KR20140030934A

KR20140030934A - 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 함유하는 뇌 허혈손상 예방 및 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20140030934A
Application number: KR1020120097718A
Authority: KR
Inventors: 최수영; 박진서; 음원식; 김대원; 장상호; 김형춘; 황인구; 신은주; 유대영
Original assignee: 한림대학교 산학협력단; 주식회사 바이오셀트란
Priority date: 2012-09-04
Filing date: 2012-09-04
Publication date: 2014-03-12

Abstract

본 발명은 퍼옥시레독신 2 단백질의 N 말단 및 C 말단 중 어느 한 곳 이상에 단백질 수송도메인이 공유결합된 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 함유하는 뇌 허혈손상 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

퍼옥시레독신 2 융합단백질을 함유하는 뇌 허혈손상 예방 및 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition containing cell-transducing peroxiredoxin 2 fusion protein for brain ischemic damage}

퍼옥시레독신 (Peroxiredoxin, Prx)은 생체 내에서 과산화수소 및 알킬 하이드로퍼록사이드의 스캐빈저이다 (Chae, H. Z. et al.,. Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 7017-7021, 1994). 포유동물에서는 타입 1~6 퍼옥시레독신 아이소자임으로 구분되며, 조직의 다양한 부분에서 관찰된다 (Rhee, SG et al., IUBMB Life 52:35~41, 2001). 이 단백질은 세포 내에서 강한 항산화 활성을 나타낸다. 퍼옥시레독신 타입 6을 제외하고 이미 알려진 모든 퍼옥시레독신은 전자 공여자로서 티오레독신 (thioredoxin)을 이용하고, 그래서 티오레독신 퍼옥시데이즈로 알려져 있었다. 이들의 항산화 활성에 더하여, 퍼옥시레독신은 세포 증식 및 분화, 자연킬러세포 (natural killer cell) 활성의 증강, 라디칼에 민감한 단백질 보호, 헴 (heme) 대사과정 및 세포간 신호전달과 같은 많은 세포의 기능들에 연관되어 있으며 (Nemoto Y, et al., Gene 91:261~265, 1990; Prosperi MT, et al., Genomics, 19:236~241,1994; Tsuji K, et al., Biochem J. 307:377~381, 1995; Shau H, et al., Immunogenetics, 40:129~134,1994; Watabe S, et al., Biochem Biophys Res Commun. 213:1010~1016, 1995; Iwahara S, et al., Biochemistry 34:13398~13406, 1995; Wen ST, et al., Genes Dev. 11:2456~2467, 1997), 배양한 동물세포에서 퍼옥시레독신의 생화학적 특성은 세포내 환원 전위(redox potential)를 유지하는데 중요한 역할을 하는 것들 중 하나임을 보여준다.

퍼옥시레독신 2 (peroxiredoxin, PRDX2)는 항산화 단백질로, 혈소판유도성장인자 (PDGF)와 상피세포유도성장인자 (EGF)를 포함하는 성장인자들에 의해 생성되는 세포 내 과산화수소를 환원시켜 제거하는 퍼옥시데이즈이다. PRDX2는 세포질에 많이 존재하며, 단백질의 C-말단부위를 통해 인테그랄 막단백질 또는 세포막에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 과산화수소에 높은 친화성(K m for H2O2 < 10 μM)을 나타낸다.

또한, PRDX2는 적혈구에서 많이 발현이 되고, 세포 내에서 활성산소종-매개 손상에 대하여 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 헤모글로빈 축적 전에 적혈구 분화 초기 단계에서 유도되는 것으로 알려져 있다(Rabilloud T, et al., Biochem J. 312:699-705, 1995).

그러나, 퍼옥시레독신 2가 실제로 뇌 허혈손상 동물에서 어떠한 기능을 수행하는지는 알려져 있지 않았다.

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나, 단백질은 크기나 여러 가지 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

인간면역결핍 바이러스 (Human Immunodeficiency Virus type-1) 단백질의 일종인 Tat (Transactivator of transcription) 펩타이드는 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 기능은 Tat 펩타이드의 중간부위인 단백질 수송 도메인 (Protein transdcution domain)의 특성 때문에 나타나며 아직까지 정확한 기전은 알려지지 않은 상태이다. 또한, PEP-1 단백질 수송 도메인도 타 단백질과 공유결합하여 타 단백질을 세포 내로 원활히 수송하는 것으로 알려져 있다. 최근의 많은 연구들은 타 단백질을 HIV-1 Tat 펩타이드, PEP-1 펩타이드와 융합시켜 투여하였을 때 세포 및 조직 내로 직접 운반된다는 것을 보여 주었다.

그러나, 모든 단백질이 단백질 수송 도메인과 융합단백질을 이루어 세포 내로 투과될 수 있는 것은 아니다. 2001년, 2004년 그리고 2007년에는 Tat 형질도입부위와 결합시킨 단백질이 세포 내로 도입은 되었으나 활성을 나타내지 않는는 연구결과가 논문으로 발표된 사실이 있다(Sengoku, T. et al. Experimental Neurology 188(2004) 161-170, Falnes P.O. et al. Biochemistry 2001 Apr 10;40(14):4349-4358, Daniele Peroni et al., Neuroscience letters 421(2007) 110-114 등). 즉, 상기 참고논문들을 통하여 세포도입이 용이하지 않은 단백질에 단백질 수송 도메인을 융합시킨다고 해서 융합된 모든 단백질이 세포 내로 도입된 후 원활한 활성을 나타내지는 못하고 있음을 알 수 있다.

본 발명은 뇌 허혈손상을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 조성물을 제공하려는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 세포 내에서 활성산소종-매개 손상에 보호효과를 나타내는 퍼옥시레독신 2의 N 말단 및/또는 C 말단에 단백질 수송 도메인이 공유결합된 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 제조하여 인비보와 인비트로에서 활성산소종에 의한 세포 손상 및 뇌허혈손상에 대한 퍼옥시레독신 2 융합단백질의 보호효과를 확인하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명에서는 단백질을 세포 및 조직 내로 운반하는 PEP-1 펩타이드를 외부 단백질인 사람 퍼옥시데이즈2에 융합시켰고, 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, PEP-1-PRDX2 융합단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 PEP-1-PRDX2 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 PRDX2 cDNA, PEP-1 펩타이드 그리고 6개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 PEP-1-PRDX2 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켜 Ni²⁺-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. PEP-1-PRDX2 융합단백질의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다.

또한, 본 발명자들은 정제된 융합단백질이 효과적으로 생물학적인 활성을 지니고 있으며, 세포 내로 운반된다는 것을 배양된 신경세포 및 동물실험을 통하여 확인하였다. 그리고, PEP-1-PRDX2 융합단백질이 신경 세포 내로 운반되며 신경 세포사를 효과적으로 보호함을 밝혀냈다.

이러한 결과는 PEP-1-PRDX2 융합단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 퍼옥시레독신 2의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 PEP-1-PRDX2 융합단백질은 활성산소종과 관련된 증세 또는 질병 및 뇌허혈 등의 신경질환에 응용할 수 있는 가능성을 제시해 준다.

PEP-1-퍼옥시레독신 2 융합단백질(이하 "PEP-1-PRDX2", "PEP-1-PRDX2 융합단백질", "PRDX2 융합단백질", "퍼옥시레독신 2 융합단백질"과 혼용함)을 포함하여 수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 PEP-1-PRDX2 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 알츠하이머병과 같은 신경 퇴행성 질환, 뇌허혈과 같은 신경질환의 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 퍼옥시레독신 2 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 퍼옥시레독신 2 단백질 분자의 세포 내 전달은 PEP-1 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 PEP-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 PEP-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, PEP-1 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 PEP-1-PRDX2 융합단백질, 이 융합단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 이 융합단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물 등에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"PEP-1-PRDX2 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 퍼옥시레독신 2를 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질(즉, 본 발명에서는 퍼옥시레독신 2를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "PEP-1-PRDX2", "PEP-1-퍼옥시레독신 2 융합단백질", "PRDX2 융합단백질", "퍼옥시레독신 2 융합단백질"과 혼용하였다.

"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 퍼옥시레독신 2를 의미한다.

"융합단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.

또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.

본 발명에서의 "단백질 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 펩타이드, 단백질 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명은 단백질 수송 도메인이 퍼옥시레독신 2의 N 말단과 C 말단 중 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 유효성분으로 하는 뇌허혈 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서 상기 수송도메인은 HIV Tat, PEP-1 중 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질의 그 아미노산 서열이 서열번호 7, 서열번호 9 또는 11과 같은 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.

예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

본 발명의 퍼옥시데이즈 2 융합단백질은 배양한 C6 성상세포에 처리하였을 때 세포 내로 원활히 침투하여 세포사멸을 저해하였다.

또한, 본 발명의 퍼옥시데이즈 2 융합단백질은 뇌허혈 유도된 동물모델에 처리하였을 때 생체 세포 내로 원활히 침투하여 세포사멸을 저해하였다.

도 1은 PEP-1-PRDX2 융합단백질 및 PRDX2 대조군 단백질 제조를 위한 벡터를 나타내는 모식도이다. His는 히스티딘 잔기 6개가 연속된 서열을 의미하며, PEP-1-PRDX2 융합단백질 및 PRDX2 대조군 단백질의 정제와 탐지를 위해 이용하였다.
도 2는 PRDX2 대조군 단백질과 PEP-1-PRDX2 융합단백질 발현 및 정제를 나타내는 사진이다.
레인 1 ; PRDX2 단백질 과대발현 전, 레인 2 ; PRDX2 단백질 과대발현 후,
레인 3 ; PRDX2 단백질 정제, 레인 4 ; PEP-1-PRDX2 융합단백질 과대발현 전,
레인 5 ; PEP-1-PRDX2 융합단백질 과대발현 후, 레인 6 ; PEP-1-PRDX2 융합단백질 정제 후.
도 3은 PRDX2 대조군 단백질과 PEP-1-PRDX2 융합단백질의 C6 성상세포에 침투를 나타내는 사진이다.
1: 대조군, 2: PRDX2 단백질 처리군, 3: PEP-1-PRDX2 융합단백질 처리군.
도 4는 C6 성상세포에서 PEP-1-PRDX2 융합단백질의 활성산소종에 대한 세포 보호효과를 나타내는 사진이다. 위쪽 사진은 광학현미경으로 세포의 형태를 관찰한 것이고, 아래쪽 사진은 DCF-DA를 이용하여 활성산소종을 측정한 형광현미경 사진이다. 활성산소종이 많을수록 형광이 많이 관찰된다.
1 ; 대조군, 2 ; H₂O₂투여군,3 ; H₂O₂ 투여 + PEP-1-PRDX2 융합단백질 처리, 4 ; H₂O₂ 투여 + PRDX2 단백질 처리, 5 ; H₂O₂ 투여 + PEP-1 펩타이드 처리.
도 5는 뇌허혈 동물모델에서 PEP-1-PRDX2 융합단백질의 보호효능을 보여주는 결과이다.
SO: 지향층 (Stratum oriens), SP: 피라미드층 (Stratum pyramidale), SR: 방사층 (Stratum radiatum).
도 6은 뇌허혈 동물모델에서 신경아교증에 대한 PEP-1-PRDX2 융합단백질의 효과를 나타내는 현미경 사진이다.
SO: 지향층 (Stratum oriens), SP: 피라미드층 (Stratum pyramidale), SR: 방사층 (Stratum radiatum), GFAP: Glial fibrillary acidic protein, Iba-1: ionized calcium binding adaptor molecule 1.
도 7은 웨스턴 블랏 사진이다.
M: 분자량 마커, 1: PRDX2 단백질, 2: PEP-1-PRDX2 융합단백질.

이하, 본 발명의 구성을 아래의 실시예의 기재를 통하여 좀더 상세히 알아본다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에만 한정된 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 자명하다.

재료

제한 효소와 T4 DNA ligase는 Promega (USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머레이즈는 stratagene(USA)에서 구입하였다. PEP-1 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer (USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa (Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 E. coli DH5α 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni²⁺-니트릴로삼초산 세파로즈 수퍼플로우는 Qiagen (Germany)에서 구입하였다. 사람 퍼옥시레독신 2 ("PRDX2"와 혼용함) cDNA는 PCR 방법으로 사람 간 cDNA 라이브러리에서 분리하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.

세포 투과성 PRDX2 융합단백질 발현벡터의 제조 및 형질전환

세포 투과성 융합단백질발현벡터의 제조 및 형질전환은 본 발명자들이 개발한 방법을 기본으로 수행하였다. 세포 투과성 PRDX2 융합단백질을 제조하기 위해 단백질 수송 도메인이 포함된 발현벡터를 만들고, 단백질 수송 도메인에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 NdeＩ-XhoＩ 제한효소로 자른 pET-15b에 이어 삽입한 다음, 사람 PRDX2 cDNA 서열 및 두 개의 프라이머 (센스 프라이머, 5'-CTCGAGGCCTCCGGTAACG-3' 및 안티센스 프라이머, 5'-GGATCCCTAATTGTGTTTGG-3')를 기본으로 하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. PCR 수행 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터 및 PEP-1 벡터에 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5α에 클로닝하였다. 또, 단백질 수송 도메인이 연결되지 않은 PRDX2 단백질을 발현하는 대조군 PRDX2도 구축하였다.

PRDX2 융합단백질을 제조하기 위해 이 벡터를 수용 세포에 형질변환시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 분리하여 PRDX2 cDNA가 포함된 TA 벡터를 XhoＩ과 BamHＩ으로 절단하여 발현벡터에 삽입하였다. 형질변환된 E. coli BL21 세포를 선택한 다음, 콜로니를 100 ㎖ LB 배지에 접종하고, 37 ℃에서 3~4시간 동안 IPTG (0.5-1 mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 융합단백질의 과대발현을 유도하였다. 하비스트한 세포는 4 ℃에서 초음파 처리로 용균한 후 세포 추출물을 맑아지게 한 후 니켈 이온-니트릴로삼초산 세파로즈 친화 크로마토그래피 컬럼 및 PD-10 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 측정하였다.

세포배양 및 PRDX2 융합단백질의 세포도입

랫트 성상세포종 세포주 C6를 10% 우태혈청 및 항생제 (100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 U/㎖ 페니실린)가 들어 있는 DMEM 배지에서 37 ℃, 95% 공기와 5% CO₂의 습한 조건에서 배양하였다.

PRDX2 융합단백질의 세포도입을 위해, 세포를 다양한 농도의 PRDX2 융합단백질로 한 시간 동안 처리하였다. 세포는 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 세척하였으며, 하비스트하여 세포 추출물에 대하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

웨스턴 블랏 분석

세포 용균액 내의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분석하였다. 분리된 단백질들은 나이트로셀룰로오스 막으로 전기이동시키고, 5% 탈지유가 포함된 PBS로 블로킹시켰다. 막은 토끼 항히스티딘 폴리클론 항체 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 탐지한 후 염소 항토끼 이뮤노글로블린 (1:10,000으로 희석함; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 함께 배양하였다. 결합한 항체는 강화된 화학형광으로 시각화하였다 (Amersham, Franklin Lakes, NJ, USA).

형광현미경 분석

3μM의 PRDX2 융합단백질로 처리한 커버슬립에서 성상세포 C6를 배양하였다. 37 ℃로 한 시간 배양한 후 세포를 PBS로 두 번 세척하고 4% 파라포름알데하이드와 5분간 실온에서 혼합하였다. 세포는 침투 가능하게 되었고, 3% 우혈청 알부민, 0.1% Triton X-100이 함유된 PBS (PBS-BT)로 30분간 블로킹하였다. 1차 항체 (His-probe, Santa Cruz Biotechnology)를 1:2000으로 희석하고 90분간 실온에서 배양하였다. 2차 항체 (Alexafluor 488, Invitrogen)를 1:15000으로 희석하고, 45분간 어두운 곳에서 실온으로 배양하였다. 핵은 5분간 1 ㎍/㎖ DAPI (Roche)로 염색하였다. 형광의 분포는 형광현미경 (Nikon eclipse 80i, Japan)으로 분석하였다.

MTT 분석

MTT 분석은 과산화수소로 처리한 성상세포의 생존율을 결정하기 위해 수행하였다. PRDX2 융합단백질 (1~3 μM)로 한 시간 동안 미리 처리한 세포에 과산화수소 (0.7 mM)를 24시간 동안 배양배지에 가하였다.

ELISA 마이크로플레이트 판독기 (Labsystems Multiskan MCC/340)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 세포생존율은 무처리 대조군 세포에 대한 백분율로 나타내었다.

활성산소종 측정

활성산소종에 민감한 안료인 DCF-DA (2',7'-dichlorofluorescein diacetate)를 이용하여 활성산소종 수준을 측정하였다. DCF-DA는 활성산소종에 의해 고형광 DCF (2',7'-dichlorofluorescein)로 변환된다. 성상세포를 PRDX2 융합단백질 (3 μM)이 있거나 없는 상태에서 한 시간 배양한 후 H₂O₂ (0.7mM)로 30 분간 처리하였다. 세포를 DCF-DA (15 μM)로 15 분간 처리하고 PBS로 두 번 세척하였다. DCF 형광의 수준은 여기 485 ㎚, 방출 538 ㎚로 조절된 플루오로스캔 (fluoroskan) ELISA 플레이트 판독기 (LabsystemsOy, Helsinki, Finland)를 이용하여 형광현미경으로 측정하였다 (결과는 도 4의 아래쪽 패널).

TUNEL 분석

성상세포를 PRDX2 융합단백질이 없는 상태 또는 가한 상태 (3 μM)로 한 시간 동안 배양하고, H₂O₂ (0.7mM)로 18시간 동안 처리하였다. 세포사멸 탐지킷트 (Roche Applied Science)를 이용하여 TUNEL (Terminaldeoxynucleotidyl- transferase-mediated biotinylated UTP nick end labeling) 염색을 수행하였다. 영상은 형광현미경 (Nikon eclipse 80i, Japan)을 이용하여 촬영하였다.

실험동물

39 마리의 웅성 저빌을 일본 SLC 사 (Shizuoka, Japan)에서 구입하였다. 저빌은 일정 온도 (23 ℃)와 일정 상대습도 (60%)에서 12시간 사이클로 명암 조절하여 사육하였다. 물과 사료에는 자유롭게 접근 가능하였다. 동물 취급 및 보호는 최근 국제법 및 정책 (실험동물 보호 및 사용에 관한 NIH 가이드, NIH 공고 No. 85-23, 1985, 1996 수정)을 충족시키기 위해 정립된 가이드라인에 따랐고, 서울대 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다 (SNU-100611-1). 모든 실험에서는 사용 동물 수 및 실험에 의해 야기되는 고통을 최소화하기 위해 노력하였다.

대뇌 전뇌허혈 모델은 선행 논문의 방법에 따라 제조하였다 (Loskota WA, Lomax P, Verity MA. 1974. A stereotaxic atlas of the Mongolian Gerbil Brain (Merionesunguiculatus). Ann Arbor: Ann Arbor Science Publishers Inc., 70-79). 동물은 2.5% 아이소플루란 (Baxtor, Deerfield, IL) 이 함유된 33% 산소와 67% 아산화질소 혼합물로 마취시켰다. 양방향 총경동맥을 분리하여 비외상성 동맥류 클립을 이용하여 폐색시켰다. 검안경을 이용하여 안구 내 중앙혈관을 관찰하여 혈류의 완전한 차단을 확인하였다. 폐색 5분 후 동맥류 클립을 총경동맥에서 제거하였다. 검안경으로 직접 재관류를 관찰하였다. 수술 중 및 수술 이후 그리고, 마취에서 완전히 깨어날 때까지 비조절 또는 정상체온 (37±0.5 ℃) 조건 하의 체온 (직장의 온도)을 직장 온도 탐침 (TR-100; Fine Science Tools, Foster City, CA)으로 모니터하고 온열담요로 유지하였다. 그 후 동물들은 안락사시킬 때까지 체온을 유지하기 위해 온열 사육기 (Mirae Medical Industry, Seoul, South Korea)에 두었다.

허혈손상에 대한 PRDX2 융합단백질의 보호효과를 밝히기 위해 동물을 샴 군 (n=11), 담체 (PEP-1)군 (n=14) 및 500 ㎍/㎏ PEP-1-PRDX2 융합단백질 처리군 (n=14)의 3개 군으로 나누었다. 담체 또는 PEP-1-PRDX2 융합단백질은 재관류 30분 후 복막주사하였다.

허혈-재관류 후 4~7일째 뇌조직 시료를 확보하고, PBS (pH 7.4)로 심장을 관통하여 관류하였고, 샴 수술군, 담체 처리군, PEP-1 펩타이드 처리군, PRDX2 단백질 처리 대조군 및 PRDX2 융합단백질 처리군 (각 3 ㎎/㎏)에 4% 파라포름알데하이드를 포함하는 0.1 M PBS (pH 7.4)를 가하였다. 뇌조직은 30% 수크로즈로 오버나잇 침윤하여 동결방지 처리하였다. 조직들을 동결한 후 저온유지장치에서 50 ㎛로 절편화하고 연속되는 절편들을 PBS가 들어 있는 6웰 플레이트에 수집하였다. 크레실 바이올렛 염색을 수행하였다.

조직학적 분석

샴 수술군과 허혈수술군 (각각 n=5)을 30 mg/kg Zoletil 50 (Virbac, Carros, France)으로 마취시키고 심장을 관통하여 0.1 M PBS (pH 7.4)로 관류시킨 다음 4% 파라포름알데하이드를 함유한 0.1 M 인산 완충액 (PB, pH 7.4)으로 관류시켰다. 뇌를 제거하고 같은 고정제로 8 시간 동안 후고정하고 파라핀에 포매하기 전 알콜 농도를 달리 하여 탈수시켰다. 그런 다음 파라핀에 포매된 조직을 마이크로톰 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany) 상에 4 ㎛ 두께로 원통형으로 절편화하고, 실란으로 코팅된 슬라이드 상에 놓았다.

군 간의 면역조직화학 데이타를 비교 가능하도록 하기 위해 절편들을 같은 조건에서 주의하여 처리하였다. 조직 절편들은 각 동물의 저빌 지도 (Loskota et al., 1974)의 브레그마 참고점에서 뒤로 -1.4 ㎜와 -2.0 ㎜ 사이에서 선택되었다. 절편들은 수화시키고 0.3% H₂O₂가 포함된 PBS로 30 분간 처리하였다. 항원 검색을 위해, 절편들을 시트르산 완충액 (pH 6.0)이 함유된 400 ㎖ 용기에 담고 2.45 GHz 및 800-W 전력으로 셋팅하여 작동시켜 마이크로웨이브 오븐 (Optiquick Compact, Moulinex)에서 가열하였다. 각각 5 분씩 세 번 가열한 후 슬라이드는 실온에서 냉각시키고 PBS로 세척하였다. 세척 후 10% 정상 염소 혈청이 함유된 PBS로 30 분간 절편을 배양하였고, 그 다음에는 희석된 마우스 항신경 핵 (NeuN, 1:1,000, Chemicon International, Temecula, CA), 토끼 항-교섬유질 산성 단백질 (GFAP, 1:1,000, Chemicon International) 및 토끼 항-이온화 칼슘-결합 어댑터 분자 1 (Iba-1, 1:500, Wako, Osaka, Japan)로 차례로 48 시간 동안 4 ℃에서 배양하였다. 그 후, 바이오틴 결합된 토끼 항-염소 IgG, 염소 항-마우스 IgG, 스트렙타비딘 퍼옥시데이즈 복합체 (1:200 희석된 것, Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 노출시키고, 3,3'-다이아미노벤지딘 사염산 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)이 함유된 0.1 M Tris-HCl 완충액 (pH 7.4)으로 시각화하였다.

면역조직화학 데이타 정량

영상분석시스템을 이용하여 뉴런 수와 면역반응의 강도를 계산하였다. 면역반응을 나타내는 구조의 염색 강도를 대조군 수준과 대비하여 상대적 광학강도 (relative optical density; ROD)로 그래프에 나타내었다. 통계적 중요성을 결정하기 위해 데이타는 일방 ANOVA를 이용하여 분석하였다.

모든 군에서 NeuN-면역반응성 세포 측정은 컴퓨터-기반 CCD 카메라를 장착한 영상분석 시스템 (software: Optimas 6.5, CyberMetrics, Scottsdale, AZ)을 이용하여 수행하였다. 또한, 모든 NeuN-면역반응성 구조의 이미지들은 해마 CA1 영역에서 컴퓨터 모니터와 연결된 디지탈 카메라 (DP71, Olympus)를 장착한 BX51 광학현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)을 통해 얻었다. 그리고나서, 해마 CA1 영역 각 절편의 NeuN-면역반응성 세포들은 Optimas 6.5 소프트웨어 (CyberMetrics)를 이용하여 계수하였다. 모든 저빌의 모든 절편에서 얻은 세포 수는 평균값을 내었다.

결과 1. PEP-1-PRDX2 벡터 제조

퍼옥시레독신 (PRDX2) 단백질에 단백질 수송 도메인 PEP-1 펩타이드가 결합된 융합단백질을 제조하는 작업을 실시하였다 (도 1).

결과 2: 퍼옥시레독신과 PEP-1-퍼옥시레독신 융합단백질 발현 및 정제

단백질 발현을 위한 수용 세포 (Bl21)에 PRDX2 유전자와 PEP-1-PRDX2 유전자를 형질전환하여 대장균에서 PRDX2 단백질과 PEP-1-PRDX2 융합단백질을 발현하였다. 단백질 발현 후 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (도 2).

결과 3: PEP-1-PRDX2 융합단백질의 C6 성상세포 침투

C6 성상세포를 배양 후 PRDX2 단백질과 PEP-1-PRDX2 융합단백질을 각각 처리하여 세포 내 침투성을 확인하였다 (도 3). 그 결과, PRDX2 단백질은 세포 내로 침투하지 않는 반면, PEP-1-PRDX2 융합단백질의 경우 세포 내로 침투되어 형광으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

결과 4: C6 성상세포에서 활성산소종에 대한 PEP-1-PRDX2 융합단백질의 세포 보호효과 확인

C6 성상세포에 H₂O₂를 가하여 세포에 산화 손상을 일으킨 후, 여기에 PRDX2 단백질과 PEP-1-PRDX2 융합단백질을 각각 처리하여 PEP-1-PRDX2 융합단백질의 H₂O₂에대한 세포 보호효과를 확인하였다 (도 4). 활성산소종에 의한 산화 손상에 대한 PEP-1-PRDX2 융합단백질의 효능을 확인한 결과 PEP-1-PRDX2 융합단백질의 경우 세포보호 효과를 확인하였다. 그러나, PRDX2 단백질과 PEP-1 펩타이드의 경우에는 그 효과를 확인할 수 없었다.

결과 5: 허혈손상에 대한 PEP-1-Prx2 융합단백질의 효과

샴 군에서, 해마 CA1 영역에서 NeuN-면역반응성 뉴런들이 풍부하게 탐지되었다 (도 5A). 담체 처리한 허혈군에서는 지향층 (strata oriens)과 방사층 (strata radiatum)에서 몇 개의 NeuN-면역반응 뉴런이 탐지되었고 (도 5B),샴 군의 그것과 비교하여 NeuN-면역반응 뉴런의 평균 수는 현저히 감소하였다. 이 군에서, NeuN-면역반응 뉴런의 평균 수는 샴 군과 비교하여 10.2%였다 (도 5D). PEP-1-Prx2 융합단백질 처리 허혈군에서는 담체 처리 허혈군과 비교하여 NeuN-면역반응 뉴런이 CA1 영역에서 현저히 증가하였고 (도 5C), NeuN-면역반응 뉴런의 평균 수는 샴 군의 65.6%였다 (도 5D).

결과 6: 허혈에 의해 유도되는 신경아교증에 대한 PEP-1-Prx2 융합단백질의 효과

뇌허혈 동물모델을 이용하여 신경아교증에 대한 PEP-1-PRDX2 융합단백질의 효과를 확인하였다 (도 6). 뇌허혈 동물모델에서 PEP-1-PRDX2 융합단백질의 효능을 확인해본 결과, PEP-1-PRDX2 융합단백질을 처리한 경우 세포사가 거의 일어나지 않은 것을 GFAP와 Iba-1 항체를 이용하여 확인하였다. 하지만, PRDX2 단백질과 PEP-1 펩타이드의 경우 보호효과가 매우 미미함을 확인할 수 있었다.

샴 군에서, GFAP-면역반응 성상세포는 돌기가 가늘고 세포질이 작았고 (도 6A), 담체처리 허혈군에서는 GFAP-면역반응 성상세포가 활성화된 형태를 나타내는데, 이것은 돌기가 두꺼워지고 세포질이 커지는 것으로 특징지어진다 (도 6C). PEP-1-Prx2 융합단백질 처리 허혈군에서는 대부분의 GFAP-면역반응 성상세포가 샴 군과 비슷한 형태를 보였다. 다만 약간의 GFAP-면역반응 성상세포만이 활성화되었다 (도 6E).

샴 군에서는 Iba-1-면역반응 소신경교세포가 가늘고 긴 돌기를 가진 둥근 세포질로 나타났다 (도 6B). 담체처리 허혈군에서는 Iba-1-면역반응 소신경교세포가 CA1 영역에서 현저히 증가하였다. 특히, Iba-1-면역반응 소신경교세포는 이 영역에서 신경사멸로 인하여 피라미드층 (stratum pyrammidale)에서 둥근 형태를 보였다. 또한, Iba-1-면역반응 소신경교세포는 움추러든 돌기와 커진 세포질로 특징지어지는 활성화 형태를 나타내었다 (도 6D). PEP-1-Prx2 융합단백질 처리 허혈군에서 Iba-1-면역반응 소신경교세포는 지향층 (strata oriens)과 방사층 (strata radiatum)에서 주로 탐지되었다. 그렇지만, Iba-1-면역반응 소신경교세포는 이 영역에서 활성화된 형태였다 (도 6F).

<110> Industry Academy Cooperation Foundation, Hallym University <120> Pharmaceutical composition containing cell-transducing peroxiredoxin 2 fusion protein for brain ischemic damage <130> inipat-hallym-PRDX2 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 1 tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60 taaagtgc 68 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bottom strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 2 tcgagcactt tacgtttttt tttcggctga caccattcgg tccaccaggt ttcccaccag 60 gtttctttcc 70 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein transducing domain called PEP-1 <400> 3 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of human peroxiredoxin 2 <400> 4 ctcgaggcct ccggtaacg 19 <210> 5 <211> 20 <212> 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Pro Leu Leu Ala 115 120 125 Asp Val Thr Arg Arg Leu Ser Glu Asp Tyr Gly Val Leu Lys Thr Asp 130 135 140 Glu Gly Ile Ala Tyr Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Gly Lys Gly Val 145 150 155 160 Leu Arg Gln Ile Thr Val Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp 165 170 175 Glu Ala Leu Arg Leu Val Gln Ala Phe Gln Tyr Thr Asp Glu His Gly 180 185 190 Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Ser Asp Thr Ile Lys Pro 195 200 205 Asn Val Asp Asp Ser Lys Glu Tyr Phe Ser Lys His Asn Gly Ser Lys 210 215 220 Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys 225 230 235 240 Lys Arg Lys Val

Claims

퍼옥시레독신 2 단백질의 N 말단 및 C 말단 중 어느 한 곳 이상에 단백질 수송도메인이 공유결합된 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 함유하는 뇌 허혈손상 예방 및 치료용 약학 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 단백질 수송 도메인은 HIV Tat 펩타이드 또는 PEP-1 펩타이드임을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 퍼옥시데이즈 2 융합단백질은 그 아미노산 서열이 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11임을 특징으로 하는 조성물.