PT2627773T - Ratinhos de cadeia pesada de imunoglobulina restrita - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
RATINHOS DE CADEIA PESADA DE IMUNOGLOBULINA RESTRITA
Campo
Os animais não humanos que são geneticamente modificados num locus de região variável (V) de cadeia pesada de imunoglobulina (ou num transgene) para fazer anticorpos a partir de um número restrito de segmentos variáveis de cadeia pesada (Vh) de imunoglobulina (ou um segmento Vh único) e/ou variantes dos mesmos. Os animais não humanos que têm um domínio variável de cadeia pesada humano derivado de um segmento de gene variável único de cadeia pesada de imunoglobulina, por exemplo, segmento de gene de VHl-69 de imunoglobulina humana ou segmento de gene de Vh1-2 humano. Os métodos para fazer sequências de anticorpos em animais não humanos são úteis para ligar agentes patogénicos, incluindo agentes patogénicos humanos.
Antecedentes
Os animais não humanos, por exemplo, ratinhos, foram geneticamente modificados para serem ferramentas úteis em métodos para fazer sequências de anticorpos para utilização em terapêutica humana baseada em anticorpos. Ratinhos com loci de região variável humanizados (por exemplo, genes VH, Dh e Jh, e genes Vl e Jl) são utilizados para gerar domínios variáveis de cadeia pesada e leve cognatos para utilização nas terapêuticas com anticorpo. Outros ratinhos estão disponíveis, os quais geram anticorpos completamente humanos com cadeias pesadas e leves cognatas. A terapêutica com anticorpo humano é projetada com base em características desejadas em relação a certos antigénios pré-selecionados. Os ratinhos humanizados são imunizados com os antigénios pré-selecionados, e os ratinhos imunizados são utilizados para gerar populações de anticorpos a partir das quais se identificam domínios variáveis pesados e leves cognatos de afinidade alta com características de ligação desejadas. Alguns ratinhos humanizados, como aqueles que têm uma humanização de apenas regiões variáveis em loci de ratinho endógenos, geram populações de células B que são semelhantes em caráter e número para populações de célula B de ratinho do tipo selvagem. Como resultado, encontra-se disponível uma população extremamente grande e diversa de células B nesses ratinhos a partir dos quais se podem triar anticorpos, que refletem um número grande de diferentes redisposições de imunoglobulina, para identificar domínios variáveis pesados e leves com as características mais desejáveis.
Mas nem todos os antigénios provocam uma resposta imunitária que exibe um número muito grande de redisposições a partir de uma seleção ampla de segmentos variáveis (V). Isto é, a resposta imunitária humoral humana a certos antigénios é aparentemente restrita. A restrição é refletida na seleção clonal de células B que expressam apenas certos segmentos V que ligam aquele antigénio particular com afinidade e especificidade suficientemente altas. Alguns antigénios são clinicamente significativos, isto é, vários são agentes patogénicos humanos bem conhecidos. Surge um pressuposto, na qual o segmento V expresso na resposta imunitária humana é um segmento V que, em combinação com um segmento D humano e um segmento J humano, é mais propenso a gerar um anticorpo de afinidade alta útil do que um segmento V aleatoriamente selecionado e que não foi observado numa resposta de anticorpo humano àquele antigénio. É colocada a hipótese que a seleção natural, ao longo dos milénios, selecionou a fundação ou base mais eficaz a partir da qual se projeta uma arma mais eficaz para neutralizar agentes patogénicos humanos - um segmento V selecionado de modo clonal. Há necessidade na técnica de mais e superiores anticorpos que se ligam e/ou neutralizam antigénios, tal como os agentes patogénicos discutidos acima. Há uma necessidade de gerar mais rapidamente as sequências úteis a partir dos segmentos V selecionados, incluindo segmentos V polimórficos e/ou com mutações somáticas selecionados, e de gerar rapidamente as populações úteis de células B que têm redisposições dos segmentos V com vários segmentos D e J, incluindo versões com mutações somáticas dos mesmos e, em particular, redisposições com CDR3s únicas e úteis. Há uma necessidade de sistemas biológicos, por exemplo, animais não humanos (como, por exemplo, ratinhos, ratos, coelhos, etc.) que possam gerar sequências de região variável de anticorpo terapeuticamente úteis a partir de segmentos V pré-selecionados em maior número e com mais diversidade do que, por exemplo, pode ser alcançado em animais modificados existentes. Há uma necessidade de sistemas biológicos projetados para ter um sistema imunitário humoral comprometido para selecionar de modo clonal as sequências variáveis de anticorpo derivadas a partir de pré-segmentos V restritos selecionados, incluindo, mas sem limitação, domínios variáveis de cadeia pesada e leve humanos cognatos, úteis no fabrico de produtos terapêuticos à base de anticorpo humano contra antigénios selecionados, incluindo certos agentes patogénicos humanos. Há uma necessidade na técnica de anticorpos terapêuticos que tenham capacidade para neutralizar antigénios virais, por exemplo, VIH e VHC, incluindo anticorpos específicos de antigénio que contêm cadeias pesadas derivadas a partir de um segmento variável humano único, e de um sistema que produz uma fonte diversa de anticorpos para selecionar sequências de anticorpos terapêuticos. Também há uma necessidade de métodos adicionais e animais não humanos para produzir anticorpos úteis, incluindo anticorpos que contêm um repertório de cadeias pesadas derivadas de um segmento Vh humano único e que tenham um conjunto diverso de sequências de CDR, e incluindo tais cadeias pesadas que se expressam com domínios variáveis de cadeia leve humanos cognatos. São necessários métodos para selecionar CDRs para proteínas de ligação à base de imunoglobulina que fornecem uma diversidade aprimorada de proteínas de ligação de escolha, e diversidade aprimorada de domínios variáveis de imunoglobulina, incluindo composições e métodos para gerar domínios variáveis de imunoglobulina com mutações somáticas e selecionados de modo clonal para utilização, por exemplo, na produção de produtos terapêuticos humanos.
Sumário
Num primeiro aspeto, a presente invenção fornece um ratinho cujo locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena é restrito, o qual contém um segmento de gene Vh humano único, um ou mais segmentos de gene Dh humano, e um ou mais segmentos de gene Jh humano e que não contém um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena funcional; sendo que o ratinho contém adicionalmente um ou mais segmentos de gene Vl de imunoglobulina humana ligados de modo operacional aos um ou mais segmentos de gene Jl humano, em que o segmento de gene Vh humano único, um ou mais segmentos de gene Dh humano, e um ou mais segmentos de gene Jh estão ligados de modo operacional a um gene de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana, em que o segmento de gene VH humano único é Vh1-69 ou uma variante polimórfica do mesmo.
Num segundo aspeto, a invenção fornece uma célula ou tecido derivado do ratinho do primeiro aspeto da invenção.
Num terceiro aspeto, a invenção fornece um método para fazer uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio Vh humano que inclui as etapas de: (a) imunizar um ratinho do primeiro aspeto da invenção com um antigénio de interesse; (b) permitir que o ratinho referido produza uma resposta imunitária para o antigénio de interesse; e (c) obter uma sequência de ácidos nucleicos de região Vh de imunoglobulina que codifica um domínio Vh humano a partir do referido ratinho.
Num quarto aspeto, a invenção fornece a utilização de um ratinho de acordo com o primeiro aspeto da invenção num método para produzir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável de cadeia pesada humano.
Os loci de imunoglobulina geneticamente modificados são fornecidos, os quais contêm um número restrito de diferentes segmentos de gene de região variável de cadeia pesada (isto é, genes V, genes VH, segmentos de gene Vh ou segmentos de gene V) , por exemplo, não mais que um, dois, ou três genes V diferentes; ou não mais que um membro de família de segmento de gene V presente, por exemplo, numa cópia única ou em múltiplas cópias e/ou que contenham um ou mais polimorfismos.
Os loci são descritos como tendo a capacidade para redispor e formar um gene que codifica um domínio variável de cadeia pesada que é derivado de um repertório de gene Vh que é restrito, por exemplo, que é um segmento de gene Vh único ou selecionado a partir de uma pluralidade de variantes polimórficas do segmento de gene Vh único. Os loci de imunoglobulina modificados que incluem loci que contêm sequências de imunoglobulina humana são fornecidos, por exemplo, um segmento V humano ligado de modo operacional a uma sequência constante de imunoglobulina humana ou (ou quimérica humana/não humana) não humana (e em ligação operável com, por exemplo, um segmento D e/ou J) . São fornecidos loci modificados que contêm múltiplas cópias de um segmento de gene Vh único, em que uma ou mais das cópias compreendem uma variante polimórfica. São fornecidos loci modificados que contêm múltiplas cópias de um segmento VH único, ligadas de modo operacional a um ou mais segmentos D e um ou mais segmentos J, ligadas de modo operacional a uma sequência constante de imunoglobulina não humana, por exemplo, uma sequência de ratinho ou rato. Os animais não humanos que contêm tais loci humanizados também são fornecidos. São fornecidos animais não humanos com uma complexidade de segmento de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina reduzida (isto é, um número limitado de segmentos de gene variáveis de cadeia pesada, ou um repertório de gene variável de cadeia pesada limitada), em que a complexidade de segmento de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina reduzida é caracterizada pela presença de não mais que um ou não mais que dois segmentos de gene variáveis de cadeia pesada, e em que os genes variáveis de cadeia pesada presentes estão ligados de modo operacional a uma sequência de região constante humana ou não humana. São fornecidos animais não humanos com uma complexidade de segmento de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina reduzida (por exemplo, um segmento de gene Vh único, ou um número limitado de segmentos de gene Vh que são variantes polimórficas de um segmento de gene VH único) , em que a complexidade de segmento de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina reduzida é caracterizada por a presença de um segmento de gene Vh único ou uma pluralidade de segmentos de gene Vh que são formas polimórficas de um segmento de gene Vh único (por exemplo, segmentos de gene Vh associados a um número de cópias alto e/ou polimorfismo em seres humanos), e em que os genes variáveis de cadeia pesada presentes estão ligados de modo operacional a uma sequência de região constante humana ou não humana. Os genes variáveis de cadeia pesada presentes estão ligados de modo operacional a um ou mais segmentos de gene D e/ou um ou mais segmentos de gene J na linha germinal do animal não humano. São fornecidos animais não humanos, os quais contêm um locus variável de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, num transgene ou como uma inserção ou substituição num locus variável de cadeia pesada de animal não humano endógeno) que contém um segmento Vh único ligado de modo operacional a um segmento de gene D e/ou J. 0 segmento de gene Vh único pode estar ligado de modo operacional a um ou mais segmentos de gene D e/ou um ou mais segmentos de gene J no locus de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena do animal não humano. São fornecidos animais não humanos, os quais são modificados em seus loci de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina para deletar todos ou substancialmente todos os segmentos VH de imunoglobulina endógena (por exemplo, todos os segmentos funcionais, ou quase todos os segmentos funcionais) e que contêm um segmento Vh1-69 humano (ou um segmento Vh1-2 humano) ligado de modo operacional a um segmento D e J ou um segmento J no locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena do animal não humano.
Também se encontram descritos animais não humanos que são modificados em seus loci de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina para tornar os loci de região variável endógenos sem capacidade para redisposição para formar uma cadeia pesada funcional que contenha segmentos de gene de região variável endógenos; em que os animais não humanos contêm um segmento de gene variável humano único (um Vh1-2 humano ou um segmento de gene Vh1-69 humano) ligado de modo operacional a um segmento D e um J ou um segmento J no locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena do animal não humano. São fornecidos animais não humanos, os quais contêm um número restrito (por exemplo, não mais que um, ou não mais que dois) de segmentos de gene de cadeia pesada ligados de modo operacional a uma sequência de região constante humana ou não humana. Num caso, os não mais que um ou não mais que dois segmentos de gene de cadeia pesada ligados à sequência de região constante estão num transgene, por exemplo, estão numa posição diferente de um locus de cadeia pesada endógeno. São descritos os métodos para fazer sequências de imunoglobulina humana em animais não humanos. Em vários casos, as sequências de imunoglobulina humana são derivadas de um repertório de sequências V de imunoglobulina que consistem essencialmente num segmento V humano único, por exemplo, Vh1-69 ou Vh1-2, e um ou mais segmentos D e J ou um ou mais segmentos J. São fornecidos os métodos para produzir sequências de imunoglobulina humana em animais, tecidos e células não humanos, em que as sequências de imunoglobulina humana se ligam a um agente patogénico. São descritos os métodos para produzir ratinhos caracterizados por um locus de cadeia pesada de imunoglobulina restrita, em que a restrição é em relação ao número de segmentos de gene Vh de imunoglobulina. Em vários casos, a restrição é a um ou não mais que dois ou um membro de família de gene Vh único (por exemplo, um ou mais alelos, variantes ou variantes polimórficas Vh do mesmo). Em vários casos, o locus de cadeia pesada contém adicionalmente um ou mais segmentos de gene Dh e um ou mais segmentos de gene Jh. Em vários casos, os segmentos de gene Vh, Dh e Jh são humanos. Em vários casos, os segmentos de gene Vh, Dh e Jh estão ligados de modo operacional a uma região constante não humana (por exemplo, uma IgM e/ou uma IgG) . Em vários casos, a região constante é uma região constante de ratinho ou rato.
Num caso, é fornecido um método para fazer um ratinho que tem um locus de cadeia pesada de imunoglobulina restrito que inclui introduzir uma construção de ácido nucleico, conforme descrito no presente documento, a uma célula estaminal (ES) embrionária de ratinho e isolar ou identificar uma célula ES de ratinho que contenha o construto de ácido nucleico.
Num caso, o construto de ácido nucleico contém um segmento de gene VH humano único, um ou mais segmentos de gene Dh humano e um ou mais segmentos de gene Jh humano. Num caso, o construto de ácido nucleico contém um ou mais sítios de recombinação específicos de sítio (por exemplo, um sítio loxP ou Frt).
Num caso, é fornecido um ratinho produzido com a utilização de um vetor de direcionamento, sequência de ácidos nucleicos ou célula, conforme descrito no presente documento. Em vários casos, o vetor de direcionamento, a sequência de ácidos nucleicos ou a célula incluem uma sequência de ADN que contém um segmento de gene Vh humano único (ou variantes polimórficas do mesmo) , um ou mais segmentos de gene DH humano e um ou mais segmentos de gene Jh humano ligados de modo operacional a um gene constante não humano.
Num caso, é fornecido um método para produzir um ratinho que contém um locus de cadeia pesada de imunoglobulina restrito, o qual inclui substituir um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de ratinho por uma sequência genómica humana que contém um segmento de gene Vh humano único (ou variantes polimórficas do mesmo) , um ou mais segmentos de gene DH humano e um ou mais segmentos de gene Jh humano, em que os segmentos de gene Vh, Dh e Jh humanos têm a capacidade de redisposição para formar uma cadeia pesada quimérica que contém um domínio variável humano ligado de modo operacional a uma região constante não humana. Num caso, a região constante não humana é uma região constante de ratinho ou rato.
Em vários casos, os animais não humanos são roedores. Em vários casos, os roedores são ratinhos e/ou ratos.
Num caso, é fornecido um locus de cadeia pesada de imunoglobulina modificado, o qual contém um repertório de segmento V de cadeia pesada que é restrito em relação à identidade do segmento V e que contém um ou mais segmentos D e um ou mais segmentos J, ou um ou mais segmentos J. Num caso, o segmento V de cadeia pesada é um segmento humano. Num caso, os um ou mais segmentos D são segmentos D humanos. Num caso, os um ou mais segmentos J são segmentos J humanos. Num caso, os um ou mais segmentos D e um ou mais segmentos J são segmentos D humanos e J humanos.
Num caso, o locus modificado é um locus não humano. Num caso, o locus não humano é modificado com pelo menos uma sequência de imunoglobulina humana.
Num caso, a restrição é a um membro de família de segmento V. Num caso, o um membro de família de segmento V está presente em duas ou mais cópias. Num caso, um membro de família de segmento V está presente em forma de duas ou mais variantes (por exemplo, duas ou mais formas polimórficas do membro de família de segmento V) . Num caso, um segmento V é um membro de família de segmento V humano. Num caso, um membro de família de segmento V está presente num número de variantes conforme é observado na população humana em relação àquela variante. Num caso, o membro de família de segmento V é selecionado a partir da Tabela 1. Num caso, o membro de família de segmento V está presente em diversas variantes conforme mostrado, para cada segmento V, em vários alelos de entre 1 alelo ao número de alelos mostrados na coluna direita da Tabela 1.
Num caso, a restrição é a um segmento de gene Vh1-69 humano. Num caso, o segmento de gene Vh1-69 humano está presente em duas ou mais cópias. Num caso, o segmento de gene Vh1-69 humano está presente m forma de duas ou mais variantes (por exemplo, duas ou mais formas polimórficas do gene Vh1-69 humano) . Num caso, o segmento de gene Vh1-69 humano está presente em diversas variantes conforme é observado na população humana em relação ao segmento de gene Vh1-69 humano. Num caso, o segmento de gene Vh1-69 humano é selecionado a partir da Tabela 2. Num caso, o segmento de gene Vh1-69 humano está presente em diversas variantes conforme mostrado, para cada segmento de gene Vh1-69, num número de alelos de entre um alelo ao número de alelos mostrado na Tabela 2.
Num caso, a restrição é a um segmento de gene Vh1-2 humano. Num caso, o segmento de gene Vh1-2 humano está presente em duas ou mais cópias. Num caso, o segmento de gene Vh1-2 humano está presente em forma de duas ou mais variantes (por exemplo, duas ou mais formas polimórficas do gene Vh1-2 humano) . Num caso, o segmento de gene Vh1-2 humano está presente em diversas variantes conforme é observado na população humana em relação ao segmento de gene Vh1-2 humano. Num caso, o segmento de gene Vh1-2 humano é selecionado a partir da Tabela 3. Num caso, o segmento de gene Vh1-2 humano está presente em diversas variantes conforme mostrado, para cada segmento de gene VHl-2, num número de alelos de entre um alelo ao número de alelos mostrado na Tabela 3.
Num caso, é descrito um locus de imunoglobulina de cadeia pesada, o qual contém um segmento V humano funcional único. Num caso, o segmento V humano funcional único é selecionado a partir de um segmento Vh1-2, Vh1-3, Vh1-8, Vh1-18, Vh1-24,
Vh1-45, VhI-46, Vh1-58, Vh1-69, Vh2-5, Vh2-26, Vh2-70, Vh3-7, Vh3-9, Vh3-11, Vh3-13, Vh3-15, Vh3-16, Vh3-20, Vh3-21, Vh3-23, Vh3-30, Vh3-30-3, Vh3-30-5, Vh3-33, Vh3-35, Vh3-38, Vh3-43, Vh3-48, Vh3-49, Vh3-53, Vh3-64, Vh3-66, Vh3-72, Vh3-73, Vh3-74, Vh4-4, Vh4-28, Vh4-30-1, Vh4-30-2, Vh4-30-4, Vh4-31, Vh4-34, Vh4-39, Vh4-59, Vh4-61, Vh5-51, Vh6-1, Vh7-4-1 e VH7-81. Num caso, o segmento V humano funcional único é um segmento VHl-69; num caso especifico, o segmento V humano funcional único está presente em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 formas polimórficas encontradas na população humana. Num caso, o segmento V humano funcional único é um segmento VHl-2; num caso especifico, o segmento V humano funcional único está presente em 1, 2, 3, 4 ou 5 formas polimórficas encontradas na população humana.
Num caso, o locus de imunoglobulina de cadeia pesada é um locus modificado de um animal não humano. Num caso, o locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana modificada está presente no animal não humano numa posição no genoma na qual o locus não humano não modificado correspondente é encontrado no animal não humano do tipo selvagem. Num caso, o locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana modificada está presente num transgene num animal não humano.
Num caso, o segmento V humano funcional único de gene é iam segmento de gene Vh1-69. Num caso, o segmento de gene Vh1-69 contém a SEQ ID NO: 34. Num caso, o segmento de gene Vh1-69 é derivado da SEQ ID NO: 34. Num caso, o segmento de gene VhI-69 é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico à SEQ ID NO: 34.
Num caso, o segmento V humano funcional único de gene é codificado pela sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 34.
Num caso, o segmento V humano funcional único de gene é um segmento de gene Vh1-2. Num caso, o segmento de gene Vh1-2 contém a SEQ ID NO: 60. Num caso, o segmento de gene Vh1-2 é derivado da SEQ ID NO: 60. Num caso, o segmento de gene Vh1-2 é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico à SEQ ID NO: 60.
Num caso, o segmento V humano funcional único de gene é codificado pela sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 60.
Num caso, o segmento V humano funcional único está ligado de modo operacional a um ou mais segmentos D e um ou mais segmentos J, ou um ou mais segmentos J. Num caso, o segmento V e um ou mais segmentos D e/ou J estão ligados de modo operacional a uma cadeia pesada de sequência de imunoglobulina de região constante. Num caso, a cadeia pesada de sequência de imunoglobulina de região constante é selecionada a partir de uma sequência ChI, uma articulação, uma sequência Ch2, uma sequência Ch3 e uma combinação dos mesmos. Num caso, a ChI, articulação, CH2, Ch3 ou combinação dos mesmos são, cada uma, sequências constantes endógenas não humanas. Num caso, pelo menos uma de entre ChI, articulação, Ch2, Ch3, ou combinação das mesmas é uma sequência humana. Num caso especifico, a ChI e/ou articulação são sequências humanas.
Num caso, é fornecido um locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana endógena modificada, o qual contém uma substituição de todos os segmentos de gene V funcionais por um segmento de gene V humano único (ou um segmento de gene V humano único presente em múltiplas formas polimórficas ou número de cópia), em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana não tem capacidade para redisposição para formar um gene variável de cadeia pesada que é derivado de um segmento de gene V diferente do segmento de gene V humano único (ou uma das formas polimórficas ou cópias).
Num caso, o segmento de gene V humano único é Vh1-69. Num caso, o segmento de gene V humano único é Vh1-2.
Num caso, o locus contém pelo menos um segmento de gene Dh humano ou não humano e um segmento de gene Jh humano ou não humano. Num caso especifico, o locus contém vim segmento de gene Dh humano e um segmento de gene Jh humano. Num caso específico, o locus contém um segmento de gene Jh humano. Noutro caso especifico, o locus contém um segmento de gene Vh1-69 humano (presente em forma de uma cópia única ou múltiplas cópias de variantes polimórficas diferentes), todos os segmentos de gene Dh humano funcionais, e todos os segmentos de gene Jh humano funcionais. Noutro caso especifico, o locus contém um segmento de gene Vh1-2 humano (presente em forma de uma cópia única ou múltiplas cópias de formas polimórficas diferentes), todos os segmentos de gene DH humano funcionais, e todos os segmentos de gene Jh humano funcionais. Num caso, os segmentos de gene V, D e J humanos (ou segmentos de gene V e J) estão ligados de modo operacional a um gene de região constante de ratinho num locus de cadeia pesada de ratinho endógeno. Num caso específico, o locus de cadeia pesada de ratinho contém um repertório do tipo selvagem de sequências de região constante de imunoglobulina de ratinho.
Num caso, é fornecido um animal não humano geneticamente modificado, em que apenas o segmento de gene V de cadeia pesada de imunoglobulina funcional do animal não humano é selecionado a partir de um segmento de gene Vh1-2, Vh1-3, VhI-8, Vh1-18, Vh1-24, Vh1-45, Vh1-46, Vh1-58, Vh1-69, Vh2-5, Vh2-26, Vh2-70, Vh3-7, Vh3-9, Vh3-11, Vh3-13, Vh3-15, Vh3-16, Vh3-20, Vh3-21, Vh3-23, Vh3-30, Vh3-30-3, Vh3-30-5, Vh3-33, Vh3-35, Vh3-38, Vh3-43, Vh3-48, Vh3-49, Vh3-53, Vh3-64, Vh3-66, Vh3-72, Vh3-73, Vh3-74, Vh4-4, Vh4-28, Vh4-30-1, Vh4-30-2, Vh4-30-4, Vh4-31, Vh4-34, Vh4-39, Vh4-59, Vh4-61, Vh5-51, Vh6-1, Vh7-4-1, e Vh7-81 humano. Num caso, o segmento V de cadeia pesada de gene é um segmento de gene Vh1-69 humano. Num caso, o segmento V de cadeia pesada de gene é um segmento de gene Vh1-2 humano.
Num caso, é fornecido um animal não humano geneticamente modificado, em que o animal não humano contém um segmento de gene Vh humano funcional único (presente em forma de uma cópia única ou múltiplas cópias de formas polimórficas diferentes), e em que o animal não humano não tem substancialmente a capacidade para formar um gene de domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina redisposta que não tem o segmento de gene Vh humano funcional único (ou uma das formas polimórficas ou cópias).
Num caso, é descrito um animal não humano geneticamente modificado, em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina única expressa no animal não humano é derivada a partir de um segmento humano selecionado a partir de um segmento de gene selecionado de entre um segmento de gene VhI-2, Vh1-3, Vh1-8, Vh1-18, Vh1-24, Vh1-45, Vh1-46, Vh1-58, Vh1-69, Vh2-5, Vh2-26, Vh2-70, Vh3-7, Vh3-9, Vh3-11, Vh3-13, Vh3-15, Vh3-16, Vh3-20, Vh3-21, Vh3-23, Vh3-30, Vh3-30-3, Vh3-30-5, Vh3-33, Vh3-35, Vh3-38, Vh3-43, Vh3-48, Vh3-49, Vh3-53, Vh3-64, Vh3-66, Vh3-72, Vh3-73, Vh3-74, Vh4-4, Vh4-28, Vh4-30-1, Vh4-30-2, Vh4-30-4, Vh4-31, Vh4-34, Vh4-39, Vh4-59, Vh4-61, Vh5-51, Vh6-1, Vh7- 4-1, e Vh7-81 humano. Num caso, o segmento humano é um segmento Vh1-69. Num caso, o segmento humano é um segmento VHl-2. Num caso, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina única expressa pelo ratinho é derivada de um membro de família de segmento V único, e em um caso, a única região variável de cadeia pesada de imunoglobulina é derivada de uma variante polimórfica do único membro de família de segmento V.
Num caso, é fornecido um animal não humano que contém um repertório de segmento de gene V de cadeia pesada de imunoglobulina restrita, em que o animal não humano contém adicionalmente um ou mais segmentos variáveis de cadeia leve k de imunoglobulina humana (Vk) . Num caso, os um ou mais segmentos Vk estão ligados de modo operacional a um ou mais segmentos J humanos. Num caso especifico, os segmentos J são segmentos Jk humanos. Noutro caso especifico, o animal não humano não expressa uma cadeia leve λ de imunoglobulina. Noutro caso específico, o animal não humano não contém um locus variável de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena funcional ou humana funcional.
Num caso, o animal não humano é um roedor. Num caso, o roedor é um ratinho.
Num caso, o animal não humano contém uma substituição no locus Vk de imunoglobulina não humana endógena de todos ou substancialmente todos os segmentos Vk endógenos funcionais com um ou mais segmentos Vk humanos funcionais. Num caso específico adicional, a substituição é feita por todos ou substancialmente todos os segmentos Vk de imunoglobulina humana funcional.
Num caso, o animal não humano contém uma substituição no locus Vk de imunoglobulina não humana endógena de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene Vk endógenos funcionais com segmentos de gene Vk humano selecionados a partir de Vk4-1, Vk5-2, Vk7-3, Vk2-4, Vk1-5, Vk1-6, Vk3-7, Vk1-8, Vk1-9, Vk2-10, Vk3-11, Vk1-12, Vk1-13, Vk2-14, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6-21, Vk1-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29,
Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33, Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36,
Vk1-37, Vk2-38, Vk1-39, Vk2-40 e uma combinação dos mesmos.
Num caso, o animal não humano contém uma substituição no locus Jk de imunoglobulina não humana endógena de todos ou substancialmente todos os segmentos Jk de imunoglobulina não humana endógena funcional com um ou mais segmentos Jk de imunoglobulina humana funcional. Num caso especifico adicional, a substituição é feita por todos ou substancialmente todos os segmentos Jk de imunoglobulina humana funcional.
Num caso, o animal não humano contém uma substituição no locus Jk de imunoglobulina não humana endógena de todos ou substancialmente todos os segmentos Jk de imunoglobulina não humana endógena funcional de gene com segmentos Jk humanos de gene selecionados a partir de JkI, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5 e uma combinação dos mesmos.
Num caso especifico, o animal não humano contém um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que contém um repertório de segmentos V que consistem essencialmente num segmento V único e/ou variantes polimórficas do mesmo. Num caso, o segmento V de cadeia pesada de imunoglobulina único é um segmento Vh1-69 humano, e o animal não humano contém adicionalmente uma substituição de todos os segmentos Dh não humanos funcionais por todos os segmentos Dh humanos funcionais, e contém adicionalmente uma substituição de todos os segmentos Jh não humanos funcionais por todos os segmentos Jh humanos funcionais, e em que o locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina está ligado de modo operacional a uma sequência de gene de região constante humana ou não humana. Num caso especifico, a sequência de gene de região constante é uma sequência de gene de região constante não humana endógena. Num caso especifico, o animal não humano redispõe segmentos no locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana para formar um gene que codifica a região variável de cadeia pesada que contém uma sequência
Vh1-69 humana, uma sequência DH humana, uma sequência Jh humana e uma sequência de região constante de ratinho.
Num caso específico, o animal não humano contém um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que contém um repertório de segmentos V que consistem essencialmente num segmento V único e/ou variantes polimórficas do mesmo. Num caso, o segmento V de cadeia pesada de imunoglobulina único é um segmento Vh1-2 humano, e o animal não humano contém adicionalmente uma substituição de todos os segmentos Dh não humanos funcionais por todos os segmentos Dh humanos funcionais, e contém adicionalmente uma substituição de todos os segmentos Jh não humanos funcionais por todos os segmentos Jh humanos funcionais, e em que o locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina está ligado de modo operacional a uma sequência de gene de região constante humana ou não humana. Num caso especifico, a sequência de gene de região constante é uma sequência de gene de região constante não humana endógena. Num caso específico, o animal não humano redispõe segmentos no locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana para formar um gene que codifica a região variável de cadeia pesada que contém uma sequência Vh1-2 humana, uma sequência Dh humana, uma sequência Jh humana e uma sequência de região constante de ratinho.
Num caso, é fornecida uma célula B, a qual contém o gene redisposto. Num caso específico, a célula B é de um ratinho, conforme descrito, que foi imunizado com um antigénio de interesse e a célula B codifica um anticorpo que liga especificamente o antigénio de interesse. Num caso, o antigénio de interesse é um agente patogénico. Num caso específico, o agente patogénico é selecionado a partir de um vírus influenza, um vírus hepatite (por exemplo, vírus hepatite B ou hepatite C) e um vírus de imunodeficiência humana. Num caso específico, a célula B codifica um anticorpo de afinidade alta (por exemplo, cerca de IO-9 Kd ou menos) com mutação somática que contém uma região variável de cadeia leve humana (por exemplo, uma região variável de cadeia leve k humana) que liga especificamente o antigénio de interesse.
Num caso, é descrito um animal não humano que contém um repertório de segmento V de cadeia pesada de imunoglobulina restrita, em que o animal não humano contém um ou mais segmentos variáveis de cadeia leve λ humana (VÀ). Num caso, os um ou mais segmentos VÀ humanos estão ligados de modo operacional a um ou mais segmentos J humanos. Num caso específico, os segmentos J são segmentos JÀ humanos. Noutro caso específico, o animal não humano não expressa uma cadeia leve k. Noutro caso específico, o animal não humano não contém um locus variável de cadeia leve κ humana ou não humana funcional.
Num caso, o animal não humano contém uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos VÀ de imunoglobulina não humana funcional por um ou mais segmentos VÀ de imunoglobulina humana funcional. Num caso específico adicional, a substituição é por todos ou substancialmente todos os segmentos VÀ de imunoglobulina humana funcional.
Num caso, o animal não humano contém uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos VÀ não humanos funcionais por um fragmento de agrupamento A do locus de cadeia leve λ humana. Num caso específico, o fragmento de agrupamento A do locus de cadeia leve λ humana contém segmentos de gene VÀ humanos VÀ3-27 a VÀ3-1.
Num caso, o animal não humano contém uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos VÀ não humanos funcionais por um fragmento de agrupamento B do locus de cadeia leve X humana. Num caso especifico, o fragmento de agrupamento B do locus de cadeia leve X humana contém segmentos de gene VX humanos VX5-52 a VX1-40.
Num caso, o animal não humano contém uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos VX não humanos funcionais por um fragmento de agrupamento A e um fragmento de agrupamento B do locus de cadeia leve X humana, em que, como um resultado da substituição, contém segmentos de gene VX humanos VX5-52 a VX3-1.
Num caso, o animal não humano contém uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos VX não humanos funcionais por pelo menos 12 segmentos de gene VX humanos, pelo menos 28 segmentos de gene VX humanos, ou pelo menos 40 segmentos de gene VX humanos.
Num caso, o animal não humano contém uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene JX de imunoglobulina não humana funcional por um ou mais segmentos de gene JX de imunoglobulina humana funcional. Num caso específico adicional, a substituição é por todos ou substancialmente todos os segmentos de gene JX de imunoglobulina humana funcional. Em vários casos, os segmentos de gene JX humano funcional incluem JXl, JX2, JX3 e JX7.
Num caso específico, o animal não humano contém um locus de região variável de cadeia pesada (Vh) de imunoglobulina que contém apenas um segmento Vh único, em que o segmento Vh único é um segmento Vh1-69 humano ou um segmento Vh1-2 humano e contém adicionalmente uma substituição de todos os segmentos Dh não humanos funcionais por todos os segmentos Dh humanos funcionais e contém adicionalmente uma substituição de todos os segmentos Jh não humanos funcionais por todos os segmentos Jh humanos funcionais, e em que o locus de região Vh está ligado de modo operacional a uma sequência de gene de região constante humana ou não humana. Num caso especifico, a sequência de gene de região constante é uma sequência de gene de região constante não humana, por exemplo, uma sequência de gene constante não humano endógeno. Num caso especifico, o animal não humano redispõe segmentos no locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana para formar um gene que codifica uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que contém uma sequência Vh1-69 humana (ou uma sequência Vh1-2 humana), uma sequência Dh humana, uma sequência Jh humana e uma sequência de região constante não humana endógena.
Num caso, é fornecida uma célula B, a qual contém o gene redisposto. Num caso especifico, a célula B é de um animal não humano, conforme descrito, que foi imunizado com um antigénio de interesse e a célula B codifica um anticorpo que liga especificamente o antigénio de interesse. Num caso, o antigénio é uma proteína humana selecionada a partir de um ligante, um recetor de superfície de célula e uma proteína intracelular. Num caso, o antigénio de interesse é um agente patogénico. Num caso específico, o agente patogénico é selecionado a partir de um vírus influenza, um vírus hepatite (por exemplo, vírus hepatite B ou hepatite C) e um vírus de imunodeficiência humana. Num caso específico, a célula B codifica um anticorpo de afinidade alta (por exemplo, cerca de IO-9 Kd ou menos) com mutação somática que contém uma região variável de cadeia leve humana (por exemplo, uma região variável de cadeia leve λ humana) que liga especificamente o antigénio de interesse.
Num caso, é descrito um animal não humano que contém um repertório de segmento Vh de imunoglobulina restrita, em que o animal não humano contém um segmento Vh1-69 humano (ou um segmento Vh1-2 humano) num transgene, em que o segmento VHl-69 humano está ligado de modo operacional no transgene a um segmento Dh humano ou não humano, e/ou um segmento J humano ou não humano, e o transgene contém adicionalmente um gene de região constante humano ou não humano, ou uma região constante humana/não humana quimérica (por exemplo, uma ChI, articulação, Ch2, Ch3 ou combinação das mesmas, em que pelo menos uma sequência é não humana, por exemplo, selecionada a partir de articulação, Ch2, e Ch3 e/ou articulação). Num caso, o animal não humano é um ratinho ou rato e o gene de região constante gene D, J e/ou de região constante não humano é um gene de ratinho ou rato ou humano/ratinho ou rato quimérico.
Num caso, o animal não humano inclui um transgene que contém um locus de região variável de cadeia leve de imunoglobulina que contém um ou mais segmentos de gene VX e segmentos de gene JX de imunoglobulina humana, ou um ou mais segmentos de gene Vk e segmentos de gene Jk de imunoglobulina humana, e um gene de região constante de cadeia leve de κ ou X de imunoglobulina humana, de modo que o transgene se redisponha no animal não humano para formar um gene de cadeia leve κ ou X de imunoglobulina redisposto. Em vários casos, os segmentos de gene Vk e Jk humanos são aqueles descritos no presente documento. Em vários casos, os segmentos de gene VX e JX humanos são aqueles descritos no presente documento.
Num caso especifico, o animal não humano inclui um transgene que tem um locus variável de cadeia pesada de imunoglobulina que contém um segmento V único que é um segmento Vh1-69 humano (ou um segmento Vh1-2 humano), um ou mais segmentos D humanos, um ou mais segmentos J humanos e um gene constante humano ligado de modo operacional ao locus variável de cadeia pesada, de modo que o ratinho expresse a partir do transgene um anticorpo completamente humano derivado do segmento Vh1-69 (ou do segmento Vh1-2) . Num caso, o animal não humano não contém um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena funcional. Num caso especifico, o animal não humano contém um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena não funcional que contém uma deleção de um segmento DH não humano endógeno e/ou JH não humano endógeno, de modo que o animal não humano não tenha capacidade para a redisposição do locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena para formar um gene de anticorpo não humano redisposto. Num caso especifico, o animal não humano contém uma deleção de uma sequência de troca ligada de modo operacional a uma região constante de cadeia pesada de ratinho endógena. Num caso especifico, a sequência de troca é uma sequência de troca μ não humano (por exemplo, ratinho). Noutro caso, o animal não humano apresenta adicionalmente uma falta de um locus variável de cadeia leve endógena funcional selecionada a partir de um locus de imunoglobulina κ e um locus de imunoglobulina λ. Num caso especifico, o animal não humano contém uma deleção de uma sequência Jk e/ou JÀ, de modo que o animal não humano não tenha capacidade para redispor uma cadeia leve de imunoglobulina κ não humana endógena e/ou uma região variável de cadeia leve λ de imunoglobulina não humana endógena para formar uma cadeia leve de imunoglobulina κ não humana endógena redisposta e/ou uma gene de cadeia leve λ de imunoglobulina não humana endógena redisposta.
Num caso, o animal não humano contém uma deleção de uma sequência de cadeia leve κ de imunoglobulina não humana endógena que resulta num knockout funcional da cadeia leve κ de imunoglobulina não humana endógena. Num caso, o animal não humano contém uma deleção de uma sequência de cadeia leve λ de imunoglobulina não humana endógena que resulta num knockout funcional da cadeia leve λ de imunoglobulina não humana endógena.
Num caso, o animal não humano contém um locus de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena funcionalmente silenciado, e contém um repertório restrito de segmentos de gene variáveis de cadeia pesada humana (por exemplo, não mais que um ou não mais que dois). Num caso, o silenciamento funcional inclui uma modificação de um locus de gene variável de cadeia pesada não humana endógena selecionado a partir de uma deleção, uma inserção, uma inversão e uma combinação dos mesmos.
Num caso, é fornecido um roedor, o qual contém um repertório VH de imunoglobulina derivado de não mais que um segmento VH humano ou um ou mais polimorfos dos mesmos, a partir de um segmento D selecionado a partir de um repertório de um ou mais segmentos D e a partir de um segmento J derivado de um repertório de um ou mais segmentos J. Num caso, o roedor redispõe o segmento VH humano, um segmento D humano e um segmento J humano e forma uma sequência de cadeia pesada humana redisposta que está ligada de modo operacional a uma sequência de região constante humana ou de roedor. Num caso, a sequência de região constante humana e/ou de roedor é selecionada a partir de uma ChI, uma articulação, uma Ch2, uma Ch3 e uma combinação dos mesmos. Num caso, o roedor expressa uma cadeia leve de imunoglobulina que contém um domínio variável humano, em que a cadeia leve é cognata com um domínio de cadeia pesada humana derivado da sequência de cadeia pesada humana redisposta. Num caso, o roedor não expressa uma sequência polipeptídica selecionada a partir de um domínio variável de cadeia pesada não humana, um domínio variável de cadeia leve não humana, e uma combinação dos mesmos.
Num caso, o segmento Vh humano está presente em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19 ou mais variantes polimórficas, em que cada variante polimórfica está ligada de modo operacional a um segmento D e/ou J de modo que cada variante polimórfica tenha capacidade para redispor e formar um domínio variável de cadeia pesada redisposta com qualquer um de entre os um ou mais segmentos D e qualquer um de entre os um ou mais segmentos J. Num caso, o roedor é um ratinho ou um rato. Num caso, o repertório de segmentos D contém dois ou mais segmentos D. Num caso, o repertório de segmentos J contém dois ou mais segmentos J. Num caso, os segmentos D e/ou J são segmentos humanos.
Num caso, é fornecido um construto de ácido nucleico, o qual contém uma sequência que codifica um segmento Vh de imunoglobulina humana único e/ou variantes polimórficas do mesmo e uma ou mais sequências Dh e uma ou mais sequências J, em que o construto contém pelo menos um braço de homologia homólogo a um locus não humano variável de cadeia pesada de imunoglobulina, ou um sítio de reconhecimento de recombinase (por exemplo, um sítio lox) . Num caso, o segmento V é um segmento Vh1-69 ou um segmento Vh1-2.
Num caso, é fornecido um construto de ácido nucleico; o qual contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um segmento V de cadeia pesada de imunoglobulina humana único, em que o segmento VH único é um segmento VHl-69 (ou VHl-2) . Num caso, o construto contém um sítio de reconhecimento de recombinase específico de sítio. Num caso, o construto contém um primeiro braço de homologia de ratinho a montante do segmento Vh1-69 (ou Vh1-2) e um segundo braço de homologia de ratinho a jusante do segmento Vh1-69 (ou Vh1-2) , em que o primeiro braço de homologia de ratinho é homólogo a uma região de um cromossoma de ratinho imediatamente a montante de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de ratinho, mas que não inclui um segmento variável de cadeia pesada de imunoglobulina de ratinho funcional. Num caso, o construto contém a SEQ ID NO: 3. Num caso, o construto contém a SEQ ID NO: 70.
Num caso, o segmento Vh único restrito está num animal não humano, ou o segmento VH restrito está num locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana (por exemplo, in situ ou num transgene), e o animal não humano ou locus de cadeia pesada de imunoglobulina não humana é selecionado a partir de um locus de ratinho, rato, coelho, porco, bovino (por exemplo, vaca, touro, búfalo), veado, carneiro, cabra, galinha, gato, cão, furão, primata (por exemplo, sagui, macaco rhesus) ou animal. Num caso especifico, o animal não humano ou locus é um locus de ratinho ou rato.
Num caso, é fornecida uma célula ou tecido, em que a célula ou tecido é derivada de um animal não humano, conforme descrito no presente documento, e contém um repertório de segmento VH restrito. Num caso, o repertório de segmento Vh é restrito a um membro de família de segmento Vh único e/ou variantes polimórficas do mesmo. Num caso específico, o segmento Vh único é um segmento Vh1-69 humano ou um segmento Vh1-2 humano. Num caso, a célula ou tecido é derivada do baço, gânglio linfático ou medula óssea do animal não humano.
Num caso, a célula é uma célula ES. Num caso, a célula é uma célula B. Num caso, a célula é uma célula de germe.
Num caso, o tecido é selecionado a partir de tecido conjuntivo, muscular, nervoso e epitelial. Num caso específico, o tecido é tecido reprodutor.
Num caso, a célula e/ou tecido derivado de um ratinho, conforme descrito no presente documento, é isolado para utilização num ou mais ensaios ex vivo. Em vários casos, os um ou mais ensaios ex vivo incluem medições de propriedades físicas, térmicas, elétricas, mecânicas ou óticas, um procedimento cirúrgico, medições de interações de tipos de tecido diferentes, o desenvolvimento de técnicas de imagiologia ou uma combinação dos mesmos.
Num caso, o animal não humano é um ratinho.
Num caso, é fornecido um embrião não humano, o qual contém segmentos VH de cadeia pesada restrita, conforme descrito no presente documento. Num caso, o embrião contém uma célula doadora ES que contém o segmento VH restrito e células de embrião hospedeiras.
Num caso, o animal não humano é um ratinho.
Num caso, uma célula não humana contém um cromossoma ou fragmento do mesmo de um animal não humano, conforme descrito no presente documento. Num caso, a célula não humana contém um núcleo de um animal não humano, conforme descrito no presente documento. Num caso, a célula não humana contém o cromossoma ou fragmento do mesmo como resultado de uma transferência nuclear.
Num caso, é fornecido um núcleo derivado de um animal não humano, conforme descrito no presente documento. Num caso, o núcleo é de uma célula diplóide que não é uma célula B.
Num caso, é fornecida uma célula pluripotente, pluripotente induzida ou totipotente derivada de um animal não humano, conforme descrito no presente documento. Num caso específico, a célula é uma célula estaminal (ES) embrionária de ratinho.
Num caso, é fornecida uma célula pluripotente induzida não humana que contém um repertório de segmento Vh restrito. Num caso, a célula pluripotente induzida é derivada de um animal não humano, conforme descrito no presente documento.
Num caso, um hibridoma ou quadroma é fornecido, derivado de uma célula de um animal não humano, conforme descrito no presente documento. Num caso, o animal não humano é um ratinho ou rato.
Num caso, é fornecido um linfócito de um animal não humano, conforme descrito no presente documento. Num caso, o linfócito é uma célula B.
Num caso, são fornecidos células de ratinho e embriões de ratinho, incluindo, mas sem limitação, células ES, células pluripotentes e células pluripotentes induzidas que contêm modificações genéticas, conforme descrito no presente documento. São fornecidas células que são XX e células que são XY. Também são fornecidas células que contêm um núcleo que contém uma modificação conforme descrito no presente documento, por exemplo, uma modificação introduzida numa célula por injeção pró-nuclear.
Num caso, é descrita uma sequência de domínio variável de anticorpo feita num animal não humano, conforme descrito no presente documento.
Num caso, um produto terapêutico humano é descrito, o qual contém um domínio variável de anticorpo que contém uma sequência derivada de um animal não humano, conforme descrito no presente documento.
Num caso, é descrito um método para obter uma sequência de região variável de anticorpo a partir de um animal não humano, em que a sequência de região variável de anticorpo é derivada de um segmento Vh1-69 humano ou um segmento VhI-2, em que o método inclui (a) imunizar um animal não humano com um antigénio de interesse, em que o animal não humano contém uma substituição no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena de todos ou substancialmente todos os segmentos variáveis não humanos por um segmento variável humano único, em que o segmento variável humano único é um segmento Vh1-69 ou um segmento Vh1-2, e em que o animal não humano é substancialmente incapaz de formar uma sequência de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que não é derivada de um segmento VHl-69 humano ou um segmento Vh1-2; (b) permitir que o animal não humano tenha uma resposta imunitária em relação ao antigénio de interesse; e (c) identificar ou isolar uma sequência de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina do animal não humano, em que o anticorpo se liga ao antigénio de interesse.
Num caso, o segmento variável humano único é um segmento Vh1-69.
Num caso, a sequência de região variável de anticorpo é derivada da SEQ ID NO: 34. Num caso, a sequência de região variável de anticorpo é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 34. Num caso, a sequência de região variável de anticorpo contém a SEQ ID NO: 34.
Num caso, o segmento variável humano único é um segmento Vh1-2.
Num caso, a sequência de região variável de anticorpo é derivada da SEQ ID NO: 60. Num caso, a sequência de região variável de anticorpo é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 60. Num caso, a sequência de região variável de anticorpo contém a SEQ ID NO: 60.
Num caso, a resposta imunitária ao antigénio é caracterizada por uma titulação de anticorpo que é cerca de 6xl04 a cerca de 5xl05 vezes maior que duas vezes o fundo, conforme determinado num ensaio ELISA. Num caso especifico, a titulação de anticorpo é de cerca de lxlO5 a cerca de 2xl05 vezes maior que duas vezes o fundo, conforme determinado num ensaio ELISA. Num caso especifico, a titulação de anticorpo é cerca de l,5xl05 vezes maior que duas vezes o fundo, conforme determinado num ensaio ELISA. Num caso, o antigénio é um recetor de superfície de célula humana.
Num caso, é descrito um método para gerar um repertório de regiões variáveis de anticorpo humano num animal não humano, em que as regiões variáveis de cadeia pesada humana do repertório são derivadas do mesmo membro de família de gene Vh e um de entre uma pluralidade de segmentos Dh e um de entre uma pluralidade de segmentos Jh, em que o repertório é caracterizado por ter sequências FRl (estrutura 1), CDRl, FR2, CDR2 e FR3 de imunoglobulina de cadeia pesada de um membro de família de gene Vh único. Num caso, o repertório é adicionalmente caracterizado por ter uma pluralidade de sequências CDR3 + FR4 diferentes.
Num caso, a família de gene Vh único é selecionada a partir das famílias Vh 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7. Num caso específico, a família de gene Vh único é família VhI . Num caso, o membro de família de gene Vh único é selecionado a partir de Vh1-2, Vh1-69, Vh2-26, Vh2-70, e Vh3-23. Num caso específico, o membro de família de gene Vh único é VHl-69. Num caso específico, o membro de família de gene VH único é VHl-2.
Num caso, o repertório inclui sequências FRl, CDRl, FR2, CDR2 e FR3 de cadeia pesada derivadas de um segmento Vh1-69. Num caso especifico, o repertório inclui sequências FRl, CDRl, FR2, CDR2 e FR3 de cadeia pesada derivadas da SEQ ID NO: 35. Num caso especifico, o repertório inclui sequências FRl, CDRl, FR2, CDR2 e FR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 35.
Num caso, o repertório inclui sequências FRl, CDRl, FR2, CDR2 e FR3 de cadeia pesada derivadas de um segmento Vh1-2. Num caso especifico, o repertório inclui sequências FRl, CDRl, FR2, CDR2 e FR3 de cadeia pesada derivadas da SEQ ID NO: 61. Num caso especifico, o repertório inclui sequências FRl, CDRl, FR2, CDR2 e FR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 61.
Num caso, um sistema biológico (isto é, in vivo) é descrito para gerar uma pluralidade de sequências CDR3 humanas diferentes que refletem uma pluralidade de redisposições de um segmento de gene Vh humano único com a pluralidade de segmentos D e J humanos, em que o sistema gera domínios variáveis de cadeia pesada humana caracterizados por ter sequências FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 humanas que são idênticas, exceto em termos de hipermutações somáticas, em que os domínios variáveis de cadeia pesada são caracterizados por hipermutações somáticas e derivados de um segmento de gene Vh humano único e uma pluralidade de segmentos D e J humanos; em que o sistema inclui um animal não humano geneticamente modificado (por exemplo, um roedor, por exemplo, um ratinho ou rato), conforme descrito no presente documento.
Num caso, o segmento de gene Vh humano único é selecionado a partir de VHl-2, VHl-69, VH2-26, VH2-70, e VH3-23. Num caso, o segmento de gene Vh humano único é Vh1-69. Num caso, o segmento de gene Vh humano único é Vh1-2. Num caso, o segmento de gene Vh humano único está identificado na Tabela 1. Num caso, o segmento de gene Vh humano único está identificado na Tabela 2. Num caso, o segmento de gene Vh humano único está identificado na Tabela 3.
Num caso, é descrito um método in vivo para gerar uma pluralidade de sequências de CDR de cadeia pesada derivadas de redisposições de um segmento de gene Vh humano único com uma pluralidade de segmentos D e J humanos, em que o método gera domínios variáveis de cadeia pesada humana caracterizados por ter sequências FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 humanas que são idênticas, excepto nas hipermutações somáticas, em que os domínios variáveis de cadeia pesada são caracterizados por hipermutações somáticas e derivados de um segmento de gene Vh humano único e uma pluralidade de segmentos D e J humanos; em que o sistema inclui um animal não humano geneticamente modificado (por exemplo, um roedor, por exemplo, um ratinho ou rato), conforme descrito no presente documento.
Num caso, o método inclui expor um animal não humano conforme descrito no presente documento a um antigénio de interesse, o que permite que o animal não humano desenvolva uma resposta imunitária ao antigénio, em que a resposta imunitária gera a pluralidade de sequências de CDR de cadeia pesada derivadas de redisposições do segmento de gene Vh humano único com um de entre os segmentos D humanos e um de entre os segmentos J humanos e identificar um conjunto de CDRs de cadeia pesada que ligam o antigénio. Num caso, o método inclui isolar do animal uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio VH humano que contém as CDRs de cadeia pesada.
Num caso, as sequências de CDR de cadeia pesada são derivadas de uma redisposição de um segmento de gene Vh1-69 humano. Num caso, as sequências de CDR de cadeia pesada são derivadas de uma redisposição de um segmento de gene Vh1-2 humano.
Num caso, é descrito um método para gerar uma pluralidade de sequências CDR3 e FR4 diferentes num animal não humano, o qual inclui expor um animal não humano que contém um locus de gene variável de cadeia pesada de imunoglobulina com um repertório de segmento Vh restrito a um membro de família de segmento Vh único a um antigénio de interesse, o que permite que o animal não humano desenvolva uma resposta imunitária ao antigénio, caso em que a resposta imunitária gera um repertório de célula B cujos domínios variáveis de cadeia pesada são derivados, cada um, do membro de família de segmento Vh único e que contêm uma pluralidade de sequências CDR3 e FR4 diferentes.
Num caso, o membro de família de segmento Vh único é humano. Num caso, o animal não humano é selecionado entre um ratinho, um rato e um coelho. Num caso, o antigénio de interesse é selecionado a partir de um ligante, um recetor, uma proteína intracelular e uma proteína secretada. Num caso, o antigénio de interesse é um agente patogénico humano, conforme descrito no presente documento.
Num caso, o membro de família de gene Vh humano único é selecionado a partir de VHl-2, VHl-69, VH2-26, Vh2-70, e VH3-23. Num caso, o membro de família de gene Vh humano único é Vh1-69. Num caso, o membro de família de gene Vh humano único é Vh1-2. Num caso, o membro de família de gene Vh humano único está identificado na Tabela 1. Num caso, o membro de família de gene VH humano único está identificado na Tabela 2. Num caso, o membro de família de gene Vh humano único está identificado na Tabela 3.
Num caso, é descrita uma sequência de nucleótidos que codifica uma região variável de imunoglobulina feita num animal não humano, conforme descrito no presente documento.
Num caso, é descrita a sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina ou cadeia leve de imunoglobulina de um anticorpo feita num animal não humano conforme descrito no presente documento.
Num caso, é descrita uma sequência de nucleótidos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina ou cadeia leve de imunoglobulina que codifica uma região variável de um anticorpo feito num não humano conforme descrito no presente documento.
Num caso, é descrito um anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio do mesmo (por exemplo, Fab, F(ab>2, scFv) feito num animal não humano conforme descrito no presente documento.
Num caso, é descrito um ratinho que tem um locus de cadeia pesada de imunoglobulina restrito caracterizado pela presença de um segmento de gene Vh humano único, um ou mais segmentos de gene Dh humano, e um ou mais segmentos de gene Jh humano, em que o segmento de gene VH humano único está num locus de ratinho endógeno e o segmento de gene Vh está ligado de modo operacional aos um ou mais segmentos de gene Dh humano, aos um ou mais segmentos de gene Jh humano e a um gene constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena.
Num caso, o ratinho contém adicionalmente um locus de cadeia leve de imunoglobulina humanizada que contém um ou mais segmentos de gene Vl humano, e um ou mais segmentos de gene Jl humano, em que os segmentos de gene VL humano e os segmentos de gene Jl humano estão ligados de modo operacional a um gene de região constante de cadeia leve de imunoglobulina não humana. Num caso especifico, os segmentos de gene Vl e Jl humanos estão num locus de cadeia leve de ratinho endógeno, e em que o gene de região constante de cadeia leve de imunoglobulina não humana é um gene de ratinho.
Num caso, o locus de cadeia leve de imunoglobulina humanizada está num transgene, e o gene de região constante é selecionado a partir de ratinho, rato e humano.
Num caso, os segmentos de gene Vl e Jl humanos são segmentos de gene Vk e Jk. Num caso, os segmentos de gene VL e Jl humanos são segmentos de gene VX e JX
Num caso, é descrito um animal não humano, em que o animal não humano tem um repertório de célula B que expressa domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina derivados de um membro de família de segmento V único. Num caso, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90, ou pelo menos 95% do repertório de célula B do domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina de animal não humano expresso no repertório de célula B é derivado do mesmo membro de família de segmento V. Num caso específico, a percentagem é pelo menos 90%. Num caso, o repertório de célula B consiste essencialmente em células B periféricas (sangue). Num caso, o repertório de célula B consiste essencialmente em células B esplénicas. Num caso, o repertório de célula B consiste essencialmente em células B de medula óssea. Num caso, o repertório de célula B consiste essencialmente em células B periféricas, células B esplénicas e células B de medula óssea.
Num caso, é descrito um animal não humano geneticamente modificado, em que mais que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais que 90% das células B do animal não humano que expressa um domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada expressam um domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada derivado de um membro de família de segmento de gene Vh único. Num caso, pelo menos 75% das células B do animal não humano que expressam um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina expressam um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina derivado do membro de família de segmento de gene Vh único. Num caso específico, a percentagem é pelo menos 90%. Num caso, todas as células B expressam um domínio de cadeia pesada que é derivado do membro de família de gene Vh único.
Num caso, é descrito um ratinho geneticamente modificado que produz uma população de célula B específica de antigénio em resposta à imunização com um antigénio de interesse, em que pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais de 90%, da referida população de célula B específica de antigénio expressa cadeias pesadas de imunoglobulina que são todas derivadas do mesmo segmento de gene VH. Num caso, pelo menos 75% da população de célula B específica de antigénio expressa cadeias pesadas de imunoglobulina derivadas do mesmo segmento de gene Vh. Num caso, todas as células B específicas de antigénio expressam uma cadeia pesada que é derivada do mesmo segmento de gene Vh.
Num caso, é descrito um animal não humano que contém um segmento Vh restrito de repertório de gene, em que a restrição é a um segmento de gene Vh1-69 humano ou um segmento de gene Vh1-69 que é pelo menos cerca de 75,5%, 76,5%, 86,7%, 87,8%, 94,9%, 96,9%, 98% ou 99% idêntico a um segmento de gene Vh1-69*01. Num caso específico, o repertório restrito é selecionado a partir de uma ou mais de entre as variantes Vh1-69 da Figura 15.
Num caso, é descrito um animal não humano que contém um segmento VH restrito de repertório de gene, em que a restrição é a um segmento de gene Vh1-2 humano ou um segmento de gene Vh1-2 que é pelo menos cerca de 94,9%, 95,9%, 96,9%, 98% ou 99% idêntico a um segmento de gene Vh1-2. Num caso específico, o repertório restrito é selecionado a partir de uma ou mais de entre as variantes Vh1-2 da Figura 18.
Num caso, o animal não humano é um ratinho.
Num caso, o ratinho exibe um imunofenótipo que tem uma característica de uma razão mais alta de células B maduras para células B imaturas em comparação com um ratinho do tipo selvagem. Num caso específico, a razão é calculada a partir das células B colhidas do baço. Num caso, o ratinho exibe uma população de células B maduras de cerca de lxlO7. Num caso, o ratinho exibe uma população de células B imaturas de cerca de 0,5xl07. Num caso, o ratinho exibe uma razão entre células B maduras e células B imaturas no baço do ratinho que é cerca de 1,5 vezes a cerca de 2 vezes mais alta do que o exibido por um ratinho do tipo selvagem.
Num caso, a razão é calculada a partir de células B colhidas da medula óssea. Num caso específico, o ratinho exibe uma população de células B maduras de cerca de 3xl05. Num caso, o ratinho exibe uma população de células B imaturas de cerca de 7xl05. Num caso, o ratinho exibe uma razão entre células B maduras e células B imaturas na medula óssea do ratinho que é cerca de 3 vezes ou cerca de 3,3 vezes mais alta do que o exibido por um ratinho do tipo selvagem.
Num caso, o ratinho exibe um imunofenótipo que tem uma característica de um número mais alto de células pró-B na medula óssea em comparação com um ratinho do tipo selvagem. Num caso específico, o ratinho exibe uma população de células pró-B na medula óssea de ratinho que é cerca de 2,5 vezes a cerca de 3 vezes mais alta do que a exibida na medula óssea de um ratinho do tipo selvagem. Num caso específico, o ratinho exibe uma população de células pró-B na medula óssea de ratinho que é cerca de 2,75 vezes mais alta do que a exibida na medula óssea de um ratinho do tipo selvagem.
Num caso, o ratinho exibe um imunofenótipo que tem uma caracteristica selecionada a partir do grupo que consiste em uma população de célula B esplénica CD19+ que é cerca de 80% de uma célula B do tipo selvagem, uma população de célula T esplénica CD3+ que é aproximadamente a mesma que um ratinho do tipo selvagem e uma combinação dos mesmos.
Num caso, o ratinho contém uma população de linfócitos cuja % de células B CD19+ no baço é aproximadamente a mesma que um ratinho do tipo selvagem. Num caso, o número de células B CD19+ por baço do ratinho é pelo menos cerca de 50% do número de células B CD19+ por baço de um ratinho do tipo selvagem.
Num caso, o animal não humano contém pelo menos cerca de 75% a cerca de 80% de células B CD19+ em medula óssea em comparação com um ratinho do tipo selvagem.
Num caso, o número total de células ósseas CD19+ por fémur do ratinho é não menor que cerca de 30%, 40%, 50%, 60% ou 75% do número total de células de medula óssea CD19+ num ratinho do tipo selvagem.
Num caso, o ratinho expressa IgD e IgM a aproximadamente o mesmo nivel que o observado num ratinho do tipo selvagem.
Num caso, é descrito um ratinho que contém um repertório de segmento VH humano restrito que contém adicionalmente um locus de segmento variável de cadeia leve de imunoglobulina humanizada, em que a razão entre cadeias leves λ e κ expressa no ratinho é aproximadamente a mesma que num ratinho do tipo selvagem.
Num caso, é descrito um ratinho, o qual contém um locus de cadeia pesada de imunoglobulina restrito caracterizado pela presença de um segmento de gene VH único, um ou mais segmentos Dh de gene, e um ou mais segmentos de gene Jh, em que o segmento de gene VH único é um segmento de gene VH polimórfico.
Num caso, o segmento de gene Vh polimórfico é um segmento de gene Vh humano que é associado a um número de cópias alto em populações humanas. Num caso, o segmento de gene Vh humano é selecionado a partir de Vh1-2, Vh1-69, Vh2-26, Vh2-70, Vh3-23 ou uma variante polimórfica dos mesmos. Num caso especifico, o segmento de gene Vh humano é um segmento de gene Vh1-69. Em outro caso especifico, o segmento de gene VH humano é um segmento de gene VHl-2.
Num caso, o segmento de gene Vh único está ligado de modo operacional a um gene de região constante de imunoglobulina humana, de ratinho ou humano/ratinho quimérico. Num caso especifico, o gene de região constante de imunoglobulina é um gene de região constante de ratinho. Num caso, o gene constante de imunoglobulina contém uma sequência humana selecionada a partir de uma ChI humana, uma articulação humana, uma Ch2 humana, uma Ch3 humana e uma combinação das mesmas. Num caso, o gene constante de ratinho está num locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena.
Num caso, o ratinho contém adicionalmente um segmento de gene Vl de imunoglobulina humana ligado de modo operacional a um segmento de gene J e um gene constante de cadeia leve. Num caso especifico, o segmento de gene Vl e/ou o segmento de gene J são selecionados a partir de um segmento de gene k humano e um segmento de gene λ humano. Num caso, os segmentos de gene Vl e/ou J são segmentos de gene κ humanos.
Em vários casos, o ratinho contém uma deleção de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene Vh endógenos.
Em vários casos, o animal não humano contém um locus de gene variável de cadeia pesada endógena desativado. Em vários casos, o locus de gene variável de cadeia pesada endógena desativado não está ligado de modo operacional a um gene de região constante de cadeia pesada endógena.
Num caso, é descrito um ratinho, caso em que o ratinho é caracterizado por a expressão de imunoglobulina sérica, em que mais de 80% da imunoglobulina sérica contém um domínio variável de cadeia pesada humano e um domínio variável de cadeia leve humano cognato, em que o domínio variável de cadeia pesada humano é derivado de um segmento Vh de repertório de gene que consiste essencialmente num segmento de gene Vh humano único e/ou variantes polimórficas do mesmo.
Num caso, o segmento de gene Vh humano único é um segmento de gene VHl-69 humano e/ou variantes polimórficas do mesmo. Num caso, o segmento de gene Vh humano único é um segmento de gene Vh1-2 humano e/ou variantes polimórficas do mesmo.
Num caso, é descrito um ratinho, o qual contém, na sua linha germinal, uma substituição num locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene Vh endógenos por um segmento de gene Vh humano único e/ou variantes polimórficas do mesmo. Num caso, o segmento de gene Vh humano único é um segmento de gene Vh1-69 humano e/ou variantes polimórficas do mesmo. Num caso, o segmento de gene VH humano único é um segmento de gene Vh1-2 humano e/ou variantes polimórficas do mesmo.
Num caso, o ratinho contém adicionalmente uma substituição num locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene Vl endógenos por um ou mais segmentos de gene Vl humano. Num caso específico, o ratinho contém adicionalmente um ou mais segmentos de gene Jl humano ligados de modo operacional aos segmentos de gene Vl humano.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para produzir uma sequência de nucleótidos de região variável de imunoglobulina. Num caso, a sequência contém um segmento de gene Vh1-69 redisposto. Num caso, a sequência contém um segmento de gene Vh1-2 redisposto.
Num caso, a sequência de nucleótidos de região variável de imunoglobulina é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica a um segmento de gene Vh1-69 humano. Num caso específico, a sequência de nucleótidos de região variável de imunoglobulina é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 34. Em vários casos, o segmento de gene VHl-69 humano é identificado a partir da Tabela 2.
Num caso, a sequência de nucleótidos de região variável de imunoglobulina codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 35.
Num caso, a sequência de nucleótidos de região variável de imunoglobulina é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica a um segmento de gene Vh1-2 humano. Num caso especifico, a sequência de nucleótidos de região variável de imunoglobulina é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 60. Em vários casos, o segmento de gene Vh1-2 humano é identificado a partir da Tabela 3.
Num caso, a sequência de nucleótidos de região variável de imunoglobulina codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica a SEQ ID NO: 61.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para produzir um Fab completamente humano ou F(ab)2 completamente humano. Num caso, o Fab completamente humano ou F(ab)2 completamente humano contém uma região variável de cadeia pesada que contém um segmento de gene VHl-69 humano redisposto. Num caso, o Fab completamente humano ou F(ab)2 completamente humano contém uma região variável de cadeia pesada que contém um segmento de gene Vh1-2 humano redisposto.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para produzir uma linhagem celular imortalizada.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para produzir um hibridoma ou quadroma.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para produzir uma biblioteca de fago que contém regiões variáveis de cadeia pesada humana e regiões variáveis de cadeia leve humana.
Num caso, as regiões variáveis de cadeia pesada humana são derivadas de um segmento de gene Vh1-69 humano que contém uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 58.
Num caso, as regiões variáveis de cadeia pesada humana são derivadas de um segmento de gene Vh1-69 humano que contém uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 59.
Num caso, as regiões variáveis de cadeia pesada humana são todas derivadas de um segmento de gene Vh1-2 humano que contém uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 68.
Num caso, as regiões variáveis de cadeia pesada humana são derivadas de um segmento de gene Vh1-2 humano que contém uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 69.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para gerar uma sequência de região variável para produzir um anticorpo humano, o que inclui (a) imunizar um ratinho, conforme descrito no presente documento, com um antigénio de interesse, (b) isolar um linfócito do ratinho imunizado de (a), (c) expor o linfócito a um ou mais anticorpos identificados, (d) identificar um linfócito que tem capacidade para se ligar ao antigénio de interesse, e (e) amplificar uma ou mais sequências de ácido nucleico de região variável do linfócito, gerando, assim, uma sequência de região variável.
Num caso, o linfócito é derivado ou isolado do baço do ratinho. Num caso, o linfócito é derivado ou isolado de um gânglio linfático do ratinho. Num caso, o linfócito é derivado ou isolado da medula óssea do ratinho. Num caso, o linfócito é derivado ou isolado do sangue do ratinho.
Num caso, o anticorpo identificado é um anticorpo conjugado por fluoróforo. Num caso, os um ou mais anticorpos conjugados por fluoróforo são selecionados a partir de uma IgM, uma IgG e/ou uma combinação das mesmas.
Num caso, o linfócito é uma célula B.
Num caso, as uma ou mais sequências de ácido nucleico de região variável contêm uma sequência de região variável de cadeia pesada. Num caso, as uma ou mais sequências de ácido nucleico de região variável contêm uma sequência de região variável de cadeia leve. Num caso especifico, a sequência de região variável de cadeia leve é uma sequência de região variável de cadeia leve κ de imunoglobulina. Num caso, as uma ou mais sequências de ácido nucleico de região variável contêm a sequência de região variável de cadeia leve e uma sequência de região variável de cadeia pesada κ.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para gerar uma sequência de região variável de cadeia leve e uma sequência de região variável de cadeia pesada κ para produzir um anticorpo humano, o qual inclui (a) imunizar um ratinho, conforme descrito no presente documento, com um antigénio de interesse, (b) isolar o baço do ratinho imunizado de (a), (c) expor linfócitos B do baço a um ou mais anticorpos identificados, (d) identificar um linfócito B de (c) que tem capacidade para se ligar ao antigénio de interesse e (e) amplificar uma sequência de região variável de cadeia pesada de ácido nucleico e uma sequência de ácidos nucleicos de região variável de cadeia leve κ do linfócito B gerando, assim, as sequências de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve κ.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para gerar uma sequência de região variável de cadeia leve e uma sequência de região variável de cadeia pesada κ para produzir um anticorpo humano, o qual inclui (a) imunizar um ratinho, conforme descrito no presente documento, com um antigénio de interesse, (b) isolar um ou mais gânglios linfáticos do ratinho imunizado de (a) , (c) expor linfócitos B dos um ou mais gânglios linfáticos a um ou mais anticorpos identificados, (d) identificar um linfócito B de (c) que tem capacidade para se ligar ao antigénio de interesse e (e) amplificar uma sequência de região variável de cadeia pesada de ácido nucleico e uma sequência de ácidos nucleicos de região variável de cadeia leve κ do linfócito B gerando, assim, as sequências de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve κ.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para gerar uma sequência de região variável de cadeia leve e uma sequência de região variável de cadeia pesada κ para produzir um anticorpo humano, a qual compreende (a) imunizar um ratinho, conforme descrito no presente documento, com um antigénio de interesse, (b) isolar a medula óssea do ratinho imunizado de (a) , (c) expor linfócitos B da medula óssea a um ou mais anticorpos identificados, (d) identificar um linfócito B de (c) que tem capacidade para se ligar ao antigénio de interesse e (e) amplificar uma sequência de região variável de cadeia pesada de ácido nucleico e uma sequência de ácidos nucleicos de região variável de cadeia leve κ do linfócito B gerando, assim, as sequências de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve κ. Em vários casos, os um ou mais anticorpos identificados são selecionados a partir de uma IgM, uma IgG e/ou uma combinação das mesmas.
Em vários casos, o antigénio de interesse é um agente patogénico que aflige indivíduos humanos incluindo, por exemplo, um antigénio virai. Os agentes patogénicos virais exemplificativos incluem, por exemplo, principalmente aqueles das famílias de Adenoviridae, bactérias Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Polyomavirus, Rhabdoviridae e Togaviridae. Tais vírus exemplificativos estão tipicamente na faixa entre 20 a 300 nanómetros em comprimento. Em vários casos, o antigénio de interesse é um antigénio virai selecionado a partir de um vírus de hepatite (por exemplo, VHC, VHB, etc.), um vírus de imunodeficiência humana (VIH) ou um vírus influenza (por exemplo, HlNl) .
Em vários casos, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para gerar uma sequência de região variável de cadeia pesada e leve κ para produzir um anticorpo humano, o qual inclui fundir adicionalmente as sequências de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve amplificadas para sequências de região constante de cadeia pesada e leve humanas, expressar as sequências de cadeia pesada e leve fundidas numa célula e recuperar as sequências de cadeia pesada e leve expressas, gerando, assim, um anticorpo humano.
Em vários casos, as regiões constantes de cadeia pesada humana são selecionadas a partir de IgM, IgD, IgA, IgE e IgG. Em vários casos específicos, a IgG é selecionada a partir de uma IgGl, uma IgG2, uma IgG3 e uma IgG4. Em vários casos, a região constante de cadeia pesada humana compreende uma ChI, uma articulação, uma Ch2, uma Ch3, uma Ch4 ou uma combinação das mesmas. Em vários casos, a região constante de cadeia leve é uma região constante κ de imunoglobulina. Em vários casos, a célula é selecionada a partir de uma célula HeLa, uma célula DU145, uma célula Lncap, uma célula MCF-7, uma célula MDA-MB-438, uma célula PC3, uma célula T47D, uma célula THP-1, uma célula U87, uma célula SHSY5Y (neuroblastoma humano), uma célula Saos-2, uma célula Vero, uma célula CHO, uma célula GH3, uma célula PC12, uma célula retinal humana (por exemplo, uma célula PER.C6™) e uma célula MC3T3. Num caso especifico, a célula é uma célula CHO.
Num caso, é descrito um método para gerar um anticorpo de roedor-humano quimérico reverso especifico contra um antigénio de interesse, o qual inclui as etapas de imunizar um ratinho, conforme descrito no presente documento, com o antigénio, ao isolar pelo menos uma célula do ratinho que produz um anticorpo de ratinho-humano quimérico reverso especifico contra o antigénio, cultivar pelo menos uma célula que produz o anticorpo de ratinho-humano quimérico reverso especifico contra o antigénio e obter o referido anticorpo.
Num caso, o anticorpo de ratinho-humano quimérico reverso contém um domínio variável de cadeia pesada humano fundido com um gene constante de cadeia pesada de ratinho ou rato e um domínio variável de cadeia leve humano fundido com um gene constante de cadeia leve de ratinho ou rato ou humano. Num caso específico, o domínio variável de cadeia pesada humano contém um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto ou Vh1-2 humano.
Num caso, o cultivo de pelo menos uma célula que produz o anticorpo de roedor-humano quimérico reverso específico contra o antigénio é realizado em pelo menos uma célula de hibridoma gerada a partir da pelo menos uma célula isolada do ratinho.
Num caso, o antigénio de interesse é um agente patogénico que aflige indivíduos humanos, conforme descrito no presente documento.
Num caso, é descrito um método para gerar um anticorpo completamente humano especifico contra um antigénio de interesse, o qual inclui as etapas de imunizar um ratinho, conforme descrito no presente documento, com o antigénio, isolar pelo menos uma célula do ratinho que produz um anticorpo de roedor-humano quimérico reverso especifico contra o antigénio, gerar pelo menos uma célula que produz um anticorpo completamente humano derivado do anticorpo de roedor-humano quimérico reverso especifico contra o antigénio, e cultivar pelo menos uma célula que produz o anticorpo completamente humano e obter o referido anticorpo completamente humano.
Em vários casos, pelo menos uma célula isolada do ratinho que produz um anticorpo de roedor-humano quimérico reverso especifico contra o antigénio é um esplenócito ou uma célula B.
Em vários casos, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
Em vários casos, o anticorpo contém um domínio variável de cadeia pesada que contém um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto ou Vh1-2 humano.
Em vários casos, a imunização com o antigénio de interesse é executada com proteína, ADN, uma combinação de ADN e proteína ou células que expressam o antigénio. Num caso, o antigénio de interesse é um agente patogénico que aflige indivíduos humanos, conforme descrito no presente documento.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para produzir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável de imunoglobulina ou fragmento da mesma. Num caso, a sequência de ácidos nucleicos é utilizada para produzir um anticorpo humano ou fragmento de ligação de antigénio do mesmo. Num caso, o ratinho é utilizado para produzir uma proteína de ligação de antigénio selecionada a partir de um anticorpo, um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico), um scFv, um scFv biespecífico, um fragmento de anticorpo biespecífico, um fragmento de anticorpo triespecífico, um fragmento de anticorpo tetraespecífico, um V-NAR, um VHh, um VL, um F(ab), um F(ab)2, uma DVD (isto é, proteína de ligação de antigénio de domínio variável duplo), uma SVD (isto é, proteína de ligação de antigénio de domínio variável único) ou um acoplador de célula T biespecífico (BiTE).
Num caso, é descrito um método para produzir uma proteína de ligação de antigénio humano, o qual n expor um animal não humano geneticamente modificado, conforme descrito no presente documento, a um antigénio de interesse, permitir que o animal não humano geneticamente modificado tenha resposta imunitária ao antigénio, obter a partir do animal não humano geneticamente modificado uma sequência de ácidos nucleicos de domínio variável de cadeia pesada que codifica um domínio variável de cadeia pesada humano que se liga especificamente ao antigénio de interesse, clonar o domínio variável de cadeia pesada sequência de ácidos nucleicos para uma sequência de região constante humana e expressar numa célula de mamífero um anticorpo que compreende a sequência domínio variável de cadeia pesada humana e a sequência de região constante humana. Num caso, a célula de mamífero é uma célula CHO. Num caso, o animal não humano geneticamente modificado contém um repertório de segmento de gene Vh humano que consiste essencialmente num segmento de gene Vh humano único, opcionalmente presente em duas ou mais variantes polimórficas do mesmo, ligadas de modo operacional a um ou mais segmentos D e/ou J humanos. Num caso, o repertório de segmento de gene Vh humano está num locus de segmento Vh não humano endógeno. Num caso, o repertório de segmento de gene Vh humano está num locus que não é um locus de segmento Vh endógeno. Num caso, o segmento de gene Vh humano é redisposto com um segmento D humano e um segmento J humano para formar um gene VDJ humano redisposto ligado de modo operacional a uma sequência de região constante, em que a sequência de região constante é selecionada a partir de uma sequência humana e uma sequência de roedor (por exemplo, uma sequência de ratinho ou rato ou hámster) . Num caso, a sequência de região constante contém uma sequência selecionada a partir de uma ChI, uma articulação, uma Ch2, uma Ch3 e uma combinação das mesmas; num caso específico, a sequência de região constante contém uma ChI, uma articulação, uma Ch2 e uma Ch3 . Num caso, o domínio variável humano e a sequência constante são expressos na célula de mamífero com um domínio variável de cadeia leve humano cognato obtido a partir do mesmo ratinho (por exemplo, sequência obtida a partir da mesma célula B que a sequência de domínio variável humano); Num caso, a sequência que codifica o domínio variável de cadeia leve humano obtido a partir do ratinho é, então, fundida com uma sequência que codifica uma sequência constante de cadeia leve humana, e a sequência de cadeia leve e a sequência de cadeia pesada são expressas na célula de mamífero.
Num caso, o antigénio de interesse é um agente patogénico que aflige indivíduos humanos, conforme descrito no presente documento.
Num caso, é descrito um método para produzir um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo que liga um antigénio de interesse, o qual inclui expressar numa célula única (a) uma primeira sequência VH de um animal não humano imunizado, conforme descrito no presente documento, em que a primeira sequência Vh é fundida com uma sequência de gene Ch; e (b) uma sequência de gene Vl de um animal não humano imunizado, conforme descrito no presente documento, em que a sequência de gene Vl é fundida com uma sequência de gene Cl humano; manter a célula sob condições suficientes para expressar um anticorpo; e isolar o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo. Num caso, a sequência de gene Vl é cognata com a primeira sequência Vh.
Num caso, a célula contém uma segunda sequência de gene VH de um animal não humano imunizado, conforme descrito no presente documento, em que a segunda sequência de gene Vh é fundida com uma sequência de gene Ch, em que a primeira sequência de gene Vh codifica um domínio Vh que se liga especificamente a um primeiro epítopo e a segunda sequência de gene VH codifica um domínio VH que se liga especificamente a um segundo epítopo, em que o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos.
Num caso, as sequências de região constante são todas sequências de região constante humanas. Num caso, o antigénio de interesse é um agente patogénico que aflige indivíduos humanos, conforme descrito no presente documento.
Num caso, é descrito um método para fazer um anticorpo biespecífico humano, o qual inclui produzir o anticorpo biespecífico com a utilização de sequências de gene de região variável humana de células B de um animal não humano, conforme descrito no presente documento.
Num caso, o método inclui (a) identificar um linfócito selecionado de modo clonal do animal não humano, em que o animal não humano foi exposto a um antigénio de interesse e permitiu-se que o mesmo desenvolvesse uma resposta imunitária ao antigénio de interesse, e em que o linfócito expressa um anticorpo que se liga especificamente ao antigénio de interesse, (b) obter a partir do linfócito ou do anticorpo uma sequência de nucleótidos que codifica uma região variável de cadeia pesada humana que se liga especificamente ao antigénio de interesse, e (c) empregar a sequência de nucleótidos que codifica a região variável de cadeia pesada humana que se liga especificamente ao antigénio de interesse na produção de anticorpo biespecifico. Num caso especifico, a região variável de cadeia pesada humana contém um segmento de gene Vh1-2 ou Vh1-69 redisposto.
Num caso, as etapas (a) a (c) são realizadas uma primeira vez para um primeiro antigénio de interesse para gerar uma primeira sequência de região variável de cadeia pesada humana, e as etapas (a) a (c) são realizadas uma segunda vez para um segundo antigénio de interesse para gerar uma segunda sequência de região variável de cadeia pesada humana, e em que a primeira sequência de região variável de cadeia pesada humana é expressa fundida com uma primeira região constante de cadeia pesada humana para formar uma primeira cadeia pesada humana, a segunda sequência de região variável de cadeia pesada humana é expressa fundida com uma segunda região constante de cadeia pesada humana para formar uma segunda cadeia pesada humana, em que a primeira e a segunda cadeias pesadas humanas são expressas na presença de uma cadeia leve humana única expressa a partir de um segmento de gene Vk3-20 humano ou Vk1-39 humano redisposto. Num caso especifico, a única cadeia leve humana contém uma sequência de linha germinal.
Num caso, o método inclui (a) clonar regiões variáveis de cadeia pesada de células B de um animal não humano, conforme descrito no presente documento, que foi exposto a um primeiro antigénio de interesse, e o mesmo animal não humano, ou um animal não humano diferente que é geneticamente o mesmo e que foi exposto a um segundo antigénio de interesse; e (b) expressar numa célula as regiões variáveis de cadeia pesada de (a) com a mesma região constante de cadeia pesada e a mesma cadeia leve para produzir um anticorpo biespecifico.
Num caso, é descrita a utilização de um animal não humano, conforme descrito no presente documento, para obter uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável de cadeia pesada humano. Num caso, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene Vh humano redisposto selecionado a partir de Vh1-2 e Vh1-69.
Num caso, é descrita uma utilização de um animal não humano conforme descrito no presente documento para obter uma célula que codifica um domínio variável de cadeia pesada humano. Num caso, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene Vh humano redisposto selecionado a partir de VHl-2 e VHl-69.
Num caso, é descrita a utilização de um animal não humano conforme descrito no presente documento para produzir um domínio variável de anticorpo humano. Num caso, o domínio variável contém um segmento de gene Vh humano redisposto selecionado a partir de VHl-2 e VHl-69.
Num caso, é descrita a utilização de um animal não humano conforme descrito no presente documento para produzir um anticorpo humano, o que incluir fazer o anticorpo com o uso de sequências de gene de região variável humana de células B de um animal não humano, conforme descrito no presente documento. Num caso, o anticorpo humano é um anticorpo biespecifico humano. Num caso específico, o anticorpo biespecifico contém um domínio variável de cadeia pesada derivado de um segmento de gene Vh1-2 ou Vh1-69 humano redisposto. Num caso, as sequências de gene de região variável humana contêm um segmento de gene Vh1-2 ou Vh1-69 humano redisposto.
Num caso, é descrita a utilização de um animal não humano conforme descrito no presente documento para selecionar um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Num caso, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene VH humano redisposto selecionado a partir de Vh1-2 e VHl-69.
Num caso, é descrita a utilização do ratinho, conforme descrito no presente documento, para o fabrico de um medicamento (por exemplo, uma proteína de ligação de antigénio) ou para o fabrico de uma sequência que codifica uma sequência variável de um medicamento (por exemplo, uma proteína de ligação de antigénio), para o tratamento de uma doença ou distúrbio humano. Num caso, a sequência variável de um medicamento contém um segmento de gene Vh humano polimórfico. Num caso, a sequência variável de um medicamento contém um segmento de gene Vh1-69 humano. Num caso, a sequência variável de um medicamento contém um segmento de gene Vh1-2 humano.
Num caso, é descrito um construto de ácido nucleico que codifica um domínio variável de imunoglobulina feito num ratinho, conforme descrito no presente documento. Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia pesada. Num caso específico, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene Vh humano redisposto selecionado a partir de Vh1-2, Vh1-69, Vh2-26, Vh2-70 ou Vh3-23. Noutro caso específico, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene Vh1-2 humano redisposto. Noutro caso específico, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto.
Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia leve. Num caso específico, o domínio variável é um domínio variável de cadeia leve κ que é cognato com um domínio variável de cadeia pesada humano que contém um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto. Num caso específico, o domínio variável é um domínio variável de cadeia leve κ que é cognato com um domínio variável de cadeia pesada humano que contém um segmento de gene Vh1-2 humano redisposto.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho conforme descrito no presente documento para produzir uma construção de ácido nucleico que codifica um domínio variável de imunoglobulina humana. Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia leve. Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia leve κ que contém um segmento de gene Vk humano redisposto selecionado a partir de Vk4-1, Vk5-2, Vk7-3, Vk2-4, Vk1-5, Vk1-6, Vk3-7, Vk1-8, Vxl-9, Vk2-10, Vk3-11, Vk1-12, Vk1-13, Vk2-14, Vk3-15, VkI-16, Vk1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6-21, Vk1-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33, Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, Vxl-37, Vk2-38, Vk1-39 e Vk2-40.
Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia pesada. Num caso específico, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene Vh humano redisposto selecionado a partir de VHl-2, Vh1-69, Vh2-26, Vh2-70 ou Vh3-23. Num caso específico, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto. Num caso específico, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene Vh1-2 humano redisposto.
Num caso, é descrita a utilização de um ratinho, conforme descrito no presente documento, para produzir um domínio variável de imunoglobulina humana. Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia leve. Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia leve κ que contém um segmento de gene Vk humano redisposto selecionado a partir de Vk4-1, Vk5-2, Vk7-3, Vk2-4, Vk1-5, Vk1-6, Vk3-7, Vk1-8, Vk1-9, Vk2-10, Vk3-11, Vk1-12, VkI-13, Vk2-14, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6-21, Vxl-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33, Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, VkI-37, Vk2-38, Vk1-39 e Vk2-40.
Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia pesada. Num caso específico, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene VH humano redisposto selecionado a partir de Vh1-2, Vh1-69, Vh2-26, Vh2-70 ou Vh3-23. Num caso específico, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto. Num caso específico, o domínio variável de cadeia pesada contém um segmento de gene Vh1-2 humano redisposto.
Num caso, é descrita a utilização de um animal não humano, conforme descrito no presente documento, para produzir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável de cadeia pesada humano. Num caso, o domínio variável de cadeia pesada humano é caracterizado por ter sequências FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 humanas que são derivadas de um segmento de gene Vh humano polimórfico. Num caso específico, o segmento de gene VH humano é selecionado a partir de um segmento de gene Vh1-2, Vh1-69, Vh2-26, Vh2-70 ou Vh3-23 humano. Num caso, o segmento de gene VH humano é um segmento de gene Vh1-69 humano. Num caso, o segmento de gene Vh humano é um segmento de gene Vh1-2 humano.
Num caso, é descrito um método para produzir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio Vh humano, sendo que o método inclui imunizar um animal não humano conforme descrito no presente documento com um antigénio de interesse, permitir que o animal não humano tenha uma resposta imunitária ao antigénio de interesse e obter a partir do mesmo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio Vh humano que se liga ao antigénio de interesse. Num caso, o método inclui adicionalmente produzir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio Vl humano que é cognato com o domínio Vh humano, que inclui isolar uma célula B que codifica o domínio Vh humano e o domínio Vl humano, e obter a partir do mesmo a sequência dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve. Em vários casos, o domínio VH humano é derivado de um segmento de gene VHl-69 humano redisposto ou Vh1-2 humano. Em vários casos, o domínio Vl humano é selecionado a partir de um domínio Vk humano ou VX humano.
Num caso, é descrita a utilização de um animal não humano, conforme descrito no presente documento, para produzir um produto terapêutico humano, a qual inclui imunizar o animal não humano com um antigénio de interesse, permitir que o animal não humano tenha uma resposta imunitária e obter a partir do animal uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável de imunoglobulina que se liga ao antigénio de interesse e empregar o domínio variável de imunoglobulina num produto terapêutico humano. Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia pesada. Num caso específico, o domínio variável de cadeia pesada é derivado de um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto ou Vh1-2 humano. Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia leve. Num caso específico, o domínio variável de cadeia leve é derivado de um segmento de gene Vk humano redisposto ou VX humano.
Num caso, é descrito um método para produzir um produto terapêutico humano, o qual inclui imunizar o animal não humano, conforme descrito no presente documento, com um antigénio de interesse, permitir que o animal não humano tenha uma resposta imunitária e obter a partir do animal uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável de imunoglobulina que se liga ao antigénio de interesse e empregar o domínio variável de imunoglobulina num produto terapêutico humano. Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia pesada. Num caso específico, o domínio variável de cadeia pesada é derivado de um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto ou Vh1~2 humano. Num caso, o domínio variável é um domínio variável de cadeia leve. Num caso específico, o domínio variável de cadeia leve é derivado de um segmento de gene Vk humano redisposto ou VÀ humano.
Num caso, é descrito um método para produzir uma proteína de ligação de antigénio humano, o qual inclui imunizar um animal não humano, conforme descrito no presente documento, com um antigénio de interesse, permitir que o animal tenha uma resposta imunitária, obter a partir do ratinho uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável de imunoglobulina que se liga especificamente ao antigénio de interesse, clonar a sequência de ácidos nucleicos num vetor adequado para expressão do ácido nucleico, em que a sequência de ácidos nucleicos é clonada num quadro com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região constante de imunoglobulina humana ou fragmento funcional da mesma e inserir o vetor numa célula de mamífero, e manter a célula sob condições adequadas para expressar uma proteína de ligação de antigénio que contém o domínio variável de imunoglobulina e a região constante de imunoglobulina ou fragmento funcional da mesma. Num caso, a proteína de ligação de antigénio é um anticorpo humano. Num caso específico, o anticorpo contém um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve obtido a partir de um ratinho, conforme descrito no presente documento. Num caso específico, o anticorpo contém iam domínio variável de cadeia pesada obtido a partir de um ratinho, conforme descrito no presente documento. Em vários casos, o domínio variável de cadeia pesada é derivado de um segmento de gene VHl-69 humano redisposto ou VHl-2 humano.
Num caso, é descrita uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio de ligação de antigénio humano feito num animal não humano, conforme descrito no presente documento. Num caso, a sequência de ácidos nucleicos codifica um domínio Vh de imunoglobulina humana. Num caso, a sequência de ácidos nucleicos codifica um domínio Vh de imunoglobulina humana e um domínio Vl humano cognato. Em vários casos, o domínio Vh humano é derivado de um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto ou VHl-2 humano.
Num caso, é descrito um método para a preparação de um anticorpo humano, o qual inclui imunizar um animal não humano, conforme descrito no presente documento, com um antigénio de interesse, permitir que o animal não humano tenha uma resposta imunitária, colher um linfócito (por exemplo, uma célula B) do animal imunizado, fundir o linfócito com uma célula de mieloma para formar uma célula de hibridoma, obter a partir da célula de hibridoma uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio Vh humano e um domínio Vl humano, clonar a sequência de ácidos nucleicos no quadro (isto é, em ligação operacional) com uma sequência de região constante humana para criar uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina e expressar as cadeias pesada e leve numa célula com capacidade para expressar o anticorpo completamente humano. Num caso, a célula é uma célula CHO. Em vários casos, o domínio Vh humano é derivado de um segmento de gene VHl-69 humano redisposto ou um segmento de gene Vh1-2 humano.
Num caso, é descrito um método para a preparação de um anticorpo humano, o qual inclui imunizar um animal não humano, conforme descrito no presente documento, com um antigénio de interesse, permitir que o animal não humano tenha uma resposta imunitária, colher um linfócito (por exemplo, uma célula B) do animal imunizado, obter a partir do linfócito uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio Vh humano e um domínio Vl humano, clonar a sequência de ácidos nucleicos no quadro (isto é, em ligação operacional) com uma sequência de região constante humana para criar uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina e expressar as cadeias pesada e leve numa célula com capacidade para expressar o anticorpo completamente humano. Num caso, o linfócito é derivado do baço do animal não humano. Num caso, a célula é uma célula CHO. Em vários casos, o domínio Vh humano é derivado de um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto ou um segmento de gene VHl-2 humano.
Em vários casos, o antigénio de interesse é um agente patogénico que aflige indivíduos humanos, conforme descrito no presente documento. Em vários casos, o antigénio de interesse é um vírus que tem capacidade para infetar um humano. Os antigénios exemplificativos que podem ser empregues nos métodos e utilizações descritos no presente documento incluem micróbios ou micro-organismos, como um virus, bactéria, prião, ou fungo ou qualquer outro agente patogénico que causa a doença em humanos. Um perito na especialidade, mediante leitura da divulgação, notará que esses agentes patogénicos humanos serão aplicáveis para os métodos e utilizações descritos no presente documento. Os vários casos têm capacidade para utilização conjunta, a menos que expressamente declarado de outro modo ou que o contexto proíba claramente a utilização conjunta.
Breve descrição de figuras A Figura 1 mostra uma ilustração geral, não em escala, de uma série de etapas de direcionamento e modificação molecular empregues para produzir um vetor de direcionamento para a construção de um locus de cadeia pesada modificado que contém um segmento de gene VHl-69 humano único, vinte e sete segmentos de gene DH humano e seis segmentos de gene Jh humano num locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena. A Figura 2 mostra uma ilustração geral, não em escala, de uma série de etapas de direcionamento e modificação molecular empregues para produzir um vetor de direcionamento para a construção de um locus de cadeia pesada modificado que contém um segmento de gene Vh1-2 humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano num locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena. A Figura 3 mostra traçados de contorno de esplenócitos sincronizados com linfócitos únicos e corados para CD19 (célula B) e CD3 (célula T) de um ratinho do tipo selvagem (WT) e um ratinho homozigótico para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO) . A Figura 4A mostra, à esquerda, a percentagem de células B CD19+ em baços colhidos a partir de ratinhos do tipo selvagem (WT) e ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene DH humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO). À direita, o número de células B CD19+ por baço é mostrado tanto para os ratinhos do tipo selvagem (WT) quanto para ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO) . A Figura 4B mostra, à esquerda, a percentagem de células B CD19+ em medula óssea colhida a partir de fémures de ratinhos do tipo selvagem (WT) e ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene DH humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO). À direita, o número de células B CD19+ por fémur é mostrado tanto para os ratinhos do tipo selvagem (WT) quanto para ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO) . A Figura 5 mostra traçados de contorno de esplenócitos sincronizados com células B CD19+ de linfócitos e corados para expressão de IgÀ+ e Igx+ de um ratinho do tipo selvagem (WT) e um ratinho homozigótico para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO) . A Figura 6 mostra traçados de contorno de esplenócitos sincronizados com células B CD19+ de linfócitos e corados para imunoglobulina D (IgD) e imunoglobulina M (IgM) de um ratinho do tipo selvagem (WT) e um ratinho homozigótico para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene DH humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO). A Figura 7 mostra o número total de células B de transição (CDl9+IgMhiIgDint) , células B maduras (CDl9+IgMintIgDhi) e a razão entre células B maduras e imaturas em baços colhidos de ratinhos do tipo selvagem (WT) e ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO) . A Figura 8 mostra traçados de contorno de medula óssea sincronizadas em singletos corados para imunoglobulina M (IgM) e B220 de um ratinho do tipo selvagem (WT) e um ratinho homozigótico para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO) . A Figura 9 mostra o número total de células B imaturas (B220intIgM+) e maduras (B220hiIgM+) na medula óssea isolada dos fémures de ratinhos do tipo selvagem (WT) e ratinhos homozigótico para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO) . A Figura 10 mostra traçados de contorno de medula óssea sincronizados em células B CD19+ e corados para ckit+ e CD43+ de um ratinho do tipo selvagem (WT) e a ratinho homozigótico para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO). A Figura 11A mostra a percentagem de células CD19+ em populações de células pró-B (CDl 9+CD43+ckit+) e pré-B (CDl9+CD43_ckit“) em medula óssea colhida dos fémures de ratinhos do tipo selvagem (WT) e ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene DH humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO) . A Figura 11B mostra o número absoluto de células por fémur em populações de células pró-B (CDl9+CD43+ckit+) e pré-B (CD19+CD43_ckit_) em medula óssea colhida de ratinhos do tipo selvagem (WT) e ratinhos homozigóticos para um segmento de gene VH humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO) . A Figura 12 mostra a expressão de ARNm relativa (eixo geométrico y) em células B esplénicas purificadas de cadeias pesadas derivadas de VHl-69 num ensaio PCR quantitativo com utilização de uma sonda específica para o segmento de gene Vh1-69 humano em ratinhos homozigóticos para uma substituição da cadeia pesada VH, Dh, Jh endógena e uma substituição dos segmentos de gene Vk e Jk de cadeia leve endógena por segmentos de gene VH, Dh, Jh, Vk e Jk humanos (Hk), ratinhos do tipo selvagem (WT), ratinhos heterozigóticos para um segmento de gene Vh humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HET) e ratinhos homozigóticos para um segmento de gene VH humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVH HO). Os sinais são normalizados para expressão de Ck de ratinho. A Figura 13 mostra o alinhamento de nucleótido do segundo exão para cada um dos treze alelos relatados para o gene VhI-69 humano. As bases em letras minúsculas indicam as diferenças de nucleótido de linha germinal de entre os alelos. As regiões de determinação complementar (CDRs) são indicadas com caixas em torno da sequência. As linhas indicam vãos artificiais para o alinhamento de sequência apropriado. Vh1-69*01 (SEQ ID NO: 34); VHl-69*02 (SEQ ID NO: 36); VH1- 69*03 (SEQ ID NO: 38); VHl-69*04 (SEQ ID NO: 40); VHl-69*05 (SEQ ID NO: 42); VHl-69*06 (SEQ ID NO: 44); VHl-69*07 (SEQ ID NO: 46); VHl-69*08 (SEQ ID NO: 48); VHl-69*09 (SEQ ID NO: 50); Vh1-69*10 (SEQ ID NO: 52); VH1-69*11 (SEQ ID NO: 54); Vh1-69*12 (SEQ ID NO: 56); VH1-69*13 (SEQ ID NO: 58). A Figura 14 mostra o alinhamento de proteína da sequência de gene variável de cadeia pesada madura para cada um de entre os treze alelos relatados para o gene Vh1-69 humano. Os aminoácidos em letra minúscula indicam as diferenças de linha germinal entre os alelos. As regiões de determinação complementar (CDRs) são indicadas com caixas em torno da sequência. As linhas indicam lacunas artificiais para o alinhamento de sequência apropriado. VH1-69*01 (SEQ ID NO: 35); Vh1-69*02 (SEQ ID NO: 37); VHl-69*03 (SEQ ID NO: 39); Vh1-69*04 (SEQ ID NO: 41); VHl-69*05 (SEQ ID NO: 43); VH1-69*06 (SEQ ID NO: 45); VHl-69*07 (SEQ ID NO: 47); VHl-69*08 (SEQ ID NO: 49); VHl-69*09 (SEQ ID NO: 51); VH1-69*10 (SEQ ID NO: 53); VH1-69*11 (SEQ ID NO: 55); VH1-69*12 (SEQ ID NO: 57); VH1-69*13 (SEQ ID NO: 59). A Figura 15 mostra uma percentagem de identidade/percentagem de matriz de semelhança para as sequências de proteína alinhadas do gene variável maduro para cada um dos treze alelos relatados para o gene Vh1-69 humano. A identidade de percentagem entre os alelos Vh1-69 é indicada acima nas caixas sombreadas e a percentagem de semelhança é indicada abaixo nas caixas sombreadas. As contagens para identidade percentual e semelhança percentual foram marcadas por uma ferramenta de alinhamento ClustalW (vl.83) com a utilização do software MacVector (MacVector, Inc., Carolina do Norte). A Figura 16 mostra o alinhamento de nucleótido do segundo exão para cada um de entre os cinco alelos relatados para o gene Vh1-2 humano. As bases em letras minúsculas indicam as diferenças de nucleótido de linha germinal entre os alelos. As regiões de determinação complementar (CDRs) são indicadas com caixas em torno da sequência. As linhas indicam lacunas artificiais para o alinhamento de sequência apropriado. VhI-2*01 (SEQ ID NO: 60); VHl-2*02 (SEQ ID NO: 62); VHl-2*03 (SEQ ID NO: 64); VHl-2*04 (SEQ ID NO: 66); VHl-2*05 (SEQ ID NO: 68). A Figura 17 mostra o alinhamento de proteína da sequência de gene variável de cadeia pesada madura para cada um dos cinco alelos relatados para o gene Vh1-2 humano. Os aminoácidos em letra minúscula indicam as diferenças de linha germinal entre os alelos. As regiões de determinação complementar (CDRs) são indicadas com caixas em torno da sequência. As linhas indicam lacunas artificiais para o alinhamento de sequência apropriado. Vh1-2*01 (SEQ ID NO: 61); Vh1-2*02 (SEQ ID NO: 63); VHl-2*03 (SEQ ID NO: 65); Vh1-2*04 (SEQ ID NO: 67); VHl-2*05 (SEQ ID NO: 69). A Figura 18 mostra uma percentagem de identidade/percentagem de matriz de semelhança para as sequências de proteína alinhadas do gene variável maduro para cada um dos cinco alelos relatados para o gene Vh1-2 humano. A identidade de percentagem -entre os alelos Vh1-2 é indicada acima nas caixas sombreadas e a percentagem de semelhança é indicada abaixo nas caixas sombreadas. As contagens para identidade percentual e semelhança percentual foram marcadas por uma ferramenta de alinhamento ClustalW (vl.83) com a utilização do software MacVector (MacVector, Inc., Carolina do Norte). A Figura 19 mostra a titulação do anticorpo de ratinhos homozigóticos para loci de gene variável de cadeia pesada humana e leve κ humana (Hk; n=4) e ratinhos homozigóticos para um segmento de gene VHl-69 humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVHHO; n=10) que foram imunizados com um recetor de superfície de célula humana (antigénio A). A Figura 20 mostra o título de anticorpo de ratinhos homozigóticos para loci de gene variável de cadeia pesada humana e leve κ humana (Hk; n=5) e ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh1-69 humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena (lhVHHO; n=5) que foram imunizados com duas vacinas diferentes contra influenza. A Figura 21 mostra a percentagem (eixo geométrico y) de cadeias pesadas com células apresentadoras de IgM que têm um comprimento de aminoácido especificado para a região VH CDR3 (eixo geométrico x) de ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh1-69 humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena e homozigótico para uma substituição dos loci variáveis de cadeia leve κ endógena por loci variáveis de cadeia leve κ humana que foram imunizados com um recetor de superfície de célula humana (antigénio A). A Figura 22 mostra a percentagem (eixo geométrico y) de cadeias pesadas com células apresentadoras de IgG que têm um comprimento de aminoácido especificado para a região VH CDR3 (eixo geométrico x) de ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh1-69 humano único, vinte e sete segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena e homozigótico para uma substituição dos loci variáveis de cadeia leve κ endógena por loci variáveis de cadeia leve κ humana que foram imunizados com um recetor de superfície de célula humana (antigénio A).
Descrição detalhada A presente invenção não é limitada a métodos particulares e condições experimentais descritas, visto que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia utilizada no presente documento é com o propósito de descrever apenas casos particulares e não é destinada a ser limitativa, visto que o âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações. A menos que definido de outra forma, todos os termos e frases utilizados no presente documento incluem os significados que os termos e as frases adquiriram na técnica, a menos que o contrário esteja claramente indicado ou claramente evidente a partir do contexto no qual o termo ou a frase é utilizado. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais particulares são descritos agora. A expressão "substancial" ou "substancialmente", quando utilizada para se referir a uma quantidade de segmentos de gene (por exemplo, "substancialmente todos" os segmentos de gene V) inclui tanto os segmentos de gene funcional quanto não funcional e incluem, em vários casos, por exemplo, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais de todos os segmentos de gene; em vários casos, "substancialmente todos" os segmentos de gene inclui, por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos segmentos de gene funcional (isto é, não pseudogene). O termo "substituição" inclui o facto de uma sequência de ADN ser colocada num genoma de uma célula de maneira a substituir uma sequência no genoma por uma sequência heteróloga (por exemplo, uma sequência humana num ratinho), no locus da sequência genómica. A sequência de ADN então colocada pode incluir uma ou mais sequências reguladoras que são parte de ADN de fonte utilizado para obter a sequência então colocada (por exemplo, promotores, acentuadores, regiões não traduzidas 5'- ou 3'-, sequências de sinal de recombinação apropriada, etc.). Por exemplo, em vários casos, a substituição é uma substituição de uma sequência endógena por uma sequência heteróloga que resulta na produção de um produto de gene da sequência de ADN então colocada (que contém a sequência heteróloga), mas não a expressão da sequência endógena; a substituição é de uma sequência genómica endógena por uma sequência de ADN que codifica uma proteína que tem uma função semelhante a uma proteína codificada pela sequência genómica endógena (por exemplo, a sequência genómica endógena codifica um gene ou domínio de imunoglobulina, e o fragmento de ADN codifica um ou mais genes ou domínios de imunoglobulina humana). Em vários casos, um gene ou fragmento endógeno do mesmo é substituído por um gene humano correspondente ou fragmento do mesmo. Um gene ou fragmento humano correspondente do mesmo é um gene ou fragmento humano que é um ortólogo, um homólogo, ou é substancialmente idêntico ou o mesmo em estrutura e/ou função, como o gene ou fragmento endógeno do mesmo que é substituído.
Foi realizada uma substituição in situ precisa de seis megabases das regiões variáveis dos loci de imunoglobulina de cadeia pesada de ratinho (Vh-Dh-Jh) por um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana restrita, enquanto as sequências de ratinho de flanqueamento foram deixadas intactas e funcionais dentro dos loci híbridos, incluindo todos os genes de cadeia constante de ratinho e regiões de controlo de transcrição de locus (Figura 1 e Figura 2) . Especificamente, um segmento de gene Vh humano, 27 segmentos de gene Dh e seis segmentos de gene Jh foram introduzidos através de vetores de direcionamento de BAC quiméricos em células ES de ratinho com a utilização de tecnologia de modificação genética VELOCIGENE® (veja-se, por exemplo, a Patente n° U.S. 6.586.251 e Valenzuela et al.r 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652 a 659).
Animais não humanos com segmentos de gene de Vh de imunoglobulina restrita São descritos animais não humanos que contêm loci de imunoglobulina que contêm um número restrito de genes Vh, e um ou mais genes D e um ou mais genes J, assim como os métodos para produzir e utilizar os mesmos. Quando imunizado com um antigénio de interesse, os animais não humanos geram populações de célula B com regiões variáveis de anticorpo derivadas apenas do gene Vh pré-selecionado restrito ou conjunto de genes Vh (por exemplo, um gene VH pré-selecionado e variantes do mesmo). Em vários casos, são fornecidos animais não humanos, os quais geram populações de célula B que expressam domínios variáveis de anticorpo humano que são domínios variáveis de cadeia pesada humana, juntamente com domínios variáveis de cadeia leve humana cognata. Em vários casos, os animais não humanos redispõem segmentos de gene variáveis de cadeia pesada humana e segmentos de gene variáveis de cadeia leve humana a partir de loci de imunoglobulina de ratinho endógeno modificado que contêm uma substituição ou inserção das sequências de região variável não redispostas não humanas por sequências de região variável não redispostas humanas. O trabalho inicial da organização, estrutura e função dos genes de imunoglobulina foi feito, em parte, em ratinhos com loci endógeno com incapacidade e projetado para ter loci transgénicos (aleatoriamente colocados) com genes de imunoglobulina humana parcial, por exemplo, um repertório parcial de genes de cadeia pesada humana ligado a um gene constante humano, aleatoriamente inserido no genoma, na presença ou ausência de um transgene de cadeia leve humana. Embora esses ratinhos tenham sido menos que ideais de algum modo para produzir anticorpos de afinidade alta úteis, os mesmos facilitaram certas análises funcionais de loci de imunoglobulina. Alguns destes ratinhos tinham dois ou três, ou até mesmo apenas um, gene variável de cadeia pesada.
Os ratinhos que expressam cadeias pesadas de imunoglobulina completamente humana derivadas de um gene Vh5-51 humano único e 10 genes Dh humanos e seis genes Jh humanos, com genes constantes μ e γΐ humanos, num transgene aleatoriamente inserido (e loci de imunoglobulina endógena com incapacidade) foram relatados (Xu e Davis, 2000, Diversity in the CDR3 Region of VH Is Sufficient for Most Antibody Specificities, Immunity 13:37 a 45). As cadeias de pesadas de imunoglobulina completamente humana desses ratinhos são principalmente expressas com uma de apenas duas cadeias leves λ completamente de ratinho derivadas do locus de cadeia leve λ de ratinho endógeno (VÀl-JÀl ou VÀ2-JX2 apenas), e pode não expressar cadeia leve κ (os ratinhos são IgK-/_) . Esses ratinhos exibem disfunção severamente anormal no desenvolvimento de célula B e expressão de anticorpo. Os números de célula B são supostamente 5 a 10% do tipo selvagem, niveis de IgM de 5 a 10% do tipo selvagem e niveis de IgGl são apenas 0,1 a 1% do tipo selvagem. O repertório de IgM observado revelou diversidade de junção altamente restrita. As cadeias pesadas completamente humanas exibem um comprimento de CDR3 amplamente idêntico ao longo dos antigénios, a mesma utilização de Jh (Jh2) ao longo dos antigénios e um resíduo Q de junção inicial, refletindo, desse modo, certa falta de diversidade de CDR3. As cadeias leves λ completamente de ratinho tinham aproximadamente uma substituição de W96L em JXl como resíduo de junção inicial. Os ratinhos são supostamente incapazes de gerar quaisquer anticorpos contra polissacárido bacteriano. Devido aos domínios variáveis humanos se acoplarem a cadeias leves de ratinho, a utilidade das regiões variáveis humanas é altamente limitada.
Outros ratinhos que têm apenas um gene VH3-23 humano único, genes Dh e Jh humanos e genes de cadeia de ratinho foram relatados, mas exibem uma diversidade limitada (e, desse modo, uma utilidade limitada) em parte devido ao potencial desemparelhamento entre os domínios Vh humano e Vl de ratinho (veja-se, por exemplo, Mageed et al., 2001, Rearrangement of the human heavy chain variable region gene V3-23 in transgenic mice generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of VhCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain variable region, Clin. Exp. Immunol. 123:1 a 5) . De modo semelhante, os ratinhos que têm dois genes Vh (3-23 e 6-1) juntamente com genes Dh e Jh humanos num transgene que contém o gene constante μ humano (Bruggemann et al., 1991, Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus, Eur. J. Immmunol. 21:1323 a 1326) e expressam os mesmos em cadeias de IgM humana com cadeias leves de ratinho podem exibir um repertório limitado por desemparelhamento (Mackworth-Young et al., 2003, The role of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene, Clin. Exp. Immunol. 134:420 a 425).
Outros ratinhos transgénicos que expressam cadeias pesadas completamente humanas restritas Vh de um transgene humano aleatoriamente inserido no genoma, com um repertório λ humano limitado expressado a partir de um transgene aleatoriamente inserido completamente humano, também foram relatados (veja-se, por exemplo, Taylor et al., 1992, A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins, Nucleic Acids Res. 20(23):6287 a 6295; Wagner et al., 1994, Antibodies generated form human immunoglobulin miniloci in transgenic mice, Nucleic Acids Res. 22(8):1389 a 1393). No entanto, ratinhos transgénicos que expressam anticorpos completamente humanos de transgenes aleatoriamente integrados ao genoma de ratinho e que contêm loci endógenos danificados são conhecidos por exibir diferenças substanciais em resposta imunitária em comparação com ratinhos do tipo selvagem que afetam a diversidade dos domínios variáveis de anticorpo obteníveis a partir de tais ratinhos.
Os animais não humanos úteis que geram uma população diversa de células B que expressa domínios variáveis de anticorpo humano de um repertório de gene Vh restrito e um ou mais genes D e um ou mais genes J terão capacidade para gerar, preferencialmente em alguns casos, repertórios de genes de região variável redispostos que são suficientemente diversos. Em vários casos, a diversidade inclui diversidade de junção, hipermutação somática e diversidade polimórfica em sequência de gene Vh (para casos em que genes Vh estão presentes em formas polimórficas). A diversidade de combinação ocorre no emparelhamento do gene Vh com um de entre uma pluralidade de domínios variáveis de cadeia leve humana cognatos (os quais, em vários casos, compreendem diversidade de junção e/ou hipermutações somáticas).
Os animais não humanos que contêm um repertório de gene Vh humano restrito e um repertório de gene VL humano completo ou substancialmente completo vão gerar, em vários casos, as populações de células B que refletem as várias fontes de diversidade, como diversidade de junção (por exemplo, VDJ, junção VJ, adições P, adições N), diversidade combinatória (por exemplo, pesada humana restrita VH cognata, leve humana), e hipermutações somáticas. Em casos em que existe uma restrição do repertório Vh para um gene Vh humano, o um gene VH humano pode estar presente em duas ou mais variantes. Em vários casos, a presença de duas ou mais formas polimórficas de um gene VH enriquecerá a diversidade dos domínios variáveis da população de célula B.
As variações nas sequências de linha germinal de segmentos de gene (por exemplo, genes V) contribuem para a diversidade da resposta de anticorpo em humanos. A contribuição relativa para a diversidade devido às diferenças de sequência de gene V varia de entre os genes V. 0 grau de polimorfismo varia através das famílias de gene, e é refletido numa pluralidade de haplótipos (estiramentos de sequência com polimorfismos hereditários) com capacidade para gerar diversidade adicional, conforme observado em diferenças de haplótipo VH entre indivíduos relacionados e não relacionados na população humana (veja-se, por exemplo, Souroujon et al., 1989, Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes from the VhIII Gene Family, J. Immunol. 143(2):706 a 711). Foi sugerido, com base em dados de famílias de gene Vh humano particularmente polimórfico, que a diversidade de haplótipo na linha germinal é um contribuidor principal para a heterogeneidade de gene Vh na população humana, a qual é refletida na diversidade grande de genes Vh de linha germinal diferente através da população humana (veja-se, Sasso et al., 1990, Prevalence and Polymorphism of Human Vh3 Genes, J. Immunol. 145(8):2751 a 2757).
Embora a população humana exiba uma diversidade grande de haplótipos em relação ao repertório de gene VH devido ao polimorfismo espalhado, certos polimorfismos são refletidos em alelos prevalentes (isto é, conservados) observados na população humana (Sasso et al., 1990). O polimorfismo Vh pode ser descrito de duas formas fundamentais. A primeira é a variação que surge a partir da variação alélica associada a diferenças entre a sequência de nucleótidos entre os alelos do mesmo segmento de gene. A segunda surge a partir das várias duplicações, inserções e/ou deleções que ocorreram no locus de cadeia pesada de imunoglobulina. Isso resultou na situação única na qual os genes Vh derivados por duplicação de genes idênticos difere dos seus respetivos alelos por uma ou mais substituições de nucleótido. Isso também influencia diretamente o número de cópia de genes Vh no locus de cadeia pesada.
Os alelos polimórficos dos segmentos de gene variáveis de cadeia pesada (genes Vh) de imunoglobulina humana foram amplamente o resultado de inserção/eliminação de segmentos de gene e diferenças de nucleótido únicas dentro de regiões de codificação, ambas as quais têm o potencial para ter consequências funcionais na molécula de imunoglobulina. A Tabela 1 apresenta os genes Vh funcionais listados pela família de gene Vh humano e o número de alelos identificados para cada gene Vh no locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Existem algumas observações que sugerem que genes Vh polimórficos foram implicados em suscetibilidade a certas doenças como, por exemplo, artrite reumatoide, enquanto, em outros casos, uma ligação entre VH e doença foi menos clara. Essa ambiguidade foi atribuída ao número de cópia e presença de vários alelos em populações humanas diferentes. De facto, diversos genes Vh humanos demonstram variação de número de cópia (por exemplo, Vh1-2, Vh1-69, Vh2-26, Vh2-70 e Vh3-23) . Em vários casos, os ratinhos humanizados, conforme descrito no presente documento, com repertórios VH restritos contêm múltiplas variantes polimórficas de um membro de família Vh individual (por exemplo, duas ou mais variantes polimórficas de VHl-2, VHl-69, Vh2-26, Vh2-70 ou Vh3-23, ao substituir todos ou substancialmente todos os segmentos VH de ratinho funcionais num locus de ratinho endógeno) . Num caso especifico, as duas ou mais variantes polimórficas de ratinhos descritas no presente documento estão em número até e incluindo o número indicado para o membro de família Vh correspondente na Tabela 1 (por exemplo, para VHl-69, 13 variantes; para Vh1-2, cinco variantes; etc.)·
As variantes comummente observadas de genes VH humanos particulares são conhecidas na técnica. Por exemplo, um dos polimorfismos mais complexos no locus Vh pertence ao gene Vh1-69. 0 gene VHl-69 humano tem 13 alelos relatados (Sasso et al.r 1993, A fetally expressed immunoglobulin VhI gene belongs to a complex set of alleles, Journal of Clinical Investigation 91:2358 a 2367; Sasso et al., 1996, EExpression of the immunoglobulin Vh gene 51pl is proportional to its germline gene copy number, Journal of Clinical Investigation 97(9):2074 a 2080) e existe em pelo menos três haplótipos que incluem duplicações do gene VhI-69, o que resulta em múltiplas cópias do gene Vh num dado locus. Esses alelos polimórficos incluem diferenças nas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), o que pode influenciar dramaticamente a especificidade de antigénio. A Tabela 2 apresenta os alelos relatados para Vh1-69 humano e os SEQ ID NOs para o ADN e sequências de proteína das regiões variáveis de cadeia pesada madura. A Tabela 3 apresenta os alelos relatados para genes Vh1-2 humanos e as SEQ ID NOs para o ADN e sequências de proteína das regiões variáveis de cadeia pesada madura. O ADN genómico representativo e as sequências de proteína de comprimento completo de um gene Vh1-69 são apresentados na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respetivamente. A Figura 13 e a Figura 14 apresentam alinhamentos de ADN e proteína de treze alelos Vh1-69 relatados, respetivamente. O ADN representativo e as sequências de proteína de um gene Vh1-2 são apresentados na SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 61, respetivamente. A Figura 16 e a Figura 17 apresentam alinhamentos de ADN e proteína de cinco alelos Vh1-2 relatados, respetivamente. A Figura 15 e Figura 18 apresentam uma percentagem de identidade/matriz de semelhança para sequências de proteína alinhadas correspondentes a treze alelos VHl-69 humanos relatados e cinco alelos Vh1-2 humanos relatados, respetivamente. Em vários casos, o locus modificado contém um gene Vh selecionado a partir da Tabela 1, presente em dois ou mais números de cópia, em que o número de cópia inclui até e inclusive o número de alelos mostrados na Tabela 1. Num caso, o locus modificado da invenção contém um gene Vh1-69 selecionado a partir da Tabela 2, presente em dois ou mais números de cópia, em que o número de cópia inclui até e inclusive o número de alelos mostrados na Tabela 1. Num caso, o locus modificado da invenção contém um gene Vh1-2 selecionado a partir da Tabela 3, presente em dois ou mais números de cópia, em que o número de cópia inclui até e inclusive o número de alelos mostrados na Tabela 1.
Embora os casos que empregam um repertório Vh humano restrito num ratinho sejam extensivamente discutidos, outros animais não humanos que expressam um repertório Vh humano restrito também são fornecidos. Tais animais não humanos incluem qualquer um daqueles que podem ser geneticamente modificados para expressar um repertório Vh humano restrito, conforme divulgado no presente documento, incluindo, por exemplo, ratinho, rato, coelho, porco, bovino (por exemplo, vaca, touro, búfalo), veado, carneiro, cabra, galinha, gato, cão, furão, primata (por exemplo, sagui, macaco-rhesus), etc. Por exemplo, para aqueles animais não humanos para os quais células ES geneticamente modificáveis adequadas não estão prontamente disponíveis, outros métodos são empregues para produzir um animal não humano que contém a modificação genética. Tais métodos incluem, por exemplo, modificar um genoma de célula não ES (por exemplo, um fibroblasto ou uma célula pluripotente induzida) e empregar a transferência nuclear para transferir o genoma modificado para uma célula adequada, por exemplo, um oócito, e gestar a célula modificada (por exemplo, o oócito modificado) num animal não humano sob condições adequadas para formar um embrião. Os métodos para modificar um genoma de animal não humano (por exemplo, um genoma de porco, vaca, roedor, galinha, etc.) incluem, por exemplo, empregar uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou uma nuclease de efetor semelhante a ativador de descrição (TALEN) para modificar um genoma para incluir um repertório Vh humano restrito. Desse modo, num caso, um método é descrito para editar um genoma de animal não humano para incluir um repertório Vh humano restrito, o qual inclui uma etapa de editar o genoma que emprega uma ZFN ou uma TALEN para incluir não mais que um ou não mais que dois segmentos de gene Vh humano (ou variantes polimórficas dos mesmos), em que os não mais que um ou não mais que dois segmentos de gene Vh humano estão ligados de modo operacional a uma sequência de gene constante de imunoglobulina. Num caso, a sequência de gene constante é selecionada a partir de uma sequência constante de cadeia pesada humana e uma sequência constante de cadeia pesada não humana. Num caso, a sequência constante é não humana e o não mais que um ou não mais que dois segmentos de gene VH humanos são ligados de modo operacional à sequência de gene constante não humano num locus de imunoglobulina não humana endógena.
Num caso, o animal não humano é um mamífero pequeno, por exemplo, da superfamília Dipodoidea ou Muroidea. Num caso, o animal geneticamente modificado é um roedor. Num caso, o roedor é selecionado entre um ratinho, um rato e um hámster. Num caso, o roedor é selecionado dentro da superfamília
Muroidea. Num caso, o animal geneticamente modificado é de uma família selecionada a partir de Calomyscidae (por exemplo, hámsteres semelhantes a ratinho), Cricetidae (por exemplo, hámsters, ratos e ratinhos do Novo Mundo, ratos-do-campo), Muridae (ratinhos e ratos verdadeiros, gerbos, ratinhos espinhosos, ratos com crista), Nesomyidae (ratinhos escaladores, ratinhos de rocha, ratos de cauda branca, ratos e ratinhos malgaxe), Platacanthomyidae (por exemplo, arganazes espinhosos) e Spalacidae (por exemplo, ratos-toupeira, ratos de bambu e zokors). Num caso específico, o roedor geneticamente modificado é selecionado a partir de um ratinho ou rato verdadeiro (família Muridae), um gerbil, um ratinho espinhoso e um rato com crista. Num caso, o ratinho geneticamente modificado é de um membro da família Muridae.
Num caso, o animal não humano é um roedor que é um ratinho de uma estirpe C57BL. Num caso, a estirpe C57BL é selecionada a partir de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6N, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr e C57BL/01a. Em outro caso, o ratinho é da estirpe 129. Num caso, a estirpe 129 é selecionada a partir do grupo que consiste em 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por exemplo, 129S1/SV, 129Sl/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (veja-se, por exemplo, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, veja também, Auerbach et al. (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). Num caso, o ratinho geneticamente modificado é de uma mistura de estirpes 129 supracitadas e uma estirpe C57BL supracitada (por exemplo, a C57BL/6 estirpe). Em outro caso, o ratinho é de uma mistura de estirpes 129 supracitadas, ou uma mistura de estirpes C57BL/6 supracitadas. Num caso, a estirpe 129 da mistura é uma estirpe 129S6 (129/SvEvTac). Em outro caso, o ratinho é de uma mistura de uma estirpe 129/SvEv-e uma estirpe derivada de C57BL/6-. Num caso específico, o ratinho é de uma mistura de uma estirpe 129/SvEv- e uma estirpe derivada de C57BL/6-, conforme descrito em Auerbach et al. 2000 BioTechniques 29:1024 a 1032. Em outro caso, o ratinho é da estirpe BALB, por exemplo, BALB/estirpe c. Em outro caso, o ratinho é da mistura de uma estirpe BALB (por exemplo, BALB/estirpe c) e outra estirpe supracitada.
Num caso, o animal não humano é um rato. Num caso, o rato é selecionado a partir de um rato Wistar, uma estirpe LEA, uma estirpe Sprague Dawley, uma estirpe Fischer, F344, F6 e Dark Agouti. Num caso, a estirpe de rato é uma mistura de dois ou mais de entre uma estirpe selecionada a partir do grupo que consiste em Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 e Dark Agouti.
Tabela 1
Tabela 2
Tabela 3
Utilização de gene Vh dependente de antigénio A utilização preferencial dependente de antigénio de genes VH pode ser explorada no desenvolvimento de produtos terapêuticos humanos que focam em antigénios clinicamente significativos. A habilidade para gerar um repertório de domínios variáveis de anticorpo com a utilização de um gene Vh particular pode fornecer uma vantagem significativa na busca por domínios variáveis de anticorpo de afinidade alta para utilização em produtos terapêuticos humanos. Os estudos em utilização de gene Vh humano e de ratinho não exposto em domínios variáveis de anticorpo divulgam que a maioria dos domínios variáveis de cadeia pesada não é derivada de qualquer gene Vh único particular ou utilizado de modo dominante. Por outro lado, os estudos de resposta de anticorpo a certos antigénios divulgam que, em alguns casos, uma resposta de anticorpo particular exibe uma utilização desviada de um gene Vh particular no repertório de célula B que segue a imunização.
Embora o repertório Vh humano seja diverso, é estimada a frequência esperada de utilização de qualquer dado gene Vh, supondo-se que a seleção aleatória de genes Vh seja de cerca de 2% (Brezinschek et al., 1995, Analysis of the Heavy Chain Repertoire of Human Peripheral B Cells Using Single-Cell Polymerase Chain Reaction, <7. Immunol. 155:190 a 202). Mas a utilização de Vh em células B periféricas em humanos é distorcida. Num estudo, a abundância de gene V funcional seguiu o padrão VH3 > VH4 > VH1 > VH2 > VH5 > VH6 (Davidkova et al., 1997, Selective Usage of Vh Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol. 45:62 a 73). Urn estudo inicial estimou que a frequência de utilização de família Vh3 foi de cerca de 0,65, enquanto a frequência de utilização de família VhI foi de cerca de 0,15; essas e outras observações sugerem que a complexidade de linha germinal do repertório VH humano não é precisamente refletida no compartimento de célula B periférico em humanos que têm um repertório VH de linha germinal normal, uma situação que é semelhante àquela observada no ratinho — isto é, a expressão de gene VH é não estocástica (Zouali e These, 1991, Probing VH Gene-Family Utilization in Human Peripheral B Cells by In Situ Hybridization, <J. Immunol. 146(8) :2855 a 2864) . De acordo com um relato, a utilização de gene Vh em humanos, da maior até a menor, é Vh3 > Vh4 > VhI > Vh5 > Vh2 > Vh6; as redisposições em células B periféricas divulgam que a utilização de família VH3 é maior do que o esperado com base no número relativo de genes Vh3 de linha germinal (Brezinschek et al., 1995). De acordo com outro relato, a utilização de Vh em humanos segue o padrão
Vh3 > Vh5 > Vh2 > VhI > Vh4 > Vh6 com base na análise de células B imunocompetentes pequenas periféricas ativadas por mitogénio pokeweed (Davidkova et al., 1997, Selective Usage of VH Genes in Adult Human B Lymphocyte Repertoires, Scand. J. Immunol. 45:62 a 73). Um relato afirma que, de entre os membros de família Vh3 mais frequentemente utilizados estão 3-23, 3-30 e 3-54 (Brezinschek et al.r 1995) . Na família Vh4, os membros 4-59 e 4-4b foram encontrados relativamente com mais frequência (Id.), assim como 4-39 e 4-34 (Brezinscheck et al., 1997, Analysis of the Human Vh Gene Repertoire, J. Clin. Invest. 99(10):2488 a 2501). Outros postulam que o repertório de cadeia pesada ativado é distorcido a favor de expressão de VH5 alta e expressão de Vh3 mais baixa (Van Dijk-Hard e Lundkvist, 2002, Long-term kinetics of adult human antibody repertoires, Immunology 107:136 a 144). Outros estudos afirmam que o gene Vh mais comummente utilizado no repertório humano adulto é Vh4-59, seguido por Vh3-23 e Vh3-48 (Arnaout et al., 2001, High-Resolution Description of Antibody Heavy-Chain Repertoires in Humans, PLoS ONE 6(8):108). Embora os estudos de utilização tenham base em números de amostra relativamente pequenos e exibam, desse modo, variância alta, tomados juntos, os estudos sugerem que a expressão de gene V não é puramente estocástica. Certamente, os estudos com antigénios particulares estabeleceram que—em certos casos—o deck é firmemente empilhado contra certas utilizações e a favor de outras.
Ao longo do tempo, tornou-se evidente que o repertório observado de domínios variáveis de cadeia pesada humana gerados em resposta a certos antigénios é altamente restrito. Alguns antigénios estão associados quase exclusivamente a anticorpos de neutralização que têm apenas certos genes Vh particulares, no sentido de que os anticorpos de neutralização eficaz são derivados essencialmente de apenas um gene Vh. Tal é o caso para vários agentes patogénicos humanos clinicamente importantes.
As cadeias pesadas derivadas de VHl-69 foram observadas numa variedade de repertórios de anticorpo especifico de antigénio de significância terapêutica. Por exemplo, Vh1-69 foi frequentemente observado em transcrições de cadeia pesada de um repertório IgE de linfócitos de sangue periférico em crianças jovens com doença atópica (Bando et al., 2004, Characterization of Vhe gene expressed in PBL from children with atopic diseases: detection of homologous Vh1-69 derived transcripts from three unrelated patients, Immunology Letters 94:99 a 106). As cadeias pesadas derivadas de Vh1-69 com um grau alto de hipermutação somática também ocorrem em linfomas de célula B (Perez et ai., 2009, Primary cutaneous B-cell lymphoma is associated with somatically hypermutated immunoglobulin variable genes and frequent use of Vh1-69 and Vh4-59 segments, British Journal of Dermatology 162:611 a 618), enquanto algumas cadeias pesadas derivadas de Vh1-69 com sequências essencialmente de linha germinal (isto é, pouca a nenhuma hipermutação somática) foram observadas de entre autoanticorpos em doentes com distúrbios sanguíneos (Pos et al., 2008, Vh1-69 germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura, Journal of Thrombosis e Haemostasis 7:421 a 428) .
Adicionalmente, os anticorpos de neutralização contra antigénios virais, como VIH, influenza e hepatite C (VHC) foram constatados por utilizar a linha germinal e/ou sequências derivadas de Vh1-69 alteradas de modo somático (Miklos et al., 2000, Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin Vh genes show frequent use of Vl-69 with distinctive CDR3 features, Blood 95(12):3878 a 3884; Kunert et al., 2004, Characterization of molecular features, antigen-binding, and in vitro properties of IgG and IgM variants of 4E10, an anti-HIV type I neutralizing monoclonal antibody, Aids Research and Human Retroviruses 20 (7):755 a 762; Chan et al., 2001, VHl-69 gene is preferentially used by hepatitis C virus-associated B cell lymphomas and by normal B cells responding to the E2 viral antigen, Blood 97(4):1023 a 1026; Carbonari et al., 2005, Hepatitis C virus drives the unconstrained monoclonal expansion of VHl-69-expressing memory B cells in type II cryoglobulinemia: A model of infection-driven lymphomagenesis, Journal of Immunology 174:6532 a 6539; Wang and Palese, 2009, Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?, Nature Structural &amp; Molecular Biology 16(3):233 a 234; Sui et al., 2009, Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses, Nature Structural &amp; Molecular Biology 16(3):265 a 273; Marasca et al., 2001, Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of VhI-69 and Vh4-34 Segments in Hepatitis C Virus-Positive and Hepatitis C Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma, Am. J. Pathol. 159 (1) :253 a 261) . O desvio de utilização de Vh também é observado na resposta imunitária humoral a Haemophilus influenzae tipo b (Hib PS) em humanos. Estudos sugerem que a família VHIII (a subfamília VijIIIb em particular, Vh9.1) caracteriza exclusivamente a resposta humoral humana a Hib PS, com diversos genes D e J (Adderson et al., 1991, Restricted Ig H Chain V Gene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Immunol. 147(5):1667 a 1674; Adderson et al., 1993, Restricted Immunoglobulin Vh Usage and VDJ Combinations in the Human Response to Haemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide, J. Clin. Invest. 91:2734 a 2743). Os genes JH humanos também exibem utilização desviada; Jh4 e Jh6 são observados a cerca de 38 a 41% em células B periféricas em humanos (Brezinschek et al., 1995). A utilização de Vh em humanos infetados com VIH-1 é supostamente desviada contra a utilização de Vh3 e a favor de famílias de gene VhI e Vh4 (Wisnewski et al., 1996, Human Antibody Variable Region Gene Usage in VIH-1 Infection, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes &amp; Human Retroviology 11(1) :31 a 38) . No entanto, a análise de ADNc de medula óssea dos pacientes afetados revelou a utilização de Vh3 significativo não expressa no repertório de célula B funcional, em que os Fabs que refletem a utilização de Vh3 exibiram a neutralização in vitro de VIH-1 (Id.). Pode ser postulado que a resposta imunitária humoral à infeção VIH-1 é possivelmente atenuada devido à restrição VH; os animais não humanos modificados conforme descrito no presente documento (não infetáveis por VIH-1) podem ser, desse modo, úteis para gerar os domínios de anticorpo de neutralização derivados de genes Vh particulares presentes nos animais geneticamente modificados descritos no presente documento, mas derivados de genes Vh diferentes daqueles observados no repertório restrito de humanos afetados.
Desse modo, a habilidade para gerar domínios variáveis de anticorpo humano de afinidade alta em ratinhos restritos Vh, por exemplo, (restritos, por exemplo, a um membro de família Vh3 e polimorfo (ou polimorfos) do mesmo) imunizados com VIH-1 pode fornecer um recurso rico para projetar os produtos terapêuticos humanos de neutralização de VIH-1 extraindo-se inteiramente o repertório restrito (por exemplo, restrito a um membro de família Vh3 ou variante (ou variantes) do mesmo) de tal ratinho imunizado. A restrição da resposta de anticorpo humano a certos agentes patogénicos pode reduzir a propensão para obter regiões
variáveis de anticorpo de humanos afetados que podem servir como trampolins para projetar anticorpos de neutralização de afinidade alta contra o agente patogénico. Por exemplo, a resposta imunitária humana à VIH-1 infeção é restrita de modo clonal através da infeção de VIH-1 e na progressão da SIDA (Muller et al., 1993, B-cell abnormalities in AIDS: stable and clonally restricted antibody response in HIV-1 infection, Scand. J. Immunol. 38:327 a 334; Wisnewski et al., 1996). Adicionalmente, os genes Vh não estão presentes, em geral, em todas as formas polimórficas em qualquer indivíduo particular; certos indivíduos em certas populações têm uma variante, enquanto indivíduos em outras populações têm uma variante diferente. Desse modo, a disponibilidade de um sistema biológico que é restrito a um gene Vh único e suas variantes fornecerá, em várias formas de realização, uma fonte não explorada até agora de diversidade para gerar regiões variáveis de anticorpo (por exemplo, domínios cognatos pesados e leves humanos) com base num gene Vh restrito. Desse modo, num caso, é descrito um animal não humano geneticamente modificado, o qual contém uma pluralidade de variantes polimórficas de não mais que um ou não mais que dois segmentos VH humanos de membro de família de gene. Num caso, o não mais que um ou não mais que dois segmentos de gene Vh humano estão ligados de modo operacional a um ou mais segmentos de gene Dh humano, um ou mais segmentos de gene Jh humano e um segmento de gene de região constante humana ou não humana. Num caso, a região constante está num locus de gene constante de imunoglobulina não humana endógena. Num caso, o animal não humano contém adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos derivada de uma sequência Vl humana, por exemplo, um segmento de gene Vl humano redisposto ou não redisposto ou uma sequência Vl/Jl humana redisposta. Num caso, a sequência de ácidos nucleicos derivada da sequência VL humana está num locus de gene VL não humano endógeno; num caso, a sequência de ácidos nucleicos derivada da sequência Vl humana está num transgene. Num caso especifico, o animal não humano não tem capacidade para expressar um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina que contém em si um segmento de gene Vl ou Jl endógeno, e contém não mais que um ou não mais que dois genes de cadeia leve que codificam domínios VL humanos redispostos (isto é, de não mais que uma ou não mais que duas sequências Vl/Jl humanas redispostas).
Os ratinhos geneticamente modificados que expressam regiões variáveis de cadeia pesada humana com utilização de segmento de gene VH restrito são úteis para gerar um repertório relativamente grande de regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina humana de afinidade alta diversas em termos de junção, diversas de modo combinatório e alteradas de modo somático a partir de um repertório restrito de outro modo. Um repertório restrito, num caso, refere-se a uma limitação predeterminada no número e/ou identidade de genes de linha germinal que resultam no ratinho ser incapaz de formar gene de cadeia pesada redisposta que é derivado de um gene V diferente de outro gene V pré-selecionado. Em casos que empregam um gene V pré-selecionado, mas não um gene D e/ou J pré-selecionado, o repertório é restrito em relação à identidade do gene V, mas não o gene D e/ou J (por exemplo, o repertório consiste essencialmente em não mais que um ou não mais que dois segmentos de gene Vh (e/ou polimorfos dos mesmos) ; e uma pluralidade de segmentos de gene D e uma pluralidade de segmentos de gene J) ) . A identidade do gene V pré-selecionado (e quaisquer genes D e/ou J pré-selecionados) não é limitada a qualquer gene V particular.
Projetar um ratinho para que o mesmo redisponha um gene Vh único (presente como segmento único ou conjunto de variantes) com uma variedade de segmentos de gene D e J humanos (por exemplo, segmentos Dh e Jh) fornece uma diversidade de junção in vivo/diversidade combinatória/máquina de permutação de hipermutação somática que pode ser utilizada para iterar mutações em sequências de região variável de cadeia pesada redisposta resultantes (por exemplo, V/D/J ou V/J, conforme o caso). Em tal ratinho, o processo de seleção clonal opera para selecionar regiões variáveis adequadas que ligam um antigénio de interesse baseado num gene Vh pré-selecionado único (ou variantes dos mesmos). Devido aos componentes de seleção clonal do ratinho serem dedicados à seleção com base no segmento de gene VH pré-selecionado único, o ruido de fundo (por exemplo, uma variedade ampla de domínios Vh de ligação de não antigénio derivados de segmentos de gene de linha germinal) é amplamente erradicado. Com a seleção criteriosa do segmento de gene Vh, um número relativamente maior de anticorpos específicos de antigénio selecionados de modo clonal pode ser triado num período mais curto de tempo em relação a um ratinho com a diversidade ampla de segmentos V.
Pré-selecionar o repertório limitado e restringir um ratinho a um segmento V único fornece um sistema para permutar junções V/D/J numa taxa que é, em vários casos, mais alta que a observada em ratinhos que têm, de outro modo, 40 ou mais segmentos V para recombinar com regiões D e J. A remoção de outros segmentos V libera o locus para formar mais combinações V/D/J para o segmento V pré-selecionado em relação ao observado de outro modo. O número aumentado de transcrições que resultam da recombinação do V pré-selecionado com um de entre a pluralidade de D e um de entre a pluralidade de segmentos J alimentará aquelas transcrições no sistema de seleção clonal na forma de células pré-B, e o clonal seleção sistema é dedicado, desse modo, a circular células B que expressam a região V pré-selecionada. Dessa maneira, redisposições de região V mais únicas derivadas do segmento V pré-selecionado podem ser triadas pelo organismo que seria possível de outro modo numa dada quantidade de tempo.
Em vários casos, os ratinhos são descritos, os quais aprimoram a diversidade de junção de recombinações V/D/J para a região V pré-selecionada, devido ao facto de que todas ou substancialmente todas as recombinações do locus de variável de cadeia pesada de imunoglobulina serão do segmento V pré-selecionado e os segmentos D e J que são colocados em tais ratinhos. Portanto, os ratinhos fornecem um método para gerar uma diversidade de segmentos CDR3 que utilizam uma base ou repertório de gene Vh restrito.
Num caso, um animal não humano é descrito, em que a população de célula B do animal não humano expressa cadeias pesadas de imunoglobulina que são derivadas de não mais que um ou não mais que dois segmentos de gene Vh humano. Num caso, cada um de entre o não mais que um ou não mais que dois segmentos de gene Vh humano estão presentes em duas ou mais formas polimórficas. Num caso, o segmento de gene VH humano está presente em três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 formas polimórficas. Num caso, o animal não humano expressa um domínio variável de cadeia leve humano derivado de um segmento de gene Vl humano.
Num caso, um método é descrito para gerar uma população de célula B num animal não humano, em que a população de célula B expressa cadeias pesadas humanas derivadas de um segmento de gene Vh humano de linha germinal única e dois ou mais segmentos de gene D humano e dois ou mais segmentos de gene J humano; sendo que o método inclui uma etapa de imunizar um animal não humano, conforme descrito no presente documento, com um antigénio de interesse, e permitir que o animal não humano tenha uma resposta imunitária ao antigénio de interesse, em que a resposta imunitária inclui expressar as cadeias pesadas humanas na superfície de células B na população de célula B. Num caso, o animal não humano é um roedor (por exemplo, um ratinho ou rato). Num caso, o segmento de gene Vh humano, segmento Dh humano e segmento Jh humano estão ligados de modo operacional a um gene de região constante não humano. Num caso, o animal não humano contém adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio Vl humano. Num caso, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o domínio Vl humano está ligada a uma sequência de gene de região constante de cadeia leve não humana.
Num caso, é descrito um método para produzir um animal não humano que expressa uma população de imunoglobulina caracterizada por as imunoglobulinas terem cadeias pesadas que são derivadas de uma pluralidade de redisposições de um segmento de gene Vh humano único (ou membro de família de gene Vh humano único) e um de entre uma pluralidade de segmentos Dh de gene e um de entre uma pluralidade de segmentos de gene Jh. Num caso, o segmento de gene Vh humano é um segmento de gene Vh1-69 humano. Num caso, o segmento de gene Vh humano é um segmento de gene Vh1-2 humano.
Num caso, um método é descrito para gerar uma população de domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina humana cujas CDR1 e CDR2 são derivadas do mesmo segmento de gene Vh de linha germinal, e cuja CDR3 é derivada do segmento de gene de linha germinal e dois ou mais segmentos D humanos, e dois ou mais segmentos J humanos; o método inclui imunizar um animal não humano, conforme descrito no presente documento com um antigénio de interesse, e permitir que o animal não humano tenha uma resposta imunitária ao antigénio de interesse, em que a resposta imunitária inclui expressar os domínios variáveis de cadeia pesada humana no contexto de um domínio variável de cadeia leve. Num caso, o animal não humano é um roedor (por exemplo, um ratinho ou rato). Num caso, o segmento de gene VH humano, segmento D humano e segmento J humano estão ligados de modo operacional a um gene de região constante não humano. Num caso, o animal não humano contém adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio Vl humano. Num caso, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o domínio Vl humano é ligada a uma sequência de gene de região constante de cadeia leve não humana.
Num caso, um animal não humano geneticamente modificado é descrito, em que o animal não humano não tem capacidade para expressar um domínio Vh não humano, e em que cada cadeia pesada de imunoglobulina da população da cadeia pesada expressa no animal compreende um domínio Vh humano que compreende uma CDR1 e uma CDR2 que são idênticas, mas para uma ou mais hipermutações somáticas, e em que a população de cadeia pesada inclui uma pluralidade de sequências de CDR3 derivadas de uma pluralidade de redisposições com uma pluralidade de segmentos de gene D e J.
Num caso, um sistema biológico para gerar variação em identidade e comprimento de CDR3 é descrito, o qual inclui um animal não humano geneticamente modificado, conforme descrito no presente documento, em que o animal não humano contém não mais que um ou não mais que dois segmentos de gene Vh humano, e dois ou mais segmentos de gene D e um ou mais segmentos de gene J, em que o animal não humano contém adicionalmente um locus de cadeia leve de imunoglobulina humanizada. Em vários casos, o animal não humano em resposta à imunização com um antigénio de interesse gera uma resposta imunitária que inclui expressar uma população de cadeia pesada de imunoglobulina caracterizada por cada cadeia pesada ter CDRls e CDR2s que diferem apenas por hipermutação somática, e CDR3s que diferem por redisposição e hipermutação somática. Num caso, o sistema biológico é um ratinho que é geneticamente modificado conforme descrito no presente documento. Num caso, o segmento de gene Vh humano e o segmento de gene VL humano estão em loci de imunoglobulina pesado e leve de ratinho endógeno, respetivamente. Num caso, um ou mais de entre o segmento de gene Vh humano e o segmento de gene VL humano estão em transgenes (isto é, num locus diferente de um locus de imunoglobulina endógena).
Exemplos
Os exemplos a seguir são fornecidos de modo a descrever aqueles de habilidade comiam na técnica de como fazer e utilizar métodos e composições da invenção, e não são destinados a limitar o âmbito que os inventores consideram como sua invenção. Salvo indicação em contrário, a temperatura é indicada em Celsius, e a pressão está em ou está perto da pressão atmosférica. Nos Exemplos supracitados, quando a utilização de kits e reagentes de vários fornecedores é indicada, todos os procedimentos são executados de acordo com especificações do fabricante.
Exemplo 1 Construção de loci de cadeia pesada restrita Um locus de cadeia pesada humana unicamente projetada que contém um segmento de gene Vh humano único localizado a montante de todos os segmentos de gene Dh e Jh humanos foi criado por uma série de reações de recombinação homóloga em células bacterianas (BHR) com a utilização de ADN de Cromossoma Artificial Bacteriano (BAC). Diversos construtos de direcionamento para a criação de um locus de cadeia pesada que contém Vh único foram construídos com a utilização de tecnologia de modificação genética VELOCIGENE® (veja-se, por exemplo, a Patente n° U.S. 6.586.251 e Valenzuela, D.M. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotechnology 21(6): 652 a 659).
Construção de um Locus de Cadeia Pesada Restrito VHl-69 Humano.
Brevemente, quatro modificações foram realizadas com a utilização de ADN de BAC para criar uma construção de direcionamento que contém um segmento de gene Vh1-69 humano com todos os segmentos DH e Jh humanos (Figura l). Na primeira modificação, um BAC humano modificado que contém múltiplos segmentos de gene VH humano distai (5'), incluindo Vh1-69, uma cassete de seleção de higromicina a montante e um braço de homologia de ratinho 5' foram direcionados com um segundo cassete de espectinomicina, o qual também conteve uma sequência de sinal de recombinação modificada (RSS; BHR 1, Figura 1, esquerda superior). Essa sequência de sinal de recombinação (RSS) modificada introduziu duas mutações de ponto (T para A e G para A) na região RSS 3' do gene Vh1-69 humano que muda o nonámero de RSS para uma sequência de consenso ideal. Desse modo, a primeira modificação (BHR 1) criou um fragmento genómico humano que contém o segmento de gene VHl-69 humano com um RSS 3' modificado, um sitio de restrição AsiSI único de cerca de 180 bp a jusante da RSS e uma cassete de espectinomicina (Figura 1, esquerda intermediária). A segunda modificação (BHR 2) incluiu a utilização de uma cassete de neomicina (Neo) flanqueado por sitios Frt para deletar a cassete de higromicina e segmentos de gene Vh humano 5' a montante do segmento de gene VHl-69. Essa modificação foi direcionada 5' para o segmento de gene VhI-69 humano permanecer intacto a cerca de 8,2 kb da região promotora de Vh1-69 humano e o braço de homologia de ratinho 5' (Figura l, esquerda inferior). A terceira modificação (BHR 3) incluiu outra cassete de espectinomicina flanqueada por PI-SceI 5' unicamente projetado e sítios AsiSI 3' direcionados a um fragmento genómico humano que contém os primeiros três segmentos de gene Vh humano funcional e todos os segmentos de gene DH e Jh humano (Figura 1, direita intermediária). 0 fragmento genómico humano foi anteriormente direcionado com uma cassete de neomicina e conteve braços de homologia 5' e 3' que contêm a sequência genómica de ratinho 5' e 3' do locus de cadeia pesada endógeno incluindo o acentuador intrónico 3' e o gene de IgM. Essa modificação deletou a sequência genómica de ratinho 5' e segmentos de gene Vh humano, deixando cerca de 3,3 kb da região intergénica Vh-Dh a montante do segmento de gene DH1-1 humano, todos de entre os segmentos Dh e Jh humanos, e o fragmento genómico de ratinho 3' que contém o acentuador intrónico 3' e o gene de IgM (Figura 1, direita do fundo). A quarta modificação foi alcançada empregando-se os sítios PI-SceI e AsiSI únicos (descritos acima) para ligar os dois BACs modificados de BHR 2 e BHR 3 (Figura 1, centro de fundo) , o que rendeu o construto de direcionamento final. 0 construto de direcionamento final para a criação de um locus de cadeia pesada modificado contém um segmento de gene Vh humano único e todos os segmentos de gene DH e Jh humanos em células ES contidos, de 5' a 3', um 5' braço de homologia que contém de cerca de 20 kb de sequência genómica de ratinho a montante do locus de cadeia pesada endógeno, um sítio Frt 5', uma cassete de neomicina, um sítio Frt 3', cerca de 8,2 kb do promotor de VHl-69 humano, o segmento de gene VHl-69 humano com uma RSS 3' modificada, 27 segmentos de gene DH humano, seis segmentos Jh humanos e um braço de homologia 3' que contém cerca de 8 kb de sequência genómica de ratinho a jusante dos segmentos de gene Jh de ratinho incluindo o acentuador intrónico 3' e gene IgM (Figura 1, fundo). O Vetor de Direcionamento Vh1-69 Humano (SEQ ID NO: 3) foi linearizado e eletroporado em células ES de ratinho heterozigótico para uma eliminação do locus de cadeia pesada endógeno.
Exemplo de Referência: Construção de um Locus de Cadela Pesada Restrita Vh1-2 Humana. Com a utilização das etapas descritas acima, outros segmentos de gene Vh polimórfico no contexto de regiões constantes de cadeia pesada de ratinho são empregues para construir uma série de ratinhos que têm um número restrito de segmentos V de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5), em que os segmentos V são variantes polimórficas de um membro de família de gene V. Os segmentos de gene VH polimórfico exemplificativos são derivados de segmentos de gene VH humano incluindo, por exemplo, VHl-2, VH2-26, Vh2-70 e VH3-23. Tais segmentos de gene VH humano são obtidos, por exemplo, por síntese de novo (por exemplo, Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA) com a utilização de sequências disponíveis em bancos de dados publicados. Desse modo, os fragmentos de ADN que codificam cada gene Vh são, em alguns casos, gerados independentemente para incorporação a vetores de direcionamento, conforme descrito no presente documento. Dessa maneira, múltiplos loci de cadeia pesada de imunoglobulina modificada que contêm um número restrito de segmentos de gene VH são projetados no contexto de regiões constantes de cadeia pesada de ratinho. Uma estratégia de direcionamento exemplificativa para criar um locus de cadeia pesada humanizada restrita que contém um segmento de gene Vh1-2 humano, 27 segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano é mostrada na Figura 2.
Brevemente, um clone de BAC humano modificado que contém três segmentos de gene Vh humano (VH6-1, VHl-2, Vh1-3) , 27 segmentos de gene Dh humano e seis segmentos de gene Jh humano (veja-se USSN 13/404.075; depositado em 24 de fevereiro de 2012) é utilizado para criar um locus de cadeia pesada humanizada restrita que contém um segmento de gene Vh1-2 humano. Esse clone de BAC modificado liga funcionalmente os segmentos de gene de cadeia pesada humana supracitados com o acentuador intrónico de ratinho e a região constante de IgM. O locus de cadeia pesada com base em Vh1-2 humano restrito é alcançado por duas recombinações homólogas com utilização do clone de BAC humano modificado descrito acima.
Para a primeira recombinação homóloga, 205 bp do segmento de gene Vh6-1 humano (de cerca de 10 bp a montante (5' ) do codão inicial Vh6-1 no exão 1 a cerca de 63 bp a jusante (3') do começo do exão 2) no clone de BAC humano modificado é deletado por recombinação homóloga bacteriana com a utilização de uma cassete de espectinomicina (aadA) flanqueado por sitios de restrição PI-SceI únicos (Figura 2, BHR 1). Isso permite a remoção subsequente da cassete de aadA sem perturbar outros segmentos de gene humano dentro do locus de cadeia pesada restrita.
Para a segunda recombinação homóloga, a extremidade 5' do clone de BAC humano modificado incluindo o segmento de gene Vh1-3 humano inteiro e cerca de 60 bp a jusante (3') do segmento de gene é deletado por recombinação homóloga com a utilização de uma cassete de higromicina que contém sitios de restrição 5' AsiSI e 3' Asei de flanqueamento (Figura 2, BHR 2) . Conforme descrito acima, a cassete de espectinomicina é opcionalmente removida após a confirmação do vetor de direcionamento final que inclui a eliminação dos dois segmentos de gene Vh humano que flanqueiam o segmento de gene Vh1-2 humano (Figura 2, fundo). Um vetor de direcionamento Vh1-2 humano exemplificativo é estabelecido na SEQ ID NO: 70.
Empregar os segmentos de gene Vh polimórfico num locus de cadeia pesada de imunoglobulina restrito representa uma abordagem inovadora para gerar anticorpos, populações de anticorpos e populações de células B que expressam anticorpos que têm cadeias pesadas com diversas CDRs derivadas de um segmento de gene Vh humano único. Explorar a maquinaria de hipermutação somática do animal hospedeiro juntamente com associação combinatória com domínios variáveis de cadeia leve de imunoglobulina humana redisposta resulta na projeção de cadeias pesadas únicas e pares Vh/Vl únicos que expandem o repertório imunitária de animais geneticamente modificados e aprimoram sua utilidade como uma plataforma de próxima geração para fazer produtos terapêuticos humanos, especialmente úteis como uma plataforma para produzir anticorpos de neutralização específicos para agentes patogénicos humanos.
Desse modo, a utilização da estratégia destacada acima para incorporação de segmentos de gene Vh polimórfico adicionais e/ou outros no locus de cadeia pesada de ratinho de imunoglobulina permite a geração de repertórios de anticorpo inovadores para utilização na neutralização de agentes patogénicos humanos que podem evitar de modo eficaz e de outro modo o sistema imunitária hospedeiro.
As células ES direcionadas descritas acima foram utilizadas como células ES doadoras e introduzidas num embrião de ratinho de estágio de 8 células pelo método VELOCIMOUSE® (supra). Os ratinhos que contêm um locus de cadeia pesada humanizada que contém um segmento de gene Vh humano único, todos os segmentos de gene Dh e Jh humanos ligados de modo operacional aos genes de região constante de imunoglobulina de ratinho foram identificados por genotipagem com a utilização de uma modificação de ensaio de alelo (Valenzuela et al., supra) que detectou a presença da cassete de neomicina, o segmento de gene Vh humano e uma região dentro dos segmentos de gene Dh e Jh humanos, assim como sequências de cadeia pesada endógena. A Tabela 4 apresenta os iniciadores e sondas utilizados nesse ensaio para confirmar os ratinhos que contêm um locus de cadeia pesada restrita que abriga um segmento de gene Vh1-69 humano único, 27 segmentos de gene DH humano e seis segmentos de gene Jh humano.
Os ratinhos que portam um locus de cadeia pesada projetada que contém um segmento de gene Vh humano único podem ser desenvolvidos para uma estirpe de ratinho deletério de FLPe (veja, por exemplo, Rodriguez, C.I. et ai. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-ioxP. Nature Genetics 25: 139-140) a fim de remover qualquer cassete de neomicina Frt'ed introduzida pelo vetor de direcionamento que não é removida, por exemplo, no estágio de célula ES ou no embrião. Opcionalmente, a cassete de neomicina é retida nos ratinhos.
Os filhotes são genotipados e um filhote heterozigótico para um locus de cadeia pesada humanizada que contém um segmento de gene VH humano único, todos os segmentos Dh e Jh humanos ligados de modo operacional aos genes constantes de imunoglobulina de ratinho endógeno são selecionados para caracterizar o repertório de cadeia pesada de imunoglobulina.
Tabela 4
neo (cassete Sonda: TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG de 9 neomicina) hIgH9T Direto: TCCTCCAACG ACAGGTCCC 10 (sequencia Reverso: GATGAACTGA CGGGCACAGG 11 genomica
Dh - Jh Sonda: TCCCTGGAAC TCTGCCCCGA CACA humana) 77h3 Direto: CTCTGTGGAA AATGGTATGG AGATT 13 (segmento de Reverso: QGTAAGCATA GAAGGTGGGT ATCTTT 14 gene VHl-69 humano) Sonda: ATAGAACTGT CATTTGGTCC AGCAATCCCA 15 mIgHA7 Direto: TGGTCACCTC CAGGAGCCTC 16 (sequencia Reverso: GCTGCAGGGT GTATCAGGTG C 17 genomica
Dh - Jh de Sonda: AGTCTCTGCT TCCCCCTTGT GGCTATGAGC X o ratinho) 88710T Direto: GATGGGAAGA GACTGGTAAC ATTTGTAC 19 (sequencia Reverso: TTCCTCTATT TCACTCTTTG AGGCTC 20 genomica 3'
VH de Sonda: CCTCCACTGT GTTAATGGCT GCCACAA ratinho) mlgHdlO Direto: GGTGTGCGAT GTACCCTCTG AAC 22 (sequencia Reverso: TGTGGCAGTT TAATCCAGCT TTATC 23 genomica 5'
VH de Sonda: CTAAAAATGC TACACCTGGG GCAAAACACC
ratinho) TG mIgHp2 Direto: GCCATGCAAG GCCAAGC 25 (sequencia Reverso: AGTTCTTGAG CCTTAGGGTG CTAG 26 genomica Jh de ratinho) Sonda: CCAGGAAAAT GCTGCCAGAG CCTG 27
Exemplo 2 Caracterização de ratinhos que expressam cadeias pesadas derivadas de um segmento de gene Vh humano único O homozigótico de ratinho para um segmento de gene Vh humano único no locus de cadeia pesada endógeno, conforme descrito no Exemplo 1, foi avaliado para expressão e desenvolvimento de célula B com a utilização de citometria de fluxo.
Brevemente, os baços e a medula óssea foram colhidos de ratinhos do tipo selvagem (n=3 por grupo; seis semanas de idade, machos e fêmeas) e homozigótico para um segmento de gene Vh humano único, todos os segmentos de gene DH e Jh humanos ligados de modo operacional a regiões constantes de cadeia pesada de ratinho. Os eritrócitos de baços foram lisados com tampão de lise ACK (Lonza Walkersville), seguidos por lavagem com meio de RPMI completo.
Citometria de fluxo. As células (lxlO6) foram incubadas com anti-ratinho CD16/CD32 (2.4G2, BD PHARMINGEN™) em gelo durante 10 minutos, seguido por identificação com os painéis de anticorpo a seguir durante 30 minutos no gelo. Painel de medula óssea: anti-ratinho FITC-CD43 (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (11/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (ll-26c.2a, BIOLEGEND®), APC-eFluor 780-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). Painel de medula óssea e baço: anti-ratinho FITC-IgK (187.1, BD Biosciences), PE-IgX (RML-42, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (11/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (ll-26c.2a, BIOLEGEND®), Pacific Blue-CD3 (17A2, BIOLEGEND®), APC-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-H7-CD19 (ID3, BD Biosciences). Medula óssea: células B imaturas (B220intIgM+) , células B maduras (B220hiIgM+), células pró-B (CD19+ckit+CD43+), células pré-B (CDl9+ckit_CD43“) , células B IgK+ imaturas (B22 0intIgM+IgK+IgX_) , células B IgX+ imaturas (B220intIgM+IgK_ IgX+), células B Igic+ maduras (B220hiIgM+IgK+IgÀ~), células B IgX+ maduras (B220hiIgM+IgK_IgÀ+) . Baço: células B (CD19+), células B maduras (CD19+IgDhiIgMint), células B de transição/imaturas (CDl9+IgDintIgMhi) . Medula óssea e baço: Células B IgK+ (CD19+IgK+IgÀ_) , células B IgX+ (CD19+IgK_IgÀ+) .
Após a coloração, as células foram lavadas e fixas em 2% de formaldeido. A aquisição de dados foi realizada num citómetro de fluxo LSRII e analisada com o software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). Os resultados para o compartimento esplénico são mostrados nas Figuras 3, 4A e 5 a 7. Os resultados para o compartimento de medula óssea são mostrados nas Figuras 4B e 8 a 11B.
Expressão Vh Humana. A expressão do segmento de gene VHl-69 humano foi determinada para ratinhos heterozigóticos e homozigóticos para um segmento de gene Vh1-69 humano, em que todos os segmentos de gene Dh e Jh humanos são ligados de modo operacional às regiões constantes de cadeia pesada de ratinho por um ensaio de PCR quantitativa com a utilização das sondas TAQMAN®.
Brevemente, as células B CD19+ foram purificadas a partir dos baços de grupos de ratinhos (n=3 por grupo) com a utilização de microesferas de CD19 de ratinho (Miltenyi Biotec) de acordo com as especificações do fabricante. 0 ARN total foi purificado com a utilização do Mini kit RNEASY™ (Qiagen) e o ARN genómico foi removido com a utilização de um tratamento na coluna de ADNase livre de ARNase (Qiagen). Cerca de 200 ng de ARNm fram transcritos de modo reverso no ADNc com a utilização do kit First Stand ADNc Synthesis (Invitrogen), seguido por amplificação com TAQMAN® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) com a utilização de ABI 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). As combinações de iniciador/sonda únicas foram empregues para determinar especificamente a expressão de cadeias pesadas derivadas de Vh1-69 humano (Tabela 5) . A expressão relativa foi normalizada para a região constante κ de ratinho (mCx). Os resultados são mostrados na Figura 12.
Tabela 5
Exemplo 3 Resposta imunitária humoral em ratinhos que expressam cadeias pesadas derivadas de um segmento de gene Vh humano único A resposta imunitária humoral foi determinada para ratinhos homozigóticos para loci de gene variável de cadeia pesada e leve κ humana (Hk) e ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único, todos os segmentos de gene Dh e Jh humanos ligados de modo operacional às regiões constantes de cadeia pesada de ratinho (lhVH HO) por imunização comparativa com a utilização de um recetor de superfície de célula humana (antigénio A).
Imunização. O soro foi colhido a partir de ratinhos anteriores à imunização com o antigénio acima. O antigénio (2,35 pg cada um) foi administrado numa imunização inicial misturada com 10 pg de oligonucleótido de CpG (Invivogen) e 25 pg de Adju-phos (Brenntag) como adjuvantes. O imunogénio foi administrado por meio dos pés (f.p.) num volume de 25 pL por ratinho. Subsequentemente, os ratinhos foram reforçados por meio de f.p. com 2,3 pg de antigénio juntamente com 10 pg de CpG e 25 pg de Adju-Phos como adjuvantes nos dias 3, 6, 11, 13, 17, e 20 para um total de seis reforços. Os ratinhos foram submetidos ao sangramento nos dias 15 e 22 após o quarto e o sexto reforços, respetivamente, e anti-soros foram ensaiados para títulos de anticorpo para o antigénio A.
As titulações de anticorpo foram determinadas em soros de ratinhos imunizados com a utilização de um ensaio ELISA. As placas de microtitulação de noventa e seis poços (Thermo Scientific) foram revestidas com antigénio A (1 pg/mL) em solução salina tamponada com fosfato (PBS, Irvine Scientific) de um dia para o outro a 4 °C. No dia seguinte, as placas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-T, Sigma-Aldrich) quatro vezes com utilização de um lavador de placas (Molecular Devices). As placas foram, então, bloqueadas com 250 pL de 1% de albumina de soro bovino (BSA, Sigma-Aldrich) em PBS e incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS-T. Os soros de ratinhos imunizados e soros pré-imunes foram diluídos em série dez vezes em 0,1% de BSA PBS-T começando em 1:100 e adicionados às placas bloqueadas em duplicado e incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. Os últimos dois poços foram deixados em branco para serem utilizados como controlo de anticorpo secundário. As placas foram lavadas novamente quatro vezes com PBS-T num lavador de placas. Uma diluição de 1:5.000 de anticorpo secundário conjugado de IgG-Fc-Peroxidase de Rábano anti-ratinho de cabra (HRP, Jackson Immunoresearch) foi adicionada às placas e incubada durante uma hora à temperatura ambiente. As placas foram, novamente, lavadas oito vezes com PBS-T e desenvolvidas com a utilização de TMB/H2O2 como substrato. 0 substrato foi incubado durante vinte minutos e a reação foi interrompida com H2SO4 a 1 N (VWR). As placas foram lidas num espectrofotómetro (Victor, Perkin Elmer) a 450 nm. As titulações de anticorpo foram calculadas com a utilização de GRAPHPAD PRISM™ (GraphPad Software, Inc). A titulação de soro foi calculada como diluição sérica dentro da faixa de titulação experimental no sinal de equivalente de ligação de antigénio duas vezes acima do fundo. A titulação de anticorpo para a resposta imunitária humoral contra um recetor de superfície de célula humana (antigénio A) é apresentado na Figura 19.
Numa experiência semelhante, as respostas imunes humorais foram determinadas para ratinhos homozigóticos para loci de gene variável de cadeia pesada e leve κ humana (Hk) e ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único, todos os segmentos de gene Dh e Jh humano ligados de modo operacional às regiões constantes de cadeia pesada de ratinho (lhVH HO) por imunização comparativa com utilização de vacinas virais de influenza FLUVIRIN® (Novartis Vaccines) e FLUMIST® (Medlmmune LLC).
Brevemente, o soro foi colhido a partir de ratinhos anteriores à imunização com o antigénio acima (conforme descrito acima). Os ratinhos (n=5) homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único (VHl-69) , todos os segmentos de gene Dh e Jh humanos ligados de modo operacional às regiões constantes de cadeia pesada de ratinho (lhVH HO) foram imunizados de modo intranasal (i.n.) com FLUMIST® (vacina da influenza atenuada viva) em 1/3 da dose normal por ratinho. Uma dose normal de FLUMIST® contém io6'5-7'5 FFU (unidades de foco fluorescente) de vacina de influenza atenuada viva. Portanto, cada ratinho foi preparado com 70 μΐ de FLUMIST® no dia 1 após reforço i.n. nos dias 3, 6, 11, 13, 17, 20 para um total de 6 reforços. Nenhum adjuvante foi empregue nessa imunização. Os ratinhos foram submetidos ao sangramento nos dias 15 e 22 após 4 o e 6o reforços, respetivamente, e anti-soros foram ensaiados para títulos de anticorpo para FLUMIST® (conforme descrito acima).
De maneira semelhante, em imunizações com FLUVIRIN®, o soro pré-imunitária foi colhido a partir de ratinhos antes da iniciação de imunização. Os ratinhos (n=5) homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único (VHl-69), todos os segmentos de gene DH e Jh humanos ligados de modo operacional às regiões constantes de cadeia pesada de ratinho (lhVH HO) foram imunizados com FLUVIRIN® (vacina da influenza desativada trivalente) por meio dos pés (f.p.) com 0,75 pg cada um de hemaglutinina/ratinho/reforço. Os ratinhos foram preparados no dia 1 após reforço f.p. nos dias 3, 6, 11, 13, 17, 20 para um total de 6 reforços. Nenhum adjuvante foi empregue nessa imunização. Os ratinhos foram submetidos ao sangramento nos dias 15 e 22 após 4o e 6o reforços, respetivamente, e anti-soros foram ensaiados para títulos de anticorpo para FLUVIRIN® (conforme descrito acima). O título de soro foi calculado como diluição sérica dentro da faixa de titulação experimental no sinal de equivalente de ligação de antigénio duas vezes acima do fundo. O título de anticorpo para a resposta imunitária humoral contra FLUMIST® e FLUVIRIN® é apresentado na Figura 20.
Conforme mostrado nesse Exemplo, os títulos de anticorpo gerados em ratinhos lhVH HO foram comparáveis àqueles gerados em ratinhos que têm uma pluralidade de segmentos de gene Vh humano (Hk) tanto para um recetor de superfície de célula humana quanto para um antigénio virai (por exemplo, influenza). Desse modo, os ratinhos que têm loci de cadeia pesada de imunoglobulina restritos a um segmento de gene Vh único têm capacidade para ter uma resposta imunitária robusta ao antigénio de maneira comparável com ratinhos que têm loci de cadeia pesada de imunoglobulina que contêm uma pluralidade de segmentos de gene Vh humano (por exemplo, 80 Vh) .
Exemplo 4 Análise de utilização de gene de anticorpo e comprimento de CDR3 em ratinhos que têm um locus de cadeia pesada de imunoglobulina restrita
Os esplenócitos colhidos de ratinhos homozigóticos para um segmento de gene Vh humano único no locus de cadeia pesada endógeno e homozigótico para uma substituição dos loci variáveis de cadeia leve κ endógena por loci variáveis de cadeia leve κ humana imunizados com um recetor de superfície de célula humana (antigénio A) foram analisados para utilização de segmento de gene de cadeia pesada e leve por reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa (RT-PCR) em ARNm de células B esplénicas.
Brevemente, os baços foram colhidos e homogeneizados em lxPBS (Gibco) com utilização de placas de vidro. Foi obtido o pellet de células numa centrifugadora (500 xg durante 5 minutos) e os eritrócitos foram lisados em tampão de lise de ACK (Gibco) durante 3 minutos. As células foram lavadas com lxPBS e filtradas com a utilização de uma peneira de célula de 0,7 pm. As células B foram isoladas a partir de células de baço com a utilização de seleção positiva magnética de MACS para CD19 (Miltenyi Biotec) . 0 ARN total foi isolado das células B em pellet com a utilização do kit RNeasy Plus (Qiagen) . O ARNm de PolyA+ foi isolado a partir do ARN total com utilização do minikit de ARNm Oligotex® Direct (Qiagen).
0 ADNc de fita dupla foi preparado a partir de ARNm de célula B esplénica por RACE 5' com utilização do kit SMARTer™ Pico ADNc Synthesis (Clontech) com substituição da transcriptase reversa suprida e dNTPs com Superscript® II e dNTPs (Invitrogen). Os repertórios de anticorpo Vh e Vk foram amplificados do ADNc com utilização de iniciadores específicos para regiões constantes de IgM, IgG ou Igx e o iniciador de RACE 5' SMARTer™ (Tabela 6) . Os produtos PCR foram purificados com utilização de um kit QIAquick® PCR Purification (Qiagen). Um segundo turno de PCR foi feito com utilização do mesmo iniciador RACE 5' e um iniciador 3' aninhado específico para as regiões constantes IgM, IgG ou IgK (Tabela 7) . Os produtos de PCR de segundo turno foram purificados com utilização de um sistema SizeSelect™ E-Gel® (Invitrogen) . Uma terceira PCR foi realizada com iniciadores que adicionaram 454 adaptadores e códigos de barra. Os produtos de PCR de terceiro turno foram purificados com utilização de microesferas Agencourt® AMPure® XP (Beckman Coulter). Os produtos de PCR purificados foram quantificados por SYBR® qPCR com utilização de um Kit ΚΑΡΑ Library Quantification (ΚΑΡΑ Biosystems). As bibliotecas agrupadas foram submetidas à PCR de emulsão (emPCR) com utilização de um Kit 454 GS Junior Titanium Series Lib-A emPCR (Roche Diagnostics) e sequenciação bidirecional com a utilização do instrumento Roche 454 GS Junior de acordo com as especificações do fabricante.
Análise bioinformática. As 454 sequências foram classificadas com base na correspondência perfeita de código de barras de amostra e separadas por qualidade. As sequências foram anotadas com base no alinhamento de sequências de imunoglobulina redispostas para o banco de dados de segmento V(D)J de linha germinal humana com utilização de instalação local de Igblast (NCBI, v2.2.25+). Uma sequência foi marcada como ambígua e removida da análise quando múltiplas melhores correspondências com contagem idêntica foram detetadas. Um conjunto de scripts perl foi desenvolvido para analisar resultados e armazenar dados no banco de dados mysql. A região CDR3 foi definida entre codão C conservado e o motivo FGXG para cadeias leves e motivo WGXG para cadeias pesadas. 0 comprimento de CDR3 foi determinado com a utilização apenas de anticorpos produtivos. A partir das sequências de ácido nucleico e sequências de aminoácidos previstas dos anticorpos, a utilização de gene foi identificada para sequências com células apresentadoras de IgM (15.650), com células apresentadoras de IgG (18.967) e com células apresentadoras de IgK (26.804). Os resultados são mostrados na Tabela 8, Tabela 9, Figura 21 e Figura 22. A Tabela 8 estabelece a percentagem de segmentos de gene DH e Jh humanos observados utilizados de entre sequências de região variável de cadeia pesada derivadas Vh1-69 com células apresentadoras de IgM (15.650 sequências) e com células apresentadoras de IgG (18.967 sequências). Os segmentos de gene Dh4-4/Dh4-11 humano e Dh5-5/Dh5-18 humano são apresentados na Tabela 8 juntos devido à identidade de sequência idêntica entre os respetivos pares de segmentos Dh de gene. A Tabela 9 apresenta a percentagem de segmentos de gene Vk e Jk humanos observados de entre cadeias leves (26.804 sequências) cognatas com regiões variáveis de cadeia pesada derivadas Vh1-69. As percentagens nas Tabelas 8 e 9 representam valores arredondados e, em alguns casos, podem não se igualar a 100% quando adicionados entre si. O comprimento de aminoácido da região CDR3 de cadeias pesadas derivadas de Vh1-69 com células apresentadoras de IgM é mostrado na Figura 21. O comprimento de aminoácido da região CDR3 de cadeias pesadas derivadas de Vh1-69 com células apresentadoras de IgG é mostrado na Figura 22.
Conforme mostrado nas Tabelas 8 e 9, os ratinhos de acordo com a invenção geram anticorpos específicos de antigénio que contêm cadeias pesadas derivadas de Vh1-69, as quais demonstram uma variedade de redisposições de um segmento de gene VHl-69 humano com uma variedade de segmentos DH humanos e segmentos Jh humanos. Adicionalmente, os anticorpos específicos de antigénio contêm cadeias leves humanas cognatas que contêm domínios Vk humanos resultantes de uma variedade de redisposições de segmentos de gene Vk e Jk humano.
Tabela 6
Tabela 7
Tabela 8
Tabela 9
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Macdonald, Lynn McWhhirter, John Gurer, Cagan Hosiawa, Karolina A.
Murphy, Andrew J. <120> Ratinhos de Cadeia Pesada de Imunoglobulina Restrita
<130> 1370A-WO <150> 61/658.459 <151> 2012-06-12 <150> 61/597.969 <151> 2012-02-13 <150> 61/547.974 <151> 2011-10-17 <160> 81 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 872
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 1 gcaggattta gggcttggtc tctcagcatc ccacacttgt acagctgatg tggcatctgt 60 gttttctttc tcatcgtaga tcaggctttg agctgtgaaa taccctgcct catgcatatg 120 caaataacct gaggtcttct gagataaata tagatatatt ggtgccctga gagcatcaca 180 taacaaccac attcctcctc taaagaagcc cctgggagca cagctcatca ccatggactg 240 gacctggagg ttcctctttg tggtggcagc agctacaggt aaggggcttc ctagtcctaa 300 ggctgaggaa gggatcctgg tttagttaaa gaggatttta ttcacccctg tgtcctctcc 360 acaggtgtcc agtcccaggt gcagctggtg cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg 420 tcctcggtga aggtctcctg caaggcttct ggaggcacct tcagcagcta tgctatcagc 480 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gagggatcat ccctatcttt 540 ggtacagcaa actacgcaca gaagttccag ggcagagtca cgattaccgc ggacgaatcc 600 acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac 660 tgtgcgagag acacagtgtg aaaacccaca tcctgagagt gtcagaaacc ctgagggaga 720 aggcagctgt gccgggctga ggagatgaca gggtttatta ggtttaaggc tgtttacaaa 780 atgggttata tatttgagaa aaaaagaaca gtagaaacaa gtacatactc ctctaatttt 840 aagataatta ttccattcaa gagtcgtaat at 872
<210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 2
Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 15 10 15
Gly Vai Gin Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys 20 25 30
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr 35 40 45
Phe Ser Ser Tyr Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly 50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr 65 70 75 80
Ala Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr 85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 115
<210> 3 <211> 99294 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 3 aagcttatct ctctgttgct cagactcatc taggaatttc agaaatttct gttctagcat 60 ctcttccagc ttttgtctcc aaccctcatt ctcttctttc tttttttttt taaattatat 120 gttctctgtc tttttaaaaa actttttaaa attaggtatt tatgtcattt acatttccaa 180 tgctatccca aaagtcccac ccacgctccc caacccacta tcccacccac ccactcccac 240 ttcttggccc tggcattcac agtgtactga gacatataaa gtttgcacaa ccaatgggcc 300 tctctttcca ctgatggccg actaggccat cttctgatac atatgcagct agagacacga 360 gattctgggg gtactggtta gttcatattg ttgttccacc tatagggttg cagatccttt 420 tagctccttg ggtactttct ctagctcctc cattgggggc cctgtgatcc atccaatagc 480 tgactgtgag catccacttc tgtgtttgct aggccccaga tagtctcaca agagacagct 540 atatctgggt cctttcagca aaatcttgct agtgtatgca acggtgtcag agtttggaag 600 ctgattatgg gatggatccc cggatatggc attctctagt tggttcatcc ttttgtctca 660 gctccaaact ttgtctctgt aactccttcc atgggtgttt tgttcccagt tctaaggagg 720 ggcaaagtat ccacactttg gtcttcattc ttcttgagtt tcatgtgttt tgcaaattgt 780 atcttatatc ttgggtattc taagtttctg ggctaatatc cacttatcag tgagtacaca 840 ttgtgtgagt tcttttgtga ttgggttacc tcactcagta tgatgccctc caggtccatc 900 catttgccta ggaatttcat aaattcattc tttttaatag ctcagtagta ctccattgtg 960 tagatgtacc acattttctg tattcattcc tctgttgagg ggcatctggg ttctttccag 1020 cttctggcta ttataaataa ggctgctatg aacatagtgg agcatgtgac cttcttaccg 1080 gttgggacat cttctggata tatgcccagg agaggtattg ctggatcttc cggtagtact 1140 atgtccaatt ttctgaggaa ctgacaaact gatttccaga gtggttagta ccagcttgca 1200 atcccaccaa caatgagagg agtgttcgtc tttctccaca tcctcaccag catgctgctg 1260 tcacctgaat ttttgatgct tagccattct gactggtgtg aggtggaatc tcagggttgt 1320 tttgatttgt atttccctga tgattaagga tgctgaacat tttctcaggt gcttctcagc 1380 cattcagtat tctttaggtg agaattcttt gtttagctct aagccccatt tttttaatgg 1440 ggttatttga ttttctggag tccaccttct tgagtttttt tttccatttt ttattacata 1500 atttcctcaa ttacatttcc aatgctatcc caaaagtccc ccataccctc ccccccccaa 1560 ttccctaccc accccttccc atttttttgg ccctggcgtt cccctgtact ggggcatata 1620 aagtttgtgt gtccaatggg cttctctttc cagtgatggc tgactaggcc atcttttgat 1680 acatatgcag ctagagtcaa gagctcccgg gtactggtta gttcataatg ttgttccacc 1740 tatagggttg cagatccctt tagcttcttg ggtactttct ctagctcctc cattgggagc 1800 cctgtgatcc atccaatagc tgactgtgag catccacttc tgtgtttgct aggccccggc 1860 atagtctcac aagagacagc tacatctggg tccttttgat aaaatcttgc tagtgtatgc 1920 aagggtgtca gcatttggaa gctgattatg gggtggatcc ctggatatgg cagtctctac 1980 atggtccatc cttttgtctc agctccaaac tttgtctctg taacttcttc catgagtgtt 2040 ttgttcccaa ttctaaggag gggcatagtg tccacacttc attcttcatt cttcttgagt 2100 ttcatgtgtt tagcaaattg tatcttatat cttgggtatc ctaggttttg ggctaatatc 2160 cacttatcag tgagtacata ttgtgtgagt tcctttgtaa atgtgttacc tcactcagga 2220 tgacgccctc caggtccatc catttggcta ggaatttcat aaattcattc tttttaatag 2280 ctgagtagta ctccattgtg taaatgtacc acattttctg tactcattcc tctgttgagg 2340 ggcatctggg ttctttatag gttctggcta ttataaataa ggttgctatg aacatagtgg 2400 agcatgtgtc cttcttaccg gttgagacat cttctggata tatgcccagg cgaggtattg 2460 ctggatcctc cggtagtact atgtccaatt ttctgaggaa ctgccagact gatttccaga 2520 gtggttgtac aagcctgcac tctcaccaac aatggaggag tgttcctctt tctccacatc 2580 cacgccagca tctgctgtca cctgaatttt tgatcttagc cattctgact ggtgtgaggt 2640 ggaatctcag ggttgttttg atttgcattt ccctgatgat taaggatgtt gaacattttt 2700 ttcaggtgct tctctgccat tcggtattcc tcaggtgaga attctttgtt cagttctgag 2760 ccccattttt taatggggtt atttgatttt ctgaagtcca ccttcttgag ttctttatat 2820 atgttggata ttagtcccct atctgattta cgataggtaa agatcctttc ccaatctgtt 2880 ggtggtcttt ttctcttatt gacggtgtct tttgccttgc agaaactttg gagtgagttc 2940 tttatatata ttggatatta gtcccctatc tgatttagga taggtaaaga tcctttccca 3000 atctgttggt gacctttttg tcttattgac ggtgtctttt gccttgcaga atctttgcaa 3060 ttttatgagg tcgcatttgt caattctcga tcttacagca caagtcattg ctgttctgtt 3120 caggaatttt tcctctgtgc ccatatcttc gaggctttta cctgctttct cctctatatg 3180 tttgagtgtc tctggtttaa tgtggagttc cttaatccac ttagatttga ccttagtaca 3240 aggagatagg aatggatcaa ttcgcattct tctacatgat aaccgctagt tgtgccagca 3300 ccatttgttg ataatgctgt cttttttcca ctggatggtt tttgctccct tgtctaagat 3360 caagtgacca taggtgtgtg ggttcatttc tgggtcttca attctatttc attggtctac 3420 ttgtctgttg ttataccagt accatgcaga ttttatcaca attgctctgt agtagagttt 3480 taggtcaggc atggtgatta caccagaggt tttttttatc cttgagcaga gtttttgcta 3540 tcctaggttt tgtgttattt cagatgaatt tgcagattgc cctttccagt tcgttgaaga 3600 attgagttgg aattttgatg gggattgcat tgaatctgta gattgctttg gcaatatagc 3660 catttttact atattgatcc tgccaatcca tgagcatggg agatctttcc atcttctcaa 3720 atcttcttta atttctttct tcagagactt gaagttcttg tcatacagat ctttcacttc 3780 cttagttaga gtcacgctaa ggtattttat attatttgtg actattgaga agggtgttgt 3840 ttccctaatt tctttctcag cctgtttatc ctttgtgtac agaaaagcca ttgacttgtg 3900 ttagttaatc tcatatccag ctacttcact gaagcggttt atcaggttta ggagttctct 3960 ggtgtaattt ttagggtcac tcatatatac tatcatatca tctgcaaaaa gtgacatttt 4020 gacttcttcc tttccaattt gtatcccctt gatctccttt tgttgtcgaa ttgctctggc 4080 aaggacatca agtactatat tgaataggta gggagaaaat cggcaccctt gtctagtccc 4140 tgattttagt aggattgctt caagtttctc accatttact ttgatgttgg ctactggttt 4200 gctgttgaat gctttttatc atgtttaggt atgggccttg aattcctgat ctttccaaga 4260 cttttatcat gaaagggtgt tggattttgt caaatgcttt ctccagcctt tcattctgag 4320 gttgtgtctg tctttttccc tgagatgggt ttcctgtaag cagcaaaatg ttgggtcctg 4380 tttgtgtagc ccgtctgtta ttctatgtct ttttattggg gagttgagtc cattgatatt 4440 aagatatatt aaggaaaagt aattgttgct tcctattatt tttgttttta aagttggcat 4500 tctgttcttg tggctgtctt cttttaggtt tgttgaagga ttcctttctt gctttttcta 4560 ggtcgtggtt tccatccttg tattcatttt ttttctgtta ttatcctttg aaggactgga 4620 ttcatggata gataatgtgt gaatttggtt ttgtcttgga atacttttgt ttctccatct 4680 acggtaattg agagtttggc tgggtatagt agcctgggct ggcaattgtg ttgtcttagt 4740 gtctatataa tgtctgtcca ggatcttctg gctttcatag tctgtggtga aaaatctggt 4800 gtaattctga taggcttgcc tttatatgtt acttgaattt ttcacttact gcttttaata 4860 ttctttcttt atttagtgca tttgttgttc tgattattat gtgtcgggag gaatttcttt 4920 tctggtccag tctatttgga gttctgtagg cttcttgtat gttcacgggc atctctttct 4980 ttaggtttgg gaagttttct tctataattt tgttgaagat atttgctggc ccttcaagtt 5040 gaaaatgttc attctcatct actcctatta ttcgtatggt tggtcttctc attgtgtcct 5100 ggatttcctg gatgttttga gttaggatct ttttgcattt tccattttct ttgattgttg 5160 tgcagatgtt ctctatggaa tcttctgcac ctgatattct ctcttccatc tcttgtagtc 5220 tgttgctgat gctcgcatct atggttccag atttctttcc tagggtttct atctccagtg 5280 ttgccccact ttgggttttc tgtatagtgt ctacttccct ttttagatct agtatggttt 5340 tgttcatttc catcacctgt ttgggtgtgt tttcctgttt ttctttaaag acttgcaact 5400 ctttagcaga gttctcctgt atttaagtga gttattaaag tccttcttga tgtccagtac 5460 cataattgtg agatatgcct ttaaatccaa gtctaggttt ttgggtgtgt tggggtgccc 5520 tggactggct gagttgggag tgctgcattc tgatgatggt gagtggtctt ggtttctgct 5580 agtaagattc ttacatctgc ctttcgccat ctggtaatct ctggagtcag ttgttaaagt 5640 tgtctctggt taaagcttgt tcctctcgtg attctgttat tctcttccag cagacctggg 5700 agactagctc tttcctgagt ttcagtggtc agagcactct ctgcaggcag gatttcctct 5760 ttcagggaag gtgcacagat atctggtgtt cagatttgcc tcctggcaga agatgatggc 5820 ctgaaacagg acctgtccca gaagctgtta gcttctgtag tcaacactgt cacctgtgca 5880 gactagtctc ggtggagtcc gggaaccaag atgtctcctg cagatgctct ggcattccct 5940 tctgggccgg gtgatcacct ctcctctggc agggaaggtg ccctggtgtc tggaacccga 6000 aaagggggct gcctcagaag ctctgtggct actgcctgtc ccagaagctg ttagcttctg 6060 tagtccacac tctcacctgt gcagactagt cttggtggag tctgggaacc aagatgtctc 6120 ccgcagatgc tccagccatt ctcctctttc tgttgcttat tttgacctat gaaatcctgg 6180 acatatagtt ctagtgttgc ttgtaatctc ttttctaagc caaggaattt tttttatcta 6240 gggcacaatc ttttgagaag acatattaaa tcaagagaat aaatattgca agaccaataa 6300 atgataaggt atctattttc tttaaatcca tcgctgtcaa accattcaaa atatcctcac 6360 ataaagccaa aaagatattt attgtgtttc ccatcttagt tgagttcaag tcaatatttt 6420 ggtgccattt tgttgcagta aatctctaac acaaatatgc ctgggcaatg aaaacacaac 6480 tcagttaata tgaatacaga ttgttcagat ctaccactac actaccatct tcttcatcta 6540 agagacccct tagaacttgc agtttctcca ggccttgtgc ttctgcgctg cttttcttct 6600 tcttcctctt ctacattgct tctctcataa acctacttct ttttttccct ccttctgttc 6660 catcttccct tttatctgcc caatcattag ctctccttta ttttacaaat taaggtgtga 6720 agccggtttc taggaaatca cctgagtgct gacttgttcc ttgttcagag ccacgcacag 6780 gagaacagaa ttaacatcaa atataattat ccccagggct atccacaaca cgtgcatcct 6840 ataagatcac cacggactaa tgctggtctt caattacaac ataaacaaca aaaaccccac 6900 atatatgtgg aaacaaatcg aactatacaa agaatcaatg aaaccaggag cttgttcttt 6960 gagaaaaatc aacaagatag ataaaccctt agccagacta accagagggc acagagacag 7020 tatccaaatt aataaagtca gaaatgaaag gaagacataa caatgaaata tatcttaaaa 7080 taattaatct gtttgtagac tattagcagt tgaaaatatt aaaatcatgt tctacaaacg 7140 tggaattatt attgataatt ttctcactgt gcttgaaatt agcattttct taatgtttaa 7200 cttcaaagag tttttgctat tttgaaatat taaacatata cttactgata aaataatttc 7260 cctcctaaca acactgataa tcttttttta agtaaactga ttattagaca atgtacacag 7320 atatataatg tgttttaaat actctcccac tgtcaggtgg tatcatatag ggcctttgaa 7380 tatattttta aatgtattat ttgtaatatt ttatggtctc tcctatgctt atttctgaaa 7440 gaatattttg tatgttttga aacaatttag tatttaacat tagatatagg atcctcagtt 7500 atggatagta ttaaatattc attaatgata tttttaaggt ataaaaggat atgaatataa 7560 aagtttaaca aattttatgt attatttgat tctaaaaata ctcaatatta ttaatatgtt 7620 tgatgtttaa aatgcattta aataataaaa acatttaaaa aaataaaatc aagaaatgag 7680 gttctaagca gaggtcaagg aaaatgagga atagaaaaat agtaaaaatc aatatgtcca 7740 tttattcaag gaaagctcct acatagacat tgcaccagat tagcaaatat tatggtcctc 7800 atattagttt aagttaggag actatgctta tgttatctat ttacattcta aggagcctag 7860 acatttgtga atggattaca ttataagagg aggatgtcta cttaagtagg catgaacgcc 7920 tgtgcattgc accctatgag ttccatcagc attccatgat tggagtatga agaacagcat 7980 tatagacatt acccagaacc ttagtggttc tagaatgcca agataaaaca atctaacctt 8040 ctggatagta gggataaatg ttcctatatc atcagaattc actggtgccc tgaggatgtt 8100 accctgctaa ctgacaattc acaggacatc acatggattc tgataagttg cagaaaagag 8160 gagatgcatt caattggtcc tcctccttct aagctgcaat attaggtgca tccaatttgt 8220 gaacttcaat ttagattaca atagacatga ataatctgaa ttcatgtagt acatattttt 8280 gttttaatat gagttaccat tgttcagaaa attaaataca catgatcaca tattcctaca 8340 tagtgctgtt agtttttcac atctctggga caatattcca aatatctcct tcattagtga 8400 aaatatcaac tactgtaaag cttagctaac atgcctttgc aggaataaga acatcctgga 8460 ttgaaagcta cacagggaga tgtaaaactt tctaagcaca cacattctcc atccattagg 8520 atcatggtcc atgagatttt tctctctctc ttcttcccat taaatgcatg tacatgcagg 8580 ttgggaaaca gattgtgttg cagaatacat ttgcttgatt tccacttcct tctcaatgca 8640 aatatttttg aagtgttaat tttgctgtga gtaccacagt ggttcttgct ctttctgttg 8700 actcctgtct gtgaatgttc caggaattca cacatggaca cacgtggggc tgcatctgag 8760 ctccagactc actgttgtcc ttctgtcctc agctgctctg gcccaggcac agcctcgtga 8820 attcaacaaa gaccctgatc tctcttgttt acacctcatt acaaatggga actgttagag 8880 gtggacccaa ctgcatttcc atgaggaaag cacatgagtt tgagagggtc gttgatgata 8940 aggtagaaac aactttaatt cataggctga gatatcagtc atcacctcca gataaacaag 9000 agccatttct tcctgcatct gagccctgta agcacactag ctttaggaat atgttactgc 9060 tgaagtcaga ttgggcaact tcatagtata caatagaaaa tctacctgca gatgagttca 9120 gaaccagcag ggggcacaat ggggccaaga atccctagca gagagatgtg gtgtgtgtgc 9180 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tatagggatg tctacacccc tcaaaaactt aagatcactg tcgtcttcac agtcacagga 10080 gtacacagga catcaccatg tgttggagct gtatcatcct cttcctgtta gcaacagctg 10140 cacgtaaggg gcttacagta gcaggcttga ggtctggcca tacactcatg tgacaatgac 10200 atccactctg tccttccctt cacaggtgtg cactcccagg tccagctgca gcagtctggg 10260 gctgagctgg tgaggcctgg ggcctcagtg aagatttcct gcaaggcttt tggctacacc 10320 ttcacaaacc atcatataaa ctgggtgaag cagaggcctg gacagggcct ggactggatt 10380 ggatatatta atccttataa tgattatact agctacagaa ccagaagttc aagggcaagg 10440 ccacattgac tgtagacaaa tcctccagca cagcctatat ggagcttagc agcctgacat 10500 ctgaggactc tgcagtctat tactgtgcaa gacacagtgc tacaaacaca tcctgagtgt 10560 gtcagaaacc ctggaggaga agcaagcaga gctggaatgg agatgacaga aagattatca 10620 tttagacttg ctcagaaaga gaaattttga atgcccattt attgcctctt ccttacagta 10680 ctatagtgcc tgtttttgtt gacattttca aactaatttc caaagtcact accacaattt 10740 acaatcacat aaaaagcaag caaggataac attattttct gtgcttactt gccatttata 10800 ttcttgctta ttctcatctc actgaggtca tattgggaca ttaaatttct 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<210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 19 gatgggaaga gactggtaac atttgtac 28 <210> 20
<211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 20 ttcctctatt tcactctttg aggctc 26
<210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 21 cctccactgt gttaatggct gccacaa 27
<210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 22 ggtgtgcgat gtaccctctg aac 23
<210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 23 tgtggcagtt taatccagct ttatc 25
<210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 24 ctaaaaatgc tacacctggg gcaaaacacc tg 32
<210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 25 gccatgcaag gccaagc 17
<210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 26 agttcttgag ccttagggtg ctag 24
<210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 27 ccaggaaaat gctgccagag cctg 24
<210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 28 aactacgcac agaagttcca gg 22 <210> 29 <211> 18
<212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 29 gctcgtggat ttgtccgc 18
<210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 30 cagagtcacg attacc 16
<210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 31 tgagcagcac cctcacgtt 19
<210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 32 gtggcctcac aggtatagct gtt 23
<210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 33 accaaggacg agtatgaa 18 <210> 34 <211> 296
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 34 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 35 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 35
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 36 <211> 294
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 36 caggtccagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 37 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 37
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Thr lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie lie Pro lie Leu Gly lie Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 38 <211> 275
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 38 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgatgac acggc 275 <210> 39 <211> 91
<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 39
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr 85 90 <210> 40 <211> 296
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 40 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 41 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 41
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie lie Pro lie Leu Gly lie Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 42 <211> 294
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 42 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accacggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaga 294 <210> 43 <211> 98
<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 43
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 44 <211> 296
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 44 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 45 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 45
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 46 <211> 233
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 46 agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc ttcagcagct 60 atgctatcag ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggaaggatca 120 tccctatctt tggtacagca aactacgcac agaagttcca gggcagagtc acgattaccg 180 cggacgaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gag 233
<210> 47 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 47
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr 15 10 15
Phe Ser Ser Tyr Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly 20 25 30
Leu Glu Trp Met Gly Arg lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr 35 40 45
Ala Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr 50 55 60
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 65 70 75 <210> 48 <211> 296
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 48 caggtccagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 49 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 49
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Thr lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie lie Pro lie Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 50 <211> 296
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 50 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 51 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 51
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie lie Pro lie Leu Gly lie Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 52 <211> 296
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 52 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 53 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 53
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Leu Gly lie Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 54 <211> 296
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 54 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 55 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 55
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie lie Pro lie Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 56 <211> 296
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 56 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 57 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 57
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 58 <211> 296
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 58 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 59 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 59
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 60 <211> 305
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 60 gagcccactc ccaggtgcag ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag cctggggcct 60 cagtgaaggt ctcctgcaag gcttctggat acaccttcac cggctactat atgcactggg 120 tgcgacaggc ccctggacaa gggcttgagt ggatgggacg gatcaaccct aacagtggtg 180 gcacaaacta tgcacagaag tttcagggca gggtcaccag taccagggac acgtccatca 240 gcacagccta catggagctg agcaggctga gatctgacga cacggtcgtg tattactgtg 300 cgaga 305
<210> 61 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 61
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Ser Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 62 <211> 307
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 62 gagcccactc ccaggtgcag ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag cctggggcct 60 cagtgaaggt ctcctgcaag gcttctggat acaccttcac cggctactat atgcactggg 120 tgcgacaggc ccctggacaa gggcttgagt ggatgggatg gatcaaccct aacagtggtg 180 gcacaaacta tgcacagaag tttcagggca gggtcaccat gaccagggac acgtccatca 240 gcacagccta catggagctg agcaggctga gatctgacga cacggccgtg tattactgtg 300 cgagaga 307
<210> 63 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 63
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 64 <211> 307
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variação <222> (124)...(124) <223> n=a, g, t ou c <400> 64 gagcccactc ccaggtgcag ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag cttggggcct 60 cagtgaaggt ctcctgcaag gcttctggat acaccttcac cggctactat atgcactggg 120 tgcnacaggc ccctggacaa gggcttgagt ggatgggatg gatcaaccct aacagtggtg 180 gcacaaacta tgcacagaag tttcagggca gggtcaccat gaccagggac acgtccatca 240 gcacagccta catggagctg agcaggctga gatctgacga cacggccgtg tattactgtg 300 cgagaga 307
<210> 65 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (38)...(38) <223> Xaa=qualquer aminoácido <400> 65
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Leu Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Xaa Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 66 <211> 294
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 66 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggctg ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 67 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 67
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 68 <211> 346
<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 68 aggatgtggg ttttcacact gtgtctctcg cacagtaata cacgaccgtg tcgtcagatc 60 tcagcctgct cagctccatg taggctgtgc tgatggacgt gtccctggtc atggtgaccc 120 tgccctgaaa cttctgtgca tagtttgtgc caccactgtt agggttgatc cgtcccatcc 180 actcaagccc ttgtccaggg gcctgtcgca cccagtgcat atagtagccg gtgaaggtgt 240 atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccagg cttcttcacc tcagccccag 300 actgcaccag ctgcacctgg gagtggacac ctgtggagac tcgcga 346
<210> 69 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sintética <400> 69
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Vai Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg
<210> 70 <211> 150288 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 70 gcgcgccctg gcatggagga aatgacaaag attattagat tgaagacttt ctcagaaaat 60 gatattaagt cattaaggaa aaggaacaat ataaacgtgt atttgagaaa ttttaattat 120 ttgagagatt tttcatacaa tatttattct gcaagcaaat ttcagggatt gaattaataa 180 aactgataca gaacttcctc tgtaggtatc tgtgtaaaca tcaatttctg aatcagtgtt 240 gtaaatattt tggaacacac acacaaatca cattttatct ctacttttat ctctattttt 300 aaaaatgcca aaaaaactca ttttgtgcat gtagcatttt gaattcccac catcaatgca 360 tgatagttct tggttttcca cattcatatt gccatttatc attatgagaa ttgtgtgttt 420 taaccattct aataggtgag taatggtatc taatttttag ttaaatgcac atttccctaa 480 taaaaattca catttaacaa ttttcatata atttttgcca agatgcctct tctcatattt 540 ggttcatttt taactgcatt gttttctttt gattagttgt aagtttactt gcatattgat 600 tataaaatca tttaacaaat taaaagaatt catttaacaa atatgtgact tggaagtatt 660 ttctccaagt ctgcggctgt cttttactcc cttatcagta tgtattgcag aaaagtgtgt 720 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ttatacaaat ttagatttaa aaaatgtaaa atgttattca 780 tccacagatc atgtctttgg tattatatct gaaatctcat tataaaatac agtaatagca 840 attacttttt ccacgtctct aatctcaggc tacaatcaac tcatgagtgt ttaagcttca 900 cctacttgat tagaggacta tcaacctaac atatttggaa tacttctgta aaaagatgtg 960 ttcctcttcc tattatttct ttatttgatc acttattaat atgtgtattg gtttatggat 1020 gtctatttca tactctgaag aagatccatg ctacattatt cattttattt ttcaaaccac 1080 cacggcttta ttatgtgctg ggagctcatt gagtttggat cctgcatcct tacagctcac 1140 ctcatgcttt tgtttttgaa cacttccctg tttcctgcta ttataataaa ttctaaactc 1200 attttctata ttatcttttt catacataga atcagccatt tttctaaaga ttgcttgctt 1260 ctgatgttaa agaatagtat ttaaaaaatt gtaatactgg gtatgtgcat tgttaatgtg 1320 gtataagtac ttgcaggacc tctcaaccaa ctggcctagt aaactatgta tctaaccttc 1380 tgtaatgtga ttacattaaa aatgagaaca cactggtctc tctacccaat tatgctacca 1440 catggatctt tctagccttc cttccttgac tgtctataac ctctcactgc aaaatgagga 1500 accccatcca accatatgcc attttattac ttagctgcac aatttcagga cacatgcata 1560 gcagtatcag aaatgtaaag ctgtaccctt gtaggaaaca tgtttatcta ctagaataga 1620 gtgcttatgt tcagtttctt tacactttaa acttacagag tttcctcatt ttcaaagttc 1680 cttaggtcag caacttcatt ttccactttc ttcagtgagg tcatttcaat gacactgtat 1740 aatttgattt atttgaaatt ctataaaagc caaaactgta gtcaagtgaa caacaacata 1800 tagaggatat tcgaggagtt tagagactgg tataaaataa gttaaaaaga cactgtttaa 1860 gaagattaaa attattttta gtgatatgca atggttcaga tatgacacaa ttaatttgtc 1920 taagcacata gttttgtgat ggaaaatata aacctaaata tatacaatta aaaaaaaatt 1980 tagcagttca ttaacccaag gatcaaatgc agattgtata aaattatctc attacttatt 2040 ttgtgagggt ggagatttca tgagatgtat gcaacaaaga atgaggtaat tttcctgatt 2100 tgcatataag atgttgccat tcactaaaga cctttaattt tttaaattgt ttttttttta 2160 aatcaatttt ctatgtgacc caggtttttt tctcttgaca agcaaataac ccacaggatt 2220 attttctttc cttggttgag aaatatttcc ccaaacttca gctcagttca ggcatacact 2280 gtccctgaat gggcatttac cctcagatgg gtacacacac ctgtcaacat gtggactctt 2340 ctgtcagaca aacgcacctt tactcacgtg gattcttctc tcagacaaac acacatgtcc 2400 ccacgtggac tctttcctca gactaccaca tatgttctta catttactct ttcctcagaa 2460 aacagacatt tcctcatgtg gactcttgtc tcagacaagc aaacatgtct ccatgtgaac 2520 tcttcactca cataagtaca catatgtcca cattgactgt ttccttacac aagtacatat 2580 atccaatgtc gaattgttct gtggcaaaat gatctcaaga taatgataat cataaacccc 2640 ctccctgaca aggcatagat ctgtattttt ttcattgcaa cctaactttg ccttattgtc 2700 aagaacagta gtttgcagct ctaaatatac caattagaga caggtgtcca ttttctctgg 2760 aaacgtattt ttatgttctt actggacata tttgttgata atgtttgcta ttatgaagat 2820 accccaacag tgtccacatt agagaataaa aaatagtaat gggcagatta actctgtgca 2880 tccagaccca gaaatccttt gaccttgact tccctgaaat gtagacacag aggatggatg 2940 agcaatgctg agcagtgcac ccatgaccac aaaaagaaag acgtggaaat gtgtcccctc 3000 cacttctcat gaaaggcagc tcatcccctg ttccctcagg ccctggcgag gagccacccc 3060 atgtctgtgc ccttcctcag tgtccacacc gtggggtctg cattgatctg gattctcttc 3120 tcatccccgt caatattagt gtccttcgta aatcaggtcc agctgtggct tctcctcacg 3180 gggctgttct cagtctgttt gctgtgttca cggaagtcct gtgtgaagtt tactgatgga 3240 gtcagagggg gaaaaaattt acagcccagt ggtgagactc tcctgcaaag cctctggttt 3300 cacctttact ggttacagca tgagcttggt ccagcacgct tcacaacagg gataggtgtg 3360 ggtgccaaca gtgagtgatc aagtatgaat tctcagggtt actttccatg agtacaaata 3420 aattaacaat ctcaagcaac acccttttaa gtgcagtctg ccttacaatg accaatctga 3480 aagccaagga caaggtcatg tattactgtg agtgacacag tgagggaaac cctgtgtgag 3540 cccagacaca aagctcaccg cagggagaca ggaggggact atgtggtaga tgctgctcag 3600 aaccaccagg gggcatcagg accatcaggg agggtgcaca gaaccaccag gaggggctca 3660 ggacaccagg gggcgctcag aaccaccagg gggccctcag gacaccagag ggtgctcaga 3720 accaccagga ggcgctcagg acaccagggg gcgctcagaa cactaggagg tgctatgaat 3780 cactaggggg cgctcaggac acaagggagc actcagaacc accagggata gctcaggata 3840 ccagggggca ctcggaaccg ccagggggcg ctcaggacac tagggggcgc tcagaaccac 3900 cagggggcac tcaggaccat cagggagggt gcacagaacc accaggaggg gctcaggaca 3960 ccagggggcg ctcaggacca caagggggcc ctcaggacac cagggggcac tcggaaccac 4020 cagggggcac tcagaaccat cagggagggt gcacagaacc accaggaggg gctcaggacc 4080 accaggaggt gctcaggaca ccagggggcg ctcagaacac taggaggtgc tatgaatcac 4140 tagggggcgc tcaggacaca agggagcact cagaaccacc agggatagct caggacacca 4200 gggggcactc ggaaccgcca gggggcgctc aggacactag ggggcgctca gaaccaccag 4260 gaggcactca ggaccatcag ggagggtgca cagaaccacc aggaggtgct caggacacca 4320 gggggcgctc agaacactag gaggtgctat gaatcactag ggggcgctca ggacacaagg 4380 gagcactcag aaccaccagg gatagctcag gataccaggg ggcactcgga accgccaggg 4440 ggcgctcagg acactagggg gcgctcagaa ccaccagggg gcactcagga ccatcaggga 4500 gggtgcacag aaccaccagg aggggctcag gacaccaggg ggcgctcagg accacaaggg 4560 ggccctcagg acaccagggg gcactcggaa ccaccagggg gcactcagaa ccatcaggga 4620 gggtgcacag aaccaccagg aggggctcag gaccaccagg aggtgctcag gacaccaggg 4680 ggcgctcaga acactaggag gtgctatgaa tcactagggg gcgctcagga cacaagggag 4740 cactcagaac caccagggat agctcaggac accagggggc actcggaacc gccagggggc 4800 actcaggaca ctagggggca ctcagaaccg ccaaggggcg ctcagaagaa gcagggggtg 4860 ctcagaacac cagagggtgc tcagaagcac cagggggcgc tcaggacacc aaagggcact 4920 catgagactg tggcaagggg gtgctgagaa ccacaggatg tgaccaagac accaaggggc 4980 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atttacctat tttatcacgt ttgttttgtc aatcacagta agtgtcgaat tcgctatctg 8400 ttatagatgt tagcctattt tctatcccag atccattggt taaatctttg gtgatgcctt 8460 ttagaaaact gatcccttta ccctatgtaa tatgcccctt gattcctgaa agtcttatgt 8520 ctaccttgtc tgaatttaac atagctaagc acgctttctt ttcgttcata ttttcatggt 8580 ccatgttttc ctgtatttaa cttttctatg tagagcaaat ttctgtacag agctagtagt 8640 tgggtcttgc tttttaaatc aactataata attctatttt aaaactggta ttactatttt 8700 tctgttaatt tctgttttaa tttggcattt tatgatcatg tttatttctc tattaactta 8760 ttgtttagtt catcttttat gaatattgta ttggccctaa gatatacaat aagaattgtg 8820 tataatcaga ttctaattca aataacgtaa aacctcttca taggttgtag agctattata 8880 acttattctt ctaaacactc tttctcatcc gttgtcttag tttattctca gtttgcactt 8940 atatgtgcta taaaatataa tatgtgcatt tttatcatta catagacata tattagaaca 9000 attaaaaata taaaaactac atttcaactt cattttttca ttcttgacca catgttttat 9060 ttggatagat tcatgtttcg gatgtatatc atatggctac tcaccctggc agaaaatttg 9120 ccaaagcacc tactgaagga tgaatgcact agcaataaat tttctcagaa tcgatttgtc 9180 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<210> 74 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 74 agactgtgcg cacaccgctg gac 23
<210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 75 tcttatcaga cagggggctc tc 22
<210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 76 aagaagcaca cgactgaggc ac 22
<210> 77 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> variação <222> (12) ... (12) <223> w = a ou t <220> <223> sintética <400> 77 agtggataga cwgatggggg tg 22
<210> 78 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 78 agtggataga ccgatggggc tg 22
<210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 79 aagggataga cagatggggc tg 22
<210> 80 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 80 ggaagacatt tgggaaggac tg 22
<210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> sintética <400> 81 ggaagatgga tacagttggt gc 22

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Ratinho cujo locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena é restrito, em termos de conter um segmento de gene VH humano único, um ou mais segmentos de gene DH humano, e um ou mais segmentos de gene Jh humano e que não contém um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina endógena funcional; sendo que o ratinho contém adicionalmente um ou mais segmentos de gene Vl de imunoglobulina humana ligados de modo operacional aos um ou mais segmentos de gene Jl humano, em que o segmento de gene VH humano único, um ou mais segmentos de gene DH humano, e um ou mais segmentos de gene Jh são ligados de modo operacional a um gene de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana, em que o segmento de gene Vh humano único é VHl-69 ou uma variante polimórfica do mesmo.
  2. 2. Ratinho, de acordo com a reivindicação 1, em que o ratinho contém uma deleção de todos os segmentos de gene VH, Dh e Jh endógeno.
  3. 3. Ratinho, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o segmento de gene Vh humano único, um ou mais segmentos de gene Dh humano e um ou mais segmentos de gene Jh humano substituem todos os segmentos de gene Vh, Dh e Jh endógeno num locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena na linha germinal do referido ratinho.
  4. 4. Ratinho, de acordo com a reivindicação 3, em que os um ou mais segmentos de gene VL humano e um ou mais segmentos de gene Jl humano substituem todos os segmentos de gene Vl e Jl endógenos num locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena.
  5. 5. Ratinho, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os um ou mais segmentos de gene Vl humano e/ou os um ou mais segmentos de gene Jl humano são selecionados a partir de segmentos de gene κ humano e λ humano.
  6. 6. Ratinho, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os um ou mais segmentos de gene Vl de imunoglobulina humana e um ou mais segmentos de gene Jl humano estão ligados de modo operacional a um gene constante de cadeia leve não humano, por exemplo, um gene de região constante κ ou λ de ratinho ou rato.
  7. 7. Ratinho, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o segmento de gene VH humano único, um ou mais segmentos de gene Dh humano, e um ou mais segmentos de gene Jh estão ligados de modo operacional a um gene de região constante de imunoglobulina de ratinho ou rato.
  8. 8. Ratinho, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o segmento de gene VH humano único, um ou mais segmentos de gene Dh humano, e um ou mais segmentos de gene Jh estão ligados de modo operacional a um gene de região constante de IgM de ratinho.
  9. 9. Célula ou tecido derivado do ratinho de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
  10. 10. Método para fazer uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio VH humano que compreende as etapas de: (a) imunizar um ratinho, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, com um antigénio de interesse; (b) permitir que o ratinho referido produza uma resposta imunitária para o antigénio de interesse; e (c) obter uma sequência de ácidos nucleicos de região Vh de imunoglobulina que codifica um domínio Vh humano a partir do referido ratinho.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência de ácidos nucleicos de região Vh de imunoglobulina: (a) contém uma sequência pelo menos 75% idêntica à SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56 ou SEQ ID NO: 58; ou (b) contém a SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, ou uma variante polimórfica da mesma; ou (c) codifica uma proteína que é pelo menos 75% idêntica à SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 59.
  12. 12. Utilização de um ratinho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, num método para produzir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável de cadeia pesada humano.
  13. 13. Utilização, de acordo com a reivindicação 12, em que o domínio variável de cadeia pesada humano é caracterizado por ter sequências FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 humanas derivadas de um segmento de gene VHl-69 humano polimórfico.
  14. 14. Utilização de um ratinho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para fazer um anticorpo humano, em que o anticorpo humano contém um domínio variável de cadeia pesada derivado de um segmento de gene Vh1-69 humano redisposto, ou variante polimórfica do mesmo, em que o segmento de gene Vh1-69 humano redisposto é pelo menos 75% idêntico à SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56 ou SEQ ID NO: 58.
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