KR20150122280A - 세포투과성 ｎｏｌ３ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 - Google Patents
세포투과성 ｎｏｌ３ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명자들은 NOL3 융합단백질이 인비트로에서 산화 스트레스로 유도된 신경세포사멸에 대한 세포 보호효과와 인비보에서 뇌허혈 동물모델 보호효과가 있음을 밝혔다. NOL3 융합단백질은 신경세포 내로 농도 및 시간 의존적으로 효과적으로 투과하였다. 세포 내로 투과된 NOL3 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰고, 세포내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰다. 동물모델에서는 전뇌 해마 CA1 부분에 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸에 대해 NOL3 융합단백질이 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 NOL3 융합단백질이 세포사멸에 대해 보호효과가 있으며, 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 치료효과가 있음을 말해준다.
Description
본 발명은 세포투과성 NOL3 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 세포 내로 투과된 NOL3 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰고, 세포내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰다. 동물모델에서는 전뇌 해마 CA1 부분에 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸에 대해 NOL3 융합단백질이 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 NOL3 융합단백질이 세포사멸에 대해 보호효과가 있으며, 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 치료효과가 있음을 말해준다.
활성산소화합물이라고 불리는 "자유 라디칼(free radicals)"은 산화적 스트레스에 그 원인이 있으며, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 산소와의 상호작용을 포함하는 다양한 세포과정에서 피할 수 없는 부산물이다. 만약 세포가 상대적으로 보다 활성화된 화합물에 노출된다면 이들은 산화적 스트레스에 놓이게 되고 그 결과 단백질, DNA, 지방과 같은 중요한 요소들이 산화되어 손상을 입게 된다. 산화적 스트레스(Oxidative stress)는 암, 알츠하이머 등과 같은 많은 병의 원인이 되고 있으며 이러한 질환들은 노화와도 관련이 있다.
NOL3(Nucleolar Protein 3)는 주로 뇌의 신경세포뿐 아니라 심장과 골격 근육에서 높게 발현되고, 태반, 간, 신장 및 췌장에서는 낮은 수준으로 발현되며, 세포질과 핵질에 집중해서 존재한다. 신경세포에서 산화스트레스가 일어나면 그로 인해 세포사멸과 관련한 신호전달체계가 활성화되는데 세포예정사에는 세포사멸 수용체에 의해 유도되는 신호전달 경로, 미토콘드리아를 통한 경로, 소포체(endoplasmic reticulum, ER) 스트레스에 의해 유도되는 경로 등 주요 3가지 경로가 있다. 그중 미토콘드리아 경로는 세포 내부의 스트레스들에 의해서 유도되며, Bax와 Bak의 구조적 변화로 인하여 미토콘드리아 막의 내구성이 약화되어 시토크롬 c와 세포예정사 유도 단백질들이 분비되면서 세포사멸이 일어난다.
활성산소에 의한 세포손상이 일어나게 되면 미토콘드리아에서 시토크롬 C가 방출되면서 케스페이즈가 활성화되는데 이때 NOL3 단백질은 케스페이즈 2, 8 및 종양에 관여하는 단백질로 잘 알려진 p53등의 효소활성을 하향 조절시킴으로써 세포사멸을 억제하는 세포사멸 억제 단백질(anti-apoptotic protein)로 잘 알려져 있다.
비정상적인 세포 과정에서 발생하는 과도한 활성산소종(ROS)은 염증, 허혈, 당뇨 및 파킨슨병(PD) 등 다양한 인간의 질병을 초래하는 것으로 알려져 있다. 활성산소종은 세포의 대사과정 중 세포 안의 DNA 뿐만 아니라 단백질, 지질과 같은 고분자들에 손상을 입히는 등 많은 영향을 미치게 되며 손상 시간이 점점 길어질수록 세포사멸을 일으켜 인간 질병에 많은 영향을 끼치게 된다. 그중에서도 뇌허혈은 뇌의 동맥이 차단될 때 뇌세포가 충분한 에너지를 만들지 못하고 그로 인해 세포사멸이 발생하는 질환으로 활성산소종의 발생량이 해마 CA1 지역에서 급격히 증가하게 되면서 신경세포의 사멸이 일어나게 된다. 그러므로, 활성산소종에 대한 조절능력이 있다는 것이 다양하게 밝혀진다면 뇌허혈 손상에 대해 많은 보호효과를 가져 올 것이라 예상한다.
단백질 전달기술은 PTD(Protein Transduction Domain) 혹은 CPP(Cell penetrating Peptide)라 불리며 대개 5∼30개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 단백질 혹은 유전자 등의 고분자와 융합하여 포유류 세포 또는 조직 안으로 손쉽게 전달할 수 있는 새로운 개념의 전달 시스템이다. 비록 PTD 융합단백질의 구체적인 메카니즘은 아직 정확히 밝혀지지 않았지만, 치료용 단백질을 인비트로와 인비보로 전달하는데 많이 사용되어 왔으며 매우 다양한 PTDs가 알려져 있다. 그중 본 발명에 사용한 것은 세포투과성 Tat 펩타이드이며, HIV-1 Tat 단백질(RKKRRQRRR)의 기본 도메인으로써 다양한 연구에 사용되고 있다.
본 발명은 허혈손상 및 허혈손상에 의한 신경세포 손상과 사멸을 치료하기 위한 효과적인 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 NOL3 융합단백질이 인비트로에서 산화 스트레스에 의해 유도된 신경세포 사멸과 인비보 허혈동물모델에서 보호효과가 있는지를 밝히고자 하였다. 허혈성 신경세포 사멸에 대해 NOL3 융합단백질의 잠재적인 효과를 연구하기 위해 본 발명자들은 세포 내로 투과할 수 있는 Tat-NOL3 융합단백질을 제작하였다. Tat-NOL3 융합단백질은 신경세포 내부로 농도 의존적 및 시간 의존적으로 효과적으로 투과하였다. 세포 내로 투과된 Tat-NOL3 융합단백질은 과산화수소 독성에 대한 세포 생존율을 증가시켰고, 세포내 활성산소종 수준을 낮추었다. 그리고, 세포 내로 투과된 Tat-NOL3 융합단백질은 과산화수소에 의해 유도된 DNA 단편화 현상도 저하시켰다. 동물모델에서 Tat-NOL3 융합단백질은 전뇌의 해마 CA1 부분에서 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸로부터 세포를 보호하였다. 이러한 결과들은 Tat-NOL3 융합단백질이 인비트로와 인비보에서 일어나는 세포사멸에 대해 보호효과를 나타내며, 산화 스트레스와 관련된 허혈손상에 대해 치료제로 이용될 수 있음을 말해준다.
NOL3(Nucleolar protein3)는 케스페이즈 2와 8 및 종양에 관여하는 단백질로 잘 알려진 p53 등의 효소활성을 하향조절함으로써 세포사멸을 억제하는 세포사멸 억제 단백질로 잘 알려져 있으며 전뇌허혈(Ischemia)에서 NOL3 자체만으로의 생물학적 기능은 알려져 있지 않다.
NOL3 단백질이 뇌 질환에 대한 치료용 단백질로의 가능성이 있는 것으로 생각되지만, 이러한 목적으로 사용하기에는 단백질이 세포 안으로 들어가기 힘들다. 그러므로 우리는 세포와 조직에 NOL3 단백질을 이동시키기 위해 단백질 형질도입 수단을 연구하였다.
본 발명자들은 사람 NOL3 유전자를 HIV-1 Tat 펩타이드와 미생물 발현 벡터를 함께 결합시킨 세포 침투성 NOL3 융합단백질을 과대 발현시킬 수 있는 발현 시스템을 사용하여 Tat-NOL3 융합단백질을 생산하였다. Tat-NOL3 융합단백질은 세포의 모든 수용성 단백질들 중에 주요한 구성성분으로 높은 수준으로 발현되었다. 그리고 SDS-PAGE 분석으로 95% 이상 순수하고 거의 동질의 단백질임을 확인하였다. 이렇게 얻어낸 융합단백질을 이용하여 연구를 수행하였다.
몇몇 연구자들은 HIV-1 Tat과 (Arg)9 등의 단백질 수송 도메인 융합단백질의 형질도입이 살아있는 세포의 세포막을 통하여 될 순 없고, 세포 고정 때문에 세포막을 인위적으로 재분포시킨다고 설명한다. 하지만 세포 고정 기술은 세포막을 부수므로 막전위 단백질 (membrane-translocating proteins) 연구는 신뢰가 떨어진다. 이런 펩타이드와 융합단백질은 엔도사이토시스로 세포 안으로 들어와 세포 자신의 것으로 받아들인다. 그래서 살아있는 세포 안으로의 단백질 형질도입 연구는 세포 고정을 피해야 한다 [36]. 그러나 본 발명에서 고정된 세포와 고정되지 않은 세포 안으로 형질도입된 Tat-NOL3 융합단백질의 형광 분포를 통해 서로 다른 점을 찾지 못했다. 이 결과들은 파라포름알데하이드를 이용한 세포 고정이 Tat-NOL3 형질도입에는 필요하지 않다는 것을 보여준다. 비슷한 연구 보고에서, 인위적인 단백질이 세포 안으로 형질도입되는데 파라포름알데하이드 고정을 유발하지 않는다고 지적했다 [37]. 또한 본 발명자들도 세포 안에 형질도입된 Tat-SOD (superoxide dismutase)와 PEP-1-SOD 융합단백질이 파라포름알데하이드 고정에 영향을 받지 않는다고 보고 했다 [18].
본 발명자들은 성상교세포 안에 정제된 Tat-NOL3 융합단백질을 시간과 농도 의존적으로(time- and dose-dependent manner) 효과적으로 형질도입시켰다. 10분 안에 세포 안으로 융합단백질이 형질도입되었고, 60분까지 시간에 따라 형질도입 수준이 점차적으로 증가하였다. Tat-β-갈락토시다아제 융합단백질이 HepG2 세포 내 최대 농도로 형질도입되는데 15분 이내에 이루어진다고 보고된바 있다. 또한 본 발명자들은 Tat-SOD와 Tat-카탈레이즈 융합단백질이 포유동물 세포와 조직에 1시간 이내에 형질도입되는 것을 보고하였다 [38,39,40]. 이러한 세포 내 투과 시간의 차이는 Tat 벡터와 융합할 때 단백질의 형태, 극성 및 분자 형태의 차이 때문으로 여겨진다. 또한 세포와 조직 내로 침투한 Tat-NOL3 융합단백질이 최대 60시간까지 안정적으로 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 조직에서는 7일 동안 그 안정성을 확인할 수 있었다.
효과적으로 세포 내로 침투한 Tat-NOL3 융합단백질이 세포에서 생물학적 역할을 하는지 측정해보았다. 산화적 스트레스 (Oxidative stress) 상태의 세포에서 Tat-NOL3 융합단백질이 형질도입되었을 때 세포의 생존율을 실험하였다. 그 결과, 과산화수소를 처리하기 전에 Tat-NOL3 융합단백질을 미리 처리했을 때 세포의 생존율이 상당히 증가하였다. Tat-NOL3 융합단백질을 처리하지 않았고 과산화수소만 처리하였을 경우 세포의 생존율은 단지 42%였다. 그리고 과산화수소를 처리하여 활성산소종을 일으키고, 이 활성산소종에서 Tat-NOL3 융합단백질이 투과되었을 때와 그렇지 않을 때의 활성산소종이 감소하였는가를 알아보았다. Tat-NOL3 융합단백질을 형질도입한 세포가 과산화수소만 처리한 세포보다 활성산소종이 감소되었다. 또한 활성산소종으로 인한 세포 사멸에 대한 억제 효과도 세포사멸의 대표적인 표지자인 케스페이즈 3 활성과 미토콘드리아 단백질인 Bax와 Bcl-2의 발현 정도, 그리고 세포사멸의 마지막 단계인 유전자 분쇄를 TUNEL 분석으로 확인하였다. 그 결과, 모두 동일하게 세포 내로 투과된 Tat-NOL3 융합단백질이 세포사멸에 대한 억제 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과들은 투과된 Tat-NOL3 융합단백질이 산화적 스트레스 (oxidative stress)로 인한 세포 사멸에 대해 세포를 효과적으로 보호한다는 것을 말해준다. 또한 앞서 설명한 대로 활성산소종이 유도되면 이로 인하여 Akt 신호가 활성화되고, pAkt가 Tat-NOL3 융합단백질을 인산화시킴으로써, 결과적으로 14-3-3 시그마와 복합체를 이루어 세포사멸을 억제한다는 기작을 확인할 수 있었다. 따라서 세포 내로 효과적으로 투과된 Tat-NOL3 융합단백질이 활성화된 pAkt에 의해 인산화 작용을 거쳐 14-3-3 시그마 단백질과 정상적으로 결합한다는 다른 연구들과 일치하는 것을 확인했으며, 이 복합체에 의해 세포사멸에 대한 보호효과 또한 일치함을 확인하였다 [14, 15].
본 발명자들은 이러한 결과를 토대로 인비보에서도 동일하게 효과가 있는지 확인해 보았다. 허혈성 손상에 대한 형질도입된 Tat-NOL3 융합단백질의 보호능력을 알아보기 위해 저빌쥐 동물모델을 설계했다. 연속적으로 대뇌혈류 (cerebral blood flow)를 감소시켜 신경세포의 죽음으로 뇌의 저산소증과 허혈을 유도함으로써 많은 양의 독성 활성산소종을 형성하였다. 활성산소종 형성이 급성 뇌허혈의 손상 동안 피와 산소가 결국에는 재관류 (reperfusion)로 뇌에 되돌아오는 것은 이미 증명되었다 [41]. 이러한 저빌쥐를 이용하여 형광면역조직화학 염색을 함께 수행한 결과, 효과적으로 조직 내로 침투한 Tat-NOL3 융합단백질을 확인할 수 있었고, 7일 동안 유지되는 안정성도 확인할 수 있었다. 나아가 신경세포의 표지자인 NeuN과 결합(merge)한 결과를 통하여 CA1 지역에서도 특히 신경세포로 침투했다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 동물모델에서도 Tat-NOL3 융합단백질의 효과적인 침투성과 안정성, 그리고 활성산소종에 의해 유도된 세포사멸에 대한 보호효과를 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 조직 내로 침투한 Tat-NOL3 융합단백질의 세포사멸에 대한 보호효과를 좀 더 자세히 확인해 보았다. 신경세포 사멸은 중추 신경 시스템의 손상을 야기하고, 때문에 미세아교세포 (microglia)를 활성화한다. 활성화된 미세아교세포는 몇몇 신경성 퇴화질병을 일으키는 자유 라디칼, 염증성 프로스타글란딘과 사이토카인과 같은 생성물을 만든다고 보고되었다 [42,43,44]. iba-1 (ionized calcium-binding adaptor molecule 1)은 새로운 Ca++-결합 단백질이고, 특이하게 뇌의 미세아교세포에서만 발현된다. iba-1의 중요한 역할은 미세아교세포의 기능을 조절하는 것이다. 여러 연구에서 뇌에 손상이 오면 미세아교세포에서 iba-1이 발현된다고 밝혀졌다. 그래서 iba-1은 이러한 연구에서 미세아교세포의 표시로 이용된다 [45]. 또한 중간 필라멘트를 이루는 구성요소이면서 성상교세포의 표지자인 GFAP (Glial fibrillary acidic protein)도 이용하였다. GFAP는 특히 신경세포에 손상을 받게 되면 성상교세포가 손상 받은 부위를 보충하기 위해 활성화될 때 발현되는 단백질이다 [46,47]. 본 발명자들은 iba-1, GFAP 면역반응성 세포를 허혈을 일으킨 해마 CA1 지역에서 관찰하였다. iba-1, GFAP-면역반응성 세포는 허혈성 손상을 준 해마 CA1 지역에서 현저히 증가하였다. 반면, Tat-NOL3 융합단백질을 처리한 그룹은 iba-1-면역반응성 세포가 허혈성 손상을 준 것보다 해마 CA1 지역에서 현저히 감소하였다. 그리고, 동일한 실험 환경에서 F-JB(Fluoro-Jade B) 조직형광기법 (histofluorescent) 염색으로 세포 사멸을 관찰하였다. F-JB 염색은 신경세포 (neuron)에 손상이 있으면 해마 CA1 지역에서 세포들이 형광을 나타내므로 관찰 가능하다. 그러나, Tat-NOL3 융합단백질이 형질도입된 손상된 신경세포에서는 해마 CA1 지역의 형광이 현저히 감소하였다. 이 결과는 Tat-NOL3 융합단백질이 허혈성 손상에서 해마 CA1 지역의 신경세포 사멸을 지연시키고, 허혈 손상에 대한 신경세포 손상을 감소시킴을 나타낸다. 이러한 결과들은 세포 실험과도 일치하며, 결론적으로 동물모델에서도 Tat-NOL3 융한단백질의 침투 효과와 세포사멸 보호효과가 있다는 것을 말해준다.
요약하면, 본 발명자들은 사람 NOL3 단백질과 HIV-1 Tat 펩타이드를 융합하여 인비트로와 인비보에서 효과적으로 투과시킬 수 있었다. 더욱이 Tat-NOL3 융합단백질이 스트레스 유도 세포사멸과 허혈 손상에 대하여 상당한 보호효과가 있었음을 밝혔다. 비록 자세한 메카니즘은 앞으로 더 밝혀야 하지만, 허혈성 손상을 일으키는 세포 파괴에 대하여 Tat-NOL3 융합단백질의 형질도입을 통하여 세포를 보호하는 새로운 방법과 뇌졸중을 포함한 다양한 질병의 치료용 약제를 제공할 수 있을 것이다.
결론적으로, 본 발명자들은 Tat 단백질 수송도메인과 함께 사람 NOL3 단백질을 융합하여 인비트로와 인비보에서 원활히 투과되도록 제작하였고, 산화 스트레스로 유도되는 세포사멸과 허혈성 외상에 대해 보호효과가 있음을 입증하였다. 세포 투과성 Tat-NOL3 융합단백질은 허혈손상으로부터 세포를 보호하여 신경퇴행성 질환 치료제로 이용할 수 있다.
본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명하면, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 먼저 Tat-NOL3 융합단백질을 과대 발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 Tat-NOL3 발현 벡터를 개발하였다. 이 발현 벡터는 인간 NOL3 단백질, Tat 형질도입 부위의 9개 아미노산 (Tat 49-57), 그리고 아미노산 말단부분에 6개의 히스티딘 잔기를 발현시킬 수 있는 cDNA를 포함하고 있다.
이 발현벡터를 이용하여 Tat-NOL3 융합단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며 Ni-친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양된 세포에 Tat-NOL3 융합단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 세포 내로 투과된 Tat-NOL3 융합단백질은 세포 내에서 최대 48시간 지속적으로 유지되었으며, 산화 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하였다.
이러한 결과는 Tat-NOL3 융합단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 NOL3 단백질의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 Tat-NOL3 융합단백질은 활성산소종과 관련된 증세 또는 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 등의 뇌신경질환에 응용할 수 있는 가능성을 제시해 준다.
NOL3 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태 등으로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제 (예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제 (예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제 (예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제 (예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제 (예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 천식에 적용하는 경우에는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 널리 알려진 바와 같이 흡입 방식이나 스프레이 방식의 제제로 제형화할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 NOL3 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뇌허혈 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 NOL3 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 NOL3 단백질 분자의 세포 내 전달은 HIV Tat을 비롯한 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 aa 49-57의 아홉 개의 아미노산으로 구성되는 HIV Tat 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 Tat 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Tat의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 7~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 다수 포함하는 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.
구체적으로, 본 발명은 NOL3 융합단백질, 이 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료, 예방 목적의 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"NOL3 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 NOL3 단백질을 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질 (즉, 본 발명에서는 NOL3 단백질을 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Tat-NOL3", "Tat-NOL3 융합단백질" 등과 혼용하였다.
"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 NOL3 단백질을 의미한다.
"융합단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.
본 발명에서의 "단백질 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.
또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 발명의 NOL3 융합단백질은 9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 NOL3 (Proline-rich Akt substrate 40)의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 NOL3 융합단백질을 말한다. 또한, 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, Pep-1 펩타이드, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고 (라이신,아르기닌) 중의 1종 이상을 말한다.
또한, 본 발명의 상기 NOL3 융합단백질 아미노산 서열은 서열번호 4를 포함한다. NOL3 융합단백질 제조에서 제한부위 서열의 선택 등에 따라 다양한 서열의 융합단백질을 얻을 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 보통의 지식을 가진 사람에게 자명하다. 위 아미노산 서열은 예시적인 것일 뿐 NOL3 융합단백질 아미노산 서열이 위에 나열된 서열로 한정되는 것이 아님은 자명하다.
또한, 본 발명은 상기 NOL3 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 뇌허혈의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 NOL3 융합단백질을 유효성분으로 하며, 뇌허혈의 예방 및 개선 효과가 있는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 9~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 포함하는 단백질 수송 도메인이 NOL3 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포도입성 (cell-transducing) NOL3 융합단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.
예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
본 발명의 세포 투과성 Tat-NOL3 융합단백질은 세포 및 동물 조직 내로 효과적으로 침투하여 활성을 나타내므로, 허혈손상으로부터 세포를 보호하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료 용도로 이용할 수 있다.
도 1은 Tat-NOL3 융합단백질의 제작 및 발현과 정제를 나타낸다. (A) Tat-NOL3 융합단백질을 제작하였다. (b) 15% SDS-PAGE와 항토끼 항히스티딘 폴리클론 항체를 이용한 웨스턴블랏 분석을 통해 Tat-NOL3 융합단백질, NOL3 단백질의 발현 및 정제를 확인하였다.
도 2는 HT22 세포 내로 Tat-NOL3 융합단백질의 형질도입을 나타내는 사진이다. (A) 농도 의존적인 것을 확인하기 위하여 60분 동안 Tat-NOL3 융합단백질(1~14㎛)과 대조군 NOL3 단백질을 처리하였고, (B) 시간 의존적인 것을 확인하기 위하여 10~60분 동안 Tat-NOL3 융합단백질(14㎛)과 대조군 NOL3 단백질을 처리하였다. (C) HT22 세포 내부로 Tat-NOL3 융합단백질이 투과된 것을 형광현미경을 이용하여 관찰하였고, (D) Tat-NOL3 융합단백질을 세포에 미리 처리한 뒤 72시간 동안 배양하여 세포 내에서 안정성을 확인하였다. 스케일 바 = 20㎛. 그리고 웨스턴블랏 분석과 밴드의 두께는 밀도계를 이용하여 측정하였다.
도 3은 세포에서 과산화수소의 처리로 인해 생긴 활성산소종에 대해 형질 도입된 Tat-NOL3 융합단백질의 효과를 나타낸다. (A) HT22 세포에서 미리 1시간 동안 Tat-NOL3 융합단백질(14㎛)과 pET-NOL3 단백질(14㎛)을 처리한 뒤 과산화수소(0.5mM)를 20분 동안 처리하였다. 먼저 1시간 동안 HT22 세포에 처리된 Tat-NOL3 융합단백질(1~14㎛), 대조군 NOL3 단백질과 함께 과산화수소를 처리하였다. (B) 세포의 생존력은 WST-1 분석을 통해 확인하였다. 세포 내 활성산소종 양은 DCF-DA로 염색한 후 ELISA 플레이트 리더로 형광도를 측정하였다. 스케일 바 = 20㎛.
도 4는 과산화수소로 유도된 DNA 단편화에 대한 Tat-NOL3 융합단백질의 보호효과 및 세포사멸 억제효능을 나타낸다. (A) 세포에 Tat-NOL3 융합단백질(14㎛), 대조군 NOL3 단백질(14㎛)을 한 시간 동안 처리한 후 과산화수소(1mM)를 18시간 처리하고 DNA 단편화는 TUNEL 염색과 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 형광 강도를 측정하였다. (B), (C) Tat-NOL3 융합단백질(14㎛), 대조군 NOL3 단백질(14㎛)을 처리한 뒤 세포사멸 기전 중 Bax/Bcl-2를 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다. (D), (E) 케스페이즈 2, 절단-케스페이즈 2, 케스페이즈-8, 절단 케스페이즈 8, PARP 및 절단 PARP를 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다.
도 5는 활성산소종에 의해 활성화되는 신호전달체계에 대한 Tat-NOL3 융합단백질의 보호기전을 나타내는 결과이다. (A), (B) Tat-NOL3 융합단백질과 대조군 NOL3 단백질을 1~14㎛의 농도로 전처리한 뒤 0.5mM 과산화수소를 1시간 동안 처리하여 JNK와 P38 양을 확인하였다.
도 6은 Tat-NOL3 융합단백질의 신경세포 생존에 관여하는 AKT 신호 및 세포사멸 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 나타내는 결과이다. (A), (B) Tat-NOL3 융합단백질과 대조군 NOL3 단백질을 1㎛~14㎛의 농도로 전처리한 뒤 과산화수소를 40분 동안 처리하여, AKT 양을 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다. (C), (D) 단백질을 전처리한 뒤 과산화수소 1mM를 4시간 30분 동안 처리 후 p53과 p21 발현량을 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다.
도 7은 세포 및 동물모델에서 침투성 Tat-NOL3 융합단백질의 세포사멸 보호효과를 나타내는 결과이다. (A) Tat-NOL3 융합단백질을 전처리하지 않은 군과 14㎛ 농도로 1시간 동안 전처리한 뒤 과산화수소 0.5mM를 2시간 동안 처리한 군의 JC-1 미토콘드리아 막 잠재력 분석을 수행하였다. (B) Tat-NOL3 융합단백질의 신경보호 효과는 면역조직화학 염색에 의해 분석하였다. 면연조직화학은 CA1 지역에서 CV, GFAP, Iba-1 및 FJB에서 샴군, 담체처리군, Tat-NOL3 융합단백질 처리군, NOL3 단백질 처리군 및 Tat 펩타이드 처리군을 7일 후에 마취를 수행하고, 뇌 조직을 적출했다. SP, stratum pyramidale; SO, stratum oriens; SR, stratum radiatum. 각각의 면역 반응성 뉴런의 수의 상대적 분석 값은 담체 투여군에서 현저하게 다르다. 스케일 바 = 50㎛. (C) 신경세포의 생존 능력은 NeuN 면역조직화학 염색에 의해 분석하였다. Tat-NOL3 융합단백질은 뇌 혈관 장벽(Blood Brain Barrier)를 통과시켰고, 히스티딘 항체를 이용하여 면역조직화학 분석을 시행하였다. 각각의 면역조직화학은 샴군, 담체처리군, Tat 펩타이드 처리군, NOL3 단백질 처리군 및 Tat- NOL3 융합단백질 처리군에 대해 7일 후에 마취를 수행하고 뇌 조직을 적출했다. SP, stratum pyramidale; SO, stratum oriens; SR, stratum radiatum. 각각의 면역 반응성 뉴런의 수의 상대적 분석 값은 담체투여군에서 현저하게 다르다. 스케일 바 = 50㎛.
도 2는 HT22 세포 내로 Tat-NOL3 융합단백질의 형질도입을 나타내는 사진이다. (A) 농도 의존적인 것을 확인하기 위하여 60분 동안 Tat-NOL3 융합단백질(1~14㎛)과 대조군 NOL3 단백질을 처리하였고, (B) 시간 의존적인 것을 확인하기 위하여 10~60분 동안 Tat-NOL3 융합단백질(14㎛)과 대조군 NOL3 단백질을 처리하였다. (C) HT22 세포 내부로 Tat-NOL3 융합단백질이 투과된 것을 형광현미경을 이용하여 관찰하였고, (D) Tat-NOL3 융합단백질을 세포에 미리 처리한 뒤 72시간 동안 배양하여 세포 내에서 안정성을 확인하였다. 스케일 바 = 20㎛. 그리고 웨스턴블랏 분석과 밴드의 두께는 밀도계를 이용하여 측정하였다.
도 3은 세포에서 과산화수소의 처리로 인해 생긴 활성산소종에 대해 형질 도입된 Tat-NOL3 융합단백질의 효과를 나타낸다. (A) HT22 세포에서 미리 1시간 동안 Tat-NOL3 융합단백질(14㎛)과 pET-NOL3 단백질(14㎛)을 처리한 뒤 과산화수소(0.5mM)를 20분 동안 처리하였다. 먼저 1시간 동안 HT22 세포에 처리된 Tat-NOL3 융합단백질(1~14㎛), 대조군 NOL3 단백질과 함께 과산화수소를 처리하였다. (B) 세포의 생존력은 WST-1 분석을 통해 확인하였다. 세포 내 활성산소종 양은 DCF-DA로 염색한 후 ELISA 플레이트 리더로 형광도를 측정하였다. 스케일 바 = 20㎛.
도 4는 과산화수소로 유도된 DNA 단편화에 대한 Tat-NOL3 융합단백질의 보호효과 및 세포사멸 억제효능을 나타낸다. (A) 세포에 Tat-NOL3 융합단백질(14㎛), 대조군 NOL3 단백질(14㎛)을 한 시간 동안 처리한 후 과산화수소(1mM)를 18시간 처리하고 DNA 단편화는 TUNEL 염색과 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 형광 강도를 측정하였다. (B), (C) Tat-NOL3 융합단백질(14㎛), 대조군 NOL3 단백질(14㎛)을 처리한 뒤 세포사멸 기전 중 Bax/Bcl-2를 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다. (D), (E) 케스페이즈 2, 절단-케스페이즈 2, 케스페이즈-8, 절단 케스페이즈 8, PARP 및 절단 PARP를 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다.
도 5는 활성산소종에 의해 활성화되는 신호전달체계에 대한 Tat-NOL3 융합단백질의 보호기전을 나타내는 결과이다. (A), (B) Tat-NOL3 융합단백질과 대조군 NOL3 단백질을 1~14㎛의 농도로 전처리한 뒤 0.5mM 과산화수소를 1시간 동안 처리하여 JNK와 P38 양을 확인하였다.
도 6은 Tat-NOL3 융합단백질의 신경세포 생존에 관여하는 AKT 신호 및 세포사멸 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 나타내는 결과이다. (A), (B) Tat-NOL3 융합단백질과 대조군 NOL3 단백질을 1㎛~14㎛의 농도로 전처리한 뒤 과산화수소를 40분 동안 처리하여, AKT 양을 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다. (C), (D) 단백질을 전처리한 뒤 과산화수소 1mM를 4시간 30분 동안 처리 후 p53과 p21 발현량을 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다.
도 7은 세포 및 동물모델에서 침투성 Tat-NOL3 융합단백질의 세포사멸 보호효과를 나타내는 결과이다. (A) Tat-NOL3 융합단백질을 전처리하지 않은 군과 14㎛ 농도로 1시간 동안 전처리한 뒤 과산화수소 0.5mM를 2시간 동안 처리한 군의 JC-1 미토콘드리아 막 잠재력 분석을 수행하였다. (B) Tat-NOL3 융합단백질의 신경보호 효과는 면역조직화학 염색에 의해 분석하였다. 면연조직화학은 CA1 지역에서 CV, GFAP, Iba-1 및 FJB에서 샴군, 담체처리군, Tat-NOL3 융합단백질 처리군, NOL3 단백질 처리군 및 Tat 펩타이드 처리군을 7일 후에 마취를 수행하고, 뇌 조직을 적출했다. SP, stratum pyramidale; SO, stratum oriens; SR, stratum radiatum. 각각의 면역 반응성 뉴런의 수의 상대적 분석 값은 담체 투여군에서 현저하게 다르다. 스케일 바 = 50㎛. (C) 신경세포의 생존 능력은 NeuN 면역조직화학 염색에 의해 분석하였다. Tat-NOL3 융합단백질은 뇌 혈관 장벽(Blood Brain Barrier)를 통과시켰고, 히스티딘 항체를 이용하여 면역조직화학 분석을 시행하였다. 각각의 면역조직화학은 샴군, 담체처리군, Tat 펩타이드 처리군, NOL3 단백질 처리군 및 Tat- NOL3 융합단백질 처리군에 대해 7일 후에 마취를 수행하고 뇌 조직을 적출했다. SP, stratum pyramidale; SO, stratum oriens; SR, stratum radiatum. 각각의 면역 반응성 뉴런의 수의 상대적 분석 값은 담체투여군에서 현저하게 다르다. 스케일 바 = 50㎛.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
재료
HT22 세포는 쥐의 해마신경 세포로써 한국세포주연구재단(KCLF)에서 제공받았다. 세포는 10% FBS와 항생제 (100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 겐타마이신 황산염)를 첨가한 DMEM을 사용하였다. 그리고 HT22 세포를 37℃, 95% 공기 및 5% 이산화탄소의 조건을 유지해주며, 조직배양용 항온장치에서 배양하였다. 플라스미드 pET-15b 백터와 대장균 균주 BL21 (DE3)은 Novagen에서 구입하였다. 그리고 FBS와 항생제는 Gibco BRL에서, Ni2 +-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우는 Qiagen에서 구매하였다. Tat-펩타이드 합성은 PEPTRON (Deajeon, Korea)에서 주문 제작하였다. 이외의 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.
실험방법
Tat
-
NOL3
단백질의 발현과 정제
NOL3 단백질 및 Tat-NOL3 융합단백질 발현 벡터를 구축하였다. 인간의 유전자 중의 하나인 NOL3를 cDNA와 함께 2개의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)으로 증폭시켰다. 센스 프라이머는 5'-CTCGAGGGCAACGCGCAG-3'으로 구성되어 있고, Xho1이라는 제하효소 작용부위가 5' 쪽에 존재한다. 그리고 안티센스 프라이머는 5'-GGATCCTCAGGAATCTTCGGACTC-3'으로 구성되어 있고, BamH1이라는 제한효소 작용부위가 5' 쪽에 존재한다. PCR을 통하여 얻은 결과물을 TA 벡터에 연결하고 Xho1과 BamH1을 이용하여 자른 후에 발현 벡터에 연결하여 Tat-NOL3를 제조하였다. 이와 마찬가지로 대조군인 NOL3는 Tat 펩타이드가 결여된 벡터를 이용하여 제조하였다. 재조합된 Tat-NOL3 플라스미드를 대장균인 BL21로 형질변환 시킨 후 0.1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)로 유도하여 20℃에서 20시간 배양하였다. 배양한 세포를 초음파로 분쇄하여 Tat-NOL3 융합단백질을 얻기위해 Ni2 +-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 컬럼과 PD-10 컬럼 크로마토그래피(Amersham, Brauncschweig,Germany)를 이용하여 정제하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 우혈청 알부민을 표준물질로 이용하여 결정하였다.
Tat
-
NOL3
융합단백질의
HT22
세포 내로의 투과성
Tat-NOL3 융합단백질의 농도 의존적 세포 내 투과를 관찰하기 위해 1시간 동안 1㎛~14㎛의 농도로 처리하였으며, 시간 의존적 세포 내 투과를 관찰하기 위해 14㎛의 농도로 10, 20, 30, 40, 50 및 60분으로 단백질을 처리하였다. 그 후에 트립신-EDTA를 처리하고 PBS를 이용하여 세척 한 다음 세포 내로 투과된 융합단백질의 양과 활성을 웨스턴블랏 분석으로 분석하였다.
웨스턴블랏
분석
단백질은 15% SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였다. 이전 단계에서 단백질은 전압차이에 의해 니트로셀룰로오스 막으로 전기이동시키고, 막은 PBS-T에 5% 탈지유로 만들어서 담가둔다. 막은 먼저 토끼 항히스티딘 폴리클론 항체(1:5000; Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 확인하였다. 결합한 항체는 강화된 화학형광으로 시각화하였다 (Amersham, Franklin Lakes, NJ, USA).
형광현미경 분석
커버슬립 상에서 HT-22 세포를 배양하고 14㎛ Tat-NOL3 융합단백질을 처리하였다. 그 후에 37℃로 1시간 동안 배양하고 PBS를 이용하여 2번 정도 씻어주고, 4% 파라포름알데하이드를 5분간 상온에서 처리하여 세포를 고정시켰다. 그 다음 PBS에 3%의 우혈청 알부민, 0.1% Triton X-100 함유 PBS(PBS-BT)로 상온에서 30분간 블로킹한 다음 PBS-BT로 세척하였다. 일차 항체(His-probe, Sadnta Cruz Biotechnology)는 1:2000로 희석하여 상온에서 2시간 처리하였다. 이차 항체(Alexa fluor 488, Invitogen)는 1:15000로 희석하여 빛이 차단된 환경에서 1시간 동안 처리하였다. 또한 핵을 염색하기 위해 2분 동안 1㎍/㎖ DAPI DAPI(Roche)를 사용하였다. 후에 형광현미경(Nikon eclipse 80i,Japan)을 이용하여 형광분석을 하였다.
WST
-1(
Water
-
soluble
tetrazolium
salt
-1) 분석
Tat-NOL3 융합단백질의 생물학적 활성도는 세포에 단백질을 전처리한 후 과산화수소를 처리하는 방식으로 진행되며 과산화수소만을 처리한 세포에 비해 단백질을 전처리한 세포군에서 얼마만큼 세포가 생존하고 있는지 알아봄으로써 측정할 수 있다. HT22 세포를 96 웰 플레이트에 80% 되게 깔아준 뒤 다음날 Tat-NOL3 융합단백질을 먼저 처리하였다. 이어서 과산화수소 0.8uM을 16시간 동안 처리해주고, WST-1(Water-soluble tetrazolium salt-1) 분석을 수행하여 450nm의 파장에서 ELISA 마이크로플레이트 리더(LabsystemsMultiskan MCC/340)를 통해 흡광도를 측정하였다.
세포 내
활성산소종
수준 측정
활성산소종에 민감한 안료인 DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescein diacetate)를 이용하여 HT22 세포에 Tat-NOL3 융합단백질을 처리하였을 때와 처리하지 않았을 때를 비교하여 세포 내의 활성산소종 수준을 측정해보았다. Tat-NOL3를 1시간 동안 전처리 후에 과산화수소 0.5mM을 20분 동안 처리하였다. 그리고 PBS로 씻어 준 다음 DCF-DA를 20㎛의 농도로 30분간 처리해 주었다. DCF 형광의 수준은 여기 485㎚, 방출 538㎚로 조절된 플루오로스캔(fluoroskan) ELISA 플레이트 판독기(LabsystemsOy, Helsinki, Finland)를 이용하여 형광현미경으로 측정하였다.
TUNEL
분석
HT22 세포에 Tat-NOL3 융합단백질을 처리하였을 때와 처리하지 않았을 때를 비교하여 사멸에 대한 보호효과를 확인하였다.
전 처리하지 않은 군과 14㎛의 농도로 1시간 동안 Tat-NOL3 융합단백질을 처리한 실험군에 과산화수소(0.5mM)를 16시간 동안 처리하였다.
세포의 세포사멸을 측정하기 위해 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated biotinylated dUTP nick end labeling) 염색을 실시하였다. 영상은 형광현미경 (Nikon eclipse 80i, Japan)으로 촬영하였다.
JC
-1 미토콘드리아 막 잠재력 분석(
Mitochondrial
Membrane
Potential
) 분석
HT22 세포에 Tat-NOL3 융합단백질을 처리하였을 때와 처리하지 않았을 때를 비교하여 활성산소종 발생에 의해 생성되는 막 잠재력 변화를 측정하기 위해 JC-1 분석을 수행하였다.
Tat-NOL3 융합단백질을 전 처리하지 않은 군과 14㎛의 농도로 1시간 동안 전처리한 실험군에 과산화수소 0.5mM를 2시간 동안 처리하였다. JC-1 미토콘드리아 막 잠재력 분석 키트(caymanchemical company cat. 10009172)를 사용하였다.
실험동물
한림대학교 실험동물센터에서 제공되는 저빌쥐 (Mongolian gerbils; Meriones unguiculatus)를 사용하였다. 동물은 23℃, 60% 습도 조건에서 12시간 밝게/12시간 어둡게 하여 사육하였고, 사료와 물은 자유롭게 접근할 수 있도록 공급하였다. 실험동물 취급 및 관리는 한국의 국립 수의 과학 검역 서비스의 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 설명서에 준거하고, 한림의료센터기관 연구동물 관리 및 사용에 관한 위원회에서 승인을 받았다.
동물 실험에서의
전뇌
허혈 유도
전뇌 허혈을 유도하였다. 온목동맥을 신경 섬유들로부터 격리시켜 폐색하고, 외상이 크게 남지 않게 하기 위해 동맥류 클립(aneurysm clips)을 이용하였다. 혈류를 폐색 시켰을 때, 검안경(ophthalmoscope)을 이용하여 혈압을 주의 깊게 관찰하였다. 그 후 5분 동안 폐색하고 동맥류 클립을 제거하였다. 그리고 폐색에 대해 혈압이 회복되는 것을 검안경으로 확인하였다. 또한 샴 수술로 정상 경동맥을 폐색하지 않고, 외과적인 절차를 제외하고 얼마나 영향을 받는지 확인해 보았다. 허혈성 손상에 대한 Tat-NOL3 융합단백질의 보호효과를 실험하기 위해, 7일 후 허혈 재관류(ischemia-reperfusion)하고 샴 수술군, 담체 처리군, Tat-NOL3 융합단백질 처리군, NOL3 단백질 처리군 및 Tat 펩타이드 처리군으로 5개 그룹(각 N=10)으로 나눠, 허혈-재관류 후 복강 내에 30분을 투여하여 실험을 수행했다.
면역조직 화학
샴 수술군, 담체 처리군, Tat-NOL3 융합단백질 처리군, NOL3 단백질 처리군 및 Tat 펩타이드 처리군을 7일 후에 마취를 수행하고, 뇌 조직을 적출했다. 허혈성 손상으로부터 Tat-NOL3 융합단백질의 보호효과를 확인하기 위해, 30분 동안 PBS에서 10% 정상 염소 혈청에서 배양하고, 크레실 바이올렛 염색을 시행하고, F-JB(Fluoro-Jade B) 염색, Iba-1(ionized calcium-binding adapter molecule 1) 및 NeuN(neuronal nuclei)을 시행하였다. 뇌의 해마에 Tat-NOL3 융답단백질의 전달을 감지하기 위해, 항체와 면역 염색을 시행하였다.
결과 1:
Tat
-
NOL3
융합단백질의
제조 및 정제
세포침투성 Tat-NOL3 융합단백질을 제조하기 위해 세포침투 능력을 갖는 Tat 벡터와 뇌질환과 관련하여 세포사멸 억제기능을 가지는 NOL3 cDNA가 연결되어 있는 Tat-NOL3 융합단백질을 제조한 뒤(도 1A), 제조된 Tat-NOL3 융합단백질 발현벡터를 대장균에서 과대발현시켜 Ni2 +-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 컬럼 크로마토그래피와 PD-10 크로마토그래피를 수행하여 정제한 뒤, SDS-PAGE와 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다(도 1B).
결과 2:
Tat
-
NOL3
융합단백질의
세포내
투과성 및 안정성 탐색
Tat-NOL3 융합단백질의 세포 내로 침투하는지 확인하기 위하여 농도(1㎛~14㎛) 및 시간(10분~60분) 별로 단백질을 처리한 뒤 웨스턴블랏 분석을 통해 분석하였다.
분석한 결과, Tat-NOL3 융합단백질은 농도와 시간 의존적으로 세포 내 투과가 일어났으나, 대조군 NOL3는 세포내로의 투과가 일어나지 않았다(도 2A, B). 또한 세포 내로 단백질이 투과되는지 형광과 핵 특정 마커인 alexa 488과 DAPI를 이용하여 이중염색 시킨 뒤 공초점을 이용하여 Tat-NOL3 융합단백질이 세포내로 침투하는 것을 확인하였고(도 2C), 투과된 Tat-NOL3 융합단백질은 시간이 지남에 따라 분해되어 단백질양이 점차 감소되었으나 세포안에서 60시간 동안 안정하게 유지되는 것을 알 수 있었다(도 2D). 이 결과를 바탕으로 Tat-NOL3 융합단백질이 세포 내부로 효과적으로 투과되는 것을 확인하였다.
결과 3:
세포침투성
Tat
-
NOL3
융합단백질의
HT22
세포에서
활성산소종
및 신경세포에 대한 보호 효과 확인
과산화수소를 처리할 때 유도되는 활성산소종을 Tat-NOL3 융합단백질이 효과적으로 억제하는지 확인하기 위하여 DCF-DA(2,5-dichlorofluorescin diacetate) 염색법을 수행하였다. 과산화수소만을 처리하여 활성산소종을 유도한 실험군과 세포 침투성 Tat-NOL3 융합단백질을 전처리 한 뒤 과산화수소를를 처리한 군을 비교하여 진행하였다. 일반적으로 세포내 활성산소종이 유도되어지면 2',7'-H2DCFDA(dichlorofluorescin diacetate)는 불투과성의 2',7'-H2DCF(dichlorofluorescin)으로 가수분해되어 저장되는데 이것은 과산화수소에 의해 유도된 활성산소와 반응하여 산화되면서 2',7'-DCF(dichloro-fluorescein)를 형성하여 녹색을 띄게 된다. 반면, 세포침투성 단백질인 Tat-NOL3 융합단백질을 세포내에 전처리하였을 경우 세포 내의 활성산소종이 억제되는 것을 형광현미경을 통해 확인하였다(도 3A). 또한, 세포침투성 Tat-NOL3 융합단백질의 세포사멸에 대한 세포 보호효능을 확인하기 위하여 살아있는 세포의 수를 측정하는 방법인 WST-1 (tetrazolium Salts)을 수행하였다. WST-1은 세포독성 물질이나 약물에 대한 반응 분석에 이용되며 WST-1을 세포 내 미토콘드리아 탈수소 효소가 분해하여 진한 붉은 색의 포르마잔 결정으로 환원시키는 원리를 이용하며 450nm의 파장에서 흡광도를 측정한다. 이 흡광도는 살아있는 세포에 의해 WST-1이 환원된 양을 나타내며 생존세포수와 비례한다.
결과를 보면, 과산화수소를 단독으로 세포 내에 처리하였을 경우 살아있는 세포의 수가 약 50% 이하로 감소하는 것을 확인할 수 있었고, Tat-NOL3 융합단백질을 전처리 하였을 때 농도 의존적으로 생포생존능력이 증가되어 세포의 사멸을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 3B).
결과 4:
침투성
Tat
-
NOL3
융합 단백질의
DNA
보호 및 세포사멸 억제효능 탐색
활성산소종이 유발되어 세포가 손상을 받으면 세포사멸이 진행되면서 DNA 분역이 발생하는데 이것에 형광 염료를 부착시켜 DNA 손상정도를 TUNEL 염색을 통해 확인해 볼 수 있다. Tat-NOL3 융합단백질을 전처리한 뒤 과산화수소를 처리해 본 결과 과산화수소를 처리한 세포에서는 다수의 세포가 염색되었지만, Tat-NOL3 융합단백질을 처리하였을 때는 DNA 분열이 많이 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 대조군 NOL3에서는 확인할 수 없었다(도 4A). 또한, 세포사멸 기전 중 Bax/Bcl-2를 웨스턴블랏 분석으로 확인해보았다. Bax 단백질은 DNA 손상 등 스트레스가 전해지면 시토크롬 C를 유리시켜 세포사멸을 유도하고, Bcl -2는 Bax 단백질의 작용을 방해하여 세포사멸을 억제한다. Tat-NOL3 융합단백질을 처리한 결과, Bax 단백질을 농도 의존적으로 억제시켰으며 Bcl -2 수준이 증가하는 것을 확인하였으나, 대조군 NOL3에서는 확인할 수 없었다(도 4B,C).
세포사멸과 관련 기전 중 케스페이즈 2와 절단-케스페이즈 2뿐 아니라 케스페이즈-8과 절단-케스페이즈 8, PARP와 절단-PARP를 항체를 사용하여 웨스턴블랏 분석으로 확인해 본 결과, Tat-NOL3 융합단백질을 처리한 그룹에서는 농도 의존적으로 전체 폼 수준이 점차 증가하고 쪼개진 형태는 감소하였지만 대조군 NOL3 그룹에서는 아무런 효과가 없었다(데이타 나타내지 않음).
이러한 결과들을 통해 세포침투성 Tat-NOL3 융합단백질이 과산화수소가 유도한 세포사멸에 대하여 보호효과가 있음을 알 수 있었다.
결과 5:
활성산소종에
의해 활성화되는 신호전달체계에 대한
Tat
-
NOL3
융합단백질의
보호 기전 연구
신경세포막으로부터 핵으로 산화적 스트레스와 같은 신호를 전달함으로써 세포의 성장과 분화를 조절하는 주요전달체계인 MAPK 기전에 Tat-NOL3 융합단백질이 미치는 영향을 웨스턴블랏 분석으로 살펴보았다. Tat-NOL3 융합단백질과 대조군 NOL3 단백질을 1㎛~14㎛의 농도로 전처리한 뒤 0.5mM 과산화수소를 1시간 동안 처리하여 신경세포에 활성산소종을 유발한 뒤 스트레스에 의해 활성화되는 대표 마커인 JNK와 P38 수준을 확인해본 결과, Tat-NOL3 융합단백질의 경우 JNK와 p38의 활성화 양식인 p-JNK, pP38을 감소시켰으나, 대조군 NOL3의 경우는 활성화 양식에 아무런 영향을 끼치지 않은 것을 확인하였다(도 5A, B).
결과 6:
Tat
-
NOL3
융합단백질의
신경세포 생존에 관여하는
AKT
신호 및 세포사멸 관련 유전자 발현에 미치는 영향에 대한 연구
Akt는 허혈상태에서 bcl-2 유전자군과 같이 신경세포 생존에 관여하며 AKT가 Bad를 인산화시켜 비활성화시킴으로서 세포자멸사를 억제하고 시토크롬 C의 활성 또한 억제하는 것으로 알려져 있으며 기존연구에 따르면 허혈군에서는 통계적으로 pAkt를 발현하는 세포의 수가 증가하는 것으로 알려져 있다. AKT 양을 웨스턴블랏 분석으로 확인해본 결과 Tat-NOL3 융합단백질을 처리하였을 때, 과산화수소로 활성산소종을 유도하였을 때보다 pAKT 양이 감소하는 것을 확인할 수 있었지만, 대조군 NOL3의 경우 유도된 pAKT 양에 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 6 A,B). p53와 p21유전자는 bax, bad, bak, fas 등과 함께 세포괴사 유발 유전자에 속한다. 세포사멸의 과정은 p53-의존성 경로(p53-dependent pathway)에 직접적인 영향을 받고 있으며, 이러한 p53 유전자의 발현은 DNA 손상이나 뇌혈류의 저하 등이 유발 인자로 작용하는 것으로 알려져 있다.
세포사멸 관련 유전자의 발현을 확인해본 결과, Tat-NOL3 융합단백질은 p53과 p21 발현 양을 감소시켰지만(도 6A, C), 대조군 NOL3 단백질의 경우는 양의 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 6B, D).
이 실험을 통해서 Tat-NOL3 융합단백질이 신경세포 생존에 관여하는 신호 및 관련 유전자 발현에 영향을 미치는 것을 확인하였다.
결과 7: 세포 및 동물모델에서
침투성
Tat
-
NOL3
융합단백질의
세포사멸 보호효능 탐색
Tat-NOL3 융합단백질의 세포사멸에 대한 보호효능을 확인하기 위하여 HT22 세포를 이용하여 JC-1 염색을 수행하였다. JC-1 염색은 세포막전위 변화(membrane potential change)에 따른 염료의 반응도를 관찰하는데 이용되는 형광염료이다. JC-1은 미토콘드리아 막전위 연구에 주로 이용되는데, 이때 정상 세포내에서의 JC-1 염료는 미토콘드리아에 붉은 형광을 띠며 축적되고, 세포사멸이 일어난 세포에서는 세포질에 녹색 형광으로 남게 된다. 결과, 과산화수소를 처리하여 세포사멸이 일어났을 때보다 Tat-NOL3 융합단백질을 전처리하면 세포사멸을 완화시키는 것을 확인할 수 있었지만 대조군 NOL3를 처리한 경우에는 보호효과를 확인할 수 없었다(도 7A).
Tat-NOL3 융합단백질의 형질도입의 생체 안에서 생물학적 역할을 알아보기 위해 Tat-NOL3 융합단백질을 신경세포에 형질도입 후 일시적으로 총경동맥을 막아 뇌허혈을 일으켜 저빌쥐 동물모델을 제작하였다.
세포사멸 정도를 확인하기 위하여 크레실 바이올렛으로 해마를 염색한 결과 아무것도 처리하지 않은 실험군은 세포가 많이 살아있었지만, 뇌허혈이 일어난 경우에는 세포가 현저히 사멸한 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 대조군 NOL3와 Tat-펩타이드에서도 동일한 양상을 보였으며 Tat-NOL3 융합단백질을 처리한 실험군에서는 세포사멸이 많이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 미세아교 세포 마커인 Iba-1, 아교세포 마커인 GFAP, 퇴화 신경 마커인 FJB를 이용하여 실험을 진행하였다.
허혈에 의해 유도된 신경교증 반응에서 Tat-NOL3 융합단백질의 보호효과를 GFAP-면역 반응성 성상세포를 통해 CA1 지방을 확인해본 결과 성상세포가 손상되면 GFAP-면역 반응성 성상세포의 양이 급격히 증가한다. 대조군 그룹에서는 GFAP-면역 반응성 성상세포가 작은 사이즈의 세포질과 함께 가느다란 돌기의 모양을 하고 있는 것을 볼 수 있지만 허혈 그룹에서는 GFAP-면역 반응성 성상세포가 많은 양의 cytoplasm 과 비정상적으로 발달한 돌기들과 함께 해마 CA1 지역 여러 곳에서 관찰되었다. 그리고 Tat-펩타이드 그룹과 대조군 NOL3 그룹에서도 대부분의 GFAP-면역 반응성 성상세포가 허혈 그룹과 비슷한 것을 확인하였다. 그러나 Tat-NOL3 융합단백질을 처리한 허혈 그룹에서는 소량의 GFAP-면역 반응성 성상세포가 발달한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 미세아교 세포의 마커인 Iba-1-i-면역반응 미세아교 세포를 사용하여 허혈에 의해 유도된 신경교증에 대한 Tat-NOL3 융합단백의 효과를 CA1 모든 지역에서 확인해 보았다. 아무것도 처리하지 않은 컨트롤 그룹에서는 Iba-1-면역반응 미세아교 세포가 so와 sr에서 관찰되었다. 반면 허혈 그룹에서는 Iba-1-면역반응 미세아교 세포가 so, sr뿐만 아니라 sp에서도 관찰되었다. sp에서는 돌기가 형성되지 않은 비정상적인 모양을 지닌 세포질을 확인하였고, 그 외 나머지 지역에서 또한 두껍고 움츠러든 돌기를 가진 비정상적인 세포질을 관찰할 수 있었다. 이것은 Tat-펩타이드와 NOL3에서도 Iba-1-면역반응 미세아교 세포의 몰포로지와 분포도가 허혈 그룹과 비슷한 패턴을 보였다. 반면, Tat-NOL3 융합단백질을 처리한 그룹에서는 sp지역에서 소량의 Iba-1-면역반응 미세아교 세포가 관찰되었다. 이는 Iba-1-면역반응 미세아교 세포의 면역반응이 CA1 지역에서 현저히 감소함을 보여준다(도 7B).
신경세포 마커인 NeuN 염색을 수행한 결과 아무것도 처리하지 않은 대조군 그룹에서는 많은 양의 NeuN-면역반응 신경세포가 해마 CA1 지역에서 관찰되는 것을 확인하였으며 대조적으로 허혈 그룹에서는 적은 양의 NeuN-면역반응 신경세포를 확인하였다. 이것은 Tat-펩타이드와 대조군 NOL3 그룹도 비슷하게 보여졌다. 반면Tat-NOL3 융합단백질을 처리한 허혈 그룹에서는 매개체 처리 허혈성 그룹과 비교했을 때 해마 CA1 지역에서 많은 양의 NeuN-면역반응 신경세포가 관찰되었다. 이러한 결과는 허혈을 유도하였을 때 감소한 신경세포에 대한 Tat-NOL3 융합단백질이 뇌 허혈손상에 대한 보호효과가 있는 것으로 예상되며, Tat-NOL3 융합단백질이 뇌허혈에서 효과적인 치료제로서의 가능성이 있음을 제시한다(도 7C).
<110> Industry Academic Cooperation Foundation
<120> Pharmaceutical composition for treating ischemia containing
cell-transducible NOL3 fusion protein
<130> HallymU-sychoi-NOL3ischemia
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
ctcgagggca acgcgcag 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
ggatcctcag gaatcttcgg actc 24
<210> 3
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding Tat-NOL3 fusion protein
<400> 3
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat aggaagaagc ggagacagcg acgaagactc 60
gagatgggca acgcgcagga gcggccgtca gagactatcg accgcgagcg gaaacgcctg 120
gtcgagacgc tgcaggcgga ctcgggactg ctgttggacg cgctgctggc gcggggcgtg 180
ctcaccgggc cagagtacga ggcattggat gcactgcctg atgccgagcg cagggtgcgc 240
cgcctactgc tgctggtgca gggcaagggc gaggccgcct gccaggagct gctacgctgt 300
gcccagcgta ccgcgggcgc gccggacccc gcttgggact ggcagcacgc taccgggacc 360
gcagctatga ccctccatgc ccaggccact ggacgccgga ggcacccggc tcggggacca 420
catgccccgg gttgcccaga gcttcagacc ctgacgaggc cgggggccct gagggctccg 480
aggcggtgca atccgggacc ccggaggagc cagagccaga gctggaagct gaggcctcta 540
aagaggctga accggagccg gagccagagc cagagctgga acccgaggct gaagcagaac 600
cagagccgga actggagcca gaaccggacc cagagcccga gcccgacttc gaggaaaggg 660
acgagtccga agattcctga aggccagagc tctgacaggc ggtgccccgc ccatgctgga 720
tagggatcc 729
<210> 4
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tat-NOL3 fusion protein
<400> 4
Leu Glu Met Gly Asn Ala Gln Glu Arg Pro Ser Glu Thr Ile Asp Arg
1 5 10 15
Glu Arg Lys Arg Leu Val Glu Thr Leu Gln Ala Asp Ser Gly Leu Leu
20 25 30
Leu Asp Ala Leu Leu Ala Arg Gly Val Leu Thr Gly Pro Glu Tyr Glu
35 40 45
Ala Leu Asp Ala Leu Pro Asp Ala Glu Arg Arg Val Arg Arg Leu Leu
50 55 60
Leu Leu Val Gln Gly Lys Gly Glu Ala Ala Cys Gln Glu Leu Leu Arg
65 70 75 80
Cys Ala Gln Arg Thr Ala Gly Ala Pro Asp Pro Ala Trp Asp Trp Gln
85 90 95
His Ala Thr Gly Thr Ala Ala Met Thr Leu His Ala Gln Ala Thr Gly
100 105 110
Arg Arg Arg His Pro Ala Arg Gly Pro His Ala Pro Gly Cys Pro Glu
115 120 125
Leu Gln Thr Leu Thr Arg Pro Gly Ala Leu Arg Ala Pro Arg Arg Cys
130 135 140
Asn Pro Gly Pro Arg Arg Ser Gln Ser Gln Ser Trp Lys Leu Arg Pro
145 150 155 160
Leu Lys Arg Leu Asn Arg Ser Arg Ser Gln Ser Gln Ser Trp Asn Pro
165 170 175
Arg Leu Lys Gln Asn Gln Ser Arg Asn Trp Ser Gln Asn Arg Thr Gln
180 185 190
Ser Pro Ser Pro Thr Ser Arg Lys Gly Thr Ser Pro Lys Ile Pro Glu
195 200 205
Gly Gln Ser Ser Asp Arg Arg Cys Pro Ala His Ala Gly
210 215 220
Claims (2)
- NOL3(nucleolar protein 3)의 N-말단에 HIV-Tat 펩타이드가 공유결합된 NOL3 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 NOL3 융합단백질은 서열번호 4임을 특징으로 하는 NOL3 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140047807A KR20150122280A (ko) | 2014-04-22 | 2014-04-22 | 세포투과성 ｎｏｌ３ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140047807A KR20150122280A (ko) | 2014-04-22 | 2014-04-22 | 세포투과성 ｎｏｌ３ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150122280A true KR20150122280A (ko) | 2015-11-02 |
Family
ID=54599464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140047807A KR20150122280A (ko) | 2014-04-22 | 2014-04-22 | 세포투과성 ｎｏｌ３ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20150122280A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022528318A (ja) * | 2019-03-25 | 2022-06-10 | イミュンワーク インク． | 金属結合モチーフを有する複合ポリペプチド及びそれを備える分子構築物 |
-
2014
- 2014-04-22 KR KR1020140047807A patent/KR20150122280A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022528318A (ja) * | 2019-03-25 | 2022-06-10 | イミュンワーク インク． | 金属結合モチーフを有する複合ポリペプチド及びそれを備える分子構築物 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Withdrawal due to no request for examination |