ES2924521T3 - Vectores del VHS para la administración de NT3, y tratamiento de la CIPN - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describen composiciones y métodos para tratar la neuropatía, realizaciones, se proporcionan vectores HSV que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican neurotrofinas, tales como neurotrofina 3 (NT3). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores del VHS para la administración de NT3, y tratamiento de la CIPN
ANTECEDENTES
La neuropatía periférica inducida por quimioterapia (CIPN) puede ser el resultado de que la quimioterapia dañe los nervios periféricos, y puede ser un efecto secundario incapacitante del tratamiento del cáncer.
Chattopadhyay et al., Brain, 127(4):929-939 (2004), describen el efecto protector de la transferencia del gen de la neurotrofina mediada por el virus del herpes simple en la neuropatía por cisplatino.
Chattopadhyay et al., Molecular Therapy, 12(2):307-313 (2005), describen la neuroprotección a largo plazo lograda con la transferencia al sistema nervioso periférico del gen del virus del herpes simple impulsada por un promotor asociado a la latencia.
Goss et al., Diabetes, 51 (7):2227-2232 (2002), describen la transferencia de genes del factor de crecimiento nervioso mediada por el herpes simple que protege contra la neuropatía periférica en la diabetes inducida por estreptozotocina en ratones.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS):
(a) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar ICP4, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; o (b) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 2, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; o (c) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 16, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3.
La presente invención también proporciona una composición que comprende un vector que comprende la variante según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona las composiciones, como se definen en las reivindicaciones, para uso en el tratamiento de la neuropatía.
La presente descripción abarca el hallazgo de que un producto del gen NT3 puede ser notablemente eficaz para proporcionar un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de la neuropatía periférica inducida por quimioterapia (CIPN). La CIPN a menudo sigue a la primera dosis de quimioterapia, y aumenta en gravedad a medida que continúa el tratamiento. La CIPN puede alterar la calidad de vida de los pacientes que se someten a un tratamiento de quimioterapia. Entre otras cosas, la presente descripción proporciona vectores del virus del herpes simple (VHS) de alta transducción capaces de entrar en los ganglios de la raíz dorsal (GRD) de los pacientes para prevenir, inhibir o tratar la CIPN. La presente descripción demuestra en particular que la administración de un producto del gen NT3 con un vector viral puede tratar eficazmente la CIPN. En ciertas realizaciones, el vector viral se basa en VHS, como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones, el vector viral se basa en una cepa McKrae del VHS, como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones, el vector viral basado en VHS es una variante con respecto a VHS al menos en cuanto a que ICP4 no es funcional, como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona composiciones para prevenir, inhibir, retrasar la progresión, y/o retrasar la aparición de neuropatía, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la neuropatía está provocada por agentes quimioterapéuticos. En algunas realizaciones, la descripción proporciona composiciones que permiten dosis mayores de agentes quimioterapéuticos y/o mayor frecuencia y/o mayor duración del tratamiento, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la descripción proporciona composiciones para revertir la neuropatía existente, que incluye, entre otras, la neuropatía causada por uno o más agentes quimioterapéuticos, como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar ICP4, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 2, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido neurotrofina 3.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 16, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido neurotrofina 3.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición que comprende: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar ICP4, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición que comprende: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 2, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición que comprende: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 16, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición para uso como medicamento, que comprende: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no expresa ICP4, en la que el genoma comprende un ácido nucleico molécula que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición para uso como medicamento, que comprende: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 2, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición para uso como medicamento, que comprende: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 16, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona usos de una composición en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la neuropatía, en los que la composición comprende un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar ICP4, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona usos de una composición en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la neuropatía, en los que la composición comprende un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 2, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona usos de una composición en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la neuropatía, en los que la composición comprende un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 16, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable
En algunas realizaciones, la descripción proporciona composiciones para uso en el tratamiento de la neuropatía, que comprenden: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar ICP4, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona composiciones para uso en el tratamiento de la neuropatía, que comprenden: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no expresa una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 2, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona composiciones para uso en el tratamiento de la neuropatía, que comprenden: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no expresa una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 16, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, el vector comprende además un promotor ligado operativamente a una secuencia que codifica neurotrofina 3. En algunas realizaciones, el vector comprende además un potenciador en dirección 5’ del promotor.
En algunas realizaciones, el promotor es específico de tejidos. En algunas realizaciones, el promotor es específico de neuronas. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de citomegalovirus humano (HCMV). En algunas realizaciones, el promotor es un promotor del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP).
En algunas realizaciones, el vector comprende un potenciador del HCMV y un promotor del CGRP. En algunas realizaciones, el vector comprende una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH).
En algunas realizaciones, el vehículo es un poliol. En algunas realizaciones, el vehículo es glicerol. En algunas realizaciones, el glicerol está en una concentración que oscila de alrededor de 1% a alrededor de 30%. En algunas realizaciones, la concentración de glicerol es alrededor de 5% a alrededor de 25%. En algunas realizaciones, la concentración de glicerol es alrededor de 5% a alrededor de 15%. En algunas realizaciones, la concentración de glicerol es alrededor de 10%.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3 tiene codones optimizados. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3 tiene una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3 tiene una secuencia de ácido nucleico que es al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 23.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3 tiene una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3 tiene una secuencia de ácido nucleico que es al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 25.
En algunas realizaciones, un polipéptido de neurotrofina 3 tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, un polipéptido de neurotrofina 3 tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 20.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona composiciones para uso en la inhibición del desarrollo o la progresión de la neuropatía en un sujeto, que comprende: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no expresa ICP4, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona composiciones para uso en la inhibición del desarrollo o la progresión de la neuropatía en un sujeto, que comprende: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 2, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona composiciones para uso en la inhibición del desarrollo o la progresión de la neuropatía en un sujeto, que comprende: un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 16, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la neuropatía es una neuropatía periférica. En algunas realizaciones, la neuropatía es iatrogénica. En algunas realizaciones, la neuropatía es el resultado de un tratamiento contra el cáncer. En algunas realizaciones, la neuropatía es el resultado de quimioterapia.
En algunas realizaciones, la quimioterapia comprende un agente quimioterapéutico basado en platino. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, satraplatino, picoplatino, nedaplatino, triplatino, lipoplatino, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la quimioterapia comprende un agente quimioterapéutico de taxano o derivado de taxano. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en paclitaxel, docetaxel, cabazitaxel, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico es nab-paclitaxel.
En algunas realizaciones, la quimioterapia comprende un agente quimioterapéutico de tipo alcaloide vegetal. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en vincristina, vinblastina, vinorelbina, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la quimioterapia comprende un agente quimioterapéutico inhibidor del proteasoma. En algunas realizaciones, el quimioterápico es bortezomib.
En algunas realizaciones, la quimioterapia comprende un agente quimioterapéutico antimitótico. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en monometil auristatina E (MMAE), brentuximab vedotina, glembatumumab, AGS67E, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la quimioterapia comprende eribulina.
En algunas realizaciones, la quimioterapia comprende talidomida.
En algunas realizaciones, la composición que comprende el vector, como se define en las reivindicaciones, es para administración por contacto con la piel de un sujeto. En algunas realizaciones, la composición que comprende el vector, como se define en las reivindicaciones, es para administración intradérmica. En algunas realizaciones, la composición que comprende el vector, como se define en las reivindicaciones, es para administración en una o más manos del sujeto. En algunas realizaciones, la composición que comprende el vector, como se define en las reivindicaciones, es para administración en uno o más pies del sujeto.
En algunas realizaciones, se ha diagnosticado previamente que el sujeto tiene una neuropatía existente. En algunas realizaciones, en las que la neuropatía existente comprende uno o más síntomas seleccionados de dolor, entumecimiento, hormigueo, ardor, hiperalgesia, alodinia, y propiocepción alterada.
En algunas realizaciones, la composición para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer con un agente quimioterapéutico comprende un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar ICP4, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3, en la que el vector se administra para promover la tolerancia frente a la neuropatía inducida por quimioterapia.
En algunas realizaciones, la composición para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer con un agente quimioterapéutico comprende un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 2 [secuencia del polipéptido ICP4], en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3, en la que el vector se administra para promover la tolerancia contra la neuropatía inducida por quimioterapia.
En algunas realizaciones, la composición para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer con un agente quimioterapéutico comprende un vector que comprende una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 16 [GPRRSSSSSGVAA], en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3, en la que el vector se administra para promover la tolerancia contra la neuropatía inducida por quimioterapia.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los dibujos son solo para fines ilustrativos, no para limitación.
La Figura 1 representa un gráfico ejemplar que muestra los potenciales de acción de los nervios sensoriales (SNAP) en grupos de ratones a los que se les administró paclitaxel o vehículo de control y diferentes dosis de un vector del VHS que expresa NT3 o GFP. El número de genomas y transcritos de NT3 en el ganglio de la raíz dorsal (GRD) aumentó con la dosis.
La Figura 2 representa un gráfico ejemplar que muestra los SNAP como un porcentaje de los niveles de control posteriores a la administración de paclitaxel en animales tratados con control de vehículo o un vector del VHS. La Figura 2 también muestra que un mutante ICP4 de la cepa McKrae que expresa NT3 muestra una mayor eficacia que un mutante ICP4 de la cepa KOS que expresa NT3. Ambos virus se obtuvieron con el mismo vector.
La Figura 3 representa un gráfico ejemplar que muestra los SNAP como porcentaje de los niveles de control después de la administración de paclitaxel en animales tratados con un vector del VHS que expresa NT3 o GFP.
La Figura 4 (que comprende los paneles A y B) representa gráficos ejemplares que muestran los SNAP (panel A) y la velocidad de conducción del nervio sensorial (SNCV) (panel B) como un porcentaje de los niveles de control después de la administración de paclitaxel en animales tratados con control de vehículo, un vector del VHS que expresa GFP, o un vector del VHS que expresa NT3.
La Figura 5 representa gráficos ejemplares que muestran los SNAP como un porcentaje de los niveles de control en animales tratados con control de vehículo, un vector del VHS que expresa GFP, o diferentes dosis de un vector del VHS que expresa NT3.
La Figura 6 representa un gráfico ejemplar que muestra el número total de transcritos de NT3 y el número de genomas de HSV-1 por GRD L4-L6 131 días después de la administración de un vector del VHS que expresa NT3 en animales que recibieron paclitaxel.
La Figura 7 representa un gráfico ejemplar que muestra el número total de transcritos de NT3 por genoma y el número de genomas de HSV-1 por GRD L4-L6 131 días después de la administración de un vector del VHS que expresa NT3 en animales que recibieron paclitaxel.
La Figura 8 representa un gráfico ejemplar que muestra el número total de transcritos de GFP y el número de genomas de HSV-1 por GRD L4-L6 131 días después de la administración de un vector del VHS que expresa NT3 en animales que recibieron paclitaxel.
La Figura 9 representa un gráfico ejemplar que muestra el número total de transcritos de GFP por genoma y el número de genomas de HSV-1 por GRD L4-L6 131 días después de la administración de un vector del VHS que expresa NT3 en animales que recibieron paclitaxel.
La Figura 10 representa un gráfico ejemplar que muestra el número total de transcritos de NT3 y el número de genomas de HSV-1 por GRD L4-L6 77 días después de la administración de un vector del VHS que expresa NT3 en animales que recibieron vincristina.
La Figura 11 representa un gráfico ejemplar que muestra el número total de transcritos de NT3 por genoma y el número de genomas de HSV-1 por GRD L4-L6 77 días después de la administración de un vector del VHS que expresa NT3 en animales que recibieron vincristina.
La Figura 12 representa un gráfico ejemplar que muestra el número total de transcritos de GFP y el número de genomas de HSV-1 por GRD L4-L6 77 días después de la administración de un vector del VHS que expresa NT3 en animales que recibieron vincristina.
La Figura 13 representa un gráfico ejemplar que muestra el número total de transcritos de GFP por genoma y el número de genomas de HSV-1 por GRD L4-L6 77 días después de la administración de un vector del VHS que expresa NT3 en animales que recibieron vincristina.
La Figura 14 (que comprende los paneles A y B) representa gráficos ejemplares que muestran SNAP (panel A) y SNCV (panel B) como un porcentaje de los niveles de control posteriores a la administración de oxaliplatino en animales tratados con control de vehículo, un vector del VHS que expresa GFP, o un vector del VHS que expresa NT3.
La Figura 15 representa gráficos ejemplares que muestran SNAP (panel izquierdo) y SNCV (panel derecho) como un porcentaje de los niveles de control posteriores a la administración de bortezomib en animales tratados con control de vehículo, un vector del VHS que expresa GFP, o un vector del VHS que expresa NT3.
La Figura 16 representa una secuencia nucleotídica de la cepa McKrae del VHS ejemplar (SEQ ID NO: 1) que se identifica como número de acceso JQ730035.1
La Figura 17 representa una secuencia de aminoácidos de ICP4 de la cepa McKrae del VHS ejemplar (SEQ ID NO: 2).
La Figura 18 representa una secuencia de aminoácidos de ICP22 de la cepa McKrae del VHS ejemplar (SEQ ID NO: 3).
La Figura 19 representa una secuencia de aminoácidos de ICP47 de la cepa McKrae del VHS ejemplar (SEQ ID NO: 4).
La Figura 20 representa una secuencia nucleotídica de ICP4 de la cepa McKrae del VHS ejemplar (SEQ ID NO: 5).
La Figura 21 representa una secuencia nucleotídica de ICP22 de la cepa McKrae del VHS ejemplar (SEQ ID NO: 6).
La Figura 22 representa una secuencia nucleotídica de ICP47 de la cepa McKrae del VHS ejemplar (SEQ ID NO: 7).
La Figura 23 representa una secuencia nucleotídica del potenciador del citomegalovirus humano ejemplar (SEQ ID NO: 8).
La Figura 24 representa una secuencia nucleotídica del péptido relacionado con el gen de la calcitonina ejemplar (SEQ iD NO: 9).
La Figura 25 representa una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina ejemplar (SEQ ID NO: 10).
La Figura 26 representa un gráfico ejemplar que muestra que la inyección con un vector del VHS que expresa NT3 no interfirió con el tratamiento con oxaliplatino en un modelo de ratón atímico.
La Figura 27 representa un gráfico ejemplar que muestra que la inyección con un vector del VHS que expresa NT3 no interfirió con el tratamiento con paclitaxel en un modelo de ratón atímico.
La Figura 28 representa un gráfico ejemplar que muestra que la inyección con un vector del VHS que expresa NT3 no interfirió con el tratamiento con bortezomib en un modelo de ratón atímico.
La Figura 29 representa la capacidad de un vector HSV NT3 para invertir el daño neuronal asociado con la neuropatía. Esto indica que un vector HSV NT3 puede revertir la CIPN existente.
La Figura 30 representa un gráfico ejemplar que muestra que la expresión de NT3 de un promotor de HCMV duró más que la expresión de GFP. Los datos de los transcritos de GFP y NT-3 específicos del vector, expresados en el ganglio de la raíz dorsal (GRD), se trazan a partir de cuatro estudios de CIPN en animales diferentes a los 47, 77, 131 y 165 días
La Figura 31 representa un gráfico ejemplar que muestra la expresión de NT3 con un promotor del HCMV (PGN-503) en comparación con la expresión de NT3 con un promotor quimérico de HCMV-CGRP (PGN-513). Cada uno brinda protección contra la neuropatía periférica inducida por paclitaxel.
La Figura 32 representa un gráfico ejemplar que muestra los efectos sobre los SNAP en animales inyectados con un vector del VHS que expresa NT3 o un vector del VHS que expresa GFP antes de recibir tres regímenes de dosificación de paclitaxel en comparación con el vehículo.
DEFINICIONES
En esta solicitud, a menos que se aclare lo contrario por el contexto, (i) el término “un” puede entenderse que significa “al menos uno”; (ii) el término “o” puede entenderse como “y/o”; (iii) puede entenderse que las expresiones “que comprende” y “que incluye” abarcan componentes o etapas detallados, ya sea que se presenten solos o junto con uno o más componentes o etapas adicionales; y (iv) puede entenderse que las expresiones “alrededor de” y “aproximadamente” permiten una variación estándar como entenderían los expertos en la técnica; y (v) cuando se proporcionan intervalos, se incluyen puntos finales.
Administración: Como se usa aquí, el término “administración” se refiere a la administración de una composición a un sujeto o sistema. La administración a un sujeto animal (por ejemplo, a un ser humano) puede realizarse por cualquier vía apropiada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la administración puede ser bronquial (incluyendo por instilación bronquial), bucal, entérica, interdérmica, intraarterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, dentro de un órgano específico (por ejemplo, intrahepática), mucosal, nasal, oral, rectal, subcutánea, sublingual, tópica, traqueal (incluyendo por instilación intratraqueal), transdérmica, vaginal y vítrea. En algunas realizaciones, la administración puede implicar una dosificación intermitente. En algunas realizaciones, la administración puede implicar una dosificación continua (por ejemplo, perfusión) durante al menos un período de tiempo seleccionado.
Agente: Como se usa aquí, el término “agente” se refiere a un compuesto o entidad de cualquier clase química, que incluye, por ejemplo, polipéptidos, ácidos nucleicos, sacáridos, lípidos, moléculas pequeñas, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un agente es o comprende un producto natural que se encuentra y/o se obtiene de la naturaleza. En algunas realizaciones, un agente es o comprende una o más entidades creadas por el hombre en el sentido de que está diseñado, modificado por ingeniería y/o producido mediante la acción de la mano del hombre y/o no se encuentra en la naturaleza. Algunas realizaciones particulares de agentes que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen moléculas pequeñas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, aptámeros, ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNpi, ARNhc, híbridos de ADN/ARN, oligonucleótidos antisentido, ribozimas), péptidos, miméticos de péptidos, etc.
Mejoría: Como se usa aquí, el término “mejoría” se refiere a la prevención, reducción o paliación de un estado, o mejora del estado de un sujeto. La mejoría incluye, pero no requiere, la recuperación completa o la prevención completa de una enfermedad, trastorno o afección.
Animal: Como se usa aquí, el término “animal” se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, “animal” se refiere a seres humanos, de cualquier sexo y en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, “animal” se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado, un primate, y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos, y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, un animal modificado genéticamente, y/o un clon.
Aproximadamente: Como se usa aquí, el término “aproximadamente” o “alrededor de”, aplicado a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el término “aproximadamente” o “alrededor de” se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor indicado de referencia, a menos que se indique lo contrario o sea evidente del contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).
Secuencia característica: Como se usa aquí, la expresión “secuencia característica” se refiere a una secuencia que se encuentra en todos los miembros de una familia de polipéptidos o ácidos nucleicos, y por lo tanto los expertos en la técnica pueden usarla para definir los miembros de la familia.
Terapia de combinación: Como se usa aquí, la expresión ‘terapia de combinación” se refiere a aquellas situaciones en las que un sujeto se expone simultáneamente a dos o más regímenes terapéuticos (por ejemplo, dos o más agentes terapéuticos). En algunas realizaciones, se pueden administrar dos o más agentes simultáneamente; en algunas realizaciones, tales agentes pueden administrarse secuencialmente; en algunas realizaciones, tales agentes se administran en regímenes de dosificación superpuestos.
Composición: Como se usa aquí, el término “composición” o “composición farmacéutica” se refiere a la combinación de dos o más agentes como se describe aquí para la coadministración o administración como parte del mismo régimen. No se requiere en todas las realizaciones que la combinación de agentes dé como resultado una mezcla física, es decir, es posible la administración como coagentes separados de cada uno de los componentes de la composición; sin embargo, muchos pacientes o profesionales en el campo pueden encontrar ventajoso preparar una composición que sea una mezcla de dos o más de los ingredientes en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, haciendo posible administrar los ingredientes componentes de la combinación en al mismo tiempo.
Modificado por ingeniería genética: Como se usa aquí, la expresión “modificado por ingeniería genética” se refiere al aspecto de haber sido manipulado por la mano del hombre. Por ejemplo, se considera que un polinucleótido está “modificado por ingeniería genética” cuando dos o más secuencias, que no están unidas entre sí en ese orden en la naturaleza, son manipuladas por la mano del hombre para unirlas directamente entre sí en el polinucleótido modificado por ingeniería genética. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente descripción, un polinucleótido modificado por ingeniería genética comprende una secuencia reguladora que se encuentra en la naturaleza en asociación operativa con una primera secuencia codificante pero no en asociación operativa con una segunda secuencia codificante, está unida por la mano del hombre de manera que está asociada operativamente con la segunda secuencia codificante. De manera similar, se considera que una célula u organismo está “modificado por ingeniería genética” si ha sido manipulado de modo que se altere su información genética (por ejemplo, se ha introducido material genético nuevo que no estaba presente previamente, por ejemplo por transformación, apareamiento, hibridación somática, transfección, transducción, u otro mecanismo, o el material genético previamente presente se altera o elimina, por ejemplo por mutación de sustitución o supresión, o por protocolos de apareamiento). Como es una práctica común y es entendido por los expertos en la técnica, la progenie de un polinucleótido o célula modificada por ingeniería genética todavía se denomina típicamente “modificada por ingeniería genética”, aunque la manipulación real se haya realizado en una entidad anterior.
Expresión: Como se usa aquí, “expresión” de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de un molde de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, por transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de ARN (por ejemplo, mediante corte y empalme, edición, formación de caperuza en 5’ y/o formación de extremo 3’); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o proteína; y/o (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.
Homología: Como se usa aquí, el término “homología” se refiere a la relación global entre moléculas poliméricas, por ejemplo entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. En algunas realizaciones, se considera que las moléculas poliméricas son “homólogas” entre sí si sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idénticas. En algunas realizaciones, se considera que las moléculas poliméricas son “homólogas” entre sí si sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% similares.
Inhibir: Como se usa aquí, el término “inhibir” o “que inhibe” se refiere a ralentizar, detener, reducir o retrasar el inicio. En algunas realizaciones, inhibir la neuropatía comprende ralentizar la progresión de la patología o los síntomas. En algunas realizaciones, inhibir la neuropatía comprende reducir la gravedad del daño tisular y/o los síntomas neurológicos asociados. En algunas realizaciones, inhibir la neuropatía comprende retrasar la aparición del daño tisular y/o los síntomas neurológicos asociados.
Aislada: Como se usa aquí, el término “aislada” se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido (1) separada de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) diseñada, producida, preparada y/o fabricada por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de alrededor del 10%, alrededor del 20%, alrededor del 30%, alrededor del 40%, alrededor del 50%, alrededor del 60%, alrededor del 70%, alrededor del 80%, alrededor del 90%, alrededor del 91%, alrededor del 92%, alrededor del 93%, alrededor del 94%, alrededor del 95%, alrededor del 96%, alrededor del 97%, alrededor del 98%, alrededor del 99%, o más de alrededor del 99% de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son alrededor del 80%, alrededor del 85%, alrededor del 90%, alrededor del 91%, alrededor del 92%, alrededor del 93%, alrededor del 94%, alrededor del 95%, alrededor del 96%, alrededor del 97%, alrededor del 98%, alrededor del 99%, o más de alrededor del 99% puros. Como se usa aquí, una sustancia es “pura” si está sustancialmente libre de otros componentes. En algunas realizaciones, como entenderán los expertos en la técnica, una sustancia aún puede considerarse “aislada”, o incluso “pura”, después de haberse combinado con otros componentes determinados, tales como, por ejemplo, uno o más vehículos o excipientes (por ejemplo, amortiguador, disolvente, agua, etc.); en tales realizaciones, el porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir dichos vehículos o excipientes. Para dar solo un ejemplo, en algunas realizaciones, un polímero biológico, tal como un polipéptido o polinucleótido que aparece en la naturaleza, se considera “aislado” cuando a) en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociado con algunos o todos de los componentes que lo acompañan en su estado nativo en la naturaleza; b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie de la especie que lo produce en la naturaleza; c) se expresa o se asocia de otro modo con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no sea de la especie que lo produce en la naturaleza. Así, por ejemplo, en algunas realizaciones, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del que lo produce en la naturaleza se considera un polipéptido “aislado”. Como alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación puede considerarse un polipéptido “aislado” en la medida en que se haya separado de otros componentes a) con los que está asociado en la naturaleza; y/o b) con el que estaba asociado cuando se produjo inicialmente.
Elemento marcador: Como se usa aquí, la expresión “elemento marcador” se refiere a un agente detectable o seleccionable. En algunas realizaciones, un “elemento marcador” es una secuencia de ácido nucleico detectable o seleccionable. En algunas realizaciones, un “elemento marcador” es un producto de expresión (por ejemplo, ARN o proteína) cuya presencia o ausencia es detectable y/o seleccionable en las células. En algunas realizaciones, un producto de expresión es o comprende una enzima. En algunas realizaciones, un producto de expresión es un fluoróforo.
Ácido nucleico: Como se usa aquí, la expresión “ácido nucleico” se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena oligonucleotídica. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o una sustancia que se incorpora o se puede incorporar en una cadena oligonucleotídica a través de un enlace de fosfodiéster. Como quedará claro por el contexto, en algunas realizaciones, “ácido nucleico” se refiere a restos de ácidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos); en algunas realizaciones, “ácido nucleico” se refiere a una cadena oligonucleotídica que comprende restos de ácidos nucleicos individuales. En algunas realizaciones, un “ácido nucleico” es o comprende ARN; en algunas realizaciones, un “ácido nucleico” es o comprende ADN. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es, comprende o consiste en uno o más restos de ácidos nucleicos naturales. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es, comprende o consiste en uno o más análogos de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, un análogo de ácido nucleico difiere de un ácido nucleico en que no utiliza un esqueleto de fosfodiéster. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un ácido nucleico es, comprende o consiste en uno o más “ácidos nucleicos peptídicos”, que son conocidos en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces de fosfodiéster en el esqueleto, se consideran dentro del alcance de la presente descripción. Como alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, un ácido nucleico tiene uno o más enlaces fosforotioato y/o 5’-N-fosforamidito, en lugar de enlaces de fosfodiéster. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es, comprende o consiste en uno o más nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, y desoxicitidina). En algunas realizaciones, un ácido nucleico es, comprende o consiste en uno o más análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodoruridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, 0(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas, y combinaciones de los mismos). En algunas realizaciones, un ácido nucleico comprende uno o más azúcares modificados (por ejemplo, 2’-fluororibosa, ribosa, 2’-desoxirribosa, arabinosa y hexosa) en comparación con los de los ácidos nucleicos naturales. En algunas realizaciones, un ácido nucleico tiene una secuencia nucleotídica que codifica un producto génico funcional, tal como un ARN o una proteína. En algunas realizaciones, un ácido nucleico incluye uno o más intrones. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se preparan mediante uno o más de: aislamiento de una fuente natural, síntesis enzimática por polimerización basada en un molde complementario (in vivo o in vitro), reproducción en una célula o sistema recombinante, y síntesis química. En algunas realizaciones, un ácido nucleico tiene al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más restos de longitud. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es monocatenario; en algunas realizaciones, un ácido nucleico es bicatenario. En algunas realizaciones, un ácido nucleico tiene una secuencia nucleotídica que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido. En algunas realizaciones, un ácido nucleico tiene actividad enzimática.
Paciente: Como se usa aquí, el término “paciente” se refiere a cualquier organismo al que se administra o se puede administrar una composición proporcionada, por ejemplo con fines experimentales, de diagnóstico, profilácticos, cosméticos, y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos, y/o seres humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un ser humano. En algunas realizaciones, un paciente sufre o es susceptible a uno o más trastornos o afecciones. En algunas realizaciones, un paciente muestra uno o más síntomas de un trastorno o afección. En algunas realizaciones, a un paciente se le ha diagnosticado uno o más trastornos o afecciones. En algunas realizaciones, el paciente está recibiendo o ha recibido cierta terapia para diagnosticar y/o tratar una enfermedad, trastorno o afección.
Composición farmacéutica: Como se usa aquí, la expresión “composición farmacéutica” se refiere a un agente activo, formulado junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, el agente activo está presente en una cantidad de dosis unitaria apropiada para la administración en un régimen terapéutico que muestra una probabilidad estadísticamente significativa de lograr un efecto terapéutico predeterminado cuando se administra a una población relevante. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden formularse especialmente para la administración en forma sólida o líquida, incluyendo las adaptadas para lo siguiente: administración oral, por ejemplo empapados (disoluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), comprimidos, por ejemplo aquellos destinados a absorción bucal, sublingual y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicar en la lengua; administración parenteral, por ejemplo mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural, tal como, por ejemplo, una disolución o suspensión estéril, o una formulación de liberación sostenida; aplicación tópica, por ejemplo como una crema, ungüento o parche de liberación controlada o pulverización aplicada a la piel, los pulmones o la cavidad bucal; por vía intravaginal o intrarrectal, por ejemplo como un pesario, crema o espuma; sublingualmente; ocularmente; transdérmicamente; o nasalmente, pulmonarmente, y a otras superficies mucosas.
Farmacéuticamente aceptable: Como se usa aquí, la expresión “farmacéuticamente aceptable”, aplicado al vehículo, diluyente o excipiente usado para formular una composición como se describe aquí, significa que el vehículo, diluyente o excipiente debe ser compatible con los demás ingredientes de la composición, y no perjudicial para el destinatario del mismo.
Vehículo farmacéuticamente aceptable: Como se usa aquí, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” significa un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, un diluyente, un excipiente o un material de encapsulación de disolvente, involucrado en el transporte del compuesto en cuestión desde un órgano, o parte del cuerpo, a otro órgano, o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; disolución salina isotónica; disolución de Ringer; alcohol etílico; disoluciones amortiguadas de pH; poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Prevenir o prevención: Como se usan aquí, los términos “prevenir” o “prevención”, cuando se usan con respecto a la aparición de una enfermedad, trastorno y/o afección, se refieren a reducir el riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección, y/o a retrasar el inicio de una o más características o síntomas de la enfermedad, trastorno o afección. La prevención puede considerarse completa cuando la aparición de una enfermedad, trastorno o afección se ha retrasado durante un período de tiempo predefinido.
Sujeto: Como se usa aquí, el término “sujeto” se refiere a un mamífero (por ejemplo, un ser humano, que en algunas realizaciones incluye formas humanas prenatales). En algunas realizaciones, un sujeto sufre una enfermedad, trastorno o afección relevante. En algunas realizaciones, un sujeto es susceptible a una enfermedad, trastorno o afección. En algunas realizaciones, un sujeto muestra uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno o afección. En algunas realizaciones, un sujeto no muestra ningún síntoma o característica de una enfermedad, trastorno o condición. En algunas realizaciones, un sujeto es alguien con una o más características de susceptibilidad o riesgo de una enfermedad, trastorno o afección. En algunas realizaciones, un sujeto es un paciente. En algunas realizaciones, un sujeto es un individuo al que se le administra y/o se le ha administrado un diagnóstico y/o una terapia.
Tratamiento: Como se usa aquí, el término “tratamiento” (también “tratar” o “tratando”) se refiere a cualquier administración de una sustancia que, parcial o completamente, alivia, mejora, mitiga, inhibe, retrasa la aparición de, reduce la gravedad de, y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas, características y/o causas de una enfermedad, trastorno y/o afección en particular (por ejemplo, neuropatía). Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no presenta signos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante, y/o de un sujeto que presenta solo signos tempranos de la enfermedad, trastorno y/o afección. Como alternativa o adicionalmente, tal tratamiento puede ser de un sujeto que presenta uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser de un sujeto al que se le ha diagnosticado que padece la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser de un sujeto que se sabe que tiene uno o más factores de susceptibilidad que están estadísticamente correlacionados con un mayor riesgo de desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante.
Vector: Como se usa aquí, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales a un genoma viral o a una porción del mismo. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedante en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano, vectores episomales de mamíferos, vectores del virus del herpes simple (VHS)). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedante tras la introducción en la célula hospedante, y por lo tanto se replican junto con el genoma hospedante. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente. Dichos vectores se denominan aquí como "vectores de expresión".
Pueden usarse técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante, o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe aquí. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En las siguientes secciones se describen en detalle diversos aspectos de la invención. El uso de secciones no pretende limitar la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o”, a menos que se indique lo contrario o quede claro por el contexto que es disyuntivo.
La presente descripción proporciona, entre otros, composiciones que comprenden vectores del VHS. En particular, la presente descripción se refiere a vectores de la cepa McKrae del VHS para la administración de NT3 a un sujeto que padece o es susceptible de neuropatía.
Neuropatía periférica inducida por quimioterapia (CIPN)
La neuropatía periférica resulta del daño a los nervios periféricos, que a menudo causa debilidad, entumecimiento y dolor, generalmente en las manos y los pies, aunque también puede afectar otras áreas del cuerpo. Las neuronas periféricas envían información desde el sistema nervioso central al resto del cuerpo (y viceversa). La neuropatía periférica puede resultar de lesiones traumáticas, diabetes mellitus, medicamentos, infecciones, problemas metabólicos, causas hereditarias, y exposición a toxinas. La neuropatía periférica causada por los medicamentos de quimioterapia es uno de los efectos secundarios más comunes de la quimioterapia, y puede ser discapacitante. Los síntomas más comunes de la CIPN son dolor (que puede estar presente en todo momento, o puede aparecer y desaparecer, tal como un dolor punzante o agudo), una sensación de ardor, hormigueo (sensación de “alfileres y agujas” o dolor eléctrico/similar a una descarga), pérdida de sensibilidad (que puede ser entumecimiento o disminución de la capacidad de sentir la presión, el tacto, el calor o el frío), dificultad para usar los dedos para levantar o sostener objetos/dejar caer objetos, problemas de equilibrio, problemas de tropiezo o titubeo al caminar, aumento de la sensibilidad al frío o al calor, aumento de la sensibilidad al tacto o la presión, encogimiento de los músculos, debilidad muscular, dificultad para tragar, estreñimiento, dificultad para orinar, cambios en la tensión arterial, y disminución o ausencia de reflejos.
Cuando los medicamentos de quimioterapia se administran de forma sistémica, generalmente se propagan por todo el cuerpo, y ciertos tipos pueden dañar diferentes nervios. Los síntomas de la CIPN tienden a comenzar más lejos de la cabeza y se acercan con el tiempo. En la mayoría de los casos, los síntomas de la CIPN comienzan en los pies, y después se notan en las manos. Los síntomas pueden comenzar en los dedos de los pies y luego pasar a los pies, los tobillos y las piernas, o pueden comenzar en los dedos de las manos y pasar a las manos, las muñecas y los brazos. La CIPN puede comenzar en cualquier momento después de que comience el tratamiento de quimioterapia, y los síntomas a menudo aumentan en gravedad a medida que continúan los tratamientos.
Agentes quimioterapéuticos particulares que están vinculados a CIPN. Estos agentes incluyen: taxanos (por ejemplo, paclitaxel), compuestos de platino (por ejemplo, oxaliplatino), inhibidores del proteosoma (por ejemplo, bortezomib), alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina), talidomida, lenalidomida, epotilonas, agentes antimitóticos (por ejemplo, eribulina, monometil auristatina E), conjugados de anticuerpos con fármacos (por ejemplo, vedotina), y otros. La CIPN puede aparecer durante un período corto, o puede aparecer durante un largo período de tiempo. Los factores que influyen en la duración de los síntomas de la CIPN incluyen: la edad, la presencia de otras afecciones médicas que causan neuropatía (por ejemplo, diabetes o infección por VIH), medicamentos recetados, antecedentes familiares de neuropatía, el agente quimioterapéutico o la combinación de agentes quimioterapéuticas usados (incluyendo los usados en el pasado), la dosis de agente quimioterapéutico, la frecuencia de dosificación del agente o agentes quimioterapéuticos, y la cantidad total del agente o agentes quimioterapéuticos administrados a lo largo del tiempo.
Diferentes agentes quimioterapéuticos afectan diferentes componentes del sistema nervioso, desde el nivel de los cuerpos celulares sensoriales en el ganglio de la raíz dorsal (GRD) hasta el axón distal. El GRD es una diana destacada, ya que está menos protegido por la barrera hemato-nerviosa, y es más vulnerable al daño neurotóxico. La interrupción de la dinámica de los microtúbulos es otro mecanismo común de neurotoxicidad. Los microtúbulos son fundamentales para los procesos de transporte axonal, y son críticos para el suministro de energía y material. Además de la deficiencia de energía, los agentes quimioterapéuticos pueden dañar la vasculatura periférica. Otra diana de la neurotoxicidad puede incluir la toxicidad axonal directa en las terminales distales.
Los tratamientos que se han utilizado para la CIPN incluyen vitamina E, calcio y magnesio, medicamentos anticonvulsivos (tal como carbamazepina (Tegretol)), antidepresivos (tales como venlafaxina (Effexor)) y glutationa. El éxito de estos tratamientos ha sido inconsistente.
El diagnóstico de la CIPN también se puede determinar mediante los potenciales de acción de los nervios sensoriales (SNAP) (véase Velasco y Bruna et al. (2013) Neurol Neurosurg Psychiatry doi: 10.1136/jnnp-2013-305334). Un mayor número de síntomas neuropáticos agudos, y la disminución de la amplitud del potencial de acción del nervio sensorial (por ejemplo, de los nervios sural dorsal y radial) a la mitad del tratamiento, se asocian con un riesgo de desarrollar una neuropatía inducida por quimioterapia más grave.
Agentes quimioterapéuticos
Como se mencionó anteriormente, ciertos agentes quimioterapéuticos se asocian con CIPN con mayor frecuencia que otros. Estos agentes incluyen: taxanos (por ejemplo, paclitaxel), compuestos de platino (por ejemplo, oxaliplatino), bortezomib, alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina), talidomida, lenalidomida, epotilonas, conjugados de anticuerpos con fármacos (por ejemplo, MMAE-MAB), y otros.
Cisplatino
El cisplatino es un agente quimioterapéutico que se clasifica como un agente alquilante. El cisplatino produce reticulación de aductos intercatenarios, intracatenarios y monofuncionales en el ADN, siendo la forma más frecuente una reticulación d(GpG) y d(ApG) intracatenaria 1,2. La polineuropatía sensorial ocurre con alta frecuencia después de la exposición a cantidades de cisplatino tan bajas como 200 mg/m2. Dosis acumulativas de cisplatino mayores que 300 mg/m2 dan lugar uniformemente a una neuropatía sensorial grave, limitando así la dosis terapéutica máxima posible. Los modelos de roedores del tratamiento con cisplatino recapitulan fielmente aspectos de la enfermedad humana.
El cisplatino se puede usar para tratar el cáncer de testículo, ovario, vejiga, cabeza y cuello, esófago, pulmón de células pequeñas y no pequeñas, mama, cuello uterino, estómago y próstata. El cisplatino también se puede usar para tratar linfomas de Hodgkin y no de Hodgkin, neuroblastoma, sarcomas, mieloma múltiple, melanoma y mesotelioma. El cisplatino se puede administrar por vía intravenosa. La dosis habitual de inyección de cisplatino para el tratamiento del cáncer de testículo en combinación con otros agentes quimioterapéuticos aprobados es 20 mg/m2 por vía intravenosa (i.v.) diariamente durante 5 días por ciclo. Como agente único, la inyección habitual de cisplatino para el tratamiento de tumores ováricos metastásicos es una dosis de 100 mg/m2 IV por ciclo una vez cada cuatro semanas. La dosis habitual de inyección de cisplatino para el tratamiento del cáncer de ovario metastásico en combinación con ciclofosfamida es 75 a 100 mg/m2 (i.v.) por ciclo una vez cada cuatro semanas. Como agente único, la inyección habitual de cisplatino para el tratamiento del cáncer de vejiga avanzado es una dosis de 50 a 70 mg/m2 (i.v.) por ciclo una vez cada tres o cuatro semanas, dependiendo del grado de exposición previa a la radioterapia y/o quimioterapia previa. Para pacientes muy pretratados, se recomienda una dosis inicial de 50 mg/m2 por ciclo, repetida cada cuatro semanas. El compuesto inorgánico cis-diaminodicloroplatino (II), comúnmente conocido como cisplatino o cis-DDP, se usa comúnmente en el tratamiento del cáncer.
Oxaliplatino
El oxaliplatino es un agente quimioterapéutico que se clasifica como un agente alquilante. El oxaliplatino se puede usar para tratar el cáncer de colon o recto que se ha metastatizado, y a menudo se administra con otros agentes quimioterapéuticos. El oxaliplatino se puede administrar por vía intravenosa.
La administración recomendada de oxaliplatino es en combinación con 5-fluorouracilo/leucovorina cada 2 semanas. Para la enfermedad avanzada, se recomienda el tratamiento hasta la progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable. Para uso adyuvante, se recomienda un tratamiento de un total de 6 meses (12 ciclos). En el régimen recomendado, el Día 1 de tratamiento implica la administración de infusión intravenosa de oxaliplatino 85 mg/m2 en 250 a 500 ml inyección de dextrosa al 5%, e infusión intravenosa de leucovorina 200 mg/m2 en inyección de dextrosa al 5%, ambas administradas durante 120 minutos al mismo tiempo en bolsas separadas mediante una vía en Y, seguido de bolo intravenoso de 5-fluorouracilo 400 mg/m2 administrado durante 2 a 4 minutos, seguido de infusión intravenosa de 5-fluorouracilo 600 mg/m2 en inyección de dextrosa al 5% de 500 ml (recomendado) como una infusión continua de 22 horas. El Día 2 de tratamiento implica la administración de infusión intravenosa de leucovorina 200 mg/m2 durante 120 minutos, seguido de bolo intravenoso de 5-fluorouracilo 400 mg/m2 administrado durante 2 a 4 minutos, seguido de infusión intravenosa de 5-fluorouracilo 600 mg/m2 en inyección de dextrosa al 5% de 500 ml (recomendado) como una infusión continua de 22 horas.
Cuando se usa como terapia adyuvante en pacientes con cáncer de colon en estadio III, se recomienda considerar una reducción de la dosis de oxaliplatino a 75 mg/m2 en pacientes que experimenten eventos neurosensoriales de Grado 2. Cuando se usa en pacientes con cáncer de colon avanzado, se recomienda considerar una reducción de la dosis de oxaliplatino a 65 mg/m2 en pacientes que experimenten eventos neurosensoriales de Grado 2. Para pacientes con eventos neurosensoriales persistentes de Grado 3, normalmente se recomienda considerar la interrupción del tratamiento.
Paclitaxel
Paclitaxel es un agente quimioterapéutico que se clasifica como un alcaloide vegetal, un taxano y un agente antimicrotubular. El paclitaxel se puede usar para tratar el cáncer de mama, ovario, pulmón, vejiga, próstata, melanoma, esófago, y otros tipos de cánceres de tumores sólidos. También se ha usado en el sarcoma de Kaposi. Paclitaxel se puede administrar por vía intravenosa.
Paclitaxel es un agente antimicrotúbulos que promueve el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabiliza los microtúbulos evitando la despolimerización. Esta estabilidad da como resultado la inhibición de la reorganización dinámica normal de la red de microtúbulos, que es esencial para la interfase vital y las funciones celulares mitóticas. Además, el paclitaxel induce conjuntos anormales o “haces” de microtúbulos a lo largo del ciclo celular, y múltiples ásteres de microtúbulos durante la mitosis.
Para pacientes con carcinoma de ovario, se han recomendado los siguientes regímenes. Para pacientes con carcinoma de ovario que no hayan recibido tratamiento previo, se puede administrar uno de los siguientes regímenes recomendados cada 3 semanas. Al seleccionar el régimen apropiado, se deben considerar las diferencias en las toxicidades. Un régimen recomendado es paclitaxel administrado por vía intravenosa durante 3 horas a una dosis de 175 mg/m2, seguido de cisplatino a una dosis de 75 mg/m2. Otro régimen recomendado es paclitaxel administrado por vía intravenosa durante 24 horas a una dosis de 135 mg/m2, seguido de cisplatino a una dosis de 75 mg/m2. En pacientes previamente tratadas con quimioterapia por carcinoma de ovario, se ha usado paclitaxel en varias dosis y esquemas; sin embargo, aún no está claro cuál es el régimen óptimo. Otro régimen recomendado es paclitaxel 135 mg/m2 o 175 mg/m2, administrado por vía intravenosa durante 3 horas cada 3 semanas.
Para pacientes con carcinoma de mama, se han recomendado los siguientes regímenes. Para el tratamiento adyuvante del cáncer de mama con ganglios positivos, la pauta recomendada es paclitaxel, a una dosis de 175 mg/m2 por vía intravenosa durante 3 horas cada 3 semanas durante 4 cursos administrados secuencialmente a la quimioterapia combinada que contiene doxorrubicina. Después del fracaso de la quimioterapia inicial para la enfermedad metastásica o la recidiva dentro de los 6 meses de la quimioterapia adyuvante, se ha dado a conocer que es eficaz paclitaxel a una dosis de 175 mg/m2, administrado intravenosamente durante 3 horas cada 3 semanas. Otro régimen recomendado es 75 mg/mg2 cada semana durante 12 semanas como parte de adriamicina, ciclofosfamida, y un taxano.
Para pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas, el régimen recomendado, administrado cada 3 semanas, es paclitaxel administrado por vía intravenosa durante 24 horas a una dosis de 135 mg/m2, seguido de cisplatino, 75 mg/m2.
Para pacientes con sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA, el régimen recomendado es paclitaxel administrado a una dosis de 135 mg/m2 administrada por vía intravenosa durante 3 horas cada 3 semanas, o a una dosis de 100 mg/m2 administrads por vía intravenosa durante 3 horas cada 2 semanas (intensidad de dosis de 45 a 50 mg/m2/semana).
Bortezomib
Bortezomib es un agente quimioterapéutico que se clasifica como un inhibidor del proteasoma. Bortezomib se puede usar para tratar el mieloma múltiple y el linfoma de células del manto en pacientes que han recibido al menos un tratamiento previo. Paclitaxel se puede administrar por vía intravenosa o como una inyección subcutánea en el muslo o el abdomen.
La dosis inicial recomendada de bortezomib es 1,3 mg/m2, y puede administrarse por vía intravenosa a una concentración de 1 mg/ml o por vía subcutánea a una concentración de 2,5 mg/ml. Se puede considerar el retratamiento con bortezomib para pacientes con mieloma múltiple que hayan respondido previamente al tratamiento con bortezomib y que hayan recaído al menos 6 meses después de completar el tratamiento previo con bortezomib. El tratamiento puede iniciarse con la última dosis tolerada. Cuando se administra por vía intravenosa, bortezomib se administra como una inyección intravenosa en bolo de 3 a 5 segundos.
En pacientes con mieloma múltiple sin tratamiento previo, bortezomib se administra en combinación con melfalán oral y prednisona oral durante nueve ciclos de tratamiento de 6 semanas. En los ciclos 1-4, bortezomib se administra dos veces por semana (días 1,4, 8, 11,22, 25, 29 y 32). En los ciclos 5-9, bortezomib se administra una vez por semana (días 1, 8, 22 y 29). Por lo general, se recomienda que transcurran al menos 72 horas entre dosis consecutivas de bortezomib.
En pacientes con linfoma de células del manto no tratados previamente, bortezomib (1,3 mg/m2) puede administrarse por vía intravenosa en combinación con rituximab intravenoso, ciclofosfamida, doxorrubicina y prednisona oral (VcR-CAP) durante seis ciclos de tratamiento de 3 semanas. Primero se administra bortezomib, seguido de rituximab. Bortezomib se administra dos veces por semana durante dos semanas (Días 1,4, 8 y 11), seguido de un período de descanso de 10 días en los Días 12-21. Para pacientes con una respuesta documentada por primera vez en el ciclo 6, se recomiendan dos ciclos adicionales de VcR-CAP.
En pacientes con mieloma múltiple recidivante o linfoma de células del manto recidivante, bortezomib (1,3 mg/m2/dosis) se administra dos veces por semana durante 2 semanas (Días 1,4, 8 y 11), seguido de un período de descanso de 10 días (Días 12-21). Para la terapia extendida de más de 8 ciclos, bortezomib se puede administrar según el programa estándar o, para el mieloma múltiple recidivante, en un programa de mantenimiento de una vez por semana durante 4 semanas (Días 1, 8, 15 y 22), seguido de un periodo de descanso de 13 días (Días 23 a 35). Los pacientes con mieloma múltiple que hayan respondido previamente al tratamiento con bortezomib (ya sea solo o en combinación) y que hayan recaído al menos 6 meses después de su tratamiento previo con bortezomib pueden comenzar con bortezomib en la última dosis tolerada. A los pacientes vueltos a tratar se les administra bortezomib dos veces por semana (Días 1,4, 8 y 11) cada tres semanas durante un máximo de 8 ciclos. Deben transcurrir al menos 72 horas entre dosis consecutivas de bortezomib. Bortezomib puede administrarse como agente único o en combinación con dexametasona.
Se puede considerar el inicio de bortezomib por vía subcutánea para pacientes con neuropatía periférica preexistente o con alto riesgo de neuropatía periférica. Los pacientes con neuropatía grave preexistente deben ser tratados con bortezomib solo después de una cuidadosa evaluación de la relación riesgo-beneficio. Los pacientes que experimentan una neuropatía periférica nueva o que empeora durante el tratamiento con bortezomib pueden necesitar una disminución de la dosis y/o un programa de dosis menos intenso. Las pautas actuales de modificación de dosis o programa para pacientes que experimentan dolor neuropático y/o neuropatía periférica relacionados con bortezomib son las siguientes. Para pacientes con signos y síntomas de Grado 1 de CIPN (con dolor) o para pacientes con síntomas de Grado 2 (síntomas moderados; que limitan las actividades instrumentales de la vida diaria (tales como preparar comidas, comprar comestibles o ropa, usar el teléfono, administrar el dinero, etc.)), las guías recomiendan que bortezomib se reduzca a 1 mg/m2. Para pacientes con síntomas de Grado 2 (con dolor) o Grado 3 (síntomas graves; que limitan las actividades cotidianas de cuidado personal (tales como bañarse, vestirse y desvestirse, alimentarse por sí mismo, ir al baño, tomar medicamentos, y no estar postrado en cama)), las guías recomiendan suspender el tratamiento con bortezomib hasta que se resuelva la toxicidad, y cuando se reinicie el tratamiento, tratar con una dosis reducida de bortezomib a 0,7 mg/m2 una vez por semana. Para pacientes con síntomas de Grado 4 (consecuencias potencialmente mortales; intervención urgente indicada), las guías recomiendan suspender el tratamiento con bortezomib.
Vincristina
La vincristina es un agente quimioterapéutico que se clasifica como un alcaloide vegetal. La vincristina se puede usar para tratar la leucemia aguda, el linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin, el neuroblastoma, el rabdomiosarcoma, el sarcoma de Ewing, el tumor de Wilms, el mieloma múltiple, la leucemia crónica, el cáncer de tiroides y los tumores cerebrales. Paclitaxel se puede administrar por vía intravenosa. El mecanismo de acción de la vincristina se ha relacionado con la inhibición de la formación de microtúbulos en los usos mitóticos, lo que da como resultado una detención de las células en división en la etapa de metafase.
La dosis habitual de vincristina para pacientes pediátricos es 1,5 a 2 mg/m2. Para pacientes pediátricos que pesen 10 kg o menos, la dosis inicial suele ser 0,05 mg/kg, administrada una vez a la semana. La dosis habitual de vincristina para adultos es 1,4 mg/m2. Se recomienda una reducción del 50% en la dosis de vincristina para pacientes que tienen un valor de bilirrubina sérica directa mayor que 3 mg/100 ml. El fármaco generalmente se administra por vía intravenosa a intervalos semanales.
Talidomida
La talidomida es un agente quimioterapéutico que se clasifica como agente inmunomodulador y agente antiangiogénico. La talidomida se puede usar para tratar el mieloma múltiple recién diagnosticado, y está bajo investigación para su uso en el tratamiento del carcinoma de células renales, el glioblastoma multiforme y la macroglobulinemia de Waldenstrom. La talidomida se puede administrar por vía oral.
La dosis habitual de talidomida para el tratamiento del mieloma múltiple se administra en combinación con dexametasona en ciclos de tratamiento de 28 días. La dosis de talidomida es 200 mg administrada por vía oral una vez al día con agua, preferiblemente a la hora de acostarse, y al menos 1 hora después de la cena. La dosis de dexametasona es 40 mg diarios por vía oral los días 1-4, 9-12 y 17-20 cada 28 días. Los pacientes que desarrollan reacciones adversas como estreñimiento, somnolencia o neuropatía periférica pueden beneficiarse ya sea descontinuando temporalmente el fármaco o continuando con una dosis más baja. Con la disminución de estas reacciones adversas, el fármaco puede iniciarse con una dosis más baja o con la dosis anterior según el juicio clínico.
Lenalidomida
La lenalidomida es un agente quimioterapéutico que se clasifica como agente inmunomodulador y agente antiangiogénico. La lenalidomida se puede usar para tratar el mieloma múltiple (en combinación con dexametasona) y el linfoma de células del manto, en el que la enfermedad ha recaído o progresado después de dos terapias anteriores, una de las cuales incluía bortezomib. La lenalidomida se puede administrar por vía oral.
La dosis inicial recomendada de lenalidomida para el tratamiento del mieloma múltiple es 25 mg por vía oral una vez al día en los Días 1-21 de ciclos repetidos de 28 días en combinación con dexametasona. Para pacientes > 75 años, la dosis inicial de dexametasona puede reducirse. La dosis inicial recomendada de lenalidomida para el tratamiento del linfoma de células del manto es 25 mg/día por vía oral en los Días 1-21 de ciclos repetidos de 28 días para el linfoma de células del manto recidivante o refractario.
Epotilonas
Las epotilonas, como los taxanos, evitan que las células cancerosas se dividan al interferir con la tubulina, pero en los primeros ensayos se informó que las epitilonas tienen una mayor eficacia y efectos adversos más leves que los taxanos. Varios análogos sintéticos de epotilona están en desarrollo clínico para el tratamiento de diversos tipos de cáncer. Un análogo que ha sido aprobado para el tratamiento del cáncer de mama es la ixabepilona. La ixabepilona, en combinación con capecitabina, está indicada para el tratamiento del cáncer de mama metastásico o localmente avanzado en pacientes después del fracaso de una antraciclina y un taxano. La ixabepilona como monoterapia está indicada para el tratamiento del cáncer de mama metastásico o localmente avanzado en pacientes después del fracaso de una antraciclina, un taxano y capecitabina. La dosis recomendada de ixabepilona es 40 mg/m2, administrada por vía intravenosa durante 3 horas cada 3 semanas. Las dosis para pacientes con área de superficie corporal (BSA) superior a 2,2 m2 debe calcularse sobre la base de 2,2 m2.
Conjugados de anticuerpo con fármaco de monometil auristatina E (MMAE)
La monometil auristatina E (MMAE) es un agente antineoplásico sintético. Debido a su alta toxicidad, no ha sido aprobado para su uso como medicamento en sí. Sin embargo, ha sido aprobado para su uso vinculado a un anticuerpo monoclonal (MAB) que lo dirige a las células cancerosas. MMAE ha sido probado con diversos anticuerpos monoclonales. Brentuximab vedotina se dirige contra la proteína CD30, que se encuentra en las células malignas del linfoma anaplásico de células grandes y el linfoma de Hodgkin. Glembatumumab se dirige contra la glicoproteína GPNMB, que se encuentra en el melanoma agresivo, el glioma, el cáncer de mama y otros tumores.
Brentuximab vedotina está indicado para el tratamiento de pacientes con linfoma de Hodgkin (LH) clásico después del fracaso del trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas (auto-HSCT) o después del fracaso de al menos dos regímenes previos de quimioterapia con múltiples agentes en pacientes que no son candidatos para el auto-HSCT, LH clásico con alto riesgo de recaída o progresión como consolidación posterior a un auto-HSCT, y linfoma anaplásico de células grandes sistémico (sALCL) después del fracaso de al menos un régimen previo de quimioterapia con múltiples agentes.
La administración habitual de brentuximab vedotina es en infusión intravenosa durante 30 minutos cada 3 semanas hasta que la enfermedad progresa o existe una toxicidad inaceptable. Para el tratamiento de consolidación del LH clásico posterior al auto-HSCT, el tratamiento con brentuximab vedotina generalmente se inicia dentro de las 4-6 semanas posteriores al auto-HSCT o al recuperarse del auto-HSCT. Estos pacientes típicamente continúan el tratamiento hasta un máximo de 16 ciclos, hasta que la enfermedad progresa o hay una toxicidad inaceptable. La dosis inicial recomendada para pacientes con función renal y hepática normal es 1,8 mg/kg hasta 180 mg. La dosis inicial recomendada para pacientes con insuficiencia renal leve (aclaramiento de creatinina >50-80 ml/min) o moderada (aclaramiento de creatinina 30-50 ml/min) es 1,8 mg/kg hasta 180. Por lo general, se recomienda que si un paciente está grave (aclaramiento de creatinina inferior a 30 ml/min), el paciente debe evitar el uso de brentuximab vedotina. La dosis inicial recomendada para pacientes con insuficiencia hepática leve (Child-Pugh A) es 1,2 mg/kg hasta 120 mg, mientras que normalmente se recomienda que si un paciente tiene insuficiencia hepática moderada (Child-Pugh B) o insuficiencia hepática grave (Child-Pugh C), el paciente debe evitar el uso de brentuximab vedotina.
Vectores virales y VHS
Pueden usarse vectores virales para facilitar la transferencia de ácidos nucleicos a las células. Los vectores virales conocidos incluyen los derivados de retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus de la vacuna, y baculovirus. Los vectores derivados de los virus del herpes simple (VHS), tales como el virus del herpes simple 1 (HSV-1) y el virus del herpes simple 2 (HSV-2), son particularmente útiles para la administración de agentes (por ejemplo, NT3) a tejidos específicamente seleccionados. Las consideraciones para escoger un vector y un sistema de administración en particular incluyen, por ejemplo, las características de las células diana, la duración de la expresión deseada, la virulencia y la invasividad del vector; y el tamaño del material genético a transferir.
Los vectores del HSV-1 normalmente pueden acomodar hasta 25 kb de secuencias de ADN extrañas. HSV-1 tiene un genoma de ADN lineal bicatenario de aproximadamente 152 kb que se puede mantener episomalmente en el núcleo de las células. El virión del HSV-1 está envuelto, y tiene un diámetro de aproximadamente 110 nm. La infección viral se inicia en las células epiteliales de la piel o las membranas mucosas mediante la unión de las glicoproteínas de la cubierta viral a los restos de sulfato de heparina en la membrana plasmática. El VHS es particularmente adecuado para la suministro de genes al sistema nervioso, y posee un tropismo natural para las neuronas sensoriales. El virus puede establecer un estado latente en el que los genomas virales persisten durante la vida del hospedante como un elemento episomal intranuclear. La persistencia de por vida de genomas latentes en los ganglios trigeminales humanos sin el desarrollo de pérdida sensorial o daño histológico a los ganglios ejemplifica la efectividad de los mecanismos de latencia. El virus del VHS de tipo salvaje puede reactivarse desde la latencia bajo la influencia de una variedad de estreses. Sin embargo, los vectores virales recombinantes que se vuelven defectuosos en la replicación retienen la capacidad de establecer un estado de reposo persistente en las neuronas pero son incapaces de replicarse (o reactivarse) en el sistema nervioso.
Los vectores basados en HSV-1 pueden tener uno o más genes del VHS necesarios para la replicación que se vuelven no funcionales (por ejemplo, por supresión o interrupción). Los genes del VHS necesarios para la replicación incluyen, por ejemplo, genes tempranos inmediatos tales como ICP4 e ICP27. En algunas realizaciones, la descripción proporciona vectores del VHS defectuosos en la replicación, con ICP4 y uno o más de ICP0, ICP22, ICP27 e ICP47 eliminados o interrumpidos. En algunas realizaciones, la descripción proporciona vectores del VHS con un gen ICP4 no funcional. En algunas realizaciones, la descripción proporciona vectores del VHS con genes ICP4, ICP22 e ICP47 no funcionales. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un vector del VHS con ICP4 eliminado e ICP22 e ICP47 interrumpidos. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un vector del VHS con ICP4 eliminado y la expresión de ICP22 e ICP47 interrumpida o retrasada. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un vector del VHS con ICP4 eliminado, e ICP0, ICP22, ICP27 y/o ICP47 no expresados como genes tempranos inmediatos.
Los vectores del HSV-1 que tienen genes del VHS eliminados se pueden producir en líneas celulares que expresan la proteína deficiente en trans. En algunas realizaciones, los vectores del HSV-1 se producen en una línea celular de mamífero. En algunas realizaciones, los vectores del HSV-1 se producen en una línea celular de mamífero del linaje Vero. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4. En algunas realizaciones, la línea celular expresa uno o más de ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 e ICP47. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4 y al menos un gen temprano inmediato adicional. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4, ICP22 e ICP 47. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4, ICP22 y UL55. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4, ICP27 y UL55. En algunas realizaciones, la línea celular comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una señal de poliadenilación del virus de simio 40 (SV40 pA). En algunas realizaciones, los vectores virales se producen en células Vero 6-5C. En algunas realizaciones, los vectores virales se producen en células Vero D.
Cepa McKrae
Se han aislado al menos 17 cepas de HSV-1, incluyendo, pero sin limitarse a, McKrae, cepa 17, cepa F, H129, HF10, MacIntyre, cepa HF, ATCC 2011 y KOS (para una revisión, véase Watson et al., Virology (2012)). Se aisló una cepa McKrae de un paciente con queratitis por herpes simple, y posteriormente se llevó a cultivo tisular. Una secuencia del genoma parcial de McKrae se muestra en la Figura 16 (SEQ ID NO: 1) (número de acceso JQ730035).
Se observan diferencias entre cepas en la replicación periférica y la virulencia del HSV-1 después de la inyección en animales. McKrae sufre una reactivación espontánea o inducida con mayor frecuencia que otras cepas conocidas, y se encuentra entre las cepas de HSV-1 más virulentas. McKrae también es más neuroinvasiva que otras cepas conocidas, tales como la cepa 17, KOS, F y H129. En un estudio, se inyectó KOS o McKrae en la córnea y el tracto genital de ratones para comparar la patogenia (Wang et al. (2013) Virus Res. 173(2):436-440. Se encontró que cada una se replicaba en un grado similar en el epitelio corneal y los ganglios del trigémino; sin embargo, los títulos de McKrae fueron alrededor de 100 veces más altos en el tronco encefálico. T ras la inyección intravaginal, McKrae y KOS se replicaron en un grado similar, excepto por un pico transitorio en el título de McKrae a los cuatro días. McKrae, pero no KOS, provocó una inflamación significativa de los genitales externos, junto con pérdida de peso en los animales. No se detectó KOS en el tejido neural, y rara vez se detectó McKrae.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona vectores virales del VHS con una supresión de un gen ICP4 que hace que la replicación del VHS sea defectuosa, pero no reduce la neuroinvasividad del VHS. Por lo tanto, los vectores del VHS son capaces de atravesar el sistema nervioso periférico para alcanzar las neuronas en el ganglio de la raíz dorsal tras la administración a la piel.
Los genes del VHS influyen en las características virales y el fenotipo. Hay al menos 9 genes y varias secuencias no codificantes exclusivas de la cepa McKrae. Además de los asociados con la patogénesis y las reactivaciones de latencia, tales como RL1, RS1 y RL2, tres genes UL (UL36, UL49A, UL56) y tres genes US (US7, US10 y US11) son únicos para la cepa McKrae. Además de las variaciones genéticas, las secuencias no codificantes, tales como LAT, la secuencia ‘a’ y los miARN, contienen variaciones exclusivas de McKrae.
Uno o más de los siguientes genes y secuencias no codificantes pueden considerarse característicos de la cepa McKrae. En McKrae, RL1 (ICP34.5) tiene una repetición P-A-T extendida entre los restos 159 y 160 que da como resultado 8 iteraciones, mientras que otras cepas contienen solo 3-5 iteraciones. Se cree que la repetición P-A-T influye en la localización celular de la proteína ICP34.5. (Mao y Rosenthal, J. Biol. Chem. 277(13): 11423-31 (2012). Se cree que ICP34.5 es un factor de neurovirulencia involucrado en la replicación viral y la respuesta anti-hospedante.
La cepa McKrae también contiene un elemento repetido extendido de seis iteraciones de la repetición interna en tándem STPSTTT (SEQ ID NO: 11) ubicada dentro de la secuencia codificante de US07 (gl). Además, en McKrae, UL 36 contiene un codón de parada prematuro introducido debido a la eliminación de un nucleótido G en una cadena mononucleotídica que codifica el resto de aminoácido 2453 (nt 72 535), y UL 56 (180 aa) contiene una inserción de un solo par de bases en el nucleótido 115.992 (aminoácido 97). La cepa McKrae también contiene un ORF extendido en US10 como resultado de una inserción de un solo pb en el nucleótido 143.416, y el desplazamiento del marco provoca una pérdida del codón de parada en McKrae y una secuencia de proteína C-terminal única. McKrae tiene diferencias de aminoácidos en UL49A en los restos 28 y 51 en comparación con otras cepas. McKrae tiene histidina y treonina en los restos 28 y 51, respectivamente, mientras que la cepa 17 tiene arginina y treonina, y otras cepas (por ejemplo, KOS) tienen histidina y alanina. Además, la cepa McKrae contiene repeticiones en tándem reducidas que se encuentran en la unión UL-RL (49 pb en McKrae frente a 181 pb en la cepa 17 y KOS), y faltan aproximadamente 330 nucleótidos inmediatamente después de la repetición de la unión UL-RL. McKrae también contiene una variación única dentro de la matriz de repetición directa 2 (DR2) de la secuencia ‘a’. En lugar de una serie de repeticiones en tándem ininterrumpidas, las repeticiones DR2 de McKrae se interrumpen dos veces por secuencias idénticas ricas en guanina.
La principal variación dentro del intrón LAT entre cepas se debe a las diferencias en un elemento repetido (GCACCCCCACTCCCAC) (SEQ ID NO: 12), que varía en el número de iteraciones a partir del nucleótido 119.482 en la cepa McKrae, conteniendo McKrae 13 repeticiones, mientras que las cepas F, H129 y 17 contienen 9 repeticiones, y KOS contiene 15 repeticiones. Además, la variación repetida en tándem entre las cepas se encuentra en McKrae a partir en la base 125.520. Los elementos repetidos de McKrae incluyen doce iteraciones de CCCCAGCCCTCCCCAG (SEQ ID NO: 13) y ocho iteraciones de CCCCTCGCCCCCTCCCG (SEQ ID NO: 14). La primera unidad repetida es única de otras cepas por cuanto contiene una transición G-A, y la cepa McKrae contiene tres iteraciones más que cualquier otra cepa. El segundo elemento repetido de la cepa McKrae está colapsado, le faltan 188 nucleótidos con respecto a todas las demás cepas, y está separado de la repetición anterior por una secuencia conservada al 100% de 105 pb que contiene miR-H5.
McKrae contiene además una secuencia codificante única para ICP4 que no se encuentra en otras cepas conocidas. (Watson et al., Virology (2012)). ICP4 es un regulador transcripcional temprano inmediato, y se ha implicado en la reactivación. Mientras que otras cepas contienen una región rica en alanina (AASAPDAADALAAA) (SEQ ID NO: 15) entre los restos 707 y 720, en McKrae la región rica en alanina se reemplaza por una secuencia rica en serina [GPRRSSSSSGVAA] (SEQ ID NO: 16). El bloque de sustituciones rico en serina presente en McKrae es adyacente a la señal de localización nuclear (NLS) (aminoácido 728-734). Un cambio en la conformación de esta región puede alterar la NLS y, a su vez, afectar la localización no solo de ICP4, sino también de otras proteínas virales (por ejemplo, ICP0, ICP8) que se ven afectadas por la localización de ICP4 (Knipe y Smith, 1986). Por lo tanto, esta región puede influir en el fenotipo viral en parte al alterar la localización de las proteínas en el núcleo.
Vector de McKrae defectuoso en la replicación
Esqueleto de McKrae
Los genes virales se expresan en una cascada ordenada y estrictamente regulada, que comienza con la producción de los genes inmediatamente tempranos (IE). Las proteínas IE resultantes, que incluyen las proteínas ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 e ICP47 de células infectadas, son responsables de regular la expresión génica viral durante las fases posteriores del ciclo de replicación. Los virus variantes de replicación defectuosa son defectuosos para una o más funciones que son esenciales para la replicación del genoma viral o la síntesis y ensamblaje de partículas virales. Dichos virus se pueden propagar en líneas celulares complementarias que expresan el o los productos génicos que faltan; sin embargo, en células normales (es decir, no complementarias), los virus expresan productos de genes virales, pero no se replican para formar viriones de progenie.
Los virus con replicación defectuosa se pueden crear a través de diversos métodos conocidos en la técnica para modificar genes. En algunas realizaciones, uno o más nucleótidos se vuelven diferentes con respecto a la secuencia de tipo salvaje. En algunas realizaciones, se eliminan uno o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la eliminación de uno o más nucleótidos crea un codón de terminación prematuro. En algunas realizaciones, la eliminación de uno o más nucleótidos crea un gen que codifica un polipéptido truncado. En algunas realizaciones, la eliminación de uno o más nucleótidos crea un gen que codifica un polipéptido no funcional. En algunas realizaciones, la supresión de uno o más nucleótidos hace que un gen no sea funcional por alteración. En algunas realizaciones, un gen se interrumpe mediante la eliminación de su promotor.
Como se define en las reivindicaciones, en algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina para hacer que la replicación del virus sea defectuosa. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP0 se elimina total o parcialmente, y el gen que codifica ICP4 se elimina total o parcialmente. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina total o parcialmente. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP22 se elimina total o parcialmente, y el gen que codifica ICP4 se elimina total o parcialmente. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP27 se elimina total o parcialmente, y el gen que codifica ICP4 se elimina total o parcialmente. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP47 se elimina total o parcialmente, y el gen que codifica ICP4 se elimina total o parcialmente. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP 4 se elimina total o parcialmente, sin interrumpir la expresión de ningún gen temprano inmediato adicional. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina total o parcialmente, y uno o más genes tempranos inmediatos (IE) se interrumpen. En algunas realizaciones, se elimina el gen que codifica ICP4, y se interrumpen ICP22 e ICP47.
Los promotores IE de HSV-1 contienen una o más copias de una secuencia reguladora específica de IE de consenso TAATGARAT (SEQ ID NO: 19) (en la que R es una purina). Estos motivos normalmente se ubican dentro de unos pocos cientos de pares de bases de las secuencias del promotor IE proximal, pero junto con sus secuencias flanqueantes son entidades funcionales discretas que pueden conferir una regulación específica de IE a otros elementos promotores proximales de diferente clase temporal. En algunas realizaciones, los virus con replicación defectuosa se crean eliminando nucleótidos en una secuencia reguladora específica de IE. En algunas realizaciones, una secuencia reguladora específica de IE contiene una supresión interna. En algunas realizaciones, una secuencia reguladora específica de IE contiene una supresión terminal. En algunas realizaciones, una secuencia reguladora específica de IE se elimina por completo.
A continuación se representa un esquema de un vector viral ejemplar de la cepa McKrae defectuosa en la replicación. El esquema muestra supresiones completas de ambas copias del gen ICP4 viral, y un casete de expresión impulsado por el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (HCMV) insertado dentro de ambas copias de los loci de ICP4 eliminados. El casete de expresión contiene NT3 para la expresión en células diana.
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Supresión de AlCP4ATGTpICP22/ATGTpICP47, inserción de casete
El alcance de la supresión de ICP4 da como resultado la eliminación de las secuencias promotoras en dirección 5’ de dos genes virales tempranos inmediatos adicionales: ICP22 e ICP47.
Carga útil
Los vectores virales según la presente descripción contienen una molécula de ácido nucleico que comprende la carga útil del vector. En algunas realizaciones, una carga útil comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína. En algunas realizaciones, una carga útil comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína. En algunas realizaciones, una carga útil codifica una molécula de ácido nucleico que es reguladora. En algunas realizaciones, una carga útil codifica un polinucleótido de ARN pequeño de interferencia (ARNpi). En algunas realizaciones, una carga útil codifica un polinucleótido de micro-ARN (miARN).
En algunas realizaciones, la carga útil es una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que es exógena al tejido o sujeto diana al que se administra el vector. En algunas realizaciones, la carga útil es una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que es endógena al tejido o sujeto diana al que se administra el vector. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico tiene codones optimizados. En algunas realizaciones, la carga útil comprende una neurotrofina. En algunas realizaciones, la carga útil comprende una pluralidad de neurotrofinas. En algunas realizaciones, la carga útil comprende un polipéptido NT3.
Neurotrofinas
Las neurotrofinas (NTF) son una clase de proteínas del factor trófico pequeñas derivadas de diana que se identificaron inicialmente por su capacidad para prevenir la muerte celular programada de las neuronas durante el desarrollo. El factor de crecimiento nervioso (NGF) es una NTF que se ha dado a conocer que es necesario para la supervivencia de las neuronas del sistema nervioso periférico simpático (SNP) y del sistema nervioso central sensorial (SNC) durante el desarrollo. Además del NGF, existen otras NTF que comparten aproximadamente un 50% de homología de aminoácidos con el NGF, incluyendo el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina-3 (NT3) y la neurotrofina-4/5 (NT-4). Las NTF se unen a dos tipos de receptores postsinápticos; una tirosina cinasa receptora relacionada con la tropomiosina (trk) de alta afinidad (KD = 10-11 M) y el receptor p75NTR (un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral) de baja afinidad (KD = 10-9 M). En el adulto, las NTF pueden promover tanto la supervivencia de las células neuronales como la muerte celular, ayudar en la preservación y el nuevo crecimiento de las redes axonales, y modular las sinapsis. Estas diferentes funciones parecen resultar de las interacciones entre la forma proforma y la forma madura procesada de los péptidos, ambos liberados de los tejidos diana, con los receptores trk y/o p75.
Aunque los estudios han dado a conocer que el tratamiento sistémico con neurotrofinas puede proteger contra la progresión de la neuropatía periférica por causas tales como la diabetes, los ensayos clínicos que usan NGF humano recombinante no lograron tratar de manera eficaz la neuropatía en sujetos humanos. Se cree aquí que dichos estudios fallaron al menos en parte debido a la incapacidad de proporcionar una concentración diana local adecuada de estos péptidos bioactivos de vida corta a través de la administración sistémica. La transferencia de genes basada en el VHS puede proporcionar concentraciones locales adecuadas de NTF directamente a los nervios periféricos, al tiempo que evita posibles efectos fuera del sitio mediante el suministro y expresión de genes específicos.
Neurotrofina 3
La neurotrofina 3 (NT3) es producida por el gen NTF3. NT3 se ha localizado en nervios periféricos y centrales en seres humanos. Se cree que NT3 apoya la supervivencia y la diferenciación de neuronas nuevas y existentes. Una secuencia de aminoácidos representativa de la NT3 humana es:
M S I L F Y V I F L A Y L R G I Q G N N M D Q R S L P E D S L N S L I
I K L I Q A D I L K N K L S K Q M V D V K E N Y Q S T L P K A E A P R
E P E R G G P A K S A F Q P V I A M D T E L L R Q Q R R Y N S P R V L
L S D S T P L E P P P L Y L M E D Y V G S P V V A N R T S R R K R Y A
E H K S H R G E Y S V C D S E S L W V T D K S S A I D I R G H Q V T V
L G E I K T G N S P V K Q Y F Y E T R C K E A R P V K N G C R G I D D
K H W N S Q C K T S Q T Y V R A L T S E N N K L V G W R W I R I D T S
C V C A L S R K I G R T (SEQ ID NO: 20)
En seres humanos, una secuencia de ácido nucleico endógena que codifica NT3 es:
taacacagac tcagctgcca gagcctgctc ttaacacctg tgtttccttt tcagatctta caggtgaaca aggtgatgtc catcttgttt tatgtgatat ttctcgctta tctccgtggc atccaaggta acaacatgga tcaaaggagt ttgccagaag actcgctcaa ttccctcatt attaagctga tccaggcaga tattttgaaa aacaagctct ccaagcagat ggtggacgtt aaggaaaatt accagagcac cctgcccaaa gctgaggctc cccgagagcc ggagcgggga gggcccgcca agtcagcatt ccagccggtg attgcaatgg acaccgaact gctgcgacaa cagagacgct acaactcacc gcgggtcctg ctgagcgaca gcaccccctt ggagcccccg cccttgtatc tcatggagga ttacgtgggc agccccgtgg tggcgaacag aacatcacgg cggaaacggt acgcggagca taagagtcac cgaggggagt actcggtatg tgacagtgag agtctgtggg tgaccgacaa gtcatcggcc atcgacattc ggggacacca ggtcacggtg ctgggggaga tcaaaacggg caactctccc gtcaaacaat atttttatga aacgcgatgt
aaggaagcca ggccggtcaa aaacggttgc aggggtattg atgataaaca ctggaactct cagtgcaaaa catcccaaac ctacgtccga gcactgactt cagagaacaa taaactcgtg ggctggcggt ggatacggat agacacgtcc tgtgtgtgtg ccttgtcgag aaaaatcgga agaacatgaa ttggcatctc tccccatata taaattatta ctttaaatta tatgatatgc atgtagcata taaatgttta tattgttttt atatattata agttgacctt tatttattaa acttcagcaa ccctacagta tataagcttt tttctcaata aaatcagtgt gcttgccttc
(SEQ ID NO: 21)
En algunas realizaciones, la descripción proporciona moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia con codones optimizados para codificar un polipéptido NT3. En algunas realizaciones, una secuencia con codones optimizados está de acuerdo con la siguiente secuencia de ácido nucleico (que incluye los sitios de restricción BamHI flanqueantes) (ggatcc, (SEQ ID NO: 22)):
GGATCCATGGTCACTTTCGCAACTATTCTGCAGGTCAACAAGGTCATGTCTATTCTGTTC
TATGTCATCTTTCTGGCTTATCTGAGAGGCATTCAGGGGAACAATATGGACCAGAGAAGC
C T GC CAGAAGATT CCC T GAACTCTCTGATCATTAAGCT GAT CCAGGCAGACATT C T GAAG
AACAAACT GT CAAAGCAGATGGTGGATGT CAAAGAAAAT TACCAGAGCACACT GCCAAAG
GCAGAGGC T C CAC GAGAGCC T GAAC GAGGAGGACCAGCAAAAT CC GCCTTCCAGCCCGTG
AT CGC TAT GGACACAGAGC T GC T GC GGCAGCAGC GGAGATATAACT C T CC TAGAGT GCTG
CTGTCTGACAGTACTCCACTGGAACCCCCTCCACTGTACCTGATGGAGGATTATGTGGGC
TCTCCTGTGGTCGCTAAT CGCACCAGTAGGC GCAAGC GATAC GCAGAGCACAAAAGCCAT
CGAGGGGAATATTCCGTGTGCGATTCAGAGAGCCTGTGGGTCACAGACAAGAGCTCCGCC
ATCGATATTCGCGGACACCAAGTGACTGTCCTGGGGGAAATCAAGACCGGAAATAGTCCC
GT GAAACAGTACT T T TAT GAGAC TAGAT GCAAGGAAGCCAGGCCT GT CAAAAAC GGAT GT
C GGGGCAT T GAC GATAAGCAT T GGAATAGT CAGT GTAAAACC T CACAGACATACGT GAGG
GCTCTGACCAGCGAGAACAACAAGCTGGTCGGCTGGCGCTGGATTAGAATTGACACTAGC
TGCGTCTGCGCCCTGAGTAGGAAGATTGGAAGAACTTAAATTGGCATCTCTGGATCC
(SEQ ID NO: 23)
En algunas realizaciones, una secuencia con codones optimizados está de acuerdo con la siguiente secuencia de ácido nucleico (que incluye una secuencia líder de 43 pb GCGGAGGACTCTGGACAGTAGAGGCCCCGGGACGACCGAGCTG, (SEC ID NO: 24):
CGCGGATCCGCGGAGGACTCTGGACAGTAGAGGCCCCGGGACGACCGAGCTGATGGTCACCTTT
GCCACCATCCTGCAAGTGAACAAAGTGATGAGCATCCTGTTCTACGTGATCTTCCTGGCCTACC
TGCGGGGCATCCAGGGCAACAACATGGACCAGAGAAGCCTGCCCGAGGACAGCCTGAACTCCCT
GAT CAT CAAG C T GAT C CAG G C C GACAT C C T GAAGAACAAG C T GAG CAAG CAGAT G G T G GAC G T G
AAAGAGAACTACCAGAGCACCCTGCCCAAGGCCGAGGCCCCTAGAGAACCTGAAAGAGGCGGCC
CTGCCAAGAGCGCCTTCCAGCCTGTGATCGCCATGGATACCGAGCTGCTGAGACAGCAGCGGCG
GTACAACAGCCCCAGAGTGCTGCTGAGCGACAGCACCCCTCTGGAACCTCCCCCCCTGTACCTG
ATGGAAGATTACGTGGGCAGCCCCGTGGTGGCCAACCGGACCAGCAGAAGAAAGAGATACGCCG
AGCACAAGAGCCACCGGGGCGAGTACAGCGTGTGCGATAGCGAGAGCCTGTGGGTCACCGACAA
GAG CAG CGC CAT C GACAT CAGAG G C CAC CAAG T GAC CGTGCTGGGC GAGAT CAAGAC C G G CAAC
TCCCCCGTGAAGCAGTACTTCTACGAGACACGGTGCAAAGAGGCCAGACCCGTGAAGAACGGCT
GCCGGGGCATCGACGACAAGCACTGGAACAGCCAGTGCAAGACCAGCCAGACCTACGTGCGGGC
CCTGACCAGCGAGAACAACAAGCTCGTGGGCTGGCGGTGGATCAGAATCGACACCAGCTGCGTG
TGCGCCCTGAGCCGGAAGATCGGCAGAACATAAGTTTAAACCGCGGGATCCGCGC
(SEQ ID NO: 25)
Elementos reguladores
Se contempla aquí la inclusión de secuencias reguladoras no nativas, secuencias de control de genes, promotores, secuencias no codificantes, intrones, o secuencias codificantes en un ácido nucleico de la presente descripción. Se contempla adicionalmente aquí la inclusión de etiquetas de ácidos nucleicos o secuencias de señalización, o ácidos nucleicos que codifican etiquetas de proteínas o secuencias de señalización de proteínas. Típicamente, la región codificante está ligada operativamente con uno o más componentes de ácido nucleico reguladores.
Un promotor incluido en un ácido nucleico de la presente descripción puede ser un promotor específico de tejido o de tipo de célula, un promotor específico de múltiples tejidos o tipos de células, un promotor específico de órganos, un promotor específico de múltiples órganos, un promotor sistémico o ubicuo, o un promotor casi sistémico o ubicuo. Los promotores que tienen expresión estocástica, expresión inducible, expresión condicional, o expresión de otro modo discontinua, inconstante o impredecible también se incluyen dentro del alcance de la presente descripción. Un promotor de la presente descripción puede incluir cualquiera de las características anteriores u otras características del promotor conocidas en la técnica.
Los ejemplos de promotores conocidos incluyen, pero no se limitan a, el promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de CMV/beta 3 globina humana, promotor de GFAP, promotor de beta actina de pollo (CBA), promotor de pglucuronidasa (GUSB), y promotores de ubiquitina tales como los aislados de ubiquitina A humana, ubiquitina B humana, y ubiquitina C humana.
En algunas realizaciones, un promotor es un promotor específico de neuronas en el sentido de que es un promotor que tiene expresión específica en neuronas, expresión preferencial en neuronas, o que típicamente impulsa la expresión de una secuencia codificante asociada en neuronas o un subconjunto de neuronas pero no en uno o más de otros tejidos o tipos de células. Los ejemplos de tales promotores incluyen el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), la sinapsina I (SYN), la proteína cinasa II dependiente de calcio/calmodulina, la tubulina alfa I, la enolasa específica de neuronas, la proteína 1B asociada a microtúbulos (MAP1B), y la promotores de la cadena beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas, así como derivados de los mismos. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), o un derivado del mismo.
Otros elementos reguladores pueden ligarse operativamente de forma adicional a la carga útil, tal como un potenciador y un sitio de poliadenilación. En algunas realizaciones, un potenciador comprende una secuencia del citomegalovirus humano (HCMV). En algunas realizaciones, un sitio de poliadenilación comprende una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH).
En algunas realizaciones, un promotor es una quimera de uno o más promotores o elementos reguladores que se encuentran en la naturaleza. En algunas realizaciones, los vectores virales comprenden una carga útil cuya expresión está impulsada por un promotor CGRP con una secuencia potenciadora del HCMV.
Preparación de vectores
La presente descripción se refiere particularmente a vectores virales de la cepa McKrae que son defectuosos en la replicación. En algunas realizaciones, los vectores virales se generan por supresión o interrupción de un gen ICP4. Los genes virales pueden eliminarse o interrumpirse usando métodos de tecnología recombinante conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, un vector viral de la presente descripción puede volverse defectuoso en la replicación como resultado de un evento de recombinación homóloga. En algunas realizaciones, los vectores virales defectuosos en la replicación se generan mediante la supresión de un gen ICP4. En algunas realizaciones, los vectores virales defectuosos en la replicación se generan mediante la eliminación de un gen ICP4 y la eliminación de un promotor para uno o más genes tempranos inmediatos (por ejemplo, ICP22 y/o ICP47).
En algunas realizaciones, los vectores virales de la presente descripción se generan mediante la eliminación de los loci que codifican ICP4 mediante recombinación homóloga. En algunas realizaciones, la generación de un vector viral de la presente descripción incluye una etapa de recombinación homóloga de un primer plásmido con un segundo plásmido. En algunas realizaciones, el primer plásmido contiene secuencias de ácido nucleico homólogas a regiones de un genoma de VHS que son adyacentes a una región de ácido nucleico de un genoma de VHS que se pretende reemplazar. En algunas realizaciones, el segundo plásmido contiene un genoma de VHS o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el primer plásmido contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, NT3) entre las secuencias de ácido nucleico homólogas. En algunas realizaciones, el polipéptido de interés puede ser o incluir una proteína marcadora que es detectable por fluorescencia, quimioluminiscencia, u otra propiedad, que puede usarse para seleccionar vectores resultantes de una recombinación homóloga exitosa.
En algunas realizaciones, un vector viral de la presente descripción se genera mediante la recombinación homóloga de un primer plásmido que contiene una secuencia de ácido nucleico homóloga a las regiones corriente en dirección 5’ del promotor ICP4, que incluye el origen viral contenido dentro de las regiones repetidas invertidas cortas del VHS, con un segundo plásmido que contiene un genoma de la cepa McKrae del VHS.
En algunas realizaciones, un vector se obtiene reemplazando primero ambas copias de los loci de ICP 4 por recombinación homóloga usando el plásmido SASB3 y cribando las placas que expresan la proteína fluorescente verde (GFP). En algunas realizaciones, un plásmido se construye clonando el fragmento Sph I a Afl III (Sal I linkere) (1928 pb) del genoma de la cepa HSV-1 KOS (nucleótidos 124485-126413) en pSP72 digerido con Sph I/Sal I, seguido de la inserción del fragmento Bgl II a BamH I de 695 pb (nucleótidos 131931 a 132626), que contiene regiones en dirección 5’ del promotor de ICP4, que incluye el origen viral contenido dentro de las regiones repetidas invertidas cortas, en los sitios Bgl II a BamH I del plásmido vector. En algunas realizaciones, un plásmido se construye clonando un fragmento de HCMV-eGFP en el sitio BamHI de un plásmido como se describe anteriormente. En algunas realizaciones, un plásmido como se describe anteriormente se recombina entonces en un locus específico de un virus McKrae de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el vector resultante se aísla usando una línea celular estable que expresa uno o más genes suprimidos o alterados en el genoma del HSV que se requieren para la replicación.
Caracterización de vectores
Los vectores virales según la presente descripción se pueden caracterizar mediante secuenciación genómica a fin de determinar si el vector esperado se creó con éxito. Cualquier método de secuenciación conocido en la técnica es aceptable para este propósito. Los métodos de secuenciación incluyen, por ejemplo, secuenciación por nanoporos, secuenciación en tiempo real de una sola molécula (SMRT), secuenciación de nanoesferas de ADN (DNB), pirosecuenciación, y uso de matrices de ADN.
La expresión de una carga útil de un vector viral puede detectarse mediante cualquier método conocido en la técnica para detectar proteínas o ácidos nucleicos. Los métodos para detectar la expresión de proteínas incluyen inmunohistoquímica, citometría de flujo, transferencia Western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), microscopía inmunoelectrónica, inmunoprecipitación de proteínas individuales (IP), inmunoprecipitación de complejos de proteínas (Co-IP), inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), inmunoprecipitación de ARN (RIP), inmunoelectroforesis, espectrofotometría, y ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Los métodos para detectar la expresión de ácidos nucleicos incluyen transferencia Southern, transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR cuantitativa, y RT-PCR.
La presente descripción describe métodos para evaluar la capacidad de los vectores virales para transducir neuronas. Las neuronas pueden ser neuronas periféricas. Las neuronas pueden ser neuronas sensoriales. Las neuronas pueden comprender ganglios de la raíz dorsal (GRD).
Se puede inyectar una preparación de vector viral en uno o más dermatomas correspondientes a una sección de GRD, por ejemplo, los GRD L4, L5 y L6 izquierdo y derecho. Los GRD se retiran, y el ADN se aísla de los GRD y se analiza en busca de copias del genoma del vector usando un ensayo de qPCR que se dirige contra una secuencia dentro del HSV-1, o una secuencia dentro del gen de la glicoproteína del HSV-1 (UL-22).
Aplicaciones/Usos
Los vectores virales según la presente descripción son útiles para una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas. En algunas realizaciones, los vectores que se describen aquí son útiles para suministrar una o más cargas útiles a una o más células diana. En algunas realizaciones, las células diana residen en tejidos que están escasamente vascularizados y son difíciles de alcanzar por la circulación sistémica. En algunas realizaciones, las células diana son células susceptibles de infección por el VHS. En algunas realizaciones, las células diana son particularmente susceptibles a la infección por una cepa McKrae del VHS. En algunas realizaciones, las células diana son o incluyen una o más células neuronales. En algunas realizaciones, las células diana son células del ganglio de la raíz dorsal (GRD).
Terapia génica
Los vectores virales según la presente descripción son útiles en cualquier contexto en el que se contemple la terapia génica. Por ejemplo, los vectores virales que comprenden un segmento de ácido nucleico heterólogo ligado operativamente a un promotor son útiles para cualquier enfermedad o afección clínica asociada con la reducción o ausencia de la proteína codificada por el segmento de ácido nucleico heterólogo, o cualquier enfermedad o afección clínica que pueda ser efectivamente tratada por la expresión de la proteína codificada dentro del sujeto. Los vectores virales que contienen un casete de expresión para la síntesis de un agente de ARNi (por ejemplo, uno o más ARNpi o ARNhp) son útiles para tratar cualquier enfermedad o afección clínica asociada con la sobreexpresión de un transcrito o su proteína codificada en un sujeto, o cualquier enfermedad o afección clínica que puede tratarse provocando la reducción de un transcrito o su proteína codificada en un sujeto. Los vectores virales que comprenden un casete de expresión para la síntesis de uno o más ARN que se autohibridan o se hibridan entre sí para formar un agente de ARNi dirigido contra un transcrito que codifica una citocina pueden usarse para regular las respuestas del sistema inmunitario (por ejemplo, rechazo de trasplantes, alergia, enfermedades autoinmunes, inflamaciones, etc.). Los vectores virales que proporcionan un molde para la síntesis de uno o más ARN que se autohibridan o se hibridan entre sí para formar un agente de ARNi dirigido contra un transcrito de un agente infeccioso, o dirigido contra un transcrito celular cuyo producto codificado es necesario o contribuye a cualquier aspecto del proceso infeccioso, pueden usarse en el tratamiento de enfermedades infecciosas.
Administración
Las composiciones que comprenden vectores virales como se describe aquí pueden formularse para su administración por cualquier vía disponible, incluyendo, pero sin limitarse a, parenteral (por ejemplo, intravenosa), intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa, rectal, y vaginal. Las vías preferidas de administración incluyen la intradérmica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen un vector viral en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. También se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos complementarios. En algunas realizaciones, los vectores virales se formulan en glicerol. En algunas realizaciones, los vectores virales se formulan en aproximadamente 10% de glicerol en disolución salina amortiguada con fosfato.
Es ventajoso formular composiciones en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un vector viral calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con un vehículo farmacéutico.
La composición farmacéutica se puede administrar en diversos intervalos y durante diferentes períodos de tiempo según se requiera, por ejemplo una vez por semana durante alrededor de 1 a 10 semanas, entre 2 a 8 semanas, entre alrededor de 3 a 7 semanas, alrededor de 4, 5, o 6 semanas, etc. El experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo necesarios para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. El tratamiento de un sujeto con un vector viral puede incluir un solo tratamiento o, en muchos casos, puede incluir una serie de tratamientos.
Composiciones
En algunas realizaciones, los agentes activos, es decir, un vector viral de la descripción y/u otros agentes que se administrarán junto con un vector viral de la descripción, se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas composiciones serán evidentes para los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la composición se dirige contra tipos de células particulares o contra células que están infectadas por un virus.
Terapia de combinación
Según la presente descripción, las composiciones proporcionadas pueden administrarse en combinación con uno o más agentes activos y/o modalidades terapéuticas, tales como agentes terapéuticos conocidos y/o agentes biológicamente activos independientemente activos. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más de dichos otros agentes activos; en algunas realizaciones, tales otros agentes activos se proporcionan como parte de distintas composiciones. En algunas realizaciones, la terapia de combinación implica la administración simultánea de una o más dosis o unidades de dos o más agentes activos y/o modalidades terapéuticas diferentes; en algunas realizaciones, la terapia de combinación implica la exposición simultánea a dos o más agentes activos y/o modalidades terapéuticas diferentes, por ejemplo a través de regímenes de dosificación superpuestos.
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen o se administran en combinación con uno o más de otros agentes activos útiles para el tratamiento de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas se administran en combinación con (por ejemplo, antes, simultánea y/o posteriormente) con agentes quimioterapéuticos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Preparación de vectores
Este ejemplo describe métodos para preparar y formular vectores ejemplares para terapia génica.
Estructura genética del vector
Un vector se obtiene reemplazando primero ambas copias de los loci de ICP4 por recombinación homóloga usando un plásmido, y seleccionando placas que expresen el elemento marcador. Un plásmido se construye clonando un fragmento de un genoma del HSV-1 que comprende regiones en dirección 5’ del promotor de ICP4, que incluye el origen viral contenido dentro de las regiones repetidas invertidas cortas. El plásmido se modifica adicionalmente clonando un elemento marcador, por ejemplo fragmento de HCMV-eGFP, en el plásmido. Este plásmido se recombina después en el locus de ICP4 de un virus VHS de tipo salvaje. El vector resultante se aísla usando una línea celular Vero que expresa ICP4 estable, como ‘6-5C’. Las células Vero 6-5C son células complementarias que expresan ICP4.
Para reemplazar el elemento marcador (por ejemplo, GFP) por un gen de interés (GOI) en el vector descrito anteriormente, un plásmido se construye clonando HCMV-GOI-pA en el plásmido. Las placas que no expresan el elemento marcador se aíslan y analizan mediante ELISA para determinar la expresión del GOI.
Producción de vector bruto
Las células Vero complementarias de ICP4 se cultivan en matraces de cultivo de tejidos usando medios completos (DMEM suplementado con FBS, HEPES, y Pen Strep), y se expanden en matraces de 6-12xT 175 a una densidad de siembra de 3-4x104 células/cm2. Los matraces de cultivo se incuban a 37°C/7,5% de CO2 durante 3-4 días.
Cuando las células tienen una confluencia de más de 1-2 días, se infectan a una multiplicidad de infección (MOI) de ~0,1 con un lote de virus de concentración conocida. La infección se inicia retirando el sobrenadante del cultivo de cada matraz e infectando con medios completos que contienen la cantidad adecuada de un lote de virus. El virus se adsorbe en las monocapas celulares incubando los cultivos durante 1,5 - 2 horas, agitando y rotando los matraces cada 15-20 minutos. Después de la etapa de adsorción, se añade un medio completo adicional a cada matraz, y los cultivos se incuban nuevamente a 37°C/7,5% de CO2.
Aproximadamente 48 horas después de iniciar la infección, los matraces se observan al microscopio para confirmar que las células muestran signos de efecto citopatógeno y desprendimiento de la superficie del matraz. En ese momento, las células y el sobrenadante se recolectan, se agrupan, y se centrifugan a ~1500xg durante -10 min. El sobrenadante se elimina del pelete celular, y se mantiene separado para su posterior procesamiento.
El pelete celular se resuspende en 4-5 ml de medio completo, se homogeneiza, y después se congela a -80°C. Después de congelar la suspensión celular durante >20 minutos, se descongela y se centrifuga a ~1500xg durante -10 min. Este segundo sobrenadante del pelete celular se retira y se combina con el primer sobrenadante recogido.
El sobrenadante agrupado se divide en alícuotas en tubos de centrífuga. A continuación, el virus se centrifuga a ~40.000xg durante -30 minutos a 2-8°C para peletizar el virus. Después de completar la etapa de centrifugación, el sobrenadante de los tubos se elimina y se desecha. Al día siguiente, los peletes de virus se homogeneizan mediante pipeteo, y se agrupan. El lote de virus resuspendido se divide entonces en alícuotas en crioviales, típicamente en volúmenes de ~ 120 gl por vial. Se añade medio completo (200-300 gl) a los peletes de virus, a fin de cubrirlos con líquido, y se almacenan a 2-8°C durante la noche para soltar las partículas de virus. Los viales se etiquetan y congelan a -80°C. Luego, un vial congelado se descongela para realizar un ensayo de titulación en placa de virus para determinar la concentración del lote de virus preparado antes de usarlo en cualquier estudio in vivo o in vitro.
Fabricación de vector clarificado
Descongelación y expansión celular
Las células Vero (por ejemplo, Vero 6-5, células VeroD) de un banco de células de trabajo se descongelan a 37°C y se transfieren a un tubo cónico, y se agrupan. Las células VeroD son células complementarias que expresan o ICP4, ICP27 y UL55. Las células se envasan en viales a aproximadamente 1,0x107 células viables/ml/tubo. Las células se diluyen gradualmente con medio completo, y se extrae una muestra para obtener recuentos de células viables. Las células se siembran en matraces de cultivo de tejidos a una densidad de 3,0 - 5,0x104 células/cm2.
Las células se incuban a 37°C, 7,5% de CO2, y se examinaron periódicamente por microscopía de fase. Las células se hacen pasar mientras están subconfluentes. Se retira el medio completo, se enjuaga con PBS, y las células se disocian. Los matraces se incuban hasta que las células se desprenden, entonces se vuelven a suspender en medio completo, se reúnen, se cuentan, y se siembran en nuevos matraces a una densidad entre 1,0-4,0x104 células/cm2. Las células se expanden y se dejan extender hasta 1-2 días después de la confluencia antes de la infección.
Infección con vector
Cuando las células alcanzan la confluencia deseada, se subcultiva un matraz modelo, y las células se cuentan para estimar el número de células por factoría de células. Se prepara un inóculo de vector de banco de virus maestro descongelando el volumen apropiado requerido para obtener una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1, y diluyendo el lote con medio completo hasta el volumen diana deseado para la infección. Las factorías de células se infectan mediante un período de adsorción inicial, seguido de incubación durante el primer día de infección en medio completo. Después de aproximadamente 24 horas, el medio de cultivo se retira y se reemplaza por un volumen igual de medio sin suero. Las factorías de células se colocan en la incubadora, y la temperatura se reduce hasta 33°C/con 7,5% de CO2. Los cultivos se monitorizan diariamente, y el porcentaje de efecto citopático se estima mediante inspección visual.
Cosecha viral bruta y clarificación
La infección se detiene colocando las factorías de células en un gabinete de bioseguridad y reuniendo el sobrenadante y los desechos celulares en una bolsa estéril. Esta cosecha a granel sin clarificar se muestrea en busca de agentes adventicios. Después del muestreo, se aumenta el nivel de cloruro de sodio de la cosecha, y después se mezcla. Entonces, la cosecha se divide en alícuotas en tubos de centrífuga, y los restos celulares se eliminan por centrifugación. El sobrenadante se reúne en una bolsa estéril. Después del pretratamiento de una cápsula filtrante de clarificación con agua estéril, el sobrenadante que contiene el virus se bombea a través de la cápsula filtrante a otra bolsa estéril, seguido de agua esterilizada para recuperar el virus restante en la cápsula. La bolsa se mezcla, y el filtrado se almacena durante la noche a 4°C.
Posteriormente, el filtrado se calienta y se ajusta a MgCl2 ~2 mM por adición de 2 volúmenes de MgCl23 mM en agua estéril. El filtrado diluido se mezcla y se trata con una endonucleasa.
Cromatografía en columna de intercambio catiónico
Una columna BPG 400 se rellena con resina de alto rendimiento SP, se higieniza con NaOH 0,5 N, y se equilibra con amortiguador de lavado (PBS pH 7,0) y amortiguador de extracción (NaCl-PBS 1 M pH 7,0) antes de cargar el virus tratado con endonucleasa.
La bolsa de procedimiento que contiene el filtrado tratado con endonucleasa se conecta a la entrada mediante un soldador de tubos, y el virus se carga en la columna. El flujo a través se recoge en una bolsa estéril. La etapa de captura del virus es seguida de un lavado con PBS hasta que la absorbancia UV vuelve a la línea base. Se detiene la bomba, y se conecta a la entrada una bolsa de procedimiento que contiene NaCl-PBS 0,45 M (pH 7,0). El tubo de salida se transfiere a un recipiente estéril en un gabinete de bioseguridad. El amortiguador se bombea a la columna, y cuando la absorbancia UV comienza a aumentar bruscamente, la salida de la columna se transfiere a un nuevo recipiente estéril para recoger el virus eluido. La recolección se detiene después de que la absorbancia UV vuelve a estar cerca de la línea de base. Esta es la fracción de eluato viral purificada. Una bolsa de procedimiento que contiene amortiguador de extracción se conecta a la entrada, y el extremo del tubo de salida se transfiere a una botella estéril para recoger la fracción de extracción. El amortiguador se bombea a través de la columna hasta que la absorbancia UV alcanza un pico y vuelve casi a la línea de base. El eluato recogido se almacena a 4°C durante la noche.
Filtración de flujo tangencial
El sistema de filtración de flujo tangencial, que usa un cartucho de filtro de fibra hueca de tamaño de poro de 0,1 micrómetros, se prepara ensamblando el tubo y el cartucho y esterilizando el sistema en autoclave. El sistema se enjuaga con PBS estéril (pH 7,0), y la fracción de eluato de virus se añade al depósito del sistema y se equilibra mediante recirculación. Después del equilibrio, la bomba de recolección de permeado se enciende y se recolecta el filtrado. El sistema se hace funcionar hasta que el volumen cargado se reduce hasta aproximadamente 500 ml. El retenido en el depósito se diluye con DPBS (pH 7,0) con diafiltración continua a volumen constante, y el producto en el retenido se recupera cuando la conductividad del permeado está dentro del 10% del amortiguador de diafiltración (DPBS pH 7,0).
Formulación, filtración final y envasado
El retenido recuperado se ajusta al 10% del volumen final con glicerol estéril y se mezcla bien antes de filtrarlo a través de una unidad de filtro de disco de 0,45 gm. El producto se dispensa en crioviales etiquetados para almacenamiento a < -65°C.
Ejemplo 2: Prevención de CIPN (Paclitaxel) con vector que comprende NT3
Este ejemplo muestra datos ejemplares para la prevención de CIPN causada por paclitaxel con un vector del VHS de la cepa McKrae que comprende NT3. Se inyectó un vector de VHS-1 defectuoso en la replicación como se describe anteriormente en la almohadilla de las patas de las ratas. Como se muestra en la Figura 1, paclitaxel dio como resultado una disminución significativa en los potenciales de acción de los nervios sensoriales (SNAP). Además, los animales pretratados con un vector de VHS-1 que comprende NT3 estaban protegidos de forma dependiente de la dosis.
Ejemplo 3: Prevención de CIPN (Paclitaxel) con vector que comprende NT3
Este ejemplo muestra datos ejemplares para la prevención de CIPN causada por paclitaxel con un vector del VHS de la cepa McKrae que comprende NT3.
Los taxanos (paclitaxel, docetaxel, cabazitaxel) son un grupo de fármacos antineoplásicos derivados del tejo (Taxus sp.) que se usan comúnmente para el tratamiento de una amplia variedad de cánceres. Los mecanismos por los que actúan los taxanos son distintos de los fármacos derivados del platino. Los taxanos son alcaloides vegetales que estabilizan los microtúbulos al inhibir la despolimerización de la tubulina, lo que da como resultado microtúbulos grandes y disfuncionales. Los microtúbulos son esenciales para la división celular, por lo que los taxanos son potentes inhibidores mitóticos. La vincristina, otro fármaco neoplásico derivado de un alcaloide vegetal, inhibe la mitosis al impedir el ensamblaje de los microtúbulos. Además de su papel en la mitosis, los microtúbulos también son necesarios para el transporte axonal en las neuronas, por lo que los agentes quimioterapéuticos, tales como los taxanos, que interfieren con el funcionamiento adecuado de los microtúbulos, causan neuropatía al interferir con el transporte axonal normal.
Cuatro grupos de animales se trataron con un vector de VHS-1 defectuoso en la replicación, o con control de vehículo, antes de recibir paclitaxel. La administración del vector o del control de vehículo se inyectó en la almohadilla de las patas de las ratas. A los animales tratados con un vector de VHS-1 defectuoso en la replicación se les administró un vector de la cepa KOS que comprende NT3, un vector de la cepa McKrae que comprende NT3, o un vector de la cepa McKrae que comprende proteína verde fluorescente (GFP). Como se muestra en la Figura 2, basado en el análisis del SNAP, el vector de la cepa McKrae que comprende NT3 (NET-NT3) protegió contra CIPN más eficazmente que el vector de la cepa KOS que comprende NT3.
En otro estudio, a los animales se les administró un vector de VHS-1 defectuoso en la replicación que comprende NT3 0 GFP, y después se les administraron dosis múltiples de paclitaxel o vehículo. Como se muestra en la Figura 3, el vector que comprende NT3 fue capaz de proteger frente a múltiples dosis de paclitaxel, como lo demuestra el porcentaje de los SNAP con respecto al control.
En otro estudio, a ratones BALB/c hembras se les inyectó por vía subcutánea en la superficie plantar de ambas patas traseras 25 gl que contenían 1x1010 PFU/ml de un vector NT3 o un vector GFP. Tres días después de la inoculación del vector, los ratones comenzaron el tratamiento con paclitaxel que consistía en 30 mg/kg de paclitaxel por vía intraperitoneal (i.p.) tres veces por semana durante dos semanas (lunes, miércoles y viernes, lunes, miércoles y viernes). En los días 3, 10, 24, 41,61 y 116 después de la última dosis de paclitaxel, la neuropatía se evaluó mediante NCS.
Como se muestra en la Figura 4, los ratones tratados con paclitaxel desarrollaron una neuropatía periférica caracterizada por una reducción del 20-35% en el potencial de amplitud del nervio sensorial evocado (SNAP), y una reducción del 15% en la velocidad de conducción (SNCV) desde los días 3-61, en comparación con los ratones de control no tratados. Esta reducción en los SNAP es similar a la encontrada en ratas tratadas con cisplatino. Los ratones inyectados con el vector NT3, pero no los que recibieron el vector GFP, estaban protegidos contra el desarrollo de neuropatía periférica, y tenían SNAP y SNCV que no se distinguían de los ratones del control no tratados. Esta protección se prolongó durante todo el transcurso del estudio.
Ejemplo 4: Estudio de reducción de dosis para la protección contra la neuropatía periférica inducida por paclitaxel
Este ejemplo muestra datos ejemplares para determinar la dosis eficaz más baja de un vector de VHS-1 de la cepa McKrae defectuoso en la replicación para que proteja contra la neuropatía periférica inducida por paclitaxel.
A cinco grupos de ratones (N=6) se les inyectó un vector de VHS-1 de la cepa McKrae defectuoso en la replicación en dosis que oscilaban de 5x104 a 5x108 PFU totales. Tres días después, los ratones comenzaron los tratamientos con paclitaxel. A los 24 días posteriores al paclitaxel, se realizó un análisis de conducción nerviosa en estos ratones, y los resultados se compararon con un grupo de ratones que recibieron un vector de GFP (5x108 PFU totales) y ratones de control intactos que recibieron inyecciones de vehículo.
Como se muestra en la Figura 5, ratones pretratados con las dos dosis más altas del vector de NT3, 5x108 y 5x107 PFU totales, estaban completamente protegidos contra el desarrollo de neuropatía periférica inducida por paclitaxel, según se mide por los potenciales de acción del nervio sensorial (SNAP). Los ratones pretratados con 5x106 PFU totales del vector de NT3 tuvieron un valor del SNAP promedio más bajo que las dos dosis más altas, aunque no fue significativamente diferente desde el punto de vista estadístico del grupo del vehículo, lo que sugiere que esta dosis fue parcialmente protectora. Las dos dosis más bajas del vector de NT3 no proporcionaron protección. Estos datos sugieren que 5x106 PFU totales fue la dosis eficaz más baja del vector de NT3 para la prevención de la neuropatía periférica inducida por paclitaxel en este paradigma.
Ejemplo 5: Análisis de la expresión de la carga útil después del tratamiento con paclitaxel
Este ejemplo muestra datos ejemplares para la expresión de transcritos con respecto al número de genomas de HSV-1 tras la administración de un vector de VHS-1 defectuoso en la replicación y paclitaxel. Como se muestra en la Figura 6, los transcritos de NT-3 en los GRD fueron detectables en seis de los ocho animales analizados 131 días después de la administración de un vector del VHS que expresaba NT3. Aquellos animales con niveles de transcritos de NT3 por debajo del nivel de detección se correlacionaron con un número total bajo de genomas de HSV-1 por GRD L4-L6. Además, como se muestra en la Figura 7, cuando los datos se analizaron como transcritos de NT3 por genoma en lugar de número total de transcritos de NT3, seis de los ocho animales estaban en el intervalo de 0 a 9,8 transcritos por genoma.
También se realizó el mismo experimento con animales a los que se les administró paclitaxel y un vector de VHS-1 defectuoso en la replicación que comprende GFP. Como se muestra en la Figura 8, los transcritos de GFP fueron detectables en tres de los siete animales analizados 131 días después de la administración del vector que expresa GFP. Los niveles de transcritos de GFP fueron aproximadamente 10 veces más bajos que los observados en los animales a los que se administró el vector de NT3. Además, como se muestra en la Figura 9, cuando los datos se analizaron como transcritos de GFP por genoma en lugar del número total de transcritos de GFP, tres de los siete animales estaban en el intervalo de 0 a 1,0 transcritos por genoma (en contraposición a 0 a 9,8 para animales a los que se administró el vector de NT3.
Ejemplo 6: Análisis de la expresión de la carga útil después del tratamiento con vincristina
Este ejemplo muestra datos ejemplares para la expresión de transcritos con respecto al número de genomas de HSV-1 tras la administración de un vector de VHS-1 defectuoso en la replicación y vincristina. Como se muestra en laFigura 10, los transcritos de NT-3 en los GRD fueron detectables en los ocho animales analizados 77 días después de la administración del vector del VHS que expresa NT3. Adicionalmente, como se muestra en la Figura 11, cuando los datos se analizaron como transcritos de NT3 por genoma en lugar del número total de transcritos de NT3, los ocho animales estaban en el intervalo de 2 a 32 transcritos por genoma.
También se realizó el mismo experimento con animales a los que se les administró vincristina y un vector de VHS-1 defectuoso en la replicación que comprende GFP. Como se muestra en la Figura 12, los transcritos de GFP fueron detectables en seis de los ocho animales analizados 77 días después de la administración del vector que expresa GFP. Los niveles de transcritos de GFP fueron significativamente más bajos que los observados en los animales a los que se administró el vector de NT3. Adicionalmente, como se muestra en la Figura 13, cuando los datos se analizaron como transcritos de GFP por genoma en lugar del número total de transcritos de GFP, tres de los siete animales estaban en el intervalo de 0 a 1,8 transcritos por genoma (a diferencia de 2 a 32 para los animales a los que se les administró el vector de NT3.
Ejemplo 7: Prevención de CIPN (oxaliplatino) con vector que comprende NT3
Este ejemplo muestra datos ejemplares para la prevención de CIPN causada por oxaliplatino con un vector del VHS que comprende NT3.
Se cree que la citotoxicidad del oxaliplatino, al igual que otros compuestos de platino (cisplatino, carboplatino), se debe a la inhibición de la síntesis de ADN en las células. En particular, el oxaliplatino forma reticulaciones tanto inter- como intracatenarias en el ADN, lo que impide la replicación y transcripción del ADN, provocando la muerte celular. El oxaliplatino se usa para el tratamiento del cáncer colorrectal, generalmente junto con ácido folínico y 5-fluorouracilo, en una combinación conocida como FOLFOX. Con el uso de oxaliplatino puede aparecer tanto una neuropatía aguda como una persistente. La neuropatía reversible aguda (por ejemplo, parestesia transitoria aguda, disestesia, e hipoestesia en manos, pies, área perioral, o garganta, espasmo mandibular, sensación anormal de la lengua, disartria, dolor ocular, sensación de presión en el pecho) puede ocurrir en cuestión de horas o 1-2 días después de la administración de oxaliplatino, y generalmente se resuelve dentro de los 14 días; con frecuencia reaparece con la administración adicional del fármaco. Una neuropatía sensorial persistente (por ejemplo, parestesias, disestesias, hipoestesias, alteración de la propiocepción) puede ocurrir sin ningún evento neuropático agudo previo, y generalmente persiste durante semanas o meses después de la administración de oxaliplatino.
Ratones BALB/c hembras se inyectaron por vía subcutánea en la superficie plantar de ambas patas traseras con 25 pl que contenían 1x1010 PFU/ml de un vector de NT3 o un vector de GFP. Tres días después de la inoculación del vector, los ratones comenzaron el tratamiento con oxaliplatino, que consistía en 3,5 mg/kg de oxaliplatino (i.v.) cada dos semanas durante seis semanas. En los días 3, 17, 35, 41,56 y 111 después de la última dosis de oxaliplatino, la neuropatía se evaluó mediante NCS.
Como se muestra en la Figura 14, los ratones tratados con oxaliplatino desarrollaron una neuropatía periférica caracterizada por una reducción del 20-30% en el potencial de amplitud del nervio sensorial evocado (SNAP) y una reducción del 10-20% en la velocidad de conducción (SNCV) desde los días 3-111 en comparación con los ratones de control no tratados. Esta reducción de los SNAP es similar a la encontrada en ratones tratados con paclitaxel. Los ratones inyectados con el vector de NT3, pero no los que recibieron el vector de GFP, estaban protegidos contra el desarrollo de neuropatía periférica, y tenían SNAP y SNCV indistinguibles de los ratones de control no tratados. Esta protección se prolongó durante todo el transcurso del estudio.
Ejemplo 8: Prevención de CIPN (bortezomib) con vector que comprende NT3
Este ejemplo muestra datos ejemplares para la prevención de CIPN causada por bortezomib con un vector del VHS que comprende NT3.
Bortezomib es un fármaco aprobado por la FDA en una clase de agentes contra el cáncer conocidos como inhibidores del proteasoma. La citotoxicidad de estos compuestos probablemente se deba a la interrupción de rutas de señalización celular críticas, tales como la regulación del ciclo celular y la transcripción de genes, lo que conduce a la detención del ciclo celular y la apoptosis. Bortezomib generalmente se usa en el tratamiento del mieloma múltiple y el linfoma de células del manto recurrente, aunque también se usa para tumores sólidos. Al igual que los taxanos y los platinos, el principal efecto secundario limitante de la dosis clínicamente significativa es la neuropatía periférica, que se caracteriza por entumecimiento y hormigueo que se presenta en un patrón distal de calcetín y guante. El dolor neuropático severo se desarrolla con frecuencia después del primer ciclo de tratamiento.
Ratones BALB/c hembras se inyectaron por vía subcutánea en la superficie plantar de ambas patas traseras con 25 pl que contenían 1x1010 PFU/ml de un vector de NT3 o un vector de GFP. Tres días después de la inoculación del vector, los ratones comenzaron el tratamiento con bortezomib, que consistía en 0,8 mg/kg de bortezomib (en etanol/tween80/disolución salina en relación 5%/5%/90%) (i.v.) cada dos semanas durante cuatro semanas. En los días 12 y 26 después de la dosis final de bortezomib, la neuropatía se evaluó mediante NCS.
Como se muestra en la Figura 15, los ratones tratados con bortezomib desarrollaron una neuropatía periférica caracterizada por una reducción en el potencial de amplitud del nervio sensorial evocado (SNAP) y una reducción en la velocidad de conducción del nervio sensorial (SNCV) en comparación con los ratones de control no tratados. Una sola aplicación de PGN-503 antes de la dosificación de bortezomib redujo la gravedad y la duración de la neuropatía periférica.
Ejemplo 9: ensayo clínico del vector de la cepa McKrae del HSV que expresa NT3 (NET-NT3)
Se realiza un ensayo clínico de Fase I/II, aleatorizado, doblemente enmascarado, controlado con placebo, de NET-NT3. NET-NT3 es un vector del HSV defectuoso en la replicación, que expresa NT-3 humana, para la prevención o el tratamiento de la neuropatía periférica inducida por quimioterapia (CIPN). La población para el ensayo clínico propuesto está compuesta por pacientes con cáncer de mama que están citadas para recibir 12 dosis semanales de tratamiento adyuvante con paclitaxel.
El ensayo clínico incluye un experimento de dosis creciente, aleatorizado, doblemente enmascarado, controlado con placebo, que evalúa la seguridad y la eficacia de la administración intradérmica de NET-NT3 para prevenir la neuropatía periférica inducida por quimioterapia en pacientes tratados con paclitaxel en el entorno adyuvante para el cáncer de mama.
Dentro de los 28 días posteriores a una visita de cribado, los sujetos que cumplan con todos los criterios de inclusión y exclusión serán citados para recibir NET-NT3 o placebo, administrados como una serie de aproximadamente 10 inyecciones intradérmicas en una pierna debajo de la rodilla y 10 inyecciones debajo del codo y en la dorso de la mano para el estudio de Fase I/II en el Día 0. La dosificación de NET-NT3 se programará entre 3 y 14 días antes del inicio de la quimioterapia. Después de 2 horas de observación en el centro de investigación clínica tras la dosificación, después de las evaluaciones posteriores a la dosificación del Día 0, los sujetos serán dados de alta. Los sujetos que reciben paclitaxel adyuvante (semanalmente durante 12 semanas) recibirán un seguimiento cada dos semanas durante 16 semanas, y entonces una visita de seguimiento de seguridad a las 28 semanas después de la dosificación.
Los objetivos principales incluyen:
(1) Evaluación de la seguridad de NET-NT3 administrado por vía intradérmica en tres cohortes de dosis crecientes, 2x10678, 2x109 y 2x1010 unidades formadoras de placa (PFU), en sujetos programados para recibir paclitaxel adyuvante para cáncer de mama; y
(2) Determinación de la eficacia de la prevención de CIPN de NET-NT3 frente a placebo en sujetos programados para recibir paclitaxel adyuvante para el cáncer de mama. Las medidas de la eficacia incluirán el potencial de acción del nervio sensorial y las velocidades de conducción nerviosa, la puntuación clínica total de neuropatía (TNSc), y EORTC-CIPN20.
Una variable principal de eficacia es un cambio en el potencial de acción del nervio sensorial (sural y cubital) entre el inicio y el final de la visita de tratamiento adyuvante con paclitaxel en la semana 12.
Los objetivos secundarios incluyen:
(1) Evaluación de la mejora en las puntuaciones de calidad de vida general y relacionada con la enfermedad (NCI-CTc y ECOG) de NET-NT3 frente a placebo; y
(2) Evaluación de la dosis total de paclitaxel recibida en sujetos que recibieron NET-NT3 frente a placebo.
Las variables secundarias de eficacia incluyen:
(1) EORTC CIPN20 entre el inicio de cada visita quincenal hasta la semana 12;
(2) Cambios en el EORTC CIPN20 promedio en las 4 semanas posteriores a la visita de dosificación de quimioterapia. Paclitaxel: 16 semanas;
(3) Cambios en el EORTC CIPN20 promedio en la visita de seguimiento de seguridad. Paclitaxel: 28 semanas;
(4) Diferencias en el desarrollo promedio de neuropatía, medido por la puntuación total de neuropatía (TNS) desde el inicio en comparación con la semana 12 para sujetos con paclitaxel;
(5) Cambio en la velocidad de conducción de los nervios sural y cubital entre el inicio y el final del tratamiento de quimioterapia en la semana 12 para sujetos con paclitaxel;
(6) Cambios en la TNS promedio en las 4 semanas posteriores a la visita de dosificación de quimioterapia. Paclitaxel: 16 semanas;
(7) Cambios en la TNS promedio en la visita de seguimiento de seguridad. Paclitaxel: 28 semanas;
(8) Cambios en los Criterios Comunes de Toxicidad del Instituto Nacional del Cáncer (NCI-CTC) en sujetos que recibieron NET-NT3 frente a placebo en cada visita;
(9) Puntuaciones del Grupo Oncológico Cooperativo del Este (ECOG) en sujetos que recibieron NET-NT3 frente a placebo en cada visita; y
(10) Dosis total acumulada de quimioterapia para pacientes tratados con paclitaxel entre el Día 0 y la visita de la semana 16.
Las variables de seguridad incluyen:
(1) Examen físico, incluyendo un examen neurológico (sensaciones intensas, cálidas, y vibratorias, y reflejos tendinosos profundos);
(2) Eventos adversos (AE);
(3) Eventos Adversos Graves (SAE);
(4) Signos vitales; y
(5) Resultados de laboratorio clínico.
Dosificación y administración: NET-NT3 se administrará en dosis de 2x108 PFU, 2x109 PFU y 2x1010 PFU (dosis total por sujeto) en 2,0 mililitros. El fármaco se inyectará por vía intradérmica en aproximadamente 20 sitios formados por 10 sitios distribuidos sobre la superficie de la piel debajo de una rodilla y 10 sitios en el dorso de la mano ipsolateral. Si las tres primeras dosis muestran un nivel similar de eficacia, se añadirá una cuarta cohorte de dosis (2x107 PFU) con el mismo número de pacientes y rendimiento del estudio.
El estudio está diseñado para dosificar a tres sujetos en cada nivel de dosis a fin de evaluar la seguridad. Después de que se haya recopilado un mes de datos de seguridad para cada paciente dentro de la cohorte de dosis, se determinará si el estudio debe avanzar al siguiente nivel de dosis. Una vez que se haya aprobado un nivel de dosis, se reclutarán 23 sujetos adicionales a ese nivel de dosis. De los 23 sujetos, a 17 se les administrará la misma dosis que a la cohorte de seguridad, y seis sujetos recibirán placebo. Este régimen de dosificación se completará para los tres niveles de dosis, a menos que no se apruebe el avance de un nivel de dosis.
El orden de dosificación comenzará con tres sujetos en la cohorte de 2x108, que comprenderá la primera dosis y avanzará hasta se alcance la dosis máxima tolerada (MTD) o el nivel de dosis más alto (2x1010 PFU). Habrá un período de revisión de un mes después de que se llene cada cohorte, a fin de evaluar la seguridad antes de que se solicite a un DSMB que apruebe el aumento al siguiente nivel de dosis. Para confirmar que la dosis escogida para la Fase II es la dosis eficaz mínima, se dosificará a 17 sujetos adicionales en cada nivel de dosificación después de que se complete la revisión de seguridad de un mes para esa dosis. Se dará prioridad para el tratamiento en el estudio a los tres sujetos en cada grupo de dosis antes de que se administren las dosis a los 17 sujetos adicionales. Suponiendo que no se produzca una DLT, la dosificación de las tres cohortes de seguridad de sujetos y las cohortes de expansión se realizará de la siguiente manera:
1. Al comienzo del estudio, se dosificará a tres sujetos con 2x108 PFU, y no se administrará ningún otro tratamiento hasta que esos tres sujetos hayan completado un mes después de la dosificación.
2. Una vez que el DSMB haya revisado los datos de seguridad y haya dado su aprobación para pasar a la siguiente dosis, se dosificará a tres sujetos con 2x109 PFU. Mientras que el período de seguimiento de un mes para la cohorte de 2x109 PFU está en marcha, se tratarán sujetos adicionales con 2x108 PFU hasta que el DSMB haya revisado los datos de la cohorte de 2x109 PFU.
3. Una vez que el DSMB haya dado la aprobación para avanzar, se dosificará a tres sujetos con 2x1010 PFU para la cohorte final. Mientras que el período de seguimiento de un mes para 2x1010 PFU está en marcha, se tratarán sujetos adicionales con 2x108 PFU hasta que se llene la cohorte de expansión, y entonces los sujetos adicionales se tratarán con 2x109 hasta que se llene esa cohorte.
4. Después de que el período de seguimiento de seguridad para los tres sujetos de la cohorte de 2x1010 PFU se complete, se reclutarán cualesquiera sujetos restantes que se necesiten para completar el grupo de expansión de 17 sujetos para el nivel de dosis de 2x108, 2x109, o 2x1010 PFU.
En el caso de que todas las dosis sean igualmente eficaces para prevenir la CIPN, se añadirá una cuarta cohorte de dosis de 2x107 PFU, y el rendimiento del estudio para la cuarta cohorte será el mismo que el de las tres cohortes anteriores.
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Reglas para el aumento de escala de la dosis en tres sujetos de seguridad:
Habrá un período de observación mínimo de un mes desde el final de la dosificación en una cohorte de dosis antes del inicio de la dosificación en una cohorte posterior. La dosificación avanzará hasta que se alcance la dosis máxima tolerada (MTD) o se alcance la dosis más alta. La MTD se define como la dosis más alta teniendo < 1/3 de los sujetos tratados con NET-NT3 una toxicidad limitante de la dosis (DLT). Una DLT se define como un evento adverso de grado 2 o superior, relacionado con el tratamiento con NET-NT3, activo probable o definido. Con respecto a los tres sujetos de cada cohorte que serán evaluados para permitir el avance a la siguiente dosis más alta, se aplicarán las siguientes reglas.
El aumento de escala de la dosis a la siguiente dosis más alta, la reducción a la dosis más baja anterior, o los ensayos adicionales a la dosis actual, se basarán en las siguientes reglas:
1. Si 0 de los 3 sujetos tratados con NET-NT3 en la cohorte tienen una DLT, aumente a la siguiente cohorte de dosis más alta de 3 sujetos activos con NET-NT3.
2. Si 1 o más de los 3 sujetos tienen DLT, enrole a 3 sujetos más con la misma dosis:
a. Si < 2 de los 6 sujetos tratados con NET-NT3 en la cohorte de dosificación tienen DLT, aumente a la siguiente dosis más alta;
b. Si > 2 de los 6 sujetos tratados con NET-NT3 tienen DLT, vuelva a la dosis anterior;
3. Si se indica la reducción de la dosis al nivel de dosis más bajo, se suspenderá el estudio y se presentará un nuevo protocolo para evaluar un intervalo de dosis más bajo.
Los sujetos que abandonen antes de la visita del Día 28 por motivos distintos a la toxicidad serán reemplazados.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una variante de la cepa McKrae del virus del herpes simple (VHS)
a) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar ICP4, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; o
b) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 2, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3; o
c) cuyo genoma contiene una alteración tal que la variante no logra expresar una proteína funcional caracterizada por SEQ ID NO: 16, en la que el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3.
2. Una composición que comprende un vector que comprende la variante de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. Una composición para uso como medicamento, que comprende el vector como se define en la reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. La composición de la reivindicación 2, para uso en el tratamiento de la neuropatía.
5. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en la que el vector comprende además un promotor ligado operativamente a una secuencia que codifica la neurotrofina 3.
6. La composición para uso de la reivindicación 5, en la que
a) el vector comprende además un potenciador en dirección 5’ del promotor; o
b) el promotor es un promotor del citomegalovirus humano (HCMV); o
c) el promotor es un promotor del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP).
7. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6(a), en la que el promotor es específico de tejido o específico de neurona.
8. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en la que el vector comprende (a) un potenciador de HCMV y un promotor de CGRP, o (b) una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH).
9. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en la que el vehículo es un poliol o glicerol.
10. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3-9, en la que
a) la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3 tiene codones optimizados; y/o b) la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3 es idéntica en un 90% a SEQ ID NO: 23; y/o
c) la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neurotrofina 3 es idéntica en un 90% a SEQ ID NO: 25.
11. La composición de la reivindicación 2, para uso en la inhibición del desarrollo o progresión de la neuropatía en un sujeto.
12. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, en la que
a) la neuropatía es una neuropatía periférica; y/o
b) la neuropatía es iatrogénica; y/o
c) la neuropatía es consecuencia de un tratamiento oncológico; y/o
d) la neuropatía es consecuencia de la quimioterapia.
13. La composición para uso según la reivindicación 12(d), en la que
a) la quimioterapia comprende un agente quimioterapéutico a base de platino; o
b) la quimioterapia comprende un agente quimioterapéutico de taxano o derivado del taxano; o
c) la quimioterapia comprende un agente quimioterapéutico de tipo alcaloide vegetal; opcionalmente en la que el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en vincristina, vinblastina, vinorelbina, y combinaciones de los mismos; o
d) la quimioterapia comprende un agente quimioterapéutico inhibidor del proteasoma; opcionalmente en la que el agente quimioterapéutico es bortezomib; o
e) la quimioterapia comprende un agente quimioterapéutico antimitótico; o
f) el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en monometil auristatina E (MMAE), brentuximab vedotina, glembatumumab, AGS67E, y combinaciones de los mismos; o
g) la quimioterapia comprende eribulina o talidomida.
14. La composición para uso según la reivindicación 13(a), en la que el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, satraplatino, picoplatino, nedaplatino, triplatino, lipoplatino, y combinaciones de los mismos; opcionalmente en la que el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en paclitaxel, docetaxel, cabazitaxel, y combinaciones de los mismos.
15. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 4-14, en la que
a) el vector se administra por contacto con la piel de un sujeto o se administra por vía intradérmica; y/o b) el vector se administra a una o más manos del sujeto; y/o
c) el vector se administra a uno o más pies del sujeto; y/o
d) se ha diagnosticado previamente que el sujeto tiene una neuropatía existente, por ejemplo en el que la neuropatía existente comprende uno o más síntomas seleccionados de dolor, entumecimiento, hormigueo, ardor, hiperalgesia, alodinia y propiocepción alterada.
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