KR102192191B1 - 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 세포 투과성 펩타이드, 상기 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 보다 보툴리눔 독소에 대한 피부 투과 및/또는 세포 투과를 효율적으로 진행되도록 함으로써 상기 보툴리눔 독소와 세포 투과성 펩타이드를 융합한 세포 투과성 재조합 단백질을 통하여, 상기 보툴리눔 독소의 생체 내에서의 고유 효능을 극대화시킬 수 있는 동시에 보다 편의성을 확보함으로써, 다양한 질환 치료, 심미 또는 미용 목적을 위한 국소 작용제로 적극 활용될 수 있다.

Description

신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도{NOVEL CELL PENETRATING PEPTIDE AND USE THEREOF}

본 발명은 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 세포 투과성 펩타이드, 상기 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.

일반적으로, 보툴리눔 독소 (Botulinum Toxin, BTX)라 함은, 그람 양성 혐기성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium Botulinum)이 만들어내는 독소이며 콜린성 신경말단에 작용함으로써 아세틸콜린 (Acetylcholine)의 세포외배출(exocytosis)을 차단하여 근육의 이완 및 수축을 초래하는 메커니즘을 가지고 있다.

보툴리눔 독소는 형청형에 의해 A~G까지 7개의 신경 독소로 분류되며 순수한 보툴리눔 독소의 크기는 약 150 kDa으로 100kDa의 중쇄와 50kDa의 경쇄로 이루어져 있다.

보툴리눔 독소 경쇄는 콜린성 신경말단세포 안에 있는 세포외배출에 중요한 SNARE 복합체 중 일부 단백질을 자르는 것으로 알려져 있다. 예시로 가장 널리 쓰이는 보툴리눔 독소 A 타입의 경우 SNARE 복합체 중 SNAP-25 단백질을 자르고 보툴리눔 독소 B 타입의 경우 SNARE 복합체 중 VAMP 단백질을 자른다.

한편, 100kDa의 중쇄는 두 부분으로 나뉘는데 전체 독소가 신경세포에 결합하는 역할을 수행하는 50kDa의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain)과 보툴리눔 독소가 신경세포에 내부화 된 후 엔도좀(endosome)안에 머물러 있을 때 보툴리눔 독소 경쇄를 엔도좀 밖으로 밀어내는 역할을 수행하는 50kDa의 전좌 도메인 (translocation domain)으로 이루어져 있다.

일반적으로 클로스트리디움 보툴리눔이 보툴리눔 독소를 생산할 때 순수한 보툴리눔 독소 단백질 이외에 비독소 단백질(non-toxin)의 복합체로 구성되어 생산되며 그 크기는 신경독소의 종류에 따라 약 900kDa까지 생성된다.

보툴리눔 독소는 근육의 경련 또는 수출을 유발하는 신호를 차단하여 마비를 초래하는 작용을 하는데, 이와 같은 특성을 이용해 1989년 미국 FDA 승인 이후 피부 주름 개선의 미용 목적으로 활용되어 왔으며 치료목적으로도 활용되고 있다. 치료 목적으로는 다한증(hyperhidrosis), 편두통(migraine), 사시(strabismus), 사경(torticollis) 또는 안면 경련(blepharospasm)과 같은 신경 근육 질환에 사용되고 있고, 미용 목적으로는 주름, 찌푸린 주름 제거 및 사각턱 치료에 주사제로 사용되고 있다. 부작용으로는 연하곤란(dysphagia), 목소리 변화(voice change), 구강건조 (dry mouth) 및 몽롱(blurred vision) 등과 같은 사례들이 보고되었으나, 아직 보툴리눔 독소 처방으로 인한 직접적인 사망사고가 없어 적절하게 사용하면 매우 안전한 약품으로 평가받고 있다. 다만, 약물에 대한 과민증이 있거나, 근골격계통 질환이 있는 경우, 임산부나 수유부의 경우에는 적용에 제한이 있다.

현재 미용목적이나 치료 목적으로 보툴리눔 독소를 사용할 경우 환자들은 작용부위에 3-5개월에 한 번씩 주사를 맞아야 하며, 보툴리눔 독소에 의해 신경과 근육 사이의 신호전달이 차단되면 새로운 신경가지가 만들어져 보툴리눔 독소에 의한 신경의 마비 효과를 경감시키므로, 정기적인 처치가 필요하다.

또한, 이러한 주사제형으로 보툴리눔 독소를 자주 주입할 경우 멍, 알레르기, 상처, 혈관주사로 인한 심각한 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서 환자의 편의성을 제공할 수 있는 다른 효과적인 전달 수단을 찾을 필요성이 대두되고 있다.

한편, 외부의 환경과 항상 접하고 있는 신체 조직인 피부는 체액 누출 및 감염 방지, 수분 소실을 막는 보호 장벽으로서의 주요 기능을 담당하며, 구성은 표피, 진피 및 피하조직으로 구성되어 있다.

표피의 각질층은 피부 최외각에 존재하면서, 피부 밖으로의 수분과 전해질의 소실을 억제함으로써 피부의 건조를 막고, 피부의 정상적인 생화화적 대사를 할 수 있는 환경을 제공한다. 또한 피부 각질층은 외부의 물리적 손상과 화학물질로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하는 중요한 역할을 한다.

피부를 통한 흡수 경로는 각질층을 통한 흡수, 모낭과 피지선을 통한 흡수, 땀샘을 통한 흡수 등 3가지 경로가 있는데, 피부를 통한 활성물질의 전달은 피부의 구조적, 물리적 특성상 여러 가지 제한이 있다. 특히, 피부 각질층은 피부의 주요 구성 세포인 각질형성세포(keratinocyte)가 자연사되어 피부 최외각층에 치밀한 구조를 이루고 있으며, 땀과 각종 지질 성분으로 인하여 pH 5 부근의 산성도를 보인다. 이러한 각질층 장벽을 투과하기 위해서는 통상적으로 분자량이 1,000 이하로 작아야 하고, 친지질 특성을 보유하고 있어야 가능하다는 보고가 있다.

미용 및 의약용 원료로 빈번하게 사용되는 저분자 합성 화합물이나 또는 천연화합물들은 쉽게 세포 내로 전달될 수 있다고 알려져 있으나 단백질, 펩타이드 및 핵산과 같은 거대분자들은 분자량의 크기와 친수성 성질 때문에 이중 지질막 구조로 되어 있는 세포막 안으로 투과하기 어려우므로, 실제로 피부 장벽을 구성하는 각질층의 고유 특성으로 인해 저분자량 물질들의 투과 효율이 극히 낮으며, 고분자량 물질들의 투과 효율은 더욱 낮은 것으로 알려져 있다.

따라서, 보툴리눔 독소를 경피로 전달하기 위해서는, 이러한 피부 장벽을 투과하여, 보툴리눔 독소를 전달할 수 있는 전송체가 필수적으로 요구된다. 이러한 저분자 및 거대분자들이 세포의 원형질막을 통과하는 효율을 증폭시키기 위한 방법으로서 세포투과성 펩타이드를 적용할 수 있다.

널리 알려진 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, CPP)로는 먼저, HIV-Tat, antennapedia 등의 CPP를 예로 들 수 있는데, 주로 양전하를 띠는 30개 아미노산 미만의 짧은 길이의 펩타이드로서 단백질뿐 아니라 DNA, RNA, 지방, 탄수화물, 화합물 또는 바이러스를 세포 내로 전달할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 수용체 비의존적이고, 엔도사이토시스(endocytosis), 파고사이토시스(phagocytosis), 직접적 침투(direct penetration)등의 메커니즘으로 세포막을 투과한다고 보고되고 있다.

실제로 보툴리눔 독소의 경피 전달은 신경근육질환 치료에 효과적일 것이라고 주장하며 여러 경피 전달 경로에 대해서 소개하는 리뷰 논문인 선행기술문헌 1과 세포투과성 펩타이드 중 가장 대표적인 HIV-Tat과 보툴리눔 독소 경쇄를 세포투과성 펩타이드와 재조합 단백질화해서 피부 투과능을 확인한 선행기술문헌2 등 여러 논문에서 보툴리눔 독소와 세포투과성 펩타이드의 재조합 단백질을 새로운 치료제로서 제시하고 있다.

하지만, 가장 널리 쓰이는 HIV-Tat의 경우는 펩타이드가 바이러스에서 유래하므로, 안전성 측면에서 문제가 제기된다. 그러므로 환자의 편의성을 고려한 바르는 보툴리눔 독소 단백질 개발을 위해서 기존 CPP보다 더 우수한 세포 투과능을 가진 신규한 세포투과성 펩타이드의 개발이 필요했다.

이러한 필요에 따라, in silico 방법을 이용하여 기존 CPP에 비하여 화합물, 펩타이드 및 단백질 등 일명 화물(Cargo)의 전달 효율이 높은 가진 새로운 세포 투과성 펩타이드 13종을 개발했고 위 13종의 세포투과성 펩타이드를 화물 전달 펩타이드 (Cargo Delivery Peptide, CDP)로 명명하고, 이 중 3종의 세포투과성 펩타이드에 대한 발명을 하였다.

비특허문헌 1: Current Drug Delivery. 2018. 15(10). 1375-1380 비특허문헌 2: Applied Microbial And Biotechnology. 2016. 100(6). 2785-2795

본 발명자들은 상기 종래 기술의 문제점 해결하기 위하여, 보다 효율적으로 세포 투과 또는 피부 투과를 통하여 보툴리눔 독소를 전달할 수 있는 세포 투과성 펩타이드를 개발하였으며, 이를 이용한 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질 등과 이를 다양한 분야에 활용될 수 있음을 확인함으로써, 신규한 세포 투과성 펩타이드, 상기 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하고자 한다.

본 발명은, 상기 언급한 과제 해결을 위하여,

세포 내로 활성 분자의 운반을 매개할 수 있는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 활성 분자는 성장인자, 효소, 전사인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체, 항체 단편, 핵산, 코딩 핵산 서열, mRNAs, 안티센스 RNA 분자, microRNA, siRNA, 탄수화물, 지질 및 당지질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.

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또한, 본 발명은, 상기 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 재조합 발현 벡터는 His, FLAG, HAT, SBP, c-myc, Chitin-binding domain, Glutathione-S transferase 및 Maltose binding protein으로 이루어진 군으로 선택된 1종 이상의 친화성 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 재조합 발현 벡터는 cold shock protein A promoter, T7, Toc, BAD 및 pRha로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 조절 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

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본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 보다 보툴리눔 독소에 대한 피부 투과 및/또는 세포 투과를 효율적으로 진행되도록 함으로써 상기 보툴리눔 독소와 세포 투과성 펩타이드를 융합한 세포 투과성 재조합 단백질을 통하여, 상기 보툴리눔 독소의 생체 내에서의 고유 효능을 극대화시킬 수 있는 동시에 보다 편의성을 확보함으로써, 다양한 질환 치료, 심미 또는 미용 목적을 위한 국소 작용제로 적극 활용될 수 있다.

첨부된 도면은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은, 본 발명의 실험예 1에서 도출한 신규한 세포 투과성 펩타이드인 CDP 1 내지 CDP 13을 기존에 알려진 세포 투과성 펩타이드와 예상 세포 투과도(SVM score) 점수를 비교한 표이다.
도 2는, 본 발명에 따른 단백질 발현 벡터를 예시적으로 나타낸 도이다.
도 3은, 본 발명의 실험예 3에서 GFP-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질의 발현 및 정제를 확인하기 위하여 수행한 전기 영동 결과를 나타낸 도이다.
도 4는, 본 발명의 실험예 4에서 GFP-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질 CDP1, CDP2, CDP3의 인체피부 조직 투과능에 대한 공초점 현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 5는, 본 발명의 실험예 4에서 GFP-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질 CDP2와 기존에 알려진 세포 투과성 펩타이드 TD1의 인체피부 조직 투과능을 비교한 공초점 현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 6은, 본 발명의 실험예 4에서 GFP-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질 CDP1과 CDP2를 기존에 알려진 세포 투과성 펩타이드 HIV-Tat의 인체피부 조직 투과능을 비교한 공초점 현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 따른 신규한 세포 투과성 펩타이드, 상기 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관하여 상세히 설명하나, 상기 신규한 세포 투과성 펩타이드, 상기 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터의 권리범위는 하기 설명에 의해 제한되는 것은 아니다.

또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함한다"고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

또한, 본 명세서상에서 용어, "보툴리눔 독소"는 세균에 의해 또는 재조합 기술에 의해 생성되거나 조작된 변이체들 또는 융합 단백질을 포함하여 뒤이어 발견될 수 있는 것인지 여부에 관계없이 임의의 공지된 종류의 보툴리눔 독소를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명은 신규한 펩타이드에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 세포 투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, CPP)에 관한 것이다.

상기 세포 투과성 펩타이드는, 바람직하게는 자체로 정의된 효소 또는 치료적 생물학적 활성을 갖지 않으나, 세포막을 통해 세포 내 전송을 가능하게 하는 전송체(carrier)로써 역할을 한다. 이는 세포 내로 전송하고자 하는 cargo의 N-말단 또는 C-말단 그리고, 양말단에 부착될 수 있으며, 각각의 말단에서 정방향 또는 역방향으로 부착될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 바람직하게는 단위체(monomer)로 적용될 것이나, 이에 한정하지 않으며, 이합체(dimer) 또는 중합체(polymer) 형태의 구성으로도 이용될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 펩타이드는, 세포 내로 활성 분자의 운반을 매개할 수 있는 펩타이드일 수 있다.

이 경우, 상기 활성 분자는 성장인자, 효소, 전사인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체, 항체 단편, 핵산, 코딩 핵산 서열, mRNAs, 안티센스 RNA 분자, microRNA, siRNA, 탄수화물, 지질 및 당지질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는, 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드가 전술한 바와 같이 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 아미노산 서열로 이루어질 경우, 후술하는 바와 같이 보툴리눔 독소와의 화학적 결합을 통하여 상기 보툴리눔 독소에 대한 피부 투과 또는 세포 투과를 보다 효율적으로 하여 보툴리눔 독소의 생체 내에서의 효능을 극대화시킬 수 있으며, 다양한 용도로 활용되도록 할 수 있다.

본 발명은, 또한 재조합 단백질에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질에 관한 것이다.

본 명세서상에서 용어, "세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질"이라 함은, 세포 투과성 펩타이드과 보툴리눔 독소를 포함하며, 이들의 펩타이드 결합이나 공유 결합과 같은 화학적 결합으로 형성된 결합체를 의미할 수 있다. 즉, 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질은 세포 내로의 도입이 용이하지 않은 거대 분자인 보툴리눔 독소에 특정한 세포 투과성 펩타이드를 융합시켜 세포 투과성을 부여함으로써 보툴리눔 독소에 세포 내로 고효율로 전달할 수 있다. 하는 것이다. 이 경우, 상기 융합은 상기 보툴리눔 독소 경쇄의 카복시 말단, 아미노 말단 또는 이들 모두에 상기 세포 투과성 펩타이드가 융합될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질은, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 보툴리눔 독소; 및 상기 세포 투과성 펩타이드가 융합된 구조 또는 형태일 수 있다.

상기 보툴리눔 독소 경쇄는, 혈청형(serotype) A, B, C, D, E, F 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다. 본 발명에서, 보툴리눔 독소 경쇄는 대안적으로 보툴리눔 독소 유도체, 즉, 보툴리눔 독소 활성을 가지나 임의로 부분 또는 서열 상에 하나 이상의 변형을 갖는 화합물 일 수 있다. 예를 들어, 상기 7종의 혈청형의 보툴리눔 독소 경쇄 단백질에 대비해, 아미노산 서열 상의 결실(deletion), 수정(modification), 치환(replacement) 또는 키메라 융합(chimeric fusion) 등의 방법을 적용하여 경쇄의 endopeptidase의 활성이 유지됨과 동시에 특성을 강화하거나 부작용을 감소시키는 방법으로 변형된 형태일 수 있다. 또는 재조합 또는 화학적인 합성으로 제조된 보툴리눔 독소 경쇄 또는 보툴리눔 독소 경쇄의 일부분이 이용될 수 있다.

하나의 예시에서, 상기 보툴리눔 독소 경쇄는, 서열번호 14 또는 서열번호15의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

또 다른 예시에서, 본 발명에 따른 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질은, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 보툴리눔 독소 경쇄 펩타이드; 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 보툴리눔 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드; 및 세포 투과성 펩타이드가 순차적으로 융합된 구조 또는 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질이 전술한 구조 또는 형태를 가질 경우, 보다 보툴리눔 독소에 대한 피부 투과 및/또는 세포 투과를 효율적으로 진행되도록 함과 동시에, 상기 보툴리눔 독소의 생체 내에서의 고유 효능을 극대화시킬 수 있는 동시에 보다 편의성을 확보함으로써, 다양한 질환 치료, 심미 또는 미용 목적을 위한 국소 작용제로 적극 활용될 수 있다.

하나의 예시에서, 본 발명에 따른 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질은, 상기 세포 투과성 펩타이드와 보툴리눔 독소 경쇄 펩타이드 사이, 상기 보툴리눔 독소 경쇄 펩타이드와 보툴리눔 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드 사이, 또는 상기 보툴리눔 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드와 세포 투과성 펩타이드 사이 중 어느 하나 이상에 링커를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 링커의 종류는, 특별히 제한되는 것은 아니나, 다양한 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 예를 들어 복수의 글라이신 아미노산이 결합된 형태일 수 있고, 또는 특정 아미노산 서열로 결합된 형태일 수 있으나, 바람직하게는 특정 아미노산 서열로 결합된 형태인 것이 바람직하다.

본 발명은, 또한 상기 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.

본 명세서상의 용어, "재조합 발현 벡터"라 함은, 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 의미할 수 있다.

또한, 상기 용어, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이라 함은, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 발현벡터와의 작동 가능하게 연결되는 것은 당해 기술 분야에 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 상기 발현 벡터는, 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 박테리오 파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하지만, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 발현벡터는 프로모터(promoter), 오퍼레이터(operator), 개시코돈(initiation codon), 종결코돈(termination codon), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 발현 벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제가 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른, 상기 재조합 발현 벡터는 His, FLAG, HAT, SBP, c-myc, Chitin-binding domain, Glutathione-S transferase 및 Maltose binding protein으로 이루어진 군으로 선택된 1종 이상의 친화성 표지를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는, cold shock protein A promoter, T7, Toc, BAD 및 pRha로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 조절 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명에서는 상기 조절 유전자로서, 일반적인 조절 유전자보다 target protein이 독소 형태이므로, 특정 조건에서 발현하는 조절 유전자를 사용하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 cold shock protein A promoter를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터가 전술한 조절 유전자를 포함할 경우, 타겟 용해성 단백질(target soluble protein)을 보다 많은 양 수득하여 결과적으로 활성 단백질의 수득 효율을 극대화시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터가 조절 유전자로 cold shock protein A promoter를 포함할 경우, 온도 15℃ 정도에서도 타겟 단백질을 발현할 수 있는 반면, 동일한 온도에서 다른 cellular protein의 발현을 억제할 수 있으므로, target protein을 높은 수율과 순도로 수득할 수 있다. 또한, 이 경우 target protein의 solubility가 증가하여 활성화된 단백질도 보다 높은 수율로 얻을 수 있다.

본 발명은, 또한, 화장료 조성물에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 전술한 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 및 왁스 파운데이션 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 함유된 화장품학적으로 유효한 담체는 제형에 따라, 당업계에서 통상적으로 이용되는 담체가 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예를 들어, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 보습제, 항산화제, 방향제, 충진제, 점증제, 염료, 착색제, 계면활성제, 천연 또는 합성오일, 보존제, 침투제, 수화제, 항진균제, 유화제 용매, 연화제, 탈취제, 왁스 등을 포함할 수 있고, 선택적으로 식물추출물, 컨디셔닝제, 색소침착제 또는 미백제, 자외선차단제, 습윤제, 비타민 및 유도체 등을 포함하는, 그와 같은 제품들에서 통상적으로 이용되는 기타 성분들을 포함할 수 있다.

하나의 예시에서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 피부 유화제를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.

본 명세서상의 용어, "피부 유화제"라 함은, 유화제 중에서도 피부 투과에 영향을 주는 성분을 의미할 수 있고, 본 발명에서는 재조합 단백질의 피부 투과 및 세포 침투를 증대시키는 역할을 하는 것으로, 레시틴(Lecithin), 라우릴 피롤리돈(Lauryl Pyrrolidone), 글리세릴 모노스테아레이트(Glyceryl Monostearate), 글리세롤 모노올리에이트(Glycerol Monooleate), 글리세롤 모노라우레이트(Glycerol Monolaurate), 프로필렌 글리콜 모노라우레이트(Propylene Glycol Monolaurate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate), 소르비탄 모노올리에이트(Sorbitan Monooleate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate) 및 세틸 알콜(Cetyl Alcohol)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 글리세릴 모노스테아레이트(Glyceryl Monostearate) 또는 세틸 알콜(Cetyl Alcohol)이 바람직하다.

하나의 예시에서, 상기 피부 유화제는 전체 조성물 중량에 대하여, 0.5 중량% 이상으로 포함될 수 있다. 상기 중량 범위에서 피부 유화제를 포함할 경우, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 투과도를 극대화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 포함된 성분들을 보다 안정화시키는 당알코올을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 당알코올은 만니톨, 에리스리톨, 자일리톨, 소르비톨 등일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은, 또한 피부 주름 개선 또는 예방을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은, 전술한 바와 같이 전술한 세포 투과성 보툴리눔 독소 재조합 단백질을 유효성분으로 포함함으로써, 국부 투여될 경우 피부 주름의 개선 또는 예방 효과를 구현할 수 있다.

본 명세서상의 용어, "국부 투여(local administration)"라 함은, 약제의 생물학적 효과를 필요로 하는 동물 신체 상의 또는 체내의 부위 또는 그 부근에 약물을 직접 투여하는 것을 의미한다. 국부 투여는 정맥투여 또는 경구투여와 같은 전신적 경로의 투여는 배제한다. 국소 투여(topical administration)는 약제학적 제제를 사람의 피부에 도포하는, 즉 "바르는 형태" 또한 국부 투여의 한 형태로 포함된다. 본 발명의 조성물은 상기의 피부학적, 미용학적 원하는 효과를 위해 경피적으로 "바르는 형태"로 투여되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 구체적인 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예에 한정되는 것은 아니다.

[실험예 1] 신규한 세포 투과성 펩타이드의 제작

보툴리눔 독소 경쇄의 경피 전달을 실현시킬 수 있는 신규의 피부 투과성 및 세포 투과성 펩타이드를 개발하였다.

먼저 보툴리눔 독소 중쇄 및 경쇄의 구조와 기능을 분석하고, 세포 투과성 펩타이드가 보이는 양전하성 및 구조적으로 아미노산 길이가 11개 내지 15개일 때 가장 최적의 세포 투과도가 나타난다는 점을 확인하였다. 특히, 아르기닌(Arginine)의 세포 투과능이 제일 우수하다는 점에 착안하여, 각각 11개와 12개의 아르기닌(Arginine) 아미노산 서열이 다른 아미노산으로 치환되었을 경우, 세포 투과도의 변화를 확인하여 이를 바탕으로 세포 투과능이 우수할 것이라고 예상되는 단백질을 도출하여 상기 단백질의 아미노산 서열대로 최종 펩타이드 13종(아미노산 서열 1 내지 13)을 제작하였다.

이를 근거로 세포 투과도를 예상하는 database 프로그램을 이용하여 본 발명에서 도출한 신규한 세포 투과성 펩타이드 CDP 1~13을 기존에 알려진 세포 투과성 펩타이드와 예상 세포 투과도 점수를 비교하였고 도 1에 나타내었다.

[실험예 2] GFP-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질의 생산을 위한 재조합 발현 벡터의 제작

당사에서 자체 개발한 세포 투과성 펩타이드인 CDP1, CDP2 그리고 CDP3를 가지고 세포 투과성을 검증하기 위해 Green Fluorescent Protein(GFP)와 결합하여 GFP-CDP1, GFP-CDP2, GFP-CDP3 재조합 단백질을 실험군으로 제작하였다. 세포 투과성 단백질로 알려진 TAT (Trans-Activator of Transcription)와 GFP의 재조합 단백질 GFP-TAT 그리고 국내특허 (10-1882461)에서 세포 투과성 펩타이드로 명명하는 TD1(Translocation Domain 1)과 GFP의 재조합 단백질인 GFP-TD1을 제작하여 비교군으로 사용하였다. 또한 음성 대조군으로 GFP를 사용하였다.

사용된 GFP는 addgene사의 pCMV-GFP(#11153)에서 가져왔으며, 이를 제작된 primer를 통해 poly chain reaction(PCR) 반응으로 GFP 뒤에 세포 투과성 펩타이드를 부착하였다. 이에 대한 각각의 primer의 서열정보는 [표 1]에 나타내었다.

GFP	Forward primer	TCGAAGGTAGGCATATGGTGAGCAAGGGCGAGG
	Reverse primer	GCTTGAATTCGGATCCTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG
GFP-CDP1	Forward primer	TCGAAGGTAGGCATATGGTGAGCAAGGGCGAGG
	Reverse primer	GCTTGAATTCGGATCCTCAGCAACGGGGTTTACGCAGACGGGAACGTTTCCCCTTGTACAGCTCGTCCAT
GFP-CDP2	Forward primer	TCGAAGGTAGGCATATGGTGAGCAAGGGCGAGG
	Reverse primer	GCTTGAATTCGGATCCTCAGCATTTACGCTTACGCAAGCGCCAGATGCGGCACTTGTACAGCTCGTCCAT
GFP-CDP3	Forward primer	TCGAAGGTAGGCATATGGTGAGCAAGGGCGAGG
	Reverse primer	GCTTGAATTCGGATCCTCAGGCAGGAGCGGCGGCGCAAACGACGAATACGCAACCCCTTGTACAGCTCGTCCAT
GFP-TAT	Forward primer	TCGAAGGTAGGCATATGGTGAGCAAGGGCGAGG
	Reverse primer	GCTTGAATTCGGATCCTCATTGTGGTGGACGGCGACGCTGGCGACGTTTCTTGCGTCCCTTGTACAGCTCGTCCAT
GFP-TD1	Forward primer	TCGAAGGTAGGCATATGGTGAGCAAGGGCGAGG
	Reverse primer	GCTTGAATTCGGATCCTCAACACTGATTCAAGAATTTGTTAATGTTAATCATTGCTTTCTTGTACAGCTCGTCCAT

PCR 반응은 pCMV-GFP벡터를 template로 1㎕에 각 100pmole의 primer 0.5㎕, polymerase 0.5㎕, 2.5mM dNTP 5ul와 5X buffer를 넣고 최종 부피 50㎕에서 시작하였다. 반응조건은 95℃에서 5분간 Denaturing 시킨 후, 95℃에서 30초 56℃에서 30초 및 72℃에서 30초반응을 25회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 5분 증폭하였다. 이 PCR product를 agarose gel electrophoresis로 확인한 후, NdeⅠ과 BamHⅠ으로 잘라 준비하였다. Histidine-tag와 lac operator 그리고 cold shock protein A(cspA) promoter를 가진 발현 벡터 pColdⅠ벡터(TaKaRa #3360)에 multi cloning site(MCS)의 NdeⅠ과 BamHⅠ를 잘라 준비하고, 이 또한 agarose gel electrophoresis로 확인하였다. insert와 vector를 RT 150초 ice에서 10분 ligation하여 발현 벡터를 제작하였다. 이는 대장균 Top10 cell에 형질 전환하여 최종적인 재조합 단백질 발현 벡터를 제작하였다. 이는 코스모진텍社에 의뢰하여 진행하였다.

[실험예 3] GFP-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질의 발현 및 정제

상기 재조합 단백질을 발현하는 플라스미드를 E. coli BL21 (TaKaRa #9126)에 heat shock(42℃, 90초) 방법으로 형질 전환시켜 유전자변형생물체를 만들었다. 형질 전환시킨 균주를 10㎕ ampicillin을 포함하는 LB 배지 37℃에서 약 18-22시간 1차 배양하였다. 2차 배양으로 LB 배지 100ml에 1차 배양세포 1ml과 ampicillin 100㎕를 넣어주고 37℃에서 세포의 OD 600값이 0.6-0.8이 될 때까지 배양하였다.

0.5mM IPTG (Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside)를 넣어주면서 재조합 단백질의 발현을 유도하고 15℃, 200rpm에서 약 19시간 배양하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 세포를 Capturem™ His-Tagged Purification Maxiprep Kit (TaKaRa #635713)에서 제공하는 라이시스 완충액 (xTractor buffer)과 균질기를 이용하여 분쇄하였다. 그 다음 10,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하고, 상층액을 분리하였다.

재조합 단백질의 정제과정은 상층액을 Capturem™ His-Tagged Purification Maxiprep Kit를 이용하여 정제한 후 단백질을 cellulose membrane에 넣어주고 1L phosphate buffer를 이용하여 투석해주었다.

재조합 단백질이 제대로 정제가 되었는지 검정하기 위하여 10% SDS-PAGE 겔에서 전기 영동을 수행하였다.

상기 전기 영동의 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서, M은 "BIO_RAD standard(#161-0377)", UI는 "Uninduced", I는 "Induced", HS는 "cell harvest & supernatant", Ly는 "Lysate", P는 "pellet", FT는 "Flow Through", W는 "Column wash" 및 E는 "Elution"을 의미한다.

도 3에서와 같이, SDS-PAGE겔 상 Elution 이후에 높은 농도의 재조합 단백질이 관찰된 것으로 보아 재조합 단백질이 상기 프로토콜로 잘 정제되었음을 확인하였다.

[실험예 4] GFP-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질의 인체피부 조직 투과능

정제된 GFP-세포 투과성 펩타이드 재조합 단백질 20㎍-30㎍을 기증받은 실제 인체 피부 (HuSKIN™, HansBiomed Corp)에 4℃에서 약 24시간 도포하였다. 24시간 후 조직을 4% Paraformaldehyde로 4℃에서 24시간 고정시켜주고 4.5% sucrose, 15% sucrose, 30% sucrose를 사용하여 탈수 과정을 거쳤다.

탈수 과정을 거친 조직은 한국병리지원에 의뢰하여 마이크롬 냉동박절기를 이용하여 동결박편 (Cryosection, 20㎛)으로 제조하고, 이를 슬라이드 위에 올려 공초점 현미경(confocal microscopy)를 이용하여 GFP 형광을 관찰하였다.

관찰 결과는 각각 도 4 내지 도 6에 나타내었다.

도 4 내지 도 6에서와 같이, 본 발명에 따른 재조합 단백질의 경우, 대조군으로 설정한 TAT 및 TD1과 음성 대조군인 GFP와 비교하여 더 높은 세포 투과능이 있다는 점을 확인하였다.

[실시예 5] 보툴리눔 독소-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질의 생산을 위한 재조합 발현벡터 제작

자사에서 자체 개발한 세포 투과성 펩타이드인 CDP1, CDP2 그리고 CDP3의 보툴리눔 독소 전달 효능을 검증하기 위해 세포 투과성 펩타이드를 보툴리눔 독소 경쇄 A타입(BTLcA)과 보툴리눔 독소 경쇄 B타입(BTLcB)을 중쇄 일부분과 결합하여 BTA-CDP1, BTA-CDP3, BTB-CDP3 재조합 단백질을 실험군으로 제작하였다. 세포 투과성 단백질로 알려진 TAT (Trans-Activator of Transcription)와 보툴리눔 독소의 재조합 단백질 BTA-TAT 그리고 국내 특허 (10-1882461)에서 세포 투과성 펩타이드로 명명하는 TD1(Translocation Domain 1)과 보툴리눔 독소의 재조합 단백질인 BTA-TD1을 제작하여 비교군으로 사용하였다.

먼저 보툴리눔 독소의 A type과 B type의 경쇄 부분을 gene합성하여 제작하였다. 합성된 gene C-terminal에 세포 투과성 펩타이드를 PCR을 통하여 붙이고 NdeⅠ/BamHⅠ으로 잘라주어 pColdⅠ vector에 ligation한 후, TOP10 cell에 형질 전환하여 재조합 발현 벡터를 제작하였다. 이는 코스모진텍社에 의뢰하여 진행하였다.

[실시예 6] 보툴리눔 독소-Cargo Delivery Peptide 펩타이드 재조합 단백질의 발현 및 정제

상기 재조합 단백질을 발현하는 플라스미드를 E. coli BL21 (TaKaRa #9126)에 heat shock(42℃, 90초) 방법으로 형질 전환시켜 유전자변형생물체를 만들었다. 형질 전환시킨 균주를 10ul ampicillin을 포함하는 LB 배지 37℃에서 약 18-22시간 1차 배양하였다. 2차 배양으로 LB 배지 100ml에 1차 배양세포 1ml과 ampicillin 100ul를 넣어주고 37℃에서 세포의 OD 600값이 0.6-0.8이 될 때까지 배양하였다.

0.5mM IPTG (Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside)를 넣어주면서 재조합 단백질의 발현을 유도하고 15℃, 200rpm에서 약 19시간 배양하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 세포를 Capturem™ His-Tagged Purification Maxiprep Kit (TaKaRa #635713)에서 제공하는 라이시스 완충액 (xTractor buffer)과 균질기를 이용하여 분쇄하였다. 그 다음 10,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하고, 상층액을 분리하였다.

재조합 단백질의 정제과정은 상층액을 Capturem™ His-Tagged Purification Maxiprep Kit를 이용하여 정제한 후 단백질을 cellulose membrane에 넣어주고 1L phosphate buffer를 이용하여 투석해주었다.

[실시예 7] 보툴리눔 독소-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질의 인체피부 조직 투과능

정제된 보툴리눔 독소-Cargo Delivery Peptide 펩타이드 재조합 단백질에 형광표지(FITC)로 labeling 하는 과정을 Fluoro Tag FITC conjugation kit (Sigma-Aldrich)를 사용하여 진행했다. 재조합 단백질을 0.1M Sodium Carbonate-Bicarbonate Buffer pH 9.0에 녹여주고 천천히 FITC isomer를 넣은 후 2시간동안 상온에서 저어주었다. Kit 안에 잇는 G-25 column을 사용하여 FITC가 붙은 재조합 단백질을 정제해주었다.

FITC로 형광 표지된 재조합 단백질 20㎍-30㎍을 기증받은 실제 인체 피부 (HuSKIN™, HansBiomed Corp)에 4℃에서 약 24시간 도포하였다. 24시간 후 조직을 4% Paraformaldehyde로 4℃에서 24시간 고정시켜주고 4.5% sucrose, 15% sucrose, 30% sucrose를 사용하여 탈수 과정을 거쳤다.

탈수 과정을 거친 조직은 한국병리지원에 의뢰하여 마이크롬 냉동박절기를 이용하여 동결박편 (Cryosection, 20㎛)으로 제조하고, 이를 슬라이드 위에 올려 공초점 현미경(confocal microscopy)를 이용하여 FITC 형광을 관찰하였다.

[실시예 8] 보툴리눔 독소-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질과 피부 유화제를 포함하는 조성물의 피부 투과 실험

실시예 7에서 제조한 FITC로 형광 표지된 재조합 단백질 0.1%를 피부 유화제인 1% GMS (Glyceryl Monostearate), 1% 세틸 알콜(Cetyl alcohol)와 정제수를 사용하여 혼합함으로 조성물을 만들어주었다.

상기 조성물을 기증받은 실제 인체 피부 (HuSKIN™, HansBiomed Corp)에 4℃에서 약 24시간 도포하였다. 24시간 후 남은 조성물을 닦아주고 조직을 4% Paraformaldehyde로 4℃에서 24시간 고정시켜주었다. 그 후 4.5% sucrose, 15% sucrose, 30% sucrose를 사용하여 탈수 과정을 거쳤다.

탈수 과정을 거친 조직은 한국병리지원에 의뢰하여 마이크롬 냉동박절기를 이용하여 동결박편 (Cryosection, 20㎛)으로 제조하고, 이를 슬라이드 위에 올려 공초점 현미경(confocal microscopy)를 이용하여 FITC 형광을 관찰하였다.

[실험예 9] 보툴리눔 독소-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질의 세포 독성 실험

재조합 단백질 BTX-CDP의 피부 세포에 대한 독성을 평가하기 위하여, 세포 생존율을 측정하는 MTT assay를 수행하였다. 먼저 한국 세포주 은행에서 분양 받은 CCD-986sk (human skin fibroblast)를 96well plate에 5 X 103/well이 되도록 배양한 후 5-100㎍/의 재조합 단백질을 처리하고 24시간 반응시켰다. 반응 후 5mg/ml의 MTT를 각각 20ul씩 첨가하여 추가로 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 배양액은 버리고 각 시료에 150ul의 DMSO를 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 뒤 OD570에서 흡광도를 측정하였다. 세포 투과성 펩타이드를 결합시키지 않은 보툴리눔 독소 단백질을 대조군으로 사용하였다.

[실험예 10] 보툴리눔 독소-Cargo Delivery Peptide 재조합 단백질의 SNAP-25 & VAMP Cleavage Assay

재조합 단백질 BTX-CDP에 함유된 보툴리눔 독소의 활성 (단백질 분해능)을 측정하기 위해 Cleavage assay를 진행하였다. 보툴리눔 독소가 체내에서 분해하는 SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor activating protein receptor) 단백질 중 보툴리눔 독소 A 타입이 분해하는 SNAP-25와 보툴리눔 독소 B 타입이 분해하는 VAMP 단백질의 오리지널 시퀀스 일부를 합성해 형광물질을 붙여 만든, SNAPtide®(Cat.#521)와 VAMPtide®(Cat.#541) (List Biological Laboratories, Inc., Campbell, CA)를 사용하였다. 이 물질들은 FRET (fluorescence resonance energy transfer) 효과를 이용해, 보툴리눔 독소에 의해서 분해되기 전까지는 형광이 적게 나타나다가 독소에 의해서 가수분해되면 양 끝에 달려있는 형광물질들의 거리가 멀어지면서 발광하게 되는 원리를 이용해 보툴리눔 독소의 단백질 분해능을 정량적으로 측정하게 된다. 우선, 재조합 단백질의 농도를 측정해 100g/mL의 농도로 HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer에 샘플들을 준비한다. 구매한 SNAPtide®와 VAMPtide®는 DMSO에 용해시켜 10M stock solution을 준비한다. 반응을 위해 96well clear bottom black plate (Corning®, CLS3603)를 준비하고 준비한 재조합 단백질을 10g/mL의 농도로 well에 넣고, SNAPtide®와 VAMPtide®를 5 M 농도로 well에 넣어서 혼합한 후 반응을 시작한다. 반응은 37C에서 시행하며 형광측정은 excitation 490nm / emission 523nm / cutoff 495nm의 파장에서 2시간 동안 기록한다.

실험예 5 내지 10을 수행한 결과, 본 발명에 따른 보툴리눔 독소-세포 투과성 펩타이드 재조합 단백질의 경우, 보다 보툴리눔 독소에 대한 피부 투과 및/또는 세포 투과를 효율적으로 진행되도록 함으로써 상기 보툴리눔 독소의 생체 내에서의 고유 효능을 극대화시킬 수 있는 동시에 보다 편의성을 확보하여, 다양한 질환 치료, 심미 또는 미용 목적을 위한 국소 작용제로 적극 활용될 수 있음을 확인하였다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KANZEN Co. Ltd. <120> NOVEL CELL PENETRATING PEPTIDE AND USE THEREOF <130> DX190193 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 1 <400> 1 Gly Lys Arg Ser Arg Leu Arg Lys Pro Arg Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 2 <400> 2 Cys Arg Ile Trp Arg Leu Arg Lys Arg Lys Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 3 <400> 3 Gly Leu Arg Ile Arg Arg Leu Arg Arg Arg Ser Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 4 <400> 4 Gly Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Lys Arg Ser Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 5 <400> 5 Gly Leu Arg Lys Arg Arg Leu Arg Arg Lys Ser Cys 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 6 <400> 6 Gly Leu Arg Trp Arg Arg Lys Arg Arg Lys Ser Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 7 <400> 7 Gly Leu Arg Ile Arg Arg Leu Arg Arg Lys Ser Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 8 <400> 8 Gly Leu Arg Ile Arg Arg Leu Arg Arg His Arg Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 9 <400> 9 Gly Leu Arg Lys Arg Arg Leu Arg Arg His Ser Cys 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 10 <400> 10 Gly Leu Arg Ile Arg Arg Leu Arg Arg His Ser Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 11 <400> 11 Lys Leu Arg Ile Arg Arg Leu Arg Arg His Ser Cys 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 12 <400> 12 Gly Leu Arg Ile Arg Arg Leu Arg Arg His Ser Cys 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CELL PENETRATING PEPTIDE 13 <400> 13 Gly Leu Arg Ile Arg Arg Leu Arg Ala Arg Ser Cys 1 5 10 <210> 14 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Botulinum Toxin light chain peptide <400> 14 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn 450 455 <210> 15 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Botulinum Toxin light chain peptide <400> 15 Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn 1 5 10 15 Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg 20 25 30 Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu 35 40 45 Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly 50 55 60 Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn 65 70 75 80 Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe 85 90 95 Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile 100 105 110 Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu 115 120 125 Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn 130 135 140 Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile 145 150 155 160 Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly 165 170 175 Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln 180 185 190 Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu 195 200 205 Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro 210 215 220 Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe 245 250 255 Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe 260 265 270 Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile 275 280 285 Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn 290 295 300 Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr 305 310 315 320 Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly 325 330 335 Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu 340 345 350 Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys 355 360 365 Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys 370 375 380 Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile 385 390 395 400 Ser Asp Lys Asn Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile 405 410 415 Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr 420 425 430 Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Arg 435 440 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Botulinum Toxin heavy chain peptide <400> 16 Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu 1 5 10

Claims (17)

1. 세포 내로 활성 분자의 운반을 매개할 수 있는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드.　
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 활성 분자는 성장인자, 효소, 전사인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체, 항체 단편, 핵산, 코딩 핵산 서열, mRNAs, 안티센스 RNA 분자, microRNA, siRNA, 탄수화물, 지질 및 당지질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩타이드.　
   
3. 삭제
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9. 제 1 항의 세포 투과성 펩타이드 및 보툴리눔 독소를 융합한 세포 투과성 재조합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
   
10. 제 9 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 His, FLAG, HAT, SBP, c-myc, Chitin-binding domain, Glutathione-S transferase 및 Maltose binding protein으로 이루어진 군으로 선택된 1종 이상의 친화성 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
    
12. 제 10 항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 cold shock protein A promoter, T7, Toc, BAD 및 pRha로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 조절 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
    
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