KR20110037536A - 세포 침투성 글리옥살레이즈 융합단백질 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글리옥살레이즈 융합단백질 및 이를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 활성산소종 대사에 관여하는 글리옥살레이즈를 단백질수송도메인과 결합시킨 융합단백질로 제조함으로써 세포 내로 원활히 도입시켜 뇌허혈 등 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제로 이용할 수 있다.

글리옥살레이즈, 융합단백질, 뇌허혈 손상, 신경세포 사멸

Description

세포 침투성 글리옥살레이즈 융합단백질 및 이를 함유하는 약제학적 조성물{Cell transducing glyoxalase fusion protein and pharmaceutical composition containing thereof}

본 발명은 글리옥살레이즈 융합단백질 및 이를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 활성산소종 대사에 관여하는 글리옥살레이즈를 단백질수송도메인과 결합시킨 융합단백질로 제조함으로써 세포 내로 원활히 도입시켜 뇌허혈 등 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제로 이용할 수 있다.

활성산소종 (reactive oxygen species)은 산소를 이용하여 에너지를 얻는 모든 생명체에서 여러 세포 내 대사과정의 부산물로 필연적으로 생성되며, 이러한 활성산소종의 유해 작용은 세포 내의 단백질, 핵산 및 지방과 같은 생체 고분자 손상과 깊게 관련되어 있다. 따라서, 활성산소종은 발암과정, 뇌졸종, 관절염, 동맥경화, 염증반응에 관여하여 정상적인 노화 과정에서도 노화를 촉진시키는 중요한 요인으로 작용한다.

생체 내에는 이와 같이 해로운 유해산소를 처리할 수 있는 방어기구가 존재하는데 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase, SOD), 카탈레이 즈(catalase), 글루타치온 퍼옥시데이즈(glutathione peroxidase)와 같은 항산화 효소들과 α-토코페롤(tocopherol), 아스코르베이트(ascorbate), 카로티노이드(carotenoide), 글루타치온, 카노신(carnosine)과 같은 유기물질들이 항산화 방어기구에 포함된다.

이 중 글리옥살레이즈(Glyoxalase, GLO)는 메틸글리옥살(Methylglyoxal, MG) 대사에 직접적으로 관여하는 단백질이다. 메틸글리옥살은 반응성 α-옥소알데하이드(oxoaldehyde)의 일종으로서, 세포 손상과 단백질 당화(protein glycation)를 유도하여 AGEs(advanced glycation end-products)를 형성한다. 이러한 AGEs들은 세포독성과 면역반응을 통하여 당뇨와 노화, 그리고 활성산소종에 의한 신경퇴행성질환에 큰 병인으로 작용하는 것으로 알려져 있다(Ma, M. and Nath, A. Molecular determinants for cellualr uptake of Tat protein of human immunodeficiency virus type 1 in brain cells. J Virol. 71:2495-2499, 1997). 이러한 메틸글리옥살 대사에 직접적으로 관여하는 글리옥살레이즈의 작용기작은 다음과 같다.

이러한 기전으로 글리옥살레이즈는 세포내의 해로운 메틸글리옥살을 효과적으로 제거하여 활성산소종에 의한 세포 내의 손상을 막아주는 역할을 한다 (Paul J. THORNALLEY. The Glyoxalase system : new developments towards functional characterization of a metabolic pathway fundamental to biological life. Biochem. J. (1990) 269, 1-11).

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나, 단백질은 크기나 여러 가지 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있 다.

인간면역결핍 바이러스 (Human Immunodeficiency Virus type-1) 단백질의 일종인 Tat(Transactivator of transcription) 펩타이드는 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 기능은 Tat 펩타이드의 중간부위인 단백질 형질도입 부위(Protein transdcution domain)의 특성 때문에 나타나며 아직까지 정확한 기전은 알려지지 않은 상태이다. 그러나, Tat 단백질의 세포막 통과에는 특정 수용체나 운반체가 관여하지 않는 것으로 보이며 Tat 단백질의 단백질 형질도입 부위가 직접 막의 지질 이중충과 작용함으로써 일어나는 것으로 이해되고 있다. 최근의 많은 연구에서, 이형단백질을 HIV-1 Tat 단백질과 융합시켜 투여하였을 때 세포 및 조직 내로 직접 운반된다는 것을 보여 주었다.

그러나, 모든 단백질이 Tat 단백질 수송 도메인과 융합단백질을 이루어 세포 내로 투과될 수 있는 것은 아니다. 2001년, 2004년 그리고 2007년에는 Tat 형질도입부위와 결합시킨 단백질이 세포 내로 도입은 되었으나 활성을 나타내지 않는는 연구결과가 논문으로 발표된 사실이 있다(Sengoku, T. et al. Experimental Neurology 188(2004) 161-170, Falnes P.O. et al. Biochemistry 2001 Apr 10;40(14):4349-4358, Daniele Peroni et al., Neuroscience letters 421(2007) 110-114 등). 즉, 상기 참고논문들을 통하여 세포도입이 용이하지 않은 단백질에 Tat 형질도입부위를 융합시킨다고 해서 융합된 모든 단백질이 세포 내로 도입된 후 원활한 활성을 나타내지는 못하고 있음을 알 수 있다.

본 발명의 목적은 당뇨, 신경 퇴행성 질환, 신경질환 등의 치료 및 예방에 유용한 글리옥살레이즈 단백질을 세포 내로 효율적으로 도입할 수 있는 방법을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 당뇨, 신경 퇴행성 질환, 신경질환 등의 예방 또는 치료제로서 사용가능한 글리옥살레이즈 융합단백질을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 세포 투과성 글리옥살레이즈 융합단백질을 주요성분으로 포함하는 당뇨, 신경 퇴행성 질환, 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하려는 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명의 목적은 상기 세포 투과성 글리옥살레이즈 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품 조성물을 제공하려는 것이다.

사람 면역결핍 바이러스(HIV-1)의 Tat 단백질이 이형 단백질을 세포 내로 이동시키는데 운반체로써 이용될 수 있다는 것이 여러 연구자들에 의하여 밝혀졌다. 따라서 본 발명에서는 이러한 Tat 단백질이 당뇨, 신경질환 및 신경퇴행성 질환 등에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 글리옥살레이즈를 세포 내로 운반시킬 수 있는지, 운반된 Tat-글리옥살레이즈 융합단백질이 세포 내에서 단백질의 기능을 나타내는지를 알아보고자 수행하였다.

본 발명에서는 단백질을 세포 및 조직 내로 운반하는 HIV-1 Tat 펩타이드를 외부 단백질인 사람 글리옥살레이즈에 융합시켰고, 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, Tat-GLO 융합단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 Tat-GLO 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 GLO cDNA, Tat 펩타이드 (9 아미노산) 그리고 6개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 Tat-GLO 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켜 Ni²⁺-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. Tat-GLO 융합단백질의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다.

또한, 본 발명자들은 정제된 융합단백질이 효과적으로 생물학적인 활성을 지니고 있으며, 세포 내로 운반된다는 것을 배양된 신경세포 및 동물실험을 통하여 확인하였다. 그리고, Tat-GLO 융합단백질이 신경 세포 내로 운반되며 신경 세포사를 효과적으로 보호함을 밝혀냈다. 즉, 배양된 신경세포에 정제된 Tat-GLO 융합단백질이 농도 및 시간 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏 방법으로 확인하였다. 또한, 세포 내로 투과된 Tat-GLO 융합단백질은 세포 내에서 최소 48시간 지속적으로 유지되었다. 또한 세포 내로 투과된 Tat-GLO 융합단백질은 메틸글리옥살과 H₂O₂에 의한 세포사를 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명하면, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 먼저 Tat-글리옥살레이즈 융합단백질을 과대 발현시키고 쉽게 정제할 수 있 는 Tat-글리옥살레이즈 발현 벡터를 개발하였다. 이 발현 벡터는 인간 글리옥살레이즈, Tat 형질도입 부위의 9개 아미노산(Tat 49-57), 그리고 아미노산 말단부분에 6개의 히스티딘 잔기를 발현시킬 수 있는 cDNA를 포함하고 있다.

이 발현벡터를 이용하여 Tat-글리옥살레이즈 융합단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며 Ni-친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양된 세포에 Tat-글리옥살레이즈 융합단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 세포 내로 투과된 Tat-글리옥살레이즈 융합단백질은 세포 내에서 최소 48시간 지속적으로 유지되었으며, 메틸글리옥살과 과산화수소에 의한 세포사를 억제하였다.

이러한 결과는 Tat-글리옥살레이즈 융합단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 글리옥살레이즈의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 Tat-글리옥살레이즈 융합단백질은 활성산소종과 관련된 증세 또는 질병 및 뇌허혈 등의 신경질환에 응용할 수 있는 가능성을 제시해 준다.

Tat-글리옥살레이즈(이하 "Tat-GLO"와 혼용함) 융합단백질을 포함하여 수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 천식에 적용하는 경우에는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 널리 알려진 바와 같이 흡입 방식이나 스프레이 방식의 제제로 제형화할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 Tat-GLO 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 알츠하이머병과 같은 신경 퇴행성 질환, 뇌허혈과 같은 신경질환의 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 Tat-GLO 융합단백질을 유효성분으로 하며, 당뇨, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 알츠하이머병과 같은 신경 퇴행성 질환 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 Tat-GLO 융합단백질을 유효성분으로 하는 화장료 조성물을 비롯한 피부 노화 예방 및 개선용 외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 융합단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 Tat-글리옥살레이즈 융합단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 융합단백질은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명은 또한 글리옥살레이즈 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 글리옥살레이즈 단백질 분자의 세포 내 전달은 HIV Tat 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 aa 49-57의 아홉 개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 5와 같은 아미노산 서열로 이루어진 HIV Tat 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 5의 Tat 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Tat의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 7~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 다수 포함하는 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 Tat-GLO 융합단백질, 이 융합단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 이 융합단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물, 건강 기능성 식품 등에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"Tat-GLO 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 글리옥살레이즈를 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질(즉, 본 발명에서는 글리옥살레이즈를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Tat-글리옥살레이즈", "GLO 융합단백질" 또는 "Tat-GLO"와 혼용하였다.

"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함 하며, 본 발명에서는 글리옥살레이즈 Ⅰ 및/또는 Ⅱ를 의미한다.

"융합단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.

또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.

본 발명에서의 "수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명은 9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 글리옥살레이즈의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 글리옥살레이즈 융합단백질을 제공한다.

또한, 본 발명에서 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질의 그 아미노산 서열이 서열번호 9 또는 11과 같은 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 글리옥살레이즈 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 상기 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합되어 글리옥살레이즈 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또한, 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드는 그 염기 서열이 서열번호 8 또는 10과 같은 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 발현시키기 위한 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 글리옥살레이즈 융합단백질 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 글리옥살레이즈 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 신경 퇴행성 질환 또는 당뇨의 예방 및 치료제로서 사용되는 약제학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 글리옥살레이즈 융합단백질을 유효성분으로 하며, 신경 퇴행성 질환 또는 당뇨의 예방 및 개선 효과가 있는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 9~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 포함하는 단백질 수송 도메인이 글리옥살레이즈 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포도입성(cell-transducing) 글리옥살레이즈 융합단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.

예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한, 본 발명은 글리옥살레이즈 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포도입성 융합단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.

본 발명의 결과는 Tat-GLO 융합단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 글리옥살레이즈 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 Tat-GLO 융합단백질은 활성산소종에 의한 다양한 질환 치료 분야에 다양하게 응용될 가능성을 제시해 준다.

이하, 본 발명의 구성을 아래의 실시예의 기재를 통하여 좀더 상세히 알아본다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에만 한정된 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 자명하다.

재료 및 방법

1) 재료

제한 효소와 T4 DNA 리가아제는 Promega(USA)에서 구입하였고, Pfu 중합효소는 stratagene(USA)에서 구입하였다. Tat 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer(USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa (Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-나이트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우는 Qiagen (Germany)에서 구입하였다. 사람 글리옥실레이즈(Glyoxalase) I과 Ⅱ cDNA는 중합효소 연쇄반응 방법으로 사람 간 cDNA 라이 브러리에서 분리하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.

<실시예 1: 재조합 Tat-GLO 융합단백질의 발현벡터 제조 및 형질변환>

기능을 가진 단백질을 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포 내로 목표단백질을 전달할 수 있는 융합단백질 발현벡터를 제조하였고, Tat 펩타이드가 단백질을 세포 내로 전달하는 능력을 용이하게 분석하기 위하여 인간 글리옥실레이즈 I과 글리옥실레이즈 Ⅱ(이하 "GLO I"과 "GLO Ⅱ"라는 약칭과 혼용함) 단백질을 선택하였다.

먼저, 글리옥실레이즈 융합단백질을 생산하기 위해 Tat 펩타이드 (RKKRRQRRR; 9 아미노산)가 포함된 pET-Tat 발현벡터를 제조하였다. Tat 펩타이드에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드(윗사슬, 5'-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3'; 아래 사슬, 5'-CCTTCTTCGCCTCTGTCGCTGCTTCTGAGCT-3')를 NdeⅠ-XhoⅠ 제한효소로 자른 pET-15b에 연결하여 삽입하였다. 이어, 사람 글리옥실레이즈 cDNA 서열을 기본으로 하여 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. GLO I의 정방향 프라이머는 5’-CTCGAGATGGCAGAACCGCAGCCCCCGTCC-3', GLO II의 정방향 프라이머는 5’-CTCGAGATGAAGGTAGAGGTGCTGCCTGCC-3'로 XhoⅠ 제한부위를 지니고 있으며 GLO I의 역방향 프라이머는 5’-GGATCCCTACATTAAGGTTGCCATTTTGTT-3', GLO II의 역방향 프라이머는 5’-GGATCCTCAGTCCCGGGGCATCTTGAACTG-3'로 BamHⅠ 제한부위를 갖고 있다.

중합효소 연쇄반응(PCR)은 온열순환기(Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행 하였다. 반응 혼합액을 50㎕ 실리콘 반응튜브에 넣고 94℃에서 5분간 가열한 후 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 그 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Sandiego, USA)에 연결한 다음, 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질변환시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균법으로 분리하였다. 사람 GLO cDNA가 포함된 TA 벡터를 XhoⅠ과 BamHⅠ로 절단한 다음 Tat 발현벡터에 삽입하였다. Tat-GLO로 형질변환된 E. coli BL21 (DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 100㎖ LB 배지에 접종하고 IPTG(0.5 mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 Tat-GLO의 과대발현을 유도하였다. 과대발현된 Tat-GLO는 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

<실시예 2: 재조합 GLO 융합단백질들의 발현 및 정제>

본 연구실에서 제조한 인간 GLO cDNA가 포함되어 있는 이.콜라이 BL21 (DE3) 세포 (Tat-GLO)를 암피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액내의 박테리아 농도가 O.D₆₀₀ = 0.5~1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5mM 되게 한 다음 37℃에서 4시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5㎖ 용균완충액(10mM 이미다졸, 0.3M NaCl, 50mM 인산나트륨, pH 8.0)을 넣고 초음파 분쇄기로 분쇄 (sonication)하였다. 원심 분리하여 상층액을 즉시 Ni²⁺-나이트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 (Ni²⁺-nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 용균 완충액과 6배 부피의 세척완충액(20mM 이미다졸, 0.3M NaCl, 50mM 인산나트륨, pH 8.0)으로 세척한 다음 용출완충액(250mM 이미다졸, 0.3M NaCl, 50mM 인산나트륨, pH 8.0)으로 융합단백질을 용출하였다. 이어, 융합단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다.

정제된 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드 방법으로 측정하였다.

<실시예 3: 신경 세포배양 및 GLO 융합단백질의 세포내 투과>

신경세포는 37℃에서 95% 공기와 5% CO₂를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 5mM NaHCO₃, 10% 우태혈청(FBS) 및 항생제(100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다.

GLO 융합단백질의 세포내 투과를 관찰하기 위하여, 신경 세포를 6-웰 플레이트에서 4~6시간 동안 키운 뒤 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체하고, 재조합 GLO 융합단백질을 배양액 내에 처리하였다. 한 시간 뒤, 세포를 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 처리하고 인산 완충액 생리식염수 (phosphate buffered saline; PBS)로 충분히 세척하였다. 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 GLO의 양을 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다.

<실시예 4: 웨스턴 블랏 분석>

Tat-GLO 융합단백질의 세포내 투과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 방법을 수행하였다. 단백질을 정제한 후 준비된 신경세포에 Tat-GLO 융합단백질(0.5~3μM)의 융합단백질을 처리한 다음 1시간 후, 세포들만 모아서 웨스턴블랏을 수행하였다. 세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아마이드 젤로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 나이트로셀룰로스 막을 5% 탈지분유(non-fat dry milk)가 들어 있는 PBS로 블로킹하였다. 이어 멤브레인은 래빗 항히스티딘 폴리클론 항체(Santacruze, USA, 1:1,000)로 1시간 처리하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 마우스 항-래빗 IgG 항체 (1:10,000 희석)와 1 시간 반응시켰다. 최종적으로 ECL 키트(ECL; Amersham)를 이용하여 사람 GLO 단일클론항체에 반응하는 단백질 띠를 확인하였다.

<실시예 5: 공촛점 현미경 관찰>

GLO 융합단백질의 신경 세포내 투과를 현미경상으로 직접 확인하기 위해 공촛점 현미경(Confocal Microscopy)을 이용하여 관찰하였다. 커버 글래스 위에 신경세포를 12시간 배양하고 배양된 신경세포에 3μM의 Tat-GLO I 과 Tat-GLO Ⅱ를 처리하였다. 처리한 세포는 신선한 PBS로 두 번 세척하고, 세척된 세포는 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 5분 고정하였다. 고정된 세포를 다시 PBS로 세 번 세척하고 3% BSA, 0.1% Triton X-100이 포함된 용액으로 1시간 투과 가능하도록(permeabilization) 처리한 후 다시 PBS로 세 번 세척하였다. 세척된 세포는 항 히스티딘 폴리클론 항체(1:500)로 3시간 반응시키고 다시 PBS로 세 번 세척한 뒤 Alexa 488 형광물질이 결합된 마우스 항-래빗 IgG 항체 (1:1,000 희석)와 1 시간 반응시켰다. 다시 PBS로 세 번 세척 후 1㎍/㎖의 DAPI를 PBS에 희석하여 상온에서 2분 반응 후 공촛점 현미경을 이용하여 세포내 투과된 GLO 융합단백질을 관찰하였다.

<실시예 6: 신경세포로 투과된 GLO 융합단백질의 안정성>

세포 내로 투과된 GLO 융합단백질의 세포내 안정성을 측정하기 위하여, 신경세포를 6-웰 플레이트에서 4~6시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1㎖의 신선한 배양액으로 교체하고 GLO 융합단백질을 배양액 내에 처리하였다. 처리 1시간 후 세포를 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 충분히 세척하였다. 이어 FBS가 포함된 배지를 넣고 계속 배양하면서, 시간별 (1~72시간)로 세포를 모아 세포 내에 남아 있는 융합단백질의 양과 활성을 웨스턴 블랏팅과 활성도 분석으로 측정하였다.

<실시예 7: 세포사멸 억제 효과>

메틸글리옥살(Methylglyoxal; MG)과 과산화수소(H₂O₂)로 유도한 세포사에 대한 억제 효과를 측정하기 위해 신경세포를 6-웰 플레이트에서 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1㎖의 신선한 배양액으로 교체하고 GLO 융합단백질을 배양액 내에 처리한 후 메틸글리옥살과 과산화수소를 투여하였다. 투여 후 세포사를 MTT 측정법으 로 확인하였다.

<실시예 8: 실험 동물의 전뇌의 뇌허혈 유도>

몽고 저빌(Mongolian gerbils)(Meriones unguiculatus)은 한림대학교 실험 동물부에서 제공되는 것을 사용하였다. 23℃, 습도 60%, 그리고 고정적으로 12시간의 빛과 음식물이 제공되는 곳에서 사육되었다. 이것은 세계에서 현재 통용되고 있는 동물보호법에 따른 것이다. 수컷 저빌의 무게가 65~75g일 때 일반적으로 2.5% 이소플루란(Abbott Laboratories Ill. USA)에 33% 산소 그리고 67% 아산화질소(nitrous oxide)를 섞은 것으로 마취했다. GLO 융합단백질을 조직침투시켜서 허혈에 의한 손상에 대해 얼마나 보호 효과가 있는지 알아보았다. GLO 융합단백질을 5mg/kg의 농도로 투여하고 저빌의 온목동맥(common carotid arteries)을 30분간 폐색(occlusion)시켰다. 이것은 목의 정중앙을 절개하고 그 안에 존재하는 혈관을 폐색한 것이다. 일반 경동맥(Common carotid arteries)을 신경 섬유들로부터 격리시켜 폐색을 시켰다. 그리고 외상이 크게 남지 않게 하기 위해 동맥류 클립(aneurysm clips)을 이용하였다. 혈류를 폐색시켰을 때, 검안경(ophthalmoscope)을 이용하여 혈압을 주의 깊게 관찰하였다. 그 후 5분 동안 폐색하고 동맥류 클립을 제거하였다. 그리고 폐색에 대해 혈압이 회복되는 것을 검안경으로 확인하였다. 또한, 섐 처리로 정상 일반 경동맥을 폐색시키지 않고, 외과적인 절차를 제외하고 얼마나 영향을 받는지 확인해 보았다. 외과적인 수술 후 국소 마취로부터 완전히 회복될 때까지 직장내 온도(rectal temperature)를 37±0.5℃로 유지 및 관찰하였다. 4일과 7일 후 허혈-재관류 (ischemia-reperfusion)하고 섐 처리 대조군, 담체 처리군, GLO I 융합단백질 처리군, Tat-GLO Ⅱ 융합단백질 처리군으로 나눠, 안락사시켜 크레실 바이올렛으로 염색하였다.

<실시예 9: GLO 융합단백질의 조직 투과 후 허혈 손상에서의 세포 생존 효과>

모든 동물은 pentobarbital sodium, perfused transcardilly한 PBS(pH7.4)와 0.1 M PBS (pH 7.4)안에 4% 파라포름알데하이드로 섐-처리군, 담체 처리군과 Tat-GLO I 융합단백질 처리군, Tat-GLO II 융합단백질 처리군을 마취하고 4일과 7일 후에 수술하였다. 뇌를 고정액으로 4시간 동안 고정시켰다. 뇌 조직에 동결 방지를 위해 30% 수크로즈를 하루 동안 침투시켰고 그 후 조직을 얼려 절편화시킨 것을 저온유지장치(50㎛)에서 저온을 유지하였다. 연속적으로 절편화한 것을 PBS가 포함된 6-웰 플레이트에 수집하였으며 자유롭게 떠다니는 형태의 절편들을 슬라이드 글라스 위에 공기건조(air-dried)시켜 크레실 바이올렛 초산(cresyl violet acetate)으로 염색하였다.

<실시예 10: F-JB 조직형광기법(histofluorescence) 염색>

신경퇴화시킨 절편을 플루오로제이드 B(Fluoro-Jade B; F-JB)로 염색하여 ischemia 손상에서 GLO 융합단백질의 효과를 확인하였다. 먼저 절편을 1% NaOH를 넣은 80% 에탄올 용액에 담근 후 70% 에탄올 용액에 담갔다. 그 후 0.06% 과망간산 칼륨에 옮기고 0.0004% 플루오로제이드 B(Histochem, Jefferson, AR, USA) 염색 용액을 스며들게 하였다. 그리고 절편을 씻어서 따뜻한 슬라이드 글라스 위에 올려놓고 형광현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 신경퇴화된 것을 확인하였다.

결과 1: GLO 융합단백질의 과대발현 및 정제

GLO 융합단백질을 과대발현시키기 위해 사람 GLO cDNA, Tat 펩타이드(RKKRRQRRR; 9아미노산) 및 6개의 히스티딘이 연속적으로 포함되어 있는 Tat-GLO 발현 벡터를 개발하였다(도 1).

IPTG로 융합단백질의 과대발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 도 2는 Tat-GLO의 과대발현과 정제된 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 단백질 띠와 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. 도 2의 레인 2는 0.5 mM IPTG를 처리하여 과대발현된 융합단백질을 나타내고 있으며, 대조군인 레인 1(pET-15b 벡터)과 비교하여 매우 높은 농도의 융합단백질이 과대발현되었음을 잘 보여주고 있다.

GLO 융합단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피(immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합단백질을 순수하게(순도〉95%) 정제하였다 (도 2). 도 2의 레인 3은 정제된 GLO 융합단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 확인한 결과이다.

과대발현 및 정제된 GLO 융합단백질을 웨스턴 블랏 분석으로 다시 한 번 확 인하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, GLO 또는 6x히스티딘 항체에 반응하는 Tat-GLO 띠는 도 2의 단백질 띠와 동일한 위치에서 관찰되었다.

결과 2: GLO 융합단백질의 신경세포 투과

정제한 GLO 융합단백질의 신경세포 투과가 시간 및 농도에 따라 어떻게 변화되는지를 관찰하였다. 도 3에 나타낸 것처럼 GLO 융합단백질이 시간 및 농도 의존적으로 신경 세포내로 투과되는 것을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 도 3A와 도 4A는 0.5~3μM GLO 융합단백질을 1시간 동안 세포배양액 내에 처리하였을 때의 결과이고, 도 3B와 도 4B는 3μM GLO 융합단백질을 10~180분 동안 세포배양액 내에 처리하였을 때의 결과이다. GLO 융합단백질의 세포내 투과 정도를 농도별로 관찰했을 때, 농도 의존적으로 세포 내로 투과된 GLO 융합단백질의 양이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 시간별로 관찰하였을 경우 투여 30분 이내에 투과된 융합단백질을 확인할 수 있었고, 처리 시간에 비례하여 세포 내로 투과된 GLO 융합단백질의 양이 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 GLO 융합단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포내 투과가 일어남을 말해준다.

웨스턴 블랏팅을 이용한 분석뿐 아니라 공촛점 현미경을 이용하여 세포 내로 투과된 GLO 융합단백질을 직접 관찰하였다. GLO 융합단백질을 3μM 처리하였을 경우 형광 표지한 GLO 융합단백질이 세포 내에 존재함을 알 수 있었다(도 6).

신경세포 내로 투과된 GLO 융합단백질은 상당한 기간 동안 세포 내에서 안정성을 유지해야만 효과적으로 단백질 치료에 응용할 수 있다. 도 5에 나타낸 바와 같이 세포 내로 투과된 GLO 융합단백질은 시간에 따라 분해되어 단백질의 양이 점차 감소되었으나, 최소 48시간 동안 세포 내에서 존재함을 알 수 있었다. 따라서, 세포 내로 투과된 GLO 융합단백질은 최소 48시간은 안정성을 유지하고 있기 때문에 유용하게 단백질 치료에 응용할 수 있으리라 사료된다.

결과 3: GLO 융합단백질의 생물학적 기능

신경세포 내로 투과된 융합단백질은 그 고유한 활성을 유지해야만 이를 단백질 치료에 응용할 수 있다. 따라서, 세포 내로 투과된 융합단백질이 어느 정도 생물학적인 활성을 지니는지는 매우 중요한 문제이다. 따라서 정제된 GLO 융합단백질들의 생물학적 기능을 알아보기 위해 메틸글리옥살(Methylglyoxal)과 과산화수소에 의해 유도되는 세포사를 MTT 방법을 이용하여 확인하였다(도 7,8).

결과 4: GLO 융합단백질의 형질도입에 의한 뇌 허혈 손상에 대한 보호

GLO 융합단백질이 침투한 후 생체 안에서의(in vivo) 생물학적 역할을 알아보기 위해 GLO 융합단백질을 신경세포에 침투시킨 후 일시적 전뇌의 허혈을 저빌 모델에 일으켰다. 허혈(ischemia)을 일으키기 30분 전에 GLO 융합단백질을 주사했다. 4일과 7일 후에 각각 허혈 손상을 유도하고 GLO I 융합단백질 처리, GLO Ⅱ 융합단백질 처리, 담체 처리, 섐 처리 대조군(sham-operated control group)으로 나누어 크레실 바이올렛 염색을 하였다. GLO 융합단백질의 허혈 손상에 대한 보호 효과를 조직화학염색으로 확인한 결과(도 9a, b, c, d), GLO 융합단백질의 효과적인 침투와 허혈에 의한 신경 세포의 손상에 대한 효과적인 보호 능력이 있음을 나타내었다.

결과 5: 해마 CA1 지역에서의 신경 세포 사멸

플루오로제이드 B(F-JB) 조직형광(histofluorescence) 염색으로 실험결과에서 섐 처리 대조군에서 F-JB 양성 뉴런은 해마의 CA1(hippocampal CA1) 지역에서 보이지 않았다(도 9a'). 4일 후에 허혈 손상을 일으킨 군은 해마 CA1 지역에서 신경세포의 사멸 때문에 F-JB 양성 뉴런이 많은 것을 확인하였다(도 9b'). 그러나, GLO I 융합단백질과 GLO Ⅱ 융합단백질을 처리한 군의 F-JB 양성 뉴런은 해마 CA1 지역에서 상당히 감소하였다(도 9c'와 d').

도 1은 Tat-GLO I 융합단백질(A) 및 Tat-GLO Ⅱ 융합단백질(B) 제조를 위한 벡터이다. Tat-GLO 융합단백질 발현벡터 시스템 구축은 벡터 pET-15b를 기반으로 한다. 합성된 Tat 펩타이드를 NdeⅠ 및 XhoⅠ 제한부위에 클론하고, 사람 GLO cDNA를 pET-15b의 XhoⅠ, BamHⅠ 제한부위 내로 클론하였다. 발현은 IPTG를 가하여 유도하였다.

도 2는 Tat-GLO I 융합단백질(A) 및 Tat-GLO Ⅱ 융합단백질(B) 발현 및 정제를 나타낸다. 세포의 단백질 추출물 및 정제된 융합단백질을 12% SDS-PAGE 및 항래빗 폴리히스티딘 항체로 웨스턴 블랏 분석하였다. A와 B의 레인 설명: 레인 1, 유도되지 않은 Tat-GLO; 레인 2, 유도된 Tat-GLO; 레인 3, 정제 Tat-GLO.

도 3은 Tat-GLO I 융합단백질의 세포도입을 나타낸다. (A) 0.5~3μM Tat-GLO I 융합단백질을 배양배지에 가하여 60분간 배양하였다. (B) 3μM의 Tat-GLO I 융합단백질을 배양배지에 가하여 10~180분간 배양하였다.

도 4는 Tat-GLO Ⅱ 융합단백질의 세포도입을 나타낸다. (A) 0.5~3μM Tat-GLO Ⅱ 융합단백질을 배양배지에 가하여 60분간 배양하였다. (B) 3μM의 Tat-GLO Ⅱ 융합단백질을 배양배지에 가하여 10~180분간 배양하였다.

도 5는 3μM Tat-GLO I 융합단백질 및 Tat-GLO Ⅱ 융합단백질로 1~72시간 동안 선처리한 세포를 웨스턴 블랏 분석한 결과이다.

도 6은 Tat-GLO I 융합단백질 및 Tat-GLO Ⅱ 융합단백질을 성상세포로 도입하고 공촛점 현미경으로 관찰한 것이다. (A) : 대조군 (Tat-GLO 융합단백질 가하지 않음), (B) : Tat-GLO I 융합단백질 3μM 처리, (C) : Tat-GLO Ⅱ 융합단백질 3μM 처리.

도 7은 세포도입된 Tat-GLO I 융합단백질이 신경세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸다. 한 시간 동안 Tat-GLO I 융합단백질로 선처리한 신경세포를 과산화수소(A) 및 메틸글리옥살(B)에 노출시켰다. 세포생존율은 MTT를 이용한 발색 어세이로 평가하였다.

도 8은 세포도입된 Tat-GLO Ⅱ 융합단백질이 신경세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸다. 한 시간 동안 Tat-GLO Ⅱ 융합단백질로 선처리한 신경세포를 과산화수소(A) 및 메틸글리옥살(B)에 노출시켰다. 세포생존율은 MTT를 이용한 발색 어세이로 평가하였다.

도 9는 저빌 뇌 해마의 CA1 부위를 허혈손상 4일 후 및 7일 후 크레실 바이올렛(a, b, c 및 d)과 플루오로-제이드 B (F-JB) (a', b', c' 및 d')로 염색한 현미경 사진이다. 음성 대조군(a-a', 정상); 양성 대조군(b-b', 담체 주사군); Tat-GLO I 융합단백질(5mg/kg) 주사군(c-c') 및 Tat-GLO Ⅱ 융합단백질(d-d') 주사군. F-JB 염색으로는 손상된 뉴런들만 형광을 나타내었다. SO: 지향층(stratum oriens), SP: 피라미드층(stratum pyramidale), SR: 방사층(stratum radiatum). 막대 = 50μm.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Cell transducing glyoxalase fusion protein and pharmaceutical composition containing thereof <130> hallym-tatGLO <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 taggaagaag cggagacagc gacgaagac 29 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 tcgagtcttc gtcgctgtct ccgcttcttc c 31 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcgagatgg cagaaccgca gcccccgtcc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcgagatga aggtagaggt gctgcctgcc 30 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggatccctac attaaggttg ccattttgtt 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatcctcag tcccggggca tcttgaactg 30 <210> 8 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of tat-GLO I fusion protein <220> <221> CDS <222> (1)..(579) <400> 8 agg aag aag cgg aga cag cga cga aga atg gca gaa ccg cag ccc ccg 48 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Ala Glu Pro Gln Pro Pro 1 5 10 15 tcc ggc ggc ctc acg gac gag gcc gcc ctc agt tgc tgc tcc gac gcg 96 Ser Gly Gly Leu Thr Asp Glu Ala Ala Leu Ser Cys Cys Ser Asp Ala 20 25 30 gac ccc agt acc aag gat ttt cta ttg cag cag acc atg cta cga gtg 144 Asp Pro Ser Thr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Gln Thr Met Leu Arg Val 35 40 45 aag gat cct aag aag tca ctg gat ttt tat act aga gtt ctt gga atg 192 Lys Asp Pro Lys Lys Ser Leu Asp Phe Tyr Thr Arg Val Leu Gly Met 50 55 60 acg cta atc caa aaa tgt gat ttt ccc att atg aag ttt tca ctc tac 240 Thr Leu Ile Gln Lys Cys Asp Phe Pro Ile Met Lys Phe Ser Leu Tyr 65 70 75 80 ttc ttg gct tat gag gat aaa aat gac atc cct aaa gaa aaa gat gaa 288 Phe Leu Ala Tyr Glu Asp Lys Asn Asp Ile Pro Lys Glu Lys Asp Glu 85 90 95 aaa ata gcc tgg gcg ctc tcc aga aaa gct aca ctt gag ctg aca cac 336 Lys Ile Ala Trp Ala Leu Ser Arg Lys Ala Thr Leu Glu Leu Thr His 100 105 110 aat tgg ggc act gaa gat gat gag acc cag agt tac cac aat ggc aat 384 Asn Trp Gly Thr Glu Asp Asp Glu Thr Gln Ser Tyr His Asn Gly Asn 115 120 125 tca gac cct cga gga ttc ggt cat att gga att gct gtt cct gat gta 432 Ser Asp Pro Arg Gly Phe Gly His Ile Gly Ile Ala Val Pro Asp Val 130 135 140 tac agt gct tgt aaa agg ttt gaa gaa ctg gga gtc aaa ttt gtg aag 480 Tyr Ser Ala Cys Lys Arg Phe Glu Glu Leu Gly Val Lys Phe Val Lys 145 150 155 160 aaa cct gat gat ggt aaa atg aaa ggc ctg gca ttt att caa gat cct 528 Lys Pro Asp Asp Gly Lys Met Lys Gly Leu Ala Phe Ile Gln Asp Pro 165 170 175 gat ggc tac tgg att gaa att ttg aat cct aac aaa atg gca acc tta 576 Asp Gly Tyr Trp Ile Glu Ile Leu Asn Pro Asn Lys Met Ala Thr Leu 180 185 190 atg t agggatcc 588 Met <210> 9 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 9 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Ala Glu Pro Gln Pro Pro 1 5 10 15 Ser Gly Gly Leu Thr Asp Glu Ala Ala Leu Ser Cys Cys Ser Asp Ala 20 25 30 Asp Pro Ser Thr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Gln Thr Met Leu Arg Val 35 40 45 Lys Asp Pro Lys Lys Ser Leu Asp Phe Tyr Thr Arg Val Leu Gly Met 50 55 60 Thr Leu Ile Gln Lys Cys Asp Phe Pro Ile Met Lys Phe Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Phe Leu Ala Tyr Glu Asp Lys Asn Asp Ile Pro Lys Glu Lys Asp Glu 85 90 95 Lys Ile Ala Trp Ala Leu Ser Arg Lys Ala Thr Leu Glu Leu Thr His 100 105 110 Asn Trp Gly Thr Glu Asp Asp Glu Thr Gln Ser Tyr His Asn Gly Asn 115 120 125 Ser Asp Pro Arg Gly Phe Gly His Ile Gly Ile Ala Val Pro Asp Val 130 135 140 Tyr Ser Ala Cys Lys Arg Phe Glu Glu Leu Gly Val Lys Phe Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Asp Asp Gly Lys Met Lys Gly Leu Ala Phe Ile Gln Asp Pro 165 170 175 Asp Gly Tyr Trp Ile Glu Ile Leu Asn Pro Asn Lys Met Ala Thr Leu 180 185 190 Met <210> 10 <211> 812 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Tat-glyoxalse II fusion protein <220> <221> CDS <222> (1)..(807) <400> 10 agg aag aag cgg aga cag cga cga aga atg aag gta gag gtg ctg cct 48 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Lys Val Glu Val Leu Pro 1 5 10 15 gcc ctg acc gac aac tac atg tac ctg gtc att gat gat gag acc aag 96 Ala Leu Thr Asp Asn Tyr Met Tyr Leu Val Ile Asp Asp Glu Thr Lys 20 25 30 gag gct gcc att gtg gat ccg gtg cag ccc cag aag gtc gtg gac gcg 144 Glu Ala Ala Ile Val Asp Pro Val Gln Pro Gln Lys Val Val Asp Ala 35 40 45 gcg aga aag cac ggg gtg aaa ctg acc aca gtg ctc acc acc cac cac 192 Ala Arg Lys His Gly Val Lys Leu Thr Thr Val Leu Thr Thr His His 50 55 60 cac tgg gac cat gct ggc ggg aat gag aaa ctg gtc aag ctg gag tcg 240 His Trp Asp His Ala Gly Gly Asn Glu Lys Leu Val Lys Leu Glu Ser 65 70 75 80 gga ctg aag gtg tac ggg ggt gac gac cgt atc ggg gcc ctg act cac 288 Gly Leu Lys Val Tyr Gly Gly Asp Asp Arg Ile Gly Ala Leu Thr His 85 90 95 aag atc act cac ctg tcc aca ctg cag gtg ggg tct ctg aac gtc aag 336 Lys Ile Thr His Leu Ser Thr Leu Gln Val Gly Ser Leu Asn Val Lys 100 105 110 tgc ctg gcg acc ccg tgc cac act tca gga cac att tgt tac ttc gtg 384 Cys Leu Ala Thr Pro Cys His Thr Ser Gly His Ile Cys Tyr Phe Val 115 120 125 agc aag ccc gga ggc tcg gag ccc cct gcc gtg ttc aca ggt gac acc 432 Ser Lys Pro Gly Gly Ser Glu Pro Pro Ala Val Phe Thr Gly Asp Thr 130 135 140 ttg ttt gtg gct ggc tgc ggg aag ttc tat gaa ggg act gcg gat gag 480 Leu Phe Val Ala Gly Cys Gly Lys Phe Tyr Glu Gly Thr Ala Asp Glu 145 150 155 160 atg tgt aaa gct ctg ctg gag gtc ttg ggc cgg ctc ccc ccg gac aca 528 Met Cys Lys Ala Leu Leu Glu Val Leu Gly Arg Leu Pro Pro Asp Thr 165 170 175 aga gtc tac tgt ggc cac gag tac acc atc aac aac ctc aag ttt gca 576 Arg Val Tyr Cys Gly His Glu Tyr Thr Ile Asn Asn Leu Lys Phe Ala 180 185 190 cgc cac gtg gag ccc ggc aat gcc gcc atc cgg gag aag ctg gcc tgg 624 Arg His Val Glu Pro Gly Asn Ala Ala Ile Arg Glu Lys Leu Ala Trp 195 200 205 gcc aag gag aag tac agc atc ggg gag ccc aca gtg cca tcc acc ctg 672 Ala Lys Glu Lys Tyr Ser Ile Gly Glu Pro Thr Val Pro Ser Thr Leu 210 215 220 gca gag gag ttt acc tac aac ccc ttc atg aga gtg agg gag aag acg 720 Ala Glu Glu Phe Thr Tyr Asn Pro Phe Met Arg Val Arg Glu Lys Thr 225 230 235 240 gtg cag cag cac gca ggt gag acg gac ccg gtg acc acc atg cgg gcc 768 Val Gln Gln His Ala Gly Glu Thr Asp Pro Val Thr Thr Met Arg Ala 245 250 255 gtg cgc agg gag aag gac cag ttc aag atg ccc cgg gac tga 810 Val Arg Arg Glu Lys Asp Gln Phe Lys Met Pro Arg Asp 260 265 gg 812 <210> 11 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 11 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Lys Val Glu Val Leu Pro 1 5 10 15 Ala Leu Thr Asp Asn Tyr Met Tyr Leu Val Ile Asp Asp Glu Thr Lys 20 25 30 Glu Ala Ala Ile Val Asp Pro Val Gln Pro Gln Lys Val Val Asp Ala 35 40 45 Ala Arg Lys His Gly Val Lys Leu Thr Thr Val Leu Thr Thr His His 50 55 60 His Trp Asp His Ala Gly Gly Asn Glu Lys Leu Val Lys Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Leu Lys Val Tyr Gly Gly Asp Asp Arg Ile Gly Ala Leu Thr His 85 90 95 Lys Ile Thr His Leu Ser Thr Leu Gln Val Gly Ser Leu Asn Val Lys 100 105 110 Cys Leu Ala Thr Pro Cys His Thr Ser Gly His Ile Cys Tyr Phe Val 115 120 125 Ser Lys Pro Gly Gly Ser Glu Pro Pro Ala Val Phe Thr Gly Asp Thr 130 135 140 Leu Phe Val Ala Gly Cys Gly Lys Phe Tyr Glu Gly Thr Ala Asp Glu 145 150 155 160 Met Cys Lys Ala Leu Leu Glu Val Leu Gly Arg Leu Pro Pro Asp Thr 165 170 175 Arg Val Tyr Cys Gly His Glu Tyr Thr Ile Asn Asn Leu Lys Phe Ala 180 185 190 Arg His Val Glu Pro Gly Asn Ala Ala Ile Arg Glu Lys Leu Ala Trp 195 200 205 Ala Lys Glu Lys Tyr Ser Ile Gly Glu Pro Thr Val Pro Ser Thr Leu 210 215 220 Ala Glu Glu Phe Thr Tyr Asn Pro Phe Met Arg Val Arg Glu Lys Thr 225 230 235 240 Val Gln Gln His Ala Gly Glu Thr Asp Pro Val Thr Thr Met Arg Ala 245 250 255 Val Arg Arg Glu Lys Asp Gln Phe Lys Met Pro Arg Asp 260 265

Claims (10)

1. 9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 글리옥살레이즈의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 글리옥살레이즈 융합단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 하는 글리옥살레이즈 융합단백질.
3. 제1항에 있어서, 상기 글리옥살레이즈는 글리옥살레이즈 Ⅰ 또는 글리옥살레이즈 Ⅱ임을 특징으로 하는 글리옥살레이즈 융합단백질.
4. 제1항에 있어서, 상기 글리옥살레이즈 융합단백질은 그 아미노산 서열이 서열번호 9 또는 서열번호 11과 같은 것을 특징으로 하는 글리옥살레이즈 융합단백질.
5. 글리옥살레이즈 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 상기 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합되어 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 글리옥살레이즈 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
6. 제5항에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드는 그 염기 서열이 서열번호 8 또는 서열번호 10과 같은 것을 특징으로 하는, 글리옥살레이즈 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
7. 상기 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 융합단백질을 발현시키기 위하여 상기 제5항 또는 제6항의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 글리옥살레이즈 융합단백질 발현벡터.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 글리옥살레이즈 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 당뇨, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 알츠하이머병을 포함하는 신경 퇴행성 질환, 뇌허혈을 포함하는 신경질환의 예방 및 치료제로서 사용되는 약제학적 조성물.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 글리옥살레이즈 융합단백질을 유효성분으로 하며, 당뇨, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 알츠하이머병을 포함하는 신경 퇴행성 질환, 뇌허혈을 포함하는 신경질환의 예방 및 개선 효과가 있는 건강 기능성 식품 조성물.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 글리옥살레이즈 융합단백질을 유효성분으로 하며, 피부 노화 개선 효과가 있는 피부 외용제 조성물.

Images