JP2021521894A - 審美的用途のための美容用タンパク質をコードする組換え核酸 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図23B
Description
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、2018年4月27日に出願された米国仮出願第62/663,476号の優先権利益を主張する。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる:配列表のコンピュータ可読形態(CRF)(ファイル名:761342000640SEQLIST.txt、記録日:2019年4月26日、サイズ:437KB)。
本開示は、部分的には、1つ以上の美容用タンパク質(例えば、1つ以上のヒトコラーゲンタンパク質)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸、組換え核酸を含むウイルス、組換え核酸及び/またはウイルスを含む組成物(例えば、美容用配合物)、それらの使用法、ならびにそれらの製品またはキットに関する。
皮膚は、人体の全ての臓器と同様に、時間の経過とともに連続的かつ多くの場合累積的な変化を受ける。皮膚の老化は、皮膚内の固有の変化、皮膚に作用する重力及び顔面筋肉の影響、軟組織の喪失またはシフト、ならびに組織弾性の喪失を含む多くの要因の結果として生じる。興味深いことに、皮膚の「老化した」表現型は、環境要因、最も顕著には、(例えば、太陽からの)紫外線照射への長期曝露によって加速され得る。臨床的には、皮膚の老化した表現型は、しわになっている、たるんでいる、及び/または一般的にその若い対応物よりも弾性及び弾力性が低いといわれ得るが、この表現型内の変動は、自然な経時的老化と光による老化との間に存在する。
これら及び他の要求を満たすために、審美的/美容的用途(例えば、しわの治療)のためのウイルス(例えば、ヘルペスウイルス)、組成物、配合物、薬剤、及び/または方法における使用のための1つ以上の美容用タンパク質をコードする組換え核酸(例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム)が本明細書に提供される。本発明者らは、本明細書に記載の組換え弱毒化ウイルスが、(1)ヒト表皮/真皮細胞に効果的に形質導入することができ、(2)コードされた外因性ヒトコラーゲン(mRNA及びタンパク質)を首尾よく発現させることができること、次いで、このタンパク質が皮膚等価物器官型培養物中の適切な領域に局在することができることを示した(例えば、実施例2を参照のこと)。さらに、本発明者らは、本明細書に記載のウイルスが著しい宿主細胞毒性なしに局所的または皮内のいずれかで首尾よく投与され得ることを示し、これらのウイルスから発現されたヒトコラーゲンが皮膚への観察可能な損傷なしにインビボ投与後に皮膚ECMの適切な領域に局在することを可能にした(例えば、実施例3及び実施例7を参照のこと)。加えて、本発明者らは、ヒトコラーゲンを発現させるウイルスを構築するために複数の異なるHSV骨格を使用することができること(例えば、実施例2を参照のこと)、単一の組換えゲノムから2つ以上のヒトコラーゲンタンパク質を首尾よく発現させるために複数の戦略を用いることができること(例えば、実施例5を参照のこと)、及び経時的なまたは紫外線により誘発された皮膚老化の複数の関連するインビトロ及びインビボモデルにおいて候補ウイルスがヒトコラーゲンタンパク質を首尾よく発現させることができること(例えば、実施例6及び実施例7を参照のこと)を示した。さらに、本発明者らは、本明細書に記載のウイルスが、インビトロ及びインビボの両方で他の美容用タンパク質(例えば、ヒトラミニン)を発現させるように首尾よく操作され得、これらのタンパク質が皮膚ECMの適切な領域に局在する(例えば、実施例8を参照のこと)ことを示した。理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載のデータは、本開示の組換え核酸及び/またはウイルスが、美容用タンパク質(例えば、ヒトコラーゲン1及びヒトコラーゲン3等のヒトコラーゲンタンパク質)を送達するための新規の手段、具体的には、審美的用途において天然のヒト皮膚ECMタンパク質を補充または置き換えるための(例えば、年齢または光により誘発されたしわの外観を減少させるための)新規の手段を構成し得るという強力な証拠を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、1つ以上の美容用タンパク質をコードする組換え核酸(例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム)、ならびに1つ以上の美容用タンパク質を皮膚に、例えば、皮膚上に、皮膚中に、及び/または皮膚を通じて(例えば、皮膚ECMに)送達するためのウイルス(例えば、ヘルペスウイルス中)、組成物、配合物、薬剤、及び/または方法におけるこれらの組換え核酸の使用に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、1つ以上の美容用タンパク質をコードする組換え核酸(例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム)、ならびに1つ以上の皮膚ECMタンパク質(例えば、1つ以上のコラーゲンタンパク質)を増加させる、増強する、及び/または補充するためのウイルス(例えば、ヘルペスウイルス中)、組成物、配合物、薬剤、及び/または方法におけるこれらの組換え核酸の使用に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、1つ以上の美容用タンパク質をコードする組換え核酸(例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム)、ならびに(例えば、1つ以上の皮膚科学的老化兆候を軽減するための)審美的状況でのウイルス(例えば、ヘルペスウイルス中)、組成物、配合物、薬剤、及び/または方法におけるこれらの組換え核酸の使用に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、組換えヘルペスウイルスベクターを含む組成物、ならびに組換えヘルペスウイルスベクターを哺乳動物の皮膚上に、その中に、及び/またはそれを通じて送達することを含む方法に関し、組換えヘルペスウイルスベクターは、哺乳動物細胞で作動可能なプロモーターと、哺乳類皮膚において美容効果を達成するために発現される異種核酸を含む。異種核酸は、哺乳動物の表皮、真皮、または皮下組織を、組換えヘルペスウイルスベクターを含む組成物と接触させることを含む、哺乳動物の哺乳類標的皮膚細胞に、組換えヘルペスウイルスベクターが、表皮、真皮、または皮下組織上に、その中に、及び/またはそれを通じて輸送され、それが発現される標的皮膚細胞に導入される条件下で送達され得る。理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または配合物のうちの1つ以上を個体に投与することにより、個体における機能的な皮膚ECMタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン)の産生の増加が可能になると考えられる。さらに、理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び/または配合物のうちの1つ以上を投与することによって個体における美容用タンパク質のレベルを増加させること、増強すること、及び/または補充することにより、(1)軟組織の強化、増強、及び/または補充、(2)皮膚の質、状態、及び/または外観の改善、(3)皮膚における1つ以上の表面陥凹(例えば、しわ)の減少、(4)皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、及び/または張りの改善、及び/または(5)1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減のうちの少なくとも1つがもたらされると考えられる。最終的に、理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、組成物、及び方法により、審美的環境において機能的美容用タンパク質を送達するための新規戦略が提供されると考えられる。
本明細書に記載または参照される技法及び手順は、一般に、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.,(2003))、the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995)),Harlow and Lane,eds.(1988)、Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)、Methods in Molecular Biology,Humana Press、Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press、Animal Cell Culture(R.I.Freshney),ed.,1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press、Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993−8)J.Wiley and Sons、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)、PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)、Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)に記載の広く利用されている方法論等の従来の方法論を使用して、当業者により十分に理解されており、一般に用いられている。
本開示を詳細に説明する前に、本開示が特定の組成物または生物学的系に限定されず、これらが言うまでもなく変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
本開示のある特定の態様は、美容用タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチド(例えば、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、10個以上等)を含む組換え核酸(例えば、単離された組換え核酸)に関する。例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン/ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン、追加の皮膚ECMタンパク質等を含む、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の任意の好適な美容用タンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリリン等)である。いくつかの実施形態では、美容用タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質)である。
コラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、コラーゲン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトコラーゲン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:1277、1278、1281、1282、1284、1291、1294、1308等を参照のこと)、マウスコラーゲン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:12842、12843、12825、12826、12827、12833、12836、12821等を参照のこと)、チンパンジーコラーゲン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:104001053、455117、459815、452689、452661、450204、101056895、101058306等を参照のこと)、ラットコラーゲン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:29393、84352、84032、290905、306628、294337、301012、294027等を参照のこと)、ウサギコラーゲン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100347598、100008997、100009177、100358256、100358522、100343947、100356561、100339335等を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のコラーゲン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、BLAST(登録商標)blastn suite等の核酸配列アラインメントプログラムの使用を含む、追加の種由来のコラーゲン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のコラーゲン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、フィブロネクチン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトフィブロネクチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:2335を参照のこと)、マウスフィブロネクチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:14268を参照のこと)、チンパンジーフィブロネクチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:459926を参照のこと)、ラットフィブロネクチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:25661を参照のこと)、ウサギフィブロネクチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100328589を参照のこと)を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のフィブロネクチン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のフィブロネクチン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブロネクチン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブロネクチン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、エラスチン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトエラスチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:2006を参照のこと)、マウスエラスチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:13717を参照のこと)、チンパンジーエラスチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:463943を参照のこと)、ラットエラスチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:25043を参照のこと)、ウサギエラスチン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100344271を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のエラスチン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のエラスチン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のエラスチン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のエラスチン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ルミカン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトルミカン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:4060を参照のこと)、マウスルミカン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:17022を参照のこと)、チンパンジールミカン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:452119を参照のこと)、ラットルミカン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:81682を参照のこと)、ウサギルミカン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100008665を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のルミカン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のルミカン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のルミカン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のルミカン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:7448及び3685を参照のこと)、マウスビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:22370及び16410を参照のこと)、チンパンジービトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:738261及び459807を参照のこと)、ラットビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:29169及び257645を参照のこと)、ウサギビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100009128及び100008956を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ラミニン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトラミニン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:284217、3908、3909、3910、3911、3912、3913、3914、3915、3918、及び10319を参照のこと)、マウスラミニン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:16774、16780、及び16782を参照のこと)、チンパンジーラミニン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:455339、469668、及び457571を参照のこと)、ラットラミニン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:307582、305078、及び192362を参照のこと)、ウサギラミニン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100346886及び100342905を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のラミニン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のラミニン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のラミニン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のラミニン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、神経調節遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、クロストリジウム・ボツリナム(clostridium botulinum)神経調節遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:5185061及び39483740を参照のこと)を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意の神経調節遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来の神経調節遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の神経調節遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の神経調節遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、フィブリリン遺伝子のコード配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトフィブリリン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:2200、2201、及び84467を参照のこと)、マウスフィブリリン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:14118及び14119を参照のこと)、チンパンジーフィブリリン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:453411、471621、及び455669を参照のこと)、ラットフィブリリン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:83727及び689008を参照のこと)、ウサギフィブリリン遺伝子(例えば、NCBI遺伝子ID:100350931、100357126、及び100359336を参照のこと)を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のフィブリリン遺伝子(その任意のアイソフォームを含む)のコード配列は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のフィブリリン遺伝子ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブリリン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブリリン遺伝子(及び/またはそのコード配列)のうちのいずれかのコドン最適化バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1〜14または35〜52から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)をコードする本開示のポリヌクレオチドは、配列番号1〜14または35〜52から選択される配列を含む。
コラーゲンタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、全長コラーゲンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトコラーゲンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P02452、P08123、P02461、P02462、P08572、P12109、Q02388、Q9UMD9等を参照のこと)、マウスコラーゲンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P11087、Q01149、P08121、P02463、P08122、Q04857、Q63870、Q07563等を参照のこと)、チンパンジーコラーゲンタンパク質(例えば、UniProt受入番号A0A2I3SM98、A0A2J8L483、H2QJ46、K7C8P4、K7C8W0、A0A2J8M8U9、H2QMJ5、H2Q2J4等を参照のこと)、ラットコラーゲンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P02454、P02466、P13941、P02466、F1M6Q3、D3ZUL3、D3ZE04、D3ZE04等を参照のこと)、ウサギコラーゲンタンパク質(例えば、UniProt受入番号G1T4A5、Q28668、G1T8J0、G1U9R7、G1T548、G1T380、G1T548等を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のコラーゲンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、BLAST(登録商標)blastp suiteまたはOrthoDB等のアミノ酸配列アラインメントプログラムの使用を含む、追加の種由来のコラーゲンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のコラーゲンポリペプチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のコラーゲンポリペプチドのうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、全長フィブロネクチンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトフィブロネクチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P02751を参照のこと)、マウスフィブロネクチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P11276を参照のこと)、チンパンジーフィブロネクチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P11276を参照のこと)、ラットフィブロネクチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P04937を参照のこと)、ウサギフィブロネクチンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P04937を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のフィブロネクチンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のフィブロネクチンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のフィブロネクチンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブロネクチンタンパク質のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
細胞外マトリックス中の弾性繊維は、組織に弾性特性を与える。弾性繊維は、概して、2つの形態学的に異なる成分、成熟エラスチン繊維と、主にフィブリリンを含有し、かつミクロフィブリル関連糖タンパク質(MAGP)、フィブリリン、及びエラスチン−ミクロフィブリル界面局在化タンパク質(EMILIN)等のさらなるタンパク質と会合しているクロフィブリルとを含有する。エラスチン及びその可溶性前駆体トロポエラスチンは、体内の主要な構造タンパク質に属する。
いくつかの実施形態では、本開示は、全長ルミカンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトルミカンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P51884を参照のこと)、マウスルミカンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P51885を参照のこと)、チンパンジールミカンタンパク質(例えば、UniProt受入番号H2Q6L3を参照のこと)、ラットルミカンタンパク質(例えば、UniProt受入番号H2Q6L3を参照のこと)、ウサギルミカンタンパク質(例えば、UniProt受入番号O46379を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のルミカンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のルミカンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のルミカンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のルミカンタンパク質のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、全長ビトロネクチンもしくはビトロネクチン受容体タンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質(例えば、UniProt受入番号P04004及びP06756を参照のこと)、マウスビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質(例えば、UniProt受入番号P29788及びP43406を参照のこと)、チンパンジービトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質(例えば、UniProt受入番号H2QCH3及びH2R6C3を参照のこと)、ラットビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質(例えば、UniProt受入番号Q7TQ11を参照のこと)、ウサギビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質(例えば、UniProt受入番号P22458を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のビトロネクチンまたはビトロネクチン受容体タンパク質のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、全長ラミニンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトラミニンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P25391、P24043、Q16787、Q16363、O15230、P07942、P55268、Q13751、P11047、Q13753、及びQ9Y6N6を参照のこと)、マウスラミニンタンパク質(例えば、UniProt受入番号Q61789、Q61087、及びQ61092を参照のこと)、チンパンジーラミニンタンパク質(例えば、UniProt受入番号H2QEC7、H2R041、及びH2Q0R2を参照のこと)、ラットラミニンタンパク質(例えば、UniProt受入番号D3ZN05、F1LPI5、及びF1LRH4を参照のこと)、ウサギラミニンタンパク質(例えば、UniProt受入番号G1SY40及びA0A0B5JSH0を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のラミニンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のラミニンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のラミニンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のラミニンタンパク質のうちのいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、全長神経調節タンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、クロストリジウム・ボツリナムタンパク質(例えば、UniProt受入番号P0DPI0、Q45894、P0DPI1、P10844、及びB1INP5を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意の神経調節タンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来の神経調節物質タンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示の神経調節タンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のいずれかの神経調節タンパク質の配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、全長フィブリリンタンパク質またはその任意のアイソフォームもしくは部分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトフィブリリンタンパク質(例えば、UniProt受入番号P35555、P35556、及びQ75N90を参照のこと)、マウスフィブリリンタンパク質(例えば、UniProt受入番号Q61554及びQ61555を参照のこと)、チンパンジーフィブリリンタンパク質(例えば、UniProt受入番号A0A2I3RTE4及びK7CZX0を参照のこと)、ラットフィブリリンタンパク質(例えば、UniProt受入番号G3V9M6及びF1M5Q4を参照のこと)、ウサギフィブリリンタンパク質(例えば、UniProt受入番号G1SKM2、G1SUS5、及びG1T1H4を参照のこと)等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な種由来の任意のフィブリリンタンパク質は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。追加の種由来のフィブリリンタンパク質ホモログ/オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示のフィブリリンタンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のフィブリリンタンパク質のいずれかの配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)は、配列番号15〜21または53〜64から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の1つ以上の美容用タンパク質(例えば、第1の美容用タンパク質、さらなる美容用タンパク質、追加の美容用タンパク質、及び/または第2の美容用タンパク質)は、配列番号15〜21または53〜64から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、第1の美容用タンパク質を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。第1の美容用タンパク質は、例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン/ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン等を含む、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の美容用タンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリリン等)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質)である。
いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1の美容用タンパク質を含むキメラポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは、第1の美容用タンパク質及びさらなる美容用タンパク質を含むキメラポリペプチドである。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、第1の美容用タンパク質とさらなる美容用タンパク質を連結するリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、n末端からc末端の方向に、第1の美容用タンパク質−リンカーポリペプチド−さらなる美容用タンパク質、を含む。例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン/ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン等を含む、第1の美容用タンパク質及び/またはさらなる美容用タンパク質は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の美容用タンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質及び/またはさらなる美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリリン等)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質及び/またはさらなる美容用タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質とさらなる美容用タンパク質は同じである。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質とさらなる美容用タンパク質は異なる。
いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、ポリシストロニックmRNAをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックmRNAは、第1のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、(1)前記第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、及び(2)追加の美容用タンパク質をコードする第2のオープンリーディングフレーム(ORF)を含むポリシストロニックmRNAをコードする。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックmRNAは、第1のORFと第2のORFを分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックmRNAは、5’から3’の方向に、第1のポリペプチドをコードする第1のORF−IRES−追加の美容用タンパク質をコードする第2のORF、を含む。第1のポリペプチドは、本明細書に記載の第1のポリペプチドのうちのいずれかであり得る。追加の美容用タンパク質は、例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン/ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン等を含む、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の美容用タンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、追加の美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリリン等)である。いくつかの実施形態では、追加の美容用タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質)である。
いくつかの実施形態では、本開示は、第2の美容用タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む組換え核酸に関する。第2の美容用タンパク質は、例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン/ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン等を含む、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の美容用タンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、第2の美容用タンパク質は、構造的細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリリン等)である。いくつかの実施形態では、第2の美容用タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質(例えば、ヒトコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはラミニンタンパク質)である。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質と第2の美容用タンパク質は同じである。いくつかの実施形態では、第1の美容用タンパク質と第2の美容用タンパク質は異なる。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第2のポリヌクレオチドの1つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第2のポリヌクレオチドの2つ以上(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、10個以上等)のコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第2のポリヌクレオチドの2つのコピーを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれか1つ以上を含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの1つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの2つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの1つのコピー及び第2のポリヌクレオチドの1つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの1つのコピー及び第2のポリヌクレオチドの2つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの2つのコピー及び第2のポリヌクレオチドの1つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、第1のポリヌクレオチドの2つのコピー及び第2のポリヌクレオチドの2つのコピーを含む。
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び/または組換え核酸のうちのいずれかを含むウイルスに関する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、対象(例えば、ヒト)の1つ以上の標的細胞に感染することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ポリヌクレオチド及び/または組換え核酸を対象(例えば、ヒト対象)の1つ以上の標的細胞に送達するのに好適である。いくつかの実施形態では、1つ以上の標的細胞は、1つ以上のヒト細胞である。いくつかの実施形態では、1つ以上の標的細胞は、皮膚の1つ以上の細胞(例えば、表皮、真皮、及び/または皮下の1つ以上の細胞)である。いくつかの実施形態では、1つ以上の細胞は、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、マスト細胞、線維芽細胞、及び/または脂肪細胞から選択される。いくつかの実施形態では、1つ以上の細胞は、ケラチノサイトである。いくつかの実施形態では、1つ以上の細胞は、角質層、顆粒層、有棘層、基底層、及び/または基底膜に存在する。いくつかの実施形態では、1つ以上の標的細胞は、1つ以上の表皮細胞である。
本開示の特定の態様は、組換え核酸(例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム)及び/またはウイルス(例えば、本明細書に記載の組換えゲノムを含むヘルペスウイルス(組換え単純ヘルペスウイルスゲノムを含む単純ヘルペスウイルス等)のうちのいずれかと、賦形剤または担体(例えば、薬学的に許容される賦形剤または担体)とを含む組成物及び配合物(例えば、薬学的組成物及び配合物)に関する。いくつかの実施形態では、組成物または配合物は、美容用組成物または配合物(例えば、スキンケア製品)である。
本開示のある特定の態様は、対象(例えば、対象の1つ以上の細胞)における1つ以上の皮膚細胞外マトリックスタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物のうちのいずれかを投与することを含む、前記方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載の組換え核酸のうちのいずれかを含む1つ以上の宿主細胞に関する。例えば、真正細菌を含む原核細胞、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、エシェリキア属(Escherichia)(例えば、大腸菌(E.coli))、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルミニア属(Erminia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ属(Salmonella)(例えば、S.チフィリウム(S.typhimurium))、セラシア属(Serratia)(例えば、S.マルセセンス(S.marcescans))、及びシゲラ属(Shigella)等の腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、ならびにB.サブティリス(B.subtilis)及びB.リケニフォルミス(B.licheniformis)等の桿菌、真菌細胞(例えば、S.セレビシエ(S.cerevisiae))、昆虫細胞(例えば、S2細胞等)、及び哺乳類細胞(例えば、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS−7、ATCC CRL 1651)、ヒト胚腎臓株(懸濁培養液中での増殖のためにサブクローニングされた293または293細胞)、ベビーハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL 10)、マウスセルトリ細胞(TM4)、サル腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)、アフリカミドリザル腎細胞(VERO−76、ATCC CRL−1587)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2)、イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL 34)、バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)、ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)、ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065)、マウス乳房腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI細胞、MRC5細胞、FS4細胞、ヒトヘパトーマ(Hep G2)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えば、DHFR”CHO細胞)、ならびにNS0及びSp2/0等の骨髄腫細胞株)を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な宿主細胞(原核細胞または真核細胞)が使用され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Vero細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、補完宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞(例えば、Vero細胞)は、1つ以上の単純ヘルペスウイルス遺伝子(例えば、ICP4遺伝子)を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞株由来の細胞である。好適な宿主細胞または細胞株の例としては、293、HeLa、SH−Sy5y、Hep G2、CACO−2、A549、L929、3T3、K562、CHO−K1、MDCK、HUVEC、Vero、N20、COS−7、PSN1、VCaP、CHO細胞等が挙げられ得るが、これらに限定されない。
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物(例えば、薬学的組成物もしくは配合物)のうちのいずれかを含む製品またはキットに関する。いくつかの実施形態では、製品またはキットは、(例えば、皮膚細胞外マトリックスタンパク質(例えば、コラーゲン)欠乏症を治療するための及び/または1つ以上の皮膚科学的老化兆候を矯正するための)組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び/または組成物もしくは配合物の投与に関する指示を含む添付文書を含む。
実施形態1:
(a)組換え核酸を含む単純ヘルペスウイルス(HSV)であって、前記組換え核酸が、第1のヒトコラーゲンタンパク質を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む、前記HSVと、
(b)賦形剤と
を含む、組成物。
(a)前記第1のヒトコラーゲンタンパク質、
(b)さらなるヒトコラーゲンタンパク質、及び
(c)(a)を(b)に連結するリンカーポリペプチド
を含む、実施形態1〜28のいずれか1つの組成物。
(a)前記第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、
(b)追加のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のORF、及び
(c)(a)と(b)を分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)
を含むポリシストロニックmRNAをコードする、実施形態1〜36のいずれか1つの組成物。
(a)実施形態1〜65のいずれか1つの組成物と、
(b)前記組成物の投与に関する指示と
を含む、キット。
(a)前記第1のヒトコラーゲンタンパク質、
(b)さらなるヒトコラーゲンタンパク質、及び
(c)(a)を(b)に連結するリンカーポリペプチド
を含む、実施形態93〜112のいずれか1つの組成物。
(a)前記第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、
(b)追加のヒトコラーゲンタンパク質をコードする第2のORF、及び
(c)(a)と(b)を分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)
を含むポリシストロニックmRNAをコードする、実施形態93〜120のいずれか1つの組成物。
(a)補完宿主細胞を実施形態93〜140のいずれか1つの組換え核酸と接触させることと、
(b)前記補完宿主細胞によって作製された単純ヘルペスウイルスを収集することと
を含む、前記方法。
(a)実施形態141〜146のいずれか1つの宿主細胞を培養することと、
(b)前記宿主細胞によって作製された単純ヘルペスウイルスを収集することと
を含む、前記方法。
標的哺乳類細胞(ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞等)においてヒトコラーゲンタンパク質(複数可)を発現させることができる改変された単純ヘルペスウイルスゲノムベクターを作製するために、単純ヘルペスウイルスゲノム(図1A)を、最初に1つ以上の単純ヘルペスウイルス遺伝子を不活性化するように改変する。かかる改変は、哺乳類細胞におけるゲノムの毒性を減少させ得る。次に、ヒトコラーゲンタンパク質(複数可)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを保有するように、それらの改変/弱毒化された組換えウイルス構築物のバリアントを作製する。これらのバリアントには、(1)各ICP4遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(図1B)、(2)各ICP4遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4改変HSV−1ゲノム(図1C)、(3)各ICP4遺伝子座に組み込まれた第1の異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び同じDNA鎖上の第2の異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(図1D)、(4)各ICP4遺伝子座に組み込まれた第1の異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び同じDNA鎖上の第2の異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4改変HSV−1ゲノム(図1E)、(5)各ICP4遺伝子座に組み込まれた第1の異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び反対側のDNA鎖上の第2の異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(図1F)、(6)各ICP4遺伝子座に組み込まれた第1の異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び反対側のDNA鎖上の第2の異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4改変HSV−1ゲノム(図1G)、(7)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下のポリシストロニックmRNAをコードする発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(ポリシストロニックmRNAが第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び内部リボソーム侵入部位(IRES)によって分離された第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む)(図1H)、(8)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下のポリシストロニックmRNAをコードする発現カセットを含む組換えΔICP4改変HSV−1ゲノム(ポリシストロニックmRNAが第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列及び内部リボソーム侵入部位(IRES)によって分離された第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む)(図1I)、(9)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下のキメラタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(キメラタンパク質が第1のヒトコラーゲンタンパク質のアミノ酸配列及びリンカーポリペプチドのアミノ酸配列によって分離された第2のヒトコラーゲンタンパク質のアミノ酸配列を含む)(図1J)、(10)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下のキメラタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4改変HSV−1ゲノム(キメラタンパク質が第1のヒトコラーゲンタンパク質のアミノ酸配列及びリンカーポリペプチドのアミノ酸配列によって分離された第2のヒトコラーゲンタンパク質のアミノ酸配列を含む)(図1K)、(11)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセット及びICP22遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22改変HSV−1ゲノム(図1L)、(12)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセット及びUL41遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔICP22/ΔUL41改変HSV−1ゲノム(図1M)、及び(13)ICP4遺伝子座の各々に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第1のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセット及びUL41遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下の第2のヒトコラーゲンタンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む組換えΔICP4/ΔUL41改変HSV−1ゲノム(図1N)が含まれる。
コラーゲンアルファ−1(VII)鎖タンパク質(COL7)は、皮膚を強化し、安定させる機能を果たす。簡潔には、COL7A1転写物を翻訳し、結果として得られたCOL7ペプチドを、ヒドロキシル化及びグリコシル化によって翻訳後に修飾し、グリコシル化COL7トリペプチドが、細胞から分泌されるプロコラーゲンとして知られているトリプルヘリックスを形成する。プロコラーゲンは、分泌時に高次構造に会合し、アンカー原線維を形成し、これらは、上皮基底膜を組織化し、安定させ、かつその接着を補助する助けとなるように利用することができる。上皮基底膜は、上皮を下層疎性結合組織につなぎ留める役割を担い、真皮−表皮安定性(真皮−表皮接合部完全性)に不可欠である。栄養障害性表皮水疱症は、COL7A1遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝性遺伝子状態であり、この遺伝子の変異は、栄養障害性表皮水疱症患者における表皮を真皮に適切に結合するCOL7の能力を損ない、脆弱な皮膚をもたらす。表皮水疱症の最も重度な形態である劣性栄養障害性表皮水疱症(RDEB)は、皮膚及び粘膜の広範囲に及ぶ水疱形成及び瘢痕形成を特徴とすることが多い。
ウイルス構築
「KCA211」ウイルスベクター(図2A)を以下のように作製した:野生型単純ヘルペスウイルスゲノムを、最初にウイルスICP4遺伝子(ΔICP4)の両方のコピーのコード配列を欠失させることによって改変した。ΔICP4改変ウイルスゲノムを、ICP4遺伝子座の各々にmCherry発現カセットを含むようにも操作した。その後、ウイルスゲノムを、野生型ヒトCOL7をコードするようにさらに改変した。簡潔には、ICP4の上流(US)領域及び下流(DS)領域に隣接する(hCMVプロモーターの制御下の)野生型COL7のコード配列を含むプラスミドを、ヘルペスウイルスICP4遺伝子を発現するように改変されたVero細胞にトランスフェクトした。その後、これらのトランスフェクト細胞を上述の改変ΔICP4 mCherry発現ウイルスに感染させた。COL7に隣接するUS及びDS ICP4領域は、mCherry遺伝子座の各々の二重交差及び置換を可能にした。その後、mCherry蛍光の非存在についての目視スクリーニングを使用して、組換えウイルスを含む細胞を特定した。
細胞を、日常的な外科的または診断的手技の一部として採取された皮膚生検から事前に単離した。書面によるインフォームドコンセントを、各患者から、または小児の場合には親もしくは法定後見人から得た。本試験をヘルシンキ宣言に従って行った。全ての細胞を5%CO2中37℃で培養した。ヒト線維芽細胞を、10%ウシ胎児血清(PEAK(登録商標)血清、カタログ番号PS−FB1)を補充したダルベッコ改変必須培地中で成長させた。RDEB及び正常なケラチノサイトを、10%FBS、10ng/mL上皮成長因子、10−10コレラ毒素、0.4μg/mLヒドロコルチゾン、5μg/mLトランスフェリン、5μg/mLインスリン、及び5μg/mLリオチロニンを補充したDMEM/ハムF12培地(3:1)中で培養した。全ての培地は、アスコルビン酸(150μM)を含んだ。ケラチノサイトを、3T3細胞の有糸分裂活性化フィーダー層の存在下及び10μMのRhoキナーゼ阻害剤Y−27632の存在下で成長させた。
ウイルスアリコートを−80℃で保管し、使用前に組織培養層流フード下で解凍した。細胞を組織培養プラスチックから切り離し、血球計でカウントした後に、標的細胞数を感染前に決定した。感染多重度(MOI)をウイルス力価及び標的細胞数から計算し、ウイルスストックの適切な体積を10%血清含有DMEM中に希釈し、標的細胞と37℃で2時間インキュベートした。その後、ウイルスを除去し、予め温められた培地で2回洗浄した後、新たな培地を標的細胞に供給した。
ケラチノサイトを100mmディッシュに8×105でプレーティングし、翌日に70〜80%コンフルエンシーを達成した。感染の48時間後、細胞を放射性免疫沈降アッセイ緩衝液で溶解した。溶解物を4℃で5分間にわたって遠心分離機に入れ、上清を6倍Laemmliローディング緩衝液と混合した。SDS−PAGEにロードする前に、試料を95℃で5分間沸騰させた。COL7検出のために、5〜30μgのタンパク質を6%アクリルアミドゲルにロードした。COL7検出のために使用した一次抗体は、ウサギ抗体(Sigma、カタログ番号HPA042420)であった。分解したタンパク質をニトロセルロース膜上に移し、一次抗体の要件に従って5%乳または5%BSAを含むPBS−0.1%Tween中でブロックし、一次抗体と一晩インキュベートした。IgG−HRPコンジュゲート二次抗体(Santa Cruz Biotechnology)とインキュベートした後、膜をウエスタンブロッティング基質(ThermoFisher Scientific、カタログ番号32106)とインキュベートし、フィルム(ThermoFisher Scientific、カタログ番号34090)に曝露した。
RNAを、RNeasy(登録商標)Mini Kit(Qiagen)を使用して製造業者のプロトコルに従って単離した。RNA抽出物を、NanoDrop(商標)分光光度計(Fisher Scientific)を使用して定量化し、1.5μgのRNAを、SuperScript III First−Strand Synthesisシステム(Invitrogen)を使用したcDNA合成に使用した。qPCRの場合、SYBR Select Master mix(Life Technologies)を使用し、cDNA試料を1:25に希釈して、鋳型として機能させた。実験を三連で行った。
96ウェルプレートを、4℃で一晩、100μL反応体積中10、20、または50μg/mLのラット尾コラーゲン1(BD Biosciences)またはヒトフィブロネクチン(Millipore)でコーティングし、その後、PBSで洗浄し、37℃で1時間にわたってPBS+0.1%BSAでブロックした。模擬(対照)またはSAR−COL7感染RDEBケラチノサイト(100μLのDMEM/HamF12+0.1%BSA中2.4×104細胞)をプレートに添加し、37℃で90分間インキュベートした。ウェルをPBSで3回洗浄して、結合していない細胞を除去し、接着細胞をPFEで20分間固定した。その後、固定細胞を70%エタノールで処理し、クリスタルバイオレットで染色し、100%エタノール中に分解し、Flex Station 3プレートリーダー(Molecular Devices)を用いて630nMで吸光度を測定することによって定量化した。
ウシフィブリノーゲン(90%凝固可能、MP Biomedicals)を1.1%NaCl中に37℃で4時間溶解し、その後、0.45μmのナイロン膜フィルターで濾過した。トリプシン及び遠心分離を使用して線維芽細胞を収集し、培地中に再懸濁して2×106細胞/mLの最終濃度にした。細胞懸濁液の150μLを1mLのトロンビン(3IU−Sigma Aldrich)と混合し、細胞/トロンビン混合物を1:1の比率でフィブリノーゲンに添加した。混合物を、1mL/ウェルで12ウェルプレートに迅速かつ穏やかに分布させ、37℃でインキュベートした。20分後、10μg/mLの最終濃度でアスコルビン酸及びアプロチニン(Sigma)を補充した培地を添加した。マトリックスを5〜7日間成熟させ、培地を一日おきに交換した。ケラチノサイトを2×106細胞/ウェルで上にプレーティングし、翌日、培養物を金属グリッド上の空気−液体界面に引き上げ、アンレキサノクスでの処理を開始した。培地を、新たな薬物、アスコルビン酸、及びアプロチニンと一日おきに交換した。培養物を処理の1週間または2週間時点で収集し、液体窒素冷却イソペンタン中のOCTで凍結した。クライオスタット(Avantik QS11)を使用して8μm切片に切断し、1:800の希釈で、ポリクローナル抗COL7抗体で免疫染色した。核をDAPI(Invitrogen)で対比染色した。
最初に、改変HSVからのCOL7発現を、HaCaTヒトケラチノサイト細胞株におけるqPCR分析及びウエスタンブロット分析により評価して、改変HSVがそれらのカーゴを発現させることができたかを決定した。HaCaT細胞に、0.3〜10の範囲のMOIでSAR−COL7またはKCA211のいずれかを形質導入した。感染の48時間後、細胞を収集し、qPCR分析(図3A)またはウエスタンブロット分析(図3B)のいずれかのために処理した。結果は、全長COL7がいずれかの改変HSVに感染したヒトケラチノサイトから用量依存的様式で発現されたことを実証した。
以下の実施例は、ヒト細胞においてインビトロで構築及び検証された組換えウイルス(上の実施例2を参照のこと)が、野生型動物においてコードされたヒトコラーゲンをインビボで発現させることが可能であったことを示す実験を説明する。本研究の目的は、部分的には、健常な免疫適格動物におけるHSV媒介性コラーゲン発現の皮膚生体内分布を評価することであった。
被験物質
マウスに投与した配合物中の活性成分は、PBS+10%グリセロール中で配合された4.8×108プラーク形成単位(PFU)/mLの力価での改変単純ヘルペスウイルスSAR−COL7またはKCA211(上の実施例2を参照のこと)であった。皮内投与に使用したビヒクルは、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)+10%グリセロールであった。局所投与に使用したビヒクルは、滅菌再蒸留水中で配合された3%ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)ゲルであった。
6〜10週齢の健常雄BALB/cマウスを使用した。プロトコルで使用した全ての手順は、該当する動物保護法に準拠しており、現地の機関内動物実験委員会(IACUC)により承認されたものである。
被験物質投与前及び投与中に、マウスを、Dexdomitor(30μLまたは0.05mg/mL)及びTelzol(10mg/mLの50μL)のカクテルを使用して麻酔した。鎮静剤をAntisedan(0.5mg/mLの50μL)で無効にした。背中領域及び側腹領域を電気ペットクリッパーで剃り、アルコールワイプで拭いた。皮内注射を、シリンジ及び27G針(VWR、カタログ番号BD305620)を用いたMantoux技術を使用して行い、各部位での表面「ブレブ」の作製を確実にした。ウイルスをドライアイス上で保持し、室温で解凍し、解凍後30分以内に投与した。皮内注射を各マウスの背中に2回投与し、「ブレブ」の縁を油性マーカーでマークした。
局所投与を、開放創または擦過もしくは乱切した皮膚のいずれか上で行った。背中領域及び側腹領域を、電気クリッパーを使用して剃った。皮膚を機械Dremelで優しく擦過し、その後、22G針で表面穿孔することにより、乱切を行った。創傷を作製するために、鋭利なはさみを使用して、皮膚の直径5〜6mmの生検を除去した。局所用配合物を擦過部位または創傷部位に含ませるために、1.5mLの微小遠心分離管の先端を切断及びオートクレーブ処理してウェルを作製した。蓋を保持し、切断側を透明な接着剤包帯で覆った。「ウェル」を、蓋側を下にして外科用接着剤を使用して擦過/創傷領域に接着させた。100μLのSAR−COL7を20μLの局所ビヒクルと混合し、透明な接着剤を介して注射することにより創傷部位に適用して、創傷上に局所ゲルを含ませ、漏れを防止した。
SAR−COL7投与後の指示された時点で、マウスを安楽死させ、8mmの生検パンチを使用して注射部位を取り出した。生検の半分を、液体窒素を使用して急速凍結し、残りの半分をOCTに包埋し、免疫蛍光染色のために凍結保存した。
急速凍結した半分の生検を分析まで−80℃で保管した。処理及び分析のために、試料を、製造業者のプロトコル(Qiagen)に従って、新たなDTTで調製した350μLのRLT緩衝液中に再懸濁した。試料を25%振幅で3回超音波処理し、氷上で1分間断続的にインキュベーションし、製造業者のプロトコル(Qiagen AllPrep DNA及びRNA抽出キット)に従ってDNA及びRNA抽出を行った。RNA試料及びDNA試料の両方を、RNAseを含まない脱イオン蒸留水中に再懸濁し、Take3マイクロプレートリーダー(BioRad)上で分光光度的に定量化した。
OCT凍結組織を5〜8μmで切片化し、最大1時間空気乾燥させた。スライドを100%メタノール中に−20℃で10分間浸漬し、空気乾燥させた。メタノール固定切片を、室温でPBS中での3回の洗浄(各5分間)により再水和した。切片を、10%血清(混合種)から成るブロッキング溶液と、湿潤チャンバ内で、室温で1時間インキュベートした。過剰なブロッキング溶液を除去し、5%ブロッキング溶液中で調製した一次抗体(抗ヒトコラーゲン7、Sigma、カタログ番号HPA042420、抗インテグリンアルファ6(クローンgoH3)、BD Biosciences、カタログ番号555734)溶液を一滴、各切片(30〜50μL/切片)に適用した。切片を一次抗体と4℃で16時間インキュベートし、PBS中で、室温で3回洗浄し(各5分間)、二次抗体(抗ウサギAF−647、Invitrogen、カタログ番号A21244、抗ラットAF−594、Invitrogen、カタログ番号A11007)を、PBS中1:400の希釈で、室温で1時間にわたって湿潤チャンバ内で適用した。3回のPBS洗浄を繰り返し、その後、スライドをHoechst溶液(1:1000)中に室温で5分間浸漬した。3回のPBS洗浄を繰り返し、染色された切片を封入剤(Fluorometer G、Southern Biotech、カタログ番号0100−01)で封入し、カバースリップで覆った。切片を、Widefield Fluorescence Microscopeを使用して脱水後(およそ24時間後)に画像化した。
6つの群に分けた合計30匹の雄BALB/cマウスをこの研究に使用した。SAR−COL7を1日目に皮内注射または局所適用のいずれかにより投与し、マウスのサブセットを3日目に収集し、残りのマウスを6日目に収集した。群2の動物は、皮内注射により同じ体積の低用量SAR−COL7(4.8×106pfu/部位)を受け、群1は、皮内コホートの対照としての役割を果たした。群4、5、及び6では、局所ビヒクル(群4)または局所ゲル中SAR−COL7(群5及び群6)を、合計体積120μLで創傷領域(群4及び群6)または擦過領域(群5)のいずれかに適用した。組織を収集し、上述のqPCR分析及び免疫蛍光分析のために処理した。
以下の実施例は、インビトロでのヒト細胞(上の実施例2を参照のこと)において及び野生型マウス(上の実施例3を参照のこと)においてインビボで構築及び検証された組換えウイルスが、COL7ハイポモルフマウスにおいてインビボで機能性ヒトコラーゲンを発現させることができることを示す実験を説明する。本研究の目的は、部分的には、COL7欠損免疫適格動物におけるHSV媒介性コラーゲン発現の皮膚生体内分布を評価することであった。
反対の指示がない限り、実験を上の実施例3に記載されるように行った。
COL7ハイポモルフマウスモデル(Fritsch et al.J Clin Invest.2008 May;118(5):1669−79)を本研究に使用した。このハイポモルフマウスモデルは、マウスが正常レベルの約10%のCOL7を発現する、栄養障害性表皮水疱症(DEB)の免疫適格動物モデルである。それらの表現型は、粘膜皮膚水疱形成、爪ジストロフィー、及び四肢のミトン奇形を含む、重度のヒトDEBの特徴に極めて類似している。
被験物質投与前及び投与中に、マウスを、2%イソフルランを使用した吸入麻酔下で維持した。乾燥を防ぐために、眼軟膏(Puralube(登録商標)Vet)を目に適用した。31G針を用いたMantoux技術を使用して、皮内注射を行った。最大4回の皮内注射を指定された用量で各マウスの背中に投与した。
組織収集前に、動物をCO2吸入により安楽死させ、その後、頸部脱臼させた。鋭利なはさみを使用して注射部位を生検した。
凍結保存した組織を5〜8μmの厚さで切片化し、最大1時間空気乾燥させた。スライドを100%メタノール中に−20℃で10分間浸漬し、空気乾燥させた。メタノール固定切片をPBS中で、室温で5分間再水和した。切片をヘマトキシリン(ワイゲルト改変ヘマトキシリン)中で、室温で5〜10分間インキュベートし、その後、PBS中で、室温で15分間洗浄した。その後、切片をエオシン(エオシンY溶液、カタログ番号HT110116)中で3回すすぎ、その後、水中で1回すすいだ。
皮膚を、0.05%タンニン酸を含有するダルベッコ無血清培地(SFM)中1.5%グルタルアルデヒド/1.5%パラホルムアルデヒド中に少なくとも1時間浸漬し、その後、SFM中で広範囲にわたってすすぎ、1%OsO4中で60分間後固定することにより、電子顕微鏡検査のために調製した。試料をSFM中で洗浄し、その後、100%までの段階的エタノール系列中で脱水し、プロピレンオキシド中ですすぎ、2時間の合計時間にわたってSpurrエポキシ中に浸潤させ、マイクロ波エネルギーにより加速した。試料を70℃で18時間にわたって重合した。追加の試料を、SFM中で広範囲にわたってすすぎ、その後、SFM中1:5で希釈したマウスIgM LH24抗体またはマウスIgG NP185抗体中に4℃で一晩浸漬することにより調製した。その後、試料をSFM中で広範囲にわたってすすぎ、金増強溶液(Nanoprobes)に氷上で15分間曝露し、その後、25℃に急速に温め、さらに5分間インキュベートした。試料を氷冷SFMですすぎ、固定し、包埋した。
3匹のハイポモルフマウスを高用量SAR−COL7研究に使用した。全てのマウスは、1日目に皮内注射により4.6×107PFU/50μL/注射部位の用量を受けた(表2)。各動物を剃り、1回の対照注射及び3回のSAR−COL7注射を含む注射を背中の4つの部位に行った。1匹の動物(マウス3)は、3日目に同じ4つの部位に2回目の注射を受けた。1匹のマウス(マウス1)を3日目に屠殺し、マウス2及びマウス3を7日目に屠殺した。
以下の実施例は、ヒトコラーゲン1を首尾よく発現させるように組換えHSV−1を操作するための2つの異なるアプローチを説明する。ヒトコラーゲン1が、COL1A1ポリペプチドの2つのコピー及びCOL1A2ポリペプチドの1つのコピーを含むヘテロ三量体巨大分子であるため、ヒトCOL1A1及びCOL1A2の両方をコードする単一HSVゲノムを作製するための2つの異なる戦略を行った。これらの2つのアプローチを、概して、図1H〜1I及び1Lに示し、以下に詳細に記載する。
以下の実施例は、ヒトコラーゲン3(C3vec01と称される)を首尾よく発現させた組換えHSV−1の操作を説明する。加えて、以下の実施例は、用量範囲研究における不死化ヒトケラチノサイト及び線維芽細胞の使用、複数の高齢ヒト患者から生検した初代ヒト皮膚線維芽細胞のより高齢の患者におけるC3vec01媒介コラーゲン3レスキューのモデルとしての使用、ならびにインビトロ紫外線照射不死化ヒト線維芽細胞の日光曝露/皮膚老化のモデルとしての使用を含む、C3vec01の有効性の特徴付けに好適な複数の関連二次元細胞培養モデル系を確立するインビトロ実験について説明する。
以下の実施例は、若年及び老年健常免疫適格動物においてC3vec01を皮内投与する方法を確立するインビボ実験を記載した。
最初に、組換えヘルペスウイルスベクターを操作して、上の実施例3に記載されるように、2つのヒトラミニンタンパク質LAMB3またはLAMC2の野生型バリアントまたはコドン最適化バリアントのいずれかを組み込んだ。ウイルス型毎にいくつかの単離体を採取した。ある特定の単離体が、コードされた野生型ヒトLAMB3タンパク質を発現させることができるかを試験するために、ICP4補完Vero細胞を6ウェルプレートにプレーティングし、感染が完了するまで野生型LamB3コードウイルスの12の非力価測定ウイルス単離体に感染させた。感染後、RNAを収集し、cDNAを作製し、各単離体由来の野生型LamB3の発現をqPCRにより決定した(図24A)。12全ての単離体が、形質導入Vero細胞において様々なレベルで野生型ヒトLamB3を発現させることができた。これらの単離体のうちの10の単離体の、ヒトLamB3を発現させる能力も、ウエスタンブロットにより試験した。ICP4補完Vero細胞を6ウェルプレートにプレーティングし、感染が完了するまで野生型LamB3発現ウイルスの10の非力価測定ウイルス単離体に感染させた。Vero細胞のウェルを、陽性対照としてLamB3発現プラスミドでトランスフェクトした。感染後、細胞を穏やかな掻爬により収集し、遠心分離して細胞ペレットを収集し、培養培地を吸引し、細胞ペレットをPBSで1回洗浄した。洗浄後、各細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する200μLのRIPA緩衝液中に再懸濁し、再懸濁液を5分毎に穏やかに撹拌しながら4℃で20分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を17,000×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、5%2−メルカプトメタノールを含有する4倍LDS還元試料緩衝液を各精製上清に添加した。その後、試料を10分間沸騰させた後、4〜20%トリス−グリシンポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動後、タンパク質をPVDF膜に移し、膜を5%乳/TBS中で30分間ブロックした。その後、一次ウサギ抗LamB3抗体(Abcam、カタログ番号ab128864)を、5%乳/TBS中1:1000希釈でPVDF膜に添加し、室温で一晩(約16時間)インキュベートした。その後、ブロットをTBSで3回洗浄し(各5分間)、次いで、5%乳/TBS中APコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG抗体(Sigma、カタログ番号A3687)で、室温で1時間染色した。その後、膜をTBSで3回洗浄し(各5分間)、BCIP/NBTを添加し、ブロットを室温で約10分間現像した。qPCRデータと一致して、10の全てのウイルス単離体が、コードされた野生型ヒトLamB3を様々なレベルで発現させることができた(図24B)。
Claims (75)
- 第1の美容用タンパク質を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む、組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを含む、請求項1に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 複製能を有する、請求項1または請求項2に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 複製欠損である、請求項1または請求項2に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 組換え単純ヘルペスウイルスゲノム、組換え水痘帯状疱疹ウイルスゲノム、組換えヒトサイトメガロウイルスゲノム、組換えヘルペスウイルス6Aゲノム、組換えヘルペスウイルス6Bゲノム、組換えヘルペスウイルス7ゲノム、組換えカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスゲノム、及びそれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)ゲノム、組換え単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)ゲノム、またはそれらの任意の誘導体である、請求項6に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)ゲノムである、請求項6または請求項7に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが不活性化変異を含む、請求項6〜8のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記不活性化変異が単純ヘルペスウイルス遺伝子に存在する、請求項9に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記不活性化変異が、前記単純ヘルペスウイルス遺伝子のコード配列の欠失である、請求項10に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記単純ヘルペスウイルス遺伝子が、感染細胞タンパク質(ICP)0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、チミジンキナーゼ(tk)、ロングユニーク領域(UL)41、及びUL55からなる群から選択される、請求項10または請求項11に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む、請求項12に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP22遺伝子に不活性化変異を含む、請求項12または請求項13に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、UL41遺伝子に不活性化変異を含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP0遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む、請求項12〜15のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP27遺伝子に不活性化変異を含む、請求項12〜16のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ICP4ウイルス遺伝子座の一方または両方内に前記第1のポリヌクレオチドを含む、請求項6〜17のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1の美容用タンパク質が、第1のコラーゲンタンパク質、第1のフィブロネクチンタンパク質、第1のエラスチンタンパク質、第1のルミカンタンパク質、第1のビトロネクチンタンパク質、第1のビトロネクチン受容体タンパク質、第1のラミニンタンパク質、第1の神経調節タンパク質、及び第1のフィブリリンタンパク質からなる群から選択される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1の美容用タンパク質が、配列番号15〜21及び53〜64からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1の美容用タンパク質が構造的細胞外マトリックスタンパク質である、請求項1〜20のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1のコラーゲンタンパク質がヒトコラーゲンタンパク質である、請求項19〜21のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1のコラーゲンタンパク質が、コラーゲンアルファ−1(I)鎖ポリペプチド(COL1−1)、コラーゲンアルファ−2(I)鎖ポリペプチド(COL1−2)、コラーゲンアルファ−1(II)鎖ポリペプチド(COL2)、コラーゲンアルファ−1(III)鎖ポリペプチド(COL3)、コラーゲンアルファ−1(IV)鎖ポリペプチド(COL4−1)、コラーゲンアルファ−2(IV)鎖ポリペプチド(COL4−2)、コラーゲンアルファ−3(IV)鎖ポリペプチド(COL4−3)、コラーゲンアルファ−4(IV)鎖ポリペプチド(COL4−4)、コラーゲンアルファ−5(IV)鎖ポリペプチド(COL4−5)、コラーゲンアルファ−6(IV)鎖ポリペプチド(COL4−6)、コラーゲンアルファ−1(V)鎖ポリペプチド(COL5−1)、コラーゲンアルファ−2(V)鎖ポリペプチド(COL5−2)、コラーゲンアルファ−3(V)鎖ポリペプチド(COL5−3)、コラーゲンアルファ−1(VI)鎖ポリペプチド(COL6−1)、コラーゲンアルファ−2(VI)鎖ポリペプチド(COL6−2)、コラーゲンアルファ−3(VI)鎖ポリペプチド(COL6−3)、コラーゲンアルファ−4(VI)鎖ポリペプチド(COL6−4)、コラーゲンアルファ−5(VI)鎖ポリペプチド(COL6−5)、コラーゲンアルファ−6(VI)鎖ポリペプチド(COL6−6)、コラーゲンアルファ−1(VIII)鎖ポリペプチド(COL8)、コラーゲンアルファ−1(IX)鎖ポリペプチド(COL9−1)、コラーゲンアルファ−2(IX)鎖ポリペプチド(COL9−2)、コラーゲンアルファ−3(IX)鎖ポリペプチド(COL9−3)、コラーゲンアルファ−1(X)鎖ポリペプチド(COL10)、コラーゲンアルファ−1(XI)鎖ポリペプチド(COL11−1)、コラーゲンアルファ−2(XI)鎖ポリペプチド(COL11−2)、コラーゲンアルファ−1(XII)鎖ポリペプチド(COL12)、コラーゲンアルファ−1(XIII)鎖ポリペプチド(COL13)、コラーゲンアルファ−1(XIV)鎖ポリペプチド(COL14)、コラーゲンアルファ−1(XV)鎖ポリペプチド(COL15)、コラーゲンアルファ−1(XVI)鎖ポリペプチド(COL16)、コラーゲンアルファ−1(XVII)鎖ポリペプチド(COL17)、コラーゲンアルファ−1(XVIII)鎖ポリペプチド(COL18)、コラーゲンアルファ−1(XIX)鎖ポリペプチド(COL19)、コラーゲンアルファ−1(XX)鎖ポリペプチド(COL20)、コラーゲンアルファ−1(XXI)鎖ポリペプチド(COL21)、コラーゲンアルファ−1(XXII)鎖ポリペプチド(COL22)、コラーゲンアルファ−1(XXIII)鎖ポリペプチド(COL23)、コラーゲンアルファ−1(XXIV)鎖ポリペプチド(COL24)、コラーゲンアルファ−1(XXV)鎖ポリペプチド(COL25)、コラーゲンアルファ−1(XXVI)鎖ポリペプチド(COL26)、コラーゲンアルファ−1(XXVII)鎖ポリペプチド(COL27)、及びコラーゲンアルファ−1(XXVIII)鎖ポリペプチド(COL28)からなる群から選択される、請求項19〜22のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1のコラーゲンタンパク質が、COL1−1、COL1−2、COL3、COL4−1、COL4−2、COL6−1、及びCOL17からなる群から選択される、請求項19〜23のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 第1のヒトコラーゲンタンパク質が、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、請求項19〜24のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1の美容用タンパク質がコラーゲンアルファ−1(VII)鎖ポリペプチド(COL7)ではない、請求項1〜25のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1のポリペプチドが、前記第1の美容用タンパク質から本質的になるか、または前記第1の美容用タンパク質からなる、請求項1〜26のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1のポリペプチドが、
(a)前記第1の美容用タンパク質、
(b)さらなる美容用タンパク質、及び
(c)(a)を(b)に連結するリンカーポリペプチド
を含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。 - 前記リンカーポリペプチドが切断可能なリンカーポリペプチドである、請求項28に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記リンカーポリペプチドが、配列番号28〜31からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、請求項28または請求項29に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1の美容用タンパク質と前記さらなる美容用タンパク質が異なる、請求項28〜30のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1のポリヌクレオチドが、
(a)前記第1のポリペプチドをコードする第1のオープンリーディングフレーム(ORF)、
(b)追加の美容用タンパク質をコードする第2のORF、及び
(c)(a)と(b)を分離する内部リボソーム侵入部位(IRES)
を含むポリシストロニックmRNAをコードする、請求項1〜31のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。 - 前記IRESをコードする核酸配列が、配列番号22または配列番号23から選択される核酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、請求項32に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1の美容用タンパク質と前記追加の美容用タンパク質が異なる、請求項32または請求項33に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 第2の美容用タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜34のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記第1の美容用タンパク質と前記第2の美容用タンパク質が異なる、請求項35に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 標的細胞に導入された場合、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して減少した細胞毒性を有する、請求項1〜36のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記標的細胞が表皮細胞及び/または真皮細胞である、請求項37に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記標的細胞がヒト細胞である、請求項37または請求項38に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 前記標的細胞が線維芽細胞である、請求項37〜39のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
- 請求項1〜40のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムを含む、ヘルペスウイルス。
- 複製能を有する、請求項41に記載のヘルペスウイルス。
- 複製欠損である、請求項41に記載のヘルペスウイルス。
- 対応する野生型ヘルペスウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する、請求項41〜43のいずれか1項に記載のヘルペスウイルス。
- 単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス6A、ヘルペスウイルス6B、ヘルペスウイルス7、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスからなる群から選択される、請求項41〜44のいずれか1項に記載のヘルペスウイルス。
- 単純ヘルペスウイルスである、請求項41〜45のいずれか1項に記載のヘルペスウイルス。
- 前記単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)、またはそれらの任意の誘導体である、請求項46に記載のヘルペスウイルス。
- (a)請求項1〜40のいずれか1項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムまたは請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスと、
(b)賦形剤と
を含む、組成物。 - 無菌である、請求項48に記載の組成物。
- 局所、経皮、皮下、皮内、経口、鼻腔内、気管内、舌下、口腔、直腸、膣内、尿道、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部、または皮膚上投与に好適である、請求項48または請求項49に記載の組成物。
- 皮内投与に好適である、請求項48〜50のいずれか1項に記載の組成物。
- 表面注射に好適である、請求項48〜51のいずれか1項に記載の組成物。
- 美容用組成物である、請求項48〜52のいずれか1項に記載の組成物。
- スキンケア製品である、請求項48〜53のいずれか1項に記載の組成物。
- 薬剤として使用するための、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物。
- 治療に使用するための、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物。
- 皮膚科学的老化の1つ以上の兆候もしくは症状を治療するための薬剤の製造における、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 対象における1つ以上の皮膚細胞外マトリックスタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
- 対象における1つ以上のコラーゲンタンパク質のレベルを強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
- 対象の軟組織を強化する、増加させる、増強する、及び/または補充する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
- 前記組成物が前記対象の軟組織に注射される、請求項60に記載の方法。
- 皮膚の状態、質、及び/または外観の改善を必要とする対象における皮膚の状態、質、及び/または外観を改善する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
- 前記組成物が、日光による損傷もしくは他の紫外線曝露、粗いきめ、皮膚のたるみ、しわ、またはそれらの任意の組み合わせの、1つ以上の部位に投与される、請求項62に記載の方法。
- 皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観の減少を必要とする対象の皮膚における1つ以上の表面陥凹の外観を減少させる方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
- 前記皮膚における前記1つ以上の表面陥凹が、鼻唇溝、目尻のしわ、眉間しわ線、額のしわ、瘢痕、眉間のしわ、眉毛下垂、眼頬溝(tear trough)、鼻頬線(nasojugal line)、バニーライン、頬/顔面中央下垂、マリオネットライン、ポピーえくぼ形成(poppy dimpling)、笑線、笑いじわ、顎のひだ、首のしわ、広頸筋帯、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項64に記載の方法。
- 皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つの増加及び/または改善を必要とする対象の皮膚のきめ、滑らかさ、弾性、または張りのうちの少なくとも1つを増加させる及び/または改善する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
- 前記対象の皮膚が、老化している皮膚である、請求項62〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象の皮膚が、紫外線光への曝露により損傷している、請求項62〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象の皮膚がしわになっている、請求項62〜68のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減を必要とする対象における1つ以上の皮膚科学的老化兆候を軽減する方法であって、前記対象に、請求項41〜47のいずれか1項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項48〜54のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
- 前記1つ以上の皮膚科学的老化兆候の軽減が、(a)細かい線及び/またはしわの治療、減少、及び/または予防、(b)皮膚の毛穴径の減少、(c)皮膚の厚み、ふっくら感、及び/または張り感の改善、(d)皮膚の滑らかさ、しなやかさ、及び/または柔らかさの改善、(e)皮膚の色調、輝き、及び/または透明度の改善、(f)プロコラーゲン及び/またはコラーゲン産生の改善、(g)皮膚のきめの改善及び/または再度きめを整えること(retexturization)の促進、(h)皮膚輪郭の外観の改善、(i)皮膚のつや及び/または明るさの復元、(j)老化及び/または閉経により減退した皮膚外観の改善、(k)皮膚保湿の改善、(l)皮膚の弾性及び/または弾力性の増加、(m)治療、軽減、及び/または予防もしくは皮膚のたるみ、(n)皮膚の締まりの改善、(o)色素斑、斑のある皮膚、及び/または瘢痕の減少、(p)光回折または反射による皮膚の光学的特性の改善、または(q)それらの任意の組み合わせによって示される、請求項70に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項58〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヘルペスウイルスまたは前記組成物が、前記対象に、局所的に、経皮的に、皮下的に、皮膚上に、皮内に、経口的に、舌下に、口腔内に、直腸に、膣に、尿道内に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、骨内に、心臓内に、腹腔内に、経粘膜的に、硝子体内に、網膜下に、関節内に、関節周囲に、局部的に、または吸入を介して投与される、請求項58〜72のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヘルペスウイルスまたは前記組成物が、前記対象に皮内投与される、請求項58〜73のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヘルペスウイルスまたは前記組成物が、表面注射によって投与される、請求項58〜74のいずれか1項に記載の方法。
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