CN109310728B - 用于递送nt3和治疗cipn的hsv载体 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于治疗神经病变的组合物和方法。在一些实施例中，本发明提供了包含编码神经营养因子，例如神经营养因子3(NT3)的核酸分子的HSV载体。

Description

用于递送NT3和治疗CIPN的HSV载体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年3月25日提交的美国临时申请号62/313,399的优先权，所述美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
序列表
根据37 CFR 1.52(e)(5)，本说明书参考序列表(以电子方式提交的命名为“2017-03-24 SL 2012073-0005_ST25”的.txt文件)。该.txt文件创建于2017年3月24日，并且大小为230,836字节。序列表的全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术
化学疗法诱导的周围神经病变(CIPN)可来源于化学疗法损伤的周围神经，并且可为癌症治疗的致残副作用。
发明内容
本公开内容涵盖以下发现：NT3基因产物在提供化学疗法诱导的周围神经病变(CIPN)的预防性和/或治疗性处理方面可显著有效。CIPN通常在化学疗法的第一个剂量之后，并且随着治疗继续，在严重性中增加。CIPN可破坏经历化学疗法治疗的患者的生活质量。尤其地，本公开内容提供了能够进入患者的背根神经节(DRG)，以便预防、抑制或治疗CIPN的高转导性单纯疱疹病毒(HSV)载体。本公开内容特别证实用病毒载体递送NT3基因产物可有效地治疗CIPN。在某些实施例中，病毒载体基于HSV。在某些实施例中，病毒载体基于HSV的McKrae株。在某些实施例中，基于HSV的病毒载体相对于HSV是变体的，至少因为一个或多个立即早期基因不起作用。
在一些实施例中，本公开内容提供了预防神经病变、抑制神经病变、减缓神经病变进展和/或延迟神经病变发作的组合物和方法。在一些实施例中，神经病变由化学治疗剂引起。在一些实施例中，本公开内容提供了允许增加剂量的化学治疗剂和/或增加的频率和/或更长的治疗持续时间的组合物和方法。在一些实施例中，本公开内容提供了逆转现有神经病变的组合物和方法，包括但不限于由一种或多种化学治疗剂引起的神经病变。
在一些实施例中，本公开内容提供了单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达一个或多个立即早期基因，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，本公开内容提供了单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，本公开内容提供了单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含以下的组合物：载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达一个或多个立即早期基因，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含以下的组合物：载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了包含以下的组合物：载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了用作药剂的组合物，其包含：载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达一个或多个立即早期基因，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了用作药剂的组合物，其包含：载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了用作药剂的组合物，其包含：载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了组合物在制造用于治疗神经病变的药剂中的用途，其中所述组合物包含载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达一个或多个立即早期基因，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，本公开内容提供了组合物在制造用于治疗神经病变的药剂中的用途，其中所述组合物包含载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了组合物在制造用于治疗神经病变的药剂中的用途，其中所述组合物包含载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了用于治疗神经病变的组合物，其包含：载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达一个或多个立即早期基因，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了用于治疗神经病变的组合物，其包含：载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，本公开内容提供了用于治疗神经病变的组合物，其包含：载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和药学可接受的载体。
在一些实施例中，载体还包含与编码神经营养因子3的序列可操作地连接的启动子。在一些实施例中，载体还包含在启动子上游的增强子。
在一些实施例中，启动子是组织特异性的。在一些实施例中，启动子是神经元特异性的。在一些实施例中，启动子是人巨细胞病毒(HCMV)启动子。在一些实施例中，启动子是降钙素基因相关肽(CGRP)启动子。
在一些实施例中，载体包含HCMV增强子和CGRP启动子。在一些实施例中，载体包含牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号。
在一些实施例中，载体是多元醇。在一些实施例中，载体是甘油。在一些实施例中，甘油的浓度范围为约1％至约30％。在一些实施例中，甘油的浓度为约5％至约25％。在一些实施例中，甘油的浓度为约5％至约15％。在一些实施例中，甘油的浓度为约10％。
在一些实施例中，编码神经营养因子3多肽的核酸分子是密码子优化的。在一些实施例中，编码神经营养因子3多肽的核酸分子具有与SEQ ID NO:23相同的核酸序列。在一些实施例中，编码神经营养因子3多肽的核酸分子具有与SEQ ID NO:23至少70％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核酸序列。
在一些实施例中，编码神经营养因子3多肽的核酸分子具有与SEQ ID NO:25相同的核酸序列。在一些实施例中，编码神经营养因子3多肽的核酸分子具有与SEQ ID NO:25至少70％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核酸序列。
在一些实施例中，神经营养因子3多肽具有与SEQ ID NO:20相同的氨基酸序列。在一些实施例中，神经营养因子3多肽具有与SEQ ID NO:20至少70％、80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开内容提供了抑制受试者中的神经病变的发展或进展的方法，该方法包括向受试者施用载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达一个或多个立即早期基因，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，本公开内容提供了抑制受试者中的神经病变的发展或进展的方法，该方法包括向受试者施用载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，本公开内容提供了抑制受试者中的神经病变的发展或进展的方法，该方法包括向受试者施用载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，本公开内容提供了治疗受试者中的神经病变的方法，该方法包括向受试者施用载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达一个或多个立即早期基因，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，本公开内容提供了治疗受试者中的神经病变的方法，该方法包括向受试者施用载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，本公开内容提供了治疗受试者中的神经病变的方法，该方法包括向受试者施用载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
在一些实施例中，神经病变是周围神经病变。在一些实施例中，神经病变是医源性的。在一些实施例中，神经病变是癌症治疗的结果。在一些实施例中，神经病变是化学疗法的结果。
在一些实施例中，化学疗法包含基于铂的化学治疗剂。在一些实施例中，化学治疗剂选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、沙铂、吡铂、奈达铂、三铂、脂质体顺铂及其组合。
在一些实施例中，化学疗法包含紫杉烷或紫杉烷衍生物化学治疗剂。在一些实施例中，化学治疗剂选自紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛及其组合。在一些实施例中，化学治疗剂是nab-紫杉醇。
在一些实施例中，化学疗法包含植物生物碱化学治疗剂。在一些实施例中，化学治疗剂选自长春新碱、长春碱、长春瑞滨及其组合。
在一些实施例中，化学疗法包含蛋白酶体抑制剂化学治疗剂。在一些实施例中，化学治疗剂是硼替佐米。
在一些实施例中，化学疗法包含抗有丝分裂化学治疗剂。在一些实施例中，化学治疗剂选自一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、格巴妥莫单抗(glembatumumab)、AGS67E及其组合。
在一些实施例中，化学疗法包含艾日布林。
在一些实施例中，化学疗法包含沙利度胺。
在一些实施例中，载体通过与受试者的皮肤接触来施用。在一些实施例中，载体皮内施用。在一些实施例中，载体施用于受试者的一只或多只手。在一些实施例中，载体施用于受试者的一只或多只脚。
在一些实施例中，受试者先前已被诊断为患有现有神经病变。在一些实施例中，其中现有神经病变包括选自疼痛、麻木、刺痛感、灼热、痛觉过敏、异常性疼痛和本体感觉受损的一种或多种症状。
在一些实施例中，在用化学治疗剂治疗患有癌症的受试者的方法中，改进包括向受试者施用载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达一个或多个立即早期基因，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子，其中施用载体以促进针对化学疗法诱导的神经病变的耐受性。
在一些实施例中，在用化学治疗剂治疗患有癌症的受试者的方法中，改进包括向受试者施用载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2[ICP4多肽序列]表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子，其中施用载体以促进针对化学疗法诱导的神经病变的耐受性。
在一些实施例中，在用化学治疗剂治疗患有癌症的受试者的方法中，改进包括向受试者施用载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16[GPRRSSSSSGVAA]表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子，其中施用载体以促进针对化学疗法诱导的神经病变的耐受性。
附图说明
附图仅用于说明性目的，而不是限制。
图1描绘了显示小鼠组中的感觉神经动作电位(SNAP)的示例性图，所述小鼠施用紫杉醇或媒介物对照和不同剂量的表达NT3或GFP的HSV载体。背根神经节(DRG)中的NT3基因组和转录物数目随着剂量而增加。
图2描绘了示例性图，其将SNAP显示为在用媒介物对照或HSV载体处理的动物中紫杉醇施用后的对照水平的百分比。图2还显示了表达NT3的McKrae株ICP4突变体显示比表达NT3的KOS株ICP4突变体更大的功效。两种病毒均用相同的载体制成。
图3描绘了示例性图，其将SNAP显示为在用表达NT3或GFP的HSV载体处理的动物中紫杉醇施用后的对照水平的百分比。
图4(包括小图A和B)描绘了示例性图，其将SNAP(小图A)和感觉神经传导速度(SNCV)(小图B)显示为动物中紫杉醇施用后的对照水平的百分比，所述动物用媒介物对照、表达GFP的HSV载体、或表达NT3的HSV载体处理。
图5描绘了示例性图，其将SNAP显示为动物中的对照水平的百分比，所述动物用媒介物对照、表达GFP的HSV载体、或不同剂量的表达NT3的HSV载体处理。
图6描绘了示例性图，其显示在接受紫杉醇的动物中，表达NT3的HSV载体施用后131天，每个L4-L6 DRG的NT3转录物的总数和HSV-1基因组的数目。
图7描绘了示例性图，其显示在接受紫杉醇的动物中，表达NT3的HSV载体施用后131天，每个L4-L6 DRG的NT3转录物的总数/基因组和HSV-1基因组的数目。
图8描绘了示例性图，其显示在接受紫杉醇的动物中，表达NT3的HSV载体施用后131天，每个L4-L6 DRG的GFP转录物的总数和HSV-1基因组的数目。
图9描绘了示例性图，其显示在接受紫杉醇的动物中，表达NT3的HSV载体施用后131天，每个L4-L6 DRG的GFP转录物的总数/基因组和HSV-1基因组的数目。
图10描绘了示例性图，其显示在接受长春新碱的动物中，表达NT3的HSV载体施用后77天，每个L4-L6 DRG的NT3转录物的总数和HSV-1基因组的数目。
图11描绘了示例图，其显示在接受长春新碱的动物中，表达NT3的HSV载体施用后77天，每个L4-L6 DRG的NT3转录物的总数/基因组和HSV-1基因组的数目。
图12描绘了示例性图，其显示在接受长春新碱的动物中，表达NT3的GFP载体施用后77天，每个L4-L6 DRG的GFP转录物的总数和HSV-1基因组的数目。
图13描绘了示例性图，其显示在接受长春新碱的动物中，表达NT3的HSV载体施用后77天，每个L4-L6 DRG的GFP转录物的总数/基因组和HSV-1基因组的数目。
图14(包括小图A和B)描绘了示例性图，其将SNAP(小图A)和SNCV(小图B)显示为动物中奥沙利铂施用后的对照水平的百分比，所述动物用媒介物对照、表达GFP的HSV载体、或表达NT3的HSV载体处理。
图15描绘了示例性图，其将SNAP(左图)和SNCV(右图)显示为动物中硼替佐米施用后的对照水平的百分比，所述动物用媒介物对照、表达GFP的HSV载体、或表达NT3的HSV载体处理。
图16描绘了示例性HSV McKrae株核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，其被鉴定为登录号JQ730035.1。
图17描绘了示例性HSV McKrae株ICP4氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图18描绘了示例性HSV McKrae株ICP22氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
图19描绘了示例性HSV McKrae株ICP47氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图20描绘了示例性HSV McKrae株ICP4核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。
图21描绘了示例性HSV McKrae株ICP22核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。
图22描绘了示例性HSV McKrae株ICP47核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。
图23描绘了示例性人巨细胞病毒增强子核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。
图24描绘了示例性降钙素基因相关肽核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。
图25描绘了示例性牛生长激素多腺苷酸化信号(SEQ ID NO:10)。
图26描绘了示例性图，其显示用表达NT3的HSV载体注射不干扰裸鼠模型中的奥沙利铂治疗。
图27描绘了示例性图，其显示用表达NT3的HSV载体注射不干扰裸鼠模型中的紫杉醇治疗。
图28描绘了示例性图，其显示用表达NT3的HSV载体注射不干扰裸鼠模型中的硼替佐米治疗。
图29描绘了HSV NT3载体逆转与神经病变相关的神经元损伤的能力。这指示HSVNT3载体可逆转现有CIPN。
图30描绘了示例性图，其显示来自HCMV启动子的NT3表达持续比GFP表达更长。在47、77、131和165天时，从四种不同的动物CIPN研究绘制了在背根神经节(DRG)中表达的载体特异性NT-3和GFP转录物数据。
图31描绘了示例图，其显示与使用嵌合HCMV-CGRP启动子(PGN-513)的NT3表达相比的使用HCMV启动子(PGN-503)的NT3表达。每种都提供了免受紫杉醇诱导的周围神经病变的保护。
图32描绘了示例图，其显示与媒介物相比，在接受紫杉醇的三种给药方案之前，在用表达NT3的HSV载体或表达GFP的HSV载体注射的动物中对SNAP的作用。
定义
在本专利申请中，除非另外从上下文明确，否则(i)术语“一个/种”可理解为意指“至少一个/种”；(ii)术语“或”可理解为意指“和/或”；(iii)术语“包含”和“包括”可理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论是单独呈现还是连同一个或多个另外组分或步骤一起呈现；并且(iv)术语“约”和“大约”可理解为允许如由本领域普通技术人员理解的标准变化；并且(v)当提供范围时，包括端点。
施用：如本文使用的，术语“施用”指将组合物施用于受试者或系统。对动物受试者(例如，对人)的施用可通过任何适当的途径。例如，在一些实施例中，施用可为支气管(包括通过支气管滴注)、颊、肠、皮间(interdermal)、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、在特定器官内(例如肝内)、粘膜、鼻腔、口腔、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括通过气管内滴注)、透皮、阴道和玻璃体。在一些实施例中，施用可涉及间歇给药。在一些实施例中，施用可涉及连续给药(例如，灌注)至少所选择的时间段。
试剂：如本文使用的，术语“试剂”指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖类、脂质、小分子或其组合。在一些实施例中，试剂是或包含天然产物，因为它在自然界中发现和/或从自然界获得。在一些实施例中，试剂是或包含一种或多种人造实体，因为它通过人的手的作用而设计、设计和/或产生，和/或在自然界中未发现。可根据本发明利用的试剂的一些具体实施例包括小分子、抗体、抗体片段、适体、核酸(例如siRNA、shRNA、DNA/RNA杂合体、反义寡核苷酸、核酶)、肽、肽模拟物等。
改善：如本文使用的，术语“改善”指状态的预防、减少或缓和，或受试者状态的改进。改善包括但不要求疾病、病症或状况的完全恢复或完全预防。
动物：如本文使用的，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”指具有任一性别且处于任何发育阶段的人。在一些实施例中，“动物”指处于任何发育阶段的非人动物。在一些实施例中，非人动物是哺乳动物(例如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可为转基因动物、遗传改造的动物和/或克隆。
大约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”指在所述参考值的任一方向上(大于或小于)落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的一系列值，除非另有说明或从上下文另外显而易见(除非当这种数目超过可能值的100％时)。
特征序列：如本文使用的，术语“特征序列”指在多肽或核酸家族的所有成员中发现的序列，并且因此可由本领域普通技术人员用于定义家族成员。
组合疗法：本文使用的，术语“组合疗法”指其中受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施例中，两种或更多种试剂或可同时施用；在一些实施例中，此类试剂可序贯施用；在一些实施例中，此类试剂以重叠给药方案施用。
组合物：如本文使用的，术语“组合物”或“药物组合物”指如本文所述的两种或更多种试剂的组合，用于共施用或作为相同方案的部分施用。在所有实施例中都不要求试剂的组合导致物理混合物，即组合物的每种组分作为分开的共试剂施用是可能的；然而，本领域的许多患者或从业者可能发现制备组合物是有利的，所述组合物是药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂中两种或更多种成分的混合物，使得能够同时施用组合的组分成分。
经改造的：如本文使用的，术语“经改造的”指已通过人的手而操纵的方面。例如，当在自然界中未以该次序连接在一起的两个或更多个序列被人的手操纵以在经改造的多核苷酸中彼此直接连接时，多核苷酸视为“经改造的”。例如，在本公开内容的一些实施例中，经改造的多核苷酸包含在自然界中发现与第一编码序列可操作地结合，但不与第二编码序列可操作地结合的调控序列，通过人的手连接，使得它与第二编码序列可操作地结合。可比较地，如果细胞或生物已被操纵使得它的遗传信息被改变(例如，先前不存在的新遗传材料已例如通过转化、交配、体细胞杂交、转染、转导或其它机制被引入，或者先前存在的遗传材料例如通过取代或缺失突变、或通过交配方案被改变或去除)，则它可视为“经改造的”。如通常的实践并且本领域技术人员理解的，即使实际操作对先前实体执行的，经改造的多核苷酸或细胞的后代通常仍被称为“经改造的”。
表达：如本文使用的，核酸序列的“表达”指下述事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3’末端形成)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
同源性：如本文使用的，术语“同源性”指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施例中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，则聚合物分子被视为彼此“同源”。在一些实施例中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相似，则聚合物分子被视为彼此“同源”。
抑制：如本文使用的，术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibiting)”指减缓、停止、减少或延迟发作。在一些实施例中，抑制神经病变包括减缓病理学或症状的进展。在一些实施例中，抑制神经病变包括减少组织损伤和/或相关神经症状的严重性。在一些实施例中，抑制神经病变包括延迟组织损伤和/或相关神经症状的发作。
分离的：如本文使用的，术语“分离的”指在最初生产时(无论在自然界中和/或在实验环境中)，已(1)与它结合的至少一些组分分开，和/或(2)通过人的手而设计、产生、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可与它们最初结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的其他组分分开。在一些实施例中，分离的试剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文使用的，如果物质基本上不含其它组分，则它是“纯的”。在一些实施例中，如本领域技术人员将理解的，在已与某些其它组分例如一种或多种载体或赋形剂(如缓冲液、溶剂、水等)组合后，物质仍可视为“分离的”或甚至“纯的”；在这样的实施例中，不包括这样的载体或赋形剂计算物质的百分比分离或纯度。仅举一个例子，在一些实施例中，在以下情况下，生物聚合物例如在自然界中出现的多肽或多核苷酸视为“分离的”：a)由于其起源或衍生源不结合在自然界中以其自然状态伴随其的某些或所有组分；b)它基本上不含来自在自然界中产生其的物种的相同物种的其它多肽或核酸；c)由细胞或其它表达系统表达或者以其它方式与来自细胞或其它表达系统的组分组合，所述细胞或其它表达系统不是在自然界中产生其的物种。因此，例如，在一些实施例中，化学合成或在与在自然界中产生其的那种不同的细胞系统中合成的多肽视为“分离的”多肽。可替代地或另外地，在一些实施例中，已经受一种或多种纯化技术的多肽可视为“分离的”多肽至它已与其它组分分开的程度：a)它在自然界中与所述其它组分结合；和/或b)在最初生产时它与所述其它组分结合。
标记物元件：如本文使用的，术语“标记物元件”指可检测或可选择试剂。在一些实施例中，“标记物元件”是可检测的或可选择的核酸序列。在一些实施例中，“标记物元件”是表达产物(例如，RNA或蛋白质)，其存在或不存在在细胞中是可检测的和/或可选择的。在一些实施例中，表达产物是或包含酶。在一些实施例中，表达产物是荧光团。
核酸：如本文使用的，术语“核酸”指掺入或可掺入寡核苷酸链内的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是经由磷酸二酯键掺入或可掺入寡核苷酸链内的化合物和/或物质。由上下文明确的是，在一些实施例中，“核酸”指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”是或包含RNA；在一些实施例中，“核酸”是或包含DNA。在一些实施例中，核酸是一种或多种天然核酸残基、包含一种或多种天然核酸残基、或者由一种或多种天然核酸残基组成。在一些实施例中，核酸是一种或多种核酸类似物、包含一种或多种核酸类似物、或者由一种或多种核酸类似物组成。在一些实施例中，核酸类似物与核酸的不同之处在于它不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施例中，“核酸”是一个或多个“肽核酸”、包含一个或多个“肽核酸”、或者由一个或多个“肽核酸”组成，所述“肽核酸”是本领域已知的，并且在主链中具有肽键代替磷酸二酯键，视为在本公开内容的范围。可替代地或另外地，在一些实施例中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。在一些实施例中，核酸是一种或多种天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)，包含一种或多种天然核苷，或者由一种或多种天然核苷组成。一些实施例中，核酸是一种或多种核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、嵌入碱基及其组合)，包含一种或多种核苷类似物，或者由一种或多种核苷类似物组成。在一些实施例中，核酸包含一种或多种与天然核酸中的那些糖相比被修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，核酸具有编码功能性基因产物(例如RNA或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施例中，核酸通过以下方式中的一种或多种来制备：从天然来源分离，通过基于互补模板的聚合酶促合成(体内或体外)，在重组细胞或系统中复制，以及化学合成。在一些实施例中，核酸长至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施例中，核酸是单链的；在一些实施例中，核酸是双链的。在一些实施例中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或者是编码多肽的序列的互补序列。在一些实施例中，核酸具有酶促活性。
患者：如本文使用的，术语“患者”指所提供的组合物施用于其施用或可施用于其的任何生物，例如用于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施例中，患者是人。在一些实施例中，患者患有或易患一种或多种病症或状况。在一些实施例中，患者展示出病症或状况的一种或多种症状。在一些实施例中，患者已被诊断有一种或多种病症或状况。在一些实施例中，患者正在接受或已经接受某些疗法，以诊断和/或治疗疾病、病症或状况。
药物组合物：如本文使用的，术语“药物组合物”指连同一种或多种药学可接受的载体一起配制的活性剂。在一些实施例中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量存在，当施用于相关群体时，所述治疗方案显示实现预定疗效的统计学显著概率。在一些实施例中，可将药物组合物专门配制成用于按固体或液体形式施用，包括适合于以下的药物组合物：口服，例如灌服药(水性或非水溶液或悬浮液)、片剂，例如靶向颊内、舌下和全身吸收的片剂、施加于舌部的大丸剂、粉末剂、颗粒剂、糊剂；肠胃外施用，例如作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制品，通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射施用；局部施用，例如作为乳膏、软膏或控制释放贴片或喷雾施加于皮肤、肺或口腔；阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；经舌下；经眼；经皮；或经鼻、经肺以及经其它粘膜表面。
药学可接受的：如本文使用的，应用于用于配制如本文公开的组合物的载体、稀释剂或赋形剂的术语“药学可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂必须与组合物的其它成分相容，并且对其接受者无害。
药学可接受的载体：如本文使用的，术语“药学可接受的载体”意指药学可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，涉及将主题化合物从身体的一个器官或一部分携带或转运到身体的另一个器官或一部分。每种载体必须在与制剂的其它成分相容并且对患者无害的意义上是“可接受的”。可充当药学可接受的载体的材料的一些例子包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如丙三醇、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及药物制剂中采用的其它无毒相容物质。
预防(Prevent)或预防(prevention)：如本文使用的，当与疾病/病症和/或病症的发生一起使用时，术语“预防(prevent)”或“预防(prevention)”指减少发展疾病、病症和/或状况的风险，和/或延迟疾病、病症或状况的一种或多种特征或症状的发作。当疾病、病症或状况的发作已延迟预定的时间段时，预防可视为完全的。
受试者：如本文使用的，术语“受试者”指哺乳动物(例如人，在一些实施例中包括出生前的人形式)。在一些实施例中，受试者患有相关疾病、病症或状况。在一些实施例中，受试者易患疾病、病症或状况。在一些实施例中，受试者展示出疾病、病症或状况的一种或多种症状或特征。在一些实施例中，受试者不展示出疾病、病症或状况的任何症状或特征。在一些实施例中，受试者是具有对疾病、病症或状况的易感性或风险特有的一种或多种特征的人。在一些实施例中，受试者是患者。在一些实施例中，受试者是诊断和/或治疗施用和/或已施用于其的个体。
治疗：如本文使用的，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指任何部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、延迟以下的发作、减少以下的严重性和/或减少以下的发生率：特定疾病、病症和/或状况(例如，神经病变)的一种或多种症状、特征和/或原因。这种治疗可为并未显示出相关疾病、病症和/或状况的体征的受试者具有的，和/或仅显示出疾病、病症和/或状况的早期体征的受试者具有的。可替代地或另外地，此类治疗可为显示出相关疾病、病症和/或状况的一种或多种确定体征的受试者具有的。在一些实施例中，治疗可为已被诊断为患有相关疾病、病症和/或状况的受试者具有的。在一些实施例中，治疗可为已知具有一种或多种易感因子的受试者具有的，所述易感因子与相关疾病、病症和/或状况的发展风险增加在统计学上相关。
载体：如本文使用的，术语“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的DNA区段可连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可连接到病毒基因组或其部分。某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体、附加型哺乳动物载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们被操作性地连接到的基因的表达。这种载体在本文中被称为“表达载体”。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书，或者如本领域通常实现的或如本文所述的执行。前述技术和程序一般可根据本领域众所周知的常规方法，并且如本说明书自始至终引用且讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述执行。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，所述参考文献以引用的方式并入本文用于任何目的。
具体实施方式
下述节段详细描述本发明的各个方面。节段的使用并不意味着限制本发明。每个节段可适用于本发明的任何方面。在专利本申请中，“或”的使用意指“和/或”，除非另有说明或从上下文中明确为分离的。
本公开内容尤其提供了包含HSV载体的组合物及其使用和制备方法。特别地，本公开内容涉及用于将NT3递送至患有或易患神经病变的受试者的HSV McKrae株载体。
化学疗法诱导的周围神经病变(CIPN)
周围神经病变来源于对周围神经的损害，其经常引起通常在手和脚的虚弱、麻木和疼痛，尽管它也可影响身体的其它部位。周围神经元将信息从中枢神经系统发送到身体的其它部分(且反之亦然)。周围神经病变可来源于创伤性损伤、糖尿病、药剂、感染、代谢问题、遗传原因和暴露于毒素。由化学疗法药剂引起的周围神经病变是化学疗法最常见的副作用之一，且可能是致残的。CIPN的最常见症状是疼痛(其可一直存在或可时有时无，如闪痛或刺痛)、灼烧感、刺痛感(“针刺”感觉或电/电击样疼痛)、感觉缺失(其可为麻木或者感觉压力、触摸、热或冷的能力减弱)、使用手指捡起或抓住物品/放下物品的困难、平衡问题、行走时绊倒或绊脚的麻烦、对冷或热的敏感性增加、对触摸或压力的敏感性增加、肌肉萎缩、肌无力、吞咽困难、便秘、排尿困难、血压变化和反射减弱或无反射。
当化学疗法药物全身施用时，它们通常遍布全身，并且某些类型可损害不同的神经。CIPN症状趋于最远离头部开始，并且随着时间过去移动得更近。在大多数情况下，CIPN症状在脚中开始，然后在手中明显。症状可在脚趾中开始，然后移动到脚、脚踝和腿，或者可在手指中开始且移动到手、手腕和手臂。CIPN可在化学疗法治疗开始后的任何时间起始，并且随着治疗继续，症状经常在严重性方面增加。
特定的化学治疗剂与CIPN联系。这些试剂包括：紫杉烷(例如紫杉醇)、铂化合物(例如奥沙利铂)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、长春花生物碱(例如长春新碱)、沙利度胺、来那度胺、埃博霉素、抗有丝分裂剂(例如艾日布林、一甲基澳瑞他汀E)、抗体药物缀合物(例如vedotin)及其他。CIPN可出现短持续时间，或者它可经过长时间段出现。影响CIPN症状的持续时间的因素包括：年龄、引起神经病变的其它医学状况(如糖尿病或HIV感染)的存在、处方药、神经病变的家族史、化学治疗试剂或化学治疗试剂的组合(包括过去使用的那些)、化学治疗试剂的剂量、化学治疗试剂的给药频率和随着时间过去给予的化学治疗试剂的总量。
不同的化学治疗剂影响神经系统的不同组分，从背根神经节(DRG)中的感觉细胞体水平到远端轴突。DRG是突出目标，因为它较不受血液神经屏障的保护，且更易受神经毒性损害影响。微管动力学的破坏是神经毒性的另一种常见机制。微管对轴突转运过程是关键的，并且对于能量和材料递送也是关键的。除能量缺乏之外，化学治疗剂还可损害外周血管系统。神经毒性的另一个目标可包括在远端末端处的直接轴突毒性。
已用于CIPN的治疗包括维生素E、钙和镁、抗癫痫药物(如卡马西平(Tegretol))、抗抑郁药(如文拉法辛(Effexor))和谷胱甘肽。这些治疗的成功是不一致的。
CIPN的诊断还可通过感觉神经动作电位(SNAP)来确定(参见Velasco&Bruna等人(2013)Neurol Neurosurg Psychiatry doi:10.1136/jnnp-2013-305334，其以引用的方式整体并入本文)。在治疗中期，急性神经病变症状的数目增加和感觉神经动作电位(例如，桡神经和背侧腓肠神经)的幅度减小与发展更严重的化学疗法诱导的神经病变的风险相关。
化学治疗试剂
如上文提及的，某些化学治疗试剂比其他试剂更频繁地与CIPN相关。这些试剂包括：紫杉烷(例如紫杉醇)、铂化合物(例如奥沙利铂)、硼替佐米、长春花生物碱(例如长春新碱)、沙利度胺、来那度胺、埃博霉素、抗体药物缀合物(例如MMAE-MAB)及其他。
顺铂
顺铂是被分类为烷化剂的化学治疗试剂。顺铂在DNA中产生链间、链内和单官能加合物交联，最普遍的形式是1,2-链内d(GpG)和d(ApG)交联。在暴露于低至200mg/m2的顺铂量后，感觉性多神经病以高频率发生。大于300mg/m2的顺铂累积剂量一致地导致严重的感觉性神经病，从而限制了可能的最大治疗剂量。顺铂治疗的啮齿类动物模型忠实地概括了人疾病的各方面。
顺铂可用于治疗睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、头与颈癌、食道癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌和前列腺癌。顺铂还可用于治疗霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、肉瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤和间皮瘤。顺铂可静脉内施用。与其它批准的化学治疗试剂组合、用于治疗睾丸癌的通常顺铂注射剂量是每天静脉内(i.v.)20mg/m2，共5天/周期。作为单一试剂，用于治疗转移性卵巢肿瘤的通常顺铂注射为100mg/m2IV/周期的剂量，每四周一次。与环磷酰胺组合、用于治疗转移性卵巢癌的通常顺铂注射剂量为75至100mg/m2(i.v.)/周期，每四周一次。作为单一试剂，用于治疗晚期膀胱癌的通常顺铂注射为50至70mg/m2(i.v.)/周期，每三至四周一次，这取决于先前暴露于放射治疗和/或先前化学疗法的程度。对于重度预治疗患者，推荐每四周重复的50mg/m2/周期的初始剂量。无机化合物顺二氨二氯铂(II)，通常称为顺铂或顺DDP，通常用于癌症治疗。
奥沙利铂
奥沙利铂是被分类为烷化剂的化学治疗试剂。奥沙利铂可用于治疗已转移的结肠癌或直肠癌，并且它经常与其它化学治疗试剂一起施用。奥沙利铂可静脉内施用。
推荐的奥沙利铂施用每2周与5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸组合。对于晚期疾病，推荐治疗直至疾病进展或不可接受的毒性。对于辅助用途，推荐治疗总共6个月(12个周期)。在推荐方案中，治疗第1天涉及施用在250至500mL 5％葡萄糖注射液中的奥沙利铂85mg/m2静脉内输注、以及在5％葡萄糖注射液中的甲酰四氢叶酸200mg/m2静脉内输注，两者使用Y线在分开的袋中经过120分钟同时给予，随后为经过2至4分钟内给予的5-氟尿嘧啶400mg/m2静脉内推注，随后为作为22小时连续输注在500mL5％葡萄糖注射液(推荐的)中的5-氟尿嘧啶600mg/m2静脉内输注。治疗第2天涉及施用经过120分钟的甲酰四氢叶酸200mg/m2静脉内输注，随后为经过2至4分钟内给予的5-氟尿嘧啶400mg/m2静脉内推注，随后为作为22小时连续输注在500mL 5％葡萄糖注射液(推荐的)中的5-氟尿嘧啶600mg/m2静脉内输注。
当在患有III期结肠癌的患者中用作辅助疗法时，出于经历2级神经感觉事件的患者中的考虑，推荐将奥沙利铂的剂量减少至75mg/m2。当在患有晚期结肠癌的患者中使用时，出于经历2级神经感觉事件的患者中的考虑，推荐将奥沙利铂的剂量减少至65mg/m2。对于持续3级神经感觉事件的患者，通常推荐应考虑停止治疗。
紫杉醇
紫杉醇是被分类为植物生物碱、紫杉烷和抗微管剂的化学治疗试剂。紫杉醇可用于治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、食道癌以及其它类型的实体瘤癌症。它也已用于卡波西肉瘤。紫杉醇可静脉内施用。
紫杉醇是抗微管剂，其促进由微管蛋白二聚体的微管组装，并且通过防止解聚来稳定微管。这种稳定性导致抑制微管网络的正常动态重新组织，这对于至关重要的间期和有丝分裂细胞功能是必需的。另外，紫杉醇在细胞周期自始至终诱导微管的异常阵列或“束”，并且在有丝分裂期间诱导微管的多个星状体。
对于患有卵巢癌的患者，已推荐下述方案。对于先前未治疗的患有卵巢癌的患者，可每3周给予下述推荐方案之一。在选择适当的方案时，应考虑毒性中的差异。一种推荐方案是经过3小时以175mg/m2的剂量静脉内施用的紫杉醇，随后为以75mg/m2剂量的顺铂。另一种推荐方案是经过24小时以135mg/m2的剂量静脉内施用的紫杉醇，随后为以75mg/m2剂量的顺铂。在先前用关于卵巢癌的化学疗法治疗的患者中，紫杉醇已以几个剂量和时间表施用；然而，最佳方案尚不清楚。另一种推荐方案是每3周经过3小时静脉内施用的紫杉醇135mg/m2或175mg/m2。
对于患有乳腺癌的患者，已推荐下述方案。对于淋巴结阳性乳腺癌的辅助治疗，推荐方案是与含多柔比星的组合化学疗法序贯施用的、每3周经过3小时以175mg/m2的剂量静脉内的紫杉醇，共4个疗程。在对于转移性疾病的初始化学疗法失败后或在辅助化学疗法的6个月内复发后，每3周经过3小时以175mg/m2的剂量静脉内施用的紫杉醇已报道是有效的。另一种推荐方案是作为阿霉素、环磷酰胺和紫杉烷的部分每周75mg/mg2，共12周。
对于患有非小细胞肺癌的患者，每3周给予的推荐方案是以135mg/m2的剂量经过24小时静脉内施用的紫杉醇，随后为顺铂，75mg/m2。
对于患有AIDS相关的卡波西肉瘤的患者，推荐方案是每3周经过3小时静脉内给予的以135mg/m2的剂量，或每2周经过3小时静脉内给予的以100mg/m2的剂量施用的紫杉醇(剂量强度45至50mg/m2/周)。
硼替佐米
硼替佐米是被分类为蛋白酶体抑制剂的化学治疗试剂。硼替佐米可用于治疗已接受至少一次先前治疗的患者的多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤。紫杉醇可静脉内施用或者作为皮下注射剂施用到大腿或腹部内。
硼替佐米的推荐起始剂量为1.3mg/m2，并且它可以1mg/mL的浓度静脉内施用，或以2.5mg/mL的浓度皮下施用。对于患有多发性骨髓瘤的患者，可考虑使用硼替佐米再治疗，所述患者先前响应用硼替佐米的治疗，并且在完成先前硼替佐米治疗后至少6个月已复发。治疗可以最后一个耐受剂量开始。当静脉内施用时，硼替佐米以3至5秒推注静脉内注射施用。
在患有先前未治疗的多发性骨髓瘤的患者中，硼替佐米与经口美法仑和经口泼尼松组合施用九个6周治疗周期。在周期1-4中，硼替佐米每周两次施用(第1、4、8、11、22、25、29和32天)。在周期5-9，硼替佐米每周一次施用(第1、8、22和29天)。通常推荐在硼替佐米的连续剂量之间经过至少72小时。
在患有先前未治疗的套细胞淋巴瘤的患者中，硼替佐米(1.3mg/m2)可与静脉内利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星和经口泼尼松(VcR-CAP)组合静脉内施用，共六个3周治疗周期。首先施用硼替佐米，随后为利妥昔单抗。硼替佐米每周施用两次，共两周(第1、4、8和11天)，随后为在第12-21天时10天休息期。对于在周期6时具有首次记录的应答的患者，推荐另外两个VcR-CAP周期。
在患有复发性多发性骨髓瘤或复发性套细胞淋巴瘤的患者中，硼替佐米(1.3mg/m2/剂量)每周施用两次，共2周(第1、4、8和11天)，随后为10天休息期(第12-21天)。对于超过8个周期的延长治疗，硼替佐米可按标准时间表施用，或者对于复发性多发性骨髓瘤，按照每周一次共4周(第1、8、15和22天)，随后为13天休息期(第23至35天)的维持时间表施用。先前响应用硼替佐米(或单独或组合)治疗的患有多发性骨髓瘤的患者、以及在其先前硼替佐米治疗后至少6个月已复发的患者，可以最后一个耐受剂量开始使用硼替佐米。再治疗的患者每三周每周两次(第1、4、8和11天)施用硼替佐米，最多8个周期。在硼替佐米的连续剂量之间应该经过至少72小时。硼替佐米可作为单一试剂或与地塞米松组合施用。
皮下开始硼替佐米可考虑用于患有预先存在的周围神经病变或处于周围神经病变的高风险中的患者。患有预先存在的严重神经病变的患者应仅在仔细的风险-效益评价后用硼替佐米治疗。在硼替佐米治疗期间经历新的或恶化的周围神经病变的患者可能需要减少剂量和/或较不剂量密集的时间表。对于经历硼替佐米相关的神经性疼痛和/或周围神经病变的患者的当前剂量或时间表修改指南如下。对于具有1级CIPN体征和症状(伴有疼痛)的患者或具有2级症状(中度症状；限制日常生活的工具性活动(如准备膳食、购买杂货或衣服、使用电话，管理钱财等))的患者，指南推荐将硼替佐米减少至1mg/m2。对于具有2级症状(伴有疼痛)或3级(严重症状；限制日常生活中的自理活动(如洗澡、穿衣和脱衣、喂养自己、上厕所、服用药物、且非卧床不起))的患者，指南推荐停用硼替佐米治疗直至毒性消退，并且当重新开始治疗时，每周一次用0.7mg/m2的减少剂量的硼替佐米治疗。对于具有4级症状(危及生命的后果；指示紧急干预)的患者，指南推荐停止用硼替佐米治疗。
长春新碱
长春新碱是被分类为植物生物碱的化学治疗试剂。长春新碱可用于治疗急性白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、肾母细胞瘤、多发性骨髓瘤、慢性白血病、甲状腺癌和脑肿瘤。紫杉醇可静脉内施用。长春新碱的作用机制已与抑制有丝分裂纺锤体中的微管形成有关，导致分裂细胞在中期阶段停滞。
用于儿科患者的长春新碱的通常剂量为1.5至2mg/m2。对于体重10kg或更小的儿科患者，起始剂量通常为0.05mg/kg，每周施用一次。用于成人的长春新碱的通常剂量为1.4mg/m2。对于直接血清胆红素值高于3mg/100mL的患者，推荐长春新碱的剂量中的50％减少。该药物通常以每周间隔静脉内施用。
沙利度胺
沙利度胺是被分类为免疫调节剂和抗血管生成剂的化学治疗试剂。沙利度胺可用于治疗新近诊断的多发性骨髓瘤，并且正处于用于治疗肾细胞癌、多形性成胶质细胞瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症的研究下。沙利度胺可经口施用。
用于治疗多发性骨髓瘤的沙利度胺的通常剂量在28天治疗周期中与地塞米松组合施用。沙利度胺的剂量为每天一次用水经口施用的200mg，优选在睡前和晚餐后至少1小时。地塞米松的剂量为每28天在第1-4天、第9-12天和第17-20天时每天经口施用的40mg。发展不良反应例如便秘、嗜睡或周围神经病变的患者可通过暂时停药或以较低剂量继续而受益。随着这些不良反应的减轻，药物可基于临床判断以较低剂量或先前剂量开始。
来那度胺
来那度胺是被分类为免疫调节剂和抗血管生成剂的化学治疗试剂。来那度胺可用于治疗多发性骨髓瘤(与地塞米松组合)和套细胞淋巴瘤，其中所述疾病在两种先前疗法(其中之一包括硼替佐米)后已复发或进展。来那度胺可经口施用。
用于治疗多发性骨髓瘤的来那度胺的推荐起始剂量为与地塞米松组合、在重复的28天周期的第1-21天时、每天一次经口25mg。对于>75岁的患者，可减少地塞米松的起始剂量。用于治疗套细胞淋巴瘤的来那度胺的推荐起始剂量为对于复发或难治性套细胞淋巴瘤，在重复的28天周期的第1-21天时经口25mg/天。
埃博霉素
埃博霉素，如同紫杉烷，通过干扰微管蛋白来阻止癌细胞分裂，但在早期试验中，埃博霉素已报道具有比紫杉烷更好的疗效和更轻微的不利效应。几种合成的埃博霉素类似物经历用于治疗各种癌症的临床开发。已被批准用于治疗乳腺癌的一种类似物是伊沙匹隆。与卡培他滨组合的伊沙匹隆指示用于在蒽环和紫杉烷失败后治疗患者中的转移性或局部晚期乳腺癌。作为单一疗法的伊沙匹隆指示用于在蒽环、紫杉烷和卡培他滨失败后治疗患者中的转移性或局部晚期乳腺癌。伊沙匹隆的推荐剂量为每3周经过3小时静脉内施用的40mg/m2。用于体表面积(BSA)大于2.2m2的患者的剂量应基于2.2m2进行计算。
单甲基奥瑞他汀E(MMAE)抗体药物缀合物
单甲基奥瑞他汀E(MMAE)是合成的抗肿瘤剂。由于高毒性，它尚未被批准用作药物本身。然而，它已被批准用于与单克隆抗体(MAB)联系的用途，所述单克隆抗体将其导向癌细胞。MMAE已用各种单克隆抗体进行检测。本妥昔单抗靶向蛋白质CD30，其在间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的恶性细胞上发现。格巴妥莫单抗靶向糖蛋白GPNMB，其在侵袭性黑素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌和其它肿瘤中发现。
本妥昔单抗指示用于治疗在自体造血干细胞移植(自体HSCT)失败后的患有经典霍奇金淋巴瘤(HL)的患者，或患者中的至少两种先前多药化学治疗方案失败后，所述患者并非自体-HSCT候选者，作为自体-HSCT巩固后处于复发或进展的高风险中的典型HL，以及在至少一种先前的多药化学治疗方案失败后的全身性间变性大细胞淋巴瘤(sALCL)。
本妥昔单抗的通常施用是每3周经过30分钟的静脉内输注，直至疾病进展或存在不可接受的毒性。对于自体HSCT巩固治疗后的典型HL，本妥昔单抗治疗通常在自体HSCT后4-6周内或从自体HSCT恢复后开始。这些患者通常继续治疗直至最多16个周期，直至疾病进展或存在不可接受的毒性。具有正常肾功能和肝功能的患者的推荐起始剂量为1.8mg/kg至180mg。具有轻度(肌酐清除率>50-80mL/分钟)或中度(肌酐清除率30-50mL/分钟)肾损伤的患者的推荐起始剂量为1.8mg/kg直至180。通常推荐如果患者具有严重(肌酐清除率小于30mL/分钟)，则患者应避免使用本妥昔单抗。具有轻度(Child-Pugh A)肝损伤的患者的推荐起始剂量为1.2mg/kg直至120mg，而通常推荐如果患者具有中度(Child-Pugh B)或严重(Child-Pugh C)肝损伤，则患者应避免使用本妥昔单抗。
病毒载体和HSV
病毒载体可用于促进核酸转移到细胞内。已知的病毒载体包括源自逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、牛痘病毒和杆状病毒的载体。源自单纯疱疹病毒(HSV)，例如单纯疱疹病毒1(HSV-1)和单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的载体，可特别用于将试剂(例如NT3)递送至特异性靶向组织。给予选择特定载体和递送系统的考虑包括例如靶细胞的特征、所需的表达寿命、载体的毒力和侵袭性；以及待转移的遗传材料的大小。
HSV-1载体通常可容纳高达25kb的外源DNA序列。HSV-1具有大约152-kb的双链线性DNA基因组，其可在细胞的核中附加地维持。HSV-1病毒粒子有包膜且直径大约110nm。通过病毒包膜糖蛋白与质膜上的硫酸肝素部分的结合，病毒感染在皮肤或粘膜的上皮细胞中启动。HSV特别良好地适合于将基因递送至神经系统，并且具有对于感觉神经元的天然向性。该病毒可建立其中病毒基因组作为核内附加型元件对于宿主的寿命持续的潜伏状态。潜伏基因组在人三叉神经节中的终身持续而不发展感觉缺失或对神经节的组织学损害，例证了潜伏机制的有效性。野生型HSV病毒可在各种胁迫的影响下从潜伏期再激活。然而，致使复制缺陷的重组病毒载体保留了在神经元中建立持久休眠状态，但仍不能在神经系统中复制(或再激活)的能力。
基于HSV-1的载体可具有致使无功能(例如，通过缺失或破坏)的复制必需的一个或多个HSV基因。复制必需的HSV基因包括例如立即早期基因，例如ICP4和ICP27。在一些实施例中，本公开内容提供了复制缺陷型HSV载体，其中ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47中的一种或多种被缺失或破坏。在一些实施例中，本公开内容提供了具有无功能的ICP4基因的HSV载体。在一些实施例中，本公开内容提供了具有无功能的ICP4、ICP22和ICP47基因的HSV载体。在一些实施例中，本公开内容提供了具有ICP4被缺失且ICP22和ICP47被破坏的HSV载体。在一些实施例中，本公开内容提供了具有ICP4被缺失且ICP22和ICP47的表达被破坏或延迟的HSV载体。在一些实施例中，本公开内容提供了具有ICP4被缺失，ICP0、ICP22、ICP27和/或ICP47不表达为立即早期基因的HSV载体。
具有缺失的HSV基因的HSV-1载体可在反式表达缺陷蛋白的细胞系中产生。在一些实施例中，HSV-1载体在哺乳动物细胞系中产生。在一些实施例中，HSV-1载体在Vero谱系的哺乳动物细胞系中产生。在一些实施例中，细胞系表达ICP4。在一些实施例中，细胞系表达ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47中的一种或多种。在一些实施例中，细胞系表达ICP4和至少一种另外的立即早期基因。在一些实施例中，细胞系表达ICP4、ICP22和ICP47。在一些实施例中，细胞系表达ICP4、ICP22和UL55。在一些实施例中，细胞系表达ICP4、ICP27和UL55。在一些实施例中，细胞系包含具有猿猴病毒40多腺苷酸化信号(SV40pA)的核酸分子。在一些实施例中，病毒载体在Vero 6-5C细胞中产生。在一些实施例中，病毒载体在Vero D细胞中产生。
McKrae株
已分离出至少17个HSV-1的毒株，包括但不限于McKrae、毒株17、毒株F、H129、HF10、MacIntyre、毒株HF、ATCC 2011和KOS(关于综述，参见Watson等人，Virology(2012))。McKrae株从患有单纯疱疹性角膜炎的患者中分离，且随后在组织培养中传代。McKrae的部分基因组序列显示于图16(SEQ ID NO:1)(登录号JQ730035)中。
在注射到动物内之后观察到HSV-1外周复制和毒力中的毒株间差异。McKrae以比其它已知毒株更高的频率经历自发或诱导的再激活，并且在最具毒力的HSV-1毒株中。McKrae也比其它已知毒株例如毒株17、KOS、F和H129更具神经侵袭性。在一项研究中，将KOS或McKrae注射到小鼠的角膜和生殖道内，以比较发病机理(Wang等人(2013)Virus Res.173(2):436-440。发现每种都在角膜上皮和三叉神经节中复制至相似程度；然而，McKrae滴度在脑干中高出100倍以上。在阴道内注射后，McKrae和KOS复制至相似的程度，除了在四天时McKrae滴度中的瞬时尖峰之外。McKrae，而不是KOS，引发外生殖器的显著炎症连同动物中的重量减轻。KOS在神经组织中未检测到，并且McKrae很少检测到。
在一些实施例中，本公开内容提供了具有基因缺失的HSV病毒载体，所述基因致使HSV复制缺陷，但不减少HSV神经侵袭性。因此，HSV载体能够穿过周围神经系统，以在施用于皮肤后到达背根神经节中的神经元。
HSV基因影响病毒特征和表型。存在对于McKrae株独特的至少9个基因和几个非编码序列。除与发病机理和潜伏期再激活相关的那些例如RL1、RS1和RL2之外，三个UL基因(UL36、UL49A、UL56)和三个US基因(US7、US10和US11)对于McKrae株是独特的。除基因变异之外，非编码序列如LAT、‘a’序列和miRNA含有对于McKrae独特的变异。
下述基因和非编码序列中的一种或多种可视为McKrae株的特征。在McKrae中，RL1(ICP34.5)具有在残基159和160之间的延伸P–A–T重复，其导致8次迭代，而其它毒株仅含有3-5次迭代。认为P-A-T重复影响ICP34.5蛋白的细胞定位。(Mao&Rosenthal,J.Biol.Chem.277(13):11423-31(2012)。认为ICP34.5是涉及病毒复制和抗宿主应答的神经毒力因子。
McKrae株还含有位于US07(gI)的编码序列内的内部串联重复STPSTTT(SEQ IDNO:11)的六次迭代的延伸重复元件。另外，在McKrae中，UL 36含有由于编码氨基酸残基2453(nt 72,535)的单核苷酸串中的G核苷酸缺失而引入的过早终止密码子，并且UL 56(180aa)含有在核苷酸115,992(氨基酸97)处的单碱基对插入。McKrae株还含有在US10中的延伸ORF，其来源于在核苷酸143,416处的单个bp插入，并且移码引起McKrae中的终止密码子缺失和独特的C末端蛋白质序列。与其它毒株相比，McKrae具有在残基28和51的UL49A处的氨基酸差异。McKrae分别在残基28和51处具有组氨酸和苏氨酸，而毒株17具有精氨酸和苏氨酸，并且其它毒株(例如KOS)具有组氨酸和丙氨酸。另外，McKrae株含有在UL–RL连接处发现的减少的串联重复(McKrae中的49bp，与毒株17和KOS中的181bp相比)，以及紧在UL–RL连接重复后缺失的大约330个核苷酸。McKrae还含有在‘a’序列直接重复2(DR2)阵列中的独特变异。代替一系列完整的串联重复，McKrae DR2重复被相同的富含鸟嘌呤的序列中断两次。
毒株之间的LAT内含子内的主要变异是由于重复元件(GCACCCCCACTCCCAC)(SEQID NO:12)中的差异，其在McKrae株的核苷酸119,482处开始的迭代次数方面不同，其中McKrae含有13个重复，而毒株F、H129和17含有9个重复，并且KOS含有15个重复。另外，毒株之间的串联重复变异在McKrae在125,520碱基处开始发现。McKrae重复元件包括CCCCAGCCCTCCCCAG(SEQ ID NO:13)的十二次迭代和CCCCTCGCCCCCTCCCG(SEQ ID NO:14)的八次迭代。第一重复单元与其它毒株不同，因为它含有G-A转换，并且毒株McKrae含有多于任何其它毒株的三次迭代。McKrae株第二重复元件塌陷(collapsed)，相对于所有其它毒株缺失188个核苷酸，并且通过含有miR-H5的105bp的100％保守序列与上游重复分离。
McKrae还含有ICP4的独特编码序列，这在其它已知毒株中未发现。(Watson等人，Virology(2012))。ICP4是立即早期转录调节因子，并且已牵涉再激活。尽管其它毒株含有在残基707和720之间的富含丙氨酸的区域(AASAPDAADALAAA)(SEQ ID NO:15)，但在McKrae中，富含丙氨酸的区域被替换为富含丝氨酸的序列[GPRRSSSSSGVAA](SEQ ID NO:16)。McKrae中存在的富含丝氨酸的取代嵌段与核定位信号(NLS)(氨基酸728-734)相邻。该区域的构象变化可改变NLS，并且依次又不仅影响ICP4的定位，还影响受ICP4定位影响的其它病毒蛋白(例如ICP0、ICP8)(Knipe和Smith，1986)。因此，该区域可通过改变蛋白质对核的定位来部分地影响病毒表型。
复制缺陷型McKrae载体
McKrae主链
病毒基因以严格调节的有序级联表达，其开始于立即早期(IE)基因的产生。所得到的IE蛋白包括受感染的细胞蛋白ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，负责在复制周期的后续阶段期间调节病毒基因表达。复制缺陷型变体病毒对于一种或多种功能是有缺陷的，所述功能对于病毒基因组复制或病毒颗粒的合成和组装是必需的。这些病毒可在表达缺失的基因产物的互补细胞系中繁殖；然而，在正常(即非互补)细胞中，病毒表达病毒基因产物，但不复制以形成子代病毒颗粒。
可通过本领域已知的用于修饰基因的各种方法产生复制缺陷型病毒。在一些实施例中，致使一个或多个核苷酸相对于野生型序列不同。在一些实施例中，一个或多个核苷酸被缺失。在一些实施例中，一个或多个核苷酸的缺失产生过早终止密码子。在一些实施例中，一个或多个核苷酸的缺失产生编码截短多肽的基因。在一些实施例中，一个或多个核苷酸的缺失产生编码非功能性多肽的基因。在一些实施例中，一个或多个核苷酸的缺失致使基因通过破坏而无功能。在一些实施例中，通过缺失其启动子来破坏基因。
在一些实施例中，一个或多个基因被缺失，以致使病毒复制缺陷。在一些实施例中，编码ICP0的基因被完全或部分缺失。在一些实施例中，编码ICP4的基因被完全或部分缺失。在一些实施例中，编码ICP22的基因被完全或部分缺失。在一些实施例中，编码ICP27的基因被完全或部分缺失。在一些实施例中，编码ICP47的基因被完全或部分缺失。在一些实施例中，编码ICP 4的基因被完全或部分缺失，而不破坏任何另外立即早期基因的表达。在一些实施例中，编码ICP4的基因被完全或部分缺失，并且一个或多个其它立即早期(IE)基因被破坏。在一些实施例中，编码ICP4的基因被缺失，并且ICP22和ICP47被破坏。
HSV-1IE启动子含有共有TAATGARAT(SEQ ID NO:19)(其中R是嘌呤)的IE特异性调节序列的一个或多个拷贝。这些基序通常位于近端IE启动子序列的几百个碱基对内，但与其侧翼序列结合，它们是离散的功能实体，其可对不同时间类别的其它近端启动子元件赋予IE特异性调节。在一些实施例中，通过缺失IE特异性调节序列中的核苷酸来产生复制缺陷型病毒。在一些实施例中，IE特异性调节序列含有内部缺失。在一些实施例中，IE特异性调节序列含有末端缺失。在一些实施例中，IE特异性调控序列被完全缺失。
下文描绘了示例性复制缺陷型McKrae株病毒载体的示意图。该示意图显示了病毒ICP4基因的两个拷贝的完全缺失，以及插入缺失的ICP4基因座的两个拷贝内的人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子驱动的表达盒。表达盒含有用于在靶细胞中表达的NT3。
Figure BDA0001806912920000261
ICP4缺失的程度导致去除两个另外的立即早期病毒基因的上游启动子序列：ICP22和ICP47。
有效负载
根据本公开内容的病毒载体含有包含载体有效负载的核酸分子。在一些实施例中，有效负载包含编码蛋白质的核酸分子。在一些实施例中，有效负载包含核酸分子，所述核酸分子包含与编码蛋白质的核酸序列互补的序列。在一些实施例中，有效负载编码调节的核酸分子。在一些实施例中，有效负载编码小干扰RNA(siRNA)多核苷酸。在一些实施例中，有效负载编码微RNA(miRNA)多核苷酸。
在一些实施例中，有效负载是编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质对于载体施用于其的靶组织或受试者是外源的。在一些实施例中，有效负载是编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质对于载体施用于其的靶组织或受试者是内源的。在一些实施例中，核酸分子是密码子优化的。在一些实施例中，有效负载包含神经营养因子。在一些实施例中，有效负载包含多种神经营养因子。在一些实施例中，有效负载包含NT3多肽。
神经营养因子
神经营养因子(NTF)是一类小型靶衍生的营养因子蛋白，其最初通过其在发育期间阻止神经元的程序性细胞死亡的能力来鉴定。神经生长因子(NGF)是据报道在发育期间交感神经周围神经系统(PNS)和感觉中枢神经系统(CNS)神经元存活所需的NTF。除NGF之外，还存在与NGF共享大约50％氨基酸同源性的其它NTF，包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT3)和神经营养因子-4/5(NT-4)。NTF与两种类型的突触后受体结合；高亲和力(KD＝10-11M)原肌球蛋白相关酪氨酸激酶(trk)受体和低亲和力(KD＝10-9M)p75NTR受体(肿瘤坏死因子受体家族成员)。在成人中，NTF可促进神经元细胞存活和细胞死亡两者，帮助轴突网络的保存和再生，并且调节突触。这些不同的功能看起来来源于肽的前体形式和经加工的成熟形式之间的相互作用，所述肽形式与trk和/或p75受体一起从靶组织释放。
虽然研究已报道用神经营养因子的全身治疗可保护周围神经病变免受原因例如糖尿病的进展，但使用重组人NGF的临床试验未能有效地治疗人受试者中的神经病变。本文认为这些研究至少部分是由于不能通过全身递送提供这些短寿命的生物活性肽的足够局部靶浓度而失败。基于HSV的基因转移可直接对周围神经提供足够的局部浓度的NTF，同时通过靶向基因递送和表达来节制潜在的异位效应。
神经营养因子3
神经营养因子3(NT3)由NTF3基因产生。NT3已定位于人中的周围神经和中枢神经。NT3被认为支持新神经元和现有神经元的存活和分化。人NT3的代表性氨基酸序列是：
MSILFYVIFLAYLRGIQGNNMDQRSLPEDSLNSLIIKLIQADILKNKLSKQMVDVKENYQSTLPKAEAPREPERGGPAKSAFQPVIAMDTELLRQQRRYNSPRVLLSDSTPLEPPPLYLMEDYVGSPVVANRTSRRKRYAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRIDTSCVCALSRKIGRT(SEQ ID NO:20)。
在人中，编码NT3的内源核酸序列是：
Figure BDA0001806912920000281
(SEQ ID NO:21)
在一些实施例中，本公开内容提供了具有用于编码NT3多肽的密码子优化序列的核酸分子。在一些实施例中，密码子优化的序列根据下述核酸序列(包括侧翼BamHI限制性位点(ggatcc，(SEQ ID NO:22))：
GGATCCATGGTCACTTTCGCAACTATTCTGCAGGTCAACAAGGTCATGTCTATTCTGTTCTATGTCATCTTTCTGGCTTATCTGAGAGGCATTCAGGGGAACAATATGGACCAGAGAAGCCTGCCAGAAGATTCCCTGAACTCTCTGATCATTAAGCTGATCCAGGCAGACATTCTGAAGAACAAACTGTCAAAGCAGATGGTGGATGTCAAAGAAAATTACCAGAGCACACTGCCAAAGGCAGAGGCTCCACGAGAGCCTGAACGAGGAGGACCAGCAAAATCCGCCTTCCAGCCCGTGATCGCTATGGACACAGAGCTGCTGCGGCAGCAGCGGAGATATAACTCTCCTAGAGTGCTGCTGTCTGACAGTACTCCACTGGAACCCCCTCCACTGTACCTGATGGAGGATTATGTGGGCTCTCCTGTGGTCGCTAATCGCACCAGTAGGCGCAAGCGATACGCAGAGCACAAAAGCCATCGAGGGGAATATTCCGTGTGCGATTCAGAGAGCCTGTGGGTCACAGACAAGAGCTCCGCCATCGATATTCGCGGACACCAAGTGACTGTCCTGGGGGAAATCAAGACCGGAAATAGTCCCGTGAAACAGTACTTTTATGAGACTAGATGCAAGGAAGCCAGGCCTGTCAAAAACGGATGTCGGGGCATTGACGATAAGCATTGGAATAGTCAGTGTAAAACCTCACAGACATACGTGAGGGCTCTGACCAGCGAGAACAACAAGCTGGTCGGCTGGCGCTGGATTAGAATTGACACTAGCTGCGTCTGCGCCCTGAGTAGGAAGATTGGAAGAACTTAAATTGGCATCTCTGGATCC
(SEQ ID NO:23)
在一些实施例中，密码子优化的序列根据下述核酸序列(包括43bp前导序列
GCGGAGGACTCTGGACAGTAGAGGCCCCGGGACGACCGAGCTG,(SEQ ID NO:24)：
CGCGGATCCGCGGAGGACTCTGGACAGTAGAGGCCCCGGGACGACCGAGCTGATGGTCACCTTTGCCACCATCCTGCAAGTGAACAAAGTGATGAGCATCCTGTTCTACGTGATCTTCCTGGCCTACCTGCGGGGCATCCAGGGCAACAACATGGACCAGAGAAGCCTGCCCGAGGACAGCCTGAACTCCCTGATCATCAAGCTGATCCAGGCCGACATCCTGAAGAACAAGCTGAGCAAGCAGATGGTGGACGTGAAAGAGAACTACCAGAGCACCCTGCCCAAGGCCGAGGCCCCTAGAGAACCTGAAAGAGGCGGCCCTGCCAAGAGCGCCTTCCAGCCTGTGATCGCCATGGATACCGAGCTGCTGAGACAGCAGCGGCGGTACAACAGCCCCAGAGTGCTGCTGAGCGACAGCACCCCTCTGGAACCTCCCCCCCTGTACCTGATGGAAGATTACGTGGGCAGCCCCGTGGTGGCCAACCGGACCAGCAGAAGAAAGAGATACGCCGAGCACAAGAGCCACCGGGGCGAGTACAGCGTGTGCGATAGCGAGAGCCTGTGGGTCACCGACAAGAGCAGCGCCATCGACATCAGAGGCCACCAAGTGACCGTGCTGGGCGAGATCAAGACCGGCAACTCCCCCGTGAAGCAGTACTTCTACGAGACACGGTGCAAAGAGGCCAGACCCGTGAAGAACGGCTGCCGGGGCATCGACGACAAGCACTGGAACAGCCAGTGCAAGACCAGCCAGACCTACGTGCGGGCCCTGACCAGCGAGAACAACAAGCTCGTGGGCTGGCGGTGGATCAGAATCGACACCAGCTGCGTGTGCGCCCTGAGCCGGAAGATCGGCAGAACATAAGTTTAAACCGCGGGATCCGCGC
(SEQ ID NO:25)
调节元件
本文考虑了在本公开内容的核酸中包括非天然调节序列、基因控制序列、启动子、非编码序列、内含子或编码序列。本文还考虑了包括核酸标签或信号序列、或编码蛋白质标签或蛋白质信号序列的核酸。通常，编码区与一种或多种调节核酸组分可操作地连接。
包括在本公开内容的核酸中的启动子可为组织或细胞类型特异性启动子、对多重组织或细胞类型特异性的启动子、器官特异性启动子、对多重器官特异性的启动子、系统或遍在启动子、或几乎系统或遍在的启动子。具有随机表达、诱导表达、条件表达或以其它方式的不连续、不稳定或不可预测表达的启动子也包括在本公开内容的范围内。本公开内容的启动子可包括任何本领域已知的上述特征或其它启动子特征。
已知启动子的例子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子CMV/人β3珠蛋白启动子GFAP启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子和遍在蛋白启动子，例如从人遍在蛋白A、人遍在蛋白B和人遍在蛋白C中分离的那些。
在一些实施例中，启动子是神经元特异性启动子，因为它是在神经元中具有特异性表达、在神经元中优先表达、或通常在神经元或神经元子集中驱动相关编码序列表达，但在一种或多种其它组织或细胞类型中则不是这样的启动子。此类启动子的例子包括降钙素基因相关肽(CGRP)、突触蛋白I(SYN)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II、微管蛋白αI、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白1B(MAP1B)和血小板源性生长因子β链启动子、以及其衍生物。在一些实施例中，启动子是降钙素基因相关肽(CGRP)启动子或其衍生物。
其它调节元件可另外与有效负载例如增强子和多腺苷酸化位点可操作地连接。在一些实施例中，增强子包含人巨细胞病毒(HCMV)序列。在一些实施例中，多腺苷酸化位点包含牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号。
在一些实施例中，启动子是在自然界中发现的一种或多种启动子或调节元件的嵌合体。在一些实施例中，病毒载体包含有效负载，其表达由具有HCMV增强子序列的CGRP启动子驱动。
载体的制备
本公开内容特别涉及复制缺陷的McKrae株病毒载体。在一些实施例中，通过缺失或破坏一个或多个立即早期基因来生成病毒载体。可使用本领域已知的重组技术方法来缺失或破坏病毒基因。在一些实施例中，由于同源重组事件，本公开内容的病毒载体可致使复制缺陷。在一些实施例中，通过缺失ICP4基因来生成复制缺陷型病毒载体。在一些实施例中，通过缺失ICP4基因和缺失一个或多个其它立即早期基因(例如ICP22和/或ICP47)的启动子来生成复制缺陷型病毒载体。
在一些实施例中，通过经由同源重组缺失编码一种或多种ICP(例如，ICP4)的基因座来生成本公开内容的病毒载体。在一些实施例中，本公开内容的病毒载体的生成包括第一质粒与第二质粒的同源重组的步骤。在一些实施例中，第一质粒含有与HSV基因组区域同源的核酸序列，所述HSV基因组区域与预期替换的HSV基因组的核酸区域相邻。在一些实施例中，第二质粒含有HSV基因组或其片段。在一些实施例中，第一质粒含有编码在同源核酸序列之间的目的多肽(例如，NT3)的核酸序列。在一些实施例中，目的多肽可为或包括可通过荧光、化学发光或其它性质检测的标记物蛋白，其可用于选择来源于成功的同源重组的载体。
在一些实施例中，通过第一质粒与含有HSV McKrae株基因组的第二质粒的同源重组来生成本公开内容的病毒载体，所述第一质粒含有与ICP4启动子上游的区域同源的核酸序列，包括在HSV的短反向重复区域内包含的病毒起点。
在一些实施例中，通过首先使用质粒SASB3通过同源重组替换ICP 4基因座的两个拷贝，并且筛选表达绿色荧光蛋白(GFP)的噬斑来制备载体。在一些实施例中，通过将HSV-1KOS株基因组(核苷酸124485-126413)的Sph I至Afl III(Sal I linkere)片段(1928bp)克隆到Sph I/Sal I消化的pSP72内，随后将695bp Bgl II至BamH I片段(核苷酸131931至132626)(其含有ICP4启动子上游的区域，包括在短反向重复区域内包含的病毒起点)插入载体质粒的Bgl II至BamH I位点内来构建质粒。在一些实施例中，通过如上所述在质粒的BamHI位点克隆HCMV-eGFP片段来构建质粒。在一些实施例中，然后将如上所述的质粒重组到野生型McKrae病毒的特定基因座内。在一些实施例中，使用稳定细胞系分离所得到的载体，所述稳定细胞系表达复制所需的在HSV基因组中被缺失或破坏的一个或多个基因。
载体的表征
可通过基因组测序来表征根据本公开内容的病毒载体，以便确定预期的载体是否成功产生。本领域已知的任何测序方法对于此目的都是可接受的。测序方法包括例如纳米孔测序、单分子实时测序(SMRT)、DNA纳米球(DNB)测序、焦磷酸测序和使用DNA阵列。
可通过本领域已知的用于检测蛋白质或核酸的任何方法检测来自病毒载体的有效负载的表达。检测蛋白质表达的方法包括免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫电子显微镜检查、个别蛋白质免疫沉淀(IP)、蛋白质复合物免疫沉淀(Co-IP)、染色质免疫沉淀(ChIP)、RNA免疫沉淀(RIP)、免疫电泳、分光光度法和二辛可宁酸测定(BCA)。检测核酸表达的方法包括DNA印迹、RNA印迹、聚合酶链反应(PCR)、定量PCR和RT-PCR。
在一些实施例中，本公开内容提供了用于测试病毒载体转导神经元的能力的方法。在一些实施例中，神经元是周围神经元。在一些实施例中，神经元是感觉神经元。在一些实施例中，神经元包括背根神经节(DRG)。
在一些实施例中，可将病毒载体制剂注射到对应于DRG的区段的一个或多个皮节内，例如左和右L4、L5和L6 DRG。取出DRG并且从DRG中分离DNA，并且使用靶向HSV-1内的序列的qPCR测定分析载体基因组拷贝。在一些实施例中，qPCR测定靶向HSV-1糖蛋白(UL-22)基因内的序列。
应用/用途
根据本公开内容的病毒载体可用于广泛多样的治疗应用。在一些实施例中，如本文所述的载体可用于将一种或多种有效负载递送至一种或多种靶细胞。在一些实施例中，靶细胞存在于弱血管化且难以通过体循环到达的组织中。在一些实施例中，靶细胞是易受HSV感染的细胞。在一些实施例中，靶细胞特别易受HSV的McKrae株感染。在一些实施例中，靶细胞是或包括一种或多种神经元细胞。在一些实施例中，靶细胞是背根神经节(DRG)细胞。
基因治疗
根据本公开内容的病毒载体可用于其中考虑基因疗法的任何背景中。例如，包含与启动子可操作地连接的异源核酸区段的病毒载体可用于与由异源核酸区段编码的蛋白质的减少或缺乏相关的任何疾病或临床状况，或者可通过在受试者内表达编码的蛋白质来有效治疗的任何疾病或临床状况。含有用于合成RNAi试剂(例如，一种或多种siRNA或shRNA)的表达盒的病毒载体可用于治疗与受试者中的转录物或其编码蛋白质的过表达相关的任何疾病或临床状况，或者可通过在受试者中引起转录物或其编码蛋白质的减少来治疗的任何疾病或临床状况。包含用于合成一种或多种RNA的表达盒的病毒载体可用于调节免疫系统应答(例如，负责器官移植排斥、过敏、自身免疫疾病、炎症等的应答)，所述RNA自杂交或彼此杂交，以形成靶向编码细胞因子的转录物的RNAi试剂。提供用于合成一种或多种RNA的模板的病毒载体可用于治疗传染病，所述RNA自杂交或彼此杂交，以形成靶向传染剂的转录物或靶向细胞转录物的RNAi试剂，所述转录物的编码产物是传染过程必需的或促进传染过程的任何方面。
施用
包含如本文所述的病毒载体的组合物可配制用于通过任何可用途径递送，所述途径包括但不限于肠胃外(例如静脉内)、皮内、皮下、经口(例如吸入)、透皮(局部)、透粘膜、直肠和阴道。优选的递送途径包括皮内。在一些实施例中，药物组合物包括与药学可接受的载体组合的病毒载体。如本文使用的，措辞“药学可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。补充的活性化合物也可掺入组合物内。在一些实施例中，病毒载体在甘油中配制。在一些实施例中，病毒载体在磷酸盐缓冲盐水中的大约10％甘油中配制。
以剂量单位形式配制组合物以便于施用和剂量均匀性是有利的。如本文使用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单元；每个单元含有经计算与药物载体结合产生所需疗效的预定数量的病毒载体。
药物组合物可根据需要以不同的间隔和经过不同的时间段施用，例如，每周一次，共约1至10周、2至8周、约3至7周、约4、5或6周等。技术人员将了解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及存在的其它疾病。用病毒载体治疗受试者可包括单次治疗，或者在许多情况下，可包括一系列治疗。
组合物
在一些实施例中，用载体制备活性剂，即本公开内容的病毒载体和/或待连同本公开内容的病毒载体一起施用的其它试剂，所述载体将保护化合物免受从体内快速消除，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种组合物的方法对于本领域技术人员是显而易见的。在一些实施例中，组合物靶向特定细胞类型或被病毒感染的细胞。
组合疗法
根据本公开内容，提供的组合物可与一种或多种其它活性剂和/或治疗模式组合施用，例如已知的治疗剂和/或独立地活性的生物活性剂。在一些实施例中，提供的组合物包括一种或多种此类其它活性剂；在一些实施例中，此类其它活性剂作为不同组合物的部分提供。在一些实施例中，组合疗法涉及同时施用两种或更多种不同的活性剂和/或治疗模式的一个或多个剂量或单位；在一些实施例中，组合疗法涉及同时暴露于两种或更多种不同的活性剂和/或治疗模式，例如通过重叠给药方案。
在一些实施例中，提供的组合物包括或与可用于治疗相关疾病、病症和/或状况的一种或多种其它活性剂组合施用。在一些实施例中，提供的组合物与化学治疗剂组合施用(例如，在其之前、与其同时和/或在其之后)。
实例
实例1：载体的制备
该实例描述了制备和配制用于基因治疗的示例性载体的方法。
载体的遗传结构
通过首先使用质粒通过同源重组替换ICP4基因座的两个拷贝，并且筛选表达标记物元件的噬斑来制备载体。通过克隆HSV-1基因组的片段来构建质粒，所述片段包含ICP4启动子上游的区域，包括在短反向重复区域内包含的病毒起点。通过将标记物元件例如HCMV-eGFP片段克隆到质粒内进一步修饰质粒。然后将该质粒重组到野生型HSV病毒的ICP4基因座内。使用表达稳定ICP4的Vero细胞系分离所得到的载体，例如‘6-5C’。Vero 6-5C细胞是表达ICP4的互补细胞。
为了用上述载体中的目的基因(GOI)替换标记物元件(例如GFP)，通过将HCMV-GOI-pA克隆到质粒内来构建质粒。分离不表达标记物元件的噬斑，并且通过ELISA测试GOI表达。
粗载体的生产
使用完全培养基(补充有FBS、HEPES和Pen Strep的DMEM)在组织培养瓶中培养补充ICP4的Vero细胞，并且以3-4x104细胞/cm2的接种密度扩增到6–12xT175烧瓶内。将培养瓶在37℃/7.5％CO2下温育3-4天。
当细胞在汇合后1-2天时，它们用已知浓度的病毒原液以约0.1的感染复数(MOI)感染。通过从每个烧瓶中取出培养物上清液，并且用含有适当量病毒原液的完全培养基感染来起始感染。通过将培养物温育1.5-2小时，每15-20分钟摇动并旋转烧瓶，将病毒吸附在细胞单层上。在吸附步骤后，向每个烧瓶中加入另外的完全培养基，并且将培养物再次在37℃/7.5％CO2下温育。
在起始感染后大约48小时，通过显微镜观察烧瓶，以确认细胞显示致细胞病变效应的征兆和从烧瓶表面脱离。此时收获细胞和上清液，合并在一起，并以约1500xg离心约10分钟。上清液从细胞团块中去除，并且分开保留用于后续处理。
将细胞团块重悬浮于4-5mL完全培养基中，匀浆化，然后在-80℃下冷冻。在细胞悬浮液已冷冻>20分钟后，将其解冻并以约1500xg离心约10分钟。去除该第二细胞团块上清液，并且与第一次收集的上清液组合。
将合并的上清液等分到离心管内。然后将病毒以约40,000xg在2-8℃下离心约30分钟，以便使病毒形成团块。在离心步骤完成后，取出管中的上清液并弃去。第二天，通过移液将病毒团块匀浆化且合并在一起。然后将重悬浮的病毒原液等分到冷冻小瓶内，通常为约120μL/小瓶的体积。将完全培养基(200-300μL)加入病毒团块中，以便用液体覆盖它们并在2-8℃下贮存过夜，以使病毒颗粒松散。将小瓶标记并在-80℃下冷冻。随后，解冻冷冻小瓶以便执行病毒噬斑滴定测定，以在用于任何体内或体外研究之前确定制备的病毒原液的浓度。
澄清载体的制造
细胞解冻和扩增
将来自工作细胞库的Vero细胞(例如，Vero 6-5、VeroD细胞)在37℃下解冻，并且转移到锥形管中且合并。VeroD细胞是表达或ICP4、ICP27和UL55的互补细胞。细胞以大约1.0×107个活细胞/mL/管加入小瓶。用完全培养基逐渐稀释细胞，且取出样品以获得活细胞计数。将细胞以3.0-5.0×104个细胞/cm2的密度在组织培养瓶中铺平板。
使细胞在37℃、7.5％CO2下温育，并且通过相差显微镜检查定期检查。细胞在亚汇合时进行传代。去除完全培养基，用PBS冲洗，且使细胞解离。将烧瓶温育直至细胞解离，然后将它们重悬浮于完全培养基中，合并，计数且以1.0-4.0×104个细胞/cm2的密度种植到新烧瓶内。将细胞扩增并且允许在感染前扩展至汇合后1-2天。
用载体感染
当细胞达到所需的汇合时，将模型烧瓶进行传代培养，并且计数细胞，以估计每个细胞工厂的细胞数目。通过解冻获得0.1的感染复数(MOI)所需的适当体积，并且用完全培养基稀释原液直至感染所需的靶体积，来制备主病毒库载体接种物。细胞工厂通过初始吸附期感染，随后为在完全培养基中的温育用于第一天感染。在大约24小时后，去除培养基且替换为等体积的无血清培养基。将细胞工厂置于培养箱中，且将温度降至33℃/具有7.5％CO2。每天监测培养物并且通过目视检查估计致细胞病变效应百分比。
粗病毒收获和澄清
通过将细胞工厂置于生物安全柜中，并且将上清液和细胞碎片合并到无菌袋内来停止感染。就外来因子取样这种批量未澄清的收获物。在取样后，收获的氯化钠水平增加，然后将其混合。然后将收获物等分到离心管内，并且通过离心去除细胞碎片。将上清液合并到无菌袋内。在用无菌水预处理澄清过滤器胶囊后，然后将含病毒的上清液泵送通过过滤器胶囊到另一个无菌袋内，随后为无菌水，以回收胶囊中剩余的病毒。将袋混合并将滤液在4℃下贮存过夜。
其后，将滤液加温，并且通过加入在无菌水中的2体积的3mM MgCl2，将其调节至约2mM MgCl2。将稀释的滤液混合并用核酸内切酶处理。
阳离子交换柱色谱
BPG 400柱用SP高性能树脂填充，用0.5N NaOH消毒，并且用洗涤缓冲液(PBS pH7.0)和剥离缓冲液(1M NaCl-PBS pH 7.0)平衡，然后装载核酸内切酶处理的病毒。
使用管道焊接机将含有经核酸内切酶处理的滤液的处理袋连接到入口，并且将病毒装载到柱上。将流通物收集在无菌袋中。病毒捕获步骤随后为用PBS洗涤，直至UV吸光度回到基线。停止泵，并且将含有0.45M NaCl-PBS(pH 7.0)的处理袋连接到入口。将出口管道转移到生物安全柜中的无菌容器中。将缓冲液泵入柱内，并且当UV吸光度开始急剧增加时，将柱出口转移到新的无菌容器中，以收集洗脱的病毒。在UV吸光度恢复到接近基线后停止收集。这是纯化的病毒洗脱物级分。将包含剥离缓冲液的处理袋连接到入口，并且将出口管道的末端转移到无菌瓶内，以收集剥离级分。将缓冲液泵送通过柱，直到UV吸光度达到峰值并返回到接近基线。将收集的洗脱物于4℃贮存过夜。
切向流过滤
通过组装管道和药液筒，并且通过高压灭菌将系统灭菌，来制备使用0.1微米孔径的中空纤维滤筒的切向流过滤系统。用无菌PBS(pH 7.0)冲洗系统，并且将病毒洗脱物级分加入系统储存器中，并且通过再循环平衡。平衡后，打开渗透物收集泵并收集滤液。运行该系统，直到装载的体积减少到大约500ml。用DPBS(pH 7.0)伴随连续恒定体积渗滤稀释储存器中的渗余物，并且当渗透物电导率在渗滤缓冲液(DPBS pH 7.0)的10％内时，回收渗余物中的产物。
配制、最终过滤和包装
用无菌甘油将回收的渗余物调节至10％最终体积，并且充分混合，然后通过0.45μm盘式过滤器单元过滤。将产品分配到标记的冷冻小瓶内，用于在≤-65℃下贮存。
实例2：用包含NT3的载体预防CIPN(紫杉醇)
该实例显示了用包含NT3的McKrae株HSV载体预防由紫杉醇引起的CIPN的示例性数据。将如上所述的复制缺陷型HSV-1载体注射到大鼠的足垫内。如图1所示，紫杉醇导致感觉神经动作电位(SNAP)中的显著降低。另外，用包含NT3的HSV-1载体预处理的动物以剂量依赖性方式受到保护。
实例3：用包含NT3的载体预防CIPN(紫杉醇)
该实例显示了用包含NT3的McKrae株HSV载体预防由紫杉醇引起的CIPN的示例性数据。
紫杉烷(紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛)是源自紫杉树(红豆杉属物种(Taxus sp.))的一组抗肿瘤药物，其通常用于治疗广泛多样的癌症。紫杉烷通过其工作的机制与铂类药物不同。紫杉烷是植物生物碱，其通过抑制微管蛋白的解聚来稳定微管，导致大的和功能失调的微管。微管对于细胞分裂是必需的，因此紫杉烷类是有力的有丝分裂抑制剂。长春新碱，另一种植物生物碱衍生的肿瘤药物，通过阻碍微管的组装来抑制有丝分裂。除了它们在有丝分裂中的作用之外，微管对于神经元中的轴突运输也是必需的，因此干扰微管的适当功能的化学治疗剂，例如紫杉烷，通过干扰正常的轴突运输引起神经病变。
在接受紫杉醇之前，用复制缺陷型HSV-1载体或媒介物对照处理四组动物。将载体或媒介物对照的施用注射到大鼠的足垫内。用复制缺陷型HSV-1载体处理的动物施用包含NT3的KOS株载体、包含NT3的McKrae株载体或包含绿色荧光蛋白(GFP)的McKrae株载体。如图2所示，基于SNAP的分析，包含NT3(NET-NT3)的McKrae株载体比包含NT3的KOS株载体更有效地保护免受CIPN。
在另一项研究中，给动物施用包含NT3或GFP的复制缺陷型HSV-1载体，然后施用紫杉醇或媒介物的多重给药。如图3所示，包含NT3的载体能够保护免受紫杉醇的多重给药，如通过SNAP相对于对照的百分比所证明的。
在另一项研究中，雌性BALB/c小鼠用含有1x1010PFU/mL的NT3载体或GFP载体的25μl皮下注射到两只后爪的足趾面内。载体接种后三天，小鼠开始紫杉醇处理，由30mg/kg紫杉醇组成，腹膜内(i.p.)，每周三次，共两周(M-W-F、M-W-F)。在最后一个紫杉醇剂量后的第3、10、24、41、61和116天时，通过NCS评价神经病变。
如图4所示，与未处理的对照小鼠相比，用紫杉醇处理的小鼠发展周围神经病变，其特征在于诱发的感觉神经振幅电位(SNAP)中的20-35％减少，以及从3-61天的传导速度(SNCV)中的15％减少。SNAP中的这种减少类似于用顺铂处理的大鼠中发现的那种。用NT3载体注射但未给予GFP载体的小鼠保护免于发展周围神经病变，并且具有与未处理的对照小鼠无法区分的SNAP和SNCV。这种保护持续了研究的整个时间过程。
实例4：针对紫杉醇诱导的周围神经病变的保护的剂量下降研究
该实例显示了用于确定复制缺陷型McKrae株HSV-1载体的最低有效剂量，以保护免受紫杉醇诱导的周围神经病变的示例性数据。
用复制缺陷型McKrae株HSV-1载体注射五组小鼠(N＝6)，剂量范围为5x104至5x108总PFU。三天后，小鼠开始紫杉醇处理。在紫杉醇后24天时，对这些小鼠执行神经传导分析，并且将结果与接受GFP载体(5x108总PFU)的一组小鼠和接受媒介物注射的完整对照小鼠进行比较。
如图5所示，如通过感觉神经动作电位(SNAP)测量的，用两种最高剂量的NT3载体，5x108和5x107总PFU预处理的小鼠，被完全保护免受紫杉醇诱导的周围神经病变的发展。用5x106总PFU的NT3载体预处理的小鼠具有比两个最高剂量更低的平均SNAP值，尽管它与媒介物组没有统计学显著差异，提示该剂量是部分保护性的。两种最低剂量的NT3载体不提供保护。这些数据提示在该范例中，5x106总PFU是NT3载体用于预防紫杉醇诱导的周围神经病变的最低有效剂量。
实例5：在用紫杉醇处理后的有效负载表达的分析
该实例显示了在施用复制缺陷型HSV-1载体和紫杉醇后，相对于HSV-1基因组数目的转录物表达的示例性数据。如图6所示，DRG中的NT-3转录物在表达NT3的HSV载体施用后131天测试的八只动物中的六只中可检测到。具有低于检测水平的NT3转录物水平的那些动物与每个L4-L6 DRG的低HSV-1基因组总数相关联。另外，如图7所示，当数据被分析为每个基因组的NT3转录物而不是NT3转录物的总数时，八只动物中的六只在每个基因组0至9.8个转录物的范围内。
还对施用紫杉醇和包含GFP的复制缺陷型HSV-1载体的动物执行相同的实验。如图8所示，GFP转录物在GFP表达载体施用后131天测试的七只动物中的三只中可检测到。GFP转录物水平比施用NT3载体的动物中可见的水平低大约10倍。另外，如图9所示，当数据被分析为每个基因组的GFP转录物而不是GFP转录物的总数时，七只动物中的三只在每个基因组0至1.0个转录物的范围内(相对于施用NT3载体的动物的0至9.8。
实例6：在用长春新碱处理后的有效负载表达的分析
该实例显示了在施用复制缺陷型HSV-1载体和长春新碱后，相对于HSV-1基因组数目的转录物表达的示例性数据。如图10所示，DRG中的NT-3转录物在表达NT3的HSV载体施用后77天测试的所有八只动物中都可检测到。另外，如图11所示，当数据被分析为每个基因组的NT3转录物而不是NT3转录物的总数时，所有八只动物都在每个基因组2至32个转录物的范围内。
还对施用长春新碱和包含GFP的复制缺陷型HSV-1载体的动物执行相同的实验。如图12所示，GFP转录物在施用GFP表达载体后77天测试的八只动物中的六只中可检测到。GFP转录物水平显著低于施用NT3载体的动物中可见的水平。另外，如图13所示，当数据被分析为每个基因组的GFP转录物而不是GFP转录物的总数时，七只动物中的三只在每个基因组0至1.8个转录物的范围内(相对于施用NT3载体的动物的2至32。
实例7：用含有NT3的载体预防CIPN(奥沙利铂)
该实例显示了用包含NT3的HSV载体预防由奥沙利铂引起的CIPN的示例性数据。
如同其它铂化合物(顺铂、卡铂)，奥沙利铂的细胞毒性被认为来源于细胞中DNA合成的抑制。特别地，奥沙利铂在DNA中形成链内和链内交联，其阻止DNA复制和转录，促使细胞死亡。奥沙利铂用于治疗结肠直肠癌，通常以称为FOLFOX的组合连同亚叶酸和5-氟尿嘧啶一起。对于奥沙利铂使用可发生急性和持续性神经病变两者。急性、可逆性神经病变(例如手、足、口周部或喉咙中的急性短暂性感觉异常、感觉迟钝、感觉减退，下颌痉挛，舌感异常，构音障碍，眼痛，胸压感)可在奥沙利铂施用后数小时或1–2天内发生，且一般在14天内消退；它经常伴随药物的进一步施用再发生。持续的感觉神经病(例如感觉异常、感觉迟钝、感觉减退、本体感觉受损)可无需任何先前的急性神经病变事件而发生，并且通常在奥沙利铂施用后持续数周至数月。
雌性BALB/c小鼠用含有1x1010PFU/mL的NT3载体或GFP载体的25μl皮下注射到两只后爪的足趾面内。载体接种后三天，小鼠开始奥沙利铂处理，由3.5mg/kg奥沙利铂(i.v.)组成，每两周一次，共六周。在最后一个奥沙利铂剂量后的第3、17、35、41、56和111天时，通过NCS评价神经病变。
如图14所示，与未处理的对照小鼠相比，用奥沙利铂处理的小鼠发展周围神经病变，其特征在于诱发的感觉神经振幅电位(SNAP)中的20-30％减少，以及从3-111天的传导速度(SNCV)中的10-20％减少。SNAP中的这种减少类似于用紫杉醇处理的小鼠中发现的那种。用NT3载体注射但未给予GFP载体的小鼠保护免于发展周围神经病变，并且具有与未处理的对照小鼠无法区分的SNAP和SNCV。这种保护持续了研究的整个时间过程。
实例8：用包含NT3的载体预防CIPN(硼替佐米)
该实例显示了用包含NT3的HSV载体预防由硼替佐米引起的CIPN的示例性数据。
硼替佐米是FDA批准的一类抗癌药物，称为蛋白酶体抑制剂。这些化合物的细胞毒性可能是由于关键细胞信号传导途径例如细胞周期调节和基因转录的破坏，导致细胞周期停滞和细胞凋亡。硼替佐米通常用于治疗多发性骨髓瘤和复发性套细胞淋巴瘤，尽管也用于实体瘤。如同紫杉烷和铂，主要临床上显著的剂量限制性副作用是周围神经病变，其特征在于以远端长袜和手套模式(distal stocking-and-glove pattern)发生的麻木和刺痛。在第一个治疗周期后经常发展严重的神经性疼痛。
雌性BALB/c小鼠用含有1x1010PFU/mL的NT3载体或GFP载体的25μl皮下注射到两只后爪的足趾面内。载体接种后三天，小鼠开始硼替佐米处理，由0.8mg/kg硼替佐米(在5％/5％/90％乙醇/tween80/盐水中)(i.v.)组成，每两周一次，共四周。在最后的硼替佐米剂量后的第12和26天时，通过NCS评价神经病变。
如图15所示，与未处理的对照小鼠相比，用硼替佐米处理的小鼠发展周围神经病变，其特征在于诱发的感觉神经振幅电位(SNAP)中的减少和感觉神经传导速度(SNCV)中的减少。在硼替佐米给药前PGN-503的单次施加减少周围神经病变的严重性和持续时间。
实例9：表达NT3(NET-NT3)的HSV McKrae株载体的临床试验
执行NET-NT3的I/II期随机化、双盲、安慰剂对照的临床试验。NET-NT3是表达人NT-3的复制缺陷型HSV载体，用于预防或治疗化学疗法诱导的周围神经病变(CIPN)。所提议的临床试验的群体由乳腺癌患者组成，所述乳腺癌患者预定接受12个周剂量的辅助紫杉醇治疗。
临床试验包括递增剂量、随机化、双盲、安慰剂对照的临床试验，评估皮内注射NET-NT3的安全性和有效性，以预防在乳腺癌的辅助背景下用紫杉醇治疗的患者中的化学疗法诱导的周围神经病变。
在筛选就诊后28天内，在第0天时，符合所有入选和排除标准的受试者预定接受作为在膝盖以下的一条腿上的一系列大约10次皮内注射、以及在肘部以下和在手背上的10次注射递送的NET-NT3或安慰剂，用于I/II期研究。NET-NT3给药预期在化学疗法起始前3-14天发生。在给药后在临床研究中心观察2小时后，在第0天施用后评价后，受试者将出院。接受佐剂紫杉醇(每周一次，共12周)的受试者每两周随访，共16周，然后为在给药后28周时的安全性随访。
主要目标包括：
(1)评估在预定接受用于乳腺癌的辅助紫杉醇的受试者中，在三个递增剂量群组，2x108、2x109和2x1010噬斑形成单位(PFU)中皮内递送NET-NT3的安全性；和
(2)确定预定接受用于乳腺癌的辅助紫杉醇的受试者中NET-NT3相对于安慰剂的CIPN预防效力。功效测量将包括感觉神经动作电位和神经传导速度、临床总神经病变评分(TNS)和EORTC-CIPN20。
主要功效变量是在基线和第12周时的辅助紫杉醇治疗随访结束之间的感觉神经动作电位(腓肠和尺骨)中的变化。
次要目标包括：
(1)评估NET-NT3相对于安慰剂的一般和疾病相关的生活质量(NCI-CTC和ECOG)评分中的改善；和
(2)评估接受NET-NT3相对于安慰剂的受试者中接受的紫杉醇总剂量。
次要功效变量包括：
(1)在基线每两周一次就诊直到第12周之间的EORTC CIPN20；
(2)在化学疗法给药就诊后4周时的平均EORTC CIPN20中的变化。紫杉醇：16周；
(3)在安全性随访就诊时的平均EORTC CIPN20中的变化。紫杉醇：28周；
(4)如对于紫杉醇受试者的第12周相比，如通过总神经病变评分(TNS)测量的，神经病变的平均发展与基线的差异；
(5)对于紫杉醇受试者在基线和第12周化学疗法治疗结束时的腓肠神经和尺神经传导速度中的变化；
(6)在化学疗法给药就诊后4周时的平均TNS中的变化。紫杉醇：16周；
(7)在安全性随访就诊时的平均TNS中的变化。紫杉醇：28周；
(8)在每次就诊时接受NET-NT3相对于安慰剂的受试者中，美国国家癌症研究所-通用毒性标准(National Cancer Institute-Common Toxicity Criteria)(NCI-CTC)中的变化；
(9)在每次就诊时接受NET-NT3相对于安慰剂的受试者中的美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group)(ECOG)评分；和
(10)在第0天和第16周就诊之间，紫杉醇受试者的化学疗法的累积总剂量。
安全性变量包括：
(1)体格检查包括神经系统检查(尖锐、温暖和振动感觉，以及深腱反射)；
(2)不良事件(AE)；
(3)严重不良事件(SAE)；
(4)生命体征；和
(5)临床实验室结果。
剂量和施用：NET-NT3将以在2.0毫升中的2x108PFU、2x109PFU和2x1010PFU的剂量(每个受试者的总剂量)递送。将药物皮内注射到大约20个部位内，这些部位由分布在单膝以下的皮肤表面上的10个部位和在同侧手背上的10个部位组成。如果前三个剂量全部显示相似的功效水平，则将添加第四剂量群组(2x107PFU)，具有相同数目的患者和研究执行。
该研究设计为在每个剂量水平下给药三个受试者，以便评估安全性。在对于剂量组内的每个患者已收集一个月的安全性数据后，将确定该研究是否应该推进到下一个剂量水平。一旦剂量水平已被批准，在该剂量水平下就招募另外23个受试者。在23个受试者中，17个将施用与安全性群组相同的剂量，并且六个受试者将接受安慰剂。除非剂量水平未被批准用于推进，否则将对于三个剂量水平完成该给药方案。
给药次序将从2x108群组中的三个受试者开始，其将包括第一剂量，并且将推进直至达到最大耐受剂量(MTD)或最高剂量水平(2x1010PFU)。每个群组填满后存在一个月的审核期，以便在DSMB被要求批准递增到下一个剂量水平之前评价安全性。为了确认对于II期选择的剂量是最小有效剂量，在该剂量的一个月安全性审查完成后，在每个给药水平下给药额外的17个受试者。在额外的17个受试者给药之前，对每个剂量组中的三个受试者给予研究中的治疗优先。假设没有发生DLT，三个受试者安全性群组和扩展群组的给药将如下执行：
1.在研究开始时，三个受试者用2x108PFU给药，并且不施用进一步治疗直到这三个受试者已完成给药后一个月。
2.一旦DSMB已审查了安全性数据并且给予推进到下一个剂量的批准，三个受试者就用2x109PFU给药。虽然2x109PFU群组的一个月随访期正在进行中，但另外的受试者将用2x108PFU治疗，直到DSMB已审查了2x109PFU群组数据。
3.一旦DSMB已给予推进的批准，三个受试者就以2x1010PFU给药用于最终群组。虽然2x1010PFU的一个月随访期正在进行中，但另外的受试者将用2x108PFU治疗，直至扩展群组被填满，然后另外的受试者将用2x109治疗，直至该群组被填满。
4.在完成三个受试者2x1010PFU群组的安全性随访期后，将招募完成对于2x108、2x109或2x1010PFU剂量水平的17受试者扩展组所需的任何剩余受试者。
在所有剂量在预防CIPN方面同样有效的情况下，添加2x107PFU的第四剂量群组，并且关于第四群组的研究执行将与前三个群组相同。
Figure BDA0001806912920000431
三个安全性受试者中的剂量递增规则：
在随后的群组中开始施用之前，在一个剂量群组中存在从给药结束的最少一个月观察期。给药将推进直到达到最大耐受剂量(MTD)或达到最高剂量。MTD定义为其中≤1/3NET-NT3治疗的受试者具有剂量限制性毒性(DLT)的最高剂量。DLT定义为可能或明确的活性NET-NT3治疗相关的2级或更高级不良事件。对于每个群组中评价以允许推进到下一个更高剂量的三个受试者，应遵循下述规则。
剂量递增至下一个更高剂量、递减至先前更低剂量、或以当前剂量的另外测试基于下述规则：
1.如果群组中3个NET-NT3治疗的受试者中的0个具有DLT，则升级到3个活跃NET-NT3受试者的下一个更高剂量群组。
2.如果3个受试者中的1个或更多个具有DLT，则以相同剂量再入选3个受试者：
a.如果给药群组中的6个NET-NT3治疗的受试者中的<2个具有DLT，则升级到下一个更高剂量；
b.如果6个NET-NT3治疗的受试者中的≥2个具有DLT，则降级到先前剂量；
3.如果降级以最低剂量水平指示，则将停止研究并且提交新的方案，以测试更低的剂量范围。
在第28天就诊之前出于除毒性外的原因退出的受试者将被替换。
等价方案
本领域技术人员将认识到，或使用不超过常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等价方案。本发明的范围并不预期限于上文说明书，而是如在下述权利要求中阐述的：
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Claims (63)

1.一种单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达ICP4，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
2.一种单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
3.一种单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
4.一种组合物，其包含：
载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达ICP4，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和
药学可接受的载体。
5.一种组合物，其包含：
载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和
药学可接受的载体。
6.一种组合物，其包含：
载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和
药学可接受的载体。
7.组合物在制造用于治疗神经病变的药剂中的用途，其中所述组合物包含载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达ICP4，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
8.组合物在制造用于治疗神经病变的药剂中的用途，其中所述组合物包含载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和
药学可接受的载体。
9.组合物在制造用于治疗神经病变的药剂中的用途，其中所述组合物包含载体，所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子；和
药学可接受的载体。
10.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中所述载体还包含与编码神经营养因子3的序列可操作地连接的启动子。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述载体还包含在所述启动子上游的增强子。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述启动子是组织特异性的。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述启动子是组织特异性的。
14.根据权利要求10所述的组合物，其中所述启动子是神经元特异性的。
15.根据权利要求11所述的组合物，其中所述启动子是神经元特异性的。
16.根据权利要求10所述的组合物，其中所述启动子是人巨细胞病毒(HCMV)启动子。
17.根据权利要求11所述的组合物，其中所述启动子是人巨细胞病毒(HCMV)启动子。
18.根据权利要求10所述的组合物，其中所述启动子是降钙素基因相关肽(CGRP)启动子。
19.根据权利要求11所述的组合物，其中所述启动子是降钙素基因相关肽(CGRP)启动子。
20.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中所述载体包含HCMV增强子和CGRP启动子。
21.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中所述载体包含牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号。
22.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中所述载体是多元醇。
23.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中所述载体是甘油。
24.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中编码神经营养因子3多肽的核酸分子是密码子优化的。
25.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中编码神经营养因子3多肽的核酸分子与SEQ ID NO:23是90％相同的。
26.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中编码神经营养因子3多肽的核酸分子与SEQ ID NO:25是90％相同的。
27.载体在制造用于抑制受试者中的神经病变发展或进展的药剂中的用途，其中所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达ICP4，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
28.载体在制造用于抑制受试者中的神经病变发展或进展的药剂中的用途，其中所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
29.载体在制造用于抑制受试者中的神经病变发展或进展的药剂中的用途，其中所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
30.载体在制造用于治疗受试者中的神经病变的药剂中的用途，其中所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达ICP4，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
31.载体在制造用于治疗受试者中的神经病变的药剂中的用途，其中所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ IDNO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
32.载体在制造用于治疗受试者中的神经病变的药剂中的用途，其中所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ IDNO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子。
33.根据权利要求7-9和27-32中任一项所述的用途，其中所述神经病变是周围神经病变。
34.根据权利要求7-9和27-32中任一项所述的用途，其中所述神经病变是医源性的。
35.根据权利要求7-9和27-32中任一项所述的用途，其中所述神经病变是癌症治疗的结果。
36.根据权利要求7-9和27-32中任一项所述的用途，其中所述神经病变是化学疗法的结果。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述化学疗法包含基于铂的化学治疗剂。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述化学治疗剂选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、沙铂、吡铂、奈达铂、三铂、脂质体顺铂及其组合。
39.根据权利要求36所述的用途，其中所述化学疗法包含紫杉烷或紫杉烷衍生物化学治疗剂。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述化学治疗剂选自紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛及其组合。
41.根据权利要求36所述的用途，其中所述化学疗法包含植物生物碱化学治疗剂。
42.根据权利要求41所述的用途，其中所述化学治疗剂选自长春新碱、长春碱、长春瑞滨及其组合。
43.根据权利要求36所述的用途，其中所述化学疗法包含蛋白酶体抑制剂化学治疗剂。
44.根据权利要求43所述的用途，其中所述化学治疗剂是硼替佐米。
45.根据权利要求36所述的用途，其中所述化学疗法包含抗有丝分裂化学治疗剂。
46.根据权利要求45所述的用途，其中所述化学治疗剂选自一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、本妥昔单抗、格巴妥莫单抗、AGS67E及其组合。
47.根据权利要求36所述的用途，其中所述化学疗法包含艾日布林。
48.根据权利要求36所述的用途，其中所述化学疗法包含沙利度胺。
49.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述载体通过与受试者的皮肤接触来施用。
50.根据权利要求27-32中任一项所述的用途，其中所述载体通过与所述受试者的皮肤接触来施用。
51.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述载体皮内施用于受试者。
52.根据权利要求27-32中任一项所述的用途，其中所述载体皮内施用于所述受试者。
53.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述载体施用于受试者的一只或多只手。
54.根据权利要求27-32中任一项所述的用途，其中所述载体施用于所述受试者的一只或多只手。
55.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述载体施用于受试者的一只或多只脚。
56.根据权利要求27-32中任一项所述的用途，其中所述载体施用于所述受试者的一只或多只脚。
57.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述载体施用于受试者，所述受试者先前已被诊断为患有现有神经病变。
58.根据权利要求27-32中任一项所述用途，其中所述受试者先前已被诊断为患有现有神经病变。
59.根据权利要求57所述的用途，其中所述现有神经病变包括选自疼痛、麻木、刺痛感、灼热、痛觉过敏、异常性疼痛和本体感觉受损的一种或多种症状。
60.根据权利要求58所述的用途，其中所述现有神经病变包括选自疼痛、麻木、刺痛感、灼热、痛觉过敏、异常性疼痛和本体感觉受损的一种或多种症状。
61.载体在制造药剂中的用途，在用化学治疗试剂治疗患有癌症的受试者的方法中使用所述药剂，其中所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达ICP4，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子，其中施用所述载体以促进针对化学疗法诱导的神经病变的耐受性。
62.载体在制造药剂中的用途，在用化学治疗试剂治疗患有癌症的受试者的方法中使用所述药剂，其中所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:2表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子，其中施用所述载体以促进针对化学疗法诱导的神经病变的耐受性。
63.载体在制造药剂中的用途，在用化学治疗试剂治疗患有癌症的受试者的方法中使用所述药剂，其中所述载体包含单纯疱疹病毒(HSV)McKrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由SEQ ID NO:16表征的功能性蛋白质，其中所述基因组包含编码神经营养因子3多肽的核酸分子，其中施用所述载体以促进针对化学疗法诱导的神经病变的耐受性。
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