KR20120051192A

KR20120051192A - 세포 투과성 설피레독신 융합 단백질을 포함하는 염증 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120051192A
Application number: KR1020100112498A
Authority: KR
Inventors: 박진서; 송하용; 주성미; 최수영
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2012-05-22
Also published as: KR101254004B1

Abstract

본 발명은 Srx 단백질과 단백질 수송도메인이 공유결합된 Srx 융합 단백질을 형성함으로써 세포에 적용시킬 때 용이하게 세포 내로 투과 가능한 Srx 융합 단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 본 발명의 단백질 수송 도메인은 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성되어 있으며, 대조군과 비교할 때 원활히 세포 내로 침투하여 염증 유발된 피부의 염증을 완화하고, 부종을 완화하는 효과를 거두었으며, 과산화수소에 의한 세포 사멸을 억제하였다.

Description

세포 투과성 설피레독신 융합 단백질을 포함하는 염증 예방 및 치료용 조성물{A composition containing cell-transducing sulfiredoxin fusion protein for preventing and treating inflammatory disorders}

본 발명은 세포 투과성 설피레독신 융합 단백질을 포함하는 염증 예방 및 치료용 약학 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)은 산소를 이용하여 에너지를 얻는 모든 생명체에서 여러 가지 세포 내 대사과정의 부산물로 필연적으로 생성된다. 활성 산소종은 세포 내 단백질, 핵산 및 지방과 같은 생체고분자에 손상을 입히며, 인체의 여러 질병 진행과정과 깊게 관련되어 있다. 활성산소종은 특히 발암과정, 뇌졸중, 관절염, 동맥경화, 방사선 손상 및 염증반응에 관여하며 정상적인 노화과정에서도 노화를 촉진하는 중요한 요인으로 작용한다. 또한, 파킨슨병, 알츠하이머, 헌팅턴병, 치매, 간질에 이르기까지 다양한 뇌 관련 질환이 활성 산소종과 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

피부는 자외선(UV), 공기 오염 등의 유해한 환경에 지속적으로 노출된다. 활성 산소종은 아토피 피부염, 피부 자가면역질환 등의 염증성 피부질환, 피부암, 광독성, 감광성, 피부노화 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.

최근 그 기능에 대하여 활발히 연구되고 있는 항산화 효소 2-Cys 퍼옥시데이즈(Peroxidase; Prx)는 티오레독신(thioredoxin), 티오레독신 환원효소(thioredoxin reductase)와 전자 전달 시스템을 형성하는 퍼옥시데이즈(peroxidase)이다. 지금까지 포유류에서 다섯 종류의 2-Cys 퍼옥시데이즈가 밝혀졌고, 공통적으로 시스테인(cysteine) 잔기를 갖고 있다. H₂O₂ 농도를 조절하는 것으로 알려져 있는 퍼옥시데이즈는 과도한 활성 산소에 의하여 시스테인 잔기가 과산화되어 시스테인 설핀산(cysteine sulfinic acid; -SO₂) 형태의 비가역적인 불활성 상태로 가게 되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 2-Cys 퍼옥시데이즈는 최근에 알려진 단백질 설피레독신(sulfiredoxin; Srx)에 의하여 환원되어 그 기능을 회복하는 것으로 알려져 있다[S.G. Rhee, Chae HZ, Kim K. (2005) Free Radic. Biol. Med. 38, 1543-1552, Wood ZA, Schrder E, Robin Harris J, Poole LB. (2003) Trends Biochem. Sci. 28, 32-40, Biteau B, Labarre J, Toledano MB. (2003). Nature 425, 980-984.]. 이러한 퍼옥시데이즈의 산화는 염증, 암 등 다양한 질병에 관여하는 것으로 알려져 있다[Cordray P, Doyle K, Edes K, Moos PJ, Fitzpatrick FA. (2007). J. Biol. Chem. 9, 32623-9].

생체 내 고분자들은 자유 라디칼의 해로운 작용에 항상 노출되어 있기 때문에 다양한 질환에 설피레독신을 치료목적으로 이용하려는 관심이 매우 높아지고 있다. 현재 가장 주목을 받고 있는 것은 유전자 치료이다. 그러나 유전자 치료는 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 인위적으로 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 가지 문제점이 있다.

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어서 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 단백질은 크기나 여러 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600 달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

최근, 단백질의 운반 방법 중 하나로 Pep-1 펩타이드를 이용하여 자연상태의 이형 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것이 밝혀졌다. Pep-1 펩타이드는 21개의 아미노산 (KETWWETWWTEW SQP KKKRKV)으로 이루어졌고, 3개의 도메인 (hydrophobic, spacer, hydrophilic domain)을 갖고 있다. 지금까지, Pep-1 펩타이드를 이용한 연구에서는 Pep-1 펩타이드와 외부 단백질을 동시에 세포에 투여하였을 경우 자연상태로 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 치료 단백질을 비롯한 모든 종류의 단백질이 Pep-1에 의해 세포 내로 운반되는지는 아직까지 정확히 밝혀지지 않았다.

본 발명의 목적은 활성 산소종에 의하여 발생하는 염증 등의 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 제시하려는 것이다.

본 발명자들은 Pep-1 펩타이드가 여러 가지 질병과 관련성을 갖는다고 알려진 2-Cys 퍼옥시레독신의 환원에 관여하는 설피레독신 단백질을 세포 내로 운반시킬 수 있는지, 운반된 설피레독신(Srx) 융합 단백질이 세포 내에서 단백질의 기능(항염증 및 세포 보호 기능)을 나타내는지를 실험하였다.

본 발명자들은 먼저 Srx 융합 단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 Srx 융합 단백질 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 Srx cDNA, Pep-1 펩타이드 (21 아미노산) 그리고 6개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 Srx 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켜 자연상태로 Ni² ⁺-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. Srx 융합 단백질의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이런 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다. 또한, 웨스턴 블랏 방법으로 정제된 Srx 융합 단백질을 배양된 PC12 세포에 투여하는 경우 농도 및 시간 의존적으로 세포 내로 운반되는 것을 확인하였다. 세포 내로 투과된 Srx 융합 단백질은 세포 내에서 최장 24시간 지속적으로 유지되었다. 또한 세포 내로 투과된 Srx 융합 단백질은 H₂O₂에 의한 세포사멸과 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)에 의하여 유도되는 염증관련 인자인 MCP-1(Monocyte chemotactic protein-1), IL-6(Interleukin-6), MMP-9(Matrix metalloproteinase-9)의 발현 억제 및 LPS(Lipopolysaccharides)에 의한 산화질소(Nitric oxide, NO) 생성을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한 동물 수준에서도 염증 억제의 효능이 있음을 밝혀낼 수 있었다.

이러한 결과는 단백질 수송 도메인과 결합한 Srx 융합 단백질이 세포 및 조직 내로 투과가 잘 일어나고, 세포와 조직 내에서 설피레독신 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명은 Srx 융합 단백질이 다양한 암 및 염증 질환 예방, 치료 분야 및 화장료에 응용될 가능성을 제시해 준다.

세포 투과성 Srx 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주사형태, 경구투여, 도포제 형태 등으로 제형화할 수 있다. 예를 들면 액제, 시럽제, 캡슐제, 과립제, 분말, 연고, 에멀젼, 겔, 크림 등으로 제제화할 수 있으며, 이를 여러 경로로 투여할 수 있다. 여러 가지 제형 중 예컨대, 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체에는 유당, 포도당, 자당, 소르비톨, 마니톨, 전분, 검 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미세결정 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등이 포함된다. 상기 조성물에는 또한 윤활제, 웨팅제, 풍미제, 유화제 및 방부제 등이 더 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 피하 투여, 근육 투여 또는 경구투여, 정맥 투여, 피부 도포 등으로 투여할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~100㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명자들은 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 피부 세포에 침투실험한 결과, 세포에 원활하게 침투하고, 염증을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 약제 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.

본 발명은 Srx 단백질을 피부 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 Srx 단백질 분자의 세포내 전달은 Srx에 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 세포투과성 수송도메인이 공유결합된 형태의 융합 단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 21개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 3과 같은 아미노산 서열로 이루어진 Pep-1 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 Pep-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Pep-1의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Pep-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일?유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합 단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증 질환 치료, 예방 목적의 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 비롯한 피부 외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 세포 투과성 Srx 융합 단백질은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화할 수 있다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

" 세포 투과성 Srx 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인과 Srx 단백질을 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자(cargo molecule, 즉 본 발명에서는 Srx를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Pep-1-Srx", "Srx 융합 단백질" , "세포 투과성 Srx 융합 단백질" 또는 "PEP-Srx"와 혼용하였다. 또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다. 구체적으로 본 발명에서는 피부 세포를 의미한다.

본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 펩타이드, 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 Pep-1 펩타이드(서열번호 3)를 말한다.

본 명세서의 "목표 단백질"은 Pep-1 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미하며, 구체적으로는 Srx를 의미한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명은 15?30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인이 Srx 단백질의 N 말단 및 C 말단 중 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성(cell-transducing) Srx 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 Srx 융합 단백질이 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 수송도메인이 Srx 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 공유결합된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 Srx 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 염증 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 Srx cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포 투과성 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 융합 단백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 설피레독신 융합 단백질은 시간 및 농도 의존적으로 세포 내로 운반되었으며, 운반된 융합 단백질은 최장 24시간 동안 유지되었다.

또한, 본 발명의 설피레독신 융합 단백질은 과산화수소에 의한 세포 사멸을 억제하였고, 뿐만 아니라, 동물 실험에서 염증을 억제 및 개선하는 효과를 나타내었다.

도 1은 Pep-1-Srx 융합 단백질 제조를 위한 발현 벡터의 모식도이다. Pep-1-Srx 발현 벡터 구축은 벡터 pET-15b를 기반으로 하였다. 합성 Pep-1 올리고머를 pET-15b 벡터의 Nde Ｉ 및 Xho Ｉ 제한부위 사이에 클론하고, 사람 Srx cDNA는 Xho Ｉ 및 BamH Ｉ 제한부위 사이에 클론하였다.
도 2는 발현된 Pep-1-Srx 융합 단백질을 발현, 정제 및 웨스턴 블랏팅한 결과이다. 세포에서 추출한 단백질 추출물 및 정제한 단백질을 12% SDS-PAGE로 전개하여 쿠마시 브릴리언트 블루로 단백질 염색하였고(A), 항-래빗 폴리히스티딘 항체로 웨스턴 블랏팅하였다(B). A와 B에서 각 레인은 다음과 같다. 레인 1: 유도되지 않은 pPep-1-Srx 융합 단백질, 레인 2: 유도된 pPep-1-Srx 융합 단백질, 레인 3: 정제된 pPep-1-Srx 융합 단백질.
도 3은 농도별, 시간별 Pep-1-Srx 융합 단백질의 세포 도입을 나타내는 사진이다. (A) 0.5~5μM의 Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질을 배양 배지에 한 시간 동안 가하였다. (B) 5μM의 Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질을 5~60분 동안 배양배지에 가하였다. (C) 3μM의 Pep-1-Srx 융합 단백질로 미리 처리한 세포를 1~48시간 동안 배양한 다음 웨스턴 블랏 분석하였다.
도 4는 PC12 세포 생존률에 미치는 세포 도입 Pep-1-Srx 융합 단백질의 영향을 나타내는 그래프이다. 1-5μM Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 5μM Srx 단백질로 한 시간 동안 미리 처리한 PC12 세포에 800μM H₂O₂를 24시간 동안 처리하였다. 세포 생존률은 MTT를 이용한 발색 어세이로 측정하였다.
도 5는 LPS로 처리한 RAW 264.7 세포에서 Pep-1-Srx 융합 단백질이 산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다. Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질 한 시간 선처리 수행 또는 선처리 없이 RAW 264.7 세포를 LPS(100ng/ml)로 18시간 동안 자극한 다음 RAW 264.7 세포 배양 배지를 수확하였다. 배양 배지의 산화질소 수준은 그리스 반응(Griess reactions)에 기반한 방법을 이용하여 결정하였다.
도 6은 HaCaT 세포에서 TNF-α에 의해 유도되는 MCP-1, IL-6 및 MMP-9 발현에 미치는 Pep-1-Srx 융합 단백질의 영향을 나타내는 그래프이다. HaCaT 세포는 각각 1, 2 및 5M Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 5M Srx 단백질로 한 시간 동안 처리한 다음 TNF-α로 24시간 처리하였다. 배양 배지 일부를 채취하여 MCP-1(A), IL6(B) 및 MMP-9(C)의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다.
도 7은 TPA에 의해 유도된 귀 염증에 대한 Pep -1- Srx 융합 단백질의 영향을 나타내는 그래프이다. ICR 마우스(각 그룹별로 다섯 마리씩)의 귀를 TPA(1㎍/귀)로 하루에 한 번씩 3일간 처리했다. TPA 처리 한 시간 후 PBS(phosphate buffered saline) 또는 Pep-1-Srx 융합 단백질을 3일간 국부 처리하였다. 마우스는 최종 처리 24시간 후 희생되었다. TPA에 의해 유도된 귀 부종에 대한 Pep-1-Srx 융합 단백질 국부 처리 효과는 귀 두께(A) 및 귀 중량(B) 변화를 측정하여 분석하였다.

이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 실시예의 기재범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 세포 투과성 Srx 융합 단백질로서 "Pep-1-Srx" 융합 단백질을 위주로 실시예 및 그 결과를 기재하였으나, Srx 단백질의 C-말단에 Pep-1이 공유결합된 Srx-Pep-1 융합 단백질(서열번호 9) 및 Srx 단백질의 N-말단과 C-말단에 Pep-1이 공유결합된 Pep-1-Srx-Pep-1 융합 단백질(서열번호 11)도 "Srx 융합 단백질" 범주에 속하며, 각 실시예에서 "Pep-1-Srx" 융합 단백질과 거의 유사한 정도(71~93%)의 결과를 나타내었다.

<재료>

제한 효소와 T4 DNA 라이게이즈(ligase)는 Promega (USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머레이즈(polymerase)는 stratagene(USA)에서 구입하였다. Pep-1 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer (USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa (Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni² ⁺-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우(nitrilotriactic acid sepharose superflow)는 Qiagen (Germany)에서 구입하였다. 사람 설피레독신(Srx) cDNA는 PCR 방법으로 사람 간 cDNA 라이브러리에서 분리하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.

<실시예 1: 설피레독신 융합 단백질 발현벡터 제조 및 형질변환>

기능을 가진 단백질을 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포 내로 목표 단백질을 전달할 수 있는 융합 단백질 발현벡터를 제조하였고, 목표 단백질로서 인간 설피레독신(Sulfiredoxin; Srx) 단백질을 선택하였다.

먼저, Pep-1-Srx 융합 단백질을 생산하기 위해 Pep-1 펩타이드 (KETWWE TWWTEW SQP KKKRKV; 21 amino acid; 서열번호 3)가 포함된 pET-PEP 발현벡터를 제조하였다. Pep-1 펩타이드에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드 {위쪽 사슬, 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3'(서열번호 1); 아래쪽 사슬(bottom strand), 5'-TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGACACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3'(서열번호 2)}를 Nde Ｉ-Xho Ｉ 제한효소로 자른 pET-15b에 결찰(ligation)하여 삽입하였다. 이어, 사람 설피레독신 cDNA 서열을 기본으로 하여 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머는 5'-CTCGAGGGGCTGCGTGCAGGAGGAACGCTGGGC-3'(서열번호 4)로 Xho Ｉ 제한부위를 지니고 있으며 역방향 프라이머는 5'-GGATCCCTACTGCAAGTCTGGTGTGGATGCTCC-3'(서열번호 5)로 BamH Ｉ 제한부위를 포함한다.

중합효소 연쇄반응 (PCR)은 온열 순환반응기 (Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였다. 반응 혼합액을 50㎕ 실리콘 반응 튜브에 넣고 94℃에서 5분간 가열하였다. PCR 반응을 수행하였다. PCR 수행 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하여 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터 (Invitrogen, Sandiego, USA)에 연결한 다음, 세포에 형질변환시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균법으로 분리하였다. 사람 Srx cDNA가 포함된 TA 벡터를 Xho Ｉ과 BamH Ｉ으로 절단한 다음 Srx 발현 벡터에 삽입하였다. Pep-1-Srx로 형질변환된 E. coli BL21 (DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 100㎖ LB 배지에 접종하고 IPTG (0.5 mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 Pep-1-Srx의 과대발현을 유도하였다. 과대발현된 Pep-1-Srx은 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

< 실시예 2: 설피레독신 융합 단백질 발현 및 정제>

본 발명자들이 제조한 인간 Srx cDNA가 포함되어 있는 E. coli BL21 (DE3) 세포 (Pep-1-Srx)를 암피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200 rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D₆₀₀ = 0.5~1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 각각 0.5와 1mM 되게 한 다음 30℃에서 12시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5㎖ 결합 완충액 (5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)을 넣고 초음파 분쇄기로 분쇄(sonication)하였다. 원심분리하여 상층액을 즉시 Ni² ⁺-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼 플로우 (Ni² ⁺-nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합완충액과 6배 부피의 세척완충액 (60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 세척한 다음 용출완충액 (1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 융합 단백질을 용출하였다. 이어, 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다.

정제된 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드 방법으로 측정하였다.

< 실시예 3: 세포배양 및 설피레독신 융합 단백질의 세포 내 투과>

PC12, Raw 264.7 그리고 HaCaT 세포는 37℃에서 95% 공기와 5% CO₂를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 5mM NaHCO₃, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 항생제(100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다.

Pep-1-Srx 융합 단백질의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, PC12 세포를 6-웰 플레이트에서 12시간 동안 키운 뒤 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체하고, 재조합 Pep-1-Srx을 농도 및 시간별로 배양액 내에 처리하였다. 처리 후 세포를 트립신-EDTA (Gibco BRL)로 처리하고 인산 완충액 생리식염수 (phosphate buffered saline; PBS)로 충분히 세척하고 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 설피레독신의 양을 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다.

< 실시예 4: 웨스턴 블랏 >

Pep-1-Srx 융합 단백질의 세포내 투과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 방법을 수행하였다. 먼저 단백질은 자연상태로 정제하였다. 준비된 피부 세포에 Pep-1-Srx 융합 단백질(5μM)을 처리한 다음 1시간 후, 세포들만 모아서 웨스턴블랏을 수행하였다. 세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 나이트로셀룰로스 막을 5% 탈분유(non-dry milk)가 들어 있는 TBST로 블로킹하였다. 이어 막은 래빗 항-히스티딘 폴리클론 항체(Santacruze, USA, 1:1,000)로 1시간 처리하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 마우스 항-래빗 IgG 항체 (1:10,000 희석)와 1시간 반응시켰다. 최종적으로 ECL kit (ECL; Amersham) 을 이용하여 사람 설피레독신 단항체에 반응하는 단백질 띠를 확인하였다.

< 실시예 5: 피부세포로 투과된 설피레독신 융합 단백질의 안정성>

세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질의 세포내 안정성을 측정하기 위하여, 피부 세포를 6-웰 플레이트에서 12시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1㎖의 신선한 배양액으로 교체하고 Pep-1-Srx 융합 단백질을 배양액 내에 처리하였다. 처리 1시간 후 세포를 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 충분히 세척하였다. 이어 FBS가 포함된 배지를 넣고 계속 배양하면서, 시간별로 세포를 모아 세포 내에 남아 있는 융합 단백질의 양을 웨스턴 블랏으로 측정하였다.

< 실시예 6: MTT 분석>

H₂O₂에 의한 세포독성에 있어서 설피레독신 단백질의 효능을 확인하기 위하여 MTT 어세이를 수행하기 하였다. PC12 세포를 24웰에 7X10⁴으로 깔아 준 후 37℃, 7.0 % CO₂ 배양기에서 오버나잇 하였다. 다음날 PBS로 세척한 후 10% FBS( fetal bovine serum)가 함유된 배지 1㎖에 H₂O₂을 각 농도에 맞게 처리하여 준 후 18시간 동안 배양하였다. 다음날 배지를 제거한 후 1mg/ml 농도의 MTT가 포함된 RPMI 0.5ml를 넣어 준 후 3시간 배양하였다. 배양 후 색이 변한 세포에 아이소프로판올(iso-propanol)을 첨가하여 1분 동안 가볍게 흔들어 준 후 100㎕의 시료를 ELISA 판독기를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

< 실시예 7: 산화질소( NO ) 어세이 >

5X10⁵으로 깔린 Raw 264.7 세포에 Pep-1-Srx 융합 단백질을 처리한 후 한 시간 뒤에 LPS를 처리하여 18시간 동안 배양하였다. Griess reagent system을 이용하여 얻어진 상층액 내의 산화질소(Nitrite)를 측정하였다.

< 실시예 8: ELISA >

5X10⁵으로 깔린 HaCaT 세포에 PEP-Srx를 처리한 후 1시간 뒤에 TNF-α를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 얻어진 상층액에서 존재하는 염증관련 분자(MCP-1, IL-6 및 MMP-9)의 양을 샌드위치 ELISA 방법 (ELISA, R&D system Inc, USA)을 이용하여 실험을 수행하였다. 먼저 캡처 항체(capture Ab; mouse anti-human MCP-1, mouse anti-human IL-6 및 mouse anti-human MMP-9)를 96웰에 2㎍/㎖ 되게 넣었고 37℃에서 2시간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. 블로킹 용액(1% BSA in PBS)을 400㎕씩 넣어준 후 37℃에서 1시간 배양한 후 Srx 또는 Pep-1-Srx 융합 단백질을 처리하고 TNF-α를 처리하여 얻은 배지를 각 웰에 넣어준 후 37℃에서 2시간 배양하였다. PBST로 3회 세척한 후, detection antibody (biotinylated goat anti-human MCP-1, biotinylated goat anti-human IL-6 and biotinylated goat anti-human MMP-9)를 각 웰 당 100ng/ml 넣고, 37℃에서 2시간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였고 스트렙타비딘(streptavidin)이 결합된 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)를 200:1로 희석하여 각 웰에 50㎕씩 넣었다. 37℃에서 30분간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. TMB 용액을 50㎕ 넣고 상온에서 30분간 배양한 후 정지 용액(stop solution)을 TMB 용액과 1:1이 되게 넣어 주었다. 이후 450nm에서 흡광도를 ELISA 판독기로 측정하였다.

< 실시예 9: 동물 처리>

자성(Female) ICR 마우스(4-5주령)는 한림대학교 실험동물센터로부터 공급받았다. 마우스는 23℃ 온도와 습도 60%, 12시간 빛/어둠 싸이클 조건에서 사육되었다. TPA와 프레드니졸론(prednisolone)은 20㎕의 아세톤에 녹여 마우스 귀에 처리하였다. TPA에 의한 마우스 귀 부종에 있어서 Pep-1-Srx 융합 단백질의 효능을 확인하기 위하여 귀 두께 및 무게를 측정하였다. 마우스 귀에 TPA(1 ㎍/ear)를 1시간 동안 처리 후 Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질을 하루에 한 번 3일 동안 처리하였다. 4일째 되는 날에 귀 부종 정도를 측정하였다.

결과 1) 재조합 Pep -1- Srx 융합단백질의 과대발현 및 정제

Pep-1-Srx 융합 단백질을 과대발현시키기 위해 사람 Srx cDNA, Pep-1 펩타이드(KETWWETWWTEW SQP KKKRKV; 21개 아미노산) 및 6개의 히스티딘이 연속적으로 포함되어 있는 Pep-1-Srx 발현 벡터를 개발하였다(도 1).

IPTG로 융합 단백질의 과대발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 도 2는 Pep-1-Srx 융합 단백질을 과대발현시켜 정제된 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 단백질 띠(도 2A)와 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다(도 2B). 도 2A의 레인 2는 0.5mM IPTG를 처리하여 과대발현된 융합 단백질을 나타내고 있다.

Pep-1-Srx 융합 단백질은 N-말단에 여섯 개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피 (immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합 단백질을 자연상태로 순수하게 정제하였다.

과대발현 및 정제된 Pep-1-Srx 융합 단백질을 웨스턴 블랏으로 다시 한 번 확인하였다. 도 2B에 나타낸 바와 같이 6x 히스티딘 항체에 반응하는 Pep-1-Srx 융합 단백질 띠는 도 2A의 단백질 띠와 동일한 위치에서 관찰되었다.

결과 2) PC12 세포 내로 Pep -1- Srx 융합 단백질의 투과

자연 상태(native form)에서 정제한 Pep-1-Srx 융합 단백질의 피부 세포내 투과가 시간 및 농도에 따라 어떻게 변화되는지를 관찰하였다. 도 3에 나타낸 것처럼 자연 상태의 Pep-1-Srx 융합 단백질은 시간 및 농도 의존적으로 피부 세포 내로 투과되는 것을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 도 3A는 농도에 따라 Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질을 1시간 동안 세포배양액 내에 처리하였을 때의 결과이고, 도 3B는 5μM Pep-1-Srx 융합 단백질 또는 Srx 단백질을 시간에 따라 처리한 결과이다. Pep-1-Srx 융합 단백질의 세포내 투과 정도를 농도별로 관찰했을 때, 농도 의존적으로 세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질의 양이 증가하는 반면 세포 투과성 도메인이 없는 Srx 단백질의 경우 세포 내로 투과되지 않음을 확인하였다(도 3A). 또한, 시간별로 관찰하였을 경우 처리 시간에 비례하여 세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질의 양이 증가함을 확인하였다(도 3B). 이러한 결과로부터 Pep-1-Srx 융합 단백질은 시간 및 농도 의존적으로 세포내 투과가 일어남을 알 수 있었다.

PC12 세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질은 상당한 기간 동안 세포 내에서 안정성을 유지해야만 효과적으로 단백질 치료에 응용할 수 있다. 도 3C에 나타낸 바와 같이 세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질은 시간에 따라 분해되어 단백질의 양이 점차 감소하였으나, 최대 24시간 동안 세포 내에서 존재함을 알 수 있었다. 따라서, 세포 내로 투과된 Pep-1-Srx 융합 단백질은 최대 24 시간은 안정성을 유지하고 있기 때문에 유용하게 단백질 치료에 응용할 수 있으리라 사료된다.

결과 3) PC12 세포에서 H ₂ O ₂ 에 의한 세포 사멸에 대한 Srx 융합 단백질의 효과

여러 가지 요인에 의하여 활성산소의 생성이 증가하거나 항산화효소의 작용 감소 또는 항산화 효소가 감당할 수 없을 정도의 과도한 활성 산소의 증가는 산화적 스트레스로 작용하여 생체 내의 고분자 물질인 불포화 지방산, 단백질, DNA 등과 반응하여 다양한 기전을 통해 세포의 노화와 변형을 유도하거나 세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다. 특히 과도한 산화적 스트레스는 염증 관련 질병이나 신경세포 사멸 등에 관련된 여러 가지 질병에 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그리하여 H₂O₂에 의한 신경세포 사멸에 있어서 Pep-1-Srx 융합 단백질의 효능을 확인하여 보았다. 도 4와 같이, H₂O₂에 의한 신경세포 사멸에 있어서 Srx 단백질은 세포사멸 억제 효능을 나타내지 않는 반면, Pep-1-Srx 융합 단백질의 경우 농도 의존적으로 세포사멸 억제 효능이 있음을 MTT 어세이를 통하여 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 Pep-1-Srx 융합 단백질이 신경세포에서 H₂O₂ 에 의한 세포 사멸을 억제하고 신경세포를 보호하는 효능이 있음을 알 수 있었다.

결과 4) Raw 264.7 세포에서 LPS 에 의해 유도된 NO 의 생성에 대한 Pep -1-Srx 융합 단백질의 효과

잘 알려진 바와 같이 NO 및 TNF-a, IL-6, MCP-1, MMP-9 등과 같은 염증 관련 분자들은 다양한 염증관련 질병에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 염증 관련 질병의 예방 및 치료에 있어서 상기 염증관련 분자의 억제가 매우 핵심적인 요소라 할 수 있다. 많은 연구 결과에 의하면 LPS에 의해 유도되는 산화질소(NO)의 생성에는 활성산소종이 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, LPS에 의해서 유도된 산화질소 생성에 있어서 Pep-1-Srx 융합 단백질의 효능을 확인하기 위하여 Raw 264.7 세포에 Srx 단백질 또는 Pep-1-Srx 융합 단백질을 농도별로 처리한 후 LPS를 18시간 동안 처리하여 NO 생성을 확인하였다. 도 5와 같이 LPS에 의한 NO 생성에 있어서 Srx 단백질은 NO 생성 억제 효능이 없는 반면 Pep-1-Srx 융합 단백질의 경우 농도 의존적으로 NO 생성을 감소시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 Pep-1-Srx 융합 단백질이 신경세포에서 H₂O₂에 의한 세포 사멸억제 효능뿐만 아니라 LPS에 의한 염증관련 분자 생성을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

결과 5) HaCaT 세포에서 TNF -α에 의해 유도된 친염증성 유전자( pro -inflammatory gene ; IL -6, MCP -1, MMP -9) 발현에 있어서 Srx 융합 단백질의 억제 효과

아토피 질환이나 천식 등과 같은 염증 관련 질환들은 다양한 친염증성 유전자들이 과도한 활성산소종에 의해 발현 유도되는 것으로 알려져 있으며, 이에 대한 방어 기작으로 세포 내 다양한 항산화 효소들이 작용하는 것으로 알려져 있다. 각질세포(keratinocytes)의 경우 다양한 염증 관련 분자를 생성할 수 있는 주요 세포로 알려져 있으므로 TNF-α에 의해 유도된 친염증성 유전자인 IL-6, MCP-1 및 MMP-9 발현에 있어서 Pep-1-Srx 융합 단백질의 효능을 확인해 보았다. 도 6에서 보듯이 TNF-α에 의해 유도된 친염증성 유전자 (IL-6, MCP-1, MMP-9) 발현 증가에 있어서 Pep-1-Srx 융합 단백질을 1시간 전처리한 것에서는 친염증성 유전자 (IL-6, MCP-1, MMP-9)의 발현이 Pep-1-Srx 융합 단백질 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었으며, 세포 침투성이 없는 Srx 단백질은 TNF-α에 의해 증가된 친염증성 유전자의 발현을 감소시키지 못했다. 이러한 결과를 통하여 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의한 NO의 생성 억제뿐만 아니라 HaCaT 세포에서 TNF-α에 의한 친염증성 유전자 (IL-6, MCP-1, MMP-9)의 발현이 세포 침투성 Pep-1-Srx 융합 단백질에 의해 조절됨을 확인하였다.

결과 6) TPA (12- O - tetradecanoylphorbol -13- acetate ) 에 의해 유도된 마우스 귀 부종에 있어서 Srx 융합 단백질의 억제 효과

앞선 결과에서 보듯이, 세포 수준에서 Srx 융합 단백질의 염증 관련 분자 발현 억제 효능을 확인한바 있다(도 5 및 도 6). 이러한 Srx 융합 단백질의 염증 억제 효과가 동물 수준에서도 나타나는지를 확인하기 위하여 귀 두께 및 무게를 측정하여 마우스의 귀 부종에 미치는 영향을 실험하였다. 도 7과 같이, TPA에 의해 유도된 귀 부종에 Srx 융합 단백질을 처리한 결과, Srx 융합 단백질에 의해 유의성 있게 귀의 두께와 무게 모두 낮아져 Srx 융합 단백질이 귀 염증을 회복시키는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 Srx 융합 단백질이 인비보(in vivo) 수준에서도 염증 억제의 효과가 있음을 알 수 있었다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> A composition containing cell-transducing Srx fusion protein for preventing and treating inflammatory disorders <130> inipat-hallym-pep-srx <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 1 tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60 taaagtgc 68 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bottom strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 2 tcgagcactt tacgtttttt tttcggctga caccattcgg tccaccaggt ttcccaccag 60 gtttctttcc 70 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein transducing domain called PEP-1 <400> 3 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of human sulfiredoxin <400> 4 ctcgaggggc tgcgtgcagg aggaacgctg ggc 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of human sulfiredoxin <400> 5 ggatccctac tgcaagtctg gtgtggatgc tcc 33 <210> 6 <211> 490 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant polynucleotide coding PEP-1-Srx fusion protein <400> 6 atgaaagaaa cctggtggga aacctggtgg accgaatctc agccgaaaaa aaaacgtaaa 60 gtggctcgag atggggctgc gtgcaggagg aacgctgggc agggccggcg cgggtcgggg 120 ggcgcccgag gggcccgggc cgagcggcgg cgcgcagggc ggcagcatcc actcgggccg 180 catcgccgcg gtgcacaacg tgccgctgag cgtgctcatc cggccgctgc cgtccgtgtt 240 ggaccccgcc aaggtgcaga gcctcgtgga cacgatccgg gaggacccag acagcgtgcc 300 ccccatcgat gtcctctgga tcaaaggggc ccagggaggt gactacttct actcctttgg 360 gggctgccac cgctacgcgg cctaccagca actgcagcga gagaccatcc ccgccaagct 420 tgtccagtcc actctctcag acctaagggt gtacctggga gcatccacac cagacttgca 480 gtagggatcc 490 <210> 7 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep-1-Srx fusion protein <400> 7 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Val Met Gly Leu Arg Ala Gly Gly Thr Leu Gly Arg Ala 20 25 30 Gly Ala Gly Arg Gly Ala Pro Glu Gly Pro Gly Pro Ser Gly Gly Ala 35 40 45 Gln Gly Gly Ser Ile His Ser Gly Arg Ile Ala Ala Val His Asn Val 50 55 60 Pro Leu Ser Val Leu Ile Arg Pro Leu Pro Ser Val Leu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Lys Val Gln Ser Leu Val Asp Thr Ile Arg Glu Asp Pro Asp Ser Val 85 90 95 Pro Pro Ile Asp Val Leu Trp Ile Lys Gly Ala Gln Gly Gly Asp Tyr 100 105 110 Phe Tyr Ser Phe Gly Gly Cys His Arg Tyr Ala Ala Tyr Gln Gln Leu 115 120 125 Gln Arg Glu Thr Ile Pro Ala Lys Leu Val Gln Ser Thr Leu Ser Asp 130 135 140 Leu Arg Val Tyr Leu Gly Ala Ser Thr Pro Asp Leu Gln 145 150 155 <210> 8 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide coding Srx-Pep-1 fusion protein <400> 8 ctcgagatgg ggctgcgtgc aggaggaacg ctgggcaggg ccggcgcggg tcggggggcg 60 cccgaggggc ccgggccgag cggcggcgcg cagggcggca gcatccactc gggccgcatc 120 gccgcggtgc acaacgtgcc gctgagcgtg ctcatccggc cgctgccgtc cgtgttggac 180 cccgccaagg tgcagagcct cgtggacacg atccgggagg acccagacag cgtgcccccc 240 atcgatgtcc tctggatcaa aggggcccag ggaggtgact acttctactc ctttgggggc 300 tgccaccgct acgcggccta ccagcaactg cagcgagaga ccatccccgc caagcttgtc 360 cagtccactc tctcagacct aagggtgtac ctgggagcat ccacaccaga cttgcagtag 420 ggatccatga aagaaacctg gtgggaaacc tggtggaccg aatctcagcc gaaaaaaaaa 480 cgtaaagtg 489 <210> 9 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Srx-Pep-1 fusion protein <400> 9 Met Gly Leu Arg Ala Gly Gly Thr Leu Gly Arg Ala Gly Ala Gly Arg 1 5 10 15 Gly Ala Pro Glu Gly Pro Gly Pro Ser Gly Gly Ala Gln Gly Gly Ser 20 25 30 Ile His Ser Gly Arg Ile Ala Ala Val His Asn Val Pro Leu Ser Val 35 40 45 Leu Ile Arg Pro Leu Pro Ser Val Leu Asp Pro Ala Lys Val Gln Ser 50 55 60 Leu Val Asp Thr Ile Arg Glu Asp Pro Asp Ser Val Pro Pro Ile Asp 65 70 75 80 Val Leu Trp Ile Lys Gly Ala Gln Gly Gly Asp Tyr Phe Tyr Ser Phe 85 90 95 Gly Gly Cys His Arg Tyr Ala Ala Tyr Gln Gln Leu Gln Arg Glu Thr 100 105 110 Ile Pro Ala Lys Leu Val Gln Ser Thr Leu Ser Asp Leu Arg Val Tyr 115 120 125 Leu Gly Ala Ser Thr Pro Asp Leu Gln Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr 130 135 140 Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Val 145 150 155 <210> 10 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide coding Pep-1-Srx-Pep-1 fusion protein <400> 10 atgaaagaaa cctggtggga aacctggtgg accgaatctc agccgaaaaa aaaacgtaaa 60 gtgctcgaga tggggctgcg tgcaggagga acgctgggca gggccggcgc gggtcggggg 120 gcgcccgagg ggcccgggcc gagcggcggc gcgcagggcg gcagcatcca ctcgggccgc 180 atcgccgcgg tgcacaacgt gccgctgagc gtgctcatcc ggccgctgcc gtccgtgttg 240 gaccccgcca aggtgcagag cctcgtggac acgatccggg aggacccaga cagcgtgccc 300 cccatcgatg tcctctggat caaaggggcc cagggaggtg actacttcta ctcctttggg 360 ggctgccacc gctacgcggc ctaccagcaa ctgcagcgag agaccatccc cgccaagctt 420 gtccagtcca ctctctcaga cctaagggtg tacctgggag catccacacc agacttgcag 480 tagggatcca tgaaagaaac ctggtgggaa acctggtgga ccgaatctca gccgaaaaaa 540 aaacgtaaag tg 552 <210> 11 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep-1-Srx-Pep-1 fusion protein <400> 11 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Val Met Gly Leu Arg Ala Gly Gly Thr Leu Gly Arg Ala 20 25 30 Gly Ala Gly Arg Gly Ala Pro Glu Gly Pro Gly Pro Ser Gly Gly Ala 35 40 45 Gln Gly Gly Ser Ile His Ser Gly Arg Ile Ala Ala Val His Asn Val 50 55 60 Pro Leu Ser Val Leu Ile Arg Pro Leu Pro Ser Val Leu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Lys Val Gln Ser Leu Val Asp Thr Ile Arg Glu Asp Pro Asp Ser Val 85 90 95 Pro Pro Ile Asp Val Leu Trp Ile Lys Gly Ala Gln Gly Gly Asp Tyr 100 105 110 Phe Tyr Ser Phe Gly Gly Cys His Arg Tyr Ala Ala Tyr Gln Gln Leu 115 120 125 Gln Arg Glu Thr Ile Pro Ala Lys Leu Val Gln Ser Thr Leu Ser Asp 130 135 140 Leu Arg Val Tyr Leu Gly Ala Ser Thr Pro Asp Leu Gln Lys Glu Thr 145 150 155 160 Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg 165 170 175 Val

Claims

9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 설피레독신의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 설피레독신 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 하는 설피레독신 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 그 아미노산 서열이 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11과 같은 것을 특징으로 하는 설피레독신 융합 단백질.
설피레독신 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 상기 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합되어 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 설피레독신 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
제4항에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드는 그 염기 서열이 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10과 같은 것을 특징으로 하는, 설피레독신 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
제4항 또는 제5항의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 설피레독신 융합 단백질 발현벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 설피레독신 융합 단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 염증성 피부질환 또는 피부암의 예방 및 치료제로서 사용되는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 설피레독신 융합 단백질을 유효성분으로 하며, 피부노화 및 피부염증 개선용 화장료 조성물.