FI105105B - Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan - Google Patents
Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan Download PDFInfo
- Publication number
- FI105105B FI105105B FI980463A FI980463A FI105105B FI 105105 B FI105105 B FI 105105B FI 980463 A FI980463 A FI 980463A FI 980463 A FI980463 A FI 980463A FI 105105 B FI105105 B FI 105105B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- self
- vector
- papillomavirus
- hiv
- replicating
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 73
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title claims description 30
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 88
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 36
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 18
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 claims description 7
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 claims description 5
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 101710192141 Protein Nef Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 25
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 9
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 101150023385 nef gene Proteins 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 5
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 3
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 1
- 108010084873 Human Immunodeficiency Virus nef Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020134 Human immunodeficiency virus 1 nef Proteins 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 101900222562 Influenza A virus Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010028470 Mycoplasma infections Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710195626 Transcriptional activator protein Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000002542 deteriorative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000006656 viral protein synthesis Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
! 105105
Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan
Keksinnön alue
Keksintö koskee itsereplikoivaa rekombinanttivektoria, joka on 5 käyttökelpoinen DNA-immunisoinnissa HIV:tä vastaan. Keksintö koskee myös mainittua vektoria käsittävää rokotetta, menetelmää vektorin valmistamiseksi ja sitä käsittävää isäntäsolua. Lisäksi keksintö koskee mainitun vektorin käyttöä HIV:n vastaisen rokotteen valmistamiseksi ja menetelmää HIV:n hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi.
10 Keksinnön tausta
Selkärankaisten ja siten myös ihmisten vuorovaikutusta patogeenisten mikrobien, kuten bakteereiden, sienten ja virusten, kanssa säätelee selkärankaisen elimistön kyky muodostaa immuunivaste elimistöön tunkeutuvaa mikrobia vastaan. Tämä reaktio perustuu immuunijärjestelmän kykyyn erottaa 15 toisistaan oma ja vieras; normaalitilanteessa immuunivaste sietää elimistön omia rakenteita, soluja ja antigeenisiä molekyylejä, samalla kun se hyökkää elimistöön tunkeutuvissa mikrobeissa esiintyviä vieraita antigeenejä vastaan. Kun selkärankainen, kuten ihminen, saa mikrobi-infektion, immuunivaste auttaa selviytymään infektiosta tappamalla mikrobeja tai mikrobien infektoimia 20 soluja tai estämällä infektion leviämisen vaarattomaksi tekevien vasta-aineiden toiminnan kautta. Toisaalta, ja mikä on tärkeämpää, tunkeutuvaa organismia vastaan kerran syntyneellä immuunivasteella on luontainen muistimekanismi, ja siten yksilö, joka on kerran käynyt läpi jonkin määrätyn mikrobi-infektion, on usein immuuni eikä voi saada infektiota toista kertaa.
25 Tämä immunologinen muisti, jonka aiheuttaa luonnollisessa tilan teessa infektio, on perustana rokotteille, jotka jäljittelevät monin tavoin luonnollista infektiota. Ihanteellinen rokote ei aiheuta oireita tai aiheuttaa vain lieviä oireita rokotetuissa yksilöissä, mutta johtaa silti sellaisen immunologisen muistin indusoitumiseen, jolla on kyky muodostaa vahva ehkäisevä immuunivaste, 30 jos rokote joutuu vastakkain kyseisen mikrobin kanssa.
Rokotteen suunnittelu jotakin määrättyä mikrobia vastaan riippuu mekanismista, jolla elimistö luonnollisen infektion ollessa kyseessä saattaa selvitä tästä määrätystä organismista ja estää myöhemmät infektiot. On olemassa muutamia tapoja, joilla immuunivaste voi herättää tämän suotuisan 35 toiminnan. Ensinnäkin B-lymfosyyttien syntetisoimat ja erittämät vasta-aineet voivat sitoutua mikrobiin ja tuhota sen komplementtivälitteisen lyysin kautta.
105105 2
Toiseksi vasta-aineet voivat estää infektion leviämisen inhiboimalla mikrobin sitoutumista kohdesoluunsa. Kolmanneksi vasta-aineet voivat komplementin aktivaation yhteydessä tuhota infektoituneita soluja ja myös spesifiset sytotok-siset T-lymfosyytit (CTL:t) voivat tappaa ja tuhota mikrobin infektoimia soluja.
5 Kaikkien näiden mekanismien on ajateltu olevan mukana immuunivasteessa, jonka herättää tyyppiä 1 ja 2 oleva ihmisen immuunikatovirus (HIV) (HIV-1 ja HIV-2). HIV:n infektoimien yksilöiden immuunivasteelle on kuitenkin tavallisesti tunnusomaista voimakas vasta-ainevaste ja vähemmän tehokas T-lymfosyyttivaste tai jopa sen puuttuminen [J. Gerstott et ai., J. Immunol. 22, 10 nro 5 (1985) 463- 470; M. C. Re et ai., J. Clinical Pathol. 42, nro 5 (1989) 282 - 283]. Tämä voi olla syynä siihen, miksi kerran HIV-infektion saaneissa yksilöissä on kehittynyt krooninen infektio huolimatta voimakkaasta vasta-ainevälitteisestä immuunivasteesta.
Ehkäisevän immuunivasteen virusinfektiolle voivat yleisesti ottaen 15 välittää edellä kuvatut neljä immuunivastetyyppiä, mutta tiedetään, että CTL-vaste, jolla on kyky tappaa viruksen infektoimia soluja, on tehokkain. Tästä syystä elävät heikennetyt virusrokotteet ovat yleisesti ottaen osoittautuneet te-hokkaimmiksi. Itse asiassa ensimmäinen rokote, jonka Jenner kehitti yli 200 vuotta sitten, elävä lehmänrokkovirus, joka pystyy ehkäisemään isorokkoviru-20 sinfektion, on esimerkki tästä periaatteesta. Kun yksilö rokotetaan elävällä heikennetyllä virusrokotteella, isäntäsolut infektoituvat ja syntetisoituu virusprote-iineja. Joitakin virusproteiinimolekyyleistä käytetään viruspartikkelien tuotantoon, kun taas jotkut pilkkoutuvat proteolyyttisesti pieniksi peptideiksi, jotka sitoutuvat päähistokompatibiliteetti (MHC) -antigeeneihin (ihmisessä HLA luokat 25 I ja II) ja ovat tarjolla T-lymfosyyteille infektoituneiden solujen pinnalla. Sen jälkeen T-lymfosyytit, joilla on asianmukainen T-solureseptori (TCR), tunnistavat HLAihan liittyneen vieraan peptidin ja joko ovat B-solujen apuna vasta-aineen tuottamiseksi (auttaja-/indusoija-T-solut; Th) tai tuhoavat infektoituneen solun (sytotoksinen T-lymfosyytti; CTL).
30 Huolimatta vuosikymmenen kestäneestä työstä tehokas rokote ih misen immuunikatovirus (HIV) -infektiota ja AIDSia vastaan puuttuu edelleen. Aiemmat yritykset ovat keskittyneet steriloivan immuniteetin aikaansaantiin HIV:n ulkovaipan glykoproteiinin, gp120/gp160:n, vastaisten vaarattomaksi tekevien vasta-aineiden avulla. Vaiheen l/ll gp160/gp120-tutkimukset osoittavat 35 kuitenkin vain laboratoriokantojen vaarattomaksi tekemisen, mutta eivät onnistu tekemään kentältä eristettyjä kantoja vaarattomiksi.
3 105105
Sen sijaan heikennetyllä viruksella tehdyt kokeet ovat olleet menestyksellisiä apinan immuunikato (SIV) -mallissa. SIV, jossa on NEF- tai REV-geenideleetioita, käyttäytyy heikennettynä viruksena ja suojaa rokotetut eläimet sairauden kehittymistä muttei villin tyypin haastajaviruksen aiheutta-5 maa infektoitumista vastaan. REV-virheen sisältävän viruksen ollessa kyseessä ainoa suojauksen kanssa korreloiva immunologinen tekijä oli soluvälitteinen immuunivaste (CMI-vaste) SIV:n säätelyproteiineja NEF ja TAT vastaan. Yksi tärkeä havainto tässä kokeessa oli, että rokotetut eläimet pystyivät jopa sel-viämään villin tyypin haastajaviruksen aiheuttamasta infektiosta. Viime aikoina 10 on raportoitu että myös HIV-infektiopotilaat saattavat satunnaisesti selvitä näkyvissä olevasta infektiosta. Ainoa merkitsevä suojauksen kanssa korreloiva tekijä näyttää näissä eläin- ja/tai ihmiskokeissa olevan soluvälitteinen immuunivaste HIV:tä vastaan.
Tämäntyyppistä immuunivastetta ei yleensä saada aikaan proteiini-15 immunisoinnilla. HIV:n ollessa kyseessä elävät heikennetyt rokotteet voisivat olla tehokkaita infektion ehkäisemiseksi, mutta ne ovat teoriassa vaarallisia useasta syystä. Yhdellä vähän aikaan sitten kuvatulla menetelmällä, geneettisellä immunisoinnilla (synonyymit: nukleiinihappoimmunisointi, DNA- immunisointi), on useita elävien heikennettyjen rokotteiden eduista muttei nii-20 den potentiaalisesti vahingollisia haittavaikutuksia. DNA-rokote, joka on yhtä tai muutamaa virusproteiinia vastaavan geenin sisältävän eukaryoottisen il-mentämisvektorin muodossa, voi indusoida virusproteiinisynteesin, kun isän-täsolu on transfektoitu DNA-vektorilla. Kohdesolussa syntetisoituneet virus-proteiinit joutuvat sitten proteolyyttisten entsyymien prosessoimiksi; muodos-25 tuneet peptidit sitoutuvat MHC/HLA-molekyyleihin ja niitä esiintyy transfektoi-tujen solujen pinnalla. Tämä aiheuttaa CTL-välitteisen immunologisen muistin, joka siinä tapauksessa, että yksilö joutuu myöhemmin virulentin villin tyypin viruksen infektoimaksi, tappaa tehokkaasti viruksen infektoimia soluja välittömästi tartunnan jälkeen ja ehkäisee siten infektion. On osoitettu, että cDNA:n . 30 suora lihaksen- tai ihonsisäisen injektointi eukaryoottisessa ilmentämisplasmi- dissa indusoi immuunivasteen [Wolff et ai., Science 246 (1990) 1465 - 1468]. Vieraiden antigeenien ilmentäminen mainitunlaisin keinoin johtaa pääasiassa auttaja-T-solujen alaryhmä 1 (TH1) -tyyppisiin immuunivasteisiin, joihin liittyy voimakas sytotoksinen T-lymfosyytti (CTL) -vaste ja joskus myös korkeatiitteri-35 nen vasta-ainevaste [B. Wang et ai., PNAS 90 (1993) 4156 - 4160; Wang et ai., NY Acad. Sei 772 (1995) 186 - 197; Haynes et ai., AIDS Res. Hum. Retro- 4 705705 viruses 10, nro 2 (1994) 43 - 45]. Lisäksi on raportoitu antigeenispesifisestä CTL:stä ja suojauksesta käytettäessä influenssa A -viruksen nukleoproteiini-antigeenia [Ulmer et ai., Science 259 (1993) 1745 - 1749J. Lisäksi on saatu aikaan hiirissä suojaus mykoplasmainfektiota vastaan käyttämällä DNA-5 immunisointia [Barry et ai., Nature 377, nro 6550 (1995) 632 - 635; Lai et ai., DNA Cell. Biol. 14, nro 7 (1995) 643 - 651] ja ihmisen papilloomavirusta vastaan kaniinimallissa [Donnelly et ai., J. Inf. Dis. 173, nro 2 (1996) 314 - 320]. DNA-immunisointia on käytetty myös sytotoksisten lymfosyyttien välittämän kasvaintenvastaisen immuniteetin indusointiin [Bohm et ai., Cancer Immunol.
10 Immunother. 44, nro 4 (1997) 230 - 238].
DNA-immunisoinnilla on useita etuja verrattuna eläviin heikennettyihin virusrokotteisiin. Koska infektoivaa virusta ei muodostu, isäntäorganismiin indusoidut virusgeenit pysyvät ainoastaan alun perin transfektoiduissa soluissa, eikä virusinfektion oireita esiinny. HIV:n ollessa kyseessä tärkein teoreetti-15 nen haittavaikutus elävän heikennetyn viruksen kohdalla olisi mutaatioiden aiheuttama palautuminen virulentiksi villin tyypin virukseksi. DNA-immunisoinnin yhteydessä voidaan lisäksi käyttää vain niitä virusgeenejä tai niiden osia, joiden tiedetään olevan tehokkaita ehkäisevän immuunivasteen indusoinnissa.
Tehokkaan CTL-vasteen kannalta olisi tärkeää, että sytotoksiset T-20 solut tuhoaisivat infektoituneet solut ennen rakenneproteiinien muodostumista ja valmiiden viruspartikkelien vapautumista. Immuunivaste virussyklin varhaisia proteiineja vastaan olisi siksi suotuisa. HIV:n replikaatiota säätelevät sen omat säätelygeenit ja -proteiinit. HIV-genomi koodittaa kolmea säätelevää ei-rakenneproteiinia (NEF, TAT, REV), jotka ovat korvaamattomia viruksen repli-25 kaation kannalta in vivo. REV kuljettaa genomi-RNA:n sytoplasmaan, TAT edistää viruksen transkriptiota, ja NEF saa aikaan replikaation lepotilassa olevissa soluissa. SIV-kokeet osoittavat, että virukset, joista puuttuu yhden tällaisen säätelygeenin toiminta, eivät ehkä pysty indusoimaan sairautta viruksen riittämättömän replikaation vuoksi. Näitä kolmea proteiinia ilmenee tilapäisesti 30 ja pieninä määrinä virusinfektiosyklin ensimmäisten tuntien aikana [Ranki et • ai., Arch. Virol. 139 (1994) 365- 378]. Vain pienellä osalla HIV-infektion saa neista yksilöistä esiintyy humoraalinen ja/tai soluvaste näihin proteiineihin, ja tämä vaste korreloi suotuista kliinisen taudinkulun kanssa.
NEF:n, TAT:n ja REV:n vastaisia CTL-vasteita on tutkittu laajasti.
35 NEF-spesifiset CTL ja Th (T-auttajasolu) -vasteet korreloivat suotuisan kliinisen ennusteen kanssa. REV-virheen sisältävän SIV-rokotteen ollessa kysees- 5 ^05 705 sä immuunivasteet NEF:iin ja TAT:iin olivat suojaavia. TAT- ja REV-proteiineissa olevat Th- ja CTL-epitoopit, jotka HIV-1-infektion saaneet yksilöt tunnistavat ja jotka korreloivat kliinisesti, on identifioitu [Blazevic et ai., J AIDS 6 (1993) 881 - 890; Blazevic et ai., AIDS Res. Hum. Retroviruses 11 (1995) 5 1335 -1341]. Kokonaisuutena tarkasteltuina nämä tulokset osoittavat, että sai raudelta suojaamiseksi saattaa olla välttämätöntä viruksen kohtuullinen repli-kaatio (heikennetty kasvu) yhdistettynä spesifisiin immuunivasteisiin viruksen replikaation tukemiseen osallistuvia säätelyproteiineja vastaan.
DNA-immunisoinnissa voidaan käyttää useita eukaryoottisia ilmen-10 tämisvektoreita, mutta niiden teho vaihtelee. Jotkut parametreistä, jotka säätelevät jonkin määrätyn ilmentämisvektorin tehoa immuunivasteen indusoin-nissa, ovat tuntemattomia, mutta antigeenisen proteiinin korkea ilmentymista-so olisi ilmeisesti edullista. Ajanjaksolla, jona soluun viety vektori voi ilmentää vierasta antigeenistä virusproteiinia, voi myös olla merkitystä. Ilmentämisvek-15 torit, jotka indusoivat tietyntasoisen soluvaurion, voivat myös olla edullisia, koska on tunnettua, että kudostuho vahvistaa immuunivastetta muutamien biologisesti aktiivisten molekyylien, kuten sytokiinien, lymfokiinien ja kemokii-nien, kautta, joita antigeenistä proteiinia ilmentävä solu erittää. Tämä on todennäköisesti yksi lisäsyy siihen, miksi elävä heikennetty virus, joka aiheuttaa 20 tietyntasoisen kudos- ja solutuhon, on niin tehokas immuniteetin indusoinnis-sa, ja siksi elävää heikennettyä rokotetta jäljittelevä DNA-vektori olisi edullinen.
Epäspesifiset tekijät, kuten sytokiinit ja lymfokiinit, voivat myös säädellä virusten replikaatiota ja immuunivasteita HIV-1-infektiossa. Clerici ja Shearer [Immunology Today 14, nro 3 (1993) 107 - 111] ja muut ovat osoitta-** 25 neet tehtävän, joka on auttajasolujen Th1/Th2-tasapainolla, jota heijastaa näille kahdelle T-solupopulaatiolle spesifisten lymfokiinien tuotanto. Liukoiset tekijät, joita tuottavat CD8-solut ja joilla on kyky vähentää HIV-1 :n infektoimien CD4-solujen virustuotantoa, on vähän aikaa sitten identifioitu RANTESiksi, MIP1-a:ksi ja MIP1-p.ksi [Cocchi et ai., Science 270, nro 5243 (1995) 1811 -30 1815]. On mahdollista, että sytokiinit, joiden tuotanto joko lisääntyy tai vähe nee HIV-1-infektiossa, säätelevät viruksen transkriptiota.
Aiemmat DNA-immunisaatiotutkimukset, joissa on käytetty HIV-säätelyproteiinia NEF koodittavaa geeniä, ovat osoittaneet T-solujen prolife-raatiovasteet [Hinkula et ai., Vaccine 15, nro 8 (1997) 874 - 878 ja Hinkula et 35 ai., J. Virol. 71, nro 7 (heinäkuu 1997) 5528 - 5539]. Positiivinen vaikutuskor- 6 ^05705 relaatio suotuisan kliinisen taudinkulun kanssa on kuitenkin nimenomaan CTL-vasteella.
Yksi esillä olevan keksinnön päätavoitteista on siksi saada aikaan DNA-immunisointirokote, joka koodittaa HIV-säätelyproteiinia ja jolla on kyky 5 herättää CTL-vaste HIV:n infektoimia soluja vastaan infektiosyklien varhaisessa vaiheessa, ennen uusien valmiiden infektoivien viruspartikkelien vapautumista.
Keksinnön yhtenä toisena tavoitteena on saada aikaan rokote, joka lisäksi herättää humoraalisen vasteen HIV:tä vastaan.
10 Keksinnön yhtenä lisätavoitteena on saada aikaan HIV-rokote, joka on turvallinen käyttää, koska se ei altista vastaanottajaa HIV:n rakennegee-neille tai -proteiineille.
Keksinnön yhtenä muuna tavoitteena on saada aikaan itsereplikoi-va vektori, joka aiheuttaa pitkäaikaisen ja korkean HlV-säätelyproteiini-15 ilmentymistason ja tietynasteisen solutuhon, mikä edelleen stimuloi immuunivastetta.
Keksinnön yhtenä muuna tavoitteena on vielä saada aikaan HIV-säätelyproteiineja ilmentävä itsereplikoiva rekombinattivektori, joka antaa tulokseksi pitkäaikaisen stabiilin ylläpidon ja suuren kopioluvun trasfektoiduissa 20 soluissa, nisäkässolut mukaan luettuina.
Keksinnön yhtenä lisätavoitteena on saada aikaan mainittua vektoria käsittävä isäntäsolu.
Keksinnön yhtenä muuna tavoitteena on vielä saada aikaan menetelmä edellä mainitun itsereplikoivan vektorin valmistamiseksi.
·. 25 Esillä oleva keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön menetelmä HIV:n hoi tamiseksi tai ehkäisemiseksi.
Keksinnön yhtenä muuna tavoitteena on vielä mainitun vektorin käyttö HIV:n vastaisen DNA-immunisointirokotteen valmistamiseksi.
Keksinnön yhteenveto 30 Tämän keksinnön tavoitteet voidaan saavuttaa sisällyttämällä hete- rologinen nukleotidisekvenssi, joka koodittaa HIV-säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista fragmenttia, vektoriin, joka käsittää papilloomaviruksen E1-geenin ja E2-geenin, papilloomaviruksen minimaalisen replikonin ja papilloomaviruksen minikromosomaalisen ylläpitoelementin.
7 105105
Keksintö koskee toisin sanoen itsereplikoivaa rekombinanttivektoria, joka käsittää papilloomaviruksen nukleotidisekvenssejä, jotka koostuvat olennaisesti (i) papilloomaviruksen E1-geenistä ja E2-geenistä, 5 (ii) papilloomaviruksen minimaalisesta replikonista ja (iii) papilloomaviruksen minikromosomaalisesta ylläpitoelementistä, ja heterologisen nukleotidisekvenssin, joka koodittaa HIV-säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista frag-10 menttia.
Keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön HIV:n vastaiseen DNA-immunisointiin tarkoitetun rokotteen, joka käsittää mainittua vektoria, mainitun vektorin käytön HIV:n vastaisen rokotteen valmistamiseksi ja menetelmän HIV:n hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi, jossa annetaan tämän tarpeessa ole-15 valle henkilölle vaikuttava määrä itsereplikoivaa vektoria ja saatetaan NEF-, REV- tai TAT-proteiini tai niiden immunologisesti aktiivinen fragmentti ilmentymään mainitussa henkilössä.
Keksintö tarjoaa vielä käyttöön menetelmän itsereplikoivan vektorin valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavaa: 20 A) insertoidaan heterologinen nukleotidisekvenssi, joka koodittaa HIV-säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista fragmenttia, vektoriin, joka käsittää papilloomaviruksen nukleotidisekvenssejä, jotka koostuvat olennaisesti - (i) papilloomaviruksen E1-geenistä ja E2-geenistä, 25 - (ii) papilloomaviruksen minimaalisesta replikonista ja - (iii) papilloomaviruksen minikromosomaalisesta ylläpitoelementistä, ja B) transformoidaan isäntäsolu tuloksena olevalla itsereplikoivalla rekombinattivektorilla, 30 C) viljellään isäntäsolua ja .· D) otetaan talteen mainittu vektori.
Keksintö tarjoaa käyttöön myös mainittua vektoria käsittävän isän- täsolun.
Piirustusten lyhyt kuvaus 35 Kuvio 1A esittää sukkulavektoria pUE83.
Kuvio 1B esittää sukkulavektoria pNP177.
» 8 1°s1 os
Kuvio 2 esittää keksinnön mukaista pBNtkREV-plasmidia.
Kuvio 3 esittää keksinnön mukaista pBNsraTAT-plasmidia.
Kuvio 4 esittää keksinnön mukaista pBNsraNEF-plasmidia.
Kuvio 5 esittää NEF-ilmentymistä pBNsraNEFillä transfektoiduissa 5 COS-7-soluissa. Western blot -näytteet on otettu 72 tunnin kuluttua transfekti-osta ja tehty näkyviksi ECL:llä.
Kuvio 6 esittää anti-NEF-vasta-aineita pBNsraNEFillä immunisoitujen hiirten seerumissa detektoituina Western blot -menetelmällä. Näytteet 1 - 4 otettiin 2 viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista ja näytteet 5-8 otettiin 4 10 viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista.
Kuvio 7 esittää pBNsraNEF-vektorilla immunisoitujen hiirten CTL-vasteita. Kuvio 7A esittää CTL-vasteita, ilmaistuina kohdesolujen prosentuaalisena spesifisenä lyysinä, neljässä hiiressä, jotka testattiin kahden viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista. Kuvio 7B esittää näitä arvoja neljän viikon 15 kuluttua viimeisestä immunisoinnista. Spesifistä lyysiä >4 % pidetään positiivisena tuloksena.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Heterologinen HIV-nukleotidisekvenssi insertoidaan keksinnön mukaisesti vektoriin, joka käsittää papilloomaviruksen E1-geenin ja E2-geenin, 20 papilloomaviruksen minimaalisen replikonin (MO) ja papilloomaviruksen minik-romosomaalisen ylläpitoelementin (MME). Tätä E1/E2/MO/MME:n käsittävää vektoria kutsutaan tästedes pBN:ksi, ja sitä on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisussa WO 97/24 451, johon viitataan. Mainittu patenttijulkaisu perustuu siihen havaintoon, ettei MO:sta käsin tapahtuva DNA-replikaatio sinänsä riitä 25 papilloomaviruksissa stabiiliin pitkäaikaiseen säilymiseen vaan tarvitaan toista virussekvenssiä MME ja että parhaat tulokset saadaan, kun vektori käsittää lisäksi papilloomaviruksen E1-ja E2-geenit.
’’Papilloomavirus” tarkoitta tässä käytettynä mitä tahansa papilloo-mavirusryhmän jäsentä. Keksinnön yhteydessä käytettävä papilloomavirus on 30 edullisesti naudan papilloomavirus (BPV) tai ihmisen papilloomavirus (HPV).
”E1” ja ”E2” ovat papilloomavirusten säätelyproteiineja, jotka replikoivat MO:n kautta ja ovat välttämättömiä replikaatiolle.
"Minimaalinen re piikoni” ("minimal origin of replication", MO) on papilloomaviruksen hyvin pieni sekvenssi, joka on välttämätön DNA-synteesin 35 käynnistymiselle.
9 705705 "Minikromosomaalinen ylläpitoelementti” ("minichromosomal maintenance element", MME) tarkoittaa papilloomavirusgenomin aluetta, johon sitoutuu papilloomaviruksen replikaatiolle välttämättömiä virus- tai ihmisproteii-neja. MME on välttämätön papilloomavirus-MO:n stabiilille episomaaliselle yl-5 läpidolle isännässä. MME käsittää edullisesti useita sitoutumiskohtia transkrip-tioaktivaattoriproteiinille E2.
"Itsereplikoiva vektori" tarkoittaa tässä hakemuksessa käytettynä vektoriplasmidia, joka kykenee autonomiseen replikaation eukaryoottisessa isäntäsolussa.
10 "Heterologinen" tarkoittaa vierasta. Esimerkeiksi keksinnön mu kaisten vektoreiden suhteen heterologinen nukleotidisekvenssi tarkoittaa ei-papilloomasekvenssiä.
"Immunologisesti aktiivinen fragmentti” tarkoittaa fragmenttia, jolla on kyky herättää immunologinen vaste vastaanottajassa.
15 "Papilloomaviruksen nukleotidisekvenssit, jotka koostuvat olennai sesti” tarkoittaa, että vektori käsittää papilloomanukleotidisekvenssit, jotka ovat välttämättömiä ja riittäviä vektorin pitkäaikaiselle säilymiselle ja replikaatiolle. Tämä tarkoittaa esimerkiksi sitä, että ylimääräiset sekvenssit, kuten kaikki pa-pilloomaviruksessa kooditettuina olevat onkogeeniset sekvenssit, on poistettu 20 tämän keksinnön yhteydessä käytetyistä pBN-vektoreista.
E1- ja E2-geenien, MO:n, MME:n ja NEF-, REV- tai TAT-geenin lisäksi keksinnön mukaiset vektorit käsittävät promoottoreja kooditettuja proteiineja varten samoin kuin lisäksi säätelysekvenssejä, polyadenylaatiosekvens-sejä ja introneja. Vektorit sisältävät edullisesti myös bakteeri-isäntäsolun repli-25 konin ja yhden tai useamman valikointimarkkerigeenin vektori-DNA:n valmistamiseksi bakteeri-isäntäsolussa.
Yksi pBN-vektoreiden olennainen piirre on, että ne eivät ole isän-täsoluspesifisiä. Tämä johtuu siitä, että E1- ja E2-proteiinien ilmentymistä säätelevät promoottorit, jotka eivät ole luontaisia, ts. ovat heterologisia. Mai-30 nitut promoottorit ovat joko toimivia laajasti nisäkässoluissa tai -kudoksissa tai .· solu- tai kudosspesifisiä.
Esillä olevan keksinnön mukaisissa vektoreissa E1 -geeni on edullisesti sr-a-promoottorin tai tymidiinikinaasipromoottorin (tk) ohjauksessa ja E2-geeni on edullisesti LTR-gag-promoottorin ohjauksessa. NEF-, REV- tai TAT-35 geeni voi olla CMV-promoottorin tai RSV-LTR-promoottorin ohjauksessa. Vektori voi käsittää lisäksi SV40:n varhaisen promoottorin antibioottivalikoinnin 10 705705 (neomysiini tai kanamysiini) mahdollistavan geenin ilmentymisen käynnistämiseksi.
Isäntäsolun replikoni on keksinnön mukaisissa vektoreissa edullisesti pUC-ORI ja käytetyt valikointimarkkerit ovat esimerkiksi kanamysiini-5 ja/tai neomysiinimarkkereita. Introni on edullisesti beeta-globiini-IVS.
TK-promoottoripohjaisissa plasmideissa esiintyvä oktasekvenssi on oktameerisen proteiinin koodittamaton sekvenssi. Sillä ei ole toiminnallista tarkoitusta plasmidissa, mutta sitä tarvittiin sopivien restriktiokohtien luomiseksi lopullisten plasmidien valmistamista varten.
10 Plasmidiin pBN insertoitavat NEF-, REV- tai TAT-geenit voidaan saada useista kaupallisista lähteistä, kuten plasmidista pKP59, jota on saatavissa tallennuspaikasta AIDS Reagent Project MHC. Mainitut geenit ovat yleisesti tunnettuja, ja ne on sekventoitu täydellisesti [Wain-Hobson et ai., Cell 40 (1985) 9- 17]. On tietenkin myös mahdollista insertoida vain mainittujen HIV-15 proteiinien immunologisesti aktiivista fragmenttia koodittava sekvenssi.
NEF-, REV- tai TAT-geenit tai niiden fragmentit insertoidaan ensin sopiviin sukkulavektoreihin. Nämä vektorit voivat sisältää MO-alueen tai olla sisältämättä sitä. Esimerkeissä valaistaan kahta sukkulavektoria: pNp177:ää, joka ei sisällä MO:ta, ja pUE83:a, joka sisältää MO:n. On tietenkin mahdollista 20 käyttää muitakin sukkulavektoreita. Sekä sukkulavektoreita että tuloksena olevia keksinnön mukaisia vektoreita lisätään edullisesti Escherichia colissa. Esimerkkejä tuloksena olevista esillä olevan keksinnön mukaisista pBN-NEF-, pBN-REV- tai pBN-TAT-vektoreista esitetään kuvioissa 2, 3 ja 4. Keksinnön mukaiset vektorit ovat stabiileja ja itsereplikoivia suurina kopiomäärinä. Euka-25 ryootti-isäntäsolun trasfektoinnin jälkeen vektori (plasmidi) monistuu ja tuottaa 100- 1000-kertaisen määrän uusia plasmideja, joista kukin pystyy ilmentämään haluttua HIV-proteiinia.
Tämän keksinnön patenttivaatimusten mukainen isäntäsolu voi olla joko vektorilla transfektoitu eukaryoottisolu tai vektorilla transformoitu prokary-30 oottisolu. Eukaryoottisolu on edullisesti nisäkässolu ja prokaryoottisolu on ·· edullisesti bakteerisolu, erityisesti E. coli.
Tuloksena olevien esillä olevan keksinnön mukaisten plasmidivekto-rien HIV-NEF:n, -REV:n ja -TAT:n ilmentymistä testattiin sekä transfektoiduis-sa COS-7-soluissa että mainituilla plasmideilla immunisoiduissa hiirissä. HIV-35 proteiinien voimakas ilmentyminen oli osoitettavissa COS-7-soluissa, ja immunisoiduissa hiirissä esiintyi huomattava humoraalinen ja soluvälitteinen (CTL) 11 105105 immuunivaste. Nämä tulokset osoittavat, että keksinnön mukaisilla vektoreilla on potentiaalisesti käyttöä tehokkaina HIV:n vastaisina rokotteina.
Esillä olevaa keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavissa esimerkeissä. Esimerkit kuvaavat yksityiskohtaisesti keksinnön joitakin suoritusmuo-5 toja, mutta niiden ei tulisi tulkita rajoittavan keksintöä, jonka määrittelevät oheiset patenttivaatimukset.
Esimerkki 1 HIV-1-geenien REV ja TAT kloonaaminen itsereplikoiviin pBNsr-α-ja pBNtk-plasmideihin 10 pBNtkREV:n ja pBNsraTAT:n tuottaminen
Vaihe 1:
Eristetystä kannasta BRU, jota kutsutaan myös LAI:ksi, peräisin olevia HIV-1 :n REV- ja TAT-geenejä [VVain-Hobson et ai., Cell 40 (1985) 9-17] monistettiin pcREV- ja pcTAT-vektoreista käsin [Arya et ai. Science 229 15 (1985) 69- 73] käyttämällä Dynazyme Taq -DNA-polymeraasia (Finnzymes,
Suomi) ja seuraavia alukkeita, joissa on restriktioentsyymikohdat entsyymejä Xhol ja Xbal varten: REV: 5’-TTTTTCTAGAACCATGGCAGGAAGAAGCGGA-3’ 20 5’-TTTTCTCGAGCTATTCTTTAGTTCCTGG-3’ TAT: 5’-TTTTTCTAG AACCAT GG AGCCAGTAG AT CCT-3 ’ 5’-TTTT CTCGAGCTAAT CGAACGGATCT GC-3’ 25
Monistettuja geenejä ja sukkulavektoria pUE83 (kuvio 1) pilkottiin lämpötilassa +37 °C Xbalillä ja Xhol:llä (New England Biolabs, USA) yön yli yhteensopivien päiden aikaansaamiseksi. Pilkotut DNA-fragmentit analysoitiin 1,5-prosenttisilla agaroosigeeleillä ja jatkopuhdistettiin käyttämällä Band Prep 30 Kit -välineistöä (Pharmacia Biotech, Ruotsi). Kukin geeni ligatoitiin vektoriin " _· erikseen käyttämällä T4-DNA-ligaasia (New England Biolabs, USA) tehden in- kubointi yön yli lämpötilassa +16 °C. Ligaatiotuotteilla transformoitiin kompetentit E. coli -solut (One Shot Kit; Invitrogen, Alankomaat), jotka siirrostettiin LB-maljoille, jotka sisälsivät kanamysiiiniä valikointia varten. Kasvavista kloo-35 neista tehtiin miniprep-preparaatit ja kloonattujen geenien läsnäolo analysoitiin pilkkomalla Xhol:llä ja Xbal:llä. Kloonattujen geenien läsnäolo varmistettiin 12 105105 myös PCR:llä, joka tehtiin miniprep-preparaatista lähtien käyttämällä edellä mainittuja alukkeita. Oikean geenin sisältäviä klooneja massaviljeltiin ja plas-midit puhdistettiin käyttämällä Megaprep-pylväitä (Qiagen, Saksa).
Vaihe 2: 5 DNA-fragmentti, joka sisälsi BPVori:n, RSV-LTR-promoottorin, REV- tai TAT-geenin ja b-globiini-IVS-poly(A):n pilkottiin irti sukkulavektorista Hindlllilla (New England Biolabs, USA) ja puhdistettiin käyttämällä 1-prosenttista agaroosigeeliä ja Band Prep Kit -välineistöä. Ligaatio HindIII-pilkottuun ja defosforyloituun (alkalinen fosfataasi, CIP, Promega, USA) plas-10 midiin pBNsra tai pBNtk, solujen transformointi, kloonatun geenin läsnäolon tarkistus ja plasmidin puhdistus tehtiin kuten vaiheessa 1.
Tuloksena olevia plasmideja kutsutaan pBNtkREV:ksi ja pBNsraTAT:ksi ja ne esitetään kuvioissa 2 ja 3.
Esimerkki 2 15 HIV-1:n NEF: n kloonaaminen itsereplikoivaan pBNsra- plasmidiin pBNsraNEF:n tuottaminen
Vaihe 1: HIV-1:n NEF-geeni saatiin plasmidi pcNEF -vektorista, joka sisälsi 20 LAI-isolaatin NEF-geenin insertoituna pcTAT-vektoriin, josta puuttuu TAT-geeni. Jatkokloonaukseen käytetty NEF-geeni saatiin 1,3ke:n fragmenttina pcNEF:stä Spel- ja Hindlll-pilkonnalla. Jotta eliminoidaan Hindlll-kohdan uu-delleenmuodostuminen ligaatiossa, fragmentti käsiteltiin Hindill-pilkkomisen jälkeen Klenow-entsyymillä ja nukleotidien dATP, dCTP ja dGTP seoksella, 1: 25 minkä jälkeen tehtiin Spel-pilkkominen. Saadut fragmentit erotettiin elektrofo- reettisesti 1-prosenttisella agaroosigeelillä standardikokomarkkerien rinnalla. Kooltaan oikeat vyöhykkeet leikattiin irti ja DNA otettiin talteen käyttämällä Sephaglas Bandprep Kit -välineistöä (Pharmacia Biotech) valmistajan ohjeen mukaan.
30 Kuvion 1B mukainen sukkulavektori pNP177 pilkottiin ensin Xhokllä, käsiteltiin sitten Klenow-entsyymillä ja dNTP-seoksella ja pilkottiin lopuksi Xbal:llä. Vektori käsiteltiin myös vasikan suoliston alkalisella fosfataasilla (CIP).
NEF-geenin sisältävä fragmentti ligatoitiin pilkotun pNP177-vektorin 35 kanssa käyttämällä T4-ligaasia lämpötilassa +14 °C yön yli. Transformointiin käytettiin kompetenttia E. colia (One Shot; Invitrogen). Positiiviset kloonit iden- 18 105los tifioitiin käyttämällä restriktioentsyymipilkkomisia ja elektroforeesia. Plasmidi-DNA:ta monistettiin edelleen E. colissa ja se puhdistettiin laajassa mitassa Qi-agen-kolonneilla. Tuloksena oleva lopullinen plasmidi nimettiin pNP177cHIVNEF:ksi.
5 Vaihe 2:
Sukkulavektori pNP177 on suunniteltu sisältämään vain kaksi Hin-dlll-kohtaa, joiden väliin voidaan kloonata insertti. Plasmidin Hind 11 l-pilkonta antaa siten tulokseksi fragmentin, joka voidaan kloonata edelleen. pNP177cHIVNEF:n Hindlll-fragmentti kloonattiin pBNsra:aan. Tämä vektori 10 pilkottiin Hindllklla ja käsiteltiin CIP:llä. Käytettiin samoja vyöhykkeidenerotus-, ligaatio- ja transformointimenetelmiä kuin ensimmäisessä vaiheessa ja insertin oikea orientaatio varmistettiin restriktioanalyysillä. Lopullinen plasmidi nimettiin pBNsraNEF:ksi ja se esitetään kuviossa 4.
Esimerkki 3 15 HIV-Nef-ilmentymisen osoittaminen in vitro 3A. Transfektiot
Esimerkkien 1 ja 2 pBN-konstruktioiden ilmentymisen testaamiseksi niillä transfektoitiin COS-7-solut käyttämällä elektroporaatiota. 10 μ9 vertai-luplasmidia ρΒΝβ-Gal ja 10 μ9 plasmidia pBN-NEF kotransfektoituna 1 μ0:η 20 kanssa plasmidia pCMVp-Gal siirrettiin kukin elektroporaatiolla kolmeen miljoonaan soluun. Käytettiin lohenmaitikantaja-DNA:ta. Elektroporaatio tehtiin kapasitanssilla 960 mF ja jännitteellä 260 V. Tehtiin proteiinipitoisuus- ja β-gal-aktiivisuusmittauksia transfektiotehokkuuden kontrolloimiseksi ja lysaattien määrän kalibroimiseksi Western blot -määrityksessä.
25 3B. Immuunihistokemia ja Western blot -määritys
Talteen otetut pBN -konstruktioilla transfektoidut solut lysoitiin käytettäviksi Western blot -määrityksessä. Lyysin jälkeen proteiininäytteet keitettiin näytepuskurissa, käsiteltiin 12-prosenttisessa SDS-polyakryyliamidigeelissä ja siirrettiin sitten 2 μπν.η nitroselluloosasuodattimelle, 30 joka suojattiin liuoksella, joka sisälsi 5 % maitoa TBS:ssä. Primaarisena vasta-,·· aineena käytettiin hiiren monoklonaalisten anti-NEF:ien seosta [V. Ovod et ai., AIDS 6 (1992) 25 - 34], joista kukin laimennettiin suhteessa 1:1000. Sekundaarinen vasta-aine oli biotinyloitu hiiren vastainen vasta-aine laimennettuna suhteessa 1:500.
35 COS-7-solujen transfektoinnin jälkeen vektorit saivat aikaan voi makkaan tilapäisen HIV-säätelyproteiini-ilmentymisen detektoituna lysoitujen 14 105TQ5 solujen Western blot -määrityksellä 72 tunnin kuluttua. Plasmidilla pBNsraNEF saadut tulokset esitetään kuviossa 5. Transfektoitujen solujen pit-käaikaisviljelyissä NEF-ilmentyminen kesti 7 viikkoon asti itsereplikoivalla pBN-vektorilla transfektoiduissa soluissa.
5 NEF-transfektoituja soluja käytettiin myös sytospin-preparaattien valmistukseen, ne värjättiin hematoksyliinillä ja käytettiin monoklonaalista NEF:n vastaista vasta-ainetta, jota seurasi sekundaarinen biotinyloitu hiiren vastainen vasta-aine, immuunihistokemiallisessa tutkimuksessa Ovodin et ai. {supra) kuvaamalla tavalla. Sytospin-levyt osoittivat ilmentymistä, koska posi-10 tiivinen värjäytyminen nähtiin suuressa määrässä soluja solun sytoplasman täyttävinä jyväsinä. Osassa NEF:ää ilmentävistä soluista esiintyi morfologisia merkkejä solutuhosta, mikä on osoitus apoptoosista. Ilmentymistaso oli silti korkea, vaikka solujen tila oli huononemassa.
Esimerkki 4 15 pBNsra-ja pBNtk-vektorin HIV-Nef-, HIV-Tat- tai HIV-Rev- ilmentymisen immunogeenisyyden osoittaminen in vivo 4A. Geenitykki DNA seostettiin 1 pm:n kultahiukkasille käyttämällä spermidiiniä ja CaCI2:a noudattaen käyttöohjeessa Helios Gene Gun Instruction Manual (Bio-20 Rad Laboratories) esitettyä menettelyä. Kukin patruuna tehtiin 0,5 pg kultaa ja 1 μg DNA:ta sisältäväksi. DNA:n määrää kontrolloitiin spektrofotometrisesti käyttöohjeessa neuvotulla tavalla. Inokuloinnit tehtiin käyttämällä Helios Gene Gun System -järjestelmää (Bio-Rad Laboratories). Heliumpurkauspaine DNA:n viemiseksi kohteeseen säädettiin arvoon 2070 kPa (300 psi). Optimoides-25 samme pommitusolosuhteita havaitsimme, että 2070 kPa (300 psi) riittää sinkoamaan kultahiukkaset ihoon.
4B. Immunisoinnit Käytettiin 6 - 8 viikon ikäisiä balb/c-naarashiiriä. Hiiret nukutettiin ja vatsapuolelta poistettiin karvat ennen immunisointeja.
30 Inokuloinnit tehtiin 8 hiiren vatsan iholle päivinä 1, 2, 3, 10, 11 ja 12 I' käyttämällä edellä kuvattua geenitykkiä ja noudattamalla valmistajan ohjeita.
Annettiin yhteensä 6 μg pBN-NEF:ää hiirtä kohden. Kummastakin ryhmästä lopetettiin neljä hiirtä kahden viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista ja loput neljä hiirtä neljän viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista. Otettiin see-35 ruminäytteet Western blot -määritystä varten ja kerättiin splenosyyttejä CTL-määritystä varten. Kaikilla kahdeksalla hiirellä, jotka oli immunisoitu pBN-NEF- is 7°5705 vektorilla, ilmeni vasta-ainevaste 2 ja 4 viikon kuluttua (kuvio 6). Reaktion intensiteetti vaihteli Western blot -määrityksessä.
4C. Sytotoksisen T-soluaktiivisuuden mittaaminen immunisoi duissa hiirissä 5 4C1. Efektorisolujen stimulaatio
Poistettiin aseptisesti pernat immunisoiduista hiiristä kahden (16 hiirtä) ja neljän viikon (16 hiirtä) kuluttua immunisoinnista. Ne rikottiin Hanks-liuoksessa, suodatettiin harson läpi ja poistettiin erytrosyytit. Soluja suspen-doitiin sitten 5-10®/ml seuraavaan kasvualustaan: RPMI-alusta, joka sisältää 10 10 % naudan sikiöseerumia (FCS; GibcoBRL), 1 % glutamiinia, 100 yksikköä penisilliiniä/ml, 100 (pg streptomysiiniä/ml ja ö-IO^mol/l 2-merkaptoetanolia. Reagoivia soluja (5-106) viljeltiin 25ml:n soluviljelypullossa 5 ml:ssa kasvualustaa yhdessä 4-106 solun kanssa, joilla esiintyy antigeeniä (APC:t; katso jäljempänä) viisi vuorokautta. Soluihin lisättiin ensimmäisenä päivänä 10 yk-15 sikköä/ml rekombinatti-interieukiini-2:a (rlL-2) [J. Hiserodt et ai., J. Immunol.
135, nro 1 (heinäkuu 1985) 53 - 59; M. Lagranderie et ai., J. Virol. 71, nro 3 (maaliskuu 1997) 2303- 2309; T. Tsuji et ai., Immunology 90, nro 1 (tammikuu 1997) 1 - 6; H. L. Vahlsing et ai., Journal of Immunological Methods 175 (1994) 11 - 22; K. Varkila et ai., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand.
20 Sect. C 95 (1987) 141 -148].
4C2. Solut, joilla esiintyy antigeeniä
Infektoitiin syngeneeisiä P815-mastosytooma (H-2d) -soluja muunnetulla lehmänrokkoviruksella Ankara (MVA), joka oli muunnettu ilmentämään HIV-1 LAI:n NEF-geeni (MVA-HIVNEF). MVA on voimakkaasti heikennetty, ** 25 replikaation suhteen puutteellinen lehmänrokkovirus, joka voi toimi tehokkaana vektorina heterologisten geenien ilmentämiseksi ja tarjoaa poikkeuksellisen korkean biologisen turvallisuustason [G. Sutter et ai., J. Virol 68, nro 7 (heinäkuu 1994) 4109 - 4116; Sutter et ai., Vaccine 12, nro 11 (1994) 1032 -1039; I. Drexler et ai., J. Gen. Virol. 79 (1998) 347 - 352; G. Sutter et ai., Proc.
30 Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 10847 -10851]. Infektoinnit MVA-HIVNEF:llä 7. tehtiin infektointikertoimella (MOI) 5 24-syvennyksisissä kuoppalevyissä (1106 solua/syvennys). Kun virus oli absorboitunut 1 tunnin lämpötilassa +37 °C, soluja inkuboitiin 15 tuntia lämpötilassa +37 °C [A. Carmichael et ai., Journal of Virology 70 (1996) 8468 - 8476]. Solut pestiin infektoinnin jälkeen kahdesti 35 PBS:llä (fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella), joka sisälsi 10 % FCS:ää, ja suspendoitiin tähän liuokseen pitoisuudeksi 5Ί06 solua/ml. Sitten « « 16 105 705 solut gammasäteilytettiin annoksella 5000 rad ja pestiin kasvualustalla ennen lisäämistä reagoiviin soluihin.
4C3. Sytotoksisuusmääritykset CTL-aktiivisuus testattiin 51Cr-vapautusmäärityksellä [J. Hiserodt et 5 ai., J. Immunol. 135, nro 1 (heinäkuu 1985) 53- 59; M. Lagranderie et ai., J. Virol. 71, nro 3 ( maaliskuu 1997) 2303- 2309; K. Varkila et ai., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C 95 (1987) 141 - 148; C. Van Baalen et ai., AIDS 7 (1993) 781 - 786]. Lyhyesti esitettynä 2-10® P-815-solua infektoitiin MVA-HIVNEF:llä, kuten kuvattiin edellä solujen yhteydessä, joilla esiintyy anti-10 geeniä. Solut pestiin infektoinnin jälkeen kerran seerumittomalla kasvualustalla. Kohdesolut suspendoitiin sitten 200 μΐιββη seerumitonta kasvualustaa ja lisättiin 100 μΟϊ 51Cr:ä (Amersham)/1106 solua 1 tunnin ajaksi lämpötilassa 37 °C. Kohdesolut pestiin sitten neljästi alustassa ja suspendoitiin pitoisuudeksi 5 104 solua/ml. Stimuloidut efektorisolut pestiin kerran kasvualustassa en-15 nen lisäämistään kohdesoluihin. Kohdesoluja siirrostettiin u-pohjaiseen 96-syvennyksiseen kuoppalevyyn 100 μΙ (5-103) syvennystä kohden ja efektori-soluja lisättiin kolmena rinnakkaisnäytteenä ΙΟΟμΙ^βθ alustaa käyttäen efek-tori.kohde-suhteita 50, 25 ja 12,5. Spontaania vapautusta varten kohdesoluja siirrostettiin kuuteen syvennykseen ΙΟΟμΙιεεθ alustaa ja maksimivapautusta 20 varten kuuteen syvennykseen 2,5-prosenttisessa Triton-X-100-liuoksessa. Levyjä sentrifugoitiin lyhyesti, inkuboitiin 4 tuntia lämpötilassa 37 °C ja tehtiin su-pernatanteille laskenta gammalaskurissa. Kohdesolujen prosentuaalinen spesifinen lyysi laskettiin kaavalla (testi-51 Cr-vapautus - spontaani vapau-tus)/(maksimivapautus - spontaani vapautus) ! 00. Prosentuaalisen spesifisen 25 lyysin >6 % katsottiin olevan positiivinen.
Yksi esimerkki, joka osoittaa CTL-aktiivisuuden kuudessa kahdeksasta pBNsrcxNEF:llä immunisoidusta hiirestä, esitetään kuviossa 7.
D. Humoraalinen immuunivaste immunisoiduissa hiirissä
Jotta saataisiin testatuksi HIV-1:n NEF:n vastaisten vasta-aineiden 30 esiintyminen immunisoitujen hiirten seerumissa, NEF-proteiini käsiteltiin elekt-roforeettisesti PAGE:lla, siirrettiin nitroselluloosasuodattimille ja detektoitiin vasta-ainereaktiivisuus edellä kuvatulla tavalla.
Yhteenveto tuloksista
Transfektio- ja immunisointitestien tulokset on koottu taulukkoon 1. 35 Immunisoiduissa hiirissä esiintyvä immuunivaste arvioitiin immuunitäplämääri-tyksellä (WB) humoraalisen ja sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) määrityk- 1os 105 sellä soluvälitteisen immuniteetin ollessa kyseessä. Kuten taulukosta nähdään, kaikissa kahdeksassa NEF:ää ilmentävällä vektorilla immunisoidussa hiiressä esiintyi sekä humoraalinen että soluvälitteinen immuunivaste.
Taulukko 1 5 HIV-1:n NEF-, TAT- ja REV-proteiinien ilmentymisen osoittaminen mainituilla vektoreilla transfektoiduissa COS-7-soluissa immuunitäplämääri-tyksellä (Western blotting, WB) tai immuunihistokemiallisesti ja humo-raalisen ja soluvälitteisen immuunivasteen indusoitumisen osoittaminen yhdellä vektoreista, pBNsraNEF:llä, immunisoiduissa hiirissä 10 ___ __Transfektio__Immunisointi
__WB__Immuunihistokemia__WB__CTL
pBNsraTAT ND__++_ 6/8 6/8 pBNtkREV +__++__7/8__7/8 pBNsraNEF ++__ND_ 6/8 6/8
Osoitamme tässä tutkimuksessa, että DNA-immunisointi käyttämällä kuvatun kaltaista itsereplikoivaa ilmentämisvektoria voi indusoida selvästi havaittavissa olevan CTL-vasteen hiirissä. Lisäksi saavutettiin humoraa-15 linen immuunivaste. Edellä esitettyjen tulosten valossa on mahdollista olettaa, että pBN-NEF-, pBN-REV- ja pBN-TAT-plasmidit ilmentävät NEF-, REV- ja TAT-proteiineja in vivo määrinä, jotka riittävät indusoimaan sekä humoraalisen että soluvälitteisen immuunivasteen, joka on välttämätön HIV:n ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi.
• ♦ > ·
I I
• <
Claims (11)
1. Itsereplikoiva rekombinanttivektori, tunnettu siitä, että se käsittää papilloomaviruksen nukleotidisekvenssejä, jotka koostuvat olennai- 5 sesti (i) papilloomaviruksen E1-geenistä ja E2-geenistä, (ii) papilloomaviruksen minimaalisesta replikonista ja (iii) papilloomaviruksen minikromosomaalisesta ylläpitoelementistä, ja 10 heterologisen nukleotidisekvenssin, joka koodittaa HIV- säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista fragmenttia.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen itsereplikoiva vektori, tunnettu siitä, että papilloomavirus on naudan papilloomavirus (BPV).
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen itsereplikoiva vektori, tunnettu siitä, että heterologinen nukleotidisekvenssi koodittaa HIV-1:n NEF-proteiinia.
4. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen itsereplikoiva vektori, tunnettu siitä, että E1 on sra-promoottorin tai tymidiiniki- 20 naasipromoottorin ohjauksessa.
5 C) viljellään isäntäsolua ja D) otetaan talteen mainittu vektori.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen itsereplikoiva vektori, tunnettu siitä, että se on kuviossa 2, 3 tai 4 esitetyn kaltainen pBNtkREV, pBNsraTAT tai pBNsraNEF.
6. Rokote HIV:n vastaista DNA-immunisointia varten, tunnettu ':· 25 siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1 - 5 mukaista itse- replikoivaa vektoria.
7. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksista 1 - 5 mukaisen itsereplikoivan vektorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavaa:
30 A) insertoidaan heterologinen nukleotidisekvenssi, joka koodittaa ·· HIV-säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista fragmenttia, vektoriin, joka käsittää papilloomaviruksen nukleotidisekvenssejä, jotka koostuvat olennaisesti - (i) papilloomaviruksen E1-geenistä ja E2-geenistä| 35 - (ii) papilloomaviruksen minimaalisesta replikonista ja 19 105105 - (iii) papilloomaviruksen minikromosomaalisesta ylläpitoelementis- tä, ja B) transformoidaan isäntäsolu tuloksena olevalla itsereplikoivalla rekombinattivektorilla,
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on E. co//-solu.
9. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen itsereplikoi-10 van vektorin käyttö HIV:n vastaisen DNA-immunisointirokotteen valmistamiseksi.
10. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukaista itsereplikoivaa vektoria.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen isäntäsolu, tunnettu 15 siitä, että se on bakteerisolu tai nisäkässolu. • < 20 1°5 Ws
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI980463A FI105105B (fi) | 1998-02-27 | 1998-02-27 | Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan |
| CN99804629A CN1295623A (zh) | 1998-02-27 | 1999-02-26 | 用于抗hiv之dna免疫的自我复制的载体 |
| OA1200000232A OA11528A (en) | 1998-02-27 | 1999-02-26 | Self-replicating vector for DNA immunization against HIV. |
| EP99906279A EP1056879A1 (en) | 1998-02-27 | 1999-02-26 | Self-replicating vector for dna immunization against hiv |
| APAP/P/2000/001892A AP2000001892A0 (en) | 1998-02-27 | 1999-02-26 | Self-replicating vector for DNA immunization against HIV. |
| PCT/FI1999/000152 WO1999043841A1 (en) | 1998-02-27 | 1999-02-26 | Self-replicating vector for dna immunization against hiv |
| RU2000122617/13A RU2232815C2 (ru) | 1998-02-27 | 1999-02-26 | Самореплицирующийся рекомбинантный вектор, экспрессирующий регуляторные белки вич, способ его получения, вакцина для иммунизации против вич на основе днк, содержащая указанный вектор, способ лечения или профилактики вич |
| AU26266/99A AU2626699A (en) | 1998-02-27 | 1999-02-26 | Self-replicating vector for dna immunization against hiv |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI980463 | 1998-02-27 | ||
| FI980463A FI105105B (fi) | 1998-02-27 | 1998-02-27 | Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI980463A0 FI980463A0 (fi) | 1998-02-27 |
| FI980463A FI980463A (fi) | 1999-09-27 |
| FI105105B true FI105105B (fi) | 2000-06-15 |
Family
ID=8551073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI980463A FI105105B (fi) | 1998-02-27 | 1998-02-27 | Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1056879A1 (fi) |
| CN (1) | CN1295623A (fi) |
| AP (1) | AP2000001892A0 (fi) |
| AU (1) | AU2626699A (fi) |
| FI (1) | FI105105B (fi) |
| OA (1) | OA11528A (fi) |
| RU (1) | RU2232815C2 (fi) |
| WO (1) | WO1999043841A1 (fi) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI107737B (fi) * | 1999-12-23 | 2001-09-28 | Atso Raasmaja | Plasmidi tyrosiinihydroksylaasigeenin ilmentämiseksi aivoissa |
| FI116851B (fi) | 2001-05-03 | 2006-03-15 | Fit Biotech Oyj Plc | Ilmentämisvektori, sen käyttöjä ja menetelmä sen valmistamiseksi sekä sitä sisältäviä tuotteita |
| EP1279404A1 (en) * | 2001-07-26 | 2003-01-29 | Istituto Superiore di Sanità | Use of HIV-1 tat, fragments or derivatives thereof, to target or to activate antigen-presenting cells, to deliver cargo molecules for vaccination or to treat other diseases |
| JP2006502704A (ja) | 2002-05-16 | 2006-01-26 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | Ｈｉｖ調節／アクセサリータンパク質の融合タンパク質 |
| KR101471043B1 (ko) * | 2009-01-08 | 2014-12-09 | 주식회사 바이오리더스 | 안정적인 항시적 고발현 자궁경부암 치료백신용 벡터 및 그에 의해 형질전환된 재조합 유산균 |
| LT3216871T (lt) * | 2011-10-17 | 2022-03-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Pelės, turinčios apribotą imunoglobulino sunkiąją grandinę |
| AU2017277810A1 (en) * | 2016-06-03 | 2018-12-06 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Negative feedback regulation of HIV-1 by gene editing strategy |
| CN110747214B (zh) * | 2019-03-13 | 2021-12-31 | 深圳市臻质医疗科技有限公司 | DNA片段、具有长效表达和细胞特异性结合能力的mRNA-抗体融合分子及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2241172C (en) * | 1995-12-29 | 2008-08-19 | Estonian Biocentre | Episomal vector and uses thereof |
-
1998
- 1998-02-27 FI FI980463A patent/FI105105B/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-02-26 OA OA1200000232A patent/OA11528A/en unknown
- 1999-02-26 CN CN99804629A patent/CN1295623A/zh active Pending
- 1999-02-26 RU RU2000122617/13A patent/RU2232815C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-02-26 EP EP99906279A patent/EP1056879A1/en not_active Withdrawn
- 1999-02-26 WO PCT/FI1999/000152 patent/WO1999043841A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-02-26 AU AU26266/99A patent/AU2626699A/en not_active Abandoned
- 1999-02-26 AP APAP/P/2000/001892A patent/AP2000001892A0/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI980463A (fi) | 1999-09-27 |
| EP1056879A1 (en) | 2000-12-06 |
| OA11528A (en) | 2004-05-07 |
| CN1295623A (zh) | 2001-05-16 |
| AU2626699A (en) | 1999-09-15 |
| AP2000001892A0 (en) | 2000-09-30 |
| WO1999043841A1 (en) | 1999-09-02 |
| RU2232815C2 (ru) | 2004-07-20 |
| FI980463A0 (fi) | 1998-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7993651B2 (en) | Chimeric human immunodeficiency virus (HIV) immunogens comprising GAG P24-P17 fused to multiple cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitopes | |
| AU2018267669B2 (en) | Methods and compositions for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection | |
| US7981430B2 (en) | Multi-clade chimeric immunogens derived from highly conserved regions of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) consensus proteome | |
| AU2021200210A1 (en) | HIV pre-immunization and immunotherapy | |
| CZ293439B6 (cs) | Farmaceutické kompozice indukující odpověď cytotoxických T-lymfocytů | |
| US20080102085A1 (en) | Vaccine comprising gp120 and nef and/or tat for the immunization against hiv | |
| JP2004508064A (ja) | コドン最適化ｈｉｖ１−ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆおよび修飾体を発現する増強された第１世代アデノウイルスワクチン | |
| AU723313B2 (en) | Recombinant live feline immunodeficiency virus and proviral DNA vaccines | |
| Abaitua et al. | Improving recombinant MVA immune responses: potentiation of the immune responses to HIV-1 with MVA and DNA vectors expressing Env and the cytokines IL-12 and IFN-gamma | |
| JP4125128B2 (ja) | ヒト免疫不全ウイルスのキメラタンパク質用組換えポックスウイルス | |
| US20110123485A1 (en) | Viral vectors for delivering vaccines for hiv and other infectious diseases | |
| US20110110892A1 (en) | Vectors for delivering disease neutralizing agents | |
| FI105105B (fi) | Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan | |
| Collings et al. | Humoral and cellular immune responses to HIV-1 nef in mice DNA-immunised with non-replicating or self-replicating expression vectors | |
| Wade-Evans et al. | Specific proliferative T cell responses and antibodies elicited by vaccination with simian immunodeficiency virus Nef do not confer protection against virus challenge | |
| JP2017512499A (ja) | モザイクｈｉｖ−１配列およびその使用 | |
| EA042265B1 (ru) | Поксвирусные векторы, кодирующие антигены вич, и способы их применения | |
| HejdemanRebecca et al. | Therapeutic immunization for HIV | |
| OA18541A (en) | Methods and compositions for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection | |
| McKee et al. | 559. Generating Powerful Immune Responses Against Lentiviral Antigens: Using rSV40 Vector-Delivered Proinflammatory Cytokines to Potentiate Immune Responses vs. rSV40-Delivered Lentiviral Antigens |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |