ES2712207T3

ES2712207T3 - Ratones que expresan un repertorio limitado de cadenas ligeras de inmunoglobulina

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Publication number: ES2712207T3
Application number: ES14717331T
Authority: ES
Inventors: Robert Babb; John Mcwhirter; Lynn Macdonald; Sean Stevens; Samuel Davis; David R Buckler; Karolina A Meagher; Andrew J Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2019-05-09
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: MX2015012539A; RS58669B1; JP2016512034A; BR112015022034A2; AU2020203238A1; CY1121545T1; RU2689664C2; JP6529957B2; WO2014160202A1; JP6790136B2; FI3501272T3; JP2019213549A; IL280892B1; PL2967013T3; DK3501272T3; EP4218409A3; SMT201900196T1; KR20150126871A; RS64185B1; JP2020182490A

Abstract

Un ratón que comprende, en su genoma de la línea germinal: dos segmentos de gen Vκ de inmunoglobulina humana y cinco segmentos de gen Jκ de inmunoglobulina humana unidos operativamente a una secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón o de rata, en el que los dos segmentos de gen Vκ de inmunoglobulina humana son un Vκ 1-39 humano y un Vκ 3-20 humano, y los cinco segmentos de gen Jκ de inmunoglobulina humana son Jκ 1 humano, Jκ 2 humano, Jκ 3 humano, Jκ 4 humano y Jκ 5 humano; y uno o más segmentos de gen VH de la inmunoglobulina humana, uno o más segmentos de gen DH de la inmunoglobulina humana y uno o más segmentos de gen JH de la inmunoglobulina humana unidos operativamente a una secuencia de región constante de inmunoglobulina de ratón o de rata; en el que los segmentos de gen humano de inmunoglobulina son capaces de reorganizarse y codificar dominios variables de inmunoglobulina humana de un anticuerpo, y, además, ratón que no comprende un segmento génico VL de inmunoglobulina endógeno que es capaz de reorganizarse para formar una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina.

Description

DESCRIPCION

Ratones que expresan un repertorio limitado de cadenas ligeras de inmunoglobulina

Campo

Se proporciona un raton modificado geneticamente que expresa anticuerpos que tienen una cadena ligera variable humana/constante de raton comun asociada con diversas cadenas pesadas variables humanas/constantes de raton. Se proporciona un metodo de generacion de un anticuerpo biespedfico humano a partir de secuencias genicas de region variable humanas de linfocitos B del raton.

Antecedentes

Los anticuerpos normalmente comprenden un componente de cadena pesada homodimerico, en el que cada monomero de cadena pesada esta asociado con una cadena ligera identica. Los anticuerpos que tienen un componente de cadena pesada heterodimerico (por ejemplo, anticuerpos biespedficos) son deseables como anticuerpos terapeuticos. Pero la generacion de anticuerpos biespedficos que tengan un componente de cadena ligera adecuado que pueda asociarse satisfactoriamente con cada una de las cadenas pesadas de un anticuerpo biespedfico ha resultado ser problematica.

En un enfoque, se podna seleccionar una cadena ligera mediante el estudio de las estadfsticas de uso de todos los dominios variables de la cadena ligera, identificando la cadena ligera empleada con mas frecuencia en anticuerpos humanos, y emparejando esa cadena ligera in vitro con las dos cadenas pesadas de diferente especificidad.

En otro enfoque, se podna seleccionar una cadena ligera observando secuencias de cadenas ligeras en una genoteca de presentacion en fagos (por ejemplo, una genoteca de presentacion en fagos que comprendiera secuencias de region variable de cadena ligera humana, por ejemplo, una genoteca de scFv humanos) y seleccionando la region variable de la cadena ligera mas comunmente usada de la biblioteca. La cadena ligera se puede probar en las dos cadenas pesadas diferentes de interes.

En otro enfoque, se podna seleccionar una cadena ligera mediante el ensayo de una genoteca de presentacion en fagos de secuencias variables de cadena ligera usando las secuencias variables de cadena pesada de ambas cadenas pesadas de interes como sondas. Una cadena ligera que se asocia con ambas secuencias variables de cadena pesada podna seleccionarse como una cadena ligera para las cadenas pesadas.

En otro enfoque, se podna alinear una cadena ligera candidata con las cadenas ligeras afines de las cadenas pesadas, y realizarse modificaciones en la cadena ligera para ajustarla mas estrechamente a las caractensticas de secuencia comunes a las cadenas ligeras afines de ambas cadenas pesadas. Si es necesario reducir al mmimo las posibilidades de inmunogenicidad, las modificaciones preferentemente dan lugar a secuencias que estan presentes en secuencias de cadenas ligeras humanas conocidas, de modo que es improbable que el procesamiento proteolftico genere un epftopo de linfocitos T basado en parametros y en metodos conocidos en la tecnica para evaluar la probabilidad de inmunogenicidad (es decir, in silico, asf como ensayos en humedo).

Todos los enfoques anteriores se basan en metodos in vitro que incluyen una serie de restricciones a priori, por ejemplo, la identidad de secuencia, la capacidad de asociarse con cadenas pesadas espedficas previamente seleccionadas, etc. Existe la necesidad en la tecnica de composiciones y metodos que no se basen en la manipulacion de las condiciones in vitro, sino que empleen enfoques biologicamente mas sensibles para producir protemas de union al epftopo humanas que incluyan una cadena ligera comun.

Sumario

Se proporcionan ratones modificados geneticamente que expresan dominios variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, ratones que tienen un repertorio variable limitado de cadenas ligeras.

En particular, se proporciona un raton que comprende, en su genoma, dos segmentos de gen Vk de inmunoglobulina humana y cinco segmentos de gen Jk de inmunoglobulina humana unidos operativamente a una secuencia de region constante de cadena ligera de inmunoglobulina de raton o de rata, en el que los dos segmentos de gen Vk de inmunoglobulina humana son un Vk1-39 humano y un Vk3-20 humano, y los cinco segmentos de gen Jk de inmunoglobulina humana son Jk1 humano, Jk2 humano, Jk3 humano, Jk4 humano y Jk5 humano; y

uno o mas segmentos de gen V^hde la inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos de gen D^hde la inmunoglobulina humana y uno o mas segmentos de gen JH de la inmunoglobulina humana unidos operativamente a una secuencia de region constante de inmunoglobulina de raton o de rata;

en el que los segmentos de gen humano de inmunoglobulina son capaces de reorganizarse y codificar dominios variables de inmunoglobulina humana de un anticuerpo, y, ademas, raton que no comprende un segmento genico V^lde inmunoglobulina endogeno que es capaz de reorganizarse para formar una secuencia de region variable de cadena ligera de inmunoglobulina.

Tambien se proporciona una celula aislada del raton proporcionado, en el que

(a) la celula es una celula madre embrionaria (ES); o

(b) la celula es un linfocito B. Ademas, se proporciona un embrion de raton que comprende dicha celula ES.

Tambien se proporciona un hibridoma fabricado con el linfocito B proporcionado.

Ademas, se proporciona el uso del raton proporcionado para:

(a) generar un anticuerpo; y/o

(b) identificar una secuencia de acido nucleico que codifique un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana; y/o

(c) fabricar un anticuerpo biespedfico humano; y/o

(d) seleccionar un segmento genico de la region variable de cadena pesada de la inmunoglobulina humana.

Ademas, se proporciona un metodo de generacion de un anticuerpo que se una a un antfgeno de interes, que comprende inmunizar a un raton provisto de un antfgeno de interes,

obtener una secuencia de region variable de inmunoglobulina del raton y emplear la secuencia de region variable de inmunoglobulina para producir un anticuerpo que se una al antigeno, preferentemente, metodo que comprende ademas:

expresar en una sola celula:

(a) una primera secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana del raton siempre que se haya inmunizado, en el que la secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana se fusiona con una secuencia de gen CH humana; y

(b) una secuencia de region variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana, en el que la secuencia de region variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana esta fusionada con una secuencia de region constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana;

mantener la celula en condiciones suficientes para expresar un anticuerpo completamente humano; y aislar el anticuerpo de la celula.

Ademas, se proporciona un metodo de generacion de un anticuerpo biespedfico humano, en el que el metodo comprende inmunizar al raton proporcionado y generar el anticuerpo biespedfico usando secuencias de region variable de inmunoglobulina humana de linfocitos B del raton, preferentemente, metodo que comprende ademas:

(a) identificar un linfocito seleccionado clonicamente del raton proporcionado, en el que el raton se ha inmunizado y se le ha permitido desarrollar una respuesta inmunitaria hacia un antfgeno de interes, en el que el linfocito expresa un anticuerpo que se une espedficamente al antfgeno de interes;

(b) obtener del linfocito o del anticuerpo una secuencia de nucleotidos que codifique un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se una espedficamente al antfgeno de interes; y

(c) emplear la secuencia de nucleotidos de (b) para generar un anticuerpo biespedfico.

Tambien se proporciona un metodo de generacion de un anticuerpo que comprende inmunizar un raton como el proporcionado con un antfgeno y obtener una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o secuencia de nucleotidos codificante, de un anticuerpo resultante producido por el raton contra el antfgeno, y utilizar dicha secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o secuencia de acido nucleico codificante en la generacion de un anticuerpo, preferentemente, metodo que comprende ademas:

(a) identificar la secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o secuencia de nucleotidos codificante, de dos anticuerpos diferentes contra diferentes epftopos del antfgeno con el que se ha inmunizado el raton; o

(b) inmunizar el mismo raton, o un raton adicional proporcionado, con un antfgeno diferente, luego, identificar una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o secuencia de nucleotidos codificante, de un anticuerpo producido por el raton que es espedfico de dicho antfgeno diferente,

en el que el metodo comprende ademas el uso de dos secuencias de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana diferentes, o secuencias de nucleotidos codificantes, para generar un anticuerpo biespedfico.

Se proporciona un sistema biologico para generar un dominio variable de cadena ligera humana que se asocia y expresa con un repertorio diverso de dominios variables de cadena pesada humanos madurados por afinidad. Tambien se hace referencia a metodos de generacion de protemas de union que comprenden dominios variables de inmunoglobulina, que comprenden inmunizar ratones que tienen un repertorio limitado de cadenas ligeras de inmunoglobulina con un antigeno de interes, y emplean una secuencia genica de la region variable de inmunoglobulina del raton en una protema de union que se une espedficamente al antigeno de interes. Los metodos incluyen metodos de generacion de dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana adecuados para su uso en la fabricacion de protemas de union al antigeno multiespedficas.

Tambien se hace referencia a ratones modificados geneticamente para seleccionar dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana madurados por afinidad adecuados derivados de un repertorio de segmentos genicos de region variable de cadena pesada humana no reordenados, en los que los dominios variables de cadena pesada humana madurados por afinidad se asocian y expresan con un solo dominio variable de cadena ligera humana derivado de un segmento genico de region variable de cadena ligera humana. Tambien se proporcionan ratones disenados geneticamente que presentan una opcion de dos segmentos genicos de region variable de cadena ligera humana. Los dos segmentos genicos son Vk1-39 humano y Vk3-20 humano.

Tambien se hace referencia a ratones modificados geneticamente que expresan un repertorio limitado de dominios variables de cadena ligera humana, o un unico dominio variable de cadena ligera humana, de un repertorio limitado de segmentos genicos de region variable de cadena ligera humana. Los ratones estan modificados geneticamente para incluir dos segmentos genicos de la region variable de cadena ligera humana desorganizados que se reorganiza para formar dos genes de region variable de cadena ligera reordenados que expresan una cualquiera o ambas cadenas ligeras. Los dominios variables de la cadena ligera humana reordenados son capaces de emparejarse con una pluralidad de cadenas pesadas humanas maduradas por afinidad seleccionadas por los ratones, en los que las regiones variables de cadena pesada se unen espedficamente a diferentes epttopos.

Tambien se hace referencia a ratones modificados geneticamente que expresan un repertorio limitado de dominios variables de cadena ligera humana, o un unico dominio variable de cadena ligera humana, de un repertorio limitado de secuencias de region variable de cadena ligera humana. Tambien se hace referencia a ratones modificados geneticamente para incluir una sola secuencia de cadena ligera humana V/J (o dos secuencias V/J) que expresen una region variable de una sola cadena ligera (o que expresen una cualquiera o ambas regiones variables). Una cadena ligera que comprende la secuencia variable es capaz de emparejarse con una pluralidad de cadenas pesadas humanas maduradas por afinidad seleccionadas clonicamente por los ratones, en los que las regiones variables de cadena pesada se unen espedficamente a diferentes epttopos.

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que comprende un solo segmento genico de la region variable (V^l) de cadena ligera de inmunoglobulina humana que es capaz de reorganizarse con un segmento genico J humano (seleccionado entre uno o una pluralidad de segmentos de J^l) y que codifica un dominio V^lhumano de una cadena ligera de inmunoglobulina. En otro aspecto, el raton modificado geneticamente proporcionado comprende dos segmentos de gen V^lhumano, cada uno de los cuales es capaz de reorganizarse con un segmento genico J humano (seleccionado entre uno o una pluralidad de segmentos de J^l) y de codificar un dominio V^lhumano de cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, los dos segmentos de gen V^lhumano estan yuxtapuestos en el genoma del raton. Los dos segmentos de gen V^lhumano estan en diferentes locus (por ejemplo, un heterocigoto, que comprende un primer segmento de V^lhumano en un primer alelo de cadena ligera, y un segundo segmento de V^lhumano en un segundo alelo de cadena ligera, en el que el primer y el segundo segmentos de V^lhumanos no son identicos) en el genoma del raton. En algunas realizaciones, los dos segmentos de gen V^lhumanos son un segmento del gen Vk1-39 humano y un segmento del gen Vk3-20 humano. En una realizacion, el segmento del gen J^lhumano se selecciona del grupo que consiste en Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5 y combinaciones de pares de los mismos. En diversas realizaciones, un raton modificado geneticamente proporcionado es incapaz de expresar una cadena ligera de inmunoglobulina que contiene un segmento endogeno del gen V^l. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un raton modificado geneticamente proporcionado contiene una modificacion genetica que inactiva y/o elimina parte o la totalidad de un segmento endogeno del gen V^l.

En un caso, el unico segmento del gen V^lhumano esta unido operativamente a un segmento del gen J^lhumano seleccionado entre Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5, en el que el unico segmento del gen V^lhumano es capaz de reorganizarse para formar una secuencia codificante de un gen de region variable de cadena ligera con cualquiera del uno o mas segmentos de gen J^lhumanos.

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que no comprende un segmento de gen V^lde raton endogeno que es capaz de reorganizarse para formar un gen de cadena ligera de inmunoglobulina, en el que el locus de V^lcontiene un solo segmento de gen V^lhumano que es capaz de reorganizarse para codificar una region de V^lde un gen de cadena ligera. En casos esped ficos, el segmento del gen V^lhumano es un segmento del gen Vk1-39Jk5 humano y un segmento del gen Vk3-20Jk1 humano. Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que comprende un locus de V^lque no comprende un segmento de gen V^lde raton endogeno que es capaz de reorganizarse para formar un gen de cadena ligera de inmunoglobulina, en el que el locus de V^lcomprende no mas de dos segmentos de gen V^lhumano que son capaces de reorganizarse para codificar una region de V^lde un gen de cadena ligera. En algunos ciertos casos, los no mas de dos segmentos de gen V^lhumanos se seleccionan del grupo que consiste en un segmento del gen Vk1-39 humano, un segmento del gen Vk3-20 humano y una combinacion de los mismos. En algunos ciertos casos, los no mas de dos segmentos de gen V^lhumanos son un segmento del gen Vk1-39Jk5 humano y un segmento del gen Vk3-20Jk1 humano.

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que comprende una sola region variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana (V/J) reordenada (V^l) (es decir, una region V^l/J^l) que codifica un dominio V^lhumano de una cadena ligera de inmunoglobulina. En otro caso, el raton comprende no mas de dos regiones V^lhumanas reordenadas que son capaces de codificar un dominio V^lhumano de una cadena ligera de inmunoglobulina.

En un caso, la region V^les una secuencia de Vk1-39/J humana reordenada o una secuencia de Vk3-20/J humana reordenada. En un caso, el segmento de J^lhumano de la secuencia de V^l/J^lreordenada se selecciona entre Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5. En un caso espedfico, la region de V^les una secuencia de Vk1-39Jk5 humana o una secuencia de Vk3-20Jk1 humana. el raton proporcionado tiene tanto una secuencia de Vk1-39Jk5 humana como una secuencia de Vk3-20Jk1 humana.

En una realizacion, el segmento del gen V^lhumano esta unido operativamente a una secuencia lfder humana o de raton. En una realizacion, la secuencia lfder es una secuencia lfder de raton. En una realizacion espedfica, la secuencia lfder de raton es una secuencia lfder de Vk3-7 de raton. En una realizacion espedfica, la secuencia lfder esta unida operativamente a un segmento de gen V^lhumano reordenado.

En una realizacion, el segmento de gen V^lesta unido operativamente a una secuencia promotora de inmunoglobulina. En una realizacion, la secuencia promotora es una secuencia promotora humana. En una realizacion espedfica, el promotor de inmunoglobulina humana es un promotor de Vk3-15 humano. En una realizacion espedfica, el promotor esta unido operativamente a un segmento de gen V^lhumano reordenado.

En una realizacion, el locus de la cadena ligera comprende una secuencia lfder flanqueada en 5' (con respecto a la direccion de la transcripcion de un segmento de gen V^l) con un promotor de inmunoglobulina humana y flanqueada en 3' con un segmento de gen V^lhumano que se reorganiza con un segmento de J humano y codifica un dominio V^lde una cadena ligera quimerica inversa que comprende una region constante endogena de cadena ligera de raton (C^l). En una realizacion espedfica, el segmento de gen V^lesta en el locus Vk de raton, y la C^lde raton es una CK de raton.

En un caso, el locus de la cadena ligera comprende una secuencia lfder flanqueada en 5' (con respecto a la direccion de la transcripcion de un segmento de gen V^l) con un promotor de inmunoglobulina humana y flanqueada en 3' con una region de V^lhumana reordenada (secuencia de V^l/J^l) y codifica un dominio V^lde una cadena ligera quimerica inversa que comprende una region constante endogena de cadena ligera de raton (C^l). En un caso esped fico, la secuencia de V^l/J^lhumana reordenada esta en el locus kappa (k) de raton, y la CL de raton es una CK de raton.

En una realizacion, el locus de V^ldel raton modificado es un locus de cadena ligera k, y el locus de cadena ligera k comprende un potenciador intronico k de raton, un potenciador 3' k de raton, o tanto un potenciador intronico como un potenciador 3'.

En una realizacion, el raton comprende un locus de cadena ligera lambda (A) de inmunoglobulina no funcional. En una realizacion espedfica, el locus de la cadena ligera A comprende una eliminacion de una o mas secuencias del locus, en el que una o mas eliminaciones hacen que el locus de la cadena ligera A sea incapaz de reorganizarse para formar un gen de la cadena ligera. En otra realizacion, se eliminan todos o esencialmente todos los segmentos de gen V^ldel locus de la cadena ligera A.

En una realizacion, el raton genera una cadena ligera que comprende un dominio V^lmutado somaticamente derivado de un segmento del gen V^lhumano. En una realizacion, la cadena ligera comprende un dominio V^lmutado somaticamente derivado de un segmento del gen V^lhumano, y una region de C^kde raton. En una realizacion, el raton no expresa una cadena ligera A.

En una realizacion, el raton modificado geneticamente es capaz de hipermutar somaticamente la secuencia de la region de V^lhumana. En una realizacion espedfica, el raton comprende una celula que comprende un gen de cadena ligera de inmunoglobulina reordenado derivado de un segmento del gen V^lhumano que es capaz de reorganizarse y codificar un dominio V^l, y el gen de cadena ligera de inmunoglobulina reordenado comprende un dominio V^lmutado somaticamente.

En una realizacion, el raton comprende una celula que expresa una cadena ligera que comprende un dominio V^lhumano mutado somaticamente unido a una Ck de raton, en el que la cadena ligera se asocia con una cadena pesada que comprende un dominio V^hmutado somaticamente derivado de un segmento del gen V^hhumano y en el que la cadena pesada comprende una region constante de la cadena pesada del raton (C^h). En una realizacion espedfica, la cadena pesada comprende una C^h1 de raton, una bisagra de raton, una C^h2 de raton y una C^h3 de raton. En una realizacion espedfica, la cadena pesada comprende una C^h1 humana, una bisagra, una C^h2 de raton y una C^h3 de raton.

El raton proporcionado comprende uno o mas segmentos de gen V^hde la inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos de gen D^hde la inmunoglobulina humana y uno o mas segmentos de gen J^hde la inmunoglobulina humana unidos operativamente a una secuencia de region constante de inmunoglobulina de raton o de rata. En una realizacion, el raton comprende un reemplazo de segmentos de gen V^hde raton endogeno con uno o mas segmentos de gen V^hhumano, en el que los segmentos de gen V^hhumano estan unidos operativamente a un gen de la region de C^hde raton, de modo que el raton reorganiza los segmentos de gen V^hhumanos y expresa una cadena pesada de inmunoglobulina quimerica inversa que comprende un dominio V^hhumano y un C^hde raton. En una realizacion, del 90 al 100 % de los segmentos de gen V^hde raton no reordenados estan reemplazados por al menos un segmento de gen V^hhumano reordenado. En una realizacion espedfica, todos o esencialmente todos los segmentos de gen V^hde raton endogenos estan reemplazados por al menos un segmento del gen V^hhumano no reordenado. En una realizacion, el reemplazo es con al menos 19, al menos 39 o al menos 80 u 81 segmentos de gen V^hhumano no reordenados. En una realizacion, el reemplazo es con al menos 12 segmentos de gen VH humano no reordenados funcionales, al menos 25 segmentos de gen V^hhumano no reordenados funcionales o al menos 43 segmentos de gen V^hhumano no reordenados funcionales. En una realizacion, el raton comprende un reemplazo de todos los segmentos de D^hy J^hde raton por al menos un segmento de D^hhumano no reordenado y al menos un segmento de J^hhumano no reordenado. En una realizacion, el al menos un segmento de D^hhumano no reordenado se selecciona entre 1-1, D1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, y una combinacion de los mismos. En una realizacion, el al menos un segmento de JH humano no reordenado se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5, 6 y una combinacion de los mismos. En una realizacion espedfica, el uno o mas segmentos de gen V^hhumano se selecciona entre un segmento de gen V^hhumano 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3 48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 y una combinacion de los mismos.

En una realizacion, el raton comprende un linfocito B que expresa una protema de union que se une espedficamente a un antfgeno de interes, en el que la protema de union comprende una cadena ligera derivada de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano o un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano, y en el que la celula comprende un gen de cadena pesada de inmunoglobulina reordenado derivado de un reordenamiento de segmentos de gen V^hhumano seleccionados de entre un segmento de gen 1-69, 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, 4-59 y 5-51. En una realizacion, el uno o mas segmentos de gen VHhumanos se reorganizan con un segmento de gen JH de cadena pesada humana seleccionado de 1, 2, 3, 4, 5 y 6. En una realizacion, El uno o mas segmentos de gen VH y JH humanos se reorganizan con un segmento de gen D^hhumano seleccionado entre 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13 y 7-27. En una realizacion espedfica, el gen de la cadena ligera tiene 1, 2, 3, 4 o 5, o mas hipermutaciones somaticas.

En una realizacion, el raton comprende un linfocito B que comprende una secuencia genica de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina reordenada que comprende una region de V^h/D^h/J^hseleccionada entre 2-5/6-6/1, 2- 5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/3, 3- 30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/3-16/6, 5-51/5-5/3, 5-51/6-13/5, 3-53/1-1/4, 1-69/6-6/5 y 1-69/6-13/4. En una realizacion espedfica, los linfocitos B expresan una protema de union que comprende una region variable de la cadena pesada de inmunoglobulina humana fusionada con una region constante de la cadena pesada de raton, y una region variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana fusionada con una region constante de cadena ligera de raton.

En una realizacion, la region de V^lhumana reordenada es una secuencia de Vk1-39Jk5 humana, y el raton expresa una cadena ligera quimerica inversa que comprende (i) un dominio V^lderivado de la secuencia de V^l/J^lhumana e (ii) una C^lde raton; estando la cadena ligera asociada con una cadena pesada quimerica inversa que comprende (i) una C^hde raton e (ii) un dominio V^hhumano mutado somaticamente derivado de un segmento de gen V^hhumano seleccionado de un segmento de gen V^hhumano 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1, y una combinacion de los mismos. En una realizacion, el raton expresa una cadena ligera que esta mutada somaticamente. En una realizacion, la C^les una Ck de raton. En una realizacion espedfica, el segmento del gen V^hhumano se selecciona entre un segmento de gen 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 4-59, 5-51 y 1-69. En una realizacion espedfica, el dominio V^hhumano mutado somaticamente comprende una secuencia derivada de un segmento de D^hseleccionado entre 1-1, 1-7, 2-8, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13 y 7-27. En una realizacion espedfica, el dominio V^hhumano mutado somaticamente comprende una secuencia derivada de un segmento de J^hseleccionado entre 1, 2, 3, 4, 5 y 6. En una realizacion espedfica, el dominio V^hhumano mutado somaticamente esta codificado por una secuencia de V^h/D^h/J^hhumana reordenada seleccionada entre 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/5-5/3, 1-69/6-6/5 y 1-69/6-13/4.

En una realizacion, la region de V^lhumana reordenada es una secuencia de Vk3-20Jk1 humana, y el raton expresa una cadena ligera quimerica inversa que comprende (i) un dominio V^lderivado de la secuencia de V^l/J^lhumana reordenada e (ii) una C^lde raton; en la que la cadena ligera esta asociada con una cadena pesada quimerica inversa que comprende (i) una C^hde raton, e (ii) una V^hhumana mutada somaticamente derivada de un segmento de gen V^hhumano seleccionado entre un segmento de gen V^hhumano 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31,4-39, 4-59, 5-51,6-1, y una combinacion de los mismos. En una realizacion, el raton expresa una cadena ligera que esta mutada somaticamente. En una realizacion, la C^les una C^kde raton. En una realizacion espedfica, el segmento del gen V^hhumano se selecciona entre un segmento de gen 3-30, 3-33, 3-53, 4 39 y 5-51. En una realizacion espedfica, el dominio V^hhumano mutado somaticamente comprende una secuencia derivada de un segmento de D^hseleccionado entre 1-1, 1-7, 1-26, 2-15, 3-3, 3-16 y 6-13. En una realizacion espedfica, el dominio V^hhumano mutado somaticamente comprende una secuencia derivada de un segmento de J^hseleccionado entre 3, 4, 5 y 6. En una realizacion espedfica, el dominio V^hhumano mutado somaticamente esta codificado por una secuencia de V^h/D^h/J^hhumana reordenada seleccionada de 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 5-51/3-16/6, 5-51/6-13/5 y 3-53/1-1/4.

Tambien se hace referencia a un raton que comprende tanto una secuencia de Vk1-39Jk5 humana reordenada como una secuencia de Vk3-20Jk1 humana reordenada, y el raton expresa una cadena ligera quimerica inversa que comprende (i) un dominio V^lderivado de la secuencia de Vk1-39Jk5 humana o la secuencia de Vk3-20Jk1 humana; e (ii) una C^lde raton; en la que la cadena ligera esta asociada con una cadena pesada quimerica inversa que comprende (i) una C^hde raton, e (ii) una V^hhumana mutada somaticamente derivada de un segmento de gen V^hhumano seleccionado entre un segmento de gen V^hhumano 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3- 23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1, y una combinacion de los mismos. En un caso, el raton expresa una cadena ligera que esta mutada somaticamente. En un caso, la C^les una CK de raton.

En una realizacion, del 90 al 100 % de los segmentos de gen V^hde raton no reordenados endogenos estan reemplazados por al menos un segmento de gen V^hhumano reordenado. En una realizacion espedfica, todos o esencialmente todos los segmentos de gen V^hde raton no reordenados endogenos estan reemplazados por al menos un segmento del gen V^hhumano no reordenado. En una realizacion, el reemplazo es con al menos 18, al menos 39, al menos 80 u 81 segmentos de gen V^hhumano no reordenados. En una realizacion, el reemplazo es con al menos 12 segmentos de gen V^hhumano no reordenados funcionales, al menos 25 segmentos de gen V^hhumano no reordenados funcionales o al menos 43 segmentos de gen V^hhumano no reordenados.

En una realizacion, el raton modificado geneticamente es una cepa C57BL, en una realizacion espedfica, seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/Ola. En una realizacion espedfica, el raton modificado geneticamente es una mezcla de una cepa 129 anteriormente mencionada y una cepa C57BL/6 anteriormente mencionada. En otra realizacion espedfica, el raton es una mezcla de las cepas 129 anteriormente mencionadas, o una mezcla de las cepas BL/6 anteriormente mencionadas. En una realizacion espedfica, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac).

Tambien se describe un raton que expresa un anticuerpo quimerico inverso que comprende una cadena ligera que comprende una Ck de raton y un dominio V^lhumano mutado somaticamente derivado de una secuencia de Vk1-39Jk5 humana reordenada o una secuencia de Vk3-20Jk1 humana reordenada, y una cadena pesada que comprende una C^hde raton y un dominio V^hhumano mutado somaticamente derivado de un segmento de gen V^hhumano seleccionado entre un segmento de gen V^hhumano 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3 30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 y 6-1, raton que no expresa un anticuerpo completamente de raton y que no expresa un anticuerpo completamente humano. En un caso, el raton comprende un locus de la cadena ligera k que comprende un reemplazo de los segmentos de gen de la cadena ligera kappa del raton endogeno con la secuencia de Vk1-39Jk5 humana reordenada o la secuencia de Vk3-20Jk1 humana reordenada, y comprende un reemplazo de todos o esencialmente todos los segmentos de genes V^hde raton endogenos con un repertorio completo o esencialmente completo de segmentos de genes VH humanos.

Tambien se describe una poblacion de anticuerpos espedficos del antfgeno derivados de un raton como el descrito en el presente documento, en la que los anticuerpos comprenden un gen de cadena ligera derivado de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humana o un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humana, y en la que los anticuerpos comprenden un gen de cadena pesada de inmunoglobulina reordenada derivado de un reordenamiento de un segmento de gen V^hhumano seleccionado de un segmento del gen V^hhumano 1-2, 1-3, 1-8, 1-18, 1-24, 1-46, 1-58, 1-69, 2-5, 2-26, 2-70, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-43, 3-48, 3-53, 3-64, 3-72, 3-73, 4- 31, 4-34, 4-39, 4-59, 5-51 y 6-1. En un caso, el uno o mas segmentos de gen VHhumanos se reorganizan con un segmento de gen J^hde cadena pesada humana seleccionado de 1, 2, 3, 4, 5 y 6. En un caso espedfico, la cadena ligera tiene 1, 2, 3, 4 o 5, o mas hipermutaciones somaticas.

En una realizacion, la cadena ligera tiene 1, 2, 3 o 4 hipermutaciones somaticas. En una realizacion, el gen de la cadena ligera tiene 1 o 2 mutaciones. En diversas realizaciones, el gen de la cadena ligera es capaz de incurrir en mutaciones multiples a lo largo de su secuencia.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y la cadena ligera tiene al menos una o no mas de cuatro hipermutaciones somaticas. En una realizacion, la cadena ligera comprende al menos dos hipermutaciones somaticas. En una realizacion, la cadena ligera comprende al menos tres hipermutaciones somaticas. En una realizacion, la cadena ligera comprende al menos cuatro hipermutaciones somaticas. En una realizacion espedfica, al menos una de dichas hipermutaciones somaticas esta presente en una o mas regiones marco conservadas (FW) de la cadena ligera. En una realizacion espedfica, al menos una de dichas hipermutaciones somaticas esta presente en una o mas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera.

En una realizacion espedfica, al menos una de dichas hipermutaciones somaticas esta presente en una o mas FW y/o una o mas CDR de la cadena ligera. En diversas realizaciones, las regiones marco conservadas se seleccionan entre la region marco conservada 1 (FW1), la region marco conservada 2 (FW2), la region marco conservada 3 (FW3) y/o una combinacion de las mismas. En diversas realizaciones, las CDR se seleccionan de entre CDR1, CDR2, CDR3 y/o una combinacion de las mismas.

En una realizacion, la cadena pesada comprende al menos una mutacion en una o mas FW o una o mas CDR. En una realizacion, la cadena pesada comprende al menos una mutacion en una o mas FW y una o mas CDR. En una realizacion, la cadena pesada comprende al menos dos mutaciones en una o mas FW y una o mas CDR. En una realizacion, la cadena pesada comprende al menos tres mutaciones en una o mas FW y una o mas CDR. En una realizacion, la cadena pesada comprende al menos cuatro mutaciones en una o mas FW y una o mas CDR. En una realizacion, la cadena pesada comprende al menos cinco o mas de cinco mutaciones en una o mas FW y una o mas CDR; en una realizacion espedfica, la cadena pesada comprende al menos cinco o mas de cinco mutaciones en dos FW; en una realizacion espedfica, la cadena pesada comprende al menos cinco o mas de cinco mutaciones en una FW y una CDR.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 9 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen al menos una mutacion presente en FW1; en una realizacion, al menos el 9 % de las cadenas ligeras comprenden una mutacion presente en FW1. En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 25 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen al menos una mutacion o mas de dos mutaciones presentes en CDR1; en una realizacion, al menos el 19 % de las cadenas ligeras tienen una mutacion presente en CDR1; en una realizacion, al menos el 5 % de las cadenas ligeras tienen dos mutaciones presentes en CDR1.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 20 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen al menos una mutacion o mas de tres mutaciones presentes en FW2; en una realizacion, al menos el 17 % de las cadenas ligeras tienen una mutacion presente en FW2; en una realizacion, al menos el 1 % de las cadenas ligeras tienen dos mutaciones presentes en FW2; en una realizacion, al menos el 1 % de las cadenas ligeras tienen tres mutaciones presentes en FW2.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 10 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen al menos una mutacion o mas de dos mutaciones presentes en CDR2; en una realizacion, al menos el 10 % de las cadenas ligeras tienen una mutacion presente en CDR2; en una realizacion, al menos el 1 % de las cadenas ligeras tienen dos mutaciones presentes en CDR2.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 29 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen al menos una mutacion o mas de cuatro mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 21 % de las cadenas ligeras tienen una mutacion presente en FW3; en una realizacion, al menos el 5 % de las cadenas ligeras tienen dos mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 2 % de las cadenas ligeras tienen tres mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 2 % de las cadenas ligeras tienen cuatro mutaciones presentes en FW3.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 37 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen al menos una mutacion o mas de cuatro mutaciones presentes en CDR3; en una realizacion, al menos el 27 % de las cadenas ligeras tienen una mutacion presente en CDR3; en una realizacion, al menos el 8 % de las cadenas ligeras tienen dos mutaciones presentes en c DR3; en una realizacion, al menos el 1 % de las cadenas ligeras tienen tres mutaciones presentes en CDR3; en una realizacion, al menos el 1 % de las cadenas ligeras tienen cuatro mutaciones presentes en CDR3.

Tambien se describe una poblacion de anticuerpos espedficos del antfgeno derivados de un raton como el descrito en el presente documento, en la que los anticuerpos comprenden una cadena ligera derivada de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 9 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen una o mas mutaciones presentes en FW1, aproximadamente el 25 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen una o mas mutaciones presentes en CDR1, aproximadamente el 20 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen una o mas mutaciones presentes en FW2, aproximadamente el 10 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen una o mas mutaciones presentes en CDR2, aproximadamente el 29 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen una o mas mutaciones presentes en FW3, y aproximadamente el 37 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39/Jk5 tienen una o mas mutaciones presentes en CDR3.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 35 % de las cadenas pesadas tienen al menos una mutacion presente en FW1; en una realizacion, al menos el 25 % de las cadenas pesadas tienen una mutacion presente en FW1; en una realizacion, al menos el 9 % de las cadenas pesadas tienen dos mutaciones presentes en FW1; en una realizacion, al menos el 1 % de las cadenas pesadas tienen tres mutaciones presentes en FW1; en una realizacion, al menos el 1 % de las cadenas pesadas tienen mas de cinco mutaciones presentes en FW1.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 92 % de las cadenas pesadas tienen al menos una o no mas de cuatro mutaciones presentes en CDR1; en una realizacion, al menos el 92 % de las cadenas pesadas tienen al menos una, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro mutaciones presentes en CDR1; en una realizacion, al menos el 26 % de las cadenas pesadas tienen una mutacion presente en CDR1; en una realizacion, al menos el 44 % de las cadenas pesadas tienen dos mutaciones presentes en CDR1; en una realizacion, al menos el 19 % de las cadenas pesadas tienen tres mutaciones presentes en CDR1; en una realizacion, al menos el 3 % de las cadenas pesadas tienen cuatro mutaciones presentes en CDR1.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 66 % de las cadenas pesadas tienen al menos una o no mas de tres mutaciones presentes en FW2; en una realizacion, al menos el 66 % de las cadenas pesadas tienen al menos una, al menos dos o al menos tres mutaciones presentes en FW2; en una realizacion, al menos el 35 % de las cadenas pesadas tienen una mutacion presente en FW2; en una realizacion, al menos el 23 % de las cadenas pesadas tienen dos mutaciones presentes en FW2; en una realizacion, al menos el 8 % de las cadenas pesadas tienen tres mutaciones presentes en FW2.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 70 % de las cadenas pesadas tienen al menos una o no mas de cuatro mutaciones presentes en CDR2; en una realizacion, al menos el 70 % de las cadenas pesadas tienen al menos dos, al menos tres o al menos cuatro mutaciones presentes en CDR2; en una realizacion, al menos el 34 % tienen una mutacion presente en CDR2; en una realizacion, al menos el 20 % de las cadenas pesadas tienen dos mutaciones presentes en CDR2; en una realizacion, al menos el 12 % de las cadenas pesadas tienen tres mutaciones presentes en CDR2; en una realizacion, al menos el 5 % de las cadenas pesadas tienen cuatro mutaciones presentes en CDR2.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 91 % de las cadenas pesadas tienen al menos una o hasta cinco o mas mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 91 % de las cadenas pesadas tienen al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco o mas mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 19 % de las cadenas pesadas tienen una mutacion presente en FW3; en una realizacion, al menos el 33 % de las cadenas pesadas tienen dos mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 22 % de las cadenas pesadas tienen tres mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 11 % de las cadenas pesadas tienen cuatro mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 7 % de las cadenas pesadas tienen cinco mutaciones o mas presentes en FW3.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y aproximadamente el 63 % de las cadenas pesadas tienen al menos una o no mas de dos mutaciones presentes en CDR3; en una realizacion, al menos el 63 % de las cadenas pesadas tienen una mutacion presente en CDR3; en una realizacion, al menos el 54 % de las cadenas pesadas tienen una mutacion presente en CDR3; en una realizacion, al menos el 9 % de las cadenas pesadas tienen dos mutaciones presentes en CDR3.

Tambien se describe una poblacion de anticuerpos espedficos del antigeno derivados de un raton como el descrito en el presente documento, en la que los anticuerpos comprenden una cadena ligera derivada de un reordenamiento de Vk1-39/Jk5 humano y al menos el 35 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en FW1, aproximadamente el 92 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en CDR1, aproximadamente el 66 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en FW2, aproximadamente el 70 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en CDR2, aproximadamente el 91 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en FW3, y aproximadamente el 63 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en CDR3.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y el gen de la cadena ligera tiene al menos una o no mas de dos hipermutaciones somaticas; en una realizacion, el gen de la cadena ligera tiene al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o mas hipermutaciones somaticas. En una realizacion espedfica, las mutaciones estan presentes en una o mas regiones marco conservadas de la cadena ligera. En una realizacion espedfica, las mutaciones estan presentes en una o mas regiones CDR de la cadena ligera. En una realizacion espedfica, las mutaciones estan presentes en una o mas regiones marco conservadas y/o una o mas regiones CDR de la cadena ligera. En diversas realizaciones, las regiones marco conservadas se seleccionan entre la region marco conservada 1 (FW1), la region marco conservada 2 (FW2), la region marco conservada 3 (FW3) y/o una combinacion de las mismas.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 10 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen al menos una mutacion presente en FW1; en una realizacion, al menos el 10 % de las cadenas ligeras tienen una mutacion en FW1.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 53 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen al menos una mutacion o mas de dos mutaciones presentes en CDR1; en una realizacion, al menos el 27 % de las cadenas ligeras tienen una o mas mutaciones en CDR1; en una realizacion, aproximadamente el 54 % de las cadenas ligeras tienen una o dos mutaciones presentes en CDR1.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 6 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen al menos una mutacion o mas de dos mutaciones presentes en FW2; en una realizacion, al menos el 6 % de las cadenas ligeras tienen al menos una mutacion presente en FW2; en una realizacion, al menos el 3 % de las cadenas ligeras tienen una mutacion presente en FW2; en una realizacion, al menos el 3 % de las cadenas ligeras tienen dos mutaciones presentes en FW2.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y al menos aproximadamente el 3 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen al menos una mutacion presente en CDR2; en una realizacion, al menos el 3 % de las cadenas ligeras tienen una mutacion en CDR2.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 17 % o mas de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen al menos una mutacion o mas de dos mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 20 % de las cadenas ligeras tienen una mutacion presente en FW3; en una realizacion, al menos el 17 % de las cadenas ligeras tienen dos mutaciones presentes en FW3.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y al menos el 43 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen al menos una mutacion presente en CDR3; en una realizacion, al menos el 43 % de las cadenas ligeras tienen una mutacion en CDR3.

Tambien se describe una poblacion de anticuerpos espedficos del antfgeno derivados de un raton como el descrito en el presente documento, en la que los anticuerpos comprenden una cadena ligera derivada de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 10 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen una o mas mutaciones presentes en al menos, aproximadamente el 53 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen una o mas mutaciones presentes en CDR1, aproximadamente el 6 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen una o mas mutaciones presentes en FW2, aproximadamente el 3 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen una o mas mutaciones presentes en CDR2, aproximadamente el 37 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen una o mas mutaciones presentes en FW3, y aproximadamente el 43 % de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20/Jk1 tienen una o mas mutaciones presentes en CDR3.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 43 % de las cadenas pesadas tienen al menos una o no mas de dos mutaciones presentes en FWl; en una realizacion, al menos el 41 % de las cadenas pesadas tienen al menos una mutacion presente en FW1; en una realizacion, aproximadamente el 41 % de las cadenas pesadas tienen una mutacion presente en FW1; en una realizacion, aproximadamente el 2 % de las cadenas pesadas tienen dos mutaciones presentes en FW1.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 92 % de las cadenas pesadas tienen al menos una o no mas de cuatro mutaciones presentes en CDR1; en una realizacion, al menos el 43 % de las cadenas pesadas tienen al menos una mutacion presente en CDR1; en una realizacion, al menos el 25 % de las cadenas pesadas tienen al menos dos mutaciones presentes en CDR1; en una realizacion, al menos el 15 % de las cadenas pesadas tienen al menos 3 mutaciones presentes en CDR1; en una realizacion, al menos el 10 % de las cadenas pesadas tienen 4 mutaciones o mas presentes en CDR1.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 46 % de las cadenas pesadas tienen al menos una o no mas de tres mutaciones presentes en FW2; en una realizacion, al menos el 34 % de las cadenas pesadas tienen al menos una mutacion presente en FW2; en una realizacion, al menos el 10 % de las cadenas pesadas tienen dos o mas mutaciones presentes en FW2; en una realizacion, al menos el 2 % de las cadenas pesadas tienen tres mutaciones o mas presentes en FW2.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 84 % de las cadenas pesadas tienen al menos una o hasta cinco o mas de cinco mutaciones presentes en CDR2; en una realizacion, al menos el 39 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones o mas presentes en CDR2; en una realizacion, al menos el 18 % de las cadenas pesadas tienen dos o mas mutaciones presentes en CDR2; en una realizacion, al menos el 21 % de las cadenas pesadas tienen tres o mas mutaciones presentes en CDR2; en una realizacion, al menos el 3 % de las cadenas pesadas tienen cuatro o mas mutaciones presentes en CDR2; en una realizacion, al menos el 2 % de las cadenas pesadas tienen cinco mutaciones o mas presentes en CDR2.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 92 % de las cadenas pesadas tienen al menos una o hasta cinco o mas de cinco mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 21 % de las cadenas ligeras tienen al menos una mutacion presente en FW3; en una realizacion, al menos el 20 % de las cadenas pesadas tienen al menos dos mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 13 % de las cadenas pesadas tienen al menos tres mutaciones presentes en FW3; en una realizacion, al menos el 20 % de las cadenas pesadas tienen al menos cuatro mutaciones en FW3; en una realizacion, al menos el 18 % de las cadenas pesadas tienen al menos 5 mutaciones en FW3.

En una realizacion, la cadena ligera se deriva de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 7 % de las cadenas pesadas tienen al menos una mutacion presente en CDR3; en una realizacion, aproximadamente el 7 % de las cadenas pesadas tienen una mutacion en CDR3.

Tambien se describe una poblacion de anticuerpos espedficos del antigeno derivados de un raton como el descrito en el presente documento, en la que los anticuerpos comprenden una cadena ligera derivada de un reordenamiento de Vk3-20/Jk1 humano y aproximadamente el 43 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en FW1, aproximadamente el 92 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en CDR1, aproximadamente el 46 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en FW2, aproximadamente el 84 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en CDR2, aproximadamente el 92 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en FW3, y aproximadamente el 7 % de las cadenas pesadas tienen una o mas mutaciones presentes en CDR3.

Tambien se hace referencia a un raton que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada, en el que la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada esta presente en la lmea germinal del raton, en el que la cadena ligera de inmunoglobulina comprende una secuencia variable humana. En un caso, la lmea germinal del raton comprende una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada que se deriva del mismo segmento V y el mismo segmento J que todas las secuencias de cadena ligera no sustitutas presentes en cada linfocito B del raton que comprende una secuencia de cadena ligera reordenada.

En una realizacion, la lmea germinal del raton carece de un segmento genico V de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenada funcional. En una realizacion, la lmea germinal del raton carece de un segmento genico J funcional de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenada.

En un caso, la lmea germinal del raton comprende no mas de una, no mas de dos, o no mas de tres secuencias de cadenas ligeras (V/J) reordenadas.

En un caso, la secuencia V/J reordenada comprende una secuencia de cadena ligera k. En un caso espedfico, la secuencia de cadena ligera k es una secuencia de cadena ligera k humana. En un caso espedfico, la secuencia de cadena ligera k se selecciona de una secuencia de Vk1-39/J humana, una secuencia de Vk3-20/J humana y una combinacion de las mismas. En un caso espedfico, la secuencia de cadena ligera k es una secuencia de Vk1-39/Jk5 humana. En un caso espedfico, la secuencia de cadena ligera k es una secuencia de Vk3-20/Jk1 humana.

En una realizacion, el raton comprende ademas en su lmea germinal una secuencia seleccionada de un potenciador intronico k de raton 5' con respecto a la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada, un potenciador 3' k de raton y una combinacion de los mismos.

En una realizacion, el raton comprende un segmento de gen V^hhumano no reordenado, un segmento de gen Dh humano no reordenado y un segmento de gen J^hhumano no reordenado, en el que dichos segmentos de gen V^h, D^hy J^hson capaces de reorganizarse para formar una secuencia de genes variable de cadena pesada de inmunoglobulina unida operativamente a una secuencia de genes constante de cadena pesada. En una realizacion, el raton comprende una pluralidad de segmentos de gen V^h, D^hy J^hhumanos. En una realizacion espedfica, los segmentos de gen V^h, D^hy J^hhumanos reemplazan segmentos de gen V^h, D^hy J^hde raton endogenos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de raton endogeno. En una realizacion espedfica, el raton comprende un reemplazo de todos o esencialmente todos los segmentos de gen V^h, D^hy J^hde raton funcionales con todos o esencialmente todos los segmentos de gen V^h, D^hy J^hhumanos funcionales.

En una realizacion, el raton expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia constante de raton. En una realizacion, el raton expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia constante humana.

En una realizacion, el raton expresa una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de raton seleccionada de una secuencia C^h1, una secuencia bisagra, una secuencia C^h2, una secuencia C^h3 y una combinacion de las mismas.

En una realizacion, el raton expresa una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia humana seleccionada de una secuencia C^h1, una secuencia bisagra, una secuencia C^h2, una secuencia C^h3 y una combinacion de las mismas.

En un caso, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada de la lmea germinal del raton esta en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endogeno de raton. En un caso espedfico, la secuencia de la cadena ligera de inmunoglobulina reordenada en la lmea germinal del raton reemplaza todas o esencialmente todas las secuencias V y J de la cadena ligera del raton en el locus de la cadena ligera de la inmunoglobulina endogeno del raton.

Tambien se hace referencia a un raton que comprende una poblacion de linfocitos B caracterizada por cada linfocito B que comprende una secuencia de cadena ligera no sustituta, secuencia que comprende un gen de cadena ligera reordenado que se genera a partir de un solo segmento de gen V humano y un solo segmento de gen J humano, en el que la unica secuencia variable de cadena ligera de la lmea germinal del raton es una secuencia reordenada generada a partir del segmento V humano unico y el segmento J humano unico, y en el que cada linfocito B que comprende el gen de cadena ligera reordenado comprende ademas un gen que codifica un dominio variable de cadena pesada humano afrn, y en el que el gen de cadena ligera reordenado comprende al menos una, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro hipermutaciones somaticas.

Tambien se hace referencia a un raton cuya poblacion de linfocitos B maduros se caracteriza porque cada linfocito B maduro comprende una secuencia de cadena ligera no sustituta en su superficie, secuencia que comprende un gen de cadena ligera reordenado que se genera a traves del reordenamiento de uno de dos segmentos de gen V^lhumano y uno de no mas de cinco segmentos de gen J^lhumano, en el que la unica secuencia variable de cadena ligera (secuencia de V^lJ^l) en la lmea germinal del raton es una secuencia reordenada que se genera a traves del reordenamiento de uno de los dos segmentos de gen V^lhumano y uno de los no mas de cinco segmentos de gen J^lhumano, y en el que cada linfocito B que comprende el gen de la cadena ligera reordenada comprende ademas un gen que codifica un dominio variable de cadena pesada humano afrn, y en el que el gen de la cadena ligera reordenada comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o cinco o mas hipermutaciones somaticas. En algunos casos, un gen de cadena ligera reordenado comprende una, dos, tres, cuatro o cinco hipermutaciones somaticas. En algunas realizaciones, los ratones como se describen en el presente documento se han inmunizado con un antfgeno de interes y, en algunos casos, una poblacion de linfocitos B maduros se enriquece con linfocitos B que se unen al antfgeno de interes.

En algunas realizaciones, el raton proporcionado es aquel cuya poblacion de linfocitos B maduros se caracteriza porque cada linfocito B maduro comprende una secuencia de cadena ligera no sustituta en su superficie, secuencia que comprende un gen de cadena ligera reordenado que se genera a traves del reordenamiento de uno de dos segmentos de gen V^lhumano y uno de 5 segmentos de gen J^lhumano, en el que los segmentos de genes V^lconsisten esencialmente en dos segmentos de genes V^lque no son identicos, y el locus de V^lcomprende 5 segmentos de genes J^lhumanos, y en el que cada linfocito B que comprende el gen de la cadena ligera reordenado comprende ademas un gen que codifica un dominio variable de cadena pesada humano afrn, y en el que el gen de cadena ligera reordenado comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o cinco o mas hipermutaciones somaticas. En algunas realizaciones, un gen de cadena ligera reordenado comprende una, dos, tres, cuatro o cinco hipermutaciones somaticas. En algunas realizaciones, los ratones como se describen en el presente documento se han inmunizado con un antfgeno de interes y, en algunas realizaciones, una poblacion de linfocitos B maduros se enriquece con linfocitos B que se unen al antfgeno de interes.

En un aspecto, se proporciona una celula pluripotente, pluripotente inducida o totipotente derivada de un raton como el descrito en el presente documento. En una realizacion espedfica, la celula es una celula madre embrionaria (ES) de raton.

En un aspecto, se proporciona un tejido derivado de un raton como el descrito en el presente documento. En una realizacion, el tejido se deriva de bazo, ganglio linfatico o medula osea de un raton como el descrito en el presente documento.

En un aspecto, se proporciona un nucleo derivado de un raton como el descrito en el presente documento. En una realizacion, el nucleo es de una celula diploide que no es un linfocito B.

En un aspecto, se proporciona una celula de raton que esta aislada de un raton como el descrito en el presente documento. En una realizacion, la celula es una celula ES. En una realizacion, la celula es un linfocito. En una realizacion, el linfocito es un linfocito B. En una realizacion, el linfocito B expresa una cadena pesada quimerica que comprende un dominio variable derivado de un segmento de gen humano; y una cadena ligera derivada de una secuencia de Vk1-39/J humana reordenada, una secuencia de Vk3-20/J humana reordenada o una combinacion de las mismas; en el que el dominio variable de cadena pesada se fusiona con una region constante del raton, y el dominio variable de cadena ligera se fusiona con una region constante de raton o humana.

En un aspecto, se proporciona un hibridoma, en el que el hibridoma se fabrica con un linfocito B de un raton como el descrito en el presente documento. En una realizacion espedfica, el linfocito B es de un raton como el descrito en el presente documento que se ha inmunizado con un inmunogeno que comprende un epftopo de interes, y el linfocito B expresa una protema de union que se une al epftopo de interes, la protema de union tiene un dominio V^hhumano mutado somaticamente y una C^hde raton, y tiene un dominio V^lhumano derivado de un Vk1-39Jk5 humano reordenado o un Vk3-20Jk1 humano reordenado y una C^lde raton.

En un aspecto, se proporciona un embrion de raton, en el que el embrion comprende una celula ES de donante que se deriva de un raton como el descrito en el presente documento.

Tambien se hace referencia a un vector de direccion, que comprende, de 5' a 3' en direccion de la transcripcion con referencia a las secuencias de los brazos de homologfa de raton 5' y 3' del vector, un brazo de homologfa de raton 5', un promotor de inmunoglobulina humano o de raton, una secuencia lfder humana o de raton, y una region de V^lhumana seleccionada de un Vk1-39Jk5 humano reordenado o un Vk3-20Jk1 humano reordenado y un brazo de homologfa de raton 3'. En un caso, los brazos de homologfa 5' y 3' dirigen el vector a una secuencia 5' con respecto a una secuencia potenciadora que esta presente en 5' y proxima al gen Ck de raton. En un caso, el promotor es un promotor del segmento genico de la region variable de inmunoglobulina humana. En un caso espedfico, el promotor es un promotor de Vk3-15 humano. En un caso, la secuencia ftder es una secuencia ftder de raton. En un caso espedfico, la secuencia ftder de raton es una secuencia ftder de Vk3-7 de raton.

Tambien se hace referencia a un vector de direccion segun lo descrito anteriormente, pero en lugar del brazo de homologfa del raton 5', el promotor humano o del raton esta flanqueado en 5' con un sitio de reconocimiento de recombinasa espedfico del sitio (SRRS), y en lugar del brazo de homologfa de raton 3', la region de V^lhumana esta flanqueada en 3' con un SRRS.

Tambien se hace referencia a un anticuerpo quimerico inverso generado por un raton como el descrito en el presente documento, en el que el anticuerpo quimerico inverso comprende una cadena ligera que comprende una V^lhumana y una CL de raton, y una cadena pesada que comprende una V^hhumana y un C^hde raton.

En un aspecto, se proporciona un metodo de generacion de un anticuerpo, que comprende expresar, en una sola celula, (a) una primera secuencia del gen V^hde un raton inmunizado como se describe en el presente documento fusionada con una secuencia del gen C^hhumano; (b) una secuencia del gen V^lde un raton inmunizado como se describe en el presente documento fusionada con una secuencia del gen C^lhumano; y (c) mantener la celula en condiciones suficientes para expresar un anticuerpo completamente humano y aislar el anticuerpo. En una realizacion, la celula comprende una segunda secuencia del gen V^hde un segundo raton inmunizado como se describe en el presente documento fusionada con una secuencia del gen C^hhumano, la primera secuencia de gen V^hcodifica un dominio V^hque reconoce un primer epftopo, y la segunda secuencia del gen V^hcodifica un dominio V^hque reconoce un segundo epftopo, en el que el primer epftopo y el segundo epftopo no son identicos.

En un aspecto, se proporciona un metodo de generacion de una protema de union al epftopo, que comprende exponer a un raton como el descrito en el presente documento a un inmunogeno que comprende un epftopo de interes, Mantener el raton en condiciones suficientes para que el raton genere una molecula de inmunoglobulina que se una espedficamente el epftopo de interes y aislar la molecula de inmunoglobulina que se une espedficamente al epftopo de interes; en el que la protema de union al epftopo comprende una cadena pesada que comprende una V^hhumana mutada somaticamente y una C^hde raton, asociada con una cadena ligera que comprende una C^lde raton y una V^lhumana derivada de un Vk1-39Jk5 humano reordenado o un Vk3-20Jk1 humano reordenado.

En un aspecto, se proporciona una celula que expresa una protema de union al epftopo, en el que la celula comprende: (a) una secuencia de nucleotidos humana que codifica un dominio V^lhumano que se deriva de un Vk1-39Jk5 humano reordenado o un Vk3-20Jk1 humano reordenado, en la que la secuencia de nucleotidos humana esta fusionada (directamente o a traves de un enlazador) a una secuencia de ADNc del dominio constante de cadena ligera de la inmunoglobulina humana (por ejemplo, una secuencia del ADN del dominio constante k humano); y (b) una primera secuencia de nucleotidos V^hhumana que codifica un dominio V^hhumano derivado de una primera secuencia de nucleotidos V^hhumana, en el que la primera secuencia de nucleotidos V^hhumana esta fusionada (directamente o a traves de un conector) a una secuencia de ADNc de dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana; en el que la protema de union al epftopo reconoce un primer epftopo. En una realizacion, la protema de union al epftopo se une al primer epftopo con una constante de disociacion inferior a 10-6 M, inferior a 10-8 M, inferior a 10-9 M, inferior a 10-10 M, Inferior a 10-11 M o inferior a 10-12 M.

En una realizacion, la celula comprende una segunda secuencia de nucleotidos humana que codifica un segundo dominio V^hhumano, en la que la segunda secuencia humana esta fusionada (directamente o a traves de un enlazador) a una secuencia de ADNc de dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y en la que el segundo dominio V^hhumano no reconoce espedficamente el primer epftopo (por ejemplo, muestra una constante de disociacion de, por ejemplo, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M o superior), y en la que la protema de union al epftopo reconoce el primer epftopo y el segundo epftopo, y en la que la primera y la segunda cadena pesada de inmunoglobulina se asocian cada una con una cadena ligera identica de (a).

En una realizacion, el segundo dominio V^hse une al segundo epftopo con una constante de disociacion que es inferior a 10-6 M, inferior a 10-1 M, inferior a 10-8 M, inferior a 10-9 M, inferior a 10-10 M, Inferior a 10-11 M o inferior a 10-12 M.

En una realizacion, la protema de union al epftopo comprende una primera cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina, cada una asociada con una cadena ligera identica derivada de una region V^lhumana reordenada seleccionada de un Vk1-39Jk5 humano o un Vk3-20Jk1 humano, en la que la primera cadena pesada de inmunoglobulina se une a un primer epftopo con una constante de disociacion en el intervalo de nanomolar a picomolar, la segunda cadena pesada de inmunoglobulina se une a un segundo epftopo con una constante de disociacion en el intervalo de nanomolar a picomolar, el primer epftopo y el segundo epftopo no son identicos, la primera cadena pesada de inmunoglobulina no se une al segundo epftopo o se une al segundo epftopo con una constante de disociacion mas debil que el intervalo micromolar (por ejemplo, el intervalo milimolar), la segunda cadena pesada de inmunoglobulina no se une al primer epftopo o se une al primer epftopo con una constante de disociacion mas debil que el intervalo micromolar (por ejemplo, el intervalo milimolar), y una o mas de entre la V^l, la V^hde la primera cadena pesada de inmunoglobulina y la V^hde la segunda cadena pesada de inmunoglobulina, estan mutadas somaticamente.

En una realizacion, la primera cadena pesada de inmunoglobulina comprende un resto de union a la protema A, y la segunda cadena pesada de inmunoglobulina carece del resto de union a la protema A.

En una realizacion, la celula se selecciona entre CHO, COS, 293, HeLa y una celula retiniana que expresa una secuencia de acido nucleico vmco (por ejemplo, una celula PERC.6™).

T ambien se hace referencia a un anticuerpo quimerico inverso, que comprende una V^hhumana y un dominio constante de cadena pesada de raton, una V^lhumana y un dominio constante de cadena ligera de raton, en el que el anticuerpo se genera mediante un proceso que comprende inmunizar un raton como el descrito en el presente documento con un inmunogeno comprende un epftopo, y el anticuerpo se une espedficamente al epftopo del inmunogeno con el que se inmunizo el raton. En un caso, el dominio V^lesta mutado somaticamente. En un caso, el dominio VHesta mutado somaticamente. En un caso, tanto el dominio V^lcomo el dominio V^hestan mutados somaticamente. En un caso, la V^lesta vinculada a un dominio Ck de raton.

Tambien se hace referencia a un raton, que comprende segmentos de gen V^hhumano que reemplazan todos o esencialmente todos los segmentos de gen V^hdel raton en el locus de la cadena pesada de raton endogeno; no mas de una o dos secuencias V^l/J^lde cadena ligera humanas reordenadas seleccionadas entre una Vk1-39/J reordenada y una Vk3-20/J reordenada o una combinacion de las mismas, que reemplaza todos los segmentos genicos de cadena ligera de raton; en el que los segmentos genicos variables de cadena pesada humanos estan unidos a un gen constante de raton, y las secuencias de cadena ligera humanas reordenadas estan vinculadas a un gen constante humano o de raton.

En algunas realizaciones, se proporciona un raton, que comprende segmentos de gen V^hde inmunoglobulina humano que reemplazan todos o esencialmente todos los segmentos de gen V^hde inmunoglobulina de raton en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de raton endogeno; no mas de dos segmentos gen V^lde inmunoglobulina humanos no reordenados y dos o mas (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos de gen J^lde inmunoglobulina humanos no reordenados o cinco segmentos de gen J^lde inmunoglobulina humanos, que reemplazan todos los segmentos genicos de cadena ligera de inmunoglobulina de raton; en el que los segmentos de gen V^hde inmunoglobulina humanos estan unidos a un gen constante de inmunoglobulina de raton, y los segmentos de gen V^ly J^lde inmunoglobulina humanos no reordenados estan unidos a un gen constante de inmunoglobulina humano o no humano. En algunas realizaciones, un gen constante no humano es un gen constante de inmunoglobulina de raton. En algunas realizaciones, un gen constante de inmunoglobulina no humano es un gen constante de inmunoglobulina de rata.

Tambien se hace referencia a una celula ES de raton que comprende un reemplazo de todos o esencialmente todos los segmentos genicos variables de cadena pesada de raton por segmentos genicos variables de cadena pesada humanos, y no mas de una o dos secuencias de V^l/J^lde cadena ligera humanas reordenadas, en la que los segmentos genicos variables de cadena pesada humanos estan unidos a un gen constante de cadena pesada de inmunoglobulina de raton, y las secuencias V^l/J^lde cadena ligera humanas reordenadas estan vinculadas a un gen constante de cadena ligera de inmunoglobulina de raton o humano. En un caso espedfico, el gen constante de cadena ligera es un gen constante de raton.

Tambien se hace referencia a una celula ES de raton, que comprende un reemplazo de todos o esencialmente todos los segmentos genicos VH de inmunoglobulina de raton por segmentos genicos VH de inmunoglobulina humanos, y no mas de dos segmentos genicos V^lde inmunoglobulina humanos no reordenados y dos o mas (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) segmentos de gen J^hde inmunoglobulina humanos no reordenados, en la que los segmentos de gen V^hde inmunoglobulina humanos estan unidos a un gen constante de cadena pesada de inmunoglobulina de raton, y los segmentos de gen V^ly J^lde inmunoglobulina humanos no reordenados estan unidos a un gen constante de cadena ligera de inmunoglobulina humano o no humano. En algunas determinadas realizaciones, el gen constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humano es un gen constante de inmunoglobulina de raton. En algunos ciertos casos, el raton comprende cinco segmentos de gen J^lde inmunoglobulina no reordenados.

Tambien se hace referencia a un raton que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que al menos uno de, y en algunas realizaciones todos, los segmentos de gen V^lde raton estan reemplazados por un segmento de gen V^lhumano o no mas de dos segmentos de gen V^lhumanos. En algunos casos, los segmentos de gen V^lhumanos de un raton son capaces de reorganizarse en uno de dos o mas segmentos de gen J^lhumanos para codificar un dominio V^lde inmunoglobulina de un anticuerpo. En algun caso, el/los segmento/s de gen V^lhumano/s de un locus de cadena ligera de un raton como el descrito en el presente documento esta/n unido/s operativamente a dos o mas (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) segmentos de gen J^lhumanos.

Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que no contiene una secuencia de nucleotidos antes del reordenamiento que codifique un segmento endogeno de gen V^l. Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que no contiene una secuencia de nucleotidos antes del reordenamiento que codifique un segmento de gen J^lendogeno. Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que no contiene un nucleotido antes del reordenamiento que codifique los segmentos de gen V^ly J^lendogenos.

Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que no contiene una secuencia de nucleotidos despues del reordenamiento que codifique un segmento endogeno de gen V^l. Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que no contiene una secuencia de nucleotidos despues del reordenamiento que codifique un segmento de gen J^lendogeno. Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que no contiene un nucleotido despues del reordenamiento que codifique los segmentos de gen VL y JL endogenos.

Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que no contiene mas de dos segmentos de gen V^lhumanos y dos o mas (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) segmentos de gen J^lhumanos antes del reordenamiento. Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que no contiene mas de dos segmentos de gen V^lhumanos y cinco segmentos de gen J^lhumanos antes del reordenamiento.

Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que no contiene mas de dos segmentos de gen V^lhumanos y cinco o menos (por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1) segmentos de gen J^lhumanos despues del reordenamiento. Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que no contiene mas de dos segmentos de gen V^lhumanos y uno, dos, tres, cuatro o cinco segmentos de gen J^lhumanos despues del reordenamiento.

Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que contiene un segmento de gen V^lhumano y cinco o menos (por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1) segmentos de gen J^lhumanos despues del reordenamiento. Tambien se hace referencia a un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que contiene un segmento de gen V^lhumano y uno, dos, tres, cuatro o cinco segmentos de gen J^lhumanos despues del reordenamiento.

En diversas realizaciones, los segmentos de gen V^ly J^lson segmentos de gen V^ky J^khumanos. los segmentos de V^khumanos se seleccionan de un segmento de gen Vk1-39 humano y un segmento de gen Vk3-20 humano. Los segmentos de gen J^khumanos son Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y J^k5 humanos.

Tambien se hace referencia a un raton que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es diferente de la estructura de referencia de la FIG. 19 en que contiene una estructura que es esencialmente la misma que la estructura de la FIG. 1, la FIG. 2, la FIG. 3 o la FIG. 9 antes del reordenamiento. En algunas realizaciones, se proporciona un raton, que comprende un locus de cadena ligera cuya estructura es identica a la estructura de la FIG. 1, la FIG. 2, la FIG. 3 o la FIG. 9 antes del reordenamiento.

Tambien se hace referencia a una protema de union al antfgeno generada por un raton como el descrito en el presente documento. En un caso espedfico, la protema de union al antfgeno comprende una region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana fusionada con una region constante de raton, y una region variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana derivada de un segmento de gen Vk1-39 o un segmento de gen Vk3-20, en la que la region constante de cadena ligera es una region constante de raton.

Tambien se hace referencia a una protema de union al antfgeno completamente humana generada a partir de una secuencia genica de region variable de inmunoglobulina de un raton como el descrito en el presente documento, en la que la protema de union al antfgeno comprende una cadena pesada completamente humana que comprende una region variable humana derivada de una secuencia de un raton como el descrito en el presente documento, y una cadena ligera completamente humana que comprende un Vk1-39 o un V^k3-20. En un caso, la region variable de cadena ligera comprende de una a cinco mutaciones somaticas. En un caso, la region variable de cadena ligera es una region variable de cadena ligera afm que esta emparejada en un linfocito B del raton con la region variable de cadena pesada.

En un caso, la protema de union al antfgeno completamente humana comprende una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada, en la que la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada comprenden regiones variables no identicas derivadas independientemente de un raton como el descrito en el presente documento, y en la que cada una de la primera y la segunda cadena pesada se expresan desde una celula hospedadora asociada con una cadena ligera humana derivada de un segmento de gen Vk1-39 o un segmento de gen Vk3-20. En un caso, la primera cadena pesada comprende una primera region variable de cadena pesada que se une espedficamente a un primer epftopo de un primer antigeno, y la segunda cadena pesada comprende una segunda region variable de cadena pesada que se une espedficamente a un segundo epftopo de un segundo antigeno. En un caso espedfico, el primer antigeno y el segundo antigeno son diferentes. En una realizacion espedfica, el primer antfgeno y el segundo antigeno son iguales, y el primer epftopo y el segundo epftopo no son identicos; en una realizacion espedfica, la union del primer epftopo por una primera molecula de la protema de union no bloquea la union del segundo epftopo por una segunda molecula de la protema de union.

Tambien se hace referencia a una protema de union completamente humana derivada de una secuencia de inmunoglobulina humana de un raton como el descrito en el presente documento que comprende una primera cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina, en la que la primera cadena pesada de inmunoglobulina comprende una primera region variable que no es identica a una region variable de la segunda cadena pesada de inmunoglobulina, y en la que la primera cadena pesada de inmunoglobulina comprende un determinante de union a la protema A de tipo silvestre, y la segunda cadena pesada carece de un determinante de union a la protema A de tipo silvestre. En una realizacion, la primera cadena pesada de inmunoglobulina se une a la protema A en condiciones de aislamiento, y la segunda cadena pesada de inmunoglobulina no se une a la protema A o se une a la protema A de manera al menos 10 veces, cien veces o mil veces mas debil de lo que la primera cadena pesada de inmunoglobulina se une a la protema A en condiciones de aislamiento. En un caso espedfico, la primera y la segunda cadena pesada son isotipos lgG1, en el que la segunda cadena pesada comprende una modificacion seleccionada entre 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), y una combinacion de las mismas, y en el que la primera cadena pesada carece de dicha modificacion.

En un aspecto, se proporciona un metodo de generacion de una protema de union al antfgeno biespedfica, que comprende exponer un primer raton como el descrito en el presente documento a un primer antfgeno de interes que comprende un primer epftopo, exponer un segundo raton como el descrito en el presente documento a un segundo antfgeno de interes que comprende un segundo epftopo, dejar que el primer y el segundo raton generen cada uno una respuesta inmunitaria hacia los antfgenos de interes, identificar en el primer raton una primera region variable de cadena pesada humana que se una al primer epftopo del primer antfgeno de interes, identificar en el segundo raton una segunda region variable de cadena pesada humana que se una al segundo epftopo del segundo antfgeno de interes, formar un primer gen de cadena pesada completamente humano que codifique una primera cadena pesada que se una al primer epftopo del primer antfgeno de interes, formar una segundo gen de cadena pesada completamente humano que codifique una segunda cadena pesada que se una al segundo epftopo del segundo antfgeno de interes, expresar la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada en una celula que exprese una unica cadena ligera completamente humana derivada de un segmento de gen Vk1-39 humano o Vk3-2o humano para formar una protema de union al antfgeno biespedfica, y aislar la protema de union al antfgeno biespedfica.

En una realizacion, el primer antfgeno y el segundo antfgeno no son identicos.

En una realizacion, el primer antfgeno y el segundo antfgeno son identicos, y el primer epftopo y el segundo epftopo no son identicos. En una realizacion, la union de la primera region variable de cadena pesada al primer epftopo no bloquea la union de la segunda region variable de cadena pesada al segundo epftopo.

En una realizacion, la cadena ligera humana, cuando se empareja con la primera cadena pesada, se une espedficamente al primer epftopo del primer antfgeno, y cuando se empareja con la segunda cadena pesada, se une espedficamente al segundo epftopo del segundo antfgeno.

En una realizacion, el primer antfgeno se selecciona de un antfgeno soluble y un antfgeno de superficie celular (por ejemplo, un antfgeno tumoral), y el segundo antfgeno comprende un receptor de superficie celular. En una realizacion espedfica, el receptor de superficie celular es un receptor de inmunoglobulina. En una realizacion espedfica, el receptor de inmunoglobulina es un receptor Fc. En una realizacion, el primer antfgeno y el segundo antfgeno son el mismo receptor de superficie celular, y la union de la primera cadena pesada al primer epftopo no bloquea la union de la segunda cadena pesada al segundo epftopo.

En una realizacion, el dominio variable de cadena ligera de la cadena ligera comprende de 2 a 5 mutaciones somaticas. En una realizacion, el dominio variable de cadena ligera es una cadena ligera afm mutada somaticamente expresada en un linfocito B del primer o segundo raton inmunizado con el primer o el segundo dominio variable de cadena pesada. En una realizacion, la cadena ligera de la celula comprende una secuencia de la lmea germinal.

En una realizacion, la primera cadena pesada completamente humana soporta una modificacion de aminoacidos que reduce su afinidad a la protema A, y la segunda cadena pesada completamente humana no comprende una modificacion que reduce su afinidad a la protema A.

En un aspecto, se proporciona un metodo de preparacion de un anticuerpo biespedfico que se une espedficamente a un primer y a un segundo antfgeno, en el que el metodo comprende (a) identificar una primera secuencia de acido nucleico que codifique un primer dominio variable (V^h) de cadena pesada humana que sea espedfico del primer antfgeno; (b) identificar una segunda secuencia de acido nucleico que codifique un segundo dominio variable de cadena pesada (V^h) humana que sea espedfico del segundo antfgeno; (c) proporcionar una tercera secuencia de acido nucleico que codifique una region variable (V^l) de cadena ligera humana que, cuando se empareje con la region V^hde (a) se una espedficamente al primer antfgeno, y cuando se empareje con la region V^hde (b) se una espedficamente al segundo antfgeno; (d) cultivar una celula hospedadora que comprenda la primera, segunda y tercera secuencia de acido nucleico para permitir la expresion de la primera y segunda regiones V^hhumanas y la region V^lhumana para formar el anticuerpo biespedfico; y (d) recuperar dicho anticuerpo biespedfico. En diversos aspectos, el primer y el segundo antigeno son diferentes entre sf. En diversos aspectos, la primera y la segunda secuencia de acido nucleico se afslan de un raton inmunizado que expresa una region V^lde inmunoglobulina humana de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada, en el que la secuencia de inmunoglobulina reordenada esta en la lmea germinal del raton.

En una realizacion, la region V^lhumana se deriva de una secuencia de cadena ligera humana reordenada que comprende un segmento del gen Vk1-39 humano o un segmento del gen Vk3-20 humano. En una realizacion espedfica, la secuencia de la cadena ligera humana reordenada es una secuencia de la lmea germinal (es decir, no comprende una hipermutacion somatica dentro de la secuencia del segmento del gen V).

En una realizacion, la tercera secuencia de acido nucleico se afsla de un raton que expresa una region V^lde inmunoglobulina humana de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada de la lmea germinal del raton. En una realizacion, la secuencia de la cadena ligera de inmunoglobulina reordenada comprende un segmento de gen Vk1-39 humano o Vk3-20 humano. En una realizacion espedfica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada comprende un segmento del gen Vk1-39 humano. En una realizacion, la region V^lde inmunoglobulina humana se expresa desde un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endogeno modificado.

En una realizacion, el primer y el segundo antfgeno estan presentes en una molecula. En una realizacion, el primer y el segundo antfgeno estan presentes en diferentes moleculas. En diversas realizaciones, la primera o segunda secuencia de acido nucleico comprende una modificacion que reduce la afinidad de la cadena pesada codificada hacia la protema A.

En una realizacion, la primera o la segunda secuencia de acido nucleico comprende una secuencia de region variable de cadena pesada humana reordenada que comprende un segmento genico de cadena pesada humano seleccionado de V^h1-2, V^h1-3, V^h1-8, V^h1-18, V^h1-24, V^h1-46, V^h1-58, V^h1-69, V^h2-5, V^h2-26, V^h2-70, V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-33, V^h3-43, V^h3-48, V^h3-53, V^h3-64, V^h3-72, V^h3-73, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h5-51 y V^h6-1. En una realizacion espedfica, el segmento genico de cadena pesada es V^h2-5, VH3-23 o VH3-30.

En un aspecto, se proporciona un metodo de preparacion de un anticuerpo biespedfico que se une espedficamente a un primer y a un segundo antfgeno, en el que el metodo comprende (a) identificar una primera secuencia de acido nucleico que codifique un primer dominio variable (V^h) de cadena pesada humana que sea espedfico del primer antfgeno; (b) identificar una segunda secuencia de acido nucleico que codifique un segundo dominio variable de cadena pesada (V^h) humana que sea espedfico del segundo antfgeno; (c) proporcionar una tercera secuencia de acido nucleico que codifique una region variable de cadena ligera (V^l) humana derivada de un segmento genico Vk1-39 humano o Vk3-20 humano que, cuando se empareje con la region V^hde (a) se una espedficamente al primer antfgeno, y cuando se empareje con la region V^hde (b) se una espedficamente al segundo antfgeno; (d) cultivar una celula hospedadora que comprenda la primera, segunda y tercera secuencia de acido nucleico para permitir la expresion de la primera y segunda regiones V^hhumanas y la region V^lhumana para formar el anticuerpo biespedfico; y (d) recuperar dicho anticuerpo biespedfico. En diversos aspectos, el primer y el segundo antfgeno son diferentes entre sf. En diversos aspectos, la primera y la segunda secuencia de acido nucleico se afslan de un raton inmunizado que expresa una region V^lde inmunoglobulina humana de una secuencia de inmunoglobulina reordenada que se deriva de un segmento de gen Vk1-39 humano o Vk3-20 humano, en los que el segmento de gen Vk1-39 o Vk3-30 humano reordenado esta en la lmea germinal del raton.

En una realizacion, la tercera secuencia de acido nucleico es una secuencia de la lmea germinal (es decir, no comprende una hipermutacion somatica dentro de la secuencia del segmento de gen V). En una realizacion, la tercera secuencia de acido nucleico se afsla del raton que expresa una region V^lde inmunoglobulina humana derivada de un segmento del gen Vk1-39 humano o Vk3-20 humano de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada de la lmea germinal del raton. En una realizacion espedfica, la tercera secuencia de acido nucleico comprende de dos a cinco hipermutaciones somaticas en una region determinante de la complementariedad (CDR) y/o una region marco conservada (FWR). En una realizacion, la region V^lde inmunoglobulina humana se expresa desde un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endogeno modificado.

En una realizacion, el primer y el segundo antfgeno estan presentes en una molecula. En una realizacion, el primer y el segundo antfgeno estan presentes en diferentes moleculas. En una realizacion, la primera o segunda secuencia de acido nucleico comprende una modificacion que reduce la afinidad de la cadena pesada codificada hacia la protema A.

En una realizacion, la primera o la segunda secuencia de acido nucleico comprende una secuencia de region variable de cadena pesada humana reordenada que comprende un segmento genico de cadena pesada humano seleccionado de V^h1-2, V^h1-3, V^h1-8, V^h1-18, V^h1-24, V^h1-46, V^h1-58, V^h1-69, V^h2-5, V^h2-26, V^h2-70, V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-33, V^h3-43, V^h3-48, V^h3-53, V^h3-64, V^h3-72, V^h3-73, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h5-51 y V^h6-1. En una realizacion espedfica, el segmento genico de cadena pesada es V^h2-5, V^h3-23 o V^h3-30.

En un aspecto, se proporciona un metodo de generacion de un anticuerpo biespedfico, que comprende exponer un raton como el descrito en el presente documento a un antfgeno de interes, dejar que el raton genere una respuesta inmunitaria hacia el antigeno de interes, identificar una primera region variable de cadena pesada humana que se una a un primer epftopo del antigeno de interes, identificar una segunda region variable de cadena pesada humana que se una a un segundo epftopo del antfgeno de interes, formar un primer gen de cadena pesada completamente humano que codifique la primera cadena pesada que se una al primer epftopo del antfgeno de interes, formar una segundo gen de cadena pesada completamente humano que codifique una segunda cadena pesada que se una al epftopo del segundo antfgeno de interes, expresar la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada en una celula que exprese una unica cadena ligera completamente humana derivada de un segmento de gen Vk1-39 humano o Vk3-20 humano para formar un anticuerpo biespedfico, y aislar la protema de union al antfgeno biespedfica.

En una realizacion, el primer epftopo y el segundo epftopo no son identicos. En una realizacion, la union de la primera region variable de cadena pesada al primer epftopo no bloquea la union de la segunda region variable de cadena pesada al segundo epftopo. En una realizacion, la primera y segunda cadena pesada son capaces de unirse al primer y al segundo epftopo simultaneamente.

En una realizacion, el anticuerpo biespedfico se une al primer y al segundo epftopo simultaneamente. En una realizacion, el anticuerpo biespedfico se une al primer epftopo y al segundo epftopo independientemente.

En una realizacion, la respuesta de union del anticuerpo biespedfico al antfgeno es aproximadamente 2 veces mas alta que la respuesta de union de la primera region variable de cadena pesada al antigeno. En una realizacion, la respuesta de union del anticuerpo biespedfico al antfgeno es aproximadamente 2 veces mas alta que la respuesta de union de la segunda region variable de cadena pesada al antfgeno. En una realizacion, la respuesta de union del anticuerpo biespedfico al antfgeno es aproximadamente la misma que, o aproximadamente igual a, la respuesta de union de la primera region variable de cadena pesada y/o la segunda region variable de cadena pesada al antfgeno.

En una realizacion, el antfgeno se selecciona de un antfgeno soluble, un antfgeno de superficie celular (por ejemplo, un antfgeno tumoral) y un receptor de superficie celular. En una realizacion espedfica, el receptor de superficie celular es un receptor de inmunoglobulina. En una realizacion espedfica, el receptor de inmunoglobulina es un receptor Fc.

En una realizacion, el dominio variable de cadena ligera de la cadena ligera comprende de 2 a 5 mutaciones somaticas. En una realizacion, el dominio variable de cadena ligera es una cadena ligera afm mutada somaticamente expresada en un linfocito B del raton inmunizado con el primer o el segundo dominio variable de cadena pesada.

En diversas realizaciones, los metodos de generacion de anticuerpos biespedficos se mejoran empleando una cadena ligera comun para emparejarse con cada region variable de cadena pesada de los anticuerpos biespedficos. En diversas realizaciones, el empleo de una cadena ligera comun como la descrita en el presente documento reduce el numero de especies inapropiadas de inmunoglobulinas que carecen de biespecificidad en comparacion con el empleo de cadenas ligeras afines originales. En diversas realizaciones, las regiones variables de cadena pesada de los anticuerpos biespedficos se identifican a partir de anticuerpos monoespedficos que comprenden una cadena ligera comun. En diversas realizaciones, las regiones variables de cadena pesada de los anticuerpos biespedficos comprenden segmentos de genes variables de cadena pesada humanos que se reorganizan in vivo dentro de linfocitos B de raton que se han disenado previamente para expresar un repertorio limitado de cadenas ligeras humanas, o una sola cadena ligera humana, afm a cadenas pesadas humanas y, en respuesta a la exposicion con un antfgeno de interes, genera un repertorio de anticuerpos quimericos que contiene una pluralidad de regiones variables de cadena pesada humanas que son afines a una o una de las dos posibles regiones variables de cadena ligera humanas, de modo que los anticuerpos quimericos son espedficos del antfgeno de interes.

En diversos aspectos, se proporciona un metodo de preparacion de un anticuerpo biespedfico, anticuerpo biespedfico que comprende 1) un primer polipeptido y un segundo polipeptido, en el que el primer y el segundo polipeptido incluye cada uno un dominio de multimerizacion (por ejemplo, un dominio Fc de inmunoglobulina) que permite que el primer y el segundo polipeptido formen un dfmero, y los dominios de multimerizacion potencian una interaccion estable entre el primer y el segundo polipeptido, y en el que uno de los dominios de multimerizacion porta una modificacion de aminoacidos que reduce su afinidad hacia la protema A y el otro dominio de multimerizacion carece de la modificacion; 2) un dominio de union en cada uno del primer y el segundo polipeptido, comprendiendo cada dominio de union una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, en el que la cadena ligera variable del primer polipeptido y la cadena ligera variable del segundo polipeptido tienen una secuencia de aminoacidos comun, cuya secuencia comun tiene una identidad de secuencia de aminoacidos con una cadena ligera original de cada uno de los polipeptidos de al menos el 80 %, de al menos el 85 %, preferentemente al menos el 90 %, mas preferentemente, al menos en el 95 % y lo mas preferentemente, al menos el 100 % de identidad de secuencia. En diversas realizaciones, la cadena ligera variable se deriva de un segmento de gen Vk1-39 humano o Vk3-20 humano. En diversas realizaciones, la cadena ligera variable es una secuencia de cadena ligera humana reordenada. En diversas realizaciones, la cadena ligera variable se afsla de un raton como el descrito en el presente documento.

En diversas realizaciones, el metodo comprende las etapas de (i) cultivar una celula hospedadora que comprende un acido nucleico que codifica el primer polipeptido, el segundo polipeptido y la cadena ligera comun, en el que se expresa el acido nucleico; e (ii) recuperar el anticuerpo biespedfico del cultivo de la celula hospedadora; en una realizacion, el acido nucleico que codifica el primer polipeptido o el acido nucleico que codifica el segundo polipeptido, porta una modificacion de aminoacido que reduce su afinidad hacia la protema A. En una realizacion, el acido nucleico que codifica el primer polipeptido, el segundo polipeptido, y la cadena ligera comun esta presente en un solo vector o en vectores separados. En una realizacion, la celula hospedadora se usa para producir un anticuerpo biespedfico de acuerdo con el parrafo anterior.

En un aspecto, se proporciona un metodo de preparacion de un anticuerpo biespedfico, que comprende (a) seleccionar un primer acido nucleico que codifica una primera region variable de cadena pesada humana aislada de un raton como el descrito en el presente documento; (b) seleccionar un segundo acido nucleico que codifica una segunda region variable de cadena pesada humana aislada del mismo raton o de un raton separado como se describe en el presente documento; (c) proporcionar un tercer acido nucleico que codifica una region variable de cadena ligera humana aislada de un raton como el descrito en el presente documento o derivada de una region variable de cadena ligera humana reordenada como se describe en el presente documento; (c) introducir, en una celula hospedadora, el primer, segundo y tercer acido nucleico, y cultivar la celula hospedadora de modo que se produzca la expresion del primer, segundo y tercer acido nucleico; y (d) recuperar el anticuerpo biespedfico formado a partir del cultivo celular.

En una realizacion, la primera y la segunda region variable de cadena pesada humana estan mutadas somaticamente. En una realizacion espedfica, la primera y segunda region variable de cadena pesada humana se derivan independientemente de un segmento de gen V^hhumano reordenado seleccionado entre un segmento de gen V^hhumano 1-2, 1-3, 1-8, 1-18, 1-24, 1-46, 1-58, 1-69, 2-5, 2-26, 2-70, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-43, 3-48, 3-53, 3-64, 3-72, 3-73, 4-31, 4-34, 4-39, 4-59, 5-51 y 6-1. En una realizacion, la primera y la segunda region variable de cadena pesada humana se derivan independientemente de un segmento de gen V^hhumano reordenado seleccionado de 2-5, 3-30 y 3-23. En una realizacion, la primera region variable de cadena pesada humana se deriva de un segmento de gen V^h2-5 humano y la segunda region variable de cadena pesada humana se deriva de un segmento de gen V^h3-30 humano. En una realizacion, la primera region variable de cadena pesada humana se deriva de un segmento de gen V^h3-30 humano y la segunda region variable de cadena pesada humana se deriva de un segmento de gen V^h3-23 humano. En una realizacion, la primera region variable de cadena pesada humana se deriva de un segmento de gen V^h3-23 humano y la segunda region variable de cadena pesada humana se deriva de un segmento de gen V^h3-30 humano.

En una realizacion, el primer o el segundo acido nucleico se modifica antes de la etapa (c), en la que el primer o segundo acido nucleico se modifica de manera que tenga una afinidad reducida hacia la protema A.

En una realizacion, el tercer acido nucleico se afsla de un raton como el descrito en el presente documento. En una realizacion, el tercer acido nucleico comprende de 2 a 5 mutaciones somaticas. En una realizacion, el tercer acido nucleico codifica una region variable de cadena ligera humana derivada de un segmento de gen Vk1-39 humano. En una realizacion, el tercer acido nucleico codifica una region variable de cadena ligera humana derivada de un segmento de gen Vk3-20 humano.

En una realizacion, el tercer acido nucleico se deriva de una region variable de cadena ligera humana reordenada. En una realizacion, la region variable de cadena ligera humana reordenada comprende una secuencia derivada de un segmento de gen Vk1-39 humano o un segmento de gen Vk3-20 humano. En una realizacion, la region variable de cadena ligera humana reordenada comprende una secuencia de Vk1-39 humana de la lmea germinal (es decir, no comprende una hipermutacion somatica dentro de la secuencia del segmento del gen V). En una realizacion, la region variable de cadena ligera humana reordenada comprende una secuencia de Vk3-20 humana de la lmea germinal.

En diversas realizaciones, se proporciona un metodo de preparacion de un anticuerpo biespedfico que incorpora una primera cadena pesada humana que comprende un dominio variable derivado de un raton modificado que carece de una secuencia de cadena ligera humana reordenada en su lmea germinal, en el que la primera cadena pesada humana esta emparejada con una cadena ligera humana afm que comprende una region variable de cadena ligera humana reordenada derivada de un segmento de gen Vk1-39 humano o Vk3-20 humano. En diversas realizaciones, una segunda cadena pesada humana con una especificidad diferente de la primera cadena pesada humana se identifica a partir de un raton inmunizado como se describe en el presente documento. Los acidos nucleicos que codifican las dos cadenas pesadas y la cadena ligera comun se introducen en una celula hospedadora como se describe en los parrafos precedentes, de modo que se produce la expresion de las tres cadenas y el anticuerpo biespedfico se recupera del cultivo celular.

En una realizacion, el raton se inmuniza con el mismo antigeno usado para generar el primer dominio variable de cadena pesada humano. En una realizacion, el raton se inmuniza con un antigeno diferente usado para generar el primer dominio variable de cadena pesada humano.

En un aspecto, se proporciona un metodo de seleccion de cadenas pesadas humanas que pueden emparejarse con una sola cadena ligera humana para producir un anticuerpo biespedfico, Incluyendo los acidos nucleicos que codifican el anticuerpo biespedfico y una celula hospedadora que comprende los acidos nucleicos.

En un aspecto, se proporciona un metodo para aumentar la cantidad de un anticuerpo biespedfico deseado en un cultivo celular frente a productos no deseados, tales como anticuerpos monoespedficos, en el que una de las cadenas pesadas del anticuerpo biespedfico se modifica para reducir su afinidad hacia la protema A.

Tambien se hace referencia a una celula hospedadora aislada, de modo que la celula hospedadora comprende (a) una primera secuencia de acido nucleico que codifica una primera region variable de cadena pesada humana que se une a un primer antfgeno, en la que la primera secuencia de acido nucleico se afsla de un raton inmunizado con el primer antfgeno que expresa una region V^lde inmunoglobulina humana a partir de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada de la lmea germinal del raton; (b) una segunda secuencia de acido nucleico que codifica una segunda region variable de cadena pesada humana que se une a un segundo antfgeno, en la que la segunda secuencia de acido nucleico se afsla de un raton inmunizado con el segundo antfgeno que expresa una region V^lde inmunoglobulina humana de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada de la lmea germinal del raton; (c) una tercera secuencia de acido nucleico que codifica una region variable de cadena ligera humana que, cuando se empareja con la region variable de cadena pesada de (a) se une espedficamente al primer antfgeno, y cuando se empareja con la region variable de cadena pesada de (b) se una espedficamente al segundo antigeno.

En diversos aspectos, el primer y el segundo antfgeno son diferentes entre sf. En diversos aspectos, la expresion de la primera, la segunda y la tercera secuencia de acido nucleico conduce a la formacion de un anticuerpo biespedfico que se une espedficamente al primer y al segundo antfgeno.

En una realizacion, la region V^lhumana se deriva de una secuencia de cadena ligera humana reordenada que comprende un segmento del gen Vk1-39 humano o un segmento del gen Vk3-20 humano. En una realizacion espedfica, la secuencia de cadena ligera humana reordenada es una secuencia de la lmea germinal (es decir, no comprende una hipermutacion somatica dentro del dominio variable). En una realizacion, la tercera secuencia de acido nucleico se afsla de un raton que expresa una region V^lde inmunoglobulina humana a partir de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada, en el que la secuencia de cadena ligera humana reordenada esta presente en la lmea germinal del raton. En una realizacion, la secuencia de la cadena ligera de inmunoglobulina reordenada comprende un segmento de gen Vk1-39 humano o un segmento de gen Vk3-20 humano. En una realizacion espedfica, el segmento de gen Vk1-39 humano o el segmento de gen Vk3-20 humano comprende al menos una hipermutacion somatica en una region determinante de la complementaria (CDR) o region marco conservada (FWR). En una realizacion espedfica, la primera, segunda y tercera secuencias de acido nucleico se afslan de un raton que expresa una region V^lde inmunoglobulina humana derivada de un segmento de gen Vk1-39 humano o Vk3-20 humano de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada, en el que la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada esta presente en la lmea germinal del raton.

En diversas realizaciones, el raton no contiene un segmento genico de la region variable de cadena ligera endogeno que sea capaz de reorganizarse para formar una cadena ligera de inmunoglobulina.

En una realizacion, la region VL de inmunoglobulina humana se expresa desde un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endogeno modificado. En una realizacion, el primer y el segundo antfgeno estan presentes en una molecula. En una realizacion, el primer y el segundo antfgeno estan presentes en diferentes moleculas. En una realizacion, la primera o segunda secuencia de acido nucleico comprende una modificacion que reduce la afinidad de la cadena pesada codificada hacia la protema A.

Tambien se hace referencia a un anticuerpo o un anticuerpo biespedfico que comprende un dominio variable de cadena pesada humano generado de acuerdo con la invencion. En otro aspecto, se proporciona el uso de un raton como el descrito en el presente documento para producir un anticuerpo completamente humano o un anticuerpo biespedfico completamente humano.

En un aspecto, un raton, un embrion o una celula modificados geneticamente descritos en el presente documento comprenden un locus de cadena ligera k que conserva elementos reguladores o de control endogenos, por ejemplo, un potenciador intronico k de raton, un potenciador 3' k de raton, o tanto un potenciador intronico como un potenciador 3', en el que los elementos reguladores o de control facilitan la mutacion somatica y la maduracion por afinidad de una secuencia expresada del locus de cadena ligera k.

Tambien se hace referencia a un raton que comprende una poblacion de linfocitos B caracterizada por tener cadenas ligeras de inmunoglobulina derivadas de no mas de uno, o no mas de dos, segmentos de genes V y J de cadena ligera de inmunoglobulina reordenados o no reordenados, de modo que el raton presenta una proporcion de la cadena ligera k:A que es aproximadamente igual a la de un raton que comprende un complemento de tipo silvestre de los segmentos de genes V y J de cadena ligera de inmunoglobulina.

En un caso, las cadenas ligeras de inmunoglobulina se derivan de no mas de uno, o no mas de dos, segmentos de genes V y J de cadena ligera de inmunoglobulina reordenados. En un caso espedfico, las cadenas ligeras se derivan de no mas de un segmento de gen V y J de cadena ligera de inmunoglobulina reordenado. En un caso, las cadenas ligeras de inmunoglobulina se generan a partir de uno de los dos segmentos de gen V^lde inmunoglobulina no reordenados y uno de 1, 2, 3, 4 o 5 segmentos de gen JL de inmunoglobulina. En una realizacion, las cadenas ligeras de inmunoglobulina se generan a partir de uno de los dos segmentos de gen V^lde inmunoglobulina no reordenados y un segmento de gen J^lde inmunoglobulina.

Tambien se hace referencia a un raton como el descrito en el presente documento que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina derivada de no mas de una, o no mas de dos, secuencias de Vk/Jk humanas, de modo que el raton comprende un reemplazo de todos o esencialmente todos los segmentos de genes de region variable de cadena pesada de raton endogenos con uno o mas segmentos de genes de region variable de cadena pesada humanos, y el raton muestra una proporcion de los (a) linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A, con respecto a (b) los linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20.

En un caso, el raton expresa una sola cadena ligera k derivada de una secuencia de Vk1-39Jk5 humana, y la proporcion de linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A con respecto a los linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20; en un caso, la proporcion es de aproximadamente 1 a al menos aproximadamente 66; en una realizacion espedfica, la proporcion es de aproximadamente 1 a 66.

Tambien se hace referencia a un raton que expresa una sola cadena ligera k derivada de una secuencia de Vk3-20Jk5 humana, y la proporcion de linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A con respecto a los linfocitos B CD19+ que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20; en un caso, la proporcion es de aproximadamente 1 a aproximadamente 21. En realizaciones espedficas, la proporcion es de 1 a 20 o de 1 a 21.

Tambien se hace referencia a un raton que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina cuya secuencia es identica a la obtenida mediante el reordenamiento de uno de los dos segmentos del gen Vk humano con 1, 2, 3, 4 o 5 segmentos del gen Jk humano.

En algunas realizaciones, el raton proporcionado expresa una cadena ligera de inmunoglobulina generada a partir de un reordenamiento de dos segmentos de gen Vk humano y 5 segmentos de gen Jk humano, de modo que el raton comprende un reemplazo de todos o esencialmente todos los segmentos de gen VHde inmunoglobulina endogenos con uno o mas segmentos de gen V^h, uno o mas segmentos de gen D^hy uno o mas segmentos de gen J^hde inmunoglobulina humanos, y el raton muestra una proporcion de (a) los linfocitos B de la medula osea que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A, con respecto a (b) los linfocitos B de medula osea que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15. En algunas realizaciones, el reordenamiento incluye un segmento de gen Vk1-39 humano. En algunas realizaciones, el reordenamiento incluye un segmento de gen Vk3-20 humano. En algunas realizaciones, el reemplazo de los segmentos de gen VH de inmunoglobulina endogenos es en un locus de VHde inmunoglobulina endogeno. En algunas realizaciones, los dos segmentos de gen Vk humano estan en un locus Vk de inmunoglobulina endogeno y, en algunas realizaciones, los dos segmentos de gen Vk humanos reemplazan todos o esencialmente todos los segmentos del gen Vk de inmunoglobulina del raton. En algunas realizaciones, los dos segmentos de gen Vk humanos estan en un locus Vk de inmunoglobulina endogeno y, en algunas realizaciones, los dos segmentos de gen Vk humano reemplazan todos o esencialmente todos los segmentos de los genes Vk y Jk de inmunoglobulina de raton. Los dos segmentos de gen Vk humanos estan unidos operativamente a 5 segmentos de gen Jk humano.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion expresa una cadena ligera generada a traves de un reordenamiento de un segmento de gen Vk1-39 humano o un segmento de gen Vk3-20 humano, y 5 segmentos del gen Jk humano, y la proporcion de los linfocitos B inmaduros d la medula osea que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A con respecto a los linfocitos B inmaduros que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k es de aproximadamente 1 a aproximadamente 13.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion expresa una cadena ligera generada a traves de un reordenamiento de un segmento de gen Vk1-39 humano o un segmento de gen Vk3-20 humano y 5 segmentos del gen Jk humano, y la proporcion de linfocitos B maduros de medula osea que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera A con respecto a los linfocitos B inmaduros que expresan una inmunoglobulina que tiene una cadena ligera k es de aproximadamente 1 a aproximadamente 7.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion expresa una cadena ligera generada a traves de un reordenamiento de un segmento de gen Vk1-39 humano o un segmento de gen Vk3-20 humano y 5 segmentos de gen Jk humano, y tiene una poblacion de linfocitos pro-B de medula osea dentro del intervalo de aproximadamente 2.5 x 104 a aproximadamente 1,5 x 105 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 2,5 x 104, 3,0 x 104, 3.5 x 104, 4,0 x 104, 4,5 x 104, 5,0 x 104, 5,5 x 104, 6,0 x 104, 6,5 x 104, 7,0 x 104, 7,5 x 104, 8,0 x 104, 8,5 x 104, 9,0 x 104, 9,5 x 104, 1,0 x 105, o 1,5 x 105 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos pro-B de la medula osea de aproximadamente 2,88 x 104 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos pro-B de la medula osea de aproximadamente 6,42 x 104 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos pro-B de la medula osea de aproximadamente 9,16 x 104 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos pro-B de la medula osea de aproximadamente 1,19 x 105 celulas. Los linfocitos pro-B ilustrativos de medula osea de ratones modificados geneticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresion de CD19, CD43, c-kit y/o una combinacion de las mismas (por ejemplo, CD19+, CD43+, c-kit+).

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion expresa una cadena ligera generada a traves de un reordenamiento de un segmento de gen Vk1-39 humano o un segmento de gen Vk3-20 humano y 5 segmentos de gen Jk humano, y tiene una poblacion de linfocitos pre-B de medula osea dentro del intervalo de aproximadamente 1 x 10° a aproximadamente 2x106 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 1,0 x 106, 1,1 x 106, 1,2 x 106, 1,3 x 106, 1,4 x 106, 1,5 x 106, 1,6 x 106, 1,7 x 106, 1,8 x 106, 1,9 x 106, o 2,0 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos pre-B de la medula osea de aproximadamente 1,25 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos pre-B de la medula osea de aproximadamente 1,46 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos pre-B de la medula osea de aproximadamente 1,64 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos pre-B de la medula osea de aproximadamente 2,03 x 106 celulas. Los linfocitos pre-B ilustrativos de medula osea de ratones modificados geneticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresion de CD19, CD43, c-kit y/o una combinacion de las mismas (por ejemplo, CD19+, CD43-, c-kit').

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion expresa una cadena ligera generada a traves de un reordenamiento de un segmento de gen Vk1-39 humano o un segmento de gen Vk3-20 humano y 5 segmentos de gen Jk humano, y tiene una poblacion de linfocitos B inmaduros de medula osea dentro del intervalo de aproximadamente 5 x 105 a aproximadamente 7 x 105 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 5,0 x 105, 5,1 x 105, 5,2 x 105, 5,3 x 105, 5,4 x 105, 5,5 x 105, 5,6 x 105, 5,7 x 105, 5,8 x 105, 5,9 x 105, 6,0 x 105, 6,1 x 105, 6,2 x 105, 6,3 x 105, 6,4 x 105, 6,5 x 105, 6,6 x 105, 6,7 x 105, 6,8 x 105, 6,9 x 105, o 7,0 x 105 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B inmaduros de la medula osea de aproximadamente 5,33 x 105 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B inmaduros de la medula osea de aproximadamente 5,80 x 105 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B inmaduros de la medula osea de aproximadamente 5,92 x 105 celulas; en algunas realizaciones, el raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B inmaduros de la medula osea de aproximadamente 6,67 x 105 celulas. Los linfocitos B inmaduros ilustrativos de medula osea de ratones modificados geneticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresion de IgM, B220 y/o una combinacion de las mismas (por ejemplo, IgM+, B220int).

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion expresa una cadena ligera generada a traves de un reordenamiento de un segmento de gen Vk1-39 humano o un segmento de gen Vk3-20 humano y uno de 5 segmentos de gen Jk humano, y tiene una poblacion de linfocitos B maduros de medula osea dentro del intervalo de aproximadamente 3 x 104 a aproximadamente 1,5 x 105 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 3,0 x 104, 3,5 x 104, 4,0 x 104, 4,5 x 104, 5,0 x 104, 5,5 x 104, 6,0 x 104, 6,5 x 104, 7,0 x 104, 7,5 x 104, 8,0 x 104, 8,5 x 104, 9,0 x 104, 9,5 x 104, 1,0 x 105, o 1,5 x 105 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B maduros de la medula osea de aproximadamente 3,11 x 104 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B maduros de la medula osea de aproximadamente 1,09 x 105 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B maduros de la medula osea de aproximadamente 1,16 x 105 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B maduros de la medula osea de aproximadamente 1,44 x 105 celulas. Los linfocitos B maduros ilustrativos de la medula osea de los ratones modificados geneticamente segun lo descrito en el presente documento se caracterizan por la expresion de IgM, B220 y/o una combinacion de las mismas (por ejemplo, IgM+, B220hi).

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion expresa una cadena ligera generada a traves de un reordenamiento de un segmento de gen Vk1-39 humano o un segmento de gen Vk3-20 humano y 5 segmentos de gen Jk humano, y tiene una poblacion de linfocitos B totales de medula osea dentro del intervalo de aproximadamente

1 x 106 a aproximadamente 3 x 106 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 1,0 x 106, 1,1 x 106, 1,2 x 106, 1,3 x 106, 1,4 x 106, 1,5 x 106, 1,6 x 106, 1,7 x 106, 1,8 x 106, 1,9 x 101, 2,0 x 106, 2,1 x 101, 2,2 x 106, 2,3 x 106,

2,4 x 106, 2,5 x 106, 2,6 x 106, 2,7 x 106, 2,8 x 106, 2,9 x 106 o 2,0 x 10° celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos totales de la medula osea de aproximadamente 1,59 x

106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B totales de la medula osea de aproximadamente 1,75 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B totales de la medula osea de aproximadamente 2,13 x 106 celulas;

en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos totales de la medula osea de aproximadamente 2,55 x 106 celulas. Los linfocitos B totales ilustrativos de medula osea de ratones modificados geneticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresion de CD19,

CD20 y/o una combinacion de las mismas (por ejemplo, CD19+).

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que expresa una sola cadena ligera k reordenada, de modo que el raton comprende un locus funcional de cadena ligera A, y el raton expresa una poblacion de linfocitos

B que comprende linfocitos IgK+ que expresan una cadena k ligera derivada de la misma cadena k ligera reordenada unica. En un caso, el porcentaje de linfocitos B IgK+IgA+ del raton es aproximadamente el mismo que en un raton de tipo silvestre. En un caso espedfico, el porcentaje de linfocitos B IgK+IgA+ en el raton es del aproximadamente 2 al aproximadamente 6 por ciento. En un caso espedfico, el porcentaje de celulas B IgK+IgA+ en un raton en el que la unica cadena ligera k reordenada se deriva de una secuencia de Vk1-39Jk5 es del aproximadamente 2 al aproximadamente 3; en una realizacion espedfica, el porcentaje es del aproximadamente 2,6. En un caso espedfico, el porcentaje de celulas B IgK+IgA+ en un raton en el que la unica cadena ligera k reordenada se deriva de una secuencia de Vk3-20Jk1 es del aproximadamente 4 al aproximadamente 8; en un caso espedfico, el porcentaje es del aproximadamente 6.

En algunas realizaciones, se proporciona un raton modificado geneticamente que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia Vk/Jk de inmunoglobulina humana reordenada, raton que comprende un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina funcional, y raton que comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos que comprende una proporcion de linfocitos B IgA+ con respecto a los linfocitos B IgA+ que es de aproximadamente 1 a aproximadamente 8; en algunas realizaciones, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.

La secuencia de Vk/Jk de inmunoglobulina humana reordenada se genera a traves de un reordenamiento de uno de los dos segmentos de gen V k de inmunoglobulina humana y uno de 5 segmentos de gen Jk de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, la secuencia de Vk/Jk de inmunoglobulina humana reordenada se genera a traves de un reordenamiento de un segmento de gen Vk1-39 de inmunoglobulina humana y un segmento de gen Jk de inmunoglobulina humana seleccionado de Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5 y/o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la secuencia de Vk/Jk de inmunoglobulina humana reordenada se genera a traves de un reordenamiento de un segmento de gen Vk3-20 de inmunoglobulina humana y un segmento de gen Jk de inmunoglobulina humana seleccionado de Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5 y/o una combinacion de los mismos.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+ en el intervalo de aproximadamente 2 x 106 a aproximadamente 7 x 106 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 2,0 x 106, 2,5 x 106, 3,0 x 106, 3,5 x 106, 4,0 x 106, 4,5 x 106, 5,0 x 106, o 7,0 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+ de aproximadamente 2,74 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+ de aproximadamente 4,30 x 106 celulas;

en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+ de aproximadamente 5,53 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+ de aproximadamente 6,18 x 106 celulas.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+, IgDhi, IgMlD en el intervalo de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 4 x 106 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 1,0 x 106, 1,5 x 106, 2,0 x 106, 2,5 x 106, 3,0 x 106, 3,5 x 106, 4,0 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+,

IgDhi, IgMlD de aproximadamente 1,30 x 106; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+, IgDhi, IgMlD de aproximadamente 2,13 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+, IgDhi,

IgMlD de aproximadamente 3,15 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+, IgDhi, IgMlD de aproximadamente 3,93 x 106 celulas.

En alguna realizacion, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+,

IgDo IgMhi en el intervalo de aproximadamente 9 x 105 a aproximadamente 2 x 106 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 9,0 x 105, 9,25 x 105, 9,5 x 105, 9,75 x 105, 1,0 x 106, 1,25 x 106, 1,50 x 106, x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+, IgDlD, IgMhi de aproximadamente 9,52 x 105; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+, IgDl0, IgMhi de aproximadamente 1,23 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos CD19+, IgDo IgMhi de aproximadamente 1,40 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos D19+, IgDlD IgMhi de aproximadamente 1,42 x 106 celulas.

En algunas realizaciones, el raton modificado geneticamente proporcionado comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende dos segmentos de gen Vk de inmunoglobulina humanos no reordenados y 5 segmentos de gen Jk humanos no reordenados, y en las que el raton comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos perifericos que comprende poblaciones de linfocitos B de transicion (por ejemplo, T1, T2 y T3) que son aproximadamente iguales a las de un raton que comprende un complemento de tipo silvestre de segmentos de gen V y J de cadena ligera k de inmunoglobulina. Las poblaciones de linfocitos B de transicion ilustrativas (por ejemplo, T1, T2 y T3) del bazo de un raton modificado geneticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresion de IgM, CD23, CD93, B220 y/o una combinacion de las mismas.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T1 del bazo (por ejemplo, CD93+, B220+, IgMhi, CD23-) en el intervalo de aproximadamente 2 x 106 a aproximadamente 7 x 106 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 2,0 x l06, 2,5 x 106, 3,0 x 106, 3,5 x 106, 4,0 x 106, 4,5 x 106, 5,0 x 106, 5,5 x 106, 6,0 x 106, 6,5 x 106, o 7,0 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T1 del bazo de aproximadamente 2,16 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T1 del bazo de aproximadamente 3,63 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T1 del bazo de aproximadamente 3,91 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T1 del bazo de aproximadamente 6,83 x 106 celulas.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T2 del bazo (por ejemplo, CD93+, B220+, IgMhi, CD23+) en el intervalo de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 7 x 106 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 1,0 x 106, 1,5 x 106, 2,0 x 106, 2,5 x 106, 3,0 x 106, 3,5 x 106, 4,0 x 106, 4,5 x 106, 5,0 x 106, 5,5 x 106, 6,0 x 106, 6,5 x 106, o 7,0 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T2 del bazo de aproximadamente 1,30 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T2 del bazo de aproximadamente 2,46 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T2 del bazo de aproximadamente 3,24 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T2 del bazo de aproximadamente 6,52 x 106 celulas.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T3 del bazo (por ejemplo, CD93+, B220+, IgMlD CD23+) en el intervalo de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 4 x 106 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 1,0 x 106, 1,5 x 106, 2,0 x 106, 2,5 x 106, 3,0 x 106, 3,5 x 106, o 4,0 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T3 del bazo de aproximadamente 1,08 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T3 del bazo de aproximadamente 1,35 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T3 del bazo de aproximadamente 3,37 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B T1 del bazo de aproximadamente 3,63 x 106 celulas.

En algunas realizaciones, el raton modificado geneticamente proporcionado comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende dos segmentos de gen Vk de inmunoglobulina humanos no reordenados y 5 segmentos de gen Jk de inmunoglobulina humanos no reordenados, y en las que el raton comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos perifericos que comprende poblaciones de linfocitos B de zona marginal y precursores de zona marginal que son aproximadamente iguales a las de un raton que comprende un complemento de tipo silvestre de segmentos de gen Vk y Jk de inmunoglobulina. Las poblaciones de linfocitos B de zona marginal ilustrativos del bazo de un raton modificado geneticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresion de IgM, CD21/35, CD23, CD93, B220 y/o una combinacion de las mismas.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B de la zona marginal del bazo (por ejemplo, CD93-, B220+, IgMhi, CD21/35hi, CD23-) en el intervalo de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 3 x 106 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 1,0 x 106, 1,5 x 106, 2,0 x 106, 2,5 x 106, o 3,0 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B de la zona marginal del bazo de aproximadamente 1,47 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B de la zona marginal del bazo de aproximadamente 1,49 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B de la zona marginal del bazo de aproximadamente 2,26 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B de la zona marginal del bazo de aproximadamente 2,33 x 106 celulas.

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente, raton que comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende dos segmentos de gen Vk de inmunoglobulina humanos no reordenados y 5 segmentos de gen Jk de inmunoglobulina humanos no reordenados, y en raton que comprende una poblacion de linfocitos B esplenicos perifericos que comprende una o varias poblaciones de linfocitos B foliculares (por ejemplo, FO-I y FO-II) que son aproximadamente iguales a las de un raton que comprende un complemento de tipo silvestre de segmentos de gen Vk y Jk de inmunoglobulina. Las poblaciones de linfocitos B foliculares ilustrativas (por ejemplo, FO-I y FO-II) del bazo de un raton modificado geneticamente como se describe en el presente documento se caracterizan por la expresion de IgM, IgD, CD21/35, CD93, B220 y/o una combinacion de las mismas.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B foliculares de tipo 1 del bazo (por ejemplo, CD93', B220+, CD21/35int, IgMo IgDhi) en el intervalo de aproximadamente 3 x 106 a aproximadamente 1,5 x 107 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, aproximadamente 3,0 x 106, 3,5 x 106, 4,0 x 106, 4,5 x 106, 5,0 x 106, 5,5 x 106, 6,0 x 106, 6,5 x 106, 7,0 x 106, 7,5 x 106, 8,0 x 106, 8,5 x 106, 9,0 x 106, 9,5 x 106, 1,0 x 107, o 1,5 x 107 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B foliculares de tipo 1 del bazo de aproximadamente 3,57 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B foliculares de tipo 1 del bazo de aproximadamente 6,31 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B foliculares de tipo 1 del bazo de aproximadamente 9,42 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B foliculares de tipo 1 del bazo de aproximadamente 1,14 x 107 celulas.

En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B foliculares de tipo 2 del bazo (por ejemplo, CD93', B220+, CD21/35int, IgMint, IgDhi) en el intervalo de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 2 x 106 celulas, ambos inclusive, por ejemplo, 1,0 x 106, 1,25 x 106, 1,5 x 106, 1,75 x 106, o 2,0 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B foliculares de tipo 2 del bazo de aproximadamente 1,14 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B foliculares de tipo 2 del bazo de aproximadamente 1,45 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B foliculares de tipo 2 del bazo de aproximadamente 1,80 x 106 celulas; en algunas realizaciones, un raton de la presente invencion comprende una poblacion de linfocitos B foliculares de tipo 2 del bazo de aproximadamente 2,06 x 106 celulas.

En un aspecto, el raton modificado geneticamente proporcionado expresa una unica cadena ligera k reordenada derivada de un segmento de gen Vk y Jk humano, en el que el raton expresa una poblacion de linfocitos B que comprende una unica cadena ligera k derivada de la unica secuencia de cadena ligera k reordenada, en el que el raton modificado geneticamente no se ha vuelto resistente a las hipermutaciones somaticas. En una realizacion, al menos el 90 % de las cadenas ligeras k expresadas en un linfocito B del raton presentan de al menos una a aproximadamente cinco hipermutaciones somaticas.

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que se modifica para expresar una unica cadena ligera k derivada de no mas de una, o no mas de dos, secuencias de cadena ligera k reordenadas, raton que presenta un uso de cadena ligera k que es aproximadamente el doble o mas, al menos aproximadamente el triple o mas, o al menos aproximadamente cuatro veces superior o mas que el uso de cadena ligera k presentada por un raton de tipo silvestre, o superior al uso de cadena ligera k presentada por un raton de la misma cepa que comprende un repertorio de tipo silvestre de segmentos genicos de cadena ligera k. En un caso espedfico, el raton expresa la unica cadena ligera k de no mas de una secuencia de cadena ligera k reordenada. En un caso mas espedfico, la secuencia de cadena ligera k reordenada se selecciona de una secuencia de Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1. En un caso, la secuencia de cadena ligera k reordenada es una secuencia de Vk1-39Jk5. En un caso, la secuencia de cadena ligera k reordenada es una secuencia de Vk3-20Jk1.

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que expresa una unica cadena ligera k derivada de no mas de una, o no mas de dos, secuencias de cadena ligera k reordenadas, raton que presenta un uso de cadena ligera k que es aproximadamente 100 veces o mas, al menos aproximadamente 200 veces o mas, al menos aproximadamente 300 veces o mas, al menos aproximadamente 400 veces o mas, al menos aproximadamente 500 veces o mas, al menos aproximadamente 600 veces o mas, al menos aproximadamente 700 veces o mas, al menos aproximadamente 800 veces o mas, al menos aproximadamente 900 veces o mas, al menos aproximadamente 1.000 veces o mas superior al mismo uso de cadena ligera k presentado por un raton que porta un locus de cadena ligera k humano completo o esencialmente completo. En un caso espedfico, el raton que porta un locus de cadena ligera k humano completo o esencialmente completo carece de una secuencia de cadena ligera k de raton no reordenada funcional. En un caso espedfico, el raton expresa la unica cadena ligera k de no mas de una secuencia de cadena ligera k reordenada. En un caso, el raton comprende una copia de una secuencia de cadena ligera k reordenada (por ejemplo, un heterocigoto). En un caso, el raton comprende dos copias de una secuencia de cadena ligera k reordenada (por ejemplo, un homocigoto). En una realizacion mas espedfica, la secuencia de cadena ligera k reordenada se selecciona de una secuencia de Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1. En una realizacion, la secuencia de cadena ligera k reordenada es una secuencia de Vk1-39Jk5. En una realizacion, la secuencia de cadena ligera k reordenada es una secuencia de Vk3-20Jk1.

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que expresa una unica cadena ligera derivada de no mas de una, o no mas de dos, secuencias de cadena ligera reordenadas, en el que la cadena ligera del raton modificado geneticamente presenta un nivel de expresion que es de al menos 10 veces a aproximadamente 1.000 veces, de 100 veces a aproximadamente 1.000 veces, de 200 veces a aproximadamente 1.000 veces, de 300 veces a aproximadamente 1.000 veces, de 400 veces a aproximadamente 1.000 veces, de 500 veces a aproximadamente 1.000 veces, de 600 veces a aproximadamente 1.000 veces, de 700 veces a aproximadamente 1.000 veces, de 800 veces a aproximadamente 1.000 veces o de 900 veces a aproximadamente 1.000 veces superior a la expresion de la misma cadena ligera reordenada que presenta un raton portador de un locus de cadena ligera completo o esencialmente completo. En un caso, la cadena ligera comprende una secuencia humana. En un caso espedfico, la secuencia humana es una secuencia k. En un caso, la secuencia humana es una secuencia A. En un caso, la cadena ligera es una cadena ligera completamente humana.

En una realizacion, el nivel de expresion se caracteriza por cuantificar el ARNm de una secuencia de cadena ligera transcrita, y compararlo con la secuencia de cadena ligera transcrita de un raton que tiene un locus de cadena ligera completo o esencialmente completo.

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que expresa una unica cadena ligera k derivada de no mas de una, o no mas de dos, secuencias de cadena ligera k reordenadas, raton que, tras la inmunizacion con antfgeno, presenta un tftulo en suero que es comparable a un raton de tipo silvestre inmunizado con el mismo antfgeno. En un caso espedfico, el raton expresa una unica cadena ligera k de no mas de una secuencia de cadena ligera k reordenada. En un caso, el tftulo en suero se caracteriza como inmunoglobulina total. En un caso espedfico, el tftulo en suero se caracteriza como un tftulo espedfico de IgM. En un caso espedfico, el tftulo en suero se caracteriza como un tftulo espedfico de IgG. En una realizacion mas espedfica, la secuencia de cadena ligera k reordenada se selecciona de una secuencia de Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1. En un caso, la secuencia de cadena ligera k reordenada es una secuencia de Vk1-39Jk5. En un caso, la secuencia de cadena ligera k reordenada es una secuencia de Vk3-20Jk1.

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que expresa una poblacion de anticuerpos espedficos del antfgeno, en la que todas las cadenas ligeras de inmunoglobulina de la poblacion de anticuerpos espedficos del antfgeno comprenden una region variable de cadena ligera humana (V^l) derivada del mismo unico segmento de gen VL humano y las cadenas pesadas de inmunoglobulina comprenden una region variable de cadena pesada humana (V^h) derivada de uno de una pluralidad de segmentos de gen V^hhumanos.

En diversas realizaciones, los segmentos de gen V^hhumano se seleccionan de V^h1-2, V^h1-3, V^h1-8, V^h1-18, V^h1-24, V^h1-46, V^h1-58, V^h1-69, V^h2-5, V^h2-26, V^h2-70, V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-15, V^h3-20, V^h3-21, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-33, V^h3-43, V^h3-48, V^h3-53, V^h3-64, V^h3-72, V^h3-73, V^h4-31, V^h4-34, V^h4-39, V^h4-59, V^h5-51 y V^h6-1.

En diversas realizaciones, el mismo segmento de gen V^lhumano unico se selecciona de un segmento de gen Vk1-39 humano y un segmento de gen Vk3-20 humano. En diversas realizaciones, todas las cadenas ligeras de inmunoglobulina comprenden un segmento de gen J de cadena ligera (J^l) humano seleccionado de un segmento de gen Jk y JA. En una realizacion espedfica, el segmento de gen J^lhumano se selecciona entre un segmento de gen Jk1 humano y un segmento de gen Jk5. En diversas realizaciones, el raton carece de una secuencia seleccionada entre un segmento de V^lde inmunoglobulina de raton, un segmento de gen J^lde inmunoglobulina de raton y una combinacion de los mismos. En diversas realizaciones, la region V^lhumana esta unida operativamente a una region constante (C^l) de cadena ligera de inmunoglobulina humana, de raton o de rata. En una realizacion espedfica, la region V^lhumana esta unida operativamente a una region Ck de raton. En una realizacion espedfica, la region V^lhumana esta unida operativamente a una region Ck de rata.

En diversas realizaciones, la region V^lhumana se expresa desde un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endogeno. En diversas realizaciones, la region V^hhumana esta unida operativamente a una region constante (C^h) de cadena pesada de inmunoglobulina humana, de raton o de rata. En diversas realizaciones, la region (C^h) comprende una secuencia humana seleccionada entre una C^h1, una bisagra, una C^h2, una C^h3, una C^h4 y/o una combinacion de las mismas. En diversas realizaciones, la region V^hhumana se expresa desde un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endogeno.

Tambien se hace referencia a un raton modificado geneticamente que expresa una pluralidad de cadenas pesadas de inmunoglobulina asociadas con una sola cadena ligera. En un caso, la cadena pesada comprende una secuencia humana. En diversos casos, la secuencia humana se selecciona de una secuencia variable, una C^h1, una bisagra, una C^h2, una C^h3 y una combinacion de las mismas. En un caso, la cadena ligera unica comprende una secuencia humana. En diversos casos, la secuencia humana se selecciona de una secuencia variable, una secuencia constante y una combinacion de las mismas. En un caso, el raton comprende un locus de inmunoglobulina endogeno deshabilitado y expresa la cadena pesada y/o la cadena ligera de un transgen o un episoma extracromosomico. En un caso, el raton comprende un reemplazo en un locus de raton endogeno de algunos o todos los segmentos genicos de cadena pesada de raton endogenos (es decir, V, D, J) y/o algunas o todas las secuencias constantes de cadena pesada de raton endogenas (por ejemplo, C^h1, bisagra, C^h2, C^h3 o una combinacion de las mismas, y/o algunas o todas las secuencias endogenas de cadena ligera del raton (por ejemplo, V, J, constante o una combinacion de las mismas), con una o mas secuencias de inmunoglobulina humanas.

Tambien se hace referencia a un raton adecuado para generar anticuerpos que tienen la misma cadena ligera, en el que todos o esencialmente todos los anticuerpos producidos en el raton se expresan con la misma cadena ligera. En un caso, la cadena ligera se expresa a partir de un locus de cadena ligera endogeno.

En un aspecto, se proporciona un metodo de generacion de una cadena ligera para un anticuerpo humano, que comprende obtener de un raton como el descrito en el presente documento una secuencia de cadena ligera y una secuencia de cadena pesada, y emplear la secuencia de cadena ligera y la secuencia de cadena pesada para generar un anticuerpo humano. En una realizacion, el anticuerpo humano es un anticuerpo biespedfico.

En un aspecto, se proporciona un metodo de identificacion de un dominio variable de cadena pesada humano que es capaz de unirse a un antfgeno de interes con una cadena ligera disenada como se describe en el presente documento, en el que el metodo comprende proporcionar un dominio variable de cadena pesada derivado de un primer anticuerpo que es capaz de unirse al antfgeno, reparar el dominio variable de cadena pesada con una secuencia de cadena ligera de la lmea germinal y transfectar una celula para que cada uno se exprese para formar un segundo anticuerpo, exponiendo el segundo anticuerpo al antfgeno y midiendo la union del segundo anticuerpo al antigeno.

En una realizacion, la cadena ligera del primer anticuerpo comprende una secuencia de Vk1-39 humana. En una realizacion, la cadena ligera del primer anticuerpo comprende una secuencia de Vk3-20 humana. En una realizacion, la secuencia de cadena ligera de la lmea germinal comprende una secuencia de Vk1-39 o Vk3-20 humana. En diversas realizaciones, la union del segundo anticuerpo al antfgeno se determina mediante la comparacion de la union del primer anticuerpo al antigeno.

cualquiera de las realizaciones y aspectos descritos en el presente documento pueden utilizarse juntos entre sf, salvo que se indique otra cosa o sea evidente a partir del contexto. Otras realizaciones seran evidentes para un experto en la materia a partir de una revision de la siguiente descripcion.

Breve descripcion de las figuras

La FIG. 1 ilustra una estrategia de direccion para reemplazar los segmentos genicos endogenos de la region variable de cadena ligera de la inmunoglobulina de raton por una region del gen Vk1-39Jk5 humano.

La FIG. 2 ilustra una estrategia de direccion para reemplazar los segmentos genicos endogenos de la region variable de cadena ligera de la inmunoglobulina de raton por una region del gen Vk3-20Jk1 humano.

La FIG. 3 ilustra una estrategia de direccion para reemplazar los segmentos genicos endogenos de la region variable de cadena ligera de la inmunoglobulina de raton por una region del gen VpreB/JA5 humano.

La FIG. 4 muestra el porcentaje de linfocitos B CD19+ (eje y) de la sangre periferica para ratones de tipo silvestre (WT), ratones homocigotos para una region de cadena ligera de Vk1-39Jk5 humana reordenada disenada por ingeniena genetica (Vk1-39Jk5 HO) y ratones homocigotos para una region de cadena ligera de Vk3-20Jk1 reordenada humana disenada por ingeniena genetica (Vk3-20Jk1 HO).

La FIG. 5A muestra la expresion relativa de ARNm (eje y) de una cadena ligera derivada de Vk1-39 en un ensayo de PCR cuantitativo usando sondas espedficas de la union de una region de cadena ligera de Vk1-39Jk5 humana disenada por ingeniena genetica (sonda de union de Vk1-39Jk5) y el segmento de gen Vk1-39 humano (sonda de Vk1-39) en un raton homocigoto para un reemplazo de los segmentos de los genes Vk y Jk endogenos con segmentos de los genes Vk y Jk humanos (Hk), un raton de tipo silvestre (WT) y un raton heterocigoto para una region de cadena ligera de Vk1-39Jk5 reordenada humana disenada por ingeniena genetica (Vk1-39Jk5 HET). Las senales se normalizan con respecto a la expresion de Ck del raton. N.D.: No detectado.

La FIG. 5B muestra la expresion relativa de ARNm (eje y) de una cadena ligera derivada de Vk1-39 en un ensayo de PCR cuantitativo usando sondas espedficas de la union de una region de cadena ligera de Vk1-39Jk5 humana disenada por ingeniena genetica (sonda de union de Vk1-39Jk5) y el segmento de gen Vk1-39 humano (sonda de Vk1-39) en un raton homocigoto para un reemplazo de los segmentos de los genes Vk y Jk endogenos con segmentos de los genes Vk y Jk humanos (Hk), un raton de tipo silvestre (WT) y un raton homocigoto para una region de cadena ligera de Vk1-39Jk5 reordenada humana disenada por ingeniena genetica (Vk1-39Jk5 HO). Las senales se normalizan con respecto a la expresion de Ck del raton.

La FIG. 5C muestra la expresion relativa de ARNm (eje y) de una cadena ligera derivada de Vk3-20 en un ensayo de PCR cuantitativo usando sondas espedficas de la union de una region de cadena ligera de Vk3-20Jk1 humana disenada por ingeniena genetica (sonda de union de Vk3-20Jk1) y el segmento de gen Vk3-20 humano (sonda de Vk3-20) en un raton homocigoto para un reemplazo de los segmentos de los genes Vk y Jk endogenos con segmentos de los genes Vk y Jk humanos (Hk), un raton de tipo silvestre (WT) y un raton heterocigoto (HET) y homocigoto (HO) para una region de cadena ligera de Vk3-20Jk1 reordenada humana disenada por ingeniena genetica. Las senales se normalizan con respecto a la expresion de CK del raton.

La FIG. 6A muestra el tttulo de IgM (izquierda) e IgG (derecha) en tipo silvestre (WT; N = 2) y ratones homocigotos para una region de cadena ligera de Vk1-39Jk5 humana reordenada disenada por ingeniena genetica (Vk1-39Jk5 HO; N = 2) inmunizados con p-galactosidasa.

La FIG. 6B muestra el tttulo de inmunoglobulina total (IgM, IgG, IgA) en el tipo silvestre (WT; N = 5) y ratones homocigotos para una region de cadena ligera de Vk3-20Jk1 humana reordenada disenada por ingeniena genetica (Vk3-20Jk1 HO; N = 5) inmunizados con p-galactosidasa.

La FIG. 7A muestra un esquema de anticuerpos monoespedficos (Parental 1 y Parental 2) y un anticuerpo biespedfico (Biespedfico) construido a partir de regiones variables de cadena pesada de cada anticuerpo monoespedfico parental. Una region variable de cadena ligera comun (oscurecida) se indica en el anticuerpo biespedfico.

La FIG. 7B muestra un esquema para las caractensticas de union de dos anticuerpos monoclonales parentales (Parental 1 y Parental 2) para un antfgeno de interes, asf como la caractenstica de union de un anticuerpo biespedfico construido a partir del emparejamiento de las regiones variables de cadena pesada de cada anticuerpo parental monoespedfico con una cadena ligera comun. Se indica la capacidad del anticuerpo biespedfico para unirse a dos epftopos distintos del antgeno de interes por separado (inferior izquierda) o simultaneamente (inferior derecha).

La FIG. 8 muestra un grafico de barras de la union de anticuerpos biespedficos 300 nM (barras oscuras) y monoespedficos (barras rayadas y grises) a una superficie del Antfgeno E monomerico capturado en unidades BIACORE™ (RU). Se indican el anticuerpo monoclonal parental 1 (Ac P1), el anticuerpo monoclonal parental 2 (Ac P2) y los anticuerpos biespedficos (Ac Bs).

La FIG. 9 muestra dos locus de cadena ligera de inmunoglobulina endogenos modificados por ingeniena genetica (por ejemplo, cadena ligera k). El locus de la parte superior (DLC-5J) contiene un fragmento de ADN humano disenado por ingeniena genetica (lmea rayada) que contiene dos segmentos de gen Vk humano y cinco segmentos de gen Jk humano. El locus de la parte inferior (DLC-1J) contiene un fragmento de ADN humano disenado por ingeniena genetica (lmea rayada) que contiene dos segmentos de gen Vk humano y un segmento de gen Jk humano. Cada locus es capaz de reordenarse para formar una region Vk humana unida operativamente a una region constante de cadena ligera endogena (por ejemplo, una Ck). Se muestran los promotores de inmunoglobulina (flecha sobre el locus), los exones lfderes (flechas rellenas) y los dos segmentos de gen Vk humano (flechas sin rellenar), todos flanqueados cadena arriba (5') por un casete de neomicina que contiene sitios de recombinacion de F it Las secuencias de senal de recombinacion disenadas con cada uno de los segmentos de genes humanos (Vk y Jk) se indican mediante ovalos sin rellenar yuxtapuestos con cada segmento genico. La FIG. 10A, en el panel superior, muestra diagramas de contorno representativos de medula osea tenida para linfocitos B y T (CD19+ and CD3+, respectivamente) de un raton de tipo silvestre (WT) y un raton homocigoto para dos segmentos de gen Vk humanos y cinco segmentos de gen Jk humanos (DLC-5J). El panel inferior muestra diagramas de contorno representativos de la medula osea seleccionados en CD19+ y tenidos para cKit+ y CD43+ de un raton de tipo silvestre (WT) y un raton homocigoto para dos segmentos de gen Vk humanos y cinco segmentos de gen Jk humanos (DLC-5J). Los linfocitos B Pro y Pre se indican en los diagramas de contorno del panel inferior.

La FIG. 10B muestra el numero de linfocitos B Pro (CD19+CD43+ckit+) y Pre (CD19+CD43- ckit-) en medula osea extrafda de femures de ratones de tipo silvestre ( WT) y ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humanos y cinco segmentos de gen Jk humanos (DLC-5J).

La FIG. 11A muestra diagramas de contorno representativos de la medula osea seleccionados en singletes tenidos para la inmunoglobulina M (IgM) y B220 de un raton de tipo silvestre (WT) y un raton homocigoto para dos segmentos de gen Vk humanos y cinco segmentos de gen Jk humanos (DLC-5J). Se observan linfocitos B inmaduros, maduros y pro/pre en cada uno de los diagramas de contorno.

La FIG. 11B muestra el numero total de linfocitos B (CD19+), B inmaduros (B220intIgM+) y B maduros (B220hiIgM+) en medula osea aislada de femures de ratones de tipo silvestre ( WT) y ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humanos y cinco segmentos de gen Jk humanos (DLC-5J).

La FIG. 12A muestra diagramas de contorno representativos de la medula osea seleccionados en singletes tenidos para la inmunoglobulina M (IgM) y B220 de un raton de tipo silvestre (WT) y un raton homocigoto para dos segmentos de gen Vk humanos y cinco segmentos de gen Jk humanos (DLC-5J). Se observan linfocitos B inmaduros, maduros y pro/pre en cada uno de los diagramas de contorno.

La FIG. 12B muestra diagramas de contorno representativos de la medula osea seleccionados en linfocitos B inmaduros (B220intIgM+) y maduros (B220hiIgM+) tenidos para la expresion de IgA e IgK aislada de los femures de un raton de tipo silvestre ( WT) y un raton homocigoto para dos segmentos de gen Vk humanos y cinco segmentos de gen Jk humanos (DLC-5J).

FIG. 13A, en el panel superior, muestra diagramas de contorno representativos de esplenocitos seleccionados en singletes y tenidos para linfocitos B y T (CD19+ and CD3+, respectivamente) de un raton de tipo silvestre (WT) y un raton homocigoto para dos segmentos de gen Vk humanos y cinco segmentos de gen Jk humanos (DLC-5J). El panel inferior muestra diagramas de contorno representativos de esplenocitos seleccionados en CD19+ y tenidos para inmunoglobulina D (IgD) e inmunoglobulina M (IgM) de un raton de tipo silvestre (WT) y un raton homocigoto para dos segmentos de gen Vk humanos y cinco segmentos de gen Jk humanos (DLC-5J). En cada uno de los diagramas de contorno, se indican los linfocitos B maduros (54 para WT, 56,9 para DLC-5J) y de transicion (23,6 para WT, 25,6 para DLC-5J).

La FIG. 13B muestra el numero total de linfocitos B CD19+, linfocitos B de transicion (CD19+IgMhiIgDlD) y linfocitos B maduros (CD19+IgMloIgDhi) en bazos extrafdos de ratones de tipo silvestre (WT) y ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano y dos segmentos de gen Jk humano (DLC-5J).

La FIG. 14A muestra diagramas de contorno representativos y esplenocitos IgA+ e IgK+ seleccionados en CD19+ de un raton de tipo silvestre (WT) y un raton homocigoto para dos segmentos de gen Vk humano y cinco segmentos de gen Jk humano (DLC-5J).

La FIG. 14B muestra el numero total de linfocitos B (CD19+), Linfocitos B IgK+ (CD19+IgK+) y linfocitos B IgA+ (CD19+IgA+) en bazos extrafdos de ratones de tipo silvestre (WT) y ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano y dos segmentos de gen Jk humano (DLC-5J).

La FIG. 15A muestra el desarrollo de linfocitos B perifericos en ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano y cinco segmentos de gen Jk humano. El primer diagrama de contorno (extremo izquierdo) muestra los esplenocitos CD93+ y B220+ seleccionados en CD19+, lo que indica linfocitos B inmaduros (39,6) y maduros (57,8). El segundo diagrama de contorno (mitad superior) muestra la expresion IgM+ y CD23+ en linfocitos B inmaduros que indican las poblaciones de linfocitos B T1 (33,7; IgD-IgM+CD21loCD23-), T2 (21,2; IgDhiIgMhiC D 2lmidCD23+) y T3 (29.1). El tercer diagrama de contorno (parte inferior central) muestra la expresion CD21+ (CD35+) y IgM+ de linfocitos B maduros que indican una pequena poblacion (14,8) que da lugar a linfocitos B de la zona marginal y una segunda poblacion (70,5 ) que da lugar a linfocitos B foliculares (FO). El cuarto diagrama de contorno (parte superior derecha) muestra la expresion B220+ y CD23+ de los linfocitos B maduros que indican poblaciones de linfocitos B de la zona marginal (90,5; MZ) y precursores de la zona marginal (7,3; IgMhiIgDhiCD21hiCD23+). El quinto diagrama de contorno (parte inferior derecha) muestra la expresion IgD+ e IgM+ en linfocitos B maduros que indican las poblaciones de linfocitos B FO-I (79,0; IgDhiIgMloCD21midCD23+) y FO-II (15,1; IgDhiIgMhiCD21midCD23+). Se muestra el porcentaje de celulas de cada region seleccionada.

La FIG. 15B muestra el desarrollo de linfocitos B perifericos en ratones de tipo silvestre. El primer diagrama de contorno (extremo izquierdo) muestra los esplenocitos CD93+ y B220+ seleccionados en CD19+, lo que indica linfocitos B inmaduros (31,1) y maduros (64,4). El segundo diagrama de contorno (mitad superior) muestra la expresion IgM+ y CD23+ en linfocitos B inmaduros que indican las poblaciones de linfocitos B T1 (28,5; IgD-IgM+CD21loCD23-), T2 (28,7; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) y T3 (30,7). El tercer diagrama de contorno (parte inferior central) muestra la expresion CD21+ (CD35+) y IgM+ de linfocitos B maduros que indican una pequena poblacion (7,69) que da lugar a linfocitos B de la zona marginal y una segunda poblacion (78,5 ) que da lugar a linfocitos B foliculares (FO). El cuarto diagrama de contorno (parte superior derecha) muestra la expresion B220+ y CD23+ de los linfocitos B maduros que indican poblaciones de linfocitos B de la zona marginal (79,9; MZ) y precursores de la zona marginal (19,4; IgMhiIgDhiCD21hiCD23+). El quinto diagrama de contorno (parte inferior derecha) muestra la expresion de IgD+ e lgM+ en linfocitos B maduros que indican las poblaciones de linfocitos B FO-I (83,6; IgDhiIgMloCD21midCD23+) y FO-II (13,1; IgDhiIgMhiCD21midCD23+). Se muestra el porcentaje de celulas de cada region seleccionada.

La FIG. 16 muestra el numero total de poblaciones de linfocitos B transicionales, de zona marginal y foliculares en bazos extrafdos de ratones de tipo silvestre (WT) y ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano y cinco segmentos de gen Jk humano (DLC-5J).

La FIG. 17 muestra la expresion relativa de ARNm en la medula osea (eje y) de cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 y derivadas de Vk1-39 en un ensayo de PCR cuantitativa que usa sondas espedficas para segmentos genicos Vk3-20 o Vk1-39 en ratones homocigotos para un reemplazo de los segmentos de genes Vk y Jk endogenos con segmentos de genes Vk y Jk humanos (Hk), ratones de tipo silvestre (WT), ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano y cinco segmentos de gen Jk humano (DLC-5J) y ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano y un segmento de gen Jk humano (DLC-1J). Las senales se normalizan con respecto a la expresion de Ck del raton. ND: No detectado.

La FIG. 18 muestra la expresion relativa de ARNm en bazos enteros (eje y) de cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 y derivadas de Vk1-39 en un ensayo de PCR cuantitativa que usa sondas espedficas para segmentos genicos Vk3-20 o Vk1-39 en ratones homocigotos para un reemplazo de los segmentos de genes Vk y Jk endogenos con segmentos de genes Vk y Jk humanos (Hk), ratones de tipo silvestre (WT), ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano y cinco segmentos de gen Jk humano (DLC-5J) y ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano y un segmento de gen Jk humano (DLC-1J). Las senales se normalizan con respecto a la expresion de Ck del raton. ND: No detectado.

La FIG. 19 muestra una ilustracion general de la recombinacion de un segmento de gen V y J de un alelo de cadena ligera k de inmunoglobulina en un raton y la estructura del locus de cadena ligera antes de la reordenacion (arriba) y despues de la reordenacion (abajo). Dicha reordenacion, como se muestra, es solo una de las varias reordenaciones posibles.

Descripcion detallada

La presente invencion no se limita a los metodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos metodos y condiciones pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologfa utilizada en el presente documento unicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, dado que el alcance de la presente invencion se define por las reivindicaciones.

Salvo que se defina de otro modo, todos los terminos y frases utilizadas en el presente documento incluyen que los terminos y las frases que son habituales en la tecnica, salvo que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se usa un termino o frase. Aunque pueden utilizarse en la practica o el ensayo de la presente invencion cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuacion, se describen metodos y materiales particulares.

El termino "anticuerpo", como se usan en el presente documento, incluye moleculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptfdicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una region variable de cadena pesada (V^h) y una region constante de cadena pesada (C^h). La region constante de cadena pesada comprende tres dominios, C^h1, C^h2 y C^h3. Cada cadena ligera comprender una region variable de cadena ligera (V^l) y una region constante de cadena ligera (C^l). Las regiones V^hy V^lpueden subdividirse ademas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, llamadas regiones marco (FR). Cada V^hy V^lcomprende tres CDR y de cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (las CDR de cadena pesada se pueden abreviar como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de cadena ligera se pueden abreviar como LCDR1, LCDR2 y LCDR3. La expresion anticuerpo “de alta afinidad” se refiere a un anticuerpo que tiene una K^dcon respecto a su epftopo diana de aproximadamente 10-9 M o inferior (por ejemplo, de aproximadamente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M o aproximadamente 1 x 10-12 M). En una realizacion, la K^dse mide mediante resonancia de plasmon superficial, por ejemplo, BIACORE™; en otra realizacion, la K^dse mide mediante ELISA.

La expresion "anticuerpo biespedfico" se refiere a un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a dos o mas epftopos. Los anticuerpos biespedficos incluyen fragmentos de dos anticuerpos monoclonales diferentes (FIG. 7A) y, en general, comprenden dos cadenas pesadas no identicas derivadas de los dos anticuerpos monoclonales diferentes, con cada cadena pesada uniendose espedficamente a un epftopo diferente, ya sea en dos moleculas diferentes (por ejemplo, diferentes epftopos en dos inmunogenos diferentes; vease la FIG. 7B, parte inferior izquierda) o en la misma molecula (por ejemplo, diferentes epftopos del mismo inmunogeno; vease la FIG. 7B, parte inferior derecha). Si un anticuerpo biespedfico es capaz de unirse selectivamente a dos epftopos diferentes (un primer epftopo y un segundo epftopo), la afinidad de la primera cadena pesada por el primer epftopo, en general, sera de al menos uno a dos o tres o cuatro o mas ordenes de magnitud inferior a la afinidad de la primera cadena pesada por el segundo epftopo, y viceversa. Los epftopos unidos espedficamente por el anticuerpo biespedfico pueden estar en la misma diana o en una diana diferente (por ejemplo, en la misma protema o en otra diferente; vease la FIG. 7B. Los anticuerpos biespedficos ilustrativos incluyen aquellos con una primera cadena pesada espedfica de un antfgeno tumoral y una segunda cadena pesada espedfica de un marcador citotoxico, por ejemplo, un receptor Fc (por ejemplo, FcyRI, FcyRII, FcyRIII, etc.) o un marcador de linfocitos T (por ejemplo, CD3, c D28, etc.). Ademas, la segunda region variable de cadena pesada puede sustituirse con una region variable de cadena pesada que tiene una especificidad deseada diferente. Por ejemplo, un anticuerpo biespedfico con una primera cadena pesada espedfica de un antfgeno tumoral y una segunda cadena pesada espedfica de una toxina puede emparejarse para administrar una toxina (por ejemplo, saporina, alcaloide de la vinca, etc.) a un linfocito tumoral. Otros ejemplos de anticuerpos biespedficos incluyen aquellos con una primera cadena pesada espedfica de un receptor activador (por ejemplo, receptor de los linfocitos B, FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, FcaRI, receptor de linfocitos T, etc.) y una segunda cadena pesada espedfica de un inhibidor receptor (por ejemplo, FcyRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a, etc.). Dichos anticuerpos biespedficos pueden construirse para condiciones terapeuticas asociadas con la activacion celular (por ejemplo, alergia y asma). Los anticuerpos biespedficos se pueden producir, por ejemplo, combinando cadenas pesadas que reconocen diferentes epftopos del mismo o diferente inmunogeno (FIG. 7B). Por ejemplo, las secuencias de acido nucleico que codifican secuencias variables de cadena pesada que reconocen diferentes epftopos del mismo o diferente inmunogeno pueden fusionarse con secuencias de acido nucleico que codifican las regiones constantes de cadena pesada iguales o diferentes, y dichas secuencias pueden expresarse en una celula que exprese una cadena ligera de inmunoglobulina. Un anticuerpo biespedfico tfpico tiene dos cadenas pesadas, cada una con tres CDR de cadena pesada, seguidas de un dominio C^h1 (N-terminal a C-terminal), una bisagra, un dominio C^h2 y un dominio C^h3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que bien no confiere especificidad de union al epftopo, pero puede asociarse con cada cadena pesada, o puede asociarse con cada cadena pesada y puede unir uno o mas de los epftopos unidos por las regiones de union al epftopo de cadena pesada, o que puede asociarse con cada pesada y permitir la union, o una o ambas cadenas pesadas a uno o ambos epftopos.

El termino "celula" incluye cualquier celula que sea adecuada para expresar una secuencia de acido nucleico recombinante. Las celulas incluyen las de organismos procariotas y eucariotas (monocelulares o multicelulares), celulas bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus sp., Streptomyces sp., etc.), celulas de micobacterias, celulas fungicas, celulas de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), celulas vegetales, celulas de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, celulas de insecto infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), celulas animales no humanas, celulas humanas o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunos casos, la celula es una celula de ser humano, mono, simio, hamster, rata o raton. En algunos casos, la celula es eucariota y se selecciona entre las siguientes celulas: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), celula retiniana, Vero, CV1, de rinon (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (Por ejemplo., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermica), c V-1, U937, 3t 3, celula L, celula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, celula de Sertoli, celula de BRL 3A, celula HT1080, celula de mieloma, celulas tumorales y una estirpe celular derivada de una celula mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, la celula comprende uno o mas genes vfticos, por ejemplo, una celula retiniana que expresa un gen vftico (por ejemplo, una celula PER.C6™).

La expresion "region determinante de la complementariedad" o el termino "CDR", incluye una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido nucleico de los genes de inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir, de un animal de tipo silvestre) aparece entre dos regiones marco conservadas en una region variable de una cadena ligera o pesada de una molecula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de linfocitos T). Una CDR puede ser codificada, por ejemplo, por una secuencia de la lmea germinal o una secuencia reordenada o no reordenada, y, por ejemplo, por un linfocito B o un linfocito T no tratado previamente o maduro. Una CDR puede ser mutada somaticamente (por ejemplo, variar de una secuencia codificada en la lmea germinal de un animal), humanizada y/o modificada con sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoacidos. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden estar codificadas por dos o mas secuencias (por ejemplo, secuencias de la lmea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia de acido nucleico no reordenada), pero que son contiguas en una secuencia de acido nucleico de linfocitos B, por ejemplo, como resultado del corte y empalme o de la conexion de las secuencias (por ejemplo, recombinacion de V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

El termino "conservativa", cuando se usa para describir una sustitucion conservativa de aminoacido, incluye la sustitucion de un resto de aminoacido por otro resto de aminoacido que tiene un grupo R de la cadena secundaria con propiedades qmmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitucion conservativa de aminoacidos no cambiara sustancialmente las propiedades funcionales de interes de una protema, por ejemplo, la capacidad de una region variable para unirse espedficamente a un epftopo diana con una afinidad deseada. Los ejemplos de grupos de aminoacidos que tienen cadenas secundarias con propiedades qmmicas similares incluyen cadenas secundarias alifaticas tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas secundarias hidroxil alifaticas tales como serina y treonina; cadenas secundarias que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas secundarias aromaticas tales como fenilalanina, tirosina y triptofano; cadenas secundarias basicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas secundarias acidas tales como acido aspartico y acido glutamico; y cadenas secundarias que contienen azufre tales como cistema y metionina. Los grupos de sustitucion de aminoacidos conservativos incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/arginina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunas realizaciones, una sustitucion de aminoacidos conservativa puede ser una sustitucion de cualquier resto nativo en una protema con alanina, como se usa en, por ejemplo, mutagenesis de barrido de alanina. En algunas realizaciones, se realiza una sustitucion conservativa que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logantmica de PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) “Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database”, Science 256:1443-45. En algunas realizaciones, la sustitucion es una sustitucion moderadamente conservativa en la que la sustitucion tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logantmica de PAM250.

En algunas realizaciones, las posiciones de los restos en una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina difieren en una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas. En algunas realizaciones, las posiciones de los restos en una cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma (por ejemplo, un fragmento que permite la expresion y la secrecion de, por ejemplo, un linfocito B) no son identicas a una cadena ligera cuya secuencia de aminoacidos se enumera en el presente documento, sino que difiere en una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas.

La expresion "protema de union al epftopo" incluye una protema que tiene al menos una CDR y que es capaz de reconocer selectivamente un epftopo, por ejemplo, es capaz de unirse a un epftopo con una K^dque esta a aproximadamente un micromolar o menos (por ejemplo, una K^dque es aproximadamente 1 x 10'6 M, 1 x 10'7 M, 1 x 10'9 M, 1 x 10'9 M, 1 x 10'10 M, 1 x 10'11 M o aproximadamente 1 x 10'12 M). Las protemas de union al epftopo terapeuticas (por ejemplo, anticuerpos terapeuticos) con frecuencia requieren una K^dque esta en el intervalo nanomolar o picomolar.

La expresion "fragmento funcional" incluye fragmentos de protemas de union al epftopo que pueden expresarse, secretarse y unirse espedficamente a un epftopo con una K^den el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar. El reconocimiento espedfico incluye tener una K^dque esta al menos en el intervalo micromolar, el intervalo nanomolar o el intervalo picomolar.

La expresion "lmea germinal" incluye una referencia a una secuencia de acido nucleico de inmunoglobulina de una celula no mutada somaticamente, por ejemplo, un linfocito B o un linfocito pre-B, o una celula hematopoyetica no mutados somaticamente.

La expresion "cadena pesada", o "cadena pesada de inmunoglobulina", incluye una secuencia de region constante de cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier organismo. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres regiones CDR de cadena pesada y cuatro regiones FR, a menos que se especifique otra cosa. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen CDR, CDR y FR, y combinaciones de las mismas. Una cadena pesada tfpica tiene, siguiendo el dominio variable (de N-terminal a C-terminal), un dominio C^h1, una bisagra, un dominio C^h2 y un dominio C^h3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer espedficamente un epftopo (por ejemplo, reconocer el epftopo con una K^den el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar), que es capaz de expresarse y secretares desde una celula, y que comprende al menos una CDR.

El termino "identidad", cuando se usa junto con secuencia incluye identidad, como se determina mediante numerosos algoritmos diferentes conocidos en la tecnica que se pueden usar para medir la identidad de la secuencia de nucleotidos y aminoacidos. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se determinan las identidades usando un alineamiento ClustalW v. 1.83 (lento) que emplea una penalizacion por apertura de hueco de 10.0, una penalizacion por extension de hueco de 0,1, y que utiliza una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0. 2, MacVector Inc., 2008). La longitud de las secuencias comparadas con respecto a la identidad de las secuencias dependera de las secuencias concretas, pero en el caso de un dominio constante de cadena ligera, la longitud debe contener una secuencia de longitud suficiente para plegarse en un dominio constante de cadena ligera que sea capaz de autoasociarse para formar un dominio canonico de cadena ligera, por ejemplo, capaz de formar dos laminas beta que comprendan cadenas beta y capaz de interactuar con al menos un dominio C^h1 de un ser humano o un raton. En el caso de un dominio C^h1, la longitud de la secuencia debe contener una secuencia de longitud suficiente para plegarse en un dominio C^h1 que sea capaz de formar dos laminas beta que comprendan cadenas beta y que pueda interactuar con al menos un dominio constante de cadena ligera de un raton o un ser humano.

La expresion "molecula de inmunoglobulina" incluye dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas pueden ser identicas o diferentes, y las cadenas ligeras pueden ser identicas o diferentes.

La expresion "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo y, a menos que se especifique lo contrario, incluye cadenas ligeras k y A humanas y una VpreB, asf como cadenas ligeras sustitutas. Los dominios variables de cadena ligera (V^l) normalmente incluyen tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique otra cosa. En general, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo, un dominio V^lque incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y un dominio constante de cadena ligera. Las cadenas ligeras incluyen aquellas, por ejemplo, que no se unen selectivamente a un primer o a un segundo epftopo unidos selectivamente por la protema de union al epftopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras tambien incluyen aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada con la union y el reconocimiento, de uno o mas epftopos unidos de forma selectiva por la protema de union al epftopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras comunes son aquellas derivadas de una secuencia de Vk1-39Jk5 humana reordenada o una secuencia de Vk3-20Jk1 humana reordenada, e incluyen versiones mutadas somaticamente (por ejemplo, maduradas por afinidad).

La expresion "intervalo micromolar" pretende significar 1-999 micromolar; la expresion "intervalo nanomolar" pretende significar 1-999 nanomolar; la expresion "intervalo picomolar" significa 1-999 picomolar.

La expresion "mutado somaticamente" incluye una referencia a una secuencia de acido nucleico de un linfocito B que ha sufrido un cambio de clase, en el que la secuencia de acido nucleico de una region variable de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada o que incluye una secuencia de CDR o FR de cadena pesada) en el linfocito B con cambio de clase no es identica a la secuencia de acido nucleico del linfocito B antes del cambio de clase, tal como, por ejemplo, una diferencia en una CDR o secuencia de acido nucleico estructural entre un linfocito B que no se ha sometido a cambio de clase y un linfocito B que ha sufrido cambio de clase. “Mutadas somaticamente” incluye la referencia a secuencias de acido nucleico de linfocitos B madurados por afinidad que no son identicos a las secuencias de region variable de inmunoglobulina correspondientes de linfocitos B que no estan madurados por afinidad (es decir, secuencias del genoma de celulas de la lrnea germinal). La expresion "mutada somaticamente" tambien incluye una referencia a una secuencia de acido nucleico de la region variable de inmunoglobulina de un linfocito B despues de la exposicion del linfocito B a un epftopo de interes, de manera que la secuencia de acido nucleico difiere de la secuencia de acido nucleico correspondiente antes de la exposicion de los linfocitos B al epftopo de interes. La expresion "mutada somaticamente" se refiere a secuencias de anticuerpos que se han generado en un animal, por ejemplo, un raton que tiene secuencias de acido nucleico de region variable de inmunoglobulina humana, en respuesta a la exposicion a un inmunogeno, y que resultan de los procesos de seleccion inherentemente operativos en dicho animal.

El termino "no reordenada", con referencia a una secuencia de acido nucleico, incluye secuencias de acido nucleico que existen en la lrnea germinal de una celula animal.

La expresion "dominio variable" incluye una secuencia de aminoacidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (modificada segun se desee) que comprende las siguientes regiones de aminoacidos, en orden desde N-terminal a C-terminal (a menos que se indique lo contrario): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Cadena ligera universal

Los esfuerzos previos por fabricar protemas de union al epftopo multiespedficas utiles, por ejemplo, anticuerpos biespedficos, se han visto obstaculizados por una variedad de problemas que frecuentemente comparten un paradigma comun: la seleccion o manipulacion in vitro de secuencias para disenar racionalmente, o para disenar mediante prueba y error, un formato adecuado para el emparejamiento de una inmunoglobulina humana biespedfica heterodimerica. Desafortunadamente, la mayoria, si no todos, los enfoques de ingenieria in vitro brindan soluciones en gran medida ad hoc que son adecuadas, si acaso, para moleculas individuales. Por otro lado, no se han realizado metodos in vivo para emplear organismos complejos para seleccionar los emparejamientos apropiados que son capaces de conducir a agentes terapeuticos humanos.

Los ratones que contienen locus de inmunoglobulina humana, regiones variables y constantes insertadas aleatoriamente en el genoma del raton, se conocen en la tecnica. Las cepas iniciales de dichos ratones conteman un numero limitado de segmentos genicos de inmunoglobulina humana. Espedficamente, un punado de cepas que conteman segmentos de genes de cadena ligera de inmunoglobulina humana conteman uno, tres o cuatro segmentos de gen V^lde inmunoglobulina humana y cinco segmentos de gen J^lde inmunoglobulina humana (Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Research 20(23): 6287-6295; Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851; Lonberg et al.

1994, Nature 368: 856-859; Green et al. 1994, Nature Genetics 7:13-21; Green y Jakobovits 1998, J. Exp. Med. 188(3): 483-495; Green 1999, J. Immunol. Methods 231: 11-23). Estos ratones que conteman solo unos cuantos segmentos de gen V^lde inmunoglobulina humanos como parte de transgenes completamente humanos insertados al azar en el genoma del raton demostraron numeros de linfocitos B comprometidos, desarrollo de linfocitos B alterado y otras deficiencias inmunitarias. La expresion de los genes V^lde la inmunoglobulina humana, detectada por la expresion superficial de la Ck humana en los linfocitos B, fue menor que la cadena ligera k endogena en comparacion con el tipo silvestre. Sorprendentemente, la presente invencion proporciona ratones cuyo numero y desarrollo de linfocitos B es casi de tipo silvestre con respecto a cuando los ratones se modifican por ingeniena genetica en los locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endogenos para contener uno o dos segmentos de gen Vk de inmunoglobulina humana (por ejemplo, los Ejemplos 2 y 14, Tablas 3, 25 y 26, y FIG. 4, 10A-18). Ademas, en algunas realizaciones, los ratones proporcionados por la presente invencion, son capaces de generar varios anticuerpos quimericos inversos de alta afinidad que contienen dominios V^hy V^lhumanos en respuesta al antfgeno, en los que cada uno de los dominios V^lcontienen uno de dos segmentos de gen V^lhumanos posibles y uno de cinco segmentos de gen J^lhumanos posibles (por ejemplo, veanse los Ejemplos 5-10, 12 y 14). Por lo tanto, a diferencia de las cepas preliminares de ratones disenados por ingeniena genetica con minilocus de cadena ligera de inmunoglobulina humana (es decir, un numero limitado de segmentos de genes de inmunoglobulina humana), en la actualidad, se proporcionan ratones disenados que contienen un numero limitado de segmentos de gen V^lde inmunoglobulina humana (dos) y 5 segmentos de gen J^lde inmunoglobulina humana, presentan sorprendentemente numeros de linfocitos B normales, expresion de cadena ligera de inmunoglobulina normal y desarrollo de linfocitos B normal. Ademas, dichos ratones proporcionados tampoco muestran una capacidad reducida o deteriorada para generar respuestas inmunitarias potentes hacia multiples antfgenos como resultado de un repertorio de cadenas ligeras de inmunoglobulina limitado. Por consiguiente, se proporcionan ratones que comprenden un locus de V^lhumanizado que comprende dos segmentos de gen V^lde inmunoglobulina humana no reordenados y 5 segmentos de gen J^lde inmunoglobulina humana, y que muestran poblaciones de linfocitos B de tipo silvestre en numero, y muestran desarrollo de linfocitos B de tipo silvestre.

Por lo tanto, se proporciona a un raton en su genoma de la lmea germinal:

dos segmentos de gen Vk de inmunoglobulina humana y cinco segmentos de gen Jk de inmunoglobulina humana unidos operativamente a una secuencia de region constante de cadena ligera de inmunoglobulina de raton o de rata, en el que los dos segmentos de gen Vk de inmunoglobulina humana son un Vk1-39 humano y un Vk3-20 humano, y los cinco segmentos de gen Jk de inmunoglobulina humana son Jk1 humano, Jk2 humano, Jk3 humano, Jk4 humano y Jk5 humano; y

uno o mas segmentos de gen V^hde la inmunoglobulina humana, uno o mas segmentos de gen D^hde la inmunoglobulina humana y uno o mas segmentos de gen J^hde la inmunoglobulina humana unidos operativamente a una secuencia de region constante de inmunoglobulina de raton o de rata;

en el que los segmentos de gen humano de inmunoglobulina son capaces de reordenarse y codificar dominios variables de inmunoglobulina humana de un anticuerpo, y, ademas, raton que no comprende un segmento genico V^lde inmunoglobulina endogeno que es capaz de reordenarse para formar una secuencia de region variable de cadena ligera de inmunoglobulina. En general, las secuencias de ratones nativos con frecuencia no son una buena fuente de secuencias terapeuticas humanas. Al menos por ese motivo, la generacion de regiones variables de inmunoglobulina de cadena pesada de raton que se emparejan con una cadena ligera humana comun tienen una utilidad practica limitada. Se realizanan mas esfuerzos de ingeniena in vitro en un proceso de prueba y error para tratar de humanizar las secuencias variables de cadena pesada del raton mientras se espera mantener la especificidad y afinidad del epftopo mientras se mantiene la capacidad de acoplarse con la cadena ligera humana comun, con un resultado incierto. Al final de dicho proceso, el producto final puede mantener algo de la especificidad y la afinidad, y asociarse con la cadena ligera comun, pero, en ultima instancia, la inmunogenicidad en un ser humano probablemente siga siendo un gran riesgo.

Por lo tanto, un raton adecuado para la fabricacion de agentes terapeuticos para seres humanos incluina un repertorio adecuadamente grande de segmentos genicos de region variable de cadena pesada humanos en lugar de segmentos genicos de region variable de cadena pesada endogenos de raton. Los segmentos genicos de region variable de cadena pesada humanos debenan poder reordenarse y recombinarse con un dominio constante de cadena pesada de raton endogeno para formar una cadena pesada quimerica inversa (es decir, una cadena pesada que comprendiera un dominio variable humano y una region constante de raton). La cadena pesada debe ser capaz de cambiar de clase e hipermutacion somatica de modo que el repertorio de dominios variables de cadena pesada este disponible para que el raton seleccione uno que pueda asociarse con el repertorio limitado de regiones variables de cadena ligera humanas.

Un raton que selecciona una cadena ligera comun para una pluralidad de cadenas pesadas tiene una utilidad practica. En diversas realizaciones, los anticuerpos que se expresan en un raton que solo puede expresar una cadena ligera comun tendran cadenas pesadas que podran asociarse y expresarse con una cadena ligera identica o esencialmente identica. Esto es particularmente util en la fabricacion de anticuerpos biespedficos. Por ejemplo, dicho raton puede inmunizarse con un primer inmunogeno para generar un linfocito B que exprese un anticuerpo que se una espedficamente a un primer epttopo. El raton (o un raton geneticamente igual) se puede inmunizar con un segundo inmunogeno para generar un linfocito B que exprese un anticuerpo que se una espedficamente al segundo epttopo. Las regiones de cadena pesada variables pueden clonarse a partir de linfocitos B y expresarse con la misma region constante de cadena pesada y la misma region variable de cadena ligera (por ejemplo, una cadena ligera comun) en una celula para producir un anticuerpo biespedfico, de modo que el componente de cadena pesada variable del anticuerpo biespedfico ha sido seleccionado por un raton para asociarlo y expresarlo con el componente de cadena ligera variable (o cadena ligera comun).

Los inventores han disenado por ingeniena genetica un raton para generar cadenas ligeras de inmunoglobulina que se emparejaran adecuadamente con una familia bastante diversa de cadenas pesadas, incluyendo las cadenas pesadas cuyas regiones variables se separan de las secuencias de la lmea germinal, por ejemplo, las regiones variables maduradas por afinidad o mutadas somaticamente. En diversas realizaciones, el raton esta disenado para emparejar dominios variables de cadena ligera humanos con dominios variables de cadena pesada humanos que comprenden mutaciones somaticas, permitiendo asf una via a protemas de union de alta afinidad adecuadas para su uso como agentes terapeuticos para seres humanos.

El raton creado mediante ingeniena genetica, a traves del largo y complejo proceso de seleccion de anticuerpos dentro de un organismo, toma decisiones biologicamente apropiadas al emparejar una coleccion diversa de dominios variables de cadena pesada humanos con un numero limitado de opciones de cadenas ligeras humanas. Para conseguir esto, el raton se disena por ingeniena genetica para presentar un numero limitado de opciones de dominio variable de cadena ligera humano junto con una amplia diversidad de opciones de dominio variable de cadena pesada humano. Tras el desaffo con un inmunogeno, el raton aumenta al maximo el numero de soluciones en su repertorio para desarrollar un anticuerpo contra el inmunogeno, limitado en gran parte o unicamente por el numero o las opciones de cadena ligera de su repertorio. En diversas realizaciones, esto incluye permitir que el raton logre mutaciones somaticas adecuadas y compatibles del dominio variable de cadena ligera que, sin embargo, seran compatibles con una variedad relativamente grande de dominios variables de cadena pesada humanos, incluyendo, en particular, dominios variables de cadena pesada humanos mutados somaticamente.

Para lograr un repertorio limitado de opciones de cadena ligera, el raton se disena para volver no funcional o esencialmente no funcional su capacidad de hacer, o reordenar, un dominio variable de cadena ligera nativo de raton. Esto puede lograrse, por ejemplo, eliminando los segmentos genicos de region variable de cadena ligera del raton. El locus del raton endogeno puede modificarse luego por un segmento genico de la region variable de cadena ligera humano exogena adecuado, unido operativamente al dominio constante de cadena ligera del raton endogeno, de manera que los segmentos genicos de la region variable humanos exogenos se puedan combinar con el gen endogeno de la region constante de cadena ligera del raton y formar un gen de cadena ligera quimerica inversa reordenada (variable humana, constante del raton). En diversas realizaciones, la region variable de cadena ligera es capaz de ser mutada somaticamente. En diversas realizaciones, para maximizar la capacidad de la region variable de cadena ligera para adquirir mutaciones somaticas, se conserva/n el/los potenciador/es apropiado/s en el raton. Por ejemplo, al modificar un locus de cadena ligera k de raton para reemplazar los segmentos genicos de cadena ligera k de raton endogenos por segmentos genicos de cadena ligera k humanos, el potenciador intronico k de raton y el potenciador 3' k de raton se mantienen funcionalmente o no se interrumpen.

Se proporciona un raton de ingeniena genetica que expresa un repertorio limitado de cadenas ligeras quimericas inversas (variables humanas, constantes de raton) asociadas con una diversidad de cadenas pesadas quimericas inversas (variables humanas, constantes de raton). En diversas realizaciones, los segmentos de gen de cadena ligera k endogenos del raton se eliminan y se reemplazan por dos regiones de cadena ligera humanas reordenadas, unidas operativamente al gen Ck endogeno de raton. En realizaciones para maximizar la hipermutacion somatica de la region de cadena ligera humana reordenada, se mantienen el potenciador intronico k de raton y el potenciador 3' k de raton. En diversas realizaciones, el raton tambien comprende un locus de cadena ligera A no funcional, o una eliminacion del mismo o una eliminacion que hace que el locus sea incapaz de formar una cadena ligera A.

Tambien se hace referencia a un raton disenado geneticamente que, en diversos casos, comprende un locus de region variable de cadena ligera que carece de segmentos de gen V^ly J^lde cadena ligera de raton endogenos y que comprende una region variable de cadena ligera humana reordenada, en un caso, una secuencia de V^l/J^lhumana reordenada, unida operativamente a una region constante de raton, de modo que el locus es capaz de experimentar hipermutacion somatica, y de modo que el locus expresa una cadena ligera que comprende la secuencia de V^l/J^lhumana unida a una region constante de raton. Por lo tanto, en diversos casos, el locus comprende un potenciador 3' k de raton, que se correlaciona con un nivel normal o de tipo silvestre de hipermutacion somatica.

El raton disenado geneticamente en diversas realizaciones, cuando se inmuniza con un antfgeno de interes, genera linfocitos B que presentan una diversidad de reordenaciones de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humanas que se expresan y funcionan con dos cadenas ligeras reordenadas, Incluyendo las realizaciones en las que dos cadenas ligeras comprenden regiones variables de cadena ligera humanas que comprenden, por ejemplo, de 1 a 5 mutaciones somaticas. En diversas realizaciones, las cadenas ligeras humanas expresadas de este modo son capaces de asociarse y expresarse con cualquier region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana expresada en el raton.

Ademas de los ratones disenados geneticamente que comprenden un repertorio limitado de cadenas ligeras de inmunoglobulina (por ejemplo, un solo segmento de gen V^lhumano o no mas de dos segmentos de gen V^lhumanos y, un segmento de gen J^lhumano u, opcionalmente, dos o mas segmentos de gen J^lhumanos) como se describe en el presente documento, tambien se describen en el presente documento otros animales no humanos modificados geneticamente que comprenden un solo segmento de gen V^lhumano o no mas de dos segmentos de gen V^lhumanos. En algunos casos, dichos animales no humanos comprenden una sola region V^lhumana reordenada compuesta de una secuencia de V^lJ^lhumana reordenada. En algunos casos, dichos animales no humanos comprenden no mas de dos segmentos de gen V^lhumanos y dos o mas (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 segmentos de gen J^lhumanos. En diversos casos, los segmentos de genes humanos estan unidos operativamente a una region constante de cadena ligera no humana, por ejemplo, una region constante de cadena ligera de raton o de rata.

El animal no humano proporcionado es un raton. Para los animales no humanos roedores cuyas celulas ES geneticamente modificables adecuadas no esten facilmente disponibles, se emplean otros metodos para obtener un animal no humano que comprenda las modificaciones geneticas segun lo descrito en el presente documento. Dichos metodos incluyen, por ejemplo, modificar el genoma de una celula no ES (por ejemplo, un fibroblasto o una celula pluripotente inducida) y emplear la transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una celula adecuada, por ejemplo, un ovocito, y gestar la celula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en las condiciones adecuadas para formar un embrion.

[Eliminado]

En algunas realizaciones, el raton proporcionado es de una cepa C57BL seleccionada entre C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/Ola. En algunas determinadas realizaciones, un raton de la presente invencion es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129p3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (vease, por ejemplo, Festing et al., 1999, “Mammalian Genome” 10:836; Auerbach et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). En algunas determinadas realizaciones, un raton modificado geneticamente de la presente invencion es una mezcla de una cepa 129 anteriormente mencionada y una cepa C57BL/6 anteriormente mencionada. En algunas determinadas realizaciones, un raton de la presente invencion es una mezcla de las cepas 129 anteriormente mencionadas, o una mezcla de las cepas BL/6 anteriormente mencionadas. En algunas determinadas realizaciones, una cepa 129 de la mezcla segun lo descrito en el presente documento es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En alguna realizacion, un raton de la presente invencion es de una cepa BALB, por ejemplo, cepa BALB/c. En algunas realizaciones, un raton de la presente invencion es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa anteriormente mencionada.

[Eliminado]

Protemas de union al epftopo que se unen a mas de un epftopo

Las composiciones y los metodos descritos en el presente documento se pueden usar para producir protemas de union que se unen a mas de un epftopo con alta afinidad, por ejemplo, anticuerpos biespedficos. Las ventajas de la invencion incluyen la capacidad de seleccionar adecuadamente cadenas de inmunoglobulina de cadena pesada de union adecuadamente alta (por ejemplo, maduradas por afinidad), cada una de las cuales se asociara con una sola cadena ligera.

Se han publicado varias tecnicas de generacion de fragmentos de anticuerpos biespedficos a partir de cultivos de celulas recombinantes. Sin embargo, la smtesis y expresion de protemas de union biespedficas ha sido problematica, en parte debido a problemas asociados con la identificacion de una cadena ligera adecuada que pueda asociarse y expresarse con dos cadenas pesadas diferentes, y en parte debido a problemas de aislamiento. En diversas realizaciones, las composiciones y los metodos descritos en el presente documento proporcionan la ventaja de los anticuerpos biespedficos de longitud completa que no requieren modificaciones especiales para mantener la estructura de inmunoglobulina tradicional al aumentarse la estabilidad/interaccion de los componentes (FIG. 7A). En diversas realizaciones, dichas modificaciones han resultado ser complicadas y han servido como un obstaculo para el desarrollo de la tecnologfa de anticuerpos biespedficos y su uso potencial en el tratamiento de enfermedades humanas. Por lo tanto, en diversas realizaciones, al proporcionar una estructura de inmunoglobulina natural (es decir, de longitud completa) que tiene la propiedad anadida de multiples especificidades, los anticuerpos biespedficos de longitud completa mantienen sus funciones efectoras crfticas de las que carecen los fragmentos biespedficos anteriores, y ademas, proporcionan agentes terapeuticos que demuestran el importante parametro farmacocinetico de una semivida mas larga.

Los metodos y las composiciones descritos en el presente documento permiten que un raton modificado geneticamente seleccione, mediante procesos naturales, una cadena ligera adecuada que pueda asociarse y expresarse con mas de una cadena pesada, incluyendo las cadenas pesadas que estan mutadas somaticamente (por ejemplo, maduradas por afinidad). Las secuencias de V^ly V^hhumanas de los linfocitos B adecuados de ratones inmunizados segun lo descrito en el presente documento que expresan anticuerpos madurados por afinidad que tienen cadenas pesadas quimericas inversas (es dedr, variables humanas y constantes de raton) se pueden identificar y clonar en fase en un vector de expresion con una secuencia genica de region constante humana adecuada (por ejemplo, una lgG1 humana). Se pueden preparar dos de dichas construcciones, de modo que cada construccion codifica un dominio variable de cadena pesada humano que se une a un epftopo diferente. Uno de los V^lhumanos (por ejemplo, Vk1-39Jk5 humano o Vk3-20Jk1 humano), en la secuencia de la lmea germinal o de un linfocito B en el que la secuencia ha sido mutada somaticamente, puede fusionarse en fase con un gen de region constante humano adecuado (por ejemplo, un gen constante k humano). Estas tres construcciones completamente humanas, pesadas y ligeras, pueden colocarse en una celula adecuada para la expresion. La celula expresara dos especies principales: una cadena pesada homodimerica con la cadena ligera identica y una cadena pesada heterodimerica con la cadena ligera identica. Para permitir una separacion facil de estas especies principales, una de las cadenas pesadas se modifica para omitir un determinante de union a la protema A, que da lugar a una afinidad diferencial de una protema de union homodimerica de una protema de union heterodimerica. Las composiciones y los metodos que abordan este problema se describen en USSN 12/832.838, presentada el 25 de junio de 2010, titulado "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format", publicado como el documento US 2010/0331527A1.

Tambien se hace referencia a una protema de union al epftopo, en la que las secuencias de V^ly V^hhumanas se derivan de ratones descritos en el presente documento que se han inmunizado con un antfgeno que comprende un epftopo de interes.

Tambien se hace referencia a una protema de union al epftopo que comprende un primer y un segundo polipeptido, comprendiendo el primer polipeptido, desde el extremo N al extremo C, una primera region de union al epftopo que se une selectivamente a un primer epftopo, seguido de una region constante que comprende una primera region C^h3 de una IgG humana seleccionada de lgGl, IgG2, IgG4 y una combinacion de las mismas; y un segundo polipeptido que comprende, desde el extremo N al extremo C, una segunda region de union al epftopo que se une selectivamente a un segundo epftopo, seguido de una region constante que comprende una segunda region C^h3 de una IgG humana seleccionada de lgG1, IgG2, IgG4 y una combinacion de las mismas, en la que la segunda region C^h3 comprende una modificacion que reduce o elimina la union del segundo dominio C^h3 a la protema A.

En un caso, la segunda region C^h3 comprende una modificacion H95R (por numeracion de exones IMGT; H435R por numeracion EU). En otra realizacion, la segunda region C^h3 comprende ademas una modificacion Y96F (IMGT; Y436F segun EU).

En un caso, la segunda region C^h3 es de una lgG1 humana modificada, y ademas comprende una modificacion seleccionada del grupo que consiste en D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I segun EU).

En un caso, la segunda region CH3 es de una lgG2 humana modificada, y ademas comprende una modificacion seleccionada del grupo que consiste en N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I segun EU).

En un caso, la segunda region CH3 es de una lgG4 humana modificada, y ademas comprende una modificacion seleccionada del grupo que consiste en Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I segun EU).

Un metodo de produccion de una protema de union al epftopo que se une a mas de un epftopo es inmunizar un primer raton de acuerdo con la invencion con un antfgeno que comprende un primer epftopo de interes, en el que el raton comprende un locus de region variable de cadena ligera de inmunoglobulina endogeno que no contiene un V^lde raton endogeno que es capaz de reordenar y formar una cadena ligera, en el que el locus de la region variable de cadena ligera de la inmunoglobulina de raton endogeno es una sola region V^lhumana reordenada unida operativamente al gen de la region constante de cadena ligera endogeno del raton, y la region V^lhumana reordenada se selecciona entre un Vk1-39Jk5 humano y un Vk3-20Jk1 humano, y los segmentos de gen V^hde raton endogenos han sido reemplazados en su totalidad o en parte por segmentos de gen VH humano, de modo que las cadenas pesadas de inmunoglobulina producidas por el raton son unica o esencialmente cadenas pesadas que comprenden dominios variables humanos y dominios constantes de raton. Cuando se inmuniza, dicho raton creara un anticuerpo quimerico inverso, que comprendera solo uno de los dos dominios variables de cadena ligera humanos (por ejemplo, uno de Vk1-39Jk5 humano o Vk3-20Jk1 humano). Una vez que se identifica un linfocito B que codifica una V^hque se une al epftopo de interes, la secuencia de nucleotidos de la V^h(y, opcionalmente, la V^l) se puede recuperar (por ejemplo, mediante PCR) y se puede clonar en una construccion de expresion en fase con un dominio constante de inmunoglobulina humana adecuado. Este proceso se puede repetir para identificar un segundo dominio V^hque se una a un segundo epftopo, y se puede recuperar una segunda secuencia del gen V^hy clonarla en un vector de expresion en fase a un segundo dominio constante de inmunoglobulina adecuado. El primer y el segundo dominio constante de inmunoglobulina pueden tener el mismo isotipo o uno diferente, y uno de los dominios constantes de inmunoglobulina (pero no el otro) puede modificarse como se describe en el presente documento o en el documento US 2010/0331527A1, y la protema de union al epftopo puede expresarse en una celula adecuada y aislarse en funcion de su afinidad diferencial por la protema A en comparacion con una protema de union al epftopo homodimerica, por ejemplo, como se describe en el documento US 2010/0331527 A1.

En una realizacion, se proporciona un metodo de generacion de una protema de union al epftopo biesped fica, que comprende identificar una primera secuencia de nucleotidos V^hhumana (V^h1) madurada por afinidad (por ejemplo, que comprende una o mas hipermutaciones somaticas) de un raton como se describe en el presente documento, identificar una segunda secuencia de nucleotidos V^hhumana madurada por afinidad (por ejemplo, que comprende una o mas hipermutaciones somaticas) (V^h2) de un raton como se describe en el presente documento, clonar V^h1 en fase con una cadena pesada humana que carece de una modificacion del determinante de la protema A como se describe en el documento US 2010/0331527A1 para formar la cadena pesada 1 (HC1), clonar V^h2 en fase con una cadena pesada humana que comprende un determinante de la protema A como se describe en el documento US 2010/0331527A1 para formar la cadena pesada 2 (HC2), introducir un vector de expresion que comprende HC1 y el mismo o un vector de expresion diferente que comprende HC2 en una celula, de manera que la celula tambien expresa una cadena ligera de inmunoglobulina humana que comprende un Vk1-39 humano /Jk5 humano o un Vk3-20 humano/JKl humano fusionado a un dominio constante de cadena ligera humano, lo que permite a la celula expresar una protema de union al epftopo biesped fica que comprende un dominio V^hcodificado por V^h1 y un dominio V^hcodificado por V^h2, y aislar la protema de union al epftopo biesped fica en funcion de su capacidad diferencial para unirse a la protema A en comparacion con la protema de union al epftopo homodimerica monoesped fica. En una realizacion esped fica, HC1 es una lgG1, y HC2 es una lgG1 que comprende la modificacion H95R (IMGT; H435R segun EU) y ademas comprende la modificacion Y96F (IMGT; Y436F segun EU). En una realizacion, el dominio VH codificado por V^h1, el dominio V^hcodificado por V^h2, o ambos, estan mutados somaticamente.

Genes Vh humanos que se expresan con una Vl comun

Se expreso una variedad de regiones variables humanas de anticuerpos madurados por afinidad generados contra cuatro antfgenos diferentes con su cadena ligera afm, o al menos una de entre una cadena ligera humana seleccionada de Vk1-39/Jk5 humana, Vk3-20/Jk1 humana o VpreB/JA5 humana (vease el Ejemplo 1). Para los anticuerpos contra cada uno de los antfgenos, las cadenas pesadas de alta afinidad mutadas somaticamente de diferentes familias de genes se emparejaron con exito con las regiones Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 de la lmea germinal humana reordenadas, y se secretaron de las celulas que expresaban las cadenas pesada y ligera. Para Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1, los dominios V^hderivados de las siguientes familias de genes V^hhumanos expresaron favorablemente: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3 9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31,4-39, 4-59, 5-51 y 6-1. Por lo tanto, un raton que esta disenado para expresar un repertorio limitado de dominios V^lhumanos de uno o ambos Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 generara una poblacion diversa de dominios V^hhumanos mutados somaticamente de un locus de V^hmodificado para reemplazar segmentos de gen V^hde raton por segmentos de gen V^hhumanos.

Los ratones disenados geneticamente para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina quimericas inversas (variables humanas, constantes de raton) asociadas con una unica cadena ligera reordenada (por ejemplo, una Vk1-39/J o una Vk3-20/J), cuando se inmunizaron con un antfgeno de interes, generaron linfocitos B que comprendfan una diversidad de reordenaciones de V^hhumanas y expresaron una diversidad de anticuerpos espedficos del antfgeno de alta afinidad con diversas propiedades con respecto a su capacidad para bloquear la union del anftgeno a su ligando, y con respecto a su capacidad para unirse a variantes del anftgeno (veanse los Ejemplos 5 a 10).

Por lo tanto, los ratones y los metodos descritos en el presente documento son utiles para generar y seleccionar dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana, Incluyendo los dominios variables de cadena pesada humanos mutados somaticamente, que resultan de una diversidad de reordenaciones, que presentan una amplia variedad de afinidades (incluyendo la presentacion de una K^dde aproximadamente nanomolar o inferior), una amplia variedad de especificidades (incluyendo la union a diferentes epftopos del mismo anftgeno), y que se asocian y expresan con la misma o esencialmente la misma region variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana.

Anticuerpos biespecficos completamente humanos que tienen una cadena ligera comun

Como primera etapa en diversas realizaciones, la primera y la segunda secuencia de acido nucleico que codifican cada uno de los dominios variables de cadena pesada humanos (y cualquier secuencia de acido nucleico adicional que forma el anticuerpo biespedfico) se seleccionan de los anticuerpos monoclonales parentales que tienen caractensticas deseadas, tales como, por ejemplo, capaces de unirse a diferentes epftopos (veanse las FIG. 7A y 7B), con diferentes afinidades, etc. Normalmente, las secuencias de acido nucleico que codifican los dominios variables de cadena pesada humanos se afslan de ratones inmunizados, como se describe en el presente documento, para permitir que la fusion con regiones constantes de cadena pesada humanas sea adecuada para la administracion a seres humanos. Se pueden realizar modificaciones adicionales en la/s secuencia/s mediante la introduccion de mutaciones que anadan funcionalidad adicional al anticuerpo biespedfico, que incluyen, por ejemplo, aumentar la semivida en suero (por ejemplo, vease el documento US 7.217.797) y/o aumentar la citotoxicidad mediada por celulas dependientes de los anticuerpos (por ejemplo, vease el documento US 6.737.056). La introduccion de mutaciones en las regiones constantes de anticuerpos es conocida en la tecnica. Ademas, parte del anticuerpo biespedfico puede prepararse de forma recombinante en cultivo celular y otra/s parte/s de la molecula puede/n prepararse mediante las tecnicas mencionadas anteriormente.

Se han descrito varias tecnicas para la produccion de anticuerpos. Por ejemplo, en diversas realizaciones, se producen anticuerpos quimericos en ratones como se describe en el presente documento. Los anticuerpos pueden aislarse directamente de los linfocitos B de un raton inmunizado (por ejemplo, vease el documento US 2007/0280945A1) y/o los linfocitos B del raton inmunizado se pueden usar para preparar hibridomas (Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:495 497). El ADN que codifica los anticuerpos (cadenas pesadas y/o ligeras humanas) de ratones como los descritos en el presente documento se afsla y se secuencia facilmente usando tecnicas convencionales. Los hibridomas y/o linfocitos B derivados de ratones como los descritos en el presente documento sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede introducirse en vectores de expresion, que luego se transfectan en celulas hospedadoras que, de lo contrario, no producen protema inmunoglobulina, para obtener la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes. El ADN tambien puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas.

En diversas realizaciones, tras el aislamiento del ADN, y la seleccion de la primera y de la segunda secuencia de acido nucleico que codifican el primer y segundo dominio variable de cadena pesada humanos que tienen las especificidades/afinidades deseadas, y una tercera secuencia de acido nucleico que codifica un dominio de cadena ligera humano (una secuencia reordenada de la lmea germinal o una secuencia de cadena ligera aislada de un raton como se describe en el presente documento), las tres secuencias de acido nucleico que codifican las moleculas se expresan para formar el anticuerpo biespedfico usando tecnicas recombinantes que estan ampliamente disponibles en la tecnica. A menudo, el sistema de expresion de eleccion incluira un vector de expresion de celulas de mairnfero y un hospedador, de modo que el anticuerpo biespedfico este adecuadamente glicosilado (por ejemplo, en el caso de los anticuerpos biespedficos que comprenden dominios de anticuerpo que estan glicosilados). Sin embargo, las moleculas tambien pueden producirse en los sistemas de expresion procariotas. Normalmente, la celula hospedadora se transformara con el ADN que codifica el primer dominio variable de cadena pesada humano, el segundo dominio variable de cadena pesada humano, el dominio de cadena ligera humano en un solo vector o vectores independientes. Sin embargo, es posible expresar el primer dominio variable de cadena pesada humano, el segundo dominio variable de cadena pesada humano y el dominio de cadena ligera humano (los componentes del anticuerpo biespedfico) en sistemas de expresion independientes y acoplar los polipeptidos expresados in vitro. En diversas realizaciones, el dominio de cadena ligera humano comprende una secuencia de la lmea germinal. En diversas realizaciones, el dominio de cadena ligera humano comprende no mas de una, no mas de dos, no mas de tres, no mas de cuatro o no mas de cinco hipermutaciones somaticas con la secuencia variable de cadena ligera del dominio de cadena ligera.

En diversas realizaciones, el/los acido/s nucleico/s (por ejemplo, ADNc o ADN genomico) que codifican las dos cadenas pesadas y la cadena ligera humana unica se insertan en un vector replicable para su posterior clonacion (amplificacion del ADN) y/o para la expresion. Muchos vectores estan disponibles, y en general, incluyen, pero sin limitacion, uno o mas de los siguientes: una secuencia senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminacion de la transcripcion. Cada componente puede seleccionarse individualmente o basarse en una eleccion de celula hospedadora u otro criterio determinado experimentalmente. Se conocen varios ejemplos de cada componente en la tecnica.

En general, los vectores de expresion y clonacion contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y esta unido operativamente a las secuencias de acido nucleico que codifican cada uno o todos los componentes del anticuerpo biespedfico. Se conoce bien un gran numero de promotores, reconocidos por una diversidad de celulas huesped potenciales. Estos promotores se unen operativamente al ADN codificante del anticuerpo biespedfico eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestion con enzimas de restriccion e insertando la secuencia promotora aislada en el vector.

Los vectores de expresion usados en celulas hospedadoras eucariotas (celulas de levaduras, hongos, insectos, planta, animal, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) tambien pueden contener secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias estan comunmente disponibles a partir de las regiones 5' y, ocasionalmente 3', no traducidas de ADN o ADNc eucariota o viral. Estas regiones contienen segmentos de nucleotidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porcion no traducida del ARNm que codifica los componentes del anticuerpo biespedfico. Los vectores de expresion adecuados para diversas realizaciones incluyen aquellos que proporcionan la expresion transitoria en celulas de m ai^eras de ADN que codifica el anticuerpo biespedfico. En general, la expresion transitoria implica el uso de un vector de expresion que es capaz de replicarse eficazmente en una celula hospedadora, de manera que la celula hospedadora acumula muchas copias del vector de expresion y, a su vez, sintetiza altos niveles de un polipeptido deseado codificado por el vector de expresion. Los sistemas de expresion transitorios, que comprenden un vector de expresion adecuado y una celula hospedadora, permiten la identificacion positiva conveniente de los polipeptidos codificados por los ADN clonados, asf como la seleccion rapida de anticuerpos biespedficos que tienen especificidades/afinidades de union deseadas o las caractensticas de migracion del gel deseadas relativas a los anticuerpos parentales que tienen homodfmeros del primer o segundo dominio variable de cadena pesada humanos.

En diversas realizaciones, una vez que el ADN que codifica los componentes del anticuerpo biespedfico se ensambla en el/los vector/es deseado/s como se ha descrito anteriormente, se introducen en una celula hospedadora adecuada para la expresion y recuperacion. Las celulas hospedadoras transfectantes se pueden lograr usando tecnicas convencionales conocidas en la tecnica apropiadas para la celula hospedadora seleccionada (por ejemplo, electroporacion, microinyeccion nuclear, fusion de protoplastos bacterianos con celulas intactas o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina, etc.).

Se elige una celula hospedadora, en diversas realizaciones, que mejor se adapte al vector de expresion que contiene los componentes, y permita la produccion mas eficaz y favorable de la especie de anticuerpo biespedfico. Las celulas hospedadoras ilustrativas para la expresion incluyen las de procariotas y eucariotas (monocelulares o pluricelulares), celulas bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus sp., Streptomyces sp., etc.), celulas de micobacterias, celulas fungicas, celulas de levadura (por ejemplo,S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), celulas vegetales,celulas de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, celulas de insecto infectadas con baculovirus, Trichoplusiani, etc.), celulas animales no humanas, celulas humanas o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En diversas realizaciones, la celula es una celula humana, de mono, simio, hamster, rata o raton. En diversas realizaciones, la celula es una celula eucariota seleccionada de CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), celula retiniana, Vero, CV1, renal (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermica), CV-1, U937, 3T3, celula L, celula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, celula Sertoli, celula BRL 3A, HT1080, celula de mieloma, celula tumoral y una estirpe celular derivada de una celula anteriormente mencionada. En diversas realizaciones, la celula comprende uno o mas genes vmcos, por ejemplo, una celula retiniana que expresa un gen vmco (por ejemplo, una celula PER.C6™).

Las celulas huesped de mairnfero usadas para producir un anticuerpo biespedfico pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como de Ham F10 (Sigma), medio mmimo esencial ((MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), medio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las celulas huesped. Los medios pueden completarse segun sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidermico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleosidos (tales como adenosina y timidina), antibioticos (tales como el GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorganicos habitualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energfa equivalente. Tambien se pueden incluir otros suplementos a concentraciones apropiadas como las conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tal como la temperatura, pH y similares, son, en diversas realizaciones, son las usadas previamente con la celula hospedadora seleccionada para la expresion, y seran evidentes para los expertos en la materia.

El anticuerpo biespedfico se recupera en diversas realizaciones del medio de cultivo en forma de un polipeptido secretado, aunque tambien puede recuperarse del lisado de la celula hospedadora cuando se produce directamente sin una senal secretora. Si el anticuerpo biespedfico esta unido a la membrana, se puede liberar de la membrana usando una solucion detergente adecuada (por ejemplo, T riton-X 100). Preferentemente, los anticuerpos biespedficos descritos en el presente documento implican el uso de un primer dominio C^h3 de inmunoglobulina y un segundo dominio C^h3 de inmunoglobulina, en el que el primer y el segundo dominio C^h3 de inmunoglobulina difieren entre sf en al menos un aminoacido, y en el que al menos una diferencia de aminoacido reduce la union del anticuerpo biespedfico a protema A en comparacion con un anticuerpo biespedfico que carece de la diferencia de aminoacido (vease el documento US 2010/0331527A1). En una realizacion, el primer dominio C^h3 de inmunoglobulina esta unido a protema A y el segundo dominio C^h3 de inmunoglobulina contiene una mutacion que reduce o anula la union a protema A tal como una modificacion H95R (por numeracion de exones IMGT; H435R por numeracion EU). El segundo C^h3 puede comprender ademas una modificacion Y96F (por IMGT; Y436F segun EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C^h3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I segun EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I segun EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I segun EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Dentro del alcance de la presente invencion se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespedfico descrito anteriormente.

Debido a la naturaleza doble de los anticuerpos biespedficos (es decir, pueden ser espedficos de diferentes epttopos de un polipeptido o pueden contener dominios de union al antfgeno espedficos de mas de un polipeptido diana, vease la FIG. 7B; vease tambien, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol.

22:238-244), ofrecen muchas ventajas utiles para la aplicacion terapeutica. Por ejemplo, los anticuerpos biespedficos pueden usarse para la citotoxicidad redirigida (por ejemplo, para destruir celulas tumorales), como adyuvante de vacuna, para administrar agentes trombolfticos a coagulos, para convertir profarmacos activados por enzimas en un sitio diana (por ejemplo, un tumor), para el tratamiento de enfermedades infecciosas, dirigiendo los complejos inmunes a los receptores de la superficie celular, o para administrar inmunotoxinas a celulas tumorales.

Los anticuerpos biespedficos descritos en el presente documento tambien se pueden usar en varios metodos de ensayo terapeuticos y no terapeuticos y/o de diagnostico, tales como inmunoensayos enzimaticos, inmunoensayos de dos sitios, inmunodiagnostico in vitro o in vivo de diversas enfermedades (por ejemplo, cancer), ensayos de union competitiva, ensayos de tipo sandwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitacion. Otros usos para los anticuerpos biespedficos seran evidentes para los expertos en la materia.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la materia como hacer y usar los metodos y las composiciones de la invencion, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invencion. Se ha intentado garantizar la exactitud con respecto a los numeros usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura se indica en grados Celsius, y la presion es la atmosferica o casi atmosferica.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la materia como hacer y usar los metodos y las composiciones de la invencion, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invencion. Se ha intentado garantizar la exactitud con respecto a los numeros usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, la temperatura se indica en grados centigrados, la presion esta en o cerca de la atmosferica, las partes estan en partes en peso, y el peso molecular es el peso molecular medio.

Ejemplo 1. Identificacion de regiones Vh humanas que se asocian con regiones Vl humanas seleccionadas

Se construyo un sistema de expresion in vitro para determinar si una sola cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada podna expresarse simultaneamente con cadenas pesadas humanas de anticuerpos humanos espedficos del antigeno.

Se conocen metodos para generar anticuerpos humanos en ratones modificados geneticamente (vease, por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®). La tecnologfa VELOCIm Mu NE® implica la generacion de un raton modificado geneticamente que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena ligera y pesada humanas unidas operativamente a los locus de region constante endogenos del raton, de modo que el raton produce un anticuerpo que comprende una region variable humana y una region constante de raton en respuesta a la estimulacion antigenica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos producidos a partir de un raton VELOCIMMUNE® es completamente humano. Inicialmente, se afslan anticuerpos quimericos de alta afinidad que tienen una region variable humana y una region constante de raton. Como se describe a continuacion, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las caractensticas deseables, entre las que se incluyen la afinidad, selectividad, epftopo, etc. Las regiones constantes de raton se remplazan por una region constante humana deseada para generar un anticuerpo completamente humano que contiene un isotipo que no es de IgM, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre o modificadas. Aunque la region constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso espedfico, las caractensticas de union a antfgeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la region variable.

Se inmunizo un raton VELOCIMMUNE® con un factor de crecimiento que potencia la angiogenesis (antfgeno C) y se aislaron anticuerpos humanos espedficos del antfgeno y se secuenciaron para el uso del gen V usando tecnicas convencionales reconocidas en la materia. Se clonaron los anticuerpos seleccionados en las regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas, y se seleccionaron 69 cadenas pesadas para emparejarse con una de las tres cadenas ligeras humanas: (1) la cadena ligera k afm se unio a una region constante k humana; (2) un Vk1-39Jk5 humano reordenado de la lmea germinal se unio a una region constante k humana; o (3) un Vk3-20Jk1 humano reordenado de la lmea germinal se unio a una region constante k humana. Se transfecto cada par de cadena pesada y cadena ligera simultaneamente en celulas CHO-K1 usando tecnicas convencionales. La presencia de anticuerpo en el sobrenadante se detecto mediante IgG anti-humana en un ensayo de ELISA. Se determino el tftulo de anticuerpos (ng/ml) para cada par de cadena pesada/cadena ligera, y se compararon los tftulos con las diferentes cadenas ligeras de la lmea germinal con los tftulos obtenidos con la molecula de anticuerpo parental (es decir, la cadena pesada se emparejo con la cadena ligera afm) y se calculo el porcentaje del tftulo nativo (Tabla 1). V^h: Gen de region variable de cadena pesada. ND: no se detecto expresion en las condiciones experimentales.

TABLA 1

En un experimento similar, los ratones VELOCIMMUNE® se inmunizaron con varios antigenos diferentes y se probaron las cadenas pesadas seleccionadas de anticuerpos humanos espedficos del antigeno para determinar su capacidad para aparearse con diferentes cadenas ligeras de la lmea germinal humanas reordenadas (como se ha descrito anteriormente). Los antigenos usados en este experimento incluyeron una enzima implicada en la homeostasis del colesterol (antigeno A), una hormona serica implicada en la regulacion de la homeostasis de la glucosa (antigeno B), un factor de crecimiento que potencia la angiogenesis (antfgeno C) y un receptor de la superficie celular (antfgeno D). Se aislaron anticuerpos espedficos del antfgeno de ratones de cada grupo de inmunizacion, y se clonaron y secuenciaron las regiones variables de cadena pesada y ligera. A partir de la secuencia de las cadenas pesada y ligera, se determino el uso del gen V, y las cadenas pesadas seleccionadas se emparejaron con su cadena ligera afrn o una region Vk1-39Jk5 humana de la lmea germinal reordenada. Se transfecto cada par de cadenas pesada/ligera simultaneamente en celulas CHO-K1, y se detecto la presencia de anticuerpo en el sobrenadante mediante IgG anti-humana en un ensayo de ELISA. Se determino el tftulo de anticuerpo (pg/ml) para cada par de cadena pesada/cadena ligera, y se compararon los tftulos con las diferentes cadenas ligeras de la lmea germinal humanas con los tftulos obtenidos con la molecula de anticuerpo parental (es decir, la cadena pesada se emparejo con la cadena ligera afrn) y se calculo el porcentaje del tftulo nativo (Tabla 2). V^h: Gen de region variable de cadena pesada. Vk: Gen de region variable de cadena ligera k. ND: no se detecto expresion en las condiciones experimentales.

TABLA 2

Los resultados obtenidos de estos experiments demuestran que algunas cadenas pesadas de alta afinidad mutadas somaticamente de diferentes familias de genes pueden emparejarse con las regiones Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 de la lmea germinal humanas reordenadas y ser secretadas de la celula como una molecula de anticuerpo normal. Como se muestra en la Tabla 1, el tftulo de anticuerpos se aumento para aproximadamente el 61 % (42 de 69) de las cadenas pesadas cuando se emparejaron con la cadena ligera Vk1-39Jk5 humana reordenada y el 29 % (20 de 69) de las cadenas pesadas cuando se emparejaron con la cadena ligera Vk3-20Jk1 humana reordenada en comparacion con la cadena ligera afm del anticuerpo parental. Para aproximadamente el 20 % (14 de 69) de las cadenas pesadas, ambas cadenas ligeras de la lmea germinal humanas reordenadas confirieron un aumento en la expresion en comparacion con la cadena ligera afm del anticuerpo parental. Como se muestra en la Tabla 2, la region Vk1-39Jk5 de la lmea germinal humana reordenada confirio un aumento en la expresion de varias cadenas pesadas especfticas para un intervalo de diferentes clases de antfgenos en comparacion con la cadena ligera afm para los anticuerpos parentales. El tftulo de anticuerpos se aumento en mas del doble para aproximadamente el 35 % (15/43) de las cadenas pesadas en comparacion con la cadena ligera afm de los anticuerpos parentales. Para dos cadenas pesadas (315 y 316), el aumento fue superior a diez veces en comparacion con el anticuerpo parental. Dentro de todas las cadenas pesadas que mostraron un aumento de la expresion en relacion con la cadena ligera afm del anticuerpo parental, las cadenas pesadas de la familia tres (V^h3) estan representadas en exceso en comparacion con otras familias de genes de la region variable de cadena pesada. Esto demuestra una relacion favorable de las cadenas pesadas V^h3 humanas para emparejarse con las cadenas ligeras de V k1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 de la lmea germinal humanas reordenadas.

Ejemplo 2. Generacion de un locus de cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada

Se crearon varios vectores de direccion de cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada usando la tecnologfa VELOCIGENE® (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. 6.586.251 y Valenzuela et al., (2003) “High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis”, Nature Biotech. 21(6): 652-659) para modificar los clones 302 g12 y 254m04 (Invitrogen) del cromosoma artificial bacteriano (BAC) genomico de raton. Usando estos dos clones de BAC, se disenaron construcciones genomicas que conteman una sola region de cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada, y se insertaron en un locus de cadena ligera k endogeno que se habfa modificado previamente para eliminar la region variable k endogena y los segmentos genicos de union.

Construccion de vectores de direccion de cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada. Se crearon tres regiones diferentes de cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada usando tecnicas convencionales de Biologfa molecular reconocidas en la materia. Los segmentos genicos variables humanos usados para construir estas tres regiones inclman la secuencia de Vk1-39Jk5 humana reordenada, una secuencia de Vk3-20Jk1 humana reordenada y una secuencia de VpreBJA5 humana reordenada.

Se creo un segmento de ADN que contema el exon 1 (codificante del peptido Kder) y el intron 1 del gen Vk3-7 de raton mediante la smtesis de ADN de novo (Integrated DNA Technologies). Se incluyo parte de la region no traducida 5' hasta un sitio de enzima de restriccion Blpl natural. Se amplificaron los exones de los genes Vk1-39 y Vk3-20 humanos mediante PCR a partir de genotecas de BAC genomicas humanas. Los cebadores directos teman una extension 5' que contema el sitio del aceptor de corte y empalme del intron 1 del gen Vk3-7 de raton. El cebador inverso usado para la PCR de la secuencia de Vk1-39 humana inclma una extension codificante de Jk5 humano, mientras que el cebador inverso usado para la PCR de la secuencia de Vk3-20 humana inclma una extension codificante de Jk1 humano. La secuencia de VpreBJA5 humana se creo mediante smtesis de novo de ADN (Integrated DNA Technologies). Se amplifico una parte del intron Jk-Ck humano que incluye el sitio donante de cortes y empalmes mediante PCR a partir del plasmido pBS-296-HA18-PIScel. El cebador de PCR directo inclma una extension codificante de parte de una secuencia humana de Jk5, Jk1 o JA5. El cebador inverso inclma un sitio Pl-Scel, que se diseno previamente en el intron.

El exon 1/intron 1 de Vk3-7 de raton, los exones de cadena ligera variable humana y los fragmentos del intron Jk-Ck humano se cosieron entre sf mediante PCR de extension de solapamiento, se digirieron con Blpl y Pl-Scel y se ligaron en el plasmido pBS-296-HA18-PIScel, que contema el promotor del segmento de gen variable Vk3-15 humano. Se reemplazo un casete de higromicina floxeado en el plasmido pBS-296-HA18-PIScel con un casete de higromicina flanqueado por sitios FRT flanqueado por sitios Notl y Ascl. Se ligo el fragmento Notl/PI-Scel de este plasmido en BAC 254m04 de raton modificado, que contema parte del intron Jk-Ck de raton, el exon Ck de raton y aproximadamente 75 Kb de secuencia genomica cadena abajo del locus k de raton, que proporciono un brazo de homologfa 3' para la recombinacion homologa en celulas ES de raton. A continuacion, se ligo el fragmento de Notl/Ascl de este BAC en BAC 302 g12 de raton modificado, que contema un casete de neomicina flanqueado por sitios FRT y aproximadamente 23 kb de secuencia genomica cadena arriba del locus k endogeno para la recombinacion homologa en celulas ES de raton.

Vector de direccion V k1-39Jk5 de la lmea germinal humana reordenada (FIG. 1). Se introdujeron sitios de enzimas de restriccion en los extremos 5' y 3' de una insercion de cadena ligera disenada para la clonacion en un vector de direccion: un sitio Ascl en el extremo 5' y un sitio Pl-Scel en el extremo 3'. Dentro del sitio AscI 5' y del sitio Pl-Scel 3', la construccion de direccion de 5' a 3' inclma un brazo de homologfa 5' que contema la secuencia 5' al locus endogeno de cadena ligera K de raton obtenido del clon 302 g12 de BAC de raton, un gen de resistencia a la neomicina flanqueado por sitios FRT, una secuencia genomica que inclma el promotor de Vk3-15 humano, una secuencia lfder del segmento genico variable Vk3-7 de raton, una secuencia intronica del segmento genico variable Vk3-7 de raton, un marco abierto de lectura de la region de Vk1-39Jk5 de la lmea germinal humana reordenada, una secuencia genomica que contema una parte del intron Jk-Ck humano, y un brazo de homologfa 3' que contema la secuencia 3' del segmento de gen Jk5 de raton endogeno obtenido del clon 254m04 de BAC de raton (Figura 1, medio). Los genes y/o las secuencias cadena arriba del locus endogeno de cadena ligera K de raton endogeno y cadena abajo del segmento de gen Jk mas 3' (por ejemplo, el potenciador 3' endogeno) no fueron modificados por la construccion de direccion (vease la Figura 1). La secuencia del locus de Vk1-39Jk5 humano disenado se muestra en la SEQ ID NO: 1.

La insercion dirigida de la region de Vk1-39Jk5 de la lmea germinal humana reordenada en el ADN de BAC se confirmo mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores ubicados en secuencias dentro de la region de cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada. En resumen, la secuencia del intron 3' a la secuencia lfder de Vk3-7 de raton se confirmo con los cebadores ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEQ ID NO: 2) y ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEQ ID NO: 3). El marco abierto de lectura de la region Vk1-39Jk5 de la lmea germinal humana reordenada se confirmo con los cebadores 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEQ ID NO: 4) y 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEQ ID NO: 5). El casete de neomicina se confirmo con los cebadores neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEQ ID n O: 6) y neoR (GAACACGGCG GCATCAG; SEQ ID NO: 7). Luego se uso ADN de BAC dirigido para electroporar celulas ES de raton para crear celulas ES modificadas con el fin de generar ratones quimericos que expresaran una region Vk1-39Jk5 humana de la lmea germinal reordenada.

Los clones de celulas ES positivas se confirmaron mediante la deteccion TAQMAN™ y cariotipado usando sondas espedficas para la region de cadena ligera Vk1-39Jk5 disenada en el locus endogeno. En resumen, la sonda neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO: 8) que se une dentro del gen marcador de neomicina, la sonda ULC-m1 P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGt Tc ; SEQ ID NO: 9) que se une dentro de la secuencia del intron 3' a la secuencia lfder de Vk3-7 de raton, y la sonda 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEQ ID NO: 10) que se une dentro del marco abierto de lectura de Vk1-39Jk5 de la lmea germinal humana reordenada. Luego se usaron clones de celulas ES positivas para implantarlos en ratones hembra y generar una camada de cnas que expresara la region de cadena ligera de Vk1-39Jk5 de la lmea germinal.

Como alternativa, las celulas ES portadoras de la region de cadena ligera de Vk1-39Jk5 de la lmea germinal humana reordenada se transfectan con una construccion que expresa FLP para eliminar el casete de neomicina flanqueado por sitios FRT introducido mediante la construccion de direccion. Opcionalmente, el casete de neomicina se extrae mediante reproduccion en ratones que expresan la FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina queda retenido en los ratones.

Vector de direccion V k3-20Jk1 de la lmea germinal humana reordenada (FIG. 2). De forma similar, se creo un locus de cadena ligera disenado que expresaba una region de Vk3-20Jk1 de la lmea germinal humana reordenada usando una construccion de direccion que inclma, de 5' a 3', un brazo de homologfa 5' que contema la secuencia 5' al locus de cadena ligera k endogeno de raton obtenido del clon 302 g12 de BAC de raton, un gen de resistencia a la neomicina flanqueado por sitios FRT, una secuencia genomica que inclma el promotor de Vk3-15 humano, Una secuencia lfder del segmento de gen variable Vk3-7 de raton, una secuencia intronica del segmento de gen variable Vk3-7 de raton, un marco abierto de lectura de la region de Vk3-20Jk1 de la lmea germinal humana reordenada, una secuencia genomica que contema una parte del intron Jk-Ck humano, y un brazo de homologfa 3' que contema la secuencia 3' del segmento de gen Jk5 de raton endogeno obtenido del clon 254m04 de BAC de raton (Figura 2, medio). La secuencia del locus de Vk3-20Jk1 humano disenado se muestra en la SEQ ID NO: 11.

La insercion dirigida de la region de Vk3-20Jk1 de la lmea germinal humana reordenada en el ADN de BAC se confirmo mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores ubicados en secuencias dentro de la region de cadena ligera de Vk3-20Jk1 de la lmea germinal humana reordenada. En resumen, la secuencia intronica 3' a la secuencia lfder de Vk3-7 de raton se confirmo con los cebadores ULC-m1F (SEQ ID NO: 2) y ULC-m1R (SEQ ID NO: 3). El marco abierto de lectura de la region Vk3-20Jk1 de la lmea germinal humana reordenada se confirmo con los cebadores 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEQ ID NO: 12) y 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEQ ID NO: 13). El casete de neomicina se confirmo con los cebadores neoF (SEQ ID NO: 6) y neoR (SEQ ID NO: 7). Luego se uso ADN de BAC dirigido para electroporar celulas ES de raton para crear celulas ES modificadas con el fin de generar ratones quimericos que expresaran la cadena ligera de Vk3-20Jk1 humana de la lmea germinal reordenada.

Los clones de celulas ES positivas se confirmaron mediante la deteccion TAQMAN™ y cariotipado usando sondas espedficas para la region de cadena ligera V k3-20Jk1 disenada en el locus endogeno de cadena ligera k. En resumen, la sonda neoP (SEQ ID NO: 8) que se une dentro del gen marcador de neomicina, la sonda ULC-m1 P (SEQ ID NO: 9) que se une dentro de la secuencia lfder de Vk3-7 de raton y la sonda 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEQ ID NO: 14) que se une dentro del marco abierto de lectura de Vk3-20Jk1. Luego se usaron clones de celulas ES positivas para implantarlos en ratones hembra. Una camada de cachorros que expresaban la region de cadena ligera de Vk3-20Jk1 de la lmea germinal humana.

Como alternativa, las celulas ES portadoras de la region de cadena ligera de Vk3-20Jk1 de la lmea germinal humana se pueden transfectar con una construccion que expresa FLP para eliminar el casete de neomicina flanqueado por sitios FRT introducido mediante la construccion de direccion. Opcionalmente, el casete de neomicina se puede extraer mediante reproduccion en ratones que expresan la FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina queda retenido en los ratones.

Vector de direccion de VpreBJA5 de la lmea germinal humana reordenada (FIG. 3). De forma similar, se creo un locus de cadena ligera disenado geneticamente que expresaba una region de VpreBJA5 de la lmea germinal humana reordenada usando una construccion de direccion que inclma, de 5' a 3', un brazo de homologfa 5' que contema la secuencia 5' al locus de cadena ligera k endogeno de raton obtenido del clon 302 g12 de BAC de raton, un gen de resistencia a la neomicina flanqueado por sitios FRT, una secuencia genomica que inclma el promotor de Vk3-15 humano, Una secuencia lfder del segmento genico variable Vk3-7 de raton, una secuencia intronica del segmento genico variable Vk3-7 de raton, un marco abierto de lectura de la region de VpreBJA5 de la lmea germinal humana reordenada, una secuencia genomica que contema una parte del intron Jk-Ck humano, y un brazo de homologfa 3' que contema la secuencia 3' del segmento de gen Jk5 de raton endogeno obtenido del clon 254m04 de BAC de raton (Figura 3, medio). La secuencia del locus de VpreBJA5 humano disenado geneticamente se muestra en SEQ ID NO: 15.

La insercion dirigida de la region de VpreBJA5 de la lmea germinal humana reordenada en el ADN de BAC se confirmo mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores ubicados en secuencias dentro de la region de cadena ligera de VpreBJA5 de la lmea germinal humana reordenada. En resumen, la secuencia intronica 3' a la secuencia lfder de Vk3-7 de raton se confirmo con los cebadores ULC-m1 F (SEQ ID NO: 2) y ULC-m1 R (SEQ ID NO: 3). El marco abierto de lectura de la region VpreBJA5 de la lmea germinal humana reordenada se confirmo con los cebadores 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEQ ID NO: 16) y 1616-h1R (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEQ ID NO: 17). El casete de neomicina se confirmo con los cebadores neoF (Se Q ID NO: 6) y neoR (SEQ ID NO: 7). Luego se uso ADN de BAC dirigido para electroporar celulas ES de raton para crear celulas ES modificadas con el fin de generar ratones quimericos que expresaran la cadena ligera de VpreBJA5 humana de la lmea germinal reordenada.

Los clones de celulas ES positivas se confirman mediante la deteccion TAQMAN™ y cariotipado usando sondas espedficas para la region de cadena ligera VpreBJA5 disenada en el locus endogeno de cadena ligera k. En resumen, la sonda neoP (SEQ ID NO: 8) que se une dentro del gen marcador de neomicina, la sonda ULC-m1P (SEQ ID NO: 9), que se une dentro de la secuencia lfder de lgVK3-7 de raton, y la sonda 1616h1 P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEQ ID NO: 18) que se une dentro del marco abierto de lectura de VpreBJA5 humano. Luego se usaron clones de celulas ES positivas para implantarlos en ratones hembra y generar una camada de cnas que expresara la region de cadena ligera de la lmea germinal.

Como alternativa, las celulas ES portadoras de la region de cadena ligera de VpreBJA5 de la lmea germinal humana reordenada se transfectan con una construccion que expresa FLP para eliminar el casete de neomicina flanqueado por sitios FRT introducido mediante la construccion de direccion. Opcionalmente, el casete de neomicina se extrae mediante reproduccion con ratones que expresan la FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina queda retenido en los ratones.

Ejemplo 3. Generacion de ratones que expresan una sola cadena ligera humana reordenada

Las celulas ES dirigidas anteriormente descritas se utilizaron como celulas ES donantes y se introdujeron en un embrion de raton en la fase de 8 celulas mediante el metodo VELOCIMOUSE® (vease, por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 7.294.754 y Poueymirou et al., (2007) “F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses”, Nature Biotech. 25(1): 91-99. VELOCIMICE® que porta independientemente una region de cadena ligera de Vk1-39Jk5 humana de la lmea germinal disenada geneticamente, una region de cadena ligera Vk3-20Jk1 o una region de cadena ligera VpreBJA5 se identifican mediante el genotipado usando una modificacion del ensayo de alelos (Valenzuela et al., supra) que detecta la presencia de la unica region de cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada.

Las cnas son genotipadas, y se selecciona una cna heterocigota u homocigota para la unica region de cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada para caracterizar la expresion de la region de cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada.

Citometna de flujo. La expresion de la region de cadena ligera humana reordenada en el repertorio normal de anticuerpos de ratones de cadena ligera comun se valido mediante el analisis de la expresion de k y A de inmunoglobulina en esplenocitos y sangre periferica de ratones de cadena ligera comun. Se prepararon suspensiones celulares de bazos extrafdos y de sangre periferica ratones de tipo silvestre (n = 5), heterocigotos de cadena ligera comun de Vk1-39Jk5 (n = 3), homocigotos de cadena ligera comun de Vk1-39Jk5 (n = 3), heterocigotos de cadena ligera comun de Vk3-20Jk1 (n = 2) y homocigotos de cadena ligera comun de Vk3-20Jk1 (n = 2) usando metodos convencionales, y se tineron con CD19+, IgA+ e IgK+ usando anticuerpos marcados con fluorescencia (BD Pharmigen).

En resumen, se incubaron 1 x 106 celulas con CD16/CD32 anti-raton (clon 2.4G2, BD Pharmigen) en hielo durante 10 minutos, seguido del marcaje con el siguiente coctel de anticuerpos durante 30 minutos en hielo: CD19 anti-raton conjugado con APC (clon 1D3, BD Pharmigen), CD3 anti-raton conjugado con PerCP-Cy5.5 (clon 17A2, BioLegend), IgK anti-raton conjugado con FITC (clon 187.1, BD Pharmigen), IgA anti-raton conjugado con PE (clon RML-42, BioLegend). Despues de la tincion, se lavaron las celulas y se fijaron en formaldehfdo al 2 %. La adquisicion de datos se realizo en un citometro de flujo LSRII y se analizaron con FlowJo. Seleccion: linfocitos B totales (CD19+CD3' ), linfocitos B IgK+ (IgK+IgA'CD19+CD3‘), linfocitos B IgA+ (IgK' IgA+CD19+CD3‘). Los datos obtenidos de muestras de sangre y esplenocitos demostraron resultados similares. La Tabla 3 muestra el porcentaje de linfocitos B positivos en CD19+ de la sangre periferica de un raton representativo de cada grupo que son IgA+, IgK+, o IgA+IgK+. En la Figura 4, se muestra el porcentaje de linfocitos B CD19+ en sangre periferica de ratones de tipo silvestre (WT) y ratones homocigotos para la cadena ligera comun de Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1.

TABLA 3

Expresion de cadena ligera comun. La expresion de cada cadena ligera comun (Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 ) se analizo en ratones heterocigotos y homocigotos usando un ensayo de PCR cuantitativo (por ejemplo, TAQMAN™).

En resumen, se purificaron linfocitos B CD19+ de los bazos de ratones de tipo silvestre, ratones homocigotos para un reemplazo de cadena pesada del raton y locus de region variable de cadena ligera k por los correspondientes locus de region variable de cadena pesada y ligera k humana (Hk), asf como ratones homocigotos y heterocigotos para cada region de cadena ligera humana reordenada (Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1) usando microperlas de CD19 de raton (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El ARN total se purifico a partir de linfocitos B CD19+ usando el Kit RNeasy Mini (Qiagen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante y el ARN genomico se elimino usando un tratamiento en columna con ADNasa sin ARNasa (Qiagen). Se transcribieron 200 ng de ARNm de forma inversa en ADNc usando el Kit de smtesis de ADNc First Stand (Invitrogen) y el ADNc resultante se amplifico con la mezcla maestra de PCR universal de Taqman (Applied Biosystems). Todas las reacciones se realizaron usando el sistema de deteccion de secuencias ABI 7900 (Applied Biosystems) usando cebadores y sondas Taqman MGB que abarcaban (1) la union de Vk-Jk para ambas cadenas ligeras comunes; (2) el gen Vk solo (es decir, Vk1-39 y Vk3-20); y (3) la region Ck de raton. La Tabla 4 muestra las secuencias de los cebadores y las sondas empleados para este ensayo. La expresion relativa se normalizo con respecto a la expresion de la region Ck de raton. Los resultados se muestran en la FIG. 5A, 5B y 5C.

TABLA 4

Anticuerpos de cadena ligera comun especificos de antigenos. Se inmunizaron ratones de cadena ligera comun portadores de una cadena ligera comun de Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1 en el locus de cadena ligera k de raton endogeno con p-galactosidasa, y se midio el tftulo de anticuerpos.

En resumen, la p-galactosidasa (Sigma) se emulsiono en adyuvante titermax (Sigma), segun las instrucciones del fabricante. Se inmunizaron ratones de tipo silvestre, homocigotos de tipo silvestre (n = 7), homocigotos de cadena ligera comun de Vk1-39Jk5 (n = 2) y homocigotos de cadena ligera comun de Vk1-20Jk1 (n = 5) mediante inyeccion subcutanea con 100 |jg de p-galactosidasa/Titermax. Los ratones recibieron un refuerzo mediante inyeccion subcutanea dos veces, en un intervalo de 3 semanas, con 50 jg de p-galactosidasa/Titermax. Tras el segundo refuerzo, se extrajo sangre de los ratones anestesiados usando un sangrado retroorbitario en tubos separadores de suero (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para medir los anticuerpos IgM o IgG antigalactosidasa, se recubrieron las placas de ELISA (Nunc) con 1 jg/m l de p-galactosidasa durante la noche a 4 °C. El exceso de antfgeno se lavo antes del bloqueo con PBS con BSA al 1 % durante una hora a temperatura ambiente. Se anadieron diluciones en serie de suero a las placas y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente antes del lavado. Las placas se incubaron luego con anti-lgM conjugado con HRP (Southern Biotech) o anti-lgG (Southern Biotech) durante una hora a temperatura ambiente. Despues de otro lavado, las placas se revelaron con sustrato TMB (BD Biosciences). Las reacciones se detuvieron con acido sulfurico 1 N y se leyo la DO450 usando un lector de placas Victor X5 (PerKin Elmer). Se analizaron los datos con GraphPad Prism, y la senal se calculo como la dilucion del suero que es dos veces superior al fondo. Los resultados se muestran en la FIG. 6A y 6B.

Como se muestra en este ejemplo, la proporcion de celulas k/A B en los compartimentos esplenico y periferico de ratones de cadena ligera comun de Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 demostro un patron de tipo casi silvestre (Tabla 3 y Figura 4). Sin embargo, los ratones de cadena ligera comun DE VpreBJA5 demostraron menos linfocitos B perifericos, de los cuales aproximadamente el 1-2 % expresan la region de cadena ligera humana disenada geneticamente (datos no mostrados). Los niveles de expresion de las regiones de cadena ligera humana de Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 reordenadas desde el locus endogeno de cadena ligera k se elevaron en comparacion con un locus endogeno de cadena ligera k que contema un reemplazo completo de los segmentos de los genes Vk y Jk de raton por los segmentos de los genes Vk y Jk humanos (FIG. 5A, 5B y 5C). Los niveles de expresion de la region de cadena ligera humana reordenada de VpreBJA5 demostraron una alta expresion similar del locus endogeno de cadena ligera k en ratones heterocigotos y homocigotos (datos no mostrados). Esto demuestra que, en competencia directa con A, k, o ambos locus de cadena ligera endogenos de raton, una unica secuencia de V^l/J^lhumana reordenada puede rendir mejor que la expresion a nivel de tipo silvestre del locus de cadena ligera k endogeno, y dar lugar a una frecuencia de linfocitos B esplenicos y sangumeos normal. Ademas, los ratones toleraron bien la presencia de un locus de cadena ligera k disenado geneticamente con una secuencia de Vk1-39Jk5 humana o Vk3-20Jk1 humana, y parecieron funcionar de forma natural al representar una parte sustancial del repertorio de cadenas ligeras del componente humoral de la respuesta inmunitaria (FIG. 6A y 6B).

Ejemplo 4. Reproduccion de ratones que expresan una sola cadena ligera de la lrnea germinal humana reordenada

Este ejemplo describe otras varias cepas de ratones modificados geneticamente que pueden reproducirse con cualquiera de los ratones de cadena ligera comun descritos en el presente documento para crear multiples cepas de ratones modificados geneticamente que albergan multiples locus de inmunoglobulina modificados geneticamente.

Desactivacion de IgA endogeno (KO). Para optimizar el uso del locus de cadena ligera disenada geneticamente, los ratones portadores de una de las regiones de cadena ligera de la lrnea germinal humana reordenada se reproducen con otro raton que contiene una eliminacion en el locus de cadena ligera A endogeno. De esta manera, la progenie obtenida expresara, como su unica cadena ligera, la region de cadena ligera de la lrnea germinal humana reordenada como se describe en el Ejemplo 2. La reproduccion se realiza mediante tecnicas convencionales reconocidas en la materia y, como alternativa, por un criador comercial (por ejemplo, The JacKson Laboratory). Se analizan las cepas de raton portadoras de un locus de cadena ligera disenado geneticamente y una eliminacion del locus de cadena ligera A endogeno para detectar la presencia de la unica region de cadena ligera y la ausencia de cadenas ligeras A de raton endogenas.

Locus de cadena pesada endogeno humanizado. Se cruzan ratones portadores de un locus de cadena ligera de la lrnea germinal humana disenado geneticamente con ratones que contienen un reemplazo del locus de gen variable de cadena pesada de raton endogeno por el locus del gen variable de cadena pesada humano (vease el documento US 6.596.541; el raton VELOCIMMUn E®, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). El raton VELOCIMMUNE® comprende un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada humanas unidas operativamente a los locus de region constante endogenos del raton, de modo que el raton produce anticuerpos que comprenden una region variable de cadena pesada humana y una region constante de cadena pesada de raton en respuesta a la estimulacion antigenica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas de los anticuerpos se afsla y se une operativamente al a Dn que codifica las regiones constantes de cadena pesada humanas. El ADN se expresa luego en una celula capaz de expresar la cadena pesada completamente humana del anticuerpo.

Se obtienen ratones portadores de un reemplazo del locus de V^hde raton endogeno por el locus de V^hhumano y una region V^lde la lrnea germinal humana reordenada en el locus de cadena ligera k endogeno. Se obtienen anticuerpos quimericos inversos que contienen cadenas pesadas mutadas somaticamente (V^hhumana y C^hde raton) con una sola cadena ligera humana (V^lhumana y C^lde raton) tras la inmunizacion con un antfgeno de interes. Se identifican las secuencias de nucleotidos V^hy V^lde los linfocitos B que expresan los anticuerpos, y se crean anticuerpos completamente humanos mediante la fusion de las secuencias de nucleotidos V^hy V^la las secuencias de nucleotidos C^hy C^lhumanas en un sistema de expresion adecuado.

Ejemplo 5. Generacion de anticuerpos a partir de ratones que expresan cadenas pesadas humanas y una region de cadena ligera de la linea germinal humana reordenada

Tras el cruce de los ratones que contienen la region de cadena ligera humana disenada geneticamente con varias cepas deseadas que contienen modificaciones y eliminaciones de otros locus de Ig endogenos (como se describe en el Ejemplo 4), los ratones seleccionados pueden inmunizarse con un antfgeno de interes.

En general, se expone un raton VELOCIMMUNE® que contiene una de las regiones de cadena ligera de la lrnea germinal humana reordenada a un antfgeno, y se obtienen celulas linfaticas (tales como linfocitos B) del suero de los animales. Las celulas linfaticas se fusionan con una estirpe celular de mieloma para preparar estirpes celulares de hibridoma inmortales, y dichas estirpes celulares de hibridoma se analizan y se seleccionan para identificar estirpes celulares de hibridoma que produzcan anticuerpos que contengan regiones variables de cadena pesada humanas y cadenas ligeras de la lrnea germinal humana reordenada que sean espedficas del antfgeno usado para la inmunizacion. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y la cadena ligera se afslan y se unen a regiones constantes isotfpicas deseables de cadena pesada y la cadena ligera. Debido a la presencia de las secuencias de raton endogenas y a cualquier elemento adicional que actue en cis presente en el locus endogeno, la cadena ligera unica de cada anticuerpo puede estar mutada somaticamente. Esto anade una diversidad adicional al repertorio espedfico del antfgeno que comprende una sola secuencia de cadena ligera y diversas secuencias de cadenas pesadas. Las secuencias de anticuerpos clonadas resultantes se expresan posteriormente en una celula, tal como una celula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quimericos espedficos del antfgeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas se identifica directamente a partir de linfocitos espedficos del antfgeno.

Inicialmente, se afslan anticuerpos quimericos de alta afinidad que tienen una region variable humana y una region constante de raton. Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las caractensticas deseables, entre las que se incluyen la afinidad, selectividad, epttopo, etc. Las regiones constantes de raton se reemplazan por una region constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano que contiene una cadena pesada humana mutada somaticamente y una unica cadena ligera derivada de una region de cadena ligera de la lmea germinal humana reordenada de la invencion. Las regiones constantes humanas adecuadas incluyen, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada.

Se inmunizaron cohortes separadas de ratones VELOCIMMUNE® que conteman un reemplazo del locus de cadena pesada de raton endogeno por segmentos de genes V^h, D^hy J^hhumanos y un reemplazo del locus de cadena ligera k de raton endogeno por la region de cadena ligera humana de Vk1-39Jk5 de la lmea germinal disenada geneticamente o la region de cadena ligera humana de Vk3-20Jk1 de la lmea germinal disenada geneticamente (descritas anteriormente) con una protema receptora de la superficie celular humana (Antigeno E). El antigeno E se administra directamente en la pata trasera de los ratones con seis inyecciones consecutivas cada 3-4 dfas. Se mezclan de dos a tres microgramos de antigeno E con 10 |jg de oligonucleotido CpG (n.° de cat. tlrl-modn-oligonucleotido ODN1826; InVivogen, San Diego, CA) y 25 |jg de Adju-Phos (adyuvante de gel de fosfato de aluminio, n.° de cat. H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Dinamarca) antes de la inyeccion. Se administra un total de seis inyecciones antes del reclutamiento final del antigeno, que se administra de 3 a 5 dfas antes del sacrificio. Se recogen las hemorragias despues de la 4a y 6a inyeccion, y se controla la respuesta inmunitaria del anticuerpo mediante un inmunoensayo convencional espedfico del antigeno.

Cuando se consigue una respuesta inmunitaria deseada, se recogen los esplenocitos y se fusionaron con celulas de mieloma de raton para conservar su viabilidad y formar estirpes celulares de hibridoma. Las estirpes celulares de hibridoma se detectan y seleccionan para identificar estirpes celulares productoras de anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antigeno E. Usando esta tecnica, se obtienen varios anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del y anti-antigeno E (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables de cadena pesada humanos, el mismo dominio variable de cadena ligera humano y dominios constantes de raton).

Como alternativa, los anticuerpos de cadena ligera comun anti-antigeno E se afslan directamente de los linfocitos B positivos en el antigeno sin fusion con las celulas de mieloma, como se describe en el documento U.S.

2007/0280945A1, incorporado espedficamente al presente documento por referencia en su totalidad. Usando este metodo, se obtuvieron varios anticuerpos de cadena ligera comun anti-antigeno E completamente humanos (es decir, anticuerpos que posefan dominios variables de cadena pesada humanos, ya sea una cadena ligera de Vk1-39Jk5 humana disenada por ingeniena genetica o una region de cadena ligera de Vk3-20Jk1 humana disenada por ingeniena genetica y dominios constantes humanos).

Las propiedades biologicas de los anticuerpos de cadena ligera comun contra el antigeno E ilustrativos generados de acuerdo con los metodos de este Ejemplo se describen en detalle en los siguientes apartados.

Ejemplo 6. Uso del segmento de gen de cadena pesada en anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antigeno

Para analizar la estructura de los anticuerpos de cadena ligera comun anti-antigeno E humanos producidos, se clonaron y secuenciaron los acidos nucleicos codificantes de las regiones variables de anticuerpos de cadena pesada. A partir de las secuencias de acido nucleico y las secuencias de aminoacidos predichas de los anticuerpos, se identifico el uso del gen para la region variable de cadena pesada (HCVR) de anticuerpos de cadena ligera comun seleccionados obtenidos de ratones VELOCIMMUNE® inmunizados que conteman la cadena ligera de Vk1-39Jk5 humana disenada geneticamente o la region de cadena ligera de Vk3-20Jk1 humana disenada por ingeniena genetica. Los resultados se muestran en las Tablas 5 y 6, que demuestran que los ratones de acuerdo con la invencion generan anticuerpos de cadena ligera comun esped ficos del antigeno a partir de una variedad de segmentos de genes de cadena pesada humana, debido a una variedad de reordenaciones, cuando se emplea un raton que expresa una cadena ligera de solo una cadena ligera derivada de Vk1-39 humano o una cadena ligera derivada de Vk3-20 humano. Los segmentos de gen V^hhumano de las familias 2, 3, 4 y 5 se reordenaron con una variedad de segmentos de D^hhumanos y segmentos de J^hhumanos para producir anticuerpos esped ficos del antigeno.

TABLA 5

TABLA 6

Ejemplo 7. Determinacion de la capacidad de bloqueo de los anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antigeno mediante el ensayo LUMINEX™

Se probaron noventa y ocho anticuerpos de cadena ligera comun humana generados contra el antigeno E para determinar su capacidad para bloquear la union del ligando natural del antigeno E (ligando Y) al antigeno E en un ensayo basado en perlas.

El dominio extracelular (ECD) del antigeno E se conjugo con dos marcadores de epftopo myc y un marcador de histidina x6 (antigeno E-mmH) y se acoplo con amina a microesferas carboxiladas a una concentracion de 20 pg/ml en tampon MES. La mezcla se incubo durante dos horas a temperatura ambiente y luego se desactivo la perla con Tris 1 M, pH 8,0, y luego se lavo en PBS con Tween-20 al 0,05 % (v/v). A continuacion, se bloquearon las perlas con PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contema BSA al 2 % (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). En una placa de filtro de 96 pocillos, se diluyeron sobrenadantes que conteman anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antigeno E 1:15 en tampon. Se preparo un control negativo que contema un sobrenadante simulado con los mismos componentes de medios que para el sobrenadante de anticuerpos. Se anadieron perlas marcadas con antigeno E a los sobrenadantes y se incubaron durante la noche a 4 °C. La protema de ligando Y biotinilada se anadio a una concentracion final de 0,06 nM y se incubo durante dos horas a temperatura ambiente. La deteccion del ligando Y biotinilado unido a perlas marcadas con antigeno E-myc-myc-6His se determino con perlas marcadas con R-ficoeritrina conjugadas con estreptavidina (Moss Inc, Pasadena, MD), a lo que le siguio la medicion en un analizador basado en citometna de flujo LUMlNEX™. Se resto la intensidad de fluorescencia media de fondo (IFM) de una muestra sin ligando Y de todas las muestras. El porcentaje de bloqueo se calculo dividiendo la IFM sustrafda del fondo de cada muestra entre el valor de control negativo ajustado, multiplicando por 100 y restando el valor resultante a 100.

En un experimento similar, los mismos 98 anticuerpos de cadena ligera comun humana generados contra el antigeno E se probaron para determinar su capacidad para bloquear la union del antigeno E a las perlas marcadas con el ligando Y.

En resumen, se acoplo con amina el ligando Y a microesferas carboxiladas a una concentracion de 20 pg/ml diluida en tampon MES. La mezcla se incubo durante dos horas a temperatura ambiente y luego se desactivaron las perlas con Tris 1 M a pH 8 y despues se lavaron en PBS con Tween-20 al 0,05 % (v/v). A continuacion, se bloquearon las perlas con PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contema BSA al 2 % (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). En una placa de filtro de 96 pocillos, se diluyeron sobrenadantes que conteman anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antigeno E 1:15 en tampon. Se preparo un control negativo que contema un sobrenadante simulado con los mismos componentes de medios que para el sobrenadante de anticuerpos. Se anadio un antigeno E-mmH biotinilado a una concentracion final de 0,42 nM y se incubo durante la noche a 4 °C. A continuacion, se anadieron las perlas marcadas con el ligando Y a la mezcla de anticuerpo/antigeno E y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. La deteccion del antigeno E-mmH biotinilado unido a las perlas de ligando Y se determino con R-ficoeritrina conjugada con estreptavidina (Moss Inc, Pasadena, MD), a lo que le siguio la medicion en un analizador basado en citometna de flujo LUMINEX™. Se resto la intensidad de fluorescencia media de fondo (IFM) de una muestra sin antigeno E de todas las muestras. El porcentaje de bloqueo se calculo dividiendo la IFM sustrafda del fondo de cada muestra entre el valor de control negativo ajustado, multiplicando por 100 y restando el valor resultante a 100.

Las Tablas 7 y 8 muestran el porcentaje de bloqueo de el total de los 98 anticuerpos de cadena ligera comun antiantigeno E probados en ambos ensayos LUMINEX™. ND: no determinado en las condiciones experimentales actuales.

TABLA 7

TABLA 8

En el primer experimento LUMINEX™ descrito anteriormente, se probaron 80 anticuerpos de cadena ligera comun que conteman la cadena ligera disenada geneticamente con Vk1-39Jk5 para determinar su capacidad para bloquear la union del ligando Y a las perlas marcadas con el antigeno E. De estos 80 anticuerpos de cadena ligera comun, 68 demostraron un bloqueo >50 %, mientras que 12 demostraron un bloqueo <50 % (6 con un bloqueo del 25-50 % y 6 con un bloqueo <25 %). Para los 18 anticuerpos de cadena ligera comun que conteman la cadena ligera disenada geneticamente con Vk3-20Jk1, 12 demostraron un bloqueo >50 %, mientras que 6 demostraron <50 % de bloqueo (3 con un bloqueo del 25-50 % y 3 con un bloqueo <25 %) de la union del ligando Y a las perlas marcadas con el antigeno E.

En el segundo experimento LUMINEX™ descrito anteriormente, se probaron los mismos 80 anticuerpos de cadena ligera comun que conteman la cadena ligera disenada geneticamente con Vk1-39Jk5 para determinar su capacidad para bloquear la union del antigeno E a las perlas marcadas con el ligando Y. De estos 80 anticuerpos de cadena ligera comun, 36 demostraron un bloqueo >50 %, mientras que 44 demostraron un bloqueo <50 % (27 con un bloqueo del 25-50 % y 17 con un bloqueo <25 %). Para los 18 anticuerpos de cadena ligera comun que conteman la cadena ligera disenada geneticamente con Vk3-20Jk1, 1 demostraron un bloqueo >50 %, mientras que 17 demostraron <50 % de bloqueo (5 con un bloqueo del 25-50 % y 12 con un bloqueo <25 %) de la union del Antigeno E a las perlas marcadas con el ligando Y.

Los datos de las Tablas 7 y 8 establecen que las reordenaciones descritas en las Tablas 5 y 6 generaron anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antigeno E que bloqueaban la union del Ligando Y a su antigeno E receptor atin con diversos grados de eficacia, lo que coincide con los anticuerpos de cadena ligera comun anti-antigeno E de las Tablas 5 y 6 que comprenden anticuerpos con especificidad del epftopo solapante y no solapante con respecto al antigeno E.

Ejemplo 8. Determinacion de la capacidad de bloqueo de los anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antigeno mediante ELISA

Se probaron anticuerpos de cadena ligera comun humanos generados contra el antigeno E para determinar su capacidad para bloquear la union del antigeno E a una superficie recubierta con ligando Y en un ensayo de ELISA.

El ligando Y se recubrio sobre placas de 96 pocillos a una concentracion de 2 pg/ml diluido en PBS y se incubo durante la noche, seguido de lavado cuatro veces en PBS con Tween-20 al 0,05 %. La placa luego se bloqueo con PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contema BSA al 0,5 % (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) durante una hora a temperatura ambiente. En una placa separada, se diluyeron sobrenadantes que conteman anticuerpos de cadena ligera comun anti-antigeno E 1:10 en tampon. Se uso un sobrenadante simulado con los mismos componentes de los anticuerpos como control negativo. El antigeno E-mmH (descrito anteriormente) se anadio a una concentracion final de 0,150 nM y se incubo durante una hora a temperatura ambiente. A continuacion, se anadio la mezcla de anticuerpo/antigeno E-mmH a la placa que contema el ligando Y y se incubo durante una hora a temperatura ambiente. La deteccion del antigeno E-mmH unido al ligando Y se determino con peroxidasa de rabano picante (HRP) conjugada con el anticuerpo anti-Penta-His (Qiagen, Valencia, CA) y se desarrollo mediante una respuesta colorimetrica convencional con sustrato tetrametilbencidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizado por acido sulfurico. La absorbancia se leyo a DO450 durante 0,1 s. Se resto la absorbancia de fondo de una muestra sin antigeno E de todas las muestras. El porcentaje de bloqueo se calculo dividiendo la IFM sustrafda del fondo de cada muestra entre el valor de control negativo ajustado, multiplicando por 100 y restando el valor resultante a 100.

Las Tablas 9 y 10 muestran el porcentaje de bloqueo del total de los 98 anticuerpos de cadena ligera comun antiantigeno E probados en ambos ELISA. ND: no determinado en las condiciones experimentales actuales.

TABLA 9

TABLA 10

Como se describe en este ejemplo, de los 80 anticuerpos de cadena ligera comun que conteman la cadena ligera disenada geneticamente con Vk1-39Jk5, se probo su capacidad para bloquear la union del antfgeno E a una superficie recubierta con ligando Y, 22 demostraron un bloqueo >50 %, mientras que 58 demostraron un bloqueo <50 % (20 con un bloqueo del 25-50 % y 38 con un bloqueo <25 %). Para los 18 anticuerpos de cadena ligera comun que conteman la cadena ligera disenada geneticamente con Vk3-20Jk1, uno demostro > 50% de bloqueo, mientras que 17 demostraron <50 % de bloqueo (5 con un bloqueo del 25-50 % y 12 con un bloqueo <25 %) de la union del Antfgeno E a la superficie marcada con el ligando Y.

Estos resultados tambien coinciden con la combinacion de anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antfgeno E que comprende anticuerpos con especificidad del epftopo solapante y no solapante con respecto al antfgeno E.

Ejemplo 9. Determinacion de la afinidad de BIACORE™ por los anticuerpos de cadena ligera comun especficos del antfgeno

Las constantes de disociacion de equilibrio (K^d) para los sobrenadantes de anticuerpos seleccionados se determinaron mediante SPR (Resonancia de plasmones superficiales) usando un instrumento BIACORE™ T100 (GE Healthcare). Todos los datos se obtuvieron usando HBS-EP (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4), tanto en los tampones de procesamiento como de muestra, a 25 °C. Se capturaron anticuerpos de muestras de sobrenadante en bruto en una superficie de chip del sensor CM5 previamente derivatizada con una alta densidad de anticuerpos anti-Fc humano usando qmmica de acoplamiento de amina convencional. Durante la etapa de captura, se inyectaron los sobrenadantes a traves de la superficie anti-Fc humano a un caudal de 3 pl/min, durante un total de 3 minutos. A la etapa de captura, le siguio una inyeccion de un tampon de procesamiento o analito a una concentracion de 100 nM durante 2 minutos a un caudal de 35 pl/min. La disociacion del antfgeno del anticuerpo capturado se controlo durante 6 minutos. El anticuerpo capturado se elimino mediante una inyeccion breve de glicina 10 mM, pH 1,5. Se hizo doble referencia a todos los sensogramas restando los sensogramas de inyecciones de tampon de los sensogramas de analito, eliminando asf los artefactos causados por la disociacion del anticuerpo de la superficie de captura. Los datos de union para cada anticuerpo se ajustaron a un modelo de union 1:1 con transporte de masa usando el software de evaluacion BIAcore T100 v2.1. Los resultados se muestran en las tablas 11 y 12.

TABLA 11

TABLA 12

Las afinidades de union de los anticuerpos de cadena ligera comun que comprenden las reordenaciones mostradas en las Tablas 5 y 6 vanan, y casi todos presentan una K^den el intervalo nanomolar. Los datos de afinidad coinciden con los anticuerpos de cadena ligera comun que resultan de la asociacion combinatoria de dominios variables reordenados descritos en las Tablas 5 y 6 que son de alta afinidad, seleccionados clonicamente y mutados somaticamente. Junto con los datos mostrados anteriormente, los anticuerpos de cadena ligera comun descritos en las Tablas 5 y 6 comprenden una coleccion de diversos anticuerpos de alta afinidad que muestran especificidad por uno o mas epftopos en el antigeno E.

Ejemplo 10. Determinacion de las especificidades de union de los anticuerpos de cadena ligera comun especificos del antfgeno mediante el ensayo LUMINEX™

Se probaron los anticuerpos de cadena ligera comun anti-antigeno E seleccionados para determinar su capacidad para unirse al ECD del antfgeno E y las variantes de ECD del antfgeno E, Incluyendo los ortologo de mono cynomolgous (Antfgeno E de Mf), que difiere de la protema humana en aproximadamente el 10 % de sus restos de aminoacidos; un mutante por eliminacion del Antfgeno E que carece de los ultimos 10 aminoacidos del extremo C-terminal del ECD (Antfgeno E-ACT); y dos mutantes que contienen una sustitucion de alanina en lugares sospechosos de interaccion con el ligando Y (Antigeno E-Ala1 y Antigeno E-Ala2). Las protemas del antigeno E se produjeron en celulas CHO y cada una contema un marcador myc-myc-His C-terminal.

Para los estudios de union, se capturaron la protema ECD del antigeno E o la protema variante (descrita anteriormente) de 1 ml de medio de cultivo mediante incubacion durante 2 horas a temperatura ambiente con 1 x 106 perlas microesfericas (LUMINEX™) recubiertas covalentemente con un anticuerpo monoclonal anti-myc (Acm 9E10, estirpe celular de hibridoma CRL-1729™; ATCC, Manassas, VA). A continuacion, se lavaron las perlas con PBS antes de su uso. Se diluyeron sobrenadantes que conteman anticuerpos de cadena ligera comun anti-antigeno E 1:4 en tampon, y se anadieron a placas de filtro de 96 pocillos. Se uso un sobrenadante simulado sin anticuerpo como control negativo. Las perlas que conteman las protemas de antfgeno E capturadas se anadieron luego a las muestras de anticuerpos (3000 perlas por pocillo) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al dfa siguiente, se lavaron las perlas de muestra y se detecto el anticuerpo de cadena ligera comun unido con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con ficoeritrina-R. La intensidad de fluorescencia de las perlas (se midieron aproximadamente 100 perlas para cada muestra de anticuerpo que se uma a cada protema de Antfgeno E) con un analizador basado en citometna de flujo LUMINEX™ y se registro la intensidad de fluorescencia media (IFM) para al menos 100 perlas contadas por interaccion de perla/anticuerpo. Los resultados se muestran en las tablas 13 y 14.

TABLA 13

TABLA 14

Los sobrenadantes del anticuerpo de cadena ligera comun anti-antigeno E mostraron una alta union espedfica a las perlas unidas al ECD del antigeno E. Para estas perlas, el sobrenadante simulado de control negativo dio como resultado una senal despreciable (<10 IFM) cuando se combino con la muestra de perlas de ECD del antigeno E, mientras que los sobrenadantes que conteman anticuerpos de cadena ligera comun anti-antigeno E mostraron una potente senal de union (IFM media de 2.627) para 98 sobrenadantes de anticuerpo; IMF> 500 para 91/98 muestras de anticuerpos).

Como medida de la capacidad de los anticuerpos de cadena ligera comun anti-antigeno E seleccionados para identificar diferentes epftopos en el ECD del antigeno E, se determino la union relativa de los anticuerpos a las variantes. Las cuatro variantes de antigeno E se capturaron en las perlas LUMINEX™ anti-myc como se ha descrito anteriormente para los estudios de union del ECD del antigeno E nativo, y se determinaron las proporciones de union relativas IFMvariante/lFMECD de antigeno E ). Para los 98 sobrenadantes de anticuerpos de cadena ligera comun probados que se muestran en las Tablas 12 y 13, las proporciones medias (IFMvariante/lFMECD de antigeno E ) difirieron para cada variante, lo que probablemente refleja diferentes cantidades de captura de protemas en las perlas (proporciones medias de 0,61, 2,9, 2,0 y 1,0 para antigeno E-ACT, Antigeno E-Ala1, Antigeno E-Ala2 y Antigeno E de Mf, respectivamente). Para cada variante de protema, la union de un subconjunto de los 98 anticuerpos de cadena ligera comun probados mostro una union muy reducida, lo que indica sensibilidad a la mutacion que caracterizo una variante dada. Por ejemplo, 19 de las muestras de anticuerpos de cadena ligera comun se unieron al antigeno E de Mf con IFMvariante/lFMECD de antigeno E de < 8 %. Dado que muchos en este grupo incluyen anticuerpos de afinidad alta o moderadamente alta (5 con K^d<5 nM, 15 con K^d<50 nM), es probable que la senal mas baja para este grupo se deba a las diferencias en la sensibilidad a la secuencia (epftopo) entre el ECD del antigeno E nativo y una variante dada en lugar de afinidades mas bajas.

Estos datos establecen que los anticuerpos de cadena ligera comun descritos en las Tablas 5 y 6 representan un grupo diverso de anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antfgeno E que reconocen espedficamente mas de un epftopo en el antigeno E.

Ejemplo 11. Intercambio de cadenas ligeras en anticuerpos de cadena ligera comun

Se probaron cadenas pesadas de los anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antigeno seleccionado para determinar su union al antigeno E despues de reparar las cadenas pesadas con una cadena ligera de Vk1-39Jk5 de la lmea germinal o una cadena ligera de Vk3-20Jk1 de la lmea germinal disenadas por ingeniena genetica (como se describe en el Ejemplo 1).

En resumen, se transfectaron 247 cadenas pesadas de anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antfgeno E (Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1) con una cadena ligera de Vk1-39 de la lmea germinal o una cadena ligera de Vk3-20 de la lmea germinal disenadas por ingeniena genetica y se volvieron a rastrear para determinar su union al antfgeno E mediante el ensayo LUMINEx ™ (como se describe en el Ejemplo 7 y el Ejemplo 10). La union al antfgeno E fue confirmada por BIACORE™ (como se describe en el Ejemplo 9). Los resultados se muestran en la Tabla 15.

Como se muestra en este ejemplo, veintiocho anticuerpos de cadena ligera comun espedficos del antfgeno E fueron capaces de unirse al antfgeno E cuando se repararon con una forma de la lmea germinal de la cadena ligera.

TABLA 15

Ejemplo 12. Uso de genes de cadena pesada y frecuencia de hipermutacion somatica en anticuerpos de cadena ligera comun

Se compilaron secuencias de cadena pesada y ligera (> 6000) de anticuerpos generados en los ratones VELCOIMMUNE® (por ejemplo, documentos US 6.596.541 y US 7.105.348) con secuencias de cadenas pesadas y ligeras (>600) de anticuerpos de cadena ligera comun obtenidos mediante un esquema de inmunizacion de multiples antfgenos, empleando ratones de cadena ligera disenados geneticamente (descritos anteriormente) para comparar el uso del segmento genico de cadena pesada y las frecuencias de hipermutacion somatica de las cadenas de anticuerpos.

Uso del gen de cadena pesada. Se analizaron secuencias de cadena pesada y ligera obtenidas de ratones VELOCIMMUNE® que conteman un reemplazo del locus de cadena pesada de raton endogeno por segmentos de genes V^h, D^hy J^hhumanos y un reemplazo del locus de cadena ligera k de raton endogeno por la region de cadena ligera humana de Vk1-39Jk5 de la lmea germinal disenada geneticamente o la region de cadena ligera humana de Vk3-20Jk1 de la lmea germinal disenada geneticamente (descritas en el Ejemplo 2) inmunizados con un receptor de la superficie celular humana (Antfgeno E), un heterodfmero de dos glicoprotemas de superficie celular humana (antfgeno F), un receptor de citocinas humanas (antfgeno G) y un antfgeno de diferenciacion tumoral humano (antfgeno H) para determinar el uso del segmento de gen de cadena pesada y se registraron los segmentos V^hy de gen J^h. Los resultados se muestran en las Tablas 16-18. Los porcentajes de las Tablas 16-18 representan valores redondeados y, en algunos casos, pueden no ser iguales al 100 % cuando se suman.

La Tabla 16 muestra el porcentaje de uso de la familia de cadenas pesadas para los anticuerpos de ratones VELCOIMMUNE® (VI), los anticuerpos de ratones VELCOIMMUNE® que tienen una cadena ligera de Vk1-39 afm (VI-Vk1-39), los anticuerpos de ratones de cadena ligera disenados geneticamente con Vk1-39 (Vk1-39), anticuerpos de ratones VELCOIMMUNE® que tienen una cadena ligera de Vk3-20 afm (VI-Vk3-20) y anticuerpos de ratones de cadena ligera disenados geneticamente con Vk3-20 (Vk3-20). La Tabla 17 muestra el porcentaje de uso de los genes V^hy J^hpara anticuerpos de ratones VELCOIMMUNE® (VI), los anticuerpos de ratones VELCOIMMUNE® que tienen una cadena ligera de Vk1-39 afm (VI-Vk1-39), los anticuerpos de ratones de cadena ligera disenados geneticamente con Vk1-39 (Vk1-39), anticuerpos de ratones VELCOIMMUNE® que tienen una cadena ligera de Vk3-20 afm (VI-Vk3-20) y anticuerpos de ratones de cadena ligera disenados geneticamente con Vk3-20 (Vk3-20). La Tabla 18 muestra el porcentaje de uso del gen V^hpara anticuerpos de ratones de cadena ligera disenada geneticamente con Vk1-39 (ratones Vk1-39) de cada grupo de inmunizacion (Antfgenos E, F, G y H) y el porcentaje de uso del gen V^hpara anticuerpos de ratones de cadena ligera disenados geneticamente con Vk3-20 (ratones Vk3-20) de grupos de inmunizacion seleccionados (antfgenos E y G).

Como se muestra en este ejemplo, el uso del gen de cadena pesada para los antfgenos probados en ratones de cadena ligera disenados geneticamente con Vk1-39Jk5 se caracterizo por una preponderancia de los subgrupos de la familia III de V^h(V^h3-7, V^h3-9, V^h3-11, V^h3-13, V^h3-20, V^h3-23, V^h3-30, V^h3-33 y V^h3-48). El uso notable de otros subgrupos de la familia de V^h1-18, V^h1-69, V^h2-5, V^h4-59 y V^h6-1. Para los antfgenos probados en ratones de cadena ligera disenados geneticamente con Vk3-20Jk1, el uso del gen de cadena pesada se caracterizo por una preponderancia de los subgrupos de la familia III de V^h, familia IV de V^hy familia V de V^h(V^h3-11, V^h3-30, V^h3-33, V^h4-39, V^h4-59 y V^h5-51). El uso notable de otros subgrupos de la familia de V^h1-18, V^h1-69, V^h2-70 y V^h6-1.

Frecuencia de hipermutacion somatica. Se alinearon las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos generados en los ratones VELCOIMMUNE® y los ratones de cadena ligera disenados geneticamente (descritos anteriormente) con las secuencias de la lmea germinal de acuerdo con el uso del gen de cadena pesada y ligera demostrado para cada cadena pesada y/o ligera. Se calcularon los cambios de aminoacidos para cada region marco conservada (FW) y region determinante de la complementariedad (CDR) tanto para la cadena pesada como ligera de cada secuencia. Los resultados se muestran en las Tablas 19-22. Los porcentajes de las Tablas 21-24 representan valores redondeados y, en algunos casos, pueden no ser iguales al 100 % cuando se suman.

La Tabla 19 muestra el numero de cambios de aminoacidos (aa) observados en cada region FW y CDR de cadenas pesadas de anticuerpos de ratones VELCOIMMUNE®, cadenas pesadas de anticuerpos de ratones de cadena ligera disenados geneticamente Vk1-39 (ratones Vk1-39) y cadenas pesadas de anticuerpos de ratones de cadena ligera disenados geneticamente con Vk3-20 (ratones Vk3-20). La Tabla 20 muestra el numero de cambios de aminoacidos (aa) observados en cada region FW y CDR de cadenas ligeras de anticuerpos de ratones VELCOIMMUNE®, la cadena ligera de anticuerpos de ratones disenados geneticamente con Vk1-39 (ratones Vk1-39) y la cadena ligera de anticuerpos de ratones disenados geneticamente con Vk3-20 (ratones Vk3-20). La Tabla 21 muestra el numero de cambios de aminoacidos (aa) observados en cada region FW y CDR de cadenas pesadas de anticuerpos de ratones de cadena ligera disenados geneticamente con Vk1-39 (ratones Vk1-39) para grupos de inmunizacion seleccionados (Antfgenos E, F y H). La Tabla 22 muestra el numero de cambios de aminoacidos (aa) observados en cada region FW y CDR de cadenas pesadas de anticuerpos de ratones de cadena ligera disenados geneticamente con Vk3-20 (ratones Vk3-20) para grupos de inmunizacion seleccionados (Antfgenos E y G).

TABLA 16

TABLA 17

TABLA 18

TABLA 19

TABLA 20

TABLA 21

TABLA 22

Ejemplo 13. Afinidad de union de anticuerpos biespedficos con cadenas ligeras universales

Se construyeron anticuerpos biespedficos completamente humanos a partir de regiones variables de cadena pesada humanas clonadas de anticuerpos de cadena ligera comun anti-antfgeno E monoespedficos seleccionados (descritos en el Ejemplo 5) usando tecnicas de ADN recombinante convencionales conocidas en la materia. La Tabla 23 muestra el emparejamiento de cadenas pesadas humanas (HC-1 y HC-2) de anticuerpos monoespedficos parentales seleccionados; cada par empleado con una cadena ligera de Vk1-39/Jk1 humana reordenada de la lmea germinal para la construccion de cada anticuerpo biespedfico.

La union de los anticuerpos anti-antfgeno E monoespedficos biespedficos o parentales con el dominio extracelular (ECD) del antfgeno E se determino usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmon superficial en tiempo real en un instrumento BIACORE™ 2000 (GE Healthcare). Se uso una superficie de sensor CM5 BIACORE™ derivada con anticuerpo monoclonal anti-c-myc espedfico (Clon n.° 9E10) usando qmmica de EDC-NHS para capturar el ECD marcado con myc-myc-hexahistidina C-terminal de antfgeno E (antfgeno E-mmh). Se capturaron aproximadamente 190 RU de antfgeno E-mmh en la superficie del sensor BIACORE™, seguido de la inyeccion de concentraciones de 300 nM y 50 nM de diferentes anticuerpos anti-antfgeno E biespedficos o monoespedficos parentales a un caudal de 50 pl/min. El experimento se realizo a 25 °C en un tampon de procesamiento de HBST (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v). Se registro la cantidad de anticuerpo que se urna a la superficie de antfgeno E-mmh a una concentracion de 300 nM tres segundos antes del final de la inyeccion del anticuerpo y se represento.

La T abla 24 y la FIG. 8 exponen las respuestas de union (unidades BIACORE™; RU) observadas para cada anticuerpo biespedfico (Ac Bs) y anticuerpo parental monoespedfico (Ac P-1, Ac P-2). Dado que cada anticuerpo se inyecto en condiciones de saturacion sobre una superficie de antfgeno E-mmh identica, la respuesta de union refleja la estequiometna de union para cada union de anticuerpo a la superficie de captura de antfgeno.

Como se muestra en este ejemplo, la respuesta de union observada para cada anticuerpo biespedfico fue aproximadamente 2 veces superior a la respuesta de union para cada anticuerpo monoespedfico parental (Tabla 24 y FIG. 8), demostrando la construccion funcional de anticuerpos biespedficos usando cadenas pesadas de anticuerpos monoclonales espedficos del antfgeno y una cadena ligera comun en la que cada brazo Fab de la molecula de anticuerpo biespedfico se une simultaneamente a distintos epftopos en el dominio extracelular de un receptor de superficie celular (Antfgeno E; vease la FIG. 7B, parte inferior izquierda).

TABLA 23

TABLA 24

Ejemplo 14. Generacion y analisis de ratones que expresan dos cadenas ligeras humanas

Usando los metodos descritos anteriormente en el Ejemplo 2, se construyeron dos locus de cadena ligera modificados por ingeniena genetica adicionales que conteman dos segmentos de genes Vk humanos (por ejemplo, un segmento de gen Vk1-39 humano y de gen Vk3-20 humano) (FIG. 9). Un locus de cadena ligera disenado geneticamente contema dos segmentos de gen Vk humano y cinco segmentos de gen Jk humano en una configuracion no reordenada (DLC-5J). El segundo locus de cadena ligera disenado geneticamente contema dos segmentos de gen Vk humano y un segmento de gen Jk humano en una configuracion no reordenada (DLC-1J). Para cada uno de los dos locus de cadena ligera disenados geneticamente adicionales, los segmentos de genes humanos estaban flanqueados en 3' con secuencias de senal de recombinacion para permitir la reordenacion in vivo de los segmentos de genes humanos de los linfocitos B.

Los clones de ADN de BAC modificados que conteman cada uno de los locus de cadena ligera disenados geneticamente unidos operativamente a las secuencias de raton (es decir, las secuencias cadena arriba y cadena abajo del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endogeno) se confirmaron mediante PCR usando cebadores ubicados en las secuencias dentro de cada locus de cadena ligera disenado geneticamente que contema los dos segmentos de gen Vk humano seguidos de la electroporacion en celulas ES para crear ratones que expresaran cualquiera de los dos segmentos de gen Vk humano (como se ha descrito anteriormente). Los clones de celulas ES positivas que contienen cualquiera de los locus de cadena ligera de ingeniena descritos anteriormente se confirmaron mediante el cribado y cariotipo TAQMAN ™ usando sondas espedficas para los locus de cadena de luz de ingeniena (como se describio anteriormente). Los clones de celulas ES confirmadas se usaron para implantar ratones hembras para dar lugar a una camada de cnas que expresan un dominio variable de cadena ligera humana fusionado con un dominio Ck de raton, denominado en el presente documento ratones de cadena ligera dual (DLC).

Como alternativa, las celulas ES que llevan el locus de cadena ligera disenada pueden transfectarse con una construccion que exprese FLP para eliminar el casete de neomicina flanqueado por sitios FRT introducido por la construccion de direccion. Opcionalmente, el casete de neomicina se extrae mediante reproduccion en ratones que expresan la FLP recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina queda retenido en los ratones.

citometria de flujo. Las poblaciones de linfocitos B y el desarrollo de linfocitos B en ratones DLC se validaron mediante analisis de citometna de flujo de preparaciones de esplenocitos y medula osea. Se realizaron suspensiones celulares de ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano y cinco segmentos de gen Jk humano (n = 4), ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano y un segmento de gen Jk humano (n = 4) y ratones de tipo silvestre (n = 4) usando metodos convencionales (descritos anteriormente) y se tineron con anticuerpos marcados con fluorescencia (como se describe en el Ejemplo 3).

En resumen, se incubaron 1 x 106 celulas con CD16/CD32 anti-raton (clon 2.4G2, BD Pharmigen) en hielo durante 10 minutos, seguido del marcaje con el siguiente coctel de anticuerpos durante 30 minutos en hielo: CD19 anti-raton conjugado con APC-H7 (clon 1D3, BD Pharmigen), CD3 anti-raton conjugado con Pacific Blue (clon 17A2, BioLegend), IgK anti-raton conjugado con FITC (clon 187.1, BD Pharmigen) o CD43 anti-raton (clon 1B11, BioLegend), IgA antiraton conjugado con PE (clon RML-42, BioLegend) o c-kit anti-raton (clon 2B8, BioLegend), IgD anti-raton conjugado con PerCP-Cy5.5 (BioLegend), IgM anti-raton conjugado con PE-Cy7 (clon 11/41, eBioscience), B220 anti-raton conjugado con APC (clon RA3-6B2, eBioscience). Despues de la tincion, se lavaron las celulas y se fijaron en formaldehndo al 2 %. La adquisicion de datos se realizo en un citometro de flujo LSRII y se analizaron con FlowJo (Tree Star, Inc.). Seleccion: linfocitos B totales (CD19+CD3'), linfocitos B IgK+ (IgK+IgA/CD19+CD3‘), linfocitos B IgA+ (IgK- IgA+CD19+CD3‘). Los resultados para el compartimiento de medula osea se muestran en la FIG. 10A-FIG. 12B. Los resultados para el compartimento esplenico se muestran en la FIG. 13A-FIG. 16.

Como se muestra en este ejemplo, los ratones DLC-5J demuestran poblaciones de linfocitos B normales dentro de los compartimentos esplenico y de la medula osea (FIG. 10A-16). Los ratones DLC-5J demostraron poblaciones de linfocitos inmaduros, maduros y B pre/pro dentro del compartimiento de la medula osea que son esencialmente iguales a las observadas en las camadas de tipo silvestre. De hecho, el locus DLC-5J era capaz de competir con el locus de cadena ligera A endogeno para producir una proporcion de k:A que era esencialmente la misma que la observada en los ratones de tipo silvestre (FIG. 14B). Ademas, los ratones DLC-5J demuestran un desarrollo normal de linfocitos B perifericos a medida que se produce la progresion de linfocitos B a traves de varias etapas en el compartimento esplenico (por ejemplo, inmaduros, maduros, T1, T2, T3, precursores de zona marginal, zona marginal, foliculares-I, foliculares-ll, etc.) de una manera esencialmente igual a la observada en los ratones de tipo silvestre (FIG. 15A-16). Por el contrario, los ratones DLC-1J demostraron un numero total mas bajo de linfocitos B y un mayor uso de la cadena ligera A en comparacion con la cadena ligera K disenada (datos no mostrados).

Expresion doble de cadena ligera. La expresion de ambos segmentos de gen Vk humano se analizo en ratones homocigotos usando un ensayo de PCR cuantitativo de acuerdo con el Ejemplo 3. En resumen, se purificaron linfocitos B CD19+ de medula osea y bazos enteros de ratones de tipo silvestre, ratones homocigotos para un reemplazo de cadena pesada del raton y locus de region variable de cadena ligera k por los correspondientes locus de region variable de cadena pesada y ligera k humana (Hk), asf como ratones homocigotos para un locus de cadena ligera k disenado geneticamente que contiene dos segmentos de gen Vk humano y cinco segmentos de gen Jk humano (DLC-5J) o un segmento de gen Jk humano (DLC-1J). La expresion relativa se normalizo con respecto a la expresion de la region Ck de raton (n = 3 a 5 ratones por grupo). Los resultados se muestran en la FIG. 17 y la FIG. 18.

La expresion de cadenas ligeras que contienen un segmento de gen Vk3-20 humano o Vk1-39 humano reordenado se detecto tanto en la medula osea como en el bazo de ratones DLC-5J y DLC-1J (FIG. 17 y FIG. 18). En el compartimiento de la medula osea, la expresion de ambas cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 humano y derivadas de Vk1-39 humano en ambas cepas de ratones DLC fue significativamente mayor en comparacion con los ratones que comprendfan un reemplazo del segmento de gen Vk y Jk de raton por segmentos de genes Vk y Jk humanos correspondientes (Hk; FIG. 17). La expresion de cadena ligera derivada de Vk3-20 humano se observo de aproximadamente seis veces (DLC-5J) a quince veces (DLC-1J) mas alta que en los ratones Hk. Los ratones DLC-1J demostraron una expresion aproximadamente dos veces mayor de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 humano frente a los ratones DLC-5J en el compartimento de la medula osea. La expresion de cadena ligera derivada de Vk1-39 humano se observo de aproximadamente seis veces (DLC-5J) a trece veces (DLC-1J) mas alta que en ratones Hk. Los ratones DLC-1J demostraron una expresion aproximadamente dos veces mayor de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39 humano frente a los ratones DLC-5J en el compartimento de la medula osea.

En el compartimento esplenico, la expresion de cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 humano y derivadas de Vk1-39 humano en ambas cepas de ratones DLC fue significativamente superior en comparacion con los ratones Hk (FIG.

18). La expresion de cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 humano se observo aproximadamente cuatro veces (DLC-5J) y ocho veces (DLC-1J) mas alta que en ratones Hk. Los ratones DLC-1J demostraron una expresion aproximadamente dos veces mayor de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 humano frente a los ratones DLC-5J en el compartimento esplenico. La expresion de cadena ligera derivada de Vk1-39 humano se observo de aproximadamente cuatro veces (DLC-5J) a cinco veces (DLC-1J) mas alta que en ratones Hk. Los ratones DLC-1J demostraron una expresion similar de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39 humano en comparacion con los ratones DLC-5J en el compartimento esplenico.

Uso de Vl/Jl humano en ratones DLC-5J. Se analizaron ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano no reordenados y cinco segmentos de gen Jk humano no reordenados (DLC-5J) para determinar el uso del segmento de gen Vk/Jk humano en linfocitos B esplenicos mediante la reaccion en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR).

En resumen, se extrajeron los bazos de ratones homocigotos DLC-5J (n = 3) y de tipo silvestre (n = 2) y se tamizaron en 10 ml de RPMI 1640 (Sigma) que contema un 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor usando portaobjetos de vidrio esmerilado para crear suspensiones unicelulares. Los esplenocitos se sedimentaron con una centnfuga (1200 rpm durante cinco minutos) y los globulos rojos se lisaron en 5 ml de tampon de lisado ACK (GIBCO) durante tres minutos. Los esplenocitos se diluyeron con PBS (Irvine Scientific), se filtraron con un filtro de celulas de 0,7 pm y se centrifugaron nuevamente para sedimentar las celulas, a lo que le siguio la resuspension en 1 ml de PBS.

Se aislo el ARN de esplenocitos sedimentados usando el mini Kit AllPrep DNA RNA (Qiagen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se realizo la RT-PCR en el ARN de los esplenocitos usando un sistema RACE 5' (amplificacion rapida de extremos de ADNc) con cebadores espedficos para el gen Ck de raton de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Invitrogen). Los cebadores espedficos para el gen Ck de raton fueron 3' mlgKC RACE1 (AAGAAGCACA CGACTGAGGC AC; SEQ ID NO: 34) y mlgKC3'-1 (OTOAOTGGAT GGTGGGAAGA TGGA; SEQ ID NO: 35). Los productos de PCR se purificaron en gel y se clonaron en el vector pCR®2.1-TOPO® (TOPO® TA Cloning® Kit, Invitrogen) y se secuenciaron con cebadores M13 Directo (GTAAAACGAC GGCCAG; Se Q ID NO: 36) y M13 Inverso (CAGg Aa ACAG CTATGAC; SEQ ID NO: 37) ubicados dentro del vector en ubicaciones que flanqueaban el sitio de clonacion. Se secuenciaron diez clones de cada muestra de bazo. Se compararon las secuencias con los conjuntos de inmunoglobulinas de raton y ser humano del directorio de referencia IMGT V-QUEST determinan el uso de Vk/Jk. La Tabla 25 muestra las combinaciones de Vk/Jk para los clones seleccionados observados en los clones de RT-PCR de cada muestra de esplenocitos. La Tabla 26 muestra la secuencia de aminoacidos de las uniones de Vk humano/JK humano y Jk humano/CK de raton de clones de RT-PCR seleccionados de ratones homocigotos DLC-5J. Las letras minusculas indican mutaciones en la secuencia de aminoacidos de la region variable o adiciones sin molde que resultan de las adiciones de N y/o P durante la recombinacion.

Como se muestra en este ejemplo, los ratones homocigotos para dos segmentos de gen Vk humano no reordenados y cinco segmentos de gen Jk humano no reordenados (DLC-5J) operativamente unidos al gen Ck de raton pueden recombinar productivamente ambos segmentos de gen Vk humano a multiples segmentos de gen Jk humano para producir un repertorio limitado de cadenas ligeras de inmunoglobulina. Entre las reordenaciones en ratones homocigotos DLC-5J mostrados en la Tabla 25, se observaron reordenaciones de Vk/Jk humanos unicas para Vk1-39/Jk2 (1), Vk1-39/Jk3 (1), Vk3-20/Jk1 (7), Vk3-20/Jk2 (4) y Vk3-20/Jk3 (1). Ademas, dichas reordenaciones unicas demostraron una diversidad de union a traves de la presencia de aminoacidos unicos dentro de la region CDR3 de cadena ligera (Tabla 26) que resulta de la mutacion y/o la recombinacion de los segmentos de los genes Vk y Jk humanos durante el desarrollo. Todos las reordenaciones mostraron una lectura funcional en la Ck de raton (Tabla 26).

En conjunto, estos datos demuestran que los ratones disenados geneticamente para presentar una opcion de no mas de dos segmentos de gen V^lhumano, ambos capaces de reorganizarse (por ejemplo, con uno o mas y, en algunas realizaciones, hasta cinco segmentos de gen J^lhumano) y que codifican el dominio V^lhumano de una cadena ligera de inmunoglobulina tienen numeros de linfocitos B y un desarrollo que es casi de tipo silvestre en todos los aspectos. Dichos ratones producen una coleccion de anticuerpos que tienen cadenas ligeras de inmunoglobulina que tienen uno de los dos posibles segmentos de gen V^lhumano presente en la coleccion. Esta coleccion de anticuerpos es producida por el raton en respuesta a la exposicion al antfgeno, y se asocia con una diversidad de cadenas pesadas quimericas inversas (variable humana/constante de raton).

TABLA 25

TABLA 26

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un raton que comprende, en su genoma de la lmea germinal:

2. El raton de la reivindicacion 1, en el que

(a) los dos segmentos del gen Vk humano y los cinco segmentos del gen Jk humano estan unidos operativamente a una secuencia de region constante de cadena ligera de inmunoglobulina de raton o de rata que es (i) una region Ck de rata o (ii) una region Ck de raton; y/o

(b) los dos segmentos del gen Vk humano y cinco segmentos del gen Jk humano estan presentes en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endogeno; y/o

(c) uno o mas segmentos de gen V^hhumano, uno o mas segmentos de gen D^hhumano y uno o mas segmentos de gen J^hhumano estan unidos operativamente a una secuencia de region constante de raton; y/o

(d) los dos segmentos del gen Vk humano y los cinco segmentos del gen Jk humano estan unidos operativamente a una secuencia de region constante de cadena ligera de inmunoglobulina de raton o de rata y estan presentes en un locus que comprende, por orden: el segmento de gen Vk1-39 humano, el segmento de gen Vk3-20 humano, un Jk1 humano, un Jk2 humano, un Jk3 humano, un Jk4 humano y un Jk5 humano; y/o

(e) el raton comprende un locus de cadena ligera que comprende, por orden: el segmento de gen Vk1-39 humano, el segmento de gen Vk3-20 humano, un Jk1 humano, un Jk2 humano, un Jk3 humano, un Jk4 humano y un Jk5 humano, y en el que el locus de cadena ligera comprende una secuencia de union de hVK/hJK/mCK seleccionada de SEQ ID NO: 38-49; y/o

(f) el raton ha sido inmunizado.

3. El raton de la reivindicacion 1 o 2, raton que comprende un locus de cadena ligera A funcional o no funcional.

4. Una celula aislada del raton de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

(a) la celula es una celula madre embrionaria (ES); o

(b) la celula es un linfocito B.

5. Un embrion de raton que comprende la celula ES de la reivindicacion 4(a).

6. Un hibridoma creado con el linfocito B de la reivindicacion 4(b).

7. Uso de un raton de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para:

(a) generar un anticuerpo; y/o

(c) fabricar un anticuerpo biespedfico humano; y/o

8. Un metodo de generacion de un anticuerpo que se une a un antfgeno de interes, que comprende inmunizar a un raton de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con un antfgeno de interes, obtener una secuencia de region variable de inmunoglobulina del raton y emplear la secuencia de region variable de inmunoglobulina para producir un anticuerpo que se una al antfgeno, preferentemente, metodo que comprende ademas:

expresar en una sola celula:

(a) una primera secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana del raton de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que ha sido inmunizado, en el que la secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana se fusiona con una secuencia de gen C^h humano; y

9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que la celula comprende una segunda secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana de un raton de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que ha sido inmunizado, en el que la segunda secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana esta fusionada con una secuencia de region constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en el que la primera secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana codifica un primer dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que reconoce un primer epftopo, y la segunda secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana codifica un segundo dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que reconoce un segundo epftopo, en el que el primer epftopo y el segundo epftopo no son identicos, y en el que el primer y el segundo dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana interaction con el dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana codificado por la secuencia de la region variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana.

10. Un metodo de generacion de un anticuerpo biespedfico humano, metodo que comprende inmunizar a un raton de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y generar el anticuerpo biespedfico usando secuencias de region variable de inmunoglobulina humana de linfocitos B del raton, preferentemente, metodo que comprende ademas:

(a) identificar un linfocitos seleccionado clonicamente del raton de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el raton se ha inmunizado y se le ha permitido desarrollar una respuesta inmunitaria hacia un antfgeno de interes, en el que el linfocito expresa un anticuerpo que se une espedficamente al antfgeno de interes;

11. El metodo de la reivindicacion 10, en el que las etapas (a) a (c) se realizan por primera vez para que un primer antfgeno de interes genere una primera secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y las etapas (a) a (c) se realizan por segunda vez para un segundo antfgeno de interes para generar una segunda secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y en el que la primera secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana se expresa con una primera secuencia de region constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana para formar una primera cadena pesada de inmunoglobulina humana, la segunda secuencia de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana se expresa con una segunda secuencia de region constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana para formar una segunda cadena pesada de inmunoglobulina humana, en el que la primera y la segunda cadena pesada de inmunoglobulina humana se expresan en presencia de una sola cadena ligera de inmunoglobulina humana que comprende una region V^lhumana derivada de una secuencia de cadena ligera humana reordenada que comprende un segmento de gen Vk1-39 humano o un segmento de gen Vk3-20 humano.

12. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 11, metodo que comprende:

(a) clonar secuencias de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana de linfocitos B de:

(i) el raton de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que ha sido inmunizado con un primer inmunogeno; e

(ii) el mismo raton o un raton diferente que es geneticamente similar, que ha sido inmunizado con un segundo inmunogeno;

(b) expresar, en una celula, las secuencias de region variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana de (a) con una secuencia de region constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana y la misma cadena ligera de inmunoglobulina para producir un anticuerpo biespedfico, preferentemente, en el que la primera cadena pesada de inmunoglobulina humana comprende una modificacion que elimina o reduce esencialmente la afinidad de la primera cadena pesada de inmunoglobulina humana hacia la proterna A, y la segunda cadena pesada de inmunoglobulina humana conserva la capacidad de unirse a la proterna A, en el que la modificacion que elimina o reduce esencialmente la afinidad de la primera cadena pesada de inmunoglobulina humana hacia la proterna A se selecciona de: 95R (EU 435R), 96F (EU 436F) y una combinacion de las mismas.

13. Un metodo de generacion de un anticuerpo que comprende inmunizar un raton de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con un antfgeno y obtener una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o secuencia de nucleotidos codificante, de un anticuerpo resultante producido por el raton contra el antigeno, y utilizar dicha secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o secuencia de acido nucleico codificante en la generacion de un anticuerpo, preferentemente, metodo que comprende ademas:

(a) identificar la secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o secuencia de nucleotidos codificante, de dos anticuerpos diferentes contra diferentes epftopos del antigeno con el que se ha inmunizado el raton; o

(b) inmunizar el mismo raton o un raton adicional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con un antfgeno diferente, luego, identificar una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o secuencia de nucleotidos codificante, de un anticuerpo producido por el raton que es espedfico de dicho antigeno diferente,

14. El metodo de la reivindicacion 13, metodo que comprende ademas:

(a) identificar la secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana, o secuencia de nucleotidos codificante, del anticuerpo o dos anticuerpos; y/o

(b) emplear la secuencia de aminoacidos del dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana y/o las secuencias de aminoacidos del dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana identificadas en el anticuerpo producido mediante el metodo de generacion de un anticuerpo biespedfico.