KR20150094210A - 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퍼옥시레독신 2 단백질의 N 말단 및 C 말단 중 어느 한 곳 이상에 단백질 수송도메인이 공유결합된 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

퍼옥시레독신 2 융합단백질을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes containing peroxiredoxin 2 fusion protein}

본 발명은 당뇨병 치료제로 이용 가능한 세포 투과성 퍼옥시레독신 2 융합단백질의 용도에 관한 것이다.

퍼옥시레독신 (Peroxiredoxin, Prx)은 생체 내에서 과산화수소 및 알킬 하이드로퍼록사이드의 스캐빈저이다 (Chae, H. Z. et al.,. Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 7017-7021, 1994). 포유동물에서는 타입 1~6 퍼옥시레독신 아이소자임으로 구분되며, 조직의 다양한 부분에서 관찰된다 (Rhee, SG et al., IUBMB Life 52:35~41, 2001). 이 단백질은 세포 내에서 강한 항산화 활성을 나타낸다. 퍼옥시레독신 타입 6을 제외하고 이미 알려진 모든 퍼옥시레독신은 전자 공여자로서 티오레독신 (thioredoxin)을 이용하고, 그래서 티오레독신 퍼옥시데이즈로 알려져 있었다. 이들의 항산화 활성에 더하여 퍼옥시레독신은 세포 증식 및 분화, 자연킬러세포 (natural killer cell) 활성의 증강, 라디칼에 민감한 단백질 보호, 헴 (heme) 대사과정 및 세포간 신호전달과 같은 많은 세포의 기능들에 관련되어 있으며 (Nemoto Y, et al., Gene 91:261~265, 1990; Prosperi MT, et al., Genomics, 19:236~241,1994; Tsuji K, et al., Biochem J. 307:377~381, 1995; Shau H, et al., Immunogenetics, 40:129~134,1994; Watabe S, et al., Biochem Biophys Res Commun. 213:1010~1016, 1995; Iwahara S, et al., Biochemistry 34:13398~13406, 1995; Wen ST, et al., Genes Dev. 11:2456~2467, 1997), 배양한 동물세포에서 퍼옥시레독신의 생화학적 특성은 세포 내 환원 전위(redox potential)를 유지하는데 중요한 역할을 하는 것들 중 하나임을 보여준다.

퍼옥시레독신 2 (peroxiredoxin, Prx2)는 항산화 단백질로, 혈소판 유도 성장인자 (PDGF)와 상피세포 유도 성장인자 (EGF)를 포함하는 성장인자들에 의해 생성되는 세포 내 과산화수소를 환원시켜 제거하는 퍼옥시데이즈이다. Prx2는 세포질에 많이 존재하며, 단백질의 C-말단부위를 통해 막내 단백질 (integral membrane protein) 또는 세포막에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 과산화수소에 높은 친화성 (H₂O₂에 대한 Km 값< 10 μM)을 나타낸다.

또한, Prx2는 적혈구에서 많이 발현이 되고, 세포 내에서 활성산소종-매개 손상에 대하여 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 헤모글로빈 축적 전에 적혈구 분화 초기 단계에서 유도되는 것으로 알려져 있다(Rabilloud T, et al., Biochem J. 312:699-705, 1995).

그러나, 퍼옥시레독신 2가 실제로 당뇨병에서 어떠한 기능을 수행하는지는 알려져 있지 않았다.

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는 데 있어 세포막을 거쳐 목표 단백질을 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나, 단백질은 크기나 여러 가지 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

인간면역결핍 바이러스-1 (Human Immunodeficiency Virus type-1) 단백질의 일종인 Tat (Transactivator of transcription) 펩타이드는 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 기능은 Tat 펩타이드의 중간부위인 단백질 수송 도메인 (Protein transdcution domain)의 특성 때문에 나타나며 아직까지 정확한 기전은 알려지지 않은 상태이다. 또한, PEP-1 단백질 수송 도메인도 타 단백질과 공유결합하여 타 단백질을 세포 내로 원활히 수송하는 것으로 알려져 있다. 최근의 많은 연구들은 타 단백질을 HIV-1 Tat 펩타이드, PEP-1 펩타이드와 융합시켜 투여하였을 때 세포 및 조직 내로 직접 운반된다는 것을 보여 주었다.

그러나, 모든 단백질이 단백질 수송 도메인과 융합단백질을 이루어 세포 내로 투과될 수 있는 것은 아니다. 2001년, 2004년 그리고 2007년에는 Tat 형질도입부위와 결합시킨 단백질이 세포 내로 도입은 되었으나 활성을 나타내지 않는 연구결과가 논문으로 발표된 사실이 있다(Sengoku, T. et al. Experimental Neurology 188(2004) 161-170, Falnes P.O. et al. Biochemistry 2001 Apr 10;40(14):4349-4358, Daniele Peroni et al., Neuroscience letters 421(2007) 110-114 등). 즉, 상기 참고논문들을 통하여 세포도입이 용이하지 않은 단백질에 단백질 수송 도메인을 융합시킨다고 해서 융합된 모든 단백질이 세포 내로 도입된 후 원활한 활성을 나타내지는 못하고 있음을 알 수 있다.

본 발명의 목적은 췌장 베타세포 사멸과 인슐린 감소 억제 등의 활성을 통하여 당뇨병 치료제로 이용할 수 있는 융합단백질을 제공하려는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 퍼옥시레독신 2의 N 말단 및/또는 C 말단에 단백질 수송 도메인이 공유결합된 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 제조하여 췌장 베타세포 사멸, 혈당 감소 및 인슐린 감소 억제효과를 확인하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명에서는 단백질을 세포 및 조직 내로 운반하는 PEP-1 펩타이드를 외부 단백질인 사람 퍼옥시레독신 2에 융합시켰고, 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, PEP-1-Prx2 융합단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 PEP-1-Prx2 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 Prx2 cDNA, PEP-1 펩타이드 그리고 6개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 PEP-1-Prx2 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켜 Ni^{2 +}-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. PEP-1-Prx2 융합단백질의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다.

또한, 본 발명자들은 정제된 융합단백질이 효과적으로 생물학적인 활성을 지니고 있으며, 세포 내로 운반된다는 것을 배양된 면역세포 및 동물실험을 통하여 확인하였다. 그리고, PEP-1-Prx2 융합단백질이 면역세포 내로 운반되며 혈당 및 인슐린 감소를 효과적으로 억제함을 밝혀냈다.

이러한 결과는 PEP-1-Prx2 융합단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 퍼옥시레독신 2의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 PEP-1-Prx2 융합단백질은 당뇨병에 응용할 수 있는 가능성을 제시해 준다.

PEP-1-퍼옥시레독신 2 융합단백질(이하 "PEP-1-Prx2", "PEP-1-Prx2 융합단백질", "Prx2 융합단백질", "퍼옥시레독신 2 융합단백질"과 혼용함)을 포함하여 수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 PEP-1-Prx2 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨병의 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 퍼옥시레독신 2 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 퍼옥시레독신 2 단백질 분자의 세포 내전달은 PEP-1 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 PEP-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 PEP-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, PEP-1 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 PEP-1-Prx2 융합단백질, 이 융합단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 이 융합단백질을 포함하는 당뇨병 치료, 예방 목적의 약학 조성물 등에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"PEP-1-Prx2 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 퍼옥시레독신 2를 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질(즉, 본 발명에서는 퍼옥시레독신 2를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "PEP-1-Prx2", "PEP-1-퍼옥시레독신 2 융합단백질", "Prx2 융합단백질", "퍼옥시레독신 2 융합단백질"과 혼용하였다.

"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 퍼옥시레독신 2를 의미한다.

"융합단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.

또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.

본 발명에서의 "단백질 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 펩타이드, 단백질 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로도입시킬 수 있는 것을 말한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명은 단백질 수송 도메인이 퍼옥시레독신 2의 N 말단과 C 말단 중 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 유효성분으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서 상기 수송도메인은 HIV Tat, PEP-1 중 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질의 그 아미노산 서열이 서열번호 7, 서열번호 9 또는 11과 같은 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.

예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

본 발명의 퍼옥시레독신 2 융합단백질은 세포 내로 농도 및 시간 의존적으로 투과하였다. 또 본 발명의 투과된 퍼옥시레독신 2 융합단백질은 세포 내 활성산소종 농도를 저하시켰다.

또한, 본 발명의 퍼옥시레독신 2 융합단백질은 췌장 베타세포의 사멸을 효과적으로 억제하여 췌장 세포를 보호하였고, 혈당 및 인슐린 분비 감소를 억제하였다.

도 1은 정제된 PEP-1-Prx2 융합단백질이 세포 내로 잘 침투되었는지를 확인하기 위하여 단백질을 세포 내로 농도 및 시간 의존적으로 침투시켜 그 효능을 확인한 결과이다. 도 1a, 1b는 세포침투성 PEP-1-Prx2 융합단백질을 세포 내로 침투시킨 결과 농도 및 시간 의존적으로 효과적으로 침투되는 것을 히스티딘 항체를 통해 웨스턴블랏으로 확인하였으며, PEP-1 단백질이 융합되지 않은 대조군 Prx2 단백질은 세포 내로 침투되지 않는 것을 확인하였다. 도 1c는 세포 침투 능력을 갖는 PEP-1-Prx2 융합단백질이 세포 내로 효과적으로 침투되는 것을 형광현미경을 통해 확인한 것이다.
도 2는 스트렙토조토신을 췌장 세포 내에 처리하였을 때 발생하게 되는 활성산소종을 PEP-1-Prx2 융합단백질이 효과적으로 억제하는지를 확인하기 위하여 DCF-DA 염색법을 실시하고 형광현미경을 통해 확인한 결과이고 (도 2a), ELISA를 이용하여 측정한 결과이다 (도 2b).
도 3a는 세포 내로 효율적으로 침투되는 PEP-1-Prx2 융합단백질의 세포 보호효능을 확인하기 위하여 살아있는 세포수를 측정하는 방법인 MTT 분석을 수행한 결과이고, 도 3b는 스트렙토조토신이 췌장의 베타세포를 산화시키게 되면 세포 내 핵이 응축되어 DNA의 분열을 촉진시키는데 이 과정을 TUNEL 분석법을 통하여 확인한 것이다.
도 4는 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델을 제작하여 당뇨로부터 PEP-1-Prx2 융합단백질의 세포 보호 효능에 대해서 실험한 결과이다. 6~8주된 ICR 마우스에 스트렙토조토신을 주사한 후 2일에 한 번씩 PEP-1-Prx2 융합단백질을 주사하여 혈당을 측정하였고 (도 4a), 동물의 혈액을 얻어 인슐린을 측정하였다 (도 4b).
도 5는 당뇨 유도동물 모델을 제작 후에 동물로부터 조직을 얻어 조직염색을 시행한 결과이다. 췌장 세포 내로 PEP-1-Prx2 융합단백질이 잘 침투하는지 확인하기 위하여 항 히스티딘 항체를 사용하여 면역염색을 시행하였다.
도 6a는 H&E 염색 통해서 스트렙토조토신으로 당뇨가 유도되었을 때 췌장 세포 내에서의 베타세포의 모양 변화 등을 확인한 결과이다. 도 6b는 췌장의 베타세포에서 분비되는 인슐린의 양을 조직염색으로 확인한 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 아래의 실시예의 기재를 통하여 좀더 상세히 알아본다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에만 한정된 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 자명하다.

PEP -1- Prx2 융합단백질 발현 및 정제

세포 투과성 융합단백질 발현벡터의 제조 및 형질전환은 본 발명자들이 개발한 방법을 기본으로 수행하였다. 세포 투과성 Prx2 융합단백질을 제조하기 위해 단백질 수송 도메인이 포함된 발현벡터를 만들고, 단백질 수송 도메인에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 NdeＩ-XhoＩ 제한효소로 자른 pET-15b에 이어 삽입한 다음, 사람 Prx2 cDNA 서열 및 두 개의 프라이머 (센스 프라이머, 5'-CTCGAGGCCTCCGGTAACG-3' 및 안티센스 프라이머, 5'-GGATCCCTAATTGTGTTTGG-3')를 기본으로 하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. PCR 수행 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터 및 PEP-1 벡터에 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5α에 클로닝하였다. 또, 단백질 수송 도메인이 연결되지 않은 Prx2 단백질을 발현하는 대조군 Prx2도 구축하였다.

Prx2 융합단백질을 제조하기 위해 이 벡터를 수용 세포에 형질변환시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 분리하여 Prx2 cDNA가 포함된 TA 벡터를 XhoＩ과 BamHＩ으로 절단하여 발현벡터에 삽입하였다. 형질변환된 E. coli BL21 세포를 선택한 다음, 콜로니를 100 ㎖ LB 배지에 접종하고, 37 ℃에서 3~4시간 동안 IPTG (0.5-1 mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 융합단백질의 과대발현을 유도하였다. 하비스트한 세포는 4 ℃에서 초음파 처리로 용균한 후 세포 추출물을 맑아지게 한 후 니켈 이온-니트릴로삼초산 세파로즈 친화 크로마토그래피 컬럼 및 PD-10 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 측정하였다.

세포배양 및 Prx2 융합단백질의 세포도입

랫트 대식세포 세포주 Raw 264.7 세포를 37℃에서 95% 공기와 5% CO₂를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 5mM NaHCO₃, 10% FBS (fetal bovine serum) 및 항생제 (100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린)가 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다.

Prx2 융합단백질의 세포도입을 위해, 세포를 다양한 농도의 Prx2 융합단백질로 한 시간 동안 처리하였다. 세포는 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 세척하였으며, 하비스트하여 세포 추출물에 대하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

웨스턴 블랏 분석

세포 용균액 내의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분석하였다. 분리된 단백질들은 나이트로셀룰로오스 막으로 전기이동시키고, 5% 탈지유가 포함된 PBS로 블로킹시켰다. 막은 토끼 항히스티딘 폴리클론 항체 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 탐지한 후 염소 항토끼 이뮤노글로블린 (1:10,000으로 희석함; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 함께 배양하였다. 결합한 항체는 강화된 화학형광으로 시각화하였다 (Amersham, Franklin Lakes, NJ, USA).

형광현미경 분석

3μM의 Prx2 융합단백질로 처리한 커버슬립에서 RAW 264.7 세포를 배양하였다. 37 ℃로 한 시간 배양한 후 세포를 PBS로 두 번 세척하고 4% 파라포름알데하이드와 5분간 실온에서 혼합하였다. 세포는 침투 가능하게 되었고, 3% 우혈청 알부민, 0.1% Triton X-100이 함유된 PBS (PBS-BT)로 30분간 블로킹하였다. 1차 항체 (His-probe, Santa Cruz Biotechnology)를 1:2000으로 희석하고 90분간 실온에서 배양하였다. 2차 항체 (Alexafluor 488, Invitrogen)를 1:15000으로 희석하고, 45분간 어두운 곳에서 실온으로 배양하였다. 핵은 5분간 1 ㎍/㎖ DAPI (Roche)로 염색하였다. 형광의 분포는 형광현미경 (Nikon eclipse 80i, Japan)으로 분석하였다.

세포 생존율 분석

MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheyltetrazolium bromide} 분석은 과산화수소로 처리한 RAW 264.7 세포의 생존율을 결정하기 위해 수행하였다. Prx2 융합단백질 (1~3 μM)로 한 시간 동안 미리 처리한 세포에 과산화수소 (0.7 mM)를 24시간 동안 배양배지에 가하였다.

ELISA 마이크로플레이트 판독기 (Labsystems Multiskan MCC/340)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 세포생존율은 무처리 대조군 세포에 대한 백분율로 나타내었다.

세포 내 활성산소종 수준 측정

활성산소종에 민감한 안료인 DCF-DA (2',7'-dichlorofluorescein diacetate)를 이용하여 활성산소종 수준을 측정하였다. DCF-DA는 활성산소종에 의해 고형광 DCF (2',7'-dichlorofluorescein)로 변환된다. RAW 264.7 세포를 Prx2 융합단백질 (3 μM)이 있거나 없는 상태에서 한 시간 배양한 후 H₂O₂ (0.7mM)로 30 분간 처리하였다. 세포를 DCF-DA (15 μM)로 15 분간 처리하고 PBS로 두 번 세척하였다. DCF 형광의 수준은 여기 485 ㎚, 방출 538 ㎚로 조절된 플루오로스캔 (fluoroskan) ELISA 플레이트 판독기 (LabsystemsOy, Helsinki, Finland)를 이용하여 형광현미경으로 측정하였다.

TUNEL 분석

PEP-1-Prx2 융합단백질 (0.3 μM)을 두 시간 동안 가하거나 또는 가하지 않고 세포를 배양한 후 과산화수소 (5 mM)로 네 시간 동안 처리하였다. 세포사멸 탐지킷트 (Roche Applied Science)를 이용하여 TUNEL {Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated biotinylated dUTP nick end labeling} 염색을 실시하였다. 영상은 형광현미경 (Nikon eclipse 80i, Japan)으로 촬영하였다.

통계 분석

데이타는 각각의 독립된 실험에서 얻은 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 평균값 간의 차이는 일방 ANOVA를 이용하여 분석하였다. 차이는 p < 0.01일 때 유의미한 것으로 하였다.

<결과>

결과 1: PEP -1- Prx2 융합단백질의 정제 및 세포 내 투과

정제된 PEP-1-Prx2 융합단백질의 세포 내 투과를 농도 및 시간별로 확인한 결과 PEP-1-Prx2 융합단백질은 농도와 시간 의존적으로 세포 내 투과가 일어났다(도 1a). 또한 세포 내로 투과된 후 PEP-1-Prx2 융합단백질은 세포 내에서 48시간 지속됨을 확인하였다(도 1b). 정제된 PEP-1-Prx2 융합단백질의 세포 내 투과를 다시 한번 확인하기 위해 형광염색으로 확인한 결과 PEP-1-Prx2 융합단백질은 효율적으로 세포 내로 투과가 일어남을 알 수 있었고, 대조군으로 사용한 PEP-1-단백질, Prx2 단백질은 세포 내로 투과가 되지 않음을 알 수 있었다(도 1c). 이러한 결과는 순수하게 정제된 PEP-1-Prx2 융합단백질이 세포 내로 효과적으로 침투되었음을 알 수 있었다.

결과 2: 세포 침투성 PEP -1- Prx2 융합단백질의 스트렙토조토신으로 유도된 활성산소종 제거 효과

세포 내에 스트렙토조토신을 처리하게 되면 활성산소종이 발생하는데 이를 DCF-DA 염색법을 통해 확인하였다. 세포 내 활성산소종이 유도되면 2',7'-H₂DCFDA (dichlorofluorescin diacetate)는 불투과성의 2',7'-H₂DCF (dichlorofluorescin)로 가수분해되어 저장되는데 이것은 스트렙토조토신에 유도된 활성산소와 반응하여 산화되면서 2',7'-DCF (dichloro-fluorescein)를 형성하여 녹색을 띄게 된다. 세포 침투성 PEP-1-Prx2 융합단백질을 세포 내에 전처리하였을 경우 침투된 PEP-1-Prx2 융합단백질에 의해 세포 내의 활성산소종이 억제되어 형광이 감소한 것을 형광현미경 (도 2a)과 ELISA (도 2b)를 통해 확인하였다.

결과 3: PEP -1- Prx2 융합단백질의 췌장세포 사멸 억제 효과

스트렙토조토신에 의해 췌장 세포에서 활성산소종이 생성되며 그로 인해 세포 사멸이 유도된다. PEP-1-Prx2 융합단백질의 세포 사멸 억제효과를 확인하기 위하여 췌장 세포에 스트렙토조토신 및 PEP-1-Prx2 융합단백질을 처리한 후 세포 사멸을 MTT 분석과 TUNEL 분석을 통하여 확인하였다. MTT 분석을 보면 췌장 세포의 사멸이 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었으며 (도 3a), TUNEL 분석에서 역시 세포 사멸의 증후인 DNA 분열이 PEP-1-Prx2 융합단백질에 의하여 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 3b).

결과 4: PEP -1- Prx2 융합단백질의 혈당 감소와 인슐린 감소 억제 효과

동물모델에서도 PEP-1-Prx2 융합단백질의 효능이 있는지를 확인하기 위해 쥐에 당뇨를 유도하여 실험하였다. 6-8주 된 ICR 마우스에 스트렙토조토신을 주사한 후 2일에 한 번씩 PEP-1-Prx2 융합단백질을 주사하여 혈당과 인슐린의 변화를 측정하였다. 스트렙토조토신만을 주사한 마우스에 비하여 PEP-1-Prx2 융합단백질을 주사한 쥐에서 혈당이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었고 (도 4a), 또한 인슐린의 양은 증가함을 확인할 수 있었다 (도 4b). 이 결과를 통해 PEP-1-Prx2 융합단백질이 당뇨에 의해 증가하는 혈당을 감소시키고 인슐린 감소를 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.

결과 5: PEP -1- Prx2 융합단백질의 췌장 조직 내로의 효과적인 침투효능 확인

PEP-1-Prx2 융합단백질의 조직 내로 효과적인 침투효능을 확인하기 위하여, 정제한 PEP-1-Prx2 융합단백질을 마우스에게 복강 주사하여 6시간 후에 조직을 떼어내어 6X 히스티딘 항체를 이용한 면역조직염색을 통하여 확인하였다. 그 결과, 췌장조직에 PEP-1-Prx2 융합단백질이 효과적으로 침투하는 것을 확인할 수 있었다(도 5) (크기 막대 = 25 ㎛ 및 12.5 ㎛).

이러한 결과를 볼 때 침투성 PEP-1-Prx2 융합단백질이 췌장조직의 세포에 효과적으로 투과되어 들어간다는 것을 확인할 수 있다.

결과 6: PEP -1- Prx2 융합단백질의 당뇨 유도 동물모델의 베타세포 사멸 억제 효과

인슐린은 췌장의 랑게르한스섬 지역의 베타세포에서 생성된다. 따라서, 베타세포가 손상되면 인슐린의 생성이 현저히 감소한다. PEP-1-Prx2 융합단백질의 베타세포 보호 효능을 확인하기 위하여 면역조직염색을 통해 실험을 진행하였다. PEP-1-Prx2 융합단백질을 복강 주사하지 않은 마우스에서는 췌장의 베타세포 사멸이 진행되어 그 세포의 수가 현저히 감소하는 반면, 침투성 PEP-1-Prx2 융합단백질을 처리한 마우스에서는 베타세포의 사멸이 억제되는 것을 H&E 염색을 통해 확인하였다 (도 6a). 베타세포 사멸에 의한 인슐린의 생성 감소 또한 침투성 PEP-1-Prx2 융합단백질을 처리한 마우스에서는 인슐린이 발현되는 베타세포의 수가 스트렙토조토신만을 처리한 동물모델에 비하여 현저히 증가하였음을 인슐린 항체를 이용한 면역조직염색을 통하여 확인하였다 (도 6b). (크기 막대 = 25 ㎛ 및 12.5 ㎛) 따라서, 세포침투성 PEP-1-Prx2 융합단백질을 복강 주사하였을 경우 췌장의 랑게르한스섬 지역에 있는 베타세포 사멸이 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다.

본 발명은 이러한 실험을 통해서 PEP-1-Prx2 융합단백질이 췌장 베타세포의 사멸과 인슐린 억제를 감소시키는 것을 확인하고, 당뇨의 새로운 치료제로서의 가능성을 제시한다.

<110> Industry Academy Cooperation Foundation, Hallym University <120> Pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes containing peroxiredoxin 2 fusion protein <130> inipat-hallym-PRDX2-diabetes <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 1 tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60 taaagtgc 68 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bottom strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 2 tcgagcactt tacgtttttt tttcggctga caccattcgg tccaccaggt ttcccaccag 60 gtttctttcc 70 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein transducing domain called PEP-1 <400> 3 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of human peroxiredoxin 2 <400> 4 ctcgaggcct ccggtaacg 19 <210> 5 <211> 20 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Claims (3)

1. 퍼옥시레독신 2 단백질의 N 말단 및 C 말단 중 어느 한 곳 이상에 단백질 수송도메인이 공유결합된 퍼옥시레독신 2 융합단백질을 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 단백질 수송 도메인은 HIV Tat 펩타이드 또는 PEP-1 펩타이드임을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 퍼옥시레독신 2 융합단백질은 그 아미노산 서열이 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11임을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물.

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