JP2021521894A - 審美的用途のための美容用タンパク質をコードする組換え核酸 - Google Patents

審美的用途のための美容用タンパク質をコードする組換え核酸 Download PDF

Info

Publication number
JP2021521894A
JP2021521894A JP2021509722A JP2021509722A JP2021521894A JP 2021521894 A JP2021521894 A JP 2021521894A JP 2021509722 A JP2021509722 A JP 2021509722A JP 2021509722 A JP2021509722 A JP 2021509722A JP 2021521894 A JP2021521894 A JP 2021521894A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
human
recombinant
collagen
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021509722A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2019210219A5 (ja
Inventor
スマ クリシュナン
スマ クリシュナン
トレバー パリー
トレバー パリー
プージャ アガーワル
プージャ アガーワル
Original Assignee
クリスタル バイオテック インコーポレイテッド
クリスタル バイオテック インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by クリスタル バイオテック インコーポレイテッド, クリスタル バイオテック インコーポレイテッド filed Critical クリスタル バイオテック インコーポレイテッド
Publication of JP2021521894A publication Critical patent/JP2021521894A/ja
Publication of JPWO2019210219A5 publication Critical patent/JPWO2019210219A5/ja
Priority to JP2024018447A priority Critical patent/JP2024056823A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/65Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/763Herpes virus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04Antipruritics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61QSPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00Preparations for care of the skin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61QSPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08Anti-ageing preparations
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/86Products or compounds obtained by genetic engineering
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/91Injection
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/16011Herpesviridae
    • C12N2710/16041Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16043Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/16011Herpesviridae
    • C12N2710/16611Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16621Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/16011Herpesviridae
    • C12N2710/16611Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16631Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本開示は、1つ以上の美容用タンパク質(例えば、1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸、この組換え核酸を含むウイルス、この組換え核酸及び/またはウイルスを含む組成物(例えば、美容用配合物)、それらの使用法、ならびにそれらの製品またはキットを提供する。
【選択図】図23B

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、2018年4月27日に出願された米国仮出願第62/663,476号の優先権利益を主張する。
ASCIIテキストファイルでの配列表の提出
ASCIIテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる:配列表のコンピュータ可読形態(CRF)(ファイル名:761342000640SEQLIST.txt、記録日:2019年4月26日、サイズ:437KB)。
発明の分野
本開示は、部分的には、1つ以上の美容用タンパク質(例えば、1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸、組換え核酸を含むウイルス、組換え核酸及び/またはウイルスを含む組成物(例えば、美容用配合物)、それらの使用法、ならびにそれらの製品またはキットに関する。
背景
皮膚は、人体の全ての臓器と同様に、時間の経過とともに連続的かつ多くの場合累積的な変化を受ける。皮膚の老化は、皮膚内の固有の変化、皮膚に作用する重力及び顔面筋肉の影響、軟組織の喪失またはシフト、ならびに組織弾性の喪失を含む多くの要因の結果として生じる。興味深いことに、皮膚の「老化した」表現型は、環境要因、最も顕著には、(例えば、太陽からの)紫外線照射への長期曝露によって加速され得る。臨床的には、皮膚の老化した表現型は、しわになっている、たるんでいる、及び/または一般的にその若い対応物よりも弾性及び弾力性が低いといわれ得るが、この表現型内の変動は、自然な経時的老化と光による老化との間に存在する。
皮膚細胞外マトリックス(ECM)は、皮膚の大部分を構成し、強度及び弾力性の両方を付与する。皮膚に支持を提供する結合組織の主要成分であるコラーゲンは、人が加齢するにつれて減少する。老化した皮膚では、コラーゲン原線維は高レベルの分解及び断片化を示し、減少した速度で皮膚線維芽細胞によって補充される。これらの分解及び断片化されたコラーゲン束は緩くなり、強度を失い(皮膚ECMの構造組織を破壊する)、皮膚の「老化」兆候と密接なつながりがある。
ヒトの皮膚の外観を改善するための多数のスキンケア製品が開発されている。しわ及び皮膚のひだは、一般に、審美的顔面フィラーの皮膚及び皮下注射で治療されるが、かかる表面アプローチは、皮膚老化の根底にある構造変化、具体的には、コラーゲンの損傷または喪失に対処しない。したがって、皮膚老化の生理学的作用への対抗またはその逆転を望む個体における、皮膚ECM成分(例えば、ヒトコラーゲン)を補充、強化、または置き換えるための代替の戦略が明らかに必要とされている。
特許出願、特許刊行物、非特許文献、及びNCBI/UniProtKB/Swiss−Prot受入番号を含む本明細書に引用される全ての参照文献は、個々の参照文献が各々参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
概要
これら及び他の要求を満たすために、審美的/美容的用途(例えば、しわの治療)のためのウイルス(例えば、ヘルペスウイルス)、組成物、配合物、薬剤、及び/または方法における使用のための1つ以上の美容用タンパク質をコードする組換え核酸(例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム)が本明細書に提供される。本発明者らは、本明細書に記載の組換え弱毒化ウイルスが、(1)ヒト表皮/真皮細胞に効果的に形質導入することができ、(2)コードされた外因性ヒトコラーゲン(mRNA及びタンパク質)を首尾よく発現させることができること、次いで、このタンパク質が皮膚等価物器官型培養物中の適切な領域に局在することができることを示した(例えば、実施例2を参照のこと)。さらに、本発明者らは、本明細書に記載のウイルスが著しい宿主細胞毒性なしに局所的または皮内のいずれかで首尾よく投与され得ることを示し、これらのウイルスから発現されたヒトコラーゲンが皮膚への観察可能な損傷なしにインビボ投与後に皮膚ECMの適切な領域に局在することを可能にした(例えば、実施例3及び実施例7を参照のこと)。加えて、本発明者らは、ヒトコラーゲンを発現させるウイルスを構築するために複数の異なるHSV骨格を使用することができること(例えば、実施例2を参照のこと)、単一の組換えゲノムから2つ以上のヒトコラーゲンタンパク質を首尾よく発現させるために複数の戦略を用いることができること(例えば、実施例5を参照のこと)、及び経時的なまたは紫外線により誘発された皮膚老化の複数の関連するインビトロ及びインビボモデルにおいて候補ウイルスがヒトコラーゲンタンパク質を首尾よく発現させることができること(例えば、実施例6及び実施例7を参照のこと)を示した。さらに、本発明者らは、本明細書に記載のウイルスが、インビトロ及びインビボの両方で他の美容用タンパク質(例えば、ヒトラミニン)を発現させるように首尾よく操作され得、これらのタンパク質が皮膚ECMの適切な領域に局在する(例えば、実施例8を参照のこと)ことを示した。理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載のデータは、本開示の組換え核酸及び/またはウイルスが、美容用タンパク質(例えば、ヒトコラーゲン1及びヒトコラーゲン3等のヒトコラーゲンタンパク質)を送達するための新規の手段、具体的には、審美的用途において天然のヒト皮膚ECMタンパク質を補充または置き換えるための(例えば、年齢または光により誘発されたしわの外観を減少させるための)新規の手段を構成し得るという強力な証拠を提供する。
したがって、本開示のある特定の態様は、第1の美容用タンパク質を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む組換えヘルペスウイルスゲノムに関する。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、第1のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、複製能を有する。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、複製欠損である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム、組換え水痘帯状疱疹ウイルスゲノム、組換えヒトサイトメガロウイルスゲノム、組換えヘルペスウイルス6Aゲノム、組換えヘルペスウイルス6Bゲノム、組換えヘルペスウイルス7ゲノム、組換えカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスゲノム、及びそれらの任意の誘導体から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)ゲノム、組換え単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)ゲノム、またはそれらの任意の誘導体である。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)ゲノムである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、不活性化変異は、単純ヘルペスウイルス遺伝子に存在する。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、単純ヘルペスウイルス遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス遺伝子は、感染細胞タンパク質(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、チミジンキナーゼ(tk)、ロングユニーク領域(UL)41、及びUL55から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP27遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL55遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、連結領域に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、連結領域の欠失を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方内に第1のポリヌクレオチドを含む。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、第1のコラーゲンタンパク質、第1のフィブロネクチンタンパク質、第1のエラスチンタンパク質、第1のルミカンタンパク質、第1のビトロネクチンタンパク質、第1のビトロネクチン受容体タンパク質、第1のラミニンタンパク質、第1の神経調節タンパク質、及び第1のフィブリリンタンパク質から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、配列番号15〜21及び53〜64から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲンタンパク質、エラスチンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、ラミニンタンパク質、フィブリリンタンパク質等)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、コラーゲンタンパク質、エラスチンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲンタンパク質、ヒトエラスチンタンパク質、ヒトフィブロネクチンタンパク質、またはヒトラミニンタンパク質)である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のコラーゲンタンパク質は、ヒトコラーゲンタンパク質である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のコラーゲンタンパク質は、コラーゲンアルファ−1(I)鎖ポリペプチド(COL1−1)、コラーゲンアルファ−2(I)鎖ポリペプチド(COL1−2)、コラーゲンアルファ−1(II)鎖ポリペプチド(COL2)、コラーゲンアルファ−1(III)鎖ポリペプチド(COL3)、コラーゲンアルファ−1(IV)鎖ポリペプチド(COL4−1)、コラーゲンアルファ−2(IV)鎖ポリペプチド(COL4−2)、コラーゲンアルファ−3(IV)鎖ポリペプチド(COL4−3)、コラーゲンアルファ−4(IV)鎖ポリペプチド(COL4−4)、コラーゲンアルファ−5(IV)鎖ポリペプチド(COL4−5)、コラーゲンアルファ−6(IV)鎖ポリペプチド(COL4−6)、コラーゲンアルファ−1(V)鎖ポリペプチド(COL5−1)、コラーゲンアルファ−2(V)鎖ポリペプチド(COL5−2)、コラーゲンアルファ−3(V)鎖ポリペプチド(COL5−3)、コラーゲンアルファ−1(VI)鎖ポリペプチド(COL6−1)、コラーゲンアルファ−2(VI)鎖ポリペプチド(COL6−2)、コラーゲンアルファ−3(VI)鎖ポリペプチド(COL6−3)、コラーゲンアルファ−4(VI)鎖ポリペプチド(COL6−4)、コラーゲンアルファ−5(VI)鎖ポリペプチド(COL6−5)、コラーゲンアルファ−6(VI)鎖ポリペプチド(COL6−6)、コラーゲンアルファ−1(VIII)鎖ポリペプチド(COL8)、コラーゲンアルファ−1(IX)鎖ポリペプチド(COL9−1)、コラーゲンアルファ−2(IX)鎖ポリペプチド(COL9−2)、コラーゲンアルファ−3(IX)鎖ポリペプチド(COL9−3)、コラーゲンアルファ−1(X)鎖ポリペプチド(COL10)、コラーゲンアルファ−1(XI)鎖ポリペプチド(COL11−1)、コラーゲンアルファ−2(XI)鎖ポリペプチド(COL11−2)、コラーゲンアルファ−1(XII)鎖ポリペプチド(COL12)、コラーゲンアルファ−1(XIII)鎖ポリペプチド(COL13)、コラーゲンアルファ−1(XIV)鎖ポリペプチド(COL14)、コラーゲンアルファ−1(XV)鎖ポリペプチド(COL15)、コラーゲンアルファ−1(XVI)鎖ポリペプチド(COL16)、コラーゲンアルファ−1(XVII)鎖ポリペプチド(COL17)、コラーゲンアルファ−1(XVIII)鎖ポリペプチド(COL18)、コラーゲンアルファ−1(XIX)鎖ポリペプチド(COL19)、コラーゲンアルファ−1(XX)鎖ポリペプチド(COL20)、コラーゲンアルファ−1(XXI)鎖ポリペプチド(COL21)、コラーゲンアルファ−1(XXII)鎖ポリペプチド(COL22)、コラーゲンアルファ−1(XXIII)鎖ポリペプチド(COL23)、コラーゲンアルファ−1(XXIV)鎖ポリペプチド(COL24)、コラーゲンアルファ−1(XXV)鎖ポリペプチド(COL25)、コラーゲンアルファ−1(XXVI)鎖ポリペプチド(COL26)、コラーゲンアルファ−1(XXVII)鎖ポリペプチド(COL27)、及びコラーゲンアルファ−1(XXVIII)鎖ポリペプチド(COL28)から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、及びCOL17から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のコラーゲンタンパク質は、配列番号15〜21から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のコラーゲンタンパク質は、COL3である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のコラーゲンタンパク質は、ヒトCOL3である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のコラーゲンタンパク質は、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、コラーゲンアルファ−1(VII)鎖ポリペプチド(COL7)ではない。
いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1の美容用タンパク質から本質的になる。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1の美容用タンパク質からなる。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、(a)第1の美容用タンパク質、(b)さらなる美容用タンパク質、及び(c)(a)を(b)に連結するリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、さらなる美容用タンパク質は、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、エラスチンタンパク質、ルミカンタンパク質、ビトロネクチンタンパク質、ビトロネクチン受容体タンパク質、ラミニンタンパク質、神経調節タンパク質、及びフィブリリンタンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、さらなる美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲンタンパク質、エラスチンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、ラミニンタンパク質、フィブリリンタンパク質等)である。いくつかの実施形態では、さらなる美容用タンパク質は、コラーゲンタンパク質、エラスチンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲンタンパク質、ヒトエラスチンタンパク質、ヒトフィブロネクチンタンパク質、またはヒトラミニンタンパク質)である。いくつかの実施形態では、さらなるコラーゲンタンパク質(例えば、さらなるヒトコラーゲンタンパク質)は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、さらなるコラーゲンタンパク質(例えば、さらなるヒトコラーゲンタンパク質)は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質とさらなる美容用タンパク質は異なる。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質はCOL1−1(例えば、ヒトCOL1−1)であり、さらなる美容用タンパク質はCOL1−2(例えば、ヒトCOL1−2)である。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、切断可能なリンカーポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号28〜31から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、(a)第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、(b)追加の美容用タンパク質をコードする第2のORF、及び(c)(a)と(b)を分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)を含むポリシストロニックmRNAをコードする。いくつかの実施形態では、追加の美容用タンパク質は、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、エラスチンタンパク質、ルミカンタンパク質、ビトロネクチンタンパク質、ビトロネクチン受容体タンパク質、ラミニンタンパク質、神経調節タンパク質、及びフィブリリンタンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、追加の美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲンタンパク質、エラスチンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、ラミニンタンパク質、フィブリリンタンパク質等)である。いくつかの実施形態では、追加の美容用タンパク質は、コラーゲンタンパク質、エラスチンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲンタンパク質、ヒトエラスチンタンパク質、ヒトフィブロネクチンタンパク質、またはヒトラミニンタンパク質)である。いくつかの実施形態では、追加のコラーゲンタンパク質(例えば、追加のヒトコラーゲンタンパク質)は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、追加のコラーゲンタンパク質(例えば、追加のヒトコラーゲンタンパク質)は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質と追加の美容用タンパク質は異なる。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質はCOL1−1(例えば、ヒトCOL1−1)であり、追加の美容用タンパク質はCOL1−2(例えば、ヒトCOL1−2)である。いくつかの実施形態では、IRESをコードする核酸配列は、配列番号22または配列番号23から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、第2の美容用タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、第2の美容用タンパク質は、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、エラスチンタンパク質、ルミカンタンパク質、ビトロネクチンタンパク質、ビトロネクチン受容体タンパク質、ラミニンタンパク質、神経調節タンパク質、及びフィブリリンタンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、第2の美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲンタンパク質、エラスチンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、ラミニンタンパク質、フィブリリンタンパク質等)である。いくつかの実施形態では、第2の美容用タンパク質は、コラーゲンタンパク質、エラスチンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲンタンパク質、ヒトエラスチンタンパク質、ヒトフィブロネクチンタンパク質、またはヒトラミニンタンパク質)である。いくつかの実施形態では、第2のコラーゲンタンパク質(例えば、第2のヒトコラーゲンタンパク質)は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、第2のコラーゲンタンパク質(例えば、第2のヒトコラーゲンタンパク質)は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質と第2の美容用タンパク質は異なる。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質はCOL1−1(例えば、ヒトCOL1−1)であり、第2の美容用タンパク質はCOL1−2(例えば、ヒトCOL1−2)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質はCOL1−1(例えば、ヒトCOL1−1)であり、第2の美容用タンパク質はCOL3(例えば、ヒトCOL3)である。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、標的細胞に導入された場合、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して減少した細胞毒性を有する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、表皮細胞及び/または真皮細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、線維芽細胞である。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムのうちのいずれかを含むヘルペスウイルスに関する。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、複製能を有する。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、複製欠損である。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、弱毒化されている。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、対応する野生型ヘルペスウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス6A、ヘルペスウイルス6B、ヘルペスウイルス7、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスから選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)、またはそれらの任意の誘導体である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)である。
本開示の他の態様は、(a)本明細書に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムのうちのいずれか及び/または本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれかと、(b)賦形剤と、を含む、組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、無菌である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組成物は、局所、経皮、皮下、皮内、経口、鼻腔内、気管内、舌下、口腔、直腸、膣内、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部、または皮膚上投与に好適である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組成物は、皮内投与に好適である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組成物は、表面注射に好適である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組成物は、美容用組成物である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組成物は、スキンケア製品である。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムのうちのいずれか及び/または本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれかの、薬剤(例えば、審美的効能のため)としての使用に関する。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムのうちのいずれか及び/または本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれかの、療法(例えば、審美的または美容的治療)としての使用に関する。
本開示の他の態様は、皮膚科学的老化の1つ以上の兆候または症状の治療に有用な薬剤の製造における、本明細書に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムのうちのいずれか及び/または本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれかの使用に関する。
本開示の他の態様は、対象における1つ以上の皮膚細胞外マトリックスタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び/または本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。
本開示の他の態様は、対象における1つ以上のコラーゲンタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び/または本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、1つ以上のコラーゲンタンパク質は、コラーゲン3である。いくつかの実施形態では、内因性コラーゲン3レベルは、経時的老化または光による老化の結果として低下する。
本開示の他の態様は、対象の軟組織を強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び/または本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、対象の軟組織に注射される。
本開示の他の態様は、皮膚の状態、質、及び/または外観の改善を必要とする対象における皮膚の状態、質、及び/または外観を改善する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び/または本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、日光による損傷もしくは他の紫外線曝露、粗いきめ、皮膚のたるみ、しわ、またはそれらの任意の組み合わせの、1つ以上の部位に投与される。
本開示の他の態様は、皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観の減少を必要とする対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観を減少させる方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び/または本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、皮膚における1つ以上の表面陥凹は、鼻唇溝、目尻のしわ、眉間しわ線、額のしわ、瘢痕、眉間のしわ、眉毛下垂、眼頬溝(tear trough)、鼻頬線(nasojugal line)、バニーライン、頬/顔面中央下垂、マリオネットライン、ポピーえくぼ形成(poppy dimpling)、笑線、笑いじわ、顎のひだ、首のしわ、広頸筋帯、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
本開示の他の態様は、皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つの増加及び/または改善を必要とする対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つを増加させる及び/または改善する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び/または本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、老化している皮膚である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、紫外線光への曝露により損傷している。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、しわになっている。
本開示の他の態様は、1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減を必要とする対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候を軽減する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び/または本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減は、(a)細かい線及び/またはしわの治療、減少、及び/または予防、(b)皮膚の毛穴径の減少、(c)皮膚の厚み、ふっくら感、及び/または張り感の改善、(d)皮膚の滑らかさ、しなやかさ、及び/または柔らかさの改善、(e)皮膚の色調、輝き、及び/または透明度の改善、(f)プロコラーゲン及び/またはコラーゲン産生の改善、(g)皮膚のきめの改善及び/または再度きめを整えること(retexturization)の促進、(h)皮膚輪郭の外観の改善、(i)皮膚のつや及び/または明るさの復元、(j)老化及び/または閉経により減退した皮膚外観の改善、(k)皮膚保湿の改善、(l)皮膚の弾性及び/または弾力性の増加、(m)治療、軽減、及び/または予防もしくは皮膚のたるみ、(n)皮膚の締まりの改善、(o)色素斑、斑のある皮膚、及び/または瘢痕(座瘡瘢痕等)の減少、(p)光回折または反射による皮膚の光学的特性の改善、または(q)それらの任意の組み合わせによって示される。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスまたは組成物は、対象に、局所的に、経皮的に、皮下的に、皮膚上に、皮内に、経口的に、舌下に、口腔内に、直腸に、膣に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、骨内に、心臓内に、腹腔内に、経粘膜的に、硝子体内に、網膜下に、関節内に、関節周囲に、局部的に、または吸入を介して投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスまたは組成物は、対象に皮内投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスまたは組成物は、表面注射によって投与される。
本開示の他の態様は、組換え核酸を含む単純ヘルペスウイルス(HSV)であって、組換え核酸が、第1のヒトコラーゲンタンパク質を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む、前記HSVと、賦形剤と、を含む、組成物に関する。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、HSVは、複製欠損である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、HSVは、複製能を有する。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、HSVは、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、またはそれらの任意の誘導体である。
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、単純ヘルペスウイルスアンプリコンである。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスアンプリコンは、HSV−1アンプリコンまたはHSV−1ハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、HSV−1ハイブリッドアンプリコンは、HSV/AAVハイブリッドアンプリコン、HSV/EBVハイブリッドアンプリコン、及びHSV/EBV/RVハイブリッドアンプリコン、またはHSV/スリーピングビューティーハイブリッドアンプリコンである。
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えHSV−1ゲノム、組換えHSV−2ゲノム、またはそれらの任意の誘導体である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス遺伝子は、感染細胞タンパク質(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、チミジンキナーゼ(tk)、ロングユニーク領域(UL)41、及びUL55からなる群から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP27遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、不活性化変異は、遺伝子(複数可)のコード配列の欠失である。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルス遺伝子座内に第1のポリヌクレオチドを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に第1のポリヌクレオチドを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP22ウイルス遺伝子座内に第1のポリヌクレオチドを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL41ウイルス遺伝子座内に第1のポリヌクレオチドを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、HSVは、野生型単純ヘルペスウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、コラーゲンアルファ−1(I)鎖ポリペプチド(COL1−1)、コラーゲンアルファ−2(I)鎖ポリペプチド(COL1−2)、コラーゲンアルファ−1(II)鎖ポリペプチド(COL2)、コラーゲンアルファ−1(III)鎖ポリペプチド(COL3)、コラーゲンアルファ−1(IV)鎖ポリペプチド(COL4−1)、コラーゲンアルファ−2(IV)鎖ポリペプチド(COL4−2)、コラーゲンアルファ−3(IV)鎖ポリペプチド(COL4−3)、コラーゲンアルファ−4(IV)鎖ポリペプチド(COL4−4)、コラーゲンアルファ−5(IV)鎖ポリペプチド(COL4−5)、コラーゲンアルファ−6(IV)鎖ポリペプチド(COL4−6)、コラーゲンアルファ−1(V)鎖ポリペプチド(COL5−1)、コラーゲンアルファ−2(V)鎖ポリペプチド(COL5−2)、コラーゲンアルファ−3(V)鎖ポリペプチド(COL5−3)、コラーゲンアルファ−1(VI)鎖ポリペプチド(COL6−1)、コラーゲンアルファ−2(VI)鎖ポリペプチド(COL6−2)、コラーゲンアルファ−3(VI)鎖ポリペプチド(COL6−3)、コラーゲンアルファ−4(VI)鎖ポリペプチド(COL6−4)、コラーゲンアルファ−5(VI)鎖ポリペプチド(COL6−5)、コラーゲンアルファ−6(VI)鎖ポリペプチド(COL6−6)、コラーゲンアルファ−1(VII)鎖ポリペプチド(COL7)、コラーゲンアルファ−1(VIII)鎖ポリペプチド(COL8)、コラーゲンアルファ−1(IX)鎖ポリペプチド(COL9−1)、コラーゲンアルファ−2(IX)鎖ポリペプチド(COL9−2)、コラーゲンアルファ−3(IX)鎖ポリペプチド(COL9−3)、コラーゲンアルファ−1(X)鎖ポリペプチド(COL10)、コラーゲンアルファ−1(XI)鎖ポリペプチド(COL11−1)、コラーゲンアルファ−2(XI)鎖ポリペプチド(COL11−2)、コラーゲンアルファ−1(XII)鎖ポリペプチド(COL12)、コラーゲンアルファ−1(XIII)鎖ポリペプチド(COL13)、コラーゲンアルファ−1(XIV)鎖ポリペプチド(COL14)、コラーゲンアルファ−1(XV)鎖ポリペプチド(COL15)、コラーゲンアルファ−1(XVI)鎖ポリペプチド(COL16)、コラーゲンアルファ−1(XVII)鎖ポリペプチド(COL17)、コラーゲンアルファ−1(XVIII)鎖ポリペプチド(COL18)、コラーゲンアルファ−1(XIX)鎖ポリペプチド(COL19)、コラーゲンアルファ−1(XX)鎖ポリペプチド(COL20)、コラーゲンアルファ−1(XXI)鎖ポリペプチド(COL21)、コラーゲンアルファ−1(XXII)鎖ポリペプチド(COL22)、コラーゲンアルファ−1(XXIII)鎖ポリペプチド(COL23)、コラーゲンアルファ−1(XXIV)鎖ポリペプチド(COL24)、コラーゲンアルファ−1(XXV)鎖ポリペプチド(COL25)、コラーゲンアルファ−1(XXVI)鎖ポリペプチド(COL26)、コラーゲンアルファ−1(XXVII)鎖ポリペプチド(COL27)、及びコラーゲンアルファ−1(XXVIII)鎖ポリペプチド(COL28)から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1〜14から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、配列番号15〜21から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL7ではない。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、(a)第1のヒトコラーゲンタンパク質、(b)さらなるヒトコラーゲンタンパク質、及び(c)(a)を(b)に連結するリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、切断可能なリンカーポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号28〜31から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1〜14から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、配列番号15〜21から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質とさらなるヒトコラーゲンタンパク質は異なる。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、(a)第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、(b)追加のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のORF、及び(c)(a)と(b)を分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)を含むポリシストロニックmRNAをコードする。いくつかの実施形態では、IRESをコードする核酸配列は、配列番号22または配列番号23から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1〜14から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、配列番号15〜21から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質と追加のヒトコラーゲンタンパク質は異なる。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え核酸は、第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第2のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1〜14から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、配列番号15〜21から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質と第2のヒトコラーゲンタンパク質は異なる。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え核酸は、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムであり、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルス遺伝子座内に第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP22ウイルス遺伝子座内に第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL41ウイルス遺伝子座内に第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に第1のポリヌクレオチドを含み、ICP22ウイルス遺伝子座内に第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に第1のポリヌクレオチドを含み、UL41ウイルス遺伝子座内に第2のポリヌクレオチドを含む。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、賦形剤は、皮膚(全身または局所)、経皮、皮下、及び/または皮内投与のために適合される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースゲルを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、賦形剤は、皮内投与のために適合される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、賦形剤は、リン酸緩衝液を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、賦形剤は、グリセロールを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、賦形剤は、脂質担体を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、賦形剤は、ナノ粒子担体を含む。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組成物は、美容用組成物である。いくつかの実施形態では、美容用組成物は、スキンケア製品である。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかと、組成物の投与に関する指示と、を含む、キットに関する。
本開示の他の態様は、対象における1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。
本開示の他の態様は、対象の軟組織を強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、対象の軟組織に注射される。
本開示の他の態様は、皮膚の質、状態、及び/または外観の改善を必要とする対象における皮膚の質、状態、及び/または外観を改善する方法であって、対象に、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、状態は、日光による損傷、老化、紫外線曝露、粗いきめ、皮膚のたるみ、しわ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。
本開示の他の態様は、皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観の減少を必要とする対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観を減少させる方法であって、対象に、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、組成物の投与は、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間、少なくとも約9ヶ月間、または少なくとも約12ヶ月間にわたって、対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観を減少させる。いくつかの実施形態では、対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観は、組成物の投与前の対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観と比較して、組成物の投与後に減少する。
本開示の他の態様は、皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つの増加及び/または改善を必要とする対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つを増加させる及び/または改善する方法であって、対象に、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、組成物の投与後少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間、少なくとも約9ヶ月間、または少なくとも約12ヶ月間にわたって、増加した及び/または改善されたきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つを維持する。いくつかの実施形態では、対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つが、組成物の投与前の対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りと比較して、組成物の投与後に増加する及び/または改善される。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、老化している皮膚である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、紫外線光への曝露により損傷している。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、しわになっている。
本開示の他の態様は、1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減を必要とする対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候を軽減する方法であって、対象に、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減は、(a)小じわ及び/またはしわの治療、減少、及び/または予防、(b)皮膚の毛穴径の減少、(c)皮膚の厚み、ふっくら感、及び/または張り感の改善、(d)皮膚の滑らかさ、しなやかさ、及び/または柔らかさの改善、(e)皮膚の色調、輝き、及び/または透明度の改善、(f)プロコラーゲン及び/またはコラーゲン産生の改善、(g)皮膚のきめの改善及び/または再度きめを整えることの促進、(h)皮膚輪郭の外観の改善、(i)皮膚のつや及び/または明るさの復元、(j)老化及び/または閉経により減退した皮膚外観の改善、(k)皮膚保湿の改善、(l)皮膚の弾性及び/または弾力性の増加、(m)治療、軽減、及び/または予防もしくは皮膚のたるみ、(n)皮膚の締まりの改善、(o)色素斑、斑のある皮膚、及び/または座瘡瘢痕の減少、(p)光回折または反射による皮膚の光学的特性の改善、ならびに(q)それらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候は、組成物の投与前の対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候と比較して、組成物の投与後に軽減される。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組成物は、対象に皮膚(全身または局所)、経皮、皮下、または皮内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、表面注射によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象に皮内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象に1回投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象に少なくとも2回投与される。いくつかの実施形態では、投与間で、少なくとも約15日、少なくとも約30日、少なくとも約60日、少なくとも約90日、または少なくとも約120日が経過している。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組成物は、対象の1つ以上の罹患領域及び/または非罹患領域に投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、その皮膚は、投与前に擦過される。
本開示の他の態様は、第1のヒトコラーゲンタンパク質を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む組換え核酸であって、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである、前記組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えHSV−1ゲノム、組換えHSV−2ゲノム、またはそれらの任意の誘導体である。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス遺伝子は、感染細胞タンパク質(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、チミジンキナーゼ(tk)、ロングユニーク領域(UL)41、及びUL55からなる群から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP27遺伝子に不活性化変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、不活性化変異は、遺伝子(複数可)のコード配列の欠失である。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルス遺伝子座内に第1のポリヌクレオチドを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に第1のポリヌクレオチドを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP22ウイルス遺伝子座内に第1のポリヌクレオチドを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL41ウイルス遺伝子座内に第1のポリヌクレオチドを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、HSVは、野生型単純ヘルペスウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL2から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1〜14から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、配列番号15〜21から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL7ではない。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、(a)第1のヒトコラーゲンタンパク質、(b)さらなるヒトコラーゲンタンパク質、及び(c)(a)を(b)に連結するリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、切断可能なリンカーポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号28〜31から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1〜14から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、配列番号15〜21から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質とさらなるヒトコラーゲンタンパク質は異なる。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、(a)第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、(b)追加のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のORF、及び(c)(a)と(b)を分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)を含むポリシストロニックmRNAをコードする。いくつかの実施形態では、IRESをコードする核酸配列は、配列番号22または配列番号23から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1〜14から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、配列番号15〜21から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質と追加のヒトコラーゲンタンパク質は異なる。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え核酸は、第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第2のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1〜14から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、配列番号15〜21から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質と第2のヒトコラーゲンタンパク質は異なる。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルス遺伝子座内に第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP22ウイルス遺伝子座内に第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL41ウイルス遺伝子座内に第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に第1のポリヌクレオチドを含み、ICP22ウイルス遺伝子座内に第2のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に第1のポリヌクレオチドを含み、UL41ウイルス遺伝子座内に第2のポリヌクレオチドを含む。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組換え核酸のうちのいずれかを含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Vero細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、補完宿主細胞である。
本開示の他の態様は、単純ヘルペスウイルスを収集する方法であって、(a)補完宿主細胞を本明細書に記載の組換え核酸のうちのいずれかと接触させることと、(b)補完宿主細胞によって作製された単純ヘルペスウイルスを収集することと、を含む、前記方法に関する。
本開示の他の態様は、単純ヘルペスウイルスを収集する方法であって、(a)本明細書に記載の組換え核酸のうちのいずれかを含む宿主細胞を培養することと、(b)宿主細胞によって作製された単純ヘルペスウイルスを収集することと、を含む、前記方法に関する。
本特許または本出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも1つの図面が含まれる。カラー図面を備えた本特許または本特許出願刊行物のコピーは、要求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁により提供される。
図1A〜Nは、野生型及び改変された単純ヘルペスウイルスゲノムの概略図を示す。図1Aは、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。 図1A〜Nは、野生型及び改変された単純ヘルペスウイルスゲノムの概略図を示す。図1Bは、異種プロモーターに作動可能に連結された第1のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)及びICP22のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図1Cは、異種プロモーターに作動可能に連結された第1のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。 図1A〜Nは、野生型及び改変された単純ヘルペスウイルスゲノムの概略図を示す。図1Dは、(1)第1の異種プロモーターに作動可能に連結された第1のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列及び(2)第2の異種プロモーターに作動可能に連結された第2のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)及びICP22のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。第1のヒトコラーゲンポリペプチドも第2のヒトコラーゲンポリペプチドもいずれも、DNAの同じ鎖上でコードされる。図1Eは、(1)第1の異種プロモーターに作動可能に連結された第1のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列及び(2)第2の異種プロモーターに作動可能に連結された第2のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。第1のヒトコラーゲンポリペプチドも第2のヒトコラーゲンポリペプチドもいずれも、DNAの同じ鎖上でコードされる。 図1A〜Nは、野生型及び改変された単純ヘルペスウイルスゲノムの概略図を示す。図1Fは、(1)第1の異種プロモーターに作動可能に連結された第1のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列及び(2)第2の異種プロモーターに作動可能に連結された第2のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)及びICP22のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。第1のヒトコラーゲンポリペプチド及び第2のヒトコラーゲンポリペプチドは、DNAの対向する鎖上でコードされる。図1Gは、(1)第1の異種プロモーターに作動可能に連結された第1のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列及び(2)第2の異種プロモーターに作動可能に連結された第2のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含有するポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。第1のヒトコラーゲンポリペプチド及び第2のヒトコラーゲンポリペプチドは、DNAの対向する鎖上でコードされる。 図1A〜Nは、野生型及び改変された単純ヘルペスウイルスゲノムの概略図を示す。図1Hは、異種プロモーターに作動可能に連結されたポリシストロニックmRNAをコードするポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)及びICP22のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。ポリシストロニックmRNAは、内部リボソーム侵入部位(IRES)によって分離された第1のヒトコラーゲンポリペプチド及び第2のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含む。図1Iは、異種プロモーターに作動可能に連結されたポリシストロニックmRNAをコードするポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。ポリシストロニックmRNAは、内部リボソーム侵入部位(IRES)によって分離された第1のヒトコラーゲンポリペプチド及び第2のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含む。 図1A〜Nは、野生型及び改変された単純ヘルペスウイルスゲノムの概略図を示す。図1Jは、異種プロモーターに作動可能に連結されたキメラポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)及びICP22のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。キメラポリペプチドは、切断可能なリンカーによって分離された第1のヒトコラーゲンポリペプチド及び第2のヒトコラーゲンポリペプチドのアミノ酸配列を含む。図1Kは、異種プロモーターに作動可能に連結されたキメラポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれている、ICP4のコード配列(両方のコピー)の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。キメラポリペプチドは、切断可能なリンカーによって分離された第1のヒトコラーゲンポリペプチド及び第2のヒトコラーゲンポリペプチドのアミノ酸配列を含む。 図1A〜Nは、野生型及び改変された単純ヘルペスウイルスゲノムの概略図を示す。図1Lは、異種プロモーターに作動可能に連結された第1のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含む第1のポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれており、異種プロモーターに作動可能に連結された第2のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含む第2のポリヌクレオチドがICP22遺伝子座に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)及びICP22のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。 図1A〜Nは、野生型及び改変された単純ヘルペスウイルスゲノムの概略図を示す。図1Mは、異種プロモーターに作動可能に連結された第1のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含む第1のポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれており、異種プロモーターに作動可能に連結された第2のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含む第2のポリヌクレオチドがUL41遺伝子座に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)、ICP22、及びUL41のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図1Nは、異種プロモーターに作動可能に連結された第1のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含む第1のポリヌクレオチドがICP4遺伝子座の各々に組み込まれており、異種プロモーターに作動可能に連結された第2のヒトコラーゲンポリペプチドのコード配列を含む第2のポリヌクレオチドがUL41遺伝子座に組み込まれている、ICP4(両方のコピー)及びUL41のコード配列の欠失を含む改変された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。 図2A〜Bは、ヒトコラーゲン7(COL7)発現カセットを保有する複製欠損性単純ヘルペスウイルス1型の概略図を示す。図2Aは、ウイルス「KCA211」の概略図を示す。図2Bは、ウイルス「SAR−COL7」の概略図を示す。 図3A〜Bは、指示されたMOIでKCA211またはSAR−COL7に感染したHaCaT細胞におけるヒトCOL7発現を示す。図3Aは、qPCRによって評価される、指示されたMOIでKCA211またはSAR−COL7に感染したHaCaT細胞におけるヒトCOL7発現を示す。データを、GAPDHに対する正規化後のSAR−COL7に対する変化倍率として示す。図3Bは、非感染HaCaT細胞、またはウエスタンブロット分析によって評価される、指示されたMOIでKCA211もしくはSAR−COL7に感染したHaCaT細胞におけるヒトCOL7発現を示す。 図4A〜Bは、健常患者(正常)から単離された模擬感染初代ヒト細胞におけるヒトCOL7発現、及び劣性栄養障害性表皮水疱症(RDEB)に罹患している患者から単離された模擬またはSAR−COL7感染初代ヒト細胞におけるヒトCOL7発現の免疫蛍光画像を示す。図4Aは、模擬感染野生型及びRDEB初代ヒトケラチノサイトにおけるヒトCOL7発現、または指示された感染多重度(MOI)でSAR−COL7に感染したRDEB初代ヒトケラチノサイトにおけるヒトCOL7発現を示す。図4Bは、模擬感染野生型及びRDEB初代ヒト線維芽細胞におけるヒトCOL7発現、または指示されたMOIでSAR−COL7に感染したRDEB初代ヒト線維芽細胞におけるヒトCOL7発現を示す。 図5A〜Bは、健常患者から単離された模擬感染初代ヒト細胞におけるヒトCOL7発現、及び劣性栄養障害性表皮水疱症(EB)に罹患している患者から単離された模擬またはSAR−COL7感染初代ヒト細胞におけるヒトCOL7発現の定量的PCR分析を示す。図5Aは、模擬感染野生型(N−HDK)及びRDEB(EB−HDK)初代ヒトケラチノサイトにおけるヒトCOL7発現、または指示されたMOIでSAR−COL7に感染したRDEB初代ヒトケラチノサイトにおけるヒトCOL7発現を示す。COL7発現を、模擬感染野生型初代ヒトケラチノサイトに対する相対的変化倍率として示す。図5Bは、模擬感染野生型(N−HDF)及びRDEB(EB−HDF)初代ヒト線維芽細胞におけるヒトCOL7発現、または指示されたMOIでSAR−COL7に感染したRDEB初代ヒト線維芽細胞におけるヒトCOL7発現を示す。COL7発現を、模擬感染野生型初代ヒト線維芽細胞に対する相対的変化倍率として示す。 図6A〜Bは、非感染(対照)またはSAR−COL7感染RDEB初代ヒトケラチノサイトのマイクロウェルプレートの未処理(プラスチック)または処理ウェルへの細胞接着を示す。図6Aは、未処理ウェル(プラスチック)または増加濃度のラット尾コラーゲン1で処理したウェルへの細胞接着を示す。図6Bは、未処理ウェル(プラスチック)または増加濃度のヒト血漿フィブロネクチンで処理したウェルへの細胞接着を示す。 SAR−COL7感染RDEB初代ヒトケラチノサイト及び線維芽細胞で構築した器官型培養物における、5日目の基底膜ゾーン(BMZ)でのヒトCOL7発現及び沈着の代表的な免疫蛍光画像を示す。培養構築後、指示されたMOIでケラチノサイト及び線維芽細胞の両方をインサイチュで感染させた。 図8A〜Dは、qPCRによって評価される、非感染マウス皮膚(対照)またはSAR−COL7の局所または皮内送達後のマウス皮膚で観察されたヒトCOL7A1の転写物レベル及びゲノムレベルを示す。エラーバーは、SEMを表す。図8Aは、感染後3日目のマウス皮膚におけるヒトCOL7A1転写物レベル/総RNA100ngを示す。図8Bは、感染後3日目のマウス皮膚におけるヒトCOL7A1 DNAのコピー数/総DNA100ngを示す。図8Cは、感染後6日目のマウス皮膚におけるヒトCOL7A1転写物レベル/総RNA100ngを示す。図8Dは、感染後6日目のマウス皮膚におけるヒトCOL7A1 DNAのコピー数/総DNA100ngを示す。 図9A〜Bは、SAR−COL7の送達後のマウス皮膚におけるヒトCOL7発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。図9Aは、SAR−COL7の皮内送達後のマウス皮膚におけるヒトCOL7発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。図9Bは、SAR−COL7の局所送達後のマウス皮膚におけるヒトCOL7発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。 図10A〜Bは、qPCRによって評価される、ビヒクル、SAR−COL7、またはKCA211の皮内送達後のBALB/cマウス皮膚で観察されたヒトCOL7A1の転写物レベル及びゲノムレベルを示す。図10Aは、BALB/cマウス皮膚におけるヒトCOL7A1転写物レベル/総RNA100ngを示す。図10Bは、BALB/cマウス皮膚におけるヒトCOL7A1 DNAのコピー数/総DNA100ngを示す。 図11A〜Bは、qPCRによって評価される、HSV−GFP(GFP対照)またはSAR−COL7の高用量皮内送達後のハイポモルフマウス皮膚における各注射部位で観察されたヒトCOL7A1の転写物レベル及びゲノムレベルを示す。各バーは、指示された時点での単一試料を表す。図11Aは、ハイポモルフマウス皮膚におけるヒトCOL7A1転写物レベル/総RNA100ngを示す。図11Bは、ハイポモルフマウス皮膚におけるヒトCOL7A1 DNAのコピー数/総DNA100ngを示す。 図12A〜Bは、HSV−GFP(GFP対照)またはSAR−COL7の高用量皮内送達後のハイポモルフマウス皮膚におけるヒトCOL7発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。図12Aは、10倍及び20倍倍率でのハイポモルフマウス1(3日目に収集)由来の対照(GFP)及びSAR−COL7免疫蛍光画像を示す。図12Bは、ハイポモルフマウス2及びハイポモルフマウス3(7日目に収集)由来のSAR−COL7免疫蛍光画像を示す。この図は、全皮膚片を捕捉する、10倍レンズで取得した16視野のタイル状画像を表す。 ハイポモルフマウス1、2、及び3(3日目及び3日目に収集)由来のH&E染色試料を示す。これらの試料を、未処置ハイポモルフマウス皮膚及びHSV−GFPまたはSAR−COL7の皮内送達後のハイポモルフマウス皮膚から採取した。 図14A〜Bは、SAR−COL7の皮内送達後のハイポモルフマウス皮膚におけるヒトCOL7発現の代表的な電子顕微鏡写真画像を示す。緻密層は、画像の中央を通して示される暗い帯であり、黒色の点は、ヒトCOL7lの染色NCドメインであり、青色の矢印は、アンカー原線維の形成を示す。図14Aは、ヒトCOL7(LH24)のNC2ドメインに特異的な抗体で染色された感染ハイポモルフマウス皮膚の電子顕微鏡写真画像を示す。図14Bは、ヒトCOL7(NP185)のNC1ドメインに特異的な抗体で染色された感染ハイポモルフマウス皮膚の電子顕微鏡写真画像を示す。 図15A〜Bは、qPCRによって評価される、SAR−COL7の低用量皮内送達後のハイポモルフマウス皮膚における各注射部位で観察されたヒトCOL7A1の転写物レベル及びゲノムレベルを示す。各バーは、指示された時点での単一試料を表す。図15Aは、ハイポモルフマウス皮膚におけるヒトCOL7A1転写物レベル/総RNA100ngを示す。図15Bは、ハイポモルフマウス皮膚におけるヒトCOL7A1 DNAのコピー数/総DNA100ngを示す。 SAR−COL7の低用量皮内送達後のハイポモルフマウス皮膚(マウス1由来)におけるヒトCOL7発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。 図17A〜Cは、COL1A1のみ(ICP4遺伝子座に挿入)またはCOL1A1及びCOL1A2(それぞれ、ICP4遺伝子座及びICP22遺伝子座に挿入)をコードするHSVの指示されたクローンに感染したVero細胞におけるヒトCOL1A1及びCOL1A2核酸ならびにタンパク質分析を示す。図17Aは、qRT−PCR分析によって決定される、指示されたHSVクローンによる感染の5日後にVero細胞中に存在するヒトCOL1A1転写物のレベルを示す。データを、2つの複製物±SEMについて提示する。図17Bは、qRT−PCR分析によって決定される、指示されたHSVクローンによる感染の5日後にVero細胞中に存在するヒトCOL1A2転写物のレベルを示す。データを、2つの複製物±SEMについて提示する。図17Cは、qRT−PCRによって決定される、指示されたCOL1A1/COL1A2陽性クローンによる感染の5日後のVero細胞におけるヒトCOL1A1及びCOL1A2タンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。非感染(模擬)Vero細胞を陰性対照として使用し、GAPDHを負荷対照として使用した。 ICP4遺伝子座に挿入されたCOL1A1−IRES−COL1A2配列をコードするHSV単離体(IRES−単離体6)による感染の5日後のVero細胞におけるヒトCOL1A1及びCOL1A2タンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。IRES構築物を含まない単離体(挿入なし)による感染を陰性対照として使用し、GAPDHを負荷対照として使用した。 図19A〜Bは、C3vec01に感染した不死化ヒトケラチノサイト(HaCaT)におけるヒトCOL3核酸及びタンパク質分析を示す。図19Aは、指示されたMOIでのC3vec01による感染後の不死化ヒトケラチノサイト(HK)中に存在するヒトCOL3A1転写物のレベルを示す。非感染(模擬)細胞及びHSV−mCherry感染(mCherry)細胞を陰性対照として使用した。データを、2つの複製物±SEMについて提示する。図19Bは、指示されたMOIでのC3vec01による感染の48時間後の不死化ヒトケラチノサイトにおけるヒトCOL3タンパク質発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。非感染(模擬)細胞を陰性対照として使用した。 図20A〜Bは、C3vec01に感染した不死化ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)におけるヒトCOL3核酸及びタンパク質分析を示す。図20Aは、指示されたMOIでのC3vec01による感染後の不死化ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)中に存在するヒトCOL3A1転写物レベルを示す。非感染(模擬)細胞及びHSV−mCherry感染(mCherry)細胞を陰性対照として使用した。データを、2つの複製物±SEMについて提示する。図20Bは、指示されたMOIでのC3vec01による感染の48時間後の不死化ヒト皮膚線維芽細胞におけるヒトCOL3タンパク質発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。非感染(模擬)細胞を陰性対照として使用した。 図21A〜Dは、指示されたMOIでC3vec01に感染した、2つの異なるベンダーから調達された老化初代ヒト線維芽細胞(HDF)におけるヒトCOL3核酸及びタンパク質分析を示す。図21Aは、指示されたMOIでのC3vec01による感染後に65歳の女性患者または73歳の男性患者のいずれかから収集された初代HDF(ベンダー1)中に存在するヒトCOL3A1転写物のレベルを示す。非感染(模擬)細胞を陰性対照として使用した。データを、2つの複製物±SEMについて提示する。図21Bは、指示されたMOIでのC3vec01による感染後に73歳の男性患者から収集された初代HDF(ベンダー1)におけるヒトCOL3A1タンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。非感染(模擬)細胞を陰性対照として使用し、組換えヒトCOL3A1(rCOL3A1)を陽性対照として使用し、GAPDHを負荷対照として使用した。図21Cは、指示されたMOIでのC3vec01による感染後に75歳の女性患者または73歳の男性患者のいずれかから収集された初代HDF(ベンダー2)中に存在するヒトCOL3A1転写物のレベルを示す。非感染(模擬)細胞を陰性対照として使用した。データを、2つの複製物±SEMについて提示する。図21Dは、指示されたMOIでのC3vec01による感染後に75歳の女性患者から収集された初代HDF(ベンダー2)におけるヒトCOL3A1タンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。非感染(模擬)細胞を陰性対照として使用し、組換えヒトCOL3A1(rCOL3A1)を陽性対照として使用し、GAPDHを負荷対照として使用した。 図22A〜Bは、紫外線曝露時の不死化ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)におけるヒトCOL3核酸及びタンパク質分析を示す。図22Aは、ELISAによって評価される、様々な照射量及び回数の紫外線光への曝露の24時間後に培養HDFの上清に分泌されたCOL3の濃度を示す。並行して培養した非紫外線曝露(−紫外線)HDFから収集された上清を対照として使用した。図22Bは、指示されたMOIでのC3vec01による感染後に紫外線曝露不死化ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)中に存在するヒトCOL3A1転写物のレベルを示す。非感染(模擬)細胞及びHSV−mCherry感染(mCherry)細胞を陰性対照として使用した。データを、2つの複製物±SEMについて提示する。 図23A〜Cは、皮内適用の48時間後に対照C57BL/6マウスまたはC3vec01で処理した若年(6〜8週齢)及び老年(約13ヶ月齢)C57BL/6マウスから採取された皮膚生検のCOL3核酸及びタンパク質分析を示す。図23Aは、qPCR分析によって評価される、C3vec01またはビヒクル対照のいずれかを皮内投与した48時間後に若年マウス及び老年マウスから採取された皮膚生検に存在するヒトCOL3A1 DNAのレベルを示す。 図23A〜Cは、皮内適用の48時間後に対照C57BL/6マウスまたはC3vec01で処理した若年(6〜8週齢)及び老年(約13ヶ月齢)C57BL/6マウスから採取された皮膚生検のCOL3核酸及びタンパク質分析を示す。図23Bは、qRT−PCR分析によって評価される、C3vec01またはビヒクル対照のいずれかを皮内投与した48時間後に若年マウス及び老年マウスから採取された皮膚生検に存在するヒトCOL3A1転写物のレベルを示す。qPCR分析及びqRT−PCR分析における各条件について、データを、4つの組織試料(2つの複製物/組織試料)の平均±SEMとして提示する。 図23A〜Cは、皮内適用の48時間後に対照C57BL/6マウスまたはC3vec01で処理した若年(6〜8週齢)及び老年(約13ヶ月齢)C57BL/6マウスから採取された皮膚生検のCOL3核酸及びタンパク質分析を示す。図23Cは、C3vec01を皮内投与した48時間後に若年マウス及び老年マウスから採取された皮膚生検におけるヒトCOL3発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。ビヒクルのみを皮内投与した若年マウスを陰性対照として使用した。DAPI染色を使用して核を可視化した。 図24A〜Bは、指示されたウイルス単離体に感染したVero細胞における野生型(WT)ヒトLamB3の発現を示す。図24Aは、qPCR分析によって評価される、感染Vero細胞における野生型ヒトLAMB3の発現を示す。図24Bは、ウエスタンブロットによって評価される、感染Vero細胞における野生型ヒトLamB3タンパク質の発現を示す。 ウエスタンブロットによって評価される、指示されたウイルス単離体に感染したVero細胞における野生型(WT)またはコドン最適化(CO)ヒトLamB3タンパク質の発現を示す。非感染Vero細胞を陰性対照として使用した。 ウエスタンブロットによって評価される、指示されたウイルス単離体に感染した初代ヒトケラチノサイトにおける野生型(WT)またはコドン最適化(CO)ヒトLamB3タンパク質の発現を示す。非感染初代ケラチノサイトを陰性対照として使用した。 図27A〜Cは、指示されたウイルス単離体に感染したVero細胞における野生型(WT)及びコドン最適化(CO)ヒトLamC2の発現を示す。図27Aは、qPCR分析によって評価される、感染Vero細胞における野生型ヒトLAMC2の発現を示す。図27Bは、qPCR分析によって評価される、感染Vero細胞におけるコドン最適化ヒトLAMC2の発現を示す。図27Cは、ウエスタンブロットによって評価される、感染Vero細胞における野生型及びコドン最適化ヒトLamC2タンパク質の発現を示す。コドン最適化LamC2を発現する囲まれたウイルス単離体「LGA」を追加の実験のために選択した。 指示された感染多重度(MOI)で感染した不死化初代ヒトケラチノサイト中のウイルス単離体「LGA」から発現されたヒトLAMC2を示す。指示されたMOIでのウイルス単離体「LGA」による感染後の初代不死化ヒトケラチノサイト中のウイルスゲノムコピー数を示す。 指示された感染多重度(MOI)で感染した不死化初代ヒトケラチノサイト中のウイルス単離体「LGA」から発現されたヒトLAMC2を示す。指示されたMOIでのウイルス単離体「LGA」による感染後に初代不死化ヒトケラチノサイトで発現されたコドン最適化LAMC2の転写物レベルを示す。 指示された感染多重度(MOI)で感染した不死化初代ヒトケラチノサイト中のウイルス単離体「LGA」から発現されたヒトLAMC2を示す。ウエスタンブロットによって評価される、指示されたMOIでのウイルス単離体「LGA」による感染後の初代不死化ヒトケラチノサイトにおけるヒトLamC2タンパク質の発現を示す。 図29A〜Dは、対照(ビヒクル)マウスまたは皮内適用から72時間後のHSV単離体「LGA」処置マウスから採取された皮膚生検のLAMC2核酸及びタンパク質分析を示す。図29Aは、処理動物上の皮内注射部位の概略図を示す。 図29A〜Dは、対照(ビヒクル)マウスまたは皮内適用から72時間後のHSV単離体「LGA」処置マウスから採取された皮膚生検のLAMC2核酸及びタンパク質分析を示す。図29Bは、qPCR分析によって評価される、HSV単離体LGAまたはビヒクル対照のいずれかを皮内投与した72時間後にマウスから採取された皮膚生検に存在するヒトLAMC2 DNAのレベルを示す。 図29A〜Dは、対照(ビヒクル)マウスまたは皮内適用から72時間後のHSV単離体「LGA」処置マウスから採取された皮膚生検のLAMC2核酸及びタンパク質分析を示す。図29Cは、qRT−PCR分析によって評価される、HSV単離体LGAまたはビヒクル対照のいずれかを皮内投与した72時間後にマウスから採取された皮膚生検に存在するヒトLAMC2転写物レベルを示す。qPCR分析及びqRT−PCR分析における各条件について、データを、2つの複製物の平均±SEMとして提示する。 図29A〜Dは、対照(ビヒクル)マウスまたは皮内適用から72時間後のHSV単離体「LGA」処置マウスから採取された皮膚生検のLAMC2核酸及びタンパク質分析を示す。図29Dは、HSV単離体LGAを皮内投与した72時間後にマウスから採取された皮膚生検におけるヒトLAMC2発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。ビヒクルのみを皮内投与した部位を陰性対照として使用した。DAPI染色を使用して核を可視化し、pKal染色を使用してマウスラミニン−332を可視化した。
詳細な説明
いくつかの実施形態では、本開示は、1つ以上の美容用タンパク質をコードする組換え核酸(例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム)、ならびに1つ以上の美容用タンパク質を皮膚に、例えば、皮膚上に、皮膚中に、及び/または皮膚を通じて(例えば、皮膚ECMに)送達するためのウイルス(例えば、ヘルペスウイルス中)、組成物、配合物、薬剤、及び/または方法におけるこれらの組換え核酸の使用に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、1つ以上の美容用タンパク質をコードする組換え核酸(例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム)、ならびに1つ以上の皮膚ECMタンパク質(例えば、1つ以上のコラーゲンタンパク質)を増加させる、増強する、及び/または補充するためのウイルス(例えば、ヘルペスウイルス中)、組成物、配合物、薬剤、及び/または方法におけるこれらの組換え核酸の使用に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、1つ以上の美容用タンパク質をコードする組換え核酸(例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム)、ならびに(例えば、1つ以上の皮膚科学的老化兆候を軽減するための)審美的状況でのウイルス(例えば、ヘルペスウイルス中)、組成物、配合物、薬剤、及び/または方法におけるこれらの組換え核酸の使用に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、組換えヘルペスウイルスベクターを含む組成物、ならびに組換えヘルペスウイルスベクターを哺乳動物の皮膚上に、その中に、及び/またはそれを通じて送達することを含む方法に関し、組換えヘルペスウイルスベクターは、哺乳動物細胞で作動可能なプロモーターと、哺乳類皮膚において美容効果を達成するために発現される異種核酸を含む。異種核酸は、哺乳動物の表皮、真皮、または皮下組織を、組換えヘルペスウイルスベクターを含む組成物と接触させることを含む、哺乳動物の哺乳類標的皮膚細胞に、組換えヘルペスウイルスベクターが、表皮、真皮、または皮下組織上に、その中に、及び/またはそれを通じて輸送され、それが発現される標的皮膚細胞に導入される条件下で送達され得る。理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または配合物のうちの1つ以上を個体に投与することにより、個体における機能的な皮膚ECMタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン)の産生の増加が可能になると考えられる。さらに、理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または配合物のうちの1つ以上を投与することによって個体における美容用タンパク質のレベルを増加させること、増強すること、及び/または補充することにより、(1)軟組織の強化、増強、及び/または補充、(2)皮膚の質、状態、及び/または外観の改善、(3)皮膚における1つ以上の表面陥凹(例えば、しわ)の減少、(4)皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、及び/または張りの改善、及び/または(5)1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減のうちの少なくとも1つがもたらされると考えられる。最終的に、理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、組成物、及び方法により、審美的環境において機能的美容用タンパク質を送達するための新規戦略が提供されると考えられる。
以下の記述は、例示的な方法、パラメータ等を説明する。しかしながら、かかる記述が本開示の範囲を制限するよう意図されておらず、代わりに、例示的な実施形態の記述として提供されることを認識されたい。
I.一般的な技法
本明細書に記載または参照される技法及び手順は、一般に、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.,(2003))、the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995)),Harlow and Lane,eds.(1988)、Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)、Methods in Molecular Biology,Humana Press、Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press、Animal Cell Culture(R.I.Freshney),ed.,1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press、Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993−8)J.Wiley and Sons、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)、PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)、Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)に記載の広く利用されている方法論等の従来の方法論を使用して、当業者により十分に理解されており、一般に用いられている。
II.定義
本開示を詳細に説明する前に、本開示が特定の組成物または生物学的系に限定されず、これらが言うまでもなく変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、内容がそうではないと明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子(a molecule)」への言及は、2つ以上のかかる分子の組み合わせを任意に含むといった具合である。
本明細書で使用される場合、「及び/または」という用語は、関連する列記された項目のうちの1つ以上のありとあらゆる組み合わせを含み得る。例えば、「a及び/またはb」という用語は、「aのみ」、「bのみ」、「aまたはb」、または「a及びb」を指し得、「a、b、及び/またはc」という用語は、「aのみ」、「bのみ」、「cのみ」、「aまたはb」、「aまたはc」、「bまたはc」、「a、b、またはc」、「a及びb」、「a及びc」、「b及びc」、または「a、b、及びc」を指し得る。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当該技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む(及び説明する)。
本開示の態様及び実施形態が、態様及び実施形態を「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」ことを含むことを理解されたい。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸」という用語、及びそれらの変形は、ポリマーが、DNA及びRNAに見られるように、塩基対合及び塩基スタッキングを可能にする立体配置で核酸塩基を含むという条件で、ポリデオキシリボヌクレオチド(2−デオキシ−D−リボースを含む)、ポリリボヌクレオチド(D−リボースを含む)、プリンまたはピリミジン塩基のN−グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、及び非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマーに対して包括的でなければならない。したがって、これらの用語には、既知のタイプの核酸配列改変、例えば、天然に存在するヌクレオチドのうちの1つ以上の類似体での置換、及びヌクレオチド間改変が含まれる。
本明細書で使用される場合、核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれると、核酸は、「作動的に連結される」または「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されており、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように位置付けされている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動的に連結される」または「作動可能に連結される」とは、連結されているDNA配列が連続していることを意味する。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、異種核酸の発現または複製のいずれかのために異種核酸を細胞に導入するために使用される別個の要素を指す。発現ベクターは、かかる核酸の発現をもたらすことができるプロモーター領域等の調節配列と作動的に連結された核酸を発現することができるベクターを含む。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたときに核酸の発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクター等のDNAまたはRNA構築物を指し得る。適切な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞で複製可能なもの、及びエピソームのままであるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものを含む。
本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」とは、タンパク質またはポリペプチドをコードするDNAまたはRNAのいずれかの核酸の連続した伸長を指す。典型的には、核酸は、ATGまたはAUG等の翻訳開始シグナルまたは開始コドン及び終止コドンを含む。
本明細書で使用される場合、「非翻訳領域」または「UTR」とは、オープンリーディングフレームの5’末端及び/または3’末端における非翻訳核酸を指す。1つ以上のUTRをポリヌクレオチドに含めることにより、転写後制御、mRNA安定性、及び/またはポリヌクレオチドの翻訳に影響が及ぼされ得る。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入された後に、RNAに転写され、適切な条件下で翻訳及び/または発現されることができるポリヌクレオチドを指す。いくつかの態様では、それが導入された細胞に所望の特性を付与するか、またはさもなければ、所望の美容、治療、または診断結果をもたらす。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という用語は、互換的に使用され、2つ以上のアミノ酸のポリマーを指し得る。
本明細書で使用される場合、「対象」、「宿主」、または「個体」とは、ヒト、家畜及び農場動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ならびに研究で使用される動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、及び非ヒト霊長類等を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
本明細書で使用される場合、「薬学的配合物」または「薬学的組成物」という用語は、活性成分(複数可)の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、組成物または配合物が投与される対象に対して許容されないほどに毒性の追加の成分を含有しない調製物を指す。「薬学的に許容される」賦形剤(例えば、ビヒクル、添加剤)は、用いられる有効成分(複数可)の有効用量を提供するために対象に適度に投与され得るものである。
本明細書で使用される場合、「皮膚投与」または「皮膚投与する」とは、組成物を含む配合物を対象の皮膚の全て(「全身」)または一部(「局所」)に直接または別様に接触させることにより組成物を対象に送達することを指す。この用語は、局所及び経皮を含むが、これらに限定されない、いくつかの投与経路を包含する。局所投与は、組成物を対象の表皮もしくは真皮に、またはその特定の層に送達するための手段として使用され得る。
本明細書で使用される場合、「治療」とは、臨床病理の過程において治療される個体または細胞の自然経過を変化させるように設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい効果には、疾患/障害/欠損進行速度の低下、疾患/障害/欠損状態の改善または緩和、及び寛解または予後の改善が含まれる。例えば、しわの減少または除去を含む、皮膚科学的老化に関連する1つ以上の症状が軽減、緩和、または除去された場合、個体は首尾よく「治療」される。
本明細書で使用される場合、疾患/障害/欠損の「進行を遅延させる」という用語は、疾患/障害/欠損(例えば、皮膚のしわ)の発症を保留する、妨げる、遅延させる、遅らせる、安定させる、及び/または延期することを指す。この遅延は、疾患/障害/欠損及び/または治療される個体の病歴に応じて、様々な長さまたは時間であり得る。当業者には明らかであるように、十分または有意な遅延は、個体が疾患/障害/欠損を発症しないという点で、実際には予防を包含し得る。
III.組換え核酸
本開示のある特定の態様は、美容用タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチド(例えば、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、10個以上等)を含む組換え核酸(例えば、単離された組換え核酸)に関する。例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン/ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン、追加の皮膚ECMタンパク質等を含む、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の任意の好適な美容用タンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリリン等)である。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質)である。
いくつかの実施形態では、本開示は、コラーゲンタンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチド(例えば、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、10個以上等)を含む組換え核酸(例えば、単離された組換え核酸)に関する。いくつかの実施形態では、コラーゲンタンパク質は、ヒトコラーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示は、ホモ三量体コラーゲン(例えば、ホモ三量体ヒトコラーゲン、例えば、ヒトコラーゲン3(例えば、3つのCOL3A1(COL3)ポリペプチドを含む)またはヒトコラーゲン7(例えば、3つのCOL7A1(COL7)ポリペプチドを含む)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ヘテロ三量体コラーゲン(例えば、ヘテロ三量体ヒトコラーゲン、例えば、ヒトコラーゲン1(例えば、2つのCOL1A1(COL1−1)ポリペプチド及び1つのCOL1A2(COL1−2)ポリペプチドを含む)またはヒトコラーゲン4(例えば、2つのCOL4A1(COL4−1)ポリペプチド及び1つのCOL4A2(COL4−2)ポリペプチドを含む)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ホモ三量体コラーゲン及びヘテロ三量体コラーゲンをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸(例えば、ヒトコラーゲン1及びヒトコラーゲン3をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸)に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトコラーゲン1をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトコラーゲン3をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、第1の美容用タンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質)を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1の美容用タンパク質から本質的になるか、または第1の美容用タンパク質からなる(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質から本質的になるか、または第1のヒトコラーゲンタンパク質からなる)。いくつかの実施形態では、本開示は、第1の美容用タンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質)、リンカーポリペプチド、及びさらなる美容用タンパク質(例えば、さらなるヒトコラーゲンタンパク質)を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質とさらなる美容用タンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質とさらなるヒトコラーゲンタンパク質)は同じである。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質とさらなる美容用タンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質とさらなるヒトコラーゲンタンパク質)は異なる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、切断可能なリンカーポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、本開示は、第1の美容用タンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質)を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関し、第1のポリヌクレオチドは、第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、内部リボソーム侵入部位(IRES)、及び追加の美容用タンパク質(例えば、追加のヒトコラーゲンタンパク質)をコードする第2のORFを含むポリシストロニックmRNAをコードする。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質と追加の美容用タンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質と追加のヒトコラーゲンタンパク質)は同じである。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質と追加の美容用タンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質と追加のヒトコラーゲンタンパク質)は異なる。
いくつかの実施形態では、本開示は、第1の美容用タンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質)を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド、及び第2の美容用タンパク質(例えば、第2のヒトコラーゲンタンパク質)をコードする第2のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質と第2の美容用タンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質と第2のヒトコラーゲンタンパク質)は同じである。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質と第2の美容用タンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質と第2のヒトコラーゲンタンパク質)は異なる。
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ベクターである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、単純ヘルペスウイルスアンプリコンである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、組換えヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)ゲノムである。
美容用タンパク質をコードするポリヌクレオチド
コラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、コラーゲン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトコラーゲン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1277、1278、1281、1282、1284、1291、1294、1308等を参照のこと)、マウスコラーゲン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:12842、12843、12825、12826、12827、12833、12836、12821等を参照のこと)、チンパンジーコラーゲン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:104001053、455117、459815、452689、452661、450204、101056895、101058306等を参照のこと)、ラットコラーゲン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:29393、84352、84032、290905、306628、294337、301012、294027等を参照のこと)、ウサギコラーゲン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100347598、100008997、100009177、100358256、100358522、100343947、100356561、100339335等を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のコラーゲン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、BLAST(登録商標)blastn suite等の核酸配列アラインメントプログラムの使用を含む、追加の種由来のコラーゲン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のコラーゲン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のコラーゲン遺伝子のうちのいずれかのコード配列のコドン最適化バリアントを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲン遺伝子のコード配列のコドン最適化バリアントの使用により、対応する非コドン最適化野生型配列の異種発現の安定性及び/または収率と比較して、標的細胞(表皮細胞及び/または真皮細胞等)におけるコードされたコラーゲンタンパク質の異種発現(RNA及び/またはタンパク質)の安定性及び/または収率が増加する。例えば、Fath et al.(PLoS One.2011 Mar 3;6(3):e17596)によって説明される方法を含む、1つ以上の標的細胞(例えば、1つ以上のヒト細胞)における発現のための配列のコドン最適化を行うための当該技術分野で既知の任意の好適な方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトコラーゲン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド(すなわち、1つ以上の第1のポリヌクレオチド及び/または1つ以上の第2のポリヌクレオチド)に関する。例えば、COL1A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1277、配列番号1を参照のこと)、COL1A2遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1278、配列番号3を参照のこと)、COL2A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1280を参照のこと)、COL3A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1281、配列番号5を参照のこと)、COL4A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1282、配列番号7を参照のこと)、COL4A2遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1284を参照のこと)、COL4A3遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1285を参照のこと)、COL4A4遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1286を参照のこと)、COL4A5遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1287を参照のこと)、COL4A6遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1288を参照のこと)、COL5A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1289を参照のこと)、COL5A2遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1290を参照のこと)、COL5A3遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:50509を参照のこと)、COL6A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1291、配列番号9を参照のこと)、COL6A2遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1292を参照のこと)、COL6A3遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1293を参照のこと)、COL6A4遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:344875を参照のこと)、COL6A5遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:256076を参照のこと)、COL6A6遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:131873を参照のこと)、COL7A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1294、配列番号10を参照のこと)、COL8A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1295を参照のこと)、COL9A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1297を参照のこと)、COL9A2遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1298を参照のこと)、COL9A3遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1299を参照のこと)、COL10A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1300を参照のこと)、COL11A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1301を参照のこと)、COL11A2遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1302を参照のこと)、COL12A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1303を参照のこと)、COL13A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1305を参照のこと)、COL14A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:7373を参照のこと)、COL15A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1306を参照のこと)、COL16A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1307を参照のこと)、COL17A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1308、配列番号12を参照のこと)、COL18A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:80781を参照のこと)、COL19A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1310を参照のこと)、COL20A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:57642を参照のこと)、COL21A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:81578を参照のこと)、COL22A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:169044を参照のこと)、COL23A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:91522を参照のこと)、COL24A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:255631を参照のこと)、COL25A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:84570を参照のこと)、COL26A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:136227を参照のこと)、COL27A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:85301を参照のこと)、COL28A1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:340267を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適なヒトコラーゲン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)は、本開示の核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(すなわち、1つ以上の第1のポリヌクレオチド及び/または1つ以上の第2のポリヌクレオチド)は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のヒトコラーゲン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(すなわち、1つ以上の第1のポリヌクレオチド及び/または1つ以上の第2のポリヌクレオチド)は、本明細書に記載のヒトコラーゲン遺伝子のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ヒトコラーゲン遺伝子のコドン最適化バリアントの使用により、対応する非コドン最適化野生型配列の異種発現の安定性及び/または収率と比較して、標的細胞(ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞等)におけるヒトコラーゲンの異種発現(RNA及び/またはタンパク質)の安定性及び/または収率が増加する。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL1A1遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1または配列番号2の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1または配列番号2の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1または配列番号2の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号1または配列番号2の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号1または配列番号2の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000個であるが、4395個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1または配列番号2の核酸1〜4392の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1または配列番号2の核酸1〜4392の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL1A2遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号3または配列番号4の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号3または配列番号4の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号3または配列番号4の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号3または配列番号4の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号3または配列番号4の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000個であるが、4101個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号3または配列番号4の核酸1〜4098の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号3または配列番号4の核酸1〜4098の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL3A1遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号5または配列番号6の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号5または配列番号6の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号5または配列番号6の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号5または配列番号6の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号5または配列番号6の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000個であるが、4401個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号5または配列番号6の核酸1〜4398の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号5または配列番号6の核酸1〜4398の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL4A1遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号7または配列番号8の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号7または配列番号8の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号7または配列番号8の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号7または配列番号8の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号7または配列番号8の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000、少なくとも4500、少なくとも5000個であるが、5010個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号7または配列番号8の核酸1〜5007の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号7または配列番号8の核酸1〜5007の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL6A1遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号9または配列番号10の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号9または配列番号10の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号9または配列番号10の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号9または配列番号10の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号9または配列番号10の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000個であるが、3087個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号9または配列番号10の核酸1〜3084の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号9または配列番号10の核酸1〜3084の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL7A1遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号11または配列番号12の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号11または配列番号12の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号11または配列番号12の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号11または配列番号12の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号11または配列番号12の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000、少なくとも4500、少なくとも5000、少なくとも5500、少なくとも6000、少なくとも6500、少なくとも7000、少なくとも7500、少なくとも8000、少なくとも8500個であるが、8835個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号11または配列番号12の核酸1〜8832の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号11または配列番号12の核酸1〜8832の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL17A1遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号13または配列番号14の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号13または配列番号14の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号13または配列番号14の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号13または配列番号14の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号13または配列番号14の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000個であるが、4494個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号13または配列番号14の核酸1〜4491の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号13または配列番号14の核酸1〜4491の配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質、さらなるヒトコラーゲンタンパク質、追加のヒトコラーゲンタンパク質、及び/または第2のヒトコラーゲンタンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1〜14から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質、さらなるヒトコラーゲンタンパク質、追加のヒトコラーゲンタンパク質、及び/または第2のヒトコラーゲンタンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1〜14から選択される配列を含む。
フィブロネクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、フィブロネクチン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトフィブロネクチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:2335を参照のこと)、マウスフィブロネクチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:14268を参照のこと)、チンパンジーフィブロネクチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:459926を参照のこと)、ラットフィブロネクチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:25661を参照のこと)、ウサギフィブロネクチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100328589を参照のこと)を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のフィブロネクチン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のフィブロネクチン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブロネクチン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブロネクチン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトフィブロネクチン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド(すなわち、1つ以上の第1のポリヌクレオチド及び/または1つ以上の第2のポリヌクレオチド)に関する。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトFN1遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号35または配列番号36の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号35または配列番号36の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号35または配列番号36の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号35または配列番号36の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号35または配列番号36の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000、少なくとも約4500、少なくとも約5000、少なくとも約5500、少なくとも約6000、少なくとも約6500、少なくとも約7000個であるが、7434個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号35または配列番号36の核酸1〜7431の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号35または配列番号36の核酸1〜7431の配列を含む。
エラスチンタンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、エラスチン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトエラスチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:2006を参照のこと)、マウスエラスチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:13717を参照のこと)、チンパンジーエラスチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:463943を参照のこと)、ラットエラスチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:25043を参照のこと)、ウサギエラスチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100344271を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のエラスチン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のエラスチン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のエラスチン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のエラスチン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトエラスチン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド(すなわち、1つ以上の第1のポリヌクレオチド及び/または1つ以上の第2のポリヌクレオチド)に関する。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトELN遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号37または配列番号38の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号37または配列番号38の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号37または配列番号38の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号37または配列番号38の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号37または配列番号38の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2250個であるが、2361個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号37または配列番号38の核酸1〜2358の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号37または配列番号38の核酸1〜2358の配列を含む。
ルミカンタンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、ルミカン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトルミカン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:4060を参照のこと)、マウスルミカン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:17022を参照のこと)、チンパンジールミカン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:452119を参照のこと)、ラットルミカン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:81682を参照のこと)、ウサギルミカン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100008665を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のルミカン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のルミカン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のルミカン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のルミカン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトルミカン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド(すなわち、1つ以上の第1のポリヌクレオチド及び/または1つ以上の第2のポリヌクレオチド)に関する。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトLUM遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号39または配列番号40の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号39または配列番号40の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号39または配列番号40の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号39または配列番号40の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号39または配列番号40の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000個であるが、1017個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号39または配列番号40の核酸1〜1014の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号39または配列番号40の核酸1〜1014の配列を含む。
ビトロネクチン及びビトロネクチン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、ビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:7448及び3685を参照のこと)、マウスビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:22370及び16410を参照のこと)、チンパンジービトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:738261及び459807を参照のこと)、ラットビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:29169及び257645を参照のこと)、ウサギビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100009128及び100008956を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド(すなわち、1つ以上の第1のポリヌクレオチド及び/または1つ以上の第2のポリヌクレオチド)に関する。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトVTN遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号41または配列番号42の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号41または配列番号42の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号41または配列番号42の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号41または配列番号42の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号41または配列番号42の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも約1250個であるが、1437個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号41または配列番号42の核酸1〜1034の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号41または配列番号42の核酸1〜1034の配列を含む。
ラミニンタンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、ラミニン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトラミニン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:284217、3908、3909、3910、3911、3912、3913、3914、3915、3918、及び10319を参照のこと)、マウスラミニン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:16774、16780、及び16782を参照のこと)、チンパンジーラミニン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:455339、469668、及び457571を参照のこと)、ラットラミニン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:307582、305078、及び192362を参照のこと)、ウサギラミニン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100346886及び100342905を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のラミニン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のラミニン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のラミニン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のラミニン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトラミニン遺伝子、例えば、ヒトLAMA1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:284217を参照のこと)、ヒトLAMA2遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:3908を参照のこと)、ヒトLAMA3遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:3909を参照のこと)、ヒトLAMA4遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:3910を参照のこと)、ヒトLAMA5遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:3911を参照のこと)、ヒトLAMB1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:3912を参照のこと)、ヒトLAMB2遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:3913を参照のこと)、ヒトLAMB3遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:3914を参照のこと)、ヒトLAMC1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:3915を参照のこと)、ヒトLAMC2遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:3918を参照のこと)、またはヒトLAMC3遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:10319を参照のこと)のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド(すなわち、1つ以上の第1のポリヌクレオチド及び/または1つ以上の第2のポリヌクレオチド)に関する。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトLAMA3遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号43または配列番号44の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号43または配列番号44の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号43または配列番号44の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号43または配列番号44の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号43または配列番号44の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000、少なくとも約4500、少なくとも約5000個であるが、5175個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号43または配列番号44の核酸1〜5172の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号43または配列番号44の核酸1〜5172の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトLAMB3遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号45または配列番号46の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号45または配列番号46の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号45または配列番号46の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号45または配列番号46の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号45または配列番号46の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500個であるが、3519個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号45または配列番号46の核酸1〜3516の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号45または配列番号46の核酸1〜3516の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトLAMC2遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号47または配列番号48の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号47または配列番号48の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号47または配列番号48の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号47または配列番号48の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号47または配列番号48の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500個であるが、3582個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号47または配列番号48の核酸1〜3579の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号47または配列番号48の核酸1〜3579の配列を含む。
神経調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、神経調節遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、クロストリジウム・ボツリナム(clostridium botulinum)神経調節遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:5185061及び39483740を参照のこと)を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意の神経調節遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来の神経調節遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の神経調節遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の神経調節遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、クロストリジウム・ボツリナム神経調節遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド(すなわち、1つ以上の第1のポリヌクレオチド及び/または1つ以上の第2のポリヌクレオチド)に関する。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、クロストリジウム・ボツリナムbotA遺伝子(またはそのコドン最適化変異形)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号49または配列番号50の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号49または配列番号50の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号49または配列番号50の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号49または配列番号50の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号49または配列番号50の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも約1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500個であるが、3891個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号49または配列番号50の核酸1〜3888の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号49または配列番号50の核酸1〜3888の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、クロストリジウム・ボツリナムbotB遺伝子(またはそのコドン最適化バリアント)のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号51または配列番号52の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号51または配列番号52の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号51または配列番号52の配列の5’切断、3’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号51または配列番号52の配列の5’切断、3’切断、または断片は、配列番号51または配列番号52の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、または少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも約1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500個であるが、3876個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号51または配列番号52の核酸1〜3873の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号51または配列番号52の核酸1〜3873の配列を含む。
フィブリリンタンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、フィブリリン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトフィブリリン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:2200、2201、及び84467を参照のこと)、マウスフィブリリン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:14118及び14119を参照のこと)、チンパンジーフィブリリン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:453411、471621、及び455669を参照のこと)、ラットフィブリリン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:83727及び689008を参照のこと)、ウサギフィブリリン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100350931、100357126、及び100359336を参照のこと)を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のフィブリリン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のフィブリリン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブリリン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブリリン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトフィブリリン遺伝子、例えば、ヒトFBN1遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:2200を参照のこと)、ヒトFBN2遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:2201を参照のこと)、またはヒトFBN3遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:84467を参照のこと)のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド(すなわち、1つ以上の第1のポリヌクレオチド及び/または1つ以上の第2のポリヌクレオチド)に関する。
例示的なポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1〜14または35〜52から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1〜14または35〜52から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1〜14、35〜38、または43〜48から選択される核酸配列にと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1〜14、35〜38、または43〜48から選択される配列を含む。
美容用タンパク質(例えば、ヒトコラーゲンタンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、追加のコード配列及び非コード配列をさらにコードし得る。追加のコード配列及び非コード配列の例としては、追加のポリペプチドタグをコードする配列(例えば、融合タンパク質を産生するために美容用タンパク質とインフレームでコードされる)、イントロン(例えば、天然、改変、または異種イントロン)、5’UTR及び/または3’UTR(例えば、天然、改変、または異種5’UTR及び/または3’UTR)等が挙げられるが、これらに限定されない。好適なポリペプチドタグの例としては、精製タグ、例えば、hisタグ、フラグタグ、マルトース結合タンパク質及びグルタチオン−S−トランスフェラーゼタグ、検出タグ、例えば、測光的に検出され得るタグ(例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質等)及び検出可能な酵素活性を有するタグ(例えば、アルカリホスファターゼ等)、分泌配列、シグナル配列、リーダー配列、及び/または安定化配列、プロテアーゼ切断部位(例えば、フラン切断部位、TEV切断部位、トロンビン切断部位等)等を含むタグの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、5’UTR及び/または3’UTRは、ポリヌクレオチドの安定性、局在化、及び/または翻訳効率を増加させる。いくつかの実施形態では、5’UTR及び/または3’UTRは、タンパク質発現レベル及び/または持続時間を改善する。いくつかの実施形態では、5’UTR及び/または3’UTRは、オフターゲット発現を遮断または低減し得る(例えば、特定の細胞型(例えば、神経細胞)における発現を阻害する、細胞周期の特定の時点での発現を阻害する、特定の発達段階での発現を阻害する等)エレメント(例えば、1つ以上のmiRNA結合部位等)を含む。いくつかの実施形態では、5’UTR及び/または3’UTRは、特定の細胞型(ヒトケラチノサイト及び/または線維芽細胞等)における美容用タンパク質発現を強化し得るエレメント(例えば、1つ以上のmiRNA結合部位等)を含む。
いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(例えば、ヒトコラーゲンタンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、1つ以上(例えば、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、10個以上等)の調節配列に作動可能に連結されている。「調節配列」という用語は、エンハンサー、インシュレーター、プロモーター、及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含み得る。例えば、哺乳類遺伝子(例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、インスリン等)由来のエンハンサー配列、真核細胞ウイルス由来のエンハンサー配列(例えば、複製起点の後半側(bp100〜270)のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー等)、及びそれらの任意の組み合わせを含む、当該技術分野で既知の任意の好適なエンハンサー(複数可)が使用され得る。例えば、ヒトインターフェロンベータ遺伝子(IFNB1)由来のHSVクロマチン境界(CTRL/CTCF結合/インシュレーター)エレメントCTRL1及び/またはCTRL2、ニワトリ高感受性部位4インシュレーター(cHS4)、ヒトHNRPA2B1−CBX3ユビキタスクロマチンオープニングエレメント(UCOE)、足場/マトリックス結合領域(S/MAR)、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む、当該技術分野で既知の任意の好適なインシュレーター(複数可)が使用され得る。例えば、ウイルス(ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(アデノウイルス2等)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、シミアンウイルス40(SV40)等)のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳類遺伝子由来のプロモーター(アクチンプロモーター(例えば、β−アクチンプロモーター)、ユビキチンプロモーター(例えば、ユビキチンC(UbC)プロモーター)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター等)、同種哺乳類遺伝子から得られるプロモーター(例えば、天然ヒトコラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクトラミン、ラミニン、及び/またはフィブリリンプロモーター等)、合成プロモーター(CAGGプロモーター等)、及びそれらの任意の組み合わせを含む、当該技術分野で既知の任意の好適なプロモーター(例えば、哺乳類宿主細胞での転写に好適なプロモーター)が使用され得るが、但し、宿主細胞と適合性であることを条件とする。調節配列は、核酸、ならびに組織特異的調節配列及び/または誘導性もしくは抑制性配列の構成的発現を指示する配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(例えば、ヒトコラーゲンタンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、1つ以上の異種プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、1つ以上の異種プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時間的プロモーター、空間的プロモーター、誘導性プロモーター、及び抑制性プロモーターのうちの1つ以上である。いくつかの実施形態では、1つ以上の異種プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)即時早期プロモーター、ヒト伸長因子−1(EF1)プロモーター、ヒトβ−アクチンプロモーター、ヒトUbCプロモーター、ヒトPGFプロモーター、合成CAGGプロモーター、及びそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上である。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(例えば、ヒトコラーゲンタンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、HCMVプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、コラーゲンアルファ−1(VII)鎖ポリペプチド(COL7)(例えば、それをコードする導入遺伝子)のコード配列を含まない。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、リシルヒドロキシラーゼ3ポリペプチド(LH3)(例えば、それをコードする導入遺伝子)のコード配列を含まない。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ケラチンI型細胞骨格17ポリペプチド(KRT17)(例えば、それをコードする導入遺伝子)のコード配列を含まない。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、トランスグルタミナーゼ(TGM)ポリペプチド(例えば、ヒトTGM1ポリペプチド等のヒトトランスグルタミナーゼポリペプチド)(例えば、それをコードする導入遺伝子)のコード配列を含まない。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ラミニンサブユニットベータ−3ポリペプチド(LAMB3)(例えば、それをコードする導入遺伝子)のコード配列を含まない。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、コラーゲンアルファ−1(VII)鎖ポリペプチド、リシルヒドロキシラーゼ3ポリペプチド、ケラチンI型細胞骨格17ポリペプチド、及び/またはそれらの任意のキメラポリペプチド(例えば、それをコードする導入遺伝子)のコード配列を含まない。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、コラーゲンアルファ−1(VII)鎖ポリペプチド、リシルヒドロキシラーゼ3ポリペプチド、ケラチンI型細胞骨格17ポリペプチド、トランスグルタミナーゼ(TGM)ポリペプチド(例えば、ヒトTGM1ポリペプチド等のヒトトランスグルタミナーゼポリペプチド)、ラミニンサブユニットベータ−3(LAMB3)ポリペプチド(例えば、ヒトLamB3ポリペプチド)、及び/またはそれらの任意のキメラポリペプチド(例えば、それをコードする導入遺伝子)のコード配列を含まない。
美容用タンパク質
コラーゲンタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、全長コラーゲンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトコラーゲンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P02452、P08123、P02461、P02462、P08572、P12109、Q02388、Q9UMD9等を参照のこと)、マウスコラーゲンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P11087、Q01149、P08121、P02463、P08122、Q04857、Q63870、Q07563等を参照のこと)、チンパンジーコラーゲンタンパク質(例えば、UniProt受入番号A0A2I3SM98、A0A2J8L483、H2QJ46、K7C8P4、K7C8W0、A0A2J8M8U9、H2QMJ5、H2Q2J4等を参照のこと)、ラットコラーゲンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P02454、P02466、P13941、P02466、F1M6Q3、D3ZUL3、D3ZE04、D3ZE04等を参照のこと)、ウサギコラーゲンタンパク質(例えば、UniProt受入番号G1T4A5、Q28668、G1T8J0、G1U9R7、G1T548、G1T380、G1T548等を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のコラーゲンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、BLAST(登録商標)blastp suiteまたはOrthoDB等のアミノ酸配列アラインメントプログラムの使用を含む、追加の種由来のコラーゲンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のコラーゲンポリペプチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のコラーゲンポリペプチドのうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示はヒトコラーゲンタンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、コラーゲンアルファ−1(I)鎖ポリペプチド(COL1−1)(例えば、UniProt受入番号P02452、配列番号15を参照のこと)、コラーゲンアルファ−2(I)鎖ポリペプチド(COL1−2)(例えば、UniProt受入番号P08123、配列番号16を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(II)鎖ポリペプチド(COL2)(例えば、UniProt受入番号P02458を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(III)鎖ポリペプチド(COL3)(例えば、UniProt受入番号P2461、配列番号17を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(IV)鎖ポリペプチド(COL4−1)(例えば、UniProt受入番号P02462、配列番号18を参照のこと)、コラーゲンアルファ−2(IV)鎖ポリペプチド(COL4−2)(例えば、UniProt受入番号P08572を参照のこと)、コラーゲンアルファ−3(IV)鎖ポリペプチド(COL4−3)(例えば、UniProt受入番号Q01955を参照のこと)、コラーゲンアルファ−4(IV)鎖ポリペプチド(COL4−4)(例えば、UniProt受入番号P53420を参照のこと)、コラーゲンアルファ−5(IV)鎖ポリペプチド(COL4−5)(例えば、UniProt受入番号29400を参照のこと)、コラーゲンアルファ−6(IV)鎖ポリペプチド(COL4−6)(例えば、UniProt受入番号Q14031を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(V)鎖ポリペプチド(COL5−1)(例えば、UniProt受入番号P20908を参照のこと)、コラーゲンアルファ−2(V)鎖ポリペプチド(COL5−2)(例えば、UniProt受入番号P05997を参照のこと)、コラーゲンアルファ−3(V)鎖ポリペプチド(COL5−3)(例えば、UniProt受入番号P25940を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(VI)鎖ポリペプチド(COL6−1)(例えば、UniProt受入番号P12109、配列番号19を参照のこと)、コラーゲンアルファ−2(VI)鎖ポリペプチド(COL6−2)(例えば、UniProt受入番号P12110を参照のこと)、コラーゲンアルファ−3(VI)鎖ポリペプチド(COL6−3)(例えば、UniProt受入番号P12111を参照のこと)、コラーゲンアルファ−4(VI)鎖ポリペプチド(COL6−4)、コラーゲンアルファ−5(VI)鎖ポリペプチド(COL6−5)(例えば、UniProt受入番号A8TX70を参照のこと)、コラーゲンアルファ−6(VI)鎖ポリペプチド(COL6−6)(例えば、UniProt受入番号A6NMZ7を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(VII)鎖ポリペプチド(COL7)(例えば、UniProt受入番号Q02388、配列番号20を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(VIII)鎖ポリペプチド(COL8)(例えば、UniProt受入番号P27658を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(IX)鎖ポリペプチド(COL9−1)(例えば、UniProt受入番号P20849を参照のこと)、コラーゲンアルファ−2(IX)鎖ポリペプチド(COL9−2)(例えば、UniProt受入番号Q14055を参照のこと)、コラーゲンアルファ−3(IX)鎖ポリペプチド(COL9−3)(例えば、UniProt受入番号Q14050を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(X)鎖ポリペプチド(COL10)(例えば、UniProt受入番号Q03692を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XI)鎖ポリペプチド(COL11−1)(例えば、UniProt受入番号P12107を参照のこと)、コラーゲンアルファ−2(XI)鎖ポリペプチド(COL11−2)(例えば、UniProt受入番号P13942を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XII)鎖ポリペプチド(COL12)(例えば、UniProt受入番号Q99715を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XIII)鎖ポリペプチド(COL13)(例えば、UniProt受入番号Q5TAT6を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XIV)鎖ポリペプチド(COL14)(例えば、UniProt受入番号Q05707を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XV)鎖ポリペプチド(COL15)(例えば、UniProt受入番号P39059を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XVI)鎖ポリペプチド(COL16)(例えば、UniProt受入番号Q07092を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XVII)鎖ポリペプチド(COL17)(例えば、UniProt受入番号Q9UMD9、配列番号21を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XVIII)鎖ポリペプチド(COL18)(例えば、UniProt受入番号P39060を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XIX)鎖ポリペプチド(COL19)(例えば、UniProt受入番号Q14993を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XX)鎖ポリペプチド(COL20)(例えば、UniProt受入番号Q9P218を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XXI)鎖ポリペプチド(COL21)(例えば、UniProt受入番号Q96P44を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XXII)鎖ポリペプチド(COL22)(例えば、UniProt受入番号Q8NFW1を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XXIII)鎖ポリペプチド(COL23)(例えば、UniProt受入番号Q86Y22を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XXIV)鎖ポリペプチド(COL24)(例えば、UniProt受入番号Q17RW2を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XXV)鎖ポリペプチド(COL25)(例えば、UniProt受入番号Q9BXS0を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XXVI)鎖ポリペプチド(COL26)(例えば、UniProt受入番号Q96A83を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XXVII)鎖ポリペプチド(COL27)(例えば、UniProt受入番号Q8IZC6を参照のこと)、コラーゲンアルファ−1(XXVIII)鎖ポリペプチド(COL28)(例えば、UniProt受入番号Q2UY09を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適なヒトコラーゲンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のヒトコラーゲンポリペプチドのうちのいずれかをコードする配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。例えば、BLAST(登録商標)blastp suiteまたはOrthoDB等のアミノ酸配列アラインメントプログラムの使用を含む、追加のヒトコラーゲンまたはコラーゲン様ポリペプチドホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL1−1タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、COL1−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号15の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトCOL1−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号15のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、COL1−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号15のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号15の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400個であるが、1464個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL1−2タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、COL1−2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号16の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトCOL1−2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号16のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、COL1−2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号16のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号16の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300個であるが、1366個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL3タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、COL3タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号17の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトCOL3タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号17のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、COL3タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号17のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号17の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400個であるが、1466個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL4−1タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、COL4−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号18の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトCOL4−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号18のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、COL4−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号18のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号18の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400、少なくとも1500、少なくとも1600個であるが、1669個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL6−1タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、COL6−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号19の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトCOL6−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号19のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、COL6−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号19のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号19の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000個であるが、1028個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL7タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、COL7タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号20の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトCOL7タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、COL7タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号20のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号20の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400、少なくとも1500、少なくとも1600、少なくとも1700、少なくとも1800、少なくとも1900、少なくとも2000、少なくとも2100、少なくとも2200、少なくとも2300、少なくとも2400、少なくとも2500、少なくとも2600、少なくとも2700、少なくとも2800、少なくとも2900個であるが、2944個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトCOL17タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、COL17タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号21の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトCOL17タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号21のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、COL17タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号21のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号21の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400個であるが、1497個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質、さらなるヒトコラーゲンタンパク質、追加のヒトコラーゲンタンパク質、及び/または第2のヒトコラーゲンタンパク質)は、配列番号15〜21から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質、さらなるヒトコラーゲンタンパク質、追加のヒトコラーゲンタンパク質、及び/または第2のヒトコラーゲンタンパク質)は、配列番号15〜21から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質、さらなるヒトコラーゲンタンパク質、追加のヒトコラーゲンタンパク質、及び/または第2のヒトコラーゲンタンパク質)は、配列番号15〜17から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質、さらなるヒトコラーゲンタンパク質、追加のヒトコラーゲンタンパク質、及び/または第2のヒトコラーゲンタンパク質)は、配列番号15〜17から選択される配列を含む。
フィブロネクチンタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、全長フィブロネクチンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトフィブロネクチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P02751を参照のこと)、マウスフィブロネクチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P11276を参照のこと)、チンパンジーフィブロネクチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P11276を参照のこと)、ラットフィブロネクチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P04937を参照のこと)、ウサギフィブロネクチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P04937を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のフィブロネクチンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のフィブロネクチンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のフィブロネクチンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブロネクチンタンパク質のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトフィブロネクチンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトフィブロネクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号53の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトフィブロネクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号53のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトフィブロネクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号53のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号53の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400、少なくとも1500、少なくとも1600、少なくとも1700、少なくとも1800、少なくとも1900、少なくとも2000、少なくとも2100、少なくとも2200、少なくとも2300、少なくとも2400個であるが、2477個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
エラスチン及び関連タンパク質
細胞外マトリックス中の弾性繊維は、組織に弾性特性を与える。弾性繊維は、概して、2つの形態学的に異なる成分、成熟エラスチン繊維と、主にフィブリリンを含有し、かつミクロフィブリル関連糖タンパク質(MAGP)、フィブリリン、及びエラスチン−ミクロフィブリル界面局在化タンパク質(EMILIN)等のさらなるタンパク質と会合しているクロフィブリルとを含有する。エラスチン及びその可溶性前駆体トロポエラスチンは、体内の主要な構造タンパク質に属する。
いくつかの実施形態では、本開示は、トロポエラスチン、フィブリリン、ミクロフィブリル関連糖タンパク質、フィブリリン、またはエラスチン−ミクロフィブリル界面局在化タンパク質を含む、エラスチンまたはエラスチン関連タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、全長エラスチンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトエラスチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P15502を参照のこと)、マウスエラスチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P15502を参照のこと)、チンパンジーエラスチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号H2QUQ6を参照のこと)、ラットエラスチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号Q99372を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のエラスチンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のエラスチンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のエラスチンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のエラスチンタンパク質のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトエラスチンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトエラスチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号54の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトエラスチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号54のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトエラスチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号54のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号54の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700個であるが、786個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
ルミカンタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、全長ルミカンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトルミカンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P51884を参照のこと)、マウスルミカンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P51885を参照のこと)、チンパンジールミカンタンパク質(例えば、UniProt受入番号H2Q6L3を参照のこと)、ラットルミカンタンパク質(例えば、UniProt受入番号H2Q6L3を参照のこと)、ウサギルミカンタンパク質(例えば、UniProt受入番号O46379を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のルミカンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のルミカンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のルミカンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のルミカンタンパク質のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトルミカンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトルミカンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号55の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトルミカンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号55のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトルミカンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号55のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号55の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300個であるが、338個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
ビトロネクチン及びビトロネクチン受容体タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、全長ビトロネクチンもしくはビトロネクチン受容体タンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質(例えば、UniProt受入番号P04004及びP06756を参照のこと)、マウスビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質(例えば、UniProt受入番号P29788及びP43406を参照のこと)、チンパンジービトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質(例えば、UniProt受入番号H2QCH3及びH2R6C3を参照のこと)、ラットビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質(例えば、UniProt受入番号Q7TQ11を参照のこと)、ウサギビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質(例えば、UniProt受入番号P22458を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトビトロネクチンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトビトロネクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号56の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトビトロネクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号56のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトビトロネクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号56のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号56の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300個、少なくとも400個であるが、478個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
ラミニンタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、全長ラミニンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトラミニンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P25391、P24043、Q16787、Q16363、O15230、P07942、P55268、Q13751、P11047、Q13753、及びQ9Y6N6を参照のこと)、マウスラミニンタンパク質(例えば、UniProt受入番号Q61789、Q61087、及びQ61092を参照のこと)、チンパンジーラミニンタンパク質(例えば、UniProt受入番号H2QEC7、H2R041、及びH2Q0R2を参照のこと)、ラットラミニンタンパク質(例えば、UniProt受入番号D3ZN05、F1LPI5、及びF1LRH4を参照のこと)、ウサギラミニンタンパク質(例えば、UniProt受入番号G1SY40及びA0A0B5JSH0を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のラミニンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のラミニンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のラミニンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のラミニンタンパク質のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトラミニンタンパク質、例えば、ヒトラミニンサブユニットアルファ−1(LamA1)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号P25391を参照のこと)、ヒトラミニンサブユニットアルファ−2(LamA2)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号P24043を参照のこと)、ヒトラミニンサブユニットアルファ−3(LamA3)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号Q16787を参照のこと)、ヒトラミニンサブユニットアルファ−4(LamA4)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号Q16363を参照のこと)、ヒトラミニンサブユニットアルファ−5(LamA5)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号O15230を参照のこと)、ヒトラミニンサブユニットベータ−1(LamB1)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号P07942を参照のこと)、ヒトラミニンサブユニットベータ−2(LamB2)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号P55268を参照のこと)、ヒトラミニンサブユニットベータ−3(LamB3)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号Q13751を参照のこと)、ヒトラミニンサブユニットガンマ−1(LamC1)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号P11047を参照のこと)、ヒトラミニンサブユニットガンマ−2(LamC2)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号Q13753を参照のこと)、ヒトラミニンサブユニットガンマ−3(LamC3)ポリペプチド(例えば、UniProt受入番号Q9Y6N6を参照のこと)等をコードする。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトLamA3ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ヒトLamA3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号57の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトLamA3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号57のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトLamA3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号57のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号57の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2250、少なくとも2500、少なくとも2750、少なくとも3000、少なくとも3250個であるが、3333個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトLamB3ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ヒトLamB3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号58の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトLamB3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号58のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、LamB3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号58のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号58の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100個であるが、1172個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトLamC2ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ヒトLamC2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号59の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトLamC2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号59のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、LamC2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号59のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号59の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100個であるが、1193個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
神経調節タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、全長神経調節タンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、クロストリジウム・ボツリナムタンパク質(例えば、UniProt受入番号P0DPI0、Q45894、P0DPI1、P10844、及びB1INP5を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意の神経調節タンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来の神経調節物質タンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示の神経調節タンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のいずれかの神経調節タンパク質の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、クロストリジウム・ボツリナム神経調節タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、A型クロストリジウム・ボツリナム神経毒素タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、A型クロストリジウム・ボツリナム神経毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号60の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、A型クロストリジウム・ボツリナム神経毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号60のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のA型クロストリジウム・ボツリナム神経毒素タンパク質は、配列番号60の27位に対応する位置にアラニンからバリンへの変異を含む。
いくつかの実施形態では、A型クロストリジウム・ボツリナム神経毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号60のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号60の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200個であるが、1296個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、B型クロストリジウム・ボツリナム神経毒素タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、B型クロストリジウム・ボツリナム神経毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号61の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、B型クロストリジウム・ボツリナム神経毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号61のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、B型クロストリジウム・ボツリナム神経毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号61のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号61の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200個であるが、1291個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
フィブリリンタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、全長フィブリリンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトフィブリリンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P35555、P35556、及びQ75N90を参照のこと)、マウスフィブリリンタンパク質(例えば、UniProt受入番号Q61554及びQ61555を参照のこと)、チンパンジーフィブリリンタンパク質(例えば、UniProt受入番号A0A2I3RTE4及びK7CZX0を参照のこと)、ラットフィブリリンタンパク質(例えば、UniProt受入番号G3V9M6及びF1M5Q4を参照のこと)、ウサギフィブリリンタンパク質(例えば、UniProt受入番号G1SKM2、G1SUS5、及びG1T1H4を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のフィブリリンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のフィブリリンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のフィブリリンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブリリンタンパク質のいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトフィブリリンタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトフィブリリン−1タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトフィブリリン−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号62の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトフィブリリン−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号62のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトフィブリリン−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号62のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号62の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2250、少なくとも2500、少なくとも2750個であるが、2871個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトフィブリリン−2タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトフィブリリン−2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号63の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトフィブリリン−2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号63のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトフィブリリン−2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号63のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号63の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2250、少なくとも2500、少なくとも2750個であるが、2912個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトフィブリリン−3タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトフィブリリン−3タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号64の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトフィブリリン−3タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号64のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトフィブリリン−3タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号64のアミノ酸配列のN末端切断、C末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。N末端切断、C末端切断、または断片は、配列番号64の少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2250、少なくとも2500、少なくとも2750個であるが、2809個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
例示的な美容ポリペプチド
いくつかの実施形態では、本開示の1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)は、配列番号15〜21または53〜64から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)は、配列番号15〜21または53〜64から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)は、配列番号15〜21、53〜54、または57〜59から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)は、配列番号15〜21、53〜54、または57〜59から選択される配列を含む。
第1のポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、第1の美容用タンパク質を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。第1の美容用タンパク質は、例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン/ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン等を含む、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の美容用タンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリリン等)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質)である。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの1つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの2つ以上(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、10個以上等)のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの2つのコピーを含む。
いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、第1のヒトコラーゲンタンパク質である。第1のヒトコラーゲンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のヒトコラーゲンタンパク質のうちのいずれであり得る。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、またはCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−2である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL3である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL4−1である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL4−2である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL6−1である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL7である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL7ではない。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質は、COL17である。
いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1の美容用タンパク質から本質的になる。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1の美容用タンパク質からなる。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1の美容用タンパク質である。
キメラポリペプチド
いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1の美容用タンパク質を含むキメラポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1の美容用タンパク質及びさらなる美容用タンパク質を含むキメラポリペプチドである。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、第1の美容用タンパク質とさらなる美容用タンパク質を連結するリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、n末端からc末端の方向に、第1の美容用タンパク質−リンカーポリペプチド−さらなる美容用タンパク質、を含む。例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン/ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン等を含む、第1の美容用タンパク質及び/またはさらなる美容用タンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の美容用タンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質及び/またはさらなる美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリリン等)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質及び/またはさらなる美容用タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質とさらなる美容用タンパク質は同じである。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質とさらなる美容用タンパク質は異なる。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、切断可能なリンカーポリペプチドである。例えば、T2Aリンカー、P2Aリンカー、E2Aリンカー、及びF2Aリンカー等を含む、当該技術分野で既知の任意の切断可能なリンカーポリペプチドが、本開示のキメラポリペプチドに使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、T2Aリンカーポリペプチドである。T2Aリンカーポリペプチドをコードする例示的な核酸配列は、配列番号24として提供される。T2Aリンカーポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号28として提供される。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、P2Aリンカーポリペプチドである。P2Aリンカーポリペプチドをコードする例示的な核酸配列は、配列番号25として提供される。P2Aリンカーポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号29として提供される。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、E2Aリンカーポリペプチドである。E2Aリンカーポリペプチドをコードする例示的な核酸配列は、配列番号26として提供される。E2Aリンカーポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号30として提供される。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、F2Aリンカーポリペプチドである。F2Aリンカーポリペプチドをコードする例示的な核酸配列は、配列番号27として提供される。F2Aリンカーポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号31として提供される。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号28〜31から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは配列番号28〜31から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、第1のコラーゲンタンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質)であり、さらなる美容用タンパク質は、さらなるコラーゲンタンパク質(例えば、さらなるヒトコラーゲンタンパク質)である。第1のヒトコラーゲンタンパク質、リンカーポリペプチド、及びさらなるヒトコラーゲンタンパク質を含むキメラポリペプチドをコードする例示的な核酸配列は、配列番号32として提供される。
いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は第1のヒトコラーゲンタンパク質であり、さらなる美容用タンパク質はさらなるヒトコラーゲンタンパク質である。さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のヒトコラーゲンタンパク質のうちのいずれであり得る。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、またはCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1である。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−2である。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL3である。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL4−1である。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL4−2である。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL6−1である。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL7である。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL7ではない。いくつかの実施形態では、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL17である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質とさらなるヒトコラーゲンタンパク質は同じである。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質とさらなるヒトコラーゲンタンパク質は異なる。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−2である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質はCOL3である。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−2であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−2であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1である。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL3であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL4−1であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL4−1であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質はCOL4−2である。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL6−1であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL7、またはCOL17から選択される。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL7であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、またはCOL17である。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL17であり、さらなるヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、またはCOL7である。
いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、第1のラミニンタンパク質(例えば、第1のヒトラミニンタンパク質)であり、さらなる美容用タンパク質は、さらなるラミニンタンパク質(例えば、さらなるヒトラミニンタンパク質)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は第1のヒトラミニンタンパク質であり、さらなる美容用タンパク質はさらなるヒトラミニンタンパク質である。さらなるヒトラミニンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のヒトラミニンタンパク質のうちのいずれであり得る。いくつかの実施形態では、第1のヒトラミニンタンパク質はヒトLamA3ポリペプチドであり、さらなるヒトラミニンタンパク質はヒトLamB3ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1のヒトラミニンタンパク質はヒトLamA3ポリペプチドであり、さらなるヒトラミニンタンパク質はヒトLamC2ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1のヒトラミニンタンパク質はヒトLamB3ポリペプチドであり、さらなるヒトラミニンタンパク質はヒトLamC2ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、モノシストロニックmRNAをコードする。いくつかの実施形態では、モノシストロニックmRNAは、第1のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。
いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、ポリシストロニックmRNAをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックmRNAは、第1のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。
ポリシストロニックmRNA
いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、ポリシストロニックmRNAをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックmRNAは、第1のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、(1)前記第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、及び(2)追加の美容用タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレーム(ORF)を含むポリシストロニックmRNAをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックmRNAは、第1のORFと第2のORFを分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックmRNAは、5’から3’の方向に、第1のポリペプチドをコードする第1のORF−IRES−追加の美容用タンパク質をコードする第2のORF、を含む。第1のポリペプチドは、本明細書に記載の第1のポリペプチドのうちのいずれかであり得る。追加の美容用タンパク質は、例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン/ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン等を含む、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の美容用タンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、追加の美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリリン等)である。いくつかの実施形態では、追加の美容用タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質)である。
例えば、ウイルス由来IRES(例えば、ポリオウイルス、サイウイルス、脳心筋炎ウイルス(EMCV)、口蹄疫ウイルス、C型肝炎ウイルス、クラシックブタ熱ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、クリケット麻痺ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス等に由来するIRES)、細胞mRNA由来IRES(例えば、線維芽細胞増殖因子2、血小板由来増殖因子B、及び血管内皮増殖因子等の増殖因子mRNA由来のIRES、アンテナペディア、ウルトラバイソラックス、及びNF−κB抑制因子等の転写因子mRNAに由来するIRES、c−myc、pim−1、及びタンパク質キナーゼp58PITSLRE等のがん遺伝子mRNAに由来するIRES等)、合成IRES(例えば、CP148 IRES)、及び他のもの(例えば、Mokrejs et al.(2007)A Bioinformatical Approach to the Analysis of Viral and Cellular Internal Ribosome Entry Sites.Columbus F editors.New Messenger RNA Research Communications.Hauppauge,NY:Nova Science Publishers;pp.133−166を参照のこと)を含む、当該技術分野で既知の任意の好適なIRESが、本開示のポリシストロニックmRNAに使用され得る。いくつかの実施形態では、IRESは、CP148 IRESである。CP148 IRESをコードする例示的な核酸配列は、配列番号22として提供される。いくつかの実施形態では、IRESは、EMCV IRESである。EMCV IRESをコードする例示的な核酸配列は、配列番号23として提供される。
いくつかの実施形態では、IRESをコードする核酸配列は、配列番号22または配列番号23から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、IRESをコードする核酸配列は、配列番号22または配列番号23の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1のコラーゲンタンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質)であり、追加の美容用タンパク質は、追加のコラーゲンタンパク質(例えば、追加のヒトコラーゲンタンパク質)である。第1のORF、IRES、及び第2のORFを含むポリシストロニックmRNAをコードする例示的な核酸は、配列番号33または配列番号34として提供される。追加のヒトコラーゲンタンパク質は、本明細書に記載のヒトコラーゲンタンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、またはCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1である。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−2である。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL3である。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL4−1である。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL4−2である。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL6−1である。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL7である。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL7ではない。いくつかの実施形態では、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL17である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質と追加のヒトコラーゲンタンパク質は同じである。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質と追加のヒトコラーゲンタンパク質は異なる。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−2である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質はCOL3である。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−2であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−2であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1である。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL3であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL4−1であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL4−1であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質はCOL4−2である。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL6−1であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL7、またはCOL17から選択される。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL7であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、またはCOL17から選択される。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL17であり、追加のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、またはCOL7から選択される。
いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1のコラーゲンタンパク質(例えば、第1のヒトコラーゲンタンパク質)であり、追加の美容用タンパク質は、追加のコラーゲンタンパク質(例えば、追加のヒトコラーゲンタンパク質)である。
いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1のラミニンタンパク質(例えば、第1のヒトラミニンタンパク質)であり、追加の美容用タンパク質は、追加のラミニンタンパク質(例えば、追加のヒトラミニンタンパク質)である。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは第1のヒトラミニンタンパク質であり、追加の美容用タンパク質は追加のヒトラミニンタンパク質である。追加のヒトラミニンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のヒトラミニンタンパク質のうちのいずれであり得る。いくつかの実施形態では、第1のヒトラミニンタンパク質はヒトLamA3ポリペプチドであり、追加のヒトラミニンタンパク質はヒトLamB3ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1のヒトラミニンタンパク質はヒトLamA3ポリペプチドであり、追加のヒトラミニンタンパク質はヒトLamC2ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1のヒトラミニンタンパク質はヒトLamB3ポリペプチドであり、追加のヒトラミニンタンパク質はヒトLamC2ポリペプチドである。
第2のポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、第2の美容用タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む組換え核酸に関する。第2の美容用タンパク質は、例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン/ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン等を含む、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の美容用タンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、第2の美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリリン等)である。いくつかの実施形態では、第2の美容用タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質と第2の美容用タンパク質は同じである。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質と第2の美容用タンパク質は異なる。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第2のポリヌクレオチドの1つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第2のポリヌクレオチドの2つ以上(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、10個以上等)のコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第2のポリヌクレオチドの2つのコピーを含む。
いくつかの実施形態では、第2の美容用タンパク質は、コラーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態では、第2の美容用タンパク質は、第2のヒトコラーゲンタンパク質である。第2のヒトコラーゲンタンパク質は、本明細書に記載のヒトコラーゲンタンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、またはCOL28から選択される。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1である。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−2である。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL3である。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL4−1である。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL4−2である。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL6−1である。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL7である。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL7ではない。いくつかの実施形態では、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL17である。
いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは第1のコラーゲンタンパク質をコードし、第2のポリヌクレオチドは第2のコラーゲンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードし、第2のポリヌクレオチドは第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質(第1のポリヌクレオチドによってコードされる)と第2のヒトコラーゲンタンパク質(第2のポリヌクレオチドによってコードされる)は同じである。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質(第1のポリヌクレオチドによってコードされる)と第2のヒトコラーゲンタンパク質(第2のポリヌクレオチドによってコードされる)は異なる。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−2である。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質はCOL3である。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−2であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−2であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質はCOL1−1である。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL3であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL4−1、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL4−1であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−2、COL1−2、COL3、COL4−2、COL6−1、COL7、またはCOL17から選択される。いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL4−1であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質はCOL4−2である。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL6−1であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL7、またはCOL17から選択される。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL7であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、またはCOL17から選択される。
いくつかの実施形態では、第1のヒトコラーゲンタンパク質はCOL17であり、第2のヒトコラーゲンタンパク質は、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、またはCOL7から選択される。
いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、第1のラミニンタンパク質(例えば、第1のヒトラミニンタンパク質)をコードし、第2のポリヌクレオチドは、第2のラミニンタンパク質(例えば、第2のヒトラミニンタンパク質)をコードする。いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは第1のヒトラミニンポリペプチドをコードし、第2のポリヌクレオチドは第2のヒトラミニンタンパク質をコードする。第2のヒトラミニンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のヒトラミニンタンパク質のうちのいずれであり得る。いくつかの実施形態では、第1のヒトラミニンタンパク質はヒトLamA3ポリペプチドであり、第2のヒトラミニンタンパク質はヒトLamB3ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1のヒトラミニンタンパク質はヒトLamA3ポリペプチドであり、第2のヒトラミニンタンパク質はヒトLamC2ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1のヒトラミニンタンパク質はヒトLamB3ポリペプチドであり、第2のヒトラミニンタンパク質はヒトLamC2ポリペプチドである。
組換え核酸
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれか1つ以上を含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの1つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの2つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの1つのコピー及び第2のポリヌクレオチドの1つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの1つのコピー及び第2のポリヌクレオチドの2つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの2つのコピー及び第2のポリヌクレオチドの1つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの2つのコピー及び第2のポリヌクレオチドの2つのコピーを含む。
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ベクター(例えば発現ベクター、ディスプレイベクター等)である。いくつかの実施形態では、ベクターは、DNAベクターまたはRNAベクターである。一般に、対象において1つ以上のポリペプチドを産生するためにポリヌクレオチドを維持する、増殖させる、及び/または発現させるのに好適なベクターが使用され得る。好適なベクターの例としては、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、トランスポゾン、及びウイルスベクター(例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、麻疹ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等)が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で自律複製することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で自律複製することができない。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主DNAに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主DNAに組み込むことができない(例えば、エピソームである)。例えば、化学合成による、または核酸の単離されたセグメントの人為的操作による(例えば、遺伝子操作技法による)、目的とする1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターを作製する方法は、当業者に周知である。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、単純ヘルペスウイルス(HSV)アンプリコンである。構造的特徴及びそれを作製する方法を含むヘルペスウイルスアンプリコンは、当業者に一般に既知である(例えば、de Silva S.and Bowers W.“Herpes Virus Amplicon Vectors”.Viruses 2009,1,594−629を参照のこと)。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスアンプリコンは、HSV−1アンプリコンである。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスアンプリコンは、HSV−1ハイブリッドアンプリコンである。HSV−1ハイブリッドアンプリコンの例としては、HSV/AAVハイブリッドアンプリコン、HSV/EBVハイブリッドアンプリコン、HSV/EBV/RVハイブリッドアンプリコン、及び/またはHSV/スリーピングビューティーハイブリッドアンプリコンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、HSV/AAVハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、HSV/スリーピングビューティーハイブリッドアンプリコンである。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、組換えヘルペスウイルスゲノムである。例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム、組換え水痘帯状疱疹ウイルスゲノム、組換えヒトサイトメガロウイルスゲノム、組換えヘルペスウイルス6Aゲノム、組換えヘルペスウイルス6Bゲノム、組換えヘルペスウイルス7ゲノム、組換えカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスゲノム、及びそれらの任意の組み合わせまたは任意の誘導体を含む、組換えヘルペスウイルスゲノムは、当該技術分野で既知のDNAウイルスのヘルペスウイルス科(Herpesviridae family)の任意のメンバー由来の組換えゲノムであり得る。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、1つ以上(例えば、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上等)の不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の不活性化変異は、1つ以上(例えば、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上等)のヘルペスウイルス遺伝子に存在する。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、(例えば、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して)弱毒化されている。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、複製能を有する。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、複製欠損である。
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、組換え単純ヘルペスウイルス(HSV)ゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)ゲノム、組換え単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)ゲノム、またはそれらの任意の誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えHSV−1ゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、複製能を有する。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、複製欠損である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、1つ以上(例えば、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上等)の不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の不活性化変異は、1つ以上(例えば、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上等)の単純ヘルペスウイルス遺伝子に存在する。本明細書で使用される場合、「不活性化変異」とは、(例えば、不活性化変異を欠く対応する配列と比較して)低下した、検出不能な、または排除された量及び/または機能を有する遺伝子またはレギュロン産物(RNAまたはタンパク質)をもたらす任意の変異を指し得る。不活性化変異の例としては、欠失、挿入、点変異、ならびに転写制御配列(プロモーター、エンハンサー、インシュレーター等)及び/または所与の遺伝子もしくはレギュロンのコード配列の再配列が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、qPCR、ノーザンブロット、RNAseq、ウエスタンブロット、ELISA等を含む、当該技術分野で既知の遺伝子またはレギュロン産物の量を測定する任意の好適な方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、感染細胞タンパク質(または感染細胞ポリペプチド)(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、チミジンキナーゼ(tk)、ロングユニーク領域(UL)41、及び/またはUL55単純ヘルペスウイルス遺伝子のうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、または8つ全てに不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP34.5単純ヘルペスウイルス遺伝子及び/またはICP47単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含まない(例えば、免疫刺激ウイルスの産生を回避するために)。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP34.5単純ヘルペスウイルス遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含まない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP47単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含まない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP34.5単純ヘルペスウイルス遺伝子(一方または両方のコピー)及びICP47単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含まない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、腫瘍溶解性ではない。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP27、ICP47、UL41、及び/またはUL55遺伝子に開始変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP4遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP4遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP4遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP22遺伝子に不活性化変異を含み、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP4遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP22遺伝子に不活性化変異を含み、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、及び/またはUL41遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP27、ICP47、及び/またはUL55遺伝子に不活性化変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換えヘルペス複合体ウイルスゲノムは、ICP4(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP27、ICP47、UL41、及び/またはUL55遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4遺伝子(一方または両方のコピー)に不活性化変異を含み、ICP22遺伝子に不活性化変異を含み、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、及び/またはUL41遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0、ICP27、ICP47、及び/またはUL55遺伝子に不活性化変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP22遺伝子に不活性化変異を含み、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP27、ICP47、UL41、及び/またはUL55遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP22遺伝子に不活性化変異を含み、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ICP22及び/またはUL41遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP27、ICP47、及び/またはUL55遺伝子に不活性化変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP27遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP27遺伝子に不活性化変異を含み、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP47、UL41、及び/またはUL55遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ICP27遺伝子のコード配列の欠失である。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP47遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP47遺伝子に不活性化変異を含み、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP27、UL41、及び/またはUL55遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ICP47遺伝子のコード配列の欠失である。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL41遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL41遺伝子に不活性化変異を含み、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP27、ICP47、及び/またはUL55遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、UL41遺伝子のコード配列の欠失である。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL55遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、UL55遺伝子に不活性化変異を含み、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP27、ICP47、及び/またはUL41遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、UL55遺伝子のコード配列の欠失である。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、IRL(internal repeat long)領域及びIRS(internal repeat short)領域を含む内部反復(連結)領域に不活性化変異(例えば、その欠失)を含む。いくつかの実施形態では、連結領域の不活性化(例えば、欠失)は、ICP4遺伝子及びICP0遺伝子の各々1つのコピーを排除する。いくつかの実施形態では、連結領域の不活性化(例えば、欠失)は、ICP22遺伝子及びICP47遺伝子のプロモーターをさらに不活性化する(例えば、欠失させる)。所望される場合、これらの遺伝子の一方または両方の発現は、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムへの即時早期プロモーターの挿入によって回復し得る(例えば、Hill et al.(1995).Nature 375(6530):411−415、Goldsmith et al.(1998).J Exp Med 187(3):341−348を参照のこと)。理論に拘束されることを望むことなく、連結領域を不活性化する(例えば、欠失させる)ことが、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムの安定性に寄与し得る、及び/または組換え単純ヘルペスウイルスゲノムがより多くの及び/またはより大きい導入遺伝子を収容することを可能にすると考えられる。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、及びICP27遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP27、及びUL55遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP27、ICP47、及びUL55遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP27、及び/またはUL55遺伝子における不活性化変異は、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP27、及び/またはUL55遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、ICP22遺伝子及びICP47遺伝子における不活性化変異は、ICP22遺伝子及びICP47遺伝子のプロモーター領域の欠失である(例えば、ICP22コード配列及びICP47コード配列はインタクトであるが、転写的に活性ではない)。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP27、及びUL55遺伝子のコード配列の欠失、ならびにICP22遺伝子及びICP47遺伝子のプロモーター領域の欠失を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0遺伝子及び/またはUL41遺伝子に不活性化変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0(一方または両方のコピー)遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0(一方または両方のコピー)及びICP4(一方または両方のコピー)遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、及びICP22遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、及びICP27遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP27、及びUL55遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP27、及び/またはUL55遺伝子における不活性化変異は、ICP0、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP27、及び/またはUL55遺伝子のコード配列の欠失を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ICP47遺伝子及び/またはUL41遺伝子に不活性化変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、1、2、3、4、5、6、7つ、またはそれ以上のウイルス遺伝子座内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含む。好適なウイルス遺伝子座の例としては、ICP0(一方または両方のコピー)、ICP4(一方または両方のコピー)、ICP22、ICP27、ICP47、tk、UL41、及びUL55単純ヘルペスウイルス遺伝子座が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスICP4遺伝子座の一方または両方内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含む(例えば、ICP4遺伝子座の一方または両方内に第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス、ICP4遺伝子座の一方または両方内に第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス等)。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスICP22遺伝子座内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含む(例えば、ICP22遺伝子座に第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス、ICP22遺伝子座に第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス等)。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスUL41遺伝子座内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含む(例えば、UL41遺伝子座に第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス、UL41遺伝子座に第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス等)。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスICP4遺伝子座の一方または両方内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含み、ウイルスICP22遺伝子座の一方または両方内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含む(例えば、ICP4遺伝子座の一方または両方に第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド及びICP22遺伝子座に第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス、ICP4遺伝子座の一方または両方に第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド及びICP22遺伝子座に第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス等)。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスICP4遺伝子座の一方または両方内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含み、ウイルスUL41遺伝子座の一方または両方内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含む(例えば、ICP4遺伝子座の一方または両方に第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド及びUL41遺伝子座に第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス、ICP4遺伝子座の一方または両方に第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド及びUL41遺伝子座に第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス等)。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスICP4遺伝子座の一方または両方内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含み、ウイルスICP22遺伝子座内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含み、ウイルスUL41遺伝子座内に本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含む(例えば、ICP4遺伝子座の一方または両方に第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドならびにICP22遺伝子座及びUL41遺伝子座に第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス、ICP4遺伝子座の一方または両方に第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドならびにICP22遺伝子座及びUL41遺伝子座に第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドを保有する組換えウイルス等)。
いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノム(例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム)は、1つ以上の毒性単純ヘルペス遺伝子(HSV ICP0遺伝子の一方または両方のコピー、HSV ICP4遺伝子の一方または両方のコピー、ICP22遺伝子、及び/またはUL41遺伝子)の発現を低減または排除するように操作されている。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノム(例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム)は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノム(例えば、野生型単純ヘルペスウイルスゲノム)と比較して、組換えゲノムの細胞毒性を低減するように操作されている(例えば、標的細胞に導入された場合)。いくつかの実施形態では、組換えウイルスゲノム(例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム)の細胞毒性(例えば、ヒトケラチノサイト及び/または線維芽細胞における)は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%低減される(例えば、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞(初代細胞または細胞株)における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムに対する組換えΔICP4(一方または両方のコピー)単純ヘルペスウイルスゲノムの相対的細胞毒性の測定、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞(初代細胞または細胞株)における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムに対する組換えΔICP4(一方または両方のコピー)/ΔICP22単純ヘルペスウイルスゲノムの相対的細胞毒性の測定等)。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノム(例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム)の細胞毒性(例えば、ヒトケラチノサイト及び/または線維芽細胞における)は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約50倍、少なくとも約75倍、少なくとも約100倍、少なくとも約250倍、少なくとも約500倍、少なくとも約750倍、少なくとも約1000倍、またはそれ以上低減される(例えば、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞(初代細胞または細胞株)における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムに対する組換えΔICP4(一方または両方のコピー)単純ヘルペスウイルスゲノムの相対的細胞毒性の測定、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞(初代細胞または細胞株)における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムに対する組換えΔICP4(一方または両方のコピー)/ΔICP22単純ヘルペスウイルスゲノムの相対的細胞毒性の測定等)。例えば、生体色素(ホルマザン色素)、プロテアーゼバイオマーカー、MTTアッセイ(またはXTT、MTS、水溶性テトラゾリウム塩等の関連テトラゾリウム塩を使用するアッセイ)の使用、ATP含有量の測定等を含む、細胞毒性を測定する方法は、当業者に既知である。
いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノム(例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム)は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノム(例えば、野生型単純ヘルペスウイルスゲノム)と比較して、標的細胞の組換えゲノムへの曝露後の宿主細胞増殖に対するその影響を低減するように操作されている。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、表皮細胞及び/または真皮細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ケラチノサイト及び/または線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、組換えゲノムへの曝露後の宿主細胞増殖(例えば、ヒトケラチノサイト及び/または線維芽細胞)は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の宿主細胞増殖と比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%速い(例えば、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞(初代細胞または細胞株)における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の細胞増殖に対する組換えΔICP4(一方または両方のコピー)単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の相対的細胞増殖の測定、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞(初代細胞または細胞株)における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の細胞増殖に対する組換えΔICP4(一方または両方のコピー)/ΔICP22単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の相対的細胞増殖の測定等)。いくつかの実施形態では、組換えゲノムへの曝露後の宿主細胞増殖(例えば、ヒトケラチノサイト及び/または線維芽細胞)は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の宿主細胞増殖と比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約50倍、少なくとも約75倍、少なくとも約100倍、少なくとも約250倍、少なくとも約500倍、少なくとも約750倍、または少なくとも約1000倍速い(例えば、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞(初代細胞または細胞株)における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の細胞増殖に対する組換えΔICP4(一方または両方のコピー)単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の相対的細胞増殖の測定、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞(初代細胞または細胞株)における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の細胞増殖に対する組換えΔICP4(一方または両方のコピー)/ΔICP22単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の相対的細胞増殖の測定等)。例えば、Ki67細胞増殖アッセイ、BrdU細胞増殖アッセイ等の使用を含む、細胞増殖の測定方法は、当業者に既知である。
ベクター(例えば、ヘルペスウイルスベクター)は、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現に好適な形態で本開示の1つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。ベクターは、(例えば、上述のように)発現されるポリヌクレオチドに作動的に連結された1つ以上の調節配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸(例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム)は、任意の配向で組換え核酸に挿入された本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの1つ以上を含む。組換え核酸が本明細書に記載の2つ以上(例えば、2つ以上、3つ以上等)のポリヌクレオチドを含む場合、ポリヌクレオチドは、互いに同じ配向でまたは反対の配向で挿入され得る。理論に拘束されることを望むことなく、2つのポリヌクレオチド(例えば、2つの導入遺伝子)をアンチセンス配向で組換え核酸(例えば、ベクター)に組み込むことにより、リードスルーを回避し、各ポリヌクレオチドの適切な発現を確実にする助けとなり得る。
IV.ウイルス
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び/または組換え核酸のうちのいずれかを含むウイルスに関する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、対象(例えば、ヒト)の1つ以上の標的細胞に感染することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ポリヌクレオチド及び/または組換え核酸を対象(例えば、ヒト対象)の1つ以上の標的細胞に送達するのに好適である。いくつかの実施形態では、1つ以上の標的細胞は、1つ以上のヒト細胞である。いくつかの実施形態では、1つ以上の標的細胞は、皮膚の1つ以上の細胞(例えば、表皮、真皮、及び/または皮下の1つ以上の細胞)である。いくつかの実施形態では、1つ以上の細胞は、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、マスト細胞、線維芽細胞、及び/または脂肪細胞から選択される。いくつかの実施形態では、1つ以上の細胞は、ケラチノサイトである。いくつかの実施形態では、1つ以上の細胞は、角質層、顆粒層、有棘層、基底層、及び/または基底膜に存在する。いくつかの実施形態では、1つ以上の標的細胞は、1つ以上の表皮細胞である。
例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス)、ワクシニアウイルス、及び/またはそれらの任意のハイブリッドウイルスを含む、当該技術分野で既知の任意の好適なウイルスが使用され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、弱毒化されている。いくつかの実施形態では、ウイルスは、複製欠損である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、複製能を有する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、改変されていない野生型ウイルスの組織トロピズムに対してその組織トロピズムを変化させるように改変されている。いくつかの実施形態では、ウイルスは、対応する野生型ウイルスと比較して低減された細胞毒性を有する。組換え核酸を含むウイルスを産生するための方法は、当業者に周知である。
いくつかの実施形態では、ウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス6A、ヘルペスウイルス6B、ヘルペスウイルス7、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス等を含む、DNAウイルスのヘルペスウイルス科のメンバーである。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、弱毒化されている。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、複製欠損である。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、複製能を有する。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、対応する野生型ヘルペスウイルスと比較して低減された細胞毒性を有する。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、腫瘍溶解性ではない。
いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペスウイルスである。組換え核酸を含む単純ヘルペスウイルスは、例えば、WO2015/009952及び/またはWO2017/176336に開示されるプロセスによって産生され得る。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、弱毒化されている。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、複製能を有する。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、複製欠損である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)、またはそれらの任意の誘導体である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)である。いくつかの実施形態では、HSV−1は、弱毒化されている。いくつかの実施形態では、HSV−1は、対応する野生型HSV−1と比較して低減された細胞毒性を有する。いくつかの実施形態では、HSV−1は、腫瘍溶解性ではない。
いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、改変されていない野生型単純ヘルペスウイルスの組織トロピズムに対してその組織トロピズムを変化させるように改変されている。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、改変エンベロープを含む。いくつかの実施形態では、改変エンベロープは、1つ以上(例えば、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上等)の変異単純ヘルペスウイルス糖タンパク質を含む。単純ヘルペスウイルス糖タンパク質の例としては、糖タンパク質gB、gC、gD、gH、及びgLが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、改変エンベロープは、野生型単純ヘルペスウイルスに対して単純ヘルペスウイルス組織トロピズムを変化させる。
いくつかの実施形態では、1つ以上の標的細胞(例えば、1つ以上のヒトケラチノサイト及び/または線維芽細胞)に対する本開示のウイルス(例えば、ヘルペスウイルス)の形質導入効率(インビトロ及び/またはインビボ)は、少なくとも約25%である。例えば、1つ以上の標的細胞に対するウイルスの形質導入効率は、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、少なくとも約99.5%、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペスウイルスであり、1つ以上の標的細胞(例えば、1つ以上のヒトケラチノサイト及び/または線維芽細胞)に対するウイルスの形質導入効率は、約85%〜約100%である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペスウイルスであり、1つ以上の標的細胞(例えば、1つ以上のヒトケラチノサイト及び/または線維芽細胞)に対するウイルスの形質導入効率は、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%である。例えば、qPCR分析、ディープシーケンシング、ウエスタンブロッティング、蛍光定量分析(蛍光インサイツハイブリダイゼーション(FISH)、蛍光レポーター遺伝子発現、免疫蛍光、FACS等)等を含む、インビトロまたはインビボでウイルス形質導入効率を測定する方法は、当業者に周知である。
V.組成物及び配合物
本開示の特定の態様は、組換え核酸(例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム)及び/またはウイルス(例えば、本明細書に記載の組換えゲノムを含むヘルペスウイルス(組換え単純ヘルペスウイルスゲノムを含む単純ヘルペスウイルス等)のうちのいずれかと、賦形剤または担体(例えば、薬学的に許容される賦形剤または担体)とを含む組成物及び配合物(例えば、薬学的組成物及び配合物)に関する。いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、美容用組成物または配合物(例えば、スキンケア製品)である。
いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、本明細書に記載のウイルス(例えば、ヘルペスウイルス)のうちのいずれか1つ以上を含む。いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、約10〜約1012プラーク形成単位(PFU)/mLのウイルスを含む。例えば、組成物または配合物は、約10〜約1012、約10〜約1012、約10〜約1012、約10〜約1012、約10〜約1012、約10〜約1012、約1010〜約1012、約1011〜約1012、約10〜約1011、約10〜約1011、約10〜約1011、約10〜約1011、約10〜約1011、約10〜約1011、約1010〜約1011、約10〜約1010、約10〜約1010、約10〜約1010、約10〜約1010、約10〜約1010、約10〜約1010、約10〜約10、約10〜約10、約10〜約10、約10〜約10、約10〜約10、約10〜約10、約10〜約10、約10〜約108、約10〜約10、約10〜約10、約10〜約10、約10〜約10、約10〜約10、約10〜約10、または約10〜約10PFU/mLのウイルスを含む。いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、約10、約10、約10、約10、約10、約10、約1010、約1011、または約1012PFU/mLのウイルスを含む。
本明細書に記載の組成物及び配合物(例えば、薬学的組成物及び配合物)は、所望の純度を有する活性成分(複数可)(組換え核酸またはウイルス等)を1つ以上の許容される担体または賦形剤と混合することによって調製され得る。許容される担体または賦形剤(例えば、薬学的に許容される担体または賦形剤)は、一般に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、これらには、緩衝液(リン酸、クエン酸、酢酸、及び他の有機酸等)、抗酸化剤(アスコルビン酸及びメチオニン等)、防腐剤(オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3−ペンタノール、及びm−クレゾール等)、アミノ酸(グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等)、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、タンパク質(血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等)、ポリオール(グリセロール等、例えば10%グリセロールを含む配合物)、親水性ポリマー(ポリビニルピロリドン等)、単糖、二糖、及び他の炭水化物(グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む)、キレート剤(EDTA等)、糖(スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等)、塩形成対イオン(ナトリウム等)、金属錯体(Zn−タンパク質錯体等)、リポソーム(例えば、カチオン性脂質)、ナノ粒子担体、及び/または非イオン性界面活性剤(ポリエチレングリコール(PEG)等)が含まれ得るが、これらに限定されない。担体の詳細な考察は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)で見つけることができる。
いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、1つ以上の脂質(例えば、カチオン性脂質)担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、1つ以上のナノ粒子担体を含む。ナノ粒子は、カプセル化薬物(迅速放出または制御放出のための合成小分子、タンパク質、ペプチド、細胞、ウイルス、及び核酸ベースの生物学的治療薬等)を運ぶことができるサブミクロン(約1000nm未満)のサイズの薬物送達ビヒクルである。様々な分子(例えば、タンパク質、ペプチド、組換え核酸等)は、当該技術分野で周知のプロセスを使用して、ナノ粒子中に効率的にカプセル化され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子中に「カプセル化」された分子とは、ナノ粒子中に含有されているか、ナノ粒子の表面に付着している及び/またはそれと会合しているか、またはそれらの任意の組み合わせである分子(ウイルス等)を指し得る。本明細書に記載の組成物または配合物に使用するためのナノ粒子は、例えば、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、PLGA、PLA、PGA、及びそれらの任意の組み合わせを含むナノ粒子を含む、当該技術分野で既知の任意のタイプの生体適合性ナノ粒子であり得る(例えば、Vauthier et al.Adv Drug Del Rev.(2003)55:519−48、US2007/0148074、US2007/0092575、US2006/0246139、US5753234、US7081483、及びWO2006/052285を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、担体または賦形剤(例えば、薬学的に許容される担体または賦形剤)は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚、鼻腔内、気管内、舌下、頬、局所、経口、経皮、皮内、腹腔内、眼窩内、硝子体内、網膜下、経粘膜、関節内、表面注射による、埋め込みによる、吸入による、髄腔内、脳室内、及び/または鼻腔内投与を含む、当該技術分野で既知の任意の投与経路に適合され得るか、またはそれに好適であり得る。いくつかの実施形態では、担体または賦形剤(例えば、薬学的に許容される担体または賦形剤)は、局所、経皮、皮下、及び/または皮内投与に適合され得るか、またはそれに好適であり得る。いくつかの実施形態では、担体または賦形剤は、局所、経皮、及び/または皮内投与に適合され得るか、またはそれに好適であり得る。いくつかの実施形態では、担体または賦形剤は、表面注射に適合され得るか、またはそれに好適であり得る。
局所、経皮、皮下、表面、及び/または皮内適用/投与での使用に適合されたまたはそれに好適な担体または賦形剤の例としては、軟膏、油、ペースト、クリーム、エアロゾル、懸濁液、乳剤、脂肪性軟膏、ゲル、粉末、液体、ローション、溶液、スプレー、パッチ(例えば、経皮パッチまたはマイクロニードルパッチ)、接着ストリップ、マイクロニードルまたはマイクロニードルアレイ、及び吸入剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、担体または賦形剤(例えば、薬学的に許容される担体または賦形剤)は、軟膏、油、ペースト、クリーム、エアロゾル、懸濁液、乳剤、脂肪性軟膏、ゲル、粉末、液体ローション、溶液、スプレー、接着ストリップ、及び吸入剤のうちの1つ以上(例えば、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上等)を含む。いくつかの実施形態では、担体は、経皮パッチまたはマイクロニードルパッチ等のパッチ(例えば、皮膚に付着するパッチ)を含む。いくつかの実施形態では、担体は、マイクロニードルまたはマイクロニードルアレイを含む。組成物の送達に好適なマイクロニードルアレイを作製及び使用する方法は、当該技術分野で一般に既知である(Kim Y.et al.“Microneedles for drug and vaccine delivery”.Advanced Drug Delivery Reviews 2012,64(14):1547−68)。
いくつかの実施形態では、組成物または配合物(例えば、薬学的組成物または配合物)は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚、経口、鼻腔内、気管内、舌下、口腔内、局所、経皮、皮内、腹腔内、眼窩内、硝子体内、網膜下、経粘膜、関節内、表面注射による、埋め込みによる、吸入による、髄腔内、脳室内、及び/または鼻腔内投与を含む、当該技術分野で既知の任意の投与経路に適合されるか、またはそれに好適である。いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、皮膚、局所、経皮、皮下、及び/または皮内投与に適合されるか、またはそれに好適である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または配合物は、局所、経皮、及び/または皮内投与に適合されるか、またはそれに好適である。いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、皮内投与に適合されるか、またはそれに好適である。いくつかの実施形態では、配合物の組成物は、表面注射に適合されるか、またはそれに好適である。
いくつかの実施形態では、組成物または配合物(例えば、薬学的組成物または配合物)は、1つ以上の追加の成分をさらに含む。追加の成分の例としては、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等)、充填剤(例えば、ラクトース及び他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸、またはリン酸水素ナトリウム等)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等)、崩壊剤(例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等)、湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等)、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトーゼ、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、甘味料、香味料、香料、着色剤、保湿剤、日焼け防止剤、抗菌剤、ポリヌクレオチドを安定化させるか、またはそれらの分解を阻止することができる薬剤等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースゲルを含む。いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、リン酸緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、グリセロール(例えば、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約15%等)を含む。
インビボ投与のために使用される組成物及び配合物(例えば、薬学的組成物及び配合物)は、一般に、無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって、容易に達成され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または組成物もしくは配合物のいずれも、コラーゲンタンパク質(例えば、コラーゲン3等のヒトコラーゲンタンパク質)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを対象の1つ以上の細胞(例えば、1つ以上のコラーゲン欠損細胞)に送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または組成物もしくは配合物のいずれも、療法に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または組成物もしくは配合物のいずれも、コラーゲンポリペプチドの発現から利益を受けるであろう美容的または審美的状態(例えば、コラーゲン欠損に関連する美容的または審美的状態(例えば、老化及び/または紫外線損傷皮膚))の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または組成物もしくは配合物のいずれも、(例えば、以下に記載される)皮膚科学的老化の治療に使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または組成物もしくは配合物のいずれも、薬剤の調製または製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または組成物もしくは配合物のいずれも、コラーゲンタンパク質(例えば、コラーゲン3等のヒトコラーゲンタンパク質)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを対象の1つ以上の細胞(例えば、1つ以上のコラーゲン欠損細胞)に送達するのに有用な薬剤の調製または製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または組成物もしくは配合物のいずれも、コラーゲンポリペプチドの発現から利益を受けるであろう美容的または審美的状態(例えば、コラーゲン欠損に関連する美容的または審美的状態(例えば、老化及び/または紫外線損傷皮膚))の治療に有用な薬剤の調製または製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または組成物もしくは配合物のいずれも、(例えば、以下に記載される)皮膚科学的老化の治療に有用な薬剤の調製または製造に使用され得る。
VI.方法
本開示のある特定の態様は、対象(例えば、対象の1つ以上の細胞)における1つ以上の皮膚細胞外マトリックスタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物のうちのいずれかを投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
本開示の他の態様は、対象における皮膚細胞外マトリックスの構造及び/または組織を安定させるまたは改善する方法であって、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物のうちのいずれかを投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
本開示の他の態様は、対象(例えば、対象の1つ以上の細胞)における1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物のうちのいずれかを投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
いくつかの実施形態では、対象への組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物の投与は、対象の1つ以上の対応する未処理細胞(例えば、処理前の1つ以上の細胞、処理中の1つ以上の非感染細胞等)におけるコラーゲン(複数可)の内因性レベルと比較して、対象の1つ以上の細胞におけるコラーゲン(例えば、COL1−1、COL1−2、COL3、COL1−1及びCOL1−2、COL1−1、及びCOL3等)レベル(転写物またはタンパク質レベル)を少なくとも約10%増加させる。例えば、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物の投与は、対象の1つ以上の対応する未処理細胞におけるコラーゲン(複数可)の内因性レベルと比較して、対象の1つ以上の細胞におけるコラーゲンレベル(転写物またはタンパク質レベル)を少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、またはそれ以上増加させ得る。いくつかの実施形態では、対象への組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物の投与は、対象の1つ以上の対応する未処理細胞(例えば、処理前の1つ以上の細胞、処理中の1つ以上の非感染細胞等)におけるコラーゲン(複数可)の内因性レベルと比較して、対象の1つ以上の細胞におけるコラーゲンレベル(転写物またはタンパク質レベル)を少なくとも約2倍増加させる。例えば、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物の投与は、対象の1つ以上の対応する未処理細胞におけるコラーゲン(複数可)の内因性レベルと比較して、対象の1つ以上の細胞におけるコラーゲンレベル(転写物またはタンパク質レベル)を少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約50倍、少なくとも約75倍、少なくとも約100倍、少なくとも約250倍、少なくとも約500倍、少なくとも約750倍、少なくとも約1000倍、またはそれ以上増加させ得る。例えば、qPCR、RNAseq、ELISA、ウエスタンブロット、質量分析等を含む、試料由来の転写物またはタンパク質レベルを測定する方法は、当業者に周知である。
本開示の他の態様は、対象の軟組織を強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物のうちのいずれかを投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、対象の軟組織に注射される。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、老化している皮膚である。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、紫外線(例えば、太陽、タンニングベッド等由来)への曝露により損傷している。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、しわになっている。
いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬物、及び/または組成物は、対象の軟組織を修復及び/または増強する方法に使用され得る。いくつかの実施形態では、「組織修復」とは、組織アーキテクチャ及び/または機能の復元を指し、組織再生及び置換を包含する。いくつかの実施形態では、軟組織の修復または増強とは、(例えば、外観が経時的な老化、または他の物理的、化学的、もしくは紫外線損傷に起因する欠陥による「老化」した皮膚と比較して)皮膚の若々しい外観を復元するために使用される手順を指す。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、例えば、しわ、線、折り目、瘢痕を満たし、真皮組織を強化する(例えば、薄い唇をふっくらとさせる、窪んだ目及び/またはこけた頬を満たす等)ための美容的軟組織用途に有用である。
本開示の他の態様は、皮膚の質、状態、及び/または外観の改善を必要とする対象における皮膚の質、状態、及び/または外観を改善する方法であって、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物のうちのいずれかを投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、皮膚の状態は、日光による損傷、老化、紫外線曝露、粗いきめ、皮膚のたるみ、及び/またはしわのうちの1つ以上である。皮膚の質、状態、及び/または外観の改善(例えば、処理前と比較した)は、例えば、FACE Q、GAIS等を含む、当該技術分野で既知の任意の適切な方法またはスケールを使用して評価され得る。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、老化している皮膚である。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、紫外線(例えば、太陽、タンニングベッド等由来)への曝露により損傷している。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、しわになっている。
本開示の他の態様は、皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観の減少を必要とする対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観を減少させる方法であって、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物のうちのいずれかを投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物の投与は、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間、少なくとも約9ヶ月間、または少なくとも約12ヶ月間にわたって、対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観を減少させる。いくつかの実施形態では、対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観は、組成物の投与前の対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観と比較して、組成物の投与後に減少する。いくつかの実施形態では、皮膚における1つ以上の表面陥凹は、細かい線及びしわ(例えば、額のしわ、「目尻のしわ」、目または口の縁のしわ等)のうちの1つ以上である。いくつかの実施形態では、1つ以上の表皮陥凹の治療は、未治療皮膚と比較した、滑らかさ、水分補給、及び弾性等の皮膚のきめまたは質の改善によって測定される。いくつかの実施形態では、1つ以上の表皮陥凹の治療は、表皮陥凹の重症度(例えば、深さ)の減少及び/または皮膚の所与の領域における細かい線もしくはしわの数の減少によって測定される。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、老化している皮膚である。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、紫外線(例えば、太陽、タンニングベッド等由来)への曝露により損傷している。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、しわになっている。
本開示の他の態様は、対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、及び/または張りのうちの少なくとも1つを増加させる及び/または改善する方法であって、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物のうちのいずれかを投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、組成物の投与後少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間、少なくとも約9ヶ月間、または少なくとも約12ヶ月間にわたって、増加した及び/または改善されたきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つを維持する。いくつかの実施形態では、対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つが、組成物の投与前の対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りと比較して、組成物の投与後に増加する及び/または改善される。皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、及び/または張りを測定する方法は、当業者者に既知である。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、老化している皮膚である。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、紫外線(例えば、太陽、タンニングベッド等由来)への曝露により損傷している。いくつかの実施形態では、対象の皮膚は、しわになっている。
本開示の他の態様は、1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減を必要とする対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候を軽減する方法であって、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減には、細かい線及び/またはしわの治療、減少、及び/または予防;皮膚の毛穴径の減少;皮膚の厚み、ふっくら感、及び/または張り感の改善;皮膚の滑らかさ、しなやかさ、及び/または柔らかさの改善;皮膚の色調、輝き、及び/または透明度の改善;プロコラーゲン及び/またはコラーゲン産生の改善;皮膚のきめの改善及び/または再度きめを整えることの促進;皮膚輪郭の外観の改善;皮膚のつや及び/または明るさの復元;老化及び/または閉経により減退した皮膚外観の改善;皮膚保湿の改善;皮膚の弾性及び/または弾力性の増加;治療、軽減、及び/または予防もしくは皮膚のたるみ;皮膚の締まりの改善;色素斑、斑のある皮膚、及び/または瘢痕(座瘡瘢痕等)の減少;及び/または光回折または反射による皮膚の光学的特性の改善のうちのいずれか1つ以上が含まれる。いくつかの実施形態では、対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候は、組成物の投与前の対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候と比較して、組成物の投与後に軽減される。当該技術分野で既知の皮膚科学的老化の1つ以上の兆候を測定するための任意の好適な方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、対象の皮膚の1つ以上の部分は、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物のうちのいずれかの有効量での治療前に擦過されるか、またはより透過性にされる。例えば、皮膚ローラーの使用、皮膚細胞層を除去するための接着ストリップの繰り返しの使用(テープ剥離)、メスまたはブレードでの掻爬、サンドペーパーの使用、化学的透過促進剤または電気エネルギーの使用、音波エネルギーまたは超音波エネルギーの使用、光(例えば、レーザー)エネルギーの使用、表皮を完全に貫通しないが、表皮を突き刺すのに好適な長さを有するミクロンサイズの針またはブレードの使用等を含む、皮膚を擦過するか、または皮膚の透過性を増加させる任意の好適な方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、皮膚における1つ以上の表面陥凹を減少させるまたは除去する、1つ以上のしわを減少させるまたは除去する、及び/または1つ以上のしわの発生または再発を予防する等の美容的用途のためのものである。いくつかの実施形態では、皮膚における1つ以上の表面陥凹またはしわは、鼻唇溝、目尻のしわ、眉間しわ線、額のしわ、瘢痕、眉間のしわ、眉毛下垂、眼頬溝、鼻頬線、バニーライン、頬/顔面中央下垂、マリオネットライン、ポピーえくぼ形成、笑線、笑いじわ、顎のひだ、首のしわ、広頸筋帯、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、「有効量」とは、特定の状態(例えば、皮膚老化等の美容状態)の1つ以上の兆候または症状の測定可能な改善または予防に影響を及ぼすのに必要とされる少なくとも最小量である。「有効量」は、患者の年齢、性別、及び体重等の要因に応じて変化し得る。有効量は、有益な効果が治療の任意の毒性作用または有害作用を上回る量である。有効量は、1回以上の投与で投与され得る。本開示の目的のために、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物の有効量は、直接または間接的のいずれかで測定可能な改善を達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されるように、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または組成物と併せて達成される場合も達成されない場合もある。したがって、「有効量」は、1つ以上の薬剤を投与する状況において考慮され得、1つ以上の他の薬剤と併せて望ましい結果が達成され得るか、または達成された場合、単一の薬剤が有効量で与えられたとみなされ得る。
いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、対象に1回投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、対象に少なくとも2回(例えば、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも10回等)投与される。いくつかの実施形態では、投与間(例えば、第1の投与と第2の投与との間、第2の投与と第3の投与との間等)で、少なくとも約15日(例えば、少なくとも約15日、少なくとも約20日、少なくとも約30日、少なくとも約40日、少なくとも約50日、少なくとも約60日、少なくとも約70日、少なくとも約80日、少なくとも約90日、少なくとも約100日、少なくとも約120日等)が経過している。
本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬物、及び/または組成物もしくは配合物は、経口投与、舌下投与、口腔投与、局所投与、直腸投与、吸入による投与、経皮投与、皮下注射、皮内注射、表面注射、静脈内(IV)注射、動脈内注射、筋肉内注射、心臓内注射、骨内注射、腹腔内注射、経粘膜投与、膣内投与、尿道内投与、硝子体内投与、眼窩内投与、網膜下投与、関節内投与、関節周囲投与、局部投与、皮膚上投与、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の好適な方法または経路によって投与され得る。したがって、本開示は、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物のうちのいずれかを個体に送達する方法を包含する。
いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物は、対象に、皮膚、局所、経皮、皮下、または皮内投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物は、皮内及び/または皮下投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物は、表面注射を介して投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物は、局所及び/または経皮投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物は、1日1回、2回、3回、4回、5回、またはそれ以上投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬物、及び/または組成物もしくは配合物は、個体の1つ以上の罹患(例えば、皺になった)領域に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、個体の1つ以上の罹患していない領域に投与される。
いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、皮膚にある表面深さで投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、約2000ミクロン以下の深さで皮膚に導入される。例えば、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、約2000ミクロン以下、約1750ミクロン以下、約1500ミクロン以下、約1250ミクロン以下、約1000ミクロン以下、約900ミクロン以下、約800ミクロン以下、約700ミクロン以下、約600ミクロン以下、または約500ミクロン以下の深さで皮膚に投与され得る。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、約0.5mm〜5.0mmの注射深さで導入される。例えば、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、約0.5mm〜5.0mm、約0.5mm〜4.5mm、約0.5mm〜4.0mm、約0.5mm〜3.5mm、約0.5mm〜3.0mm、約0.5mm〜2.5mm、約0.5mm〜2.0mm、約0.5mm〜1.5mm、約0.5mm〜1.0mm、1.0mm〜5.0mm、約1.0mm〜4.5mm、約1.0mm〜4.0mm、約1.0mm〜3.5mm、約1.0mm〜3.0mm、約1.0mm〜2.5mm、約1.0mm〜2.0mm、約1.0mm〜1.5mm、1.5mm〜5.0mm、約1.5mm〜4.5mm、約1.5mm〜4.0mm、約1.5mm〜3.5mm、約1.5mm〜3.0mm、約1.5mm〜2.5mm、約1.5mm〜2.0mm等の注射深さで導入され得る。
いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、約1mm〜約30mmの距離で離間された注射によって投与される。例えば、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、約1mm〜30mm、2mm〜30mm、5mm〜30mm、10mm〜30mm、15mm〜30mm、1mm〜20mm、2mm〜20mm、5mm〜20mm、10mm〜20mm、15mm〜20mm、1mm〜15mm、2mm〜15mm、5mm〜15mm、10mm〜15mm、1mm〜10mm、2mm〜10mm、5mm〜10mm、1mm〜5mm、2mm〜5mm等の距離で離間された注射によって投与され得る。いくつかの実施形態では、注射は、少なくとも約1mm、少なくとも約2mm、少なくとも約5mm、少なくとも約10mm、少なくとも約15mm、少なくとも約20mm、少なくとも約30mm、またはそれ以上の距離で離間される。
例えば、顔、額、唇、頭皮、首、腕、手、脚、膝、足、胸、背中、鼠径部、臀部、大腿等を含む、身体の多数の領域が、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物で治療され得る。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、顔に投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、1つ以上の鼻唇溝に投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、片目または両目の周囲に投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬物、及び/または組成物は、1つ以上の目尻のしわに投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、1つ以上の眉間しわ線に投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、1つ以上の瘢痕(例えば、座瘡瘢痕)に投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、1つ以上の眉間のしわに投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、1つ以上の眉毛下垂に投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、1つ以上の深い眼頬溝に投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬物、及び/または組成物は、1つ以上の鼻頬線に投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬物、及び/または組成物は、1つ以上のバニーラインに投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬物、及び/または組成物は、1つ以上の頬/顔面中央下垂に投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、1つ以上のマリオネットラインに投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、1つのまたはポピーえくぼ形成部位に投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、1つ以上の顎のひだに投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物は、1つ以上の首のしわに投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬物、及び/または組成物は、1つ以上の広頸筋帯に投与される。
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、組換え核酸が対象の1つ以上の標的細胞に送達されると、美容用タンパク質(複数可)(例えば、ヒトコラーゲン)を発現する。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(複数可)(例えば、ヒトコラーゲン)の発現は、1つ以上の標的細胞におけるヒトコラーゲンレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(複数可)(例えば、ヒトコラーゲン)の発現は、1つ以上の標的細胞によって分泌されるヒトコラーゲンレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(複数可)(例えば、ヒトコラーゲン)の発現は、細胞外マトリックス中のヒトコラーゲンレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(複数可)(例えば、ヒトコラーゲン)の発現は、対象における細胞外マトリックスの安定性を強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(複数可)(例えば、ヒトコラーゲン)の発現は、対象の軟組織を強化する、増強する、及び/または補充する。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(複数可)(例えば、ヒトコラーゲン)の発現は、個体の皮膚の質、状態、及び/または外観を改善する。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(複数可)(例えば、ヒトコラーゲン)の発現は、対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹(例えば、しわ)を減少させる。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(複数可)(例えば、ヒトコラーゲン)の発現は、対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、及び/または張りを改善する。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質(複数可)(例えば、ヒトコラーゲン)の発現は、対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候を軽減する。
VII.宿主細胞
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載の組換え核酸のうちのいずれかを含む1つ以上の宿主細胞に関する。例えば、真正細菌を含む原核細胞、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、エシェリキア属(Escherichia)(例えば、大腸菌(E.coli))、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルミニア属(Erminia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ属(Salmonella)(例えば、S.チフィリウム(S.typhimurium))、セラシア属(Serratia)(例えば、S.マルセセンス(S.marcescans))、及びシゲラ属(Shigella)等の腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、ならびにB.サブティリス(B.subtilis)及びB.リケニフォルミス(B.licheniformis)等の桿菌、真菌細胞(例えば、S.セレビシエ(S.cerevisiae))、昆虫細胞(例えば、S2細胞等)、及び哺乳類細胞(例えば、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS−7、ATCC CRL 1651)、ヒト胚腎臓株(懸濁培養液中での増殖のためにサブクローニングされた293または293細胞)、ベビーハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL 10)、マウスセルトリ細胞(TM4)、サル腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)、アフリカミドリザル腎細胞(VERO−76、ATCC CRL−1587)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2)、イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL 34)、バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)、ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)、ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065)、マウス乳房腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI細胞、MRC5細胞、FS4細胞、ヒトヘパトーマ(Hep G2)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えば、DHFR”CHO細胞)、ならびにNS0及びSp2/0等の骨髄腫細胞株)を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な宿主細胞(原核細胞または真核細胞)が使用され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Vero細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、補完宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞(例えば、Vero細胞)は、1つ以上の単純ヘルペスウイルス遺伝子(例えば、ICP4遺伝子)を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞株由来の細胞である。好適な宿主細胞または細胞株の例としては、293、HeLa、SH−Sy5y、Hep G2、CACO−2、A549、L929、3T3、K562、CHO−K1、MDCK、HUVEC、Vero、N20、COS−7、PSN1、VCaP、CHO細胞等が挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、単純ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、単純ヘルペスウイルスアンプリコンである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、HSV−1アンプリコンまたはHSV−1ハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスを含む宿主細胞は、本明細書に記載のHSV−1アンプリコンまたはHSV−1ハイブリッドアンプリコンと接触し、本明細書に記載の1つ以上の組換え核酸を含むウイルスの産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ウイルスは、接触した宿主細胞の上清から収集される。ヘルパーウイルスを含む宿主細胞をHSV−1アンプリコンまたはHSV−1/ハイブリッドアンプリコンと接触させることによってウイルスを作製する方法は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、補完宿主細胞である。いくつかの実施形態では、補完宿主細胞は、本明細書に記載のウイルスベクターのうちのいずれかにおいて不活性化される1つ以上の遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、補完宿主細胞は、本明細書に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム(例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム)と接触させられる。いくつかの実施形態では、補完宿主細胞を組換えヘルペスウイルスゲノムと接触させることにより、本明細書に記載の1つ以上の組換え核酸を含むヘルペスウイルスの産生がもたらされる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、接触した宿主細胞の上清から収集される。補完宿主細胞を組換え単純ヘルペスウイルスと接触させることによってウイルスを作製する方法は、概して、WO2015/009952及び/またはWO2017/176336に記載されている。
VIII.製品またはキット
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物(例えば、薬学的組成物もしくは配合物)のうちのいずれかを含む製品またはキットに関する。いくつかの実施形態では、製品またはキットは、(例えば、皮膚細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン)欠乏症を治療するための及び/または1つ以上の皮膚科学的老化兆候を矯正するための)組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物の投与に関する指示を含む添付文書を含む。
組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物に好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、チューブ、及びシリンジが挙げられ得る。容器は、ガラス、プラスチック(ポリ塩化ビニルもしくはポリオレフィン等)、または金属合金(ステンレス鋼もしくはハステロイ等)等の様々な材料から形成され得る。いくつかの実施形態では、容器は、容器上にラベルを含むか、または容器に関連するラベルを含み、ラベルは、使用に関する指示を示す。製品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、添付文書等を含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
IX.列挙される実施形態
実施形態1:
(a)組換え核酸を含む単純ヘルペスウイルス(HSV)であって、前記組換え核酸が、第1のヒトコラーゲンタンパク質を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む、前記HSVと、
(b)賦形剤と
を含む、組成物。
実施形態2:前記組換え核酸が、前記第1のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む、実施形態1の組成物。
実施形態3:前記HSVが複製欠損である、実施形態1または2の組成物。
実施形態4:前記HSVが複製能を有する、実施形態1または2の組成物。
実施形態5:前記HSVが、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、またはそれらの任意の誘導体である、実施形態1〜4のいずれか1つの組成物。
実施形態6:前記組換え核酸が、単純ヘルペスウイルスアンプリコンである、実施形態1〜5のいずれか1つの組成物。
実施形態7:前記単純ヘルペスウイルスアンプリコンが、HSV−1アンプリコンまたはHSV−1ハイブリッドアンプリコンである、実施形態6の組成物。
実施形態8:前記HSV−1ハイブリッドアンプリコンが、HSV/AAVハイブリッドアンプリコン、HSV/EBVハイブリッドアンプリコン、及びHSV/EBV/RVハイブリッドアンプリコン、またはHSV/スリーピングビューティーハイブリッドアンプリコンである、実施形態7の組成物。
実施形態9:前記組換え核酸が、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである、実施形態1〜5のいずれか1つの組成物。
実施形態10:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、組換えHSV−1ゲノム、組換えHSV−2ゲノム、またはそれらの任意の誘導体である、実施形態9の組成物。
実施形態11:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態9または10の組成物。
実施形態12:前記単純ヘルペスウイルス遺伝子が、感染細胞タンパク質(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、チミジンキナーゼ(tk)、ロングユニーク領域(UL)41、及びUL55からなる群から選択される、実施形態11の組成物。
実施形態13:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む、実施形態12の組成物。
実施形態14:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態12または13の組成物。
実施形態15:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、UL41遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態12〜14のいずれか1つの組成物。
実施形態16:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP0遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態12〜15のいずれか1つの組成物。
実施形態17:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP27遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態12〜16のいずれか1つの組成物。
実施形態18:前記不活性化変異が、前記遺伝子(複数可)のコード配列の欠失である、実施形態11〜17のいずれか1つの組成物。
実施形態19:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ウイルス遺伝子座内に第1のポリヌクレオチドを含む、実施形態9〜18のいずれか1つの組成物。
実施形態20:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に前記第1のポリヌクレオチドを含む、実施形態9〜19のいずれか1つの組成物。
実施形態21:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP22ウイルス遺伝子座内に第1のポリヌクレオチドを含む、実施形態9〜20のいずれか1つの組成物。
実施形態22:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、UL41ウイルス遺伝子座内に第1のポリヌクレオチドを含む、実施形態9〜21のいずれか1つの組成物。
実施形態23:前記HSVが、野生型単純ヘルペスウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する、実施形態1〜22のいずれか1つの組成物。
実施形態24:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質が、コラーゲンアルファ−1(I)鎖ポリペプチド(COL1−1)、コラーゲンアルファ−2(I)鎖ポリペプチド(COL1−2)、コラーゲンアルファ−1(II)鎖ポリペプチド(COL2)、コラーゲンアルファ−1(III)鎖ポリペプチド(COL3)、コラーゲンアルファ−1(IV)鎖ポリペプチド(COL4−1)、コラーゲンアルファ−2(IV)鎖ポリペプチド(COL4−2)、コラーゲンアルファ−3(IV)鎖ポリペプチド(COL4−3)、コラーゲンアルファ−4(IV)鎖ポリペプチド(COL4−4)、コラーゲンアルファ−5(IV)鎖ポリペプチド(COL4−5)、コラーゲンアルファ−6(IV)鎖ポリペプチド(COL4−6)、コラーゲンアルファ−1(V)鎖ポリペプチド(COL5−1)、コラーゲンアルファ−2(V)鎖ポリペプチド(COL5−2)、コラーゲンアルファ−3(V)鎖ポリペプチド(COL5−3)、コラーゲンアルファ−1(VI)鎖ポリペプチド(COL6−1)、コラーゲンアルファ−2(VI)鎖ポリペプチド(COL6−2)、コラーゲンアルファ−3(VI)鎖ポリペプチド(COL6−3)、コラーゲンアルファ−4(VI)鎖ポリペプチド(COL6−4)、コラーゲンアルファ−5(VI)鎖ポリペプチド(COL6−5)、コラーゲンアルファ−6(VI)鎖ポリペプチド(COL6−6)、コラーゲンアルファ−1(VII)鎖ポリペプチド(COL7)、コラーゲンアルファ−1(VIII)鎖ポリペプチド(COL8)、コラーゲンアルファ−1(IX)鎖ポリペプチド(COL9−1)、コラーゲンアルファ−2(IX)鎖ポリペプチド(COL9−2)、コラーゲンアルファ−3(IX)鎖ポリペプチド(COL9−3)、コラーゲンアルファ−1(X)鎖ポリペプチド(COL10)、コラーゲンアルファ−1(XI)鎖ポリペプチド(COL11−1)、コラーゲンアルファ−2(XI)鎖ポリペプチド(COL11−2)、コラーゲンアルファ−1(XII)鎖ポリペプチド(COL12)、コラーゲンアルファ−1(XIII)鎖ポリペプチド(COL13)、コラーゲンアルファ−1(XIV)鎖ポリペプチド(COL14)、コラーゲンアルファ−1(XV)鎖ポリペプチド(COL15)、コラーゲンアルファ−1(XVI)鎖ポリペプチド(COL16)、コラーゲンアルファ−1(XVII)鎖ポリペプチド(COL17)、コラーゲンアルファ−1(XVIII)鎖ポリペプチド(COL18)、コラーゲンアルファ−1(XIX)鎖ポリペプチド(COL19)、コラーゲンアルファ−1(XX)鎖ポリペプチド(COL20)、コラーゲンアルファ−1(XXI)鎖ポリペプチド(COL21)、コラーゲンアルファ−1(XXII)鎖ポリペプチド(COL22)、コラーゲンアルファ−1(XXIII)鎖ポリペプチド(COL23)、コラーゲンアルファ−1(XXIV)鎖ポリペプチド(COL24)、コラーゲンアルファ−1(XXV)鎖ポリペプチド(COL25)、コラーゲンアルファ−1(XXVI)鎖ポリペプチド(COL26)、コラーゲンアルファ−1(XXVII)鎖ポリペプチド(COL27)、及びコラーゲンアルファ−1(XXVIII)鎖ポリペプチド(COL28)からなる群から選択される、実施形態1〜23のいずれか1つの組成物。
実施形態25:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17からなる群から選択される、実施形態1〜24のいずれか1つの組成物。
実施形態26:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号1〜14からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、実施形態1〜25のいずれか1つの組成物。
実施形態27:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質が、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態1〜26のいずれか1つの組成物。
実施形態28:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質がCOL7ではない、実施形態1〜27のいずれか1つの組成物。
実施形態29:前記第1のポリペプチドが、
(a)前記第1のヒトコラーゲンタンパク質、
(b)さらなるヒトコラーゲンタンパク質、及び
(c)(a)を(b)に連結するリンカーポリペプチド
を含む、実施形態1〜28のいずれか1つの組成物。
実施形態30:前記リンカーポリペプチドが切断可能なリンカーポリペプチドである、実施形態29の組成物。
実施形態31:前記リンカーポリペプチドが、配列番号28〜31からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態29または30の組成物。
実施形態32:前記さらなるヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28からなる群から選択される、実施形態29〜31のいずれか1つの組成物。
実施形態33:前記さらなるヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17からなる群から選択される、実施形態29〜32のいずれか1つの組成物。
実施形態34:前記さらなるヒトコラーゲンタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号1〜14からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、実施形態29〜33のいずれか1つの組成物。
実施形態35:前記さらなるヒトコラーゲンタンパク質が、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態29〜34のいずれか1つの組成物。
実施形態36:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質と前記さらなるヒトコラーゲンタンパク質が異なる、実施形態29〜35のいずれか1つの組成物。
実施形態37:前記第1のポリヌクレオチドが、
(a)前記第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、
(b)追加のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のORF、及び
(c)(a)と(b)を分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)
を含むポリシストロニックmRNAをコードする、実施形態1〜36のいずれか1つの組成物。
実施形態38:前記IRESをコードする前記核酸配列が、配列番号22または配列番号23から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、実施形態37の組成物。
実施形態39:前記追加のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28からなる群から選択される、実施形態37または38の組成物。
実施形態40:前記追加のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17からなる群から選択される、実施形態37〜39のいずれか1つの組成物。
実施形態41:前記追加のヒトコラーゲンタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号1〜14からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、実施形態37〜40のいずれか1つの組成物。
実施形態42:前記追加のヒトコラーゲンタンパク質が、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態37〜41のいずれか1つの組成物。
実施形態43:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質と前記追加のヒトコラーゲンタンパク質が異なる、実施形態37〜42のいずれか1つの組成物。
実施形態44:前記組換え核酸が、第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態1〜43のいずれか1つの組成物。
実施形態45:前記組換え核酸が、前記第2のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む、実施形態44の組成物。
実施形態46:前記第2のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28からなる群から選択される、実施形態44または45の組成物。
実施形態47:前記第2のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17からなる群から選択される、実施形態44〜46のいずれか1つの組成物。
実施形態48:前記第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号1〜14からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、実施形態44〜48のいずれか1つの組成物。
実施形態49:前記第2のヒトコラーゲンタンパク質が、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態44〜48のいずれか1つの組成物。
実施形態50:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質と前記第2のヒトコラーゲンタンパク質が異なる、実施形態44〜49のいずれか1つの組成物。
実施形態51:前記組換え核酸が組換え単純ヘルペスウイルスゲノムであり、前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ウイルス遺伝子座内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態44〜50のいずれか1つの組成物。
実施形態52:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態51の組成物。
実施形態53:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP22ウイルス遺伝子座内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態51または52の組成物。
実施形態54:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、UL41ウイルス遺伝子座内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態51〜53のいずれか1つの組成物。
実施形態55:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に前記第1のポリヌクレオチドを含み、ICP22ウイルス遺伝子座内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態51〜54のいずれか1つの組成物。
実施形態56:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に前記第1のポリヌクレオチドを含み、UL41ウイルス遺伝子座内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態51〜54のいずれか1つの組成物。
実施形態57:前記賦形剤が、皮膚(全身または局所)、経皮、皮下、及び/または皮内投与のために適合される、実施形態1〜56のいずれか1つの組成物。
実施形態58:前記賦形剤が、ヒドロキシプロピルメチルセルロースゲルを含む、実施形態1〜57のいずれか1つの組成物。
実施形態59:前記賦形剤が、皮内投与のために適合される、実施形態1〜58のいずれか1つの組成物。
実施形態60:前記賦形剤が、リン酸緩衝液を含む、実施形態1〜59のいずれか1つの組成物。
実施形態61:前記賦形剤が、グリセロールを含む、実施形態1〜60のいずれか1つの組成物。
実施形態62:前記賦形剤が、脂質担体を含む、実施形態1〜61のいずれか1つの組成物。
実施形態63:前記賦形剤が、ナノ粒子担体を含む、実施形態1〜62のいずれか1つの組成物。
実施形態64:美容用組成物である、実施形態1〜63のいずれか1つの組成物。
実施形態65:前記美容用組成物がスキンケア製品である、実施形態64の組成物。
実施形態66:
(a)実施形態1〜65のいずれか1つの組成物と、
(b)前記組成物の投与に関する指示と
を含む、キット。
実施形態67:対象における1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、前記対象に、実施形態1〜65のいずれか1つの組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態68:対象の軟組織を強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、前記対象に、実施形態1〜65のいずれか1つの組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態69:前記組成物が、前記対象の軟組織に注射される、実施形態68の方法。
実施形態70:皮膚の質、状態、及び/または外観の改善を必要とする対象における皮膚の質、状態、及び/または外観を改善する方法であって、前記対象に、実施形態1〜65のいずれか1つの組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態71:前記状態が、日光による損傷、老化、紫外線曝露、粗いきめ、皮膚のたるみ、しわ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態70の方法。
実施形態72:皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観の減少を必要とする対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観を減少させる方法であって、前記対象に、実施形態1〜65のいずれか1つの組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態73:前記組成物の投与が、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間、少なくとも約9ヶ月間、または少なくとも約12ヶ月間にわたって、前記対象の皮膚における前記1つ以上の表面陥凹の外観を減少させる、実施形態72の方法。
実施形態74:前記対象の皮膚における前記1つ以上の表面陥凹の外観が、前記組成物の投与前の前記対象の皮膚における前記1つ以上の表面陥凹の外観と比較して、前記組成物の投与後に減少する、実施形態72または73の方法。
実施形態75:皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つの増加及び/または改善の必要とする対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つを増加させる及び/または改善する方法であって、前記対象に、実施形態1〜65のいずれか1つの組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態76:前記対象の皮膚が、前記組成物の投与後少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間、少なくとも約9ヶ月間、または少なくとも約12ヶ月間にわたって、増加した及び/または改善されたきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つを維持する、実施形態75の方法。
実施形態77:前記対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つが、前記組成物の投与前の前記対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りと比較して、前記組成物の投与後に増加する及び/または改善される、実施形態75または76の方法。
実施形態78:前記対象の皮膚が、老化している皮膚である、実施形態70〜77のいずれか1つの方法。
実施形態79:前記対象の皮膚が、紫外線光への曝露により損傷している、実施形態70〜78のいずれか1つの方法。
実施形態80:前記対象の皮膚がしわになっている、実施形態70〜79のいずれか1つの方法。
実施形態81:1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減を必要とする対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候を軽減する方法であって、前記対象に、実施形態1〜65のいずれか1つの組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態82:前記1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減が、(a)小じわ及び/またはしわの治療、減少、及び/または予防、(b)皮膚の毛穴径の減少、(c)皮膚の厚み、ふっくら感、及び/または張り感の改善、(d)皮膚の滑らかさ、しなやかさ、及び/または柔らかさの改善、(e)皮膚の色調、輝き、及び/または透明度の改善、(f)プロコラーゲン及び/またはコラーゲン産生の改善、(g)皮膚のきめの改善及び/または再度きめを整えることの促進、(h)皮膚輪郭の外観の改善、(i)皮膚のつや及び/または明るさの復元、(j)老化及び/または閉経により減退した皮膚外観の改善、(k)皮膚保湿の改善、(l)皮膚の弾性及び/または弾力性の増加、(m)治療、軽減、及び/または予防もしくは皮膚のたるみ、(n)皮膚の締まりの改善、(o)色素斑、斑のある皮膚、及び/または瘢痕(座瘡瘢痕)の減少、(p)光回折または反射による皮膚の光学的特性の改善、ならびに(q)それらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態81の方法。
実施形態83:前記対象における前記1つ以上の皮膚科学的老化兆候が、前記組成物の投与前の前記対象における前記1つ以上の皮膚科学的老化兆候と比較して、前記組成物の投与後に軽減される、実施形態81または82の方法。
実施形態84:前記対象がヒトである、実施形態67〜83のいずれか1つの方法。
実施形態85:前記組成物が、対象に皮膚(全身にまたは局所)、経皮、皮下、または皮内投与される、実施形態67〜84のいずれか1つの方法。
実施形態86:前記組成物が、表面注射によって投与される、実施形態67〜85のいずれか1つの方法。
実施形態87:前記組成物が、対象に皮下投与される、実施形態67〜85のいずれか1つの方法。
実施形態88:前記組成物が、対象に1回投与される、実施形態67〜87のいずれか1つの方法。
実施形態89:前記組成物が、前記対象に少なくとも2回投与される、実施形態67〜87のいずれか1つの方法。
実施形態90:前記投与間で、少なくとも約15日、少なくとも約30日、少なくとも約60日、少なくとも約90日、または少なくとも約120日が経過している、実施形態89の方法。
実施形態91:前記組成物が、前記対象の1つ以上の罹患領域及び/または非罹患領域に投与される、実施形態67〜90のいずれか1つの方法。
実施形態92:前記対象の皮膚が、投与前に擦過される、実施形態67〜91のいずれか1つの方法。
実施形態93:第1のヒトコラーゲンタンパク質を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む組換え核酸であって、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである、前記組換え核酸。
実施形態94:前記組換え核酸が、前記第1のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む、実施形態93の組換え核酸。
実施形態95:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、組換えHSV−1ゲノム、組換えHSV−2ゲノム、またはそれらの任意の誘導体である、実施形態93または94の組換え核酸。
実施形態96:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態93〜95のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態97:前記単純ヘルペスウイルス遺伝子が、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、tk、UL41、及びUL55からなる群から選択される、実施形態96の組換え核酸。
実施形態98:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む、実施形態97の組換え核酸。
実施形態99:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態97または98の組換え核酸。
実施形態100:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、UL41遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態97〜99のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態101:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP0遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態97〜100のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態102:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP27遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態97〜101のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態103:前記不活性化変異が、前記遺伝子(複数可)のコード配列の欠失である、実施形態96〜102のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態104:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ウイルス遺伝子座内に前記第1のポリヌクレオチドを含む、実施形態93〜103のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態105:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に前記第1のポリヌクレオチドを含む、実施形態93〜104のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態106:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP22ウイルス遺伝子座内に前記第1のポリヌクレオチドを含む、実施形態93〜105のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態107:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、UL41ウイルス遺伝子座内に前記第1のポリヌクレオチドを含む、93〜106のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態108:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28からなる群から選択される、実施形態93〜107のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態109:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17からなる群から選択される、実施形態93〜108のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態110:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号1〜14からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、実施形態93〜109のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態111:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質が、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態93〜110のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態112:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質がCOL7ではない、実施形態93〜111のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態113:前記第1のポリペプチドが、
(a)前記第1のヒトコラーゲンタンパク質、
(b)さらなるヒトコラーゲンタンパク質、及び
(c)(a)を(b)に連結するリンカーポリペプチド
を含む、実施形態93〜112のいずれか1つの組成物。
実施形態114:前記リンカーポリペプチドが切断可能なリンカーポリペプチドである、実施形態113の組換え核酸。
実施形態115:前記リンカーポリペプチドが、配列番号28〜31からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態113または114の組換え核酸。
実施形態116:前記さらなるヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28からなる群から選択される、実施形態113〜115のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態117:前記さらなるヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17からなる群から選択される、実施形態113〜116のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態118:前記さらなるヒトコラーゲンタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号1〜14からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、実施形態113〜117のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態119:前記さらなるヒトコラーゲンタンパク質が、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態113〜118のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態120:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質と前記さらなるヒトコラーゲンタンパク質が異なる、実施形態113〜119のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態121:前記第1のポリヌクレオチドが、
(a)前記第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、
(b)追加のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のORF、及び
(c)(a)と(b)を分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)
を含むポリシストロニックmRNAをコードする、実施形態93〜120のいずれか1つの組成物。
実施形態122:前記IRESをコードする前記核酸配列が、配列番号22または配列番号23から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、実施形態121の組換え核酸。
実施形態123:前記追加のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28からなる群から選択される、実施形態121または122の組換え核酸。
実施形態124:前記追加のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17からなる群から選択される、実施形態121〜123のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態125:前記追加のヒトコラーゲンタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号1〜14からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、実施形態121〜124のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態126:前記追加のヒトコラーゲンタンパク質が、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態121〜125のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態127:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質と前記追加のヒトコラーゲンタンパク質が異なる、実施形態121〜126のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態128:前記組換え核酸が、第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態93〜127のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態129:前記組換え核酸が、前記第2のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む、実施形態128の組換え核酸。
実施形態130:前記第2のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL4−3、COL4−4、COL4−5、COL4−6、COL5−1、COL5−2、COL5−3、COL6−1、COL6−2、COL6−3、COL6−4、COL6−5、COL6−6、COL7、COL8、COL9−1、COL9−2、COL9−3、COL10、COL11−1、COL11−2、COL12、COL13、COL14、COL15、COL16、COL17、COL18、COL19、COL20、COL21、COL22、COL23、COL24、COL25、COL26、COL27、及びCOL28からなる群から選択される、実施形態128または129の組換え核酸。
実施形態131:前記第2のヒトコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL6−1、COL7、及びCOL17からなる群から選択される、実施形態128〜130のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態132:前記第2のヒトコラーゲンタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号1〜14からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、実施形態128〜131のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態133:前記第2のヒトコラーゲンタンパク質が、配列番号15〜21からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態128〜132のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態134:前記第1のヒトコラーゲンタンパク質と前記第2のヒトコラーゲンタンパク質が異なる、実施形態128〜133のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態135:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ウイルス遺伝子座内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態128〜134のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態136:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態135の組換え核酸。
実施形態137:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP22ウイルス遺伝子座内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態135または136の組換え核酸。
実施形態138:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、UL41ウイルス遺伝子座内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態135〜137のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態139:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に前記第1のポリヌクレオチドを含み、ICP22ウイルス遺伝子座内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態135〜138のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態140:前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方のコピー内に前記第1のポリヌクレオチドを含み、UL41ウイルス遺伝子座内に前記第2のポリヌクレオチドを含む、実施形態135〜138のいずれか1つの組換え核酸。
実施形態141:実施形態93〜140のいずれか1つの組換え核酸を含む、宿主細胞。
実施形態142:真核細胞である、実施形態141の宿主細胞。
実施形態143:哺乳類細胞である、実施形態141または142のホース細胞。
実施形態144:ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞である、実施形態141〜143のいずれか1つの宿主細胞。
実施形態145:Vero細胞である、実施形態141〜144のいずれか1つの宿主細胞。
実施形態146:前記コスト細胞が補完宿主細胞である、実施形態141〜145のいずれか1つの宿主細胞。
実施形態147:単純ヘルペスウイルスを収集する方法であって、
(a)補完宿主細胞を実施形態93〜140のいずれか1つの組換え核酸と接触させることと、
(b)前記補完宿主細胞によって作製された単純ヘルペスウイルスを収集することと
を含む、前記方法。
実施形態148:単純ヘルペスウイルスを収集する方法であって、
(a)実施形態141〜146のいずれか1つの宿主細胞を培養することと、
(b)前記宿主細胞によって作製された単純ヘルペスウイルスを収集することと
を含む、前記方法。
本明細書は、当業者が本開示を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本明細書に示され、記載されるものに加えて、本開示の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかになり、添付の特許請求の範囲内に入るであろう。
本開示は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解される。しかしながら、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態が、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。
実施例1:ヒトコラーゲンタンパク質(複数可)をコードする改変された単純ヘルペスウイルスベクター
標的哺乳類細胞(ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞等)においてヒトコラーゲンタンパク質(複数可)を発現させることができる改変された単純ヘルペスウイルスゲノムベクターを作製するために、単純ヘルペスウイルスゲノム(図1A)を、最初に1つ以上の単純ヘルペスウイルス遺伝子を不活性化するように改変する。かかる改変は、哺乳類細胞におけるゲノムの毒性を減少させ得る。次に、ヒトコラーゲンタンパク質(複数可)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを保有するように、それらの改変/弱毒化された組換えウイルス構築物のバリアントを作製する。これらのバリアントには、(1)各ICP4遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(図1B)、(2)各ICP4遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4改変HSV−1ゲノム(図1C)、(3)各ICP4遺伝子座に組み込まれた第1の異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び同じDNA鎖上の第2の異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(図1D)、(4)各ICP4遺伝子座に組み込まれた第1の異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び同じDNA鎖上の第2の異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4改変HSV−1ゲノム(図1E)、(5)各ICP4遺伝子座に組み込まれた第1の異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び反対側のDNA鎖上の第2の異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(図1F)、(6)各ICP4遺伝子座に組み込まれた第1の異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び反対側のDNA鎖上の第2の異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4改変HSV−1ゲノム(図1G)、(7)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下のポリシストロニックmRNAをコードする発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(ポリシストロニックmRNAが第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び内部リボソーム侵入部位(IRES)によって分離された第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む)(図1H)、(8)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下のポリシストロニックmRNAをコードする発現カセットを含む組換えΔICP4改変HSV−1ゲノム(ポリシストロニックmRNAが第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び内部リボソーム侵入部位(IRES)によって分離された第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む)(図1I)、(9)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下のキメラタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(キメラタンパク質が第1のヒトコラーゲンタンパク質のアミノ酸配列及びリンカーポリペプチドのアミノ酸配列によって分離された第2のヒトコラーゲンタンパク質のアミノ酸配列を含む)(図1J)、(10)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下のキメラタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4改変HSV−1ゲノム(キメラタンパク質が第1のヒトコラーゲンタンパク質のアミノ酸配列及びリンカーポリペプチドのアミノ酸配列によって分離された第2のヒトコラーゲンタンパク質のアミノ酸配列を含む)(図1K)、(11)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセット及びICP22遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(図1L)、(12)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセット及びUL41遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22/ΔUL41改変HSV−1ゲノム(図1M)、及び(13)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセット及びUL41遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔUL41改変HSV−1ゲノム(図1N)が含まれる。
これらの改変された単純ヘルペスウイルスゲノムベクターを、1つ以上のヘルペスウイルス遺伝子を発現するように改変された操作されたVero細胞にトランスフェクトする。これらの操作されたVero細胞は、改変ゲノムを内部にパッケージングしている複製欠損単純ヘルペスウイルスを上清に分泌する。その後、上清を収集し、濃縮し、5μmフィルターを通して滅菌濾過する。
実施例2:ヒトCOL7をコードするHSV候補の構築及びインビトロ分析
コラーゲンアルファ−1(VII)鎖タンパク質(COL7)は、皮膚を強化し、安定させる機能を果たす。簡潔には、COL7A1転写物を翻訳し、結果として得られたCOL7ペプチドを、ヒドロキシル化及びグリコシル化によって翻訳後に修飾し、グリコシル化COL7トリペプチドが、細胞から分泌されるプロコラーゲンとして知られているトリプルヘリックスを形成する。プロコラーゲンは、分泌時に高次構造に会合し、アンカー原線維を形成し、これらは、上皮基底膜を組織化し、安定させ、かつその接着を補助する助けとなるように利用することができる。上皮基底膜は、上皮を下層疎性結合組織につなぎ留める役割を担い、真皮−表皮安定性(真皮−表皮接合部完全性)に不可欠である。栄養障害性表皮水疱症は、COL7A1遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝性遺伝子状態であり、この遺伝子の変異は、栄養障害性表皮水疱症患者における表皮を真皮に適切に結合するCOL7の能力を損ない、脆弱な皮膚をもたらす。表皮水疱症の最も重度な形態である劣性栄養障害性表皮水疱症(RDEB)は、皮膚及び粘膜の広範囲に及ぶ水疱形成及び瘢痕形成を特徴とすることが多い。
以下の実施例は、ヒトコラーゲンアルファ−1(VII)鎖ポリペプチド(COL7)を発現させるように改変された組換え単純ヘルペスウイルス1型の構築を説明し、組換えHSVが、健常患者及びRDEB患者由来の初代ヒトケラチノサイト及び線維芽細胞においてインビトロで機能性ヒトコラーゲンを発現させることができたことを示す実験をさらに提供する。
材料及び方法
ウイルス構築
「KCA211」ウイルスベクター(図2A)を以下のように作製した:野生型単純ヘルペスウイルスゲノムを、最初にウイルスICP4遺伝子(ΔICP4)の両方のコピーのコード配列を欠失させることによって改変した。ΔICP4改変ウイルスゲノムを、ICP4遺伝子座の各々にmCherry発現カセットを含むようにも操作した。その後、ウイルスゲノムを、野生型ヒトCOL7をコードするようにさらに改変した。簡潔には、ICP4の上流(US)領域及び下流(DS)領域に隣接する(hCMVプロモーターの制御下の)野生型COL7のコード配列を含むプラスミドを、ヘルペスウイルスICP4遺伝子を発現するように改変されたVero細胞にトランスフェクトした。その後、これらのトランスフェクト細胞を上述の改変ΔICP4 mCherry発現ウイルスに感染させた。COL7に隣接するUS及びDS ICP4領域は、mCherry遺伝子座の各々の二重交差及び置換を可能にした。その後、mCherry蛍光の非存在についての目視スクリーニングを使用して、組換えウイルスを含む細胞を特定した。
「SAR−COL7」ウイルスベクター(図2B)を以下のように作製した:野生型単純ヘルペスウイルスゲノムを、最初にウイルスICP4遺伝子の両方のコピー及びICP22遺伝子の単一コピー(ΔICP4/ΔICP22)のコード配列を欠失させることによって改変した。ΔICP4/ΔICP22改変ウイルスゲノムを、ICP4遺伝子座の各々にmCherry発現カセットを含むようにも操作した。その後、ウイルスゲノムを、野生型ヒトCOL7をコードするようにさらに改変した。簡潔には、ICP4の上流(US)領域及び下流(DS)領域に隣接する(hCMVプロモーターの制御下の)野生型COL7のコード配列を含むプラスミドを、ヘルペスウイルスICP4遺伝子を発現するように改変されたVero細胞にトランスフェクトした。その後、これらのトランスフェクト細胞を上述の改変ΔICP4/ΔICP22 mCherry発現ウイルスに感染させた。COL7に隣接するUS及びDS ICP4領域は、mCherry遺伝子座の各々の二重交差及び置換を可能にした。その後、mCherry蛍光の非存在についての目視スクリーニングを使用して、組換えウイルスを含む細胞を特定した。
細胞培養
細胞を、日常的な外科的または診断的手技の一部として採取された皮膚生検から事前に単離した。書面によるインフォームドコンセントを、各患者から、または小児の場合には親もしくは法定後見人から得た。本試験をヘルシンキ宣言に従って行った。全ての細胞を5%CO中37℃で培養した。ヒト線維芽細胞を、10%ウシ胎児血清(PEAK(登録商標)血清、カタログ番号PS−FB1)を補充したダルベッコ改変必須培地中で成長させた。RDEB及び正常なケラチノサイトを、10%FBS、10ng/mL上皮成長因子、10−10コレラ毒素、0.4μg/mLヒドロコルチゾン、5μg/mLトランスフェリン、5μg/mLインスリン、及び5μg/mLリオチロニンを補充したDMEM/ハムF12培地(3:1)中で培養した。全ての培地は、アスコルビン酸(150μM)を含んだ。ケラチノサイトを、3T3細胞の有糸分裂活性化フィーダー層の存在下及び10μMのRhoキナーゼ阻害剤Y−27632の存在下で成長させた。
ウイルス感染
ウイルスアリコートを−80℃で保管し、使用前に組織培養層流フード下で解凍した。細胞を組織培養プラスチックから切り離し、血球計でカウントした後に、標的細胞数を感染前に決定した。感染多重度(MOI)をウイルス力価及び標的細胞数から計算し、ウイルスストックの適切な体積を10%血清含有DMEM中に希釈し、標的細胞と37℃で2時間インキュベートした。その後、ウイルスを除去し、予め温められた培地で2回洗浄した後、新たな培地を標的細胞に供給した。
ウエスタンブロット
ケラチノサイトを100mmディッシュに8×10でプレーティングし、翌日に70〜80%コンフルエンシーを達成した。感染の48時間後、細胞を放射性免疫沈降アッセイ緩衝液で溶解した。溶解物を4℃で5分間にわたって遠心分離機に入れ、上清を6倍Laemmliローディング緩衝液と混合した。SDS−PAGEにロードする前に、試料を95℃で5分間沸騰させた。COL7検出のために、5〜30μgのタンパク質を6%アクリルアミドゲルにロードした。COL7検出のために使用した一次抗体は、ウサギ抗体(Sigma、カタログ番号HPA042420)であった。分解したタンパク質をニトロセルロース膜上に移し、一次抗体の要件に従って5%乳または5%BSAを含むPBS−0.1%Tween中でブロックし、一次抗体と一晩インキュベートした。IgG−HRPコンジュゲート二次抗体(Santa Cruz Biotechnology)とインキュベートした後、膜をウエスタンブロッティング基質(ThermoFisher Scientific、カタログ番号32106)とインキュベートし、フィルム(ThermoFisher Scientific、カタログ番号34090)に曝露した。
qRT−PCR
RNAを、RNeasy(登録商標)Mini Kit(Qiagen)を使用して製造業者のプロトコルに従って単離した。RNA抽出物を、NanoDrop(商標)分光光度計(Fisher Scientific)を使用して定量化し、1.5μgのRNAを、SuperScript III First−Strand Synthesisシステム(Invitrogen)を使用したcDNA合成に使用した。qPCRの場合、SYBR Select Master mix(Life Technologies)を使用し、cDNA試料を1:25に希釈して、鋳型として機能させた。実験を三連で行った。
接着アッセイ
96ウェルプレートを、4℃で一晩、100μL反応体積中10、20、または50μg/mLのラット尾コラーゲン1(BD Biosciences)またはヒトフィブロネクチン(Millipore)でコーティングし、その後、PBSで洗浄し、37℃で1時間にわたってPBS+0.1%BSAでブロックした。模擬(対照)またはSAR−COL7感染RDEBケラチノサイト(100μLのDMEM/HamF12+0.1%BSA中2.4×10細胞)をプレートに添加し、37℃で90分間インキュベートした。ウェルをPBSで3回洗浄して、結合していない細胞を除去し、接着細胞をPFEで20分間固定した。その後、固定細胞を70%エタノールで処理し、クリスタルバイオレットで染色し、100%エタノール中に分解し、Flex Station 3プレートリーダー(Molecular Devices)を用いて630nMで吸光度を測定することによって定量化した。
器官型皮膚等価物
ウシフィブリノーゲン(90%凝固可能、MP Biomedicals)を1.1%NaCl中に37℃で4時間溶解し、その後、0.45μmのナイロン膜フィルターで濾過した。トリプシン及び遠心分離を使用して線維芽細胞を収集し、培地中に再懸濁して2×10細胞/mLの最終濃度にした。細胞懸濁液の150μLを1mLのトロンビン(3IU−Sigma Aldrich)と混合し、細胞/トロンビン混合物を1:1の比率でフィブリノーゲンに添加した。混合物を、1mL/ウェルで12ウェルプレートに迅速かつ穏やかに分布させ、37℃でインキュベートした。20分後、10μg/mLの最終濃度でアスコルビン酸及びアプロチニン(Sigma)を補充した培地を添加した。マトリックスを5〜7日間成熟させ、培地を一日おきに交換した。ケラチノサイトを2×10細胞/ウェルで上にプレーティングし、翌日、培養物を金属グリッド上の空気−液体界面に引き上げ、アンレキサノクスでの処理を開始した。培地を、新たな薬物、アスコルビン酸、及びアプロチニンと一日おきに交換した。培養物を処理の1週間または2週間時点で収集し、液体窒素冷却イソペンタン中のOCTで凍結した。クライオスタット(Avantik QS11)を使用して8μm切片に切断し、1:800の希釈で、ポリクローナル抗COL7抗体で免疫染色した。核をDAPI(Invitrogen)で対比染色した。
結果
最初に、改変HSVからのCOL7発現を、HaCaTヒトケラチノサイト細胞株におけるqPCR分析及びウエスタンブロット分析により評価して、改変HSVがそれらのカーゴを発現させることができたかを決定した。HaCaT細胞に、0.3〜10の範囲のMOIでSAR−COL7またはKCA211のいずれかを形質導入した。感染の48時間後、細胞を収集し、qPCR分析(図3A)またはウエスタンブロット分析(図3B)のいずれかのために処理した。結果は、全長COL7がいずれかの改変HSVに感染したヒトケラチノサイトから用量依存的様式で発現されたことを実証した。
次に、免疫蛍光実験を行い、様々なMOI(0.1〜10の範囲)でSAR−COL7に24〜48時間感染した初代RDEBケラチノサイトまたはRDEB線維芽細胞におけるCOL7発現を可視化した。非感染正常細胞ならびにRDEBケラチノサイト及び線維芽細胞と比較して、ケラチノサイト(図4A)及び線維芽細胞(図4B)の両方について試験したSAR−COL7の全ての用量で強いCOL7シグナルが観察された。線維芽細胞における0.1〜1のMOIでのSAR−COL7の感染効率は、16〜36%の範囲であった。線維芽細胞における3.0以上のMOIでのSAR−COL7の感染効率は、90%以上であった。
COL7A1 RNA発現を評価するために、RDEB患者由来のヒト皮膚ケラチノサイト(HDK)及びヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を様々なMOIでSAR−COL7に感染させた。正常HDK及びHDF、ならびに模擬感染RDEB HDK及びHDFを陰性対照として使用した。SAR−COL7に感染したHDK(図5A)及びHDF(図5B)の両方において、COL7A1転写物の用量依存的増加が観察された。感染後のCOL7A1転写物発現の非感染健常HDK(表1A)または非感染健常HDF(表1B)に対する相対的変化倍率も計算した。COL7A1をコードするHSVの使用は、MOI3で、健常HDK及びHDFにおける野生型COL7A1転写物レベルと比較して、RDEB HDKにおけるCOL7A1転写物発現をおよそ26倍増加させ、RDEB HDFにおけるCOL7A1転写物発現をおよそ60倍増加させることができた。
(表1A)HDKにおけるCOL7A1発現
Figure 2021521894
(表1B)HDFにおけるCOL7A1発現
Figure 2021521894
次に、SAR−COL7から発現したヒトCOL7の機能性を細胞接着アッセイにより試験した。非感染RDEBケラチノサイト及び様々なMOIでSAR−COL7に感染したRDEBケラチノサイトの、コラーゲン1またはフィブロネクチンで処理したウェルに接着する能力を研究した。興味深いことに、SAR−COL7に感染したRDEBケラチノサイトは、プレートベースの接着アッセイを使用の際に、用量依存的様式でコラーゲン1(図6A)及びフィブロネクチン(図6B)への接着の増加を示した。
最後に、RDEB線維芽細胞及びケラチノサイトから成る皮膚等価物(SE)器官型培養物を使用して、基底膜ゾーン(BMZ)におけるSAR−COL7からのCOL7の発現を評価した。器官培養物をRDEBまたは正常の線維芽細胞及びケラチノサイトで構築した。RDEB細胞を器官培養物構築前にSAR−COL7に感染させたか(データ示さず)、またはSAR−COL7を、空気−液体界面に引き上げる前に培養物上に滴下した(図7)。結果として得られた皮膚等価物(SE)を単離し、切片化し、免疫蛍光のために染色して、COL7タンパク質発現を検出した。COL7がSAR−COL7に感染した細胞由来の器官型培養物において検出され、BMZでのCOL7タンパク質沈着の開始が観察された。このデータは、SAR−COL7がCOL7A1を送達してCOL7タンパク質を効率的に発現させることができたのみならず、インビボでのCOL7タンパク質に予期される組織化パターンと同様に、COL7タンパク質が器官型培養物において組織化し始めたことを示唆した。
まとめると、本明細書に提供されるデータは、複製欠損HSVが、二次元または三次元培養系のいずれにおいても明らかな毒性なしで、野生型初代ヒト細胞、ならびにコラーゲン欠乏症に罹患している患者から単離された初代ヒト細胞において、高レベルの機能性ヒトコラーゲンを効果的に送達及び発現させるためのビヒクルとして用いられ得ることを示した。
実施例3:野生型動物におけるヒトCOL7をコードするHSV候補のインビボ分析
以下の実施例は、ヒト細胞においてインビトロで構築及び検証された組換えウイルス(上の実施例2を参照のこと)が、野生型動物においてコードされたヒトコラーゲンをインビボで発現させることが可能であったことを示す実験を説明する。本研究の目的は、部分的には、健常な免疫適格動物におけるHSV媒介性コラーゲン発現の皮膚生体内分布を評価することであった。
材料及び方法
被験物質
マウスに投与した配合物中の活性成分は、PBS+10%グリセロール中で配合された4.8×10プラーク形成単位(PFU)/mLの力価での改変単純ヘルペスウイルスSAR−COL7またはKCA211(上の実施例2を参照のこと)であった。皮内投与に使用したビヒクルは、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)+10%グリセロールであった。局所投与に使用したビヒクルは、滅菌再蒸留水中で配合された3%ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)ゲルであった。
動物
6〜10週齢の健常雄BALB/cマウスを使用した。プロトコルで使用した全ての手順は、該当する動物保護法に準拠しており、現地の機関内動物実験委員会(IACUC)により承認されたものである。
皮内注射
被験物質投与前及び投与中に、マウスを、Dexdomitor(30μLまたは0.05mg/mL)及びTelzol(10mg/mLの50μL)のカクテルを使用して麻酔した。鎮静剤をAntisedan(0.5mg/mLの50μL)で無効にした。背中領域及び側腹領域を電気ペットクリッパーで剃り、アルコールワイプで拭いた。皮内注射を、シリンジ及び27G針(VWR、カタログ番号BD305620)を用いたMantoux技術を使用して行い、各部位での表面「ブレブ」の作製を確実にした。ウイルスをドライアイス上で保持し、室温で解凍し、解凍後30分以内に投与した。皮内注射を各マウスの背中に2回投与し、「ブレブ」の縁を油性マーカーでマークした。
局所適用
局所投与を、開放創または擦過もしくは乱切した皮膚のいずれか上で行った。背中領域及び側腹領域を、電気クリッパーを使用して剃った。皮膚を機械Dremelで優しく擦過し、その後、22G針で表面穿孔することにより、乱切を行った。創傷を作製するために、鋭利なはさみを使用して、皮膚の直径5〜6mmの生検を除去した。局所用配合物を擦過部位または創傷部位に含ませるために、1.5mLの微小遠心分離管の先端を切断及びオートクレーブ処理してウェルを作製した。蓋を保持し、切断側を透明な接着剤包帯で覆った。「ウェル」を、蓋側を下にして外科用接着剤を使用して擦過/創傷領域に接着させた。100μLのSAR−COL7を20μLの局所ビヒクルと混合し、透明な接着剤を介して注射することにより創傷部位に適用して、創傷上に局所ゲルを含ませ、漏れを防止した。
組織の収集
SAR−COL7投与後の指示された時点で、マウスを安楽死させ、8mmの生検パンチを使用して注射部位を取り出した。生検の半分を、液体窒素を使用して急速凍結し、残りの半分をOCTに包埋し、免疫蛍光染色のために凍結保存した。
リアルタイム定量PCR
急速凍結した半分の生検を分析まで−80℃で保管した。処理及び分析のために、試料を、製造業者のプロトコル(Qiagen)に従って、新たなDTTで調製した350μLのRLT緩衝液中に再懸濁した。試料を25%振幅で3回超音波処理し、氷上で1分間断続的にインキュベーションし、製造業者のプロトコル(Qiagen AllPrep DNA及びRNA抽出キット)に従ってDNA及びRNA抽出を行った。RNA試料及びDNA試料の両方を、RNAseを含まない脱イオン蒸留水中に再懸濁し、Take3マイクロプレートリーダー(BioRad)上で分光光度的に定量化した。
COL7A1導入遺伝子を特異的に検出する、ヒトCOL7A1オープンリーディングフレームの3’末端及び3’UTRにわたるカスタムプライマー/プローブアッセイを使用したTaqmanリアルタイムPCR分析により、COL7A1 DNAコピー及びRNA転写物の絶対定量化を行った。100ngのDNA及びRNAを、それぞれ、qPCRアッセイ及びqRT−PCRアッセイに使用し、増幅される領域を含むプラスミド標準物を100ngのマウスゲノムまたはRNAマトリックス中で調製した。GAPDHを両方の分析の対照として使用した。
免疫蛍光染色
OCT凍結組織を5〜8μmで切片化し、最大1時間空気乾燥させた。スライドを100%メタノール中に−20℃で10分間浸漬し、空気乾燥させた。メタノール固定切片を、室温でPBS中での3回の洗浄(各5分間)により再水和した。切片を、10%血清(混合種)から成るブロッキング溶液と、湿潤チャンバ内で、室温で1時間インキュベートした。過剰なブロッキング溶液を除去し、5%ブロッキング溶液中で調製した一次抗体(抗ヒトコラーゲン7、Sigma、カタログ番号HPA042420、抗インテグリンアルファ6(クローンgoH3)、BD Biosciences、カタログ番号555734)溶液を一滴、各切片(30〜50μL/切片)に適用した。切片を一次抗体と4℃で16時間インキュベートし、PBS中で、室温で3回洗浄し(各5分間)、二次抗体(抗ウサギAF−647、Invitrogen、カタログ番号A21244、抗ラットAF−594、Invitrogen、カタログ番号A11007)を、PBS中1:400の希釈で、室温で1時間にわたって湿潤チャンバ内で適用した。3回のPBS洗浄を繰り返し、その後、スライドをHoechst溶液(1:1000)中に室温で5分間浸漬した。3回のPBS洗浄を繰り返し、染色された切片を封入剤(Fluorometer G、Southern Biotech、カタログ番号0100−01)で封入し、カバースリップで覆った。切片を、Widefield Fluorescence Microscopeを使用して脱水後(およそ24時間後)に画像化した。
結果
6つの群に分けた合計30匹の雄BALB/cマウスをこの研究に使用した。SAR−COL7を1日目に皮内注射または局所適用のいずれかにより投与し、マウスのサブセットを3日目に収集し、残りのマウスを6日目に収集した。群2の動物は、皮内注射により同じ体積の低用量SAR−COL7(4.8×10pfu/部位)を受け、群1は、皮内コホートの対照としての役割を果たした。群4、5、及び6では、局所ビヒクル(群4)または局所ゲル中SAR−COL7(群5及び群6)を、合計体積120μLで創傷領域(群4及び群6)または擦過領域(群5)のいずれかに適用した。組織を収集し、上述のqPCR分析及び免疫蛍光分析のために処理した。
屠殺後のqPCR分析を行った。COL7A1の転写物レベル及びDNAレベルが皮内適用または局所適用のいずれかによりSAR−COL7を受けた全てのコホートに検出され(図8A〜D)、明らかな用量応答が観察された。転写物レベル及びDNAレベルは、皮内コホート及び局所コホート(SAR−COL7高ID、高創傷、及び高擦過)間で同等であり、局所適用が皮内注射と同程度に効率的にCOL7A1を送達することを示唆した。全体的に、6日目の試料(図8C〜D)のDNAレベル及びRNAレベルが3日目の試料(図8A〜B)よりも低く、これは、SAR−COL7がエピソームのままである(経時的に消えることが予想される)非組み込みベクターであるため、予想外ではなかった。
次に、インビボでのSAR−COL7感染後のCOL7発現を可視化するために免疫蛍光実験を行った。図9A〜Bに提供される代表的な画像で観察されるように、試験した両方の時点で、COL7が動物コホートの大半で検出された。多くの試料は、BMZで及び毛嚢周囲でCOL7の正しい局在化を示した。いくつかの場合において、具体的には、皮内適用では、恐らく皮内注射ではなく皮下注射であったため、強いCOL7発現が、下層筋膜により近い、皮膚のより深い層で観察された。同様に、BMZが擦過中に除去される可能性が高い擦過皮膚試料の多くでは(代表的なgoH3染色の欠如によって示唆されるように)、強力なCOL7染色は皮膚表面に限定された。全体的に、免疫蛍光試料中のCOL7の存在は、改変HSV SAR−COL7のロバストな有効性を強力に支持した。
加えて、ヒトCOL7を発現させるKCA211の能力をインビボで試験し、SAR−COL7投与と比較した。KCA211も免疫適格マウスにおいてインビボでCOL7導入遺伝子を発現させることが見出された(図10A〜B)。
まとめると、このデータは、改変HSVが、局所投与または皮内投与後に健常免疫適格動物においてインビボでヒトコラーゲンタンパク質を送達及び発現させることができることを示し、傷ついた皮膚または開放創に局所投与したウイルス由来のコラーゲンの発現が、インタクトな皮膚への皮内投与と同等であることをさらに示した。
実施例4:ハイポモルフ動物におけるヒトCOL7をコードする低用量及び高用量のHSV候補のインビボ分析
以下の実施例は、インビトロでのヒト細胞(上の実施例2を参照のこと)において及び野生型マウス(上の実施例3を参照のこと)においてインビボで構築及び検証された組換えウイルスが、COL7ハイポモルフマウスにおいてインビボで機能性ヒトコラーゲンを発現させることができることを示す実験を説明する。本研究の目的は、部分的には、COL7欠損免疫適格動物におけるHSV媒介性コラーゲン発現の皮膚生体内分布を評価することであった。
材料及び方法
反対の指示がない限り、実験を上の実施例3に記載されるように行った。
ハイポモルフマウス
COL7ハイポモルフマウスモデル(Fritsch et al.J Clin Invest.2008 May;118(5):1669−79)を本研究に使用した。このハイポモルフマウスモデルは、マウスが正常レベルの約10%のCOL7を発現する、栄養障害性表皮水疱症(DEB)の免疫適格動物モデルである。それらの表現型は、粘膜皮膚水疱形成、爪ジストロフィー、及び四肢のミトン奇形を含む、重度のヒトDEBの特徴に極めて類似している。
マウスをマウスCOL7A1のエクソン2のflp/frt媒介除去により作製した。COL7「ハイポモルフマウス」と称されるCOL7A1(Col7a1flNew/flNeo)の両方の機能的コピーを欠く動物は、正常レベルの約10%のCOL7を発現した。合計15匹の繁殖対から、58匹の仔を得て、その同腹仔は2〜7匹のマウス/同腹仔の範囲であった。これらの58匹の仔のうち、6匹がハイポモルフであると遺伝子型決定した。マウスを、耳穿孔組織試料から抽出したDNAで遺伝子型決定した。PCR分析により、COL7A1のエクソン2の上流にloxP部位の存在が検出された。野生型(WT)マウスは269塩基対(bp)でバンドを示し、ハイポモルフマウスは435bpでバンドを示し、ヘテロ接合マウスは両方のバンドを示した。全ての手順は、該当する動物保護法に準拠しており、現地の機関内動物実験委員会(IACUC)により承認されたものである。
皮内注射
被験物質投与前及び投与中に、マウスを、2%イソフルランを使用した吸入麻酔下で維持した。乾燥を防ぐために、眼軟膏(Puralube(登録商標)Vet)を目に適用した。31G針を用いたMantoux技術を使用して、皮内注射を行った。最大4回の皮内注射を指定された用量で各マウスの背中に投与した。
組織の収集
組織収集前に、動物をCO吸入により安楽死させ、その後、頸部脱臼させた。鋭利なはさみを使用して注射部位を生検した。
ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色
凍結保存した組織を5〜8μmの厚さで切片化し、最大1時間空気乾燥させた。スライドを100%メタノール中に−20℃で10分間浸漬し、空気乾燥させた。メタノール固定切片をPBS中で、室温で5分間再水和した。切片をヘマトキシリン(ワイゲルト改変ヘマトキシリン)中で、室温で5〜10分間インキュベートし、その後、PBS中で、室温で15分間洗浄した。その後、切片をエオシン(エオシンY溶液、カタログ番号HT110116)中で3回すすぎ、その後、水中で1回すすいだ。
切片を、70%エチルアルコール中に10回、95%エチルアルコール中に10回、100%エチルアルコール中に10回に浸漬することにより、エタノールで徐々に脱水させた。切片を乾燥させるように設定し、封入剤(Fischer Scientific、カタログ番号SPF15−100)で封入し、カバースリップで覆った。切片を、明視野顕微鏡を使用して脱水後(およそ24時間後)に画像化した。
電子顕微鏡検査
皮膚を、0.05%タンニン酸を含有するダルベッコ無血清培地(SFM)中1.5%グルタルアルデヒド/1.5%パラホルムアルデヒド中に少なくとも1時間浸漬し、その後、SFM中で広範囲にわたってすすぎ、1%OsO中で60分間後固定することにより、電子顕微鏡検査のために調製した。試料をSFM中で洗浄し、その後、100%までの段階的エタノール系列中で脱水し、プロピレンオキシド中ですすぎ、2時間の合計時間にわたってSpurrエポキシ中に浸潤させ、マイクロ波エネルギーにより加速した。試料を70℃で18時間にわたって重合した。追加の試料を、SFM中で広範囲にわたってすすぎ、その後、SFM中1:5で希釈したマウスIgM LH24抗体またはマウスIgG NP185抗体中に4℃で一晩浸漬することにより調製した。その後、試料をSFM中で広範囲にわたってすすぎ、金増強溶液(Nanoprobes)に氷上で15分間曝露し、その後、25℃に急速に温め、さらに5分間インキュベートした。試料を氷冷SFMですすぎ、固定し、包埋した。
結果
3匹のハイポモルフマウスを高用量SAR−COL7研究に使用した。全てのマウスは、1日目に皮内注射により4.6×10PFU/50μL/注射部位の用量を受けた(表2)。各動物を剃り、1回の対照注射及び3回のSAR−COL7注射を含む注射を背中の4つの部位に行った。1匹の動物(マウス3)は、3日目に同じ4つの部位に2回目の注射を受けた。1匹のマウス(マウス1)を3日目に屠殺し、マウス2及びマウス3を7日目に屠殺した。
(表2)高用量SAR−COL7の皮内注射のための研究設計
Figure 2021521894
屠殺後のqPCR分析を行った。COL7A1の転写物レベル(図11A)及びDNAレベル(図11B)を3つ全てのマウスの各ウイルス注射部位で検出した。全ての対照試料(PBSまたはHSV−GFP)中の転写物レベルが本アッセイにおける検出レベル以下であったため、1つの対照(3日目、試料1、HSV−GFP)のみを比較のためにグラフに含めた。SAR−COL7の単回投与(マウス2)後7日目までにDNAレベル及び転写物レベルのいくらかの減少が観察されたが、SAR−COL7の再投与(マウス3)時にDNAレベル及び転写物レベルが増加した。
次に、免疫蛍光(IF)実験を行い、インビボでのSAR−COL7感染後のハイポモルフマウスにおけるCOL7発現を可視化した(図12A〜B)。IF実験は、3日目及び7日目の両方の時点で、ロバストな広範囲のCOL7タンパク質発現がBMZで観察され、毛嚢(HF)周囲でも観察されたことを実証した。SAR−COL7処理試料が線維症または急性炎症の明らかな兆候のない正常な皮膚形態を示したため、(反復投与後でさえも)皮膚形態への悪影響は観察されなかった(図13)。全体的に、免疫蛍光試料中のCOL7の存在は、下層皮膚構造で分泌され、かつ適切に組織化されることができるヒトコラーゲンを送達する際のSAR−COL7のロバストな有効性を強力に支持した。
3日目の生検を、電子顕微鏡検査によりアンカー原線維の形成についても評価した。適切に構造化されたアンカー原線維では、COL7のNC1ドメイン(NP158抗体で染色される)が緻密層に向かって整列する一方で、COL7のNC2ドメイン(LH24抗体で染色される)は、緻密層から離れて整列する。SAR−COL7注射マウス由来の生検は、LH24抗体(図14A)及びNP185抗体(図14B)の両方でのCOL7染色を示し、重要なことに、電子顕微鏡(EM)画像は、アンカー原線維の形成を明らかにした。緻密層は、EM画像の中央を通る暗い帯として観察された。外因性ヒトCOL7のNC2ドメインが緻密層から離れて配置された一方で、外因性ヒトCOL7のNC1ドメインは、適切に形成されたアンカー原線維で予想されるように、緻密層に沿って配置された。このデータは、SAR−COL7が、BMZで分泌されかつ適切に組織化されることができるコードされたヒトCOL7を発現させることができたことのみならず、分泌されたCOL7が機能的であり、結果として生じたアンカー原線維中に適切に配置され、ハイポモルフマウスの皮膚組織を支持したことも示した。
3匹の追加のハイポモルフマウスを低用量SAR−COL7試験に使用した。全てのマウスは、1日目に皮内注射により3つの部位(マウス1)または2つの部位(マウス2及びマウス3)に6.4×10PFU/50μL/注射部位のSAR−COL7の用量を受けた(表3)。
(表3)低用量SAR−COL7の皮内注射のための研究設計
Figure 2021521894
屠殺後のqPCR分析を行った。COL7A1の転写物レベル(図15A)及びDNAレベル(図15B)を3つ全てのマウスの各ウイルス注射部位で検出した。用量応答が観察された。これらの低用量試料におけるCOL7A1のDNAレベル及び転写物レベルの両方が高用量研究で観察されたものと比較して低かったが、COL7A1発現は依然として検出可能であった。DNAまたはRNAレベルのおよそ2logの減少にもかかわらず、COL7タンパク質は、低用量SAR−COL7注射動物の皮膚で依然として検出可能であった(図16)。COL7タンパク質は、BMZ及び毛嚢周囲の両方で観察された。このデータは、より低い投薬量であっても、改変HSVが、コードされたヒトコラーゲンタンパク質の送達及び発現に依然として有効であり、次いで、それが分泌され、皮膚の適切な領域に局在したことを示した。
まとめると、実施例に提供されるデータは、本明細書に記載の改変HSVが、以下を行うことができたことを示した:(1)インビトロ及び器官型培養下で、機能性ヒトコラーゲンを産生するように皮膚細胞に形質導入する(実施例2を参照のこと)、(2)局所適用後及び皮内適用後の両方で、健常免疫適格動物において、インビボで皮膚に形質導入し、ヒトコラーゲンを送達する(実施例3を参照のこと)、(3)コラーゲン欠損動物において、インビボで皮膚に形質導入し、ヒトコラーゲンを送達し、アンカー原線維の形成を開始する(実施例4を参照のこと)。理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載の組換えベクターが、機能性ヒトコラーゲンを皮膚に送達するための望ましい戦略を提供し、美容的環境において真皮及び/または表皮を支持するための新規のアプローチを可能にすると考えられる。
実施例5:ヒトコラーゲン1をコードする複数の操作HSVの構築及び検証
以下の実施例は、ヒトコラーゲン1を首尾よく発現させるように組換えHSV−1を操作するための2つの異なるアプローチを説明する。ヒトコラーゲン1が、COL1A1ポリペプチドの2つのコピー及びCOL1A2ポリペプチドの1つのコピーを含むヘテロ三量体巨大分子であるため、ヒトCOL1A1及びCOL1A2の両方をコードする単一HSVゲノムを作製するための2つの異なる戦略を行った。これらの2つのアプローチを、概して、図1H〜1I及び1Lに示し、以下に詳細に記載する。
第1のアプローチとして、組換えHSV−1を最初に操作して、異種プロモーター及びポリA配列を含むヒトCOL1A1発現カセットを上の実施例2に記載されるようにICP4遺伝子座の各々に組み込んだ。ヒトCOL1A1カセットを推定上含むウイルスの複数のプラークを採取し、Vero細胞の感染によりスクリーニングして、COL1A1発現を試験した(データ示さず)。少なくとも3つの単離体(クローン1A1、2A1、及び3A1)がヒトCOL1A1導入遺伝子発現に対して陽性であった。次に、ヒトCOL1A1陽性クローン1A1及び2A1を操作して、COL1A1カセットとは異なる異種プロモーター及びそれ自体のポリA配列を含むヒトCOL1A2発現カセットを組み込み、ICP22遺伝子座に挿入した。その後、7つの単離体(クローン1A2−1A1、1B2−1A1、1C1−1A1、1B3−2A1、3B1−1A1、及び3B1−2A1)をスクリーニングして、ヒトCOL1A1及びCOL1A2の両方、ひいては全長ヒトコラーゲン1を発現させることができる弱毒化HSV−1ウイルスを特定した。
Vero細胞を、7つの推定COL1A1−COL1A2陽性単離体のうちの1つまたは3つのCOL1A1のみの単離体のうちの1つ(COL1A2発現の陰性対照として)に感染させて、両方の導入遺伝子を発現することができる組換えHSV−1クローンを特定した。Vero細胞の感染を5日間継続させ、細胞を穏やかな掻爬により収集し、細胞ペレットを6000×gで5分間の遠心分離により収集した。各ペレットの半分をqRT−PCR分析のために収集し、残りの半分をウエスタンボッティングのために処理した。ヒトCOL1A1またはCOL1A2オープンリーディングフレーム(ORF)の3’末端及び3’非翻訳領域(UTR)にわたり、導入遺伝子に特異的なカスタムプライマー/プローブアッセイを使用したTaqmanリアルタイムPCR分析により、COL1A1またはCOL1A2 RNAコピーの絶対定量化を行った。3つ全てのCOL1A1のみのウイルスに感染した細胞及び7つのCOL1A1−COL1A2ウイルスのうちの6つに感染した細胞から抽出したRNAは、ヒトCOL1A1導入遺伝子発現に対して陽性であった(図17A)。興味深いことに、7つのCOL1A1−COL1A2ウイルスのうちの3つ(クローン1B2−1A1、1C1−1A1、及び1B3−2A1)のみが、検出可能なレベルのヒトCOL1A2も発現させた(図17B)。これらの3つの単離体に感染した細胞溶解物におけるCOL1A1及びCOL1A2タンパク質発現のウエスタンブロッティングを行い、これらの導入遺伝子が核酸レベル及びタンパク質レベルの両方で発現されることを確実にした。簡潔には、細胞ペレットを、Haltプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するRIPA緩衝液中に再懸濁し、4℃で10分間インキュベートし、その後、室温で10分間にわたってベンゾナーゼで処理した。その後、試料を5%2−メルカプトエタノールを含有する4倍LDS試料緩衝液で希釈し、トリス−グリシンゲル上で分解した。模擬感染Vero細胞溶解物を陰性対照としてゲルにロードした。タンパク質をPVDFに移し、ブロックし、その後、一次抗体(抗ヒトCOL1A1、ThermoFisherカタログ番号PA5−29569、抗ヒトCOL1A2、Abcamカタログ番号ab96723、または抗GAPDH、Abcamカタログ番号ab9485)で一晩染色した。その後、染色された膜を洗浄し、二次抗体とインキュベートし、その後、現像した。qRT−PCR分析と一致して、3つ全てのクローンが、ヒトCOL1A1及びCOL1A2タンパク質の両方を検出可能なレベルで発現することができた(図17C)。
第2のアプローチを並行して続行して、COL1A1−COL1A2陽性組換え弱毒化HSVベクターを作製した。ここで、5’から3’の方向に、ヒトCOL1A1 ORF、合成IRES、及びヒトCOL1A2 ORFをコードする、ポリヌクレオチド構築物を作製した。その後、このIRESベースの構築物(異種プロモーター及びポリA配列も含む発現カセットでコードされる)を、上の実施例2に記載されるように、ICP4遺伝子座の各々に挿入した。複数のプラークを採取し、スクリーニングして、正しく挿入されたIRES構築物を有するベクターを特定した。簡潔には、Vero細胞を推定IRESウイルス単離体に感染させ、感染を5日間継続させ、細胞を収集し、qPCR分析及びqRT−PCR分析のために処理した。合成IRESを認識するカスタムプライマー/プローブアッセイを使用したTaqmanリアルタイムPCR分析により、挿入DNA及びRNAコピーの絶対定量化を行った。13個のウイルス単離体をqPCR分析及びqRT−PCR分析によりスクリーニングし、これらの単離体のうちの1つ(単離体6)のみが、IRES配列を含むIRES DNA及びRNA転写物に対して陽性であった(データ示さず)。この単離体がヒトCOL1A1及びCOL1A2の両方をタンパク質レベルで発現させることができることを確認するために、感染Vero細胞を上述のようにウエスタンブロッティングのために処理した。qPCRによる発現カセット組み込み及びqRT−PCRによる導入遺伝子発現を示さなかったウイルス単離体(単離体1)を陰性対照として使用した。qPCR/qRT−PCRデータと並行して、ウイルス単離体6は、感染後にヒトCOL1A1タンパク質及びCOL1A2タンパク質の両方を発現させることができた(図18)。
まとめると、この試料に示されるデータは、(1)標的細胞感染後のヒトCOL1A1及びCOL1A2の両方の発現において高い能力を有する複数の組換えHSV−1ベクターを首尾よく構築したこと、(2)ヘテロ三量体ヒトコラーゲンタンパク質を発現させるようにベクターを操作することができること、及び(3)複数の異なるアプローチを用いて、単一の組換えゲノムから複数のタンパク質を発現させることができることを示す。理論に拘束されることを望むことなく、組換えHSV−1ゲノムからのヒトコラーゲン1の発現の成功により、任意のヘテロ三量体コラーゲンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン4)を発現させるための操作HSVの使用が支持されると考えられる。
実施例6:ヒトコラーゲン3をコードする操作HSVの構築、検証、及びインビトロ特徴付け
以下の実施例は、ヒトコラーゲン3(C3vec01と称される)を首尾よく発現させた組換えHSV−1の操作を説明する。加えて、以下の実施例は、用量範囲研究における不死化ヒトケラチノサイト及び線維芽細胞の使用、複数の高齢ヒト患者から生検した初代ヒト皮膚線維芽細胞のより高齢の患者におけるC3vec01媒介コラーゲン3レスキューのモデルとしての使用、ならびにインビトロ紫外線照射不死化ヒト線維芽細胞の日光曝露/皮膚老化のモデルとしての使用を含む、C3vec01の有効性の特徴付けに好適な複数の関連二次元細胞培養モデル系を確立するインビトロ実験について説明する。
ヒト皮膚は、主に、皮膚線維芽細胞によって産生、組織化、及び維持されるコラーゲン豊富な結合組織から成る。皮膚コラーゲンは、ヒト皮膚の90%超(乾燥重量)に相当し、主に、約85:15の典型的な比率でCOL1原線維及びCOL3原線維から成る。これらの原線維は皮膚に強度を提供し、皮膚組織アーキテクチャの維持に重要である。
皮膚老化特徴は、主に異常なコラーゲン恒常性に起因し、純コラーゲン欠損をもたらし、コラーゲンの生合成が減少し、コラーゲン原線維の断片化が増加し、皮膚コラーゲンが進行的に喪失し、これらは全て老化表現型に寄与する。皮膚老化は、内的要因及び外的要因の両方の組み合わせに影響され、内因性要因には、時間の経過、遺伝、細胞代謝、ホルモン等があり、外因性要因には、光への長期曝露、汚染、電離放射線等がある。これらの要因は一緒に皮膚に累積的な構造的及び生理学的変化をもたらし、最終的には皮膚のしわの出現及び悪化をもたらす。
皮膚幼若化は、皮膚の凹凸(しわ等)を逆転させるまたは修復するプロセスであり、部分的には、新たなコラーゲンの合成(新コラーゲン生成(neocollagenesis))によって達成される。皮膚において、新コラーゲン生成は、コラーゲン1及びコラーゲン3の沈着、ならびにコラーゲン1とコラーゲン3との間の複雑な相互作用に影響される。COL3は、コラーゲン原線維形成中の初期に出現し、COL1によるこのCOL3のその後の置換は、コラーゲン原線維成熟及び細胞外マトリックス再編成に重要なステップである(Wang,et al.,2018,Journal of the Chinese Medical Association,81(2),pp.94−101)。加えて、COL3は、COL1繊維の寸法を調節し(Liu,et al.,1997,Proc Natl Acad Sci USA,94(5),pp.1853−6)、COL1弾性を強化する(Asgari,et al.,2017,Sci Rep,7(1),p.1392)。したがって、初期COL3発現の出現及びその後のCOL1での置換は、ヒトにおける注射用顔面フィラーの有効性のマーカーとして使用されている(Yutskovskaya,et al.,2014,J Drugs Dermatol,13(9),pp.1047−52)。
別途言及されない限り、全ての実験を上述のように行った。
最初に、組換えHSV−1を操作して、異種プロモーター及びポリA配列を含むヒトCOL3A1発現カセットをICP4遺伝子座の各々に組み込んだ。ヒトCOL3A1カセットを推定上含むウイルスの複数のプラークを採取し、Vero細胞の感染によりスクリーニングして、COL3A1発現を試験した(データ示さず)。その後、C3vec01と称される高発現クローンのうちの1つを、追加のインビトロ分析(以下に記載)及びインビボ分析(実施例7)のために選択した。
最初に、用量範囲研究を行い、不死化ヒトケラチノサイト(図19)及び不死化ヒト皮膚線維芽細胞(図20)の両方におけるC3vec01のコードされたヒトカーゴのC3vec01媒介送達の有効性を決定した。不死化細胞を、0.3〜3の範囲の様々な感染多重度(MOI)で48時間感染させ、ヒトコラーゲン3発現を、複数のアッセイにより定量的及び定性的に測定した。不死化HK及び不死化HDFにおけるqPCR分析(データは示さず)によるエフェクターDNAレベル及びqRT−PCR分析によるエフェクター転写物レベルの両方の用量依存的増加が観察された(それぞれ、図19A及び図20A)。模擬感染細胞、及びC3vec01と同じHSV−1骨格を含むが、代わりにmCherryエフェクターをコードするウイルスに感染した細胞を、陰性対照として使用した。これらの結果と並行して、C3vec01感染後のCOL3タンパク質発現の用量依存的増加が、不死化HK(図19B)及び不死化HDF(図20B)において免疫蛍光により観察された。不死化HDFは感染前は内因性ヒトCOL3を発現したが(予想通り)、低用量であってもC3vec01による感染後に、COL3発現の有意な増加が観察された(一次抗COL3抗体、Abcamカタログ番号ab7778)。非感染不死化ケラチノサイトでは検出可能な内因性COL3はほとんどまたは全く観察されなかった。重要なことに、高用量であっても、C3vec01に感染した不死化ケラチノサイトまたは線維芽細胞では、細胞形態または生存への有意な影響は観察されなかった。
皮膚が老化するにつれて、常在性皮膚線維芽細胞はコラーゲン3をあまり産生しなくなり、皮膚中のCOL1:COL3の比率は、コラーゲン1に偏る。新たなコラーゲン3の合成により皮膚幼若化をもたらすために、C3vec01が老化皮膚線維芽細胞に効果的に感染し、そのコードされたヒトコラーゲン3を強力に発現させることができるかを理解することが重要であった。したがって、老化初代皮膚線維芽細胞に感染し、かつ複数のMOIで外因性コラーゲン3を発現させるC3vec01の能力を、2つの異なるベンダーから調達した細胞で試験した。以下の表4は、この研究で使用した4つの主要なHDF試料のドナー情報を提供する。
(表4)初代ヒト皮膚線維芽細胞ドナー
Figure 2021521894
不死化HDFと比較して、同等のまたはそれよりも高いCOL3転写物レベルで同様の用量依存的増加がベンダー1(図21A)及びベンダー2(図21C)からの初代HDFのC3vec01感染後に観察された。各ベンダーからの代表的な初代細胞の試料も、ウエスタンブロット分析によりCOL3発現について試験した(一次抗COL3抗体、Abcamカタログ番号ab7778)。C3vec01は、最も低いMOIで試験した場合でも、73歳の男性患者(図21B)及び75歳の女性患者(図21D)から生検した初代HDFにおける高レベルのヒトコラーゲン3発現をレスキューすることができた。
最後に、紫外線曝露不死化ヒト線維芽細胞におけるロバストなコラーゲン3発現を誘導するC3vec01の能力を試験した。日光への曝露、及び対応する紫外線損傷が、老化皮膚表現型に対する唯一の最大の外因性寄与因子であることが知られており、複数のグループがインビトロ皮膚線維芽細胞紫外線曝露システムを用いて光老化のある特定の態様をモデル化している(例えば、Qin et al.2018,Cell Physiol Biochem 46(5):1849−1860を参照のこと)。紫外線曝露がヒト皮膚線維芽細胞に、より少ないコラーゲン3を分泌させたことを確認するために(光老化皮膚の表現型を考慮して予想されるように)、培養不死化ヒト皮膚線維芽細胞の上清中へのCOL3分泌を、3つの異なるレベルの紫外線曝露の前後にELISAにより測定した(図22A)。実際には、培養線維芽細胞の紫外線照射は、内因性COL3発現を著しく低下させた。COL1発現をこの実験で並行して監視し、紫外線照射の影響を有意に受けなかったことから、タンパク質合成の包括的抑制とは対照的に、紫外線曝露がCOL3の特異的抑制を誘導したことが示された。次に、紫外線照射不死化HDFに感染し、かつ外因性COL3を発現させるC3vec01の能力を試験した。ここで、不死化HDFを紫外線照射に曝露し、その後、24時間回復させた後に、0.3または1のMOIでC3vec01に感染させた。感染の48時間後、外因性ヒトCOL3をqRT−PCR分析により評価した。強力なCOL3発現が、試験した両方のMOIで、C3vec01感染紫外線照射HDFで検出され(図22B)、これは、C3vec01が光損傷細胞に効率的に形質導入し、そのコードされたカーゴを送達したことを示す。C3vec01と同じHSV−1骨格を含むが、代わりにmCherryエフェクターをコードするウイルスに感染した細胞を陰性対照として使用して、導入遺伝子検出の特異度を確実にした。
まとめると、この実施例に示されるデータは、組換えHSV−1ベクターC3vec01が複数のヒト皮膚細胞型に効率的に形質導入し、高齢患者から収集された老化初代線維芽細胞におけるコラーゲン3発現をレスキューすることができ、紫外線損傷HDFからのコラーゲン3発現を回復させることができることを示す。理論に拘束されることを望むことなく、このデータが、老化皮膚のコラーゲン欠損を修正するためのヒトコラーゲン3をコードする組換えHSVの使用を支持すると考えられる。
実施例7:皮内投与したC3vec01のインビボ特徴付け
以下の実施例は、若年及び老年健常免疫適格動物においてC3vec01を皮内投与する方法を確立するインビボ実験を記載した。
別途言及されない限り、全ての実験を上述のように行った。
この実施例で行った全ての手順は、該当する動物保護法に準拠しており、現地の機関内動物実験委員会(IACUC)により承認されたものである。
さらなる操作の前にマウスの背中を剃った。その後、C3vec01(またはビヒクル対照)をマウスの背中の4つの部位に皮内注射した。感染器官及びその後の回復期間後、動物を安楽死させ、8mmパンチ生検を使用して処理部位を取り出した。各生検の半分を、qPCR/qRT−PCR分析のために液体窒素中で急速凍結し、残りの半分を免疫蛍光分析のために処理した。
組織試料を、上述のように核酸及びタンパク質分析のために処理した。COL3免疫蛍光染色のために、ウサギ抗ヒトコラーゲン3一次抗体(Abcam、カタログ番号ab7778)及びAlexa Fluor(登録商標)488コンジュゲート二次抗体を使用した。組織試料を,DAPIを含有する封入剤で封入して、核を可視化した。
インビボ薬理学的研究を若年(6〜8週齢)及び老年(およそ13ヶ月齢)C57BL/6マウスに行い、ベクターの皮内投与時の免疫適格動物におけるヒトCOL3のC3vec01媒介発現を評価した。合計10匹の動物をこの研究に使用した。最初に各マウスの背中を剃り、その後、4部位/動物で2×10PFU/部位のC3vec01(またはビヒクル対照)を皮内注射した。注射部位を投薬後48時間または1週間のいずれかの時点で生検し、qPCR及び免疫蛍光によりヒトCOL3発現について評価した。以下の表5は、実験設計の概要を提供する。
(表5)研究設計及び被験物質投与
Figure 2021521894
C3vec01の皮内送達は、注射後48時間時点で収集した皮膚生検における高レベルの形質導入ベクターゲノムの検出をもたらし(図23A)、さらに、若年マウス及び老年マウスの両方に高レベルのヒトコラーゲン3転写物をもたらした(図23B)。免疫蛍光ベースの検出は、ビヒクル処理皮膚と比較して、C3vec01処理皮膚中の真皮全体にわたって顕著に増加したレベルのヒトCOL3も示し、転写物レベルと相関した(図23C)。
まとめると、この実施例で提供されるデータは、皮膚に効率的に形質導入し、皮内注射後にインビボでヒトコラーゲン3を発現させることができることを示す。理論に拘束されることを望むことなく、ここに示されるインビボ研究が、審美的環境においてヒトコラーゲン3を送達するための新規の遺伝子療法としてのHSV−1の使用をさらに支持すると考えられる。
実施例8:ヒトラミニンをコードする改変単純ヘルペスウイルスベクターの作製及び検証
最初に、組換えヘルペスウイルスベクターを操作して、上の実施例3に記載されるように、2つのヒトラミニンタンパク質LAMB3またはLAMC2の野生型バリアントまたはコドン最適化バリアントのいずれかを組み込んだ。ウイルス型毎にいくつかの単離体を採取した。ある特定の単離体が、コードされた野生型ヒトLAMB3タンパク質を発現させることができるかを試験するために、ICP4補完Vero細胞を6ウェルプレートにプレーティングし、感染が完了するまで野生型LamB3コードウイルスの12の非力価測定ウイルス単離体に感染させた。感染後、RNAを収集し、cDNAを作製し、各単離体由来の野生型LamB3の発現をqPCRにより決定した(図24A)。12全ての単離体が、形質導入Vero細胞において様々なレベルで野生型ヒトLamB3を発現させることができた。これらの単離体のうちの10の単離体の、ヒトLamB3を発現させる能力も、ウエスタンブロットにより試験した。ICP4補完Vero細胞を6ウェルプレートにプレーティングし、感染が完了するまで野生型LamB3発現ウイルスの10の非力価測定ウイルス単離体に感染させた。Vero細胞のウェルを、陽性対照としてLamB3発現プラスミドでトランスフェクトした。感染後、細胞を穏やかな掻爬により収集し、遠心分離して細胞ペレットを収集し、培養培地を吸引し、細胞ペレットをPBSで1回洗浄した。洗浄後、各細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する200μLのRIPA緩衝液中に再懸濁し、再懸濁液を5分毎に穏やかに撹拌しながら4℃で20分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を17,000×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、5%2−メルカプトメタノールを含有する4倍LDS還元試料緩衝液を各精製上清に添加した。その後、試料を10分間沸騰させた後、4〜20%トリス−グリシンポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動後、タンパク質をPVDF膜に移し、膜を5%乳/TBS中で30分間ブロックした。その後、一次ウサギ抗LamB3抗体(Abcam、カタログ番号ab128864)を、5%乳/TBS中1:1000希釈でPVDF膜に添加し、室温で一晩(約16時間)インキュベートした。その後、ブロットをTBSで3回洗浄し(各5分間)、次いで、5%乳/TBS中APコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG抗体(Sigma、カタログ番号A3687)で、室温で1時間染色した。その後、膜をTBSで3回洗浄し(各5分間)、BCIP/NBTを添加し、ブロットを室温で約10分間現像した。qPCRデータと一致して、10の全てのウイルス単離体が、コードされた野生型ヒトLamB3を様々なレベルで発現させることができた(図24B)。
ヒトLamB3のコドン最適化バリアントをコードするウイルスも、ウエスタンブロット分析により、Vero細胞においてそれらのカーゴを発現させるそれらの能力について試験した。簡潔には、上述のように、コドン最適化(CO)LamB3コードウイルスの10の非力価測定ウイルス単離体を使用してVero細胞を感染させ、細胞ペレットを収集し、各ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有するRIPA緩衝液中に再懸濁し、これらの細胞溶解物を使用してウエスタンブロットを行った。10の全てのウイルス単離体が、Vero細胞において、コードされたコドン最適化ヒトLamB3を発現させることができた(図25)。
次に、野生型LAMB3またはコドン最適化LAMB3のいずれかをコードする4つのウイルス単離体を、初代ヒト細胞に形質導入してそれらのカーゴを発現させるそれらの能力について、試験した。不死化初代正常ケラチノサイトを感染多重度(MOI)1.0で48時間感染させた。非感染細胞を陰性対照として使用した。その後、感染ヒトケラチノサイトにおけるLamB3の発現をウエスタンブロットにより試験した。ウエスタンブロットを、一次ウサギ抗LamB3抗体(Abcam、カタログ番号ab128864)を使用して上述のように行った。Vero細胞を使用して作成されたデータと一致して、野生型LamB3及びコドン最適化LamB3のいずれかを発現させるウイルス単離体が、初代ヒトケラチノサイトに効果的に形質導入してそれらのコードされた構築物を適切なレベルで発現させることが確認された(図26)。
LamC2含有単離体が、コードされた野生型またはコドン最適化ヒトLAMC2を発現させることができるかを試験するために、ICP4補完Vero細胞を6ウェルプレートにプレーティングし、感染が完了するまでいくつかの非力価測定野生型またはコドン最適化LamC2発現ウイルス単離体に感染させた。感染後、RNAを収集し、cDNAを作製し、各単離体由来の野生型LamC2(図27A)またはコドン最適化LamC2(図27B)の発現をqPCRにより決定した。12の単離体のうちの8つが、形質導入Vero細胞において様々なレベルで野生型ヒトLamC2を発現させることができた一方で、7つの単離体のうちの3つは、コドン最適化ヒトLamC2を発現させることができた。次に、ヒトLamC2を発現させるある特定の野生型単離体及びコドン最適化単離体の能力をウエスタンブロットにより試験した。ICP4補完Vero細胞を6ウェルプレートにプレーティングし、感染が完了するまで非力価測定ウイルス単離体に感染させた。Vero細胞のウェルを陰性対照として非感染のままにした。感染後、細胞を穏やかな掻爬により収集し、遠心分離して細胞ペレットを収集し、培養培地を吸引し、細胞ペレットをPBSで1回洗浄した。洗浄後、各細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する200μLのRIPA緩衝液中に再懸濁し、再懸濁液を5分毎に穏やかに撹拌しながら4℃で20分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を17,000×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、5%2−メルカプトメタノールを含有する4倍LDS還元試料緩衝液を各精製上清に添加した。その後、試料を10分間沸騰させた後、4〜20%トリス−グリシンポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動後、タンパク質をPVDF膜に移し、膜を5%乳/TBS中で30分間ブロックした。その後、一次ウサギ抗LamC2抗体(Abcam、カタログ番号ab96327)を、5%乳/TBS中1:1000希釈でPVDF膜に添加し、室温で一晩(約16時間)インキュベートした。その後、ブロットをTBSで3回洗浄し(各5分間)、次いで、5%乳/TBS中APコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG抗体(Sigma、カタログ番号A3687)で、室温で1時間染色した。その後、膜をTBSで3回洗浄し(各5分間)、BCIP/NBTを添加し、ブロットを室温で約10分間現像した。qPCRデータと一致して、9つ全ての試験したウイルス単離体も、コードされたヒトLamC2を発現させることができた(図27C)。
コドン最適化LamC2発現ウイルス単離体「LGA」を、ヒト細胞におけるさらなる試験のために選択した。不死化初代正常ケラチノサイトを、LGA単離体に0.3、1.0、または3.0の感染多重度(MOI)で48時間感染させた。非感染細胞(対照)及びmCherry発現ウイルス感染細胞を陰性対照として使用した。感染の48時間後にDNA及びRNAを不死化ケラチノサイトから抽出し、qPCR/qRT−PCRを行った(図28A〜B)。DNA50ng当たり検出されるウイルスゲノムコピーによって評価されるように、不死化ケラチノサイトにおけるLGA単離体において良好な用量応答が観察された(図28A)。興味深いことに、MOIを0.3から1.0に増加させた場合、用量応答が転写物レベルで観察されたが、MOIを1.0から3.0に増加させた場合、転写物レベルの追加の増加は観察されなかった(図28B)。感染ヒトケラチノサイトにおけるLamC2の発現も、ウエスタンブロットにより試験した。ウエスタンブロットを上述のように行った(一次ウサギ抗LamC2抗体(Abcam、カタログ番号ab96327)を使用した)。転写物分析と一致して、MOIを0.3から1.0に増加させた場合、用量応答がタンパク質レベルで観察されたが、1.0から3.0に増加させた場合には観察されなかった(図28C)。
最後に、単離体「LGA」がインビボで送達されたときにそのヒトラミニンを発現させることができるかを試験するために、ヒトLAMC2発現を、動物における皮内注射後に、qPCR、qRT−PCR、及び免疫蛍光により評価した。1×10PFUのPBS+10%グリセロール(ビヒクル)中に配合したLGAを、2匹のマウスの背面皮膚及び足蹠に皮内注射した。陰性対照とするために、ビヒクルのみの等価体積を1匹のマウスの背面皮膚に皮内投与した。本研究で処理したこれらの2匹の動物の注射部位の概略図を図29Aに提供する。
投与後72時間時点で、全厚8mmの生検を各処理部位から採取し、半分に分けた。各切片の半分を液体窒素中で急速凍結し、その後、qPCR分析及びqRT−PCR分析のために処理して、背面皮膚におけるLAMC2のDNAコピー数(図29B)及び転写物レベル(図29C)を定量化した。各生検の残りの半分を、免疫蛍光(IF)のためにOCTに包埋した。凍結切片におけるLAMC2発現は、抗ヒトLAMC2抗体(Abcam、カタログ番号ab96327)を使用した免疫蛍光分析により決定した。LGAから発現したヒトLAMC2が、天然ラミニン−332が見られる皮膚の領域に正しく局在したことを確認するために、背面皮膚試料にマウスラミニン−332(pKal)についての対比染色も行った。LGAの皮内投与により、マウス皮膚の形質導入の成功がもたらされ、コードされたヒト導入遺伝子を表皮の正しい層にロバストに発現させた。組織学的評価は、処理部位に炎症性浸潤を示さず、この療法の安全性を実証した。
まとめると、この実施例に示されるデータは、以下を実証する:(1)HSVベクターを首尾よく操作して、ヒトラミニンタンパク質(具体的には、ヒトラミニン−332のβまたはγサブユニット)をロバストに発現させることができた、(2)HSVベースのベクター(LGA)がインビボでヒトラミニン−332サブユニットを首尾よく送達することができた、及び(3)組換えヒトラミニン−332サブユニットが処理動物の表皮の適切な領域で発現され、それに局在した。

Claims (75)

  1. 第1の美容用タンパク質を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む、組換えヘルペスウイルスゲノム。
  2. 前記第1のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む、請求項1に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  3. 複製能を有する、請求項1または請求項2に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  4. 複製欠損である、請求項1または請求項2に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  5. 組換え単純ヘルペスウイルスゲノム、組換え水痘帯状疱疹ウイルスゲノム、組換えヒトサイトメガロウイルスゲノム、組換えヘルペスウイルス6Aゲノム、組換えヘルペスウイルス6Bゲノム、組換えヘルペスウイルス7ゲノム、組換えカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスゲノム、及びそれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  6. 組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  7. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)ゲノム、組換え単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)ゲノム、またはそれらの任意の誘導体である、請求項6に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  8. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)ゲノムである、請求項6または請求項7に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  9. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが不活性化変異を含む、請求項6〜8のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  10. 前記不活性化変異が単純ヘルペスウイルス遺伝子に存在する、請求項9に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  11. 前記不活性化変異が、前記単純ヘルペスウイルス遺伝子のコード配列の欠失である、請求項10に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  12. 前記単純ヘルペスウイルス遺伝子が、感染細胞タンパク質(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、チミジンキナーゼ(tk)、ロングユニーク領域(UL)41、及びUL55からなる群から選択される、請求項10または請求項11に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  13. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む、請求項12に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  14. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む、請求項12または請求項13に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  15. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、UL41遺伝子に不活性化変異を含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  16. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP0遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む、請求項12〜15のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  17. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP27遺伝子に不活性化変異を含む、請求項12〜16のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  18. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方内に前記第1のポリヌクレオチドを含む、請求項6〜17のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  19. 前記第1の美容用タンパク質が、第1のコラーゲンタンパク質、第1のフィブロネクチンタンパク質、第1のエラスチンタンパク質、第1のルミカンタンパク質、第1のビトロネクチンタンパク質、第1のビトロネクチン受容体タンパク質、第1のラミニンタンパク質、第1の神経調節タンパク質、及び第1のフィブリリンタンパク質からなる群から選択される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  20. 前記第1の美容用タンパク質が、配列番号15〜21及び53〜64からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  21. 前記第1の美容用タンパク質が構造的細胞外マトリックスタンパク質である、請求項1〜20のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  22. 前記第1のコラーゲンタンパク質がヒトコラーゲンタンパク質である、請求項19〜21のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  23. 前記第1のコラーゲンタンパク質が、コラーゲンアルファ−1(I)鎖ポリペプチド(COL1−1)、コラーゲンアルファ−2(I)鎖ポリペプチド(COL1−2)、コラーゲンアルファ−1(II)鎖ポリペプチド(COL2)、コラーゲンアルファ−1(III)鎖ポリペプチド(COL3)、コラーゲンアルファ−1(IV)鎖ポリペプチド(COL4−1)、コラーゲンアルファ−2(IV)鎖ポリペプチド(COL4−2)、コラーゲンアルファ−3(IV)鎖ポリペプチド(COL4−3)、コラーゲンアルファ−4(IV)鎖ポリペプチド(COL4−4)、コラーゲンアルファ−5(IV)鎖ポリペプチド(COL4−5)、コラーゲンアルファ−6(IV)鎖ポリペプチド(COL4−6)、コラーゲンアルファ−1(V)鎖ポリペプチド(COL5−1)、コラーゲンアルファ−2(V)鎖ポリペプチド(COL5−2)、コラーゲンアルファ−3(V)鎖ポリペプチド(COL5−3)、コラーゲンアルファ−1(VI)鎖ポリペプチド(COL6−1)、コラーゲンアルファ−2(VI)鎖ポリペプチド(COL6−2)、コラーゲンアルファ−3(VI)鎖ポリペプチド(COL6−3)、コラーゲンアルファ−4(VI)鎖ポリペプチド(COL6−4)、コラーゲンアルファ−5(VI)鎖ポリペプチド(COL6−5)、コラーゲンアルファ−6(VI)鎖ポリペプチド(COL6−6)、コラーゲンアルファ−1(VIII)鎖ポリペプチド(COL8)、コラーゲンアルファ−1(IX)鎖ポリペプチド(COL9−1)、コラーゲンアルファ−2(IX)鎖ポリペプチド(COL9−2)、コラーゲンアルファ−3(IX)鎖ポリペプチド(COL9−3)、コラーゲンアルファ−1(X)鎖ポリペプチド(COL10)、コラーゲンアルファ−1(XI)鎖ポリペプチド(COL11−1)、コラーゲンアルファ−2(XI)鎖ポリペプチド(COL11−2)、コラーゲンアルファ−1(XII)鎖ポリペプチド(COL12)、コラーゲンアルファ−1(XIII)鎖ポリペプチド(COL13)、コラーゲンアルファ−1(XIV)鎖ポリペプチド(COL14)、コラーゲンアルファ−1(XV)鎖ポリペプチド(COL15)、コラーゲンアルファ−1(XVI)鎖ポリペプチド(COL16)、コラーゲンアルファ−1(XVII)鎖ポリペプチド(COL17)、コラーゲンアルファ−1(XVIII)鎖ポリペプチド(COL18)、コラーゲンアルファ−1(XIX)鎖ポリペプチド(COL19)、コラーゲンアルファ−1(XX)鎖ポリペプチド(COL20)、コラーゲンアルファ−1(XXI)鎖ポリペプチド(COL21)、コラーゲンアルファ−1(XXII)鎖ポリペプチド(COL22)、コラーゲンアルファ−1(XXIII)鎖ポリペプチド(COL23)、コラーゲンアルファ−1(XXIV)鎖ポリペプチド(COL24)、コラーゲンアルファ−1(XXV)鎖ポリペプチド(COL25)、コラーゲンアルファ−1(XXVI)鎖ポリペプチド(COL26)、コラーゲンアルファ−1(XXVII)鎖ポリペプチド(COL27)、及びコラーゲンアルファ−1(XXVIII)鎖ポリペプチド(COL28)からなる群から選択される、請求項19〜22のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  24. 前記第1のコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、及びCOL17からなる群から選択される、請求項19〜23のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  25. 第1のヒトコラーゲンタンパク質が、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、請求項19〜24のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  26. 前記第1の美容用タンパク質がコラーゲンアルファ−1(VII)鎖ポリペプチド(COL7)ではない、請求項1〜25のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  27. 前記第1のポリペプチドが、前記第1の美容用タンパク質から本質的になるか、または前記第1の美容用タンパク質からなる、請求項1〜26のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  28. 前記第1のポリペプチドが、
    (a)前記第1の美容用タンパク質、
    (b)さらなる美容用タンパク質、及び
    (c)(a)を(b)に連結するリンカーポリペプチド
    を含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  29. 前記リンカーポリペプチドが切断可能なリンカーポリペプチドである、請求項28に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  30. 前記リンカーポリペプチドが、配列番号28〜31からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、請求項28または請求項29に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  31. 前記第1の美容用タンパク質と前記さらなる美容用タンパク質が異なる、請求項28〜30のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  32. 前記第1のポリヌクレオチドが、
    (a)前記第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、
    (b)追加の美容用タンパク質をコードする第2のORF、及び
    (c)(a)と(b)を分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)
    を含むポリシストロニックmRNAをコードする、請求項1〜31のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  33. 前記IRESをコードする核酸配列が、配列番号22または配列番号23から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、請求項32に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  34. 前記第1の美容用タンパク質と前記追加の美容用タンパク質が異なる、請求項32または請求項33に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  35. 第2の美容用タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  36. 前記第1の美容用タンパク質と前記第2の美容用タンパク質が異なる、請求項35に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  37. 標的細胞に導入された場合、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して減少した細胞毒性を有する、請求項1〜36のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  38. 前記標的細胞が表皮細胞及び/または真皮細胞である、請求項37に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  39. 前記標的細胞がヒト細胞である、請求項37または請求項38に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  40. 前記標的細胞が線維芽細胞である、請求項37〜39のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  41. 請求項1〜40のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムを含む、ヘルペスウイルス。
  42. 複製能を有する、請求項41に記載のヘルペスウイルス。
  43. 複製欠損である、請求項41に記載のヘルペスウイルス。
  44. 対応する野生型ヘルペスウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する、請求項41〜43のいずれか1項に記載のヘルペスウイルス。
  45. 単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス6A、ヘルペスウイルス6B、ヘルペスウイルス7、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスからなる群から選択される、請求項41〜44のいずれか1項に記載のヘルペスウイルス。
  46. 単純ヘルペスウイルスである、請求項41〜45のいずれか1項に記載のヘルペスウイルス。
  47. 前記単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)、またはそれらの任意の誘導体である、請求項46に記載のヘルペスウイルス。
  48. (a)請求項1〜40のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムまたは請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスと、
    (b)賦形剤と
    を含む、組成物。
  49. 無菌である、請求項48に記載の組成物。
  50. 局所、経皮、皮下、皮内、経口、鼻腔内、気管内、舌下、口腔、直腸、膣内、尿道、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部、または皮膚上投与に好適である、請求項48または請求項49に記載の組成物。
  51. 皮内投与に好適である、請求項48〜50のいずれか1項に記載の組成物。
  52. 表面注射に好適である、請求項48〜51のいずれか1項に記載の組成物。
  53. 美容用組成物である、請求項48〜52のいずれか1項に記載の組成物。
  54. スキンケア製品である、請求項48〜53のいずれか1項に記載の組成物。
  55. 薬剤として使用するための、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物。
  56. 治療に使用するための、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物。
  57. 皮膚科学的老化の1つ以上の兆候もしくは症状を治療するための薬剤の製造における、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の使用。
  58. 対象における1つ以上の皮膚細胞外マトリックスタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  59. 対象における1つ以上のコラーゲンタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  60. 対象の軟組織を強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  61. 前記組成物が前記対象の軟組織に注射される、請求項60に記載の方法。
  62. 皮膚の状態、質、及び/または外観の改善を必要とする対象における皮膚の状態、質、及び/または外観を改善する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  63. 前記組成物が、日光による損傷もしくは他の紫外線曝露、粗いきめ、皮膚のたるみ、しわ、またはそれらの任意の組み合わせの、1つ以上の部位に投与される、請求項62に記載の方法。
  64. 皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観の減少を必要とする対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観を減少させる方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  65. 前記皮膚における前記1つ以上の表面陥凹が、鼻唇溝、目尻のしわ、眉間しわ線、額のしわ、瘢痕、眉間のしわ、眉毛下垂、眼頬溝(tear trough)、鼻頬線(nasojugal line)、バニーライン、頬/顔面中央下垂、マリオネットライン、ポピーえくぼ形成(poppy dimpling)、笑線、笑いじわ、顎のひだ、首のしわ、広頸筋帯、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項64に記載の方法。
  66. 皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つの増加及び/または改善を必要とする対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つを増加させる及び/または改善する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  67. 前記対象の皮膚が、老化している皮膚である、請求項62〜66のいずれか1項に記載の方法。
  68. 前記対象の皮膚が、紫外線光への曝露により損傷している、請求項62〜67のいずれか1項に記載の方法。
  69. 前記対象の皮膚がしわになっている、請求項62〜68のいずれか1項に記載の方法。
  70. 1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減を必要とする対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候を軽減する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  71. 前記1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減が、(a)細かい線及び/またはしわの治療、減少、及び/または予防、(b)皮膚の毛穴径の減少、(c)皮膚の厚み、ふっくら感、及び/または張り感の改善、(d)皮膚の滑らかさ、しなやかさ、及び/または柔らかさの改善、(e)皮膚の色調、輝き、及び/または透明度の改善、(f)プロコラーゲン及び/またはコラーゲン産生の改善、(g)皮膚のきめの改善及び/または再度きめを整えること(retexturization)の促進、(h)皮膚輪郭の外観の改善、(i)皮膚のつや及び/または明るさの復元、(j)老化及び/または閉経により減退した皮膚外観の改善、(k)皮膚保湿の改善、(l)皮膚の弾性及び/または弾力性の増加、(m)治療、軽減、及び/または予防もしくは皮膚のたるみ、(n)皮膚の締まりの改善、(o)色素斑、斑のある皮膚、及び/または瘢痕の減少、(p)光回折または反射による皮膚の光学的特性の改善、または(q)それらの任意の組み合わせによって示される、請求項70に記載の方法。
  72. 前記対象がヒトである、請求項58〜71のいずれか1項に記載の方法。
  73. 前記ヘルペスウイルスまたは前記組成物が、前記対象に、局所的に、経皮的に、皮下的に、皮膚上に、皮内に、経口的に、舌下に、口腔内に、直腸に、膣に、尿道内に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、骨内に、心臓内に、腹腔内に、経粘膜的に、硝子体内に、網膜下に、関節内に、関節周囲に、局部的に、または吸入を介して投与される、請求項58〜72のいずれか1項に記載の方法。
  74. 前記ヘルペスウイルスまたは前記組成物が、前記対象に皮内投与される、請求項58〜73のいずれか1項に記載の方法。
  75. 前記ヘルペスウイルスまたは前記組成物が、表面注射によって投与される、請求項58〜74のいずれか1項に記載の方法。
JP2021509722A 2018-04-27 2019-04-26 審美的用途のための美容用タンパク質をコードする組換え核酸 Pending JP2021521894A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024018447A JP2024056823A (ja) 2018-04-27 2024-02-09 審美的用途のための美容用タンパク質をコードする組換え核酸

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862663476P 2018-04-27 2018-04-27
US62/663,476 2018-04-27
PCT/US2019/029422 WO2019210219A1 (en) 2018-04-27 2019-04-26 Recombinant nucleic acids encoding cosmetic protein(s) for aesthetic applications

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024018447A Division JP2024056823A (ja) 2018-04-27 2024-02-09 審美的用途のための美容用タンパク質をコードする組換え核酸

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2021521894A true JP2021521894A (ja) 2021-08-30
JPWO2019210219A5 JPWO2019210219A5 (ja) 2022-05-06

Family

ID=68291937

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021509722A Pending JP2021521894A (ja) 2018-04-27 2019-04-26 審美的用途のための美容用タンパク質をコードする組換え核酸
JP2024018447A Pending JP2024056823A (ja) 2018-04-27 2024-02-09 審美的用途のための美容用タンパク質をコードする組換え核酸

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024018447A Pending JP2024056823A (ja) 2018-04-27 2024-02-09 審美的用途のための美容用タンパク質をコードする組換え核酸

Country Status (13)

Country Link
US (2) US10786438B2 (ja)
EP (1) EP3810149A4 (ja)
JP (2) JP2021521894A (ja)
KR (1) KR20210005141A (ja)
CN (1) CN112041434A (ja)
AU (2) AU2019260757B2 (ja)
BR (1) BR112020021804A2 (ja)
CA (1) CA3095187A1 (ja)
CL (2) CL2020002755A1 (ja)
CO (1) CO2020013588A2 (ja)
MX (1) MX2020011257A (ja)
SG (1) SG11202009895TA (ja)
WO (1) WO2019210219A1 (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3377637T3 (da) 2016-04-08 2020-05-18 Krystal Biotech Inc Sammensætninger til anvendelse i fremgangsmåder til behandling af sår, lidelser og sygdomme i huden
GB201607901D0 (en) * 2016-05-05 2016-06-22 Ipsen Biopharm Ltd Chimeric neurotoxins
US11707510B2 (en) * 2018-02-16 2023-07-25 Preclinics Discovery Gmbh Nucleic acid-based botulinum neurotoxin for therapeutic use
CA3094345A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of autosomal recessive congenital ichthyosis
JP2022519734A (ja) 2019-02-08 2022-03-24 クリスタル バイオテック インコーポレイテッド Cftrポリペプチドを送達するための組成物及び方法
US20210189427A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for gene delivery to the airways and/or lungs
CN113046331B (zh) * 2020-03-05 2022-09-13 北京唯源立康生物科技股份有限公司 非复制性重组疱疹病毒及其用途
CN111423516B (zh) * 2020-04-01 2022-02-11 广州佰斯伦医疗器械有限公司 一种蛋白及其在创口修复及抑菌中的应用
CN112746076B (zh) * 2020-12-28 2023-05-12 中吉智药(南京)生物技术有限公司 一种密码子优化的col7a1基因及慢病毒和应用
JP2024513826A (ja) 2021-04-02 2024-03-27 クリスタル バイオテック インコーポレイテッド がん治療のためのウイルスベクター
CN114195884B (zh) * 2021-10-27 2024-03-29 禾美生物科技(浙江)有限公司 一种重组人源胶原蛋白及其制备方法
CN114656572A (zh) * 2022-02-25 2022-06-24 北京大学第一医院 一种bp180抗体快速检测试剂盒及其制备方法
CN117143223B (zh) * 2022-08-23 2024-03-08 山西锦波生物医药股份有限公司 一种生物合成人体结构性材料的制备方法
CN117230103B (zh) * 2023-09-25 2024-04-19 爱光生物医药(南昌)有限公司 17型人源化胶原蛋白及其蛋白支架、填充材料及应用
CN117402235A (zh) * 2023-10-25 2024-01-16 山西锦波生物医药股份有限公司 生物合成人体结构性材料iv型胶原蛋白的制备方法
CN117866077B (zh) * 2024-03-13 2024-05-28 北京未名拾光生物技术有限公司 重组xvii型胶原蛋白及其表达体系

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008174459A (ja) * 2007-01-16 2008-07-31 Maruzen Pharmaceut Co Ltd 抗老化剤、並びに皮膚外用剤及び美容用飲食品
JP2015517995A (ja) * 2012-04-02 2015-06-25 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. 美容タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド
JP2015221759A (ja) * 2014-05-22 2015-12-10 株式会社東洋新薬 コラーゲン合成促進剤、ヒアルロン酸合成促進剤及びセラミド合成促進剤
JP2017510542A (ja) * 2014-01-31 2017-04-13 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 核酸生成及び送達のための方法及び製品
WO2017176336A1 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Krystal Biotech, LLC Compositions and methods for the treatment of wounds, disorders, and diseases of the skin

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5658724A (en) 1992-07-31 1997-08-19 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus strains deficient for the essential immediate early genes ICP4 and ICP27 and methods for their production, growth and use
CA2285937C (en) 1997-04-10 2010-12-14 Frederick L. Hall Modified proteins which bind extracellular matrix components
US5998174A (en) 1997-05-12 1999-12-07 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Multigene vectors
GB9715085D0 (en) 1997-07-18 1997-09-24 Jahoda Amanda J Gene therapy vehicle
US6106826A (en) 1997-12-17 2000-08-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Replication competent, avirulent Herpes simplex virus as a vector for neural and ocular gene therapy
GB9801930D0 (en) 1998-01-29 1998-03-25 Univ London Mutant herpes simplex viruses and uses thereof
AU4680699A (en) 1998-06-12 1999-12-30 Aradigm Corporation Methods of delivering aerosolized polynucleotides to the respiratory tract
EP1141338A4 (en) 1998-12-31 2002-09-25 Arch Dev Corp RECOMBINANT HERPES SIMPLEX VIRUS USEFUL IN THE TREATMENT OF NEOPLASTIC DISEASES
BR0015507A (pt) * 1999-11-12 2002-10-22 Fibrogen Inc Gelatinas e colágenos animais
GB9930418D0 (en) 1999-12-22 2000-02-16 Neurovex Ltd Replication incompetent herpes virus vectors
US6846670B2 (en) 2000-11-28 2005-01-25 The University Of Chicago Genetically engineered herpes virus for the treatment of cardiovascular disease
US8703703B2 (en) 2006-12-20 2014-04-22 University Of Central Flordia Research Foundation, Inc. MCPIP as wound therapy
US20080299182A1 (en) 2007-03-01 2008-12-04 Shuyuan Zhang Methods and formulations for topical gene therapy
ES2590461T3 (es) 2010-07-02 2016-11-22 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Oncológicas Carlos Iii La transcriptasa inversa de la telomerasa como protección frente al envejecimiento
CN102212559B (zh) 2011-04-14 2014-04-09 郑州威瑞生物技术有限公司 一种重组的hsv扩增子载体及其用途
EP3279324B1 (en) 2011-10-11 2021-02-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Exon skipping therapy for dystrophic epidermolysis bullosa
GB201202561D0 (en) 2012-02-15 2012-03-28 Univ Dundee Treatment of skin disorders
NZ701949A (en) 2012-05-18 2016-07-29 Otago Innovation Ltd Combination treatments and compositions for wound healing
ES2750550T3 (es) 2013-03-01 2020-03-26 Univ Minnesota Corrección de gen a base de TALEN
KR102649583B1 (ko) 2013-07-17 2024-03-20 유니버시티 오브 피츠버그-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 효율적인 유전자 전달 적용을 위한 비독성 hsv 벡터 및 이의 생산을 위한 보완 세포
FR3021541B1 (fr) 2014-05-28 2017-10-27 Oreal Procede cosmetique pour attenuer les rides
WO2016128783A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Allergan Industrie Sas Compositions and methods for improving skin appearance
BR122019004464B1 (pt) 2015-03-05 2021-05-11 Avon Products, Inc método para diminuir sinais dermatológicos de envelhecimento em pele humana
EP4212169A1 (en) 2016-03-25 2023-07-19 PeriphaGen, Inc. High-transducing hsv vectors
MA45492A (fr) 2016-06-23 2019-05-01 Hopitaux Paris Assist Publique Vecteurs viraux pour le traitement de l'hyperactivité vésicale neurogène
CA3094345A1 (en) * 2018-04-12 2019-10-17 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of autosomal recessive congenital ichthyosis

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008174459A (ja) * 2007-01-16 2008-07-31 Maruzen Pharmaceut Co Ltd 抗老化剤、並びに皮膚外用剤及び美容用飲食品
JP2015517995A (ja) * 2012-04-02 2015-06-25 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. 美容タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド
JP2017510542A (ja) * 2014-01-31 2017-04-13 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 核酸生成及び送達のための方法及び製品
JP2015221759A (ja) * 2014-05-22 2015-12-10 株式会社東洋新薬 コラーゲン合成促進剤、ヒアルロン酸合成促進剤及びセラミド合成促進剤
WO2017176336A1 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Krystal Biotech, LLC Compositions and methods for the treatment of wounds, disorders, and diseases of the skin

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019260757B2 (en) 2023-09-28
EP3810149A4 (en) 2022-08-24
MX2020011257A (es) 2021-01-15
CA3095187A1 (en) 2019-10-31
CL2023001338A1 (es) 2023-10-20
US10786438B2 (en) 2020-09-29
CL2020002755A1 (es) 2021-01-29
AU2023285844A1 (en) 2024-01-25
US20210045988A1 (en) 2021-02-18
WO2019210219A1 (en) 2019-10-31
EP3810149A1 (en) 2021-04-28
KR20210005141A (ko) 2021-01-13
CO2020013588A2 (es) 2020-11-10
SG11202009895TA (en) 2020-11-27
BR112020021804A2 (pt) 2021-02-23
CN112041434A (zh) 2020-12-04
AU2019260757A1 (en) 2020-12-03
US20190328644A1 (en) 2019-10-31
JP2024056823A (ja) 2024-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2021521894A (ja) 審美的用途のための美容用タンパク質をコードする組換え核酸
JP7480105B2 (ja) 皮膚の創傷、障害、及び疾患を処置するための組成物及び方法
US11717547B2 (en) Compositions and methods for the treatment of autosomal recessive congenital ichthyosis
US20230118087A1 (en) Compositions and methods for the treatment of congenital ichthyoses
JP2022502026A (ja) ネザートン症候群の治療のための組成物及び方法
US20210395775A1 (en) Compositions and methods for the treatment of skin diseases
NZ746213B2 (en) Compositions and methods for the treatment of wounds, disorders, and diseases of the skin

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201118

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210202

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220422

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220422

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20230317

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230320

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230619

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230719

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20230807

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230920

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20231218

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240209

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20240502