadena pesada de inmunoglobulina humana seleccionada se expresan conjuntamente en una célula hospedadora adecuada, por ejemplo, células hospedadoras eucariotas, por ejemplo, célula CHO, para generar una proteína de unión a antígeno. Varias células hospedadoras que pueden usarse para la expresión son conocidas en la técnica y se mencionan en esta memoria descriptiva.

Una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, generada en la célula hospedadora puede secretarse en el sobrenadante celular, que se analiza para determinar la expresión y la afinidad por el antígeno original adecuadas a pH neutro. La proteína de unión a antígeno también puede recuperarse del lisado celular o, si está unida a la membrana, liberarse de la membrana usando un detergente adecuado (por ejemplo, Triton-X). Se puede purificar la proteína de unión a antígeno con características deseadas.

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno que comprende modificación o modificaciones con histidina conserva la afinidad por el antígeno que es comparable a la afinidad por el antígeno de la misma proteína de unión a antígeno (original) que no comprende modificaciones con histidina. En un aspecto, la afinidad de la proteína de unión a antígeno modificada con histidina por el antígeno de interés expresada como una constante de disociación (K<d>) a un pH neutro<es menos de 10>-6<M, por ejemplo, menos de 10>-8<M, por ejemplo, menos de 10>-9<M, por ejemplo, menos de 10>-10<M, por ejemplo, menos de 10>-11<M, por ejemplo, menos de 10>-12<M.>

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, que comprende modificaciones con histidina descritas en el presente documento muestra propiedades de unión a antígeno dependientes del pH. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno que comprende modificaciones con histidina posee propiedades dependientes del pH potenciadas sobre una proteína de unión a antígeno equivalente sin las modificaciones con histidina (proteína de unión a antígeno de la misma secuencia de aminoácidos pero para las modificaciones de histidina). En un aspecto, la proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento conserva la unión a antígeno a pH neutro (por ejemplo, conserva la afinidad deseada por el antígeno a pH neutro) mientras presenta una unión reducida a un pH ácido. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, el anticuerpo, descrita en el presente documento, no muestra unión a antígeno en pH ácido, mientras conserva unión a antígeno a pH a neutro. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento, tiene una disminución en la semivida disociativa (t-io) a un pH ácido en comparación con la semivida disociativa (t-io) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces. En<un aspecto, una proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento tiene una t-i>/2<a un pH ácido y 37 °C>de aproximadamente 2 minutos o menos. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno descrita en el presente<documento tiene una t-i>/2<a un pH ácido y 37 °C de menos de aproximadamente 1 minuto. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento tiene una t-i>/2<a un pH ácido y 25 °C de aproximadamente 2 minutos o menos. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento tiene una t-i>/2<a>un pH ácido y 25 °C de menos de aproximadamente 1 minuto.

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno puede(por ejemplo, el anticuerpo, que comprende modificaciones con histidina descritas en el presente documento, muestra una semivida en suero aumentada tras la administración de una dosis terapéutica a un sujeto en comparación con una semivida en suero tras la administración de una dosis terapéutica equivalente de proteína de unión a antígeno que no comprende modificaciones con histidina (por ejemplo, la proteína de unión a antígeno original que no comprende modificaciones con histidina). En algunos aspectos, el aumento en la semivida en suero tras la administración de una dosis de la proteína de unión a antígeno que comprende modificaciones con histidina descritas en el presente documento durante una semivida en suero tras la administración de la misma dosis de la proteína de unión a antígeno que no comprende modificaciones de histidina es aproximadamente 2 veces, por ejemplo, aproximadamente 5 veces, por ejemplo, aproximadamente 10 veces, por ejemplo, aproximadamente 15 veces, por ejemplo, aproximadamente 20 veces o más. En un aspecto, la semivida en<suero es de al menos aproximadamente>1<día, por ejemplo, al menos aproximadamente>2<días, por ejemplo, al menos>aproximadamente 7 días, por ejemplo, al menos aproximadamente 14 días, por ejemplo, al menos aproximadamente 30 días, por ejemplo, al menos aproximadamente 60 días.

Además de los métodosin vitropara generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH descritas anteriormente, también se describen en el presente documento proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, generadas por dicho método. Además, dicho método puede utilizarse para generar proteínas de unión a antígeno multiespecíficas, por ejemplo, biespecíficas, seleccionando dos cadenas pesadas de inmunoglobulina humana diferentes que se unen a una cadena ligera común (universal) en un ratón, determinando secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas, modificando la cadena ligera universal para que comprenda las sustituciones de histidina como se describe anteriormente y expresando dos cadenas pesadas humanas con una cadena ligera universal modificada con histidina única en una célula hospedadora. Varias etapas para generar una proteína de unión a antígeno descrita anteriormente pueden ser aplicables al método de generación de una proteína de unión a antígeno biespecífica. Se puede purificar la proteína de unión a antígeno biespecífica, confirmada que posee afinidad deseada para el(los) antígeno(s) y las propiedades de unión a antígeno dependientes del pH. Por tanto, se describen anticuerpos biespecíficos que comprenden dos cadenas pesadas humanas y una única cadena ligera humana que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera humana codificada por un gen de región variable humana, por ejemplo, gen de región variable V<k>1-39J<k>5 o V<k>3-20J<k>1 que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina.

También se describen en el presente documento, en algunos aspectos, métodos para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión dependientes del pH utilizando cadenas ligeras, por ejemplo, cadenas ligeras específicas de antígeno, generadas en ratones de cadena ligera doble; así como proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, generados por dichos métodos. Tales métodos y anticuerpos generados por dichos métodos serían evidentes a partir de la presente memoria descriptiva.

También se describen construcciones utilizadas en la producción de una proteína de unión a antígeno que comprende cadena pesada de inmunoglobulina humana y cadena ligera de inmunoglobulina humana que comprenden sustituciones de histidina. También se describen en el presente documento células hospedadoras que expresan proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la materia cómo hacer y usar los métodos y composiciones descritos en el presente documento, y no pretenden limitar el alcance de lo que los presentes inventores consideran su invención. Se ha intentado garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de métodos convencionales que serían bien conocidos para los expertos en la materia (técnicas de clonación molecular, etc.). A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura se indica en grados Celsius, y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.

Ejemplo 1. Identificación de Restos de Histidina en Cadenas Ligeras Humanas Específicas de Antígeno

La generación de un ratón de cadena ligera común (por ejemplo, ratón de cadena ligera común V<k>1-39 o V<k>3-20) y anticuerpos específicos de antígeno en esos ratones se describe en, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de Estados Unidos N.° 13/022.759, 13/093.156 y 13/412.936 (Publicación Nos. 2011/0195454, 2012/0021409 y 2012/0192300, respectivamente). En resumen, el vector de direccionamiento de cadena ligera de la línea germinal humana se realizó utilizando la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6): 652-659) para modificar los clones del Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) del genoma del ratón, y las construcciones genómicas se diseñaron genéticamente para contener una región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada única y se insertaron en un locus de cadena ligera k endógeno que se modificó previamente para eliminar la variable k endógena y los segmentos génicos que se unen. Después se usó ADN de BAC dirigido para someter a electroporación células ES de ratón para crear células ES modificadas para generar ratones quiméricos que expresan una región V<k>1-39J<k>5 o V<k>3-20J<k>1 de la línea germinal humana reordenada. Las células ES dirigidas se utilizaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase<de>8<células mediante el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 7.294.754 y>Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor genetargeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1): 91-99). VELOCIMICE® que lleva independientemente una región de cadena ligera humana diseñada genéticamente de V<k>1-39J<k>5 o V<k>3-20J<k>1 se identificó mediante tipificación génica utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuelaet al., Supra)que detecta la presencia de la región de cadena ligera de la línea germinal humana única reordenada.

Los ratones que soportan un locus de cadena ligera de la línea germinal humana diseñado genéticamente (ratones ULC) se cruzaron con ratones que contienen un reemplazo del locus del gen variable de cadena pesada de ratón endógeno con el locus del gen variable de cadena pesada humana (véase el documento US 6,596,541; the VELOCIMMUNE® mouse, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). El ratón VELOCIMMUNE® que contiene una región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada única se expone con un antígeno de interés y se aíslan y secuencian los anticuerpos que comprenden una cadena ligera universal (por ejemplo, V<k>1-39J<k>5).

Se alinearon las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras seleccionadas (A-K, correspondientes a las SEQ ID NO: 136-146, respectivamente) que contenían V<k>1-39 de anticuerpos humanos específicos de antígeno. Se identificaron mutaciones de histidina en las CDR de cadenas ligeras derivadas de V<k>1-39 humano para un número seleccionado de anticuerpos humanos específicos de antígeno (Figura 1). La secuencia de aminoácidos de la línea germinal V<k>1-39 se muestra sobre las alineaciones y se expone en la SEQ ID NO: 1, la secuencia completa de aminoácidos del dominio variable para V<k>1-39J<k>5 se expone en la SEQ ID NO:80.

Ejemplo 2. Diseño y Caracterización de Anticuerpos de Cadena Ligera Universal Humana Sustituida con Histidina

Ejemplo 2.1. Diseño de Restos de Histidina en una Cadena Ligera Reordenada Humana de la Línea Germinal

Los restos de histidina se diseñaron genéticamente en una cadena ligera de Vk1-39Jk5 humano reordenada utilizando cebadores de mutagénesis dirigida al sitio específicamente diseñados genéticamente para introducir restos de histidina diseñados en las posiciones Q105, Q106, Y108 y P111 de la cadena ligera de V<k>1-39J<k>5 humano. La mutagénesis dirigida al sitio se realizó utilizando técnicas moleculares conocidas en la técnica (por ejemplo, el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL, Agilent Technologies). Las localizaciones de los restos de diseñados genéticamente en la CDR3 se muestran en la FIG. 2, las secuencias de ácidos nucleicos de las CDR3 sustituidas con histidina<representadas en la FIG. 2 se exponen en las SEQ ID NO: 4,>6<,>8<, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 (las>secuencias de aminoácidos correspondientes se exponen en las SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31 y 33). Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de CDR3 de V<k>1-39J<k>5 reordenadas de la línea germinal se exponen en las SEQ ID NO: 2 y 3, respectivamente.

Ejemplo 2.2. Construcción y Expresión de Cadenas Ligeras de Diseñadas Genéticamente con Histidina

Se construyeron cadenas ligeras derivadas de V<k>1-39 humano que contenían restos de histidina diseñados genéticamente en la línea germinal producidos de acuerdo con el Ejemplo 2 y se emparejaron con varias cadenas pesadas humanas (marcadas 1-5), específicas para un receptor de superficie celular humano, para analizar la expresión en células CHO. Las cinco cadenas pesadas humanas específicas para un receptor de superficie celular humano que se emparejaron con cadenas ligeras derivadas de V<k>1-39 sustituidas con histidina se obtuvieron de ratones que tienen una cadena ligera humana reordenada única (una cadena ligera reordenada de V<k>1-39/J<k>5 humano; véase el documento US2011/0195454A1).

Ensayo de Imunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA):La secreción de anticuerpos a partir de las células CHO se detectó utilizando un ELISA de Fc, para cadenas ligeras con modificaciones de histidina indicadas con cinco cadenas pesadas diferentes. Las secuencias de cadena ligera y pesada (pero para las modificaciones) se generaron en ratones que tienen una cadena ligera humana reordenada única (por ejemplo, una cadena ligera reordenada de Vk1-39/Jk5 humano; véase el documento US2011/0195454A1). El anticuerpo de captura fue anti IgG humana de cabra y el anticuerpo de detección fue anti HRP (Fc gamma-específico) humano de cabra. Los resultados se muestran en la figura 3. ULC pesada: cadena pesada específica y cadena ligera derivada de Vk1-39 humano no modificada. Como se muestra en la Figura 3, se detectó la expresión en todos los mutantes.

Inmunotransferencia de Proteínas.La expresión en sobrenadantes de células CHO de cadenas pesadas específicas de antígeno emparejadas con cadenas ligeras diseñadas genéticamente con histidina se analizó adicionalmente mediante transferencia Western. Las muestras se ejecutaron en un gel de tris-glicina al 4-12%. Los resultados que utilizan una cadena pesada seleccionada (cadena pesada 3) se muestran en la FIG. 4. ULC se refiere a una cadena ligera derivada de V<k>1-39 humano reordenada (como se describe anteriormente).

Ejemplo 2.3. Determinación de la Afinidad de Unión de las Cadenas Ligeras Diseñadas Genéticamente con Histidina

Las constantes de disociación de equilibrio (K<d>), las semividas disociativas (t) y otros parámetros cinéticos para los sobrenadantes de anticuerpos seleccionados se determinaron mediante SPR (Resonancia de Plasmón de Superficie) utilizando un instrumento BIACORE™ T200 (GE Healthcare). Las cinéticas se midieron a pH 7,4 y a pH 5,75. Los resultados se muestran en las FIG. 5A - 5E.

Los valores numéricos para las propiedades de unión cinética (por ejemplo,ka, kd, Kd ,t<- i/2>, etc.) de anticuerpos que se unen a inmunógeno a pH neutro (pH 7,4) y a pH ácido (pH 5,75) se obtuvieron utilizando un biosensor de resonancia de plasmón de superficie en tiempo real (Biacore T200). Un chip sensor Biacore CM5 se derivatizó con un anticuerpo anti Fc humano de ratón para capturar los anticuerpos del sobrenadante. Después se inyectó una concentración única (50 nM) de inmunógeno sobre la superficie capturada por el anticuerpo a un caudal de 30 pl/min. La asociación anticuerpo-antígeno se controló durante 2,5 minutos y después la disociación del antígeno del anticuerpo capturado<se controló durante>8<minutos. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a una unión>1:1<con un modelo de transporte de masa utilizando el>software de evaluación Biacore T200 versión 1.0. Las constantes de disociación (KD) y las semividas disociativas (t)<en equilibrio se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd (M) = kd/ka ; y ty>2<(min) =>(ln2/(60*k<d>).

Como se muestra en la Figura 5, en un ensayo de unión de anticuerpo a un receptor de la superficie celular, dos de cada cinco anticuerpos con cadenas ligeras comunes modificadas con histidina (CDR3 modificadas con histidina de cadenas ligeras de Vk1-39/Jk5) que se emparejaron con las cadenas pesadas humanas específicas del antígeno, mostraron unión a antígeno (por ejemplo, a un receptor de superficie celular) con diferentes afinidades a pH 7,4 y pH 5,75. Son deseables anticuerpos con modificaciones con histidina que conservan la unión a pH 7.4, pero que muestran una unión baja o no detectable a pH 5,75. Son deseables anticuerpos con modificaciones con histidina que muestran treducida a pH 5,75 en comparación con pH 7,4.

Los datos de unión a antígeno para tres anticuerpos que comprenden cadenas ligeras comunes modificadas con<histidina y tres cadenas pesadas específicas del antígeno (marcadas como 2, 3 y>6<) a diferentes pH se resumen en la FIG.>6<. Estos anticuerpos mostraron una caída significativa en la unión a antígeno a pH 5,75 en comparación con el>pH 7,4, como se demostró, por ejemplo, por la reducción en to al no detectarse unión a pH 5,75.

Ejemplo 3. Diseño y Caracterización de Ratones Genéticamente Modificados que Comprenden una Cadena Ligera Universal de Vk1-39Jk5 Humano Sustituida con Histidina

Ejemplo 3.1. Construcción del Vector de Direccionamiento para el Diseño de Restos de Histidina en una Región Variable de Cadena Ligera Humana Reordenada

Se produce un ratón genéticamente modificado que contiene un gen de cadena ligera humana reordenada que tiene restos de histidina diseñados genéticamente en una región CDR de la cadena ligera humana utilizando vectores de direccionamiento producidos mediante técnicas estándar de clonación molecular conocidas en la técnica.

En resumen, varios vectores de direccionamiento de la cadena ligera de la línea germinal humana se hacen usando la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.

<21 (>6<): 652-659) para modificar el ADN del Cromosoma Artificial Bacteriano (bAc ) genómico de ratón para que>contenga una región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada única e insertada en un locus de cadena ligera k endógeno que se modificó previamente para eliminar la variable k endógena y segmentos genéticos de unión. La región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada se modifica en una o más posiciones de nucleótidos dentro de la secuencia de la cadena ligera para codificar los restos de histidina que normalmente no están presentes en las ubicaciones respectivas de la secuencia de la línea germinal. Los vectores de direccionamiento se someten a electroporación en células madre embrionarias (ES) de ratón y se confirman mediante un ensayo de PCR cuantitativa (por ejemplo, TAQMAN ™).

<Específicamente, se muestra una estrategia para construir estos vectores de direccionamiento en las Figs.>8<A ->8<F.>Un plásmido utilizado para generar un vector de direccionamiento para un ratón de cadena ligera (universal) ("ratón U<l>C", descrito en, por ejemplo, el documento US2011/0195454A1), que contiene pBS FRT-Ub-Hyg-FRT líder de V<k>3-7 de ratón+ V<k>1-39J<k>5 humano se modificó por mutagénesis dirigida al sitio (kit QuickChange II XL) para reemplazar Q105, Q106, Y108 y P111 o Q106, y 108 y P111 con restos de histidina en la región CDR3 usando<cebadores de mutagénesis dirigida al sitio mostrados en la FIG. 7 (Véase la FIG.>8<A para esta etapa de diseño). Los>vectores resultantes (H105/106/108/111 y H106/108/111) se modificaron adicionalmente y se unieron en un vector que comprende la región constante de IgK de ratón, potenciadores de ratón, un brazo de homología de ratón 3 ' y un<casete SPEC (Figura>8<B). La modificación adicional implicó la unión en un vector que porta el brazo 5 ' de ratón y que comprende un casete Frt-Ub-NEO-Frt (Figura>8<B). Los vectores de direccionamiento resultantes se sometieron a>electroporación en células ES que comprendían la eliminación del locus variable de IgK de ratón (que comprendía k<variables y segmentos génicos de unión) (las Figs.>8<C->8<F).>

Los clones de células ES positivas se confirmaron utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al.) utilizando sondas específicas para la región de la cadena ligera de V<k>1-39J<k>5 diseñada genéticamente en el locus endógeno de la cadena ligera k. Los cebadores y las sondas utilizadas en el ensayo se muestran en la Tabla 1 a<continuación y se exponen en el Listado de Secuencias; las localizaciones de las sondas se muestran en las Figs.>8<C->8<F.>

T l 1: r n iliz r l Ex l r i n l l E

El casete de selección NEO introducido por las construcciones de direccionamiento se eliminó mediante la transfección<de células ES con un plásmido que expresa FLP (Figs.>8<C y>8<E). Opcionalmente, el casete de neomicina puede>eliminarse cruzando con ratones que expresan FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina se conserva en los ratones.

Las células ES dirigidas anteriormente descritas se utilizaron como células ES donantes y se introdujeron en un<embrión de ratón en la fase de>8<células mediante el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de los>EE.UU. n.° 7.294.754 y Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor genetargeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25 (1):91-99. VELOCIMICE® que lleva independientemente un gen de cadena ligera humana diseñado genéticamente que contiene restos de histidina mutados en una o más posiciones a lo largo de la secuencia se produjo a partir de las células ES dirigidas descritas anteriormente.

Las crías se genotipificaron y las crías heterocigotas para la cadena ligera humana modificada con histidina diseñada genéticamente se seleccionaron para caracterizar la expresión de la cadena ligera y las capacidades de unión de los anticuerpos expresados. Los cebadores y las sondas para la genotipificación de ratones que comprenden específicamente un gen de cadena ligera universal con tres (H106/108/111; "1930") o cuatro (H105/105/108/111; "1927") modificaciones con histidina se enumeran en la Tabla 2 a continuación y se expone en el Listado de Secuencias. Los ratones que contienen modificación con histidina en sus cadenas ligeras universales se denominan en el presente documento ratones "HULC" (ratones de cadena ligera universales de histidina).

T l 2: r n iliz r l n i ifi i n

Ejemplo 3.2. Análisis de la Respuesta Inmunitaria al Antígeno en Ratones con Cadenas Ligeras Universales Sustituidas con Histidina Humanas

El receptor de la superficie celular ("Antígeno A") se usó como inmunógeno para inmunizar ratones que eran heterocigotos para la expresión de una cadena ligera kappa humana preestablecida utilizando V<k>1-39 y J<k>5 que tiene 4 sustituciones de histidina en CDR3 (en adelante en el presente documento "HULC 1927 ") o heterocigotos para la expresión de una cadena ligera kappa humana preestablecida utilizando V<k>1-39 y J<k>5 que tiene 3 sustituciones de histidina en CDR3 (en adelante en el presente documento " HULC1930 "), o ratones de TS homocigotos. El suero preinmunitario se recogió de los ratones antes del inicio de la inmunización. El inmunógeno se administró a 2,35 ^g de proteína para la inmunización de cebado inicial mezclada con 10 ^g de oligonucleótido CpG como adyuvante (Invivogen) en un volumen de 25 ^l a través de la almohadilla plantar (f.p.). Posteriormente, los ratones fueron reforzados por la misma vía con 2,35 ^g de Antígeno A junto con 10 ^g de CpG y 25 ^g de Adju-Phos (Brenntag)<como adyuvantes en los días 3,>6<, 11, 13, 17, 20 para un total de>6<refuerzos. Los ratones se sangraron los días 15 y 22 después del 4° y>6<° refuerzo, respectivamente. Su antisuero se analizó para determinar los títulos de anticuerpos>frente al antígeno A.

Los títulos séricos de anticuerpos contra el inmunógeno se determinaron mediante un ELISA convencional. Para realizar el ELISA, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (Thermo Scientific) a 2 ^g/ml con Antígeno A en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Irvine Scientific) durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05% (PBS-T, Sigma-Aldrich) cuatro veces usando un lavador de placas (Molecular Devices). Las placas se bloquearon después con 250 ^l de albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA, Sigma-Aldrich) en PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después cuatro veces con PBS-T. Los sueros de ratones inmunizados y los sueros preinmunitarios se diluyeron en serie tres veces en BSA-PBS al 0,5% comenzando a 1:300 o 1:1000, se agregaron a las placas bloqueadas por duplicado y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los dos últimos pocillos se dejaron en blanco para utilizarlos como control de anticuerpos secundarios (control de fondo). Las placas se lavaron de nuevo cuatro veces con PBS-T en un lavador de placas. El anticuerpo secundario conjugado anti IgG de ratón de cabra-Fc de Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) (Jackson Immunoresearch) se añadió después a las placas a una dilución 1:5000/1:10.000 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después ocho<veces con PBS-T y se desarrollaron utilizando TMB/H>2<O>2<como sustrato. El sustrato se incubó durante 20 minutos y la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2 N (H>2<SO4, VWR, n° de cat. BDH3500-1) o ácido fosfórico 1 N (JT Baker, n°>de cat. 7664-38-2). Las placas se leyeron en un espectrofotómetro (Victor, Perkin Elmer) a 450 nm. Los títulos de anticuerpos se estimaron utilizando el software Graphpad PRISM.

La respuesta inmunitaria inducida en ratones al inmunógeno inyectado se representa como títulos de anticuerpos, que se define como el recíproco de la dilución más alta del suero a la que la absorbancia de unión a antígeno es dos veces mayor que en el fondo. Por tanto, cuanto mayor sea el número, mayor será la respuesta inmunitaria humoral al inmunógeno. Los títulos de anticuerpos inducidos al inmunógeno fueron muy altos en ambas cepas de ratones HULC y en ratones de TS, sin que se observaran diferencias significativas entre las cepas (Figura 9).

Ejemplo 3.3. Generación de Anticuerpos Monoclonales Sensibles al pH

Cuando se logró una respuesta inmunitaria al inmunógeno deseada en ambas cepas de ratones HULC y en ratones de TS, se recolectaron esplenocitos de cada cepa de ratón y se fusionaron con células de mieloma de ratón para generar células de hibridoma, que se dejaron crecer en placas de 96 pocillos. Después de 10 días de crecimiento, los sobrenadantes de cada pocillo que contenía células de hibridoma se seleccionaron mediante ELISA específico de inmunógeno para identificar muestras de unión a antígeno positivas. Para el ELISA, las placas de microtitulación de 96 pocillos se recubrieron con 1 ug/ml de un anticuerpo policlonal anti myc (Novus Biologicals, número NB600-34) durante la noche a 4 °C para inmovilizar el antígeno marcado con myc, seguido de un bloqueo con una solución de BSA al 0,5% (p/v) en PBS. Se lavaron las placas, las soluciones de antígeno se agregaron a las placas a una<concentración de>1<pg/ml y se dejaron unir a la placa recubierta durante>1<hora a temperatura ambiente.>Posteriormente, se añadieron sobrenadantes de células de hibridoma a los pocillos a una dilución de 1:50 y se dejaron unir durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos unidos a la placa se detectaron utilizando un anticuerpo policlonal anti IgG de ratón conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch, número 115-035-164). Se agregaron sustratos TMB a las placas (BD Biosciences, número 51-2606KC/51-2607KC) y se desarrollaron señales colorimétricas de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. La absorbancia se registró a 450 nm en un lector de placas Victor Wallac. Las muestras de antígeno positivo definidas como que tienen una DO igual o mayor que 0,5 (con un valor inicial que tiene una DO de aproximadamente 0,1) se sometieron a un análisis de afinidad utilizando un biosensor de resonancia de plasmón de superficie en tiempo real (Biacore 4000).

<Se registraron los parámetros de unión cinética (por ejemplo, ka, kd, Kd , t-i>/2<, etc.) para determinar la unión del anticuerpo>al inmunógeno a pH neutro (pH 7,4) y a pH ácido (pH 6,0). Un chip sensor Biacore CM4 se derivatizó con un anticuerpo policlonal de cabra anti Fc de ratón para capturar anticuerpos del sobrenadante. Después se inyectó una concentración única (100 nM) de inmunógeno sobre la superficie capturada por el anticuerpo a un caudal de 30 pl/min. La asociación anticuerpo-antígeno se controló durante 1,5 minutos y después la disociación del antígeno del anticuerpo capturado se controló durante 2,5 minutos. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se<determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión>1:1<con un modelo de transporte masivo>utilizando el software de evaluación Biacore 4000 versión 1.0. Las constantes de disociación (Kd) y las semividas disociativas (t-io) en equilibrio se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd (M) =kd/k¿y t1^ (min) = ln2/(60*kd). Se seleccionó un conjunto de muestras que presentaban una disminución de la unión a pH 6,0 en comparación con la del pH 7,4 (sensible al pH), así como un conjunto de muestras de control que no presentaban cambios significativos en la tasa entre el pH 7,4 y el pH 6,0 (controles insensibles al pH) para producirse clonalmente. La FIG. 10 representa la comparación del número de antígeno positivos totales y el número de antígeno positivos que presentan unión a antígeno sensible al pH de ratones HULC y de TS.

Entre los antígenos positivos, se hicieron monoclonales 18 y 7 clones aislados de dos ratones HULC1927 heterocigotos y dos HULC1930 respectivamente, y 1 clon del ratón de TS. Los sobrenadantes de los hibridomas monoclonales se sometieron a un análisis de tasa de disociación (constante de disociación) del antígeno a pH neutro y bajo y los sedimentos celulares se usaron para la secuenciación del ADN del dominio variable de cadena ligera.

Ejemplo 3.4. Secuenciación e Hipermutaciones Somáticas en la Región CDR3 de Ratones de Cadena Ligera Universal de Histidina Basados en VKl-39jK5 Humano

Los sedimentos celulares de hibridomas monoclonales de ratones HULC y de TS se usaron para la secuenciación del ADN del dominio variable de cadena ligera. De los 26 clones hechos monoclonales (véase el Ejemplo 3.3 más arriba) y sometidos a secuenciación, se confirmó que 15 usaban una cadena ligera de ratón HULC o de TS (MM y NN, véase la Tabla 4). 14 clones derivaron de ratones HULC heterocigotos (ratones 1927 o 1930) y 1 derivó de un ratón de TS (OO, véase la Tabla 4).

De las 14 muestras positivas para el antígeno derivadas de ratones HULC heterocigotos, 12 de los anticuerpos monoclonales utilizaron su correspondiente cadena ligera HULC, mientras que 2 utilizaron una cadena ligera de ratón de TS. Todos menos uno de los HULC que utilizan anticuerpos conservaron todas las mutaciones de histidina introducidas como se muestra en la Tabla 3 (anticuerpo en cursiva). La secuenciación del clon AA produjo 2 secuencias HULC diferentes, que se reflejan en dos entradas en la Tabla 3.

Tabla 3: Número de inserciones de histidina conservadas e hipermutaciones somáticas en secuencias de cadenas ligeras de clones que utilizan cadena ligera HULC

Ejemplo 3.5. Unión dependiente del pH de Anticuerpos Monoclonales Generados en Ratones de Cadena Ligera Universal de Histidina basada en Vk1-39Jk5 Humano

Con el fin de evaluar adicionalmente las características de unión dependientes del pH de los anticuerpos monoclonales aislados de ratones HULC y de TS, se llevaron a cabo experimentos de unión en los que la fase de asociación anticuerpo/antígeno se observó a pH neutro y la fase de disociación anticuerpo/antígeno se observó a pH neutro o ácido.

Un chip sensor Biacore CM4 se derivatizó con un anticuerpo policlonal de conejo anti Fc de ratón. Los sobrenadantes de anticuerpos monoclonales se capturaron sobre la superficie del sensor anti Fc de ratón. Se inyectaron dos concentraciones, 50 nM (por duplicado) y 16,7 nM, del inmunógeno sobre la superficie capturada con el anticuerpo monoclonal a un caudal de 30 pl/min. La asociación de anticuerpo-antígeno se controló a pH 7,4 durante 4 minutos y después la disociación del antígeno del anticuerpo monoclonal capturado se monitorizó durante 15 minutos a pH 7,4 o 6,0. Las constantes de velocidad de disociación (kd) se determinaron procesando y ajustando los datos utilizando el software de ajuste de curvas Scrubber versión 2.0 y se muestran en la Tabla 4. Las semividas disociativas (t-io) se<calcularon a partir de la constante de velocidad de disociación: t-i>/2<(min) = (In2/kd)/60, y se muestran en la Tabla 4. Los>diagramas de sensibilidad que representan las características de asociación/disociación de varios anticuerpos enumerados en la Tabla 4 en las diferentes condiciones de pH se muestran gráficamente en la Figura 11. Las líneas individuales en cada gráfico representan las respuestas de unión a diferentes concentraciones de los respectivos anticuerpos. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C. Los valores de semivida disociativa (t-io) se indican sobre los respectivos sensogramas. La respuesta se mide en UR.

Ejemplo 4. Diseño de un Ratón Modificado Genéticamente que Comprende una Cadena Ligera Universal de Vk3-20Jk1 humano Sustituida con Histidina

Se generó un ratón que comprende una cadena ligera Vk3-20Jk1 común como se describe en, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de EE. UU. Números 13/022.759, 13/093.156, 13/412.936 y 13/488.628 (Publicación Nos.

2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 y 2013/0045492, respectivamente), y en el Ejemplo 1 anterior. La secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera Vk3-20Jk1 de la línea germinal se muestra en la SEQ ID NO: 59.

Se introdujeron sustituciones de histidina en el vector de direccionamiento de la cadena ligera universal V<k>3-20J<k>1 y se generaron ratones a partir del mismo utilizando una estrategia similar a la descrita anteriormente en el Ejemplo 3 para ratones de cadena ligera universal modificada con histidina Vk1-39Jk5 (HULC 1927 y 1930).

En resumen, la estrategia para generar un vector de direccionamiento de cadena ligera universal Vk3-20Jk1 modificada con histidina se resume en las FIGS. 14A-14D. Un plásmido utilizado para generar un vector de direccionamiento para un ratón de cadena ligera (universal) ("ratón ULC", descrito en, por ejemplo, el documento US2011/0195454A1), que contiene pBS FRT-Ub-Hyg-FRT líder de V<k>3-7 de ratón+ V<k>3-20J<k>1 humano fue modificado por mutagénesis dirigida al sitio (Kit QuickChange Lightning) para reemplazar Q105, Q106, Y107 y S109 o Q105, Q106 y S109 (véase alineación en la FIG. 12) con restos de histidina en la región CDR3 usando los cebadores de mutagénesis dirigida al sitio mostrados en la FIG. 13 (véase la FIG. 14A para esta etapa de diseño). Los vectores resultantes (H105/106/107/109 y H105/106/109) se modificaron adicionalmente y se unieron en un vector que comprendía la región constante de IgK de ratón, potenciadores de ratón, un brazo de homología de ratón 3 ' y un casete SPEC (Figura 14B). La modificación adicional implicó la unión en un vector que porta el brazo 5' de ratón y que comprende un casete Frt-UB-NEO-Frt (figura 14B). Los vectores de direccionamiento resultantes se sometieron a electroporación en células ES que comprendían la eliminación del locus variable de IgK de ratón (que comprendía k variables y segmentos génicos de unión) (las Figs. 14C-14D).

Los clones de células ES positivas se confirmaron utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al.) utilizando sondas específicas para la región de la cadena ligera de Vk3-20kJ1 diseñada genéticamente en el locus endógeno de la cadena ligera k. Los cebadores y las sondas utilizados en el ensayo se muestran en la Tabla 5 a continuación y se exponen en el Listado de secuencias; las localizaciones de las sondas se muestran en las Figs.

14C-14D.

Tabla 5: Cebadores Sondas Utilizados ara la Ex loración de Células ES

El casete de selección NEO introducido por las construcciones de direccionamiento se elimina mediante la transfección de células ES con un plásmido que expresa FLP (Figs. 14C y 14D). Opcionalmente, el casete de neomicina puede eliminarse cruzando con ratones que expresan FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina se conserva en los ratones.

Las células ES dirigidas anteriormente descritas se utilizan como células ES donantes y se introdujeron en un embrión<de ratón en la fase de>8<células mediante el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU.>n.° 7.294.754 y Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor genetargeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE®, que lleva independientemente un gen de cadena ligera humana diseñado genéticamente que contiene restos de histidina mutados en una o más posiciones a lo largo de la secuencia, se realiza a partir de las células ES dirigidas descritas anteriormente.

Los cachorros son genotipificados y los cachorros heterocigotos para la cadena ligera humana modificada con histidina diseñada genéticamente se seleccionan para caracterizar la expresión de la cadena ligera y las capacidades de unión de los anticuerpos expresados. Los cebadores y las sondas para la genotipificación de ratones que comprenden específicamente un gen de cadena ligera universal con tres (H105/106/109; "6183") o cuatro (H105/105/108/111;<"6181") modificaciones de histidina se enumeran en la Tabla>6<a continuación y se establecen en el Listado de>secuencias. Los ratones que contienen modificación con histidina en sus cadenas ligeras universales se denominan en el presente documento ratones "HULC" (ratones de cadena ligera universales de histidina).

T l : r n iliz r l n i ifi i n

Los ratones se inmunizan con un antígeno de interés y se analiza su capacidad para generar anticuerpos con uniones dependientes del pH.

Ejemplo 5. Cría de Ratones que Comprenden Cadenas Ligeras Universales Humanas (HULC) Sustituidas con Histidina

Este ejemplo describe varias otras cepas de ratones modificadas genéticamente que pueden reproducirse con cualquiera de los ratones HULC humanos descritos en el presente documento para crear múltiples cepas de ratones modificados genéticamente que albergan múltiples loci de inmunoglobulinas modificados genéticamente.

Ratón nuligénico (KO, por sus sigals en inglés) para igA Endógena.Para optimizar el uso del locus de cadena ligera diseñada genéticamente, cualquiera de los animales HULC descritos anteriormente (p. ej., que comprenden cadena ligera universal sustituida con histidina Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1) puede reproducirse con otro ratón que contenga una deleción en el locus de cadena ligera A endógeno. De esta manera, la progenie obtenida expresará, como su única cadena ligera, la región de cadena ligera de la línea germinal humana sustituida con histidina reordenada como se describe en los Ejemplos 3 y 4 anteriores. El cruce se realiza mediante técnicas convencionales reconocidas en la técnica y, como alternativa, por un criador comercial (por ejemplo, The Jackson Laboratory). Las cepas de ratón que llevan un locus de cadena ligera sustituida con histidina diseñado genéticamente y una eliminación del locus de la cadena ligera A endógena se analizan para detectar la presencia de la región de cadena ligera única y la ausencia de cadenas ligeras A de ratón endógenas.

Locus de Cadena Pesada Endógena Humanizada.Los ratones que soportan un locus de cadena ligera de la línea germinal humana diseñado genéticamente (ratones HULC) se cruzan con ratones que contienen un reemplazo del locus del gen variable de cadena pesada de ratón endógeno con el locus del gen variable de la cadena pesada humana (véanse los documentos US 6.596.541 y US 8.502.018; the VELOCIMMUNE® mouse, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). El ratón VELOCIMMUNE® comprende un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada humana unidas operativamente a loci de región constante endógena de ratón, de modo que el ratón produce anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena pesada humana y una región constante de cadena pesada de ratón en respuesta a la estimulación antigénica.

Se obtienen ratones que soportan una sustitución del locus de la región variable de cadena pesada del ratón endógeno con el locus de la región variable de cadena pesada humana y una región variable de cadena ligera humana reordenada única sustituida con histidina en el locus de la cadena ligera k endógeno. Los anticuerpos quiméricos inversos que contienen cadenas pesadas somáticamente mutadas (dominio variable de cadena pesada humana y C<h>de ratón) con una cadena ligera humana única sustituida con histidina (HULC, dominio variable de cadena ligera humana y Cl de ratón) se obtienen tras la inmunización con un antígeno de interés. Los anticuerpos humanos dependientes del pH generados en tales ratones se identifican utilizando métodos de aislamiento y análisis de anticuerpos conocidos en la técnica o descritos anteriormente. Se identifican secuencias de nucleótidos de la región de cadena ligera y pesada variables de linfocitos B que expresan los anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos sensibles al pH, y se producen anticuerpos completamente humanos mediante la fusión de las secuencias de nucleótidos de la región de cadena ligera y pesada variables a secuencias de nucleótidos Ch y Cl humanas, por ejemplo, respectivamente, en un sistema de expresión adecuado.

Ejemplo 6: Unión Dependiente del pH de Anticuerpos Generados en Ratones que Comprenden Cadenas Ligeras Universales Humanas (HULC) Sustituidas con Histidina y Dominios Variables de Cadena Pesada Humana

Ratones que soportan ULC de Vk1-39/Jk5 (1633) o Vk1-39/Jk5 diseñados genéticamente que comprendían 4 sustituciones de histidina (HULC 1927) o 3 sustituciones de histidina (HULC 1930) se cruzaron con ratones que comprendían un reemplazo del locus de la región variable de cadena pesada de ratón endógeno con el locus de la región variable humana (véanse los documentos US 6.596.541 y US 8.502.018, the VELOCIMMUNE® mouse, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). Se obtuvieron ratones homocigotos tanto para el locus de la región variable de cadena pesada humana como para ULC diseñada genéticamente (marcados como "ULC 1633ho/human heavy ho"), Y<k>1-39/J<k>5 que comprende 4 sustituciones de histidina (marcados como "HULC 1927ho/human heavy ho"), o Y<k>1-39/Jk5 que comprende 3 sustituciones de histidina (marcados como "HULC 1930ho/pesada humana ho").

Posteriormente, los ratones diseñados genéticamente homocigotos para modificaciones tanto en los loci de cadena ligera como de pesada descritos anteriormente se utilizaron para la inmunización con el receptor de citoquinas ("Antígeno B"). Se utilizaron tres ratones ULC 1633ho/cruzando con ratones, siete HULC 1927ho/cruzando con ratones y seis HULC 1930ho/cruzando con ratones para la inmunización.

Los ratones se sacrificaron y se recogieron los esplenocitos. Los glóbulos rojos se eliminaron mediante lisis, seguida de la sedimentación de los esplenocitos recogidos. Los esplenocitos resuspendidos se incubaron con un cóctel de reactivos que pueden permitir la identificación y el aislamiento de linfocitos B antígeno positivos. Se analizaron las células mediante citometría de flujo. Cada linfocito B IgG positivo, IgM negativo y antígeno positivo se clasificó y se sembró en placas en un pocillo separado sobre una placa de 384 pocillos. Los linfocitos B individuales se sometieron a PCR para amplificar los dominios variables de cadena pesada y ligera específicos de antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y ligera amplificados se clonaron en vectores de anticuerpos que contenían la región constante de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera de IgG 1 humana, respectivamente. Los plásmidos recombinantes purificados que tenían una secuencia variable de cadena pesada y ligera del mismo linfocito B se cotransfectaron y expresaron en una línea de células hospedadoras CHO.

Los anticuerpos expresados se sometieron a análisis de afinidad utilizando un biosensor de resonancia de plasmón de superficie en tiempo real (Biacore 4000). Se registraron los parámetros de unión cinéticos (por ejemplo,ka,kd, Kd,<t-i>/2<, etc.) para determinar la unión del anticuerpo al inmunógeno a pH neutro (pH 7,4) y a pH ácido (pH 6,0). Un chip>sensor Biacore CM4 se derivatizó con un anticuerpo monoclonal de ratón anti Fc humano para capturar los anticuerpos del sobrenadante. Después se inyectó una concentración única (100 nM) de inmunógeno sobre la superficie capturada por el anticuerpo a un caudal de 30 pl/min. La asociación anticuerpo-antígeno se controló durante 1,5 minutos y después la disociación del antígeno del anticuerpo capturado se controló durante 2,5 minutos. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 con un modelo de transporte masivo utilizando el software de evaluación Biacore 4000 versión 1.0. Las constantes de disociación de unión (K<d>) y las semividas disociativas (t-io) en equilibrio se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como:Kd(M) = kd/ka; y t1^ (min) = ln2/(60*kd).

Los aglutinantes Biacore se definieron como cualquier anticuerpo que tenga un K<d>medible. El aglutinante dependiente<del pH, en este experimento, se definió como cualquier anticuerpo que tenga una relación de t-i>/2<a pH 7,4 a t-i>/2<a un>pH 6,0 mayor que aproximadamente 2.

Como se muestra en la Tabla 7 a continuación, hubo un aumento de 2-3 veces en el porcentaje de anticuerpos que presentaron una unión a antígeno dependiente del pH en los ratones HULC 1927 y 1930 en comparación con los ratones ULC 1633.

T l 7: P r n An i r D n i n l H n r n R n H L

Ejemplo 7: Generación y Análisis de Ratones que Comprenden Dos Segmentos V Humanos

Ejemplo 7.1: Construcción de Vectores de Direccionamiento para la Generación de Ratones que Comprenden Dos Segmentos V Humanos

Sediseñaron genéticamente dos loci de cadena ligera diseñados que contenían dos segmentos génicos Vk humanos (por ejemplo, un segmento de los genes Vk1-39 y Vk3-20 humanos) (Figura 16B). Un locus de cadena ligera diseñado genéticamente contenía dos segmentos génicos Vk humanos y cinco segmentos génicos Jk humanos en una configuración no reordenada (DLC-5J). El segundo locus de cadena ligera diseñado genéticamente contenía dos segmentos génicos Vk humanos y un segmento génico Jk humano en una configuración no reordenada (DLC-1J). Para cada uno de los dos loci de cadena ligera diseñados adicionales, los segmentos de genes humanos estaban 3' flanqueados con secuencias de señal de recombinación para permitir la reordenaciónin vivode los segmentos génicos humanos en los linfocitos B.

Diseño y Generación de Ratones DLC-1J.Las etapas de diseño que dan como resultado la generación de un locus de cadena ligera que comprende dos segmentos génicos V<k>humanos (V<k>1-39 y V<k>3-20) y un segmento génico J<k>humano (J<k>5), también denominado DLC-1J, se representa en la FIG. 17. Específicamente, Las secuencias V<k>1-39 y Vk3-20 humanas se amplificaron por PCR a partir de plantillas BAC (Invitrogen), y junto con una secuencia amplificada que contenía la secuencia de señal de recombinación (rss, por sus siglas en inglés) y el segmento Jk5 humano, se clonaron mediante una unión de cuatro vías en un plásmido que contiene un Casete de selección de higromicina UB (Figura 17A). Los brazos 5' y 3' se unieron como se representa en las FIGS. 17B y 17C.

La construcción de direccionamiento resultante se representa en la FIG. 16B (diagrama inferior; DLC-1J), con secuencias de señales de recombinación (RSS) en óvalos claros. El clon de ADN de BAC modificado del locus de la cadena ligera DLC-1J diseñado genéticamente operativamente unido a secuencias de ratón (es decir, las secuencias cadena arriba y cadena abajo del locus de la cadena ligera k de inmunoglobulina endógena) se confirmó mediante PCR utilizando cebadores ubicados en secuencias dentro del locus de la cadena ligera diseñada genéticamente que contiene los dos segmentos génicos V<k>humanos, seguido de electroporación en células ES que comprenden la eliminación del locus variable de IgK de ratón (que comprende segmentos k variables y de genes de unión) (Figura 17D) para crear un ratón que expresa cualquiera de los dos segmentos génicos V<k>humanos. Los clones de células ES positivas que contenían el locus de la cadena ligera DLC-1J diseñada genéticamente se confirmaron mediante análisis TAQMAN ™ y cariotipificación utilizando sondas específicas para el locus de la cadena ligera DLC-1J diseñada genéticamente. Las secuencias de los cebadores y sondas utilizadas para la exploración de células ES de células<DLC-1J se representan en la Tabla>8<a continuación y se incluyen en el Listado de secuencias.>

Los clones de células ES confirmadas se utilizaron después para implantar ratones hembra para dar lugar a una camada de crías que comprenden el locus de la cadena ligera DLC-1J y que expresan un dominio variable de cadena ligera humana fusionado con un dominio Ck de ratón. Las secuencias de los cebadores y las sondas utilizados para<la genotipificación de las crías se enumeran en la Tabla>8<anterior. La secuencia a través del locus DLC-1J diseñado genéticamente, que incluye aproximadamente>100<nucleótidos de la secuencia del ratón cadena arriba y cadena abajo>de la secuencia diseñada genéticamente insertada se presenta en la FIG. 18 y se establece en la SEQ ID NO: 82.

Las células ES que contienen el locus de la cadena ligera diseñada genéticamente pueden transfectarse con una construcción que expresa FLP para eliminar el casete de neomicina FRTed introducido por la construcción de direccionamiento (véase la Figura 17E). Opcionalmente, el casete de neomicina se elimina cruzando con ratones que expresan FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina se conserva en los ratones.

Diseño y Generación de Ratones DLC-5J.Para generar un locus de cadena ligera que comprenda dos segmentos génicos Vk humanos (Vk1-39 y Vk3-20) y cinco segmentos génicos Jk humanos (Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, y Jk5),<denominado de otra manera DLC-5J, se unió una secuencia amplificada de>2000<pares de bases que comprende los>5 Jk humanos en un vector que comprende dos segmentos génicos Vk humanos y un Jk humano, representado en la FIG. 17B (centro) (véase la figura 19A). Las etapas de diseño posteriores incluyeron la unión de los brazos 3' y 5' como se muestra en la FIG. 19B.

La construcción de direccionamiento resultante se representa en la FIG. 16B (diagrama superior; DLC-5J), con secuencias de señales de recombinación (RSS) en óvalos claros. El ADN de BAC modificado clonó el locus de la cadena ligera DLC-5J diseñado genéticamente operativamente unido a las secuencias de ratón (es decir, las secuencias cadena arriba y cadena abajo del locus de la cadena ligera k de la inmunoglobulina endógena), se confirmó mediante PCR utilizando cebadores ubicados en las secuencias dentro del locus de la cadena ligera diseñada genéticamente que contiene los dos segmentos génicos V<k>humanos, seguida de electroporación en células ES que comprenden la eliminación del locus variable de IgK de ratón (que comprende segmentos k variables y de genes de unión) (Figura 19C) para crear un ratón que expresa cualquiera de los dos segmentos génicos Vk humanos. Los clones de células ES positivas que contenían el locus de la cadena ligera DLC-5J diseñada genéticamente se confirmaron mediante análisis TAQMA<n>™ y cariotipificación utilizando sondas específicas para el locus de la cadena ligera DLC-5J diseñada genéticamente. Las secuencias de los cebadores y las sondas utilizadas para la exploración de células ES de células ES DLC-5J se representan en la Tabla 9 a continuación y se incluyen en el Listado de secuencias.

El clon de células ES confirmado se usó después para implantar ratones hembras para dar lugar a una camada de crías que comprende el locus de la cadena ligera DLC-5J y que expresa un dominio variable de cadena ligera humana fusionado con un dominio Ck de ratón. Las secuencias de los cebadores y las sondas utilizados para la genotipificación de las crías se enumeran en la Tabla 9 anterior. La secuencia a través del locus DLC-5J diseñado genéticamente, que<incluye aproximadamente>100<nucleótidos de la secuencia del ratón cadena arriba y cadena abajo de la secuencia>diseñada genéticamente insertada se presenta en la FIG. 20 y se establece en la SEQ ID NO: 83.

Las células ES que contienen el locus de la cadena ligera diseñada genéticamente pueden transfectarse con una construcción que expresa FLP para eliminar el casete de neomicina FRTed introducido por la construcción de direccionamiento (véase la Figura 19D). Opcionalmente, el casete de neomicina se elimina cruzando con ratones que expresan FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina se conserva en los ratones.

Ejemplo 7.2: Caracterización de Ratones que Comprenden Dos Segmentos V Humanos

Citometría de Flujo.Las poblaciones de linfocitos B y el desarrollo de linfocitos B en ratones DLC se validaron mediante análisis de citometría de flujo de preparaciones de esplenocitos y médula ósea. Se produjeron suspensiones celulares de ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y cinco segmentos génicos Jk humanos (n = 4), ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos y un segmento génico Jk humano (n = 4) y ratones de tipo silvestre (n = 4) utilizando métodos convencionales y se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia.

<En resumen, se incubaron 1x10>6<células con anti CD16/CD32 de ratón (clon 2.4G2, BD Pharmigen) en hielo durante>10 minutos, seguido de marcado con el siguiente cóctel de anticuerpos durante 30 minutos en hielo: APC-H7 conjugado con anti CD19 de ratón (clon 1D3, BD Pharmigen), Azul Pacific con jugado con anti CD3 de ratón (clon 17A2, BioLegend), FITC conjugado con anti IgK de ratón (clon 187.1, BD Pharmigen) o anti CD43 de ratón (clon 1B11, BioLegend), PE conjugado con anti IgA de ratón (clon RML-42, BioLegend) o anti c-kit de ratón (clon 2B8, BioLegend), PerCP-Cy5.5 conjugado con anti IgD de ratón (BioLegend), PE-Cy7 conjugado con anti IgM de ratón (clon 11/41, eBioscience), APC conjugado con anti B220 de ratón (clon RA3-6B2, eBioscience). Después de la tinción, las células se lavaron y se fijaron en formaldehído al 2%. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo LSRII y se analizó con FlowJo (Tree Star, Inc.). Entrada: linfocitos B totales (CD19+CD3-), linfocitos B IgK+(IgK+IgA-CD19+cD3‘), linfocitos B IgA+ (IgK'IgA+CD19+CD3‘). Los resultados para el compartimiento de médula ósea se muestran en la FIG.

21A-23B. Los resultados para el compartimento esplénico se muestran en la FIG. 24A - FIG. 27.

Como se muestra en este ejemplo, los ratones DLC-5J demuestran poblaciones de linfocitos B normales dentro de los compartimentos esplénico y de médula ósea (Fig. 21A -27). Los ratones DLC-5J demostraron poblaciones de linfocitos inmaduros, maduros y pre/pro B dentro del compartimiento de médula ósea que son sustancialmente las mismas que los observados en las camadas de tipo silvestre. De hecho, el locus DLC-5J era capaz de competir con el locus de la cadena ligera A endógeno para producir una proporción<k>:A que es sustancialmente la misma que la observada en ratones de tipo silvestre (Figura 25B). Asimismo, los ratones DLC-5J demuestran un desarrollo normal de linfocitos B periféricos a medida que la progresión de linfocitos B a través de varias etapas en el compartimento esplénico (por ejemplo, inmaduros, maduros, T1, T2, T3, precursor de la zona marginal, zona marginal, folicular-I, folicular-II, etc.) se produce de una manera sustancialmente igual a la observada en ratones de tipo salvaje (FIG. 26A - 27). En cambio, los ratones DLC-1J demostraron un número total más bajo de linfocitos B y un mayor uso de la cadena ligera A en comparación con la cadena ligera k diseñada genéticamente (datos no mostrados).

Expresión de la Cadena Ligera Doble.La expresión de ambos segmentos génicos V<k>humanos se analizó en ratones homocigotos utilizando un ensayo de PCR cuantitativa. En resumen, Los linfocitos B CD19+ se purificaron a partir de médula ósea y bazos completos de ratones de tipo silvestre, ratones homocigotos para un reemplazo de los loci variables de cadena pesada y cadena ligera k de ratón con los loci de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera k (Hk) correspondientes, así como ratones homocigotos para un loci de la cadena ligera k diseñado genéticamente que contiene dos segmentos génicos V<k>humanos y cualquiera de los cinco segmentos génicos J<k>humanos (DLC-5J) o un segmento génico J<k>humano (DLC-1J). La expresión relativa se normalizó a la expresión de la región C<k>de ratón (n = 3 a 5 ratones por grupo). Los resultados se muestran en la FIG. 28 y la FIG. 29.

La expresión de cadenas ligeras que contienen un segmento del gen Vk3-20 humano o Vk1-39 humano reordenado se detectó tanto en la médula ósea como en el bazo de ratones DLC-5J y DLC-1J (Figura 28 y Figura 29). En el compartimiento de la médula ósea, la expresión de ambas cadenas ligeras derivadas de V<k>3-20 humano y derivada de Vk1-39 humano en ambas cepas de ratones DLC fue significativamente mayor en comparación con los ratones que comprenden un reemplazo del segmento génico V<k>y J<k>de ratón con los segmentos génicos V<k>y J<k>humanos correspondientes (Hk; FIG. 28). La expresión de la cadena ligera derivada de V<k>3-20 humano se observó de aproximadamente seis veces (DLC-5J) a quince veces (DLC-1J) mayor que en ratones Hk. Los ratones DLC-1J demostraron una expresión aproximadamente dos veces mayor de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 humano sobre ratones DLC-5J en el compartimento de la médula ósea. La expresión de la cadena ligera derivada de V<k>1-39 humano se observó de aproximadamente seis veces (DLC-5J) a trece veces (DLC-1J) mayor que en ratones Hk. Los ratones DLC-1J demostraron una expresión aproximadamente dos veces mayor de las cadenas ligeras derivadas de V<k>1-39 humano sobre ratones DLC-5J en el compartimento de la médula ósea.

En el compartimento esplénico, la expresión de cadenas ligeras derivadas tanto de Vk3-20 humano como derivadas de V<k>1-39 humano en ambas cepas de ratones DLC fue significativamente mayor en comparación con los ratones Hk (Figura 29). La expresión de la cadena ligera derivada de Vk3-20 humano se observó aproximadamente cuatro veces (DLC-5J) y ocho veces (DLC-1J) mayor que en los ratones Hk. Los ratones DLC-lJ demostraron una expresión aproximadamente dos veces mayor de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 humano sobre ratones DLC-5J en el compartimento esplénico. La expresión de la cadena ligera derivada de V<k>1-39 humano se observó de aproximadamente cuatro veces (DLC-5J) a cinco veces (DLC-1J) mayor que en ratones Hk. Los ratones DLC-1J demostraron una expresión similar de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39 humano en comparación con los ratones DLC-5J en el compartimento esplénico.

Uso de Vl/J l humanos en ratones DLC-5J.Los ratones homocigotos para dos segmentos génicos Vk humanos no reordenado y cinco segmentos génicos Jk humanos no reordenados (DLC-5J) se analizaron para el uso del segmento de genes V<k>/J<k>humanos en linfocitos B esplénicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).

En resumen, los bazos de ratones homocigotos DLC-5J (n = 3) y de tipo silvestre (n = 2) se recogieron y se combinaron en 10 ml de RPMI 1640 (Sigma) que contenía suero bovino fetal inactivado por calor al 10% utilizando portaobjetos de vidrio esmerilado para crear suspensiones de células sueltas. Los esplenocitos se sedimentaron con una centrífuga (1200 rpm durante cinco minutos) y los glóbulos rojos se lisaron en 5 ml de tampón de lisado ACK (GIBCO) durante tres minutos. Los esplenocitos se diluyeron con PBS (Irvine Scientific), se filtraron con un tamiz de células de 0,7 pm y se centrifugaron nuevamente para sedimentar las células, lo que fue seguido de resuspensión en 1 ml de PBS.

El ARN se aisló a partir de esplenocitos sedimentados utilizando el mini kit AllPrep ADN/ARN (Qiagen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La RT-PCR se realizó en el ARN de esplenocitos utilizando un sistema RACE 5' (amplificación rápida de extremos de ADNc) con cebadores específicos para el gen Ck de ratón según las especificaciones del fabricante (Invitrogen). Los cebadores específicos para el gen Ck de ratón fueron 3 ' mIgKC RACE1 (AAGAAGCACA CGACTGAGGC AC; SEQ ID NO: 90) y mIgKC3'-1 (CTCACTGGAT GGTGGGAAGA TGGA; SEQ ID NO: 91). Los productos de la PCR se purificaron en gel y se clonaron en el vector pCR®2.1-TOPO® (TOPO® TA Cloning® Kit, Invitrogen) y se secuenciaron con cebadores M13 Directo (GTAAAACGAC GGCCAG; S<e>Q ID NO: 92) y M13 Inverso (CAGG<a>A<a>CAG CTATGAC; SEQ ID NO: 93) ubicados dentro del vector en localizaciones que flanquean el sitio de clonación. Se secuenciaron diez clones de cada muestra de bazo. Las secuencias se compararon con los conjuntos de inmunoglobulinas humana y de ratón de los conjuntos de directorios de referencia IMGT/V-QUEST para determinar el uso de V<k>/J<k>. La Tabla 10 expone las combinaciones de V<k>/J<k>para clones seleccionados observadas en clones de RT-PCR de cada muestra de esplenocitos. La Tabla 11 expone la secuencia de aminoácidos de las uniones Vk/Jk humanos y Jk/C k humanos de clones de RT-PCR seleccionados de ratones homocigotos DLC-5J. Las letras minúsculas indican mutaciones en la secuencia de aminoácidos de la región variable o adiciones sin plantilla que son el resultado de las adiciones de N y/o P durante la recombinación.

Como se muestra en este ejemplo, ratones homocigotos para dos segmentos génicos V<k>humanos no reordenados y cinco segmentos génicos Jk humanos no reordenados (DLC-5J) operativamente unidos al gen Ck de ratón pueden recombinar productivamente ambos segmentos génicos V<k>humanos a múltiples segmentos génicos J<k>humanos para producir un repertorio de cadenas ligeras de inmunoglobulinas limitado. Entre los reordenamientos en ratones homocigotos DLC-5J mostrados en la Tabla 10, se observaron reordenamientos únicos de Vk/Jk humanos para Vk1-39/J<k>2 (1), V<k>1-39/J<k>3 (1), V<k>3-20/J<k>1 (7), V<k>3-20/J<k>2 (4) y V<k>3-20/J<k>3 (1). Además, tales reordenamientos únicos demostraron diversidad de unión a través de la presencia de aminoácidos únicos dentro de la región CDR3 de la cadena ligera (Tabla 11) que es el resultado de la mutación y/o la recombinación de los segmentos génicos V<k>y J<k>humanos durante el desarrollo. Todos los reordenamientos mostraron una lectura funcional en Ck de ratón (Tabla 11).

En conjunto, estos datos demuestran que los ratones diseñados genéticamente para presentar una elección de no más de dos segmentos del gen Vl humano, los cuales son capaces de reordenarse (por ejemplo, con uno o más y, en algunos aspectos, hasta cinco segmentos génicos Jl humanos) y codificar un dominio Vl humano de una cadena ligera de inmunoglobulina tienen un número de linfocitos B y un desarrollo que es casi de tipo silvestre en todos los aspectos. Dichos ratones producen una colección de anticuerpos que tienen cadenas ligeras de inmunoglobulina que tienen uno de los dos posibles segmentos génicos Vl humanos presentes en la colección. Esta colección de anticuerpos es producida por el ratón en respuesta a la exposición al antígeno y está asociada con una diversidad de cadenas pesadas quiméricas inversas (variable humana/constante de ratón).

Tabla 10: Combinaciones Vk/Jk Observadas en Muestras de Es lenocitos

continuación

Tabla 11: Secuencias de aminoácidos de las uniones Vk humanos/JK humanos y Jk humanos/CK de ratón de ratones homoci óticos DLC-5J

Ejemplo 8: Generación y Caracterización de Ratones que Comprenden Dos Cadenas Ligeras Humanas Sustituidas con Histidina

Ejemplo 8.1: Diseño y Generación de Ratones que Comprenden Dos Segmentos V Kappa, que contiene cada uno cuatro Sustituciones de Histidina

Las sustituciones de histidina se introdujeron en el locus de la cadena ligera doble como se describe anteriormente para los ratones ULC Vk1-39 y Vk3-20. En resumen, La secuencia DLC representada en la FIG. 19A (parte inferior) se sometió a mutagénesis dirigida al sitio, modificando primero la secuencia Vk1-39, y modificando posteriormente la secuencia Vk3-20, usando los cebadores representados en la FIG. 30. La secuencia de cadena ligera doble resultante contenía el segmento Vk1-39 con histidinas introducidas en la secuencia de la línea germinal en las posiciones 105, 106, 108 y 111, el segmento V<k>3-20 con histidinas introducidas en la secuencia de la línea germinal en las posiciones 105, 106, 107 y 109, así como los cinco segmentos J<k>(J<k>1, J<k>2, J<k>3, J<k>4 y J<k>5). Una etapa de ingeniería posterior incluyó la unión de un brazo 5 ' que portaba un casete FRT-UB-NEO-FRT, y un brazo 3' que portaba un potenciador de IgK y una región constante de ratón. Este vector de direccionamiento se sometió a electroporación en células ES que comprendían la eliminación del locus variable de IgK de ratón (que comprendía k variables y segmentos génicos de unión), como se representa en la FIG. 31A (las secuencias de señal de recombinación, RSS, se omiten en esta figura). Las células e S dirigidas se exploraron mediante una modificación del ensayo de alelos como se describe anteriormente, utilizando cebadores y sondas que detectaron las regiones descritas anteriormente en las Tablas 1, 5, 8<y 9 (específicamente, 1633h2, 1635h2, neo, Jxn 1-39/3-20, mlgKd2 y mlgKp15), así como dos conjuntos adicionales>de cebadores y sondas enumerados en la Tabla 12 a continuación. Las secuencias de estos dos conjuntos adicionales de cebadores y sondas se incluyen en el Listado de Secuencias.

T l 12: r n iliz r l Ex l r i n l l E

El clon de células ES confirmado se utiliza después plantar ratones hembras para dar lugar a una camada de crías que comprenden locus de la cadena ligera DLC-5J con cuatro modificaciones con histidina en cada una de las dos secuencias de segmento V<l>presentes, y que expresan un dominio variable de la cadena ligera humana fusionado con un dominio C<k>de ratón. Algunas de las mismas secuencias que se utilizan para la exploración de células ES también se utilizan para la genotipificación de las crías.

Las células ES que contienen el locus de la cadena ligera diseñada genéticamente pueden transfectarse con una construcción que expresa FLP (por ejemplo, FLPo) para eliminar el casete de neomicina FRTed introducido por la construcción de direccionamiento (véase la Figura 31B, en esta figura se omiten las RSS). Opcionalmente, el casete de neomicina se elimina cruzando con ratones que expresan FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina se conserva en los ratones.

Ejemplo 8.2: Diseño y Generación de Ratones que Comprenden Dos Segmentos V Kappa que Contienen cada uno Tres Sustituciones de Histidina

Se introdujeron tres sustituciones de histidina en cada Vk1-39 y Vk3-20 de los ratones de cadena ligera doble. En resumen, La secuencia DLC representada en la FIG. 19A (parte inferior) se sometió a mutagénesis dirigida al sitio, modificando primero la secuencia Vk1-39, y modificando posteriormente la secuencia Vk3-20, usando los cebadores representados en la FIG. 32. La secuencia de cadena ligera doble resultante contenía el segmento V<k>1-39 con histidinas introducidas en la secuencia de la línea germinal en las posiciones 106, 108 y 111, el segmento Vk3-20 con histidinas introducidas en la secuencia de la línea germinal en las posiciones 105, 106 y 109, así como los cinco segmentos J<k>(J<k>1, J<k>2, J<k>3, J<k>4 y J<k>5). Una etapa de ingeniería posterior incluyó la unión de un brazo 5 ' que portaba un casete FRT-UB-NEO-FRT, y un brazo 3' que portaba un potenciador de IgK y una región constante de ratón. Este vector de direccionamiento se sometió a electroporación en células ES que comprendían la eliminación del locus variable de IgK de ratón (que comprendía k variables y segmentos génicos de unión), como se representa en la FIG.

33A (en esta figura se omiten las RSS). Las células<e>S dirigidas se exploraron mediante una modificación del ensayo de alelos como se describe anteriormente, utilizando cebadores y sondas que detectaron las regiones descritas<anteriormente en las Tablas 1, 5,>8<y 9 (específicamente, 1633h2, 1635h2, neo, Jxn 1-39/3-20, mlgKd2, and mlgKp15),>así como dos conjuntos adicionales de cebadores y sondas enumerados en la Tabla 13 a continuación. Las secuencias de estos dos conjuntos adicionales de cebadores y sondas se incluyen en el Listado de Secuencias.

T l 1 : r n iliz r l ^ Ex l r i n l l E

El clon de células ES confirmado se utiliza después plantar ratones hembras para dar lugar a una camada de crías que comprenden locus de la cadena ligera DLC-5J con cuatro modificaciones con histidina en cada una de las dos secuencias de segmento Vl presentes, y que expresan un dominio variable de la cadena ligera humana fusionado con un dominio C<k>de ratón. Algunas de las mismas secuencias que se utilizan para la exploración de células ES también se utilizan para la genotipificación de las crías.

Las células ES que contienen el locus de la cadena ligera diseñada genéticamente pueden transfectarse con una construcción que expresa FLP (por ejemplo, FLPo) para eliminar el casete de neomicina FRTed introducido por la construcción de direccionamiento (véase la Figura 33B, en esta figura se omiten las RSS). Opcionalmente, el casete de neomicina se elimina cruzando con ratones que expresan FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina se conserva en los ratones.

Ejemplo 8.3: Cruce de Ratones que Comprenden Cadenas Ligeras Dobles Sustituidas con Histidina HumanasLos ratones que contienen un locus de cadena ligera doble sustituida con histidina humana diseñado genéticamente se cruzan con ratones que contienen una eliminación del locus de cadena ligera A endógeno para generar una progenie que exprese, como sus únicas cadenas ligeras, las cadenas ligeras sustituidas con histidina diseñadas genéticamente derivadas del locus de cadena ligera doble.

Los ratones que contienen un locus de cadena ligera doble sustituida con histidina humana diseñada genéticamente se cruzan con ratones que contienen un reemplazo del locus variable de cadena pesada de ratón endógeno con locus variable de cadena pesada humana (véanse los documentos US 6,596,541 y Us 8,502,018; the VELOCIMMUNE® mouse, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.).

Se configuran cruces similares a los descritos en el presente documento para ratones de cadena ligera doble descritos en el Ejemplo 7 anterior.

Los detalles adicionales de estos métodos de reproducción y la generación de anticuerpos completamente humanos a partir de las regiones variables de cadena ligera y pesada humanas se describen en el Ejemplo 5 anterior.

Ejemplo 8.4: Detección de Modificaciones con Histidina en las Cadenas Ligeras de Inmunoglobulina Obtenidas de Ratones que Comprenden Dos Segmentos V Kappa, que contiene cada uno Tres Sustituciones de HistidinaSe prepararon amplicones de V kappa a partir de ARNm de linfocitos B esplénicos usando PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) y exploración de alto rendimiento.

En resumen, se recogieron bazos de cinco ratones heterocigotos que comprenden dos segmentos V kappa (Vk1-39 y

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un roedor modificado genéticamente que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende no más de dos segmentos génicos Vk humanos no reordenados y al menos un segmento génico Jk humano no reordenado operativamente unidos a una secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina,

en donde los no más de dos segmentos génicos Vk humanos no reordenados y el al menos un segmento génico Jk humano no reordenado se reordenan en los linfocitos B durante el desarrollo de los linfocitos B, de manera que el roedor comprende una pluralidad de secuencias génicas V<k>/J<k>de cadena ligera humana reordenadas, cada una de las cuales codifica un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina distinto y comprende la al menos una histidina en la CDR3 que no está codificada por el segmento génico Vk de la línea germinal humana correspondiente, y

en donde el roedor expresa una población de anticuerpos específicos de antígeno en respuesta a un antígeno, en donde cada anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la al menos una histidina en una CDR3 que no está codificada por el segmento génico Vk de la línea germinal humana correspondiente y presente una unión dependiente del pH a un antígeno de interés.

2. El roedor de la reivindicación 1, en donde el roedor no comprende un segmento génico Vk endógeno que sea capaz de reordenarse para formar una cadena ligera de inmunoglobulina.

3. El roedor de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es

(i) una secuencia de región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de roedor,

(ii) una secuencia de región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón o una secuencia de región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de rata, y/o

(iii) una secuencia de región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina endógena.

4. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además en su línea germinal un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada que comprende segmentos génicos V<h>, D<h>y J<h>humanos operativamente unidos a una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

5. El roedor de la reivindicación 4, en donde la secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es

(i) una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de roedor

(ii) una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón o una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de rata, y/o

(iii) una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógena.

6<. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los no más de dos segmentos génicos Vk>humanos no reordenados y el al menos un segmento génico Jk humano no reordenado están presentes en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógena.

7. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el roedor comprende cinco segmentos Jk humanos, y los cinco segmentos Jk humanos son segmentos Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5 humanos.

8<. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una sustitución de tres o cuatro>codones de no histidina con el codón de histidina.

9. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los no más de dos segmentos génicos Vk humanos no reordenados son segmentos génicos Vk1-39 y Vk3-20 humanos no reordenados, y en donde cada uno de los segmentos génicos V<k>1-39 y V<k>3-20 humanos comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina codificado por una secuencia de segmento génico Vk de la línea germinal humana correspondiente con el codón de histidina.

10. El roedor de la reivindicación 9, en donde cada uno de los segmentos génicos V<k>1-39 y V<k>3-20 humanos comprende una sustitución de tres o cuatro codones de no histidina con los codones de histidina.

11. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el roedor es una rata o un ratón.

12. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el roedor es un ratón.

13. Un método de generación de un anticuerpo que presenta una unión dependiente del pH a un antígeno de interés que comprende:

permitir que el roedor monte una respuesta inmunitaria al antígeno de interés, y

seleccionar un anticuerpo que se una al antígeno de interés con una afinidad deseada a un pH neutro mientras presenta una unión reducida al antígeno de interés a un pH ácido.

14. Un método para fabricar un roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, comprendiendo el método:

modificar un genoma del roedor para eliminar o generar segmentos génicos Vk y Jk de cadena ligera de inmunoglobulina endógena no funcionales en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina, y

colocar en el genoma del roedor una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprenda no más de dos segmentos génicos Vk humanos no reordenados y al menos un segmento génico Jk humano no reordenado, de forma que la secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina esté operativamente unida a una secuencia de región constante de inmunoglobulina, opcionalmente en donde la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina está en el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina endógena, en donde cada segmento génico Vk humano no reordenado codifica al menos una histidina en una región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) que no está codificada por segmento génico VK de la línea germinal humana correspondiente,

en donde no más de dos segmentos génicos Vk humanos no reordenados y al menos un segmento génico Jk humano no reordenado se reordenan en los linfocitos B durante el desarrollo de los linfocitos B, de modo que el roedor comprende una pluralidad de secuencias génicas V<k>/J<k>de cadena ligera humana reordenadas, cada una de las cuales codifica un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina distinto y comprende la al menos una histidina en la región determinante de la complementariedad CDR3 que no está codificada por el segmento génico Vk de la línea germinal humana correspondiente, y

15. El método de la reivindicación 14, en donde el roedor es una rata o un ratón.