CN112041434A - 用于美容性应用的编码一种或多种美容蛋白的重组核酸 - Google Patents

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T·派里
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Abstract

本公开提供了包含一种或多种编码一种或多种美容蛋白(例如一种或多种人胶原蛋白)的多核苷酸的重组核酸；包含所述重组核酸的病毒；包含所述重组核酸和/或所述病毒的组合物(例如美容制剂)；它们的使用方法；以及它们的制品或药盒。

Description

用于美容性应用的编码一种或多种美容蛋白的重组核酸
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年4月27日提交的美国临时申请序列号62/663,476的优先权权益，所述美国临时申请以引用的方式整体并入本文。
采用ASCII文本文件的序列表提交
采用ASCII文本文件的以下提交的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：761342000640SEQLIST.txt，记录日期：2019年4月26日，大小：437KB)。
技术领域
本公开部分地涉及包含一种或多种编码一种或多种美容蛋白(例如一种或多种人胶原(collagen)蛋白)的多核苷酸的重组核酸；包含所述重组核酸的病毒；包含所述重组核酸和/或所述病毒的组合物(例如美容制剂)；它们的使用方法；以及它们的制品或药盒。
背景技术
如同人体中的所有器官一样，皮肤随着时间的推移而经受连续以及经常是累积性的改变。皮肤的老化由于众多因素而发生，包括皮肤内的固有变化，重力的影响和作用于皮肤的面部肌肉，软组织丧失或移位、以及组织弹性的丧失。引起关注的是，皮肤的“老化”表型可由环境因素加速，最特别是长期暴露于紫外线照射(例如来自太阳)。在临床上，皮肤的老化表型可描述为起皱，下陷，和/或相比于它的年轻对应物，通常具有较小弹性和回弹力，但这个表型内的变化存在于天然时序性老化与光老化之间。
真皮细胞外基质(ECM)构成皮肤的主体，并且赋予强度与回弹力两者。胶原，作为对皮肤提供支撑的结缔组织的主要组分，随着个人年龄而降低。在老化皮肤中，胶原原纤维显示高水平的降解和断裂，并且通过真皮纤维母细胞在减弱速率下补充。这些降解和断裂的胶原束变得松散并丧失强度(从而破坏真皮ECM的结构组织)，并且无法解脱地导致皮肤的“老化”表现。
已开发用于使人皮肤的外观改进的众多皮肤护理产品。皱纹和皮肤皱褶通常用真皮和真皮下注射美容性面部填充剂治疗；然而，这种浅表方法不解决潜伏在皮肤老化下的结构变化，特别是胶原的损害或丧失。因此，存在对用以在想要抗击或逆转皮肤老化的生理影响的个体中补充、强化或替换真皮ECM组分(例如人胶原)的替代性策略的明确需要。
本文引用的所有参考资料，包括专利申请、专利公布、非专利文献和NCBI/UniProtKB/Swiss-Prot登录号，都以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度就好像已特定地和单独地指出将每个单独的参考资料以引用的方式并入一样。
发明内容
为满足这些和其他需要，本文提供了编码一种或多种美容蛋白的重组核酸(例如重组疱疹病毒基因组)，所述重组核酸供在用于美容性/美容应用(例如治疗皱纹)的病毒(例如疱疹病毒)、组合物、制剂、药剂和/或方法中使用。本发明者已显示本文所述的重组减毒病毒能够1)有效转导人表皮/真皮细胞，以及2)成功表达所编码外源性人胶原(mRNA和蛋白)，其中所述蛋白可接着定位至皮肤等同性器官型培养物中的适当区域(参见例如实施例2)。此外，本发明者已显示本文所述的病毒可在无重大宿主细胞细胞毒性下以局部或真皮内方式成功施用，从而允许在体内施用之后从这些病毒表达的人胶原定位至真皮ECM的适当区域，而无对皮肤的可观察损害(参见例如实施例3和7)。此外，本发明者已显示多种不同HSV骨架可用于构建表达人胶原的病毒(参见例如实施例2)，多种策略可用于从单一重组基因组成功表达超过一种人胶原蛋白(参见例如实施例5)，并且候选病毒可在时序性或UV诱导的皮肤老化的多个相关体外和体内模型中成功表达人胶原蛋白(参见例如实施例6和7)。此外，本发明者已显示本文所述的病毒可被成功工程化来在体外以及在体内表达其他美容蛋白(例如人层粘连蛋白(laminin))，其中这些蛋白定位至真皮ECM的适当区域(参见例如实施例8)。在不希望受理论束缚下，本文所述的数据提供强力证据表明本公开的重组核酸和/或病毒可构成一种用于递送美容蛋白(例如人胶原蛋白，诸如人胶原1和人胶原3)，并且特别是用以在美容性应用中补充或替换天然人真皮ECM蛋白(例如以减少年龄或光诱导的皱纹的出现)的新型手段。
因此，本公开的某些方面涉及一种包含编码第一多肽的第一多核苷酸的重组疱疹病毒基因组，所述第一多肽包含第一美容蛋白。在一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组包含第一多核苷酸的两个或更多个拷贝。在一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组是有复制能力的。在一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组是复制缺陷性的。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组选自重组单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus)基因组、重组水痘带状疱疹(varicella zoster)病毒基因组、重组人巨细胞病毒基因组、重组疱疹病毒6A基因组、重组疱疹病毒6B基因组、重组疱疹病毒7基因组、重组卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)相关疱疹病毒基因组以及它们的任何衍生物。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组是重组单纯疱疹病毒基因组。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组是重组1型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组、重组2型单纯疱疹病毒(HSV-2)基因组或它们的任何衍生物。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组是重组1型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组包含失活性突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，失活性突变在单纯疱疹病毒基因中。在一些实施方案中，失活性突变是单纯疱疹病毒基因的编码序列的缺失。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒基因选自感染细胞蛋白(Infected Cell Protein，ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、胸苷激酶(thymidine kinase，tk)、长独特区域(UL)41和UL55。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4基因的一个或两个拷贝中包含失活性突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22基因中包含失活性突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL41基因中包含失活性突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因的一个或两个拷贝中包含失活性突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP27基因中包含失活性突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL55基因中包含失活性突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在接合区域中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组包含接合区域的缺失。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座中的一个或两个内包含第一多核苷酸。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一美容蛋白选自第一胶原蛋白、第一纤连蛋白(fibronectin)、第一弹性蛋白(elastin)、第一光蛋白聚糖(lumican)蛋白、第一玻连蛋白(vitronectin)、第一玻连蛋白受体蛋白、第一层粘连蛋白、第一神经调质(neuromodulator)蛋白和第一原纤蛋白(fibrillin)。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一美容蛋白包含与选自SEQ ID NO:15-21以及53-64的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一美容蛋白是结构性细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)。在一些实施方案中，第一美容蛋白是胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白(例如人胶原蛋白、人弹性蛋白、人纤连蛋白或人层粘连蛋白)。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一胶原蛋白是人胶原蛋白。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一胶原蛋白选自胶原α-1(I)链多肽(COL1-1)、胶原α-2(I)链多肽(COL1-2)、胶原α-1(II)链多肽(COL2)、胶原α-1(III)链多肽(COL3)、胶原α-1(IV)链多肽(COL4-1)、胶原α-2(IV)链多肽(COL4-2)、胶原α-3(IV)链多肽(COL4-3)、胶原α-4(IV)链多肽(COL4-4)、胶原α-5(IV)链多肽(COL4-5)、胶原α-6(IV)链多肽(COL4-6)、胶原α-1(V)链多肽(COL5-1)、胶原α-2(V)链多肽(COL5-2)、胶原α-3(V)链多肽(COL5-3)、胶原α-1(VI)链多肽(COL6-1)、胶原α-2(VI)链多肽(COL6-2)、胶原α-3(VI)链多肽(COL6-3)、胶原α-4(VI)链多肽(COL6-4)、胶原α-5(VI)链多肽(COL6-5)、胶原α-6(VI)链多肽(COL6-6)、胶原α-1(VIII)链多肽(COL8)、胶原α-1(IX)链多肽(COL9-1)、胶原α-2(IX)链多肽(COL9-2)、胶原α-3(IX)链多肽(COL9-3)、胶原α-1(X)链多肽(COL10)、胶原α-1(XI)链多肽(COL11-1)、胶原α-2(XI)链多肽(COL11-2)、胶原α-1(XII)链多肽(COL12)、胶原α-1(XIII)链多肽(COL13)、胶原α-1(XIV)链多肽(COL14)、胶原α-1(XV)链多肽(COL15)、胶原α-1(XVI)链多肽(COL16)、胶原α-1(XVII)链多肽(COL17)、胶原α-1(XVIII)链多肽(COL18)、胶原α-1(XIX)链多肽(COL19)、胶原α-1(XX)链多肽(COL20)、胶原α-1(XXI)链多肽(COL21)、胶原α-1(XXII)链多肽(COL22)、胶原α-1(XXIII)链多肽(COL23)、胶原α-1(XXIV)链多肽(COL24)、胶原α-1(XXV)链多肽(COL25)、胶原α-1(XXVI)链多肽(COL26)、胶原α-1(XXVII)链多肽(COL27)和胶原α-1(XXVIII)链多肽(COL28)。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1和COL17。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一胶原蛋白包含与选自SEQ ID NO:15-21的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一胶原蛋白是COL3。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一胶原蛋白是人COL3。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一胶原蛋白包含与SEQID NO:17的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一美容蛋白不是胶原α-1(VII)链多肽(COL7)。
在一些实施方案中，第一多肽基本上由第一美容蛋白组成。在一些实施方案中，第一多肽由第一美容蛋白组成。在一些实施方案中，第一多肽包含：(a)第一美容蛋白；(b)另一美容蛋白；和(c)使(a)连接于(b)的接头多肽。在一些实施方案中，另一美容蛋白选自胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、光蛋白聚糖蛋白、玻连蛋白、玻连蛋白受体蛋白、层粘连蛋白、神经调质蛋白和原纤蛋白。在一些实施方案中，另一美容蛋白是结构性细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)。在一些实施方案中，另一美容蛋白是胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白(例如人胶原蛋白、人弹性蛋白、人纤连蛋白或人层粘连蛋白)。在一些实施方案中，另一胶原蛋白(例如另一人胶原蛋白)选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。在一些实施方案中，另一胶原蛋白(例如另一人胶原蛋白)选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7和COL17。在一些实施方案中，第一美容蛋白和另一美容蛋白是不同的。在一些实施方案中，第一美容蛋白是COL1-1(例如人COL1-1)，并且另一美容蛋白是COL1-2(例如人COL1-2)。在一些实施方案中，接头多肽是可裂解接头多肽。在一些实施方案中，接头多肽包含与选自SEQ ID NO:28-31的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一多核苷酸编码多顺反子mRNA，所述多顺反子mRNA包含：(a)编码第一多肽的第一开放阅读框(ORF)；(b)编码额外美容蛋白的第二ORF；和(c)分隔(a)和(b)的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，额外美容蛋白选自胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、光蛋白聚糖蛋白、玻连蛋白、玻连蛋白受体蛋白、层粘连蛋白、神经调质蛋白和原纤蛋白。在一些实施方案中，额外美容蛋白是结构性细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)。在一些实施方案中，额外美容蛋白是胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白(例如人胶原蛋白、人弹性蛋白、人纤连蛋白或人层粘连蛋白)。在一些实施方案中，额外胶原蛋白(例如额外人胶原蛋白)选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。在一些实施方案中，额外胶原蛋白(例如额外人胶原蛋白)选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7和COL17。在一些实施方案中，第一美容蛋白和额外美容蛋白是不同的。在一些实施方案中，第一美容蛋白是COL1-1(例如人COL1-1)，并且额外美容蛋白是COL1-2(例如人COL1-2)。在一些实施方案中，编码IRES的核酸序列与选自SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:23的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组还包含编码第二美容蛋白的第二多核苷酸。在一些实施方案中，第二美容蛋白选自胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、光蛋白聚糖蛋白、玻连蛋白、玻连蛋白受体蛋白、层粘连蛋白、神经调质蛋白和原纤蛋白。在一些实施方案中，第二美容蛋白是结构性细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)。在一些实施方案中，第二美容蛋白是胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白(例如人胶原蛋白、人弹性蛋白、人纤连蛋白或人层粘连蛋白)。在一些实施方案中，第二胶原蛋白(例如第二人胶原蛋白)选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。在一些实施方案中，第二胶原蛋白(例如第二人胶原蛋白)选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7和COL17。在一些实施方案中，第一美容蛋白和第二美容蛋白是不同的。在一些实施方案中，第一美容蛋白是COL1-1(例如人COL1-1)，并且第二美容蛋白是COL1-2(例如人COL1-2)。在一些实施方案中，第一美容蛋白是COL1-1(例如人COL1-1)，并且第二美容蛋白是COL3(例如人COL3)。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，相较于相应野生型疱疹病毒基因组，重组疱疹病毒基因组当引入靶标细胞中时具有降低的细胞毒性。在一些实施方案中，靶标细胞是表皮和/或真皮的细胞。在一些实施方案中，靶标细胞是人细胞。在一些实施方案中，靶标细胞是纤维母细胞。
本公开的其他方面涉及一种包含本文所述的任何重组疱疹病毒基因组的疱疹病毒。在一些实施方案中，疱疹病毒是有复制能力的。在一些实施方案中，疱疹病毒是复制缺陷性的。在一些实施方案中，疱疹病毒是减毒的。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，相较于相应野生型疱疹病毒，疱疹病毒具有降低的细胞毒性。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，疱疹病毒选自单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、人巨细胞病毒、疱疹病毒6A、疱疹病毒6B、疱疹病毒7和卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，疱疹病毒是单纯疱疹病毒。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒是1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)或它们的任何衍生物。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒是1型单纯疱疹病毒(HSV-1)。
本公开的其他方面涉及一种组合物，所述组合物包含：(a)本文所述的任何重组疱疹病毒基因组和/或本文所述的任何疱疹病毒；和(b)赋形剂。在一些实施方案中，组合物是无菌的。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，组合物适于局部、经皮、皮下、真皮内、口服、鼻内、气管内、舌下、经颊、经直肠、经阴道、吸入、静脉内、动脉内、肌肉内、心内、骨内、腹膜内、经粘膜、玻璃体内、视网膜下、关节内、关节周、局部或皮上施用。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，组合物适于真皮内施用。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，组合物适于浅表注射。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，组合物是美容组合物。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，组合物是皮肤护理产品。
本公开的其他方面涉及本文所述的任何重组疱疹病毒基因组和/或本文所述的任何疱疹病毒作为药剂(例如用于美容性适应症)的用途。
本公开的其他方面涉及本文所述的任何重组疱疹病毒基因组和/或本文所述的任何疱疹病毒作为疗法(例如作为美容性或美容疗法)的用途。
本公开的其他方面涉及本文所述的任何重组疱疹病毒基因组和/或本文所述的任何疱疹病毒制造可用于治疗皮肤学老化的一种或多种征象或症状的药剂的用途。
本公开的其他方面涉及一种增强、增加、加强和/或补充受试者中一种或多种真皮细胞外基质蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何疱疹病毒和/或本文所述的任何组合物。
本公开的其他方面涉及一种增强、增加、加强和/或补充受试者中一种或多种胶原蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何疱疹病毒和/或本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，一种或多种胶原蛋白是胶原3。在一些实施方案中，内源性胶原3的水平由于时序性老化或光老化而降低。
本公开的其他方面涉及一种增强、增加、加强和/或补充受试者的软组织的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何疱疹病毒和/或本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，将组合物注射至受试者的软组织中。
本公开的其他方面涉及一种使有需要的受试者的皮肤状况、品质和/或外观改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何疱疹病毒和/或本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，向一个或多个日光损害或其他UV暴露部位、粗糙纹理部位、皮肤下陷部位、皱纹部位或它们的任何组合施用组合物。
本公开的其他方面涉及一种减少有需要的受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何疱疹病毒和/或本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，皮肤中一种或多种浅表凹陷选自由以下组成的组：鼻唇皱褶、鱼尾纹(crows’feet)、皱眉纹、烦恼纹(worry line)、疤痕、眉间纹、眉下垂、泪槽、鼻颊纹、兔宝宝纹(bunny line)、面颊/面中部下垂、木偶纹(marionette line)、罂粟陷窝(poppy dimpling)、微笑纹(smile line)、笑纹(laugh line)、下巴皱痕、颈纹、颈阔肌带以及它们的任何组合。
本公开的其他方面涉及一种使有需要的受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性或张力中的至少一者增加和/或改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何疱疹病毒和/或本文所述的任何组合物。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，受试者的皮肤是老化中的皮肤。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，受试者的皮肤已由于暴露于紫外光而受损害。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，受试者的皮肤是有皱纹的。
本公开的其他方面涉及一种使有需要的受试者的一种或多种皮肤学老化征象减弱的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何疱疹病毒和/或本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，一种或多种皮肤学老化征象的减弱由以下方面指示：(a)细纹和/或皱纹得到治疗、减轻和/或预防；(b)皮肤孔尺寸得到降低；(c)皮肤厚度、饱满度和/或紧固度得到改进；(d)皮肤光滑度、柔韧性和/或柔软度得到改进；(e)皮肤色泽、光亮度和/或透明度得到改进；(f)原胶原和/或胶原产生得到改进；(g)皮肤纹理得到改进和/或再纹理化得到促进；(h)皮肤轮廓的外观得到改进；(i)皮肤光泽和/或亮度得到恢复；(j)由于老化和/或绝经而减退的皮肤外观得到改进；(k)皮肤保湿得到改进；(l)皮肤弹性和/或回弹力得到增加；(m)皮肤下陷得到治疗、减轻和/或预防；(n)皮肤紧致度得到改进；(o)色素斑点、斑点化皮肤和/或疤痕(诸如痤疮疤痕)得到减轻；(p)就光衍射或反射来说的皮肤光学性质得到改进；或(q)它们的任何组合。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，受试者是人。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，疱疹病毒或组合物局部、经皮方式、皮下方式、皮上方式、真皮内方式、口服方式、舌下方式、经颊方式、经直肠方式、经阴道方式、静脉内方式、动脉内方式、肌肉内方式、骨内方式、心内方式、腹膜内方式、经粘膜方式、玻璃体内方式、视网膜下方式、关节内方式、关节周方式、局部方式、或通过吸入来向受试者施用。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，疱疹病毒或组合物以真皮内方式向受试者施用。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，疱疹病毒或组合物通过浅表注射来施用。
本公开的其他方面涉及一种组合物，所述组合物包含：包含重组核酸的单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组核酸包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含第一人胶原蛋白；以及赋形剂。在一些实施方案中，重组核酸包含第一多核苷酸的两个或更多个拷贝。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，HSV是复制缺陷性的。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，HSV是有复制能力的。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，HSV是单纯疱疹1型病毒、单纯疱疹2型病毒或它们的任何衍生物。
在一些实施方案中，重组核酸是单纯疱疹病毒扩增子。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒扩增子是HSV-1扩增子或HSV-1杂合扩增子。在一些实施方案中，HSV-1杂合扩增子是HSV/AAV杂合扩增子、HSV/EBV杂合扩增子、以及HSV/EBV/RV杂合扩增子、或HSV/睡美人(Sleeping Beauty)杂合扩增子。
在一些实施方案中，重组核酸是重组单纯疱疹病毒基因组。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在单纯疱疹病毒基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒基因选自由感染细胞蛋白(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、胸苷激酶(tk)、长独特区域(UL)41和UL55组成的组。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4基因的一个或两个拷贝中包含失活突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22基因中包含失活性突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL41基因中包含失活突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因中包含失活突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP27基因中包含失活突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，失活性突变是一种或多种基因的编码序列的缺失。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在病毒基因座内包含第一多核苷酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含第一多核苷酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22病毒基因座内包含第一多核苷酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL41病毒基因座内包含第一多核苷酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，相较于野生型单纯疱疹病毒，HSV具有降低的细胞毒性。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一人胶原蛋白选自胶原α-1(I)链多肽(COL1-1)、胶原α-2(I)链多肽(COL1-2)、胶原α-1(II)链多肽(COL2)、胶原α-1(III)链多肽(COL3)、胶原α-1(IV)链多肽(COL4-1)、胶原α-2(IV)链多肽(COL4-2)、胶原α-3(IV)链多肽(COL4-3)、胶原α-4(IV)链多肽(COL4-4)、胶原α-5(IV)链多肽(COL4-5)、胶原α-6(IV)链多肽(COL4-6)、胶原α-1(V)链多肽(COL5-1)、胶原α-2(V)链多肽(COL5-2)、胶原α-3(V)链多肽(COL5-3)、胶原α-1(VI)链多肽(COL6-1)、胶原α-2(VI)链多肽(COL6-2)、胶原α-3(VI)链多肽(COL6-3)、胶原α-4(VI)链多肽(COL6-4)、胶原α-5(VI)链多肽(COL6-5)、胶原α-6(VI)链多肽(COL6-6)、胶原α-1(VII)链多肽(COL7)、胶原α-1(VIII)链多肽(COL8)、胶原α-1(IX)链多肽(COL9-1)、胶原α-2(IX)链多肽(COL9-2)、胶原α-3(IX)链多肽(COL9-3)、胶原α-1(X)链多肽(COL10)、胶原α-1(XI)链多肽(COL11-1)、胶原α-2(XI)链多肽(COL11-2)、胶原α-1(XII)链多肽(COL12)、胶原α-1(XIII)链多肽(COL13)、胶原α-1(XIV)链多肽(COL14)、胶原α-1(XV)链多肽(COL15)、胶原α-1(XVI)链多肽(COL16)、胶原α-1(XVII)链多肽(COL17)、胶原α-1(XVIII)链多肽(COL18)、胶原α-1(XIX)链多肽(COL19)、胶原α-1(XX)链多肽(COL20)、胶原α-1(XXI)链多肽(COL21)、胶原α-1(XXII)链多肽(COL22)、胶原α-1(XXIII)链多肽(COL23)、胶原α-1(XXIV)链多肽(COL24)、胶原α-1(XXV)链多肽(COL25)、胶原α-1(XXVI)链多肽(COL26)、胶原α-1(XXVII)链多肽(COL27)和胶原α-1(XXVIII)链多肽(COL28)。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，编码第一人胶原蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:1-14的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一人胶原蛋白包含与选自SEQ ID NO:15-21的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一人胶原蛋白不是COL7。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一多肽包含：(a)第一人胶原蛋白；(b)另一人胶原蛋白；和(c)使(a)连接于(b)的接头多肽。在一些实施方案中，接头多肽是可裂解接头多肽。在一些实施方案中，接头多肽包含与选自SEQ ID NO:28-31的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。在一些实施方案中，编码另一人胶原蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:1-14的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白包含与选自SEQ ID NO:15-21的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白和另一人胶原蛋白是不同的。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一多核苷酸编码多顺反子mRNA，所述多顺反子mRNA包含：(a)编码第一多肽的第一开放阅读框(ORF)；(b)编码额外人胶原蛋白的第二ORF；和(c)分隔(a)和(b)的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，编码IRES的核酸序列与选自SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。在一些实施方案中，编码额外人胶原蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:1-14的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白包含与选自SEQ ID NO:15-21的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白和额外人胶原蛋白是不同的。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组核酸还包含编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组核酸包含第二多核苷酸的两个或更多个拷贝。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。在一些实施方案中，编码第二人胶原蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:1-14的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白包含与选自SEQ ID NO:15-21的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白和第二人胶原蛋白是不同的。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组核酸是重组单纯疱疹病毒基因组，并且其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在病毒基因座内包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22病毒基因座内包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL41病毒基因座内包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含第一多核苷酸，并且在ICP22病毒基因座内包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含第一多核苷酸，并且在UL41病毒基因座内包含第二多核苷酸。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，赋形剂适合于经皮肤(全身性或局部)、经皮、皮下和/或真皮内施用。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，赋形剂包括羟丙基甲基纤维素凝胶。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，赋形剂适合于真皮内施用。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，赋形剂包括磷酸盐缓冲剂。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，赋形剂包括甘油。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，赋形剂包括脂质载体。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，赋形剂包括纳米粒子载体。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，组合物是美容组合物。在一些实施方案中，美容组合物是皮肤护理产品。
本公开的其他方面涉及一种包括本文所述的任何组合物和关于施用组合物的说明书的药盒。
本公开的其他方面涉及一种增强、增加、加强和/或补充受试者中一种或多种人胶原蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何组合物。
本公开的其他方面涉及一种增强、增加、加强和/或补充受试者的软组织的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，将组合物注射至受试者的软组织中。
本公开的其他方面涉及一种使有需要的受试者的皮肤品质、状况和/或外观改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，状况选自日光损害、老化、UV暴露、粗糙纹理、皮肤下陷、皱纹以及它们的任何组合。
本公开的其他方面涉及一种减少有需要的受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，组合物的施用持续至少约三个月、至少约六个月、至少约九个月或至少约12个月来减少受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现。在一些实施方案中，相较于在施用组合物之前受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现，在施用组合物之后，受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现得以减少。
本公开的其他方面涉及一种使有需要的受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性或张力中的至少一者增加和/或改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，在施用组合物之后，受试者的皮肤持续至少约三个月、至少约六个月、至少约九个月或至少约12个月来维持纹理、光滑度、弹性或张力增加和/或改进中的至少一者。在一些实施方案中，相较于在施用组合物之前受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性或张力，在施用组合物之后，受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性或张力中的至少一者得以增加和/或改进。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，受试者的皮肤是老化中的皮肤。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，受试者的皮肤已由于暴露于紫外光而受损害。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，受试者的皮肤是有皱纹的。
本公开的其他方面涉及一种使有需要的受试者的一种或多种皮肤学老化征象减弱的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，一种或多种皮肤学老化征象的减弱选自：(a)细纹和/或皱纹得到治疗、减轻和/或预防；(b)皮肤孔尺寸得到降低；(c)皮肤厚度、饱满度和/或紧固度得到改进；(d)皮肤光滑度、柔韧性和/或柔软度得到改进；(e)皮肤色泽、光亮度和/或透明度得到改进；(f)原胶原和/或胶原产生得到改进；(g)皮肤纹理得到改进和/或再纹理化得到促进；(h)皮肤轮廓的外观得到改进；(i)皮肤光泽和/或亮度得到恢复；(j)由于老化和/或绝经而减退的皮肤外观得到改进；(k)皮肤保湿得到改进；(l)皮肤弹性和/或回弹力得到增加；(m)皮肤下陷得到治疗、减轻和/或预防；(n)皮肤紧致度得到改进；(o)色素斑点、斑点化皮肤和/或痤疮疤痕得到减轻；(p)就光衍射或反射来说的皮肤光学性质得到改进；和(q)它们的任何组合。在一些实施方案中，相较于在施用组合物之前受试者的一种或多种皮肤学老化征象，在施用组合物之后，受试者的一种或多种皮肤学老化征象得到减弱。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，受试者是人。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，组合物以经皮肤(全身性或局部)方式、经皮方式、皮下方式和/或真皮内方式向受试者施用。在一些实施方案中，组合物通过浅表注射来施用。在一些实施方案中，组合物以真皮内方式向受试者施用。在一些实施方案中，向受试者施用组合物一次。在一些实施方案中，向受试者施用组合物至少两次。在一些实施方案中，在施用之间，经过至少约15、至少约30、至少约60、至少约90或至少约120天。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，向受试者的一个或多个受影响和/或未受影响区域施用组合物。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，在施用之前对皮肤进行磨削。
本公开的其他方面涉及一种包含编码第一多肽的第一多核苷酸的重组核酸，所述第一多肽包含第一人胶原蛋白，其中所述重组核酸是重组单纯疱疹病毒基因组。在一些实施方案中，重组核酸包含第一多核苷酸的两个或更多个拷贝。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在单纯疱疹病毒基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒基因选自由感染细胞蛋白(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、胸苷激酶(tk)、长独特区域(UL)41和UL55组成的组。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4基因的一个或两个拷贝中包含失活突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22基因中包含失活性突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL41基因中包含失活突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因中包含失活突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP27基因中包含失活突变。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，失活性突变是一种或多种基因的编码序列的缺失。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在病毒基因座内包含第一多核苷酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含第一多核苷酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22病毒基因座内包含第一多核苷酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL41病毒基因座内包含第一多核苷酸。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，相较于野生型单纯疱疹病毒，HSV具有降低的细胞毒性。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL2。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，编码第一人胶原蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:1-14的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一人胶原蛋白包含与选自SEQ ID NO:15-21的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一人胶原蛋白不是COL7。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一多肽包含：(a)第一人胶原蛋白；(b)另一人胶原蛋白；和(c)使(a)连接于(b)的接头多肽。在一些实施方案中，接头多肽是可裂解接头多肽。在一些实施方案中，接头多肽包含与选自SEQ ID NO:28-31的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。在一些实施方案中，编码另一人胶原蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:1-14的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白包含与选自SEQ ID NO:15-21的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白和另一人胶原蛋白是不同的。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，第一多核苷酸编码多顺反子mRNA，所述多顺反子mRNA包含：(a)编码第一多肽的第一开放阅读框(ORF)；(b)编码额外人胶原蛋白的第二ORF；和(c)分隔(a)和(b)的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，编码IRES的核酸序列与选自SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。在一些实施方案中，编码额外人胶原蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:1-14的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白包含与选自SEQ ID NO:15-21的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白和额外人胶原蛋白是不同的。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组核酸还包含编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组核酸包含第二多核苷酸的两个或更多个拷贝。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。在一些实施方案中，编码第二人胶原蛋白的核酸序列与选自SEQ ID NO:1-14的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白包含与选自SEQ ID NO:15-21的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白和第二人胶原蛋白是不同的。
在可与任何先前实施方案组合的一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在病毒基因座内包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22病毒基因座内包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL41病毒基因座内包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含第一多核苷酸，并且在ICP22病毒基因座内包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含第一多核苷酸，并且在UL41病毒基因座内包含第二多核苷酸。
本公开的其他方面涉及一种包含本文所述的任何重组核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人细胞或非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是Vero细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是补充性宿主细胞。
本公开的其他方面涉及一种收集单纯疱疹病毒的方法，所述方法包括：(a)使补充性宿主细胞与本文所述的任何重组核酸接触；以及(b)收集通过所述补充性宿主细胞产生的所述单纯疱疹病毒。
本公开的其他方面涉及一种收集单纯疱疹病毒的方法，所述方法包括：(a)培养包含本文所述的任何重组核酸的宿主细胞；以及(b)收集通过所述宿主细胞产生的所述单纯疱疹病毒。
附图说明
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图1A-图1N显示野生型和经修饰单纯疱疹病毒基因组的示意图。图1A显示野生型单纯疱疹病毒基因组。图1B显示包含ICP4(两个拷贝)和ICP22的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述多核苷酸含有可操作地连接于异源性启动子的第一人胶原多肽的编码序列。图1C显示包含ICP4(两个拷贝)的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述多核苷酸含有可操作地连接于异源性启动子的第一人胶原多肽的编码序列。图1D显示包含ICP4(两个拷贝)和ICP22的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述多核苷酸含有1)可操作地连接于第一异源性启动子的第一人胶原多肽的编码序列，和2)可操作地连接于第二异源性启动子的第二人胶原多肽的编码序列。第一人胶原多肽与第二人胶原多肽两者在相同DNA链上编码。图1E显示包含ICP4(两个拷贝)的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述多核苷酸含有1)可操作地连接于第一异源性启动子的第一人胶原多肽的编码序列，和2)可操作地连接于第二异源性启动子的第二人胶原多肽的编码序列。第一人胶原多肽与第二人胶原多肽两者在相同DNA链上编码。图1F显示包含ICP4(两个拷贝)和ICP22的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述多核苷酸含有1)可操作地连接于第一异源性启动子的第一人胶原多肽的编码序列，和2)可操作地连接于第二异源性启动子的第二人胶原多肽的编码序列。第一人胶原多肽和第二人胶原多肽在相反DNA链上编码。图1G显示包含ICP4(两个拷贝)的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述多核苷酸含有1)可操作地连接于第一异源性启动子的第一人胶原多肽的编码序列，和2)可操作地连接于第二异源性启动子的第二人胶原多肽的编码序列。第一人胶原多肽和第二人胶原多肽在相反DNA链上编码。图1H显示包含ICP4(两个拷贝)和ICP22的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述多核苷酸编码可操作地连接于异源性启动子的多顺反子mRNA。多顺反子mRNA含有由内部核糖体进入位点(IRES)分隔的第一人胶原多肽的编码序列和第二人胶原多肽的编码序列。图1I显示包含ICP4(两个拷贝)的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述多核苷酸编码可操作地连接于异源性启动子的多顺反子mRNA。多顺反子mRNA含有由内部核糖体进入位点(IRES)分隔的第一人胶原多肽的编码序列和第二人胶原多肽的编码序列。图1J显示包含ICP4(两个拷贝)和ICP22的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述多核苷酸含有可操作地连接于异源性启动子的嵌合多肽的编码序列。嵌合多肽包含由可裂解接头分隔的第一人胶原多肽的氨基酸序列和第二人胶原多肽的氨基酸序列。图1K显示包含ICP4(两个拷贝)的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述多核苷酸含有可操作地连接于异源性启动子的嵌合多肽的编码序列。嵌合多肽包含由可裂解接头分隔的第一人胶原多肽的氨基酸序列和第二人胶原多肽的氨基酸序列。图1L显示包含ICP4(两个拷贝)和ICP22的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的第一多核苷酸和整合在ICP22基因座处的第二多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述第一多核苷酸含有可操作地连接于异源性启动子的第一人胶原多肽的编码序列，所述第二多核苷酸含有可操作地连接于异源性启动子的第二人胶原多肽的编码序列。图1M显示包含ICP4(两个拷贝)、ICP22和UL41的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的第一多核苷酸和整合在UL41基因座处的第二多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述第一多核苷酸含有可操作地连接于异源性启动子的第一人胶原多肽的编码序列，所述第二多核苷酸含有可操作地连接于异源性启动子的第二人胶原多肽的编码序列。图1N显示包含ICP4(两个拷贝)和UL41的编码序列的缺失，具有整合在ICP4基因座中的每一者处的第一多核苷酸和整合在UL41基因座处的第二多核苷酸的经修饰单纯疱疹病毒基因组，所述第一多核苷酸含有可操作地连接于异源性启动子的第一人胶原多肽的编码序列，所述第二多核苷酸含有可操作地连接于异源性启动子的第二人胶原多肽的编码序列。
图2A-图2B显示携带人胶原7(COL7)表达盒的复制缺陷性单纯疱疹1型病毒的示意图。图2A显示病毒“KCA211”的示意图。图2B显示病毒“SAR-COL7”的示意图。
图3A-图3B显示用KCA211或SAR-COL7在所指示MOI下感染的HaCaT细胞中的人COL7表达。图3A显示用KCA211或SAR-COL7在所指示MOI下感染的HaCaT细胞中的人COL7表达，如通过qPCR所评估。数据显示为在相对于GAPDH加以归一化之后，相对于SAR-COL7的倍数变化。图3B显示未感染HaCaT细胞或用KCA211或SAR-COL7在所指示MOI下感染的HaCaT细胞中的人COL7表达，如通过蛋白质印迹分析所评估。
图4A-图4B显示模拟感染的从健康患者分离的原代人细胞(正常)以及模拟或SAR-COL7感染的从罹患隐性营养不良性大疱性表皮松解(RDEB)的患者分离的原代人细胞中的人COL7表达的免疫荧光图像。图4A显示模拟感染的野生型和RDEB原代人角质化细胞中或用SAR-COL7在所指示感染复数(MOI)下感染的RDEB原代人角质化细胞中的人COL7表达。图4B显示模拟感染的野生型和RDEB原代人纤维母细胞中或用SAR-COL7在所指示MOI下感染的RDEB原代人纤维母细胞中的人COL7表达。
图5A-图5B显示对模拟感染的从健康患者分离的原代人细胞以及模拟或SAR-COL7感染的从罹患隐性营养不良性大疱性表皮松解(EB)的患者分离的原代人细胞中的人COL7表达的定量PCR分析。图5A显示模拟感染的野生型(N-HDK)和RDEB(EB-HDK)原代人角质化细胞中或用SAR-COL7在所指示MOI下感染的RDEB原代人角质化细胞中的人COL7表达。COL7表达显示为相比于模拟感染的野生型原代人角质化细胞的相对倍数变化。图5B显示模拟感染的野生型(N-HDF)和RDEB(EB-HDF)原代人纤维母细胞中或用SAR-COL7在所指示MOI下感染的RDEB原代人纤维母细胞中的人COL7表达。COL7表达显示为相比于模拟感染的野生型原代人纤维母细胞的相对倍数变化。
图6A-图6B显示未感染(对照)或SAR-COL7感染的RDEB原代人角质化细胞对微孔板的未处理(塑料)或经处理孔的细胞粘附。图6A显示对未处理孔(塑料)或用递增浓度的大鼠尾胶原1处理的孔的细胞粘附。图6B显示对未处理孔(塑料)或用递增浓度的人血浆纤连蛋白处理的孔的细胞粘附。
图7显示在用SAR-COL7感染的RDEB原代人角质化细胞和纤维母细胞构建的器官型培养物中，在第5天时在基底膜区(BMZ)处，人COL7表达和沉积的代表性免疫荧光图像。角质化细胞与纤维母细胞两者均在培养物构建之后在所指示MOI下加以原位感染。
图8A-图8D显示在未感染小鼠皮肤(对照)中或在局部或真皮内递送SAR-COL7之后在小鼠皮肤中观察到的人COL7A1转录物和基因组水平，如通过qPCR所评估。误差棒代表SEM。图8A显示在感染之后第3天，小鼠皮肤中的人COL7A1转录物水平/100ng总RNA。图8B显示在感染之后第3天，小鼠皮肤中的人COL7A1 DNA拷贝数/100ng总DNA。图8C显示在感染之后第6天，小鼠皮肤中的人COL7A1转录物水平/100ng总RNA。图8D显示在感染之后第6天，小鼠皮肤中的人COL7A1 DNA拷贝数/100ng总DNA。
图9A-图9B显示在递送SAR-COL7之后，小鼠皮肤中的人COL7表达的代表性免疫荧光图像。图9A显示在真皮内递送SAR-COL7之后，小鼠皮肤中的人COL7表达的代表性免疫荧光图像。图9B显示在局部递送SAR-COL7之后，小鼠皮肤中的人COL7表达的代表性免疫荧光图像。
图10A-图10B显示在真皮内递送媒介物、SAR-COL7或KCA211之后在BALB/c小鼠皮肤中观察到的人COL7A1转录物和基因组水平，如通过qPCR所评估。图10A显示BALB/c小鼠皮肤中的人COL7A1转录物水平/100ng总RNA。图10B显示BALB/c小鼠皮肤中的人COL7A1 DNA拷贝数/100ng总DNA。
图11A-图11B显示在高剂量真皮内递送HSV-GFP(GFP对照)或SAR-COL7之后，在亚效小鼠皮肤中的每个注射部位处观察到的人COL7A1转录物和基因组水平，如通过qPCR所评估。每个棒条代表在所指示时间点的单一样品。图11A显示亚效小鼠皮肤中的人COL7A1转录物水平/100ng总RNA。图11B显示亚效小鼠皮肤中的人COL7A1 DNA拷贝数/100ng总DNA。
图12A-图12B显示在高剂量真皮内递送HSV-GFP(GFP对照)或SAR-COL7之后，亚效小鼠皮肤中的人COL7表达的代表性免疫荧光图像。图12A显示由亚效小鼠1(在第3天收集)获得的在10倍和20倍放大下的对照(GFP)和SAR-COL7免疫荧光成像。图12B显示由亚效小鼠2和亚效小鼠3(在第7天收集)获得的SAR-COL7免疫荧光成像。图代表用10倍透镜获得的16个视野的平铺图像，捕获了整个皮肤截面。
图13显示来自亚效小鼠1、2和3(在第3和3天收集)的经H&E染色样品。样品取自未处理亚效小鼠皮肤以及在真皮内递送HSV-GFP或SAR-COL7之后的亚效小鼠皮肤。
图14A-图14B显示在真皮内递送SAR-COL7之后，亚效小鼠皮肤中的人COL7表达的代表性电子显微照片图像。致密层是穿过图像的中央的所指示暗带；黑点是人COL7l的经染色NC结构域，蓝色箭号指示锚定原纤维的形成。图14A显示用对人COL7的NC2结构域具有特异性的抗体(LH24)染色的受感染亚效小鼠皮肤的电子显微照片图像。图14B显示用对人COL7的NC1结构域具有特异性的抗体(NP185)染色的受感染亚效小鼠皮肤的电子显微照片图像。
图15A-图15B显示在低剂量真皮内递送SAR-COL7之后，在亚效小鼠皮肤中的每个注射部位处观察到的人COL7A1转录物和基因组水平，如通过qPCR所评估。每个棒条代表在所指示时间点的单一样品。图15A显示亚效小鼠皮肤中的人COL7A1转录物水平/100ng总RNA。图15B显示亚效小鼠皮肤中的人COL7A1 DNA拷贝数/100ng总DNA。
图16显示在低剂量真皮内递送SAR-COL7之后，亚效小鼠皮肤(来自小鼠1)中的人COL7表达的代表性免疫荧光图像。
图17A-图17C显示在用编码单独COL1A1(插入ICP4基因座中)或COL1A1和COL1A2(分别插入ICP4和ICP22基因座中)的HSV的所指示克隆感染的Vero细胞的情况下的人COL1A1和COL1A2核酸和蛋白质分析。图17A显示在用所指示HSV克隆感染之后5天，存在于Vero细胞中的人COL1A1转录物的水平，如通过qRT-PCR分析所测定。呈现两个平行测定的数据±SEM。图17B显示在用所指示HSV克隆感染之后5天，存在于Vero细胞中的人COL1A2转录物的水平，如通过qRT-PCR分析所测定。呈现两个平行测定的数据±SEM。图17C显示在用如通过qRT-PCR确定的所指示COL1A1/COL1A2阳性克隆感染之后5天，Vero细胞中的人COL1A1和COL1A2蛋白表达的蛋白质印迹分析。未感染(模拟)Vero细胞用作阴性对照；GAPDH用作上样对照。
图18显示在用编码插入ICP4基因座中的COL1A1-IRES-COL1A2序列的HSV分离株(IRES-分离株6)感染之后5天，Vero细胞中的人COL1A1和COL1A2蛋白表达的蛋白质印迹分析。用不含有IRES构建体(无插入)的分离株进行的感染用作阴性对照；GAPDH用作上样对照。
图19A-图19B显示在用C3vec01感染的永生化人角质化细胞(HaCaTs)的情况下的人COL3核酸和蛋白质分析。图19A显示在用C3vec01在所指示MOI下感染之后，存在于永生化人角质化细胞(HK)中的人COL3A1转录物的水平。未感染(模拟)和HSV-mCherry感染(mCherry)细胞用作阴性对照。呈现两个平行测定的数据±SEM。图19B显示在用C3vec01在所指示MOI下感染之后48小时，永生化人角质化细胞中的人COL3蛋白表达的代表性免疫荧光图像。未感染(模拟)细胞用作阴性对照。
图20A-图20B显示在用C3vec01感染的永生化人真皮纤维母细胞(HDF)的情况下的人COL3核酸和蛋白质分析。图20A显示在用C3vec01在所指示MOI下感染之后，存在于永生化人真皮纤维母细胞(HDF)中的人COL3A1转录物的水平。未感染(模拟)和HSV-mCherry感染(mCherry)细胞用作阴性对照。呈现两个平行测定的数据±SEM。图20B显示在用C3vec01在所指示MOI下感染之后48小时，永生化人真皮纤维母细胞中的人COL3蛋白表达的代表性免疫荧光图像。未感染(模拟)细胞用作阴性对照。
图21A-图21D显示在用C3vec01在所指示MOI下感染的来源于两个不同供应商的老化原代人纤维母细胞(HDF)的情况下的人COL3核酸和蛋白质分析。图21A显示在用C3vec01在所指示MOI下感染之后，存在于从65岁女性患者或73岁男性患者收集的原代HDF(供应商1)中的人COL3A1转录物的水平。未感染(模拟)细胞用作阴性对照。呈现两个平行测定的数据±SEM。图21B显示在用C3vec01在所指示MOI下感染之后，从73岁男性患者收集的原代HDF(供应商1)中的人COL3A1蛋白表达的蛋白质印迹分析。未感染(模拟)细胞用作阴性对照；重组人COL3A1(rCOL3A1)用作阳性对照；GAPDH用作上样对照。图21C显示在用C3vec01在所指示MOI下感染之后，存在于从75岁女性患者或73岁男性患者收集的原代HDF(供应商2)中的人COL3A1转录物的水平。未感染(模拟)细胞用作阴性对照。呈现两个平行测定的数据±SEM。图21D显示在用C3vec01在所指示MOI下感染之后，从75岁女性患者收集的原代HDF(供应商2)中的人COL3A1蛋白表达的蛋白质印迹分析。未感染(模拟)细胞用作阴性对照；重组人COL3A1(rCOL3A1)用作阳性对照；GAPDH用作上样对照。
图22A-图22B显示在UV暴露后，在永生化人真皮纤维母细胞(HDF)的情况下的人COL3核酸和蛋白质分析。图22A显示在暴露于各种剂量和时间的UV光之后24小时，分泌至培养的HDF的上清液中的COL3的浓度，如通过ELISA所评估。从并行培养的非UV暴露(-UV)HDF收集的上清液用作对照。图22B显示在用C3vec01在所指示MOI下感染之后，存在于UV暴露的永生化人真皮纤维母细胞(HDF)中的人COL3A1转录物的水平。未感染(模拟)和HSV-mCherry感染(mCherry)细胞用作阴性对照。呈现两个平行测定的数据±SEM。
图23A-图23C显示在真皮内施加之后48小时，取自经对照或C3vec01处理的年轻(6-8周龄)和年老(约13月龄)C57BL/6小鼠的皮肤活检体的COL3核酸和蛋白质分析。图23A显示在真皮内施用C3vec01或媒介物对照之后48小时，存在于取自年轻和年老小鼠的皮肤活检体中的人COL3A1 DNA的水平，如通过qPCR分析所评估。图23B显示在真皮内施用C3vec01或媒介物对照之后48小时，存在于取自年轻和年老小鼠的皮肤活检体中的人COL3A1转录物的水平，如通过qRT-PCR分析所评估。对于qPCR和qRT-PCR分析中的每种条件，数据呈现为四个组织样品(两个平行测定/组织样品)的平均值±SEM。图23C显示在真皮内施用C3vec01之后48小时，取自年轻和年老小鼠的皮肤活检体中的人COL3表达的代表性免疫荧光图像。真皮内施用了单独媒介物的年轻小鼠用作阴性对照。DAPI染色用于使核显现。
图24A-图24B显示用所指示病毒分离株感染的Vero细胞中野生型(WT)人LamB3的表达。图24A显示受感染Vero细胞中野生型人LAMB3的表达，如通过qPCR分析所评估。图24B显示受感染Vero细胞中野生型人LamB3蛋白的表达，如通过蛋白质印迹所评估。
图25显示用所指示病毒分离株感染的Vero细胞中野生型(WT)或密码子优化(CO)人LamB3蛋白的表达，如通过蛋白质印迹所评估。未感染Vero细胞用作阴性对照。
图26显示用所指示病毒分离株感染的原代人角质化细胞中野生型(WT)或密码子优化(CO)人LamB3蛋白的表达，如通过蛋白质印迹所评估。未感染原代角质化细胞用作阴性对照。
图27A-图27C显示用所指示病毒分离株感染的Vero细胞中野生型(WT)和密码子优化(CO)人LamC2的表达。图27A显示受感染Vero细胞中野生型人LAMC2的表达，如通过qPCR分析所评估。图27B显示受感染Vero细胞中密码子优化人LAMC2的表达，如通过qPCR分析所评估。图27C显示受感染Vero细胞中野生型和密码子优化人LamC2蛋白的表达，如通过蛋白质印迹所评估。选择表达密码子优化LamC2的框示病毒分离株“LGA”用于进行额外实验。
图28A-图28C显示在所指示感染复数(MOI)下受感染的永生化原代人角质化细胞中从病毒分离株“LGA”表达的人LAMC2。图28A显示在用病毒分离株“LGA”在所指示MOI下感染之后，原代永生化人角质化细胞中的病毒基因组拷贝数。图28B显示在用病毒分离株“LGA”在所指示MOI下感染之后，原代永生化人角质化细胞中表达的密码子优化LAMC2的转录物水平。图28C显示在用病毒分离株“LGA”在所指示MOI下感染之后，原代永生化人角质化细胞中人LamC2蛋白的表达，如通过蛋白质印迹所评估。
图29A-图29D显示在真皮内施加之后72小时，取自经对照(媒介物)或HSV分离株“LGA”处理小鼠的皮肤活检体的LAMC2核酸和蛋白质分析。图29A显示经处理动物上的真皮内注射部位的示意图。图29B显示在真皮内施用HSV分离株LGA或媒介物对照之后72小时，存在于取自小鼠的皮肤活检体中的人LAMC2 DNA的水平，如通过qPCR分析所评估。图29C显示在真皮内施用HSV分离株LGA或媒介物对照之后72小时，存在于取自小鼠的皮肤活检体中的人LAMC2转录物的水平，如通过qRT-PCR分析所评估。对于qPCR和qRT-PCR分析中的每种条件，数据呈现为两个平行测定的平均值±SEM。图29D显示在真皮内施用HSV分离株LGA之后72小时，取自小鼠的皮肤活检体中的人LAMC2表达的代表性免疫荧光图像。真皮内施用单独媒介物的部位用作阴性对照。DAPI染色用于使核显现；pKal染色用于使小鼠层粘连蛋白-332显现。
具体实施方式
在一些实施方案中，本公开涉及编码一种或多种美容蛋白的重组核酸(例如重组疱疹病毒基因组)，以及这些重组核酸在用于将一种或多种美容蛋白递送至皮肤，诸如向皮肤上，向皮肤中和/或穿过皮肤(例如向真皮ECM)进行递送的病毒(例如在疱疹病毒)、组合物、制剂、药剂和/或方法中的用途。在一些实施方案中，本公开涉及编码一种或多种美容蛋白的重组核酸(例如重组疱疹病毒基因组)，以及这些重组核酸在用以增加、加强和/或补充一种或多种真皮ECM蛋白(例如一种或多种胶原蛋白)的病毒(例如在疱疹病毒)、组合物、制剂、药剂和/或方法中的用途。在一些实施方案中，本公开涉及编码一种或多种美容蛋白的重组核酸(例如重组疱疹病毒基因组)，以及这些重组核酸在处于美容性情形下(例如用以减轻一种或多种皮肤学老化征象)的病毒(例如在疱疹病毒)、组合物、制剂、药剂和/或方法中的用途。在一些实施方案中，本公开涉及包含重组疱疹病毒载体的组合物以及包括向哺乳动物的皮肤上，向哺乳动物的皮肤中和/或穿过哺乳动物的皮肤递送所述重组疱疹病毒载体的方法，其中所述重组疱疹病毒载体包含在哺乳动物细胞中可操作的启动子和被表达来在哺乳动物皮肤中实现美容作用的异源性核酸。异源性核酸可递送至哺乳动物的哺乳动物靶标皮肤细胞，包括使所述哺乳动物的表皮、真皮或皮下组织与包含重组疱疹病毒载体的组合物在向所述表皮、真皮或皮下组织上，向所述表皮、真皮或皮下组织中，和/或穿过所述表皮、真皮或皮下组织运送所述重组疱疹病毒载体，并且引入它在其中表达的所述靶标皮肤细胞中所凭借的条件下接触。在不希望受理论束缚下，据信向个体施用本文所述的重组核酸、病毒和/或制剂中的一者或多者将允许功能性真皮ECM蛋白(例如人胶原)在所述个体中的产生增加。此外，在不希望受理论束缚下，据信通过施用本文所述的重组核酸、病毒和/或制剂中的一者或多者来增加、加强和/或补充个体中美容蛋白的水平将导致以下中的至少一者：1)软组织的增强、加强和/或补充；2)皮肤品质、状况和/或外观的改进；3)皮肤中一种或多种浅表凹陷(例如皱纹)的减少；4)皮肤的纹理、光滑度、弹性和/或张力的改进；和/或5)一种或多种皮肤学老化征象的减轻。最后，在不希望受理论束缚下，据信本文所述的重组核酸、病毒、组合物和方法提供了一种用于在美容性环境中递送功能性美容蛋白的新型策略。
以下描述阐述示例性方法、参数等。然而，应认识到这种描述不意图作为对本公开的范围的限制，而是代之以作为对示例性实施方案的描述而提供。
I.一般性技术
本文中描述或参考的技术和程序通常由本领域技术人员所充分了解，并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用，所述方法诸如像以下中描述的广泛利用的方法：Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel等人编,(2003))；丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))；Harlow和Lane编(1988)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)PlenumPress；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)。
II.定义
在详细描述本公开之前，应了解本公开不限于毫无疑问可变化的特定组合物或生物系统。还应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图具有限制性。
如本文所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”包括复数个(种)指示物。因此，举例来说，提及“一个(种)分子”任选地包括两个(种)或更多个(种)所述分子的组合，以此类推。
如本文所用，术语“和/或”可包括相关所列条目中的一者或多者的任何和所有组合。举例来说，术语“a和/或b”可指“单独a”、“单独b”、“a或b”或“a和b”；术语“a、b和/或c”可指“单独a”、“单独b”、“单独c”、“a或b”、“a或c”、“b或c”、“a、b或c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”、或“a、b和c”；等。
如本文所用，术语“约”是指相应值的易于为本技术领域中的熟练人士所知的通常误差范围。在本文中提及“约”某一值或参数包括(并且描述)有关那个值或参数本身的实施方案。
应了解，本公开的方面和实施方案包括“包含”、“由……组成”以及“基本上由……组成”方面和实施方案。
如本文所用，术语“多核苷酸”“核酸序列”、“核酸”以及它们的变化形式对于以下各物来说将是通用的：多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)、是嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的任何其他类型的多核苷酸、以及含有非核苷酸骨架的其他聚合物，前提是所述聚合物以允许进行如见于DNA和RNA中的碱基配对和碱基堆积的构型含有核苷碱基。因此，这些术语包括已知类型的核酸序列修饰，例如用类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的取代，以及核苷酸间修饰。
如本文所用，当将核酸与另一核酸序列放置成功能性关系时，所述核酸是“操作性地连接的”或“可操作地连接的”。举例来说，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么所述启动子或增强子可操作地连接于所述序列；或如果使核糖体结合位点定位以便促进翻译，那么所述核糖体结合位点可操作地连接于编码序列。通常，“操作性地连接”或“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是邻接的。
如本文所用，术语“载体”是指用于将异源性核酸引入细胞中以达成其表达或复制的离散元件。表达载体包括能够表达与调控序列诸如启动子区域操作性地连接的核酸的载体，所述调控序列能够实现所述核酸的表达。因此，表达载体可指在引入适当宿主细胞中后导致核酸的表达的DNA或RNA构建体，诸如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体。适当表达载体为本领域技术人员所熟知，并且包括可在真核细胞中复制的那些，以及保持游离的那些或整合至宿主细胞基因组中的那些。
如本文所用，“开放阅读框”或“ORF”是指编码蛋白质或多肽的一段连续DNA或RNA核酸。通常，核酸包含翻译起始信号或起始密码子诸如ATG或AUG，以及终止密码子。
如本文所用，“非翻译区”或“UTR”是指在开放阅读框的5’和/或3’末端的非翻译核酸。在多核苷酸中包括一个或多个UTR可影响所述多核苷酸的转录后调控、mRNA稳定性和/或翻译。
如本文所用，术语“转基因”是指在引入细胞中之后能够在适当条件下转录成RNA并翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面，它对它被引入其中的细胞赋予所需性质，或另外导致所需美容、治疗或诊断效果。
如本文所用，术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可互换使用，并且可指两个或更多个氨基酸的聚合物。
如本文所用，“受试者”、“宿主”或“个体”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物、以及动物园动物、运动动物或玩赏动物，诸如狗、马、猫、母牛，以及研究中使用的动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠、兔和非人灵长类动物等。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
如本文所用，术语“药物制剂”或“药物组合物”是指呈容许一种或多种活性成分的生物活性有效的形式，并且不含有对组合物或制剂将施用的受试者具有不可接受毒性的额外组分的制剂。“药学上可接受的”赋形剂(例如媒介物、添加剂)是可合理地向受试者施用以提供所采用的一种或多种活性成分的有效剂量的那些。
如本文所用，“经皮肤施用”或“以经皮肤方式施用”是指通过使包含组合物的制剂直接地或以其他方式与受试者的皮肤的全部(“全身性”)或一部分(“局部”)接触来向受试者递送组合物。所述术语涵盖若干施用途径，包括但不限于局部和经皮。局部施用可用作一种用以将组合物递送至受试者的表皮或真皮或它们的特定层的手段。
如本文所用，“治疗”是指旨在在临床病变的过程期间改变所治疗的个体或细胞的天然过程的临床干预。合乎需要的治疗作用包括降低疾病/病症/缺陷进展的速率，改善或缓和疾病/病症/缺陷状态，以及缓解或改进预后。举例来说，如果一种或多种与皮肤学老化相关的症状得以减轻、缓和或消除，包括减少或消除皱纹，那么个体被成功“治疗”。
如本文所用，术语“延迟疾病/病症/缺陷的进展”是指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或延后所述疾病/病症/缺陷(例如皮肤皱纹)的发展。视疾病/病症/缺陷的历史和/或所治疗的个体而定，这个延迟可具有不同时长或时间。如为本领域普通技术人员所显而易知，充分或显著延迟可实际上涵盖预防，因为个体不显现疾病/病症/缺陷。
III.重组核酸
本公开的某些方面涉及包含一种或多种编码美容蛋白的多核苷酸(例如一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种等)的重组核酸(例如经分离重组核酸)。本文描述或本领域中已知的任何适合美容蛋白都可由本公开的多核苷酸编码，所述美容蛋白包括例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、光蛋白聚糖、玻连蛋白/玻连蛋白受体、层粘连蛋白、神经调质、原纤蛋白、额外真皮ECM蛋白等。在一些实施方案中，美容蛋白是结构性细胞外基质蛋白(例如胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)。在一些实施方案中，美容蛋白是胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白(例如人胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白)。
在一些实施方案中，本公开涉及包含一种或多种编码胶原蛋白的多核苷酸(例如一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种等)的重组核酸(例如经分离重组核酸)。在一些实施方案中，胶原蛋白是人胶原蛋白。在一些实施方案中，本公开涉及包含一种或多种编码同三聚胶原(例如同三聚人胶原，诸如人胶原3(例如包括三个COL3A1(COL3)多肽)或人胶原7(例如包含三个COL7A1(COL7)多肽))的多核苷酸的重组核酸。在一些实施方案中，本公开涉及包含一种或多种编码异三聚胶原(例如异三聚人胶原，诸如人胶原1(例如包含两个COL1A1(COL1-1)多肽和一个COL1A2(COL1-2)多肽)或人胶原4(例如包含两个COL4A1(COL4-1)多肽和一个COL4A2(COL4-2)多肽))的多核苷酸的重组核酸。在一些实施方案中，本公开涉及包含一种或多种编码同三聚胶原和异三聚胶原的多核苷酸的重组核酸(例如包含一种或多种编码人胶原1和人胶原3的多核苷酸的重组核酸)。在一些实施方案中，本公开涉及包含一种或多种编码人胶原1的多核苷酸的重组核酸。在一些实施方案中，本公开涉及包含一种或多种编码人胶原3的多核苷酸的重组核酸。
在一些实施方案中，本公开涉及包含编码第一多肽的第一多核苷酸的重组核酸，所述第一多肽包含第一美容蛋白(例如第一人胶原蛋白)。在一些实施方案中，第一多肽基本上由第一美容蛋白组成或由第一美容蛋白组成(例如基本上由第一人胶原蛋白组成或由第一人胶原蛋白组成)。在一些实施方案中，本公开涉及包含编码第一多肽的第一多核苷酸的重组核酸，所述第一多肽包含：第一美容蛋白(例如第一人胶原蛋白)、接头多肽以及另一美容蛋白(例如另一人胶原蛋白)。在一些实施方案中，第一美容蛋白和另一美容蛋白(例如第一人胶原蛋白和另一人胶原蛋白)是相同的。在一些实施方案中，第一美容蛋白和另一美容蛋白(例如第一人胶原蛋白和另一人胶原蛋白)是不同的。在一些实施方案中，接头多肽是可裂解接头多肽。
在一些实施方案中，本公开涉及包含编码第一多肽的第一多核苷酸的重组核酸，所述第一多肽包含第一美容蛋白(例如第一人胶原蛋白)，其中所述第一多核苷酸编码多顺反子mRNA，所述多顺反子mRNA包含：编码所述第一多肽的第一开放阅读框(ORF)、内部核糖体进入位点(IRES)、以及编码额外美容蛋白(例如额外人胶原蛋白)的第二ORF。在一些实施方案中，第一美容蛋白和额外美容蛋白(例如第一人胶原蛋白和额外人胶原蛋白)是相同的。在一些实施方案中，第一美容蛋白和额外美容蛋白(例如第一人胶原蛋白和额外人胶原蛋白)是不同的。
在一些实施方案中，本公开涉及重组核酸，所述重组核酸包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含第一美容蛋白(例如第一人胶原蛋白)；以及编码第二美容蛋白(例如第二人胶原蛋白)的第二多核苷酸。在一些实施方案中，第一美容蛋白和第二美容蛋白(例如第一人胶原蛋白和第二人胶原蛋白)是相同的。在一些实施方案中，第一美容蛋白和第二美容蛋白(例如第一人胶原蛋白和第二人胶原蛋白)是不同的。
在一些实施方案中，重组核酸是载体。在一些实施方案中，重组核酸是病毒载体。在一些实施方案中，重组核酸是疱疹病毒载体。在一些实施方案中，重组核酸是单纯疱疹病毒扩增子。在一些实施方案中，重组核酸是重组疱疹病毒基因组。在一些实施方案中，重组核酸是重组单纯疱疹病毒基因组。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组是重组1型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组。
编码美容蛋白的多核苷酸
编码胶原蛋白的多核苷酸
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含一种或多种包含胶原基因的编码序列的多核苷酸的重组核酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何胶原基因(包括其任何亚型)的编码序列都可由本公开的多核苷酸编码，所述胶原基因包括例如人胶原基因(参见例如NCBI基因标识符：1277、1278、1281、1282、1284、1291、1294、1308等)、小鼠胶原基因(参见例如NCBI基因标识符：12842、12843、12825、12826、12827、12833、12836、12821等)、黑猩猩胶原基因(参见例如NCBI基因标识符：104001053、455117、459815、452689、452661、450204、101056895、101058306等)、大鼠胶原基因(参见例如NCBI基因标识符：29393、84352、84032、290905、306628、294337、301012、294027等)、兔胶原基因(参见例如NCBI基因标识符：100347598、100008997、100009177、100358256、100358522、100343947、100356561、100339335等)等。鉴定来自额外物种的胶原基因同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知，包括例如使用核酸序列比对程序诸如
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blastn套件。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与本文描述或本领域中已知的任何胶原基因(和/或其编码序列)的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含本文描述或本领域中已知的任何胶原基因的编码序列的密码子优化变体。在一些实施方案中，相较于相应非密码子优化野生型序列的异源性表达的稳定性和/或产率，胶原基因的编码序列的密码子优化变体的使用使所编码胶原蛋白在靶标细胞(诸如表皮和/或真皮的细胞)中的异源性表达(RNA和/或蛋白质)的稳定性和/或产率增加。可使用本领域中已知的用于针对在一种或多种靶标细胞(例如一种或多种人细胞)中的表达对序列进行密码子优化的任何适合方法，包括例如通过由Fath等人(PLoS One.2011年3月3日；6(3):e17596)描述的方法。
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种包含人胶原基因的编码序列的多核苷酸(即一种或多种第一多核苷酸和/或一种或多种第二多核苷酸)。本领域中已知的任何适合人胶原基因(包括其任何亚型)都可由本公开的核酸编码，所述人胶原基因包括例如COL1A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1277；SEQ ID NO:1)、COL1A2基因(参见例如NCBI基因标识符：1278；SEQ ID NO:3)、COL2A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1280)、COL3A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1281；SEQ ID NO:5)、COL4A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1282；SEQ ID NO:7)、COL4A2基因(参见例如NCBI基因标识符：1284)、COL4A3基因(参见例如NCBI基因标识符：1285)、COL4A4基因(参见例如NCBI基因标识符：1286)、COL4A5基因(参见例如NCBI基因标识符：1287)、COL4A6基因(参见例如NCBI基因标识符：1288)、COL5A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1289)、COL5A2基因(参见例如NCBI基因标识符：1290)、COL5A3基因(参见例如NCBI基因标识符：50509)、COL6A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1291；SEQID NO:9)、COL6A2基因(参见例如NCBI基因标识符：1292)、COL6A3基因(参见例如NCBI基因标识符：1293)、COL6A4基因(参见例如NCBI基因标识符：344875)、COL6A5基因(参见例如NCBI基因标识符：256076)、COL6A6基因(参见例如NCBI基因标识符：131873)、COL7A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1294；SEQ ID NO:10)、COL8A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1295)、COL9A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1297)、COL9A2基因(参见例如NCBI基因标识符：1298)、COL9A3基因(参见例如NCBI基因标识符：1299)、COL10A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1300)、COL11A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1301)、COL11A2基因(参见例如NCBI基因标识符：1302)、COL12A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1303)、COL13A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1305)、COL14A1基因(参见例如NCBI基因标识符：7373)、COL15A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1306)、COL16A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1307)、COL17A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1308；SEQ ID NO:12)、COL18A1基因(参见例如NCBI基因标识符：80781)、COL19A1基因(参见例如NCBI基因标识符：1310)、COL20A1基因(参见例如NCBI基因标识符：57642)、COL21A1基因(参见例如NCBI基因标识符：81578)、COL22A1基因(参见例如NCBI基因标识符：169044)、COL23A1基因(参见例如NCBI基因标识符：91522)、COL24A1基因(参见例如NCBI基因标识符：255631)、COL25A1基因(参见例如NCBI基因标识符：84570)、COL26A1基因(参见例如NCBI基因标识符：136227)、COL27A1基因(参见例如NCBI基因标识符：85301)、COL28A1基因(参见例如NCBI Gene ID:340267)等。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(即一种或多种第一多核苷酸和/或一种或多种第二多核苷酸)包含与本文描述或本领域中已知的任何人胶原基因(和/或其编码序列)的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸(即一种或多种第一多核苷酸和/或一种或多种第二多核苷酸)包含本文所述的任何人胶原基因的密码子优化变体。在一些实施方案中，相较于相应非密码子优化野生型序列的异源性表达的稳定性和/或产率，人胶原基因的密码子优化变体的使用使人胶原在靶标细胞(诸如人角质化细胞或纤维母细胞)中的异源性表达(RNA和/或蛋白质)的稳定性和/或产率增加。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人COL1A1基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000但少于4395个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸1-4392的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的核酸1-4392的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人COL1A2基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000但少于4101个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核酸1-4098的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:3或SEQID NO:4的核酸1-4098的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人COL3A1基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000但少于4401个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核酸1-4398的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:5或SEQID NO:6的核酸1-4398的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人COL4A1基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500、至少5000但少于5010个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核酸1-5007的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQID NO:7或SEQ ID NO:8的核酸1-5007的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人COL6A1基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000但少于3087个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核酸1-3084的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核酸1-3084的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人COL7A1基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500、至少5000、至少5500、至少6000、至少6500、至少7000、至少7500、至少8000、至少8500但少于8835个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核酸1-8832的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12的核酸1-8832的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人COL17A1基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000但少于4494个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的核酸1-4491的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的核酸1-4491的序列。
在一些实施方案中，本公开的编码一种或多种人胶原蛋白(例如第一人胶原蛋白、另一人胶原蛋白、额外人胶原蛋白和/或第二人胶原蛋白)的多核苷酸与选自SEQ ID NO:1-14的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，本公开的编码一种或多种人胶原蛋白(例如第一人胶原蛋白、另一人胶原蛋白、额外人胶原蛋白和/或第二人胶原蛋白)的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:1-14的序列。
编码纤连蛋白的多核苷酸
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含一种或多种包含纤连蛋白基因的编码序列的多核苷酸的重组核酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何纤连蛋白基因(包括其任何亚型)的编码序列都可由本公开的多核苷酸编码，所述纤连蛋白基因包括例如人纤连蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：2335)、小鼠纤连蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：14268)、黑猩猩纤连蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：459926)、大鼠纤连蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：25661)、兔纤连蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：100328589)等。鉴定来自额外物种的纤连蛋白基因同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与本文描述或本领域中已知的任何纤连蛋白基因(和/或其编码序列)的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含本文描述或本领域中已知的任何纤连蛋白基因(和/或其编码序列)的密码子优化变体。
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种包含人纤连蛋白基因的编码序列的多核苷酸(即一种或多种第一多核苷酸和/或一种或多种第二多核苷酸)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人FN1基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少约4500、至少约5000、至少约5500、至少约6000、至少约6500、至少约7000但少于7434个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的核酸1-7431的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:35或SEQID NO:36的核酸1-7431的序列。
编码弹性蛋白的多核苷酸
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含一种或多种包含弹性蛋白基因的编码序列的多核苷酸的重组核酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何弹性蛋白基因(包括其任何亚型)的编码序列都可由本公开的多核苷酸编码，所述弹性蛋白基因包括例如人弹性蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：2006)、小鼠弹性蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：13717)、黑猩猩弹性蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：463943)、大鼠弹性蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：25043)、兔弹性蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：100344271)等。鉴定来自额外物种的弹性蛋白基因同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与本文描述或本领域中已知的任何弹性蛋白基因(和/或其编码序列)的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含本文描述或本领域中已知的任何弹性蛋白基因(和/或其编码序列)的密码子优化变体。
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种包含人弹性蛋白基因的编码序列的多核苷酸(即一种或多种第一多核苷酸和/或一种或多种第二多核苷酸)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人ELN基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2250但少于2361个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的核酸1-2358的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的核酸1-2358的序列。
编码光蛋白聚糖蛋白的多核苷酸
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含一种或多种包含光蛋白聚糖基因的编码序列的多核苷酸的重组核酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何光蛋白聚糖基因(包括其任何亚型)的编码序列都可由本公开的多核苷酸编码，所述光蛋白聚糖基因包括例如人光蛋白聚糖基因(参见例如NCBI基因标识符：4060)、小鼠光蛋白聚糖基因(参见例如NCBI基因标识符：17022)、黑猩猩光蛋白聚糖基因(参见例如NCBI基因标识符：452119)、大鼠光蛋白聚糖基因(参见例如NCBI基因标识符：81682)、兔光蛋白聚糖基因(参见例如NCBI基因标识符：100008665)等。鉴定来自额外物种的光蛋白聚糖基因同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与本文描述或本领域中已知的任何光蛋白聚糖基因(和/或其编码序列)的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含本文描述或本领域中已知的任何光蛋白聚糖基因(和/或其编码序列)的密码子优化变体。
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种包含人光蛋白聚糖基因的编码序列的多核苷酸(即一种或多种第一多核苷酸和/或一种或多种第二多核苷酸)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人LUM基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000但少于1017个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40的核酸1-1014的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:39或SEQ ID NO:40的核酸1-1014的序列。
编码玻连蛋白和玻连蛋白受体蛋白的多核苷酸
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含一种或多种包含玻连蛋白或玻连蛋白受体基因的编码序列的多核苷酸的重组核酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何玻连蛋白或玻连蛋白受体基因(包括其任何亚型)的编码序列都可由本公开的多核苷酸编码，所述玻连蛋白或玻连蛋白受体基因包括例如人玻连蛋白或玻连蛋白受体基因(参见例如NCBI基因标识符：7448和3685)、小鼠玻连蛋白或玻连蛋白受体基因(参见例如NCBI基因标识符：22370和16410)、黑猩猩玻连蛋白或玻连蛋白受体基因(参见例如NCBI基因标识符：738261和459807)、大鼠玻连蛋白或玻连蛋白受体基因(参见例如NCBI基因标识符：29169和257645)、兔玻连蛋白或玻连蛋白受体基因(参见例如NCBI基因标识符：100009128和100008956)等。鉴定来自额外物种的玻连蛋白或玻连蛋白受体基因同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与本文描述或本领域中已知的任何玻连蛋白或玻连蛋白受体基因(和/或其编码序列)的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含本文描述或本领域中已知的任何玻连蛋白或玻连蛋白受体基因(和/或其编码序列)的密码子优化变体。
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种包含人玻连蛋白或玻连蛋白受体基因的编码序列的多核苷酸(即一种或多种第一多核苷酸和/或一种或多种第二多核苷酸)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人VTN基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:41或SEQID NO:42的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少约1250但少于1437个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的核酸1-1034的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的核酸1-1034的序列。
编码层粘连蛋白的多核苷酸
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含一种或多种包含层粘连蛋白基因的编码序列的多核苷酸的重组核酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何层粘连蛋白基因(包括其任何亚型)的编码序列都可由本公开的多核苷酸编码，所述层粘连蛋白基因包括例如人层粘连蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：284217、3908、3909、3910、3911、3912、3913、3914、3915、3918和10319)、小鼠层粘连蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：16774、16780和16782)、黑猩猩层粘连蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：455339、469668和457571)、大鼠层粘连蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：307582、305078和192362)、兔层粘连蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：100346886和100342905)等。鉴定来自额外物种的层粘连蛋白基因同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与本文描述或本领域中已知的任何层粘连蛋白基因(和/或其编码序列)的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含本文描述或本领域中已知的任何层粘连蛋白基因(和/或其编码序列)的密码子优化变体。
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种包含人层粘连蛋白基因的编码序列的多核苷酸(即一种或多种第一多核苷酸和/或一种或多种第二多核苷酸)，所述人层粘连蛋白基因诸如是人LAMA1基因(参见例如NCBI基因标识符：284217)、人LAMA2基因(参见例如NCBI基因标识符：3908)、人LAMA3基因(参见例如NCBI基因标识符：3909)、人LAMA4基因(参见例如NCBI基因标识符：3910)、人LAMA5基因(参见例如NCBI基因标识符：3911)、人LAMB1基因(参见例如NCBI基因标识符：3912)、人LAMB2基因(参见例如NCBI基因标识符：3913)、人LAMB3基因(参见例如NCBI基因标识符：3914)、人LAMC1基因(参见例如NCBI基因标识符：3915)、人LAMC2基因(参见例如NCBI基因标识符：3918)、或人LAMC3基因(参见例如NCBI基因标识符：10319)。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人LAMA3基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:43或SEQ ID NO:44的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少约4500、至少约5000但少于5175个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的核酸1-5172的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的核酸1-5172的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人LAMB3基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:45或SEQ ID NO:46的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500但少于3519个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的核酸1-3516的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:45或SEQID NO:46的核酸1-3516的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含人LAMC2基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ IDNO:47或SEQ ID NO:48的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500但少于3582个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48的核酸1-3579的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:47或SEQID NO:48的核酸1-3579的序列。
编码神经调质蛋白的多核苷酸
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含一种或多种包含神经调质基因的编码序列的多核苷酸的重组核酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何神经调质基因(包括其任何亚型)的编码序列都可由本公开的多核苷酸编码，所述神经调质基因包括例如肉毒梭菌(clostridium botulinum)神经调质基因(参见例如NCBI基因标识符：5185061和39483740)等。鉴定来自额外物种的神经调质基因同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与本文描述或本领域中已知的任何神经调质基因(和/或其编码序列)的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含本文描述或本领域中已知的任何神经调质基因(和/或其编码序列)的密码子优化变体。
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种包含肉毒梭菌神经调质基因的编码序列的多核苷酸(即一种或多种第一多核苷酸和/或一种或多种第二多核苷酸)。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含肉毒梭菌botA基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:49或SEQ IDNO:50的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少约1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500但少于3891个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的核酸1-3888的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的核酸1-3888的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含肉毒梭菌botB基因的编码序列(或其密码子优化变体)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:51或SEQ IDNO:52的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段。在一些实施方案中，SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的序列的5’截短形式、3’截短形式或片段是具有SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、或至少350、至少400、至少450、至少500、至少750、至少1000、至少约1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500但少于3876个连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的核酸1-3873的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的核酸1-3873的序列。
编码原纤蛋白的多核苷酸
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含一种或多种包含原纤蛋白基因的编码序列的多核苷酸的重组核酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何原纤蛋白基因(包括其任何亚型)的编码序列都可由本公开的多核苷酸编码，所述原纤蛋白基因包括例如人原纤蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：2200、2201和84467)、小鼠原纤蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：14118和14119)、黑猩猩原纤蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：453411、471621和455669)、大鼠原纤蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：83727和689008)、兔原纤蛋白基因(参见例如NCBI基因标识符：100350931、100357126和100359336)等。鉴定来自额外物种的原纤蛋白基因同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与本文描述或本领域中已知的任何原纤蛋白基因(和/或其编码序列)的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含本文描述或本领域中已知的任何原纤蛋白基因(和/或其编码序列)的密码子优化变体。
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种包含人原纤蛋白基因的编码序列的多核苷酸(即一种或多种第一多核苷酸和/或一种或多种第二多核苷酸)，所述人原纤蛋白基因诸如是人FBN1基因(参见例如NCBI基因标识符：2200)、人FBN2基因(参见例如NCBI基因标识符：2201)、或人FBN3基因(参见例如NCBI基因标识符：84467)。
示例性多核苷酸
在一些实施方案中，本公开的编码一种或多种美容蛋白(例如第一美容蛋白、另一美容蛋白、额外美容蛋白和/或第二美容蛋白)的多核苷酸与选自SEQ ID NO:1-14或35-52的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，本公开的编码一种或多种美容蛋白(例如第一美容蛋白、另一美容蛋白、额外美容蛋白和/或第二美容蛋白)的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:1-14或35-52的序列。
在一些实施方案中，本公开的编码一种或多种美容蛋白(例如第一美容蛋白、另一美容蛋白、额外美容蛋白和/或第二美容蛋白)的多核苷酸与选自SEQ ID NO:1-14、35-38或43-48的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，本公开的编码一种或多种美容蛋白(例如第一美容蛋白、另一美容蛋白、额外美容蛋白和/或第二美容蛋白)的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:1-14、35-38或43-48的序列。
本公开的编码美容蛋白(例如人胶原蛋白)的多核苷酸可还编码额外编码序列和非编码序列。额外编码序列和非编码序列的实例可包括但不限于编码额外多肽标签(例如与美容蛋白同框编码以产生融合蛋白)的序列、内含子(例如天然、经修饰或异源性内含子)、5’和/或3’UTR(例如天然、经修饰或异源性5’和/或3’UTR)等。适合多肽标签的实例可包括但不限于纯化标签，诸如his标签、flag标签、麦芽糖结合蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶标签；检测标签，诸如可以光度测量方式检测的标签(例如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等)；以及具有可检测酶活性的标签(例如碱性磷酸酶等)；含有分泌序列、信号序列、前导序列和/或稳定化序列的标签；蛋白酶裂解位点(例如弗林蛋白酶(furin)裂解位点、TEV裂解位点、凝血酶(Thrombin)裂解位点等)等的任何组合。在一些实施方案中，5’和/或3’UTR使多核苷酸的稳定性、定位和/或翻译效率增加。在一些实施方案中，5’和/或3’UTR使蛋白质表达的水平和/或持续时间改进。在一些实施方案中，5’和/或3’UTR包括可阻断或降低脱靶表达(例如抑制在特定细胞类型(例如神经元细胞)中，在细胞周期中的特定时间，在特定发育阶段等情况下的表达)的元件(例如一个或多个miRNA结合位点等)。在一些实施方案中，5’和/或3’UTR包括可使美容蛋白在特定细胞类型(诸如人角质化细胞和/或纤维母细胞)中的表达增强的元件(例如一个或多个miRNA结合位点等)。
在一些实施方案中，本公开的编码美容蛋白(例如人胶原蛋白)的多核苷酸可操作地连接于一种或多种(例如一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种等)调控序列。术语“调控序列”可包括增强子、绝缘子、启动子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。可使用本领域中已知的任何一种或多种适合增强子，包括例如来自哺乳动物基因(诸如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白、胰岛素等)的增强子序列、来自真核细胞病毒的增强子序列(诸如在复制起点的后侧上的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点的后侧上的多瘤病毒增强子、腺病毒增强子等)以及它们的任何组合。可使用本领域中已知的任何一种或多种适合绝缘子，包括例如HSV染色质边界(CTRL/CTCF结合/绝缘子)元件CTRL1和/或CTRL2、鸡过敏位点4绝缘子(cHS4)、人HNRPA2B1—CBX3遍在性染色质开放元件(UCOE)、来自人干扰素β基因(IFNB1)的骨架/基质附着区(S/MAR)以及它们的任何组合。可使用本领域中已知的任何适合启动子(例如适于在哺乳动物宿主细胞中进行的转录)，包括例如从病毒(诸如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)等)的基因组获得的启动子、来自异源性哺乳动物基因的启动子(诸如肌动蛋白启动子(例如β-肌动蛋白启动子)、泛素启动子(例如泛素C(UbC)启动子)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、免疫球蛋白启动子，来自热激启动子等)、来自同源性哺乳动物基因的启动子(例如天然人胶原、纤连蛋白、弹性蛋白、光蛋白聚糖、玻连蛋白、层粘连蛋白和/或原纤蛋白启动子)、合成启动子(诸如CAGG启动子)以及它们的任何组合，前提是所述启动子可与宿主细胞相容。调控序列可包括指导核酸的组成型表达的那些，以及组织特异性调控序列和/或诱导型或阻遏型序列。
在一些实施方案中，本公开的编码美容蛋白(例如人胶原蛋白)的多核苷酸可操作地连接于一种或多种异源性启动子。在一些实施方案中，一种或多种异源性启动子是组成型启动子、组织特异性启动子、时间启动子、空间启动子、诱导型启动子和阻遏型启动子中的一者或多者。在一些实施方案中，一种或多种异源性启动子是人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子、人延伸因子-1(EF1)启动子、人β-肌动蛋白启动子、人UbC启动子、人PGF启动子、合成CAGG启动子以及它们的任何组合中的一者或多者。在一些实施方案中，本公开的编码美容蛋白(例如人胶原蛋白)的多核苷酸可操作地连接于HCMV启动子。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸不包含胶原α-1(VII)链多肽(COL7)(例如编码胶原α-1(VII)链多肽(COL7)的转基因)的编码序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸不包含赖氨酰基羟化酶3多肽(LH3)(例如编码赖氨酰基羟化酶3多肽(LH3)的转基因)的编码序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸不包含角蛋白(Keratin)I型细胞骨架17多肽(KRT17)(例如编码角蛋白I型细胞骨架17多肽(KRT17)的转基因)的编码序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸不包含转谷氨酰胺酶(TGM)多肽(例如人转谷氨酰胺酶多肽，诸如人TGM1多肽)(例如编码转谷氨酰胺酶(TGM)多肽(例如人转谷氨酰胺酶多肽，诸如人TGM1多肽)的转基因)的编码序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸不包含层粘连蛋白亚单位β-3多肽(LAMB3)(例如编码层粘连蛋白亚单位β-3多肽(LAMB3)的转基因)的编码序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸不包含胶原α-1(VII)链多肽、赖氨酰基羟化酶3多肽、角蛋白I型细胞骨架17多肽和/或它们的任何嵌合多肽(例如编码胶原α-1(VII)链多肽、赖氨酰基羟化酶3多肽、角蛋白I型细胞骨架17多肽和/或它们的任何嵌合多肽的转基因)的编码序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸不包含胶原α-1(VII)链多肽、赖氨酰基羟化酶3多肽、角蛋白I型细胞骨架17多肽、转谷氨酰胺酶(TGM)多肽(例如人转谷氨酰胺酶多肽，诸如人TGM1多肽)、层粘连蛋白亚单位β-3(LAMB3)多肽(例如人LamB3多肽)和/或它们的任何嵌合多肽(例如编码胶原α-1(VII)链多肽、赖氨酰基羟化酶3多肽、角蛋白I型细胞骨架17多肽、转谷氨酰胺酶(TGM)多肽(例如人转谷氨酰胺酶多肽，诸如人TGM1多肽)、层粘连蛋白亚单位β-3(LAMB3)多肽(例如人LamB3多肽)和/或它们的任何嵌合多肽的转基因)的编码序列。
美容蛋白
胶原蛋白
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种编码全长胶原蛋白或其任何亚型或部分的多核苷酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何胶原蛋白都可由本公开的多核苷酸编码，所述胶原蛋白包括例如人胶原蛋白(参见例如UniProt登录号P02452、P08123、P02461、P02462、P08572、P12109、Q02388、Q9UMD9等)、小鼠胶原蛋白(参见例如UniProt登录号P11087、Q01149、P08121、P02463、P08122、Q04857、Q63870、Q07563等)、黑猩猩胶原蛋白(参见例如UniProt登录号A0A2I3SM98、A0A2J8L483、H2QJ46、K7C8P4、K7C8W0、A0A2J8M8U9、H2QMJ5、H2Q2J4等)、大鼠胶原蛋白(参见例如UniProt登录号P02454、P02466、P13941、P02466、F1M6Q3、D3ZUL3、D3ZE04、D3ZE04等)、兔胶原蛋白(参见例如UniProt登录号G1T4A5、Q28668、G1T8J0、G1U9R7、G1T548、G1T380、G1T548等)等。鉴定来自额外物种的胶原蛋白同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知，包括例如使用氨基酸序列比对程序诸如
Figure BDA0002744714680000671
blastp套件或OrthoDB。在一些实施方案中，本公开的胶原多肽包含与本文描述或本领域中已知的任何胶原多肽的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种编码人胶原蛋白的多核苷酸。本领域中已知的任何适合人胶原蛋白都可由本公开的多核苷酸编码，所述人胶原蛋白包括例如胶原α-1(I)链多肽(COL1-1)(参见例如UniProt登录号P02452；SEQ ID NO:15)、胶原α-2(I)链多肽(COL1-2)(参见例如UniProt登录号P08123；SEQ ID NO:16)、胶原α-1(II)链多肽(COL2)(参见例如UniProt登录号P02458)、胶原α-1(III)链多肽(COL3)(参见例如UniProt登录号P2461；SEQ ID NO:17)、胶原α-1(IV)链多肽(COL4-1)(参见例如UniProt登录号P02462；SEQ ID NO:18)、胶原α-2(IV)链多肽(COL4-2)(参见例如UniProt登录号P08572)、胶原α-3(IV)链多肽(COL4-3)(参见例如UniProt登录号Q01955)、胶原α-4(IV)链多肽(COL4-4)(参见例如UniProt登录号P53420)、胶原α-5(IV)链多肽(COL4-5)(参见例如UniProt登录号29400)、胶原α-6(IV)链多肽(COL4-6)(参见例如UniProt登录号Q14031)、胶原α-1(V)链多肽(COL5-1)(参见例如UniProt登录号P20908)、胶原α-2(V)链多肽(COL5-2)(参见例如UniProt登录号P05997)、胶原α-3(V)链多肽(COL5-3)(参见例如UniProt登录号P25940)、胶原α-1(VI)链多肽(COL6-1)(参见例如UniProt登录号P12109；SEQ ID NO:19)、胶原α-2(VI)链多肽(COL6-2)(参见例如UniProt登录号P12110)、胶原α-3(VI)链多肽(COL6-3)(参见例如UniProt登录号P12111)、胶原α-4(VI)链多肽(COL6-4)、胶原α-5(VI)链多肽(COL6-5)(参见例如UniProt登录号A8TX70)、胶原α-6(VI)链多肽(COL6-6)(参见例如UniProt登录号A6NMZ7)、胶原α-1(VII)链多肽(COL7)(参见例如UniProt登录号Q02388；SEQID NO:20)、胶原α-1(VIII)链多肽(COL8)(参见例如UniProt登录号P27658)、胶原α-1(IX)链多肽(COL9-1)(参见例如UniProt登录号P20849)、胶原α-2(IX)链多肽(COL9-2)(参见例如UniProt登录号Q14055)、胶原α-3(IX)链多肽(COL9-3)(参见例如UniProt登录号Q14050)、胶原α-1(X)链多肽(COL10)(参见例如UniProt登录号Q03692)、胶原α-1(XI)链多肽(COL11-1)(参见例如UniProt登录号P12107)、胶原α-2(XI)链多肽(COL11-2)(参见例如UniProt登录号P13942)、胶原α-1(XII)链多肽(COL12)(参见例如UniProt登录号Q99715)、胶原α-1(XIII)链多肽(COL13)(参见例如UniProt登录号Q5TAT6)、胶原α-1(XIV)链多肽(COL14)(参见例如UniProt登录号Q05707)、胶原α-1(XV)链多肽(COL15)(参见例如UniProt登录号P39059)、胶原α-1(XVI)链多肽(COL16)(参见例如UniProt登录号Q07092)、胶原α-1(XVII)链多肽(COL17)(参见例如UniProt登录号Q9UMD9；SEQ ID NO:21)、胶原α-1(XVIII)链多肽(COL18)(参见例如UniProt登录号P39060)、胶原α-1(XIX)链多肽(COL19)(参见例如UniProt登录号Q14993)、胶原α-1(XX)链多肽(COL20)(参见例如UniProt登录号Q9P218)、胶原α-1(XXI)链多肽(COL21)(参见例如UniProt登录号Q96P44)、胶原α-1(XXII)链多肽(COL22)(参见例如UniProt登录号Q8NFW1)、胶原α-1(XXIII)链多肽(COL23)(参见例如UniProt登录号Q86Y22)、胶原α-1(XXIV)链多肽(COL24)(参见例如UniProt登录号Q17RW2)、胶原α-1(XXV)链多肽(COL25)(参见例如UniProt登录号Q9BXS0)、胶原α-1(XXVI)链多肽(COL26)(参见例如UniProt登录号Q96A83)、胶原α-1(XXVII)链多肽(COL27)(参见例如UniProt登录号Q8IZC6)、胶原α-1(XXVIII)链多肽(COL28)(参见例如UniProt登录号Q2UY09)等。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含与编码本文描述或本领域中已知的任何人胶原多肽的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。鉴定额外人胶原或胶原样多肽同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知，包括例如使用氨基酸序列比对程序诸如
Figure BDA0002744714680000691
blastp套件或OrthoDB。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人COL1-1蛋白。在一些实施方案中，编码COL1-1蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:15的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人COL1-1蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码COL1-1蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:15的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400但少于1464个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人COL1-2蛋白。在一些实施方案中，编码COL1-2蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:16的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人COL1-2蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码COL1-2蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:16的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:16的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300但少于1366个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人COL3蛋白。在一些实施方案中，编码COL3蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:17的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人COL3蛋白的多核苷酸是编码包含SEQID NO:17的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码COL3蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:17的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:17的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400但少于1466个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人COL4-1蛋白。在一些实施方案中，编码COL4-1蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:18的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人COL4-1蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码COL4-1蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:18的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:18的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600但少于1669个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人COL6-1蛋白。在一些实施方案中，编码COL6-1蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:19的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人COL6-1蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码COL6-1蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:19的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:19的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000但少于1028个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人COL7蛋白。在一些实施方案中，编码COL7蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:20的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人COL7蛋白的多核苷酸是编码包含SEQID NO:20的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码COL7蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:20的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000、至少2100、至少2200、至少2300、至少2400、至少2500、至少2600、至少2700、至少2800、至少2900但少于2944个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人COL17蛋白。在一些实施方案中，编码COL17蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:21的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人COL17蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码COL17蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:21的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:21的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400但少于1497个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的一种或多种人胶原蛋白(例如第一人胶原蛋白、另一人胶原蛋白、额外人胶原蛋白和/或第二人胶原蛋白)包含含有与选自SEQ ID NO:15-21的氨基酸序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的一种或多种人胶原蛋白(例如第一人胶原蛋白、另一人胶原蛋白、额外人胶原蛋白和/或第二人胶原蛋白)包含选自SEQ ID NO:15-21的序列。
在一些实施方案中，本公开的一种或多种人胶原蛋白(例如第一人胶原蛋白、另一人胶原蛋白、额外人胶原蛋白和/或第二人胶原蛋白)包含含有与选自SEQ ID NO:15-17的氨基酸序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的一种或多种人胶原蛋白(例如第一人胶原蛋白、另一人胶原蛋白、额外人胶原蛋白和/或第二人胶原蛋白)包含选自SEQ ID NO:15-17的序列。
纤连蛋白
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种编码全长纤连蛋白或其任何亚型或部分的多核苷酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何纤连蛋白都可由本公开的多核苷酸编码，所述纤连蛋白包括例如人纤连蛋白(参见例如UniProt登录号P02751)、小鼠纤连蛋白(参见例如UniProt登录号P11276)、黑猩猩纤连蛋白(参见例如UniProt登录号P11276)、大鼠纤连蛋白(参见例如UniProt登录号P04937)、兔纤连蛋白(参见例如UniProt登录号P04937)等。鉴定来自额外物种的纤连蛋白同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的纤连蛋白包含与本文描述或本领域中已知的任何纤连蛋白的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人纤连蛋白。在一些实施方案中，编码人纤连蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:53的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人纤连蛋白的多核苷酸是编码包含SEQID NO:53的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码人纤连蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:53的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:53的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000、至少2100、至少2200、至少2300、至少2400但少于2477个连续氨基酸。
弹性蛋白和相关蛋白
细胞外基质中的弹性纤维对组织给与弹性性质。弹性纤维通常含有两种在形态上不同的组分-成熟弹性蛋白纤维和微原纤维，所述微原纤维主要含有原纤蛋白并且与其他蛋白质相关，所述其他蛋白质诸如是微原纤维相关糖蛋白(MAGP)、纤蛋白和弹性蛋白-微原纤维界面定位蛋白(EMILIN)。弹性蛋白和它的可溶性前体原弹性蛋白属于身体的主要结构蛋白。
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种编码弹性蛋白或弹性蛋白相关蛋白的多核苷酸，所述弹性蛋白相关蛋白包括原弹性蛋白、原纤蛋白、微原纤维相关糖蛋白、纤蛋白、或弹性蛋白-微原纤维界面定位蛋白。在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种编码全长弹性蛋白或其任何亚型或部分的多核苷酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何弹性蛋白都可由本公开的多核苷酸编码，所述弹性蛋白包括例如人弹性蛋白(参见例如UniProt登录号P15502)、小鼠弹性蛋白(参见例如UniProt登录号P15502)、黑猩猩弹性蛋白(参见例如UniProt登录号H2QUQ6)、大鼠弹性蛋白(参见例如UniProt登录号Q99372)等。鉴定来自额外物种的弹性蛋白同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的弹性蛋白包含与本文描述或本领域中已知的任何弹性蛋白的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人弹性蛋白。在一些实施方案中，编码人弹性蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:54的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人弹性蛋白的多核苷酸是编码包含SEQID NO:54的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码人弹性蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:54的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:54的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700但少于786个连续氨基酸。
光蛋白聚糖蛋白
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种编码全长光蛋白聚糖蛋白或其任何亚型或部分的多核苷酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何光蛋白聚糖蛋白都可由本公开的多核苷酸编码，所述光蛋白聚糖蛋白包括例如人光蛋白聚糖蛋白(参见例如UniProt登录号P51884)、小鼠光蛋白聚糖蛋白(参见例如UniProt登录号P51885)、黑猩猩光蛋白聚糖蛋白(参见例如UniProt登录号H2Q6L3)、大鼠光蛋白聚糖蛋白(参见例如UniProt登录号H2Q6L3)、兔光蛋白聚糖蛋白(参见例如UniProt登录号O46379)等。鉴定来自额外物种的光蛋白聚糖蛋白同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的光蛋白聚糖蛋白包含与本文描述或本领域中已知的任何光蛋白聚糖蛋白的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人光蛋白聚糖蛋白。在一些实施方案中，编码人光蛋白聚糖蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:55的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人光蛋白聚糖蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码人光蛋白聚糖蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:55的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:55的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300但少于338个连续氨基酸。
玻连蛋白和玻连蛋白受体蛋白
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种编码全长玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白或其任何亚型或部分的多核苷酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白都可由本公开的多核苷酸编码，所述玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白包括例如人玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白(参见例如UniProt登录号P04004和P06756)、小鼠玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白(参见例如UniProt登录号P29788和P43406)、黑猩猩玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白(参见例如UniProt登录号H2QCH3和H2R6C3)、大鼠玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白(参见例如UniProt登录号Q7TQ11)、兔玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白(参见例如UniProt登录号P22458)等。鉴定来自额外物种的玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白包含与本文描述或本领域中已知的任何玻连蛋白或玻连蛋白受体蛋白的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人玻连蛋白。在一些实施方案中，编码人玻连蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:56的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人玻连蛋白的多核苷酸是编码包含SEQID NO:56的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码人玻连蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:56的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:56的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400但少于478个连续氨基酸。
层粘连蛋白
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种编码全长层粘连蛋白或其任何亚型或部分的多核苷酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何层粘连蛋白都可由本公开的多核苷酸编码，所述层粘连蛋白包括例如人层粘连蛋白(参见例如UniProt登录号P25391、P24043、Q16787、Q16363、O15230、P07942、P55268、Q13751、P11047、Q13753和Q9Y6N6)、小鼠层粘连蛋白(参见例如UniProt登录号Q61789、Q61087和Q61092)、黑猩猩层粘连蛋白(参见例如UniProt登录号H2QEC7、H2R041和H2Q0R2)、大鼠层粘连蛋白(参见例如UniProt登录号D3ZN05、F1LPI5和F1LRH4)、兔层粘连蛋白(参见例如UniProt登录号G1SY40和A0A0B5JSH0)等。鉴定来自额外物种的层粘连蛋白同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的层粘连蛋白包含与本文描述或本领域中已知的任何层粘连蛋白的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人层粘连蛋白，诸如人层粘连蛋白亚单位α-1(LamA1)多肽(参见例如UniProt登录号P25391)、人层粘连蛋白亚单位α-2(LamA2)多肽(参见例如UniProt登录号P24043)、人层粘连蛋白亚单位α-3(LamA3)多肽(参见例如UniProt登录号Q16787)、人层粘连蛋白亚单位α-4(LamA4)多肽(参见例如UniProt登录号Q16363)、人层粘连蛋白亚单位α-5(LamA5)多肽(参见例如UniProt登录号O15230)、人层粘连蛋白亚单位β-1(LamB1)多肽(参见例如UniProt登录号P07942)、人层粘连蛋白亚单位β-2(LamB2)多肽(参见例如UniProt登录号P55268)、人层粘连蛋白亚单位β-3(LamB3)多肽(参见例如UniProt登录号Q13751)、人层粘连蛋白亚单位γ-1(LamC1)多肽(参见例如UniProt登录号P11047)、人层粘连蛋白亚单位γ-2(LamC2)多肽(参见例如UniProt登录号Q13753)、人层粘连蛋白亚单位γ-3(LamC3)多肽(参见例如UniProt登录号Q9Y6N6)等。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人LamA3多肽。在一些实施方案中，编码人LamA3多肽的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:57的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人LamA3多肽的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码人LamA3多肽的多核苷酸是编码SEQ ID NO:57的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:57的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2250、至少2500、至少2750、至少3000、至少3250但少于3333个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人LamB3多肽。在一些实施方案中，编码人LamB3多肽的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:58的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人LamB3多肽的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码LamB3多肽的多核苷酸是编码SEQ ID NO:58的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:58的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100但少于1172个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人LamC2多肽。在一些实施方案中，编码人LamC2多肽的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:59的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人LamC2多肽的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码LamC2多肽的多核苷酸是编码SEQ ID NO:59的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:59的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100但少于1193个连续氨基酸。
神经调质蛋白
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种编码全长神经调质蛋白或其任何亚型或部分的多核苷酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何神经调质蛋白都可由本公开的多核苷酸编码，所述神经调质蛋白包括例如肉毒梭菌蛋白(参见例如UniProt登录号P0DPI0、Q45894、P0DPI1、P10844和B1INP5)等。鉴定来自额外物种的神经调质蛋白同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的神经调质蛋白包含与本文描述或本领域中已知的任何神经调质蛋白的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码肉毒梭菌神经调质蛋白。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码肉毒梭菌A型神经毒素蛋白。在一些实施方案中，编码肉毒梭菌A型神经毒素蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:60的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码肉毒梭菌A型神经毒素蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的肉毒梭菌A型神经毒素蛋白在对应于SEQ ID NO:60的位置27的位置处包含丙氨酸至缬氨酸突变。
在一些实施方案中，编码肉毒梭菌A型神经毒素蛋白的多核苷酸是编码SEQ IDNO:60的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:60的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200但少于1296个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码肉毒梭菌B型神经毒素蛋白。在一些实施方案中，编码肉毒梭菌B型神经毒素蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:61的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码肉毒梭菌B型神经毒素蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码肉毒梭菌B型神经毒素蛋白的多核苷酸是编码SEQ IDNO:61的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:61的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200但少于1291个连续氨基酸。
原纤蛋白
在一些实施方案中，本公开涉及一种或多种编码全长原纤蛋白或其任何亚型或部分的多核苷酸。来自本领域中已知的任何适合物种的任何原纤蛋白都可由本公开的多核苷酸编码，所述原纤蛋白包括例如人原纤蛋白(参见例如UniProt登录号P35555、P35556和Q75N90)、小鼠原纤蛋白(参见例如UniProt登录号Q61554和Q61555)、黑猩猩原纤蛋白(参见例如UniProt登录号A0A2I3RTE4和K7CZX0)、大鼠原纤蛋白(参见例如UniProt登录号G3V9M6和F1M5Q4)、兔原纤蛋白(参见例如UniProt登录号G1SKM2、G1SUS5和G1T1H4)等。鉴定来自额外物种的原纤蛋白同源物/直系同源物的方法为本领域普通技术人员所知。在一些实施方案中，本公开的原纤蛋白包含与本文描述或本领域中已知的任何原纤蛋白的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人原纤蛋白。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人原纤蛋白-1蛋白。在一些实施方案中，编码人原纤蛋白-1蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:62的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人原纤蛋白-1蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码人原纤蛋白-1蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:62的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:62的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2250、至少2500、至少2750但少于2871个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人原纤蛋白-2蛋白。在一些实施方案中，编码人原纤蛋白-2蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:63的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人原纤蛋白-2蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码人原纤蛋白-2蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:63的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:63的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2250、至少2500、至少2750但少于2912个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码人原纤蛋白-3蛋白。在一些实施方案中，编码人原纤蛋白-3蛋白的多核苷酸是编码包含与SEQ ID NO:64的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码人原纤蛋白-3蛋白的多核苷酸是编码包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，编码人原纤蛋白-3蛋白的多核苷酸是编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列的N末端截短形式、C末端截短形式或片段的多核苷酸。N末端截短形式、C末端截短形式或片段可包含SEQ ID NO:64的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2250、至少2500、至少2750但少于2809个连续氨基酸。
示例性美容多肽
在一些实施方案中，本公开的一种或多种美容蛋白(例如第一美容蛋白、另一美容蛋白、额外美容蛋白和/或第二美容蛋白)包含含有与选自SEQ ID NO:15-21或53-64的氨基酸序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的一种或多种美容蛋白(例如第一美容蛋白、另一美容蛋白、额外美容蛋白和/或第二美容蛋白)包含选自SEQ ID NO:15-21或53-64的序列。
在一些实施方案中，本公开的一种或多种美容蛋白(例如第一美容蛋白、另一美容蛋白、额外美容蛋白和/或第二美容蛋白)包含含有与选自SEQ ID NO:15-21、53-54或57-59的氨基酸序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的一种或多种美容蛋白(例如第一美容蛋白、另一美容蛋白、额外美容蛋白和/或第二美容蛋白)包含选自SEQ ID NO:15-21、53-54或57-59的序列。
第一多核苷酸
在一些实施方案中，本公开涉及一种包含编码第一多肽的第一多核苷酸的重组核酸，所述第一多肽包含第一美容蛋白。第一美容蛋白可为本文描述或本领域中已知的任何美容蛋白，包括例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、光蛋白聚糖、玻连蛋白/玻连蛋白受体、层粘连蛋白、神经调质、原纤蛋白等。在一些实施方案中，第一美容蛋白是结构性细胞外基质蛋白(例如胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)。在一些实施方案中，第一美容蛋白是胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白(例如人胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白)。
在一些实施方案中，本公开的重组核酸包含第一多核苷酸的一个拷贝。在一些实施方案中，本公开的重组核酸包含第一多核苷酸的两个或更多个(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个等)拷贝。在一些实施方案中，本公开的重组核酸包含第一多核苷酸的两个拷贝。
在一些实施方案中，第一美容蛋白是第一人胶原蛋白。第一人胶原蛋白可为本文描述或本领域中已知的任何人胶原蛋白。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27或COL28。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-1。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-2。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL3。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL4-1。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL4-2。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL6-1。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL7。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白不是COL7。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL17。
在一些实施方案中，第一多肽基本上由第一美容蛋白组成。在一些实施方案中，第一多肽由第一美容蛋白组成。在一些实施方案中，第一多肽是第一美容蛋白。
嵌合多肽
在一些实施方案中，第一多肽是包含第一美容蛋白的嵌合多肽。在一些实施方案中，第一多肽是包含第一美容蛋白和另一美容蛋白的嵌合多肽。在一些实施方案中，嵌合多肽包含连接第一美容蛋白和另一美容蛋白的接头多肽。在一些实施方案中，嵌合多肽从n末端至c末端包含第一美容蛋白-接头多肽-另一美容蛋白。第一美容蛋白和/或另一美容蛋白可为本文描述或本领域中已知的任何美容蛋白，包括例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、光蛋白聚糖、玻连蛋白/玻连蛋白受体、层粘连蛋白、神经调质、原纤蛋白等。在一些实施方案中，第一美容蛋白和/或另一美容蛋白是结构性细胞外基质蛋白(例如胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)。在一些实施方案中，第一美容蛋白和/或另一美容蛋白是胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白(例如人胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白)。在一些实施方案中，第一美容蛋白和另一美容蛋白是相同的。在一些实施方案中，第一美容蛋白和另一美容蛋白是不同的。
在一些实施方案中，接头多肽是可裂解接头多肽。可在本公开的嵌合多肽中使用本领域中已知的任何可裂解接头多肽，包括例如T2A接头、P2A接头、E2A接头和F2A接头等。在一些实施方案中，接头多肽是T2A接头多肽。编码T2A接头多肽的一示例性核酸序列以SEQID NO:24提供。T2A接头多肽的一示例性氨基酸序列以SEQ ID NO:28提供。在一些实施方案中，接头多肽是P2A接头多肽。编码P2A接头多肽的一示例性核酸序列以SEQ ID NO:25提供。P2A接头多肽的一示例性氨基酸序列以SEQ ID NO:29提供。在一些实施方案中，接头多肽是E2A接头多肽。编码E2A接头多肽的一示例性核酸序列以SEQ ID NO:26提供。E2A接头多肽的一示例性氨基酸序列以SEQ ID NO:30提供。在一些实施方案中，接头多肽是F2A接头多肽。编码F2A接头多肽的一示例性核酸序列以SEQ ID NO:27提供。F2A接头多肽的一示例性氨基酸序列以SEQ ID NO:31提供。
在一些实施方案中，接头多肽包含与选自SEQ ID NO:28-31的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，接头多肽包含选自SEQ ID NO:28-31的序列。
在一些实施方案中，第一美容蛋白是第一胶原蛋白(例如第一人胶原蛋白)，并且另一美容蛋白是另一胶原蛋白(例如另一人胶原蛋白)。编码包含第一人胶原蛋白、接头多肽和另一人胶原蛋白的嵌合多肽的一示例性核酸序列以SEQ ID NO:32提供。
在一些实施方案中，第一美容蛋白是第一人胶原蛋白，并且另一美容蛋白是另一人胶原蛋白。另一人胶原蛋白可为本文描述或本领域中已知的任何人胶原蛋白。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27或COL28。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白是COL1-1。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白是COL1-2。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白是COL3。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白是COL4-1。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白是COL4-2。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白是COL6-1。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白是COL7。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白不是COL7。在一些实施方案中，另一人胶原蛋白是COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白和另一人胶原蛋白是相同的。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白和另一人胶原蛋白是不同的。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-1，并且另一人胶原蛋白选自COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-1，并且另一人胶原蛋白是COL1-2。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-1，并且另一人胶原蛋白是COL3。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-2，并且另一人胶原蛋白是COL1-1、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-2，并且另一人胶原蛋白是COL1-1。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL3，并且另一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL4-1，并且另一人胶原蛋白是COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL4-1，并且另一人胶原蛋白是COL4-2。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL6-1，并且另一人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL7或COL17。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL7，并且另一人胶原蛋白是COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1或COL17。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL17，并且另一人胶原蛋白是COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1或COL7。
在一些实施方案中，第一美容蛋白是第一层粘连蛋白(例如第一人层粘连蛋白)，并且另一美容蛋白是另一层粘连蛋白(例如另一人层粘连蛋白)。在一些实施方案中，第一美容蛋白是第一人层粘连蛋白，并且另一美容蛋白是另一人层粘连蛋白。另一人层粘连蛋白可为本文描述或本领域中已知的任何人层粘连蛋白。在一些实施方案中，第一人层粘连蛋白是人LamA3多肽，并且另一人层粘连蛋白是人LamB3多肽。在一些实施方案中，第一人层粘连蛋白是人LamA3多肽，并且另一人层粘连蛋白是人LamC2多肽。在一些实施方案中，第一人层粘连蛋白是人LamB3多肽，并且另一人层粘连蛋白是人LamC2多肽。
在一些实施方案中，第一多核苷酸编码单顺反子mRNA。在一些实施方案中，单顺反子mRNA包含编码第一多肽的开放阅读框(ORF)。
在一些实施方案中，第一多核苷酸编码多顺反子mRNA。在一些实施方案中，多顺反子mRNA包含编码第一多肽的开放阅读框(ORF)。
多顺反子mRNA
在一些实施方案中，第一多核苷酸编码多顺反子mRNA。在一些实施方案中，多顺反子mRNA包含编码第一多肽的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，第一多核苷酸编码多顺反子mRNA，所述多顺反子mRNA包含：1)编码第一多肽的第一开放阅读框(ORF)，和2)编码额外美容蛋白的第二开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，多顺反子mRNA还包含分隔第一ORF和第二ORF的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，多顺反子mRNA从5’至3’包含编码第一多肽的第一ORF-IRES-编码额外美容蛋白的第二ORF。第一多肽可为本文所述的任何第一多肽。额外美容蛋白可为本文描述或本领域中已知的任何美容蛋白，包括例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、光蛋白聚糖、玻连蛋白/玻连蛋白受体、层粘连蛋白、神经调质、原纤蛋白等。在一些实施方案中，额外美容蛋白是结构性细胞外基质蛋白(例如胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)。在一些实施方案中，额外美容蛋白是胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白(例如人胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白)。
可在本公开的多顺反子mRNA中使用本领域中已知的任何适合IRES，包括例如病毒源性IRES(例如源于脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、脑心肌炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒、经典猪瘟病毒、劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)、人免疫缺陷病毒、蟋蟀麻痹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒等的IRES)、细胞mRNA源性IRES(例如源于生长因子mRNA诸如纤维母细胞生长因子2、血小板源性生长因子B和血管内皮生长因子的IRES；源于转录因子mRNA诸如触角足蛋白、超级双胸蛋白(ultrabithorax)和NF-κB阻遏因子的IRES；源于致癌基因mRNA诸如c-myc、pim-1和蛋白质激酶p58PITSLRE等的IRES)、合成IRES(例如CP148IRES)以及其他IRES(参见例如Mokrejs等(2007)A Bioinformatical Approach to theAnalysis of Viral and Cellular Internal Ribosome Entry Sites.Columbus F编.NewMessenger RNA Research Communications.Hauppauge,NY:Nova Science Publishers；第133-166页)。在一些实施方案中，IRES是CP148 IRES。编码CP148IRES的一示例性核酸序列以SEQ ID NO:22提供。在一些实施方案中，IRES是EMCV IRES。编码EMCV IRES的一示例性核酸序列以SEQ ID NO:23提供。
在一些实施方案中，编码IRES的核酸序列包括与选自SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码IRES的核酸序列包括SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的序列。
在一些实施方案中，第一多肽是第一胶原蛋白(例如第一人胶原蛋白)，并且额外美容蛋白是额外胶原蛋白(例如额外人胶原蛋白)。编码包含第一ORF、IRES和第二ORF的多顺反子mRNA的一示例性核酸以SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34提供。额外人胶原蛋白可为本文所述的任何人胶原蛋白。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27或COL28。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白是COL1-1。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白是COL1-2。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白是COL3。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白是COL4-1。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白是COL4-2。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白是COL6-1。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白是COL7。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白不是COL7。在一些实施方案中，额外人胶原蛋白是COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白和额外人胶原蛋白是相同的。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白和额外人胶原蛋白是不同的。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-1，并且额外人胶原蛋白选自COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-1，并且额外人胶原蛋白是COL1-2。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-1，并且额外人胶原蛋白是COL3。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-2，并且额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-2，并且额外人胶原蛋白是COL1-1。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL3，并且额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL4-1，并且额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL4-1，并且额外人胶原蛋白是COL4-2。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL6-1，并且额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL7或COL17。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL7，并且额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1或COL17。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL17，并且额外人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1或COL7。
在一些实施方案中，第一多肽是第一胶原蛋白(例如第一人胶原蛋白)，并且额外美容蛋白是额外胶原蛋白(例如额外人胶原蛋白)。
在一些实施方案中，第一多肽是第一层粘连蛋白(例如第一人层粘连蛋白)，并且额外美容蛋白是额外层粘连蛋白(例如额外人层粘连蛋白)。在一些实施方案中，第一多肽是第一人层粘连蛋白，并且额外美容蛋白是额外人层粘连蛋白。额外人层粘连蛋白可为本文描述或本领域中已知的任何人层粘连蛋白。在一些实施方案中，第一人层粘连蛋白是人LamA3多肽，并且额外人层粘连蛋白是人LamB3多肽。在一些实施方案中，第一人层粘连蛋白是人LamA3多肽，并且额外人层粘连蛋白是人LamC2多肽。在一些实施方案中，第一人层粘连蛋白是人LamB3多肽，并且额外人层粘连蛋白是人LamC2多肽。
第二多核苷酸
在一些实施方案中，本公开涉及一种还包含编码第二美容蛋白的第二多核苷酸的重组核酸。第二美容蛋白可为本文描述或本领域中已知的任何美容蛋白，包括例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、光蛋白聚糖、玻连蛋白/玻连蛋白受体、层粘连蛋白、神经调质、原纤蛋白等。在一些实施方案中，第二美容蛋白是结构性细胞外基质蛋白(例如胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)。在一些实施方案中，第二美容蛋白是胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白(例如人胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白)。在一些实施方案中，第一美容蛋白和第二美容蛋白是相同的。在一些实施方案中，第一美容蛋白和第二美容蛋白是不同的。在一些实施方案中，重组核酸包含第二多核苷酸的一个拷贝。在一些实施方案中，重组核酸包含第二多核苷酸的两个或更多个(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个等)拷贝。在一些实施方案中，重组核酸包含第二多核苷酸的两个拷贝。
在一些实施方案中，第二美容蛋白是胶原蛋白。在一些实施方案中，第二美容蛋白是第二人胶原蛋白。第二人胶原蛋白可为本文所述的任何人胶原蛋白。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27或COL28。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白是COL1-1。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白是COL1-2。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白是COL3。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白是COL4-1。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白是COL4-2。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白是COL6-1。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白是COL7。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白不是COL7。在一些实施方案中，第二人胶原蛋白是COL17。
在一些实施方案中，第一多核苷酸编码第一胶原蛋白，并且第二多核苷酸编码第二胶原蛋白。在一些实施方案中，第一多核苷酸编码第一人胶原蛋白，并且第二多核苷酸编码第二人胶原蛋白。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白(由第一多核苷酸编码)和第二人胶原蛋白(由第二多核苷酸编码)是相同的。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白(由第一多核苷酸编码)和第二人胶原蛋白(由第二多核苷酸编码)是不同的。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-1，并且第二人胶原蛋白选自COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-1，并且第二人胶原蛋白是COL1-2。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-1，并且第二人胶原蛋白是COL3。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-2，并且第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL1-2，并且第二人胶原蛋白是COL1-1。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL3，并且第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL4-1、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL4-1，并且第二人胶原蛋白选自COL1-2、COL1-2、COL3、COL4-2、COL6-1、COL7或COL17。在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL4-1，并且第二人胶原蛋白是COL4-2。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL6-1，并且第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL7或COL17。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL7，并且第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1或COL17。
在一些实施方案中，第一人胶原蛋白是COL17，并且第二人胶原蛋白选自COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1或COL7。
在一些实施方案中，第一多核苷酸编码第一层粘连蛋白(例如第一人层粘连蛋白)，并且第二多核苷酸编码第二层粘连蛋白(例如第二人层粘连蛋白)。在一些实施方案中，第一多核苷酸编码第一人层粘连蛋白多肽，并且第二多核苷酸编码第二人层粘连蛋白。第二人层粘连蛋白可为本文描述或本领域中已知的任何人层粘连蛋白。在一些实施方案中，第一人层粘连蛋白是人LamA3多肽，并且第二人层粘连蛋白是人LamB3多肽。在一些实施方案中，第一人层粘连蛋白是人LamA3多肽，并且第二人层粘连蛋白是人LamC2多肽。在一些实施方案中，第一人层粘连蛋白是人LamB3多肽，并且第二人层粘连蛋白是人LamC2多肽。
重组核酸
在一些实施方案中，本公开涉及包含本文所述的多核苷酸中的任何一者或多者的重组核酸。在一些实施方案中，重组核酸包含第一多核苷酸的一个拷贝。在一些实施方案中，重组核酸包含第一多核苷酸的两个拷贝。在一些实施方案中，重组核酸包含第一多核苷酸的一个拷贝和第二多核苷酸的一个拷贝。在一些实施方案中，重组核酸包含第一多核苷酸的一个拷贝和第二多核苷酸的两个拷贝。在一些实施方案中，重组核酸包含第一多核苷酸的两个拷贝和第二多核苷酸的一个拷贝。在一些实施方案中，重组核酸包含第一多核苷酸的两个拷贝和第二多核苷酸的两个拷贝。
在一些实施方案中，重组核酸是载体(例如表达载体、展示载体等)。在一些实施方案中，载体是DNA载体或RNA载体。通常，可使用适于在受试者中维持、繁殖和/或表达多核苷酸以产生一种或多种多肽的载体。适合载体的实例可包括例如质粒、粘粒、游离体、转座子和病毒载体(例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体、辛德毕斯(Sindbis)病毒载体、麻疹载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体等)。在一些实施方案中，载体是疱疹病毒载体。在一些实施方案中，载体能够在宿主细胞中自主复制。在一些实施方案中，载体不能在宿主细胞中自主复制。在一些实施方案中，载体可整合至宿主DNA中。在一些实施方案中，载体不能整合至宿主DNA中(例如是游离型的)。制备含有一种或多种目标多核苷酸的载体的方法为本领域普通技术人员所熟知，包括例如通过化学合成，或通过人工操控核酸的经分离区段(例如通过遗传工程化技术)。
在一些实施方案中，本公开的重组核酸是单纯疱疹病毒(HSV)扩增子。疱疹病毒扩增子，包括结构特征和制备所述疱疹病毒扩增子的方法，通常为本领域普通技术人员所知(参见例如de Silva S.和Bowers W.“Herpes Virus Amplicon Vectors”.Viruses 2009,1,594-629)。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒扩增子是HSV-1扩增子。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒扩增子是HSV-1杂合扩增子。HSV-1杂合扩增子的实例可包括但不限于HSV/AAV杂合扩增子、HSV/EBV杂合扩增子、HSV/EBV/RV杂合扩增子、和/或HSV/睡美人杂合扩增子。在一些实施方案中，扩增子是HSV/AAV杂合扩增子。在一些实施方案中，扩增子是HSV/睡美人杂合扩增子。
在一些实施方案中，本公开的重组核酸是重组疱疹病毒基因组。重组疱疹病毒基因组可为来自本领域中已知的DNA病毒的疱疹病毒科的任何成员的重组基因组，包括例如重组单纯疱疹病毒基因组、重组水痘带状疱疹病毒基因组、重组人巨细胞病毒基因组、重组疱疹病毒6A基因组、重组疱疹病毒6B基因组、重组疱疹病毒7基因组、重组卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒基因组、以及它们的任何组合或任何衍生物。在一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组包含一个或多个(例如一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个等)失活性突变。在一些实施方案中，一个或多个失活性突变在一种或多种(例如一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种等)疱疹病毒基因中。在一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组是减毒的(例如相较于相应野生型疱疹病毒基因组)。在一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组是有复制能力的。在一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组是复制缺陷性的。
在一些实施方案中，重组核酸是重组单纯疱疹病毒(HSV)基因组。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组是重组1型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组、重组2型单纯疱疹病毒(HSV-2)基因组或它们的任何衍生物。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组是有复制能力的。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组是复制缺陷性的。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组包含一个或多个(例如一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个等)失活性突变。在一些实施方案中，一个或多个失活性突变在一种或多种(例如一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种等)单纯疱疹病毒基因中。如本文所用，“失活性突变”可指导致基因或调节子产物(RNA或蛋白质)具有降低、不可检测或消除的数量和/或功能(例如相较于缺乏失活性突变的相应序列)的任何突变。失活性突变的实例可包括但不限于在给定基因或调节子的转录控制序列(启动子、增强子、绝缘子等)和/或编码序列中的缺失、插入、点突变和重排。可使用本领域中已知的测量基因或调节子产物的数量的任何适合方法，包括例如qPCR、Northern印迹、RNA测序、蛋白质印迹、ELISA等。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在感染细胞蛋白(或感染细胞多肽)(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、胸苷激酶(tk)、长独特区域(UL)41和/或UL55单纯疱疹病毒基因中的至少一者、至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者或全部八者中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP34.5和/或ICP47单纯疱疹病毒基因中不包含失活性突变(例如以避免产生免疫刺激性病毒)。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP34.5单纯疱疹病毒基因(一个或两个拷贝)中不包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP47单纯疱疹病毒基因中不包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP34.5(一个或两个拷贝)和ICP47单纯疱疹病毒基因中不包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组不是溶瘤性的。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，并且还在ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP27、ICP47、UL41和/或UL55基因中包含引发性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，并且在ICP4基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，并且在ICP22基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，并且在UL41基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，在ICP4基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，并且在ICP22基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，在ICP4基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，并且在UL41基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，在ICP22基因中包含失活性突变，并且在UL41基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，在ICP4基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，在ICP22基因中包含失活性突变，并且在UL41基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，失活性突变是ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22和/或UL41基因的编码序列的缺失。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组还在ICP27、ICP47和/或UL55基因中包含失活性突变。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组复合疱疹(herpes complex)病毒基因组在ICP4(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，并且还在ICP0(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP27、ICP47、UL41和/或UL55基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，并且在ICP22基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，并且在UL41基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4基因(一个或两个拷贝)中包含失活性突变，在ICP22基因中包含失活性突变，并且在UL41基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，失活性突变是ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22和/或UL41基因的编码序列的缺失。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组还在ICP0、ICP27、ICP47和/或UL55基因中包含失活性突变。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22基因中包含失活性突变，并且还在ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP27、ICP47、UL41和/或UL55基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22基因中包含失活性突变，并且在UL41基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，失活性突变是ICP22和/或UL41基因的编码序列的缺失。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组还在ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP27、ICP47和/或UL55基因中包含失活性突变。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP27基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP27基因中包含失活性突变，并且还在ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP47、UL41和/或UL55基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，失活性突变是ICP27基因的编码序列的缺失。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP47基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP47基因中包含失活性突变，并且还在ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP27、UL41和/或UL55基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，失活性突变是ICP47基因的编码序列的缺失。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL41基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL41基因中包含失活性突变，并且还在ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP27、ICP47和/或UL55基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，失活性突变是UL41基因的编码序列的缺失。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL55基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在UL55基因中包含失活性突变，并且还在ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP27、ICP47和/或UL41基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，失活性突变是UL55基因的编码序列的缺失。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在包含内部重复长(IRL)区域和内部重复短(IRS)区域的内部重复(接合)区域中包含失活性突变(例如所述内部重复(接合)区域的缺失)。在一些实施方案中，接合区域的失活(例如缺失)消除ICP4基因和ICP0基因各自一个拷贝。在一些实施方案中，接合区域的失活(例如缺失)进一步使ICP22和ICP47基因的启动子失活(例如缺失)。如果需要，那么这些基因中的一者或两者的表达可通过将立即早期启动子插入重组单纯疱疹病毒基因组中来恢复(参见例如Hill等(1995).Nature 375(6530):411-415；Goldsmith等(1998).J Exp Med 187(3):341-348)。在不希望受理论束缚下，据信使接合区域失活(例如缺失)可促进重组单纯疱疹病毒基因组的稳定性和/或允许重组单纯疱疹病毒基因组容纳更多和/或更大转基因。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22和ICP27基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4(一个或两个拷贝)、ICP27和UL55基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP27、ICP47和UL55基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，ICP4(一个或两个拷贝)、ICP27和/或UL55基因中的失活性突变是ICP4(一个或两个拷贝)、ICP27和/或UL55基因的编码序列的缺失。在一些实施方案中，ICP22和ICP47基因中的失活性突变是ICP22和ICP47基因的启动子区域中的缺失(例如ICP22和ICP47编码序列是完整的，但不具有转录活性)。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4(一个或两个拷贝)、ICP27和UL55基因的编码序列中包含缺失，并且在ICP22和ICP47基因的启动子区域中包含缺失。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组还在ICP0和/或UL41基因中包含失活性突变。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0(一个或两个拷贝)基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0(一个或两个拷贝)和ICP4(一个或两个拷贝)基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)和ICP22基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22和ICP27基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP27和UL55基因中包含失活性突变。在一些实施方案中，ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP27和/或UL55基因中的失活性突变包括ICP0、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP27和/或UL55基因的编码序列的缺失。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组还在ICP47和/或UL41基因中包含失活性突变。
在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个病毒基因座内包含本公开的一种或多种多核苷酸。适合病毒基因座的实例可包括不限于ICP0(一个或两个拷贝)、ICP4(一个或两个拷贝)、ICP22、ICP27、ICP47、tk、UL41和UL55单纯疱疹病毒基因座。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在病毒ICP4基因座中的一个或两个内包含本公开的一种或多种多核苷酸(例如重组病毒在ICP4基因座中的一个或两个中携带编码第一人胶原蛋白的第一多核苷酸；重组病毒在ICP4基因座中的一个或两个中携带编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸；等)。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在病毒ICP22基因座内包含本公开的一种或多种多核苷酸(例如重组病毒在ICP22基因座中携带编码第一人胶原蛋白的第一多核苷酸；重组病毒在ICP22基因座中携带编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸；等)。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在病毒UL41基因座内包含本公开的一种或多种多核苷酸(例如重组病毒在UL41基因座中携带编码第一人胶原蛋白的第一多核苷酸；重组病毒在UL41基因座中携带编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸；等)。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在病毒ICP4基因座中的一个或两个内包含本公开的一种或多种多核苷酸，并且在病毒ICP22基因座内包含本公开的一种或多种多核苷酸(例如重组病毒在ICP4基因座中的一个或两个中携带编码第一人胶原蛋白的第一多核苷酸，并且在ICP22基因座中携带编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸；重组病毒在ICP4基因座中的一个或两个中携带编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸，并且在ICP22基因座中携带编码第一人胶原蛋白的第一多核苷酸；等)。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在病毒ICP4基因座中的一个或两个内包含本公开的一种或多种多核苷酸，并且在病毒UL41基因座内包含本公开的一种或多种多核苷酸(例如重组病毒在ICP4基因座中的一个或两个中携带编码第一人胶原蛋白的第一多核苷酸，并且在UL41基因座中携带编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸；重组病毒在ICP4基因座中的一个或两个中携带编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸，并且在UL41基因座中携带编码第一人胶原蛋白的第一多核苷酸；等)。在一些实施方案中，重组单纯疱疹病毒基因组在病毒ICP4基因座中的一个或两个内包含本公开的一种或多种多核苷酸，在病毒ICP22基因座内包含本公开的一种或多种多核苷酸，并且在病毒UL41基因座内包含本公开的一种或多种多核苷酸(例如重组病毒在ICP4基因座中的一个或两个中携带编码第一人胶原蛋白的第一多核苷酸，并且在ICP22和UL41基因座中携带编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸；重组病毒在ICP4基因座中的一个或两个中携带编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸，并且在ICP22和UL41基因座中携带编码第一人胶原蛋白的第一多核苷酸；等)。
在一些实施方案中，重组疱疹病毒基因组(例如重组单纯疱疹病毒基因组)已被工程化来使一种或多种毒性单纯疱疹基因(诸如HSV ICP0基因的一个或两个拷贝、HSV ICP4基因的一个或两个拷贝、ICP22基因和/或UL41基因)的表达降低或消除。在一些实施方案中，相较于相应野生型疱疹病毒基因组(例如野生型单纯疱疹病毒基因组)，重组疱疹病毒基因组(例如重组单纯疱疹病毒基因组)已被工程化来使重组基因组(例如当引入靶标细胞中时)的细胞毒性降低。在一些实施方案中，相较于相应野生型疱疹病毒基因组，重组病毒基因组(例如重组单纯疱疹病毒基因组)的细胞毒性(例如在人角质化细胞和/或纤维母细胞中)降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％(例如测量重组ΔICP4(一个或两个拷贝)单纯疱疹病毒基因组相对于野生型单纯疱疹病毒基因组的在人角质化细胞或纤维母细胞(原代细胞或细胞系)中的相对细胞毒性；测量重组ΔICP4(一个或两个拷贝)/ΔICP22单纯疱疹病毒基因组相对于野生型单纯疱疹病毒基因组的在人角质化细胞或纤维母细胞(原代细胞或细胞系)中的相对细胞毒性；等)。在一些实施方案中，相较于相应野生型疱疹病毒基因组，重组疱疹病毒基因组(例如重组单纯疱疹病毒基因组)的细胞毒性(例如在人角质化细胞和/或纤维母细胞中)降低至至少约1/1.5、至少约1/2、至少约1/3、至少约1/4、至少约1/5、至少约1/6、至少约1/7、至少约1/8、至少约1/9、至少约1/10、至少约1/15、至少约1/20、至少约1/25、至少约1/50、至少约1/75、至少约1/100、至少约1/250、至少约1/500、至少约1/750、至少约1/1000，或降低更多(例如测量重组ΔICP4(一个或两个拷贝)单纯疱疹病毒基因组相对于野生型单纯疱疹病毒基因组的在人角质化细胞或纤维母细胞(原代细胞或细胞系)中的相对细胞毒性；测量重组ΔICP4(一个或两个拷贝)/ΔICP22单纯疱疹病毒基因组相对于野生型单纯疱疹病毒基因组的在人角质化细胞或纤维母细胞(原代细胞或细胞系)中的相对细胞毒性；等)。测量细胞毒性的方法为本领域普通技术人员所知，包括例如通过使用活体染料(甲臜染料)、蛋白酶生物标志物、MTT测定(或使用相关四唑嗡盐诸如XTT、MTS、水溶性四唑嗡盐等的测定)，测量ATP含量等。
在一些实施方案中，相较于相应野生型疱疹病毒基因组(例如野生型单纯疱疹病毒基因组)，重组疱疹病毒基因组(例如重组单纯疱疹病毒基因组)已被工程化来使在靶标细胞暴露于重组基因组之后，重组疱疹病毒基因组对宿主细胞增殖的影响降低。在一些实施方案中，靶标细胞是人细胞。在一些实施方案中，靶标细胞是表皮和/或真皮的细胞。在一些实施方案中，靶标细胞是角质化细胞和/或纤维母细胞。在一些实施方案中，相较于在暴露于相应野生型疱疹病毒基因组之后的宿主细胞增殖，在暴露于重组基因组之后的宿主细胞增殖(例如人角质化细胞和/或纤维母细胞)加快至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％(例如在人角质化细胞或纤维母细胞(原代细胞或细胞系)的情况下，相对于在暴露于野生型单纯疱疹病毒基因组之后的细胞增殖，测量在暴露于重组ΔICP4(一个或两个拷贝)单纯疱疹病毒基因组之后的相对细胞增殖；在人角质化细胞或纤维母细胞(原代细胞或细胞系)的情况下，相对于在暴露于野生型单纯疱疹病毒基因组之后的细胞增殖，测量在暴露于重组ΔICP4(一个或两个拷贝)/ΔICP22单纯疱疹病毒基因组之后的相对细胞增殖；等)。在一些实施方案中，相较于在暴露于相应野生型疱疹病毒基因组之后的宿主细胞增殖，在暴露于重组基因组之后的宿主细胞增殖(例如人角质化细胞和/或纤维母细胞)加快至至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约250倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1000倍(例如在人角质化细胞或纤维母细胞(原代细胞或细胞系)的情况下，相对于在暴露于野生型单纯疱疹病毒基因组之后的细胞增殖，测量在暴露于重组ΔICP4(一个或两个拷贝)单纯疱疹病毒基因组之后的相对细胞增殖；在人角质化细胞或纤维母细胞(原代细胞或细胞系)的情况下，相对于在暴露于野生型单纯疱疹病毒基因组之后的细胞增殖，测量在暴露于重组ΔICP4(一个或两个拷贝)/ΔICP22单纯疱疹病毒基因组之后的相对细胞增殖；等)。测量细胞增殖的方法为本领域普通技术人员所知，包括例如通过使用Ki67细胞增殖测定、BrdU细胞增殖测定等。
载体(例如疱疹病毒载体)可包括本公开的一种或多种呈适于在宿主细胞中表达多核苷酸的形式的多核苷酸。载体可包括一种或多种操作性地连接于待表达的多核苷酸的调控序列(例如如上所述)。
在一些实施方案中，本公开的重组核酸(例如重组单纯疱疹病毒基因组)包含本文所述的多核苷酸中的一者或多者，所述一者或多者以任何定向插入所述重组核酸中。如果重组核酸包含本文所述的两种或更多种多核苷酸(例如两种或更多种、三种或更多种等)，那么多核苷酸可以彼此相同定向或相反定向加以插入。在不希望受理论束缚下，以反义定向将两种多核苷酸(例如两种转基因)并入重组核酸(例如载体)中可有助于避免通读，并且确保每种多核苷酸的适当表达。
IV.病毒
本公开的某些方面涉及包含本文所述的多核苷酸和/或重组核酸中的任一者的病毒。在一些实施方案中，病毒能够感染受试者(例如人)的一种或多种靶标细胞。在一些实施方案中，病毒适于将多核苷酸和/或重组核酸递送至受试者(例如人受试者)的一种或多种靶标细胞中。在一些实施方案中，一种或多种靶标细胞是一种或多种人细胞。在一些实施方案中，一种或多种靶标细胞是皮肤的一种或多种细胞(例如表皮、真皮和/或皮下组织的一种或多种细胞)。在一些实施方案中，一种或多种细胞选自角质化细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans cell)、梅克尔细胞(Merkel cell)、肥大细胞、纤维母细胞和/或脂肪细胞。在一些实施方案中，一种或多种细胞是角质化细胞。在一些实施方案中，一种或多种细胞存在于角质层、颗粒层、棘层、基底层和/或基底膜中。在一些实施方案中，一种或多种靶标细胞是一种或多种表皮细胞。
可使用本领域中已知的任何适合病毒，包括例如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘苗病毒和/或它们的任何杂合病毒。在一些实施方案中，病毒是减毒的。在一些实施方案中，病毒是复制缺陷性的。在一些实施方案中，病毒是有复制能力的。在一些实施方案中，相对于未修饰野生型病毒的组织趋性，病毒已被修饰来改变它的组织趋性。在一些实施方案中，相较于相应野生型病毒，病毒具有降低的细胞毒性。用于产生包含重组核酸的病毒的方法为本领域普通技术人员所熟知。
在一些实施方案中，病毒是DNA病毒的疱疹病毒科的成员，包括例如单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、人巨细胞病毒、疱疹病毒6A、疱疹病毒6B、疱疹病毒7和卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒等。在一些实施方案中，疱疹病毒是减毒的。在一些实施方案中，疱疹病毒是复制缺陷性的。在一些实施方案中，疱疹病毒是有复制能力的。在一些实施方案中，相较于相应野生型疱疹病毒，疱疹病毒具有降低的细胞毒性。在一些实施方案中，疱疹病毒不是溶瘤性的。
在一些实施方案中，病毒是单纯疱疹病毒。包含重组核酸的单纯疱疹病毒可通过例如在WO2015/009952和/或WO2017/176336中公开的方法产生。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒是减毒的。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒是有复制能力的。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒是复制缺陷性的。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒是单纯疱疹1型病毒(HSV-1)、单纯疱疹2型病毒(HSV-2)或它们的任何衍生物。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒是单纯疱疹1型病毒(HSV-1)。在一些实施方案中，HSV-1是减毒的。在一些实施方案中，相较于相应野生型HSV-1，HSV-1具有降低的细胞毒性。在一些实施方案中，HSV-1不是溶瘤性的。
在一些实施方案中，相对于未修饰野生型单纯疱疹病毒的组织趋性，单纯疱疹病毒已被修饰来改变它的组织趋性。在一些实施方案中，单纯疱疹病毒包含经修饰包膜。在一些实施方案中，经修饰包膜包含一种或多种(例如一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种等)突变单纯疱疹病毒糖蛋白。单纯疱疹病毒糖蛋白的实例可包括但不限于糖蛋白gB、gC、gD、gH和gL。在一些实施方案中，相对于野生型单纯疱疹病毒，经修饰包膜改变单纯疱疹病毒组织趋性。
在一些实施方案中，本公开的病毒(例如疱疹病毒)对一种或多种靶标细胞(例如一种或多种人角质化细胞和/或纤维母细胞)的转导效率(体外和/或体内)是至少约25％。举例来说，病毒对一种或多种靶标细胞的转导效率可为至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约99.5％或更高。在一些实施方案中，病毒是单纯疱疹病毒，并且病毒对一种或多种靶标细胞(例如一种或多种人角质化细胞和/或纤维母细胞)的转导效率是约85％至约100％。在一些实施方案中，病毒是单纯疱疹病毒，并且病毒对一种或多种靶标细胞(例如一种或多种人角质化细胞和/或纤维母细胞)的转导效率是至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在体外或在体内测量病毒转导效率的方法为本领域普通技术人员所熟知，包括例如qPCR分析、深度测序、蛋白质印迹、荧光分析(诸如荧光原位杂交(FISH)、荧光报告基因表达、免疫荧光、FACS)等。
V.组合物和制剂
本公开的某些方面涉及包含重组核酸(例如重组疱疹病毒基因组)和/或病毒(例如包含本文所述的重组基因组的疱疹病毒，诸如包含重组单纯疱疹病毒基因组的单纯疱疹病毒)中的任一者以及赋形剂或载体(例如药学上可接受的赋形剂或载体)的组合物和制剂(例如药物组合物和制剂)。在一些实施方案中，组合物或制剂是美容组合物或制剂(例如皮肤护理产品)。
在一些实施方案中，组合物或制剂包含本文所述的病毒(例如疱疹病毒)中的任何一者或多者。在一些实施方案中，组合物或制剂包含约104至约1012个空斑形成单位(PFU)/mL的病毒。举例来说，组合物或制剂可包含约104至约1012、约105至约1012、约106至约1012、约107至约1012、约108至约1012、约109至约1012、约1010至约1012、约1011至约1012、约104至约1011、约105至约1011、约106至约1011、约107至约1011、约108至约1011、约109至约1011、约1010至约1011、约104至约1010、约105至约1010、约106至约1010、约107至约1010、约108至约1010、约109至约1010、约104至约109、约105至约109、约106至约109、约107至约109、约108至约109、约104至约108、约105至约108、约106至约108、约107至约108、约104至约107、约105至约107、约106至约107、约104至约106、约105至约106、或约104至约105PFU/mL的病毒。在一些实施方案中，组合物或制剂包含约104、约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011或约1012PFU/mL的病毒。
如本文所述的组合物和制剂(例如药物组合物和制剂)可通过使一种或多种具有所需纯度的活性成分(诸如重组核酸或病毒)与一种或多种可接受的载体或赋形剂混合来制备。可接受的载体或赋形剂(例如药学上可接受的载体或赋形剂)在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且可包括但不限于：缓冲剂(诸如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其他有机酸)；抗氧化剂(诸如抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；多元醇(诸如甘油，例如包括10％甘油的制剂)；亲水性聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；单糖、二糖和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(诸如EDTA)；糖(诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇)；成盐反离子(诸如钠)；金属络合物(诸如Zn-蛋白质络合物)；脂质体(例如阳离子脂质)；纳米粒子载体；和/或非离子表面活性剂(诸如聚乙二醇(PEG))。对载体的彻底讨论可在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中获得。
在一些实施方案中，组合物或制剂包含一种或多种脂质(例如阳离子脂质)载体。在一些实施方案中，组合物或制剂包含一种或多种纳米粒子载体。纳米粒子是可携带囊封化药物以达成快速或控制释放的亚微米(小于约1000nm)大小的药物递送载体，所述药物诸如是合成小分子、蛋白质、肽、细胞、病毒和基于核酸的生物治疗剂。多种分子(例如蛋白质、肽、重组核酸等)可使用本领域中熟知的方法来高效囊封在纳米粒子中。在一些实施方案中，“囊封”在纳米粒子中的分子可指含于所述纳米粒子内或连接于所述纳米粒子的表面和/或与所述纳米粒子的表面联合或呈它们的任何组合的形式的分子(诸如病毒)。用于本文所述的组合物或制剂中的纳米粒子可为本领域中已知的任何类型的生物可相容纳米粒子，包括例如包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、PLGA、PLA、PGA以及它们的任何组合的纳米粒子(参见例如Vauthier等Adv Drug Del Rev.(2003)55:519-48；US2007/0148074；US2007/0092575；US2006/0246139；US5753234；US7081483；以及WO2006/052285)。
在一些实施方案中，载体或赋形剂(例如药学上可接受的载体或赋形剂)可适合于或适于本领域中已知的任何施用途径，包括例如静脉内、肌肉内、皮下、经皮肤、鼻内、气管内、舌下、经颊、局部、口服、经皮、真皮内、腹膜内、眶内、玻璃体内、视网膜下、经粘膜、关节内、通过浅表注射、通过植入、通过吸入、鞘内、室内和/或鼻内施用。在一些实施方案中，载体或赋形剂(例如药学上可接受的载体或赋形剂)适合于或适于局部、经皮、皮下和/或真皮内施用。在一些实施方案中，载体或赋形剂适合于或适于局部、经皮和/或真皮内施用。在一些实施方案中，载体或赋形剂适合于或适于浅表注射。
适合于或适于在局部、经皮、皮下、浅表和/或真皮内施加/施用中使用的载体或赋形剂的实例可包括但不限于软膏、油、糊、乳膏、气雾、混悬液、乳液、脂肪软膏、凝胶、粉末、液体、洗液、溶液、喷雾、贴片(例如经皮贴片或微针贴片)、粘合带、微针或微针阵列、以及吸入物。在一些实施方案中，载体或赋形剂(例如药学上可接受的载体或赋形剂)包括软膏、油、糊、乳膏、气雾、混悬液、乳液、脂肪软膏、凝胶、粉末、液体、洗液、溶液、喷雾、粘合带和吸入物中的一者或多者(例如一者或多者、两者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者等)。在一些实施方案中，载体包括贴片(例如粘着于皮肤的贴片)，诸如经皮贴片或微针贴片。在一些实施方案中，载体包括微针或微针阵列。用于制备和使用适于组合物递送的微针阵列的方法通常在本领域中是已知的(Kim Y.等“Microneedles for drug andvaccine delivery”.Advanced Drug Delivery Reviews 2012,64(14):1547-68)。
在一些实施方案中，组合物或制剂(例如药物组合物或制剂)适合于或适于本领域中已知的任何施用途径，包括例如静脉内、肌肉内、皮下、经皮肤、口服、鼻内、气管内、舌下、经颊、局部、经皮、真皮内、腹膜内、眶内、玻璃体内、视网膜下、经粘膜、关节内、通过浅表注射、通过植入、通过吸入、鞘内、室内和/或鼻内施用。在一些实施方案中，组合物或制剂适合于或适于经皮肤、局部、经皮、皮下和/或真皮内施用。在一些实施方案中，药物组合物或制剂适合于或适于局部、经皮和/或真皮内施用。在一些实施方案中，组合物或制剂适合于或适于真皮内施用。在一些实施方案中，组合物或制剂适合于或适于浅表注射。
在一些实施方案中，组合物或制剂(例如药物组合物或制剂)还包含一种或多种额外组分。额外组分的实例可包括但不限于粘合剂(例如预凝胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸盐或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、淀粉乙醇酸钠等)；湿润剂(例如月桂基硫酸钠等)；盐溶液；醇；聚乙二醇；明胶；乳糖；淀粉酶；硬脂酸镁；滑石；硅酸；粘性石蜡；羟甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；甜味剂；调味剂；芳香剂；着色剂；保湿剂；遮光剂；抗细菌剂；能够使多核苷酸稳定或防止它们的降解的试剂等。在一些实施方案中，组合物或制剂包含羟丙基甲基纤维素凝胶。在一些实施方案中，组合物或制剂包含磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，组合物或制剂包含甘油(例如以约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％等)。
待用于体内施用的组合物和制剂(例如药物组合物和制剂)通常是无菌的。无菌性可易于例如通过经无菌过滤膜过滤来实现。
在一些实施方案中，本文所述的重组核酸、病毒和/或组合物或制剂中的任一者都可用于将一种或多种编码胶原蛋白(例如人胶原蛋白诸如胶原3)的多核苷酸递送至受试者的一种或多种细胞(例如一种或多种胶原缺乏性细胞)中。在一些实施方案中，本文所述的重组核酸、病毒和/或组合物或制剂中的任一者都可用于疗法中。在一些实施方案中，本文所述的重组核酸、病毒和/或组合物或制剂中的任一者都可用于治疗将受益于胶原多肽的表达的美容或美容性状况(例如与胶原缺乏相关的美容或美容性状况(诸如老化和/或UV损害的皮肤))。在一些实施方案中，本文所述的重组核酸、病毒和/或组合物或制剂中的任一者都可用于治疗皮肤学老化(例如如下所述)。
在一些实施方案中，本文所述的重组核酸、病毒和/或组合物或制剂中的任一者都可用于制备或制造药剂。在一些实施方案中，本文所述的重组核酸、病毒和/或组合物或制剂中的任一者都可用于制备或制造可用于将一种或多种编码胶原蛋白(例如人胶原蛋白诸如胶原3)的多核苷酸递送至受试者的一种或多种细胞(例如一种或多种胶原缺乏性细胞)中的药剂。在一些实施方案中，本文所述的重组核酸、病毒和/或组合物或制剂中的任一者都可用于制备或制造可用于治疗将受益于胶原多肽的表达的美容或美容性状况(例如与胶原缺乏相关的美容或美容性状况(诸如老化和/或UV损害的皮肤))的药剂。在一些实施方案中，本文所述的重组核酸、病毒和/或组合物或制剂中的任一者都可用于制备或制造可用于治疗皮肤学老化(例如如下所述)的药剂。
VI.方法
本公开的某些方面涉及一种增强、增加、加强和/或补充受试者中(例如受试者的一种或多种细胞中)一种或多种真皮细胞外基质蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物中的任一者。在一些实施方案中，受试者是人。
本公开的其他方面涉及使受试者中真皮细胞外基质的结构和/或组织稳定或改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物中的任一者。在一些实施方案中，受试者是人。
本公开的其他方面涉及一种增强、增加、加强和/或补充受试者中(例如受试者的一种或多种细胞中)一种或多种人胶原蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物中的任一者。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，相较于受试者的一种或多种相应未治疗细胞(例如在治疗之前的一种或多种细胞、在治疗期间的一种或多种未感染细胞等)中一种或多种胶原的内源性水平，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物向受试者的施用使受试者的一种或多种细胞中的胶原(例如COL1-1；COL1-2；COL3；COL1-1和COL1-2；COL1-1和COL3；等)水平(转录物或蛋白质水平)增加至少约10％。举例来说，相较于受试者的一种或多种相应未治疗细胞中一种或多种胶原的内源性水平，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物的施用可使受试者的一种或多种细胞中的胶原水平(转录物或蛋白质水平)增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或更多。在一些实施方案中，相较于受试者的一种或多种相应未治疗细胞(例如在治疗之前的一种或多种细胞、在治疗期间的一种或多种未感染细胞等)中一种或多种胶原的内源性水平，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物向受试者的施用使受试者的一种或多种细胞中的胶原水平(转录物或蛋白质水平)增加至至少约2倍。举例来说，相较于受试者的一种或多种相应未治疗细胞中一种或多种胶原的内源性水平，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物的施用可使受试者的一种或多种细胞中的胶原水平(转录物或蛋白质水平)增加至至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约250倍、至少约500倍、至少约750倍、至少约1000倍或更多倍。从样品测量转录物或蛋白质水平的方法为本领域普通技术人员所熟知，包括例如通过qPCR、RNA测序、ELISA、蛋白质印迹、质谱测定法等。
本公开的其他方面涉及一种增强、增加、加强和/或补充受试者的软组织的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物中的任一者。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，将重组核酸、病毒、药剂和/或组合物注射至受试者的软组织中。在一些实施方案中，受试者的皮肤是老化中的皮肤。在一些实施方案中，受试者的皮肤已由于暴露于紫外光(例如来自太阳，来自晒黑床等)而受损害。在一些实施方案中，受试者的皮肤是有皱纹的。
在一些实施方案中，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物可用于用以修复和/或加强受试者的软组织的方法中。在一些实施方案中，“组织修复”是指恢复组织构造和/或功能，并且涵盖组织再生和置换。在一些实施方案中，修复或加强软组织是指用于恢复皮肤的年轻外观(例如相较于外观归因于由时序性老化或其他物理、化学或UV损害所致的缺陷的“老化”皮肤)的程序。在一些实施方案中，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物可用于美容软组织应用中，诸如以填充皱纹、纹路、皱褶、疤痕，以及使真皮组织增强(例如使薄唇饱满，填充凹眼和/或浅面颊等)。
本公开的其他方面涉及一种使有需要的受试者的皮肤品质、状况和/或外观改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物中的任一者。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，皮肤状况是日光损害、老化、UV暴露、粗糙纹理、皮肤下陷和/或皱纹中的一者或多者。皮肤品质、状况和/或外观的改进(例如相较于在治疗之前)可使用包括例如FACE Q、GAIS等的本领域中已知的任何适当方法或量表来评估。在一些实施方案中，受试者的皮肤是老化中的皮肤。在一些实施方案中，受试者的皮肤已由于暴露于紫外光(例如来自太阳，来自晒黑床等)而受损害。在一些实施方案中，受试者的皮肤是有皱纹的。
本公开的其他方面涉及一种减少有需要的受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物中的任一者。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物的施用持续至少约三个月、至少约六个月、至少约九个月或至少约12个月来减少受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现。在一些实施方案中，相较于在施用组合物之前受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现，在施用组合物之后，受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现得以减少。在一些实施方案中，皮肤中一种或多种浅表凹陷是细纹和皱纹(例如前额皱纹、“鱼尾纹”、在眼或口的边缘的皱纹等)中的一者或多者。在一些实施方案中，对一种或多种浅表皮肤凹陷的治疗通过相较于非治疗皮肤，在皮肤纹理或皮肤品质诸如光滑度、水化和弹性方面的改进来度量。在一些实施方案中，对一种或多种浅表皮肤凹陷的治疗通过浅表凹陷的严重性(例如深度)的减轻和/或皮肤的给定区域中细纹或皱纹的数目的降低来度量。在一些实施方案中，受试者的皮肤是老化中的皮肤。在一些实施方案中，受试者的皮肤已由于暴露于紫外光(例如来自太阳，来自晒黑床等)而受损害。在一些实施方案中，受试者的皮肤是有皱纹的。
本公开的其他方面涉及一种使受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性和/或张力中的至少一者增加和/或改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物中的任一者。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，在施用组合物之后，受试者的皮肤持续至少约三个月、至少约六个月、至少约九个月或至少约12个月来维持纹理、光滑度、弹性或张力增加和/或改进中的至少一者。在一些实施方案中，相较于在施用组合物之前受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性或张力，在施用组合物之后，受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性或张力中的至少一者得以增加和/或改进。测量皮肤的纹理、光滑度、弹性和/或张力的方法为本领域技术人员所知。在一些实施方案中，受试者的皮肤是老化中的皮肤。在一些实施方案中，受试者的皮肤已由于暴露于紫外光(例如来自太阳，来自晒黑床等)而受损害。在一些实施方案中，受试者的皮肤是有皱纹的。
本公开的其他方面涉及一种使有需要的受试者的一种或多种皮肤学老化征象减弱的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物中的任一者。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，减弱一种或多种皮肤学老化征象包括以下中的任何一者或多者：治疗、减轻和/或预防细纹和/或皱纹；降低皮肤孔尺寸；改进皮肤厚度、饱满度和/或紧固度；改进皮肤光滑度、柔韧性和/或柔软度；改进皮肤色泽、光亮度和/或透明度；改进原胶原和/或胶原产生；改进皮肤纹理和/或促进再纹理化；改进皮肤轮廓的外观；恢复皮肤光泽和/或亮度；改进由于老化和/或绝经而减退的皮肤外观；改进皮肤保湿；增加皮肤弹性和/或回弹力；治疗、减轻和/或预防皮肤下陷；改进皮肤紧致度；减轻色素斑点、斑点化皮肤和/或疤痕(诸如痤疮疤痕)；和/或改进就光衍射或反射来说的皮肤光学性质。在一些实施方案中，相较于在施用组合物之前受试者的一种或多种皮肤学老化征象，在施用组合物之后，受试者的一种或多种皮肤学老化征象得到减弱。可使用本领域中已知的用于测量一种或多种皮肤学老化征象的任何适合方法。
在一些实施方案中，在用有效量的本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物中的任一者治疗之前，对受试者的皮肤的一个或多个部分进行磨削，或使得所述一个或多个部分更加可穿透。可使用本领域中已知的磨削皮肤或使皮肤可穿透性增加的任何适合方法，包括例如使用皮肤滚轮，重复使用粘合带来移除皮肤细胞层(胶带剥落)，用解剖刀或刀片刮削，使用砂纸，使用化学穿透增强剂或电能，使用声波或超声波能，使用光(例如激光)能，使用长度适于刺穿但不完全穿过表皮的微米大小的针或刀片等。
在一些实施方案中，本公开的方法用于美容应用，诸如减少或消除皮肤中一种或多种浅表凹陷，减少或消除一种或多种皱纹，和/或预防一种或多种皱纹的出现或再现。在一些实施方案中，皮肤中一种或多种浅表凹陷或皱纹选自鼻唇皱褶、鱼尾纹、皱眉纹、烦恼纹、疤痕、眉间纹、眉下垂、泪槽、鼻颊纹、兔宝宝纹、面颊/面中部下垂、木偶纹、罂粟陷窝、微笑纹、笑纹、下巴皱痕、颈纹、颈阔肌带以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，“有效量”是为影响特定状况(例如美容状况诸如皮肤老化)的一种或多种征象或症状的可测量改进或预防所述一种或多种征象或症状所需的至少最小量。“有效量”可根据诸如患者的年龄、性别和重量的因素而变化。有效量还是其中有益作用胜过治疗的任何毒性或有害作用的量。有效量可以一次或多次施用加以施用。出于本公开的目的，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物的有效量是足以直接或间接实现可测量改进的量。如在临床情形下所了解，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物的有效量可或可不与另一药物、化合物或组合物联合实现。因此，可在施用一种或多种药剂的情形下考虑“有效量”，并且如果在与一种或多种其他药剂联合的情况下可实现或实现了合乎需要的结果，那么单一药剂可被视为以有效量给与。
在一些实施方案中，向受试者施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物一次。在一些实施方案中，向受试者施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物至少两次(例如至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次等)。在一些实施方案中，在施用之间(例如在第一施用与第二施用之间，在第二施用与第三施用之间，等)，经过至少约15天(例如至少约15天、至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天、至少约60天、至少约70天、至少约80天、至少约90天、至少约100天、至少约120天等)。
本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂可通过本领域中已知的任何适合方法或途径施用，包括不限于通过口服施用、舌下施用、经颊施用、局部施用、经直肠施用、通过吸入、经皮施用、皮下注射、真皮内注射、浅表注射、静脉内(IV)注射、动脉内注射、肌肉内注射、心内注射、骨内注射、腹膜内注射、经粘膜施用、经阴道施用、尿道内施用、玻璃体内施用、眶内施用、视网膜下施用、关节内施用、关节周施用、局部施用、皮上施用或它们的任何组合。因此，本公开涵盖将本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂中的任一者递送至个体的方法。
在一些实施方案中，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂以经皮肤方式、局部、经皮方式、皮下方式和/或真皮内方式向受试者施用。在一些实施方案中，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂以真皮内方式和/或皮下方式施用。在一些实施方案中，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂通过浅表注射来施用。在一些实施方案中，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂局部和/或经皮方式施用。在一些实施方案中，每天一次、两次、三次、四次、五次或更多次施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂。在一些实施方案中，向个体的一个或多个受影响(例如有皱纹)区域施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂。在一些实施方案中，向个体的一个或多个未受影响区域施用组合物。
在一些实施方案中，在皮肤中在浅表深度下施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，在约2000微米或更小的深度下将重组核酸、病毒、药剂和/或组合物引入皮肤中。举例来说，可在约2000微米或更小，约1750微米或更小，约1500微米或更小，约1250微米或更小，约1000微米或更小，约900微米或更小，约800微米或更小，约700微米或更小，约600微米或更小，或约500微米或更小的深度下向皮肤中施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，在约0.5mm与5.0mm之间的注射深度下引入重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。举例来说，可在约0.5mm与5.0mm，约0.5mm与4.5mm，约0.5mm与4.0mm，约0.5mm与3.5mm，约0.5mm与3.0mm，约0.5mm与2.5mm，约0.5mm与2.0mm，约0.5mm与1.5mm，约0.5mm与1.0mm，1.0mm与5.0mm，约1.0mm与4.5mm，约1.0mm与4.0mm，约1.0mm与3.5mm，约1.0mm与3.0mm，约1.0mm与2.5mm，约1.0mm与2.0mm，约1.0mm与1.5mm，1.5mm与5.0mm，约1.5mm与4.5mm，约1.5mm与4.0mm，约1.5mm与3.5mm，约1.5mm与3.0mm，约1.5mm与2.5mm，约1.5mm与2.0mm等之间的注射深度下引入重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。
在一些实施方案中，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物通过以约1mm至约30mm之间的距离加以间隔开的注射来施用。举例来说，重组核酸、病毒、药剂和/或组合物可通过以约1mm与30mm，2mm与30mm，5mm与30mm，10mm与30mm，15mm与30mm，1mm与20mm，2mm与20mm，5mm与20mm，10mm与20mm，15mm与20mm，1mm与15mm，2mm与15mm，5mm与15mm，10mm与15mm，1mm与10mm，2mm与10mm，5mm与10mm，1mm与5mm，2mm与5mm等之间的距离加以间隔开的注射来施用。在一些实施方案中，注射以至少约1mm、至少约2mm、至少约5mm、至少约10mm、至少约15mm、至少约20mm、至少约30mm或更大的距离加以间隔开。
身体的众多区域可用本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物治疗，包括例如面部、前额、唇、头皮、颈、臂、手、腿、膝、足、胸、背、腹股沟、臀部、大腿等。在一些实施方案中，向面部施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个鼻唇皱褶施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，在一只或两只眼的周围施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个鱼尾纹施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个皱眉纹施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个疤痕(例如痤疮疤痕)施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个眉间纹施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个眉下垂施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个深度泪槽施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个鼻颊纹施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个兔宝宝纹施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个面颊/面中部下垂施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个木偶纹施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个罂粟陷窝部位施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个下巴皱痕施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个颈纹施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。在一些实施方案中，向一个或多个颈阔肌带施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物。
在一些实施方案中，当将重组核酸递送至受试者的一种或多种靶标细胞中时，重组核酸表达一种或多种美容蛋白(例如人胶原)。在一些实施方案中，一种或多种美容蛋白(例如人胶原)的表达增强、增加、加强和/或补充一种或多种靶标细胞中人胶原的水平。在一些实施方案中，一种或多种美容蛋白(例如人胶原)的表达增强、增加、加强和/或补充由一种或多种靶标细胞分泌的人胶原的水平。在一些实施方案中，一种或多种美容蛋白(例如人胶原)的表达增强、增加、加强和/或补充细胞外基质中人胶原的水平。在一些实施方案中，一种或多种美容蛋白(例如人胶原)的表达增强、增加、加强和/或补充受试者中细胞外基质的稳定性。在一些实施方案中，一种或多种美容蛋白(例如人胶原)的表达增强、加强和/或补充受试者的软组织。在一些实施方案中，一种或多种美容蛋白(例如人胶原)的表达使个体的皮肤品质、状况和/或外观改进。在一些实施方案中，一种或多种美容蛋白(例如人胶原)的表达使受试者的皮肤中的一种或多种浅表凹陷(例如皱纹)减少。在一些实施方案中，一种或多种美容蛋白(例如人胶原)的表达使受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性和/或张力改进。在一些实施方案中，一种或多种美容蛋白(例如人胶原)的表达使受试者的一种或多种皮肤学老化征象减轻。
VII.宿主细胞
本公开的某些方面涉及一种或多种包含本文所述的任何重组核酸的宿主细胞。可使用本领域中已知的任何适合宿主细胞(原核或真核)，包括例如：原核细胞，包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)诸如埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erminia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如粘质沙雷氏菌(S.marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)，以及杆菌(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；真菌细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))；昆虫细胞(例如S2细胞等)；以及哺乳动物细胞，包括由SV40转化的猴肾CV1株系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾株系(293细胞或被亚克隆来达成悬浮培养生长的293细胞)、幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、小鼠塞尔托利细胞(Sertoli cell)(TM4)、猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TRI细胞、MRC 5细胞、FS4细胞、人肝细胞瘤株系(Hep G2)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR"CHO细胞，以及骨髓瘤细胞系，诸如NS0和Sp2/0。在一些实施方案中，宿主细胞是人或非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是Vero细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是补充性宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞(例如Vero细胞)表达一种或多种单纯疱疹病毒基因(例如ICP4基因)。在一些实施方案中，宿主细胞是来自细胞系的细胞。适合宿主细胞或细胞系的实例可包括但不限于293、HeLa、SH-Sy5y、Hep G2、CACO-2、A549、L929、3T3、K562、CHO-K1、MDCK、HUVEC、Vero、N20、COS-7、PSN1、VCaP、CHO细胞等。
在一些实施方案中，重组核酸是单纯疱疹病毒载体。在一些实施方案中，重组核酸是单纯疱疹病毒扩增子。在一些实施方案中，重组核酸是HSV-1扩增子或HSV-1杂合扩增子。在一些实施方案中，使包含辅助病毒的宿主细胞与本文所述的HSV-1扩增子或HSV-1杂合扩增子接触，从而导致产生包含本文所述的一种或多种重组核酸的病毒。在一些实施方案中，从经接触宿主细胞的上清液收集病毒。通过使包含辅助病毒的宿主细胞与HSV-1扩增子或HSV-1/杂合扩增子接触来产生病毒的方法在本领域中是已知的。
在一些实施方案中，宿主细胞是补充性宿主细胞。在一些实施方案中，补充性宿主细胞表达一种或多种在本文所述的任何病毒载体中失活的基因。在一些实施方案中，使补充性宿主细胞与本文所述的重组疱疹病毒基因组(例如重组单纯疱疹病毒基因组)接触。在一些实施方案中，使补充性宿主细胞与重组疱疹病毒基因组接触导致产生包含本文所述的一种或多种重组核酸的疱疹病毒。在一些实施方案中，从经接触宿主细胞的上清液收集病毒。通过使补充性宿主细胞与重组单纯疱疹病毒接触来产生病毒的方法一般地描述于WO2015 009952和/或WO2017/176336中。
VIII.制品或药盒
本公开的某些方面涉及一种包括本文所述的重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂(例如药物组合物或制剂)中的任一者的制品或药盒。在一些实施方案中，制品或药盒包括包含关于施用重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂(例如以治疗真皮细胞外基质蛋白(例如胶原)缺乏和/或矫正一种或多种皮肤学老化征象)的说明的包装插页。
适于重组核酸、病毒、药剂和/或组合物或制剂的容器可包括例如瓶、小瓶、袋、管和注射器。容器可由多种材料诸如玻璃、塑料(诸如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(诸如不锈钢或哈斯特合金(hastelloy))形成。在一些实施方案中，容器包括在容器上或与容器相伴的标签，其中所述标签指示使用说明。制品或药盒可还包括从商业和使用者观点来看可合乎需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器、包装插页等。
IX.列举的实施方案
实施方案1：一种组合物，所述组合物包含：(a)包含重组核酸的单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组核酸包含编码第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽包含第一人胶原蛋白，和(b)赋形剂。
实施方案2：如实施方案1所述的组合物，其中所述重组核酸包含所述第一多核苷酸的两个或更多个拷贝。
实施方案3：如实施方案1或2所述的组合物，其中所述HSV是复制缺陷性的。
实施方案4：如实施方案1或2所述的组合物，其中所述HSV是有复制能力的。
实施方案5：如实施方案1-4中的任一者所述的组合物，其中所述HSV是单纯疱疹1型病毒、单纯疱疹2型病毒或它们的任何衍生物。
实施方案6：如实施方案1-5中的任一者所述的组合物，其中所述重组核酸是单纯疱疹病毒扩增子。
实施方案7：如实施方案6所述的组合物，其中所述单纯疱疹病毒扩增子是HSV-1扩增子或HSV-1杂合扩增子。
实施方案8：如实施方案7所述的组合物，其中所述HSV-1杂合扩增子是HSV/AAV杂合扩增子、HSV/EBV杂合扩增子、以及HSV/EBV/RV杂合扩增子、或HSV/睡美人杂合扩增子。
实施方案9：如实施方案1-5中的任一者所述的组合物，其中所述重组核酸是重组单纯疱疹病毒基因组。
实施方案10：如实施方案9所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。
实施方案11：如实施方案9或10所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在单纯疱疹病毒基因中包含失活性突变。
实施方案12：如实施方案11所述的组合物，其中所述单纯疱疹病毒基因选自由感染细胞蛋白(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、胸苷激酶(tk)、长独特区域(UL)41和UL55组成的组。
实施方案13：如实施方案12所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP4基因的一个或两个拷贝中包含失活突变。
实施方案14：如实施方案12或13所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP22基因中包含失活性突变。
实施方案15：如实施方案12-14中的任一者所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述UL41基因中包含失活突变。
实施方案16：如实施方案12-15中的任一者所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP0基因中包含失活突变。
实施方案17：如实施方案12-16中的任一者所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP27基因中包含失活突变。
实施方案18：如实施方案11-17中的任一者所述的组合物，其中所述失活性突变是所述一种或多种基因的编码序列的缺失。
实施方案19：如实施方案9-18中的任一者所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在病毒基因座内包含所述第一多核苷酸。
实施方案20：如实施方案9-19中的任一者所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含所述第一多核苷酸。
实施方案21：如实施方案9-20中的任一者所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22病毒基因座内包含所述第一多核苷酸。
实施方案22：如实施方案9-21中的任一者所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在UL41病毒基因座内包含所述第一多核苷酸。
实施方案23：如实施方案1-22中的任一者所述的组合物，其中相较于野生型单纯疱疹病毒，所述HSV具有降低的细胞毒性。
实施方案24：如实施方案1-23中的任一者所述的组合物，其中所述第一人胶原蛋白选自由以下组成的组：胶原α-1(I)链多肽(COL1-1)、胶原α-2(I)链多肽(COL1-2)、胶原α-1(II)链多肽(COL2)、胶原α-1(III)链多肽(COL3)、胶原α-1(IV)链多肽(COL4-1)、胶原α-2(IV)链多肽(COL4-2)、胶原α-3(IV)链多肽(COL4-3)、胶原α-4(IV)链多肽(COL4-4)、胶原α-5(IV)链多肽(COL4-5)、胶原α-6(IV)链多肽(COL4-6)、胶原α-1(V)链多肽(COL5-1)、胶原α-2(V)链多肽(COL5-2)、胶原α-3(V)链多肽(COL5-3)、胶原α-1(VI)链多肽(COL6-1)、胶原α-2(VI)链多肽(COL6-2)、胶原α-3(VI)链多肽(COL6-3)、胶原α-4(VI)链多肽(COL6-4)、胶原α-5(VI)链多肽(COL6-5)、胶原α-6(VI)链多肽(COL6-6)、胶原α-1(VII)链多肽(COL7)、胶原α-1(VIII)链多肽(COL8)、胶原α-1(IX)链多肽(COL9-1)、胶原α-2(IX)链多肽(COL9-2)、胶原α-3(IX)链多肽(COL9-3)、胶原α-1(X)链多肽(COL10)、胶原α-1(XI)链多肽(COL11-1)、胶原α-2(XI)链多肽(COL11-2)、胶原α-1(XII)链多肽(COL12)、胶原α-1(XIII)链多肽(COL13)、胶原α-1(XIV)链多肽(COL14)、胶原α-1(XV)链多肽(COL15)、胶原α-1(XVI)链多肽(COL16)、胶原α-1(XVII)链多肽(COL17)、胶原α-1(XVIII)链多肽(COL18)、胶原α-1(XIX)链多肽(COL19)、胶原α-1(XX)链多肽(COL20)、胶原α-1(XXI)链多肽(COL21)、胶原α-1(XXII)链多肽(COL22)、胶原α-1(XXIII)链多肽(COL23)、胶原α-1(XXIV)链多肽(COL24)、胶原α-1(XXV)链多肽(COL25)、胶原α-1(XXVI)链多肽(COL26)、胶原α-1(XXVII)链多肽(COL27)和胶原α-1(XXVIII)链多肽(COL28)。
实施方案25：如实施方案1-24中的任一者所述的组合物，其中所述第一人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。
实施方案26：如实施方案1-25中的任一者所述的组合物，其中编码所述第一人胶原蛋白的核酸序列与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施方案27：如实施方案1-26中的任一者所述的组合物，其中所述第一人胶原蛋白包含与选自由SEQ ID NO:15-21组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
实施方案28：如实施方案1-27中的任一者所述的组合物，其中所述第一人胶原蛋白不是COL7。
实施方案29：如实施方案1-28中的任一者所述的组合物，其中所述第一多肽包含：(a)所述第一人胶原蛋白；(b)另一人胶原蛋白；和(c)使(a)连接于(b)的接头多肽。
实施方案30：如实施方案29所述的组合物，其中所述接头多肽是可裂解接头多肽。
实施方案31：如实施方案29或30所述的组合物，其中所述接头多肽包含与选自由SEQ ID NO:28-31组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
实施方案32：如实施方案29-31中的任一者所述的组合物，其中所述另一人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。
实施方案33：如实施方案29-32中的任一者所述的组合物，其中所述另一人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。
实施方案34：如实施方案29-33中的任一者所述的组合物，其中编码所述另一人胶原蛋白的核酸序列与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施方案35：如实施方案29-34中的任一者所述的组合物，其中所述另一人胶原蛋白包含与选自由SEQ ID NO:15-21组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
实施方案36：如实施方案29-35中的任一者所述的组合物，其中所述第一人胶原蛋白和所述另一人胶原蛋白是不同的。
实施方案37：如实施方案1-36中的任一者所述的组合物，其中所述第一多核苷酸编码多顺反子mRNA，所述多顺反子mRNA包含：(a)编码所述第一多肽的第一开放阅读框(ORF)；(b)编码额外人胶原蛋白的第二ORF；和(c)分隔(a)和(b)的内部核糖体进入位点(IRES)。
实施方案38：如实施方案37所述的组合物，其中编码所述IRES的核酸序列与选自SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施方案39：如实施方案37或38所述的组合物，其中所述额外人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。
实施方案40：如实施方案37-39中的任一者所述的组合物，其中所述额外人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。
实施方案41：如实施方案37-40中的任一者所述的组合物，其中编码所述额外人胶原蛋白的核酸序列与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施方案42：如实施方案37-41中的任一者所述的组合物，其中所述额外人胶原蛋白包含与选自由SEQ ID NO:15-21组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
实施方案43：如实施方案37-42中的任一者所述的组合物，其中所述第一人胶原蛋白和所述额外人胶原蛋白是不同的。
实施方案44：如实施方案1-43中的任一者所述的组合物，其中所述重组核酸还包含编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸。
实施方案45：如实施方案44所述的组合物，其中所述重组核酸包含所述第二多核苷酸的两个或更多个拷贝。
实施方案46,如实施方案44或45所述的组合物，其中所述第二人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。
实施方案47：如实施方案44-46中的任一者所述的组合物，其中所述第二人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。
实施方案48：如实施方案44-48中的任一者所述的组合物，其中编码所述第二人胶原蛋白的核酸序列与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施方案49：如实施方案44-48中的任一者所述的组合物，其中所述第二人胶原蛋白包含与选自由SEQ ID NO:15-21组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
实施方案50：如实施方案44-49中的任一者所述的组合物，其中所述第一人胶原蛋白和所述第二人胶原蛋白是不同的。
实施方案51：如实施方案44-50中的任一者所述的组合物，其中所述重组核酸是重组单纯疱疹病毒基因组，并且其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在病毒基因座内包含所述第二多核苷酸。
实施方案52：如实施方案51所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含所述第二多核苷酸。
实施方案53：如实施方案51或52所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22病毒基因座内包含所述第二多核苷酸。
实施方案54：如实施方案51-53中的任一者所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在UL41病毒基因座内包含所述第二多核苷酸。
实施方案55：如实施方案51-54中的任一者所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含所述第一多核苷酸，并且在ICP22病毒基因座内包含所述第二多核苷酸。
实施方案56：如实施方案51-54中的任一者所述的组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含所述第一多核苷酸，并且在UL41病毒基因座内包含所述第二多核苷酸。
实施方案57：如实施方案1-56中的任一者所述的组合物，其中所述赋形剂适合于经皮肤(全身性或局部)、经皮、皮下和/或真皮内施用。
实施方案58：如实施方案1-57中的任一者所述的组合物，其中所述赋形剂包括羟丙基甲基纤维素凝胶。
实施方案59：如实施方案1-58中的任一者所述的组合物，其中所述赋形剂适合于真皮内施用。
实施方案60：如实施方案1-59中的任一者所述的组合物，其中所述赋形剂包括磷酸盐缓冲剂。
实施方案61：如实施方案1-60中的任一者所述的组合物，其中所述赋形剂包括甘油。
实施方案62：如实施方案1-61中的任一者所述的组合物，其中所述赋形剂包括脂质载体。
实施方案63：如实施方案1-62中的任一者所述的组合物，其中所述赋形剂包括纳米粒子载体。
实施方案64：如实施方案1-63中的任一者所述的组合物，其中所述组合物是美容组合物。
实施方案65：如实施方案64所述的组合物，其中所述美容组合物是皮肤护理产品。
实施方案66：一种药盒，所述药盒包括：(a)如实施方案1-65中的任一者所述的组合物；和(b)关于施用所述组合物的说明书。
实施方案67：一种增强、增加、加强和/或补充受试者中一种或多种人胶原蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案1-65中的任一者所述的组合物。
实施方案68：一种增强、增加、加强和/或补充受试者的软组织的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案1-65中的任一者所述的组合物。
实施方案69：如实施方案68所述的方法，其中将所述组合物注射至所述受试者的软组织中。
实施方案70：一种使有需要的受试者的皮肤品质、状况和/或外观改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案1-65中的任一者所述的组合物。
实施方案71：如实施方案70所述的方法，其中所述状况选自由日光损害、老化、UV暴露、粗糙纹理、皮肤下陷、皱纹以及它们的任何组合组成的组。
实施方案72：一种减少有需要的受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案1-65中的任一者所述的组合物。
实施方案73：如实施方案72所述的方法，其中所述组合物的施用持续至少约三个月、至少约六个月、至少约九个月或至少约12个月来减少所述受试者的皮肤中所述一种或多种浅表凹陷的出现。
实施方案74：如实施方案72或73所述的方法，其中相较于在施用所述组合物之前所述受试者的皮肤中所述一种或多种浅表凹陷的出现，在施用所述组合物之后，所述受试者的皮肤中所述一种或多种浅表凹陷的出现得以减少。
实施方案75：一种使有需要的受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性或张力中的至少一者增加和/或改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案1-65中的任一者所述的组合物。
实施方案76：如实施方案75所述的方法，其中在施用所述组合物之后，所述受试者的皮肤持续至少约三个月、至少约六个月、至少约九个月或至少约12个月来维持纹理、光滑度、弹性或张力增加和/或改进中的至少一者。
实施方案77：如实施方案75或76所述的方法，其中相较于在施用所述组合物之前所述受试者的皮肤的所述纹理、光滑度、弹性或张力，在施用所述组合物之后，所述受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性或张力中的至少一者得以增加和/或改进。
实施方案78：如实施方案70-77中的任一者所述的方法，其中所述受试者的皮肤是老化中的皮肤。
实施方案79：如实施方案70-78中的任一者所述的方法，其中所述受试者的皮肤已由于暴露于紫外光而受损害。
实施方案80：如实施方案70-79中的任一者所述的方法，其中所述受试者的皮肤是有皱纹的。
实施方案81：一种使有需要的受试者的一种或多种皮肤学老化征象减弱的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案1-65中的任一者所述的组合物。
实施方案82：如实施方案81所述的方法，其中一种或多种皮肤学老化征象的所述减弱选自由以下组成的组：(a)细纹和/或皱纹得到治疗、减轻和/或预防；(b)皮肤孔尺寸得到降低；(c)皮肤厚度、饱满度和/或紧固度得到改进；(d)皮肤光滑度、柔韧性和/或柔软度得到改进；(e)皮肤色泽、光亮度和/或透明度得到改进；(f)原胶原和/或胶原产生得到改进；(g)皮肤纹理得到改进和/或再纹理化得到促进；(h)皮肤轮廓的外观得到改进；(i)皮肤光泽和/或亮度得到恢复；(j)由于老化和/或绝经而减退的皮肤外观得到改进；(k)皮肤保湿得到改进；(l)皮肤弹性和/或回弹力得到增加；(m)皮肤下陷得到治疗、减轻和/或预防；(n)皮肤紧致度得到改进；(o)色素斑点、斑点化皮肤和/或痤疮疤痕得到减轻；(p)就光衍射或反射来说的皮肤光学性质得到改进；和(q)它们的任何组合。
实施方案83：如实施方案81或82所述的方法，其中相较于在施用所述组合物之前所述受试者的所述一种或多种皮肤学老化征象，在施用所述组合物之后，所述受试者的所述一种或多种皮肤学老化征象得到减弱。
实施方案84：如实施方案67-83中的任一者所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案85：如实施方案67-84中的任一者所述的方法，其中所述组合物以经皮肤(全身性或局部)方式、经皮方式、皮下方式和/或真皮内方式向所述受试者施用。
实施方案86：如实施方案67-85中的任一者所述的方法，其中所述组合物通过浅表注射来施用。
实施方案87：如实施方案67-85中的任一者所述的方法，其中所述组合物以真皮内方式向所述受试者施用。
实施方案88：如实施方案67-87中的任一者所述的方法，其中向所述受试者施用所述组合物一次。
实施方案89：如实施方案67-87中的任一者所述的方法，其中向所述受试者施用所述组合物至少两次。
实施方案90：如实施方案89所述的方法，其中在施用之间，经过至少约15、至少约30、至少约60、至少约90或至少约120天。
实施方案91：如实施方案67-90中的任一者所述的方法，其中向所述受试者的一个或多个受影响和/或未受影响区域施用所述组合物。
实施方案92：如实施方案67-91中的任一者所述的方法，其中在施用之前对所述受试者的皮肤进行磨削。
实施方案93：一种包含编码第一多肽的第一多核苷酸的重组核酸，所述第一多肽包含第一人胶原蛋白，其中所述重组核酸是重组单纯疱疹病毒基因组。
实施方案94：如实施方案93所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含所述第一多核苷酸的两个或更多个拷贝。
实施方案95：如实施方案93或94所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。
实施方案96：如实施方案93-95中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在单纯疱疹病毒基因中包含失活性突变。
实施方案97：如实施方案96所述的重组核酸，其中所述单纯疱疹病毒基因选自由ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、tk、UL41和UL55组成的组。
实施方案98：如实施方案97所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP4基因的一个或两个拷贝中包含失活突变。
实施方案99：如实施方案97或98所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP22基因中包含失活性突变。
实施方案100：如实施方案97-99中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述UL41基因中包含失活突变。
实施方案101：如实施方案97-100中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP0基因中包含失活突变。
实施方案102：如实施方案97-101中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP27基因中包含失活突变。
实施方案103：如实施方案96-102中的任一者所述的重组核酸，其中所述失活性突变是所述一种或多种基因的编码序列的缺失。
实施方案104：如实施方案93-103中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在病毒基因座内包含所述第一多核苷酸。
实施方案105：如实施方案93-104中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含所述第一多核苷酸。
实施方案106：如实施方案93-105中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22病毒基因座内包含所述第一多核苷酸。
实施方案107：如93-106中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在UL41病毒基因座内包含所述第一多核苷酸。
实施方案108：如实施方案93-107中的任一者所述的重组核酸，其中所述第一人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。
实施方案109：如实施方案93-108中的任一者所述的重组核酸，其中所述第一人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。
实施方案110：如实施方案93-109中的任一者所述的重组核酸，其中编码所述第一人胶原蛋白的核酸序列与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施方案111：如实施方案93-110中的任一者所述的重组核酸，其中所述第一人胶原蛋白包含与选自由SEQ ID NO:15-21组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
实施方案112：如实施方案93-111中的任一者所述的重组核酸，其中所述第一人胶原蛋白不是COL7。
实施方案113：如实施方案93-112中的任一者所述的重组核酸，其中所述第一多肽包含：(a)所述第一人胶原蛋白；(b)另一人胶原蛋白；和(c)使(a)连接于(b)的接头多肽。
实施方案114：如实施方案113所述的重组核酸，其中所述接头多肽是可裂解接头多肽。
实施方案115：如实施方案113或114所述的重组核酸，其中所述接头多肽包含与选自由SEQ ID NO:28-31组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
实施方案116：如实施方案113-115中的任一者所述的重组核酸，其中所述另一人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。
实施方案117：如实施方案113-116中的任一者所述的重组核酸，其中所述另一人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。
实施方案118：如实施方案113-117中的任一者所述的重组核酸，其中编码所述另一人胶原蛋白的核酸序列与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施方案119：如实施方案113-118中的任一者所述的重组核酸，其中所述另一人胶原蛋白包含与选自由SEQ ID NO:15-21组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
实施方案120：如实施方案113-119中的任一者所述的重组核酸，其中所述第一人胶原蛋白和所述另一人胶原蛋白是不同的。
实施方案121：如实施方案93-120中的任一者所述的重组核酸，其中所述第一多核苷酸编码多顺反子mRNA，所述多顺反子mRNA包含：(a)编码所述第一多肽的第一开放阅读框(ORF)；(b)编码额外人胶原蛋白的第二ORF；和(c)分隔(a)和(b)的内部核糖体进入位点(IRES)。
实施方案122：如实施方案121所述的重组核酸，其中编码所述IRES的核酸序列与选自SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施方案123：如实施方案121或122所述的重组核酸，其中所述额外人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。
实施方案124：如实施方案121-123中的任一者所述的重组核酸，其中所述额外人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。
实施方案125：如实施方案121-124中的任一者所述的重组核酸，其中编码所述额外人胶原蛋白的核酸序列与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施方案126：如实施方案121-125中的任一者所述的重组核酸，其中所述额外人胶原蛋白包含与选自由SEQ ID NO:15-21组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
实施方案127：如实施方案121-126中的任一者所述的重组核酸，其中所述第一人胶原蛋白和所述额外人胶原蛋白是不同的。
实施方案128：如实施方案93-127中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含编码第二人胶原蛋白的第二多核苷酸。
实施方案129：如实施方案128所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含所述第二多核苷酸的两个或更多个拷贝。
实施方案130：如实施方案128或129所述的重组核酸，其中所述第二人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL4-3、COL4-4、COL4-5、COL4-6、COL5-1、COL5-2、COL5-3、COL6-1、COL6-2、COL6-3、COL6-4、COL6-5、COL6-6、COL7、COL8、COL9-1、COL9-2、COL9-3、COL10、COL11-1、COL11-2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27和COL28。
实施方案131：如实施方案128-130中的任一者所述的重组核酸，其中所述第二人胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL6-1、COL7和COL17。
实施方案132：如实施方案128-131中的任一者所述的重组核酸，其中编码所述第二人胶原蛋白的核酸序列与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施方案133：如实施方案128-132中的任一者所述的重组核酸，其中所述第二人胶原蛋白包含与选自由SEQ ID NO:15-21组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
实施方案134：如实施方案128-133中的任一者所述的重组核酸，其中所述第一人胶原蛋白和所述第二人胶原蛋白是不同的。
实施方案135：如实施方案128-134中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在病毒基因座内包含所述第二多核苷酸。
实施方案136：如实施方案135所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含所述第二多核苷酸。
实施方案137：如实施方案135或136所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP22病毒基因座内包含所述第二多核苷酸。
实施方案138：如实施方案135-137中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在UL41病毒基因座内包含所述第二多核苷酸。
实施方案139：如实施方案135-138中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含所述第一多核苷酸，并且在ICP22病毒基因座内包含所述第二多核苷酸。
实施方案140：如实施方案135-138中的任一者所述的重组核酸，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座的一个或两个拷贝内包含所述第一多核苷酸，并且在UL41病毒基因座内包含所述第二多核苷酸。
实施方案141：一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如实施方案93-140中的任一者所述的重组核酸。
实施方案142：如实施方案141所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
实施方案143：如实施方案141或142所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
实施方案144：如实施方案141-143中的任一者所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞或非人灵长类动物细胞。
实施方案145：如实施方案141-144中的任一者所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是Vero细胞。
实施方案146：如实施方案141-145中的任一者所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是补充性宿主细胞。
实施方案147：一种收集单纯疱疹病毒的方法，所述方法包括：(a)使补充性宿主细胞与如实施方案93-140中的任一者所述的重组核酸接触；以及(b)收集通过所述补充性宿主细胞产生的所述单纯疱疹病毒。
实施方案148：一种收集单纯疱疹病毒的方法，所述方法包括：(a)培养如实施方案141-146中的任一者所述的宿主细胞；以及(b)收集通过所述宿主细胞产生的所述单纯疱疹病毒。
说明书被认为足以使得本领域技术人员能够实施本公开。除本文显示和描述的那些修改之外，本公开的各种修改也将根据先前描述而变得为本领域技术人员显而易知，并且落在随附权利要求的范围内。
实施例
通过参考以下实施例，本公开将得以更充分了解。然而，它不应解释为限制本公开的范围。应了解本文所述的实施例和实施方案仅出于说明目的，并且根据所述实施例和实施方案的各种修改或变化将为本领域技术人员所想起，并将包括在本申请的精神和界限以及随附权利要求的范围内。
实施例1：编码一种或多种人胶原蛋白的经修饰的单纯疱疹病毒载体
为制备能够在靶标哺乳动物细胞(诸如人角质化细胞或纤维母细胞)中表达一种或多种人胶原蛋白的经修饰的单纯疱疹病毒基因组载体，首先修饰单纯疱疹病毒基因组(图1A)以使一种或多种单纯疱疹病毒基因失活。所述修饰可使基因组在哺乳动物细胞中的毒性降低。接着，产生这些经修饰/减毒重组病毒构建体的变体以使它们携带一种或多种编码一种或多种人胶原蛋白的多核苷酸。这些变体包括：1)包含整合在每个ICP4基因座处的含有在异源性启动子的控制下的第一人胶原蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4/ΔICP22修饰HSV-1基因组(图1B)；2)包含整合在每个ICP4基因座处的含有在异源性启动子的控制下的第一人胶原蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4修饰HSV-1基因组(图1C)；3)包含整合在每个ICP4基因座处的含有在相同DNA链上的在第一异源性启动子的控制下的第一人胶原蛋白的编码序列和在第二异源性启动子的控制下的第二人胶原蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4/ΔICP22修饰HSV-1基因组(图1D)；4)包含整合在每个ICP4基因座处的含有在相同DNA链上的在第一异源性启动子的控制下的第一人胶原蛋白的编码序列和在第二异源性启动子的控制下的第二人胶原蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4修饰HSV-1基因组(图1E)；5)包含整合在每个ICP4基因座处的含有在相反DNA链上的在第一异源性启动子的控制下的第一人胶原蛋白的编码序列和在第二异源性启动子的控制下的第二人胶原蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4/ΔICP22修饰HSV-1基因组(图1F)；6)包含整合在每个ICP4基因座处的含有在相反DNA链上的在第一异源性启动子的控制下的第一人胶原蛋白的编码序列和在第二异源性启动子的控制下的第二人胶原蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4修饰HSV-1基因组(图1G)；7)包含整合在ICP4基因座中的每一者处的编码在异源性启动子的控制下的多顺反子mRNA的表达盒的重组经ΔICP4/ΔICP22修饰HSV-1基因组，其中所述多顺反子mRNA含有由内部核糖体进入位点(IRES)分隔的第一人胶原蛋白的编码序列和第二人胶原蛋白的编码序列(图1H)；8)包含整合在ICP4基因座中的每一者处的编码在异源性启动子的控制下的多顺反子mRNA的表达盒的重组经ΔICP4修饰HSV-1基因组，其中所述多顺反子mRNA含有由内部核糖体进入位点(IRES)分隔的第一人胶原蛋白的编码序列和第二人胶原蛋白的编码序列(图1I)；9)包含整合在ICP4基因座中的每一者处的含有在异源性启动子的控制下的嵌合蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4/ΔICP22修饰HSV-1基因组，其中所述嵌合蛋白含有由接头多肽的氨基酸序列分隔的第一人胶原蛋白的氨基酸序列和第二人胶原蛋白的氨基酸序列(图1J)；10)包含整合在ICP4基因座中的每一者处的含有在异源性启动子的控制下的嵌合蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4修饰HSV-1基因组，其中所述嵌合蛋白含有由接头多肽的氨基酸序列分隔的第一人胶原蛋白的氨基酸序列和第二人胶原蛋白的氨基酸序列(图1K)；11)包含整合在ICP4基因座中的每一者处的含有在异源性启动子的控制下的第一人胶原蛋白的编码序列的表达盒，以及整合在ICP22基因座处的含有在异源性启动子的控制下的第二人胶原蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4/ΔICP22修饰HSV-1基因组(图1L)；12)包含整合在ICP4基因座中的每一者处的含有在异源性启动子的控制下的第一人胶原蛋白的编码序列的表达盒，以及整合在UL41基因座处的含有在异源性启动子的控制下的第二人胶原蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4/ΔICP22/ΔUL41修饰的HSV-1基因组(图1M)；和13)包含整合在ICP4基因座中的每一者处的含有在异源性启动子的控制下的第一人胶原蛋白的编码序列的表达盒，以及整合在UL41基因座处的含有在异源性启动子的控制下的第二人胶原蛋白的编码序列的表达盒的重组经ΔICP4/ΔUL41修饰的HSV-1基因组(图1N)。
将这些经修饰的单纯疱疹病毒基因组载体转染至被修饰来表达一种或多种疱疹病毒基因的经工程化的Vero细胞中。这些经工程化的Vero细胞将在其中包装有经修饰的基因组的复制缺陷性单纯疱疹病毒分泌至上清液中。接着对上清液进行收集，浓缩，并且经5μm过滤器进行无菌过滤。
实施例2：编码人COL7的HSV候选物的构建和体外分析
胶原α-1(VII)链蛋白(COL7)起使皮肤强化和稳定的作用。简要来说，使COL7A1转录物翻译，所得COL7肽通过羟基化和糖基化加以翻译后修饰，并且糖基化COL7三肽形成从细胞分泌的被称为原胶原的三螺旋。原胶原在分泌后缔合成更高级结构，从而形成锚定原纤维，所述锚定原纤维接着可用于帮助组织上皮基底膜，使上皮基底膜稳定，并且有助于上皮基底膜的粘着。上皮基底膜负责使上皮锚定于下伏的疏松结缔组织，并且为达成真皮-表皮稳定性所必需(真皮-表皮接合完整性)。营养不良性大疱性表皮松解是一种由COL7A1基因中的突变引起的遗传性遗传病状；这个基因中的突变使营养不良性大疱性表皮松解患者中COL7使表皮适当地连接于真皮的能力受损，从而导致皮肤脆弱。作为大疱性表皮松解的最重度形式的隐性营养不良性大疱性表皮松解(RDEB)的特征最经常在于皮肤和粘膜广泛起疱和结疤。
以下实施例描述被修饰来表达人胶原α-1(VII)链多肽(COL7)的重组单纯疱疹1型病毒的构建，并且还提供了显示重组HSV能够在体外在来自健康者和RDEB患者的原代人角质化细胞和纤维母细胞中表达功能性人胶原的实验。
材料和方法
病毒构建
如下产生“KCA211”病毒载体(图2A)：首先通过使病毒ICP4基因的两个拷贝的编码序列缺失(ΔICP4)来修饰野生型单纯疱疹病毒基因组。经ΔICP4修饰的病毒基因组还被工程化来在ICP4基因座中的每一者中含有mCherry表达盒。病毒基因组接着被进一步修饰来编码野生型人COL7。简要来说，将含有由ICP4的上游(US)和下游(DS)区域侧接的野生型COL7的编码序列(在hCMV启动子的控制下)的质粒转染至被修饰来表达疱疹病毒ICP4基因的Vero细胞中。这些经转染的细胞接着用以上所述的经修饰的ΔICP4 mCherry表达性病毒感染。侧接于COL7的US和DS ICP4区域允许进行双交换，以及替换mCherry基因座中的每一者。关于不存在mCherry荧光进行的目视筛选接着用于鉴定含有重组病毒的细胞。
如下产生“SAR-COL7”病毒载体(图2B)：首先通过使病毒ICP4基因的两个拷贝以及单一拷贝ICP22基因的编码序列缺失(ΔICP4/ΔICP22)来修饰野生型单纯疱疹病毒基因组。经ΔICP4/ΔICP22修饰是病毒基因组还被工程化来在ICP4基因座中的每一者中含有mCherry表达盒。病毒基因组接着被进一步修饰来编码野生型人COL7。简要来说，将含有由ICP4的上游(US)和下游(DS)区域侧接的野生型COL7的编码序列(在hCMV启动子的控制下)的质粒转染至被修饰来表达疱疹病毒ICP4基因的Vero细胞中。这些经转染细胞接着用以上所述的经修饰的ΔICP4/ΔICP22 mCherry表达性病毒感染。侧接于COL7的US和DS ICP4区域允许进行双交换，以及替换mCherry基因座中的每一者。关于不存在mCherry荧光进行的目视筛选接着用于鉴定含有重组病毒的细胞。
细胞培养
先前从作为常规手术或诊断程序的一部分获取的皮肤活检体分离细胞。从每名患者或在儿童的情况下从父母或法定监护人获得知情书面同意。这个研究根据赫尔辛基宣言(Helsinki declaration)进行。所有细胞都在37℃下在5％CO2中培养。使人纤维母细胞在补充以10％胎牛血清(
Figure BDA0002744714680001491
血清，目录号PS-FB1)的杜贝卡氏改良必需培养基(Dulbecco’s modified essential medium)中生长。在补充以10％FBS、10ng/mL表皮生长因子、10-10霍乱毒素、0.4μg/mL氢化可的松(hydrocortisone)、5μg/mL转铁蛋白(transferrin)、5μg/mL胰岛素和5μg/mL碘塞罗宁(liothyronine)的DMEM/汉姆氏F12培养基(Ham’s F12medium)(3:1)中培养RDEB和正常角质化细胞。所有培养基都含有抗坏血酸(150μM)。使角质化细胞在有丝分裂活化的3T3细胞滋养层存在下以及在10μM Rho激酶抑制剂Y-27632存在下生长。
病毒感染
将病毒等分试样储存在-80℃下，并且在使用之前使其在组织培养层流通风橱下除霜。在感染之前在使细胞从组织培养塑料制品脱离以及在血球计上计数之后测定靶标细胞数目。感染复数(MOI)由病毒效价和靶标细胞数目计算，并且在含有10％血清的DMEM中稀释适当体积的病毒储备物并与靶标细胞一起在37℃下孵育2小时。接着移除病毒，并且在用预先温热的培养基洗涤两次之后向靶标细胞供给新鲜培养基。
蛋白质印迹
将角质化细胞在8x105下铺于100mm培养皿中以在次日实现70-80％汇合。在感染之后48小时，用放射免疫沉淀测定缓冲液使细胞裂解。将裂解物放置在离心机中，在4℃下持续5分钟，并且使上清液与6x拉姆利(Laemmli)上样缓冲液混合。在上样于SDS-PAGE上之前，将样品在95℃下煮沸5分钟。对于COL7检测，将5-30μg蛋白质上样于6％丙烯酰胺凝胶上。用于COL7检测的初级抗体是兔抗体(Sigma，目录号HPA042420)。将经解析的蛋白质转移于硝化纤维素膜上，根据初级抗体的要求在具有5％奶或5％BSA的PBS-0.1％吐温中封闭，并且与初级抗体一起孵育过夜。在与IgG-HRP缀合二级抗体(Santa Cruz Biotechnology)一起孵育之后，使膜与蛋白质印迹底物(ThermoFisher，目录号32106)一起孵育，并且暴露于胶片(ThermoFisher Scientific，目录号34090)。
qRT-PCR
根据制造商方案使用
Figure BDA0002744714680001501
小型试剂盒(Qiagen)分离RNA。使用NanoDropTM分光光度计(Fisher Scientific)定量RNA提取物，并且1.5μg RNA用于使用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)进行cDNA合成。对于qPCR，使用SYBR精选主混合物(LifeTechnologies)，并且以1:25稀释cDNA样品以充当模板。一式三份进行实验。
粘附测定
使96孔板未包被，或用10、20或50μg/mL大鼠尾胶原1(BD Biosciences)或人纤连蛋白(Millipore)以100μL反应体积在4℃下包被过夜，接着用PBS洗涤，并且用PBS+0.1％BSA在37℃下封闭1小时。将模拟物(对照)或经SAR-COL7感染的RDEB角质化细胞(2.4x104个细胞于100μL DMEM/HamF12+0.1％BSA中)添加至板中，并且在37℃下孵育90分钟。将孔用PBS洗涤三次以移除任何未结合的细胞，并且将粘附细胞用PFE固定20分钟。固定细胞接着用70％乙醇处理，用结晶紫染色，在100％乙醇中拆解，并且通过用Flex Station 3板读取器(Molecular Devices)在630nM下测量吸光度来定量。
器官型皮肤等同物
将牛纤维蛋白原(90％可凝结，MP Biomedicals)在37℃下在1.1％NaCl中溶解4小时，接着用0.45μm尼龙膜过滤器过滤。在使用胰蛋白酶和离心的情况下收集纤维母细胞，并且再混悬于培养基中以达到2x106个细胞/毫升的最终浓度。使150μL细胞混悬液与1mL凝血酶(thrombin)(3IU–Sigma Aldrich)混合，并且将细胞/凝血酶混合物在1:1的比率下添加至纤维蛋白原中。将混合物在1mL/孔下快速但温和地分配至12孔板中，并且在37℃下孵育。在20分钟之后，添加补充以抗坏血酸和在10μg/mL的最终浓度下的抑肽酶(aprotinin)(Sigma)的培养基。使基质成熟5-7天，同时每隔一天更换培养基。将角质化细胞在2x106个细胞/孔下铺于上部上，并且在次日，使培养物在金属格网上升高至空气-液体界面，并且开始用氨来呫诺(amlexanox)处理。每隔一天用新鲜药物、抗坏血酸和抑肽酶更换培养基。在处理的一周或两周时收集培养物，并且与OCT一起冷冻在液氮冷却的异戊烷中。使用低温恒温器(Avantik QS11)切割8μm切片，并且用多克隆抗COL7抗体在1:800的稀释度下进行免疫染色。用DAPI(Invitrogen)对核进行复染。
结果
首先，通过qPCR和蛋白质印迹分析评估了在HaCaT人角质化细胞细胞系中从经修饰HSV进行的COL7表达以确定经修饰HSV是否能够表达它们的运载物。用SAR-COL7或KCA211在0.3-10的范围内的MOI下转导HaCaT细胞。在感染之后48小时，收集并处理细胞以进行qPCR(图3A)或蛋白质印迹(图3B)分析。结果证明全长COL7以剂量依赖性方式从用任一经修饰HSV感染的人角质化细胞表达。
接着，进行免疫荧光实验以显现COL7在用SAR-COL7在各种MOI(在0.1至10的范围内)下感染24-48小时的原代RDEB角质化细胞或RDEB纤维母细胞中的表达。相较于未感染正常角质化细胞和纤维母细胞以及RDEB角质化细胞和纤维母细胞，对于角质化细胞(图4A)与纤维母细胞(图4B)两者，在SAR-COL7的所有测试剂量下都观察到强烈COL7信号。SAR-COL7在0.1-1的MOI下在纤维母细胞中的感染效率在16-36％的范围内。SAR-COL7在3.0以及以上的MOI下在纤维母细胞中的感染效率是≥90％。
用SAR-COL7在不同MOI下感染RDEB患者源性人真皮角质化细胞(HDK)和纤维母细胞(HDF)以评价COL7A1 RNA表达。正常HDK和HDF以及模拟感染的RDEB HDK和HDF用作阴性对照。观察到在用SAR-COL7感染的HDK(图5A)与HDF(图5B)两者中，COL7A1转录物以剂量依赖性方式增加。还计算了在感染之后相对于未感染健康HDK(表1A)或未感染健康HDF(表1B)的相对COL7A1转录物表达倍数变化。在是3的MOI下，相对于健康HDK和HDF中的野生型COL7A1转录物水平，使用COL7A1编码性HSV能够使COL7A1转录物表达增加约26倍(在RDEB HDK中)和60倍(在RDEB HDF中)。
表1A：在HDK中的COL7A1表达
细胞类型： MOI： 相比于N-HDK的倍数变化：
正常HDK(N-HDK) 0 1.00
RDEB HDK(EB-HDK) 0 0.79
RDEB HDK(EB-HDK) 0.3 7.00
RDEB HDK(EB-HDK) 1.0 13.73
RDEB HDK(EB-HDK) 3.0 26.25
表1B：在HDF中的COL7A1表达
细胞类型： MOI： 相比于N-HDF的倍数变化：
正常HDF(N-HDF) 0 1.000
RDEB HDF(EB-HDF) 0 0.340
RDEB HDF(EB-HDF) 0.1 1.805
RDEB HDF(EB-HDF) 0.3 5.134
RDEB HDF(EB-HDF) 1.0 30.788
RDEB HDF(EB-HDF) 3.0 60.571
接着，通过细胞粘附测定来测试从SAR-COL7表达的人COL7的功能性。研究了未感染的RDEB角质化细胞以及用SAR-COL7在不同MOI下感染的RDEB角质化细胞粘附于用胶原1或纤连蛋白处理的孔的能力。引起关注的是，使用基于板的粘附测定，用SAR-COL7感染的RDEB角质化细胞以剂量依赖性方式显示对胶原1(图6A)和纤连蛋白(图6B)的粘附增加。
最后，由RDEB纤维母细胞和角质化细胞组成的皮肤等同性(SE)器官型培养物用于评价在基底膜区(BMZ)处，COL7从SAR-COL7的表达。用RDEB或正常纤维母细胞和角质化细胞构建器官培养物。在器官培养物构建之前用SAR-COL7感染RDEB细胞(数据未显示)，或在于空气-液体界面处升高之前将SAR-COL7逐滴添加于培养物上(图7)。对所得皮肤等同物(SE)进行分离，切片，并且染色以获得免疫荧光来检测COL7蛋白表达。在由用SAR-COL7感染的细胞获得的这些器官型培养物中检测到COL7，并且观察到COL7蛋白开始沉积在BMZ处。这个数据表明SAR-COL7不仅可高效递送COL7A1以及表达COL7蛋白，而且COL7蛋白开始在器官型培养物中进行组织，类似于在体内对COL7蛋白所预期的组织样式。
总之，本文提供的数据指示复制缺陷性HSV可作为载体用于在2D或3D培养系统中在野生型原代人细胞以及从罹患胶原缺乏症的患者分离的原代人细胞中有效递送和表达高水平的功能性人胶原，而无任何明显毒性。
实施例3：在野生型动物中对编码人COL7的HSV候选物的体内分析
以下实施例描述显示构建并在体外在人细胞中验证的重组病毒(参见以上实施例2)能够在体内在野生型动物中表达所编码的人胶原的实验。研究的目的部分地在于评价HSV介导的胶原表达在健康的有免疫能力的动物中的皮肤生物分布。
材料和方法
测试物品
向小鼠施用的制剂中的活性成分是在PBS+10％甘油中配制的在4.8x108个空斑形成单位(PFU)/mL的效价下的经修饰的单纯疱疹病毒SAR-COL7或KCA211(参见以上实施例2)。用于真皮内施用的媒介物是杜贝卡氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)+10％甘油。用于局部施用的媒介物是在无菌双蒸水中配制的3％羟丙基甲基纤维素(HPMC)凝胶。
动物
使用在6与10周龄之间的健康雄性BALB/c小鼠。方案中使用的所有程序都依照适用的动物福利法案，并且由当地机构动物护理和使用委员会(IACUC)核准。
真皮内注射
在测试物品施用之前以及期间，使用得麻效(Dexdomitor)(30μL0.05mg/mL)和舒泰(Telzol)(50μL 10mg/mL)的混合物使小鼠麻醉。用安醒顺(Antisedan)(50μL 0.5mg/mL)逆转镇静剂。使用电动宠物剪将背部和侧腹区域剃毛，并且用酒精湿巾擦拭所述区域。使用芒图(Mantoux)技术用注射器和27G针(VWR，目录号BD305620)进行真皮内注射，从而确保在每个部位处创建浅表“泡”。将病毒保持在干冰上，在室温下解冻，并且在解冻后30分钟内施用。向每只小鼠的背部施用两处真皮内注射，并且“泡”的边缘用永久性标记加以标记。
局部施加
对开放伤口或经磨削或划痕皮肤进行局部施用。使用电动剪将背部和侧腹区域剃毛。划痕通过用机械琢美(Dremel)打磨机温和磨削皮肤，继之以用22G针进行浅表穿孔来进行。对于创建伤口，使用锋利剪刀移除皮肤的5-6mm直径活检体。为将局部制剂限于经磨削或受伤部位，从1.5mL微量离心管的经切割和热压处理顶端创建孔。保留盖子，并且切割一侧用透明粘性敷料覆盖。使用手术胶水使“孔”粘附于经磨削/受伤区域，其中盖子一侧向下。使100μL SAR-COL7与20μL局部媒介物混合，并且通过注射穿过透明粘性敷料以使局部凝胶限制在伤口上以及防止渗漏来施加于伤口。
组织收集
在SAR-COL7施用之后的所指示时间点，使小鼠安乐死，并且使用8mm活检穿孔器移除注射部位。活检体的一半使用液氮快速冷冻，而另一半包埋在OCT中并低温保存以进行免疫荧光染色。
实时定量PCR
快速冷冻的一半活检体在-80℃下储存直至分析。对于处理和分析，遵循制造商方案(Qiagen)，将样品再混悬于用新鲜DTT制备的350μL RLT缓冲液中。在25％幅度下对样品进行3次超声处理，伴有在冰上间歇性孵育1分钟，并且根据制造商方案(Qiagen AllPrepDNA和RNA提取试剂盒)进行DNA和RNA提取。将RNA样品与DNA样品两者再混悬于蒸馏去离子无RNA酶水中，并且在Take3微板读取器(BioRad)上以分光光度方式定量。
使用跨越人COL7A1开放阅读框的3’末端和3’UTR，从而特异性检测COL7A1转基因的定制引物/探针测定，通过Taqman实时PCR分析对COL7A1 DNA拷贝和RNA转录物进行绝对定量。100ng的DNA和RNA分别用于qPCR和qRT-PCR测定，并且在100ng小鼠基因组或RNA基质中制备含有待扩增的区域的质粒标准物。GAPDH用作两种分析的对照。
免疫荧光染色
将OCT冷冻组织在5-8μm下切片，并且使其风干多达1小时。将载片在-20℃下于100％甲醇中浸渍10分钟，并且使其风干。通过在室温下在PBS中洗涤3次(每次5分钟)来使甲醇固定切片再水化。使切片与由10％血清(混合物种)组成的封闭溶液一起在潮湿腔室中在室温下孵育1小时。移除过量封闭溶液，并且在每个切片上施加一滴在5％封闭溶液中制备的初级抗体(抗人胶原7抗体，Sigma，目录号HPA042420；抗整合素α6抗体(克隆goH3)，BDBiosciences，目录号555734)溶液(30-50μL/切片)。使切片与初级抗体一起在4℃下孵育16小时，在室温下在PBS中洗涤3次，每次5分钟，并且在以1:400在PBS中稀释下施加二级抗体(抗兔AF 647，Invitrogen，目录号A21244；抗大鼠抗体AF-594，Invitrogen，目录号A11007)，在潮湿腔室中在室温下持续1小时。重复3次PBS洗涤，接着将载片在室温下于赫希斯特(Hoechst)溶液(1:1000)中浸渍5分钟。重复3次PBS洗涤，并且将经染色的切片用封固介质(Fluorometer G，Southern Biotech，目录号0100-01)封固并用盖片覆盖。在脱水之后(约24小时)使用广视野荧光显微镜使切片成像。
结果
分成6组的总计30只雄性BALB/c小鼠用于这个研究。在第1天通过真皮内注射或局部施加来施用SAR-COL7，并且在第3天收集一个子组的小鼠，而其余小鼠在第6天加以收集。第2组中的动物通过真皮内注射来接受处于相同体积下的低剂量的SAR-COL7(4.8x106pfu/部位)，并且第1组充当真皮内群组的对照。在第4、5和6组中，以120μL的总体积向受伤(第4和6组)或经磨削(第5组)区域施加局部媒介物(第4组)或呈局部凝胶剂形式的SAR-COL7(第5和6组)。收集组织，并且处理以进行如上所述的qPCR和免疫荧光分析。
进行处死后qPCR分析。在通过真皮内或局部施加来接受SAR-COL7的所有群组中都检测到COL7A1转录物和DNA水平(图8A-图8D)，并且观察到明确剂量响应。在真皮内群组与局部群组(SAR-COL7高剂量真皮内群组、高剂量伤口群组和高剂量经磨削群组)之间，转录物和DNA水平是类似的，从而表明局部施加在递送COL7A1方面与真皮内注射同样高效。总之，相比于第3天样品(图8A-图8B)，在第6天样品(图8C-图8D)中，DNA和RNA水平是较低的，此不是出乎意料的，因为SAR-COL7是一种保持游离的非整合载体(其将被预期随时间而清除)。
接着，进行免疫荧光实验以显现在体内SAR-COL7感染之后的COL7表达。如在提供于图9A-图9B中的代表性图像中所观察，在考查的两个时间点，在大多数动物群组中检测到COL7。许多样品显示COL7正确定位在BMZ处以及毛囊周围。在一些情况下，特别地在真皮内施加的情况下，在皮肤的靠近于下伏筋膜的深层中观察到强烈COL7表达，此可能由于注射是在皮下而非在真皮内。类似地，在其中BMZ可能在磨削期间被移除(如由缺乏代表性goH3染色所暗示)的许多经磨削皮肤样品中，强烈COL7染色限于皮肤表面。总之，在免疫荧光样品中存在COL7强烈支持了经修饰的HSV SAR-COL7的稳健功效。
此外，在体内测试了KCA211表达人COL7的能力，并且与SAR-COL7施用进行比较。发现KCA211也在体内在有免疫能力的小鼠中表达COL7转基因(图10A-图10B)。
总之，数据指示经修饰HSV能够在局部或真皮内施用之后在体内在健康的有免疫能力的动物中递送和表达人胶原蛋白，并且此外，从局部施用至受损害皮肤或开放伤口中的病毒进行的胶原表达与向完整皮肤中进行的真皮内施用类似。
实施例4：在亚效动物中对低剂量和高剂量的编码人COL7的HSV候选物的体内分析
以下实施例描述显示构建并在体外在人细胞中(参见以上实施例2)以及在体内在野生型小鼠中(参见以上实施例3)验证的重组病毒能够在体内在COL7亚效小鼠中表达功能性人胶原的实验。研究的目的部分地在于评价HSV介导的胶原表达在缺乏COL7的有免疫能力的动物中的皮肤生物分布。
材料和方法
除非相反指示，否则如以上实施例3中所述进行实验。
亚效小鼠
COL7亚效小鼠模型(Fritsch等J Clin Invest.2008年5月；118(5):1669-79)用于这个研究中。这个亚效小鼠模型是营养不良性大疱性表皮松解(DEB)的有免疫能力的动物模型，其中小鼠表达正常水平的约10％的COL7。它们的表型紧密类似于重度人DEB的特征，包括粘膜与皮肤起疱、甲营养不良以及肢端的连指手套样畸形。
小鼠通过flp/frt介导的对小鼠COL7A1的外显子2的移除来产生。缺乏COL7A1的两个功能性拷贝的动物(Col7a1flNew/flNeo)，被称为COL7亚效小鼠，表达正常水平的约10％的COL7。从总计15个交配对，获得了58只幼仔，其中同窝仔在2-7只小鼠/窝的范围内。在这58个幼仔之中，6个幼仔被基因分型为亚效幼仔。用从耳穿孔组织样品提取的DNA对小鼠进行基因分型。PCR分析检测到在COL7A1的外显子2的上游存在loxP位点。野生型(WT)小鼠显示在269个碱基对(bp)下的条带，亚效小鼠显示在435bp下的条带，而杂合性小鼠显示两种条带。所有程序都依照适用的动物福利法案，并且由当地机构动物护理和使用委员会(IACUC)核准。
真皮内注射
在测试物品施用之前以及期间，使用2％异氟烷，在吸入麻醉下维持小鼠。在眼上施加眼用软膏(
Figure BDA0002744714680001581
兽用)以防止干燥。使用芒图技术用31G针进行真皮内注射。在指定剂量下向每只小鼠的背部施用多达四处真皮内注射。
组织收集
在组织收集之前，通过CO2吸入继之以颈脱位来使动物安乐死。使用锋利剪刀对注射部位进行活检。
苏木精和伊红(H&E)染色
将低温保存的组织在5-8μm的厚度下切片，并且使其风干多达一小时。将载片在-20℃下于100％甲醇中浸渍十分钟，并且使其风干。使甲醇固定切片在室温下在PBS中再水化5分钟。将切片在室温下在苏木精(魏格特氏改良苏木精(Weigert’s modifiedhematoxylin))中孵育5-10分钟，继之以在室温下在PBS中洗涤15分钟。接着将切片在伊红(伊红Y溶液，目录号HT110116)中冲洗3次，随后在水中冲洗一次。
通过在70％乙醇中浸渍10次，在95％乙醇中浸渍十次，以及在100％乙醇中浸渍十次来用乙醇使切片逐渐脱水。将切片放置以进行干燥，用封固介质(Fischer Scientific，目录号SPF15-100)封固并用盖片覆盖。在脱水之后(约24小时)使用亮视野显微镜使切片成像。
电子显微术
通过以下方式来制备用于电子显微术的皮肤：在含1.5％戊二醛/1.5％多聚甲醛的含有0.05％丹宁酸的杜贝卡氏无血清培养基(SFM)中浸渍至少一小时，随后在SFM中进行充分冲洗，并且在1％OsO4中持续60分钟进行固定后步骤。在SFM中洗涤样品，接着在直至100％的一系列分级乙醇中脱水，在氧化丙烯中冲洗，并且历经两小时的总时间在斯珀尔氏环氧树脂(Spurr’s epoxy)中浸润，通过微波能来加速。使样品在70℃下历经18小时加以聚合。通过以下方式来制备额外样品：在SFM中充分冲洗，接着在4℃下在以1:5在SFM中稀释的小鼠IgM LH24抗体或小鼠IgG NP185抗体中浸渍过夜。接着将样品在SFM中充分冲洗，在冰上暴露于金增强溶液(Nanoprobes)15分钟，接着快速升温至25℃，并且再孵育5分钟。将样品用冰冷SFM冲洗，固定，并且包埋。
结果
三只亚效小鼠用于高剂量SAR-COL7研究。在第1天，所有小鼠都通过真皮内注射来接受4.6x107 PFU/50μL/注射部位的剂量(表2)。将每个动物剃毛，并且在背部上在4个部位处加以注射，包括1处对照注射和3处SAR-COL7注射。一个动物(小鼠3)在第3天在相同的4个部位处接受第二注射。一只小鼠(小鼠1)在第3天被处死，而小鼠2和小鼠3在第7天被处死。
表2：关于真皮内注射高剂量SAR-COL7的研究设计
Figure BDA0002744714680001601
进行处死后qPCR分析。在所有三只小鼠中，在每个病毒注射部位处都检测到COL7A1转录物(图11A)和DNA水平(图11B)。在测定中，所有对照样品(PBS或HSV-GFP)中的转录物水平都处于或低于检测水平，因此在图中仅包括1个对照(第3天，样品1，HSV-GFP)用于比较。观察到在单次施用SAR-COL7之后截至第7天，DNA和转录物水平存在一定降低(小鼠2)；然而，在再施用SAR-COL7后，DNA和转录物水平增加(小鼠3)。
接着，进行免疫荧光(IF)实验以显现在体内SAR-COL7感染之后，COL7在亚效小鼠中的表达(图12A-图12B)。IF实验证明在第3天时间点和第7天时间点，在BMZ中以及在毛囊(HF)周围观察到稳健和广布的COL7蛋白表达。未观察到对皮肤形态的负性影响(即使在重复施用之后)，因为经SAR-COL7治疗样品显示正常皮肤形态，不具有纤维化或急性炎症的明显征象(图13)。总之，在免疫荧光样品中存在COL7强烈支持了SAR-COL7在递送能够在下伏皮肤子结构中分泌以及适当组织的人胶原方面的稳健功效。
还通过电子显微术评价了第3天活检体的锚定原纤维形成。在以适当方式结构化的锚定原纤维中，COL7的NC1结构域(其用NP158抗体染色)朝向致密层排列，而COL7的NC2结构域(其用LH24抗体染色)远离致密层排列。来自经SAR-COL7注射的小鼠的活检体显示了用LH24(图14A)抗体与NP185(图14B)抗体两者达成的COL7染色，并且重要的是，电子显微术(EM)图像揭示了锚定原纤维的形成。致密层作为穿过EM图像的中央的暗带被观察到。外源性人COL7的NC2结构域远离致密层加以定位，而外源性人COL7的NC1结构域沿致密层加以定位，如将在以适当方式形成的锚定原纤维中所预期。这个数据指示SAR-COL7不仅可表达能够在BMZ处分泌和适当组织的所编码的人COL7，但是所分泌的COL7具有功能性，并且在所得锚定原纤维中适当定位，从而支撑亚效小鼠的皮肤组织。
三只额外亚效小鼠用于低剂量SAR-COL7研究。在第1天，所有小鼠都通过真皮内注射来在3(小鼠1)或2(小鼠2和3)个部位中接受6.4x106 PFU/50μL/注射部位的剂量的SAR-COL7(表3)。
表3：关于真皮内注射低剂量SAR-COL7的研究设计
小鼠： 治疗日： 注射部位的数目： 终止日：
1 1 3 3
2 1 2 3
3 1 2 7
进行处死后qPCR分析。在所有三只小鼠中，在每个病毒注射部位处都检测到COL7A1转录物(图15A)和DNA水平(图15B)。观察到剂量响应。尽管相对于在高剂量研究中观察到的那些DNA和转录物水平，在这些低剂量样品中的COL7A1的DNA水平与转录物水平两者均较低，但COL7A1表达仍然是可检测的。尽管DNA或RNA水平存在约2个对数降低，但在经低剂量SAR-COL7注射的动物的皮肤中，COL7蛋白仍然是可检测的(图16)。在BMZ中以及在毛囊周围均观察到COL7蛋白。数据指示即使在较低剂量下，经修饰的HSV仍然有效递送和表达所编码的人胶原蛋白，所述所编码的人胶原蛋白接着分泌并定位至皮肤的适当区域。
总之，实施例中提供的数据指示本文所述的经修饰的HSV能够：1)在体外以及在器官型培养中转导皮肤细胞以产生功能性人胶原(参见实施例2)；2)在局部施加和真皮内施加之后，在体内在健康的有免疫能力的动物中转导皮肤以及递送人胶原(参见实施例3)；以及3)在体内在胶原缺乏性动物中转导皮肤，递送人胶原，并且引发锚定原纤维的形成(参见实施例4)。在不希望受理论束缚下，据信本文所述的重组载体提供了一种用于将功能性人胶原递送至皮肤的合乎需要的策略，从而允许达成用以在美容环境中支撑真皮和/或表皮的新型方法。
实施例5：编码人胶原1的多种经工程化HSV的构建和验证
以下实施例描述用于对重组HSV-1进行工程化以成功表达人胶原1的两种不同方法。因为人胶原1是一种包含COL1A1多肽的两个拷贝和COL1A2多肽的一个拷贝的异三聚大分子，所以进行两种不同策略以产生编码人COL1A1与COL1A2两者的单一HSV基因组；这两种方法一般地描绘于图1H-图1I和图1L中，并且在以下详细描述。
作为第一方法，重组HSV-1初始被工程化来将含有异源性启动子和多腺苷酸序列的人COL1A1表达盒并入ICP4基因座中的每一者中，如以上实施例2中所述。挑选推定含有人COL1A1盒的多个病毒空斑，并且通过在Vero细胞中感染以测试COL1A1表达来筛选(数据未显示)。至少三个分离株(克隆1A1、2A1和3A1)关于人COL1A1转基因表达呈阳性。然后，人COL1A1阳性克隆1A1和2A1接着被工程化来并入含有与COL1A1盒不同的异源性启动子以及它自身的多腺苷酸序列且插入ICP22基因座中的人COL1A2表达盒。接着筛选七个分离株(克隆1A2-1A1、1B2-1A1、1C1-1A1、1B3-2A1、3B1-1A1和3B1-2A1)以鉴定能够表达人COL1A1与COL1A2两者，并因此能够表达全长人胶原1的减毒HSV-1病毒。
用七个推定COL1A1-COL1A2阳性分离株中的一者或三个单独COL1A1分离株中的一者(作为COL1A2表达的阴性对照)感染Vero细胞以鉴定能够表达两种转基因的重组HSV-1克隆。使对Vero细胞的感染进行五天，通过温和刮削来收集细胞，并且通过在6000xg下离心五分钟来收集细胞集结块。收集每个集结块的一半用于qRT-PCR分析，而对另一半进行处理以进行蛋白质印迹。使用跨越人COL1A1或COL1A2开放阅读框(ORF)的3’末端和3’非翻译区(UTR)，并且对转基因具有特异性的定制引物/探针测定，通过Taqman实时PCR分析对COL1A1或COL1A2 RNA拷贝进行绝对定量。从用所有三种单独COL1A1病毒感染的细胞以及用6/7的COL1A1-COL1A2病毒感染的细胞提取的RNA对于人COL1A1转基因表达呈阳性(图17A)。引起关注的是，仅3/7的COL1A1-COL1A2病毒(克隆1B2-1A1、1C1-1A1和1B3-2A1)还表达可检测水平的人COL1A2(图17B)。对在用这三个分离株感染的细胞溶解产物中的COL1A1和COL1A2蛋白表达进行蛋白质印迹以确保转基因在核酸水平与蛋白质水平两者上均表达。简要来说，将细胞集结块再混悬于含有Halt蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中，在4℃下孵育十分钟，并且接着在室温下用全能核酸酶处理10分钟。接着用含有5％2-巯基乙醇的4x LDS样品缓冲液稀释样品，并且在Tris-甘氨酸凝胶上解析。将模拟感染的Vero细胞裂解物作为阴性对照上样于凝胶上。将蛋白质转移至PVDF，封闭，接着用初级抗体(抗人COL1A1，ThermoFisher目录号PA5-29569；抗人COL1A2，Abcam目录号ab96723；或抗GAPDH，Abcam目录号ab9485)染色过夜。接着洗涤经染色的膜，与二级抗体一起孵育，然后显色。与qRT-PCR分析一致，所有三个克隆都能够在可检测水平下表达人COL1A1蛋白与COL1A2蛋白两者(图17C)。
并行探求第二方法以产生COL1A1-COL1A2阳性重组减毒HSV载体。在此处，产生了从5’至3’编码人COL1A1 ORF、合成IRES和人COL1A2 ORF的多核苷酸构建体。接着将这个基于IRES的构建体(在还含有异源性启动子和多腺苷酸序列的表达盒中编码)插入ICP4基因座中的每一者中，如以上实施例2中所述。挑选多个空斑，并且筛选以鉴定具有正确插入的IRES构建体的载体。简要来说，用推定IRES病毒分离株感染Vero细胞，使感染进行五天，并且收集细胞并处理以进行qPCR和qRT-PCR分析。使用识别合成IRES的定制引物/探针测定，通过Taqman实时PCR分析对插入DNA和RNA拷贝进行绝对定量。通过qPCR和qRT-PCR分析筛选了13个病毒分离株；关于IRES DNA和包含IRES序列的RNA转录物，这些分离株中仅一者(分离株6)测试呈阳性(数据未显示)。为确认这个分离株能够在蛋白质水平上表达人COL1A1与COL1A2两者，处理受感染的Vero细胞以进行如上所述的蛋白质印迹。根据qPCR显示无表达盒并入，并且根据qRT-PCR显示无转基因表达的病毒分离株(分离株1)用作阴性对照。与qPCR/qRT-PCR数据相应，病毒分离株6能够在感染之后表达人COL1A1蛋白与COL1A2蛋白两者(图18)。
总之，在这个样品的情况下呈现的数据指示：(1)成功构建了在感染所靶向细胞之后自如表达人COL1A1与COL1A2两者的多种重组HSV-1载体；(2)载体可被工程化来表达异三聚人胶原蛋白；以及(3)可采用多种不同方法来从单一重组基因组表达多种蛋白质。在不希望受理论束缚下，据信人胶原1从重组HSV-1基因组的成功表达提供了对使用经工程化的HSV来表达任何异三聚胶原蛋白(例如人胶原4)的支持。
实施例6：编码人胶原3的经工程化的HSV的构建、验证和体外表征
以下实施例描述成功表达人胶原3的重组HSV-1(被称为C3vec01)的工程化。此外，以下实施例描述建立适于表征C3vec01的功效的多种相关2D细胞培养模型系统的体外实验，包括在剂量探索研究中使用永生化人角质化细胞和纤维母细胞，使用从多名年老人患者活检获得的原代人真皮纤维母细胞作为在年长患者中进行C3vec01介导的胶原3挽救的模型，以及使用体外经UV照射永生化人纤维母细胞作为日光暴露/皮肤老化的模型。
人皮肤主要由通过真皮纤维母细胞来产生、组织和维持的富含胶原的结缔组织组成。真皮胶原占人皮肤的>90％(干重)，并且主要由COL1和COL3原纤维在约85:15的典型比率下组成。这些原纤维对皮肤提供强度，并且对于维持皮肤组织构造至关重要。
皮肤老化特征主要归因于异常胶原体内平衡，从而导致净胶原缺乏；胶原的生物合成降低，胶原原纤维断裂增加，以及存在进行性真皮胶原丧失，所述事项全都促进老化表型。皮肤老化受内部因素与外部因素两者的组合的影响：内在因素-时间的推移、遗传、细胞代谢、激素等；以及外在因素–长期光照暴露、污染、电离辐射等。这些因素共同导致对皮肤的累积性结构和生理改变，从而最终导致皮肤皱纹的出现和恶化。
皮肤活力恢复，即逆转或修复皮肤中的不规整(诸如皱纹)的过程，部分地通过新胶原的合成(胶原新生)来实现。在皮肤中，胶原新生受胶原1和胶原3的沉积以及胶原1与胶原3之间的复杂相互作用的影响。COL3出现在胶原原纤维生成期间的早期，并且由COL1对这个COL3的后续替换是胶原原纤维成熟和细胞外基质重新组织的关键步骤(Wang等,2018,Journal of the Chinese Medical Association,81(2),第94-101页)。此外，COL3调控COL1纤维的尺寸(Liu等,1997,Proc Natl Acad Sci U S A,94(5),第1853-6页)，并且使COL1弹性增强(Asgari等,2017,Sci Rep,7(1),第1392页)。因此，早期COL3表达的出现以及随后被COL1替换已用作可注射面部填充剂在人中具有功效的标志(Yutskovskaya等,2014,J Drugs Dermatol,13(9),第1047-52页)。
除非另外指示，否则所有实验都如上所述来进行。
为开始研究，重组HSV-1被工程化来将含有异源性启动子和多腺苷酸序列的人COL3A1表达盒并入ICP4基因座中的每一者中。挑选推定含有人COL3A1盒的多个病毒空斑，并且通过在Vero细胞中感染以测试COL3A1表达来筛选(数据未显示)。高表达性克隆中的一者，被称为C3vec01，随后被选择用于额外体外(以下描述)和体内(实施例7)分析。
首先，进行剂量探索研究以测定在永生化人角质化细胞(图19)与永生化人真皮纤维母细胞(图20)两者中，C3vec01介导的对它的所编码人运载物的递送的功效。在0.3至3的范围内的各种感染复数(MOI)下感染永生化细胞48小时，并且通过多种测定来定量和定性测量人胶原3表达。观察到在永生化HK和HDF(分别是图19A和图20A)中，根据qPCR分析在效应DNA方面(数据未显示)，以及根据qRT-PCR分析在效应转录物水平方面均存在剂量依赖性增加。模拟感染的细胞以及用含有与C3vec01相同的HSV-1骨架但代之以编码mCherry效应物的病毒感染的细胞用作阴性对照。与这些结果相应，观察到在永生化HK(图19B)和HDF(图20B)中，根据免疫荧光，在C3vec01感染之后在COL3蛋白表达方面存在剂量依赖性增加。尽管永生化HDF在感染之前表达内源性人COL3(如所预期)，但在用C3vec01感染之后观察到COL3表达显著增加，即使在低剂量下也是这样(初级抗COL3抗体，Abcam目录号ab7778)。在未感染的永生化角质化细胞中观察到少许至无可检测内源性COL3。重要的是，在用C3vec01感染的永生化角质化细胞或纤维母细胞的情况下，未观察到对细胞形态或活力的显著影响，即使在高剂量下也是这样。
随着皮肤老化，驻留真皮纤维母细胞产生较少胶原3，并且皮肤中COL1:COL3的比率朝向胶原1进行偏移。为通过新胶原3的合成来提供皮肤活力恢复，重要的是了解C3vec01是否将能够有效感染老化真皮纤维母细胞以及稳健表达它的所编码人胶原3。因此，在来源于两个不同供应商的细胞的情况下测试C3vec01在多种MOI下感染老化原代真皮纤维母细胞以及表达外源性胶原3的能力。下表4提供这个研究中使用的四个原代HDF样品的供者信息。
表4：原代人真皮纤维母细胞供者
年龄 性别 种族 组织 目录号 批号 公司
73 男 白种人 皮肤/眼睑 C-12302 435Z009.2 PromoCell
65 女 白种人 皮肤/眼睑 C-12302 417Z010.2 PromoCell
73 男 白种人 左下背部 CC-2511 0000633428 Lonza
75 女 白种人 背部 CC-2511 18TL057585 Lonza
相较于永生化HDF，在C3vec01感染来自供应商1(图21A)和供应商2(图21C)的原代HDF之后，观察到类似剂量依赖性增加，伴有相当或更高COL3转录物水平。还通过蛋白质印迹分析(初级抗COL3抗体，Abcam目录号ab7778)测试了来自每个供应商的代表性原代细胞的样品的COL3表达。C3vec01能够在从73岁男性患者(图21B)和75岁女性患者(图21D)活检获得的原代HDF中挽救高水平的人胶原3表达，即使在测试的最低MOI下也是这样。
最后，测试了C3vec01在UV暴露的永生化人纤维母细胞中诱导稳健胶原3表达的能力。日光暴露和相应UV损害已知是老化皮肤表型的单一最大外在促进因素，并且多个团体已采用体外皮肤纤维母细胞UV暴露系统来对光老化的某些方面建模(参见例如Qin等2018,Cell Physiol Biochem 46(5):1849-1860)。为确认UV暴露导致人真皮纤维母细胞分泌较少胶原3(如将鉴于光老化皮肤的表型所预期)，通过ELISA来测量在三种不同水平的UV暴露之前和之后，COL3向培养的永生化人真皮纤维母细胞的上清液中的分泌(图22A)。实际上，UV照射培养的纤维母细胞使内源性COL3表达显著降低。COL1表达在这个实验中被并行监测，并且不受UV照射显著影响，从而指示与对蛋白质合成的整体抑制不同，UV暴露诱导对COL3的特异性阻遏。接着，测试了C3vec01感染经UV照射永生化HDF以及表达外源性COL3的能力。在此处，使永生化HDF暴露于UV照射，接着使其恢复24小时，随后用C3vec01在0.3或1的MOI下感染。在感染之后48小时，通过qRT-PCR分析来评估外源性人COL3。在两种测试MOI下均检测到受C3vec01感染的经UV照射HDF中的强烈COL3表达(图22B)，从而指示C3vec01高效转导了光损害细胞以及递送了它的所编码运载物。模拟感染的细胞以及用含有与C3vec01相同的HSV-1骨架但代之以编码mCherry效应物的病毒感染的细胞用作阴性对照以确保转基因检测的特异性。
总之，这个实施例中呈现的数据指示重组HSV-1载体C3vec01高效转导多种人皮肤细胞类型，能够挽救胶原3在从年老患者收集的老化原代纤维母细胞中的表达，并且能够补救胶原3从UV损害的HDF进行的表达。在不希望受理论束缚下，据信数据支持使用编码人胶原3的重组HSV来矫正老化皮肤的胶原缺陷。
实施例7：真皮内施用的C3vec01的体内表征
以下实施例描述建立在年轻的和年老的健康的有免疫能力的动物中真皮内施用C3vec01的方法的体内实验。
除非另外指示，否则所有实验都如上所述来进行。
这个实施例中进行的所有程序都依照适用的动物福利法案，并且由当地机构动物护理和使用委员会(IACUC)核准。
在进一步操作之前，将小鼠的背部剃毛。接着将C3vec01(或媒介物对照)在真皮内注射至小鼠的背部中的四个部位。在感染以及后续恢复时期之后，使动物安乐死，并且使用8mm穿孔活检移除处理部位。将每个活检体的一半快速冷冻在液氮中以进行qPCR/qRT-PCR分析，而对另一半进行处理以进行免疫荧光分析。
处理组织样品以进行如上所述的核酸和蛋白质分析。对于COL3免疫荧光染色，使用兔抗人胶原3初级抗体(Abcam，目录号ab7778)和Alexa
Figure BDA0002744714680001691
488缀合的二级抗体。在含有DAPI的封固介质中封固组织样品以使核显现。
在年轻(6-8周龄)和年老(约13月龄)C57BL/6小鼠中进行体内药理学研究以评价在真皮内施用载体后，在有免疫能力的动物中，C3vec01介导的人COL3表达。总计10只动物用于这项研究。首先将每只小鼠的背部剃毛，接着在每个动物4个部位处用2x108 PFU/部位的C3vec01(或媒介物对照)在真皮内注射。在给药后48小时或1周对经注射部位进行活检，并且通过qPCR和免疫荧光来评价人COL3表达。下表5提供实验设计的概要。
表5：研究设计和测试物品施用
Figure BDA0002744714680001692
真皮内递送C3vec01导致在注射后48小时收集的皮肤活检体中检测到高水平的经转导载体基因组(图23A)，以及在年轻小鼠与年老小鼠两者中均产生高水平的人胶原3转录物(图23B)。基于免疫荧光的检测还显示相对于经媒介物处理的皮肤，在经C3vec01处理的皮肤中的整个真皮中，人COL3的水平都明显增加(图23C)，从而与转录物水平相关联。
总之，这个实施例中提供的数据指示在体内在真皮内注射之后可高效转导皮肤以及表达人胶原3。在不希望受理论束缚下，据信此处呈现的体内研究为在美容性环境中使用HSV-1作为用以递送人胶原3的新型基因疗法提供进一步支持。
实施例8：编码人层粘连蛋白的经修饰的单纯疱疹病毒载体的产生和验证
为开始研究，重组疱疹病毒载体被工程化来并入两种人层粘连蛋白即LAMB3或LAMC2的野生型或密码子优化变体，如以上实施例3中所述。对于每种类型的病毒，挑选许多分离株。为测试某些分离株是否能够表达所编码的野生型人LAMB3蛋白，将ICP4补充性Vero细胞铺于6孔板中，并且用野生型LamB3编码病毒的12个未滴定病毒分离株感染直至完成感染。在感染之后，收集RNA，产生cDNA，并且通过qPCR来测定野生型LamB3从每个分离株的表达(图24A)。所有12个分离株都能够在不同水平下在经转导的Vero细胞中表达野生型人LamB3。还通过蛋白质印迹来测试了这些分离株中的10者表达人LamB3的能力。将ICP4补充性Vero细胞铺于6孔板中，并且用野生型LamB3表达性病毒的10个未滴定病毒分离株感染直至完成感染。用LamB3表达质粒转染一孔的Vero细胞，作为阳性对照。在感染之后，将细胞通过温和刮削来收集，离心以收集细胞集结块，吸出培养基，并且用PBS洗涤细胞集结块一次。在洗涤之后，将每个细胞集结块再混悬于含有蛋白酶抑制剂的200μL RIPA缓冲液中，并且在4℃下孵育再混悬液20分钟，其中每5分钟进行温和搅拌。在孵育之后，在17,000x g下离心样品5分钟，移除上清液，并且将含有5％2-巯基甲醇的4x LDS还原样品缓冲液添加至每个澄清上清液中。接着将样品煮沸10分钟，随后上样于4-20％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上。在电泳之后，将蛋白质转移至PVDF膜，并且将膜在5％奶/TBS中封闭30分钟。接着将初级兔抗LamB3抗体(Abcam，目录号ab128864)在以1:1000在5％奶/TBS中稀释下添加至PVDF膜，并且在室温下孵育过夜(约16小时)。印迹接着用TBS洗涤3次，每次5分钟，接着用处于5％奶/TBS中的AP缀合山羊抗兔IgG抗体(Sigma，目录号A3687)在室温下染色1小时。接着将膜用TBS洗涤3次，每次5分钟，添加BCIP/NBT，并且在室温下使印迹显色约10分钟。与qPCR数据一致，所有10个病毒分离株都能够在不同水平下表达所编码野生型人LamB3(图24B)。
还通过蛋白质印迹分析来测试了编码人LamB3的密码子优化变体的病毒在Vero细胞中表达它们的运载物的能力。简要来说，密码子优化(CO)LamB3编码病毒的10个未滴定病毒分离株用于感染Vero细胞，收集细胞集结块，将每个集结块再混悬于含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中，并且使用这些细胞溶解产物进行蛋白质印迹，如上所描述。所有10个病毒分离株都能够在Vero细胞中表达所编码的密码子优化人LamB3(图25)。
接着，测试编码野生型或密码子优化的LAMB3的四个病毒分离株转导原代人细胞以及表达它们的运载物的能力。在1.0的感染复数(MOI)下感染永生化原代正常角质化细胞48小时。未感染的细胞用作阴性对照。接着通过蛋白质印迹来考查LamB3在受感染人角质化细胞中的表达。使用初级兔抗LamB3抗体(Abcam，目录号ab 128864)，如上所述来进行蛋白质印迹。与使用Vero细胞产生的数据一致，确认了表达野生型和密码子优化LamB3的病毒分离株有效转导原代人角质化细胞以及在适合水平下表达它们的所编码的构建体(图26)。
为测试含有LamC2的分离株是否能够表达所编码的野生型或密码子优化的人LAMC2，将ICP4补充性Vero细胞铺于6孔板中，并且用许多未滴定的野生型或密码子优化的LamC2表达性病毒分离株感染直至完成感染。在感染之后，收集RNA，产生cDNA，并且通过qPCR来测定野生型LamC2(图27A)或密码子优化LamC2(图27B)从每个分离株的表达。8/12分离株能够在不同水平下在经转导的Vero细胞中表达野生型人LamC2，而3/7分离株能够表达密码子优化的人LamC2。接着通过蛋白质印迹来测试了某些野生型和密码子优化分离株表达人LamC2的能力。将ICP4补充性Vero细胞铺于6孔板中，并且用未滴定病毒分离株感染直至完成感染。使一孔Vero细胞未受感染，作为阴性对照。在感染之后，细胞通过温和刮削来收集，离心以收集细胞集结块，吸出培养基，并且用PBS洗涤细胞集结块一次。在洗涤之后，将每个细胞集结块再混悬于含有蛋白酶抑制剂的200μL RIPA缓冲液中，并且在4℃下孵育再混悬液20分钟，其中每5分钟进行温和搅拌。在孵育之后，在17,000x g下离心样品5分钟，移除上清液，并且将含有5％2-巯基甲醇的4x LDS还原样品缓冲液添加至每个澄清的上清液中。接着将样品煮沸10分钟，随后上样于4-20％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上。在电泳之后，将蛋白质转移至PVDF膜，并且将膜在5％奶/TBS中封闭30分钟。接着将初级兔抗LamC2抗体(Abcam，目录号ab96327)在以1:1000在5％奶/TBS中稀释下添加至PVDF膜中，并且在室温下孵育过夜(约16小时)。印迹接着用TBS洗涤3次，每次5分钟，接着用处于5％奶/TBS中的AP缀合的山羊抗兔IgG抗体(Sigma，目录号A3687)在室温下染色1小时。接着将膜用TBS洗涤3次，每次5分钟，添加BCIP/NBT，并且在室温下使印迹显色约10分钟。与qPCR数据一致，测试病毒分离株中的全部9者都也能够表达所编码的人LamC2(图27C)。
选择密码子优化的LamC2表达性病毒分离株“LGA”用于在人细胞中进一步测试。用LGA分离株在0.3、1.0或3.0的感染复数(MOI)下感染永生化原代正常角质化细胞48小时。未感染(对照)和mCherry表达性病毒感染的细胞用作阴性对照。在感染48小时之后，从永生化角质化细胞提取DNA和RNA，并且进行qPCR/qRT-PCR(图28A-图28B)。在永生化角质化细胞的情况下，对于LGA分离株，观察到良好剂量-响应，如通过每50ng DNA所检测到的病毒基因组拷贝数所评估(图28A)。引起关注的是，尽管当使MOI从0.3增加至1.0时在转录物水平上观察到剂量响应，但当使MOI从1.0增加至3.0时未观察到转录物水平的额外增加(图28B)。还通过蛋白质印迹来考查LamC2在受感染人角质化细胞中的表达。如上所述来进行蛋白质印迹(使用初级兔抗LamC2抗体(Abcam，目录号ab96327))。与转录物分析一致，当使MOI从0.3增加至1.0，而非从1.0增加至3.0时，在蛋白质水平上观察到剂量响应(图28C)。
最后，为测试分离株“LGA”是否能够在体内递送时表达它的人层粘连蛋白，在动物中在真皮内注射之后，通过qPCR、qRT-PCR和免疫荧光来评估人LAMC2表达。将在PBS+10％甘油(媒介物)中配制的1x108 PFU的LGA在真皮内注射至两只小鼠的背侧皮肤和足垫中。以真皮内方式向一只小鼠的背侧皮肤施用相等体积的单独媒介物以充当阴性对照。在这个研究中处理的两个动物的注射部位的示意图提供于图29A中。
在施用后72小时，从每个处理部位获取完全厚度8mm活检体，并且一分为二。将每个节段的一半快速冷冻在液氮中，并且随后处理以进行qPCR和qRT-PCR分析来定量背侧皮肤中的LAMC2 DNA拷贝数(图29B)和转录物水平(图29C)。将每个活检体的剩余一半包埋在OCT中以测定免疫荧光(IF)。低温切片中的LAMC2表达通过使用抗人LAMC2抗体(Abcam，目录号ab96327)进行免疫荧光分析来测定。为确认从LGA表达的人LAMC2正确定位至皮肤的在其中得见天然层粘连蛋白-332的区域，还关于小鼠层粘连蛋白-332对背侧皮肤样品进行复染(pKal)。真皮内施用LGA导致对小鼠皮肤的成功转导，其中所编码的人转基因在表皮的正确层中稳健表达。组织学评价显示在经处理的部位处无炎症性浸润，从而证明这个疗法具有安全性。
总之，这个实施例中呈现的数据证明(1)HSV载体可被成功工程化来稳健表达人层粘连蛋白(尤其是人层粘连蛋白-332的β或γ亚单位)，(2)基于HSV的载体(LGA)可在体内成功递送人层粘连蛋白-332，以及(3)重组人层粘连蛋白-332亚单位在经处理的动物的表皮的适当区域中表达以及定位至经处理的动物的表皮的适当区域。
序列表
<110> 克里斯托生物技术股份有限公司(Krystal Biotech, Inc.)
克里希南•苏马(KRISHNAN, Suma)
帕里•特雷弗(PARRY, Trevor)
阿加瓦尔•普嘉(AGARWAL, Pooja)
<120> 用于美容性应用的编码一种或多种美容蛋白的重组核酸
<130> 761342000640
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/663,476
<151> 2018-04-27
<160> 64
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 4395
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atgttcagct ttgtggacct ccggctcctg ctcctcttag cggccaccgc cctcctgacg 60
cacggccaag aggaaggcca agtcgagggc caagacgaag acatcccacc aatcacctgc 120
gtacagaacg gcctcaggta ccatgaccga gacgtgtgga aacccgagcc ctgccggatc 180
tgcgtctgcg acaacggcaa ggtgttgtgc gatgacgtga tctgtgacga gaccaagaac 240
tgccccggcg ccgaagtccc cgagggcgag tgctgtcccg tctgccccga cggctcagag 300
tcacccaccg accaagaaac caccggcgtc gagggaccca agggagacac tggcccccga 360
ggcccaaggg gacccgcagg cccccctggc cgagatggca tccctggaca gcctggactt 420
cccggacccc ccggaccccc cggacctccc ggaccccctg gcctcggagg aaactttgct 480
ccccagctgt cttatggcta tgatgagaaa tcaaccggag gaatttccgt gcctggcccc 540
atgggtccct ctggtcctcg tggtctccct ggcccccctg gtgcacctgg tccccaaggc 600
ttccaaggtc cccctggtga gcctggcgag cctggagctt caggtcccat gggtccccga 660
ggtcccccag gtccccctgg aaagaatgga gatgatgggg aagctggaaa acctggtcgt 720
cctggtgagc gtgggcctcc tgggcctcag ggtgctcgag gattgcccgg aacagctggc 780
ctccctggaa tgaagggaca cagaggtttc agtggtttgg atggtgccaa gggagatgct 840
ggtcctgctg gtcctaaggg tgagcctggc agccctggtg aaaatggagc tcctggtcag 900
atgggccccc gtggcctgcc tggtgagaga ggtcgccctg gagcccctgg ccctgctggt 960
gctcgtggaa atgatggtgc tactggtgct gccgggcccc ctggtcccac cggccccgct 1020
ggtcctcctg gcttccctgg tgctgttggt gctaagggtg aagctggtcc ccaagggccc 1080
cgaggctctg aaggtcccca gggtgtgcgt ggtgagcctg gcccccctgg ccctgctggt 1140
gctgctggcc ctgctggaaa ccctggtgct gatggacagc ctggtgctaa aggtgccaat 1200
ggtgctcctg gtattgctgg tgctcctggc ttccctggtg cccgaggccc ctctggaccc 1260
cagggccccg gcggccctcc tggtcccaag ggtaacagcg gtgaacctgg tgctcctggc 1320
agcaaaggag acactggtgc taagggagag cctggccctg ttggtgttca aggaccccct 1380
ggccctgctg gagaggaagg aaagcgagga gctcgaggtg aacccggacc cactggcctg 1440
cccggacccc ctggcgagcg tggtggacct ggtagccgtg gtttccctgg cgcagatggt 1500
gttgctggtc ccaagggtcc cgctggtgaa cgtggttctc ctggccctgc tggccccaaa 1560
ggatctcctg gtgaagctgg tcgtcccggt gaagctggtc tgcctggtgc caagggtctg 1620
actggaagcc ctggcagccc tggtcctgat ggcaaaactg gcccccctgg tcccgccggt 1680
caagatggtc gccccggacc cccaggccca cctggtgccc gtggtcaggc tggtgtgatg 1740
ggattccctg gacctaaagg tgctgctgga gagcccggca aggctggaga gcgaggtgtt 1800
cccggacccc ctggcgctgt cggtcctgct ggcaaagatg gagaggctgg agctcaggga 1860
ccccctggcc ctgctggtcc cgctggcgag agaggtgaac aaggccctgc tggctccccc 1920
ggattccagg gtctccctgg tcctgctggt cctccaggtg aagcaggcaa acctggtgaa 1980
cagggtgttc ctggagacct tggcgcccct ggcccctctg gagcaagagg cgagagaggt 2040
ttccctggcg agcgtggtgt gcaaggtccc cctggtcctg ctggtccccg aggggccaac 2100
ggtgctcccg gcaacgatgg tgctaagggt gatgctggtg cccctggagc tcccggtagc 2160
cagggcgccc ctggccttca gggaatgcct ggtgaacgtg gtgcagctgg tcttccaggg 2220
cctaagggtg acagaggtga tgctggtccc aaaggtgctg atggctctcc tggcaaagat 2280
ggcgtccgtg gtctgactgg ccccattggt cctcctggcc ctgctggtgc ccctggtgac 2340
aagggtgaaa gtggtcccag cggccctgct ggtcccactg gagctcgtgg tgcccccgga 2400
gaccgtggtg agcctggtcc ccccggccct gctggctttg ctggcccccc tggtgctgac 2460
ggccaacctg gtgctaaagg cgaacctggt gatgctggtg ctaaaggcga tgctggtccc 2520
cctggccctg ccggacccgc tggaccccct ggccccattg gtaatgttgg tgctcctgga 2580
gccaaaggtg ctcgcggcag cgctggtccc cctggtgcta ctggtttccc tggtgctgct 2640
ggccgagtcg gtcctcctgg cccctctgga aatgctggac cccctggccc tcctggtcct 2700
gctggcaaag aaggcggcaa aggtccccgt ggtgagactg gccctgctgg acgtcctggt 2760
gaagttggtc cccctggtcc ccctggccct gctggcgaga aaggatcccc tggtgctgat 2820
ggtcctgctg gtgctcctgg tactcccggg cctcaaggta ttgctggaca gcgtggtgtg 2880
gtcggcctgc ctggtcagag aggagagaga ggcttccctg gtcttcctgg cccctctggt 2940
gaacctggca aacaaggtcc ctctggagca agtggtgaac gtggtccccc tggtcccatg 3000
ggcccccctg gattggctgg accccctggt gaatctggac gtgagggggc tcctggtgcc 3060
gaaggttccc ctggacgaga cggttctcct ggcgccaagg gtgaccgtgg tgagaccggc 3120
cccgctggac cccctggtgc tcctggtgct cctggtgccc ctggccccgt tggccctgct 3180
ggcaagagtg gtgatcgtgg tgagactggt cctgctggtc ccgccggtcc tgtcggccct 3240
gttggcgccc gtggccccgc cggaccccaa ggcccccgtg gtgacaaggg tgagacaggc 3300
gaacagggcg acagaggcat aaagggtcac cgtggcttct ctggcctcca gggtccccct 3360
ggccctcctg gctctcctgg tgaacaaggt ccctctggag cctctggtcc tgctggtccc 3420
cgaggtcccc ctggctctgc tggtgctcct ggcaaagatg gactcaacgg tctccctggc 3480
cccattgggc cccctggtcc tcgcggtcgc actggtgatg ctggtcctgt tggtcccccc 3540
ggccctcctg gacctcctgg tccccctggt cctcccagcg ctggtttcga cttcagcttc 3600
ctgccccagc cacctcaaga gaaggctcac gatggtggcc gctactaccg ggctgatgat 3660
gccaatgtgg ttcgtgaccg tgacctcgag gtggacacca ccctcaagag cctgagccag 3720
cagatcgaga acatccggag cccagagggc agccgcaaga accccgcccg cacctgccgt 3780
gacctcaaga tgtgccactc tgactggaag agtggagagt actggattga ccccaaccaa 3840
ggctgcaacc tggatgccat caaagtcttc tgcaacatgg agactggtga gacctgcgtg 3900
taccccactc agcccagtgt ggcccagaag aactggtaca tcagcaagaa ccccaaggac 3960
aagaggcatg tctggttcgg cgagagcatg accgatggat tccagttcga gtatggcggc 4020
cagggctccg accctgccga tgtggccatc cagctgacct tcctgcgcct gatgtccacc 4080
gaggcctccc agaacatcac ctaccactgc aagaacagcg tggcctacat ggaccagcag 4140
actggcaacc tcaagaaggc cctgctcctc cagggctcca acgagatcga gatccgcgcc 4200
gagggcaaca gccgcttcac ctacagcgtc actgtcgatg gctgcacgag tcacaccgga 4260
gcctggggca agacagtgat tgaatacaaa accaccaaga cctcccgcct gcccatcatc 4320
gatgtggccc ccttggacgt tggtgcccca gaccaggaat tcggcttcga cgttggccct 4380
gtctgcttcc tgtaa 4395
<210> 2
<211> 4395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
atgttcagct tcgtggacct gagactgctg ctgctcctgg ctgctacagc cctgctgaca 60
cacggacaag aggaaggcca ggtcgaagga caggacgagg acatccctcc tatcacctgt 120
gtgcagaacg gcctgagata ccacgaccgg gatgtgtgga agcccgagcc ttgcagaatc 180
tgcgtgtgcg acaatggcaa ggtgctgtgc gacgacgtga tctgcgacga gacaaagaat 240
tgccctggcg ccgaagtgcc tgagggcgaa tgttgtcctg tgtgccctga tggcagcgag 300
agccccacag atcaagagac aacaggcgtg gaaggcccca agggcgatac aggacctaga 360
ggtcctagag gacctgccgg acctcctggc agagatggaa ttcctggaca gcctggactg 420
cccggaccac ctggacctcc agggcctcca ggtccaccag gactcggagg aaattttgcc 480
ccacagctga gctacggcta cgacgagaaa agcacaggcg gcatctctgt gcctggacct 540
atgggacctt ctggcccaag aggacttcct ggtcctcctg gtgctccagg acctcaggga 600
tttcaaggac caccaggcga acctggcgaa ccaggcgcta gtggtccaat gggaccaaga 660
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cctggcgaaa gaggcccgcc aggaccgcaa ggcgctagag ggttgcctgg aactgcagga 780
ctgcctggca tgaagggcca cagaggcttt tctggactgg atggcgctaa gggcgacgct 840
ggaccagcag gacctaaagg cgagcctgga tctcctggcg agaatggtgc acctggacag 900
atgggtccca gaggattgcc aggcgagaga ggtagacctg gcgctccggg accagccggt 960
gctagaggaa atgatggcgc aacaggtgct gctgggcctc ctggaccaac cggaccagct 1020
ggcccacctg gatttccagg cgctgttgga gcaaagggcg aagcaggccc acaaggacct 1080
aggggatctg aaggtcctca gggcgttaga ggcgagccag ggccacctgg gcctgccggt 1140
gcagctggac ctgctggaaa ccctggtgct gatggacagc caggtgccaa aggtgctaat 1200
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caaggcccag gcggacctcc gggtcctaag ggaaatagcg gagagccagg cgctcctggg 1320
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ggaccagctg gcgaggaagg caaaagaggc gctaggggag aaccaggacc aacagggctc 1440
cctggtccac ctggcgagcg cggaggacct ggatctagag gattccctgg cgcagatggc 1500
gtggccggac caaaaggacc tgcaggcgaa aggggatcac caggtcctgc aggccctaag 1560
ggttctccag gcgaggctgg cagacccggc gaagctggac tcccaggtgc taagggactg 1620
acaggctcac caggatctcc cggaccagac ggaaaaacag gacctccagg accggcagga 1680
caggatggta gacccggtcc tcctggaccg cctggtgcaa gaggacaagc tggcgtgatg 1740
ggctttcctg gaccaaaagg tgcagccggc gaacctggaa aagcaggcga gaggggagtt 1800
cccggacctc caggtgctgt tggacctgcc ggaaaagatg gcgaagctgg tgcacaaggt 1860
cctccagggc cagccggacc agccggcgag agaggcgaac aaggaccagc cggatctcca 1920
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aagggcgaat ctggacctag tggacccgct ggtcctacag gtgctagggg agccccaggc 2400
gaccggggag agcctggtcc accaggacct gctggatttg ctggacctcc tggcgctgat 2460
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<210> 3
<211> 4101
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 4101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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ccagggcaac caggccctcc tggacctcct ggtgcccctg gtccttgctg tggtggtgtt 3600
ggagccgctg ccattgctgg gattggaggt gaaaaagctg gcggttttgc cccgtattat 3660
ggagatgaac caatggattt caaaatcaac accgatgaga ttatgacttc actcaagtct 3720
gttaatggac aaatagaaag cctcattagt cctgatggtt ctcgtaaaaa ccccgctaga 3780
aactgcagag acctgaaatt ctgccatcct gaactcaaga gtggagaata ctgggttgac 3840
cctaaccaag gatgcaaatt ggatgctatc aaggtattct gtaatatgga aactggggaa 3900
acatgcataa gtgccaatcc tttgaatgtt ccacggaaac actggtggac agattctagt 3960
gctgagaaga aacacgtttg gtttggagag tccatggatg gtggttttca gtttagctac 4020
ggcaatcctg aacttcctga agatgtcctt gatgtgcagc tggcattcct tcgacttctc 4080
tccagccgag cttcccagaa catcacatat cactgcaaaa atagcattgc atacatggat 4140
caggccagtg gaaatgtaaa gaaggccctg aagctgatgg ggtcaaatga aggtgaattc 4200
aaggctgaag gaaatagcaa attcacctac acagttctgg aggatggttg cacgaaacac 4260
actggggaat ggagcaaaac agtctttgaa tatcgaacac gcaaggctgt gagactacct 4320
attgtagata ttgcacccta tgacattggt ggtcctgatc aagaatttgg tgtggacgtt 4380
ggccctgttt gctttttata a 4401
<210> 6
<211> 4401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
atgatgagct tcgtgcagaa aggcagctgg ctgctgctgg cactgctgca ccctacaatc 60
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ggacagggac ctcagggccc taaaggcgat cctggacctc ctggaatccc cggcagaaat 360
ggcgatccag gcattcctgg acagcctggc tctcctggaa gtccaggtcc acctggcatc 420
tgcgagagct gtcctacagg ccctcagaac tacagcccac agtacgacag ctacgacgtg 480
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cctggactga aaggcgaaaa tggactgcca ggcgagaatg gcgcacccgg acctatggga 900
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tctaatggtg ccccaggaca gaggggagaa ccaggaccac aaggacatgc tggtgctcaa 1140
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ggtagacccg gacctccggg accatcagga ccaagaggac aacctggcgt gatgggcttc 1740
cctggaccta agggaaatga cggcgctccc ggaaagaacg gcgaacgcgg tggccctggc 1800
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gaaggtggcg cccctggctt gcctggaatt gctggtccta gaggttcacc tggcgagcgg 2400
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cctggattgg ctggaacagc tggcgaacct ggaagagatg gcaatcctgg ctctgatggc 3060
ttgccgggga gagatggctc cccaggtggc aagggcgatc gcggagaaaa tggtagccca 3120
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tctggcgata gaggcgagtc tggacccgca ggtcccgctg gcgccccagg gcctgccgga 3240
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ggagccgctg gaatcaaagg ccatagagga ttcccaggca accctggtgc acccggatca 3360
ccaggaccgg caggacaaca aggcgctatt ggcagtccgg ggcctgctgg gccgagagga 3420
ccagttggac ctagtggacc accgggcaaa gatggaacaa gcggacaccc tggacctatc 3480
ggaccaccag gacctagagg caatagaggc gagagaggca gcgagggatc tcccggacat 3540
cctggacaac ccggtccacc ggggccacca ggcgcaccag ggccatgttg tggcggagtt 3600
ggagctgctg ccattgctgg aatcggcgga gagaaagccg gcggatttgc cccttattac 3660
ggcgacgagc ccatggattt caagatcaac accgacgaga tcatgaccag cctgaagtcc 3720
gtgaacggcc agatcgagag cctgatcagc cctgacggca gcagaaagaa ccccgccaga 3780
aactgccgcg acctgaagtt ctgtcacccc gagctgaaaa gcggcgagta ctgggttgac 3840
cccaaccagg gctgtaaact ggacgccatt aaggtgttct gcaacatgga aaccggcgag 3900
acatgcatca gcgccaatcc tctgaacgtg cccagaaagc actggtggac agatagcagc 3960
gccgagaaga agcacgtttg gttcggcgag agcatggacg gcggcttcca gttctcttac 4020
ggcaatcccg agctgcccga ggacgtgctg gatgtgcaac tggcctttct gagactgctg 4080
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caggccagcg gcaacgtgaa gaaagccctg aagctgatgg gcagcaacga gggcgagttt 4200
aaggccgagg gcaacagcaa gttcacctac accgtgctgg aagatggctg caccaagcac 4260
acaggcgagt ggtccaagac cgtgttcgag taccggacaa gaaaggccgt gcggctgcct 4320
atcgtggata tcgcccctta cgatatcgga ggccccgatc aagagttcgg cgttgacgtg 4380
ggccctgtgt gtttcctgta a 4401
<210> 7
<211> 5010
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
atggggcccc ggctcagcgt ctggctgctg ctgctgcccg ccgcccttct gctccacgag 60
gagcacagcc gggccgctgc gaagggtggc tgtgctggct ctggctgtgg caaatgtgac 120
tgccatggag tgaagggaca aaagggtgaa agaggcctcc cggggttaca aggtgtcatt 180
gggtttcctg gaatgcaagg acctgagggg ccacagggac caccaggaca aaagggtgat 240
actggagaac caggactacc tggaacaaaa gggacaagag gacctccggg agcatctggc 300
taccctggaa acccaggact tcccggaatt cctggccaag acggcccgcc aggcccccca 360
ggtattccag gatgcaatgg cacaaagggg gagagagggc cgctcgggcc tcctggcttg 420
cctggtttcg ctggaaatcc cggaccacca ggcttaccag ggatgaaggg tgatccaggt 480
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ccagggactc caggcccacc aggactgcca gggcttcaag gtcctgttgg gcctccagga 600
tttaccggac caccaggtcc cccaggccct cccggccctc caggtgaaaa gggacaaatg 660
ggcttaagtt ttcaaggacc aaaaggtgac aagggtgacc aaggggtcag tgggcctcca 720
ggagtaccag gacaagctca agttcaagaa aaaggagact tcgccaccaa gggagaaaag 780
ggccaaaaag gtgaacctgg atttcagggg atgccagggg tcggagagaa aggtgaaccc 840
ggaaaaccag gacccagagg caaacccgga aaagatggtg acaaagggga aaaagggagt 900
cccggttttc ctggtgaacc cgggtaccca ggactcatag gccgccaggg cccgcaggga 960
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ggagaaaaag gagagagggg ctaccctgga actccggggc caagaggaga gccaggccca 1080
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gctggtgccc ctggcttccc tggtgaaaga ggagaaaaag gtgaccgagg atttcctggt 1200
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ccacagggac ccccgggaga aataggtttc ccagggcagc caggggccaa gggcgacaga 1500
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ttacctggga acccaggtgt gcagggccag aagggagagc ctggagttgg tctaccggga 2220
ctcaaaggtt tgccaggtct tcccggcatt cctggcacac ccggggagaa ggggagcatt 2280
ggggtaccag gcgttcctgg agaacatgga gcgatcggac cccctgggct tcaggggatc 2340
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cctcctggaa taaaaggaga gaagggtttc cccggattcc ctggactgga catgccgggc 2520
cctaaaggag ataaaggggc tcaaggactc cctggcataa cgggacagtc ggggctccct 2580
ggccttcctg gacagcaggg ggctcctggg attcctgggt ttccaggttc caagggagaa 2640
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ttaccgggtg aaaaagggga ccatggcttt ccgggctcct caggacccag gggagaccct 2760
ggcttgaaag gtgataaggg ggatgtcggt ctccctggca agcctggctc catggataag 2820
gtggacatgg gcagcatgaa gggccagaaa ggagaccaag gagagaaagg acaaattgga 2880
ccaattggtg agaagggatc ccgaggagac cctgggaccc caggagtgcc tggaaaggac 2940
gggcaggcag gacagcctgg gcagccagga cctaaaggtg atccaggtat aagtggaacc 3000
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gggctgcgag gtgaaaaggg agatcaaggg atagcgggtt tcccaggaag ccctggagag 3240
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tctcccggga gtgttggcta tccaggaagt cctgggctac ctggagaaaa aggtgacaaa 3360
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cctggcccca caggcccagc tggccagaaa ggggagccag gcagtgatgg aatcccgggg 3480
tcagcaggag agaagggtga accaggtcta ccaggaagag gattcccagg gtttccaggg 3540
gccaaaggag acaaaggttc aaagggtgag gtgggtttcc caggattagc cgggagccca 3600
ggaattcctg gatccaaagg agagcaagga ttcatgggtc ctccggggcc ccagggacag 3660
ccggggttac cgggatcccc aggccatgcc acggaggggc ccaaaggaga ccgcggacct 3720
cagggccagc ctggcctgcc aggacttccg ggacccatgg ggcctccagg gcttcctggg 3780
attgatggag ttaaaggtga caaaggaaat ccaggctggc caggagcacc cggtgtccca 3840
gggcccaagg gagaccctgg attccagggc atgcctggta ttggtggctc tccaggaatc 3900
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cttcctggcc tccagggaat taaaggtgat caaggcgatc aaggcgtccc gggagctaaa 4020
ggtctcccgg gtcctcctgg ccccccaggt ccttacgaca tcatcaaagg ggagcccggg 4080
ctccctggtc ctgagggccc cccagggctg aaagggcttc agggactgcc aggcccgaaa 4140
ggccagcaag gtgttacagg attggtgggt atacctggac ctccaggtat tcctgggttt 4200
gacggtgccc ctggccagaa aggagagatg ggacctgccg ggcctactgg tccaagagga 4260
tttccaggtc caccaggccc cgatgggttg ccaggatcca tggggccccc aggcacccca 4320
tctgttgatc acggcttcct tgtgaccagg catagtcaaa caatagatga cccacagtgt 4380
ccttctggga ccaaaattct ttaccacggg tactctttgc tctacgtgca aggcaatgaa 4440
cgggcccatg gccaggactt gggcacggcc ggcagctgcc tgcgcaagtt cagcacaatg 4500
cccttcctgt tctgcaatat taacaacgtg tgcaactttg catcacgaaa tgactactcg 4560
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ataagaccat ttattagtag gtgtgctgtg tgtgaggcgc ctgccatggt gatggccgtg 4680
cacagccaga ccattcagat cccaccgtgc cccagcgggt ggtcctcgct gtggatcggc 4740
tactcttttg tgatgcacac cagcgctggt gcagaaggct ctggccaagc cctggcgtcc 4800
cccggctcct gcctggagga gtttagaagt gcgccattca tcgagtgtca cggccgtggg 4860
acctgcaatt actacgcaaa cgcttacagc ttttggctcg ccaccataga gaggagcgag 4920
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<211> 5010
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
atgggcccta gactgtctgt gtggctgctg cttcttcctg ccgctctgct gctgcacgag 60
gaacattcta gagccgccgc taaaggcgga tgtgccggat ctggatgcgg caagtgtgat 120
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acaggcgaac ctggcctgcc tggcacaaag ggaacaagag gaccacctgg cgcctctggc 300
tatcctggaa atccaggact gcctggaatc ccaggacagg atggacctcc tggtcctcct 360
ggcattcctg gctgtaatgg caccaaaggc gagagaggtc cactcggacc accaggactc 420
ccaggatttg ctggaaaccc tgggccacct ggattgcctg gcatgaaggg cgatcctggc 480
gaaattctgg gacacgttcc cggcatgctg ctgaaaggcg aaaggggctt tcccggaatt 540
cctggcacac ctggtccacc aggcttgcca ggacttcaag gaccagttgg cccacctggc 600
tttacaggtc ctccaggtcc accggggcct ccagggccgc caggcgaaaa aggacaaatg 660
ggactgagct ttcagggccc caagggcgac aaaggcgatc aaggtgttag tggccctcca 720
ggtgttcctg gacaggccca ggttcaagag aaaggcgatt tcgccaccaa gggcgagaag 780
ggacagaaag gcgaaccagg ctttcaggga atgcctggcg tgggagaaaa gggcgaaccc 840
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cctggattcc ctggcgaacc tggatatcct ggactgatcg gtagacaggg ccctcaaggc 960
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ggagaaaaag gcgagcgagg ataccctgga actcccggac ctaggggaga accaggacct 1080
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gctggtgctc caggatttcc cggcgaacgt ggcgaaaagg gcgatagagg ttttcctggc 1200
acaagcctgc ctgggccttc tggaagagat ggacttcccg ggccaccagg ttctcccgga 1260
ccacctggac agcctggcta taccaatggc atcgtcgagt gtcaacccgg tccacctggc 1320
gatcaaggac ctcctggaat accaggccag cctggcttta tcggcgagat tggagagaaa 1380
gggcaaaaag gggagagctg cctgatctgc gacatcgatg gatacagagg ccctcctgga 1440
cctcaaggcc caccaggcga gataggtttt ccagggcaac ctggcgcaaa aggcgaccgt 1500
ggactccctg gtagagatgg tgttgctggc gttccaggac cacaaggcac ccctggactt 1560
attggacagc caggtgcaaa gggcgagcca ggcgagttct acttcgacct gagacttaaa 1620
ggcgacaagg gcgaccctgg ctttcctgga caacctggaa tgcccggtag agctggatca 1680
ccaggccgtg atggacatcc agggttgccc ggaccaaaag gctctccagg atctgtgggc 1740
ctcaaaggcg aaagaggccc tccaggcgga gttggatttc ctggctctag aggcgatact 1800
ggcccaccag gtccacctgg atatggacct gctggcccta ttggagataa gggccaagca 1860
ggattcccag gcggacccgg ttctccaggc cttccgggtc ctaaaggcga gcctggaaaa 1920
atcgttccac tgcctggacc tccaggcgct gaaggattgc ctggatctcc cggttttcct 1980
ggaccgcaag gcgatagagg attccccgga acacccggta gaccaggcct tcctggcgag 2040
aaaggtgctg tgggtcaacc tggaatcggc tttcctgggc ctcctggtcc aaaaggtgtt 2100
gatggactgc ccggcgatat gggcccaccg ggaacaccag gcagacccgg ctttaatgga 2160
ttgcccggaa atcccggcgt ccaaggccag aaaggcgagc ccggtgttgg ccttcctgga 2220
cttaaaggac ttccaggcct gccaggcata cctgggacac ctggcgaaaa gggatctatc 2280
ggagttcctg gcgtgccagg cgaacatggt gcaattggtc cacctgggct gcaaggcatt 2340
agaggcgaac ccgggcctcc aggactccct ggctctgttg gaagtccagg cgtccccgga 2400
attggaccac caggtgctag gggacctcct ggcggacaag gtccaccagg attgtctgga 2460
ccacctggga tcaaaggcga gaaaggcttc cccggctttc ccggccttga tatgcctgga 2520
cctaaaggcg ataagggtgc ccagggcctg cctggaatta ctggacaaag cggcttgccc 2580
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ttgcccggcg aaaaaggcga ccacggattc ccaggatcaa gcggaccaag aggcgatccg 2760
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cctggaccta caggaccagc tggccaaaaa ggcgaaccgg gatctgatgg aattcccggc 3480
tctgctggcg aaaaaggcga gccaggcctt cctggaagag gcttcccagg atttcctggc 3540
gcaaagggcg ataagggctc taagggcgaa gtcggctttc caggacttgc cggttctcct 3600
ggcatcccag gttccaaggg cgaacaagga ttcatgggtc ctccgggtcc tcagggtcaa 3660
ccagggttgc ctggaagccc tggacatgcc acagaaggac caaaaggcga cagaggacct 3720
cagggacaac ctgggcttcc cggccttcca ggaccaatgg gtcctcctgg actccccggt 3780
attgatggcg tcaagggcga caagggaaat ccaggatggc caggtgctcc aggcgttccc 3840
ggtccaaagg gcgatcccgg gtttcaaggg atgcctggta tcggaggaag ccccggcatt 3900
actggaagca aaggcgacat gggaccacca ggcgtgcccg gttttcaggg acctaaaggg 3960
ttgccaggcc tgcagggaat caaaggcgac cagggcgatc aaggcgttcc aggtgccaag 4020
ggattgcctg ggccaccagg accgccagga ccttacgata tcattaaggg cgagcccgga 4080
ctgcctggtc ctgagggtcc tccaggattg aaaggacttc aggggctccc tggaccaaaa 4140
ggacagcagg gtgttacagg cctcgtcggt attcctggac ctccggggat acctggattt 4200
gatggtgctc ctgggcagaa aggcgaaatg ggtccagcag gaccaacagg cccaagaggt 4260
ttccccggac ctccagggcc tgatggcctg ccaggatcta tgggtccacc agggacacca 4320
tccgtggatc acggctttct ggtcaccaga cacagccaga ccatcgacga tcctcagtgt 4380
cctagcggca ccaagatcct gtatcacggc tacagcctgc tgtacgtgca gggcaatgag 4440
agagcacacg gacaggatct gggcacagcc ggcagctgtc tgcggaagtt tagcaccatg 4500
ccttttctgt tctgcaacat caacaacgtg tgcaacttcg ccagccggaa cgactacagc 4560
tactggctgt ctacccctga gcctatgcct atgagcatgg cccctatcac cggggagaac 4620
atcagaccct tcatcagcag atgtgccgtg tgcgaagccc ctgccatggt tatggctgtg 4680
cactcccaga ccattcagat ccctccatgt ccaagcggct ggtctagcct gtggatcggc 4740
tactcctttg tgatgcacac atctgccggc gcagaaggat caggacaagc ccttgctagc 4800
cccggctcct gtctggaaga attcagaagc gcccctttca tcgagtgcca cggcagaggc 4860
acctgtaact actacgccaa cgcctacagc ttttggctgg ccaccatcga gcggagcgag 4920
atgttcaaga agcccacacc ttctacactg aaggccggcg agctgagaac acacgtgtcc 4980
agatgtcaag tgtgcatgcg gcggacctga 5010
<210> 9
<211> 3087
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
atgagggcgg cccgtgctct gctgcccctg ctgctgcagg cctgctggac agccgcgcag 60
gatgagccgg agaccccgag ggccgtggcc ttccaggact gccccgtgga cctgttcttt 120
gtgctggaca cctctgagag cgtggccctg aggctgaagc cctacggggc cctcgtggac 180
aaagtcaagt ccttcaccaa gcgcttcatc gacaacctga gggacaggta ctaccgctgt 240
gaccgaaacc tggtgtggaa cgcaggcgcg ctgcactaca gtgacgaggt ggagatcatc 300
caaggcctca cgcgcatgcc tggcggccgc gacgcactca aaagcagcgt ggacgcggtc 360
aagtactttg ggaagggcac ctacaccgac tgcgctatca agaaggggct ggagcagctc 420
ctcgtggggg gctcccacct gaaggagaat aagtacctga ttgtggtgac cgacgggcac 480
cccctggagg gctacaagga accctgtggg gggctggagg atgctgtgaa cgaggccaag 540
cacctgggcg tcaaagtctt ctcggtggcc atcacacccg accacctgga gccgcgtctg 600
agcatcatcg ccacggacca cacgtaccgg cgcaacttca cggcggctga ctggggccag 660
agccgcgacg cagaggaggc catcagccag accatcgaca ccatcgtgga catgatcaaa 720
aataacgtgg agcaagtgtg ctgctccttc gaatgccagc ctgcaagagg acctccgggg 780
ctccggggcg accccggctt tgagggagaa cgaggcaagc cggggctccc aggagagaag 840
ggagaagccg gagatcctgg aagacccggg gacctcggac ctgttgggta ccagggaatg 900
aagggagaaa aagggagccg tggggagaag ggctccaggg gacccaaggg ctacaaggga 960
gagaagggca agcgtggcat cgacggggtg gacggcgtga agggggagat ggggtaccca 1020
ggcctgccag gctgcaaggg ctcgcccggg tttgacggca ttcaaggacc ccctggcccc 1080
aagggagacc ccggtgcctt tggactgaaa ggagaaaagg gcgagcctgg agctgacggg 1140
gaggcgggga gaccagggag ctcgggacca tctggagacg agggccagcc gggagagcct 1200
gggccccccg gagagaaagg agaggcgggc gacgagggga acccaggacc tgacggtgcc 1260
cccggggagc ggggtggccc tggagagaga ggaccacggg ggaccccagg cacgcgggga 1320
ccaagaggag accctggtga agctggcccg cagggtgatc agggaagaga aggccccgtt 1380
ggtgtccctg gagacccggg cgaggctggc cctatcggac ctaaaggcta ccgaggcgat 1440
gagggtcccc cagggtccga gggtgccaga ggagccccag gacctgccgg accccctgga 1500
gacccggggc tgatgggtga aaggggagaa gacggccccg ctggaaatgg caccgagggc 1560
ttccccggct tccccgggta tccgggcaac aggggcgctc ccgggataaa cggcacgaag 1620
ggctaccccg gcctcaaggg ggacgaggga gaagccgggg accccggaga cgataacaac 1680
gacattgcac cccgaggagt caaaggagca aaggggtacc ggggtcccga gggcccccag 1740
ggacccccag gacaccaagg accgcctggg ccggacgaat gcgagatttt ggacatcatc 1800
atgaaaatgt gctcttgctg tgaatgcaag tgcggcccca tcgacctcct gttcgtgctg 1860
gacagctcag agagcattgg cctgcagaac ttcgagattg ccaaggactt cgtcgtcaag 1920
gtcatcgacc ggctgagccg ggacgagctg gtcaagttcg agccagggca gtcgtacgcg 1980
ggtgtggtgc agtacagcca cagccagatg caggagcacg tgagcctgcg cagccccagc 2040
atccggaacg tgcaggagct caaggaagcc atcaagagcc tgcagtggat ggcgggcggc 2100
accttcacgg gggaggccct gcagtacacg cgggaccagc tgctgccgcc cagcccgaac 2160
aaccgcatcg ccctggtcat cactgacggg cgctcagaca ctcagaggga caccacaccg 2220
ctcaacgtgc tctgcagccc cggcatccag gtggtctccg tgggcatcaa agacgtgttt 2280
gacttcatcc caggctcaga ccagctcaat gtcatttctt gccaaggcct ggcaccatcc 2340
cagggccggc ccggcctctc gctggtcaag gagaactatg cagagctgct ggaggatgcc 2400
ttcctgaaga atgtcaccgc ccagatctgc atagacaaga agtgtccaga ttacacctgc 2460
cccatcacgt tctcctcccc ggctgacatc accatcctgc tggacggctc cgccagcgtg 2520
ggcagccaca actttgacac caccaagcgc ttcgccaagc gcctggccga gcgcttcctc 2580
acagcgggca ggacggaccc cgcccacgac gtgcgggtgg cggtggtgca gtacagcggc 2640
acgggccagc agcgcccaga gcgggcgtcg ctgcagttcc tgcagaacta cacggccctg 2700
gccagtgccg tcgatgccat ggactttatc aacgacgcca ccgacgtcaa cgatgccctg 2760
ggctatgtga cccgcttcta ccgcgaggcc tcgtccggcg ctgccaagaa gaggctgctg 2820
ctcttctcag atggcaactc gcagggcgcc acgcccgctg ccatcgagaa ggccgtgcag 2880
gaagcccagc gggcaggcat cgagatcttc gtggtggtcg tgggccgcca ggtgaatgag 2940
ccccacatcc gcgtcctggt caccggcaag acggccgagt acgacgtggc ctacggcgag 3000
agccacctgt tccgtgtccc cagctaccag gccctgctcc gcggtgtctt ccaccagaca 3060
gtctccagga aggtggcgct gggctag 3087
<210> 10
<211> 3087
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
atgagagccg ctagagccct tctgcctctg ctgctgcaag cctgttggac agccgctcag 60
gatgagcccg aaacacctag agccgtggca ttccaggact gccccgtgga tctgttcttc 120
gtgctggata ccagcgagag cgtggccctg agactgaaac cttatggcgc cctggtggac 180
aaagtgaagt ccttcaccaa gcggttcatc gacaacctgc gcgaccggta ctacagatgc 240
gacagaaacc tcgtgtggaa cgcaggcgcc ctgcactact ctgacgaggt ggaaatcatc 300
cagggcctga ccagaatgcc tggcggaaga gatgccctga agtctagcgt ggacgccgtg 360
aagtactttg gcaagggcac ctacaccgac tgcgccatca agaaaggcct ggaacagctg 420
ctcgtcggcg gcagccatct gaaagagaac aagtacctga tcgtggttac cgacggacac 480
cctctggaag gctacaaaga accttgtggc ggactggaag atgccgtgaa cgaggccaaa 540
cacctgggcg tgaaggtgtt cagcgtggcc atcacacccg accacctgga acctcggctg 600
agcatcattg ccaccgacca cacctaccgg cggaatttca cagccgctga ttggggccag 660
agcagggatg ccgaagaggc catcagccag accatcgaca ccatcgtgga catgatcaag 720
aacaacgtgg aacaagtgtg ctgcagcttc gagtgccagc ctgctagagg acctcctgga 780
cttagaggcg accctggctt tgagggcgag agaggaaaac ctggactgcc cggcgaaaaa 840
ggcgaagctg gcgatcctgg tagacctggc gatctgggac ctgtgggcta tcagggaatg 900
aagggcgaga aaggctcccg gggagagaag ggatctagag gccctaaggg ctacaagggc 960
gaaaaaggca agaggggcat cgatggcgtg gacggcgtca aaggcgagat gggatatcct 1020
ggactccctg gctgtaaagg cagccctggc ttcgatggaa tccagggacc tccaggacct 1080
aagggcgatc caggcgcctt tggactgaaa ggcgaaaagg gcgaaccagg tgccgatggc 1140
gaagcaggca gacctggatc ttctggccct agcggagatg aaggacagcc tggcgaacct 1200
ggaccacctg gcgagaaggg cgaagccggc gacgagggaa atccaggacc agatggtgct 1260
cctggcgaaa gaggtggacc aggcgaaagg ggacctagag gaacaccagg cacaagaggc 1320
ccaagaggcg atcccggcga ggctggacct caaggcgatc agggaagaga aggaccagtg 1380
ggagttcctg gcgacccagg cgaagcagga cctatcggcc ctaagggata tagaggcgac 1440
gaaggccctc ctggatctga aggtgctaga ggcgcaccag gtccagcagg ccctccaggc 1500
gaccccggac ttatgggaga acgcggagaa gatggccctg ccggcaatgg cacagagggc 1560
tttccaggct ttcctggcta ccccggaaat agaggcgctc ctggaatcaa cggcaccaag 1620
ggatatccag ggctcaaagg cgacgaaggc gaggcaggcg atccagggga tgacaacaac 1680
gatatcgccc ctagaggcgt gaaaggcgcc aaaggctata gaggaccaga gggaccacaa 1740
ggcccacctg gtcatcaagg gccaccagga cctgacgagt gcgagatcct ggacatcatt 1800
atgaagatgt gcagctgctg cgagtgcaag tgcggcccta tcgatctgct gtttgtgctg 1860
gacagctccg agagcatcgg cctgcagaat ttcgagatcg ccaaggactt cgtggtcaaa 1920
gtgatcgaca gactgagccg ggacgagctg gtcaagtttg agcctggcca gtcttatgcc 1980
ggcgtggtgc agtacagcca cagccagatg caagagcacg tgtccctgag aagccccagc 2040
atcagaaacg tgcaagagct gaaagaagcc atcaagtccc tgcagtggat ggctggcgga 2100
acctttactg gcgaggccct gcagtacacc agagatcaac tgctgcctcc ttctcctaac 2160
aaccggattg ccctcgtgat caccgacggc agaagcgaca cccagagaga caccacacct 2220
ctgaacgtgc tgtgcagccc cggcattcag gtggtgtctg tgggcatcaa ggacgtgttc 2280
gacttcatcc ccggcagcga ccagctgaac gtgatctctt gtcaaggact ggcccctagc 2340
caaggcagac caggactgtc tctggtcaaa gagaactacg ccgagctgct cgaggacgcc 2400
ttcctgaaga atgtgacagc ccagatctgc atcgacaaga agtgccccga ctacacatgc 2460
cccatcacct ttagcagccc tgccgacatc accatcctgc tggatggctc tgctagcgtg 2520
ggcagccaca acttcgacac caccaagaga ttcgccaagc ggctggccga gagatttctg 2580
acagccggca gaaccgatcc tgctcacgat gtgcgagtgg ccgtggtcca gtattctggc 2640
acaggccagc aaagacccga gagagcctct ctgcagttcc tgcagaacta cactgccctg 2700
gcctctgccg tggatgccat ggactttatc aacgacgcca ccgacgtgaa cgacgccctg 2760
ggctatgtga cccggtttta cagagaagcc tctagcggag ccgccaagaa gagactgctg 2820
ctgttcagcg acggcaactc ccaaggtgct acaccagccg ccattgagaa ggccgtgcaa 2880
gaagctcaga gagccggcat cgagatcttc gtggtggtcg tgggcagaca agtgaacgag 2940
cctcacatca gagtgctggt caccggcaag accgccgagt acgatgtggc ttatggcgag 3000
agccacctgt tcagagtgcc cagctatcag gctctgctga gaggcgtgtt ccaccagacc 3060
gtgtctagaa aggtggccct gggatga 3087
<210> 11
<211> 8835
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
atgacgctgc ggcttctggt ggccgcgctc tgcgccggga tcctggcaga ggcgccccga 60
gtgcgagccc agcacaggga gagagtgacc tgcacgcgcc tttacgccgc tgacattgtg 120
ttcttactgg atggctcctc atccattggc cgcagcaatt tccgcgaggt ccgcagcttt 180
ctcgaagggc tggtgctgcc tttctctgga gcagccagtg cacagggtgt gcgctttgcc 240
acagtgcagt acagcgatga cccacggaca gagttcggcc tggatgcact tggctctggg 300
ggtgatgtga tccgcgccat ccgtgagctt agctacaagg ggggcaacac tcgcacaggg 360
gctgcaattc tccatgtggc tgaccatgtc ttcctgcccc agctggcccg acctggtgtc 420
cccaaggtct gcatcctgat cacagacggg aagtcccagg acctggtgga cacagctgcc 480
caaaggctga aggggcaggg ggtcaagcta tttgctgtgg ggatcaagaa tgctgaccct 540
gaggagctga agcgagttgc ctcacagccc accagtgact tcttcttctt cgtcaatgac 600
ttcagcatct tgaggacact actgcccctc gtttcccgga gagtgtgcac gactgctggt 660
ggcgtgcctg tgacccgacc tccggatgac tcgacctctg ctccacgaga cctggtgctg 720
tctgagccaa gcagccaatc cttgagagta cagtggacag cggccagtgg ccctgtgact 780
ggctacaagg tccagtacac tcctctgacg gggctgggac agccactgcc gagtgagcgg 840
caggaggtga acgtcccagc tggtgagacc agtgtgcggc tgcggggtct ccggccactg 900
accgagtacc aagtgactgt gattgccctc tacgccaaca gcatcgggga ggctgtgagc 960
gggacagctc ggaccactgc cctagaaggg ccggaactga ccatccagaa taccacagcc 1020
cacagcctcc tggtggcctg gcggagtgtg ccaggtgcca ctggctaccg tgtgacatgg 1080
cgggtcctca gtggtgggcc cacacagcag caggagctgg gccctgggca gggttcagtg 1140
ttgctgcgtg acttggagcc tggcacggac tatgaggtga ccgtgagcac cctatttggc 1200
cgcagtgtgg ggcccgccac ttccctgatg gctcgcactg acgcttctgt tgagcagacc 1260
ctgcgcccgg tcatcctggg ccccacatcc atcctccttt cctggaactt ggtgcctgag 1320
gcccgtggct accggttgga atggcggcgt gagactggct tggagccacc gcagaaggtg 1380
gtactgccct ctgatgtgac ccgctaccag ttggatgggc tgcagccggg cactgagtac 1440
cgcctcacac tctacactct gctggagggc cacgaggtgg ccacccctgc aaccgtggtt 1500
cccactggac cagagctgcc tgtgagccct gtaacagacc tgcaagccac cgagctgccc 1560
gggcagcggg tgcgagtgtc ctggagccca gtccctggtg ccacccagta ccgcatcatt 1620
gtgcgcagca cccagggggt tgagcggacc ctggtgcttc ctgggagtca gacagcattc 1680
gacttggatg acgttcaggc tgggcttagc tacactgtgc gggtgtctgc tcgagtgggt 1740
ccccgtgagg gcagtgccag tgtcctcact gtccgccggg agccggaaac tccacttgct 1800
gttccagggc tgcgggttgt ggtgtcagat gcaacgcgag tgagggtggc ctggggaccc 1860
gtccctggag ccagtggatt tcggattagc tggagcacag gcagtggtcc ggagtccagc 1920
cagacactgc ccccagactc tactgccaca gacatcacag ggctgcagcc tggaaccacc 1980
taccaggtgg ctgtgtcggt actgcgaggc agagaggagg gccctgctgc agtcatcgtg 2040
gctcgaacgg acccactggg cccagtgagg acggtccatg tgactcaggc cagcagctca 2100
tctgtcacca ttacctggac cagggttcct ggcgccacag gatacagggt ttcctggcac 2160
tcagcccacg gcccagagaa atcccagttg gtttctgggg aggccacggt ggctgagctg 2220
gatggactgg agccagatac tgagtatacg gtgcatgtga gggcccatgt ggctggcgtg 2280
gatgggcccc ctgcctctgt ggttgtgagg actgcccctg agcctgtggg tcgtgtgtcg 2340
aggctgcaga tcctcaatgc ttccagcgac gttctacgga tcacctgggt aggggtcact 2400
ggagccacag cttacagact ggcctggggc cggagtgaag gcggccccat gaggcaccag 2460
atactcccag gaaacacaga ctctgcagag atccggggtc tcgaaggtgg agtcagctac 2520
tcagtgcgag tgactgcact tgtcggggac cgcgagggca cacctgtctc cattgttgtc 2580
actacgccgc ctgaggctcc gccagccctg gggacgcttc acgtggtgca gcgcggggag 2640
cactcgctga ggctgcgctg ggagccggtg cccagagcgc agggcttcct tctgcactgg 2700
caacctgagg gtggccagga acagtcccgg gtcctggggc ccgagctcag cagctatcac 2760
ctggacgggc tggagccagc gacacagtac cgcgtgaggc tgagtgtcct agggccagct 2820
ggagaagggc cctctgcaga ggtgactgcg cgcactgagt cacctcgtgt tccaagcatt 2880
gaactacgtg tggtggacac ctcgatcgac tcggtgactt tggcctggac tccagtgtcc 2940
agggcatcca gctacatcct atcctggcgg ccactcagag gccctggcca ggaagtgcct 3000
gggtccccgc agacacttcc agggatctca agctcccagc gggtgacagg gctagagcct 3060
ggcgtctctt acatcttctc cctgacgcct gtcctggatg gtgtgcgggg tcctgaggca 3120
tctgtcacac agacgccagt gtgcccccgt ggcctggcgg atgtggtgtt cctaccacat 3180
gccactcaag acaatgctca ccgtgcggag gctacgagga gggtcctgga gcgtctggtg 3240
ttggcacttg ggcctcttgg gccacaggca gttcaggttg gcctgctgtc ttacagtcat 3300
cggccctccc cactgttccc actgaatggc tcccatgacc ttggcattat cttgcaaagg 3360
atccgtgaca tgccctacat ggacccaagt gggaacaacc tgggcacagc cgtggtcaca 3420
gctcacagat acatgttggc accagatgct cctgggcgcc gccagcacgt accaggggtg 3480
atggttctgc tagtggatga acccttgaga ggtgacatat tcagccccat ccgtgaggcc 3540
caggcttctg ggcttaatgt ggtgatgttg ggaatggctg gagcggaccc agagcagctg 3600
cgtcgcttgg cgccgggtat ggactctgtc cagaccttct tcgccgtgga tgatgggcca 3660
agcctggacc aggcagtcag tggtctggcc acagccctgt gtcaggcatc cttcactact 3720
cagccccggc cagagccctg cccagtgtat tgtccaaagg gccagaaggg ggaacctgga 3780
gagatgggcc tgagaggaca agttgggcct cctggcgacc ctggcctccc gggcaggacc 3840
ggtgctcccg gcccccaggg gccccctgga agtgccactg ccaagggcga gaggggcttc 3900
cctggagcag atgggcgtcc aggcagccct ggccgcgccg ggaatcctgg gacccctgga 3960
gcccctggcc taaagggctc tccagggttg cctggccctc gtggggaccc gggagagcga 4020
ggacctcgag gcccaaaggg ggagccgggg gctcccggac aagtcatcgg aggtgaagga 4080
cctgggcttc ctgggcggaa aggggaccct ggaccatcgg gcccccctgg acctcgtgga 4140
ccactggggg acccaggacc ccgtggcccc ccagggcttc ctggaacagc catgaagggt 4200
gacaaaggcg atcgtgggga gcggggtccc cctggaccag gtgaaggtgg cattgctcct 4260
ggggagcctg ggctgccggg tcttcccgga agccctggac cccaaggccc cgttggcccc 4320
cctggaaaga aaggagaaaa aggtgactct gaggatggag ctccaggcct cccaggacaa 4380
cctgggtctc cgggtgagca gggcccacgg ggacctcctg gagctattgg ccccaaaggt 4440
gaccggggct ttccagggcc cctgggtgag gctggagaga agggcgaacg tggaccccca 4500
ggcccagcgg gatcccgggg gctgccaggg gttgctggac gtcctggagc caagggtcct 4560
gaagggccac caggacccac tggccgccaa ggagagaagg gggagcctgg tcgccctggg 4620
gaccctgcag tggtgggacc tgctgttgct ggacccaaag gagaaaaggg agatgtgggg 4680
cccgctgggc ccagaggagc taccggagtc caaggggaac ggggcccacc cggcttggtt 4740
cttcctggag accctggccc caagggagac cctggagacc ggggtcccat tggccttact 4800
ggcagagcag gacccccagg tgactcaggg cctcctggag agaagggaga ccctgggcgg 4860
cctggccccc caggacctgt tggcccccga ggacgagatg gtgaagttgg agagaaaggt 4920
gacgagggtc ctccgggtga cccgggtttg cctggaaaag caggcgagcg tggccttcgg 4980
ggggcacctg gagttcgggg gcctgtgggt gaaaagggag accagggaga tcctggagag 5040
gatggacgaa atggcagccc tggatcatct ggacccaagg gtgaccgtgg ggagccgggt 5100
cccccaggac ccccgggacg gctggtagac acaggacctg gagccagaga gaagggagag 5160
cctggggacc gcggacaaga gggtcctcga gggcccaagg gtgatcctgg cctccctgga 5220
gcccctgggg aaaggggcat tgaagggttt cggggacccc caggcccaca gggggaccca 5280
ggtgtccgag gcccagcagg agaaaagggt gaccggggtc cccctgggct ggatggccgg 5340
agcggactgg atgggaaacc aggagccgct gggccctctg ggccgaatgg tgctgcaggc 5400
aaagctgggg acccagggag agacgggctt ccaggcctcc gtggagaaca gggcctccct 5460
ggcccctctg gtccccctgg attaccggga aagccaggcg aggatggcaa acctggcctg 5520
aatggaaaaa acggagaacc tggggaccct ggagaagacg ggaggaaggg agagaaagga 5580
gattcaggcg cctctgggag agaaggtcgt gatggcccca agggtgagcg tggagctcct 5640
ggtatccttg gaccccaggg gcctccaggc ctcccagggc cagtgggccc tcctggccag 5700
ggttttcctg gtgtcccagg aggcacgggc cccaagggtg accgtgggga gactggatcc 5760
aaaggggagc agggcctccc tggagagcgt ggcctgcgag gagagcctgg aagtgtgccg 5820
aatgtggatc ggttgctgga aactgctggc atcaaggcat ctgccctgcg ggagatcgtg 5880
gagacctggg atgagagctc tggtagcttc ctgcctgtgc ccgaacggcg tcgaggcccc 5940
aagggggact caggcgaaca gggcccccca ggcaaggagg gccccatcgg ctttcctgga 6000
gaacgcgggc tgaagggcga ccgtggagac cctggccctc aggggccacc tggtctggcc 6060
cttggggaga ggggcccccc cgggccttcc ggccttgccg gggagcctgg aaagcctggt 6120
attcccgggc tcccaggcag ggctgggggt gtgggagagg caggaaggcc aggagagagg 6180
ggagaacggg gagagaaagg agaacgtgga gaacagggca gagatggccc tcctggactc 6240
cctggaaccc ctgggccccc cggaccccct ggccccaagg tgtctgtgga tgagccaggt 6300
cctggactct ctggagaaca gggaccccct ggactcaagg gtgctaaggg ggagccgggc 6360
agcaatggtg accaaggtcc caaaggagac aggggtgtgc caggcatcaa aggagaccgg 6420
ggagagcctg gaccgagggg tcaggacggc aacccgggtc taccaggaga gcgtggtatg 6480
gctgggcctg aagggaagcc gggtctgcag ggtccaagag gcccccctgg cccagtgggt 6540
ggtcatggag accctggacc acctggtgcc ccgggtcttg ctggccctgc aggaccccaa 6600
ggaccttctg gcctgaaggg ggagcctgga gagacaggac ctccaggacg gggcctgact 6660
ggacctactg gagctgtggg acttcctgga ccccccggcc cttcaggcct tgtgggtcca 6720
caggggtctc caggtttgcc tggacaagtg ggggagacag ggaagccggg agccccaggt 6780
cgagatggtg ccagtggaaa agatggagac agagggagcc ctggtgtgcc agggtcacca 6840
ggtctgcctg gccctgtcgg acctaaagga gaacctggcc ccacgggggc ccctggacag 6900
gctgtggtcg ggctccctgg agcaaaggga gagaagggag cccctggagg ccttgctgga 6960
gacctggtgg gtgagccggg agccaaaggt gaccgaggac tgccagggcc gcgaggcgag 7020
aagggtgaag ctggccgtgc aggggagccc ggagaccctg gggaagatgg tcagaaaggg 7080
gctccaggac ccaaaggttt caagggtgac ccaggagtcg gggtcccggg ctcccctggg 7140
cctcctggcc ctccaggtgt gaagggagat ctgggcctcc ctggcctgcc cggtgctcct 7200
ggtgttgttg ggttcccggg tcagacaggc cctcgaggag agatgggtca gccaggccct 7260
agtggagagc ggggtctggc aggcccccca gggagagaag gaatcccagg acccctgggg 7320
ccacctggac caccggggtc agtgggacca cctggggcct ctggactcaa aggagacaag 7380
ggagaccctg gagtagggct gcctgggccc cgaggcgagc gtggggagcc aggcatccgg 7440
ggtgaagatg gccgccccgg ccaggaggga ccccgaggac tcacggggcc ccctggcagc 7500
aggggagagc gtggggagaa gggtgatgtt gggagtgcag gactaaaggg tgacaaggga 7560
gactcagctg tgatcctggg gcctccaggc ccacggggtg ccaaggggga catgggtgaa 7620
cgagggcctc ggggcttgga tggtgacaaa ggacctcggg gagacaatgg ggaccctggt 7680
gacaagggca gcaagggaga gcctggtgac aagggctcag ccgggttgcc aggactgcgt 7740
ggactcctgg gaccccaggg tcaacctggt gcagcaggga tccctggtga cccgggatcc 7800
ccaggaaagg atggagtgcc tggtatccga ggagaaaaag gagatgttgg cttcatgggt 7860
ccccggggcc tcaagggtga acggggagtg aagggagcct gtggccttga tggagagaag 7920
ggagacaagg gagaagctgg tcccccaggc cgccccgggc tggcaggaca caaaggagag 7980
atgggggagc ctggtgtgcc gggccagtcg ggggcccctg gcaaggaggg cctgatcggt 8040
cccaagggtg accgaggctt tgacgggcag ccaggcccca agggtgacca gggcgagaaa 8100
ggggagcggg gaaccccagg aattgggggc ttcccaggcc ccagtggaaa tgatggctct 8160
gctggtcccc cagggccacc tggcagtgtt ggtcccagag gccccgaagg acttcagggc 8220
cagaagggtg agcgaggtcc ccccggagag agagtggtgg gggctcctgg ggtccctgga 8280
gctcctggcg agagagggga gcaggggcgg ccagggcctg ccggtcctcg aggcgagaag 8340
ggagaagctg cactgacgga ggatgacatc cggggctttg tgcgccaaga gatgagtcag 8400
cactgtgcct gccagggcca gttcatcgca tctggatcac gacccctccc tagttatgct 8460
gcagacactg ccggctccca gctccatgct gtgcctgtgc tccgcgtctc tcatgcagag 8520
gaggaagagc gggtaccccc tgaggatgat gagtactctg aatactccga gtattctgtg 8580
gaggagtacc aggaccctga agctccttgg gatagtgatg acccctgttc cctgccactg 8640
gatgagggct cctgcactgc ctacaccctg cgctggtacc atcgggctgt gacaggcagc 8700
acagaggcct gtcacccttt tgtctatggt ggctgtggag ggaatgccaa ccgttttggg 8760
acccgtgagg cctgcgagcg ccgctgccca ccccgggtgg tccagagcca ggggacaggt 8820
actgcccagg actga 8835
<210> 12
<211> 8835
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
atgaccctga gactgctggt ggctgccctg tgtgctggaa ttctggctga ggctcctaga 60
gtgcgggccc agcatagaga aagagtgacc tgtacacggc tgtacgccgc cgatatcgtg 120
tttctgctgg atggcagcag cagcatcggc cggtccaatt tcagagaagt gcggagcttt 180
ctggaaggcc tggtgctgcc tttttctggc gctgcttctg cccagggcgt cagatttgcc 240
accgtgcagt acagcgacga ccctagaaca gagtttggcc tggatgctct cggcagcggc 300
ggagatgtga tcagagccat cagagagctg agctacaaag gcggcaatac cagaacaggc 360
gccgctattc tgcacgtggc cgaccatgtt tttctgcccc aactggctag acccggcgtg 420
ccaaaagtgt gcatcctgat cacagacggc aagagccagg acctggtgga tacagccgct 480
cagagactga aaggacaggg cgtgaaactg ttcgccgtgg gcatcaagaa cgccgatcct 540
gaggaactga agagagtggc cagccagcct accagcgatt tcttcttctt cgtgaacgac 600
ttcagcatcc tgcggaccct gctgcctctg gtgtctagaa gagtgtgtac aacagccggc 660
ggagtgcctg tgaccagacc tcctgatgat agcacaagcg cccctagaga tctggtgctg 720
tctgagccaa gcagccagag tctgagagtg cagtggacag ctgctagcgg ccctgtgaca 780
ggctacaagg tgcagtatac acctctgaca ggcctgggcc agcctctgcc ttctgagaga 840
caagaagtga acgtcccagc cggcgaaaca tctgtcagac tgagaggact gaggcccctg 900
accgagtacc aagtgacagt gatcgccctg tacgccaatt ctatcggcga ggccgtgtct 960
ggcacagcca gaacaacagc tctggaagga ccagagctga ccatccagaa cacaacagcc 1020
cattctctgc tggttgcttg gagatctgtg cctggcgcca ccggctatag agtgacttgg 1080
agagttctga gcggaggccc cacacagcag caagaacttg gacctggaca gggctccgtg 1140
ctgctgagag atctcgagcc tggcaccgat tacgaagtga ccgtgtctac cctgttcggc 1200
agatctgtgg gacctgccac aagcctgatg gccagaacag atgccagcgt ggaacagacc 1260
ctgaggcctg tgattctggg ccctacatct atcctgctga gctggaatct ggtgcccgag 1320
gccagaggct atagactgga atggcggaga gaaaccggcc tggaacctcc tcagaaagtg 1380
gtcctgccta gcgacgtgac aagataccag ctggatggac tgcagcccgg caccgagtac 1440
agactgacac tgtatacact gctcgagggc cacgaagtgg ccacaccagc tacagttgtg 1500
ccaacaggac ctgagctgcc tgtgtctcct gtgactgatc tgcaggccac agaactgcct 1560
ggccagagag tcagagttag ctggtcacct gttccaggcg ccacacagta cagaatcatc 1620
gtgcggtcta cacagggcgt cgagagaaca ctggttctgc ctggaagcca gaccgccttc 1680
gatctggatg atgtgcaggc cggactgtcc tacacagtca gagtgtctgc cagagtgggc 1740
cctagagaag gatctgcctc tgtgctgacc gtgcggagag agcctgaaac accactggca 1800
gtgcctggac tgagagtggt ggtgtcagat gccaccagag ttagagtggc ttggggacca 1860
gttcctggcg cctctggctt tagaatcagc tggtctacag gctctggccc cgaaagctct 1920
cagacactgc ctccagatag caccgccacc gatattacag gcctgcagcc tggaactacc 1980
taccaggtgg ccgttagcgt gctgagagga agagaagaag gccctgccgc cgtcatcgtg 2040
gctagaactg atcctctggg acctgtgcgg acagtgcacg tgacacaagc ctctagcagc 2100
agcgtgacca tcacctggac aagagtgcca ggcgctacag gatacagagt gtcctggcat 2160
tctgctcacg gccctgagaa gtctcagctg gtgtctggcg aagccacagt ggctgaactc 2220
gacggactgg aacctgacac agagtatact gtgcacgtgc gggctcatgt ggctggtgtt 2280
gatggacctc ctgcttctgt ggtcgtcaga acagcccctg aacctgtggg aagagtgtcc 2340
agactgcaga tcctgaatgc cagcagcgac gtgctgagga tcacatgggt tggagtgacc 2400
ggcgccacag cttatagact cgcctggggt agaagcgaag gcggccctat gagacatcag 2460
atcctgcctg gcaataccga ctccgccgag attagaggcc ttgaaggcgg agtgtcttac 2520
agcgttagag tgacagccct cgtgggcgat agagaaggca cacctgtgtc catcgtggtc 2580
accacacctc cagaagctcc tccagctctg ggaacactgc atgtggtgca gagaggcgag 2640
cactctctga gactgagatg ggaacctgtg ccacgcgctc agggatttct gctgcattgg 2700
caaccagaag gcggacaaga gcagagcaga gtgctgggac cagaactgag cagctaccac 2760
ctcgatggac ttgagcctgc cactcagtat agagtcagac tgtcagtgct ggggcctgcc 2820
ggcgaaggac cttctgctga agtgacagct agaaccgagt ctcccagagt gcccagcatc 2880
gagctgagag tcgtggatac ctccatcgat agcgtgacac tggcctggac acccgtgtct 2940
agagccagct cttacatcct gtcttggcgg cctctcagag gaccaggcca agaagttcct 3000
ggatctccac agacactccc aggcatcagt agctcccaga gagtgactgg acttgaacca 3060
ggcgtgtcct acatcttcag cctgacacct gtgctggacg gcgttagagg acctgaagcc 3120
tctgtgaccc agactccagt gtgtcctaga ggactggccg atgtggtgtt cctgcctcac 3180
gctacacagg acaatgccca tagagccgag gccacaagac gcgtgctgga aagactggtt 3240
cttgcccttg gaccactggg acctcaggct gttcaagtgg gcctgctgtc ctactctcac 3300
agaccctctc cactgttccc tctgaacggc tctcacgacc tgggcatcat cctgcagaga 3360
atccgggaca tgccctacat ggacccctct ggcaacaatc tgggcacagc cgttgtgact 3420
gcccacagat atatgctggc cccagatgct cctggcagac gacaacatgt ccctggcgtt 3480
atggtgctgc tggtcgatga acccctgcgg ggcgatatct ttagccctat tagagaagcc 3540
caggccagcg gcctgaatgt ggttatgctt ggaatggctg gcgccgatcc agagcagctt 3600
agaaggcttg cccctggcat ggatagcgtg cagaccttct ttgccgtgga cgatggacct 3660
tctctggatc aggctgtgtc tggactggct acagcactgt gccaggcaag cttcaccaca 3720
cagcctagac ctgagccttg tccagtgtac tgccctaagg gacagaaggg cgaacctggc 3780
gaaatgggac ttagaggcca agtgggacca cctggcgatc ctggacttcc tggaagaact 3840
ggtgctcctg gacctcaagg tcctcctgga agtgccacag ccaagggcga aagaggattc 3900
cctggcgctg atggcagacc aggatctcct ggtagagccg gcaatcctgg aacacctggc 3960
gcaccaggac tcaaaggatc tccaggactg cctggaccta gaggcgatcc aggcgagaga 4020
ggaccaagag gtccaaaagg cgaacccggt gctccaggac aagtgattgg cggagaagga 4080
cccggattgc ccggaagaaa aggcgaccct ggaccaagtg gacctccagg acctagggga 4140
cctttgggag atcccggtcc aagaggccct cctggattgc ctggtacagc catgaagggc 4200
gacaaaggcg ataggggaga aagaggacca ccaggaccag gcgaaggtgg aattgctcct 4260
ggcgaaccag ggttgcctgg actccctggc tcacctggac cacaaggacc tgttggccca 4320
cctggaaaga aaggcgaaaa gggcgattct gaggatggcg ccccagggct tcctggacaa 4380
ccaggctctc caggcgaaca aggacccaga gggcctccag gtgctattgg ccctaaaggc 4440
gacagagggt ttcccggacc acttggagaa gctggcgaaa aaggcgaacg aggacctcct 4500
ggacctgccg gatctagagg acttccaggt gttgctggca gacctggcgc taaaggtcct 4560
gaaggcccac cagggcctac aggcagacaa ggcgagaaag gcgagccagg cagacccggc 4620
gatcctgctg ttgttggacc agctgttgca ggcccaaagg gcgagaaggg cgacgttgga 4680
cctgctggac caaggggagc tacaggcgtt caaggcgaaa ggggtccacc tggacttgtt 4740
ttgccgggcg atcccggacc taagggcgac cccggcgaca ggggaccaat tggattgaca 4800
ggcagagctg ggccaccagg cgatagtggg cctccaggcg aaaaaggcga tcctggtaga 4860
cctggacctc ctgggccagt tggaccaaga ggaagagatg gcgaagtcgg agagaaaggc 4920
gacgaaggtc ctccaggcga cccaggactc cctggaaaag caggcgaaag aggtcttaga 4980
ggcgctcctg gtgttagagg ccctgttgga gaaaagggcg accaaggcga ccctggcgag 5040
gatggaagaa atggctcccc tggatctagc ggcccaaaag gcgatcgcgg cgagcccggt 5100
ccaccgggtc caccaggcag gcttgttgat actggacccg gcgctcgtga aaaaggcgag 5160
cccggcgatc gtggacaaga aggcccaaga ggacccaagg gcgatccggg actgccaggt 5220
gcaccaggcg agcgaggtat tgaaggattc agaggccctc caggaccaca aggcgatccc 5280
ggtgtcagag gacctgctgg cgagaagggc gatagaggtc ctccaggact ggatggcaga 5340
tccggacttg atggaaaacc cggcgcagct ggcccttctg gacctaatgg tgcagccgga 5400
aaagctggcg acccaggcag agatggattg ccaggattga ggggagaaca gggactcccc 5460
ggaccttctg ggccgcctgg gttgcccgga aagcctggcg aagatggcaa acctggcctg 5520
aacggcaaaa acggcgaacc gggcgatcca ggcgaagatg gcagaaaggg cgaaaaaggc 5580
gacagcggag cctctggccg agagggtaga gatggaccta aaggcgagag gggcgctcct 5640
ggaattttgg gaccccaagg accgcctggg ctgccaggtc cagttgggcc tcctggtcaa 5700
ggttttcctg gtgtcccagg cggaactgga ccaaaaggcg atagaggcga aacaggctct 5760
aagggcgagc aaggacttcc tggcgaacgt ggactgagag gcgaacctgg aagcgtgccc 5820
aatgtggaca gactcctgga aaccgccgga atcaaagcca gcgctctgcg ggaaatcgtg 5880
gaaacctggg atgagagcag cggctctttt ctgcctgtgc ctgaaagaag aaggggaccg 5940
aaaggcgatt ctggcgaaca aggtccacct ggcaaagagg gccctatcgg atttcccggc 6000
gagcggggtc ttaaaggcga ccggggagat ccgggacctc aagggccacc aggacttgct 6060
cttggagaaa gaggtcctcc ggggccatct ggacttgctg gcgagcctgg aaaacctgga 6120
ataccaggac ttcccggcag agcaggcgga gttggagagg ccggacgacc tggcgaacgc 6180
ggagaaaggg gagagaaggg cgagcgaggc gaacagggac gagatggacc accggggctc 6240
cctggaactc ctggaccgcc aggaccacct ggtcctaaag tgtcagtgga tgagcctgga 6300
ccaggtctta gcggagaaca aggacctcca ggcctgaaag gcgctaaggg cgaaccaggt 6360
tcaaatggcg atcagggacc caaaggcgat cggggcgttc caggcattaa gggcgaccgt 6420
ggcgaaccag gacctagagg acaagatggc aatcccggac tgcctggcga aagaggaatg 6480
gccggacctg agggaaagcc agggctgcaa gggcctcgcg ggccacctgg gcctgtcgga 6540
ggacatggcg accccggacc accaggtgct cccggacttg ctggaccagc aggacctcaa 6600
ggaccatctg gacttaaagg cgaaccaggc gaaacagggc caccaggcag aggacttaca 6660
ggacctacag gtgctgttgg gttgcctggt ccaccagggc caagtggact tgttggtcct 6720
caaggttcac ctggactgcc cggacaagtg ggagaaactg gcaaaccagg cgcacctggg 6780
cgagatggcg catctggaaa agacggcgat cgaggtagcc ctggtgttcc cggttctcct 6840
gggctcccag gacctgtggg ccccaagggc gaacccggac caactggcgc acctggtcaa 6900
gcagttgttg gattgcctgg cgcaaagggc gagaaaggtg ctccaggcgg attggctggc 6960
gatcttgttg gagaaccagg tgccaaaggc gacaggggct tgccaggtcc taggggagag 7020
aaaggcgaag ctggtagagc aggcgagcct ggcgatcccg gcgaggacgg acaaaaaggt 7080
gcccctgggc ctaaaggctt taagggcgat cctggtgtcg gcgtcccagg ttctcctgga 7140
ccacctgggc cgccaggcgt taagggcgat ttgggacttc ctgggctgcc tggcgctcct 7200
ggcgttgtgg gatttccagg acaaactggc cctcggggag aaatgggtca acctgggcct 7260
agcggagaaa gaggccttgc cggacctcct ggaagagagg gaatacctgg accacttgga 7320
ccgcctggac ctccaggttc tgttggacct cctggcgctt caggattgaa gggcgataag 7380
ggcgaccctg gtgttggact tcccggtcct cgtggcgaaa ggggagaacc aggcattaga 7440
ggcgaagatg gacggcctgg acaagaggga cctagaggtc ttacaggccc accaggctct 7500
agaggcgaaa ggggcgagaa aggcgacgtg ggttctgcag gacttaaggg cgacaagggc 7560
gattccgctg tgattttggg accaccggga ccaagaggcg ctaaaggcga tatgggcgag 7620
agaggcccta gaggcctgga tggcgataag gggccaagag gcgacaacgg cgacccaggc 7680
gataagggat ctaaaggcga acccggcgat aagggctctg ctggactgcc aggacttcga 7740
ggacttctgg gtccacaagg ccaacctggc gccgcaggca ttcccggcga tccgggttct 7800
cctggcaaag atggtgttcc tggcatcagg ggcgaaaagg gcgacgtcgg ttttatgggc 7860
cctcgcggat tgaaaggcga gagaggtgtt aagggcgcct gtggacttga cggcgaaaaa 7920
ggcgataagg gcgaagctgg acctcctggc agacctggat tggctggaca caagggcgag 7980
atgggagagc ccggtgttcc tggacaaagt ggcgcccctg gaaaagaagg actgatcggt 8040
ccaaagggcg accgcggatt tgatggccaa ccgggtccta aaggcgatca gggcgagaaa 8100
ggcgaaagag gcactcctgg catcggaggc tttccaggac caagcggcaa tgatggatct 8160
gctggcccgc cagggcctcc tggatctgtt ggtccaagag gaccagaagg cctgcaggga 8220
caaaaaggcg agcgcggacc accaggcgaa agagttgttg gagcacccgg cgttcccggt 8280
gctcccggcg aaagaggcga acaaggcaga cctggaccag ctggccctag aggcgaaaaa 8340
ggggaagccg ctctgaccga ggacgatatc agaggctttg tgcggcaaga gatgagccag 8400
cattgtgcct gtcaggggca gtttatcgcc agcggttcta gacctctgcc tagctatgcc 8460
gctgataccg ccggatctca gctgcatgct gtgcctgtgc ttagagtgtc tcacgccgag 8520
gaagaggaaa gagtccctcc agaggacgac gagtactccg agtatagcga gtactctgtg 8580
gaagagtatc aggaccccga ggctccttgg gatagcgacg atccatgttc tctgccactg 8640
gatgagggca gctgtaccgc ctacacactg aggtggtatc acagagccgt gaccggaagc 8700
accgaggcct gccatccttt tgtttatggc ggctgcggcg gcaacgccaa tagatttgga 8760
acaagagagg cctgcgagcg gagatgccct ccaagagtgg ttcagtctca aggcaccggc 8820
actgcccagg actaa 8835
<210> 13
<211> 4494
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
atggatgtaa ccaagaaaaa caaacgagat ggaactgaag tcactgagag aattgtcact 60
gaaacagtaa ccacaagact tacatcctta ccaccaaaag gcgggaccag caatggctat 120
gctaaaacag cctctcttgg tggagggagc cggctggaga aacaaagcct gactcatggc 180
agcagcggct acataaactc aactggaagc acacgaggcc atgcctccac ctctagttac 240
aggagggctc actcacctgc ctccactctg cccaactccc caggctcaac ctttgaaagg 300
aaaactcacg ttacccgcca tgcgtatgaa gggagctcca gtggcaactc ttctccggag 360
taccctcgga aggaatttgc atcttcttca accagaggac ggagtcaaac acgagagagt 420
gaaattcgag ttcgactgca gagtgcgtcc ccatccaccc gatggacaga attggatgat 480
gttaagcgtt tgctcaaggg gagtcgatcg gcaagtgtga gccccacccg gaattcctcc 540
aacacactcc ccatccccaa gaaaggcact gtggagacca aaattgtgac agcgagctcc 600
cagtcggtgt caggcaccta cgatgcaacg atcctggatg ccaaccttcc ctcccatgtg 660
tggtcctcca ccctgcccgc ggggtcctcc atggggacct atcacaacaa catgacaacc 720
cagagctcat ccctcctcaa caccaatgcc tactctgcgg gatcagtctt cggagttcca 780
aacaacatgg cgtcctgctc acccactttg caccctggac tcagcacatc ctcctcagtg 840
tttggcatgc agaacaatct ggcccccagc ttgaccaccc tgtcccatgg caccaccacc 900
acttccacag catatggggt gaagaaaaac atgccccaga gtcctgcggc tgtgaacact 960
ggcgtttcca cctccgccgc ctgcaccaca agtgtgcaga gcgatgacct tttgcacaag 1020
gactgcaagt tcctgatcct agagaaagac aacacacctg ccaagaagga gatggagctg 1080
ctcatcatga ccaaggacag cgggaaggtc tttacagcct cccctgccag catcgctgca 1140
acttcttttt cagaagacac cctaaaaaaa gaaaagcaag ctgcctacaa tgctgactca 1200
ggcctaaaag ccgaagctaa tggagacctg aagactgtgt ccacaaaggg caagaccacc 1260
actgcagata tccacagcta cggcagcagt ggtggtggtg gcagtggagg aggtggcggt 1320
gttggtggcg ctggcggcgg cccttgggga ccagcgccag cctggtgccc ctgcggctcc 1380
tgctgcagct ggtggaagtg gctgctgggc ctgctgctca cctggctgct actcctgggg 1440
ctgctcttcg gcctcattgc tctggcggag gaggtgagga agctgaaggc gcgtgtggat 1500
gagctggaga ggatcaggag gagcatactg ccctatgggg acagcatgga tagaatagaa 1560
aaggaccgcc tccagggcat ggcacccgcg gcgggagcag acctggacaa aattgggctg 1620
cacagtgaca gccaggagga gctctggatg ttcgtgagga agaagctaat gatggaacag 1680
gaaaatggaa atctccgagg aagccctggc cctaaaggtg acatgggaag tccaggccct 1740
aaaggagatc gagggttccc tgggactcca ggtatccctg ggcccttggg ccacccaggt 1800
ccacaaggac caaagggtca aaaaggcagc gtgggagatc ctggcatgga aggccccatg 1860
ggccagagag ggcgagaagg ccccatggga cctcgtggtg aggcagggcc tcctggatct 1920
ggagagaaag gggaaagagg ggctgctggt gaaccaggtc ctcatggccc acctggtgtc 1980
ccaggttctg tgggtcccaa aggttccagc ggctctcctg gcccacaggg ccctccaggt 2040
cctgtaggtc tccaagggct ccgaggtgaa gtaggacttc ctggtgtcaa aggtgacaaa 2100
ggaccaatgg gaccaccagg acccaaaggt gaccagggtg agaaaggacc tcgaggcctc 2160
acaggcgagc ctggcatgag aggtttgcct ggtgctgttg gtgagcccgg ggctaaagga 2220
gcaatgggtc ctgctggccc agacggacac caaggcccaa gaggtgaaca aggtcttact 2280
gggatgcctg gaatccgtgg cccaccagga ccttctggag acccaggaaa gccaggtctc 2340
acaggacccc agggacctca gggacttccc ggtacccctg gccgaccagg aataaaaggt 2400
gaaccaggag ctccaggcaa gatcgtgact tcggaggggt catcgatgct cactgtccca 2460
ggccccccag gacctcctgg agccatggga cccccaggac ctccaggtgc cccaggccct 2520
gccggcccag ctggtctccc aggacatcaa gaagttctta atttacaagg tcccccaggc 2580
ccacccggcc cacgcgggcc accagggcct tccattccag gcccaccagg accccgaggc 2640
ccaccagggg agggtttgcc aggcccacca ggcccaccag gatcgttcct gtccaactca 2700
gaaaccttcc tctccggccc cccaggccca cctggccccc caggtcccaa gggagaccaa 2760
ggtcccccag gccccagagg acaccaaggc gagcaaggcc tcccaggttt ctcaacctca 2820
gggtccagtt ctttcggact caaccttcag ggaccaccag gcccacctgg cccccaggga 2880
cccaaaggtg acaaaggtga tccaggtgtt ccaggggctc ttggcattcc tagtggtcct 2940
tctgaagggg gatcatcaag taccatgtac gtgtcaggcc cgccagggcc ccctgggccc 3000
cctgggcctc cgggctctat cagcagctct ggccaggaga ttcagcagta catctctgag 3060
tacatgcaga gtgacagtat tagatcttac ctatccggag ttcagggtcc cccaggccca 3120
cctggtcccc caggacctgt caccaccatc acaggcgaga ctttcgacta ctcagagctg 3180
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tccatctctt ctgaagacat tctggctgtg ctgcagcggg atgacgtgcg tcagtaccta 3300
cgtcagtact tgatgggccc tcggggtccg ccagggccac caggagccag tggagatggg 3360
tccctcctgt ctttggacta tgcagagctg agtagtcgca ttctcagcta catgtcgagt 3420
tctgggatca gcattgggct tcctggtccc ccggggcccc ctggcttgcc gggaacctcc 3480
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agcttcattg ttggcccccc aggccctcct gggccgcagg gaccccctgg ggacagccgc 3840
ctcctgtcca cggatgcctc ccacagtcgg ggtagcagct cctcctcaca cagctcatct 3900
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ctgggtgcag gcggtgcctt tggtgaagct gcaggagaca ggggtcccta tggcactgac 4020
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ggactattgg gagctgactt tgctggagat ctggattaca atgagctggc tgtgagggtg 4140
tcagagagca tgcagcgtca gggcctactg caagggatgg cctacactgt ccagggccca 4200
ccaggccagc ctgggccaca ggggccaccc ggcatcagca aggtcttctc tgcctacagc 4260
aacgtgactg cggacctcat ggacttcttc caaacttatg gagccattca aggaccccct 4320
gggcaaaaag gagagatggg cactccagga cccaaaggtg acaggggccc tgctgggcca 4380
ccaggtcatc ctgggccacc tggccctcga ggacacaagg gagaaaaagg agacaaaggt 4440
gaccaagtct atgctgggcg gagaaggaga agaagtattg ctgtcaagcc gtga 4494
<210> 14
<211> 4494
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
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gaaaccgtga ccaccagact gaccagcctg cctcctaaag gcggcacctc taatggctac 120
gccaagacag cttctctcgg cggaggcagc agactggaaa agcagtctct gacacacggc 180
agcagcggct acatcaatag caccggctct acaagaggcc acgccagcac aagcagctac 240
agaagggctc acagccctgc cagcacactg cctaatagcc caggcagcac cttcgagaga 300
aagacccacg tgaccagaca cgcctacgag ggctctagca gcggcaatag cagccctgag 360
taccccagaa aagagttcgc cagcagcagc accagaggca gaagccagac acgggaaagc 420
gagatcagag tgcggctgca gtctgctagc cctagcacca gatggaccga gctggacgac 480
gtgaagaggc tgctgaaggg aagcagatcc gccagcgtgt cccctaccag aaacagcagc 540
aacaccctgc ctattcctaa gaaaggcacc gtcgagacta agatcgtgac agccagcagc 600
cagagcgtgt ccggcacata cgatgccaca atcctggacg ccaacctgcc tagccatgtg 660
tggtcctcta cactgcctgc cggaagcagc atgggcacct accacaacaa catgaccaca 720
cagagcagca gcctgctgaa caccaatgcc tactctgccg gctccgtgtt cggcgtgcca 780
aacaatatgg ccagctgcag ccctacactg caccctggcc tgagcacaag ctcctccgtg 840
tttggaatgc agaacaatct ggcccctagc ctgacaaccc tgagccacgg aacaaccacc 900
accagcacag cctacggcgt gaagaaaaac atgcctcagt ctccagccgc cgtgaacaca 960
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gactgcaagt ttctgatcct ggaaaaggac aacacgcccg ccaagaaaga gatggaactg 1080
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acaagcttta gcgaggacac cctgaagaaa gaaaagcagg ccgcctacaa cgccgactct 1200
ggactgaaag ccgaggccaa cggcgacctg aaaaccgtgt ctaccaaggg caagaccacc 1260
accgccgaca tccacagcta tggatctagc ggaggcggag gatctggtgg tggcggcgga 1320
gttggaggtg ctggcggagg accttgggga cctgctcctg cttggtgtcc ttgtggctcc 1380
tgttgcagct ggtggaagtg gctgcttggc ctgctgctga cttggctgct tcttctgggc 1440
ctgctgtttg gcctgattgc cctggctgag gaagtgcgga agctgaaggc cagagtggat 1500
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aaggacagac tgcaaggcat ggctccagca gctggcgccg atctggataa gatcggactg 1620
cacagcgaca gccaagagga actctggatg ttcgtgcgga agaaactgat gatggaacaa 1680
gagaacggca acctgagagg cagccctgga cctaagggcg atatgggaag cccaggacca 1740
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cccggatctg tgggccctaa gggatcttct ggttcccctg gaccacaagg cccacctgga 2040
cctgttggac tccaaggact gaggggcgaa gttggactgc caggcgtcaa gggcgacaag 2100
ggtccaatgg gaccacctgg tccaaagggc gatcagggcg aaaagggacc tagaggactg 2160
acaggcgagc ccggaatgag aggacttcct ggtgctgttg gagagcctgg cgctaaaggt 2220
gctatgggac ctgcaggccc cgacggacat caaggaccta ggggagaaca gggcctgacc 2280
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cctccaggcg aaggattgcc aggtcctcca gggccacctg gcagctttct gagcaacagc 2700
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His
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Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp
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Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro
85 90 95
Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly
100 105 110
Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro
115 120 125
Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro
130 135 140
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala
145 150 155 160
Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser
165 170 175
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Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro
195 200 205
Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly
210 215 220
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Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro
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260 265 270
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Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro
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500 505 510
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1605 1610 1615
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
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2580 2585 2590
Gly Ile Pro Gly Asp Pro Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Pro Gly
2595 2600 2605
Ile Arg Gly Glu Lys Gly Asp Val Gly Phe Met Gly Pro Arg Gly Leu
2610 2615 2620
Lys Gly Glu Arg Gly Val Lys Gly Ala Cys Gly Leu Asp Gly Glu Lys
2625 2630 2635 2640
Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly Pro Pro Gly Arg Pro Gly Leu Ala Gly
2645 2650 2655
His Lys Gly Glu Met Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly Gln Ser Gly Ala
2660 2665 2670
Pro Gly Lys Glu Gly Leu Ile Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Asp
2675 2680 2685
Gly Gln Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly
2690 2695 2700
Thr Pro Gly Ile Gly Gly Phe Pro Gly Pro Ser Gly Asn Asp Gly Ser
2705 2710 2715 2720
Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Val Gly Pro Arg Gly Pro Glu
2725 2730 2735
Gly Leu Gln Gly Gln Lys Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Arg Val
2740 2745 2750
Val Gly Ala Pro Gly Val Pro Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Glu Gln
2755 2760 2765
Gly Arg Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Lys Gly Glu Ala Ala
2770 2775 2780
Leu Thr Glu Asp Asp Ile Arg Gly Phe Val Arg Gln Glu Met Ser Gln
2785 2790 2795 2800
His Cys Ala Cys Gln Gly Gln Phe Ile Ala Ser Gly Ser Arg Pro Leu
2805 2810 2815
Pro Ser Tyr Ala Ala Asp Thr Ala Gly Ser Gln Leu His Ala Val Pro
2820 2825 2830
Val Leu Arg Val Ser His Ala Glu Glu Glu Glu Arg Val Pro Pro Glu
2835 2840 2845
Asp Asp Glu Tyr Ser Glu Tyr Ser Glu Tyr Ser Val Glu Glu Tyr Gln
2850 2855 2860
Asp Pro Glu Ala Pro Trp Asp Ser Asp Asp Pro Cys Ser Leu Pro Leu
2865 2870 2875 2880
Asp Glu Gly Ser Cys Thr Ala Tyr Thr Leu Arg Trp Tyr His Arg Ala
2885 2890 2895
Val Thr Gly Ser Thr Glu Ala Cys His Pro Phe Val Tyr Gly Gly Cys
2900 2905 2910
Gly Gly Asn Ala Asn Arg Phe Gly Thr Arg Glu Ala Cys Glu Arg Arg
2915 2920 2925
Cys Pro Pro Arg Val Val Gln Ser Gln Gly Thr Gly Thr Ala Gln Asp
2930 2935 2940
<210> 21
<211> 1497
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Met Asp Val Thr Lys Lys Asn Lys Arg Asp Gly Thr Glu Val Thr Glu
1 5 10 15
Arg Ile Val Thr Glu Thr Val Thr Thr Arg Leu Thr Ser Leu Pro Pro
20 25 30
Lys Gly Gly Thr Ser Asn Gly Tyr Ala Lys Thr Ala Ser Leu Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Arg Leu Glu Lys Gln Ser Leu Thr His Gly Ser Ser Gly Tyr
50 55 60
Ile Asn Ser Thr Gly Ser Thr Arg Gly His Ala Ser Thr Ser Ser Tyr
65 70 75 80
Arg Arg Ala His Ser Pro Ala Ser Thr Leu Pro Asn Ser Pro Gly Ser
85 90 95
Thr Phe Glu Arg Lys Thr His Val Thr Arg His Ala Tyr Glu Gly Ser
100 105 110
Ser Ser Gly Asn Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Lys Glu Phe Ala Ser
115 120 125
Ser Ser Thr Arg Gly Arg Ser Gln Thr Arg Glu Ser Glu Ile Arg Val
130 135 140
Arg Leu Gln Ser Ala Ser Pro Ser Thr Arg Trp Thr Glu Leu Asp Asp
145 150 155 160
Val Lys Arg Leu Leu Lys Gly Ser Arg Ser Ala Ser Val Ser Pro Thr
165 170 175
Arg Asn Ser Ser Asn Thr Leu Pro Ile Pro Lys Lys Gly Thr Val Glu
180 185 190
Thr Lys Ile Val Thr Ala Ser Ser Gln Ser Val Ser Gly Thr Tyr Asp
195 200 205
Ala Thr Ile Leu Asp Ala Asn Leu Pro Ser His Val Trp Ser Ser Thr
210 215 220
Leu Pro Ala Gly Ser Ser Met Gly Thr Tyr His Asn Asn Met Thr Thr
225 230 235 240
Gln Ser Ser Ser Leu Leu Asn Thr Asn Ala Tyr Ser Ala Gly Ser Val
245 250 255
Phe Gly Val Pro Asn Asn Met Ala Ser Cys Ser Pro Thr Leu His Pro
260 265 270
Gly Leu Ser Thr Ser Ser Ser Val Phe Gly Met Gln Asn Asn Leu Ala
275 280 285
Pro Ser Leu Thr Thr Leu Ser His Gly Thr Thr Thr Thr Ser Thr Ala
290 295 300
Tyr Gly Val Lys Lys Asn Met Pro Gln Ser Pro Ala Ala Val Asn Thr
305 310 315 320
Gly Val Ser Thr Ser Ala Ala Cys Thr Thr Ser Val Gln Ser Asp Asp
325 330 335
Leu Leu His Lys Asp Cys Lys Phe Leu Ile Leu Glu Lys Asp Asn Thr
340 345 350
Pro Ala Lys Lys Glu Met Glu Leu Leu Ile Met Thr Lys Asp Ser Gly
355 360 365
Lys Val Phe Thr Ala Ser Pro Ala Ser Ile Ala Ala Thr Ser Phe Ser
370 375 380
Glu Asp Thr Leu Lys Lys Glu Lys Gln Ala Ala Tyr Asn Ala Asp Ser
385 390 395 400
Gly Leu Lys Ala Glu Ala Asn Gly Asp Leu Lys Thr Val Ser Thr Lys
405 410 415
Gly Lys Thr Thr Thr Ala Asp Ile His Ser Tyr Gly Ser Ser Gly Gly
420 425 430
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly Gly Pro
435 440 445
Trp Gly Pro Ala Pro Ala Trp Cys Pro Cys Gly Ser Cys Cys Ser Trp
450 455 460
Trp Lys Trp Leu Leu Gly Leu Leu Leu Thr Trp Leu Leu Leu Leu Gly
465 470 475 480
Leu Leu Phe Gly Leu Ile Ala Leu Ala Glu Glu Val Arg Lys Leu Lys
485 490 495
Ala Arg Val Asp Glu Leu Glu Arg Ile Arg Arg Ser Ile Leu Pro Tyr
500 505 510
Gly Asp Ser Met Asp Arg Ile Glu Lys Asp Arg Leu Gln Gly Met Ala
515 520 525
Pro Ala Ala Gly Ala Asp Leu Asp Lys Ile Gly Leu His Ser Asp Ser
530 535 540
Gln Glu Glu Leu Trp Met Phe Val Arg Lys Lys Leu Met Met Glu Gln
545 550 555 560
Glu Asn Gly Asn Leu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Met Gly
565 570 575
Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Ile
580 585 590
Pro Gly Pro Leu Gly His Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Gln Lys
595 600 605
Gly Ser Val Gly Asp Pro Gly Met Glu Gly Pro Met Gly Gln Arg Gly
610 615 620
Arg Glu Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Glu Ala Gly Pro Pro Gly Ser
625 630 635 640
Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Pro His Gly
645 650 655
Pro Pro Gly Val Pro Gly Ser Val Gly Pro Lys Gly Ser Ser Gly Ser
660 665 670
Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Leu Gln Gly Leu Arg
675 680 685
Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Pro Met Gly
690 695 700
Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu Lys Gly Pro Arg Gly Leu
705 710 715 720
Thr Gly Glu Pro Gly Met Arg Gly Leu Pro Gly Ala Val Gly Glu Pro
725 730 735
Gly Ala Lys Gly Ala Met Gly Pro Ala Gly Pro Asp Gly His Gln Gly
740 745 750
Pro Arg Gly Glu Gln Gly Leu Thr Gly Met Pro Gly Ile Arg Gly Pro
755 760 765
Pro Gly Pro Ser Gly Asp Pro Gly Lys Pro Gly Leu Thr Gly Pro Gln
770 775 780
Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Thr Pro Gly Arg Pro Gly Ile Lys Gly
785 790 795 800
Glu Pro Gly Ala Pro Gly Lys Ile Val Thr Ser Glu Gly Ser Ser Met
805 810 815
Leu Thr Val Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Met Gly Pro Pro
820 825 830
Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly
835 840 845
His Gln Glu Val Leu Asn Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
850 855 860
Arg Gly Pro Pro Gly Pro Ser Ile Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly
865 870 875 880
Pro Pro Gly Glu Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Phe
885 890 895
Leu Ser Asn Ser Glu Thr Phe Leu Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
900 905 910
Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His
915 920 925
Gln Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Phe Ser Thr Ser Gly Ser Ser Ser
930 935 940
Phe Gly Leu Asn Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly
945 950 955 960
Pro Lys Gly Asp Lys Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly Ala Leu Gly Ile
965 970 975
Pro Ser Gly Pro Ser Glu Gly Gly Ser Ser Ser Thr Met Tyr Val Ser
980 985 990
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ile Ser
995 1000 1005
Ser Ser Gly Gln Glu Ile Gln Gln Tyr Ile Ser Glu Tyr Met Gln Ser
1010 1015 1020
Asp Ser Ile Arg Ser Tyr Leu Ser Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro
1025 1030 1035 1040
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Thr Thr Ile Thr Gly Glu Thr Phe Asp
1045 1050 1055
Tyr Ser Glu Leu Ala Ser His Val Val Ser Tyr Leu Arg Thr Ser Gly
1060 1065 1070
Tyr Gly Val Ser Leu Phe Ser Ser Ser Ile Ser Ser Glu Asp Ile Leu
1075 1080 1085
Ala Val Leu Gln Arg Asp Asp Val Arg Gln Tyr Leu Arg Gln Tyr Leu
1090 1095 1100
Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ser Gly Asp Gly
1105 1110 1115 1120
Ser Leu Leu Ser Leu Asp Tyr Ala Glu Leu Ser Ser Arg Ile Leu Ser
1125 1130 1135
Tyr Met Ser Ser Ser Gly Ile Ser Ile Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly
1140 1145 1150
Pro Pro Gly Leu Pro Gly Thr Ser Tyr Glu Glu Leu Leu Ser Leu Leu
1155 1160 1165
Arg Gly Ser Glu Phe Arg Gly Ile Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1170 1175 1180
Pro Pro Gly Ile Pro Gly Asn Val Trp Ser Ser Ile Ser Val Glu Asp
1185 1190 1195 1200
Leu Ser Ser Tyr Leu His Thr Ala Gly Leu Ser Phe Ile Pro Gly Pro
1205 1210 1215
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Val Ser
1220 1225 1230
Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Ala Ala Glu Asn Ser Asp Ser Phe Arg Ser
1235 1240 1245
Glu Leu Ile Ser Tyr Leu Thr Ser Pro Asp Val Arg Ser Phe Ile Val
1250 1255 1260
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Asp Ser Arg
1265 1270 1275 1280
Leu Leu Ser Thr Asp Ala Ser His Ser Arg Gly Ser Ser Ser Ser Ser
1285 1290 1295
His Ser Ser Ser Val Arg Arg Gly Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Met Ser
1300 1305 1310
Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ala Gly Gly Ala Phe Gly
1315 1320 1325
Glu Ala Ala Gly Asp Arg Gly Pro Tyr Gly Thr Asp Ile Gly Pro Gly
1330 1335 1340
Gly Gly Tyr Gly Ala Ala Ala Glu Gly Gly Met Tyr Ala Gly Asn Gly
1345 1350 1355 1360
Gly Leu Leu Gly Ala Asp Phe Ala Gly Asp Leu Asp Tyr Asn Glu Leu
1365 1370 1375
Ala Val Arg Val Ser Glu Ser Met Gln Arg Gln Gly Leu Leu Gln Gly
1380 1385 1390
Met Ala Tyr Thr Val Gln Gly Pro Pro Gly Gln Pro Gly Pro Gln Gly
1395 1400 1405
Pro Pro Gly Ile Ser Lys Val Phe Ser Ala Tyr Ser Asn Val Thr Ala
1410 1415 1420
Asp Leu Met Asp Phe Phe Gln Thr Tyr Gly Ala Ile Gln Gly Pro Pro
1425 1430 1435 1440
Gly Gln Lys Gly Glu Met Gly Thr Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly
1445 1450 1455
Pro Ala Gly Pro Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His
1460 1465 1470
Lys Gly Glu Lys Gly Asp Lys Gly Asp Gln Val Tyr Ala Gly Arg Arg
1475 1480 1485
Arg Arg Arg Ser Ile Ala Val Lys Pro
1490 1495
<210> 22
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
gaattcgtcg attcggttgc agcatttaaa gcggttgaca actttaaaag aaggaaaaag 60
aaggttgaag aaaagggtgt agtaagtaag tataagtaca gaccggagaa gtacgccggt 120
cctgattcgt ttaatttgaa agaagaaa 148
<210> 23
<211> 491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
gttattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt 60
cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt 120
gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc 180
gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc 240
acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat 300
agttgtggaa agagtcaaat ggctcacctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc 360
ccagaaggta ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg 420
tgtttagtcg aggttaaaaa gcgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt 480
tgaaaaacac g 491
<210> 24
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
agggccaaga ggggcagcgg cgagggcagg ggcagcctgc tgacctgcgg cgacgtggag 60
gagaaccccg gcccc 75
<210> 25
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 26
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60
cctggacct 69
<210> 27
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60
tccaaccctg gacct 75
<210> 28
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 29
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 30
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 31
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 32
<211> 8565
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
atgttcagct tcgtggacct gagactgctg ctgctcctgg ctgctacagc cctgctgaca 60
cacggacaag aggaaggcca ggtcgaagga caggacgagg acatccctcc tatcacctgt 120
gtgcagaacg gcctgagata ccacgaccgg gatgtgtgga agcccgagcc ttgcagaatc 180
tgcgtgtgcg acaatggcaa ggtgctgtgc gacgacgtga tctgcgacga gacaaagaat 240
tgccctggcg ccgaagtgcc tgagggcgaa tgttgtcctg tgtgccctga tggcagcgag 300
agccccacag atcaagagac aacaggcgtg gaaggcccca agggcgatac aggacctaga 360
ggtcctagag gacctgccgg acctcctggc agagatggaa ttcctggaca gcctggactg 420
cccggaccac ctggacctcc agggcctcca ggtccaccag gactcggagg aaattttgcc 480
ccacagctga gctacggcta cgacgagaaa agcacaggcg gcatctctgt gcctggacct 540
atgggacctt ctggcccaag aggacttcct ggtcctcctg gtgctccagg acctcaggga 600
tttcaaggac caccaggcga acctggcgaa ccaggcgcta gtggtccaat gggaccaaga 660
ggccctcctg ggccaccagg caaaaatggc gacgatggcg aagccggaaa gcctggaagg 720
cctggcgaaa gaggcccgcc aggaccgcaa ggcgctagag ggttgcctgg aactgcagga 780
ctgcctggca tgaagggcca cagaggcttt tctggactgg atggcgctaa gggcgacgct 840
ggaccagcag gacctaaagg cgagcctgga tctcctggcg agaatggtgc acctggacag 900
atgggtccca gaggattgcc aggcgagaga ggtagacctg gcgctccggg accagccggt 960
gctagaggaa atgatggcgc aacaggtgct gctgggcctc ctggaccaac cggaccagct 1020
ggcccacctg gatttccagg cgctgttgga gcaaagggcg aagcaggccc acaaggacct 1080
aggggatctg aaggtcctca gggcgttaga ggcgagccag ggccacctgg gcctgccggt 1140
gcagctggac ctgctggaaa ccctggtgct gatggacagc caggtgccaa aggtgctaat 1200
ggcgcccctg gaattgccgg cgctccaggt tttcccggcg caagagggcc atctggacct 1260
caaggcccag gcggacctcc gggtcctaag ggaaatagcg gagagccagg cgctcctggg 1320
agtaaaggcg atactggcgc aaaaggcgaa cccggacctg tgggagttca aggacctcct 1380
ggaccagctg gcgaggaagg caaaagaggc gctaggggag aaccaggacc aacagggctc 1440
cctggtccac ctggcgagcg cggaggacct ggatctagag gattccctgg cgcagatggc 1500
gtggccggac caaaaggacc tgcaggcgaa aggggatcac caggtcctgc aggccctaag 1560
ggttctccag gcgaggctgg cagacccggc gaagctggac tcccaggtgc taagggactg 1620
acaggctcac caggatctcc cggaccagac ggaaaaacag gacctccagg accggcagga 1680
caggatggta gacccggtcc tcctggaccg cctggtgcaa gaggacaagc tggcgtgatg 1740
ggctttcctg gaccaaaagg tgcagccggc gaacctggaa aagcaggcga gaggggagtt 1800
cccggacctc caggtgctgt tggacctgcc ggaaaagatg gcgaagctgg tgcacaaggt 1860
cctccagggc cagccggacc agccggcgag agaggcgaac aaggaccagc cggatctcca 1920
ggatttcagg gactgccagg gcctgctggc ccgcctggcg aggcagggaa gccaggcgaa 1980
cagggtgttc ctggcgatct tggagcccct ggtcctagcg gagctagagg cgaaagagga 2040
tttcctggcg aaaggggcgt tcagggtcca ccgggaccag ctggaccaag gggtgcaaat 2100
ggtgccccag gcaatgacgg tgctaaaggc gacgcaggcg ccccaggtgc tcctggatct 2160
caaggcgcac ctggacttca gggaatgcct ggcgaacggg gagctgctgg acttcccggt 2220
ccaaaaggcg ataggggaga tgctggtcct aagggcgctg atggctctcc tggaaaggat 2280
ggcgtcagag gcctgacagg cccaattggc cctccgggac ctgctggcgc tccaggcgat 2340
aagggcgaat ctggacctag tggacccgct ggtcctacag gtgctagggg agccccaggc 2400
gaccggggag agcctggtcc accaggacct gctggatttg ctggacctcc tggcgctgat 2460
ggtcaacctg gtgctaaggg cgagccaggc gacgctggtg caaaaggcga cgctggtcca 2520
cctggaccgg ccggacctgc tgggccgcca ggacctattg gaaatgttgg tgcccctggc 2580
gccaaaggcg caagaggatc tgctggccca ccaggcgcta caggattccc aggtgccgct 2640
ggaagagttg gaccaccggg gccaagtgga aatgctggac caccgggacc gccaggacca 2700
gccggcaaag aaggtggaaa aggccctagg ggcgaaactg gccctgcagg caggccaggc 2760
gaagtgggcc ctccaggacc tccggggcct gccggcgaaa aaggatctcc aggcgcagat 2820
ggacccgcag gcgctcccgg aacaccaggt ccacagggaa ttgctggaca aaggggagtt 2880
gtcggcctgc caggacagag gggagagaga ggttttccag gactccctgg gccaagcgga 2940
gaacctggca aacagggacc atctggtgcc agcggagaga gagggccacc aggaccaatg 3000
ggtcctccag gattggcagg gcctcctggc gaatctggta gagaaggtgc tccaggcgcc 3060
gagggatctc ctggacgtga tggttctcct ggcgccaagg gcgatagagg cgaaacaggc 3120
ccagctggac ctccaggcgc acccggcgct ccaggcgcac caggacctgt tggccctgct 3180
ggaaaatctg gcgacagagg cgaaactgga cccgcaggac cagccggacc tgttggacct 3240
gtgggtgcta gaggacccgc tggaccacaa ggtcctagag gcgacaaggg cgaaacaggc 3300
gagcaaggcg acagaggcat caagggacac agaggattca gcggactgca gggaccacca 3360
gggccgcctg gaagtcccgg cgagcaggga ccaagcggag ctagtggtcc cgccggacct 3420
agaggaccac ctggttctgc tggtgcaccc ggaaaggacg gactgaatgg gctccccgga 3480
cctattgggc cacctggacc tagaggaaga acaggcgacg caggaccagt tggaccacct 3540
gggccacctg gaccgcctgg tcctcctgga cctccttctg ccggattcga cttcagcttc 3600
ctgcctcagc ctcctcaaga gaaggcccat gacggcggca gatattacag agccgacgac 3660
gccaacgtcg tgcgggacag agatctggaa gtggacacca cactgaagtc cctgtctcag 3720
cagatcgaga acatcagaag ccccgagggc agcagaaaga accctgccag aacctgtcgg 3780
gacctgaaga tgtgccacag cgattggaag tctggcgagt actggatcga ccccaaccag 3840
ggctgcaacc tggatgccat caaggtgttc tgcaacatgg aaaccggcga gacatgcgtg 3900
taccccacac agccatctgt ggctcagaag aactggtaca tcagcaagaa ccccaaggac 3960
aagcggcacg tttggttcgg cgagagcatg accgatggct tccagtttga gtatggcggc 4020
cagggctctg accctgccga tgttgctatc cagctgacct tcctgcggct gatgtctaca 4080
gaggccagcc agaacatcac ctaccactgc aagaacagcg tggcctacat ggatcagcag 4140
accggcaacc tgaagaaggc actgctgctt cagggcagca acgagatcga gatcagagcc 4200
gagggcaaca gccggttcac ctacagcgtg acagtggatg gctgcaccag ccatacaggc 4260
gcttggggca agaccgtgat cgagtacaag accaccaaga ccagcagact gcccatcatc 4320
gatgtggccc ctctggatgt tggggcaccc gatcaagagt tcggcttcga tgtgggccca 4380
gtgtgcttcc tgagggccaa gaggggcagc ggcgagggca ggggcagcct gctgacctgc 4440
ggcgacgtgg aggagaaccc cggccccctg agcttcgtgg acaccagaac actgctgctg 4500
ctggccgtga cactgtgtct ggccacttgt cagagcctgc aagaggaaac agtgcggaaa 4560
ggacctgccg gcgatagagg acctagaggc gaaagaggtc ctcctggacc tcctggtaga 4620
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<210> 33
<211> 8644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
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caaggcccag gcggacctcc gggtcctaag ggaaatagcg gagagccagg cgctcctggg 1320
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ggaccagctg gcgaggaagg caaaagaggc gctaggggag aaccaggacc aacagggctc 1440
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gtggccggac caaaaggacc tgcaggcgaa aggggatcac caggtcctgc aggccctaag 1560
ggttctccag gcgaggctgg cagacccggc gaagctggac tcccaggtgc taagggactg 1620
acaggctcac caggatctcc cggaccagac ggaaaaacag gacctccagg accggcagga 1680
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<210> 35
<211> 7434
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
atgcttaggg gtccggggcc cgggctgctg ctgctggccg tccagtgcct ggggacagcg 60
gtgccctcca cgggagcctc gaagagcaag aggcaggctc agcaaatggt tcagccccag 120
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actggaaatg gtattcagct tcctggcact tctggtcagc aacccagtgt tgggcaacaa 6420
atgatctttg aggaacatgg ttttaggcgg accacaccgc ccacaacggc cacccccata 6480
aggcataggc caagaccata cccgccgaat gtaggtgagg aaatccaaat tggtcacatc 6540
cccagggaag atgtagacta tcacctgtac ccacacggtc cgggactcaa tccaaatgcc 6600
tctacaggac aagaagctct ctctcagaca accatctcat gggccccatt ccaggacact 6660
tctgagtaca tcatttcatg tcatcctgtt ggcactgatg aagaaccctt acagttcagg 6720
gttcctggaa cttctaccag tgccactctg acaggcctca ccagaggtgc cacctacaac 6780
atcatagtgg aggcactgaa agaccagcag aggcataagg ttcgggaaga ggttgttacc 6840
gtgggcaact ctgtcaacga aggcttgaac caacctacgg atgactcgtg ctttgacccc 6900
tacacagttt cccattatgc cgttggagat gagtgggaac gaatgtctga atcaggcttt 6960
aaactgttgt gccagtgctt aggctttgga agtggtcatt tcagatgtga ttcatctaga 7020
tggtgccatg acaatggtgt gaactacaag attggagaga agtgggaccg tcagggagaa 7080
aatggccaga tgatgagctg cacatgtctt gggaacggaa aaggagaatt caagtgtgac 7140
cctcatgagg caacgtgtta tgatgatggg aagacatacc acgtaggaga acagtggcag 7200
aaggaatatc tcggtgccat ttgctcctgc acatgctttg gaggccagcg gggctggcgc 7260
tgtgacaact gccgcagacc tgggggtgaa cccagtcccg aaggcactac tggccagtcc 7320
tacaaccagt attctcagag ataccatcag agaacaaaca ctaatgttaa ttgcccaatt 7380
gagtgcttca tgcctttaga tgtacaggct gacagagaag attcccgaga gtaa 7434
<210> 36
<211> 7434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
atgctgagag gacctggacc aggactgctg ctgctggctg ttcagtgtct gggaacagcc 60
gtgcctagca caggcgccag caagtctaaa agacaggccc agcagatggt gcagcctcag 120
tctcctgtgg ccgtgtctca gtctaagccc ggctgctacg acaacggcaa gcactaccag 180
atcaaccagc agtgggagag aacctacctg ggcaacgccc tcgtgtgtac atgttacggc 240
ggcagcagag gcttcaactg cgagtctaaa cccgaggccg aggaaacctg cttcgacaag 300
tacaccggca acacctacag agtgggcgac acctacgaga ggcccaagga cagcatgatc 360
tgggactgca catgtatcgg agccggcaga ggcagaatca gctgcacaat cgccaaccgg 420
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cctatcgccg agaagtgctt cgatcatgcc gccggaacaa gctacgtcgt gggcgagaca 600
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cggatcggcg atacctggtc caagaaggac aaccggggca acctgctgca gtgcatctgt 780
accggaaatg gaagaggcga atggaagtgc gagcggcaca caagcgtgca gacaacatct 840
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cagcctccac cttatggcca ctgcgtgaca gatagcggcg tggtgtatag cgtgggcatg 960
cagtggctga aaacccaggg caacaagcag atgctgtgca catgcctcgg caatggcgtg 1020
tcctgccaag agacagccgt gacacagacc tatggcggca atagcaatgg cgagccttgc 1080
gtgctgccct tcacctacaa tggccggacc ttctacagct gcaccaccga gggtagacag 1140
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tgcaccgacc acaccgtgct ggtgcaaacc agaggcggca attctaacgg cgccctgtgt 1260
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aatggtcgcg gagagtggac atgcattgcc tacagccagc tgcgggacca gtgcatcgtg 1560
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ctgaactgca cctgtttcgg ccaaggcaga ggccggtgga agtgtgatcc tgtggatcag 1680
tgccaggaca gcgaaaccgg caccttttac cagatcggag actcctggga gaaatacgtg 1740
cacggcgtgc gctaccagtg ctactgttac ggcagaggaa ttggcgagtg gcactgtcag 1800
cccctgcaga cataccctag ctctagcgga cctgtcgagg tgttcatcac cgagacaccc 1860
agccagccta actctcaccc catccagtgg aatgcccctc agcctagcca catcagcaag 1920
tacatcctga gatggcggcc caagaactcc gtcggcagat ggaaagaggc caccattcct 1980
ggccacctga acagctacac catcaaggga ctgaagcccg gcgtggtcta tgagggccag 2040
ctgatctcta tccagcagta cggccaccaa gaagtgacca gattcgactt caccaccacc 2100
tccaccagca cacccgtgac cagcaatacc gtgaccggcg agacaacccc tttctctcca 2160
ctggtggcca caagcgagag cgtgaccgag attaccgcca gcagctttgt ggtgtcttgg 2220
gtgtccgcca gcgatacagt gtccggcttc agagtggaat acgagctgag cgaggaaggc 2280
gacgagcccc agtatctgga tctgccaagc accgccacca gcgtgaacat ccctgatctg 2340
ctgcccggca gaaagtacat cgtgaacgtg taccagatct ccgaggacgg cgagcagagc 2400
ctgatcctga gcacaagcca gacaacagcc cctgacgctc ctcctgatcc taccgttgat 2460
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tacaggatcg tgtacagccc tagcgtggaa ggcagcagca ccgagctgaa tctgcccgag 2580
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accaccatcg tgatcacctg gacacccgct cctcggatcg gctttaagct gggcgtcaga 3360
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tctggactga caccaggcgt ggaatatgtg tacaccatcc aggtgctgcg cgacggccaa 3480
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cacctggaag ccaatcctga taccggcgtg ctgactgtgt cctgggaaag aagcaccaca 3600
cctgacatta ccggctatcg gatcaccaca acacccacca atggccagca gggcaactcc 3660
ctggaagagg tggtgcatgc cgatcagtcc agctgtacct tcgacaatct gagccctggc 3720
ctcgagtaca atgtgtccgt gtacacagtg aaggacgaca aagaaagcgt gcccatctcc 3780
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accgtggtgg ccgctggcga gggcatccca atcttcgagg actttgtgga cagcagcgtg 3960
ggctactaca ccgtgactgg actggaaccc ggcatcgact acgacatcag cgtcatcacc 4020
ctgatcaatg gcggcgagag cgcccctaca acactgacac aacagactgc cgtgcctcct 4080
cctaccgatc tgcggttcac aaatatcggc cccgacacca tgagagtgac ttgggctcct 4140
ccaccaagta tcgacctgac caacttcctc gtgcggtaca gccccgtgaa gaacgaggaa 4200
gatgtggccg agctgtccat ctctcccagc gataatgccg tggtgctgac caatctgctc 4260
cccggaacag agtacgtggt gtccgttagc agcgtgtacg aacagcacga gagcacaccc 4320
ctgcggggca gacaaaaaac aggcctggat agccccaccg gaatcgactt cagcgatatc 4380
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atccggcatc accccgagca cttcagcggc agacctagag aagatagagt gccccactcc 4500
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accgggtaca gagtgaccac cacaccaaag aacggccctg gacctaccaa gaccaagacc 5040
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gtgtctgtgt acgcccagaa tcctagcggc gagtctcagc ctcttgtgca gaccgccgtg 5160
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tccgagtaca tcatctcttg tcaccccgtg ggcaccgacg aggaaccact gcaattcaga 6720
gtgcccggca cctctaccag cgccacactt acaggactga ctagaggcgc cacctataac 6780
atcatcgtgg aagccctgaa agaccagcag cggcacaaag tgcgcgaaga ggttgtgact 6840
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<210> 37
<211> 2361
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
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<210> 38
<211> 2361
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
atggctggac tgacagccgc tgctcctaga cctggtgttc tgctgctgct cctgagcatt 60
ctgcaccctt ctagaccagg cggagtgcct ggtgctattc ctggcggagt tcccggcgga 120
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ggactggttc ctggcgtcgg agtggcacca ggtgttggag ttgcacctgg cgttggcgtg 1560
gcccctggcg tgggtcttgc tcctggtgtt ggtgttgccc caggtgtcgg agtcgctccc 1620
ggtgtcggtg tcgcacctgg tattggtcct ggtggcgttg ccgcagctgc caaatctgct 1680
gcaaaggtgg ccgccaaagc acagctgaga gctgctgccg gtcttggcgc tggaatccca 1740
ggactcggtg ttggagtggg agtgccaggt cttggtgttg gagcaggcgt gcccggactc 1800
ggagtcggag ctggtgtccc aggttttgga gctggtgcag atgaaggcgt gcggagatct 1860
ctgagccctg agctgagaga gggcgatcct agctctagcc agcatctccc tagcacacct 1920
agcagcccta gagtccctgg ggctcttgct gcagccaaag ccgctaagta tggggctgct 1980
gtccctggtg ttcttggagg acttggagca ctcggcggag tgggaattcc aggcggtgtc 2040
gttggtgcag gacctgctgc tgccgccgca gctgcaaaag cagcagctaa ggcagcccag 2100
tttggccttg ttggagccgc tggacttggt ggcctcggag ttggtggtct tggtgtcccc 2160
ggtgttggcg gacttggagg aattccacca gccgcagcag ccaaggctgc taaatacggc 2220
gctgcaggac ttggcggtgt tcttggcgga gctggacagt ttccacttgg aggcgttgca 2280
gccagacctg gctttggcct gtctcctatt tttcctggcg gcgcttgtct gggcaaagcc 2340
tgcggcagaa agcggaagta a 2361
<210> 39
<211> 1017
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
atgagtctaa gtgcatttac tctcttcctg gcattgattg gtggtaccag tggccagtac 60
tatgattatg attttcccct atcaatttat gggcaatcat caccaaactg tgcaccagaa 120
tgtaactgcc ctgaaagcta cccaagtgcc atgtactgtg atgagctgaa attgaaaagt 180
gtaccaatgg tgcctcctgg aatcaagtat ctttacctta ggaataacca gattgaccat 240
attgatgaaa aggcctttga gaatgtaact gatctgcagt ggctcattct agatcacaac 300
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ctgcatataa accacaacaa cctgacagag tctgtgggcc cacttcccaa atctctggag 420
gatctgcagc ttactcataa caagatcaca aagctgggct cttttgaagg attggtaaac 480
ctgaccttca tccatctcca gcacaatcgg ctgaaagagg atgctgtttc agctgctttt 540
aaaggtctta aatcactcga ataccttgac ttgagcttca atcagatagc cagactgcct 600
tctggtctcc ctgtctctct tctaactctc tacttagaca acaataagat cagcaacatc 660
cctgatgagt atttcaagcg ttttaatgca ttgcagtatc tgcgtttatc tcacaacgaa 720
ctggctgata gtggaatacc tggaaattct ttcaatgtgt catccctggt tgagctggat 780
ctgtcctata acaagcttaa aaacatacca actgtcaatg aaaaccttga aaactattac 840
ctggaggtca atcaacttga gaagtttgac ataaagagct tctgcaagat cctggggcca 900
ttatcctact ccaagatcaa gcatttgcgt ttggatggca atcgcatctc agaaaccagt 960
cttccaccgg atatgtatga atgtctacgt gttgctaacg aagtcactct taattaa 1017
<210> 40
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
atgagcctga gcgccttcac actgtttctg gccctgatcg gcggcacaag cggccagtac 60
tacgactacg atttcccact gagcatctac ggccagagca gccctaattg cgcccctgag 120
tgcaattgcc ccgagagcta tcctagcgcc atgtactgcg acgagctgaa gctgaagtcc 180
gtgcctatgg tgcctcctgg catcaagtac ctgtacctgc ggaacaacca gatcgaccac 240
atcgacgaga aggcctttga gaacgtgacc gacctgcagt ggctgatcct ggaccacaac 300
ctgctggaaa acagcaagat caagggccgc gtgttcagca agctgaagca gctgaagaaa 360
ctgcacatca accacaacaa cctgaccgag agcgtgggcc ctctgcctaa gtctctggaa 420
gatctgcagc tgacccacaa caagatcacc aagctgggca gcttcgaggg cctcgtgaac 480
ctgaccttca tccatctgca gcacaaccgg ctgaaagagg atgccgttag cgccgccttc 540
aagggcctga agagtctgga atacctggac ctgagcttca atcagatcgc cagactgcct 600
agcggcctgc ctgtttctct gctgacactg tacctggaca acaacaaaat cagcaacatc 660
cccgacgagt acttcaagcg gttcaacgcc ctgcagtacc tgagactgag ccacaacgag 720
ctggccgatt ctggcatccc cggcaacagc ttcaatgtgt ccagcctggt ggaactggac 780
ctgtcctaca acaagctgaa aaacatcccc accgtgaacg agaacctcga gaactactac 840
ctggaagtga accagctcga gaagttcgat atcaagagct tctgcaagat cctggggcct 900
ctgagctact ccaagattaa gcacctgagg ctggacggca accggatcag cgaaacaagc 960
ctgcctcctg atatgtacga gtgcctgaga gtggccaacg aagtgaccct gaactga 1017
<210> 41
<211> 1437
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
atggcacccc tgagacccct tctcatactg gccctgctgg catgggttgc tctggctgac 60
caagagtcat gcaagggccg ctgcactgag ggcttcaacg tggacaagaa gtgccagtgt 120
gacgagctct gctcttacta ccagagctgc tgcacagact atacggctga gtgcaagccc 180
caagtgactc gcggggatgt gttcactatg ccggaggatg agtacacggt ctatgacgat 240
ggcgaggaga aaaacaatgc cactgtccat gaacaggtgg ggggcccctc cctgacctct 300
gacctccagg cccagtccaa agggaatcct gagcagacac ctgttctgaa acctgaggaa 360
gaggcccctg cgcctgaggt gggcgcctct aagcctgagg ggatagactc aaggcctgag 420
acccttcatc cagggagacc tcagccccca gcagaggagg agctgtgcag tgggaagccc 480
ttcgacgcct tcaccgacct caagaacggt tccctctttg ccttccgagg gcagtactgc 540
tatgaactgg acgaaaaggc agtgaggcct gggtacccca agctcatccg agatgtctgg 600
ggcatcgagg gccccatcga tgccgccttc acccgcatca actgtcaggg gaagacctac 660
ctcttcaagg gtagtcagta ctggcgcttt gaggatggtg tcctggaccc tgattacccc 720
cgaaatatct ctgacggctt cgatggcatc ccggacaacg tggatgcagc cttggccctc 780
cctgcccata gctacagtgg ccgggagcgg gtctacttct tcaaggggaa acagtactgg 840
gagtaccagt tccagcacca gcccagtcag gaggagtgtg aaggcagctc cctgtcggct 900
gtgtttgaac actttgccat gatgcagcgg gacagctggg aggacatctt cgagcttctc 960
ttctggggca gaacctctgc tggtaccaga cagccccagt tcattagccg ggactggcac 1020
ggtgtgccag ggcaagtgga cgcagccatg gctggccgca tctacatctc aggcatggca 1080
ccccgcccct ccttggccaa gaaacaaagg tttaggcatc gcaaccgcaa aggctaccgt 1140
tcacaacgag gccacagccg tggccgcaac cagaactccc gccggccatc ccgcgccacg 1200
tggctgtcct tgttctccag tgaggagagc aacttgggag ccaacaacta tgatgactac 1260
aggatggact ggcttgtgcc tgccacctgt gaacccatcc agagtgtctt cttcttctct 1320
ggagacaagt actaccgagt caatcttcgc acacggcgag tggacactgt ggaccctccc 1380
tacccacgct ccatcgctca gtactggctg ggctgcccag ctcctggcca tctgtag 1437
<210> 42
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
atggcccctc ttagacccct gctgattctg gctctgctgg cttgggttgc cctggccgat 60
caagagtctt gcaagggcag atgcaccgag ggcttcaacg tggacaagaa atgccagtgc 120
gacgagctgt gcagctacta ccagagctgc tgcaccgatt acaccgccga gtgcaagccc 180
caagtgacaa gaggcgacgt gttcaccatg cctgaggacg agtacaccgt gtacgacgac 240
ggcgaggaaa agaacaacgc caccgtgcac gagcaagttg gcggaccttc tctgaccagc 300
gatctgcagg ctcagagcaa gggcaatcct gagcagaccc ctgtgctgaa gcctgaggaa 360
gaagcccctg ctcctgaagt gggagcctct aagcctgaag gcatcgacag cagacccgag 420
acactgcatc caggcagacc tcagcctcct gccgaagagg aactgtgtag cggcaagcct 480
ttcgacgcct tcaccgacct gaagaacggc agcctgttcg cctttagagg ccagtactgc 540
tacgagctgg acgagaaggc cgtgcggcct ggatatccta agctgatcag agatgtgtgg 600
ggcatcgagg gccccatcga cgccgctttc accagaatca actgtcaggg caagacctac 660
ctgttcaagg gcagccagta ttggagattc gaggacggcg tgctggaccc tgactacccc 720
agaaatatca gcgacggctt cgacggcatc cccgacaatg ttgatgctgc tctggccctg 780
cctgctcaca gctactctgg cagagaacgg gtgtacttct ttaagggcaa acagtactgg 840
gagtaccagt tccagcacca gcctagccaa gaggaatgcg agggcagctc tctgagcgcc 900
gtgtttgagc acttcgccat gatgcagaga gacagctggg aagatatttt cgagctgctg 960
ttctggggca gaaccagcgc cggaacaaga cagcctcagt tcatcagcag agactggcat 1020
ggcgtgccag gacaagtgga tgctgccatg gccggcagaa tctacatcag cggaatggcc 1080
cctagaccta gcctggccaa gaagcagcgg ttccggcaca gaaaccggaa gggctacaga 1140
agccagagag gccactccag aggccggaac cagaatagca gaaggccctc tagagccacc 1200
tggctgagcc tgtttagcag cgaggaaagc aacctgggcg ccaacaacta cgacgactac 1260
cggatggatt ggctggtgcc tgccacatgc gagcctatcc agagcgtgtt cttcttcagc 1320
ggcgacaaat attaccgcgt gaacctgcgg actcggagag tggatacagt ggaccctcct 1380
tatcctcggt ctatcgctca gtattggctg ggctgtccag ctcctggaca cctgtaa 1437
<210> 43
<211> 5175
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
atgcctccag cagtgaggcg gtcagcctgc agcatgggat ggctgtggat ctttggggca 60
gccctggggc agtgtctggg ctacagttca cagcagcaaa gggtgccatt tcttcagcct 120
cccggtcaaa gtcaactgca agcgagttat gtggagttta gacccagcca gggttgtagc 180
cctggatact atcgggatca taaaggcttg tataccggac ggtgtgttcc ctgcaattgc 240
aacggacatt caaatcaatg ccaggatggc tcaggcatat gtgttaactg tcagcacaac 300
accgcgggag agcactgtga acgctgccag gagggctact atggcaacgc cgtccacgga 360
tcctgcaggg cctgcccatg tcctcacact aacagctttg ccactggctg tgtggtgaat 420
gggggagacg tgcggtgctc ctgcaaagct gggtacacag gaacacagtg tgaaaggtgt 480
gcaccgggat atttcgggaa tccccagaaa ttcggaggta gctgccaacc atgcagttgt 540
aacagcaatg gccagctggg cagctgtcat cccctgactg gagactgcat aaaccaagaa 600
cccaaagata gcagccctgc agaagaatgt gatgattgcg acagctgtgt gatgaccctc 660
ctgaacgacc tggccaccat gggcgagcag ctccgcctgg tcaagtctca gctgcagggc 720
ctgagtgcca gcgcagggct tctggagcag atgaggcaca tggagaccca ggccaaggac 780
ctgaggaatc agttgctcaa ctaccgttct gccatttcaa atcatggatc aaaaatagaa 840
ggcctggaaa gagaactgac tgatttgaat caagaatttg agactttgca agaaaaggct 900
caagtaaatt ccagaaaagc acaaacatta aacaacaatg ttaatcgggc aacacaaagc 960
gcaaaagaac tggatgtgaa gattaaaaat gtcatccgga atgtgcacat tcttttaaag 1020
cagatctctg ggacagatgg agagggaaac aacgtgcctt caggtgactt ttccagagag 1080
tgggctgaag cccagcgcat gatgagggaa ctgcggaaca ggaactttgg aaagcacctc 1140
agagaagcag aagctgataa aagggagtcg cagctcttgc tgaaccggat aaggacctgg 1200
cagaaaaccc accaggggga gaacaatggg cttgctaaca gtatccggga ttctttaaat 1260
gaatacgaag ccaaactcag tgaccttcgt gctcggctgc aggaggcagc tgcccaagcc 1320
aagcaggcaa atggcttgaa ccaagaaaac gagagagctt tgggagccat tcagagacaa 1380
gtgaaagaaa taaattccct gcagagtgat ttcaccaagt atctaaccac tgcagactca 1440
tctttgttgc aaaccaacat tgcgctgcag ctgatggaga aaagccagaa ggaatatgaa 1500
aaattagctg ccagtttaaa tgaagcaaga caagaactaa gtgacaaagt aagagaactt 1560
tccagatctg ctggcaaaac atcccttgtg gaggaggcag aaaagcacgc gcggtcctta 1620
caagagctgg caaagcagct ggaagagatc aagagaaacg ccagcgggga tgagctggtg 1680
cgctgtgctg tggatgccgc caccgcctac gagaacatcc tcaatgccat caaagcggcc 1740
gaggacgcag ccaacagggc tgccagtgca tctgaatctg ccctccagac agtgataaag 1800
gaagatctgc caagaaaagc taaaaccctg agttccaaca gtgataaact gttaaatgaa 1860
gccaagatga cacaaaagaa gctaaagcaa gaagtcagtc cagctctcaa caacctacag 1920
caaaccctga atattgtgac agttcagaaa gaagtgatag acaccaatct cacaactctc 1980
cgagatggtc ttcatgggat acagagaggt gatattgatg ctatgatcag tagtgcaaag 2040
agcatggtca gaaaggccaa cgacatcaca gatgaggttc tggatgggct caaccccatc 2100
cagacagatg tggaaagaat taaggacacc tatgggagga cacagaacga agacttcaaa 2160
aaggctctga ctgatgcaga taactcggtg aataagttaa ccaacaaact acctgatctt 2220
tggcgcaaga ttgaaagtat caaccaacag ctgttgccct tgggaaacat ctctgacaac 2280
atggacagaa tacgagaact aattcagcag gccagagatg ctgccagtaa ggttgctgtc 2340
cccatgaggt tcaatggtaa atctggagtc gaagtccgac tgccaaatga cctggaagat 2400
ttgaaaggat atacatctct gtccttgttt ctccaaaggc ccaactcaag agaaaatggg 2460
ggtactgaga atatgtttgt gatgtacctt ggaaataaag atgcctcccg ggactacatc 2520
ggcatggcag ttgtggatgg ccagctcacc tgtgtctaca acctggggga ccgtgaggct 2580
gaactccaag tggaccagat cttgaccaag agtgagacta aggaggcagt tatggatcgg 2640
gtgaaatttc agagaattta tcagtttgca aggcttaatt acaccaaagg agccacatcc 2700
agtaaaccag aaacacccgg agtctatgac atggatggta gaaatagcaa tacactcctt 2760
aatttggatc ctgaaaatgt tgtattttat gttggaggtt acccacctga ttttaaactt 2820
cccagtcgac taagtttccc tccatacaaa ggttgtattg aattagatga cctcaatgaa 2880
aatgttctga gcttgtacaa cttcaaaaaa acattcaatc tcaacacaac tgaagtggag 2940
ccttgtagaa ggaggaagga agagtcagac aaaaattatt ttgaaggtac gggctatgct 3000
cgagttccaa ctcaaccaca tgctcccatc ccaacctttg gacagacaat tcagaccacc 3060
gtggatagag gcttgctgtt ctttgcagaa aacggggatc gcttcatatc tctaaatata 3120
gaagatggca agctcatggt gagatacaaa ctgaattcag agctaccaaa agagagagga 3180
gttggagacg ccataaacaa cggcagagac cattcgattc agatcaaaat tggaaaactc 3240
caaaagcgta tgtggataaa tgtggacgtt caaaacacta taattgatgg tgaagtattt 3300
gatttcagca catattatct gggaggaatt ccaattgcaa tcagggaaag atttaacatt 3360
tctacgcctg ctttccgagg ctgcatgaaa aatttgaaga aaaccagtgg tgtcgttaga 3420
ttgaatgata ctgtgggagt aaccaaaaag tgctcggaag actggaagct tgtgcgatct 3480
gcctcattct ccagaggagg acaattgagt ttcactgatt tgggcttacc acctactgac 3540
cacctccagg cctcatttgg atttcagacc tttcaaccca gtggcatatt attagatcat 3600
cagacatgga caaggaacct gcaggtcact ctggaagatg gttacattga attgagcacc 3660
agcgatagcg gcggcccaat ttttaaatct ccacagacgt atatggatgg tttactgcat 3720
tatgtatctg taataagcga caactctgga ctacggcttc tcatcgatga ccagcttctg 3780
agaaatagca aaaggctaaa acacatttca agttcccggc agtctctgcg tctgggcggg 3840
agcaattttg agggttgtat tagcaatgtt tttgtccaga ggttatcact gagtcctgaa 3900
gtcctagatt tgaccagtaa ctctctcaag agagatgtgt ccctgggagg ctgcagttta 3960
aacaaaccac cttttctaat gttgcttaaa ggttctacca ggtttaacaa gaccaagact 4020
tttcgtatca accagctgtt gcaggacaca ccagtggcct ccccaaggag cgtgaaggtg 4080
tggcaagatg cttgctcacc acttcccaag acccaggcca atcatggagc cctccagttt 4140
ggggacattc ccaccagcca cttgctattc aagcttcctc aggagctgct gaaacccagg 4200
tcacagtttg ctgtggacat gcagacaaca tcctccagag gactggtgtt tcacacgggc 4260
actaagaact cctttatggc tctttatctt tcaaaaggac gtctggtctt tgcactgggg 4320
acagatggga aaaaattgag gatcaaaagc aaggagaaat gcaatgatgg gaaatggcac 4380
acggtggtgt ttggccatga tggggaaaag gggcgcttgg ttgtggatgg actgagggcc 4440
cgggagggaa gtttgcctgg aaactccacc atcagcatca gagcgccagt ttacctggga 4500
tcacctccat cagggaaacc aaagagcctc cccacaaaca gctttgtggg atgcctgaag 4560
aactttcagc tggattcaaa acccttgtat accccttctt caagcttcgg ggtgtcttcc 4620
tgcttgggtg gtcctttgga gaaaggcatt tatttctctg aagaaggagg tcatgtcgtc 4680
ttggctcact ctgtattgtt ggggccagaa tttaagcttg ttttcagcat ccgcccaaga 4740
agtctcactg ggatcctaat acacatcgga agtcagcccg ggaagcactt atgtgtttac 4800
ctggaggcag gaaaggtcac ggcctctatg gacagtgggg caggtgggac ctcaacgtcg 4860
gtcacaccaa agcagtctct gtgtgatgga cagtggcact cggtggcagt caccataaaa 4920
caacacatcc tgcacctgga actggacaca gacagtagct acacagctgg acagatcccc 4980
ttcccacctg ccagcactca agagccacta caccttggag gtgctccagc caatttgacg 5040
acactgagga tccctgtgtg gaaatcattc tttggctgtc tgaggaatat tcatgtcaat 5100
cacatccctg tccctgtcac tgaagccttg gaagtccagg ggcctgtcag tctgaatggt 5160
tgtcctgacc agtaa 5175
<210> 44
<211> 5175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
atgcctcctg ctgtgcggag aagcgcctgt tctatgggat ggctgtggat ctttggcgcc 60
gctctgggac agtgtctggg ctactcttct cagcagcagc gggtgccatt tctgcagcca 120
cctggacagt ctcagctgca ggccagctac gtggaattca gacctagcca gggctgtagc 180
cccggctact acagagatca caagggcctg tacaccggca gatgcgtgcc ctgcaactgt 240
aacggccaca gcaaccagtg tcaggacggc tctggcatct gcgtgaactg ccagcataat 300
actgccggcg agcactgcga gagatgccaa gagggctact acggcaatgc cgtgcatggc 360
agctgtcggg cttgtccttg tcctcacacc aacagctttg ccaccggctg cgttgtgaac 420
ggcggagatg ttcggtgttc ttgcaaggcc ggctacacag gcacacagtg cgaaagatgt 480
gcccctggct actttggcaa ccctcagaag tttggcggct cctgccagcc ttgctcctgc 540
aattctaatg gccagctggg ctcttgtcac cctctgaccg gcgactgcat caatcaagag 600
cctaaggaca gcagccctgc cgaggaatgc gacgattgcg atagctgcgt gatgaccctg 660
ctgaacgacc tggccacaat gggagaacag ctgcggctgg ttaagagcca gctccaggga 720
ctgtctgcct ctgctggact gctggaacag atgcggcaca tggaaaccca ggccaaggac 780
ctgagaaacc agctgctgaa ctacagaagc gccatctcca accacggcag caagatcgaa 840
ggcctggaaa gagagctgac cgacctgaat caagagttcg agacactgca agagaaggcc 900
caagtgaaca gccggaaggc ccagactctg aacaacaacg tgaaccgggc cacacagtcc 960
gccaaagaac tggacgtgaa gatcaagaac gtgatccgga acgtgcacat cctgctgaag 1020
cagatcagcg gcacagatgg cgagggcaac aatgtgccta gcggcgactt tagcagagag 1080
tgggccgaag ctcagcggat gatgagagag ctgcggaacc ggaacttcgg caagcacctg 1140
agagaagccg aggccgacaa gagagagagc caactgctgc tcaaccggat cagaacctgg 1200
cagaaaaccc accagggcga gaacaacggc ctggccaaca gcatcagaga cagcctgaat 1260
gagtacgagg ccaagctgag cgatctgcgg gccagacttc aagaagctgc cgctcaggcc 1320
aagcaggcca acggccttaa tcaagagaac gagagagccc tgggcgccat ccagagacaa 1380
gtgaaagaga tcaacagcct gcagagcgac ttcaccaagt acctgaccac cgccgatagc 1440
agcctgctgc agacaaatat cgccctgcag ctcatggaaa agagccagaa agagtacgaa 1500
aagctggccg ccagcctgaa cgaggccagg caagaactgt ctgacaaagt gcgcgagctg 1560
agcagatccg ccggcaagac atctctggtg gaagaggccg agaagcacgc cagatctctg 1620
caagagctgg ccaaacagct ggaagagatt aagcggaacg ccagcggcga cgaactcgtc 1680
agatgtgcag tggatgccgc caccgcctac gagaacatcc tgaatgccat caaggccgcc 1740
gaggacgccg ctaatagagc cgcttctgct tctgagtctg ccctgcagac cgtgatcaaa 1800
gaggacctgc ctagaaaggc caagacactg agcagcaaca gcgacaaact gctgaatgag 1860
gccaagatga cccagaagaa actgaagcaa gaggtgtccc ctgcactgaa caacctgcag 1920
cagaccctga acatcgtgac cgtgcagaaa gaagtgatcg acaccaacct gacaaccctg 1980
agagatggcc tgcacggaat ccagagaggc gacatcgacg ccatgatcag cagcgccaag 2040
agcatggttc gaaaagccaa cgacatcacc gacgaggtgc tggacggcct gaatcctatc 2100
cagaccgacg tggaacggat caaggacacc tacggcagaa cccagaacga ggatttcaag 2160
aaggccctga ccgacgccga caactccgtg aacaagctga ccaacaagct gcccgatctg 2220
tggcggaaga tcgagagcat caaccagcaa ctgctccctc tgggcaacat cagcgacaac 2280
atggacagaa tccgggaact gatccagcag gccagagatg ccgcctccaa agtggctgtg 2340
cccatgagat tcaacggcaa gagcggagtg gaagtgcggc tgcccaacga tctggaagat 2400
ctgaagggct ataccagcct gagcctgttc ctgcagaggc ccaacagcag agagaatggc 2460
ggcaccgaga atatgttcgt gatgtacctg ggaaacaagg acgccagccg ggactatatc 2520
ggaatggccg ttgtggacgg ccagctgacc tgcgtgtaca acctgggaga cagagaagct 2580
gaactgcagg tcgaccagat cctgaccaag agcgagacaa aagaggccgt gatggacaga 2640
gtgaagttcc agcggatcta ccagttcgcc cggctgaatt acaccaaggg cgccacaagc 2700
agcaagcccg aaacacctgg cgtgtacgac atggacggcc ggaactctaa cactctgctg 2760
aatctggacc ccgagaacgt ggtgttttac gtcggcggct accctcctga cttcaagctg 2820
cctagcagac tgagcttccc accttacaag ggctgcatcg agctggatga cctgaacgaa 2880
aacgtgctgt ccctgtacaa cttcaaaaag accttcaacc tgaacaccac cgaggtggaa 2940
ccctgcaggc gcagaaaaga ggaatccgac aagaactact tcgaaggcac cggctacgcc 3000
agagtgccta cacaacctca cgctcccatt cctaccttcg gccagaccat ccagacaacc 3060
gtggatagag gcctgctgtt cttcgccgag aacggcgaca gattcatctc cctgaatatc 3120
gaggatggca agctgatggt ccgatacaag ctgaatagcg agctgcccaa agaaagaggc 3180
gtgggcgacg ccatcaacaa cggcagggat cacagcatcc agatcaagat cggcaaactg 3240
cagaaacgga tgtggatcaa cgtggacgtg cagaacacca tcatcgacgg cgaggtgttc 3300
gacttcagca cctactatct cggcggaatc cctatcgcca tcagagagcg gttcaatatc 3360
agcacccctg ccttccgggg ctgcatgaag aacctgaaaa agaccagcgg cgtcgtgcgg 3420
ctgaatgata cagtgggcgt gaccaagaag tgcagcgagg actggaagct tgtgcggagc 3480
gccagttttt ctagaggcgg acagctgagc tttaccgacc tgggactgcc tcctaccgat 3540
catctgcagg caagcttcgg attccagacc ttccagccaa gcggaatcct gctggaccac 3600
cagacctgga ccagaaacct gcaagtgacc ctggaagatg gctacatcga actgagcacc 3660
agcgactctg gcggccctat ctttaagagc cctcagacct acatggatgg gctgctgcac 3720
tacgtgtccg tgatcagcga taacagcggc ctgagactgc tgatcgacga ccagctcctg 3780
cggaacagca agcggctgaa gcacatctcc agcagcagac agagtctgag actcggcggc 3840
agcaatttcg agggctgtat cagcaacgtg ttcgtgcagc gcctgagtct gtctccagaa 3900
gtgctggacc tgaccagcaa tagcctgaag agggatgtgt ctctcggcgg ctgctccctg 3960
aacaaacctc ctttcctgat gctgctgaag ggcagcaccc ggttcaacaa gaccaagacc 4020
tttcggatca atcagctgct ccaggacacc cctgtggcta gccctagaag cgtgaaagtg 4080
tggcaggacg cctgcagtcc cctgcctaaa acacaggcca atcacggggc tctgcagttc 4140
ggcgatatcc ccacaagcca tctgctgttt aagctgcccc aagagctgct caagcctcgg 4200
agccagttcg ctgtggatat gcagaccacc tcctccagag gactggtgtt tcacaccggc 4260
accaagaaca gcttcatggc cctgtacctg agcaaaggca ggctggtgtt tgccctgggc 4320
accgacggaa agaaactgcg gatcaagagc aaagagaagt gcaacgacgg caagtggcac 4380
accgtggtgt tcggacacga tggcgagaaa ggcagactcg tggtggatgg cctgagagcc 4440
agagagggat ctctgcctgg caactccacc atctccatca gagcccctgt gtatctgggc 4500
agccctccta gcggaaagcc taagagcctg cctaccaact ccttcgtggg ctgtctgaag 4560
aactttcagc tggacagcaa gcctctgtac acccctagca gcagctttgg cgtgtcctcc 4620
tgtctcggag gccctctgga aaagggcatc tacttctctg aggaaggcgg ccacgttgtc 4680
ctggctcatt ctgttctgct gggccccgag ttcaagctgg tgttctctat ccggcctaga 4740
agcctgaccg gcatcctgat tcacatcggc agccagcctg ggaagcacct gtgtgtgtat 4800
ctcgaggccg gcaaagtgac cgccagcatg gattctggtg ctggcggcac aagcacctcc 4860
gtgacaccta agcagagcct gtgtgatggc cagtggcaca gtgtggccgt gacaatcaag 4920
cagcacattc tgcacctgga actggacacc gacagcagct ataccgccgg acagatccca 4980
tttcctccag ccagcacaca agagcctctg caccttggag gcgcccctgc caatctgacc 5040
acactgagaa tccccgtgtg gaagtccttc ttcggctgcc tgcggaatat ccatgtgaac 5100
cacattccag tgcctgtgac agaggccctg gaagtgcagg gacccgtgtc tctgaatgga 5160
tgccccgatc agtga 5175
<210> 45
<211> 3519
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
atgagaccat tcttcctctt gtgttttgcc ctgcctggcc tcctgcatgc ccaacaagcc 60
tgctcccgtg gggcctgcta tccacctgtt ggggacctgc ttgttgggag gacccggttt 120
ctccgagctt catctacctg tggactgacc aagcctgaga cctactgcac ccagtatggc 180
gagtggcaga tgaaatgctg caagtgtgac tccaggcagc ctcacaacta ctacagtcac 240
cgagtagaga atgtggcttc atcctccggc cccatgcgct ggtggcagtc acagaatgat 300
gtgaaccctg tctctctgca gctggacctg gacaggagat tccagcttca agaagtcatg 360
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cgccagggtc ggcctcagag ctggcaggat gttcggtgcc agtccctgcc tcagaggcct 540
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ccagcaactc aaagtcaaaa aattcaagag gtgggggaga tcacaaactt gagagtcaat 660
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ggtgtgtgtg acaattgccg ggaccacacc gaaggcaaga actgtgagcg gtgtcagctg 1080
cactatttcc ggaaccggcg cccgggagct tccattcagg agacctgcat ctcctgcgag 1140
tgtgatccgg atggggcagt gccaggggct ccctgtgacc cagtgaccgg gcagtgtgtg 1200
tgcaaggagc atgtgcaggg agagcgctgt gacctatgca agccgggctt cactggactc 1260
acctacgcca acccgcaggg ctgccaccgc tgtgactgca acatcctggg gtcccggagg 1320
gacatgccgt gtgacgagga gagtgggcgc tgcctttgtc tgcccaacgt ggtgggtccc 1380
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tgtgcctgcg acccgcacaa ctccctcagc ccacagtgca accagttcac agggcagtgc 1500
ccctgtcggg aaggctttgg tggcctgatg tgcagcgctg cagccatccg ccagtgtcca 1560
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gggccccgct gtgaccagtg ccagcgaggc tactgtaatc gctacccggt gtgcgtggcc 1740
tgccaccctt gcttccagac ctatgatgcg gacctccggg agcaggccct gcgctttggt 1800
agactccgca atgccaccgc cagcctgtgg tcagggcctg ggctggagga ccgtggcctg 1860
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actctccagg gcctgcagct ggatctgccc ctggaggagg agacgttgtc ccttccgaga 2040
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gagcagtttg aaaaaataag cagtgctgat ccttcaggag ccttccggat gctgagcaca 2160
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cagctcaggg acagccggag agaggcagag aggctggtgc ggcaggcggg aggaggagga 2280
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acacccacct tcaacaagct ctgtggcaac tccaggcaga tggcttgcac cccaatatca 2400
tgccctggtg agctatgtcc ccaagacaat ggcacagcct gtggctcccg ctgcaggggt 2460
gtccttccca gggccggtgg ggccttcttg atggcggggc aggtggctga gcagctgcgg 2520
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tcacagattc aatccagtgc ccagcgcttg gagacccagg tgagcgccag ccgctcccag 2640
atggaggaag atgtcagacg cacacggctc ctaatccagc aggtccggga cttcctaaca 2700
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ctgcccacag actcagctac tgttctgcag aagatgaatg agatccaggc cattgcagcc 2820
aggctcccca acgtggactt ggtgctgtcc cagaccaagc aggacattgc gcgtgcccgc 2880
cggttgcagg ctgaggctga ggaagccagg agccgagccc atgcagtgga gggccaggtg 2940
gaagatgtgg ttgggaacct gcggcagggg acagtggcac tgcaggaagc tcaggacacc 3000
atgcaaggca ccagccgctc ccttcggctt atccaggaca gggttgctga ggttcagcag 3060
gtactgcggc cagcagaaaa gctggtgaca agcatgacca agcagctggg tgacttctgg 3120
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cagcagcttg cggaaggtgc cagcgagcag gcattgagtg cccaagaggg atttgagaga 3240
ataaaacaaa agtatgctga gttgaaggac cggttgggtc agagttccat gctgggtgag 3300
cagggtgccc ggatccagag tgtgaagaca gaggcagagg agctgtttgg ggagaccatg 3360
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atcaatgggc gcgtgctcta ctatgccacc tgcaagtga 3519
<210> 46
<211> 3519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
atgaggccct tcttcctgct gtgctttgcc ctgcctggac tgctgcatgc tcagcaggct 60
tgtagcagag gcgcctgcta tcctcctgtg ggcgatctgc ttgtgggcag aaccagattc 120
ctgcgggcca gctctacatg cggcctgaca aagcctgaga catactgcac ccagtacggc 180
gagtggcaga tgaagtgctg caagtgcgac agcagacagc cccacaacta ctacagccac 240
agagtggaaa acgtggccag cagcagcggc cctatgagat ggtggcagag ccagaacgac 300
gtgaaccccg ttagcctgca gctggacctg gacagacggt ttcagctgca agaagtgatg 360
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aagacctggc gggtgtacca gtatctggcc gccgattgca ccagcacatt ccccagagtt 480
agacagggca gaccccagag ctggcaggat gttcgttgtc agtctctgcc ccagcggcct 540
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ttcacccggc tggctcccgt tcctcagaga ggatatcatc ctcctagcgc ctactacgcc 720
gtgtctcagc ttagactgca gggcagctgc ttctgtcacg gccacgctga tagatgcgcc 780
cctaaacctg gtgcctctgc cggaccttct acagccgtgc aagtgcacga tgtgtgcgtg 840
tgccagcaca ataccgccgg acctaactgc gagagatgtg cccctttcta caacaaccgg 900
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cacagcgaga catgccactt tgaccctgcc gtgtttgccg cttctcaggg cgcttatggc 1020
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cactacttcc ggaatagaag gccaggcgcc agcatccaag agacatgcat cagctgcgag 1140
tgcgatcccg atggtgctgt tcctggcgct ccttgtgatc ctgtgacagg ccagtgcgtg 1200
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acctacgcca atcctcaggg ctgccacaga tgtgattgca acatcctggg cagcagacgg 1320
gacatgccct gtgatgaaga gtctggcaga tgcctgtgcc tgcctaatgt cgtgggcccc 1380
aagtgcgatc agtgtgcccc atatcactgg aagctggcct ctggccaggg atgcgaacct 1440
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tgccatcctt gcttccagac ctacgacgcc gacctgagag aacaggccct gagattcggc 1800
agactgagaa atgccaccgc cagcctttgg agcggacctg gccttgaaga tagaggcctg 1860
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ccagccgtga ccgaacaaga ggtggcccaa gtggctagcg ccatcctgag cctgagaaga 1980
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acccctacct tcaacaagct gtgcggcaac agccggcaga tggcctgcac acctattagc 2400
tgtcctggcg agctgtgccc tcaggataat ggaaccgcct gcggctccag atgtagaggc 2460
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agactgccca atgtggatct ggtgctgagc cagaccaagc aggatatcgc cagagctaga 2880
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gaggacgttg tgggcaatct gagacaggga accgtggctc tgcaagaggc ccaggataca 3000
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cagggcgcca gaattcagag cgtgaaaaca gaggccgagg aactgttcgg cgagacaatg 3360
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atcaacggcc gggtgctgta ctacgccaca tgcaagtaa 3519
<210> 47
<211> 3582
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
atgcctgcgc tctggctggg ctgctgcctc tgcttctcgc tcctcctgcc cgcagcccgg 60
gccacctcca ggagggaagt ctgtgattgc aatgggaagt ccaggcagtg tatctttgat 120
cgggaacttc acagacaaac tggtaatgga ttccgctgcc tcaactgcaa tgacaacact 180
gatggcattc actgcgagaa gtgcaagaat ggcttttacc ggcacagaga aagggaccgc 240
tgtttgccct gcaattgtaa ctccaaaggt tctcttagtg ctcgatgtga caactccgga 300
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agctcagccc aacgactaga ccctgtctat tttgtggctc ctgccaaatt tcttgggaat 780
caacaggtga gctatggtca aagcctgtcc tttgactacc gtgtggacag aggaggcaga 840
cacccatctg cccatgatgt gattctggaa ggtgctggtc tacggatcac agctcccttg 900
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cggaatctca cagccctccg catccgagct acatatggag aatacagtac tgggtacatt 1080
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tttggggacc cctttggtga acatggccca gtgaggcctt gtcagccctg tcaatgcaac 1560
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tgtatccaca acacagccgg catctactgc gaccagtgca aagcaggcta cttcggggac 1680
ccattggctc ccaacccagc agacaagtgt cgagcttgca actgtaaccc catgggctca 1740
gagcctgtag gatgtcgaag tgatggcacc tgtgtttgca agccaggatt tggtggcccc 1800
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aggctcatca ctcagatgca gctgagcctg gcagaaagtg aagcttcctt gggaaacact 2220
aacattcctg cctcagacca ctacgtgggg ccaaatggct ttaaaagtct ggctcaggag 2280
gccacaagat tagcagaaag ccacgttgag tcagccagta acatggagca actgacaagg 2340
gaaactgagg actattccaa acaagccctc tcactggtgc gcaaggccct gcatgaagga 2400
gtcggaagcg gaagcggtag cccggacggt gctgtggtgc aagggcttgt ggaaaaattg 2460
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gcagataggt cttatcagca cagtctccgc ctcctggatt cagtgtctcg gcttcaggga 2580
gtcagtgatc agtcctttca ggtggaagaa gcaaagagga tcaaacaaaa agcggattca 2640
ctctcaagcc tggtaaccag gcatatggat gagttcaagc gtacacagaa gaatctggga 2700
aactggaaag aagaagcaca gcagctctta cagaatggaa aaagtgggag agagaaatca 2760
gatcagctgc tttcccgtgc caatcttgct aaaagcagag cacaagaagc actgagtatg 2820
ggcaatgcca ctttttatga agttgagagc atccttaaaa acctcagaga gtttgacctg 2880
caggtggaca acagaaaagc agaagctgaa gaagccatga agagactctc ctacatcagc 2940
cagaaggttt cagatgccag tgacaagacc cagcaagcag aaagagccct ggggagcgct 3000
gctgctgatg cacagagggc aaagaatggg gccggggagg ccctggaaat ctccagtgag 3060
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gaaaggaagg agctggagtt tgacacgaat atggatgcag tacagatggt gattacagaa 3240
gcccagaagg ttgataccag agccaagaac gctggggtta caatccaaga cacactcaac 3300
acattagacg gcctcctgca tctgatggac cagcctctca gtgtagatga agaggggctg 3360
gtcttactgg agcagaagct ttcccgagcc aagacccaga tcaacagcca actgcggccc 3420
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<210> 48
<211> 3582
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
atgcctgctc tgtggctggg ctgctgcctg tgttttagtc tgctgctgcc agccgccaga 60
gccacatcta gaagagaagt gtgcgactgc aacggcaaga gccggcagtg catcttcgac 120
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gtgcagagaa atggctctcc tgccaagctg cagtggtccc agagacacca ggacgtgttc 720
agcagcgctc agagactgga ccccgtgtac tttgtggccc ctgccaagtt cctgggcaac 780
cagcaagtgt cttacggcca gagcctgagc ttcgactaca gagtggatag aggcggcaga 840
caccccagcg ctcacgatgt gattcttgaa ggcgccggac tgcggatcac agcccctctt 900
atgcctctgg gcaagaccct gccttgtggc ctgaccaaga cctacacctt ccggctgaat 960
gagcacccca gcaacaactg gtccccacag ctgagctact tcgagtacag acggctgctg 1020
cggaacctga cagccctgag aatcagagcc acctacggcg agtacagcac cggctacatc 1080
gacaacgtga ccctgatcag cgccagacct gtttctggtg ctcctgctcc ttgggtcgag 1140
cagtgtatct gtcccgtggg ctacaagggc cagttctgcc aggattgtgc cagcggctac 1200
aagagagact ctgccagact gggccccttc ggcacatgca tcccttgtaa ttgtcaaggc 1260
ggcggagcct gcgatcccga tacaggcgat tgctacagcg gcgacgagaa ccccgatatc 1320
gagtgcgccg attgtcccat cggcttttac aacgaccctc acgaccccag atcctgcaag 1380
ccatgtcctt gccacaatgg cttcagctgc agcgtgatgc ccgaaaccga agaggtcgtg 1440
tgcaacaatt gcccaccagg cgttacaggg gccagatgtg aactgtgtgc cgacggctac 1500
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aacaacgtgg acccaagcgc cagcggcaac tgcgatagac tgacaggcag atgtctgaag 1620
tgcatccaca ataccgccgg gatctactgt gaccagtgca aggccggcta ttttggcgac 1680
cctctggctc ccaatcctgc cgataagtgc agagcctgca actgtaaccc tatgggctct 1740
gagcctgtgg gctgcagatc tgatggaacc tgcgtgtgca agccaggctt tggcggacct 1800
aattgtgaac acggcgcctt tagctgcccc gcctgctaca atcaagtgaa gatccagatg 1860
gaccagttca tgcagcagct gcagaggatg gaagccctga tctctaaagc ccaaggcgga 1920
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<211> 3891
<212> DNA
<213> 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
<400> 49
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gtgaagatta agaacctgct ggacaacgag atctacacca tcgaggaagg cttcaacatc 1200
agcgacaagg acatggaaaa agagtaccgg ggccagaaca aggccattaa caagcaggcc 1260
tacgaggaaa tcagcaaaga acacctggcc gtgtacaaga ttcagatgtg caagagcgtg 1320
aaggcccctg gcatctgcat tgacgtggac aatgaggacc tgttctttat cgccgacaag 1380
aacagcttta gcgacgacct gagcaagaac gagcggatcg agtacaacac ccagagcaac 1440
tacatcgaga acgacttccc catcaacgaa ctgatcctgg acaccgacct gatcagcaag 1500
atcgagctgc ccagcgagaa caccgagagc ctgaccgact tcaatgtgga cgtgcccgtg 1560
tacgagaagc agcccgccat caagaagatc tttaccgacg agaataccat cttccagtac 1620
ctgtacagcc agacctttcc tctggacatc cgggacatca gcctgacctc cagcttcgat 1680
gatgccctgc tgttcagcaa caaggtctac agcttcttca gcatggacta catcaagacc 1740
gccaacaagg tggtggaagc cggcctgttt gccggctggg ttaagcagat cgtgaacgat 1800
ttcgtgatcg aggccaacaa gtccaacacc atggacaaga tcgccgatat ctccctgatc 1860
gtgccctaca tcggactggc cctgaacgtg ggaaacgaga cagccaaggg caacttcgag 1920
aatgccttcg agattgccgg cgctagcatc ctgctcgagt tcatccctga gctgctgatc 1980
cctgtcgtgg gcgcttttct gctggaatcc tacatcgata acaaaaacaa gatcatcaag 2040
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gtggcccagt ggctgagcac cgtgaatacc cagttttaca ccatcaaaga agggatgtac 2160
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tacagcgaga aagagaagtc taacatcaac atcgacttca acgacatcaa cagcaagctc 2280
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ctgaacaata tcatcctgaa cctgcggtac aaggacaaca atctgatcga tctgagcggc 2640
tacggcgcca aggtggaagt gtatgatggc gtggaactga acgataagaa tcagttcaag 2700
ctgaccagca gcgccaactc caagatcaga gtgacccaga accagaacat tatcttcaac 2760
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<210> 53
<211> 2477
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
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Gly Gly Tyr Met Leu Glu Cys Val Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly Glu
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Gln Cys Ile Cys Thr Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Lys Cys Glu Arg
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Val Arg Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro
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Gly Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly
355 360 365
Arg Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu
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Trp Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe
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Cys Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn
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485 490 495
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Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser Val Gly Arg Trp Lys Glu
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Pro Gly Val Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly
675 680 685
His Gln Glu Val Thr Arg Phe Asp Phe Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr
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Pro Val Thr Ser Asn Thr Val Thr Gly Glu Thr Thr Pro Phe Ser Pro
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Leu Val Ala Thr Ser Glu Ser Val Thr Glu Ile Thr Ala Ser Ser Phe
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Val Val Ser Trp Val Ser Ala Ser Asp Thr Val Ser Gly Phe Arg Val
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Glu Tyr Glu Leu Ser Glu Glu Gly Asp Glu Pro Gln Tyr Leu Asp Leu
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Pro Ser Thr Ala Thr Ser Val Asn Ile Pro Asp Leu Leu Pro Gly Arg
770 775 780
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Leu Ile Leu Ser Thr Ser Gln Thr Thr Ala Pro Asp Ala Pro Pro Asp
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Arg Pro Gln Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Val Tyr Ser Pro Ser
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Tyr Ala Val Glu Glu Asn Gln Glu Ser Thr Pro Val Val Ile Gln Gln
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900 905 910
Leu Gln Phe Val Glu Val Thr Asp Val Lys Val Thr Ile Met Trp Thr
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Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
1445 1450 1455
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1540 1545 1550
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1555 1560 1565
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1570 1575 1580
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1605 1610 1615
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Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu
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Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile
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1955 1960 1965
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Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu
1985 1990 1995 2000
Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro
2005 2010 2015
Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly
2020 2025 2030
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<210> 54
<211> 786
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
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Leu Leu Ser Ile Leu His Pro Ser Arg Pro Gly Gly Val Pro Gly Ala
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Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Leu
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Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala
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Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val
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Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val
530 535 540
Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala
545 550 555 560
Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly
565 570 575
Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly
580 585 590
Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly
595 600 605
Phe Gly Ala Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu Ser Pro Glu
610 615 620
Leu Arg Glu Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln His Leu Pro Ser Thr Pro
625 630 635 640
Ser Ser Pro Arg Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys
645 650 655
Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly
660 665 670
Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala
675 680 685
Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val
690 695 700
Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro
705 710 715 720
Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala
725 730 735
Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly
740 745 750
Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser
755 760 765
Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys
770 775 780
Arg Lys
785
<210> 55
<211> 338
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
Met Ser Leu Ser Ala Phe Thr Leu Phe Leu Ala Leu Ile Gly Gly Thr
1 5 10 15
Ser Gly Gln Tyr Tyr Asp Tyr Asp Phe Pro Leu Ser Ile Tyr Gly Gln
20 25 30
Ser Ser Pro Asn Cys Ala Pro Glu Cys Asn Cys Pro Glu Ser Tyr Pro
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Ser Ala Met Tyr Cys Asp Glu Leu Lys Leu Lys Ser Val Pro Met Val
50 55 60
Pro Pro Gly Ile Lys Tyr Leu Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Ile Asp His
65 70 75 80
Ile Asp Glu Lys Ala Phe Glu Asn Val Thr Asp Leu Gln Trp Leu Ile
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Leu Asp His Asn Leu Leu Glu Asn Ser Lys Ile Lys Gly Arg Val Phe
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Leu Thr Phe Ile His Leu Gln His Asn Arg Leu Lys Glu Asp Ala Val
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Ser Ala Ala Phe Lys Gly Leu Lys Ser Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Ser
180 185 190
Phe Asn Gln Ile Ala Arg Leu Pro Ser Gly Leu Pro Val Ser Leu Leu
195 200 205
Thr Leu Tyr Leu Asp Asn Asn Lys Ile Ser Asn Ile Pro Asp Glu Tyr
210 215 220
Phe Lys Arg Phe Asn Ala Leu Gln Tyr Leu Arg Leu Ser His Asn Glu
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Leu Ala Asp Ser Gly Ile Pro Gly Asn Ser Phe Asn Val Ser Ser Leu
245 250 255
Val Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Lys Leu Lys Asn Ile Pro Thr Val
260 265 270
Asn Glu Asn Leu Glu Asn Tyr Tyr Leu Glu Val Asn Gln Leu Glu Lys
275 280 285
Phe Asp Ile Lys Ser Phe Cys Lys Ile Leu Gly Pro Leu Ser Tyr Ser
290 295 300
Lys Ile Lys His Leu Arg Leu Asp Gly Asn Arg Ile Ser Glu Thr Ser
305 310 315 320
Leu Pro Pro Asp Met Tyr Glu Cys Leu Arg Val Ala Asn Glu Val Thr
325 330 335
Leu Asn
<210> 56
<211> 478
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
Met Ala Pro Leu Arg Pro Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ala Trp Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Thr Glu Gly Phe
20 25 30
Asn Val Asp Lys Lys Cys Gln Cys Asp Glu Leu Cys Ser Tyr Tyr Gln
35 40 45
Ser Cys Cys Thr Asp Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gln Val Thr Arg
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Gly Glu Glu Lys Asn Asn Ala Thr Val His Glu Gln Val Gly Gly Pro
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100 105 110
Thr Pro Val Leu Lys Pro Glu Glu Glu Ala Pro Ala Pro Glu Val Gly
115 120 125
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130 135 140
Gly Arg Pro Gln Pro Pro Ala Glu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Lys Pro
145 150 155 160
Phe Asp Ala Phe Thr Asp Leu Lys Asn Gly Ser Leu Phe Ala Phe Arg
165 170 175
Gly Gln Tyr Cys Tyr Glu Leu Asp Glu Lys Ala Val Arg Pro Gly Tyr
180 185 190
Pro Lys Leu Ile Arg Asp Val Trp Gly Ile Glu Gly Pro Ile Asp Ala
195 200 205
Ala Phe Thr Arg Ile Asn Cys Gln Gly Lys Thr Tyr Leu Phe Lys Gly
210 215 220
Ser Gln Tyr Trp Arg Phe Glu Asp Gly Val Leu Asp Pro Asp Tyr Pro
225 230 235 240
Arg Asn Ile Ser Asp Gly Phe Asp Gly Ile Pro Asp Asn Val Asp Ala
245 250 255
Ala Leu Ala Leu Pro Ala His Ser Tyr Ser Gly Arg Glu Arg Val Tyr
260 265 270
Phe Phe Lys Gly Lys Gln Tyr Trp Glu Tyr Gln Phe Gln His Gln Pro
275 280 285
Ser Gln Glu Glu Cys Glu Gly Ser Ser Leu Ser Ala Val Phe Glu His
290 295 300
Phe Ala Met Met Gln Arg Asp Ser Trp Glu Asp Ile Phe Glu Leu Leu
305 310 315 320
Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly Thr Arg Gln Pro Gln Phe Ile Ser
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Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Gln Val Asp Ala Ala Met Ala Gly
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355 360 365
Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly
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Ile Ala Gln Tyr Trp Leu Gly Cys Pro Ala Pro Gly His Leu
465 470 475
<210> 57
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Met Pro Pro Ala Val Arg Arg Ser Ala Cys Ser Met Gly Trp Leu Trp
1 5 10 15
Ile Phe Gly Ala Ala Leu Gly Gln Cys Leu Gly Tyr Ser Ser Gln Gln
20 25 30
Gln Arg Val Pro Phe Leu Gln Pro Pro Gly Gln Ser Gln Leu Gln Ala
35 40 45
Ser Tyr Val Glu Phe Arg Pro Ser Gln Gly Cys Ser Pro Gly Tyr Tyr
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275 280 285
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370 375 380
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530 535 540
Lys Gln Leu Glu Glu Ile Lys Arg Asn Ala Ser Gly Asp Glu Leu Val
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595 600 605
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610 615 620
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645 650 655
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660 665 670
Asp Ala Met Ile Ser Ser Ala Lys Ser Met Val Arg Lys Ala Asn Asp
675 680 685
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690 695 700
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850 855 860
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930 935 940
Ser Phe Pro Pro Tyr Lys Gly Cys Ile Glu Leu Asp Asp Leu Asn Glu
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Asn Val Leu Ser Leu Tyr Asn Phe Lys Lys Thr Phe Asn Leu Asn Thr
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1315 1320 1325
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Thr Asp Gly Lys Lys Leu Arg Ile Lys Ser Lys Glu Lys Cys Asn Asp
1445 1450 1455
Gly Lys Trp His Thr Val Val Phe Gly His Asp Gly Glu Lys Gly Arg
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Leu Val Val Asp Gly Leu Arg Ala Arg Glu Gly Ser Leu Pro Gly Asn
1475 1480 1485
Ser Thr Ile Ser Ile Arg Ala Pro Val Tyr Leu Gly Ser Pro Pro Ser
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Gly Lys Pro Lys Ser Leu Pro Thr Asn Ser Phe Val Gly Cys Leu Lys
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Asn Phe Gln Leu Asp Ser Lys Pro Leu Tyr Thr Pro Ser Ser Ser Phe
1525 1530 1535
Gly Val Ser Ser Cys Leu Gly Gly Pro Leu Glu Lys Gly Ile Tyr Phe
1540 1545 1550
Ser Glu Glu Gly Gly His Val Val Leu Ala His Ser Val Leu Leu Gly
1555 1560 1565
Pro Glu Phe Lys Leu Val Phe Ser Ile Arg Pro Arg Ser Leu Thr Gly
1570 1575 1580
Ile Leu Ile His Ile Gly Ser Gln Pro Gly Lys His Leu Cys Val Tyr
1585 1590 1595 1600
Leu Glu Ala Gly Lys Val Thr Ala Ser Met Asp Ser Gly Ala Gly Gly
1605 1610 1615
Thr Ser Thr Ser Val Thr Pro Lys Gln Ser Leu Cys Asp Gly Gln Trp
1620 1625 1630
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1650 1655 1660
Ser Thr Gln Glu Pro Leu His Leu Gly Gly Ala Pro Ala Asn Leu Thr
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Thr Leu Arg Ile Pro Val Trp Lys Ser Phe Phe Gly Cys Leu Arg Asn
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<210> 58
<211> 1172
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
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Leu Thr Lys Pro Glu Thr Tyr Cys Thr Gln Tyr Gly Glu Trp Gln Met
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180 185 190
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Ala Pro Val Pro Gln Arg Gly Tyr His Pro Pro Ser Ala Tyr Tyr Ala
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Val Ser Gln Leu Arg Leu Gln Gly Ser Cys Phe Cys His Gly His Ala
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Asp Arg Cys Ala Pro Lys Pro Gly Ala Ser Ala Gly Pro Ser Thr Ala
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Gly Ala Tyr Gly Gly Val Cys Asp Asn Cys Arg Asp His Thr Glu Gly
340 345 350
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Gly Ala Ser Ile Gln Glu Thr Cys Ile Ser Cys Glu Cys Asp Pro Asp
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Gly Ala Val Pro Gly Ala Pro Cys Asp Pro Val Thr Gly Gln Cys Val
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Cys Lys Glu His Val Gln Gly Glu Arg Cys Asp Leu Cys Lys Pro Gly
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595 600 605
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Pro Ala Val Thr Glu Gln Glu Val Ala Gln Val Ala Ser Ala Ile Leu
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Ser Leu Arg Arg Thr Leu Gln Gly Leu Gln Leu Asp Leu Pro Leu Glu
660 665 670
Glu Glu Thr Leu Ser Leu Pro Arg Asp Leu Glu Ser Leu Asp Arg Ser
675 680 685
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705 710 715 720
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Arg Leu Leu Asp Gln Leu Arg Asp Ser Arg Arg Glu Ala Glu Arg Leu
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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1025 1030 1035 1040
Thr Arg Met Glu Glu Leu Arg His Gln Ala Arg Gln Gln Gly Ala Glu
1045 1050 1055
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Ser Ala Gln Glu Gly Phe Glu Arg Ile Lys Gln Lys Tyr Ala Glu Leu
1075 1080 1085
Lys Asp Arg Leu Gly Gln Ser Ser Met Leu Gly Glu Gln Gly Ala Arg
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Ile Gln Ser Val Lys Thr Glu Ala Glu Glu Leu Phe Gly Glu Thr Met
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Glu Met Met Asp Arg Met Lys Asp Met Glu Leu Glu Leu Leu Arg Gly
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Ser Gln Ala Ile Met Leu Arg Ser Ala Asp Leu Thr Gly Leu Glu Lys
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1155 1160 1165
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1170
<210> 59
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
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85 90 95
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Cys Asp Arg Cys Leu Pro Gly Phe His Met Leu Thr Asp Ala Gly Cys
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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225 230 235 240
Ser Ser Ala Gln Arg Leu Asp Pro Val Tyr Phe Val Ala Pro Ala Lys
245 250 255
Phe Leu Gly Asn Gln Gln Val Ser Tyr Gly Gln Ser Leu Ser Phe Asp
260 265 270
Tyr Arg Val Asp Arg Gly Gly Arg His Pro Ser Ala His Asp Val Ile
275 280 285
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290 295 300
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370 375 380
Pro Val Gly Tyr Lys Gly Gln Phe Cys Gln Asp Cys Ala Ser Gly Tyr
385 390 395 400
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1045 1050 1055
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Ala Val Gln Met Val Ile Thr Glu Ala Gln Lys Val Asp Thr Arg Ala
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<212> PRT
<213> 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
<400> 60
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Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
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Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
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Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
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885 890 895
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Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro
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Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys
1045 1050 1055
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Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly
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<210> 61
<211> 1291
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌(Clostridium botulinum)
<400> 61
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Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro
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Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
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Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe
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Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile
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355 360 365
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Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp
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Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly
580 585 590
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595 600 605
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675 680 685
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690 695 700
Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr
705 710 715 720
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770 775 780
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Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly
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Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr
1125 1130 1135
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Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr
1155 1160 1165
Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys
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Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp
1185 1190 1195 1200
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Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr
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Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile
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Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu
1250 1255 1260
Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp
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Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu
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<210> 62
<211> 2871
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
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Leu Ala Ser Tyr Thr Ser His Gly Ala Asp Ala Asn Leu Glu Ala Gly
20 25 30
Asn Val Lys Glu Thr Arg Ala Ser Arg Ala Lys Arg Arg Gly Gly Gly
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Pro Asp Ala Ser Gly Arg Asn Cys Ile Asp Ile Asp Glu Cys Leu Val
805 810 815
Asn Arg Leu Leu Cys Asp Asn Gly Leu Cys Arg Asn Thr Pro Gly Ser
820 825 830
Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Val Phe Arg Thr Glu Thr Glu
835 840 845
Thr Cys Glu Asp Ile Asn Glu Cys Glu Ser Asn Pro Cys Val Asn Gly
850 855 860
Ala Cys Arg Asn Asn Leu Gly Ser Phe Asn Cys Glu Cys Ser Pro Gly
865 870 875 880
Ser Lys Leu Ser Ser Thr Gly Leu Ile Cys Ile Asp Ser Leu Lys Gly
885 890 895
Thr Cys Trp Leu Asn Ile Gln Asp Ser Arg Cys Glu Val Asn Ile Asn
900 905 910
Gly Ala Thr Leu Lys Ser Glu Cys Cys Ala Thr Leu Gly Ala Ala Trp
915 920 925
Gly Ser Pro Cys Glu Arg Cys Glu Leu Asp Thr Ala Cys Pro Arg Gly
930 935 940
Leu Ala Arg Ile Lys Gly Val Thr Cys Glu Asp Val Asn Glu Cys Glu
945 950 955 960
Val Phe Pro Gly Val Cys Pro Asn Gly Arg Cys Val Asn Ser Lys Gly
965 970 975
Ser Phe His Cys Glu Cys Pro Glu Gly Leu Thr Leu Asp Gly Thr Gly
980 985 990
Arg Val Cys Leu Asp Ile Arg Met Glu Gln Cys Tyr Leu Lys Trp Asp
995 1000 1005
Glu Asp Glu Cys Ile His Pro Val Pro Gly Lys Phe Arg Met Asp Ala
1010 1015 1020
Cys Cys Cys Ala Val Gly Ala Ala Trp Gly Thr Glu Cys Glu Glu Cys
1025 1030 1035 1040
Pro Lys Pro Gly Thr Lys Glu Tyr Glu Thr Leu Cys Pro Arg Gly Ala
1045 1050 1055
Gly Phe Ala Asn Arg Gly Asp Val Leu Thr Gly Arg Pro Phe Tyr Lys
1060 1065 1070
Asp Ile Asn Glu Cys Lys Ala Phe Pro Gly Met Cys Thr Tyr Gly Lys
1075 1080 1085
Cys Arg Asn Thr Ile Gly Ser Phe Lys Cys Arg Cys Asn Ser Gly Phe
1090 1095 1100
Ala Leu Asp Met Glu Glu Arg Asn Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Arg
1105 1110 1115 1120
Ile Ser Pro Asp Leu Cys Gly Ser Gly Ile Cys Val Asn Thr Pro Gly
1125 1130 1135
Ser Phe Glu Cys Glu Cys Phe Glu Gly Tyr Glu Ser Gly Phe Met Met
1140 1145 1150
Met Lys Asn Cys Met Asp Ile Asp Glu Cys Glu Arg Asn Pro Leu Leu
1155 1160 1165
Cys Arg Gly Gly Thr Cys Val Asn Thr Glu Gly Ser Phe Gln Cys Asp
1170 1175 1180
Cys Pro Leu Gly His Glu Leu Ser Pro Ser Arg Glu Asp Cys Val Asp
1185 1190 1195 1200
Ile Asn Glu Cys Ser Leu Ser Asp Asn Leu Cys Arg Asn Gly Lys Cys
1205 1210 1215
Val Asn Met Ile Gly Thr Tyr Gln Cys Ser Cys Asn Pro Gly Tyr Gln
1220 1225 1230
Ala Thr Pro Asp Arg Gln Gly Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Met Ile
1235 1240 1245
Met Asn Gly Gly Cys Asp Thr Gln Cys Thr Asn Ser Glu Gly Ser Tyr
1250 1255 1260
Glu Cys Ser Cys Ser Glu Gly Tyr Ala Leu Met Pro Asp Gly Arg Ser
1265 1270 1275 1280
Cys Ala Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Asn Pro Asp Ile Cys Asp Gly
1285 1290 1295
Gly Gln Cys Thr Asn Ile Pro Gly Glu Tyr Arg Cys Leu Cys Tyr Asp
1300 1305 1310
Gly Phe Met Ala Ser Met Asp Met Lys Thr Cys Ile Asp Val Asn Glu
1315 1320 1325
Cys Asp Leu Asn Ser Asn Ile Cys Met Phe Gly Glu Cys Glu Asn Thr
1330 1335 1340
Lys Gly Ser Phe Ile Cys His Cys Gln Leu Gly Tyr Ser Val Lys Lys
1345 1350 1355 1360
Gly Thr Thr Gly Cys Thr Asp Val Asp Glu Cys Glu Ile Gly Ala His
1365 1370 1375
Asn Cys Asp Met His Ala Ser Cys Leu Asn Ile Pro Gly Ser Phe Lys
1380 1385 1390
Cys Ser Cys Arg Glu Gly Trp Ile Gly Asn Gly Ile Lys Cys Ile Asp
1395 1400 1405
Leu Asp Glu Cys Ser Asn Gly Thr His Gln Cys Ser Ile Asn Ala Gln
1410 1415 1420
Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Ala Cys Ser Glu Gly Phe
1425 1430 1435 1440
Thr Gly Asp Gly Phe Thr Cys Ser Asp Val Asp Glu Cys Ala Glu Asn
1445 1450 1455
Ile Asn Leu Cys Glu Asn Gly Gln Cys Leu Asn Val Pro Gly Ala Tyr
1460 1465 1470
Arg Cys Glu Cys Glu Met Gly Phe Thr Pro Ala Ser Asp Ser Arg Ser
1475 1480 1485
Cys Gln Asp Ile Asp Glu Cys Ser Phe Gln Asn Ile Cys Val Phe Gly
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Thr Cys Asn Asn Leu Pro Gly Met Phe His Cys Ile Cys Asp Asp Gly
1505 1510 1515 1520
Tyr Glu Leu Asp Arg Thr Gly Gly Asn Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys
1525 1530 1535
Ala Asp Pro Ile Asn Cys Val Asn Gly Leu Cys Val Asn Thr Pro Gly
1540 1545 1550
Arg Tyr Glu Cys Asn Cys Pro Pro Asp Phe Gln Leu Asn Pro Thr Gly
1555 1560 1565
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1570 1575 1580
Pro Arg Gly Asp Gly Ser Leu Ser Cys Asn Thr Glu Ile Gly Val Gly
1585 1590 1595 1600
Val Ser Arg Ser Ser Cys Cys Cys Ser Leu Gly Lys Ala Trp Gly Asn
1605 1610 1615
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1620 1625 1630
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1650 1655 1660
Asn Cys Ile Asn Thr Phe Gly Ser Phe Gln Cys Glu Cys Pro Gln Gly
1665 1670 1675 1680
Tyr Tyr Leu Ser Glu Asp Thr Arg Ile Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys
1685 1690 1695
Phe Ala His Pro Gly Val Cys Gly Pro Gly Thr Cys Tyr Asn Thr Leu
1700 1705 1710
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1715 1720 1725
Gly His Asn Cys Met Asp Met Arg Lys Ser Phe Cys Tyr Arg Ser Tyr
1730 1735 1740
Asn Gly Thr Thr Cys Glu Asn Glu Leu Pro Phe Asn Val Thr Lys Arg
1745 1750 1755 1760
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1765 1770 1775
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1780 1785 1790
Asn Ile Pro Gly Phe Thr Phe Asp Ile His Thr Gly Lys Ala Val Asp
1795 1800 1805
Ile Asp Glu Cys Lys Glu Ile Pro Gly Ile Cys Ala Asn Gly Val Cys
1810 1815 1820
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1825 1830 1835 1840
Tyr Asn Asp Leu Leu Leu Val Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Asn
1845 1850 1855
Gly Asp Asn Leu Cys Gln Arg Asn Ala Asp Cys Ile Asn Ser Pro Gly
1860 1865 1870
Ser Tyr Arg Cys Glu Cys Ala Ala Gly Phe Lys Leu Ser Pro Asn Gly
1875 1880 1885
Ala Cys Val Asp Arg Asn Glu Cys Leu Glu Ile Pro Asn Val Cys Ser
1890 1895 1900
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1905 1910 1915 1920
Asn Gly Phe Lys Ala Ser Gln Asp Gln Thr Met Cys Met Asp Val Asp
1925 1930 1935
Glu Cys Glu Arg His Pro Cys Gly Asn Gly Thr Cys Lys Asn Thr Val
1940 1945 1950
Gly Ser Tyr Asn Cys Leu Cys Tyr Pro Gly Phe Glu Leu Thr His Asn
1955 1960 1965
Asn Asp Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Ser Phe Phe Gly Gln Val
1970 1975 1980
Cys Arg Asn Gly Arg Cys Phe Asn Glu Ile Gly Ser Phe Lys Cys Leu
1985 1990 1995 2000
Cys Asn Glu Gly Tyr Glu Leu Thr Pro Asp Gly Lys Asn Cys Ile Asp
2005 2010 2015
Thr Asn Glu Cys Val Ala Leu Pro Gly Ser Cys Ser Pro Gly Thr Cys
2020 2025 2030
Gln Asn Leu Glu Gly Ser Phe Arg Cys Ile Cys Pro Pro Gly Tyr Glu
2035 2040 2045
Val Lys Ser Glu Asn Cys Ile Asp Ile Asn Glu Cys Asp Glu Asp Pro
2050 2055 2060
Asn Ile Cys Leu Phe Gly Ser Cys Thr Asn Thr Pro Gly Gly Phe Gln
2065 2070 2075 2080
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2085 2090 2095
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2100 2105 2110
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2145 2150 2155 2160
Thr Val Pro Ser Leu His Asp Thr Arg Glu Asp Val Asn Glu Cys Leu
2165 2170 2175
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2180 2185 2190
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2195 2200 2205
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2210 2215 2220
Asn Gly Thr Cys Thr Asn Val Ile Gly Ser Phe Glu Cys Asn Cys Asn
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2275 2280 2285
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2290 2295 2300
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Cys Ile Cys Pro Pro Gly Met Ala Arg Arg Pro Asp Gly Glu Gly Cys
2325 2330 2335
Val Asp Glu Asn Glu Cys Arg Thr Lys Pro Gly Ile Cys Glu Asn Gly
2340 2345 2350
Arg Cys Val Asn Ile Ile Gly Ser Tyr Arg Cys Glu Cys Asn Glu Gly
2355 2360 2365
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2370 2375 2380
Leu Cys Phe Ala Glu Val Leu Gln Thr Ile Cys Gln Met Ala Ser Ser
2385 2390 2395 2400
Ser Arg Asn Leu Val Thr Lys Ser Glu Cys Cys Cys Asp Gly Gly Arg
2405 2410 2415
Gly Trp Gly His Gln Cys Glu Leu Cys Pro Leu Pro Gly Thr Ala Gln
2420 2425 2430
Tyr Lys Lys Ile Cys Pro His Gly Pro Gly Tyr Thr Thr Asp Gly Arg
2435 2440 2445
Asp Ile Asp Glu Cys Lys Val Met Pro Asn Leu Cys Thr Asn Gly Gln
2450 2455 2460
Cys Ile Asn Thr Met Gly Ser Phe Arg Cys Phe Cys Lys Val Gly Tyr
2465 2470 2475 2480
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2485 2490 2495
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2500 2505 2510
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2515 2520 2525
Thr Cys Lys Asp Leu Asp Glu Cys Gln Thr Lys Gln His Asn Cys Gln
2530 2535 2540
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2545 2550 2555 2560
Gly Phe Thr Gln His His Thr Ala Cys Ile Asp Asn Asn Glu Cys Gly
2565 2570 2575
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2580 2585 2590
Gly Ser Phe Ser Cys Glu Cys Gln Arg Gly Phe Ser Leu Asp Ala Thr
2595 2600 2605
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Gln Gly Tyr Ile Gln His Tyr Gln Trp Asn Gln Cys Val Asp Glu Asn
2645 2650 2655
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2660 2665 2670
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2675 2680 2685
Phe Ser Ser Ala Cys His Asp Val Asn Glu Cys Ser Ser Ser Lys Asn
2690 2695 2700
Pro Cys Asn Tyr Gly Cys Ser Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Leu Cys Gly
2705 2710 2715 2720
Cys Pro Pro Gly Tyr Tyr Arg Val Gly Gln Gly His Cys Val Ser Gly
2725 2730 2735
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2740 2745 2750
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2755 2760 2765
Gly Tyr Ser Lys Lys Asp Ser Arg Gln Lys Arg Ser Ile His Glu Pro
2770 2775 2780
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Ser Pro Val Asn Met Lys Phe Asn Leu Ser His Leu Gly Ser Lys Glu
2805 2810 2815
His Ile Leu Glu Leu Arg Pro Ala Ile Gln Pro Leu Asn Asn His Ile
2820 2825 2830
Arg Tyr Val Ile Ser Gln Gly Asn Asp Asp Ser Val Phe Arg Ile His
2835 2840 2845
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Pro Gly Thr Tyr Thr Leu Glu Ile Thr Ser Ile Pro Leu Tyr Lys Lys
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Lys Glu Leu Lys Lys Leu Glu Glu Ser Asn Glu Asp Asp Tyr Leu Leu
2885 2890 2895
Gly Glu Leu Gly Glu Ala Leu Arg Met Arg Leu Gln Ile Gln Leu Tyr
2900 2905 2910
<210> 64
<211> 2809
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
Met Thr Leu Glu Gly Leu Tyr Leu Ala Arg Gly Pro Leu Ala Arg Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Trp Ser Ala Leu Leu Cys Met Ala Gly Gly Gln Gly Arg
20 25 30
Trp Asp Gly Ala Leu Glu Ala Ala Gly Pro Gly Arg Val Arg Arg Arg
35 40 45
Gly Ser Pro Gly Ile Leu Gln Gly Pro Asn Val Cys Gly Ser Arg Phe
50 55 60
His Ala Tyr Cys Cys Pro Gly Trp Arg Thr Phe Pro Gly Arg Ser Gln
65 70 75 80
Cys Val Val Pro Ile Cys Arg Arg Ala Cys Gly Glu Gly Phe Cys Ser
85 90 95
Gln Pro Asn Leu Cys Thr Cys Ala Asp Gly Thr Leu Ala Pro Ser Cys
100 105 110
Gly Val Ser Arg Gly Ser Gly Cys Ser Val Ser Cys Met Asn Gly Gly
115 120 125
Thr Cys Arg Gly Ala Ser Cys Leu Cys Gln Lys Gly Tyr Thr Gly Thr
130 135 140
Val Cys Gly Gln Pro Ile Cys Asp Arg Gly Cys His Asn Gly Gly Arg
145 150 155 160
Cys Ile Gly Pro Asn Arg Cys Ala Cys Val Tyr Gly Phe Met Gly Pro
165 170 175
Gln Cys Glu Arg Asp Tyr Arg Thr Gly Pro Cys Phe Gly Gln Val Gly
180 185 190
Pro Glu Gly Cys Gln His Gln Leu Thr Gly Leu Val Cys Thr Lys Ala
195 200 205
Leu Cys Cys Ala Thr Val Gly Arg Ala Trp Gly Leu Pro Cys Glu Leu
210 215 220
Cys Pro Ala Gln Pro His Pro Cys Arg Arg Gly Phe Ile Pro Asn Ile
225 230 235 240
His Thr Gly Ala Cys Gln Asp Val Asp Glu Cys Gln Ala Val Pro Gly
245 250 255
Leu Cys Gln Gly Gly Ser Cys Val Asn Met Val Gly Ser Phe His Cys
260 265 270
Arg Cys Pro Val Gly His Arg Leu Ser Asp Ser Ser Ala Ala Cys Glu
275 280 285
Asp Tyr Arg Ala Gly Ala Cys Phe Ser Val Leu Phe Gly Gly Arg Cys
290 295 300
Ala Gly Asp Leu Ala Gly His Tyr Thr Arg Arg Gln Cys Cys Cys Asp
305 310 315 320
Arg Gly Arg Cys Trp Ala Ala Gly Pro Val Pro Glu Leu Cys Pro Pro
325 330 335
Arg Gly Ser Asn Glu Phe Gln Gln Leu Cys Ala Gln Arg Leu Pro Leu
340 345 350
Leu Pro Gly His Pro Gly Leu Phe Pro Gly Leu Leu Gly Phe Gly Ser
355 360 365
Asn Gly Met Gly Pro Pro Leu Gly Pro Ala Arg Leu Asn Pro His Gly
370 375 380
Ser Asp Ala Arg Gly Ile Pro Ser Leu Gly Pro Gly Asn Ser Asn Ile
385 390 395 400
Gly Thr Ala Thr Leu Asn Gln Thr Ile Asp Ile Cys Arg His Phe Thr
405 410 415
Asn Leu Cys Leu Asn Gly Arg Cys Leu Pro Thr Pro Ser Ser Tyr Arg
420 425 430
Cys Glu Cys Asn Val Gly Tyr Thr Gln Asp Val Arg Gly Glu Cys Ile
435 440 445
Asp Val Asp Glu Cys Thr Ser Ser Pro Cys His His Gly Asp Cys Val
450 455 460
Asn Ile Pro Gly Thr Tyr His Cys Arg Cys Tyr Pro Gly Phe Gln Ala
465 470 475 480
Thr Pro Thr Arg Gln Ala Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ile Val Ser
485 490 495
Gly Gly Leu Cys His Leu Gly Arg Cys Val Asn Thr Glu Gly Ser Phe
500 505 510
Gln Cys Val Cys Asn Ala Gly Phe Glu Leu Ser Pro Asp Gly Lys Asn
515 520 525
Cys Val Asp His Asn Glu Cys Ala Thr Ser Thr Met Cys Val Asn Gly
530 535 540
Val Cys Leu Asn Glu Asp Gly Ser Phe Ser Cys Leu Cys Lys Pro Gly
545 550 555 560
Phe Leu Leu Ala Pro Gly Gly His Tyr Cys Met Asp Ile Asp Glu Cys
565 570 575
Gln Thr Pro Gly Ile Cys Val Asn Gly His Cys Thr Asn Thr Glu Gly
580 585 590
Ser Phe Arg Cys Gln Cys Leu Gly Gly Leu Ala Val Gly Thr Asp Gly
595 600 605
Arg Val Cys Val Asp Thr His Val Arg Ser Thr Cys Tyr Gly Ala Ile
610 615 620
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625 630 635 640
Glu Cys Cys Cys Ala Asn Pro Asp His Gly Phe Gly Glu Pro Cys Gln
645 650 655
Leu Cys Pro Ala Lys Asp Ser Ala Glu Phe Gln Ala Leu Cys Ser Ser
660 665 670
Gly Leu Gly Ile Thr Thr Asp Gly Arg Asp Ile Asn Glu Cys Ala Leu
675 680 685
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Tyr Arg Cys Val Cys Asn Leu Gly Tyr Glu Ala Gly Ala Ser Gly Lys
705 710 715 720
Asp Cys Thr Asp Val Asp Glu Cys Ala Leu Asn Ser Leu Leu Cys Asp
725 730 735
Asn Gly Trp Cys Gln Asn Ser Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Ser Cys Pro
740 745 750
Pro Gly Phe His Phe Trp Gln Asp Thr Glu Ile Cys Lys Asp Val Asp
755 760 765
Glu Cys Leu Ser Ser Pro Cys Val Ser Gly Val Cys Arg Asn Leu Ala
770 775 780
Gly Ser Tyr Thr Cys Lys Cys Gly Pro Gly Ser Arg Leu Asp Pro Ser
785 790 795 800
Gly Thr Phe Cys Leu Asp Ser Thr Lys Gly Thr Cys Trp Leu Lys Ile
805 810 815
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820 825 830
Glu Cys Cys Ala Thr Leu Gly Ala Ala Trp Gly Ser Pro Cys Glu Arg
835 840 845
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850 855 860
Val Thr Cys Asp Asp Val Asn Glu Cys Glu Ser Phe Pro Gly Val Cys
865 870 875 880
Pro Asn Gly Arg Cys Val Asn Thr Ala Gly Ser Phe Arg Cys Glu Cys
885 890 895
Pro Glu Gly Leu Met Leu Asp Ala Ser Gly Arg Leu Cys Val Asp Val
900 905 910
Arg Leu Glu Pro Cys Phe Leu Arg Trp Asp Glu Asp Glu Cys Gly Val
915 920 925
Thr Leu Pro Gly Lys Tyr Arg Met Asp Val Cys Cys Cys Ser Ile Gly
930 935 940
Ala Val Trp Gly Val Glu Cys Glu Ala Cys Pro Asp Pro Glu Ser Leu
945 950 955 960
Glu Phe Ala Ser Leu Cys Pro Arg Gly Leu Gly Phe Ala Ser Arg Asp
965 970 975
Phe Leu Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Lys Asp Val Asn Glu Cys Lys Val
980 985 990
Phe Pro Gly Leu Cys Thr His Gly Thr Cys Arg Asn Thr Val Gly Ser
995 1000 1005
Phe His Cys Ala Cys Ala Gly Gly Phe Ala Leu Asp Ala Gln Glu Arg
1010 1015 1020
Asn Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Arg Ile Ser Pro Asp Leu Cys Gly
1025 1030 1035 1040
Gln Gly Thr Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe Glu Cys Glu Cys Phe
1045 1050 1055
Pro Gly Tyr Glu Ser Gly Phe Met Leu Met Lys Asn Cys Met Asp Val
1060 1065 1070
Asp Glu Cys Ala Arg Asp Pro Leu Leu Cys Arg Gly Gly Thr Cys Thr
1075 1080 1085
Asn Thr Asp Gly Ser Tyr Lys Cys Gln Cys Pro Pro Gly His Glu Leu
1090 1095 1100
Thr Ala Lys Gly Thr Ala Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Leu Ser
1105 1110 1115 1120
Asp Gly Leu Cys Pro His Gly Gln Cys Val Asn Val Ile Gly Ala Phe
1125 1130 1135
Gln Cys Ser Cys His Ala Gly Phe Gln Ser Thr Pro Asp Arg Gln Gly
1140 1145 1150
Cys Val Asp Ile Asn Glu Cys Arg Val Gln Asn Gly Gly Cys Asp Val
1155 1160 1165
His Cys Ile Asn Thr Glu Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Cys Gly Gln Gly
1170 1175 1180
Tyr Ser Leu Met Pro Asp Gly Arg Ala Cys Ala Asp Val Asp Glu Cys
1185 1190 1195 1200
Glu Glu Asn Pro Arg Val Cys Asp Gln Gly His Cys Thr Asn Met Pro
1205 1210 1215
Gly Gly His Arg Cys Leu Cys Tyr Asp Gly Phe Met Ala Thr Pro Asp
1220 1225 1230
Met Arg Thr Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Asp Leu Asn Pro His Ile
1235 1240 1245
Cys Leu His Gly Asp Cys Glu Asn Thr Lys Gly Ser Phe Val Cys His
1250 1255 1260
Cys Gln Leu Gly Tyr Met Val Arg Lys Gly Ala Thr Gly Cys Ser Asp
1265 1270 1275 1280
Val Asp Glu Cys Glu Val Gly Gly His Asn Cys Asp Ser His Ala Ser
1285 1290 1295
Cys Leu Asn Ile Pro Gly Ser Phe Ser Cys Arg Cys Leu Pro Gly Trp
1300 1305 1310
Val Gly Asp Gly Phe Glu Cys His Asp Leu Asp Glu Cys Val Ser Gln
1315 1320 1325
Glu His Arg Cys Ser Pro Arg Gly Asp Cys Leu Asn Val Pro Gly Ser
1330 1335 1340
Tyr Arg Cys Thr Cys Arg Gln Gly Phe Ala Gly Asp Gly Phe Phe Cys
1345 1350 1355 1360
Glu Asp Arg Asp Glu Cys Ala Glu Asn Val Asp Leu Cys Asp Asn Gly
1365 1370 1375
Gln Cys Leu Asn Ala Pro Gly Gly Tyr Arg Cys Glu Cys Glu Met Gly
1380 1385 1390
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1395 1400 1405
Ala Gln Gly Asn Leu Cys Ala Phe Gly Ser Cys Glu Asn Leu Pro Gly
1410 1415 1420
Met Phe Arg Cys Ile Cys Asn Gly Gly Tyr Glu Leu Asp Arg Gly Gly
1425 1430 1435 1440
Gly Asn Cys Thr Asp Ile Asn Glu Cys Ala Asp Pro Val Asn Cys Ile
1445 1450 1455
Asn Gly Val Cys Ile Asn Thr Pro Gly Ser Tyr Leu Cys Ser Cys Pro
1460 1465 1470
Gln Asp Phe Glu Leu Asn Pro Ser Gly Val Gly Cys Val Asp Thr Arg
1475 1480 1485
Ala Gly Asn Cys Phe Leu Glu Thr His Asp Arg Gly Asp Ser Gly Ile
1490 1495 1500
Ser Cys Ser Ala Glu Ile Gly Val Gly Val Thr Arg Ala Ser Cys Cys
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Cys Ser Leu Gly Arg Ala Trp Gly Asn Pro Cys Glu Leu Cys Pro Met
1525 1530 1535
Ala Asn Thr Thr Glu Tyr Arg Thr Leu Cys Pro Gly Gly Glu Gly Phe
1540 1545 1550
Gln Pro Asn Arg Ile Thr Val Ile Leu Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln
1555 1560 1565
Glu Leu Pro Gly Leu Cys Gln Gly Gly Asp Cys Val Asn Thr Phe Gly
1570 1575 1580
Ser Phe Gln Cys Glu Cys Pro Pro Gly Tyr His Leu Ser Glu His Thr
1585 1590 1595 1600
Arg Ile Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Thr His Ser Gly Ile Cys
1605 1610 1615
Gly Pro Gly Thr Cys Tyr Asn Thr Leu Gly Asn Tyr Thr Cys Val Cys
1620 1625 1630
Pro Ala Glu Tyr Leu Gln Val Asn Gly Gly Asn Asn Cys Met Asp Met
1635 1640 1645
Arg Lys Ser Val Cys Phe Arg His Tyr Asn Gly Thr Cys Gln Asn Glu
1650 1655 1660
Leu Ala Phe Asn Val Thr Arg Lys Met Cys Cys Cys Ser Tyr Asn Ile
1665 1670 1675 1680
Gly Gln Ala Trp Asn Arg Pro Cys Glu Ala Cys Pro Thr Pro Ile Ser
1685 1690 1695
Pro Asp Tyr Gln Ile Leu Cys Gly Asn Gln Ala Pro Gly Phe Leu Thr
1700 1705 1710
Asp Ile His Thr Gly Lys Pro Leu Asp Ile Asp Glu Cys Gly Glu Ile
1715 1720 1725
Pro Ala Ile Cys Ala Asn Gly Ile Cys Ile Asn Gln Ile Gly Ser Phe
1730 1735 1740
Arg Cys Glu Cys Pro Ala Gly Phe Asn Tyr Asn Ser Ile Leu Leu Ala
1745 1750 1755 1760
Cys Glu Asp Val Asp Glu Cys Gly Ser Arg Glu Ser Pro Cys Gln Gln
1765 1770 1775
Asn Ala Asp Cys Ile Asn Ile Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Lys Cys Thr
1780 1785 1790
Arg Gly Tyr Lys Leu Ser Pro Gly Gly Ala Cys Val Gly Arg Asn Glu
1795 1800 1805
Cys Arg Glu Ile Pro Asn Val Cys Ser His Gly Asp Cys Met Asp Thr
1810 1815 1820
Glu Gly Ser Tyr Met Cys Leu Cys His Arg Gly Phe Gln Ala Ser Ala
1825 1830 1835 1840
Asp Gln Thr Leu Cys Met Asp Ile Asp Glu Cys Asp Arg Gln Pro Cys
1845 1850 1855
Gly Asn Gly Thr Cys Lys Asn Ile Ile Gly Ser Tyr Asn Cys Leu Cys
1860 1865 1870
Phe Pro Gly Phe Val Val Thr His Asn Gly Asp Cys Val Asp Phe Asp
1875 1880 1885
Glu Cys Thr Thr Leu Val Gly Gln Val Cys Arg Phe Gly His Cys Leu
1890 1895 1900
Asn Thr Ala Gly Ser Phe His Cys Leu Cys Gln Asp Gly Phe Glu Leu
1905 1910 1915 1920
Thr Ala Asp Gly Lys Asn Cys Val Asp Thr Asn Glu Cys Leu Ser Leu
1925 1930 1935
Ala Gly Thr Cys Leu Pro Gly Thr Cys Gln Asn Leu Glu Gly Ser Phe
1940 1945 1950
Arg Cys Ile Cys Pro Pro Gly Phe Gln Val Gln Ser Asp His Cys Ile
1955 1960 1965
Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu Glu Pro Asn Leu Cys Leu Phe Gly Thr
1970 1975 1980
Cys Thr Asn Ser Pro Gly Ser Phe Gln Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe
1985 1990 1995 2000
Val Leu Ser Asp Asn Gly His Arg Cys Phe Asp Thr Arg Gln Ser Phe
2005 2010 2015
Cys Phe Thr Arg Phe Glu Ala Gly Lys Cys Ser Val Pro Lys Ala Phe
2020 2025 2030
Asn Thr Thr Lys Thr Arg Cys Cys Cys Ser Lys Arg Pro Gly Glu Gly
2035 2040 2045
Trp Gly Asp Pro Cys Glu Leu Cys Pro Gln Glu Gly Ser Ala Ala Phe
2050 2055 2060
Gln Glu Leu Cys Pro Phe Gly His Gly Ala Val Pro Gly Pro Asp Asp
2065 2070 2075 2080
Ser Arg Glu Asp Val Asn Glu Cys Ala Glu Asn Pro Gly Val Cys Thr
2085 2090 2095
Asn Gly Val Cys Val Asn Thr Asp Gly Ser Phe Arg Cys Glu Cys Pro
2100 2105 2110
Phe Gly Tyr Ser Leu Asp Phe Thr Gly Ile Asn Cys Val Asp Thr Asp
2115 2120 2125
Glu Cys Ser Val Gly His Pro Cys Gly Gln Gly Thr Cys Thr Asn Val
2130 2135 2140
Ile Gly Gly Phe Glu Cys Ala Cys Ala Asp Gly Phe Glu Pro Gly Leu
2145 2150 2155 2160
Met Met Thr Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Leu Asn Pro Leu Leu
2165 2170 2175
Cys Ala Phe Arg Cys His Asn Thr Glu Gly Ser Tyr Leu Cys Thr Cys
2180 2185 2190
Pro Ala Gly Tyr Thr Leu Arg Glu Asp Gly Ala Met Cys Arg Asp Val
2195 2200 2205
Asp Glu Cys Ala Asp Gly Gln Gln Asp Cys His Ala Arg Gly Met Glu
2210 2215 2220
Cys Lys Asn Leu Ile Gly Thr Phe Ala Cys Val Cys Pro Pro Gly Met
2225 2230 2235 2240
Arg Pro Leu Pro Gly Ser Gly Glu Gly Cys Thr Asp Asp Asn Glu Cys
2245 2250 2255
His Ala Gln Pro Asp Leu Cys Val Asn Gly Arg Cys Val Asn Thr Ala
2260 2265 2270
Gly Ser Phe Arg Cys Asp Cys Asp Glu Gly Phe Gln Pro Ser Pro Thr
2275 2280 2285
Leu Thr Glu Cys His Asp Ile Arg Gln Gly Pro Cys Phe Ala Glu Val
2290 2295 2300
Leu Gln Thr Met Cys Arg Ser Leu Ser Ser Ser Ser Glu Ala Val Thr
2305 2310 2315 2320
Arg Ala Glu Cys Cys Cys Gly Gly Gly Arg Gly Trp Gly Pro Arg Cys
2325 2330 2335
Glu Leu Cys Pro Leu Pro Gly Thr Ser Ala Tyr Arg Lys Leu Cys Pro
2340 2345 2350
His Gly Ser Gly Tyr Thr Ala Glu Gly Arg Asp Val Asp Glu Cys Arg
2355 2360 2365
Met Leu Ala His Leu Cys Ala His Gly Glu Cys Ile Asn Ser Leu Gly
2370 2375 2380
Ser Phe Arg Cys His Cys Gln Ala Gly Tyr Thr Pro Asp Ala Thr Ala
2385 2390 2395 2400
Thr Thr Cys Leu Asp Met Asp Glu Cys Ser Gln Val Pro Lys Pro Cys
2405 2410 2415
Thr Phe Leu Cys Lys Asn Thr Lys Gly Ser Phe Leu Cys Ser Cys Pro
2420 2425 2430
Arg Gly Tyr Leu Leu Glu Glu Asp Gly Arg Thr Cys Lys Asp Leu Asp
2435 2440 2445
Glu Cys Thr Ser Arg Gln His Asn Cys Gln Phe Leu Cys Val Asn Thr
2450 2455 2460
Val Gly Ala Phe Thr Cys Arg Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gln His His
2465 2470 2475 2480
Gln Ala Cys Phe Asp Asn Asp Glu Cys Ser Ala Gln Pro Gly Pro Cys
2485 2490 2495
Gly Ala His Gly His Cys His Asn Thr Pro Gly Ser Phe Arg Cys Glu
2500 2505 2510
Cys His Gln Gly Phe Thr Leu Val Ser Ser Gly His Gly Cys Glu Asp
2515 2520 2525
Val Asn Glu Cys Asp Gly Pro His Arg Cys Gln His Gly Cys Gln Asn
2530 2535 2540
Gln Leu Gly Gly Tyr Arg Cys Ser Cys Pro Gln Gly Phe Thr Gln His
2545 2550 2555 2560
Ser Gln Trp Ala Gln Cys Val Asp Glu Asn Glu Cys Ala Leu Ser Pro
2565 2570 2575
Pro Thr Cys Gly Ser Ala Ser Cys Arg Asn Thr Leu Gly Gly Phe Arg
2580 2585 2590
Cys Val Cys Pro Ser Gly Phe Asp Phe Asp Gln Ala Leu Gly Gly Cys
2595 2600 2605
Gln Glu Val Asp Glu Cys Ala Gly Arg Arg Gly Pro Cys Ser Tyr Ser
2610 2615 2620
Cys Ala Asn Thr Pro Gly Gly Phe Leu Cys Gly Cys Pro Gln Gly Tyr
2625 2630 2635 2640
Phe Arg Ala Gly Gln Gly His Cys Val Ser Gly Leu Gly Phe Ser Pro
2645 2650 2655
Gly Pro Gln Asp Thr Pro Asp Lys Glu Glu Leu Leu Ser Ser Glu Ala
2660 2665 2670
Cys Tyr Glu Cys Lys Ile Asn Gly Leu Ser Pro Arg Asp Arg Pro Arg
2675 2680 2685
Arg Ser Ala His Arg Asp His Gln Val Asn Leu Ala Thr Leu Asp Ser
2690 2695 2700
Glu Ala Leu Leu Thr Leu Gly Leu Asn Leu Ser His Leu Gly Arg Ala
2705 2710 2715 2720
Glu Arg Ile Leu Glu Leu Arg Pro Ala Leu Glu Gly Leu Glu Gly Arg
2725 2730 2735
Ile Arg Tyr Val Ile Val Arg Gly Asn Glu Gln Gly Phe Phe Arg Met
2740 2745 2750
His His Leu Arg Gly Val Ser Ser Leu Gln Leu Gly Arg Arg Arg Pro
2755 2760 2765
Gly Pro Gly Thr Tyr Arg Leu Glu Val Val Ser His Met Ala Gly Pro
2770 2775 2780
Trp Gly Val Gln Pro Glu Gly Gln Pro Gly Pro Trp Gly Gln Ala Leu
2785 2790 2795 2800
Arg Leu Lys Val Gln Leu Gln Leu Leu
2805

Claims (75)

1.一种重组疱疹病毒基因组，所述重组疱疹病毒基因组包含编码包含第一美容蛋白的第一多肽的第一多核苷酸。
2.如权利要求1所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组疱疹病毒基因组包含所述第一多核苷酸的两个或更多个拷贝。
3.如权利要求1或权利要求2所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组疱疹病毒基因组是有复制能力的。
4.如权利要求1或权利要求2所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组疱疹病毒基因组是复制缺陷性的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组疱疹病毒基因组选自由以下组成的组：重组单纯疱疹病毒基因组、重组水痘带状疱疹病毒基因组、重组人巨细胞病毒基因组、重组疱疹病毒6A基因组、重组疱疹病毒6B基因组、重组疱疹病毒7基因组、重组卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒基因组以及它们的任何衍生物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组疱疹病毒基因组是重组单纯疱疹病毒基因组。
7.如权利要求6所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组1型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组、重组2型单纯疱疹病毒(HSV-2)基因组或它们的任何衍生物。
8.如权利要求6或权利要求7所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组1型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组。
9.如权利要求6-8中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组包含失活性突变。
10.如权利要求9所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述失活性突变在单纯疱疹病毒基因中。
11.如权利要求10所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述失活性突变是所述单纯疱疹病毒基因的编码序列的缺失。
12.如权利要求10或权利要求11所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述单纯疱疹病毒基因选自由感染细胞蛋白(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、胸苷激酶(tk)、长独特区域(UL)41和UL55组成的组。
13.如权利要求12所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP4基因的一个或两个拷贝中包含失活性突变。
14.如权利要求12或权利要求13所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP22基因中包含失活性突变。
15.如权利要求12-14中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述UL41基因中包含失活性突变。
16.如权利要求12-15中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP0基因的一个或两个拷贝中包含失活性突变。
17.如权利要求12-16中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在所述ICP27基因中包含失活性突变。
18.如权利要求6-17中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组在ICP4病毒基因座中的一个或两个内包含所述第一多核苷酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一美容蛋白选自由以下组成的组：第一胶原蛋白、第一纤连蛋白、第一弹性蛋白、第一光蛋白聚糖蛋白、第一玻连蛋白、第一玻连蛋白受体蛋白、第一层粘连蛋白、第一神经调质蛋白和第一原纤蛋白。
20.如权利要求1-19中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一美容蛋白包含与选自由SEQ ID NO:15-21和53-64组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
21.如权利要求1-20中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一美容蛋白是结构性细胞外基质蛋白。
22.如权利要求19-21中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一胶原蛋白是人胶原蛋白。
23.如权利要求19-22中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一胶原蛋白选自由以下组成的组：胶原α-1(I)链多肽(COL1-1)、胶原α-2(I)链多肽(COL1-2)、胶原α-1(II)链多肽(COL2)、胶原α-1(III)链多肽(COL3)、胶原α-1(IV)链多肽(COL4-1)、胶原α-2(IV)链多肽(COL4-2)、胶原α-3(IV)链多肽(COL4-3)、胶原α-4(IV)链多肽(COL4-4)、胶原α-5(IV)链多肽(COL4-5)、胶原α-6(IV)链多肽(COL4-6)、胶原α-1(V)链多肽(COL5-1)、胶原α-2(V)链多肽(COL5-2)、胶原α-3(V)链多肽(COL5-3)、胶原α-1(VI)链多肽(COL6-1)、胶原α-2(VI)链多肽(COL6-2)、胶原α-3(VI)链多肽(COL6-3)、胶原α-4(VI)链多肽(COL6-4)、胶原α-5(VI)链多肽(COL6-5)、胶原α-6(VI)链多肽(COL6-6)、胶原α-1(VIII)链多肽(COL8)、胶原α-1(IX)链多肽(COL9-1)、胶原α-2(IX)链多肽(COL9-2)、胶原α-3(IX)链多肽(COL9-3)、胶原α-1(X)链多肽(COL10)、胶原α-1(XI)链多肽(COL11-1)、胶原α-2(XI)链多肽(COL11-2)、胶原α-1(XII)链多肽(COL12)、胶原α-1(XIII)链多肽(COL13)、胶原α-1(XIV)链多肽(COL14)、胶原α-1(XV)链多肽(COL15)、胶原α-1(XVI)链多肽(COL16)、胶原α-1(XVII)链多肽(COL17)、胶原α-1(XVIII)链多肽(COL18)、胶原α-1(XIX)链多肽(COL19)、胶原α-1(XX)链多肽(COL20)、胶原α-1(XXI)链多肽(COL21)、胶原α-1(XXII)链多肽(COL22)、胶原α-1(XXIII)链多肽(COL23)、胶原α-1(XXIV)链多肽(COL24)、胶原α-1(XXV)链多肽(COL25)、胶原α-1(XXVI)链多肽(COL26)、胶原α-1(XXVII)链多肽(COL27)和胶原α-1(XXVIII)链多肽(COL28)。
24.如权利要求19-23中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一胶原蛋白选自由以下组成的组：COL1-1、COL1-2、COL3、COL4-1、COL4-2、COL6-1和COL17。
25.如权利要求19-24中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一人胶原蛋白包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
26.如权利要求1-25中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一美容蛋白不是胶原α-1(VII)链多肽(COL7)。
27.如权利要求1-26中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一多肽基本上由所述第一美容蛋白组成或由所述第一美容蛋白组成。
28.如权利要求1-26中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一多肽包含：(a)所述第一美容蛋白；(b)另一美容蛋白；和(c)使(a)连接于(b)的接头多肽。
29.如权利要求28所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述接头多肽是可裂解接头多肽。
30.如权利要求28或权利要求29所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述接头多肽包含与选自由SEQ ID NO:28-31组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
31.如权利要求28-30中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一美容蛋白和所述另一美容蛋白是不同的。
32.如权利要求1-31中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一多核苷酸编码多顺反子mRNA，所述多顺反子mRNA包含：(a)编码所述第一多肽的第一开放阅读框(ORF)；(b)编码额外美容蛋白的第二ORF；和(c)分隔(a)和(b)的内部核糖体进入位点(IRES)。
33.如权利要求32所述的重组疱疹病毒基因组，其中编码所述IRES的核酸序列与选自SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
34.如权利要求32或权利要求33所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一美容蛋白和所述额外美容蛋白是不同的。
35.如权利要求1-34中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述重组疱疹病毒基因组还包含编码第二美容蛋白的第二多核苷酸。
36.如权利要求35所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述第一美容蛋白和所述第二美容蛋白是不同的。
37.如权利要求1-36中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中相较于相应野生型疱疹病毒基因组，所述重组疱疹病毒基因组当引入靶标细胞中时具有降低的细胞毒性。
38.如权利要求37所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述靶标细胞是表皮和/或真皮的细胞。
39.如权利要求37或权利要求38所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述靶标细胞是人细胞。
40.如权利要求37-39中任一项所述的重组疱疹病毒基因组，其中所述靶标细胞是纤维母细胞。
41.一种疱疹病毒，所述疱疹病毒包含如权利要求1-40中任一项所述的重组疱疹病毒基因组。
42.如权利要求41所述的疱疹病毒，其中所述疱疹病毒是有复制能力的。
43.如权利要求41所述的疱疹病毒，其中所述疱疹病毒是复制缺陷性的。
44.如权利要求41-43中任一项所述的疱疹病毒，其中相较于相应野生型疱疹病毒，所述疱疹病毒具有降低的细胞毒性。
45.如权利要求41-44中任一项所述的疱疹病毒，其中所述疱疹病毒选自由以下组成的组：单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、人巨细胞病毒、疱疹病毒6A、疱疹病毒6B、疱疹病毒7和卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒。
46.如权利要求41-45中任一项所述的疱疹病毒，其中所述疱疹病毒是单纯疱疹病毒。
47.如权利要求46所述的疱疹病毒，其中所述单纯疱疹病毒是1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)或它们的任何衍生物。
48.一种组合物，所述组合物包含：(a)如权利要求1-40中任一项所述的重组疱疹病毒基因组或如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒；和(b)赋形剂。
49.如权利要求48所述的组合物，其中所述组合物是无菌的。
50.如权利要求48或权利要求49所述的组合物，其中所述组合物适于局部、经皮、皮下、真皮内、口服、鼻内、气管内、舌下、经颊、经直肠、经阴道、经尿道、吸入、静脉内、动脉内、肌肉内、心内、骨内、腹膜内、经粘膜、玻璃体内、视网膜下、关节内、关节周、局部或皮上施用。
51.如权利要求48-50中任一项所述的组合物，其中所述组合物适于真皮内施用。
52.如权利要求48-51中任一项所述的组合物，其中所述组合物适于浅表注射。
53.如权利要求48-52中任一项所述的组合物，其中所述组合物是美容组合物。
54.如权利要求48-53中任一项所述的组合物，其中所述组合物是皮肤护理产品。
55.如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒或如权利要求48-54中任一项所述的组合物，所述疱疹病毒或所述组合物用作药剂。
56.如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒或如权利要求48-54中任一项所述的组合物，所述疱疹病毒或所述组合物用于疗法中。
57.如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒或如权利要求48-54中任一项所述的组合物制造用于治疗皮肤学老化的一种或多种征象或症状的药剂的用途。
58.一种增强、增加、加强和/或补充受试者中一种或多种真皮细胞外基质蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒或如权利要求48-54中任一项所述的组合物。
59.一种增强、增加、加强和/或补充受试者中一种或多种胶原蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒或如权利要求48-54中任一项所述的组合物。
60.一种增强、增加、加强和/或补充受试者的软组织的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒或如权利要求48-54中任一项所述的组合物。
61.如权利要求60所述的方法，其中将所述组合物注射至所述受试者的所述软组织中。
62.一种使有需要的受试者的皮肤状况、品质和/或外观改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒或如权利要求48-54中任一项所述的组合物。
63.如权利要求62所述的方法，其中向一个或多个日光损害或其他UV暴露部位、粗糙纹理部位、皮肤下陷部位、皱纹部位或它们的任何组合施用所述组合物。
64.一种减少有需要的受试者的皮肤中一种或多种浅表凹陷的出现的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒或如权利要求48-54中任一项所述的组合物。
65.如权利要求64所述的方法，其中皮肤中所述一种或多种浅表凹陷选自由以下组成的组：鼻唇皱褶、鱼尾纹、皱眉纹、烦恼纹、疤痕、眉间纹、眉下垂、泪槽、鼻颊纹、兔宝宝纹、面颊/面中部下垂、木偶纹、罂粟陷窝、微笑纹、笑纹、下巴皱痕、颈纹、颈阔肌带以及它们的任何组合。
66.一种使有需要的受试者的皮肤的纹理、光滑度、弹性或张力中的至少一者增加和/或改进的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒或如权利要求48-54中任一项所述的组合物。
67.如权利要求62-66中任一项所述的方法，其中所述受试者的皮肤是老化中的皮肤。
68.如权利要求62-67中任一项所述的方法，其中所述受试者的皮肤已由于暴露于紫外光而受损害。
69.如权利要求62-68中任一项所述的方法，其中所述受试者的皮肤是有皱纹的。
70.一种使有需要的受试者的一种或多种皮肤学老化征象减弱的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求41-47中任一项所述的疱疹病毒或如权利要求48-54中任一项所述的组合物。
71.如权利要求70所述的方法，其中一种或多种皮肤学老化征象的所述减弱由以下方面指示：(a)细纹和/或皱纹得到治疗、减轻和/或预防；(b)皮肤孔尺寸得到降低；(c)皮肤厚度、饱满度和/或紧固度得到改进；(d)皮肤光滑度、柔韧性和/或柔软度得到改进；(e)皮肤色泽、光亮度和/或透明度得到改进；(f)原胶原和/或胶原产生得到改进；(g)皮肤纹理得到改进和/或再纹理化得到促进；(h)皮肤轮廓的外观得到改进；(i)皮肤光泽和/或亮度得到恢复；(j)由于老化和/或绝经而减退的皮肤外观得到改进；(k)皮肤保湿得到改进；(l)皮肤弹性和/或回弹力得到增加；(m)皮肤下陷得到治疗、减轻和/或预防；(n)皮肤紧致度得到改进；(o)色素斑点、斑点化皮肤和/或疤痕得到减轻；(p)就光衍射或反射来说的皮肤光学性质得到改进；或(q)它们的任何组合。
72.如权利要求58-71中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
73.如权利要求58-72中任一项所述的方法，其中所述疱疹病毒或所述组合物局部、经皮、皮下、皮上、真皮内、口服、舌下、经颊、经直肠、经阴道、尿道内、静脉内、动脉内、肌肉内、骨内、心内、腹膜内、经粘膜、玻璃体内、视网膜下、关节内、关节周、局部、或通过吸入来向所述受试者施用。
74.如权利要求58-73中任一项所述的方法，其中所述疱疹病毒或所述组合物向所述受试者真皮内施用。
75.如权利要求58-74中任一项所述的方法，其中所述疱疹病毒或所述组合物通过浅表注射来施用。
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