WO2016163806A1 - 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 - Google Patents

탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 Download PDF

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WO2016163806A1
WO2016163806A1 PCT/KR2016/003711 KR2016003711W WO2016163806A1 WO 2016163806 A1 WO2016163806 A1 WO 2016163806A1 KR 2016003711 W KR2016003711 W KR 2016003711W WO 2016163806 A1 WO2016163806 A1 WO 2016163806A1
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protein
sirt2
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fusion protein
hair
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PCT/KR2016/003711
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정지형
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차의과학대학교 산학협력단
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth

Definitions

  • the present invention is Sirt2 protein; Nucleotides encoding said Sirt2 protein; It relates to a composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising the Sirt2 protein and a protein delivery domain fusion protein as an active ingredient.
  • hair loss is frequently caused by natural factors such as environmental pollution and strong ultraviolet rays, physiological factors such as stress and hormonal imbalance, and hair loss occurs regardless of age, sex, and gender unlike in the past, which was limited to adult men. Therefore, the need for materials for the prevention and treatment thereof is urgently needed.
  • Hair follicles the physiological organs in the body that make up the hair, form the hair during the postnatal development, the anagen phase in which the hair grows actively, the catagen phase in which the hair degenerates, and the hair drop out.
  • the hair cycle is divided into a telogen phase, an exogen phase in which hair loss is maintained, and is involved in hair growth, maintenance, and dropout.
  • the activity of hair follicles is caused by dermal papilla cells, in particular the proliferation and differentiation of dermal papilla cells is primarily involved in the progress of hair growth cycle and hair formation (Botchkarev VA, Kishimoto J, Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling.
  • hair growth and hair loss are closely related to the proliferation and death of dermal papilla cells, so inducing their proliferation may lengthen the growth phase or inhibit cell death and shorten the degenerative, resting and hair loss periods to improve and treat hair loss.
  • Minoxidil and finasteride both of which are currently approved by the FDA, have side effects such as systemic hair growth and decreased sexual function, and the specific mechanism of action of minoxidil is not clear. Therefore, it is necessary to develop a biological material that promotes proliferation of dermal papilla cells in hair follicles and increases expression of growth factors while having less concern about side effects.
  • Sirt2 protein or a fusion protein thereof promotes proliferation of dermal papilla cells by increasing expression of hair growth-related cytokines, ie VEGF, in the dermal papilla cells. That is, the inventors have discovered that Sirt2 protein or a fusion protein thereof may be useful for preventing hair loss or promoting hair growth through hair follicle maintenance and activation by promoting the growth of dermal papilla cells in hair follicles.
  • an object of the present invention is to provide a composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising the Sirt2 protein or a fusion protein thereof as an active ingredient.
  • Sirt2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Nucleotides encoding said Sirt2 protein; Or it provides a hair loss prevention or hair growth promoting composition comprising a fusion protein fused to the Sirt2 protein and a protein delivery domain as an active ingredient.
  • the nucleotides encoding the Sirt2 protein may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the fusion protein may be a fusion protein in which a TAT protein delivery domain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is fused to an N-terminus or C-terminus of the Sirt2 protein.
  • the fusion protein may further be a poly histidine region fused to the N-terminus or C-terminus of the fusion protein between the Sirt2 protein and the protein transfer domain.
  • Sirt2 protein, a nucleotide encoding it, or a fusion protein thereof promotes proliferation of dermal papilla cells by increasing expression of hair growth-related cytokines, ie VEGF, in the dermal papilla cells. Therefore, Sirt2 protein, a nucleotide encoding the same, or a fusion protein thereof may be useful for preventing hair loss or promoting hair growth through hair follicle maintenance and activation by promoting the proliferation of dermal papilla cells in hair follicles.
  • 1 shows a cleavage map of the pHis / TAT-Sirt2 expression vector.
  • FIG. 2 shows a fusion protein (TAT-Sirt2 protein, SEQ ID NO: 10) obtained by transforming Escherichia coli by introducing a human Sirt2 gene into a pHis / TAT expression vector and then transforming to E. coli (Coomassie brilliant blue). The result of staining with) is shown.
  • TAT-Sirt2 protein SEQ ID NO: 10
  • Figure 3 shows the results of measuring the proliferation of the dermal papilla cells by treatment with the fusion protein according to the present invention to the dermal papilla cells isolated from the rat by BrdU enzyme immunoassay kit.
  • Figure 4 shows the results of analyzing the expression level of growth factor VEGF by treating the papilla cells fusion protein according to the present invention.
  • 4 is a photograph showing the results of electrophoresis after RT-PCR, and the graph below shows the same experiment repeated three times for statistical analysis.
  • FIG. 5 is a photograph of hair growth effects when the fusion protein according to the present invention is treated after depilation of the back of the mouse (C57BL / 6 mouse).
  • FIG. 6 shows fusion protein (TAT-Sirt2), saline (Control), TAT-GFP fusion protein (TAT-GFP), and minoxidil (Minoxidil) according to the present invention in a mouse (C57BL / 6 mouse) from which hair root was removed. After treatment, the hair growth effect was measured after 2 weeks.
  • TAT-Sirt2 a fusion protein
  • saline Control
  • TAT-GFP fusion protein TAT-GFP
  • minoxidil ((Minoxidil)) according to the present invention in a mouse (C57BL / 6 mouse) removed hair root After each treatment, hair follicles were obtained by staining hematoxylin eosin (H & E).
  • the present invention is Sirt2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Nucleotides encoding said Sirt2 protein; Or it provides a hair loss prevention or hair growth promoting composition comprising a fusion protein fused to the Sirt2 protein and protein delivery domain as an active ingredient.
  • Sirt2 protein is a protein called NAD-dependent deacetylase sirtuin-2 and is one of the sirtuin families.
  • the cau- tine protein family is characterized by a clum-in core domain and is involved in various processes, including transcriptional regulation, cell cycle progression, DNA-damage repair and aging. Get involved.
  • Sirt2 protein is a NAD-dependent deacetylase that deacetylates Lys-40 of alpha-tubulin. It has been found by the present invention that Sirt2 protein, nucleotides encoding it, or fusion proteins thereof promote the growth of dermal papilla cells by increasing the expression of hair growth-related cytokines, ie VEGF, in the dermal papilla cells.
  • Sirt2 protein a nucleotide encoding the same, or a fusion protein thereof may be useful for preventing hair loss or promoting hair growth through hair follicle maintenance and activation by promoting the proliferation of dermal papilla cells in hair follicles.
  • the Sirt2 protein is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and may be prepared in the form of a pharmaceutical composition or a cosmetic composition including the protein as an active ingredient.
  • the nucleotide encoding the Sirt2 protein may be preferably a nucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide encoding the Sirt2 protein may be introduced into a conventional expression vector through a known method, and may be prepared in the form of a pharmaceutical composition or a cosmetic composition including an expression vector into which the nucleotide encoding the Sirt2 protein is introduced as an active ingredient.
  • the expression vector may be a plasmid vector or a viral vector.
  • plasmid expression vector mammalian expression plasmids known in the art may be used.
  • pET pcDNA
  • pRK5 European Patent No. 307,247
  • pSV16B International Patent Publication No. 91/08291
  • pVL1392 PharMingen
  • pHis / TAT plasmid Kwon JH et al., 2007, Biochem Biophys Res) Commun., 363, 399-404
  • the plasmid expression vector into which the nucleotide encoding the Sirt2 protein was introduced was transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dex.
  • the transient transfection method can be used.
  • the viral vector may be a retrovirus vector, an adenovirus vector, a herpes virus vector, an avidoxvirus vector, or the like.
  • the retroviral vector is constructed such that all of the viral genes have been removed or altered so that non-viral proteins are made in the cells infected by the viral vector.
  • PA317 amphoteric retrovirus package cells a retroviral vector certified by the FDA, can be used (Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6: 2895-2902, 1986).
  • the Sirt2 protein may be used as an active ingredient in the composition for preventing hair loss or promoting hair growth according to the present invention.
  • it is used in the form of a fusion protein obtained by fusing a protein transduction domain to the Sirt2 protein.
  • Sirt2 protein can be effectively delivered to cells without using an expression vector or the like.
  • the protein delivery domain is a protein capable of delivering a protein into cells, for example, trans-activating transcriptional activator (TAT) derived from human immunodeficiency virus type I (HIV-1); Antp (Antennapedia or penetratin) peptide, which is an antennapedia Homeodomain of Drosophila; Mutant phenotype protein 1 (Mph-1) of the mouse transcription factor, VP22 (viral protein 22) of Herpes simplex virus (HSV-1); Human protamine P4 (HP4) from herring protamine; Or modified peptides thereof (eg, 47-57 amino acid residues of the TAT protein or peptides modified therefrom).
  • TAT trans-activating transcriptional activator
  • HSV-1 human immunodeficiency virus type I
  • Antp Antp (Antennapedia or penetratin) peptide, which is an antennapedia Homeodomain of Drosophila
  • a plasmid vector eg, a prokaryotic expression vector pET or a eukaryotic expression vector pcDNA
  • a protein delivery domain by obtaining a DNA fragment from a Sirt2 gene (preferably, the gene of SEQ ID NO: 2) by PCR method It can be prepared by introducing into and expressing the protein by transforming the cells for expression.
  • the fusion protein may be a fusion protein in which the TAT protein delivery domain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is fused to the N-terminus or C-terminus of the Sirt2 protein, for example, of the Sirt2 protein. It may be a fusion protein fused with a TAT protein delivery domain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 at the N-terminus, that is, a fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the fusion protein may comprise a linker protein consisting of one or two amino acids between the TAT protein transduction domain and the Sirt2 protein.
  • the linker protein may be a sequence introduced in the process of cloning the Sirt2 gene to a plasmid vector including a TAT protein transfer domain, and may be composed of, for example, a sequence of -Gly-Ser-.
  • the fusion protein may be a protein (eg, a fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5) comprising a linker protein consisting of a sequence of -Gly-Ser- between the TAT protein transduction domain and the Sirt2 protein.
  • methionine (Met) which is the first amino acid at the N-terminus of the Sirt2 protein, may be deleted.
  • the fusion protein comprises a linker protein consisting of a sequence of -Gly-Ser- between the TAT protein transduction domain and the Sirt2 protein, wherein the first amino acid at the N-terminus of the Sirt2 protein is deleted (e.g., , A fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6).
  • the fusion protein used as an active ingredient in the hair loss prevention or hair growth promoting composition of the present invention may further include a poly histidine region.
  • the fusion protein comprising the poly histidine region may be a protein in which the poly histidine region is further fused to the N-terminus or C-terminus of the fusion protein of the Sirt2 protein with the protein transfer domain.
  • the poly histidine region may be a His-tag sequence commonly used in the art, for example His-tag sequence or other peptide for protein purification (e.g.
  • S-tag S-tag
  • T7-tag HA-tag
  • FLAG-tag FLAG-tag
  • myc-tag E-tag
  • V5-tag Fc-tag
  • VSV-tag Xpress-tag
  • SBP Strabitin binding protein
  • GST glutathione S-transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • MBP maltose-binding protein
  • thioredoxin thioredoxin
  • CBD ketosteroid isomerase
  • KSI ketosteroid isomerase
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • NusA-tag NusA-tag
  • intein-tag intein-tag
  • polu NANP
  • biotin carboxyl carrier protein BCCP
  • fluorescent protein eg, green fluorescent protein (GFP) -tag
  • fluorescent protein eg, green fluorescent protein (GFP) -tag
  • the poly histidine region may be composed of
  • compositions of the present invention may be formulated in the form of pharmaceutical compositions and / or cosmetic compositions.
  • the composition of the present invention comprises a Sirt2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Nucleotides encoding the Sirt2 protein (eg, in the form of an expression vector into which the nucleotide is introduced); Or it may be in the form of a pharmaceutical composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising the fusion protein fusion of the Sirt2 protein and protein delivery domain as an active ingredient.
  • composition of the present invention comprises a Sirt2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Nucleotides encoding the Sirt2 protein (eg, in the form of an expression vector into which the nucleotide is introduced); Or it may be in the form of a cosmetic composition for preventing hair loss or promoting hair growth, including a fusion protein fused with the Sirt2 protein and a protein delivery domain.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated into a parenteral formulation such as a liquid, suspension, emulsion, lotion, ointment, lyophilizer, etc. according to a conventional method. Preferably, it may be formulated into a transdermal dosage form such as an external solution, an emulsion, an ointment.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes an aqueous diluent or solvent such as phosphate buffered saline, purified water and sterile water, and a non-aqueous diluent or solvent such as propylene glycol, polyethylene glycol, and olive oil. It includes.
  • Sirt2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 contained in the pharmaceutical composition; Nucleotides encoding said Sirt2 protein;
  • the dosage of the fusion protein in which the Sirt2 protein and the protein delivery domain are fused depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the drug form, the route of administration, and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Sirt2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Nucleotides encoding said Sirt2 protein;
  • the fusion protein fused with the Sirt2 protein and the protein delivery domain may be administered (for example, applied) to the scalp area in an amount of 0.01 to 1 mg, preferably 0.1 to 1 mg per day, The administration may be administered once or several times a day.
  • the cosmetic composition may be prepared in various forms according to a conventional cosmetic preparation method.
  • the cosmetic composition of the present invention comprises a Sirt2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Nucleotides encoding the Sirt2 protein (eg, in the form of an expression vector into which the nucleotide is introduced); Or it may be prepared in the form of cosmetic products, shampoo, hair lotion, hair cream, hair gel, scalp essence, tonic, etc. containing the fusion protein fusion of the Sirt2 protein and protein delivery domain, which is a conventional cleansing liquid, astringent It can be used diluted with liquid and moisturizing liquid.
  • the cosmetic composition may include conventional adjuvants such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and flavorings commonly used in the field of cosmetic compositions.
  • Sirt2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Nucleotides encoding said Sirt2 protein;
  • the content of the fusion protein fused with the Sirt2 protein and the protein delivery domain may be contained in an amount effective to achieve hair loss prevention or hair growth promoting effect, for example, in an amount of 0.001 to 50% by weight relative to the total weight of the composition. Preferably it may be contained in an amount of about 1 to 20% by weight.
  • Fusion proteins of the Sirt2 protein and the TAT protein transduction domain were prepared by recombinant protein expression and purification using pHis / TAT expression vectors (Kwon JH et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun., 363, 399-404).
  • SEQ ID NO: 2 in Sirt2 DNA as a template and the following two primers of 5'-GGAGAA GGATCC GACTTCCTGCGGAACTTA-3 ' ( SEQ ID NO: 11, underlined BamHI restriction enzyme site), 5'-GAGATG CTCGAG TCACTGGGGTTTCTC CCT -3' ( SEQ ID NO: 12 , DNA fragments (SEQ ID NO: 15) were obtained by polymerase chain reaction using the underlined XhoI restriction enzyme site), cut into respective restriction enzymes (BamHI / XhoI), and put them into a pHis / TAT expression vector.
  • Sirt2 was constructed (FIG. 1) and transduced into E. coli BL21 (DE3).
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thio-galactoside
  • Example 2 Proliferation effect of dermal papilla cells
  • the obtained dermal papilla cells were cultured in DMEM medium to which 10% FBS and antibiotics (penicillin / streptomycin) were added. On day 3 of culture, cells were removed from the culture dish and transferred to 96-well plates in equal amounts.
  • the TAT-Sirt2 protein obtained in Example 1 was added to the medium by concentration, and then cultured for 2 hours and replaced with a fresh medium, and 5% CO 2 at 37 ° C for 24 hours. Further incubation. Cell proliferation was analyzed using the BrdU enzyme immunoassay kit (Millipore). After the reaction was carried out according to the manual of the BrdU enzyme immunoassay kit and measured with an absorbance meter of 450nm, the results are shown in FIG. From the results of Figure 3, it can be seen that the amount of dermal papilla cells significantly increased with concentration.
  • the TAT-GFP of Figure 3 is a control group treated with a TAT-GFP (green fluorescent protein) fusion protein prepared in the same manner as the TAT-Sirt2 protein production, the cell proliferation effect of Figure 3 is not the effect of TAT single-stage Sirt2 It can be seen that it is due to quality.
  • TAT-GFP green fluorescent protein
  • Example 3 VEGF growth factor expression promoting effect
  • mRNA extraction kit Geneol
  • TAT-Sirt2 obtained in Example 1 by concentration.
  • cDNA was synthesized using reverse transcriptase (Gendepot, M-MLV)
  • PCR was performed using Taq polymerase. Primers used for PCR to confirm the expression of VEGF were 5'-GACCCTGGTGGACATCTTCCA GGA-3 '(SEQ ID NO: 13) and 5'-GTTTAACTCAAGCTGCCTCGC-3' (SEQ ID NO: 14).
  • the skin of the mouse (C57BL / 6 mouse) was depilated and wiped with buffer PBS.
  • 20 ⁇ g of the TAT-Sirt2 protein obtained in Example 1 was dissolved in 150 ⁇ l of saline solution and then applied, and then beated for 30 seconds to be absorbed.
  • the control group was treated with saline only.
  • the protein or saline treatment was attempted once every two days. Photographs taken four weeks after the treatment are shown in FIG. 5. From the results of Figure 5, it can be seen that the TAT-Sirt2 protein treatment group exhibits an excellent hair growth effect.
  • Example 5 Hair growth promoting effect using a depilation cream mouse model
  • the skin of the mouse (C57BL / 6 mouse) was applied with a depilatory cream (Veet, Oxy Rekit Benckiser, Korea) and after 3 minutes, it was scraped with a spatula (spatula) to remove hair and hair roots, and then wiped with PBS buffer solution.
  • the surface of the epidermis of the rat was pushed to remove dead skin cells, and then further dead skin cells were removed using a transparent tape.
  • 20 ⁇ g of the TAT-Sirt2 protein obtained in Example 1 was dissolved in 150 ⁇ l of saline solution, and then beaten for 30 seconds to be absorbed.
  • TAT-GFP treated group TAT-GFP
  • minoxidil treated group Minoxidil
  • a solution 50 ⁇ l dissolved in saline at a concentration of 5%.
  • FIG. 6 Photographs taken two weeks after the treatment are shown in FIG. 6. From the results of FIG. 6, it can be seen that the TAT-Sirt2 protein treatment group showed a remarkably excellent hair growth effect compared to other test groups including the control group.

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Abstract

본 발명은 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드; 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.

Description

탈모방지 또는 발모촉진용 조성물
본 발명은 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드; 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다.
현대 사회에서는 환경 오염과 강한 자외선 등의 자연적인 요인, 스트레스 및 호르몬 불균형 등의 생리학적인 요인에 의해 탈모가 빈번히 발생되고 있으며, 성인 남성에 국한되던 과거와 다르게 남녀노소를 불문하고 탈모 현상이 나타남에 따라 이의 예방 및 치료를 위한 소재의 필요성이 절실하다.
모발을 만들어내는 신체내의 생리학적 기관인 모낭(hair follicle)은 출생 후의 발생 과정 동안 모발의 생성 및 생성된 모발이 활발히 성장하는 성장기(anagen phase), 모발이 퇴화하는 퇴행기(catagen phase), 모발 탈락 때까지 유지되는 휴지기(telogen phase), 탈모가 일어나는 탈모기(exogen phase)로 나뉘는 모발성장 주기(hair cycle)를 반복하며 모발의 성장과 유지 및 탈락에 관여한다. 모낭의 활성은 모유두세포에 의해 일어나며, 특히 모유두세포의 증식 및 분화가 모발성장 주기의 진행과 모발형성에 일차적으로 관여한다(Botchkarev VA, Kishimoto J, Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling. J Iinvestig Dermatol Symp Proc 8, 46-55,2003). 활발히 모발이 성장하는 성장기에는 모유두세포의 활발한 증식 및 분화가 활발하게 일어나며 모발의 성장이 중단되며 탈모현상이 일어나는 퇴행기, 휴지기, 탈모기에는 이 세포가 사멸된다(Botchkarev V.A, Batchkareva N.V., Nakamura M, Noggin is required for induction of the hair follicle growth phase in postnatal skin. FASEB J 15, 2205-2214, 2001). 또한, 모유두 부근의 세포 분열과 이동은 머리카락의 성장과 밀접한 관련을 갖고 있으며, 성장기에서 모유두로부터 모발이 새롭게 생성되는데, 여러 가지 사이토카인, 호르몬 등에 의해서 세포가 활성화 되어 모유두로 세포의 이동이 나타나 모발의 성장에 영향을 주게 된다(Eva M.J. Peters, Desmond J Tobin, Migration of melanoblasts into developing murine hair follicle is accompanied by transient c-kit expression, J Histochem Cytochem, 50, 6751-766, 2002; Jahoda CA, Cell movement in the hair follicle dermis-more than a two-way street? J Invest Dermatol, 1221, 1523-1747, 2003).
따라서 발모 및 탈모에는 모유두세포의 증식 및 사멸이 밀접하게 연관되어 있으므로 이의 증식을 유도함으로써 성장기를 길게 하거나 혹은 세포 사멸을 억제하고 퇴행기, 휴지기, 탈모기를 짧게 하는 것이 탈모를 개선, 치료 방안이 될 것이다. 현재 FDA에서 승인된 대표적인 약물인 미녹시딜(minoxidil)과 피나스테라이드(finasteride)는 전신의 발모 및 성기능 저하 등의 부작용이 따르고 미녹시딜의 구체적인 작용 기전 또한 명확하게 밝혀지지는 않은 상태이다. 따라서, 모낭에서 모유두세포의 증식을 촉진하고 성장인자의 발현을 증가시키면서 부작용 우려가 적은 생물학적 소재의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자는 Sirt2 단백질 또는 이의 융합 단백질이 모유두세포에서 모발성장-관련 사이토카인, 즉 VEGF 등의 발현을 증가시킴으로써 모유두세포의 증식을 촉진시킨다는 것을 밝혀냈다. 즉, 본 발명자는 Sirt2 단백질 또는 이의 융합 단백질은 모낭에서 모유두세포의 증식을 촉진함으로써, 모낭 유지 및 활성화를 통해 탈모방지 또는 발모촉진에 유용하게 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 상기 Sirt2 단백질 또는 이의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드; 또는 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 융합 단백질은 상기 Sirt2 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 TAT 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질일 수 있다. 또한 상기 융합 단백질은 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인과의 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 폴리 히스티딘 영역이 추가로 융합된 것일 수 있다.
Sirt2 단백질, 이를 코딩하는 뉴클레오티드, 또는 이의 융합 단백질이 모유두세포에서 모발성장-관련 사이토카인, 즉 VEGF 등의 발현을 증가시킴으로써 모유두세포의 증식을 촉진시킨다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, Sirt2 단백질, 이를 코딩하는 뉴클레오티드, 또는 이의 융합 단백질은 모낭에서 모유두세포의 증식을 촉진함으로써, 모낭 유지 및 활성화를 통해 탈모방지 또는 발모촉진에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pHis/TAT-Sirt2 발현 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 사람의 Sirt2 유전자를 pHis/TAT 발현 벡터에 도입하여 대장균에 형질전환한 후 단백질 발현 및 정제를 통해 얻어진 융합 단백질(TAT-Sirt2 단백질, 서열번호 10)을 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 결과를 나타낸다.
도 3은 랫트로부터 분리한 모유두세포에 본 발명에 따른 융합 단백질을 처리하여 모유두세포의 증식을 BrdU 효소면역반응 분석키트로 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 모유두세포에 본 발명에 따른 융합 단백질을 처리하여 성장인자 VEGF의 발현 정도를 분석한 결과를 나타낸다. 도 4의 위쪽 그림은 RT-PCR 후 전기영동 결과를 나타내는 사진이고, 아래 그래프는 동일한 실험을 3회 반복하여 통계 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 마우스(C57BL/6 mouse)의 등가죽 부위를 제모한 후, 본 발명에 따른 융합 단백질을 처리하였을 때의 발모 효과를 측정한 사진이다.
도 6은 모근이 제거된 마우스(C57BL/6 mouse)에 본 발명에 따른 융합 단백질(TAT-Sirt2), 식염수(Control), TAT-GFP 융합 단백질(TAT-GFP), 및 미녹시딜((Minoxidil)을 각각 처리하고, 2주후 발모 효과를 측정한 사진이다.
도 7은 모근이 제거된 마우스(C57BL/6 mouse)에 본 발명에 따른 융합 단백질(TAT-Sirt2), 식염수(Control), TAT-GFP 융합 단백질(TAT-GFP), 및 미녹시딜((Minoxidil)을 각각 처리한 후, 모낭(hair follicle)을 헤마톡실린 에오신(H&E) 염색하여 얻어진 결과이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드; 또는 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.
Sirt2 단백질은 NAD-의존성 데아세틸라아제 서튜인-2(NAD-dependent deacetylase sirtuin-2)로 지칭되는 단백질로서, 서튜인 단백질군(sirtuin family) 중 하나이다. 서튜인 단백질군은 서튜인 코어 도메인을 특징으로 하며, 전사 조절(transcriptional regulation), 세포 주기 진행(cell cycle progression), DNA-손상 복구(DNA-damage repair) 및 노화(aging)를 포함한 다양한 과정에 관여한다. Sirt2 단백질은 알파-튜블린의 Lys-40 탈아세틸화시키는 NAD-의존성 데아세틸라아제이다. 본 발명에 의해, Sirt2 단백질, 이를 코딩하는 뉴클레오티드, 또는 이의 융합 단백질이 모유두세포에서 모발성장-관련 사이토카인, 즉 VEGF 등의 발현을 증가시킴으로써 모유두세포의 증식을 촉진시킨다는 것이 밝혀졌다. 따라서, Sirt2 단백질, 이를 코딩하는 뉴클레오티드, 또는 이의 융합 단백질은 모낭에서 모유두세포의 증식을 촉진함으로써, 모낭 유지 및 활성화를 통해 탈모방지 또는 발모촉진에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 있어서, 상기 Sirt2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되며, 유효성분으로서 상기 단백질을 포함하는 약학 조성물 또는 화장료 조성물 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 있어서, 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 통상의 발현 벡터에 공지의 방법을 통하여 도입하여, 유효성분으로서 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드가 도입된 발현벡터를 포함하는 약학 조성물 또는 화장료 조성물 형태로 제조될 수 있다.
상기 발현벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, pET, pcDNA, pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호), pVL1392(PharMingen), pHis/TAT 플라스미드(Kwon JH et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun., 363, 399-404) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드가 도입된 플라스미드 발현 벡터는 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입, 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electroporation), 유전자 건(gene gun) 등의 방법에 의해 세포 내에 도입할 수 있으며, 바람직하게는, 일시적 형질감염방법을 사용할 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 허피스바이러스(herpes virus) 벡터, 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 벡터 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 바람직하게는, FDA에서 인증받은 레트로바이러스 벡터인 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용할 수 있다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986).
상기한 바와 같이, 상기 Sirt2 단백질은 그 자체로 본 발명의 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 유효성분으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 Sirt2 단백질에 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)을 융합하여 얻어진 융합 단백질의 형태로 사용된다. 이와 같이 융합 단백질의 형태로 약학 조성물 또는 화장료 조성물을 제제화할 경우, 발현 벡터 등의 사용 없이도, 효과적으로 Sirt2 단백질을 세포에 전달할 수 있다.
상기 단백질 전달 도메인은 세포 내로 단백질을 전달할 수 있는 단백질로서, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 타입 I(HIV-1)에서 유래한 TAT(trans-activating transcriptional activator); 초파리의 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia Homeodomain)인 Antp(Antennapedia 또는 penetratin) 펩타이드; 쥐의 전사인자의 Mph-1(Mutator phenotype protein 1), HSV-1(Herpes simplex virus)의 VP22(viral protein 22); 청어 프로타민의 HP4(human protamine P4); 또는 이들의 변형 펩타이드(예를 들면, TAT 단백질의 47-57 아미노산 잔기 또는 이를 변형한 펩타이드)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 융합 단백질은 생물공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Sirt2 유전자(바람직하게는, 서열번호 2의 유전자)를 PCR 방법으로 DNA 단편을 얻어 단백질 전달 도메인이 포함된 플라스미드 벡터(원핵세포 발현용 벡터 pET 등 또는 진핵 세포 발현용 벡터 pcDNA 등)에 도입한 후 발현용 세포에 형질전환시켜 단백질 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 융합 단백질은 상기 Sirt2 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 TAT 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질일 수 있으며, 예를 들어, 상기 Sirt2 단백질의 N-말단에 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 TAT 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질, 즉, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질일 수 있다. 상기 융합 단백질은 상기 TAT 단백질 전달 도메인과 상기 Sirt2 단백질 사이에 1 또는 2개의 아미노산으로 구성된 링커 단백질을 포함할 수 있다. 상기 링커 단백질은 Sirt2 유전자를 TAT 단백질 전달 도메인이 포함된 플라스미드 벡터에 클로닝하는 과정에서 도입되는 서열일 수 있으며, 예를 들어 -Gly-Ser-의 서열로 구성될 수 있다. 따라서, 상기 융합 단백질은 상기 TAT 단백질 전달 도메인과 상기 Sirt2 단백질 사이에 -Gly-Ser-의 서열로 구성된 링커 단백질을 포함하는 단백질(예를 들어, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질)일 수 있다. 또한, 상기 Sirt2 단백질과 TAT 단백질 전달 도메인과의 융합 과정에서, Sirt2 단백질의 N-말단의 첫번째 아미노산인 메티오닌(Met)가 결실될 수 있다. 따라서, 상기 융합 단백질은 상기 TAT 단백질 전달 도메인과 상기 Sirt2 단백질 사이에 -Gly-Ser-의 서열로 구성된 링커 단백질을 포함하고, 상기 Sirt2 단백질의 N-말단의 첫번째 아미노산이 결실된 단백질(예를 들어, 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질)일 수 있다.
또한, 본 발명의 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 유효성분으로 사용되는 상기 융합 단백질은 추가로 폴리 히스티딘 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 폴리 히스티딘 영역을 포함하는 융합 단백질은 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인과의 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 폴리 히스티딘 영역이 추가로 융합된 단백질일 수 있다. 상기 폴리 히스티딘 영역은 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 His-tag 서열일 수 있으며, 예를 들어 단백질 정제(예를 들어, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography))를 위한 His-tag 서열 또는 다른 펩타이드 또는 단백질 서열일 수 있으며, 예를 들어 S-tag, T7-tag, HA-tag, FLAG-tag, myc-tag, E-tag, V5-tag, Fc-tag, VSV-tag, Xpress-tag, 스트렙트아비딘 결합 단백질(streptavidin binding protein, SBP)-tag, 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(glutathione S-transferase, GST)-tag, 말토오즈-결합 단백질(maltose-binding protein, MBP)-tag, 티오레독신(thioredoxin)-tag, 키틴 결합 도메인(chitin binding domain, CBD)-tag, 케토스테로이드 아이소머라아제(ketosteroid isomerase, KSI)-tag, 디히드로폴레이트 리덕타아제(dihydrofolate reductase, DHFR)-tag), NusA-tag, intein-tag, polu(NANP)-tag, 바이오틴 카르복실 담체 단백질(biotin carboxyl carrier protein, BCCP)-tag, 형광 단백질(예를 들어, 그린 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)-tag) 등을 포함한 공지의 tag 서열일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 폴리 히스티딘 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 얻어진 융합 단백질은 서열번호 8 내지 10의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학 조성물 및/또는 화장료 조성물 형태로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드(예를 들어, 상기 뉴클레오티드가 도입된 발현 벡터의 형태); 또는 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드(예를 들어, 상기 뉴클레오티드가 도입된 발현 벡터의 형태); 또는 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질을 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물 형태일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로오숀제, 연고제, 동결건조제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 바람직하게는 외용액제, 에멀젼, 연고제 등의 경피투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 습윤제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물에 함유되는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드; 또는 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드; 또는 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질은 예를 들어, 두피 부위에 1일 0.01 내지 1 mg, 바람직하게는 0.1 내지 1 mg의 양으로 투여(예를 들어, 도포)할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.
상기 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드(예를 들어, 상기 뉴클레오티드가 도입된 발현 벡터의 형태); 또는 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질을 함유하는 향장 제품, 샴푸, 헤어로션, 헤어크림, 헤어 젤, 두피 에센스, 토닉 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드; 또는 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질의 함량은 탈모방지 또는 발모촉진 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ∼ 50 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 1 ∼ 20 중량%의 함량으로 함유될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 융합 단백질의 제조
Sirt2 단백질과 TAT 단백질 전달 도메인의 융합 단백질은 pHis/TAT 발현 벡터(Kwon JH et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun., 363, 399-404)를 이용하여 재조합 단백질 발현 및 정제에 의해 제조하였다. 서열번호 2의 Sirt2 DNA를 주형으로 하여 다음의 두 가지 프라이머 5'-GGAGAAGGATCCGACTTCCTGCGGAACTTA-3' (서열번호 11, 밑줄 BamHI 제한효소부위), 5'-GAGATGCTCGAGTCACTGGGGTTTCTC CCT-3' (서열번호 12, 밑줄 XhoI 제한효소부위)를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통하여 DNA 단편(서열번호 15)을 얻어 각각의 제한효소(BamHI/XhoI)로 잘라 pHis/TAT 발현 벡터에 넣어 재조합 발현벡터 pHis/TAT-Sirt2을 제작하였고(도 1), 이를 대장균 BL21(DE3)에 형질도입시켰다. 단백질 발현을 위해 약 4시간 동안 배양한 후 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 첨가하여 4시간 추가 배양하였다. 배양된 대장균을 원심분리로 회수하여 초음파 분쇄기로 파쇄한 후, Ni-NTA 친화성 컬럼 크로마토그래피(Ni-NTA affinity column chromatography) 방법으로 TAT-Sirt2 단백질(서열번호 10)을 분리하였다. 정제된 단백질은 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하여 확인하였다(도 2).
실시예 2: 모유두세포(dermal papilla cell)의 증식 효과
SD-랫트의 등가죽으로부터 얻은 모유두세포를 형태학적으로 확인하고, 생물학적인 표지인자로서 ALP 활성(alkaline phosphatase activity)을 측정하고, 베르시칸(versican), 넥신(nexin) 발현양을 통해 모유두세포임을 확인하였다. 얻어진 모유두세포를 10% FBS와 항생제(penicillin/streptomycin)가 첨가된 DMEM 배지에 배양하였다. 배양 3일째, 배양접시에서 세포를 떼어내 동일한 양으로 96-웰 플레이트에 옮겼다. 약 24시간 동안 배양하여 세포가 붙은 후, 실시예 1에서 얻어진 TAT-Sirt2 단백질을 농도별로 배지에 넣어 준 후 2시간 배양시키고 새로운 배지로 바꾸어 주었으며, 5% CO2, 37℃의 조건 하에서 24시간 추가 배양하였다. 세포 증식은 BrdU 효소면역반응 분석키트(Millipore)를 사용하여 분석하였다. 반응이 끝난 후 BrdU 효소면역반응 분석키트의 매뉴얼대로 시행후 450nm의 흡광 계측기로 측정하였으며, 그 결과는 도 3과 같다. 도 3의 결과로부터, 농도에 따라 유의적으로 모유두세포의 양이 증가하는 것을 알 수 있다. 이때, 도 3의 TAT-GFP은 TAT-Sirt2 단백질 제조와 동일한 방법으로 제조된 TAT-GFP(green fluorescent protein) 융합 단백질을 처리한 대조군으로서, 도 3의 세포 증식 효과는 TAT의 영향이 아니라 Sirt2 단배질에 기인하는 것임을 알 수 있다.
실시예 3: VEGF 성장인자 발현 촉진 효과
모유두세포를 항생제(penicillin/streptomycin)가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하면서 실시예 1에서 얻어진 TAT-Sirt2를 농도별로 처리하여 24시간이 지난 후 mRNA 추출 키트(Geneol)를 이용하여 mRNA를 추출하였다. 역전사 효소(Gendepot, M-MLV)를 이용하여 cDNA를 합성한 후, Taq 중합효소를 이용하여 PCR을 수행하였다. VEGF의 발현 확인을 위해 PCR에 사용한 프라이머는 5'-GACCCTGGTGGACATCTTCCA GGA-3' (서열번호 13)과 5'-GTTTAACTCAAGCTGCCTCGC-3' (서열번호 14)이었다. PCR 반응의 결과물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기 영동하여 확인하였으며, 이를 통해 성장인자 VEGF의 발현 정도를 확인하였다. 도 4의 결과로부터, TAT-Sirt2 단백질 처리 농도에 따라 발현이 증가됨을 확인할 수 있다. 도 4의 위쪽 그림은 RT-PCR 후 전기영동 결과를 나타내는 사진이고, 아래 그래프는 동일한 실험을 3회 반복하여 통계 분석하여 나타낸 그래프이다.
실시예 4: 마우스 발모 촉진 효과 확인
마우스(C57BL/6 mouse)의 등가죽 부위를 제모한 후 완충용액 PBS로 닦아내었다. 여기에 실시예 1에서 얻어진 TAT-Sirt2 단백질 20 ㎍을 각각 식염수 150 ㎕에 용해시켜 도포한 후, 흡수되도록 30초간 두들겨 주었다. 이때 대조군(Control)은 식염수만을 처리하였다. 상기 단백질 혹은 식염수 처리는 이틀에 한번씩 시도하였다. 처리 4주후에 사진 촬영한 결과는 도 5와 같다. 도 5의 결과로부터, TAT-Sirt2 단백질 처리군은 우수한 발모 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 5: 제모크림 이용 마우스 모델 이용한 발모 촉진 효과
마우스(C57BL/6 mouse)의 등가죽 부위를 제모크림(Veet, 옥시레킷벤키저, 대한민국)을 바르고 3분 후에 스패츌러(spatula)로 긁어 털과 모근을 제거한 후 PBS 완충용액으로 닦아내었다. 쥐의 피부 표피 부분 표면을 밀어 각질을 제거한 후 투명 테이프를 이용하여 추가로 각질을 제거하였다. 여기에 실시예 1에서 얻어진 TAT-Sirt2 단백질 20 ㎍을 각각 식염수 150 ㎕에 용해시켜 도포한 후 흡수되도록 30초간 두들겨 주었다. 이때 대조군(Control)은 식염수만을 처리하였고, TAT-GFP 처리군(TAT-GFP)은 TAT-GFP 단백질 20 ㎍을 각각 식염수 150 ㎕에 용해시켜 처리하였다. 또한, 미녹시딜 처리군(Minoxidil)은 5%의 농도로 식염수에 용해시킨 액(50 ㎕)을 처리하였다. 각각의 단백질, 식염수, 또는 약물 처리는 이틀에 한번씩 시도하였다. 처리 2주후에 사진 촬영한 결과는 도 6과 같다. 도 6의 결과로부터, 대조군을 포함한 다른 시험군에 비하여 TAT-Sirt2 단백질 처리군은 현저하게 우수한 발모 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
또한, 각 군의 시험동물들을 치사시킨 후, 모낭(hair follicle)을 헤마톡실린 에오신(H&E) 염색하였으며, 그 결과는 도 7과 같다. 도 7의 결과로부터, 대조군 및 다른 시험군에 비하여 TAT-Sirt2 단백질 처리군에서 진피층의 활성화 및 모낭의 숫자가 현저히 증가된 것을 확인할 수 있으며, 모낭의 모양도 길쭉하게 활성화된 것을 확인할 수 있다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Sirt2 단백질; 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드; 또는 상기 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Sirt2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드가 서열번호 2의 염기서열로 구성된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 Sirt2 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 TAT 단백질 전달 도메인이 융합된 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 TAT 단백질 전달 도메인과 상기 Sirt2 단백질 사이에 1 또는 2개의 아미노산으로 구성된 링커 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 TAT 단백질 전달 도메인과 상기 Sirt2 단백질 사이에 -Gly-Ser-의 서열로 구성된 링커 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 TAT 단백질 전달 도메인과 상기 Sirt2 단백질 사이에 -Gly-Ser-의 서열로 구성된 링커 단백질을 포함하고, 상기 Sirt2 단백질의 N-말단의 첫번째 아미노산이 결실된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 Sirt2 단백질과 단백질 전달 도메인과의 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 폴리 히스티딘 영역이 추가로 융합된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리 히스티딘 영역이 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 8 내지 10의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
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