KR101677449B1 - 세포투과성 ｎｑｏ１ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포투과성 NQO1 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 세포 내로 투과된 NQO1 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰고, 세포 내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰다. 동물모델에서는 전뇌 해마 CA1 부분에 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸에 대해 NQO1 융합단백질이 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 NQO1 융합단백질이 세포사멸에 대해 보호효과가 있으며, 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 치료효과가 있음을 말해준다.
Description
본 발명은 세포투과성 NQO1 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 세포 내로 투과된 NQO1 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰고, 세포 내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰다. 동물모델에서는 전뇌 해마 CA1 부분에 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸에 대해 NQO1 융합단백질이 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 NQO1 융합단백질이 세포사멸에 대해 보호효과가 있으며, 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 치료효과가 있음을 말해준다.
산소의 신진 대사의 자연 부산물 중 하나는 활성산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)이다. 활성산소종은 심혈관 질환, 허혈 손상 면역, 염증 반응을 포함한 다양한 세포활성의 증가에 중요한 역할을 담당한다. 활성산소종 증가는 허혈/재관류 신경 세포의 사멸과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 활성산소종 생성 조절은 뇌허혈 손상에 대해 보호 기능을 한다.
뇌허혈은 뇌 저산소증, 뇌 조직 사멸, 뇌경색, 허혈성 뇌졸중 등을 일으킨다. 뇌허혈의 주요 증상은 시각, 신체의 움직임 저하 및 말하기 손상 등이 있다.
단백질 전달 기술은 포유류 세포 내로 단백질을 효과적으로 전달할 수 있는 유용한 방법이다. CPP(Cell penetrating Peptide)라고도 불리는 단백질 수송 도메인(Protein Transduction Domain)은 세포 안으로 단백질을 손쉽게 전달할 수 있는 새로운 개념의 전달 시스템이다. 단백질 수송 도메인은 일반적으로 인 비트로 및 인 비보에서 치료 단백질을 전달하기 위해 사용된다. PEP-1 펩타이드(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)는 가장 일반적으로 사용되는 단백질 수송 도메인이다.
NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 {NAD(P)H:quinone oxidoreductase(EC1.6.99.2); "NQO"}는 DT-diaphorase, quinone reductase, menadione reductase, vitamin K reductase 등으로 불리며, NQO는 두 개의 아이소폼, 즉, NQO1과 NQO2로 존재한다(ROM. J. INTERN. MED. 2000-2001, vol. 38-39, 33-50). NQO는 플라보프로테인(flavoprotein)으로서, 퀴논 또는 퀴논 유도체들의 쌍전자환원(two electron reduction) 및 무독화를 촉매하는 작용을 한다. NQO는 전자공여체로 NADH 및 NADPH를 모두 사용한다. NQO의 활성은 반응성이 매우 큰 퀴논 대사물의 형성을 예방하고, 벤조(d)피렌, 퀴논을 무독화시키며, 크롬의 독성을 감소시킨다. NQO 활성은 모든 조직에 존재하지만, 활성은 조직에 따라 차이가 있다. 일반적으로 암세포조직, 간, 위, 신장과 같은 조직에서 NQO의 발현량이 많은 것으로 확인되었다. NQO의 유전자 발현은 생체이물 (xenobiotics), 항산화제, 산화제, 중금속, 자외선, 방사선 등에 의해 유도된다. NQO는 산화적 스트레스에 의해 유도되는 수많은 세포방어기작 중의 일부이다. NQO를 포함한 방어기작에 관여하는 유전자들의 연합된 발현은 산화적 스트레스, 유리기 및 종양형성 (neoplasia)에 대하여 세포를 보호하는 역할을 수행한다. NQO는 매우 넓은 기질 특이성이 있는데, 퀴논 이외에 퀴논-이민 (quinone-imines), 질소 화합물 및 아조 화합물이 기질로 사용될 수 있다.
그 중 NQO1은 상피세포와 내피세포에 주로 분포한다. 이는 NQO1이 공기, 식도 또는 혈관을 통해 흡수된 화합물에 대한 방어기작을 수행할 수 있음을 뜻한다. 최근, NQO1이 암억제 유전자인 p53의 안정화에 산화환원 기작을 통해 관여하는 것으로 밝혀져, 암발생 억제에 중요한 역할을 할 것으로 기대된다. NQO1은 특히 많은 고형암세포에 높은 수준으로 존재하기 때문에, 퀴논 화합물에 의해 활성화되는 NQO1이 특별한 주목을 받고 있다.
그러나, NQO1 융합단백질의 뇌허혈 예방 및 치료 효과에 관해서는 알려지지 않았다.
본 발명은 허혈손상 및 허혈손상에 의한 신경세포 손상과 사멸을 치료하기 위한 효과적인 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 NQO1 융합단백질이 인비트로에서 산화 스트레스에 의해 유도된 신경세포 사멸과 인비보 허혈동물모델에서 보호효과가 있는지를 밝히고자 하였다. 허혈성 신경세포 사멸에 대해 NQO1 융합단백질의 잠재적인 효과를 연구하기 위해 본 발명자들은 세포 내로 투과할 수 있는 Tat-NQO1 융합단백질을 제작하였다. Tat-NOL3 융합단백질은 신경세포 내부로 농도 의존적 및 시간 의존적으로 효과적으로 투과하였다. 세포 내로 투과된 Tat-NQO1 융합단백질은 과산화수소 독성에 대한 세포 생존율을 증가시켰고, 세포 내 활성산소종 수준을 낮추었다. 그리고, 세포 내로 투과된 Tat-NQO1 융합단백질은 과산화수소에 의해 유도된 DNA 단편화 현상도 저하시켰다. 동물모델에서 Tat-NQO1 융합단백질은 전뇌의 해마 CA1 부분에서 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸로부터 세포를 보호하였다. 이러한 결과들은 Tat-NQO1 융합단백질이 인비트로와 인비보에서 일어나는 세포사멸에 대해 보호효과를 나타내며, 산화 스트레스와 관련된 허혈손상에 대해 치료제로 이용될 수 있음을 말해준다.
본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명하면, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 먼저 NQO1 융합단백질을 과대 발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 NQO1 발현 벡터를 개발하였다. 이 발현 벡터는 인간 NQO1 단백질, Tat 단백질 수송 도메인, 그리고 아미노산 말단부분에 6개의 히스티딘 잔기를 발현시킬 수 있는 cDNA를 포함하고 있다.
이 발현벡터를 이용하여 NQO1 융합단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며 Ni-친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양된 세포에 NQO1 융합단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 세포 내로 투과된 NQO1 융합단백질은 세포 내에서 최대 60시간 지속적으로 유지되었으며, 산화 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하였다.
이러한 결과는 NQO1 융합단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 NQO1 단백질의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 NQO1 융합단백질은 활성산소종과 관련된 증세 또는 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 등의 뇌신경질환에 응용할 수 있는 가능성을 제시해 준다.
세포 투과성 NQO1 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태 등으로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제 (예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제 (예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제 (예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제 (예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제 (예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 천식에 적용하는 경우에는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 널리 알려진 바와 같이 흡입 방식이나 스프레이 방식의 제제로 제형화할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 NQO1 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뇌허혈 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 NQO1 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 NQO1 단백질 분자의 세포 내 전달은 Tat 펩타이드를 비롯한 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 PEP-1 펩타이드, Tat 펩타이드, 올리고라이신 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 Tat 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Tat의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로 Tat 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인 및 단백질 수송 도메인으로 알려진 펩타이드를 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.
구체적으로, 본 발명은 NQO1 융합단백질, 이 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료, 예방 목적의 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"NQO1 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 NQO1 단백질을 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질 (즉, 본 발명에서는 NQO1 단백질을 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Tat-NQO1", "Tat-NQO1 융합단백질" 등과 혼용하였다.
"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 NQO1 단백질을 의미한다.
"융합단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.
본 발명에서의 "단백질 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.
또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 발명의 NQO1 융합단백질은 단백질 수송도메인이 NQO1의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 NQO1 융합단백질을 말한다. 또한, 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, PEP-1 펩타이드, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고 (라이신,아르기닌) 중의 1종 이상을 말한다.
또한, 본 발명의 상기 NQO1 융합단백질 아미노산 서열은 서열번호 4를 포함한다. NQO1 융합단백질 제조에서 제한부위 서열의 선택 등에 따라 다양한 서열의 융합단백질을 얻을 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 보통의 지식을 가진 사람에게 자명하다. 위 아미노산 서열은 예시적인 것일 뿐 NQO1 융합단백질 아미노산 서열이 위의 서열로 한정되는 것이 아님은 자명하다.
또한, 본 발명은 상기 NQO1 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 뇌허혈의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 NQO1 융합단백질을 유효성분으로 하며, 뇌허혈의 예방 및 개선 효과가 있는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 단백질 수송 도메인이 NQO1 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성 (cell-transducing) NQO1 융합단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.
예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
본 발명에서 세포 내로 투과된 NQO1 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰다. 또한, 본 발명의 NQO1 융합단백질은 세포 내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰다. 또한, 동물모델에서 전뇌 해마 CA1 부분에 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸에 대해 본 발명의 NQO1 융합단백질이 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과들로부터 본 발명의 세포 투과성 NQO1 융합단백질이 뇌허혈 예방 및 치료용 약학 조성물로 이용 가능함을 알 수 있다.
도 1은 Tat-NQO1 융합단백질의 제작 및 발현과 정제를 나타낸다(a). Tat-NQO1 융합단백질을 12% SDS-PAGE를 이용하여 정제하고, 항토끼 항히스티딘 폴리클론 항체를 이용한 웨스턴블랏 분석을 수행하였다(b). HT22 세포 내로 Tat-NQO1 융합단백질의 형질도입을 나타내는 사진이다. 세포는 60mm 배양접시에서 배양하였다. 세포 투과가 농도 의존적지를 확인하기 위하여 2시간 동안 Tat-NQO1 융합단백질(0.5~2μM)과 대조군 NQO1 단백질을 처리하였고(c), 세포 투과가 시간 의존적인지를 확인하기 위하여 10~120분 동안 Tat-NQO1 융합단백질(2μM)과 대조군 NQO1 단백질을 처리하였다(d). 2μM Tat-NQO1 융합단백질로 2시간 동안 처리하여 세포 내에서 안정성을 확인하고 웨스턴블랏 분석을 시행하였다(e). Tat-NQO1 융합단백질의 세포 내 분포는 공초점 형광현미경으로 관찰하였다(f). 크기 막대=20mm.
도 2는 과산화수소로 유도된 세포의 생존율, DCF-DA 및 DNA 단편화에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 보호효과 및 세포사멸 억제효능을 나타낸다. 세포에 Tat-NQO1 융합단백질(2μM)을 2시간 동안 처리한 후 과산화수소(1mM)를 12시간 처리하고 MTT 분석을 시행하였다(a). **P<0.01 과산화수소로 처리된 세포와 비교한 값. 세포에 Tat-NQO1 융합단백질(2μM)을 2시간 동안 처리한 후, 과산화수소 1mM을 5분 동안 처리하여 과산화수소에 의해 유도되는 활성산소종 생산에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 효과를 확인하였다. 세포 내 활성산소종 수준은 8-OHdG로 염색한 후 측정하였다(b). 크기 막대=25mm. *P<0.01 과산화수소로 처리한 세포와 비교한 값. 세포를 2시간 동안 Tat-NQO1 융합단백질(2μM)로 처리한 후 과산화수로(1mM) 4시간 동안 처리하였다. DNA 단편화는 TUNEL 염색으로 측정하였다(c). 크기 막대=50mm.
도 3은 산화 스트레스로 유도된 pAkt/Akt(ser-473)에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 효과. HT22 세포에 Tat-NQO1 융합단백질(0.5~2μM)과 NQO1 단백질을 처리한 후 과산화수소(1mM)를 10분 동안 처리하였다. (pAkt/Akt) 각각. 과산화수소로 유도된 pAkt/Akt(A)의 발현 수준을 웨스턴블랏 분석으로 알아보고, 밴드 강도는 밀도계로 측정하였다. 세포를 30분 동안 과산화수소(1mM)로 자극하였다. 1시간 동안 Tat-NQO1 융합단백질(0.5~2μM)로 전처리하였다. 이어서, 세포를 준비하고, P38, ERK, JNK의 인산화를 웨스턴블랏 분석과 밀도계로 측정하였다(b). 세포에 2시간 동안 Tat-NQO1 단백질(0.5~2μM)로 전처리하고, 12시간 동안 과산화수소(1mM)를 처리하였다. 이어서, 세포를 준비하고 절단된 케스페이즈 3, 케스페이즈 3 수준을 웨스턴블랏 분석하고, 밴드 강도는 밀도계로 측정하였다(c). *P<0.01 과산화수소 처리한 세포와 비교하였다.
도 4는 허혈 동물모델에서 CA1 영역 뉴런의 생존에 미치는 Tat-NQO1 융합단백질의 효과에 관한 것이다. 히스티딘 항체를 이용하여 면역조직화학 분석을 시행한 결과, Tat-NQO1 융합단백질은 뇌 혈관 장벽(Blood Brain Barrier)을 통과하였다. 샴군, 담체처리군, Tat 펩타이드 처리군, NQO1 단백질 처리군 및 Tat-NQO1 융합단백질 처리군에 대해 7일 후에 마취를 수행하고 뇌 조직을 적출했다. SP, stratum pyramidale; SO, stratum oriens; SR, stratum radiatum. 각각의 면역 반응성 뉴런의 수의 상대적 분석 값은 담체 투여군과 현저하게 다르다(a). *P<0.01, 담체 투여군과 비교하였다. 크기 막대=50㎛. Tat-NQO1 융합단백질의 신경보호 효과는 면역조직화학 염색으로 분석하였다. 면역조직화학은 CA1 영역에서 CV, GFAP, Iba-1 및 FJB에서 샴군, 담체처리군, Tat-NQO1 융합단백질 처리군, NQO1 단백질 처리군 및 Tat 펩타이드 처리군을 7일 후에 마취를 수행하고, 뇌 조직을 적출했다. SP, stratum pyramidale; SO, stratum oriens; SR, stratum radiatum. 각각의 면역 반응성 뉴런의 수의 상대적 분석 값은 담체 투여군과 현저하게 다르다(b). *P<0.01 담체 투여군과 비교한 값. 크기 막대=50㎛.
도 2는 과산화수소로 유도된 세포의 생존율, DCF-DA 및 DNA 단편화에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 보호효과 및 세포사멸 억제효능을 나타낸다. 세포에 Tat-NQO1 융합단백질(2μM)을 2시간 동안 처리한 후 과산화수소(1mM)를 12시간 처리하고 MTT 분석을 시행하였다(a). **P<0.01 과산화수소로 처리된 세포와 비교한 값. 세포에 Tat-NQO1 융합단백질(2μM)을 2시간 동안 처리한 후, 과산화수소 1mM을 5분 동안 처리하여 과산화수소에 의해 유도되는 활성산소종 생산에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 효과를 확인하였다. 세포 내 활성산소종 수준은 8-OHdG로 염색한 후 측정하였다(b). 크기 막대=25mm. *P<0.01 과산화수소로 처리한 세포와 비교한 값. 세포를 2시간 동안 Tat-NQO1 융합단백질(2μM)로 처리한 후 과산화수로(1mM) 4시간 동안 처리하였다. DNA 단편화는 TUNEL 염색으로 측정하였다(c). 크기 막대=50mm.
도 3은 산화 스트레스로 유도된 pAkt/Akt(ser-473)에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 효과. HT22 세포에 Tat-NQO1 융합단백질(0.5~2μM)과 NQO1 단백질을 처리한 후 과산화수소(1mM)를 10분 동안 처리하였다. (pAkt/Akt) 각각. 과산화수소로 유도된 pAkt/Akt(A)의 발현 수준을 웨스턴블랏 분석으로 알아보고, 밴드 강도는 밀도계로 측정하였다. 세포를 30분 동안 과산화수소(1mM)로 자극하였다. 1시간 동안 Tat-NQO1 융합단백질(0.5~2μM)로 전처리하였다. 이어서, 세포를 준비하고, P38, ERK, JNK의 인산화를 웨스턴블랏 분석과 밀도계로 측정하였다(b). 세포에 2시간 동안 Tat-NQO1 단백질(0.5~2μM)로 전처리하고, 12시간 동안 과산화수소(1mM)를 처리하였다. 이어서, 세포를 준비하고 절단된 케스페이즈 3, 케스페이즈 3 수준을 웨스턴블랏 분석하고, 밴드 강도는 밀도계로 측정하였다(c). *P<0.01 과산화수소 처리한 세포와 비교하였다.
도 4는 허혈 동물모델에서 CA1 영역 뉴런의 생존에 미치는 Tat-NQO1 융합단백질의 효과에 관한 것이다. 히스티딘 항체를 이용하여 면역조직화학 분석을 시행한 결과, Tat-NQO1 융합단백질은 뇌 혈관 장벽(Blood Brain Barrier)을 통과하였다. 샴군, 담체처리군, Tat 펩타이드 처리군, NQO1 단백질 처리군 및 Tat-NQO1 융합단백질 처리군에 대해 7일 후에 마취를 수행하고 뇌 조직을 적출했다. SP, stratum pyramidale; SO, stratum oriens; SR, stratum radiatum. 각각의 면역 반응성 뉴런의 수의 상대적 분석 값은 담체 투여군과 현저하게 다르다(a). *P<0.01, 담체 투여군과 비교하였다. 크기 막대=50㎛. Tat-NQO1 융합단백질의 신경보호 효과는 면역조직화학 염색으로 분석하였다. 면역조직화학은 CA1 영역에서 CV, GFAP, Iba-1 및 FJB에서 샴군, 담체처리군, Tat-NQO1 융합단백질 처리군, NQO1 단백질 처리군 및 Tat 펩타이드 처리군을 7일 후에 마취를 수행하고, 뇌 조직을 적출했다. SP, stratum pyramidale; SO, stratum oriens; SR, stratum radiatum. 각각의 면역 반응성 뉴런의 수의 상대적 분석 값은 담체 투여군과 현저하게 다르다(b). *P<0.01 담체 투여군과 비교한 값. 크기 막대=50㎛.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
재료
HT22 세포는 쥐의 해마신경 세포로서 한국세포주연구재단(KCLF)에서 제공받았다. 세포는 10% FBS와 항생제 (100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 겐타마이신 황산염)를 첨가한 DMEM을 사용하여 배양하였다. 그리고, HT22 세포는 37℃, 95% 공기 및 5% 이산화탄소의 조건을 유지해주며 조직배양용 항온장치에서 배양하였다. 플라스미드 pET-15b 백터와 대장균 균주 BL21 (DE3)은 Novagen에서 구입하였다. 그리고 FBS와 항생제는 Gibco BRL에서, Ni2 +-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우는 Qiagen에서 구매하였다. Tat-펩타이드 합성은 PEPTRON (Deajeon, Korea)에서 주문 제작하였다. 이외의 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.
실험방법
Tat
-
NQO1
융합단백질의
발현과 정제
NQO1 단백질 및 Tat-NQO1 융합단백질 발현 벡터를 구축하였다. 인간 유전자 중 하나인 NQO1을 cDNA와 함께 2개의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)으로 증폭시켰다. 센스 프라이머는 5'-CTCGAGGGCAACGCGCAG-3'으로 구성되어 있고, XhoI이라는 제한효소 작용부위가 5' 쪽에 존재한다. 그리고 안티센스 프라이머는 5'-GGATCCTCAGGAATCTTCGGACTC-3'으로 구성되어 있고, BamHI이라는 제한효소 작용부위가 5' 쪽에 존재한다. PCR을 통하여 얻은 결과물을 TA 벡터에 연결하고 XhoI과 BamHI을 이용하여 자른 후에 발현 벡터에 연결하여 Tat-NQO1 융합단백질을 제조하였다. 이와 마찬가지로 대조군인 NQO1은 Tat 펩타이드가 결여된 벡터를 이용하여 제조하였다. 재조합된 Tat-NQO1 플라스미드를 대장균인 BL21로 형질변환시킨 후 0.1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)로 유도하여 20℃에서 20시간 배양하였다. 배양한 세포를 초음파로 분쇄하여 Tat-NQO1 융합단백질을 얻기 위해 Ni2 +-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 컬럼과 PD-10 컬럼 크로마토그래피(Amersham, Brauncschweig,Germany)를 이용하여 정제하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 우혈청 알부민을 표준물질로 이용하여 결정하였다.
Tat
-NQO1
융합단백질의
HT22 세포 내로의 투과성
Tat-NQO1 융합단백질의 농도 의존적 세포 내 투과를 관찰하기 위해 2시간 동안 0.5~2μM 농도로 처리하였으며, 시간 의존적 세포 내 투과를 관찰하기 위해 2μM 농도로 30, 60, 90 및 120분으로 단백질을 처리하였다. 그 후에 트립신-EDTA를 처리하고 PBS를 이용하여 세척 한 다음 세포 내로 투과된 융합단백질의 양과 활성을 웨스턴블랏으로 분석하였다.
웨스턴블랏
분석
단백질은 12% SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였다. 이전 단계에서 단백질은 나이트로셀룰로오스 막으로 전기이동시키고, 토끼 항히스티딘 폴리클론 항체(1:5000; Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 확인하였다. 결합한 항체는 강화된 화학형광으로 시각화하였다 (Amersham, Franklin Lakes, NJ, USA).
형광현미경 분석
커버슬립 상에서 HT-22 세포를 배양하고 2μM Tat-NQO1 융합단백질을 처리하였다. 그 후에 37℃로 1시간 동안 배양하고 PBS를 이용하여 2번 정도 씻어주고, 4% 파라포름알데하이드를 5분간 상온에서 처리하여 세포를 고정하였다. 그 다음 3% 우혈청 알부민, 0.1% Triton X-100 함유 PBS(PBS-BT)로 상온에서 30분간 블로킹한 다음 PBS-BT로 세척하였다. 일차 항체(His-probe, Sadnta Cruz Biotechnology)는 1:2000로 희석하여 상온에서 두 시간 처리하였다. 이차 항체(Alexa fluor 488, Invitogen)는 1:15000로 희석하여 빛이 차단된 환경에서 한 시간 동안 처리하였다. 또한 핵을 염색하기 위해 2분 동안 1㎍/㎖ DAPI (Roche)를 사용하였다. 후에 형광현미경(Nikon eclipse 80i,Japan)을 이용하여 형광분석을 하였다.
세포 생존율 분석
과산화수소로 처리한 HT22 세포 및 C6 세포의 생존율을 MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheyltetrazolium bromide}를 이용하여 비색분석법으로 확인하였다. 세포를 1 mM의 과산화수소에 2시간 동안 노출하여 세포사멸을 유도하였다. ELISA 마이크로플레이트 판독기 (Labsystems Multiskan MCC/340)로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 무처리 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
세포 내 활성산소종 수준 측정
활성산소종에 민감한 안료인 DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescein diacetate)를 이용하여 HT22 세포에 Tat-NQO1 융합단백질을 처리하였을 때와 처리하지 않았을 때를 비교하여 세포 내의 활성산소종 수준을 측정해보았다. Tat-NQO1를 2시간 동안 전처리한 다음 과산화수소 1mM을 4시간 동안 처리하였다. 그리고 PBS로 씻어 준 다음 DCF-DA를 20μM의 농도로 30분간 처리해 주었다. DCF 형광의 수준은 여기파장 485㎚, 방출파장 538㎚로 조절된 플루오로스캔(fluoroskan) ELISA 플레이트 판독기(LabsystemsOy, Helsinki, Finland)를 이용하여 형광현미경으로 측정하였다.
TUNEL 분석
HT22 세포에 Tat-NQO1 융합단백질을 처리하였을 때와 처리하지 않았을 때를 비교하여 세포사멸에 대한 보호효과를 확인하였다.
전처리하지 않은 군과 0.5~2μM의 농도로 1시간 동안 Tat-NQO1 융합단백질을 처리한 시험군에 과산화수소(1mM)를 12시간 동안 처리하였다.
세포 세포사멸을 측정하기 위해 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated biotinylated dUTP nick end labeling) 염색을 실시하였다. 영상은 형광현미경 (Nikon eclipse 80i, Japan)으로 촬영하였다.
실험동물
한림대학교 실험동물센터에서 제공되는 저빌쥐 (Mongolian gerbils; Meriones unguiculatus)를 사용하였다. 동물은 23℃, 60% 습도 조건에서 12시간 밝게/12시간 어둡게 하여 사육하였고, 사료와 물은 자유롭게 접근할 수 있도록 공급하였다. 실험동물 취급 및 관리는 실험동물 취급 및 관리는 최근의 국제법과 정책에 따라 수행하였고 [NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publication No. 85-23, 1985, revised 1996], 한림대 병원 연구동물 관리 및 사용에 관한 위원회에서 승인받았다. 모든 실험에서는 이용되는 동물 수와 본 발명에서 사용되는 공정에 의한 고통을 최소화하기 위해 노력하였다.
동물 실험에서의 전뇌 허혈 유도
전뇌 허혈을 유도하였다. 온목동맥을 신경 섬유들로부터 격리시켜 폐색하고, 외상이 크게 남지 않게 하기 위해 동맥류 클립(aneurysm clips)을 이용하였다. 혈류를 폐색시켰을 때, 검안경(ophthalmoscope)을 이용하여 혈압을 주의 깊게 관찰하였다. 그 후 5분 동안 폐색하고 동맥류 클립을 제거하였다. 그리고 폐색에 대해 혈압이 회복되는 것을 검안경으로 확인하였다. 또한 샴 수술로 정상 경동맥을 폐색하지 않고, 외과적인 절차를 제외하고 얼마나 영향을 받는지 확인해 보았다. 허혈성 손상에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 보호효과를 실험하기 위해, 7일 후 허혈 재관류(ischemia-reperfusion)하고 샴 수술군, 담체 처리군, Tat-NQO1 융합단백질 처리군, NQO1 단백질 처리군 및 Tat 펩타이드 처리군으로 5개 그룹(각 N=10)으로 나누어 허혈-재관류 후 복강 내에 30분 동안 투여하여 실험을 수행했다.
면역조직 화학
샴 수술군, 담체 처리군, Tat-NQO1 융합단백질 처리군, NQO1 단백질 처리군 및 Tat 펩타이드 처리군에 대하여 7일 후에 마취를 수행하고, 뇌 조직을 적출했다. 조직 절편은 젤라틴 코팅된 현미경 슬라이드에 올려놓았다. 크레실 바이올렛 아세트산 (Sigma, St. Louis, MO, USA)은 증류수에 1.0% (w/v)가 되도록 용해하여 이 용액에 차가운 아세트산을 가하였다. 실온에서 2분간 염색한 후 절편은 증류수로 두 번 세척하고 50, 70, 80, 90, 95 및 100% 에탄올로 두 시간 동안 처리하고 실온에 두어 최종적으로 카나다 발삼 (Kato, Japan)으로 올려놓았다.
허혈 손상에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 보호 효과를 확인하기 위하여 신경퇴화의 마커인 F-JB (Fluoro-Jade B)로 절편들을 염색하였고, 조직형광을 평가하였다. 또한, 절편을 NaOH가 1% 되도록 80% 알코올과 혼합한 용액에 담그고 70% 알코올 용액에 담갔다. 그 후 0.06% 과망간산칼륨에 옮기고 0.0004% FJB (fluoro-Jade Bh; histochem, Jefferson, AR, USA)의 염색용액을 스며들게 하였다. 그리고 절편을 씻어서 따뜻한 슬라이드 위에 올려놓고 형광(epifluorescent) 현미경 (Carl Zeiss, Germany)으로 확인하였다.
융합단백질을 처리한 후 신경보호효과 및 반응성 신경교증을 확인하기 위하여 Iba-1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1)에 대한 면역조직화학을 수행하였다. 절편들은 희석된 마우스 항-NeuN (anti-neuronal nuclei, 1:1,000, Chemicon International, Temecula, CA), 토끼 항-GFAP (rabbit anti-glial fibrillary acidic protein, 1:1,000, Chemicon International) 및 토끼 항-Iba-1 (rabbit anti-ionized calcium-binding adapter molecule 1, 1:500, Wako, Osaka, Japan)으로 48시간 동안 4 ℃로 배양하였다. 그런 다음, 이들은 바이오틴 결합된 염소 항-토끼 IgG 또는 염소 항-마우스 IgG, 스트렙타비딘 퍼옥시데이즈 복합체 (1:200 희석한 것, Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 노출된 후 0.1 M Tris-HCl 완충액 내의 3,3'-다이아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드로 시각화되었다. NeuN(neuronal nuclei) 염색도 수행하였다.
결과 1: Tat-NQO1 융합단백질의 제조 및 정제
Tat-NQO1 융합단백질을 제조하기 위해 단백질 수송 도메인의 일종인 HIV Tat이 포함된 Tat-벡터와 NQO1 유전자를 재조합하여(도 1a), 대장균에서 과대발현시켜 Ni2 +-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 컬럼 크로마토그래피와 PD-10 크로마토그래피를 이용하여 정제하였고, SDS-PAGE와 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다(도 1b).
Tat-NQO1 융합단백질이 세포 내로 잘 침투되는지를 확인하기 위하여 단백질을 세포 내로 농도 및 시간 의존적으로 침투시켜 확인하였다. 그 결과, 시간 및 농도 의존적으로 세포 내 투과가 효과적으로 일어났으며, 대조군과 NQO1 단백질은 투과가 일어나지 않았다(도 1c, 도 1d). DAPI로 세포핵을 염색하고, Tat-NQO1 융합단백질을 녹색 형광으로 염색하여 효과적으로 세포 내로 투과되는 것을 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다(도 1f). 그리고, 투과된 융합단백질들이 세포 내에 60시간 동안 안정하게 유지되는 것을 알 수 있었다(도 1e).
결과 2:
HT22
세포에서
Tat
-
NQO1
융합단백질의
세포사멸 억제효과
세포에 Tat-NQO1 융합단백질을 농도별로 전처리한 다음 과산화수소로 산화 스트레스를 주었다. 세포 생존능력을 확인하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. HT22 세포에 1mM 과산화수소를 단일 처리하였을 경우 생존한 세포 수가 56%로 감소하였으나, Tat-NQO1 융합단백질을 처리하였을 경우 농도 의존적으로 세포생존 능력이 증가하였다(도 2a).
또한, Tat-NQO1 융합단백질이 과산화수소에 의해 유도되는 세포 내 활성산소종 생성을 억제하는지를 조사하였다. 활성산소종의 생성을 평가하기 위해, 8-OHdG(8-hydroxydeoxyguanosine) 형광염색을 사용하여 세포 내 산화 정도를 확인하였다. HT22 세포가 10분 동안 1mM의 과산화수소에 노출되었을 때, 과산화수소에 의해 현저하게 8-OHdG 신호가 증가하였다. 그러나, 과산화수소에 의해 유도된 활성산소종은 Tat-NQO1 융합단백질에 의해 감소하였다(도 2b).
과산화수소로 인해 생겨난 활성산소종이 DNA 단편화를 일으키게 되는데, TdT(terminal deoxynucleotidyl transferas)라는 효소를 이용해 UTP(Uridine triphosphate)를 DNA 조각 말단에 붙여 DNA 단편화가 일어났는지 여부를 확인해 보았다.
과산화수소만 처리한 군에서는 푸른색으로 염색된 강도가 매우 강함을 확인할 수 있었는데, 이는 과산화수소에 의해 생겨난 활성산소종이 DNA 단편화를 일으킨 것을 의미한다.
Tat-NQO1 융합단백질을 처리한 군에서는 그 정도가 매우 감소하였고, NQO1 단백질을 처리한 군에서는 그 보호효과를 확인할 수 없었다. 이런 결과를 통해 Tat-NQO1 융합단백질이 HT22 세포에서 DNA 단편화를 막아주는 역할을 하는 것을 알 수 있었다(도 2c).
결과 3: 과산화수소로 유도된 세포 내 활성산소종에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 보호 효과
Akt는 세포 생존에 중요한 역할을 하고 세포사멸을 방지한다. 산화 스트레스로 유도되어 인산화된 Akt의 활성은 세포사멸 및 신경 세포사멸을 일으킨다. 따라서, 과산화수소로 유도되는 pAkt의 인산화에 미치는 Tat-NQO1 융합단백질의 효과를 조사하였다. pAkt(s473) 인산화는 NQO1 단백질 처리군에서는 변화가 없었으나, Tat-NOQ1 융합단백질을 처리한 세포에서는 pAkt 인산화가 감소하였다(도 3a). 이로부터 과산화수소로 유도된 HT22 세포에서 산화 스트레스에 의한 세포사멸에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 항산화 방어 효과를 알 수 있다. 세포 생존 신호는 과산화수소와 같은 외부 스트레스와 성장 요인에 의해 활성화된다. 산화 스트레스로 유도되는 손상은 MAPKs 신호를 증가시킨다. 활성산소에 의한 MAPKs 활성화에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 효과를 조사하였다. 웨스턴블랏 분석 결과 과산화수소를 전처리하여 자극된 세포에 Tat-NQO1 융합단백질을 투여하였을 때 p38의 활성화가 농도의존적으로 감소함을 확인하였다. 또한, Tat-NQO1 융합단백질은 산화스트레스에 반응하여 MAPK / JNK와 ERK에 대하여 억제 효과를 나타내었다(도 3b). 그러나, NQO1 단백질은 P38, JNK 및 ERK의 활성화 수준에 영향을 미치지 않았다.
과산화수소 처리 세포에서 케스페이즈-3(caspase-3) 발현 수준이 증가하였음을 관찰하였고, 반면 Tat-NQO1 융합단백질이 처리된 세포에서는 케스페이즈-3(caspase-3) 발현 수준이 감소하였다(도 3c). 따라서, 이러한 결과는 Tat- NQO1 융합단백질이 MAPKs 활성화와 케스페이즈-3(caspase-3)의 규제를 통해 과산화수소 자극에 의한 세포사멸을 억제하는 효과가 있음을 나타낸다.
결과 4:
뇌허혈
유도 동물 모델에서
Tat
-
NQO1
융합단백질의
침투확인 및 허혈성 손상으로부터의 보호 효능
Tat-NQO1 융합단백질의 신경세포 보호 효능을 확인하기 위하여 면역조직염색을 수행하였다. Tat-NQO1 융합단백질을 복강 주사하지 않은 실험군에서는 저빌쥐의 CA1 영역에서 신경세포 사멸이 진행되어 NeuN(neuronal nuclei) 항체로 염색된 세포 수가 현저히 감소한 반면, Tat-NQO1 융합단백질을 전처리한 실험군은 CA1 영역의 신경세포 사멸이 억제된 것을 NeuN 항체 염색을 통해 확인하였다. 또한 항히스티딘 항체로 Tat-NQO1 융합단백질의 조직 내 침투를 확인하였으며, DAPI로 핵을 염색하여 확인하였다(도 4a).
허혈성 손상에 대한 Tat-NQO1 융합단백질의 보호효능을 알아보기 위해 저빌쥐를 이용하여, 연속적으로 대뇌혈류(cerebral blood flow)를 감소시켜 뇌의 저산소증과 허혈을 유도함으로써 많은 양의 독성 활성산소종을 형성시켜 급성 뇌허혈 손상을 통해 신경세포 사멸을 유도하는 외과적 수술법으로 동물모델을 제작하였다. 침투한 Tat-NQO1 융합단백질이 뇌허혈에 대해 보호 효과가 있는지 살아있는 세포만을 염색하는 CV(Cresyl Violet) 염색과 손상 받은 뇌세포를 형광으로 염색하는 F-JB(Fluoro-Jade B)를 이용한 조직형광기법(histofluorescent) 염색으로 확인했다. 뇌허혈 유도 동물 모델에서 Tat-NQO1 융합단백질을 처리한 동물에서는 세포사멸에 대한 보호효과가 나타났으며, 반면, NQO1 단백질을 처리한 동물에서는 세포사멸에 대한 보호효과가 전혀 나타나지 않았다. 또한 Iba-1(ionized calcium-binding adaptor molecule 1)은 새로운 Ca++ 결합 단백질(calcium-binding protein)이고, 특이하게 뇌의 활성화된 미세아교 세포에서만 발현된다. 따라서 Iba-1은 미세아교세포 마커로 이용되며, 신경세포 사멸로 인한 미세아교세포의 활성화를 확인할 수 있다. 그리고 중간 섬유를 이루는 구성요소이면서 성상세포의 표지자인 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)도 이용하였다. GFAP는 특히 신경세포에 손상을 받게 되면 성상세표가 손상 받은 부위를 보충하기 위해 활성화가 될 때 발현되는 단백질로 뇌손상시 활성화 되어 응집하는 성상세포를 관찰할 수 있다. 뇌허혈 모델에서 Tat-NQO1 융합단백질의 미세아교 세포와 성상세포의 활성과 응집에 대해 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 뇌허혈이 유도된 경우 염색된 미세아교와 성상세포의 활성이 증가하고 서로 응집된 것을 확인 하였으며, 반면 Tat-NQO1 융합단백질을 처리한 경우 활성화 및 응집 모두 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(도 4b).
따라서, Tat-NQO1 융합단백질이 산화스트레스로 인한 뇌허혈 등의 신경퇴행성 질환 및 다양한 질환에 대하여 치료제로서 효과적으로 응용될 수 있다는 가능성이 있음을 제시한다.
<110> Industry Academic Cooporation Foundation, Hallym University
<120> Pharmaceutical composition for treating ischemia containing
cell-transducible NQO1 fusion protein
<130> HallymU-SYCHOI-NQO1-ischemia
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
ctcgagggca acgcgcag 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
ggatcctcag gaatcttcgg actc 24
<210> 3
<211> 906
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide coding Tat-NQO1 fusion protein
<400> 3
catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccatag gaagaagcgg 60
agacagcgac gaagactcga gatggtcggc agaagagcac tgatcgtact ggctcactca 120
gagaggacgt ccttcaacta tgccatgaag gaggctgctg cagcggcttt gaagaagaaa 180
ggatgggagg tggtggagtc ggacctctat gccatgaact tcaatcccat catttccaga 240
aaggacatca caggtaaact gaaggaccct gcgaactttc agtatcctgc cgagtctgtt 300
ctggcttata aagaaggcca tctgagccca gatattgtgg ctgaacaaaa gaagctggaa 360
gccgcagacc ttgtgatatt ccagttcccc ctgcagtggt ttggagtccc tgccattctg 420
aaaggctggt ttgagcgagt gttcatagga gagtttgctt acacttacgc tgccatgtat 480
gacaaaggac ccttccggag taagaaggca gtgctttcca tcaccactgg tggcagtggc 540
tccatgtact ctctgcaagg gatccacggg gacatgaatg tcattctctg gccaattcag 600
agtggcattc tgcatttctg tggcttccaa gtcttagaac ctcaactgac atatagcatt 660
gggcacactc cagcagacgc ccgaattcaa atcctggaag gatggaagaa acgcctggag 720
aatatttggg atgagacacc actgtatttt gctccaagca gcctctttga cctaaacttc 780
caggcaggat tcttaatgaa aaaagaggta caggatgagg agaaaaacaa gaaatttggc 840
ctttctgtgg gccatcactt gggcaagtcc atcccaactg acaaccagat caaagctaga 900
aaatga 906
<210> 4
<211> 285
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tat-NQO1 fusion protein
<400> 4
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Val Gly Arg Arg
1 5 10 15
Ala Leu Ile Val Leu Ala His Ser Glu Arg Thr Ser Phe Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Lys Glu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Lys Lys Gly Trp Glu Val
35 40 45
Val Glu Ser Asp Leu Tyr Ala Met Asn Phe Asn Pro Ile Ile Ser Arg
50 55 60
Lys Asp Ile Thr Gly Lys Leu Lys Asp Pro Ala Asn Phe Gln Tyr Pro
65 70 75 80
Ala Glu Ser Val Leu Ala Tyr Lys Glu Gly His Leu Ser Pro Asp Ile
85 90 95
Val Ala Glu Gln Lys Lys Leu Glu Ala Ala Asp Leu Val Ile Phe Gln
100 105 110
Phe Pro Leu Gln Trp Phe Gly Val Pro Ala Ile Leu Lys Gly Trp Phe
115 120 125
Glu Arg Val Phe Ile Gly Glu Phe Ala Tyr Thr Tyr Ala Ala Met Tyr
130 135 140
Asp Lys Gly Pro Phe Arg Ser Lys Lys Ala Val Leu Ser Ile Thr Thr
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ser Met Tyr Ser Leu Gln Gly Ile His Gly Asp Met
165 170 175
Asn Val Ile Leu Trp Pro Ile Gln Ser Gly Ile Leu His Phe Cys Gly
180 185 190
Phe Gln Val Leu Glu Pro Gln Leu Thr Tyr Ser Ile Gly His Thr Pro
195 200 205
Ala Asp Ala Arg Ile Gln Ile Leu Glu Gly Trp Lys Lys Arg Leu Glu
210 215 220
Asn Ile Trp Asp Glu Thr Pro Leu Tyr Phe Ala Pro Ser Ser Leu Phe
225 230 235 240
Asp Leu Asn Phe Gln Ala Gly Phe Leu Met Lys Lys Glu Val Gln Asp
245 250 255
Glu Glu Lys Asn Lys Lys Phe Gly Leu Ser Val Gly His His Leu Gly
260 265 270
Lys Ser Ile Pro Thr Asp Asn Gln Ile Lys Ala Arg Lys
275 280 285
Claims (2)
- NQO1 (NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1)의 N-말단에 Tat 펩타이드가 공유결합된 NQO1 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 NQO1 융합단백질은 서열번호 4임을 특징으로 하는 NQO1 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150089570A KR101677449B1 (ko) | 2015-06-24 | 2015-06-24 | 세포투과성 ｎｑｏ１ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150089570A KR101677449B1 (ko) | 2015-06-24 | 2015-06-24 | 세포투과성 ｎｑｏ１ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101677449B1 true KR101677449B1 (ko) | 2016-11-21 |
Family
ID=57537999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150089570A KR101677449B1 (ko) | 2015-06-24 | 2015-06-24 | 세포투과성 ｎｑｏ１ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101677449B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110250300A1 (en) * | 2005-07-01 | 2011-10-13 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for the treatment or prevention of disorders relating to oxidative stress |
-
2015
- 2015-06-24 KR KR1020150089570A patent/KR101677449B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110250300A1 (en) * | 2005-07-01 | 2011-10-13 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for the treatment or prevention of disorders relating to oxidative stress |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J Exp Stroke Transl Med (2009) 2(1): 22-40 * |
| 보건의료 기술 진흥 사업, '심장기능에 대한 NQO1의 역할 연구' 중앙대학교 산학협력단, 보건복지부 (2012.) * |
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