JP2022502026A - ネザートン症候群の治療のための組成物及び方法 - Google Patents

ネザートン症候群の治療のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、セリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型（ＳＰＩＮＫ）ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫＳポリペプチド）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸、その組換え核酸を含むウイルス、その組換え核酸及び／またはウイルスを含む組成物及び製剤、それらの使用方法（例えば、ネザートン症候群の治療のための）、ならびにそれらの製品またはキットを提供する。【選択図】図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年９月２４日に出願された米国仮出願第６２／７３５，５８２号の優先権の利益を主張する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：７６１３４２０００４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１９年９月１９日、サイズ：６０ＫＢ）。
発明の分野
本開示は、部分的には、セリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型（ＳＰＩＮＫ）ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸、それを含むウイルス、その薬学的組成物、製剤、及び薬剤、ならびにその使用方法（例えば、ネザートン症候群の治療のための）に関する。
背景
ネザートン症候群（ＮＳ）は、コメル−ネザートン症候群とも称され、角化欠損、重度の皮膚バリア欠損、及び再発性感染症を引き起こす衰弱性常染色体劣性皮膚障害である。患者は、出生直後に全身性発疹を発症し、これが重度の魚鱗癬になる（Ｃｏｍｅｌ，１９４９．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９８（３）：１３３−６（非特許文献１））。より重度のＮＳ症状を有する乳児は、発育障害、体液の過剰喪失に伴う高ナトリウム血性脱水症、成長遅延、小人症、及び再発性感染症に関連する（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６．Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４（６）：７４１−３（非特許文献２）、Ｈａｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３（３）：１８３−９９（非特許文献３））。ネザートン症候群の出生後死亡率は極めて高く、最大２０％の患者が１歳の誕生日を迎えることができない（Ｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４（３）：５３６−４３（非特許文献４））。
臨床的に、ネザートン症候群は、先天性魚鱗癬様紅皮症、毛幹欠損、再発性感染症、及び皮膚バリア欠損を特徴とする（Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３１（５）：６１５−２１（非特許文献５）、Ｓｃｈｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２１（２）：１２３−３３（非特許文献６））。毛幹は、重積性裂毛症、すなわち、「竹状毛」のため、脆くて切れ易く、短く薄い髪になる。アレルギー、喘息、及び湿疹になりやすい傾向もＮＳの特徴である。最終的に、ネザートン症候群に罹患している者は、慢性皮膚炎症、重度の脱水症、及び成長不良をしばしば経験する。
この疾患は、セリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型５（ＳＰＩＮＫ５）遺伝子の変異に起因し、そのコードされたセリンプロテアーゼインヒビタータンパク質ＳＰＩＮＫ５（別名、リンパ上皮Ｋａｚａｌ型関連インヒビター（ＬＥＫＴＩ））の活性の喪失をもたらす（Ｂｉｔｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１８（２）：３５２−６１（非特許文献７））。健常な個体では、ＳＰＩＮＫ５は、皮膚の最外層で発現されるセリンプロテアーゼインヒビターの１つであり、角質細胞を一緒に保持する細胞外タンパク質を加水分解するセリンプロテアーゼの調節に重要な役割を果たす。ネザートン症候群に罹患している患者では、これらのセリンプロテアーゼに対するＳＰＩＮＫ５の抑制効果は、ＳＰＩＮＫ５遺伝子における根底にある遺伝子変異のため、無効になる（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２８（５）：１１４８−５９（非特許文献８））。その結果として、皮膚における過活性化セリンプロテアーゼは、コントロール不良の落屑を引き起こし、皮膚バリア欠損につながる（Ｄｅｓｃａｒｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．３７（１）：５６−６５（非特許文献９））。
現在、ネザートン症候群の既知の治療法は存在せず、患者の治療選択肢は限定されている。現在の治療は、皮膚の鱗屑化／ひび割れを最小限に抑えるための保湿製品の使用、及び適切な場合には抗感染治療の提供を含む、疾患の症状の管理に焦点を当てている。加えて、皮膚感染症を軽減するための免疫グロブリンの静脈内投与が普及している。残念ながら、ステロイド及びレチノイド製品が他の魚鱗癬関連障害の治療におけるある程度の成功を示しているが、これらの製品は、ＮＳには無効であることが証明されており、実際には、罹患した個体に対して事態を悪化させる可能性がある（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．１９５（１）：７５（非特許文献１０））。したがって、この感受性患者集団において観察されるＳＰＩＮＫ５欠乏症の分子補正を目標とする新規の治療選択肢が明らかに必要とされている。
特許出願、特許刊行物、非特許文献、及びＮＣＢＩ／ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号を含む本明細書で引用される全ての参考文献は、個々の参考文献が各々参照により組み込まれると明確かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Ｃｏｍｅｌ，１９４９．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９８（３）：１３３−６ Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６．Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４（６）：７４１−３ Ｈａｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３（３）：１８３−９９ Ｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４（３）：５３６−４３ Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３１（５）：６１５−２１ Ｓｃｈｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２１（２）：１２３−３３ Ｂｉｔｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１８（２）：３５２−６１ Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２８（５）：１１４８−５９ Ｄｅｓｃａｒｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．３７（１）：５６−６５ Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．１９５（１）：７５
簡単な概要
これら及び他の必要性を満たすために、ＳＰＩＮＫ欠乏症の治療に有用な、及び／またはＳＰＩＮＫ関連障害（例えば、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、遺伝性膵炎、熱帯性石灰沈着性膵炎、精子形成不全２９等を有するか、またはそれを発症するリスクのある個体の治療に有用な、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）、薬学的組成物及び製剤、薬剤、及び／または方法における使用のためのセリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型（ＳＰＩＮＫ）ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチド）をコードする組換え核酸（例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム）が本明細書に提供される。本発明人らは、本明細書に記載の組換えウイルスがヒト表皮細胞を形質導入することができ、コードされた外因性ＳＰＩＮＫ（ＲＮＡ及びタンパク質）を首尾よく発現することができたこと、及び外因性ポリペプチドが適切に分泌され、完全に機能したことを示した（例えば、実施例２を参照のこと）。さらに、本発明人らは、本明細書に記載のウイルスが有意な細胞毒性なしにインビボで局所または皮内のいずれかで首尾よく投与される可能性があり、コードされたヒトＳＰＩＮＫポリペプチドが皮膚の適切な領域で発現され、かつそこに局在することを可能にしたことを示した（例えば、実施例３を参照のこと）。理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、組成物、及び／または薬剤のうちの１つ以上を投与することによって、その必要がある対象においてＳＰＩＮＫポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５）のレベルを増加させる、増強する、及び／または補充することにより、対象における１）粘膜上皮の抗炎症保護及び／または抗微生物保護が強化される、２）経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）が軽減される、３）落屑が抑制される、及び４）皮膚バリア欠損が軽減または治療されるであろうと考えられる。加えて、理論に拘束されることを望むことなく、（本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物のうちのいずれかを投与することにより）対象の１つ以上の細胞におけるＳＰＩＮＫポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５）のレベルを増加させる、増強する、及び／または補充することにより、ＳＰＩＮＫ欠乏症（例えば、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎等）に罹患している個体における既存の皮膚異常の治療がもたらされるであろうと考えられる。
したがって、本開示のある特定の態様は、セリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型（ＳＰＩＮＫ）ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えヘルペスウイルスゲノムに関する。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、複製可能である。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、複製欠損である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム、組換え水痘帯状疱疹ウイルスゲノム、組換えヒトサイトメガロウイルスゲノム、組換えヘルペスウイルス６Ａゲノム、組換えヘルペスウイルス６Ｂゲノム、組換えヘルペスウイルス７ゲノム、組換えカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスゲノム、及びそれらの任意の組み合わせまたは派生物から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換え単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ゲノム、組換え単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）ゲノム、またはそれらの任意の派生物である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノムである。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、単純ヘルペスウイルス遺伝子に存在する。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、単純ヘルペスウイルス遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス遺伝子は、感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ロングユニーク領域（ＵＬ）４１、及びＵＬ５５から選択される。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２７遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ５５遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、連結領域に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、連結領域の欠失を含む。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上のウイルス遺伝子座内に含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、ＩＣＰ４ウイルス遺伝子座の一方または両方内に含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、ＩＣＰ２２ウイルス遺伝子座内に含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、ＵＬ４１ウイルス遺伝子座内に含む。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、ヒトＳＰＩＮＫポリペプチドである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、セリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型５（ＳＰＩＮＫ５）ポリペプチドである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、配列番号７〜２５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、配列番号７〜９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、標的細胞に導入された場合に、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して減少した細胞毒性を有する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、表皮細胞及び／または真皮細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ケラチノサイトまたは線維芽細胞である。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムのうちのいずれかを含むヘルペスウイルスに関する。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、複製可能である。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、複製欠損である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、対応する野生型ヘルペスウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス６Ａ、ヘルペスウイルス６Ｂ、ヘルペスウイルス７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、及びそれらの任意の組み合わせまたは派生物から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、またはそれらの任意の派生物である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１である。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムのうちのいずれか及び／または本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれかと、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物に関する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所、経皮、皮下、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部、皮膚上（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、またはそれらの任意の組み合わせに好適である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所、経皮、皮下、皮内、及び／または経粘膜投与に好適である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所、経皮、及び／または皮内投与に好適である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与及び／または皮内投与に好適である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与に好適である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、メチルセルロースゲル（例えば、カルボキシメチルセルロースゲル、ヒドロキシプロピルメチルセルロースゲル等）を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、リン酸緩衝液を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、グリセロールを含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、脂質担体を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ナノ粒子担体を含む。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組換え核酸、ヘルペスウイルス、及び／または薬学的組成物のうちのいずれかの薬剤としての使用に関する。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組換え核酸、ヘルペスウイルス、及び／または薬学的組成物のうちのいずれかの療法における使用に関する。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組換え核酸、ヘルペスウイルス、及び／または薬学的組成物のうちのいずれかの、ＳＰＩＮＫポリペプチド欠乏症（例えば、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎等）の１つ以上の兆候または症状を治療するための薬剤の生産または製造における使用に関する。
本開示の他の態様は、対象の１つ以上の細胞におけるＳＰＩＮＫポリペプチドレベルを強化する、増加させる、増強する、及び／または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び／または本明細書に記載の薬学的組成物のいずれかを投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド）である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象のゲノムは、ＳＰＩＮＫ５遺伝子に機能喪失変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮膚上、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、心臓内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部投与、または吸入により投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わされ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に局所投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、投与前に擦過される。
本開示の他の態様は、その必要がある対象において粘膜上皮の抗炎症保護及び／または抗微生物保護を強化する、増加させる、増強する、及び／または補充する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び／または本明細書に記載の薬学的組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象のゲノムは、ＳＰＩＮＫ５遺伝子に機能喪失変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮膚上、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、心臓内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部投与、または吸入により投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わされ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に局所投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、投与前に擦過される。
本開示の他の態様は、その必要がある対象において落屑を抑制する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのいずれか及び／または本明細書に記載の薬学的組成物のいずれかの有効量を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象のゲノムは、ＳＰＩＮＫ５遺伝子に機能喪失変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮膚上、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、心臓内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部投与、または吸入により投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わされ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に局所投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、投与前に擦過される。
本開示の他の態様は、その必要がある対象において皮膚バリア欠損を軽減または治療する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び／または本明細書に記載の薬学的組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、皮膚バリア欠損は、経上皮水分喪失（ＴＥＷＬ）である。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象のゲノムは、ＳＰＩＮＫ５遺伝子に機能喪失変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮膚上、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、心臓内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部投与、または吸入により投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わされ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に局所投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、投与前に擦過される。
本開示の他の態様は、その必要がある対象においてネザートン症候群（ＮＳ）の１つ以上の兆候または症状の予防的、姑息的、または治療的緩和を提供する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び／または本明細書に記載の薬学的組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、ＮＳの１つ以上の兆候または症状は、角化欠損、皮膚バリア欠損、慢性皮膚炎症、汎発性掻痒症、重度の脱水症、成長不良、重積性裂毛症及び／または結節性裂毛症、皮膚からの体液漏出、皮膚における環状病変の発症、湿疹、感染症に対する感受性の増大、再発性皮膚感染症、アレルギーに対する感受性の増大、鱗状／赤みを帯びた皮膚の発症、曲折線状魚鱗癬及び／または魚鱗癬様紅皮症の発症、免疫グロブリンレベルの変化、溶解機能の低下を有する未熟ナチュラルキラー細胞、体温の調節困難、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＮＳの１つ以上の兆候または症状は、角化欠損、皮膚バリア欠損、再発性皮膚感染症、先天性魚鱗癬様紅皮症、曲折線状魚鱗癬、重積性裂毛症、慢性皮膚炎症、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象のゲノムは、ＳＰＩＮＫ５遺伝子に機能喪失変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮膚上、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、心臓内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部投与、または吸入により投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わされ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、または皮内投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に局所投与または皮内投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に皮内投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に局所投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、投与前に擦過される。
本開示の他の態様は、その必要がある対象においてアトピー性皮膚炎の１つ以上の兆候または症状の予防的、姑息的、または治療的緩和を提供する方法であって、対象に、本明細書に記載のヘルペスウイルスのうちのいずれか及び／または本明細書に記載の薬学的組成物のうちのいずれかの有効量を投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、アトピー性皮膚炎の１つ以上の兆候または症状は、皮膚の掻痒、乾燥皮膚、皮膚における赤色〜茶色がかった灰色の斑点、皮膚における小さい隆起した突出物、肥厚した皮膚、ひび割れした皮膚、鱗状の皮膚、腫れた皮膚、湿潤性ただれ（ｗｅｅｐｉｎｇ ｓｏｒｅ）、皮膚感染症、眼瞼皮膚炎、白内障、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象のゲノムは、ＳＰＩＮＫ５遺伝子に機能喪失変異を含む。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮膚上、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、心臓内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部投与、または吸入により投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わされ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に、局所、経皮、または皮内投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に局所投与または皮内投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に皮内投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ヘルペスウイルス及び／または薬学的組成物は、対象に局所投与される。前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、対象の皮膚は、投与前に擦過される。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかと、その投与に関する指示とを含む製品またはキットに関する。
図１Ａ〜Ｉは、野生型単純ヘルペスウイルスゲノム及び修飾された単純ヘルペスウイルスゲノムの概略図を示す。図１Ａは、野生型単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図１Ｂは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットがＩＣＰ４遺伝子座の各々に組み込まれている、ＩＣＰ４（両方のコピー）のコード配列の欠失を含む修飾された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図１Ｃは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットがＩＣＰ４遺伝子座の各々に組み込まれている、ＩＣＰ４（両方のコピー）及びＩＣＰ２２のコード配列の欠失を含む修飾された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図１Ｄは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットがＩＣＰ２２遺伝子座に組み込まれている、ＩＣＰ４（両方のコピー）及びＩＣＰ２２のコード配列の欠失を含む修飾された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図１Ｅは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットがＩＣＰ４遺伝子座の各々に組み込まれている、ＩＣＰ４（両方のコピー）及びＵＬ４１のコード配列の欠失を含む修飾された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図１Ｆは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットがＵＬ４１遺伝子座に組み込まれている、ＩＣＰ４（両方のコピー）及びＵＬ４１のコード配列の欠失を含む修飾された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図１Ｇは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットがＩＣＰ４遺伝子座の各々に組み込まれている、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及びＵＬ４１のコード配列の欠失を含む修飾された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図１Ｈは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットがＵＬ４１遺伝子座に組み込まれている、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及びＵＬ４１のコード配列の欠失を含む修飾された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。図１Ｉは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットがＩＣＰ２２遺伝子座に組み込まれている、ＩＣＰ４（両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及びＵＬ４１のコード配列の欠失を含む修飾された単純ヘルペスウイルスゲノムを示す。 図１−１の説明を参照のこと。 図１−１の説明を参照のこと。 図１−１の説明を参照のこと。 図１−１の説明を参照のこと。 図２Ａ〜Ｄは、ＨＳＶ−Ｓ５に感染した不死化正常ケラチノサイトにおけるヒトＳＰＩＮＫ５核酸及びタンパク質分析を示す。図２Ａは、ｑＰＣＲ分析によって決定される、指示されたＭＯＩでのＨＳＶ−Ｓ５による感染の４８時間後に不死化正常ケラチノサイト中に存在するコドン最適化ヒトＳＰＩＮＫ５のＤＮＡレベルを示す。図２Ｂは、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって決定される、指示されたＭＯＩでのＨＳＶ−Ｓ５による感染の４８時間後に不死化正常ケラチノサイト中に存在するコドン最適化ヒトＳＰＩＮＫ５の転写物レベルを示す。図２Ｃは、指示されたＭＯＩでのＨＳＶ−Ｓ５による感染の４８時間後の不死化正常ケラチノサイトにおけるヒトＳＰＩＮＫ５タンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。ＧＡＰＤＨを負荷対照として使用した。図２Ｄは、指示されたＭＯＩでのＨＳＶ−Ｓ５による感染の４８時間後の不死化正常ケラチノサイトにおけるヒトＳＰＩＮＫ５タンパク質発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。ＤＡＰＩ染色を使用して、核を可視化した。全ての実験について、非感染（模擬）細胞を陰性対照として使用した。 ＥＬＩＳＡによって評価される、指示されたＭＯＩでのＨＳＶ−Ｓ５による感染の４８時間後に培養された不死化正常ケラチノサイトの上清中に分泌されたヒトＳＰＩＮＫ５の濃度を示す。非感染（模擬）不死化正常ケラチノサイトから収集した細胞上清を陰性対照として使用した。 ヒトカリクレイン５（ＫＬＫ５）の合成非天然ペプチド基質を用いたフルオロメトリーアッセイで評価される、指示されたＭＯＩでのＨＳＶ−Ｓ５に感染した不死化正常ケラチノサイトから収集した細胞培養上清とのインキュベーション後の組換えヒトＫＬＫ５のタンパク質分解活性における阻害パーセントを示す。非感染（模擬）不死化正常ケラチノサイトから収集した細胞上清を陰性対照として使用した。データを平均±標準誤差として提示する。 図５Ａ〜Ｆは、対照マウスまたはＨＳＶ−Ｓ５処理ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した皮膚生検の核酸及びタンパク質分析、ならびに組織学を示す。図５Ａは、ｑＰＣＲ分析によって評価される、ＨＳＶ−Ｓ５またはビヒクル対照の局所適用の４８時間後に採取した免疫担当動物の皮膚に存在するヒトＳＰＩＮＫ５のＤＮＡレベルを示す。 図５Ａ〜Ｆは、対照マウスまたはＨＳＶ−Ｓ５処理ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した皮膚生検の核酸及びタンパク質分析、ならびに組織学を示す。図５Ｂは、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価される、ＨＳＶ−Ｓ５またはビヒクル対照の局所適用の４８時間後に採取した免疫担当動物の皮膚に存在するヒトＳＰＩＮＫ５の転写物レベルを示す。 図５Ａ〜Ｆは、対照マウスまたはＨＳＶ−Ｓ５処理ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した皮膚生検の核酸及びタンパク質分析、ならびに組織学を示す。図５Ｃは、ｑＰＣＲ分析によって評価される、ＨＳＶ−Ｓ５またはビヒクル対照の皮内注射の４８時間後に採取した免疫担当動物の皮膚に存在するヒトＳＰＩＮＫ５のＤＮＡレベルを示す。 図５Ａ〜Ｆは、対照マウスまたはＨＳＶ−Ｓ５処理ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した皮膚生検の核酸及びタンパク質分析、ならびに組織学を示す。図５Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価される、ＨＳＶ−Ｓ５またはビヒクル対照の皮内注射の４８時間後に採取した免疫担当動物の皮膚に存在するヒトＳＰＩＮＫ５の転写物レベルを示す。ｑＰＣＲ分析及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析について、ビヒクル対照データを、２つの組織試料（２つの複製物／組織試料）の平均±標準誤差として提示し、ＨＳＶ−Ｓ５データを、６つの組織試料（２つの複製物／組織試料）の平均±標準誤差として提示する。 図５Ａ〜Ｆは、対照マウスまたはＨＳＶ−Ｓ５処理ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した皮膚生検の核酸及びタンパク質分析、ならびに組織学を示す。図５Ｅは、ＨＳＶ−Ｓ５またはビヒクル対照の局所適用の４８時間後にＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した皮膚生検におけるヒトＳＰＩＮＫ５及びマウスフィラグリンタンパク質発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。ＤＡＰＩ染色を使用して、核を可視化した。 図５Ａ〜Ｆは、対照マウスまたはＨＳＶ−Ｓ５処理ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した皮膚生検の核酸及びタンパク質分析、ならびに組織学を示す。図５Ｆは、ＨＳＶ−Ｓ５またはビヒクル対照の局所適用の４８時間後にＢＡＬＢ／ｃマウスから採取したマウス皮膚生検の代表的な組織学を示す。
詳細な説明
いくつかの実施形態では、本開示は、セリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型（ＳＰＩＮＫ）ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸（例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム）、及び／または（例えば、ゲノムがＳＰＩＮＫ遺伝子の機能喪失変異及び／または病原性バリアントを天然に有する対象における）ＳＰＩＮＫ遺伝子欠乏症を補充する及び／または治療する、及び／または医学的介入を、それを必要とする対象に提供する（例えば、ＳＰＩＮＫ遺伝子欠乏症（例えば、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎等）に起因する１つ以上の疾患または障害に予防的、姑息的、及び／または治療的緩和を提供する）ための、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）、組成物、製剤、薬剤、及び／または方法におけるそれらの組換え核酸の使用に関する。理論に拘束されることを望むことなく、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、組成物、製剤、薬剤、及び／または方法が、ネザートン症候群及び／またはアトピー性皮膚炎に罹患している個体における既存の皮膚異常の治療、ならびに治療された対象における皮膚異常の再形成の防止または遅延を助けるであろうと考えられる。
以下の記述は、例示的な方法及びパラメータ等を説明する。しかしながら、かかる記述が本開示の範囲を限定するようには意図されておらず、代わりに、例示的な実施形態の記述として提供されることを認識されたい。
Ｉ．一般的な技法
本明細書に記載または参照される技術及び手順は、当業者によって一般に十分に理解されており、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）に記載の広く利用されている方法論を使用して一般的に用いられている。
ＩＩ．定義
本開示を詳細に説明する前に、本開示が特定の組成物または生物学的系に限定されず、これらが言うまでもなく変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、内容がそうではないと明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、２つ以上のかかる分子の組み合わせを任意に含むといった具合である。
本明細書で使用される場合、「及び／または」という用語は、関連する列記される項目のうちの１つ以上のありとあらゆる組み合わせを含み得る。例えば、「ａ及び／またはｂ」という用語は、「ａのみ」、「ｂのみ」、「ａまたはｂ」、または「ａ及びｂ」を指し得、「ａ、ｂ、及び／またはｃ」という用語は、「ａのみ」、「ｂのみ」、「ｃのみ」、「ａまたはｂ」、「ａまたはｃ」、「ｂまたはｃ」、「ａ、ｂ、またはｃ」、「ａ及びｂ」、「ａ及びｃ」、「ｂ及びｃ」、または「ａ、ｂ、及びｃ」を指し得るといった具合である。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。
本開示の態様及び実施形態が、態様及び実施形態を「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」ことを含むことが理解される。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸」という用語、及びそれらの変形は、ポリマーが、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるように、塩基対合及び塩基スタッキングを可能にする立体配置で核酸塩基を含むという条件で、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、及び非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマーに対して包括的であるものとする。したがって、これらの用語には、既知のタイプの核酸配列修飾、例えば、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体での置換、及びヌクレオチド間修飾が含まれる。
本明細書で使用される場合、核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動的に連結されている」または「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されており、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けされている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動的に連結されている」または「作動可能に連結されている」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味する。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、異種核酸の発現または複製のいずれかのためにそれを細胞に導入するために使用される別個の要素を指す。発現ベクターには、かかる核酸の発現をもたらすことができるプロモーター領域等の調節配列と作動的に連結された核酸を発現することができるベクターが含まれる。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたときに核酸の発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクター等のＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を指し得る。適切な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞で複製可能なもの、及びエピソームのままであるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものを含む。
本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの連続した伸長を指す。典型的には、核酸は、ＡＴＧまたはＡＵＧ等の翻訳開始シグナルまたは開始コドン及び終止コドンを含む。
本明細書で使用される場合、「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」とは、オープンリーディングフレームの５’末端及び／または３’末端における非翻訳核酸を指す。１つ以上のＵＴＲをポリヌクレオチドに含めることにより、転写後制御、ｍＲＮＡ安定性、及び／またはポリヌクレオチドの翻訳に影響が及ぼされ得る。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入された後に、ＲＮＡに転写され、適切な条件下で翻訳及び／または発現されることができるポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、これは、それが導入された細胞に所望の特性を付与するか、またはさもなければ所望の治療結果または診断結果をもたらす。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という用語は、互換的に使用され、２つ以上のアミノ酸のポリマーを指し得る。
本明細書で使用される場合、「対象」、「宿主」、または「個体」とは、ヒト、家畜及び農場動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ならびに研究で使用される動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、及び非ヒト霊長類等を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
本明細書で使用される場合、「薬学的製剤」または「薬学的組成物」という用語は、活性成分（複数可）の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であり、組成物または製剤が投与される対象に対して許容し難いほどに毒性の追加の成分を含まない調製物を指す。「薬学的に許容される」賦形剤（例えば、ビヒクル、添加物）は、用いられる活性成分（複数可）の有効用量を提供するために対象哺乳動物に適度に投与され得るものである。
本明細書で使用される場合、「有効量」とは、特定の障害の１つ以上の症状の測定可能な改善または予防に影響を及ぼすのに必要な少なくとも最低限の量である。「有効量」は、患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重等の要因に応じて変化し得る。有効量は、治療の任意の毒性または有害効果を治療上有益な効果が上回る量でもある。予防的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、疾患、その合併症、及び疾患の発症中に提示される中間病理学的表現型のリスクの排除または低下、その重症度の軽減、またはその発症の遅延等の結果が含まれる。治療的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、疾患に起因する１つ以上の症状の軽減、疾患に罹患している者の生活の質の向上、疾患の症状を治療するために使用される他の薬剤の用量の減少、疾患の進行の遅延、及び／または生存期間の延長等の臨床結果が含まれる。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。本開示の目的のために、組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物の有効量は、直接または間接的のいずれかで予防的または治療的治療を達成するのに十分な量である。臨床状況で理解されるように、組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と併せて達成される場合も達成されない場合もある。したがって、「有効量」は、１つ以上の治療剤を投与する状況で考慮され得、１つ以上の他の薬剤と併せて望ましい結果が達成され得るまたは達成された場合、単一の薬剤が有効量で与えられたとみなされ得る。
本明細書で使用される場合、「治療」とは、臨床病理学の過程において治療される個体または細胞の自然経過を変化させるように設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい効果には、疾患／障害／欠損症の進行速度の低下、疾患／障害／欠損症状態の改善または緩和、及び寛解または予後の改善が含まれる。例えば、ネザートン症候群及び／またはアトピー性皮膚炎に関連する１つ以上の症状が軽減または除去された場合、個体は首尾よく「治療」される。
本明細書で使用される場合、疾患／障害／欠損症の「進行を遅延させる」という用語は、疾患／障害／欠損症の発症を引き延ばす、妨げる、遅延させる、遅らせる、安定化する、及び／または延期することを指す。この遅延は、疾患／障害／欠損症及び／または治療される個体の病歴に応じて、様々な長さまたは時間であり得る。当業者には明らかであるように、十分なまたは有意な遅延は、個体が疾患を発症しないという点で、実際には予防を包含し得る。
ＩＩＩ．組換え核酸
本開示のある特定の態様は、セリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型（ＳＰＩＮＫ）ポリペプチドをコードする１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上等）のポリヌクレオチドを含む組換え核酸（例えば、単離された組換え核酸）に関する。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする１つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする２つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、ヒトＳＰＩＮＫポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、セリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型５（ＳＰＩＮＫ５）ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ベクターである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、単純ヘルペスウイルスアンプリコンである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、組換えヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、組換え単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ゲノムである。
ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＰＩＮＫ遺伝子のコード配列またはその一部分（例えば、全長ＳＰＩＮＫポリペプチドのタンパク質分解切断から（例えば、フーリン切断により）生じる１つ以上のＫａｚａｌ型ドメインに対応するコード配列）を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ＳＰＩＮＫ１遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ１遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６６９０を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ２遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ２遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６６９１を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ４遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ４遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２７９２０を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１１００５を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ６遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ６遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４０４２０３を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ７遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ７遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８４６５１を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ８遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ８遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６４６４２４を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ９遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ９遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６４３３９４を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ１３遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ１３遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１５３２１８を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ１４遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ１４遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４０８１８７を参照のこと））等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適なＳＰＩＮＫ（その任意のアイソフォームを含む）が、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のいずれかのＳＰＩＮＫ遺伝子（及び／またはそのコード配列）の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）ｂｌａｓｔｎ ｓｕｉｔｅ等の核酸配列アラインメントプログラムの使用を含む、追加の種由来のＳＰＩＮＫ遺伝子ホモログ／オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、本開示の１つ以上のポリヌクレオチドは、ヒトＳＰＩＮＫ遺伝子のコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のＳＰＩＮＫ遺伝子のコドン最適化バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ遺伝子のコドン最適化バリアントの使用により、対応する非コドン最適化野生型配列の異種発現の安定性及び／または収率と比較して、標的細胞（例えば、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞等の標的ヒト細胞）におけるコードされたＳＰＩＮＫポリペプチドの異種発現（ＲＮＡ及び／またはタンパク質）の安定性及び／または収率が増加する。例えば、Ｆａｔｈ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１ Ｍａｒ ３；６（３）：ｅ１７５９６）によって説明される方法を含む、１つ以上の標的細胞（例えば、１つ以上のヒト細胞）における発現のための配列のコドン最適化を行うための当該技術分野で既知の任意の好適な方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５遺伝子）のコード配列またはその一部分（例えば、全長ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドのタンパク質分解切断から（例えば、フーリン切断により）生じる１つ以上のＫａｚａｌ型ドメインに対応するコード配列）を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え核酸に関する。例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１１００５、配列番号１、３、または５を参照のこと）、チンパンジーＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４６２１７３を参照のこと）、マウスＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７２４３２を参照のこと）、ラットＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３６１３１９を参照のこと）、イヌＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４７８０５５を参照のこと）、ウシＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５２６６３７を参照のこと）、ウマＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１０００７１８７３を参照のこと）、ブタＳＰＩＮＫ５遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１００５１２１６０を参照のこと）等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適なＳＰＩＮＫ５遺伝子（その任意のアイソフォームを含む）が、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のいずれかのＳＰＩＮＫ５遺伝子（及び／またはそのコード配列）の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）ｂｌａｓｔｎ ｓｕｉｔｅ等の核酸配列アラインメントプログラムの使用を含む、追加の種由来のＳＰＩＮＫ５遺伝子ホモログ／オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のＳＰＩＮＫ５遺伝子のコドン最適化バリアントを含む（例えば、配列番号２、４、６、または２６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５遺伝子のコドン最適化バリアント（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５遺伝子のコドン最適化バリアント）の使用により、対応する非コドン最適化野生型配列の異種発現の安定性及び／または収率と比較して、標的細胞（例えば、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞等の標的ヒト細胞）におけるコードされたＳＰＩＮＫ５ポリペプチドの異種発現（ＲＮＡ及び／またはタンパク質）の安定性及び／または収率が増加する。例えば、Ｆａｔｈ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１ Ｍａｒ ３；６（３）：ｅ１７５９６）によって説明される方法を含む、１つ以上の標的細胞（例えば、１つ以上のヒト細胞）における発現のための配列のコドン最適化を行うための当該技術分野で既知の任意の好適な方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の１つ以上のポリヌクレオチドは、ヒトＳＰＩＮＫ５遺伝子（またはそのコドン最適化バリアント）のコード配列またはその一部分（例えば、全長ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドのタンパク質分解切断から（例えば、ヒトフーリン切断により）生じる１つ以上のＫａｚａｌ型ドメインに対応するコード配列）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１〜６及び２６から選択される配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１〜６及び２６から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、及び２６から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の配列の５’切断、３’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１または配列番号２の配列の５’切断、３’切断、または断片は、配列番号１または配列番号２の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、または少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００、少なくとも１７５０、少なくとも２０００、少なくとも２２５０、少なくとも２５００、少なくとも２７５０、少なくとも３０００、少なくとも３２５０個であるが、３２８５個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１〜３２８２の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１〜３２８２の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸８２〜１９８の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸８２〜１９８の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸２７１〜４５９の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸２７１〜４５９の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸４６３〜６４８の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸４６３〜６４８の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸６５５〜８５５の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸６５５〜８５５の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸８７１〜１０５６の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸８７１〜１０５６の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１０８１〜１２６９の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１０８１〜１２６９の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１２９１〜１４６７の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１２９１〜１４６７の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１４６８〜１６５３の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１４６８〜１６５３の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１６８１〜１８６６の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１６８１〜１８６６の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１８７６〜２０６４の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸１８７６〜２０６４の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸２１０１〜２２７１の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸２１０１〜２２７１の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸２３０２〜２４９０の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸２３０２〜２４９０の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸２５２７〜２７１５の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸２５２７〜２７１５の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸２７２８〜３００３の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸２７２８〜３００３の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸３０４９〜３２３４の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の核酸３０４９〜３２３４の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３または配列番号４の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３または配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３または配列番号４の配列の５’切断、３’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３または配列番号４の配列の５’切断、３’切断、または断片は、配列番号３または配列番号４の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、または少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００、少なくとも１７５０、少なくとも２０００、２２５０、少なくとも２５００、少なくとも２７５０個であるが、２７５１個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３または配列番号４の核酸１〜２７４８の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３または配列番号４の核酸１〜２７４８の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６、または配列番号２６の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６、または配列番号２６の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号６の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２６の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６、または配列番号２６の配列の５’切断、３’切断、または断片を含む。いくつかの実施形態では、配列番号５、配列番号６、または配列番号２６の配列の５’切断、３’切断、または断片は、配列番号５、配列番号６、または配列番号２６の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、または少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００、少なくとも１７５０、少なくとも２０００、少なくとも２２５０、少なくとも２５００、少なくとも２７５０、少なくとも３０００個であるが、３１９５個未満の連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６、または配列番号２６の核酸１〜３１９２の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６、または配列番号２６の核酸１〜３１９２の配列を含む。
ＳＰＩＮＫポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド）をコードする本開示のポリヌクレオチドは、追加のコード配列及び非コード配列をさらにコードし得る。追加のコード配列及び非コード配列の例には、追加のポリペプチドタグをコードする配列（例えば、融合タンパク質を産生するためにＳＰＩＮＫタンパク質とインフレームでコードされる）、イントロン（例えば、天然、修飾、または異種イントロン）、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ（例えば、天然、修飾、または異種５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）等が挙げられるが、これらに限定されない。好適なポリペプチドタグの例には、精製タグ、例えば、ｈｉｓタグ、ｆｌａｇタグ、マルトース結合タンパク質及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、検出タグ、例えば、測光的に検出され得るタグ（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質等）及び検出可能な酵素活性を有するタグ（例えば、アルカリホスファターゼ等）、分泌配列、シグナル配列、リーダー配列、及び／または安定化配列、プロテアーゼ切断部位（例えば、フーリン切断部位、ＴＥＶ切断部位、トロンビン切断部位等）等を含むタグの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、ポリヌクレオチドの安定性、局在化、及び／または翻訳効率を増加させる。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、タンパク質発現レベル及び／または持続時間を改善する。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、オフターゲット発現を遮断し得るまたは減少させ得る（例えば、特定の細胞型（例えば、神経細胞）における発現を、細胞周期の特定の時点で、特定の発達段階で阻害する）エレメント（例えば、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位等）を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、特定の細胞型（ヒトケラチノサイト及び／または線維芽細胞等）におけるエフェクタータンパク質発現を強化し得るエレメント（例えば、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位等）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上等）の調節配列に作動可能に連結されている。「調節配列」という用語は、エンハンサー、インシュレーター、プロモーター、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含み得る。例えば、哺乳類遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、インスリン等）由来のエンハンサー配列、真核細胞ウイルス由来のエンハンサー配列（例えば、複製起点の後半側（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー等）、及びそれらの任意の組み合わせを含む、当該技術分野で既知の任意の好適なエンハンサー（複数可）が使用され得る。例えば、ヒトインターフェロンベータ遺伝子（ＩＦＮＢ１）由来の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）クロマチン境界（ＣＴＲＬ／ＣＴＣＦ結合／インシュレーター）エレメントＣＴＲＬ１及び／またはＣＴＲＬ２、ニワトリ高感受性部位４インシュレーター（ｃＨＳ４）、ヒトＨＮＲＰＡ２Ｂ１−ＣＢＸ３ユビキタスクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）、足場／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）、及びそれらの任意の組み合わせを含む、当該技術分野で既知の任意の好適なインシュレーター（複数可）が使用され得る。例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等）のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳類遺伝子由来のプロモーター（例えば、アクチンプロモーター（例えば、β−アクチンプロモーター）、ユビキチンプロモーター（例えば、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックタンパク質プロモーター等）、天然及び／または相同哺乳類遺伝子由来のプロモーター（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ遺伝子プロモーター）、合成プロモーター（例えば、ＣＡＧＧプロモーター等）、及びそれらの任意の組み合わせを含む、当該技術分野で既知の任意の好適なプロモーター（例えば、哺乳類宿主細胞での転写に好適なプロモーター）が使用され得る。調節配列は、核酸、ならびに組織特異的調節配列及び／または誘導性もしくは抑制性配列の構成的発現を指示する配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、１つ以上の異種プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の異種プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時間的プロモーター、空間的プロモーター、誘導性プロモーター、及び抑制性プロモーターのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、１つ以上の異種プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期プロモーター、ヒト伸長因子−１（ＥＦ１）プロモーター、ヒトβ−アクチンプロモーター、ヒトＵｂＣプロモーター、ヒトＰＧＫプロモーター、合成ＣＡＧＧプロモーター、及びそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＨＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド（ＣＯＬ７）（例えば、それをコードする導入遺伝子）のコード配列を含むポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、リシルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド（ＬＨ３）（例えば、それをコードする導入遺伝子）のコード配列を含むポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド（ＫＲＴ１７）（例えば、それをコードする導入遺伝子）のコード配列を含むポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、トランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ）ポリペプチド（例えば、ヒトＴＧＭ１ポリペプチド等のヒトトランスグルタミナーゼポリペプチド）（例えば、それをコードする導入遺伝子）のコード配列を含むポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、美容タンパク質（例えば、コラーゲンタンパク質、フィブロネクチン、エラスチン、ルミカン、ビトロネクチン／ビトロネクチン受容体、ラミニン、神経調節物質、フィブリリン、追加の皮膚細胞外マトリックスタンパク質等）（例えば、それをコードする導入遺伝子）のコード配列を含むポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、抗体（例えば、全長抗体、抗体断片等）（例えば、それをコードする導入遺伝子）のコード配列を含むポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リシルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、及び／またはそれらの任意のキメラポリペプチド（例えば、それをコードする導入遺伝子）のコード配列を含むポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、コラーゲンアルファ−１（ＶＩＩ）鎖ポリペプチド、リシルヒドロキシラーゼ３ポリペプチド、ケラチンＩ型細胞骨格１７ポリペプチド、トランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ）ポリペプチド、美容タンパク質、抗体、及び／またはそれらの任意のキメラポリペプチド（例えば、それをコードする導入遺伝子）のコード配列を含むポリヌクレオチドを含まない。
ＳＰＩＮＫポリペプチド
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＰＩＮＫポリペプチドまたはその任意の一部分（例えば、全長ＳＰＩＮＫポリペプチドのタンパク質分解切断から（例えば、フーリン切断により）生じる１つ以上のＫａｚａｌ型ドメインのアミノ酸配列）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ＳＰＩＮＫ１ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ１ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｐ００９９５を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ２ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ２ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｐ２０１５５を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ４ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｏ６０５７５を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｑ９ＮＱ３８を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ６ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ６ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｑ６ＵＷＮ８を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ７ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ７ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｐ５８０６２を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ８ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ８ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｐ０Ｃ７Ｌ１を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ９ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ９ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｑ５ＤＴ２１を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ１３ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ１３ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｑ１Ｗ４Ｃ９を参照のこと））、ＳＰＩＮＫ１４ポリペプチド（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ１４ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｑ６ＩＥ３８を参照のこと））等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適なＳＰＩＮＫポリペプチド（またはその一部分）が、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫポリペプチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のいずれかのＳＰＩＮＫポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）ｂｌａｓｔｐ ｓｕｉｔｅまたはＯｒｔｈｏＤＢ等のアミノ酸配列アラインメントプログラムの使用を含む、追加の種由来のＳＰＩＮＫポリペプチドホモログ／オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、ヒトＳＰＩＮＫポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、配列番号７〜９）またはその任意の一部分（例えば、全長ＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、配列番号１０〜２５）のタンパク質分解切断から（例えば、フーリン切断により）生じる１つ以上のＫａｚａｌ型ドメインのアミノ酸配列）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドに関する。例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：１１００５を参照のこと）、チンパンジーＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：４６２１７３を参照のこと）、マウスＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｑ５Ｋ５Ｄ４を参照のこと）、ラットＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｄ３ＺＥＴ２を参照のこと）、イヌＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｆ１ＰＲ８０を参照のこと）、ウシＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｆ１ＭＪＨ０を参照のこと）、ウマＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｂ９ＶＪ４０を参照のこと）、ブタＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号：Ｆ１ＲＬＺ２を参照のこと）等を含む、当該技術分野で既知の任意の好適なＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（またはその一部分）が、本開示のポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のいずれかのＳＰＩＮＫ５ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）ｂｌａｓｔｐ ｓｕｉｔｅまたはＯｒｔｈｏＤＢ等のアミノ酸配列アラインメントプログラムの使用を含む、追加の種由来のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドホモログ／オルソログを特定する方法は、当業者に既知である。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドまたはその一部分（例えば、全長ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドのタンパク質分解切断から（例えば、ヒトフーリン切断により）生じる１つ以上のＫａｚａｌ型ドメインに対応するアミノ酸配列を含むポリペプチド）である。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７〜２５から選択される配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７〜２５から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７〜９から選択される配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７〜９から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号７〜２５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号７〜２５から選択される配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号７〜９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号７〜９から選択される配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７のアミノ酸配列のＮ末端切断、Ｃ末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、または断片は、配列番号７の少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００個であるが、１０９４個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８のアミノ酸配列のＮ末端切断、Ｃ末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、または断片は、配列番号８の少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００個であるが、９１６個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９のアミノ酸配列のＮ末端切断、Ｃ末端切断、または断片をコードするポリヌクレオチドである。Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、または断片は、配列番号９の少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００個であるが、１０６４個未満の連続するアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドに由来するＫａｚａｌ型ドメイン（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５のタンパク質分解切断から（例えば、フーリン切断を介して）生じるＫａｚａｌ型ドメイン）をコードする。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１０の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１１の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１２の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１３の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１４の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１５の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、または配列からなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１６の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１７の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１８の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１９の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２０の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２１の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２２の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２３の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２４の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２５の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチド）をコードする本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが対象の１つ以上の標的細胞に送達されると、ＳＰＩＮＫポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチド）の発現は、（例えば、外因性ＳＰＩＮＫポリペプチドの発現前と比較して）対象の１つ以上の標的細胞におけるＳＰＩＮＫポリペプチドのレベル、機能、及び／または活性を強化する、増加させる、増強する、及び／または補充する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチド）の発現は、対象における粘膜上皮の抗炎症保護及び／または抗微生物保護を強化する、増加させる、増強する、及び／または補充する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチド）の発現は、対象の皮膚の完全性及び／または保護バリア機能を強化する、増加させる、増強する、及び／または補充する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチド）の発現は、対象におけるカリクレイン−５（ＫＬＫ５）、カリクレイン−７（ＫＬＫ７）、カリクレイン−１４（ＫＬＫ１４）、カスパーゼ−１４（ＣＡＳＰ１４）、及び／またはトリプシンのうちの１つ以上を減少させる、増強する、及び／または阻害する（例えば、ＫＬＫ５、ＫＬＫ７、ＫＬＫ１４、ＣＡＳＰ１４、及び／またはトリプシンの１つ以上の活性を減少させる、増強する、及び／または阻害する）。
組換え核酸
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター、ディスプレイベクター等）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。一般に、ポリヌクレオチドを維持する、増殖させる、及び／または発現して、対象において１つ以上のポリペプチドを産生するのに好適なベクターが使用され得る。好適なベクターの例には、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、トランスポゾン、及びウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、麻疹ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等）が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で自己複製することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で自己複製することができない。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主ＤＮＡに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主ＤＮＡに組み込むことができない（例えば、エピソーム性である）。例えば、化学合成または核酸の単離されたセグメントの人為的操作（例えば、遺伝子操作技法）等による、目的とする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターを作製する方法は、当業者に周知である。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）アンプリコンである。構造的特徴を含むヘルペスウイルスアンプリコン及びそれを作製する方法は、当業者に一般に既知である（例えば、ｄｅ Ｓｉｌｖａ Ｓ．ａｎｄ Ｂｏｗｅｒｓ Ｗ．“Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”．Ｖｉｒｕｓｅｓ ２００９，１，５９４−６２９を参照のこと）。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスアンプリコンは、ＨＳＶ−１アンプリコンである。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスアンプリコンは、ＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンである。ＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンの例には、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドアンプリコン、ＨＳＶ／ＥＢＶハイブリッドアンプリコン、ＨＳＶ／ＥＢＶ／ＲＶハイブリッドアンプリコン、及び／またはＨＳＶ／スリーピングビューティーハイブリッドアンプリコンが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、ＨＳＶ／スリーピングビューティーハイブリッドアンプリコンである。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸は、組換えヘルペスウイルスゲノムである。例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム、組換え水痘帯状疱疹ウイルスゲノム、組換えヒトサイトメガロウイルスゲノム、組換えヘルペスウイルス６Ａゲノム、組換えヘルペスウイルス６Ｂゲノム、組換えヘルペスウイルス７ゲノム、組換えカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスゲノム、及びそれらの任意の組み合わせまたは派生物を含む、組換えヘルペスウイルスゲノムは、当該技術分野で既知のＤＮＡウイルスのヘルペスウイルス科ファミリーの任意のメンバー由来の組換えゲノムであり得る。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上等）の不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の不活性化変異は、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上等）のヘルペスウイルス遺伝子に存在する。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、（例えば、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して）弱毒化されている。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、複製可能である。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノムは、複製欠損である。
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムである。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換え単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ゲノム、組換え単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）ゲノム、またはそれらの任意の派生物である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、組換えＨＳＶ−１ゲノムである。いくつかの実施形態では、組換えＨＳＶ−１ゲノムは、例えば、株１７、Ｔｙ２５、Ｒ６２、Ｓ２５、Ｋｕ８６、Ｓ２３、Ｒ１１、Ｔｙ１４８、Ｋｕ４７、Ｈ１６６ｓｙｎ、１３１９−２００５、Ｆ−１３、Ｍ−１２、９０２３７、Ｆ−１７、ＫＯＳ、３０８３−２００８、Ｆ１２ｇ、Ｌ２、ＣＤ３８、Ｈ１９３、Ｍ−１５、Ｉｎｄｉａ ２０１１、０１１６２０９、Ｆ−１１Ｉ、６６−２０７、２７６２、３６９−２００７、３３５５、ＭａｃＩｎｔｙｒｅ、ＭｃＫｒａｅ、７８６２、７−ｈｓｅ、ＨＦ１０、１３９４，２００５、２７０−２００７、ＯＤ４、ＳＣ１６、Ｍ−１９、４Ｊ１０３７、５Ｊ１０６０、Ｊ１０６０、ＫＯＳ７９、１３２−１９８８、１６０−１９８２、Ｈ１６６、２１５８−２００７、ＲＥ、７８３２６、Ｆ１８ｇ、Ｆ１１、１７２−２０１０、Ｈ１２９、Ｆ、Ｅ４、ＣＪ９９４、Ｆ１４ｇ、Ｅ０３、Ｅ２２、Ｅ１０、Ｅ０６、Ｅ１１、Ｅ２５、Ｅ２３、Ｅ３５、Ｅ１５、Ｅ０７、Ｅ１２、Ｅ１４、Ｅ０８、Ｅ１９、Ｅ１３、ＡＴＣＣ ２０１１等を含む、当該技術分野で既知の任意のＨＳＶ−１株由来であり得る（例えば、Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１９ Ａｐｒ ３；９３（８）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、組換えＨＳＶ−１ゲノムは、ＫＯＳ株由来である。いくつかの実施形態では、組換えＨＳＶ−１ゲノムは、ＭｃＫｒａｅ株由来ではない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、弱毒化されている。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、複製可能である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、複製欠損である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上等）の不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の不活性化変異は、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上等）の単純ヘルペスウイルス遺伝子に存在する。本明細書で使用される場合、「不活性化変異」とは、（例えば、不活性化変異を欠く対応する配列と比較して）低下した、検出不能な、または排除された量及び／または機能を有する遺伝子またはレギュロン産物（ＲＮＡまたはタンパク質）をもたらす任意の変異を指し得る。不活性化変異の例には、欠失、挿入、点変異、ならびに所与の遺伝子もしくはレギュロンの転写制御配列（プロモーター、エンハンサー、インシュレーター等）及び／またはコード配列の再編成が挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡｓｅｑ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等を含む、当該技術分野で既知の遺伝子またはレギュロン産物の量を測定する任意の好適な方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、感染細胞タンパク質（または感染細胞ポリペプチド）（ＩＣＰ）０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ロングユニーク領域（ＵＬ）４１、及び／またはＵＬ５５単純ヘルペスウイルス遺伝子のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または８つ全てに不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ３４．５（一方または両方のコピー）単純ヘルペスウイルス遺伝子及び／またはＩＣＰ４７単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含まない（例えば、免疫刺激ウイルスの産生を回避するために）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ３４．５（一方または両方のコピー）単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含まない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含まない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ３４．５（一方または両方のコピー）単純ヘルペスウイルス遺伝子及びＩＣＰ４７単純ヘルペスウイルス遺伝子に不活性化変異を含まない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、腫瘍溶解性ではない。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＵＬ４１、及び／またはＵＬ５５遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ４遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ４遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ４遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含み、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ４遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含み、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及び／またはＵＬ４１遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及び／またはＵＬ５５遺伝子に不活性化変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＵＬ４１、及び／またはＵＬ５５遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４遺伝子（一方または両方のコピー）に不活性化変異を含み、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含み、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及び／またはＵＬ４１遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及び／またはＵＬ５５遺伝子に不活性化変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含み、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＵＬ４１、及び／またはＵＬ５５遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含み、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ＩＣＰ２２及び／またはＵＬ４１遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及び／またはＵＬ５５遺伝子に不活性化変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２７遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ２７遺伝子に不活性化変異を含み、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ４７、ＵＬ４１、及び／またはＵＬ５５遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ＩＣＰ２７遺伝子のコード配列の欠失である。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子に不活性化変異を含み、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＵＬ４１、及び／またはＵＬ５５遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ＩＣＰ４７遺伝子のコード配列の欠失である。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含み、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及び／またはＵＬ５５遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ＵＬ４１遺伝子のコード配列の欠失である。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ５５遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＵＬ５５遺伝子に不活性化変異を含み、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及び／またはＵＬ４１遺伝子に不活性化変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、不活性化変異は、ＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失である。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、内部リピートロング（ＩＲＬ）領域及び内部リピートショート（ＩＲＳ）領域を含む内部リピート（ジョイント）領域に不活性化変異（例えば、その欠失）を含む。いくつかの実施形態では、ジョイント領域の不活性化（例えば、欠失）は、ＩＣＰ４遺伝子及びＩＣＰ０遺伝子の各々１つのコピーを除去する。いくつかの実施形態では、ジョイント領域の不活性化（例えば、欠失）は、ＩＣＰ２２遺伝子及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーターをさらに不活性化する（例えば、欠失させる）。所望の場合、これらの遺伝子の一方または両方の発現は、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムへの前初期プロモーターの挿入によって回復し得る（例えば、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｎａｔｕｒｅ ３７５（６５３０）：４１１−４１５、Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８７（３）：３４１−３４８）。理論に拘束されることを望むことなく、ジョイント領域の不活性化（例えば、欠失）が、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムの安定性に寄与し得る、及び／または組換え単純ヘルペスウイルスゲノムがより多くの及び／またはより大きい導入遺伝子を収容することを可能にすると考えられる。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びＵＬ５５遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２７、及び／またはＵＬ５５遺伝子における不活性化変異は、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２７、及び／またはＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失である。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ２２遺伝子及びＩＣＰ４７遺伝子における不活性化変異は、ＩＣＰ２２遺伝子及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域の欠失である（例えば、ＩＣＰ２２コード配列及びＩＣＰ４７コード配列はインタクトであるが、転写的に活性ではない）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失、ならびにＩＣＰ２２遺伝子及びＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域の欠失を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０遺伝子（１つまたは両方のコピー）及び／またはＵＬ４１遺伝子に不活性化変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）及びＩＣＰ４（一方または両方のコピー）遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、及びＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、及びＩＣＰ２７遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及びＵＬ５５遺伝子に不活性化変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及び／またはＵＬ５５遺伝子における不活性化変異は、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、及び／またはＵＬ５５遺伝子のコード配列の欠失を含む。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ４７遺伝子及び／またはＵＬ４１遺伝子に不活性化変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のウイルス遺伝子座内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む。好適なウイルス遺伝子座の例には、ＩＣＰ０（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ４（一方または両方のコピー）、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ｔｋ、ＵＬ４１、及び／またはＵＬ５５単純ヘルペスウイルス遺伝子座が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルス）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ２２遺伝子座内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ２２遺伝子座内にＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルス）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＵＬ４１遺伝子座内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＵＬ４１遺伝子座内にＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルス）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４７遺伝子座内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ４７遺伝子座内にＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルス）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含み、ウイルスＩＣＰ２２遺伝子座内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びＩＣＰ２２遺伝子座に同じまたは異なるＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルス）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含み、ウイルスＵＬ４１遺伝子座内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方にＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座に同じまたは異なるＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルス）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ２２遺伝子座内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含み、ウイルスＵＬ４１遺伝子座内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ２２遺伝子座にＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びＵＬ４１遺伝子座に同じまたは異なるＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルス）。いくつかの実施形態では、組換え単純ヘルペスウイルスゲノムは、ウイルスＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含み、ウイルスＩＣＰ２２遺伝子座内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含み、ウイルスＵＬ４１遺伝子座内に本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む（例えば、ＩＣＰ４遺伝子座の一方または両方に、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＩＣＰ２２遺伝子座に、同じまたは異なるＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びＵＬ４１遺伝子座に、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＩＣＰ４遺伝子座及び／またはＩＣＰ２２遺伝子座にコードされたＳＰＩＮＫポリペプチドと同じＳＰＩＮＫポリペプチドであってもよく、またはＩＣＰ４遺伝子座及び／またはＩＣＰ２２遺伝子座にコードされたＳＰＩＮＫポリペプチドとは異なるＳＰＩＮＫポリペプチドであってもよい）を含む、組換えウイルス）。
いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノム（例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム）は、ＨＳＶ ＩＣＰ０遺伝子の一方または両方のコピー、ＨＳＶ ＩＣＰ４遺伝子の一方または両方のコピー、ＨＳＶ ＩＣＰ２２遺伝子、ＨＳＶ ＵＬ４１遺伝子、ＨＳＶ ＩＣＰ２７遺伝子等の１つ以上のヘルペスウイルス遺伝子（例えば、１つ以上の毒性ヘルペスウイルス遺伝子）の発現を減少させるまたは排除するように操作されている。いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノム（例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム）は、（例えば、標的細胞に導入されると）対応する野生型ヘルペスウイルスゲノム（例えば、野生型単純ヘルペスウイルスゲノム）と比較して組換えゲノムの細胞毒性を減少させるように操作されている。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、表皮細胞及び／または真皮細胞（例えば、ヒト表皮細胞及び／またはヒト真皮細胞）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ケラチノサイトまたは線維芽細胞（例えば、ヒトケラチノサイトまたはヒト線維芽細胞）である。いくつかの実施形態では、組換えゲノム（例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム）の（例えば、ヒトケラチノサイト及び／または線維芽細胞における）細胞毒性は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％減少する（例えば、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞（初代細胞または細胞株）における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムに対する組換えΔＩＣＰ４（一方または両方のコピー）単純ヘルペスウイルスゲノムの相対的細胞毒性の測定、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞（初代細胞または細胞株）における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムに対する組換えΔＩＣＰ４（一方または両方のコピー）／ΔＩＣＰ２２単純ヘルペスウイルスゲノムの相対的細胞毒性の測定等）。いくつかの実施形態では、組換えゲノム（例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム）の（例えば、ヒトケラチノサイト及び／または線維芽細胞における）細胞毒性は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、またはそれ以上減少する（例えば、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞（初代細胞または細胞株）における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムに対する組換えΔＩＣＰ４（一方または両方のコピー）単純ヘルペスウイルスゲノムの相対的細胞毒性の測定、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞（初代細胞または細胞株）における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムに対する組換えΔＩＣＰ４（一方または両方のコピー）／ΔＩＣＰ２２単純ヘルペスウイルスゲノムの相対的細胞毒性の測定等）。例えば、生体色素（ホルマザン色素）、プロテアーゼバイオマーカー、ＭＴＴアッセイ（またはＸＴＴ、ＭＴＳ、水溶性テトラゾリウム塩等の関連テトラゾリウム塩を使用するアッセイ）の使用、ＡＴＰ含有量の測定等を含む、細胞毒性を測定する方法は、当業者に既知である。
いくつかの実施形態では、組換えヘルペスウイルスゲノム（例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム）は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノム（例えば、野生型単純ヘルペスウイルスゲノム）と比較して、標的細胞の組換えゲノムへの曝露後の宿主細胞増殖に対するその影響を低減するように操作されている。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、表皮細胞及び／または真皮細胞（例えば、ヒト表皮細胞及び／またはヒト真皮細胞）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ケラチノサイトまたは線維芽細胞（例えば、ヒトケラチノサイトまたはヒト線維芽細胞）である。いくつかの実施形態では、組換えゲノムへの曝露後の宿主細胞増殖（例えば、ヒトケラチノサイト及び／または線維芽細胞）は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の宿主細胞増殖と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％速い（例えば、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞（初代細胞または細胞株）における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の細胞増殖に対する組換えΔＩＣＰ４（一方または両方のコピー）単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の相対的細胞増殖の測定、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞（初代細胞または細胞株）における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の細胞増殖に対する組換えΔＩＣＰ４（一方または両方のコピー）／ΔＩＣＰ２２単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の相対的細胞増殖の測定等）。いくつかの実施形態では、組換えゲノムへの曝露後の宿主細胞増殖（例えば、ヒトケラチノサイト及び／または線維芽細胞）は、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の宿主細胞増殖と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１０００倍速い（例えば、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞（初代細胞または細胞株）における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の細胞増殖に対する組換えΔＩＣＰ４（一方または両方のコピー）単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の相対的細胞増殖の測定、ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞（初代細胞または細胞株）における野生型単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の細胞増殖に対する組換えΔＩＣＰ４（一方または両方のコピー）／ΔＩＣＰ２２単純ヘルペスウイルスゲノムへの曝露後の相対的細胞増殖の測定等）。例えば、Ｋｉ６７細胞増殖アッセイ、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ等の使用を含む、細胞増殖を測定する方法は、当業者に既知である。
ベクター（例えば、ヘルペスウイルスベクター）は、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現に好適な形態で本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。ベクターは、（例えば、上述のように）発現されるポリヌクレオチドに作動的に連結された１つ以上の調節配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え核酸（例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム等の組換えヘルペスウイルスゲノム）は、組換え核酸に任意の配向で挿入された本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含む。組換え核酸が本明細書に記載の２つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上等）のポリヌクレオチドを含む場合、これらのポリヌクレオチドは、同じ配向でまたは互いに反対の配向で挿入され得る。理論に拘束されることを望むことなく、２つのポリヌクレオチド（例えば、２つの導入遺伝子）をアンチセンス配向で組換え核酸（例えば、ベクター）に組み込むことにより、リードスルーを回避し、各ポリヌクレオチドの適切な発現を確実にする助けとなり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組換え核酸のうちのいずれかを含む１つ以上の異種ポリヌクレオチド（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ））に関する。
ＩＶ．ウイルス
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び／または組換え核酸のうちのいずれかを含むウイルスに関する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、対象（例えば、ヒト）の１つ以上の標的細胞に感染することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ポリヌクレオチド及び／または組換え核酸を対象（例えば、ヒト）の１つ以上の標的細胞に送達するのに好適である。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び／または組換え核酸のうちのいずれかを含む１つ以上のウイルス粒子に関する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、１つ以上のヒト細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、ＳＰＩＮＫ欠乏症を有する１つ以上の細胞（例えば、ＳＰＩＮＫ５遺伝子等の天然ＳＰＩＮＫ遺伝子における機能喪失変異、またはその病原性バリアントを含む１つ以上の細胞）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、１つ以上の皮膚細胞（例えば、１つ以上の表皮細胞、真皮細胞、及び／または皮下細胞）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、表皮細胞及び／または真皮細胞（例えば、ヒト表皮細胞及び／または真皮細胞）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、マスト細胞、線維芽細胞、及び／または脂肪細胞から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、ケラチノサイトである。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、角質層、顆粒層、有棘層、基底層、及び／または基底膜に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、１つ以上の表皮細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞は、１つ以上の真皮細胞である。
例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ワクシニアウイルス、及び／またはそれらの任意のハイブリッドもしくは派生物ウイルスを含む、当該技術分野で既知の任意の好適なウイルスが使用され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、弱毒化されている。いくつかの実施形態では、ウイルスは、複製欠損である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、複製可能である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、対応する修飾されていない野生型ウイルスの組織向性と比較してその組織向性を改変するように修飾されている。いくつかの実施形態では、ウイルスは、対応する野生型ウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する。組換え核酸を含むウイルスを産生する方法は、当業者に周知である。
いくつかの実施形態では、ウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス６Ａ、ヘルペスウイルス６Ｂ、ヘルペスウイルス７、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス等を含む、ＤＮＡウイルスのヘルペスウイルス科ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、弱毒化されている。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、複製欠損である。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、複製可能である。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、対応する野生型ヘルペスウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する。いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、腫瘍溶解性ではない。
いくつかの実施形態では、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスである。組換え核酸を含む単純ヘルペスウイルスは、例えば、ＷＯ２０１５／００９９５２及び／またはＷＯ２０１７／１７６３３６に開示されるプロセスによって産生され得る。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、弱毒化されている。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、複製欠損である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、複製可能である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ウイルス、ＨＳＶ−２、またはそれらの任意の派生物である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ウイルスである。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−１は、弱毒化されている。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−１は、複製欠損である。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−１は、複製可能である。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１）は、対応する野生型単純ヘルペスウイルス（例えば、野生型ＨＳＶ−１）と比較して減少した細胞毒性を有する。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１）は、腫瘍溶解性ではない。
いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、修飾されていない野生型単純ヘルペスウイルスの組織向性と比較してその組織向性を改変するように修飾されている。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスは、修飾されたエンベロープを含む。いくつかの実施形態では、修飾されたエンベロープは、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上等）の変異単純ヘルペスウイルス糖タンパク質を含む。単純ヘルペスウイルス糖タンパク質の例には、糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＨ、及びｇＬが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、修飾されたエンベロープは、野生型単純ヘルペスウイルスと比較して単純ヘルペスウイルス組織向性を改変する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞（例えば、１つ以上のヒトケラチノサイト及び／または線維芽細胞）に対する本開示のウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス等のヘルペスウイルス）の形質導入効率（インビトロ及び／またはインビボ）は、少なくとも約２５％である。例えば、１つ以上の標的細胞に対するウイルスの形質導入効率は、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペスウイルスであり、１つ以上の標的細胞（例えば、１つ以上のヒトケラチノサイト及び／または線維芽細胞）に対するウイルスの形質導入効率は、約８５％〜約１００％である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、単純ヘルペスウイルスであり、１つ以上の標的細胞（例えば、１つ以上のヒトケラチノサイト及び／または線維芽細胞）に対するウイルスの形質導入効率は、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。例えば、ｑＰＣＲ分析、ディープシーケンシング、ウエスタンブロッティング、蛍光定量分析（蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、蛍光レポーター遺伝子発現、免疫蛍光、ＦＡＣＳ等）等を含む、ウイルス形質導入効率をインビトロまたはインビボで測定する方法は、当業者に周知である。
Ｖ．薬学的組成物及び製剤
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載の組換え核酸（例えば、組換えヘルペスウイルスゲノム）及び／またはウイルス（例えば、組換えゲノムを含むヘルペスウイルス（組換え単純ヘルペスウイルスゲノムを含む単純ヘルペスウイルス等）のうちのいずれかと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む薬学的組成物及び製剤に関する。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、本明細書に記載のウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）のうちのいずれか１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、約１０４〜約１０１２プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬのウイルスを含む。例えば、薬学的組成物または製剤は、約１０４〜約１０１２、約１０５〜約１０１２、約１０６〜約１０１２、約１０７〜約１０１２、約１０８〜約１０１２、約１０９〜約１０１２、約１０１０〜約１０１２、約１０１１〜約１０１２、約１０４〜約１０１１、約１０５〜約１０１１、約１０６〜約１０１１、約１０７〜約１０１１、約１０８〜約１０１１、約１０９〜約１０１１、約１０１０〜約１０１１、約１０４〜約１０１０、約１０５〜約１０１０、約１０６〜約１０１０、約１０７〜約１０１０、約１０８〜約１０１０、約１０９〜約１０１０、約１０４〜約１０９、約１０５〜約１０９、約１０６〜約１０９、約１０７〜約１０９、約１０８〜約１０９、約１０４〜約１０８、約１０５〜約１０８、約１０６〜約１０８、約１０７〜約１０８、約１０４〜約１０７、約１０５〜約１０７、約１０６〜約１０７、約１０４〜約１０６、約１０５〜約１０６、または約１０４〜約１０５ＰＦＵ／ｍＬのウイルスを含み得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、または約１０１２ＰＦＵ／ｍＬのウイルスを含む。
薬学的組成物及び製剤は、所望の純度を有する活性成分（複数可）（組換え核酸及び／またはウイルス等）を１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することによって調製され得る。薬学的に許容される担体または賦形剤は、一般に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、緩衝液（リン酸、クエン酸、酢酸、及び他の有機酸等）、抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニン等）、保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール等）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等）、ポリオール（グリセロール等、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％等のグリセロールを含む製剤）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）、単糖、二糖、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、糖（スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等）、塩形成対イオン（ナトリウム等）、金属錯体（Ｚｎ−タンパク質錯体等）、及び／または非イオン性界面活性剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）を含み得る。薬学的に許容される担体の詳細な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質）担体を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、１つ以上のナノ粒子担体を含む。ナノ粒子は、迅速放出または制御放出のためのカプセル化された薬物（合成小分子、タンパク質、ペプチド、細胞、ウイルス、及び核酸ベースの生物学的治療薬等）を運ぶことができるサブミクロン（約１０００ｎｍ未満）のサイズの薬物送達ビヒクルである。様々な分子（例えば、タンパク質、ペプチド、組換え核酸等）は、当該技術分野で周知のプロセスを使用してナノ粒子中に効率的にカプセル化され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子中に「カプセル化」された分子とは、ナノ粒子中に含まれているか、ナノ粒子の表面に付着している及び／またはそれと会合しているか、またはそれらの任意の組み合わせである分子（ウイルス等）を指し得る。本明細書に記載の組成物または製剤に使用するためのナノ粒子は、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、及びそれらの任意の組み合わせを含むナノ粒子を含む、当該技術分野で既知の任意のタイプの生体適合性ナノ粒子であり得る（例えば、Ｖａｕｔｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ Ｒｅｖ．（２００３）５５：５１９−４８、ＵＳ２００７／０１４８０７４、ＵＳ２００７／００９２５７５、ＵＳ２００６／０２４６１３９、ＵＳ５７５３２３４、ＵＳ７０８１４８３、及びＷＯ２００６／０５２２８５を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚、経口、経鼻、気管内、舌下、頬、局所、経皮内、皮内、腹腔内、眼窩内、硝子体内、網膜下、経粘膜、関節内、埋め込みによる、吸入による、髄腔内、脳室内、及び／または鼻腔内投与を含む、当該技術分野で既知の任意の投与経路に適合され得るか、またはそれらに好適であり得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚、経口、経鼻、気管内、舌下、口腔内、局所、経皮、皮内、腹腔内、眼窩内、硝子体内、網膜下、経粘膜、関節内、埋め込みによる、吸入による、髄腔内、脳室内、及び／または鼻腔内投与を含む、当該技術分野で既知の任意の投与経路に適合されるか、またはそれらに好適である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤は、局所、経皮、皮下、皮内、及び／または経粘膜投与に適合されるか、またはそれらに好適である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、局所、経皮、皮下、皮内、及び／または経粘膜投与に適合されるか、またはそれらに好適である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤は、局所、経皮、及び／または皮内投与に適合されるか、またはそれらに好適である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、局所、経皮、及び／または皮内投与に適合されるか、またはそれらに好適である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤は、局所投与に適合されるか、またはそれに好適である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、局所投与に適合されるか、またはそれに好適である。
本開示の薬学的組成物または製剤における使用に適合されたまたはそれに好適な担体または賦形剤の例には、軟膏、油、ペースト、クリーム、エアロゾル、懸濁液、乳剤、脂肪性軟膏、ゲル（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のメチルセルロースゲル）、粉末、液体、ローション、溶液、スプレー、パッチ（例えば、経皮パッチまたはマイクロニードルパッチ）、接着ストリップ、マイクロニードルまたはマイクロニードルアレイ、及び吸入剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、担体または賦形剤（例えば、薬学的に許容される担体または賦形剤）は、軟膏、油、ペースト、クリーム、エアロゾル、懸濁液、乳剤、脂肪性軟膏、ゲル、粉末、液体、ローション、溶液、スプレー、パッチ、接着ストリップ、及び吸入剤のうちの１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上等）を含む。いくつかの実施形態では、担体は、経皮パッチまたはマイクロニードルパッチ等のパッチ（例えば、皮膚に付着するパッチ）を含む。いくつかの実施形態では、担体は、マイクロニードルまたはマイクロニードルアレイを含む。組成物の送達に好適なマイクロニードルアレイを作製及び使用するための方法は、当該技術分野で一般に既知である（例えば、Ｋｉｍ Ｙ．ｅｔ ａｌ．“Ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１２，６４（１４）：１５４７−６８を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、１つ以上の追加の成分をさらに含む。追加の成分の例には、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例えば、ラクトース及び他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、甘味料、香味料、香料、着色剤、保湿剤、日焼け防止剤、抗菌剤、ポリヌクレオチドを安定化するか、またはそれらの分解を阻止することができる薬剤等が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、メチルセルロースゲル、例えば、カルボキシメチルセルロースゲル、ヒドロキシプロピルメチルセルロースゲル等を（例えば、約０．５％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％、約１０．５％、約１１％、約１１．５％、約１２％等）含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、リン酸緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、グリセロールを（例えば、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％等）含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、メチルセルロースゲル（カルボキシメチルセルロースゲル、ヒドロキシプロピルメチルセルロースゲル等）、リン酸緩衝液、及び／またはグリセロールを含む。
インビボ投与のために使用される組成物及び製剤（例えば、薬学的組成物及び製剤）は、一般に、滅菌である。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって、容易に達成され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを対象の１つ以上の細胞（例えば、１つ以上のＳＰＩＮＫ欠損細胞、ＳＰＩＮＫ遺伝子変異を有する１つ以上の細胞等）に送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、療法に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、ＳＰＩＮＫポリペプチドの発現から利益を得るであろう疾患または状態（例えば、ＳＰＩＮＫ欠乏症に関連する疾患及び／またはＳＰＩＮＫ遺伝子変異に関連する疾患）の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、ネザートン症候群（例えば、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドの送達により）、アトピー性皮膚炎（例えば、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドの送達により）、遺伝性膵炎（ＰＣＴＴ）（例えば、ＳＰＩＮＫ１ポリペプチドの送達により）、熱帯性石灰沈着性膵炎（例えば、ＳＰＩＮＫ１ポリペプチドの送達により）、及び／または精子形成不全２９（ＳＰＧＦ２９）（例えば、ＳＰＩＮＫ２ポリペプチドの送達により）の１つ以上の兆候または症状に予防的、姑息的、または治療的緩和を提供するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドの送達により）ネザートン症候群の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドの送達により）アトピー性皮膚炎の治療に使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、薬剤の調製または製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを対象の１つ以上の細胞（例えば、１つ以上のＳＰＩＮＫ欠損細胞、ＳＰＩＮＫ遺伝子変異を有する１つ以上の細胞等）に送達するのに有用な薬剤の調製または製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、ＳＰＩＮＫポリペプチドの発現から利益を得るであろう疾患または状態（例えば、ＳＰＩＮＫ欠乏症に関連する疾患及び／またはＳＰＩＮＫ遺伝子変異に関連する疾患）の治療に有用な薬剤の調製または製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、ネザートン症候群（例えば、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドの送達により）、アトピー性皮膚炎（例えば、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドの送達により）、遺伝性膵炎（ＰＣＴＴ）（例えば、ＳＰＩＮＫ１ポリペプチドの送達により）、熱帯性石灰沈着性膵炎（例えば、ＳＰＩＮＫ１ポリペプチドの送達により）、及び／または精子形成不全２９（ＳＰＧＦ２９）（例えば、ＳＰＩＮＫ２ポリペプチドの送達により）の治療に有用な薬剤の調製または製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドの送達により）ネザートン症候群の治療に有用な薬剤の調製または製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれも、（例えば、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドの送達により）アトピー性皮膚炎の治療に有用な薬剤の調製または製造に使用され得る。
ＶＩ．方法
本開示のある特定の態様は、対象の１つ以上の細胞におけるＳＰＩＮＫポリペプチドのレベルを強化する、増加させる、増加させる、増強する、及び／または補充することに関し、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかの有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、ヒトＳＰＩＮＫポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドは、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象のゲノムは、内因性ＳＰＩＮＫ遺伝子（例えば、内因性ＳＰＩＮＫ５遺伝子）に変異（例えば、機能喪失変異、病原性バリアント）を含む。いくつかの実施形態では、対象は、ネザートン症候群に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、アトピー性皮膚炎に罹患している。
いくつかの実施形態では、対象への組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤の投与は、対象の１つ以上の対応する未処理細胞における内因性ＳＰＩＮＫレベルと比較して、対象の１つ以上の接触細胞または処理細胞におけるＳＰＩＮＫ（例えば、ＳＰＩＮＫ５）レベル（転写物またはタンパク質レベル）を少なくとも約２倍増加させる。例えば、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤の投与は、対象の１つ以上の対応する未処理細胞における内因性ＳＰＩＮＫレベルと比較して、対象の１つ以上の接触細胞または処理細胞におけるＳＰＩＮＫ（例えば、ＳＰＩＮＫ５）レベル（転写物またはタンパク質レベル）を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、またはそれ以上増加させ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の接触細胞または処理細胞は、１つ以上の表皮細胞及び／または真皮細胞（例えば、ケラチノサイト）である。例えば、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット、質量分析等を含む、試料から転写物またはタンパク質レベルを測定する方法は、当業者に周知である。
いくつかの実施形態では、個体に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかの有効量を投与することは、対象の皮膚の完全性及び／または保護バリア機能を強化する、増加させる、増強する、及び／または補充する。いくつかの実施形態では、個体に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかの有効量を投与することは、対象におけるカリクレイン−５（ＫＬＫ５）、カリクレイン−７（ＫＬＫ７）、カリクレイン−１４（ＫＬＫ１４）、カスパーゼ−１４（ＣＡＳＰ１４）、及び／またはトリプシンのうちの１つ以上を減少させる、増強する、及び／または阻害する（例えば、ＫＬＫ５、ＫＬＫ７、ＫＬＫ１４、ＣＡＳＰ１４、及び／またはトリプシンの１つ以上の活性（例えば、タンパク質分解活性）を減少させる、増強する、及び／または阻害する）。
本開示の他の態様は、その必要がある対象において粘膜上皮の抗炎症保護及び／または抗微生物保護を強化する、増加させる、増強する、及び／または補充することに関し、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかの有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物の投与は、対象の皮膚感染症に対する感受性を低下させる。
本開示の他の態様は、その必要がある対象において落屑を抑制または阻害することに関し、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかの有効量を投与することを含む。
本開示の他の態様は、その必要がある対象において皮膚バリア欠損を軽減または治療することに関し、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかの有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、皮膚バリア欠損は、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）であり、経上皮水分喪失とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、その必要がある対象において経表皮水分喪失を軽減する。例えば、Ａｎｔｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｂｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１６；４９：６１−７０）によって説明された方法のうちのいずれかを含む、ＴＥＷＬを含む皮膚バリア機能を測定する方法は、当業者に周知である。
本開示の他の態様は、その必要がある対象においてネザートン症候群の１つ以上の兆候または症状の予防的、姑息的、または治療的緩和を提供することに関し、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかの有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象のゲノムは、内因性ＳＰＩＮＫ５遺伝子に変異（例えば、機能喪失変異、病原性バリアント）を含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
ネザートン症候群の兆候または症状には、角化欠損、皮膚バリア欠損、慢性皮膚炎症、汎発性掻痒症（掻痒）、重度の脱水症、成長不良、重積性裂毛症及び／または結節性裂毛症（毛幹欠損、別名、竹状毛）、皮膚からの体液漏出、皮膚における環状病変の発症、湿疹、感染症に対する感受性の増大（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる再発性皮膚感染症を含む、特に皮膚の感染症）、アレルギーに対する感受性の増大、鱗状／赤みを帯びた皮膚（アトピー性皮膚炎に類似）の発症、曲折線状魚鱗癬及び／または魚鱗癬様紅皮症の発症、免疫グロブリンレベルの変化（典型的には高ＩｇＥ及び低〜正常ＩｇＧ免疫グロブリン）、未熟ナチュラルキラー細胞（溶解機能の低下を有する）、ならびに体温の調節困難が含まれ得るが、これらに限定されない。
本開示の他の態様は、その必要がある対象においてアトピー性皮膚炎の１つ以上の兆候または症状の予防的、姑息的、または治療的緩和を提供することに関し、対象に、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかの有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象のゲノムは、内因性ＳＰＩＮＫ５遺伝子に変異（例えば、機能喪失変異、病原性バリアント）を含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、ヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
アトピー性皮膚炎の兆候及び症状には、乾燥皮膚、特に夜間に重度になる可能性のある掻痒、特に手、足、足首、手首、首、上部胸部、眼瞼、肘及び膝の屈曲部の内側、ならびに乳児では顔及び頭皮上の赤色〜茶色がかった灰色の斑点、湿潤性である可能性のある皮膚における小さい隆起した突出物、皮膚感染症、眼瞼皮膚炎、白内障、ＩｇＥレベルの上昇、肥厚した、ひび割れした、または鱗状の皮膚、引っ掻きにより皮が剥けて敏感になった腫れた皮膚が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、経口、舌下、口腔内、局所、直腸、吸入による、経皮、皮下、皮内、静脈内、動脈内、筋肉内、心内、骨内、腹腔内、経粘膜、膣内、硝子体内、眼窩内、網膜下、関節内、関節周囲、局所、皮膚上、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の好適な方法または経路によって投与され得る。したがって、本開示は、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかを個体（例えば、ネザートン症候群及び／またはアトピー性皮膚炎を有するか、またはそれを発症するリスクのある個体）に送達する方法を包含する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、対象に、局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、対象に、局所、経皮、または皮内投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、対象に、局所または皮内投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、対象に局所投与される。
いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、対象に１回投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、対象に少なくとも２回（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回等）投与される。いくつかの実施形態では、投与間（例えば、第１の投与と第２の投与との間、第２の投与と第３の投与との間等）で、少なくとも１時間（例えば、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約５０日間、少なくとも約６０日間、少なくとも約７０日間、少なくとも約８０日間、少なくとも約９０日間、少なくとも約１００日間、少なくとも約１２０日間等）が経過している。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、対象に１日１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上投与される。いくつかの実施形態では、組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤は、対象の１つ以上の罹患領域（例えば、ネザートン症候群及び／またはアトピー性皮膚炎の１つ以上の兆候または症状を呈する皮膚の１つ以上の領域）及び／または非罹患領域に投与される。
いくつかの実施形態では、対象の皮膚の１つ以上の部分は、治療前に擦過されるか、またはより透過性にされる。例えば、皮膚ローラーの使用、皮膚細胞層を除去するための接着ストリップの繰り返しの使用（テープ剥離）、メスまたはブレードでの掻爬、サンドペーパーの使用、化学的透過促進剤または電気エネルギーの使用、音波エネルギーまたは超音波エネルギーの使用、光（例えば、レーザー）エネルギーの使用、表皮を完全に貫通しないが、突き刺すのに好適な長さを有するミクロンサイズの針またはブレードの使用等を含む、皮膚を擦過するか、または皮膚の透過性を増加させる任意の好適な方法が使用され得る。
ＶＩＩ．宿主細胞
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載の組換え核酸のうちのいずれかを含む１つ以上の宿主細胞に関する。例えば、真正細菌を含む原核細胞、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルミニア（Ｅｒｍｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（例えば、霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ））、及びシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）等の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ならびに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）、真菌細胞（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、昆虫細胞（例えば、Ｓ２細胞等）、及び哺乳類細胞（例えば、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚腎臓株（懸濁培養液中での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒトヘパトーマ（Ｈｅｐ Ｇ２）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＤＨＦＲ’’ＣＨＯ細胞）、ならびにＮＳ０及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株）を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な宿主細胞（原核細胞または真核細胞）が使用され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞株由来の細胞である。好適な宿主細胞または細胞株の例には、２９３、ＨｅＬａ、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＣＡＣＯ−２、Ａ５４９、Ｌ９２９、３Ｔ３、Ｋ５６２、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、ＨＵＶＥＣ、Ｖｅｒｏ、Ｎ２０、ＣＯＳ−７、ＰＳＮ１、ＶＣａＰ、ＣＨＯ細胞等が挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、単純ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、単純ヘルペスウイルスアンプリコンである。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンである。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスを含む宿主細胞は、本明細書に記載のＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンと接触し、本明細書に記載の１つ以上の組換え核酸を含むウイルスの産生をもたらす。いくつかの実施形態では、ウイルスは、接触した宿主細胞の上清から収集される。ヘルパーウイルスを含む宿主細胞をＨＳＶ−１アンプリコンまたはＨＳＶ−１ハイブリッドアンプリコンと接触させることによってウイルスを生成する方法は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、補完宿主細胞である。いくつかの実施形態では、補完宿主細胞は、本明細書に記載のウイルスベクターのうちのいずれかにおいて不活性化される１つ以上の遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、補完宿主細胞は、本明細書に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム（例えば、組換え単純ヘルペスウイルスゲノム）と接触する。いくつかの実施形態では、補完宿主細胞を組換えヘルペスウイルスゲノムと接触させることにより、本明細書に記載の１つ以上の組換え核酸を含むヘルペスウイルスの産生がもたらされる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、接触した宿主細胞の上清から収集される。補完宿主細胞を組換え単純ヘルペスウイルスと接触させることによってウイルスを生成する方法は、概して、ＷＯ２０１５／００９９５２及び／またはＷＯ２０１７／１７６３３６に記載されている。
ＶＩＩＩ．製品またはキット
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載の組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤のうちのいずれかを含む製品またはキットに関する。いくつかの実施形態では、製品またはキットは、（例えば、ＳＰＩＮＫ遺伝子変異を有する対象における）ＳＰＩＮＫ欠乏症を治療するための及び／またはＳＰＩＮＫ欠乏症に関連する疾患（ネザートン症候群及び／またはアトピー性皮膚炎等）の１つ以上の兆候または症状の予防的、姑息的、または治療的緩和を提供するための組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤の投与に関する指示を含む添付文書を含む。
組換え核酸、ウイルス、薬剤、及び／または薬学的組成物もしくは製剤に好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、チューブ、及びシリンジが含まれ得る。容器は、ガラス、プラスチック（ポリ塩化ビニルもしくはポリオレフィン等）、または金属合金（ステンレス鋼もしくはハステロイ等）等の様々な材料から形成され得る。いくつかの実施形態では、容器は、容器上にラベルを含むか、または容器に関連するラベルを含み、ラベルは、使用に関する指示を示す。製品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、添付文書等を含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
ＩＸ．列挙される実施形態
実施形態１：セリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型（ＳＰＩＮＫ）ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２：複製可能である、実施形態１に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態３：複製欠損である、実施形態１に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態４：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、前記ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする前記１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上のウイルス遺伝子座内に含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態５：組換え単純ヘルペスウイルスゲノム、組換え水痘帯状疱疹ウイルスゲノム、組換えヒトサイトメガロウイルスゲノム、組換えヘルペスウイルス６Ａゲノム、組換えヘルペスウイルス６Ｂゲノム、組換えヘルペスウイルス７ゲノム、組換えカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスゲノム、及びそれらの任意の派生物から選択される、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態６：組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態７：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、組換え単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ゲノム、組換え単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）ゲノム、またはそれらの任意の派生物である、実施形態５または実施形態６に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態８：前記ＳＰＩＮＫポリペプチドがヒトＳＰＩＮＫポリペプチドである、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態９：前記ＳＰＩＮＫポリペプチドがセリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型５（ＳＰＩＮＫ５）ポリペプチドである、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態１０：前記ＳＰＩＮＫポリペプチドがヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドである、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態１１：前記ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドが、配列番号７〜２５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態９または実施形態１０に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態１２：前記ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドが、配列番号７〜９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態９〜１１のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態１３：前記ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態９〜１２のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態１４：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが不活性化変異を含む、実施形態５〜１３のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態１５：前記不活性化変異が単純ヘルペスウイルス遺伝子に存在する、実施形態１４に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態１６：前記不活性化変異が、前記単純ヘルペスウイルス遺伝子のコード配列の欠失である、実施形態１５に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態１７：前記単純ヘルペスウイルス遺伝子が、感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ロングユニーク領域（ＵＬ）４１、及びＵＬ５５から選択される、実施形態１５または実施形態１６に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態１８：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ４遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む、実施形態１７に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態１９：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態１７または実施形態１８に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２０：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態１７〜１９のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２１：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ０遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む、実施形態１７〜２０のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２２：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ２７遺伝子に不活性化変異を含む、実施形態１７〜２１のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２３：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ４ウイルス遺伝子座の一方または両方内に前記ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする前記１つ以上のポリヌクレオチドを含む、実施形態５〜２２のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２４：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ２２ウイルス遺伝子座内に前記ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする前記１つ以上のポリヌクレオチドを含む、いずれか１つまたは実施形態５〜２３に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２５：前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＵＬ４１ウイルス遺伝子座内に前記ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする前記１つ以上のポリヌクレオチドを含む、実施形態５〜２４のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２６：標的細胞に導入された場合に、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して減少した細胞毒性を有する、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２７：前記標的細胞がヒト細胞である、実施形態２６に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２８：前記標的細胞が表皮細胞及び／または真皮細胞である、実施形態２６または実施形態２７に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態２９：前記標的細胞がケラチノサイトまたは線維芽細胞である、実施形態２６〜２８のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
実施形態３０：実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノムを含む、ヘルペスウイルス。
実施形態３１：複製可能である、実施形態３０に記載のヘルペスウイルス。
実施形態３２：複製欠損である、実施形態３０に記載のヘルペスウイルス。
実施形態３３：対応する野生型ヘルペスウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する、実施形態３０〜３２のいずれか１つに記載のヘルペスウイルス。
実施形態３４：単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス６Ａ、ヘルペスウイルス６Ｂ、ヘルペスウイルス７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、及びそれらの任意の派生物から選択される、実施形態３０〜３３のいずれか１つに記載のヘルペスウイルス。
実施形態３５：単純ヘルペスウイルスである、実施形態３０〜３４のいずれか１つに記載のヘルペスウイルス。
実施形態３６：前記単純ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１ウイルス、ＨＳＶ−２ウイルス、またはそれらの任意の派生物である、実施形態３４または実施形態３５に記載のヘルペスウイルス。
実施形態３７：実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の組換えヘルペスウイルスゲノム及び／または実施形態３０〜３６のいずれか１つに記載のヘルペスウイルスと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
実施形態３８：局所、経皮、皮下、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部、または皮膚上投与に好適である、実施形態３７に記載の薬学的組成物。
実施形態３９：局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与に好適である、実施形態３７または実施形態３８に記載の薬学的組成物。
実施形態４０：局所投与に好適である、実施形態３７〜３９のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
実施形態４１：ヒドロキシプロピルメチルセルロースゲルを含む、実施形態３７〜４０のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
実施形態４２：リン酸緩衝液を含む、実施形態３７〜４１のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
実施形態４３：グリセロールを含む、実施形態３７〜４２のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
実施形態４４：脂質担体を含む、実施形態３７〜４３のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
実施形態４５：ナノ粒子担体を含む、実施形態３７〜４４のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
実施形態４６：対象の１つ以上の細胞におけるＳＰＩＮＫポリペプチドのレベルを強化する、増加させる、増強する、及び／または補充する方法であって、前記対象に、実施形態３０〜３６のいずれか１つに記載のヘルペスウイルスまたは実施形態３７〜４５のいずれか１つに記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態４７：前記ＳＰＩＮＫポリペプチドがＳＰＩＮＫ５ポリペプチドである、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８：その必要がある対象において粘膜上皮の抗炎症保護及び／または抗微生物保護を強化する、増加させる、増強する、及び／または補充する方法であって、前記対象に、実施形態３０〜３６のいずれか１つに記載のヘルペスウイルスまたは実施形態３７〜４５のいずれか１つに記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態４９：その必要がある対象において落屑を抑制する方法であって、前記対象に、実施形態３０〜３６のいずれか１つに記載のヘルペスウイルスまたは実施形態３７〜４５のいずれか１つに記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態５０：その必要がある対象において皮膚バリア欠損を軽減または治療する方法であって、前記対象に、実施形態３０〜３６のいずれか１つに記載のヘルペスウイルスまたは実施形態３７〜４５のいずれか１つに記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態５１：前記皮膚バリア欠損が経上皮水分喪失（ＴＥＷＬ）である、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２：その必要がある対象においてネザートン症候群（ＮＳ）の１つ以上の兆候または症状の予防的、姑息的、または治療的緩和を提供する方法であって、前記対象に、実施形態３０〜３６のいずれか１つに記載のヘルペスウイルスまたは実施形態３７〜４５のいずれか１つに記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
実施形態５３：ＮＳの前記１つ以上の兆候または症状が、角化欠損、皮膚バリア欠損、再発性皮膚感染症、先天性魚鱗癬様紅皮症、曲折線状魚鱗癬、重積性裂毛症、慢性皮膚炎症、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４：前記対象がヒトである、実施形態４６〜５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５：前記対象のゲノムが、ＳＰＩＮＫ５遺伝子に機能喪失変異を含む、実施形態４６〜５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６：前記ヘルペスウイルスまたは前記薬学的組成物が、前記対象に、局所、経皮、皮下、皮膚上、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、心臓内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部投与、または吸入により投与される、実施形態４６〜５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５７：前記ヘルペスウイルスまたは前記薬学的組成物が、前記対象に、局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与される、実施形態４６〜５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８：前記ヘルペスウイルスまたは前記薬学的組成物が、前記対象に局所投与される、実施形態４６〜５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９：前記対象の皮膚が、投与前に擦過される、実施形態４６〜５８のいずれか１つに記載の方法。
本明細書は、当業者が本開示を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本明細書に示され、かつ記載される修正に加えて、本開示の様々な修正は、前述の記述から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に入るであろう。
本開示は、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらが本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態が例証のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。
実施例１：ヒトＳＰＩＮＫ５タンパク質をコードする修飾された単純ヘルペスウイルスベクター
標的哺乳類細胞（ヒトケラチノサイトまたは線維芽細胞等）においてＳＰＩＮＫ５ポリペプチドを発現することができる修飾された組換え単純ヘルペスウイルスベクターを作製するために、単純ヘルペスウイルスゲノム（図１Ａ）を、最初に１つ以上の単純ヘルペスウイルス遺伝子を不活性化するように修飾する。かかる修飾は、哺乳類細胞におけるゲノムの毒性を減少させ得る。次に、これらの修飾／弱毒化された組換えウイルス構築物のバリアントを、それらが所望のＳＰＩＮＫ５ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを有するように生成する。これらのバリアントには、１）各ＩＣＰ４遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下のヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、配列番号７）のコード配列（例えば、配列番号２）を含む発現カセットを含む組換えΔＩＣＰ４修飾ＨＳＶ−１ゲノム（図１Ｂ）、２）各ＩＣＰ４遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下のヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、配列番号４）のコード配列（例えば、配列番号２）を含む発現カセットを含む組換えΔＩＣＰ４／ΔＩＣＰ２２修飾ＨＳＶ−１ゲノム（図１Ｃ）、３）ＩＣＰ２２遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下のヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、配列番号４）のコード配列（例えば、配列番号２）を含む発現カセットを含む組換えΔＩＣＰ４／ΔＩＣＰ２２修飾ＨＳＶ−１ゲノム（図１Ｄ）、４）各ＩＣＰ４遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下のヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、配列番号４）のコード配列（例えば、配列番号２）を含む発現カセットを含む組換えΔＩＣＰ４／ΔＵＬ４１修飾ＨＳＶ−１ゲノム（図１Ｅ）、５）ＵＬ４１遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下のヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、配列番号４）のコード配列（例えば、配列番号２）を含む発現カセットを含む組換えΔＩＣＰ４／ΔＵＬ４１修飾ＨＳＶ−１ゲノム（図１Ｆ）、６）各ＩＣＰ４遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下のヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、配列番号４）のコード配列（例えば、配列番号２）を含む発現カセットを含む組換えΔＩＣＰ４／ΔＩＣＰ２２／ΔＵＬ４１修飾ＨＳＶ−１ゲノム（図１Ｇ）、７）ＵＬ４１遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下のヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、配列番号４）のコード配列（例えば、配列番号２）を含む発現カセットを含む組換えΔＩＣＰ４／ΔＩＣＰ２２／ΔＵＬ４１修飾ＨＳＶ−１ゲノム（図１Ｈ）、及び８）ＩＣＰ２２遺伝子座に組み込まれた異種プロモーターの制御下のヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチド（例えば、配列番号４）のコード配列（例えば、配列番号２）を含む発現カセットを含む組換えΔＩＣＰ４／ΔＩＣＰ２２／ΔＵＬ４１修飾ＨＳＶ−１ゲノム（図１Ｉ）が含まれる。
これらの修飾された単純ヘルペスウイルスゲノムベクターを、１つ以上のヘルペスウイルス遺伝子を発現するように修飾された操作されたＶｅｒｏ細胞にトランスフェクトする。その後、これらの操作されたＶｅｒｏ細胞は、修飾されたゲノムを内部にパッケージングした複製欠損単純ヘルペスウイルスを細胞培養物の上清に分泌する。その後、上清を収集し、濃縮し、５μｍフィルターに通して滅菌濾過する。
実施例２：ヒトＳＰＩＮＫ５をコードするＨＳＶ候補の構築及びインビトロ分析
以下の実施例は、ヒトＳＰＩＮＫ５を発現するように修飾された組換え単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の構築を説明し、この組換えウイルスが感染ヒト細胞においてインビトロで機能性ヒトＳＰＩＮＫ５を発現することができたことを示す実験をさらに提供する。
材料及び方法
ウイルス構築
「ＨＳＶ−Ｓ５」ベクターを以下のように生成した：組換えＨＳＶ−１を操作して、異種プロモーター及びポリＡ配列を含むコドン最適化ヒトＳＰＩＮＫ５発現カセットをＩＣＰ４遺伝子座の各々に組み込んだ。推定上ヒトＳＰＩＮＫ５カセットを含む操作されたウイルスの複数のプラークを採取し、Ｖｅｒｏ細胞の感染によりスクリーニングして、ＳＰＩＮＫ５発現を試験した（データ示さず）。「ＨＳＶ−Ｓ５」と称される最も高いＳＰＩＮＫ５産生ウイルスを単離し、精製した。
細胞培養
全ての細胞を５％ＣＯ２中３７℃で培養した。不死化正常ケラチノサイトを、１０％ＦＢＳ及び１％ＨＥＰＥＳ緩衝液を補充したＤＭＥＭ中で培養した。ｑＰＣＲ／ｑＲＴ−ＰＣＲ分析、ウエスタンブロッティング、ならびにエフェクター分泌及び機能性アッセイのために、細胞を６ウェルプレート中で成長させた。免疫蛍光のために、細胞を８つのチャンバースライド中で成長させた。
ウイルス感染
ウイルスアリコートを−８０℃の冷凍庫から取り出し、組織培養層流フード下で解凍させた。感染多重度をウイルス力価及び標的細胞数から計算し、適切な体積のウイルスストックを細胞培養培地中に希釈して最終体積１００μＬにし、調製したウイルスを標的細胞と３７℃で１時間インキュベートした。１時間感染させた後、２ｍＬの適切な細胞培養培地を６ウェルプレートのウェルに添加し、８チャンバースライドの場合、４００μＬの培地を添加した。
ｑＰＣＲ／ｑＲＴ−ＰＣＲ分析
不死化ケラチノサイトを６ウェルプレート中に７×１０５細胞／ウェルでプレーティングして、翌日に９０〜１００％コンフルエンスに達した。模擬感染またはＨＳＶ−Ｓ５による感染の４８時間後、細胞を、ＤＴＴを含有する３５０μＬのＲＬＴ緩衝液中に再懸濁し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒカラムに通すことによって均質化した。ＤＮＡ及びＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ｑＰＣＲ／ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、２５μＬの総反応体積で５０ｎｇのＤＮＡまたはＲＮＡを反応毎に使用した。ＤＮＡ定量を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したｑＰＣＲ分析によって決定し、ＲＮＡ定量を、Ｑｕａｎｔａｂｉｏ １−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘを使用したｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって決定した。全ての試料を二連で実行した。
ウエスタンブロッティング
不死化ケラチノサイトを６ウェルプレート中に７×１０５細胞／ウェルでプレーティングして、翌日に９０〜１００％コンフルエンスに達した。模擬感染またはＨＳＶ−Ｓ５による感染の４８時間後、培地を吸引し、細胞を穏やかに掻爬して回収し、細胞ペレットを遠心分離により生成した。細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、間欠的に撹拌しながらインキュベートした。次に、ベンゾナーゼ（１０Ｕ）を室温で１０分間にわたって各溶解物に添加した。その後、溶解物を５％２−メルカプトエタノールを含有する４倍ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。ロードする前に、試料を最初に９５℃で１０分間沸騰させ、室温に冷却させ、その後、短時間遠心分離した。その後、溶解物を４〜２０％トリス−グリシンゲル上で泳動させた後、ＰＶＤＦに移した。一次抗体（ウサギ抗ヒトＳＰＩＮＫ５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＡＦ８５１５、ウサギ抗ヒトＧＡＰＤＨ、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ９４８５）を、ブロックしたブロットとインキュベートした。その後、ブロットを二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＰコンジュゲート、Ｓｉｇｍａ）と室温で１時間インキュベートし、ブロットをＴＢＳで３回、各々５分間洗浄し、その後、洗浄したブロットをＡＰ発色基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートして、バンドの展開を可能にした。
免疫細胞化学
不死化ケラチノサイトを８チャンバースライド中に１．３×１０５細胞／ウェルでプレーティングし、翌日に９０〜１００％コンフルエンスに達した。模擬感染またはＨＳＶ−Ｓ５による感染の４８時間後、細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００で５分間透過処理した。細胞をＰｏｗｅｒｂｌｏｃｋ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）と３０分間インキュベートし、その後、ウサギ抗ヒトＳＰＩＮＫ５一次抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓカタログ番号ＮＢＰ１−９０５０９）と一晩インキュベートした。その後、スライドをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート二次抗体とインキュベートし、ＤＡＰＩを含有するＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止試薬でマウントした。
ＳＰＩＮＫ５ ＥＬＩＳＡ
ヒトＳＰＩＮＫ５タンパク質の発現及び分泌を、製造業者のプロトコル（ＬＳＢｉｏ）に従って市販のＥＬＩＳＡキットを使用して評価した。簡潔には、標準物または試料（細胞培養物由来の培地）をウェルに添加し、非結合標準物または試料を洗い流し、その後、ビオチンコンジュゲート検出抗体を添加した。アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートをウェル中でインキュベートしてビオチンに結合させ、その後、ＴＭＢ基質を添加し、定量的比色発生をもたらした。硫酸停止溶液を添加して発色を終了させ、各ウェルの光学密度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒを使用して４５０ｎｍの波長で測定した。
ＳＰＩＮＫ５活性アッセイ
ＨＳＶ−Ｓ５感染不死化ケラチノサイト細胞上清による組換えヒトカリクレイン５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）プロテアーゼ活性の阻害を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによって提供された修正法を使用して評価した。簡潔には、ｒｈＫＬＫ５（２ｎｇ／μＬ）を、ＨＳＶ−Ｓ５感染（または模擬感染）細胞由来の培養上清と室温で５分間プレインキュベートした。プレインキュベートした後、蛍光発生ペプチドＢｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣを添加して２０μＭの最終濃度にした。基質を添加した直後に、基質の切断（相対蛍光単位ＲＦＵ）を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒを使用して励起３８０ｎｍ／発光４６０ｎｍで７０秒毎に１５分間測定した。
結果
不死化正常ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）を、０．３〜３．０の範囲の様々な感染多重性（ＭＯＩ）でＨＳＶ−Ｓ５に感染させた。ＳＰＩＮＫ５発現を、感染の４８時間後に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ウエスタンブロット分析、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。
ＳＰＩＮＫ５を、０．３と低いＭＯＩで感染させた正常ケラチノサイト中で検出し、最大３．０のＭＯＩでＤＮＡレベル（図２Ａ）及び転写物レベル（図２Ｂ）の両方に用量依存的増加を示すように見えた。ウエスタンブロットによって評価される、ＳＰＩＮＫ５タンパク質発現の同時用量依存的増加が感染した正常ケラチノサイトの細胞質で観察された（図２Ｃ）。
ＨＳＶ−Ｓ５感染ケラチノサイトにおけるＳＰＩＮＫ５発現も、免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって評価した。核酸及びウエスタンブロット分析と一致して、ＳＰＩＮＫ５タンパク質発現の用量依存的増加がＩＣＣ分析によって観察された（図２Ｄ）。模擬感染細胞の７．３６％がＳＰＩＮＫ５陽性であった一方で、ＨＳＶ−Ｓ５形質導入細胞をＭＯＩ ０．３、１．０、及び３．０で感染させた場合、それぞれ、２７．３％、６８．４８％、及び９５．２０％がＳＰＩＮＫ５陽性であった。注目すべきことに、高用量のＨＳＶ−Ｓ５でさえも、細胞形態または細胞生存のいずれにも感染の有意な影響はなかった。
内因性ＳＰＩＮＫ５が天然分泌タンパク質であるため、ＨＳＶ−Ｓ５発現外因性ヒトＳＰＩＮＫ５も感染細胞から効果的に分泌され、それ故に、ＳＰＩＮＫ５欠損患者におけるＨＳＶ−Ｓ５の使用を支持することができることを示すことが重要であった。したがって、ＳＰＩＮＫ５タンパク質レベルを、感染したＨａＣａＴから採取した細胞培養培地中で定量化した。ＳＰＩＮＫ５は、用量依存的様式で感染した正常ケラチノサイトから首尾よく分泌された（図３）。
最後に、感染したケラチノサイトから分泌されるＨＳＶ−Ｓ５発現ヒトＳＰＩＮＫ５の機能性を、ＳＰＩＮＫ５の天然標的であるヒトセリンプロテアーゼカリクレイン５（ＫＬＫ５）を阻害するＳＰＩＮＫ５の能力を測定する酵素阻害アッセイを使用して確認した。簡潔には、組換えヒトＫＬＫ５を、ＨＳＶ−Ｓ５感染ＨａＣａＴから収集した細胞培養上清とプレインキュベートした（模擬感染細胞由来の上清を対照として使用した）。プレインキュベートした後、ヒトＫＬＫ５の合成非天然ペプチド基質（Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣ）を試料に添加し、基質のＫＬＫ５媒介性切断を各試料中で評価した。この実験的アプローチを使用して、ＫＬＫ５のタンパク質分解活性（及びＳＰＩＮＫ５によるその阻害）を、ＫＬＫ５によるＡｒｇ−ＡＭＣアミド結合の加水分解後のＢｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣの以前にクエンチされた蛍光ＡＭＣ部分の遊離に起因する蛍光を決定することによって直接定量化することができた。
予想通り、プロテアーゼを模擬感染ケラチノサイトから得た細胞培養上清とプレインキュベートした場合、ＫＬＫ５活性の阻害は観察されなかった。対照的に、ＨＳＶ−Ｓ５による感染は、プロテアーゼを次第に増加するＭＯＩのＨＳＶ−Ｓ５に感染させたケラチノサイトから収集した細胞培養上清で前処理した場合、ＫＬＫ５阻害の増加によって観察されるように、機能性ＳＰＩＮＫ５発現の用量依存的増加をもたらした（図４）。
まとめると、この実施例に提示されるデータは、操作された単純ヘルペスウイルスが正常ヒトケラチノサイトを効率的に形質導入し、形質導入後に高レベルの外因性ＳＰＩＮＫ５を産生することができることを示す。重要なことに、ＨＳＶ−Ｓ５がヒト細胞におけるＳＰＩＮＫ５発現を救出／補充することができた一方で、ベクターは、これらの研究のいずれにおいても、いかなる重大な毒性も誘導しなかった。加えて、本明細書に提示されるデータは、ＨＳＶ−Ｓ５が、治療関連レベルで機能性ＳＰＩＮＫ５の分泌を誘導することができることを示す。
実施例３：ＨＳＶ−Ｓ５のインビボ特徴付け
以下の実施例は、健常免疫担当動物におけるＨＳＶ−Ｓ５のための複数の送達経路を確立するインビボ実験について記載する。ＳＰＩＮＫ５のホモ接合性欠失が動物において新生児致死性であるという理由からＳＰＩＮＫ５欠乏症の実用的な疾患動物モデルが存在しないため、これらの研究をＢＡＬＢ／ｃマウスで行った。
材料及び方法
この実施例で行った全ての手順は、適用可能な動物保護法に準拠しており、現地のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたものである。
ＨＳＶ−Ｓ５局所投与
さらなる操作前に、マウスの背中を剃り、毛包を脱毛製品で除去した。テープ剥離（Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標）を使用した）を、以前に説明されたように行った（Ｅｋａｎａｙａｋｅ−Ｍｕｄｉｙａｎｓｅｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ（１９９８），１１１（３）：５１７−２３）。テープ剥離後、各マウスの背中の２つの部位を適切な被験物質で局所処理した。処理部位に局所製剤を含ませるために、透明な接着剤ドレッシング材で覆われた滅菌プラスチックウェルを、外科用接着剤を使用して動物の皮膚に接着させた。その後、メチルセルロースゲル担体中に処方したＨＳＶ−Ｓ５（またはビヒクル対照）を、透明な接着剤ドレッシング材を介して注射により処理部位に適用した。
ＨＳＶ−Ｓ５皮内注射
さらなる操作前に、マウスの背中を剃った。その後、ＨＳＶ−Ｓ５（またはビヒクル対照）を各マウスの背中の２つの部位に皮内注射した。
組織収集
感染期間及びその後の回復期間後、動物を、ＣＯ２吸入、続いて、頸椎脱臼により安楽死させ、８ｍｍパンチ生検を使用して処理部位を除去した。各生検の半分をｑＰＣＲ／ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために液体窒素中で急速凍結し、残りの半分を免疫蛍光分析及びＨ＆Ｅ染色のために処理した。
ｑＰＣＲ／ｑＲＴ−ＰＣＲ分析
急速凍結した半分の生検を分析まで−８０℃で保管した。処理及び分析のために、試料を、製造業者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って新鮮なＤＴＴで調製した３５０μＬのＲＬＴ緩衝液中に再懸濁し、２５％振幅で３回超音波処理し、氷上で１分間間欠的にインキュベートした。ＤＮＡ及びＲＮＡ抽出を、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出キットを使用して行った（ＲＮＡ試料の場合は任意のＤＮａｓｅ処理ステップを含んだ）。ＤＮＡ試料及びＲＮＡ試料の両方を、ＲＮａｓｅを含まない脱イオン蒸留水中に再懸濁し、ＳｙｎｅｒｇｙＴＭ Ｈ１マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で分光光度的に定量化した。
ＳＰＩＮＫ５ ＤＮＡ及びＲＮＡコピーの絶対的定量を、カスタム導入遺伝子特異的プライマー／プローブ対を使用してＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ分析によって行った。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＤＮＡ定量（ｑＰＣＲ）に使用し、Ｑｕａｎｔａｂｉｏ １−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘをＲＮＡ定量（ｑＲＴ−ＰＣＲ）に使用した。全ての試料を二連で実行し、コピー数を、既知のコピー数のＳＰＩＮＫ５導入遺伝子を含むプラスミド標準物の希釈系列から得られた標準曲線を使用して決定した。
免疫蛍光染色
５μｍ切片をＯＣＴ凍結組織から採取し、スライド上にマウントし、最大１時間空気乾燥させた。その後、スライドを１００％メタノール（ＭｅＯＨ）中に−２０℃で１０分間浸漬し、空気乾燥させた。メタノール固定切片を、ＰＢＳ中で、室温で３回（各５分間）洗浄し、その後、３％Ｈ２Ｏ２中で、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄することによって再水和させた。その後、試料を、加湿チャンバ内でブロッキング溶液（Ｐｏｗｅｒ Ｂｌｏｃｋ）と室温で１０分間インキュベートした。過剰なブロッキング溶液を除去し、切片を、抗体希釈剤緩衝液（３０〜５０μＬの一次抗体（Ａｂ）溶液／切片）中で調製した一滴の一次Ａｂ溶液（最終希釈１：２００）で染色した。切片を一次抗体と４℃で１６時間または室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で、室温で３回、５分間洗浄し、二次Ａｂを、加湿チャンバ内で、室温で３０分間、抗体希釈剤緩衝液中１：２００の希釈で適用した。スライドを再びＴＢＳＴで３回洗浄し、染色した切片を封入剤（ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｇｏｌｄ褪色防止用封入剤、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｐ３６９３１）で封入し、カバースリップで覆った。切片を、ＥＣＨＯ蛍光顕微鏡を使用して脱水後（およそ２４時間後）に画像化した。この研究で使用した一次抗体及び二次抗体を表１に提示する。
（表１）免疫蛍光に使用した抗体
Figure 2022502026
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色
５μｍ切片を凍結保存組織から採取し、スライド上にマウントし、最大１時間空気乾燥させた。乾燥させたスライドを、室温で２分間、再蒸留水中に浸漬することによって再水和した。その後、切片をヘマトキシリンギル２倍（ＶＷＲ）中で、室温で２分間インキュベートし、その後、酸アルコール中に２〜３回浸漬し、青色アンモニア水中に３〜４回浸漬し、エオシン（エオシンＹ溶液１％、ＶＷＲ）中で２分間インキュベートした。各ステップ間で試料を水道水で３〜４回すすいだ。染色してすすいだ切片を、最初に９５％エタノール（ＥｔＯＨ）で２回（各２分間）、その後、１００％ＥｔＯＨで２回（各２分間）すすぐことによって、ＥｔＯＨで徐々に脱水した。その後、切片を、Ｈｉｓｔｏ−Ｃｌｅａｒで３回（各２分間）すすぐことによって透徹し、封入剤（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（商標）封入剤）で封入し、カバースリップで覆った。切片を、明視野顕微鏡を使用して脱水のおよそ２４時間後に画像化した。
結果
単回用量薬理学研究を免疫担当ＢＡＬＢ／ｃマウスに行い、ＨＳＶ−Ｓ５の局所及び／または皮内投与によりヒトＳＰＩＮＫ５を投与する実現可能性を決定した。合計４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをこの研究に使用した。被験物質の投与前に、マウスの背中を剃り、化学脱毛製品を使用して毛包を除去した。次に、局所処理部位で、露出した皮膚を９回テープ剥離して角質層を破壊／除去し、ゲル担体中に処方した１×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨＳＶ−Ｓ５（またはビヒクル対照）を各マウス上のテープ剥離した皮膚の２つの領域に局所投与した。皮内投与の場合、１×１０８ＰＦＵのＨＳＶ−Ｓ５（またはビヒクル対照）を各動物の背中上の２つの平行部位に注射した。以下の表２は、実験計画の概要を提供する。
（表２）研究計画及び被験物質投与
Figure 2022502026
投与の４８時間後、全厚８ｍｍの生検を各処理部位から採取し、半分に分割した。各切片の半分を液体窒素中で急速凍結し、その後、ｑＰＣＲ分析及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために処理して、それぞれ、ＳＰＩＮＫ５ ＤＮＡコピー数及び転写物レベルを定量化した。各生検の残りの半分を、免疫蛍光（ＩＦ）のためにＯＣＴに包埋した。
局所処理したテープ剥離皮膚のｑＰＣＲ分析は、ヒトＳＰＩＮＫ５導入遺伝子をコードする操作されたＨＳＶゲノムが、免疫担当動物の破壊された皮膚を効率的に形質導入したことを示した（図５Ａ）。ゲノムが標的組織に効率的に入っただけでなく、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価されるように、組換えヒトＳＰＩＮＫ５が感染後にロバストに発現された（図５Ｂ）。ＨＳＶ−Ｓ５を完全にインタクトな皮膚に皮内注射した後に、同様の結果がＤＮＡレベル（図５Ｃ）及びＲＮＡレベル（図５Ｄ）の両方で見られた。ビヒクル処理組織中ではＳＰＩＮＫ５ ＤＮＡもＳＰＩＮＫ５ ＲＮＡも検出されず、ＨＳＶ−Ｓ５被験物質に対する本アッセイの特異度を示す。
局所処理動物から採取した凍結切片におけるＳＰＩＮＫ５発現を、抗ヒトＳＰＩＮＫ５抗体を使用して免疫蛍光分析によって決定した。ＨＳＶ−Ｓ５から発現されたＳＰＩＮＫ５が表皮の角化層に正しく局在したことを確認するために、試料をこの皮膚領域に局在した別の構造タンパク質であるマウスフィラグリンについて対比染色した（図５Ｅ）。このデータは、ＨＳＶ−Ｓ５の局所適用により、マウス皮膚の形質導入の成功がもたらされ、表皮の正しい層におけるコードされたヒト導入遺伝子のロバストな発現を誘導したことを示した。
局所処理皮膚の組織学的評価は、処理部位に炎症性浸潤を示さず、ＨＳＶ−Ｓ５処理皮膚は形態学的に正常に見え（ビヒクル処理皮膚と同等）（図５Ｆ）、この療法の安全性を実証した。
まとめると、本明細書に提示されるインビボデータは、（１）ＨＳＶ−Ｓ５が免疫担当マウスに局所及び皮内投与された場合にインビボでヒトＳＰＩＮＫ５を首尾よく発現すること、及び（２）組換えＳＰＩＮＫ５が表皮の適切な領域で発現され、かつそこに局在することを明確に示す。加えて、ＨＳＶ−Ｓ５処理部位で炎症性浸潤または皮膚への肉眼的構造変化は観察されず、ＨＳＶ−Ｓ５が良好な耐容性を示すことを確認した。理論に拘束されることを望むことなく、これらのデータが、インビトロ試験の結果と組み合わせて、ヒトＳＰＩＮＫ５の一過性の反復送達のための局所または皮内ＨＳＶ−Ｓ５の安全かつ有効な使用を強力に支持すると考えられる。加えて、理論に拘束されることを望むことなく、ＨＳＶ−Ｓ５がネザートン症候群の治療のための臨床的に有益な非侵襲的遺伝子療法の候補になる可能性があると考えられる。

Claims (66)

  1. セリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型（ＳＰＩＮＫ）ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、組換えヘルペスウイルスゲノム。
  2. ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  3. 複製可能である、請求項１または請求項２に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  4. 複製欠損である、請求項１または請求項２に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  5. 組換え単純ヘルペスウイルスゲノム、組換え水痘帯状疱疹ウイルスゲノム、組換えヒトサイトメガロウイルスゲノム、組換えヘルペスウイルス６Ａゲノム、組換えヘルペスウイルス６Ｂゲノム、組換えヘルペスウイルス７ゲノム、組換えカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスゲノム、及びそれらの任意の派生物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  6. 組換え単純ヘルペスウイルスゲノムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  7. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、組換え単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ゲノム、組換え単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）ゲノム、またはそれらの任意の派生物である、請求項６に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  8. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが組換えＨＳＶ−１ゲノムである、請求項６または請求項７に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  9. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが不活性化変異を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  10. 前記不活性化変異が単純ヘルペスウイルス遺伝子に存在する、請求項９に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  11. 前記不活性化変異が、前記単純ヘルペスウイルス遺伝子のコード配列の欠失である、請求項１０に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  12. 前記単純ヘルペスウイルス遺伝子が、感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ロングユニーク領域（ＵＬ）４１、及びＵＬ５５からなる群から選択される、請求項１０または請求項１１に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  13. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ４遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む、請求項１２に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  14. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ２２遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１２または請求項１３に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  15. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＵＬ４１遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  16. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ０遺伝子の一方または両方のコピーに不活性化変異を含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  17. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＣＰ２７遺伝子に不活性化変異を含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  18. 前記組換え単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＳＰＩＮＫポリペプチドをコードする前記１つ以上のポリヌクレオチドを、ＩＣＰ４ウイルス遺伝子座の一方または両方に含む、請求項６〜１７のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  19. 前記ＳＰＩＮＫポリペプチドがヒトＳＰＩＮＫポリペプチドである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  20. 前記ＳＰＩＮＫポリペプチドがセリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌ型５（ＳＰＩＮＫ５）ポリペプチドである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  21. 前記ＳＰＩＮＫポリペプチドがヒトＳＰＩＮＫ５ポリペプチドである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  22. 前記ＳＰＩＮＫポリペプチドが、配列番号７〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  23. 前記ＳＰＩＮＫポリペプチドが、配列番号７〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  24. 前記ＳＰＩＮＫポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  25. 標的細胞に導入された場合に、対応する野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して減少した細胞毒性を有する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  26. 前記標的細胞がヒト細胞である、請求項２５に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  27. 前記標的細胞が表皮細胞及び／または真皮細胞である、請求項２５または請求項２６に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  28. 前記標的細胞がケラチノサイトまたは線維芽細胞である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノム。
  29. 請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムを含む、ヘルペスウイルス。
  30. 複製可能である、請求項２９に記載のヘルペスウイルス。
  31. 複製欠損である、請求項２９に記載のヘルペスウイルス。
  32. 対応する野生型ヘルペスウイルスと比較して減少した細胞毒性を有する、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のヘルペスウイルス。
  33. 単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス６Ａ、ヘルペスウイルス６Ｂ、ヘルペスウイルス７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、及びそれらの任意の派生物からなる群から選択される、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のヘルペスウイルス。
  34. 単純ヘルペスウイルスである、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載のヘルペスウイルス。
  35. 前記単純ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、またはそれらの任意の派生物である、請求項３３または請求項３４に記載のヘルペスウイルス。
  36. 前記単純ヘルペスウイルスがＨＳＶ−１である、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のヘルペスウイルス。
  37. 請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組換えヘルペスウイルスゲノムまたは請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
  38. 局所、経皮、皮下、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部、または皮膚上（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与に好適である、請求項３７に記載の薬学的組成物。
  39. 局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与に好適である、請求項３７または請求項３８に記載の薬学的組成物。
  40. 局所、経皮、または皮内投与に好適である、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  41. 局所投与に好適である、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  42. メチルセルロースゲルを含む、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  43. リン酸緩衝液を含む、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  44. グリセロールを含む、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  45. 脂質担体を含む、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  46. ナノ粒子担体を含む、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  47. 薬剤としての使用のための、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  48. 療法における使用のための、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  49. ネザートン症候群及び／またはアトピー性皮膚炎の１つ以上の兆候または症状を治療するための薬剤の製造における、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の薬学的組成物の、使用。
  50. 対象の１つ以上の細胞におけるＳＰＩＮＫポリペプチドレベルを強化する、増加させる、増強する、及び／または補充する方法であって、前記対象に、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  51. 前記ＳＰＩＮＫポリペプチドがＳＰＩＮＫ５ポリペプチドである、請求項５０に記載の方法。
  52. その必要がある対象において粘膜上皮の抗炎症保護及び／または抗微生物保護を強化する、増加させる、増強する、及び／または補充する方法であって、前記対象に、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  53. その必要がある対象において落屑を抑制する方法であって、前記対象に、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  54. その必要がある対象において皮膚バリア欠損を軽減または治療する方法であって、前記対象に、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  55. 前記皮膚バリア欠損が経表皮水分喪失である、請求項５４に記載の方法。
  56. その必要がある対象においてネザートン症候群（ＮＳ）の１つ以上の兆候または症状の予防的、姑息的、または治療的緩和を提供する方法であって、前記対象に、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  57. ＮＳの前記１つ以上の兆候または症状が、角化欠損、皮膚バリア欠損、再発性皮膚感染症、先天性魚鱗癬様紅皮症、曲折線状魚鱗癬、重積性裂毛症、慢性皮膚炎症、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
  58. その必要がある対象においてアトピー性皮膚炎の１つ以上の兆候または症状の予防的、姑息的、または治療的緩和を提供する方法であって、前記対象に、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のヘルペスウイルスまたは請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  59. アトピー性皮膚炎の前記１つ以上の兆候または症状が、皮膚の掻痒、乾燥皮膚、皮膚における赤色〜茶色がかった灰色の斑点、皮膚における小さい隆起した突出物、肥厚した皮膚、ひび割れした皮膚、鱗状の皮膚、腫れた皮膚、湿潤性ただれ（ｗｅｅｐｉｎｇ ｓｏｒｅ）、皮膚感染症、眼瞼皮膚炎、白内障、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記対象がヒトである、請求項５０〜５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記対象のゲノムが、ＳＰＩＮＫ５遺伝子に機能喪失変異を含む、請求項５０〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記ヘルペスウイルスまたは前記薬学的組成物が、前記対象に、局所、経皮、皮下、皮膚上、皮内、経口、舌下、口腔、直腸、膣内、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、心臓内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局部投与、または吸入により投与される、請求項５０〜６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記ヘルペスウイルスまたは前記薬学的組成物が、前記対象に、局所、経皮、皮下、皮内、または経粘膜投与される、請求項５０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記ヘルペスウイルスまたは前記薬学的組成物が、前記対象に、局所、経皮、または皮内投与される、請求項５０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記ヘルペスウイルスまたは前記薬学的組成物が、前記対象に局所投与される、請求項５０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記対象の皮膚が、投与前に擦過される、請求項５０〜６５のいずれか１項に記載の方法。
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