KR101942755B1

KR101942755B1 - 멜리틴 유사 재조합 단백질의 제조방법과 이를 포함하는 피부용 조성물

Info

Publication number: KR101942755B1
Application number: KR1020170025985A
Authority: KR
Inventors: 이삼석
Original assignee: 주식회사 유앤아이미트
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2019-01-28
Also published as: KR20180099047A

Abstract

본 발명은 멜리틴 유사 재조합 단백질과 이를 코딩하는 뉴크레오티드 및 이들을 포함하는 피부기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게 설명하자면, 콜린셀라 속( Collinsella sp.) 미생물로부터 유래된 멜리틴(melittin) 유사 재조합 단백질과, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전정보를 갖는 뉴클레오티드, 그리고 상기 재조합 단백질이나 상기 뉴클레오티드 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함함으로써 인체의 피부장벽 활성화 및 주름개선 효능을 갖는 피부용 조성물에 관한 것이다.

Description

멜리틴 유사 재조합 단백질의 제조방법과 이를 포함하는 피부용 조성물{Method for producing melittin-like recombinant protein and composition for skin containing them}

본 발명은 멜리틴 유사 재조합 단백질과 이를 코딩하는 뉴크레오티드 및 이들을 포함하는 피부기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게 설명하자면, 콜린셀라 속( Collinsella sp .) 미생물로부터 유래된 멜리틴(melittin) 유사 재조합 단백질과, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전정보를 갖는 뉴클레오티드, 그리고 상기 재조합 단백질이나 상기 뉴클레오티드 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함함으로써 인체의 피부장벽 활성화 및 주름개선 효능을 갖는 피부용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 봉독(bee venom)은 꿀벌(Apis mellifera)의 산란관에서 나오는 독액으로서, 임상적으로 신경통·류머티즘·요통 등에 유의할 만한 효과가 있다. 봉독은 여러 가지 구성성분들로 이루어져 있는데, 그 중에서 약리학적으로 유용한 활성성분 중의 하나는 멜리틴(melittin)이다.

상기 멜리틴은 26개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로서 주로 용혈작용과 효소작용을 한다. 상기 효소작용으로는 뇌하수체와 부신피질체계를 자극하여 카테콜라민(catecholamine)과 코르티손(cortisone)의 분비를 촉진한다. 상기 카테콜아민에는 노르에피네프린(norepinephrine)과 에피네프린(epinephrine) 및 도파민(dopamine)이 있다. 상기 노르에피네프린은 교감신경 충동전달체로서 감정, 주의 및 각성 상태와 관계가 있고, 상기 도파민은 우울증에 대하여 중요한 역할을 하고 있는 것으로 보고되고 있다.

봉독에는 상기 멜리틴 이외에도 포스포리파아제, 히알루로니다아제, 히스타민 등과 같이 인체에 알러지 증상을 일으키는 유해성분들도 다량 포함되어 있다. 이러한 알레르겐(allergen)들은 두드러기, 가려움증, 경련 등을 유발할 수 있고, 심하면 현기증이나 호흡 곤란을 일으킬 수도 있다. 따라서 임상적으로 봉독을 사용하기 위해서는 안전을 위하여 상기 알레르겐들을 제거해야 한다. 그래서 대한민국 특허 제10-1364506호(2014.02.12.)에는 봉독에서 알러지 성분을 분리 및 정제하는 방법이 개시되어 있다.

또한, 대한민국 특허등록 제10-1394817호(2014.05.07.)에는 봉독 또는 봉독 추출물을 함유하는 화장료 조성물이 소개되어 있다. 상기 화장료 조성물은 피부의 항산화, 항노화 및 주름 개선에 효과가 있다고 보고되어 있다. 그런데, 상기 봉독을 얻기 위해서는 꿀벌에 전기 충격을 가하여 봉침을 회수하고, 상기 봉침으로부터 유해성분을 제거하기 위하여 여러 단계의 분리 및 정제 공정을 거쳐야 하는 번거러움이 있다.

한편, 잘 알려진 바와 같이, 인체의 피부는 표피층와 진피층 및 피하지방층으로 구성되어 있다. 상기 표피층은 최외곽층으로서, 주로 피부에 유분과 수분을 유지시켜 주는 세포장벽의 기능을 담당하고 있다. 상기 표피층의 세포장벽 기능을 향상시키기 위해서는 표피세포(dermal keratinocytes)들의 세포간 결합력을 증대시켜서 세포 투과성을 억제하여야 한다.

또한, 세포대사 과정 중에 생성되는 프리 라디칼은 각종 반응기전을 통해서 DNA를 손상시켜 돌연변이를 유발하고, 막지질을 산화시켜 세포내 소기관들을 파괴한다. 이러한 일련의 과정들은 세포가 정상적으로 분열, 성장하는 것을 방해하고, 피부 노화를 촉진하여 주름을 생성하는 원인이 된다.

그리고 세포외 기질(ECM; extracellular matrix)의 주요 구성성분인 콜라겐(collagen)의 비정상적인 합성이나 비정상적인 분해 역시 피부 노화 및 피부 주름의 형성에 매우 깊이 관련되어 있다. 특히 프로콜라겐 Ⅰ형은 콜라겐을 합성하는 세포내에서 콜라겐 합성을 스스로 조절하는 기능이 있다고 보고되어 있다(Wiestner, M. 등. (1979) J. Biol. Chem. 254, 10482∼10484; Paglia, L. M. 등. (1979) Biochemistry 18, 5030∼5034). 따라서 콜라겐의 감소로 인한 피부주름을 개선하기 위해서는 진피세포(dermal fibroblasts) 내에서 콜라겐 합성을 유도할 필요가 있다.

[특허문헌 1] 대한민국 특허 제10-1364506호(2014.02.12.) [특허문헌 2] 대한민국 특허등록 제10-1394817호(2014.05.07.)

[비특허문헌 1] Wiestner, M. et al. (1979) J. Biol. Chem. 254, 10482∼10484 [비특허문헌 2] Paglia, L. M. et al. (1979) Biochemistry 18, 5030∼5034

이에 본 발명의 목적은, 표피세포(dermal keratinocytes)의 세포간 결합력을 증대시키고 세포투과성을 억제하며, 나아가 진피세포(dermal fibroblasts) 내에서의 콜라겐 합성을 촉진하는 효능이 있는 멜리틴 유사 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 멜리틴 유사 재조합 단백질 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하여 인체의 피부장벽 활성화 및 주름 개선에 우수한 효능을 갖는 피부용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은, 꿀벌에 전기 충격을 가하여 봉독을 채취하거나, 상기 봉독으로부터 유해성분을 제거하는 정제과정을 거칠 필요 없이, 유전자 재조합 및 미생물 배양을 통해 정제된 멜리틴 유사 재조합 단백질을 대량생산 할 수 있는 효율적인 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 콜린셀라 속(Collinsella sp.) 미생물로부터 유래되고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 멜리틴 유사 재조합 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은, 콜린셀라 속(Collinsella sp.) 미생물로부터 유래되고, 상기 청구항 1의 멜리틴 유사 재조합 단백질을 코딩하며, 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명은, 콜린셀라 에어로파시엔스(Collinsella aerofaciens) KCTC 15038 균주로부터 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 얻는 단계와; 상기 프라이머로부터 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 DNA 단편을 얻는 단계와; 상기 DNA 단편과 pET28a 벡터를 이용하여 재조합 벡터를 제조하는 단계와; 상기 재조합 발현벡터를 대장균에 도입하여 상기 대장균을 형질전환 시키는 단계와; 상기 대장균을 배양하고, 그로부터 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 분리 및 정제하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 멜리틴 유사 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

마지막으로 본 발명은, 상기 멜리틴 유사 재조합 단백질이나 상기 뉴클레오티드 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하고, 인체의 피부장벽 활성화 및 주름개선 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 피부용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 멜리틴 유사 재조합 단백질 및 이를 코팅하는 뉴클레오티드는, 표피세포의 세포간 결합력을 증대시키고 세포투과성을 억제하며, 나아가 진피세포 내에서의 콜라겐 합성을 촉진하는 효능이 있다.

따라서 상기 멜리틴 유사 재조합 단백질이나 뉴클레오티드를 포함하는 피부용 조성물은 인체의 피부 주름을 개선하고 탄력을 강화하는 화장료 조성물로는 물론, 피부 창상이나 상처를 치료하는 의약 조성물로도 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명에 따르면, 꿀벌에 전기 충격을 가하여 봉독을 채취하거나, 상기 봉독으로부터 유해성분을 제거하기 위한 정제과정을 거칠 필요 없이, 정제된 멜리틴 유사 재조합 단백질을 효율적으로 대량생산 할 수 있다.

도 1은 pET28a 발현벡터 및 재조합 발현벡터 pET28a-Meebong의 DNA 지도,
도 2는 본 발명에 따른 멜리틴 유사 재조합 단백질의 SDS-PAGE 사진,
도 3은 사람 유래 표피세포에 대하여 상기 재조합 단백질의 농도별 세포독성 여부를 나타낸 그래프,
도 4는 사람 유래 피부 섬유아세포에 대하여 상기 재조합 단백질의 농도별 세포독성 여부를 나타낸 그래프,
도 5는 사람 유래 표피세포에 대하여 상기 재조합 단백질의 농도별 세포간 결합력 변화를 나타낸 그래프,
도 6은 사람 유래 표피세포에 대하여 상기 재조합 단백질의 농도별 세포투과성 변화를 나타낸 그래프,
도 7은 산화자극제를 처리한 사람 유래 피부 섬유아세포에 대하여 상기 재조합 단백질의 농도별 세포생존율의 변화를 나타낸 그래프,
도 8은 사람 유래 피부 섬유아세포에 대하여 상기 재조합 단백질의 프로콜라겐 생성 여부를 나타내는 면역 블라팅 분석도 이다.

본 발명에 따른 멜리틴 유사 재조합 단백질은 콜린셀라 속(Collinsella sp.) 미생물, 바람직하기로는 콜린셀라 에어로파시엔스(Collinsella aerofaciens) KCTC 15038 균주로부터 유래되고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된다.

본 발명자들은 상기 재조합 단백질이 표피세포의 세포간 결합력을 증대시키고 세포투과성을 억제하며, 나아가 진피세포 내에서의 콜라겐 합성을 촉진하는 효능이 있다는 것을 확인하고,‘Meebong 81’이라는 명칭을 부여하였다.

상기‘Meebong 81’이라는 명칭은 ‘콜린셀라 속 미생물 유래되고, 81개 아미노산 서열로 구성된 봉독 유사 단백질’이라는 의미이다. 상기 Meebong 81은 봉독의 주요 활성성분인 멜리틴(Melittin)과 유사한 아미노산 서열 및 기능을 갖는다.

본 발명에 따른 멜리틴 유사 재조합 단백질을 제조하기 위해서는 먼저 상기 콜린셀라 속(Collinsella sp.) 미생물, 바람직하기로는 콜린셀라 에어로파시엔스 KCTC 15038 균주를 주형으로 하여 프라이머 2개를 분리한다. 상기 프라이머는 각각 서열번호 1의 염기서열과, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진다.

이어서 상기 프라이머를 PCR(polymerase chain reaction)하여 상기 Meebong 81에 대한 유전정보를 갖는 DNA 단편, 즉 서열번호 3의 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 얻는다. 그리고 상기 뉴클레오티드를 제한효소로 절단하고, 이를 발현벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제작한 다음, 상기 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환 시킨다.

상기 발현벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 플라스미드 벡터로는 당 업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, pET, pcDNA, pRK5(EP 307,247), pSV16B(WO 91/08291), PVL1392(PharMingen), pHid/TAT 플라스미드(Kwon JH 등., 2007, Biochem. Biophys. Res. Commun., 363, 399-404) 등을 사용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

상기 Meebong 81을 코딩하는 뉴클레오티드가 도입된 플라스미드 벡터는 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입, 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브덴-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electrophoration), 유전자 건(gene gun) 등의 방법에 의해 숙주세포 내에 도입할 수 있으며, 바람직하게는 일시적 형질감염 방법을 사용할 수 있다.

상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 허피스바이러스(herpes virus) 벡터, 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 벡터 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 바람직하게는, FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터인 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용할 수 있다(Miller, A. D. and Buttimore. C. Mol. Cell Biol. 6:2985-2902, 1986).

상기 숙주세포로는 대장균이 바람직하다.

한편, 본 발명에 따른 피부용 조성물은 상기 멜리틴 유사 재조합 단백질, 즉 Meebong 81이나, 상기 Meebong 81을 코딩하는 뉴클레오티드를 유효성분으로 포함한다. 이때, 상기 Meebong 81은 추가로 폴리 히스티딘 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예로서, 폴리 히스티딘 영역을 포함하는 재조합 단백질은 Meebong 81과 그 서열 N-말단 또는 C-말단에 폴리 히스티딘 영역이 추가로 융합된 단백질 일 수 있다.

상기 폴리 히스티딘 영역은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 His-tag 서열 일 수 있으며, 예를 들어 단백질 정제[예를 들어, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)]를 위한 His-tag 서열 또는 다른 펩타이드 또는 단백질 서열일 수 있으며, 예를 들어 S-tag, T7-tag, Ha-tag, FLAG-tag, myc-tag, E-tag, V5-tag, Fc-tag, VSV-tag, Xpress-tag, 스트렙트아비딘 결합 단백질(streptavidin binding protein, SBP)-tag, 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(glutathione S-transferase, GST)-tag, 말토오즈-결합단백질(maltose-binding protein, MBP)-tag, 티오레독신(thioredoxin)-tag, 키틴 결합 도메인(chitin-binding domain, CBD)-tag, 케토스테로이드 아이소머라아제(ketosteroid isomerase, KSI)-tag, 디히드로폴레이트 리덕타아제(dihydrofolate reductase, DHFR)-tag, NusA-tag, intein-tag, polu(NANP)-tag, 바이오틴 카르복실 담체 단백질(biotin carboxyl carrier protein, BCCP)-tag, 그린 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)-tag 등을 포함하는 공지의 tag 서열일 수 있다.

상기 피부용 조성물은 피부 표피세포에서 세포독성이 없이 세포간 결합력을 촉진하고, 세포투과성을 억제하는 등을 피부장벽을 활성화하며, 또한 인간 피부 섬유아세포에 대하여 세포독성 없이 항산화 효과 및 콜라겐 생합성을 촉진함으로써 피부주름을 개선하는 효능이 있다.

상기 피부용 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로오숀제, 연고제, 동결건조제, 스프레이, 에어로졸 등의 비경구용 제형으로 제제화 될 수 있다.

상기 담체로는 인산완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수, 미네럴 워터 등의 수성 희석제 또는 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일 등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 계면활성제, 유화제, 증점제, 산화방지제, 습윤제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물에 포함되는 Meebong 81 또는 상기 뉴클레오티드의 함량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 1회에 0.01 내지 1 mg, 바람직하게는 0.1 내지 1 mg의 양으로 1일 1회, 또는 1일 수회에 걸쳐서 투여 또는 도포할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 예컨대 삼푸나 로션, 크림, 젤, 에센스, 토닉 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 Meebong 81 또는 상기 뉴클레오티드의 함량은 조성물 전체 중량의 0.001 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 20 중량% 만큼 포함될 수 있다.

이하, 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해서 본 발명의 보호범위가 한정하는 것은 아니다.

[ 실시예 ] Meebong 81단백질의 제조

생물자원센터(KCTC)에서 분양 받은 Collinsella aerofaciens KCTC 15038 균주의 genomic DNA를 주형으로 사용하여 두 가지 프라이머, 즉 5'-CACCTAGGATCCACCGGCGAGCTCACGGCG-3'(서열번호 1, 밑줄 BamHⅠ site)와 5'-CAGAGACTGGAGTTAGGCATCGTTTCGAAT-3'(서열번호 2, 밑줄 XhoⅠ site)를 얻고, 이를 PCR 하여 DNA 단편(서열번호 3)을 얻었다.

상기 DNA 단편(서열번호 3)을 각각의 제한효소 BamHⅠ과 XhoⅠ으로 절단하고, 이들을 pET28a 발현벡터(출처; Novagen)에 삽입하여 재조합 발현벡터 pET28a-Meebong을 제작한 다음, 이를 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환 시켰다. 첨부 도 1에서 (A)은 상기 pET28a 발현벡터(출처: Novagen)의 DNA 지도이고, (B)는 상기 발현벡터에 Meebong 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터 pET28a-Meebong의 DNA 지도를 나타낸 것이다.

상기 대장균을 일정시간 배양하고, 여기에 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 첨가하여 12시간 동안 추가 배양하였다. 배양된 대장균을 원심분리로 회수하여 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 Ni-IDA 친화 컬럼크로마토그래피(affinity column chromatography) 방법으로 재조합 단백질 Meebong 81을 분리하였다.

쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하여 정제된 Meebong 81을 확인하고, SDS-PAGE 사진을 촬영하여 첨부 도 2에 수록하였다. 첨부 도 2에서 왼쪽 레인은 단백질 크기 마커이고. 오른쪽 레인은 Meebong 81단백질이다.

[ 시험예 1] 표피세포에 대한 세포독성 시험

사람으로부터 유래된 표피세포(human dermal keratinocytes)를 10% FBS와 항생제(penicillin streptomycin)가 첨가된 DMEM 배지에 배양을 하고, 배양 3일째 상기 세포를 배양접시에서 96-well 플레이트로 옮겼다. 세포가 붙은 후 Meebong 81을 농도별로 배지에 처리하고, 5% CO₂, 37℃의 조건 하에서 24시간 추가 배양하였다.

이어서 세포생존 능력을 정량화하기 위하여 MTT 용액(sigma)을 처리하고, 반응이 끝난 후 570nm의 흡광계측기로 세포생존율(cell viability)를 측정한 다음, 그 결과를 도 3에 그래프로 수록하였다. 실험 결과, 본 발명의 Meebong 81은 모든 농도에서 대조군과 비교하여 표피세포의 생존에 아무런 영향을 주지 않았다.

[ 시험예 2] 피부 섬유아세포에 대한 세포독성 시험

사람 유래 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblasts)를 10% FBS와 항생제(penicillin streptomycin)가 첨가된 DMEM 배지에 배양하고, 배양 3일째 상기 세포를 배양접시에서 96-well 플레이트로 옮겼다. 세포가 붙은 후 Meebong 81을 농도별로 배지에 처리하고, 5% CO₂, 37℃의 조건 하에서 24시간 추가 배양하였다.

이어서 세포생존 능력을 정량화하기 위하여 MTT 용액(Sigma)을 처리하고, 반응이 끝난 후 570 nm의 흡광계측기로 세포생존율(cell viability)를 측정한 다음, 그 결과를 도 4에 그래프로 수록하였다. 실험 결과, 본 발명의 Meebong 81은 모든 농도에서 대조군과 비교하여 피부 섬유아세포의 생존에 아무런 영향을 주지 않았다.

[ 시험예 3] 세포간 상호작용(cell-cell interaction) 촉진 시험

사람 유래 표피세포(human dermal keratinocytes)을 24-well plates에 5 x 10⁴의 농도로 시딩(seeding)하고, 같은 세포를 microtube에 1 x 10⁵ 만큼 분주하여 Vybrant DiO cell labeling dye(ThermoFisher)로 형광 염색하였다. 여기에 Meebong 81단백질을 농도별로 처리하여 30분간 반응한 후 세척하였다.

이어서 24-well plates에 미리 시딩해 둔 세포에다 형광 염색된 세포를 처리하여 10분간 반응한 후 세척하고, 480/501 nm에서 표피세포간 결합력을 측정한 다음, 그 결과를 도 5에 그래프로 수록하였다. 실험 결과, Meebong 81의 처리농도가 증가 할수록 표피세포간 상호작용이 촉진되는 것으로 나타났다.

[ 시험예 4] 세포투과성(cell permeability) 시험

사람 유래 표피세포(human dermal keratinocytes)를 배양하고, 배양 3일째 상기 세포를 배양접시에서 transwell(24-well)의 인서트 챔버(Millipore)로 옮긴 다음, 5% CO₂, 37℃의 조건 하에서 cell monolayer가 형성 될 수 있도록 24시간 동안 배양하였다. 여기에 Meebong 81을 농도별로 처리한 뒤, 24 시간 동안 추가 배양하였다.

이어서 형광 시약 FITC-dextran 4 kDa(Sigma-Aldrich)을 이용하여 24시간 후에 outer chamber로 빠져 나온 형광을 excitation 490 nm, emission 520 nm의 형광계측기로 측정하여 세포투과성을 산출한 다음, 그 결과를 도 6에 수록하였다. 실험 결과, Meebong 81의 농도가 증가할수록 세포투과성이 억제되는 것으로 나타났다.

[ 시험예 5] 산화자극에 대한 세포보호 효과 시험

사람 유래 피부 섬유아세포(human dermal fibroblasts)를 배양하고 배양 3일째, 상기 세포를 배양접시에서 96-well 플레이트로 옮겼다. 세포가 붙은 후 Meebong 81을 농도 별로 처리하고, 과산화수소 500 μΜ을 처리한 다음, 5% CO₂, 37℃의 조건 하에서 24시간 추가 배양하였다.

이어서, WST-1 시약(Roche)을 처리하고, 반응이 끝난 후 450 nm의 흡광계측기로 세포생존율을 측정한 다음, 그 결과를 첨부 표 7에 수록하였다.시험 결과, Meebong 81은 산화자극에 대한 세포 보호효과가 있는 것으로 확인되었다.

[ 시험예 6] 콜라겐 생합성의 촉진효과 시험

사람 유래 피부 섬유아세포(human dermal fibroblasts)의 콜라겐 생합성에 대한 효과를 관찰하기 위해 면역블롯 분석(Immunoblot analysis)으로 프로콜라겐 I형(procollagen type I)의 생합성 촉진효과를 확인하였다. 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 상기 세포를 6-well 플레이트에서 배양하고, FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에서 Meebong 81(500 nM)을 처리하였다.

상기 세포를 모아 면역블롯 분석(Immunoblot analysis)를 시행한 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, Meebong 81 처리군은 대조군에 비해 섬유아세포의 프로콜라겐 I형의 생합성 양이 현저히 증가하는 것으로 확인되었다.

따라서 본 발명에 따른 멜리틴 유사 재조합 단백질이나, 이들 코딩하는 뉴클레오티드는 피부주름을 개선하고 탄력을 강화하는 화장료 조성물로는 물론, 피부 의 창상 및 상처를 치료하는 의약 조성물로도 사용될 수 있다.

<110> UNIMEAT <120> Melittin-like recombinant protein, nucleotide encoding the same and composition for skin containing them <130> IS17P011 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 cacctaggat ccaccggcga gctcacggcg 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cagagactgg agttaggcat cgtttcgaat 30 <210> 3 <211> 267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collinsella aerofaciens KCTC 15038 <400> 3 cacctaggat ccaccggcga gctcacggcg gcaagcggag gcgtgctcgg cctgattccc 60 ttttcctggc ctgcacggct cgggtcgctc tccatcgaag cgggcattgc gcgggcaacg 120 gatgccgccc aggccgccac aatcagttcg cttgcctggg cgctcgccat cgcagcggtc 180 gtgctcacca taacggggct cgctgcgctc atagcatggt tcaaccgatt cgaaggagga 240 cgaaacgatg cctaactcca gtctctg 267 <210> 4 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Collinsella aerofaciens KCTC 15038 <400> 4 Met Thr Gly Glu Leu Thr Ala Ala Ser Gly Gly Val Leu Gly Leu Ile 1 5 10 15 Pro Phe Ser Trp Pro Ala Arg Leu Gly Ser Leu Ser Ile Glu Ala Gly 20 25 30 Ile Ala Arg Ala Thr Asp Ala Ala Gln Ala Ala Thr Ile Ser Ser Leu 35 40 45 Ala Trp Ala Leu Ala Ile Ala Ala Val Val Leu Thr Ile Thr Gly Leu 50 55 60 Ala Ala Leu Ile Ala Trp Phe Asn Arg Phe Glu Gly Gly Arg Asn Asp 65 70 75 80 Ala

Claims

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콜린셀라 에어로파시엔스(Collinsella aerofaciens) KCTC 15038 균주로부터 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 얻는 단계와;
상기 프라이머로부터 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 DNA 단편을 얻는 단계와;
상기 DNA 단편과 pET28a 벡터를 이용하여 재조합 벡터를 제조하는 단계와;
상기 재조합 발현벡터를 대장균에 도입하여 상기 대장균을 형질전환시키는 단계와;
상기 대장균을 배양하고, 그로부터 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 분리 및 정제하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 멜리틴 유사 재조합 단백질의 제조방법.
콜린셀라 속(Collinsella sp.) 미생물로부터 유래되고 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 멜리틴 유사 재조합 단백질과, 상기 멜리틴 유사 재조합 단백질을 코딩하며 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 뉴클레오티드 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하고, 인체의 주름개선 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 피부용 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 멜리틴 유사 재조합 단백질은 N-말단 또는 C-말단에 폴리히스티딘 영역이 융합된 것임을 특징으로 하는 피부용 화장료 조성물.
콜린셀라 속(Collinsella sp.) 미생물로부터 유래되고 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 멜리틴 유사 재조합 단백질과, 상기 멜리틴 유사 재조합 단백질을 코딩하며 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 뉴클레오티드 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하고, 인체 피부의 창상이나 상처 치료 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 피부용 의약 조성물.