FI107737B - Plasmidi tyrosiinihydroksylaasigeenin ilmentämiseksi aivoissa - Google Patents
Plasmidi tyrosiinihydroksylaasigeenin ilmentämiseksi aivoissa Download PDFInfo
- Publication number
- FI107737B FI107737B FI992771A FI19992771A FI107737B FI 107737 B FI107737 B FI 107737B FI 992771 A FI992771 A FI 992771A FI 19992771 A FI19992771 A FI 19992771A FI 107737 B FI107737 B FI 107737B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- expression
- plasmid
- brain
- disease
- gene
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/44—Oxidoreductases (1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/16—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced pteridine as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.16)
- C12Y114/16002—Tyrosine 3-monooxygenase (1.14.16.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2820/00—Vectors comprising a special origin of replication system
- C12N2820/60—Vectors comprising a special origin of replication system from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Psychology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
107737
Plasmidi tyrosiinihydroksylaasigeenin ilmentämiseksi aivoissa Keksinnön alue 5 Tämä keksintö koskee neuraalisten tai nonneuraalisten sairauksien, erityisesti Parkinsonin taudin geeniterapiaa. Keksinnössä esitetään naudan tyypin-1 papilloomavirukseen perustuva ekspressioplasmidi, johon on liitetty terapeuttinen geeni, transfektoitavaksi in vivo kohdeyksilön soluihin.
10 Keksinnön taustaa
Parkinsonin taudissa tapahtuu asteittaista dopaminergisten neuronien degeneraatiota substantia nigra pars compacta'ssa, mikä johtaa dopaminergisen hermotuksen katoamiseen corpus striatum'issa (Homykiewicz, 1982; Homykiewicz et ai, 1986). Nykyinen Parkinso-15 nin taudin hoito perustuu dopamiinin esiasteen antamiseen yhdessä perifeerisen dopade-karboksylaasin eston kanssa (DDC) (Birkmayer & Homykiewicz, 1961; Cotzias et ai, 1967). Useimmissa potilaissa tämä käsittely menettää tehoaan ajan kuluessa, ja hoitoon liittyy myös joukko sivuvaikutuksia (Chase et ai, 1994; Nutt & Holford, 1996).
20 Tyrosiinihydroksylaasi (TH) on dopamiinin tuotantoa rajoittava entsyymi, joka muuttaa tyrosiinia L-dopaksi, josta sitten endogeenisen DDC.n vaikutuksesta tuotetaan dopamiinia.
• · · · * ‘ Koska aivoissa on runsaasti muita entsyymejä samoin kuin tyrosiinia, toinen mahdollisuus • · • · • 1 ’ lisätä dopamiinin synteesiä on lisätä TH-entsyymin ekspressiota paikallisesti striatumissa • · \ 2 (Elsworth & Roth, 1997). Onkin todella raportoitu, että striatumin solujen transfektio TH- • · · 25 geeniä ilmentävällä virusvektorilla voi johtaa TH:n lähetti-RNA:n tuotantoon ja vastaavan • · · 1.. proteiinin synteesiin striatumissa, joten TH-geeniterapia saattaa todella toimia Parkinsonin • · · • · · taudin eläinmalleissa. Tulokset ovat kuitenkin olleet hyvin vaihtelevia (Jiao et ai 1993; - # During et ai, 1994; Horellou et ai, 1994; Cao et ai, 1995; Geller et ai, 1997; Jiao et ai, • · # · ·. # 1996; Lundberg et ai, 1996). Lisäksi joidenkin vektorisysteemien käytössä on havaittu * 1 1 30 toksisia sivuvaikutuksia, mikä hankaloittaa geeniterapian soveltamista aivosairauksissa ja ,.. lisää tarvetta kehittää käyttökelpoisempia vektoreita (Isacson, 1995; Sabel et ai, 1995).
• · • · ♦ ·· · • · 2 ♦ · m m • m 2 107737
Erilaiset kiijallisuudessa kuvatut BPV-1 -pohjaiset vektorit perustuvat kokonaiseen BPV-1 -genomiin tai sisältävät ainakin 69 % virusgenomista - välttämättä viruksen ’early region’ -alueen.
5 Tämän keksinnön mukaiset BPV-1 -ekspressioplasmidit sisältävät viruksen replikaatiota säätelevien proteiinien geenit siten, että näiden geenien ekspressiota ohjaavat heterologiset promoottorit, minkä vuoksi El-ja E2-proteiinien ekspressio on mahdollista yleisesti alkuperältään muissakin kuin epiteelikudoksen soluissa.
10 Keksinnön yhteenveto
Me olemme rakentaneet ja karakterisoineet naudan tyypin-1 papilloomavirus (BPV-1) -vektorin terapeuttisten geenien ekspressoimiseksi kohdeyksilön soluissa, erityisesti tyrosiinihydroksylaasigeenin ekspressoimiseksi aivosoluissa.
15
Toisin sanoen tämän keksinnön yleinen tarkoitus on BPV-1-plasmidi, jossa on terapeuttinen geeni, käytettäväksi neuraalisten ja nonneuraalisten sairauksien in vivo -geeniterapiassa.
20 Menetelmä terapeuttisen geenin ilmentämiseksi kohdeyksilön soluissa on eräs keksinnön kohde. Ekspressio saadaan aikaan infusoimalla kuvattua ekspressioplasmidia yksilön * 1 soluihin.
• · • · • «· • 1 • ♦ ; Tämän keksinnön spesifinen kohde on BPV-1-ekspressioplasmidi, joka sisältää • ♦ · 25 tyrosiinihydroksylaasigeenin käytettäväksi Parkinsonin taudin geeniterapiassa.
• · « • · t ♦ • · · • · · • · · * Edelleen tämän keksinnön kohteena on menetelmä Parkinsonin taudin hoitamiseksi, siten . että terapeuttisesti tehokas määrä BPV-1 -ekspressioplasmidia annostellaan kyseisestä • · ... taudista kärsivään potilaaseen.
• · « . 30 ’ Parkinsonin taudin hoito saavutetaan ekspressoimalla tyrosiinihydroksylaasigeeniä yksilön * · * 1; · ’ aivoissa, siten että keksinnössä kuvattua BPV-1 -ekspressioplasmidia infusoidaan potilaan • · : '1· corpus striatum'\\n.
• · 3 107737
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti seuraavassa kokeellisessa osassa viitaten liitteinä oleviin kuviin, joissa 5
Kuvassa IA on esitetty pTkBPVTH-ekspressioplasmidin yleinen rakenne. pTkBPVTHin transkriptioyksikössä on Tk (tymidiinikinaasi) -promoottori, rotan TH-cDNA ja SV40 ’early region’ -polyadenylaatiokohta. BPV-E1- ja E2-elementit tarvitaan viraalisten El- ja E2-proteiinien ilmentämiseen, mikä on välttämätöntä ja riittävää pysyvälle ekstrakromoso-10 maaliselle replikaatiolle.
Kuvassa IB on esitetty pTkBPVlacZ-ekspressioplasmidin yleinen rakenne. Transkriptio-yksikkö on samanlainen kuin pTkBPVTHilla, mutta geeninä on IacZ.
15 Kuvassa 2 on esitetty pBPVTH-plasmidin transfektio Cos-7-soluviljelmässä. Solut on transfektoitu 3 pg:lla pBPV-SRaTH-plasmidia (kaista 1), pTkBPVTH-plasmidia (kaista 2) tai ainoastaan puhdasta DNA:ta (kaistat 3 ja 4) käyttämällä elektroporaatiotekniikkaa. Cos-7-solut hajotettiin 48 t transfektion jälkeen ja TH-entsyymin ekspressio analysoitiin Westem-hybridisaatiolla käyttämällä kanin polyklonaalisia anti-TH-vasta-aineita.
20
Kuvassa 3 on esitetty pTkBPVlacZ-plasmidin geeninsiirron vaikutus β-galaktosidaasi- • · · · • « .. entsyymin ekspressioon rotan striatumissa. Transfektiossa infusoitiin 50 ttg pTkBPV-lacZ- 5 ·. sense-plasmidia 20 μΐ: ssa PB S-puskuria rotan striatumiin infuusiopumpun avulla ; nopeudella 1 μΐ/min. Analysoitava β-galaktosidaasientsyymi osoitettiin käyttämällä X-gal- • · · « · ;. 25 histokemiaa ja näkyy sinivihreänä väijäytymisenä infuusiokanavan ympärillä (10 x suurennos).
*:**: Kuvat 4A, 4B, 4C ja 4D esittävät pTkBPBTH-geeniterapian vaikutusta striatumin TH- \ ^ immunohistokemiassa Parkinsonin taudin rottamallissa. TH-ekspressio leesioimattomassa v · 30 ja leesioidussa striatumissa on esitetty transfektoimattomalle rotalle kuvassa 4A (normaali leesioimaton striatum) ja 4B (leesioitu transfektoimaton striatum), ja transfektoidulle «·· : · i rotalle kuvassa 4C (leesioimaton transfektoitu striatum) ja 4D (leesioitu transfektoitu • »· ....: striatum). Rotalle annosteltiin 50 ttg pTkBPVTH-plasmidia transfektioliuoksessa, ja 4 107737 infiisoitiin mikrodialyysipumpulla nopeudella 0,5 μΙ/min. TH-entsyymin analyysiä varten aivot perfusoitiinja kiinnitettiin jääkylmällä PBS- ja PFA-liuoksella. Kiinnittämisen jälkeen aivot leikattiin kryostaatilla 15 pm:n viipaleiksi, ja TH-entsyymi osoitettiin käyttämällä monoklonaalisia anti-TH-vasta-aineita ja Vectastain-immunohistokemiallista 5 kittiä kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät -osassa (10 x suurennos).
Kuva 5 esittää pTkBPVTH-geeninsiirron vaikutusta apomorfiinilla stimuloituun pyörimiskäyttäytymiseen Parkinsonin taudin eläinmallissa. Kontrollirotille annettiin antisense-TH-cDNA plasmidia ja TH-rotille sense-TH-cDNA-plasmidia. pTkBPVTH-10 plasmidi laimennettiin 20-30 μ1:α3η PBS-puskuria, ja infusoitiin striatumiin infuusio-pumpulla nopeudella 0,5-1 μΐ/min. Transfektoidun plasmidin määrä oli 90 μ^^ΐυπι. Pyörimistulokset ovat prosentteja kontrollista eri ajankohtina kuten mainittu.
Kokeellinen osa 15
Materiaalit ja menetelmät Eläimet
Urospuoliset Wistar-rotat toimitti B&K (Sollentuna, Ruotsi) tai Valtakunnallinen koe- 20 eläinkeskus (Kuopio, Suomi). Rotat painoivat 220-250 g kokeiden alussa, ja saivat . juodakseen vesijohtovettä ja syödäkseen jyrsijäpellettejä vapaasti koko tutkimuksen ajan.
• # · · • ·
Rotat pidettiin huoneenlämmössä, ja vuorokausirytmi oli 12:12 (valoarpimeää). Rottia • · j. ^ pidettiin muovihäkeissä viisi rottaa/häkki ennen kuin toispuoliset leesiot tehtiin ja * ·· yksi/häkki leesioinnin j älkeen.
• «· 25 • · ♦ ♦ ♦ · . 1: ·. Yhdisteet ja kemikaalit • · ·
Yhdisteet ja kemikaalit hankittiin eri toimittajilta seuraavasti. Apomorfiinihydrokloridi ja 6-OH-dopamiini (Research Biochemical Inc., MA, U.S.A.), X-gal (5-bromi-4-kloori-3- • 1 1 1; indolyyli-p-D-galaktopyranosidi) ja hiiren anti-TH-vasta-aineet (Boehringer Mannheim, * · · 30 Saksa), Vectastain ABC (Vector Laboratories, U.S.A.). pTkBPVlacZ-ja pTkBPVTH- . · · \ ekspressioplasmidit kasvatettiin E. coli -DH5-soluissa ja preparoitiin Qiagen'in • · • · · „. 1 puhdistuskitillä (Qiagen, Saksa) ja CsCl-isopyknisellä sentrifugoinnilla. Kaikki muut • · • ·» » 5 107737 kemikaalit olivat tavanomaista analyyttistä ja molekyylibiologista laatua ja hankittiin yleisistä kaupallisista lähteistä.
Apomorfiinilla indusoitu pyorimiskäyttäytyminen S Leesio mediaaliseen etuaivojen tumakkeeseen sekä pyörimiskäyttäytymisen testaus
Wistar-urosrotilla tehtiin kuten Ungerstedt (1971) on kuvannut lukuun ottamatta joitakin modifikaatioita (Törmvall ja Männistö, 1993). Rotametri (Coulboum Instruments, U.S.A.) rekisteröi sekä oikeaan että vasempaan suuntaan täysiä pyörähdyksiä erikseen kahdeksasta rotasta samanaikaisesti. Apomorfiini (0,1 mg/kg) annettiin subkutaanisesti leesion onnistuit) misen testaamiseksi noin 14 päivää 6-OH-dopamiinin iniuusion jälkeen. Rotat saivat sopeutua pyörimislaitteeseen muutamia minuutteja ennen apomorfiinin injektiota. Pyörimisen monitorointi aloitettiin välittömästi apomorfiinin injektion jälkeen.
BPV Tk (ja SRa) -ekspressioplasmidit 15 Naudan tyypin-1 papilloomavirus (Bovine papilloma virus type-1 eli BPV-1) -plasmidit valmistettiin IacZ- ja TH-geenien ekspressoimiseksi. Näiden plasmidien rakenteen perustana on käytetty sitä tietoa ja osaamista, mikä on karttunut viime vuosina papilloomavirus-ten replikaatiomekanismeista. Esim. PCT-hakemuksessa n:o WO 97/24451 on kuvattu re-kombinantti-BPV-1-vektoreita, jotka ovat olleet tässä keksinnössä valmistettujen plasmi-20 dien perustana.
Plasmidien valmistamisessa sovellettiin kaksivaiheista kloonausta. Ensin, IacZ- tai TH- ·· : 1'* koodaussekvenssit kloonattiin pUE83-plasmidiin, jossa on BPV-1 :n ylävirran säätelyalue φ « • · _ : · (Upstream Regulatory Region, URR) ja siinä replikaation ’minimal origin’ -elementti • · *· 1· 25 (Minimal Origin of Replication, MO) ja minikromosomaalinen kiinnittymiselementti • · · • · ’·’ (Minichromosome Maintenance element, MME), inserttigeenin ekspressiota ohjaava Rous- • · « * · * 1 sarkoomaviruksen 5'-LTR-promoottori ja kanin β-globiinin introni ja polyadenylaatio- signaali viestin prosessoimiseksi. Plasmidi pGEMTH-3, joka sisältää rotan TH-cDNA:n, * · ... joka oli alakloonattu pGEM-2-plasmidinita/wHI-kohtaan, saatiin ystävällisenä lahjoituk- *** 30 sena Dr. Kent E. Vranalta (Wake Forest University, NC, U.S.A). TH-cDNA:n sisältämä * 1 fragmentti digestoitiin pGEMTH-3-plasmidista BamiHin avulla, ja kloonattiin ainoaan • · 2?a/wHI-kohtaan pUE-plasmidin polykloonauskohdassa, ja näin saatiin pUETH-plasmidi.
• 1 • 1 • · 1 0 6 107737
Ekspressiokasetti, joka koodaa IacZ- tai TH-geeniä, siirrettiin pTkl .5- tai pSRal4.2-plasmideihin ainoaan Hindlll kohtaan.
Näissä plasmideissa voimakas SRa- tai heikko HSV-l-Tk-promoottori kontrolloivat El-5 geenin transkriptiota. Lisäksi pSRaBPV- ja pTkBPV-plasmidit ekspressoivat BPV-1 :n E2-proteiinia, ja tämä tapahtuu heterologisen laaja-alaisen MoMLV LIR-promoottorin alaisena, ja ne sisältävät selektiomarkkerin G418-resistenssille eukaryoottisissa ja kana-mysiiniresistenssille bakteerisoluissa. Plasmidit kasvatettiin E. coli -DH5-kannassa suurina määrinä ja puhdistettiin CsCl-isopyknisellä sentrifugoinnilla tai Qiagen-pylväillä. Puhdis-10 tetut plasmidit liuotettiin sopivaan määrään puskuria ja säilytettiin -20°C:ssa geeninsiirtoja varten.
Geeninsiirto pTkBPVlacZ-ja pTkBPVTH-plasmidit liuotettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen 15 (PBS, pH 7,4) korkeina pitoisuuksina (n. 10 mg/ml) ja eri määriä infusoitiin striatumiin mikrodialyysipumpulla (CMA 102, Carnegie Medioin, Ruotsi). Infuusiokanyylit operoitiin yhteen tai kolmeen eri koordinaattiin striatumissa, ja sijoitettiin 2 mm lopullisten koordinaattien yläpuolelle, jotka koordinaatit olivat: 1) A 1,5, L 2, V -5; 2) A 0, L 3, V -5; 3) A 0, 4, V -6 (Paxinos ja Watson, 1982). Striatumin solujen transfektoimiseksi 10-30 μΐ BPV-20 plasmidia sisältävää transfektioliuosta infusoitiin nopeudella 0,5-2 μΐ/min 10-30 minuutin ajan. Infusoidun plasmidin määrä vaihteli 10-90 μg DNA:ta. Kontrollirotille annettiin • « :*.>m plasmidia, jossa oli antisense-sekvenssi, ja/tai pelkkää transfektioliuosta. Apomorfiinilla • * ·,. indusoitua pyörimistä seurattiin koejakson aikana viikoittain aina neljän tunnin ajan.
• · • « · • · · • · 25 Histokemia ja immunohistokemia xl: Histokemiallista ja immunohistokemiallista määritystä varten rotat nukutettiin kloraali- hydraatilla (350 mg/kg, i.p.), ja aivot perfusoitiin ensin 100 ml:lla jääkylmää PBS-puskuria (0,1 M PBS, pH 7,4) ja sitten 100 ml:lla 4%:ista paraformaldehydiä (4% PFA, liuotettuna • · · *...: 0,1 M PBS: aan, pH 7,4). Perfuusion jälkeen rotat lopetettiin ja aivot otettiin nopeasti tal- *:**: 30 teen ja jälkikiinnitettiin 21 +4°C:ssa (4% PFA ja 30% sakkaroosi 0,1 M PBS:ssa, pH 7,4).
Sitten aivot jäädytettiin nopeasti -70°C:ssa ja säilytettiin pakastettuina aivoleikkeiden ·*·.. valmistukseen saakka. Jäätyneet aivot valettiin Tissue Tek OCT-vahiaineeseen, ja aivoista • *:·*: preparoitiin kryostaattimikrotomin (Bright 5030 Microtome, Instrument Company Ltd, 7 107737
Huntingdon, Englanti) avulla 12 μπι leikkeitä -20 °C:ssaja leikkeet lämpökiinnitettiin polylysiinikäsitellyille (PolyLysine™ Microslides, Menzel Gläser, Saksa) objektilaseille.
Valmiit aivoleikkeet säilytettiin -70 °C:ssa analyysiin saakka. Immunohistokemiallista 5 määritystä varten aivoleikkeet huuhdeltiin PBS.ssa ja inkuboitiin yön yli +4 °C:ssa hiiren monoklonaalisten anti-TH-vasta-aineiden kanssa (1:500 laimennos) kosteassa atmosfäärissä. Sitten aivoleikkeet huuhdeltiin PBS:ssa ja inkuboitiin biotilynoitujen hevosen anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa ja väijättiin biotiini/avidiini-immunoperoksidaasimenetelniällä (Vectastain ABC-kitti). Objektilasit peitettiin ksyleenillä näytteiden suojaamiseksi.
10
Analysoitaessa β-galaktosidaasin ekspressiota aivoleikkeitä inkuboitiin X-gal-substraatissa yön yli 37 °C:ssa, ja entsyymiaktiivisuus todettiin mikroskooppisesti sinivihreänä väqäy-tymisenä.
15 Lopulta immunohistokemiallisesti ja histokemiallisesti käsitellyt aivoleikkeet analysoitiin
Olympus AX70-mikroskoopissa ja kuvattiin SenSys-digitaalikameralla käyttämällä apuna Win95/NT-jäijestelmälle laadittua Image-Pro Plus -ohjelmaa (Media Cybernetics, L.P.).
Tulokset 20 >>>; Eri promoottorien merkityksen tutkimiseksi aloituskohdan tunnistustekijän (origin recog- • ·
;·. nition factor) ja virushelikaasin El ekspression kannalta valmistettiin plasmidit pSRaBPV
» · · ja pTkBPV, ja verrattiin transfektiotehoa Cos-7- ja CV1 -P-soluviljelmissä. pTkBPV eks-
: pressioplasmidit, joihin on liitetty rotan TH:n geeni tai IacZ-geeni, on esitetty kuvissa 1A
• · 25 ja IB. SRot-plasmideilla on vastaavat rakenteet. Cos-7-soluissa, joihin oli transfektoitu : pTkBPVTH-plasmidia (3 pg) elektroporaation avulla, TH:n ekspressio oli suurempi, kun
El :n ekspressiota ohjasi HSV-Tk-promoottori kuin SRa-promoottori (Kuva 2). Saman- * · ' * kaltaisia tuloksia saatiin, kun pSRotBPVlacZ- ja pTkBPVlacZ-plasmidia (2,5pg) trans- • · ·♦·* fektoitiin Dosper-liposomien avulla apinan CVl-P-soluihin (Lampela et ai., julkaistavaksi 9 ’ ‘: 30 lähetetty käsikirjoitus). Siksi in vivo -geeninsiirroissa käytettiin ensisijaisesti pTkBPVlacZ- • * · *... * ja pTkBPVTH-plasmideita.
• m • · • ·· • 0 8 107737
Ekspressiovektorin toimivuus in vivo varmistettiin rotan aivoissa transfektoimalla pTk-BPVlacZ plasmidia (50 pg) leesioimattomiin kontrollirottiin. PTkBPVlacZ-vektoreita, joihin oli liitetty joko sense- tai antisense-lacZ-koodaussekvessi, infusoitiin rotan stria-tumiin, ja β-galaktosidaasientsyymi analysoitiin in situ X-gal-histokemian avulla. Posi-5 tiivinen vaikutus nähtiin sinivihreänä väijäytymisenä vastaten lacZ-sense-cDNA:n trans-fektiota (Kuva 3). Mitään vaikutusta ei havaittu käytettäessä antisense-lacZ-plasmidia tai pelkkää puskuriliuosta. Nämä tulokset osoittavat, että paljasta DNA:ta fosfaattipusku-roidussa suolaliuoksessa infusoituna voidaan käyttää terapeuttisten geenien ekspressoimi-seen aivoissa.
10 TH-entsyymin ekspressiota striatumissa analysoitiin immunohistokemiallisesti kontrolli-ja 6-OHDA-käsitellyistä rotista. TH:n ekspressio näkyi hyvin striatumin leesioimattomalla puolella rotan aivoissa (Kuva 4A ja 4C). Leesioinnin tekeminen rotan aivoihin johtaa TH-ekspression häviämiseen tasolle, joka vastaa immunohistokemiallisen detektion tausta-15 signaalia ilman primaarista vasta-ainetta (vrt. Kuvat 4A, 4B ja 4C). Tämä osoittaa, että 6-OH-dopamiinilla aiheutettu toksisuus inaktivoi tai tappaa useimmat dopaminergiset nigro-striataaliset neuronit johtaen TH:n ja dopamiinisynteesin puuttumiseen striatumista. Tämä heijastuu selvästi myös fysiologisessa vasteessa, mikä näkyy leesioiduilla rotilla apomorfii-nilla indusoituna kontralateraalisena pyörimisenä, minkä saa aikaan toispuolinen dopamin-20 ergisten hermojen leesiointi ja siitä johtuva ipsilateraalisten postsynaptisten dopamiini- reseptorien herkistyminen.
♦ ♦ · # • · «· • · • ** pTkBPVTH-plasmidin geeninsiirron vaikutus oli nähtävissä TH-entsyymin ekspressiona • · : (Kuva 4D). Siten leesiomattomassa striatumissa havaittiin normaali TH-ekspressio (4A, • « · 25 4C). Leesioidun puolen striatumissa, johon ei ollut tehty geeninsiirtoa, ei ollut TH-eks- • · · l.. pressiota (Kuva 4B), kun taas leesioidussa pTkBPVTH-ekspressiovektorilla transfektoi- • · · • · 1 _ dussa striatumissa oli selvä TH-värjäytyminen (Kuva 4D). TH:n ekspressio näkyi lähellä sitä kohtaa, johon DNA-liuosta laitettiin, ja ekspressio oli levinnyt pienelle alueelle aivo- • · ·.. kudosta.
• · 30
Plasmidin pTkBPVTH infuusion geeniterapeuttista vaikutusta tutkittiin toispuolisesti • · • · * I ’ leesioiduissa rotissa, j oita käytettiin Parkinsonin taudin kokeellisena mallina.
• 1 • · • 1« 9 107737 pTkBPVTH-sense- tai antisense-konstruktia (90 pg) laimennettiin 20-30 μΐ PBS:een ja infusoitiin nopeudella 0,5-2 μΐ/min. Rotille annettiin joko antisense-cDNA:ta (kontrolli-rotat) tai sense-TH-cDNA:ta (TH-rotat). Geeninsiirron vaikutusta tutkittiin seuraamalla apomorfiinilla indusoitua pyörimiskäyttäytymistä. Tulokset pTkBPVTH-plasmidin trans-5 fektioista on esitetty kuvassa 5. Luvut ovat suhteellisia TH-cDNA-transfektion vaikutuksia apomorfiinilla stimuloituun pyörimiskäyttäytymiseen.
Apomorfiinilla indusoitu pyöriminen väheni keskimäärin 25-30 % kolmessa erillisessä koesarjassa kaksi ja neljä viikkoa geeninsiirtojen jälkeen. Pyörimiskäyttäytymisessä ei 10 havaittu muutoksia, kun käytettiin antisense-TH-plasmidia.
Tässä keksinnössä rotan ΊΉ-cDNA liitettiin BPV-ekspressioplasmidiin ja transfektoitiin rotan striatumiin Parkinsonin taudin eläinmallissa, mikä johti TH-entsyymin ekspressioon ja rottien osittaiseen parantumiseen kokeellisesta Parkinsonin taudista.
15 BPVTH-plasmidi transfektoitiin rotan striatumiin in vivo indusoimalla paljasta DNA:ta rotan normaaleihin tai leesioituihin aivoihin. Havaitsimme, että paljaan DNA:n infuusio aivoihin voi johtaa vektori-DNA:n ottoon soluihin, ja geenien ekspressoitumiseen aivoissa, kuten immunohistokemiallinen määritys osoittaa. Lisäksi pTkBPVTH.n tuottaman TH:n 20 ekspressio leesioiduissa rotan aivoissa aikaansai fysiologisen vasteen, joka todettiin kontralateraalisen pyörimiskäyttäytymisen muutoksena, kun rotille annettiin dopaminergista • · · ·
Jl ' agonistia, so. apomorfiinia.
• · • · · • · • · *. . TkBPV-ekspressioplasmiditja käytetty geeninsiirtomenetelmä vaikuttivat lupaavilta « · · • · ♦ L. 1 25 fysiologisen, nontoksisen ja turvallisen geeniterapian kehittämiseksi. In vitro -geeninsiirrot • · # *... ja ekspressiot onnistuivat seerumin läsnäollessa, pitkillä transfektioajoilla ja pienillä DNA- • · · määrillä, eikä merkittävää solutuhoa havaittu optimaalisissa transfektio-olosuhteissa.
....: Lisäksi BPV-plasmideita voitiin transfektoida ja ekspressoida myös jakaantuvissa sub- • · . · · ·. konfluenteissa soluissa ja kontakti-inhiboiduissa konfluenteissa soluissa, eri alkuperää • · · ' . 30 olevissa erilaisten kudosten ja lajien soluissa, so. apinan munuaisen fibroblasteissa ja ... ihmisen neuroblastoomasoluissa. Reportterigeenin hyvä ekspressio tukee sitä, että E2- • » riippuvainen kromatiiniin sitoutuminen takaa vektorimolekyylin tehokkaan sijoittumisen • · 1 tumassa ja johtaa sen tehokkaaseen ekspressioon.
10 107737
Kokeilimme myös geeninsiirtoja rotan aivoihin käyttämällä paljasta DNA:ta, ja totesimme molempien geenien, so. IacZ ja TH, ekspressoituvan kohtalaisesti in vivo rotan striatumis-sa. Terapeuttisen TH-geenin ekspressioon liittyi myös kohtalainen parantuminen Parkinsonin taudin eläinmallissa. Nämä tulokset tukevat sitä, että aivosolut voivat ottaa paljasta 5 DNA:ta sisälleen, kuljettaa DNA:n tumaan ja ekspressoida siihen liitettyjä vieraita geenejä. Kaikki nämä ominaisuudet ovat tärkeitä in vivo -olosuhteissa, kun proliferoivien solujen määrä kudoksessa on varsin pieni. Täten käyttämämme geeninsiirtomenetelmä ja BPV-ekspressioplasmidit saattavat olla käyttökelpoisia Parkinsonin taudin geeniterapiassa.
10
Viitejulkaisut
Birkmayer, W. ja Homykiewicz, O. (1961). Der L-3,4-Dioxyphenylalanin (=DOPA)-EfFekt bei der Parkinson-Akinese. Wien. Klin. Wochenschr., 73: 787-788.
15
Cao, L, Zheng, Z.-C., Zhao, Y.-C., Jiang, Z.-H., Liu, Z.-G., Chen, S.-D., Zhou, C.-F., ja Liu, X.-Y. (1995). Gene Therapy of Parkinson Disease Model Rat by Direct Injection of Plasmid DNA-Lipofectin Complex. Hum. Gen. Ther. 6, 1497-1501.
20 Chase, T.N., Engber, T.M. ja Mouradian, M.M. (1994). Palliative and prophylactic benefits of continuously administered dopaminomimetics in Parkinson's disease. Neurology, 44: 15-18.
Cotzias, C.G., Van Woert, M.H. ja SchifFer, L.M. (1967). Aromatic amino acids and 25 modification of parkinsonism. N. Engl. J. Med., 276: 374-379.
...: During, M.J., Naegele, J.R., O'Malley K.L. ja Geller, A.I. (1994). Long-Term Behavioural * Recovery in Parkinsonian Rats by an HSV Vector Expressing Tyrosine Hydroxylase.
Science 266, 1399-1403.
Ϊ1. 30 • · · *. . Elsworth, J.D. ja Roth, R.H. (1997). Dopamine synthesis, uptake, metabolism, and receptors: relevance to gene therapy of Parkinson's disease. Exp. Neurol., 144: 4-9.
»·· • · · j!.1 Geller, A.I., During, M.J., Oh, Y.J., Freese, A. ja O’Malley, K. (1995). AnHSV-1 Vector *·1 1 35 Expressing Tyrosine Hydroxylase Causes production and Release of L-DOPA from
Cultured Rat striatal cells. J. Neurochem. 64, 487-496.
4
* ‘ Horellou, P., Vigne, E., Castel, M.-N., Bameoud, P., Colin, P., Perricaudet, M., Delaere, P
*,..! ja Mallet, J. (1994). Direct intracerebral gene transfer of adenoviral vector expressing * . 40 tyrosine hydroxylase in a rat model of Parkinson's disease. NeuroRepori 6, 49-53.
• ·
Homykiewicz, O. (1982). Brain neurotransmitter changes in Parkinson's disease. In: .1·’ Movement Disorders, Marsden, C.D. and Fahn, S. (Eds.), Butterworth Scientific, London, j’··· ss. 41-558.
....: 45 • · 11 107737
Homykiewicz, 0., Kish, S.J., Becker, L.E., Farley, I. ja Shannak, K. (1986). Brain transmitters in dystonia musculorum deforms. N. Engl. J. Med., 315: 347-353.
Isacson, O. (1995). Behavioural Effects and Gene Delivery in a Rat Model of Parkinson's 5 Disease. Science 269, 856.
Jiao, S., Gurevich, V. ja Wolff, J. (1993). Long-term correction of rat model of Parkinson's disease by gene therapy. Nature 362, 450-453.
10 Jiao, S., Gurevich, V. ja Wolff, J. (1996). Retraction. Long-term correction of rat model of Parkinson's disease by gene therapy. Nature 380, 734.
Lundberg, C., Horellou, P., Mallet, J. ja Björklund, A. (1996). Generation of DOPA-Producing Astrocytes by Retroviral Transduction of Human Tyrosine Hydroxylase Gene: 15 In Vitro Characterization and In Vivo Effects in the Rat Parkinson Model. Exp. Neurol. 139, 39-53.
Lampela, P., Ustav, E., Ustav, M., Männistö, P.T. ja Raasmaja, A. (1999) Transfection of Bovine Papilloma Virus Plasmids Expressing lacZ and Tyrosine Hydroxylase Genes in 20 Primate Cell Cultures. Toimitettu julkaistavaksi.
Nutt, J.G. ja Hoiford, N.H. (1996). The response to levodopa in Parkinson's disease: imposing pharmacological law and order. Ann. Neurol., 39: 561-573.
25 Paxinos, G. ja Watson, C. (1982). The Rat Brain in Stereotazic Coordinates. 1. painos Academic Press, London.
Sabel, B. A., Vick, A. ja Holt, V. (1995). Neurotoxic reactions of CNS cells following gene transfer with defective herpes simplex virus (HSV-1) vector. NeuroReport 6,2447-2449.
30
Tomwall, M. ja Männistö, P. T. (1993). Effects of three types of catechol O-methylation ...: inhibitors on L-3,4,-dihydroxyphenylalanine-iriduced circling behaviour in rats. Eur. J.
.. Pharmacol 250, 77-84.
• · • · · • 35 Ungerstedt, (1971). Postsynaptic supersensitivity after 6-hydroxydopamine induced *. . degeneration of the nigro-striatal dopamine system. Acta Physiol. Scand 82(Suppl. 367), 69-93.
• · · • · · • « · ♦ ·♦· • · · « · · • · • ·· • · „ ♦·· • · • ·· • · • · «·· • · • · • ·· 1 ·
Claims (6)
1. Naudan tyypin-1 papilloomavirus (Bovine Papilloma Virus Type-1, BPV-1) -ekspressioplasmidi, jossa on 5. papilloomaviruksen E1 - ja E2-geenit pysyvän ekstrakromosomaalisen replikaation aikaansaamiseksi, - papilloomaviruksen replikaation minimal origin -elementti (MO), - papilloomaviruksen minikromosomaalinen kiinnittymiselementti (MME), - tyrosiinihydroksylaasientsyymiä (TH) koodaava nukleotidisekvenssi. 10
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ekspressioplasmidi, joka lisäksi sisältää säätelyalueet ekspression ja transkription kontrolloimiseksi.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen ekspressioplasmidi, jossa säätelyalueet sisältävät 15 promoottoreita, jotka ohjaavat TH:n ekspressiota soluissa.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen ekspressioplasmidi, jossa säätelyalueet sisältävät - BPV-1 :n ylävirran säätelyalueen (URR) ja - tymidiinikinaasin (Tk) promoottorin. 20
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisen ekspressioplasmidin käyttö valmistettaessa * neuraalisten tai nonneuraalisten sairauksien geeniterapeuttiseen hoitoon tarkoitettua ·· : *·* lääkevalmistetta. ·· • · « ·· • · * « · *· *· 25
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että tauti on Parkinsonin tauti. ·*· • » · i « « ·♦· • · · * · « • » ·*· • · « ·*♦ „ ♦ • · ··· • · • · · ·· • · • »· ♦ • « 107737 3
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI992771A FI107737B (fi) | 1999-12-23 | 1999-12-23 | Plasmidi tyrosiinihydroksylaasigeenin ilmentämiseksi aivoissa |
| PCT/FI2000/001140 WO2001048232A1 (en) | 1999-12-23 | 2000-12-22 | A plasmid for the expression of a therapeutic gene in a tissue |
| AU25186/01A AU2518601A (en) | 1999-12-23 | 2000-12-22 | A plasmid for the expression of a therapeutic gene in a tissue |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI992771 | 1999-12-23 | ||
| FI992771A FI107737B (fi) | 1999-12-23 | 1999-12-23 | Plasmidi tyrosiinihydroksylaasigeenin ilmentämiseksi aivoissa |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI19992771A FI19992771A (fi) | 2001-06-24 |
| FI107737B true FI107737B (fi) | 2001-09-28 |
Family
ID=8555804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI992771A FI107737B (fi) | 1999-12-23 | 1999-12-23 | Plasmidi tyrosiinihydroksylaasigeenin ilmentämiseksi aivoissa |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU2518601A (fi) |
| FI (1) | FI107737B (fi) |
| WO (1) | WO2001048232A1 (fi) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994012629A1 (en) * | 1992-12-02 | 1994-06-09 | Baylor College Of Medicine | Episomal vectors for gene therapy |
| DE69637628D1 (de) * | 1995-12-29 | 2008-09-18 | Fit Biotech Oyj Plc | Episomaler vektor und dessen verwendung |
| AU1275299A (en) * | 1997-10-23 | 1999-05-10 | Uab Research Foundation | Human papillomavirus vectors for the episomal transduction of host cells and method of making same |
| FI105105B (fi) * | 1998-02-27 | 2000-06-15 | Finnish Immunotechnology Ltd O | Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan |
-
1999
- 1999-12-23 FI FI992771A patent/FI107737B/fi not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-12-22 WO PCT/FI2000/001140 patent/WO2001048232A1/en active Application Filing
- 2000-12-22 AU AU25186/01A patent/AU2518601A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI19992771A (fi) | 2001-06-24 |
| WO2001048232A1 (en) | 2001-07-05 |
| AU2518601A (en) | 2001-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5108797B2 (ja) | 色素上皮誘導因子：ｐｅｄｆ遺伝子の特性評価、ゲノム構成および配列 | |
| Klugmann et al. | AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats | |
| Wolff et al. | Grafting fibroblasts genetically modified to produce L-dopa in a rat model of Parkinson disease. | |
| Lemkine et al. | Adult neural stem cell cycling in vivo requires thyroid hormone and its alpha receptor | |
| US5851832A (en) | In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny | |
| Thompson et al. | Conditionally immortalized cell lines, engineered to produce and release GABA, modulate the development of behavioral seizures | |
| Park et al. | ATF3 negatively regulates adiponectin receptor 1 expression | |
| WO2000058451A1 (en) | Regulation of tyrosine hydroxylase expression | |
| AU777187B2 (en) | Novel mitogenic regulators | |
| US5998188A (en) | Mitogen activated protein kinase phosphatase cDNAS and their biologically active expression products | |
| WO2000012139A1 (en) | Hypoxia regulated genes | |
| AU755251B2 (en) | Compositions and methods for sensitizing and inhibiting growth of human tumor cells | |
| CN108610409B (zh) | Etv5在制备预防或治疗肥胖症及相关代谢性疾病药物中的应用 | |
| FI107737B (fi) | Plasmidi tyrosiinihydroksylaasigeenin ilmentämiseksi aivoissa | |
| Barkats et al. | Intrastriatal grafts of embryonic mesencephalic rat neurons genetically modified using an adenovirus encoding human Cu/Zn superoxide dismutase | |
| Ikari et al. | Adenovirus-mediated gene transfer of dopamine D2 receptor cDNA into rat striatum | |
| JP2008530029A (ja) | 神経保護剤およびそれらの使用方法 | |
| EP2059598B1 (en) | Compositions and methods for modulating ampa receptor-mediated excitotoxicity | |
| US8124393B2 (en) | Compositions and methods for inducing or inhibiting activities of selected human cells | |
| JP3761152B2 (ja) | ヒトグリア細胞株由来神経栄養因子プロモーター、該プロモーターを含むベクター、および該プロモーターによる化合物のスクリーニング方法 | |
| GB2400103A (en) | Cell lines expressing VGSC, Nav1.8 | |
| Sui et al. | Neuroprotective roles of HAX-1 in ischemic neuronal injury | |
| KR20140030934A (ko) | 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 함유하는 뇌 허혈손상 예방 및 치료용 약학 조성물 | |
| WO2006123644A1 (ja) | 低酸素ストレス応答に関与するInt6タンパク質、およびその利用 | |
| WO1994001135A1 (en) | Method of producing genetically modified astrocytes and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |