JP2022119955A - 血管新生阻害剤としてのｃ型レクチンであるレベセチン - Google Patents

Abstract

【課題】網膜血管新生又は脈絡膜血管新生疾患の治療のための医薬組成物を提供する。【解決手段】医薬組成物は、レベセチン及びその機能的変異体から選択されるタンパク質を含み、該タンパク質は、特定のアミノ酸配列を含む第１サブユニットと、更なる特定のアミノ酸配列を含む第２サブユニットとを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、医薬の分野に関し、特に血管新生に関する疾患の治療、好ましくは網膜血管新生に関する眼疾患の治療に関する。

加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は５５歳以上の人々が失明を引き起こす原因となり、糖尿病網膜症（ＤＲ）、網膜静脈閉塞症及び未熟児網膜症等の静脈うっ血性網膜症は、５５歳未満の人々が失明を引き起こす原因となる（Friedman DS et al. 2004; Kempen JH et al. 2004; Klein R et al. 2004）。増殖型のこれらの症状（ｗｅｔ ＡＭＤ及び増殖性糖尿病
網膜症）は、急性且つ不可逆性の失明を引き起こす。ＡＭＤにおいて、新たな血管は、主に血管の脈絡膜床に由来し、網膜下腔内又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）の下で成長し、一方、増殖型ＤＲ（ＰＤＲ）において、神経虚血は網膜血管からの血管新生を引き起こす。

血管新生（Neoangiogenesis）は、血管新生（neovascularization）とも呼ばれ、既存
の血管から毛細管を発芽し、新生血管を構成する基本的なプロセスである。それは、脈絡形成（vasculogenesis）／血管新生（angiogenesis）と比較して、循環系の胚発生の際に起こる又は成体の血管内皮前駆細胞で起こる血管形成の別のプロセスである。

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、網膜及び脈絡膜血管新生の主要なメディエータである（D'AmoreP.A. et al. 1994）。抗ＶＥＧＦ抗体又は可溶型ＶＥＧＦＲ１の眼内注射は
、ｗｅｔ ＡＭＤにおける脈絡膜血管新生を有効に阻害する。しかしながら、未治療患者の１０％は抗ＶＥＧＦに反応せず（Brown, D. M. et al. 2006; Rosenfeld P.J. et al. 2006）、抗ＶＥＧＦ反応者の２～１０％は、時間と共に耐性となる（Forooghian, F. et al. 2009; Eghoj, M. S. et al. 2012）。抗ＶＥＧＦ療法も、糖尿病黄斑浮腫の第一選択治療である。これに対して、網膜血管新生（ＲＮＶ）により特徴付けられるＰＤＲは、予防的な汎網膜光凝固（ＰＲＰ）によりほぼ治療される（Martinez-Zapata, M. J. et al. 2014）。抗ＶＥＧＦは、現在、ＰＲＰの代替法としてＰＤＲの治療のために米国で承認されている。継続中の研究は、この新規の適用において自発的に獲得された耐性の割合を決定するであろう。まとめると、これらの臨床データは、ＶＥＧＦ経路を主に標的としない追加の抗血管新生療法の必要性を支持する。

さらに、網膜血管新生は、急性の失明の原因となる滲出及び出血に関与するため、過剰な血管新生及び血管漏出を防ぐための別の経路の同定が大きな治療的関心である。

本発明者らは、ここでレベセチンの予測できない効果を明らかにした。実際に、彼らは、レベセチンが脈絡膜又は網膜の血管新生の拡大を有効に抑制できることを証明し、従って血管新生を阻害する新規の方法を提供する。

従って、本発明の第１の態様は、血管新生疾患の治療に用いるためのレベセチン、並びにその機能的変異体及び断片から選択されたタンパク質に関する。

特に、このタンパク質は、配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列、若しくは配
列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ
酸配列からなる若しくは含む第１サブユニットと、配列番号３若しくは配列番号４のアミ
ノ酸配列、若しくは配列番号３若しくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７５％の
同一性を有するアミノ酸配列からなる若しくは含む第２サブユニットとを含む、レベセチ
ン又はレベセチンの機能的変異体であってもよい。該レベセチンの機能的変異体は、配列
番号１若しくは２の配列に由来する配列であって１～３０のアミノ酸保存的置換を含む配
列からなる若しくは含む第１サブユニット、及び／又は配列番号３若しくは４の配列に由
来する配列であって１～３０のアミノ酸保存的置換を含む配列からなる若しくは含む第２
サブユニットを含んでいてもよい。好ましくは、１）α鎖とβ鎖との間の鎖内又は鎖間ジ
スルフィド架橋に関連するシステイン残基、すなわち配列番号１のＣｙｓ２７、Ｃｙｓ３
８、Ｃｙｓ５５、Ｃｙｓ１０６、Ｃｙｓ１２９、Ｃｙｓ１４６及びＣｙｓ１５４、並びに
配列番号３のＣｙｓ２７、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ５５、Ｃｙｓ１００、Ｃｙｓ１２１、Ｃｙ
ｓ１３６及びＣｙｓ１４４；及び／又は、２）ＨＣＹドメインの残基、すなわち配列番号
１のＨｉｓ３７、Ｃｙｓ３８、Ｔｙｒ３９、及び配列番号３のＨｉｓ３７、Ｃｙｓ３８、
Ｔｙｒ３９；及び／又は３）ＤＡＥＫドメインの残基、すなわち配列番号１のＡｓｐ５０
、Ａｌａ５１、Ｇｌｕ５２、ｌｙｓ５３、及び配列番号３のＡｓｐ５０、Ａｌａ５１、Ｇ
ｌｕ５２、ｌｙｓ５３；及び／又は４）ＷＩＧＬモチーフの残基、すなわち配列番号１の
Ｔｒｐ９４～Ｌｅｕ９７及び配列番号３のＴｒｐ９０～Ｌｅｕ９３に対応する残基が、レ
ベセチンの機能的変異体に保存されている。

好ましくは、本発明に従って用いられるタンパク質は、M. Lebetinaの毒から単離され
る又は組換えタンパク質である。

第２の態様において、本発明は、血管新生疾患の治療に用いるための、本発明に従って用いられるタンパク質をコードする核酸配列、又は該核酸を含む発現ベクターに関する。

第３の態様において、本発明は、本発明に従って用いられるタンパク質、核酸又はベクターと、薬学的賦形剤とを含む医薬組成物に関する。また、本発明は、血管新生疾患の治療に用いるための上記医薬組成物に関する。好ましくは、上記医薬組成物は、少なくとも１つの追加の有効成分、好ましくは１つの血管新生阻害剤、より好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤をさらに含む。

特定の実施形態において、上記医薬組成物は、少なくとも１つの血管新生阻害剤、好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤と組み合わせて用いられ得る。

好ましくは、本発明の医薬組成物を用いて治療される対象は、血管新生阻害剤、好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤による治療に反応しない又は耐性となった対象である。

血管新生疾患は、眼の血管新生疾患及び血管新生要素を含む癌からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、血管新生疾患は、眼の血管新生疾患、好ましくは加齢黄斑変性、糖尿病網膜虚血又は増殖性糖尿病網膜症等の糖尿病網膜変性症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生及び角膜炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、血管新生疾患は、血管新生要素を含む癌、好ましくは肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌及び脳癌からなる群から選択される。

ＬＣＴは大動脈及び脈絡膜外植片からの血管発芽を阻害する。（Ａ、Ｃ）大動脈及び内皮での発芽の代表的な顕微鏡写真である。（Ｂ）コントロール群及びＬＣＴ（３０ｎＭ、３００ｎＭ、１．５μＭ）群におけるＰ４ルイス仔ラット大動脈リングからの血管発芽の測定結果である（一群当たりｎ＝４、^＊ｐ０．０５；ダネットのポストテスト後に一元配置分散分析；参照はＣＴＬと示し、３つの独立した試験の代表を示す。）。（Ｄ）コントロール群及びＬＣＴ（３０ｎＭ、３００ｎＭ、１．５μＭ）群における３週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊ雄マウスの脈絡膜外植片からの血管発芽の測定結果である（一群当たりｎ≧５、^＊ｐ＜０．０５；ダネットのポストテスト後に一元配置分散分析；参照はＣＴＬと示し、３つの独立した試験の代表を示す。）。Ａ及びＣのスケールバーは２００μｍである。 ＬＣＴの硝子体注射は視覚機能を変更しない。（Ａ）１μｌのＰＢＳ又はＬＣＴ（５００μＭ）の硝子体注射の７日後における網膜の代表的なＳＤ－ＯＣＴ像である。（Ｂ）５００μｍの視神経における全網膜、ＯＮＬ、ＩＮＬ及びＯＳの厚さの定量である。一群当たりｎ＝４つの眼である。（Ｃ）０．３ｃｄｓ／ｍ^２におけるＣＴＬ、ＰＢＳ及びＬＣＴ群の暗順応ＥＲＧ記録からの代表的な網膜電図のトレースである。（Ｄ）暗所で記録された異なる刺激強度（０．００３ｃｄ．ｓ／ｍ^２；０．０３ｃｄ．ｓ／ｍ^２；０．３ｃｄ．ｓ／ｍ^２；３ｃｄ．ｓ／ｍ^２；１０ｃｄ．ｓ／ｍ^２）におけるａ及びｂ波の振幅である。（Ｅ）明順応動物の１０ｃｄ．ｓ／ｍ^２の光強度における明順応振幅である。（Ｆ）１ｃｄｓ／ｍ^２の強度で１０Ｈｚの光周波数におけるＥＲＧフリッカー記録からの代表的な網膜電図のトレースである。（Ｇ）１０及び２０Ｈｚの光周波数におけるフリッカー反応振幅であり、各ＥＧＲ記録で一群当たりｎ＝１０個の眼とした。ＩＰＬは内網状層、ＯＮＬ：外網状層、ＯＬＭ：外境界膜である。Ａのスケールバーは１００μｍである。 ＬＣＴの硝子体注射は血管恒常性を変更しない。（Ａ）ＰＢＳ（１μｌ）又はＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）の硝子体注射から７日後に、ＦＩＴＣ結合ＢＳ－１レクチン（緑色）、コラーゲン－ＩＶ（赤色）及び（Ｂ）ＧＦＡＰ（緑色）で免疫染色されたＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスの網膜のフラットマウントの顕微鏡写真である。（Ｃ）ＰＢＳ（１μｌ）又はＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）の硝子体注射から７日後に、内網状組織及び外網状組織においてコラーゲン－ＩＶ（赤色）及びＩｂａ１（緑色）抗体で免疫染色されたＣＸＣＲ１^＋／^ＧＦＰマウスからの網膜のフラットマウントの顕微鏡写真である。（Ｄ）ＰＢＳ（１μｌ）又はＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）の硝子体注射から７日後に、ＴＲＩＴＣ結合ファロイジン（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）で共免疫染色されたＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスからの脈絡膜のフラットマウントである。Ａ、Ｂ及びＣにおけるスケールバーは５０μｍであり、Ｄにおけるスケールバーは１００μｍである。 ＬＣＴはＣＮＶ病変に結合する。（Ａ）レーザによる脈絡膜病変の誘導後０日、１日、３日及び７日に回収されたＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊの脈絡膜のＧＡＰＤＨｍＲＮＡで正規化されたインテグリンサブユニットｍＲＮＡ（αｖ、α５、β３、β５）の定量化ＲＴ－ＰＣＴの結果であり、一群当たりｎ＝８つの眼である。（Ｂ）４日目にAlexa Fluor 647 色素に共有結合的にコンジュゲートされたウシ血清アルブミン（６４７－ＢＳＡ）、ＬＣＴ（６４７－ＬＣＴ）又はアフリベルセプト（６４７－アフリベルセプト）を硝子体注射された後、脈絡膜フラットマウントにおいてレーザにより誘導されたＣＮＶ病変の７日目の顕微鏡写真である。すべての脈絡膜は、ＣＤ１０２抗体（緑色）で共染色された。Ｂ～Ｅにおけるスケールバーは５０μｍである。 ＬＣＴは、レーザ誘導性の脈絡膜血管新生を阻害する。（Ａ）レーザ、並びにＰＢＳ（１μｌ）、ＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）及びアフリベルセプト（１μｌ、２５μＭ）の硝子体注射の後７日目の脈絡膜病変の代表的なＳＤ－ＯＣＴ像及び病変体積の定量である（一群当たりのレーザ照射はそれぞれｎ＝２６、３５及び１６である。^＊ｐ＜０．０５；ダネットのポストテスト後に一元配置分散分析；それぞれ２つの独立した試験を行った。）。病変体積は、以下の式（４／３π^＊ａ^＊ｂ^２）／２を用いて推定され、ａは極半径（縦軸）であり、ｂは長半径（横軸）である。（Ｂ）ＣＤ１０２（緑色）、Ｉｂａ（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）で染色されたＰＢＳ（１μｌ）、ＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）及びアフリベルセプト（１μｌ、２５μＭ）の脈絡膜フラットマウントにおけるＣＮＶ病変の顕微鏡写真である。（Ｃ）レーザ、並びにＰＢＳ（１μｌ）、ＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）及びアフリベルセプト（１μｌ、２５μＭ）の硝子体注射の後７日目のＣＮＶ（ＣＤ－１０２陽性領域）の定量結果である（一群当たりのレーザ照射はそれぞれｎ＝２９、３２及び３０である。^＊ｐ＜０．０５；ダネットのポストテスト後に一元配置分散分析；それぞれ２つの独立した試験を行った。）。（Ｄ）レーザ、並びにＰＢＳ（１μｌ）、ＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）及びアフリベルセプト（１μｌ、２５μＭ）の硝子体注射の後７日目の刺激当たりのＩｂａ１陽性細胞の定量結果である（一群当たりのレーザ照射はそれぞれｎ＝２９、３２及び３０である。^＊ｐ＜０．０５；ダネットのポストテスト後に一元配置分散分析；それぞれ２つの独立した試験を行った。）。（Ｅ）３日目におけるＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊの脈絡膜のＧＡＰＤＨｍＲＮＡで正規化されたインテグリンサブユニットｍＲＮＡ（αｖ、α５、β３、β５）の定量化ＲＴ－ＰＣＲの結果である。マウスは２日目にＰＢＳ（１μｌ）又はＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）の１回の硝子体注射で処理され、一群当たりｎ＝５つの眼とした。ＩＮＬは内顆粒層であり、ＯＮＬは外顆粒層であり、Ａにおけるスケールバーは５０μｍであり、Ｂにおけるスケールバーは１００μｍである。 ３日目のＬＣＴの硝子体注射は脈絡膜の血管新生を阻害する。（Ａ）レーザ（０日目）、及びＰＢＳ（１μｌ）又はＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）の硝子体注射（３日目）の後７日目のＣＤ１０２（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）で染色されたＣＮＶ病変の顕微鏡写真である。（Ｂ）７日目におけるＰＢＳ及びＬＣＴ処理された脈絡膜のフラットマウントでのＣＮＶ（ＣＤ１０２陽性領域）の定量結果である（一群当たりｎ＝２７及び２８のレーザ照射をした。^＊ｐ＜０．０５；マン・ホイットニーのＵ検定；それぞれ２つの独立した試験を行った。）。Ａにおけるスケールバーは１００μｍである。 ＬＣＴは、酸素誘発網膜症（ＯＩＲ）モデルにおける網膜の血管新生を阻害する。（Ａ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７色素（赤色）に共有結合的にコンジュゲートされたＬＣＴ（６４７－ＬＣＴ）の硝子体注射をＰ１４で受けたＰ１７－ＯＩＲＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスのＦＩＴＣ結合ＢＳ－１レクチン染色網膜（緑色）の顕微鏡写真である。（Ｂ）ＰＢＳ（１μｌ）、ＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）又はアフリベルセプト（１μｌ、２５μＭ）のＰ１２での硝子体注射後のＰ１７－ＯＩＲＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスのＦＩＴＣ結合ＢＳ－１レクチン染色網膜の顕微鏡写真である。血管新生（ＮＶ）及び虚血（ＶＯ）領域をそれぞれ白色及び赤色で強調させた。（Ｃ）ＢＳ－１レクチン染色されたコントロール及び処理網膜における血管新生の代表的な共焦点顕微鏡写真である。（Ｄ、Ｅ）Ｐ１７コントロール及び処理網膜のフラットマウントにおける（Ｄ）虚血及び（Ｅ）血管新生（ＢＳ－１レクチン陽性領域）の定量結果である（それぞれｎ＝３５、３２及び１６のＯＩＲ網膜である。^＊ｐ＜０．０５；ボンフェローニのポストテスト後に一元配置分散分析；それぞれ２つの独立した試験を行った。）。Ａにおけるスケールバーは３０μｍであり、Ｂにおけるスケールバーは８０ｍｍであり、Ｃにおけるスケールバーは１００μｍである。 （Ａ、Ｂ）ＰＢＳ（１μｌ）、ＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）、アフリベルセプト（１μｌ、２５μＭ）又はＬＣＴ＋アフリベルセプト（１μｌ、５００μＭのＬＣＴ／２５μＭのアフリベルセプト）のＰ１２での硝子体注射後のＰ１７－ＯＩＲＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスの（Ａ）血管新生（ＢＳ－１ レクチン陽性領域）及び（Ｂ）虚血の定量結果である（それぞれｎ＝３５、３２、１６及び２４のＯＩＲ網膜である。）。^＊ｐ＜０．０５；ダネットのポストテスト後に一元配置分散分析；それぞれ２つの独立した試験を行った。 （Ａ）未処理（ＣＴＬ）の脈絡膜内皮発芽、又は３日目にMacroviperalebetinaからのレベセチン（ＬＣＴ）若しくは組換え型ＬＣＴ（ｒＬＣＴ）で処理された６日目（Ｄ６）の脈絡膜内皮発芽の代表的な顕微鏡写真である。（Ｂ）コントロール、ＬＣＴ（１．５μＭ）及びｒＬＣＴ（１．５μＭ、５μＭ、１５μＭ）群における２週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊ雄マウスの脈絡膜外植片の血管発芽の測定結果である。血管発芽はＤ３からＤ６の間で増加するように示されている（一群当たりｎ≧１０、^＊ｐ＜０．０５；ダネットのポストテスト後に一元配置分散分析；ＣＴＬはコントロールである。）。（Ｃ）コントロール、ＬＣＴ（１．５μＭ）及びｒＬＣＴ（１．５μＭ、５μＭ、１５μＭ）群における２．５μＭのアフリベルセプトで３日間処理された２週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊ雄マウスの脈絡膜外植片の血管発芽の測定結果である（一群当たりｎ≧６、^＊ｐ＜０．０５；ダネットのポストテスト後に一元配置分散分析；Ａｆｌｉはコントロールである。）。Ａにおけるスケールバーは５００μｍである。 （Ａ）ＰＢＳ（１μｌ）又は組換え型ＬＣＴ（ｒＬＣＴ、１μｌ、５００μＭ）のＰ１２での硝子体注射後のＰ１７－ＯＩＲ Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスのＣＤ１０２染色網膜の顕微鏡写真である。（Ｂ、Ｃ）Ｐ１７のコントロール及び処理された網膜フラットマウントにおける（Ｂ）虚血及び（Ｃ）血管新生（ＣＤ１０２陽性領域）の定量結果である（それぞれｎ＝９及び１０のＯＩＲ－網膜。^＊ｐ＜０．０５；独立ｔ検定。）。Ａにおけるスケールバーは５００μｍであり、挿入写真は４０μｍである。 （Ａ）ＣＤ１０２で染色されたＰＢＳ及び組換え型ＬＣＴ（ｒＬＣＴ）の脈絡膜フラットマウントにおけるＣＮＶ病変の顕微鏡写真である。（Ｂ）レーザ、並びにＰＢＳ（１μｌ）及びｒＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）の硝子体注射の後７日目のＣＮＶ（ＣＤ１０２陽性領域）の定量結果である（一群当たりそれぞれｎ＝２９、３２及び３０のレーザ照射をした。^＊ｐ＜０．０５；ボンフェローニのポストテスト後に一元配置分散分析；それぞれ２つの独立した試験を行った。）。（Ｅ）レーザ、並びにＰＢＳ（１μｌ）、ＬＣＴ（１μｌ、５００μＭ）及びアフリベルセプト（１μｌ、１．７μｇ）の硝子体注射の後７日目の刺激当たりのＩｂａ１陽性細胞の定量結果である（一群当たりのレーザ照射はそれぞれｎ＝３５及び４７である。^＊ｐ＜０．０５；独立ｔ検定。）。Ａにおけるスケールバーは５０μｍである。

本発明者らは、本明細書において、レベセチンが抗ＶＥＧＦ療法と同程度に、血管新生のエクスビボモデルすなわち大動脈及び脈絡膜外植片、並びに血管新生のインビボモデルすなわちレーザ誘導性脈絡膜血管新生及び酸素誘発網膜症モデルで、血管発芽を抑制するのに有効であることを証明した。実際に、本発明者らは、レベセチンの硝子体注射が血管新生を防止及び退行させることを観察した。また、本発明者らは、レベセチンの治療的有効量の硝子体注射が網膜構造、網膜機能又は血管完全性を変更しないことを示した。従って、これらの結果は、レベセチンが血管新生、特に網膜及び／又は脈絡膜の血管新生に関連する病気の治療に有効に用いられ得ることを明らかに証明する。

従って、第１の態様において、本発明は、血管新生疾患の治療に用いるためのレベセチン、並びにその機能的変異体及び断片から選択されたタンパク質に関する。

本明細書で用いられる「レベセチン」又は「ＬＣＴ」の用語は、Macrovipera lebetina（ＭＶＬ）から単離された３０ｋＤａのＣ型レクチン（ＣＴＬ）を意味する。ＣＴＬは、（最低４つのシステインを含む）システインスキャフォールドと糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）又はＣＤＲ類似ドメインとを含む共通の機能を共有する。ＬＣＴは、α鎖（ＭＬＶＡ１）（配列番号１）及びβ鎖（ＭＬＶＢ１）（配列番号３）で構成されている。両方のサブユニットは、クローニングされ(Jebali et al. 2009)、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに索引付けられている（登録番号：それぞれＡＢＷ８２６５６及びＡＢＷ８２６７２）。２つのサブユニットは、ジスルフィド結合により結合されている(Sarray, S. et al. 2003)。ＭＬＶＡ１及びＭＬＶＢ１は、ＣＬＥＣＴドメイン、すなわち糖鎖認識ドメイン（ＭＶＬＡ１、２７残基～１５５残基のドメイン（ｃｄｄ２９５３０２）及びＭＶＬＢ１、２７残基～１４５残基のドメイン（ｃｄｄ２１４４８０））を有する。ＭＬＶＡ１又はＭＬＶＢ１のホモ二量体は、活性ではない(Jebali et al. 2012)。開始コドンから２４番目のコドンｎまでの推定レベセチン「シグナルペプチド」配列は省略され得る。

本明細書で用いられる「機能的断片」の用語は、レベセチンの抗血管新生活性を保持し、ｉ）レベセチンのα鎖（配列番号１）及びレベセチンのβ鎖の断片、ｉｉ）レベセチンのα鎖の断片及びレベセチンのβ鎖（配列番号３）、又はｉｉｉ）レベセチンのα鎖の断片及びレベセチンのβ鎖の断片を含むレベセチン由来のヘテロ二量体タンパク質を意味する。

好ましくは、α鎖の断片は、配列番号１の少なくとも１００、１１０若しくは１２０、より好ましくは少なくとも１３０の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列からなる又は含み、及び／又はβ鎖の断片は、配列番号３の少なくとも１００若しくは１１０、より好ましくは少なくとも１２０の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列からなる又は含む。好ましくは、前記連続するアミノ酸は、サブユニットのＣ末端を含む。

好ましくは、「機能的断片」の用語は、レベセチンの成熟型を意味し、すなわち１つ又は両方のサブユニット、好ましくは両方のサブユニットのＮ末端のシグナルペプチドを含まない。従って、特定の実施形態において、本発明において用いられるタンパク質は、配列番号２からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号４からなる又は含む第２サブユニットとの２つの異なるサブユニットからなるヘテロ二量体であるレベセチンの機能的断片であり、これらのサブユニットはジスルフィド架橋により結合されている。

一実施形態において、本発明において用いられるタンパク質は、配列番号１又は２からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号３又は４からなる又は含む第２サブユニットとの異なる２つのサブユニットからなるヘテロダイマーであり、これらの２つのサブユニットはジスルフィド架橋により結合されている。

特定の実施形態において、本発明において用いられるタンパク質は、配列番号１からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号３からなる又は含む第２サブユニットとを含む。

他の特定の実施形態において、本発明において用いられるタンパク質は、配列番号２からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号４からなる又は含む第２サブユニットとを含む。

他の特定の実施形態において、本発明において用いられるタンパク質は、配列番号２からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号４又は１８からなる又は含む第２サブユニットとの２つの異なるサブユニットを含むヘテロ二量体であり、これらの２つのサブユニットはジスルフィド架橋により結合されている。

本明細書で用いられる「機能的変異体」の用語は、レベセチン由来であり、そのサブユニットの一方又は両方の１つ以上（例えば数個）の位置において置換、挿入及び／又は欠失といった改変を含み、レベセチンの抗血管新生活性を保持するヘテロ二量体タンパク質を意味する。この活性は、以下の実施例の項で説明するように容易に評価され得る。位置又はアミノ酸に関して用いられる「欠失」の用語は、特定の位置におけるアミノ酸が除去される又は存在しないことを意味する。位置又はアミノ酸に関して用いられる「挿入」の用語は、１つ以上のアミノ酸が特定の位置を占めるアミノ酸に隣接し且つすぐ後ろに挿入される又は存在することを意味する。位置又はアミノ酸に関して用いられる「置換」の用語は、特定の位置におけるアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられていること、又は野生型タンパク質のアミノ酸と異なるアミノ酸が存在することを意味する。好ましくは、「置換」の用語は、天然起源の標準の２０アミノ酸残基、希少な天然起源アミノ酸残基（例えばヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、６－Ｎ－メチルリシン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノブチル酸、オルニチン）、及びよく合成的に生成される非天然起源アミノ酸（例えばノルロイシン、ノルバリン及びシクロヘキシルアラニン）から選択される他のものによるアミノ酸残基の置き換えを意味する。好ましくは「置換」は、天然起源の標準アミノ酸残基（Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ及びＴ）から選択される他のものによるアミノ酸残基の置き換えを意味する。変異体は、本技術分野にお
いて周知の種々の技術により得られ得る。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を変更するための技術の例は、以下のものに限定されないが、部位特異的変異導入、ランダム変異導入及び合成オリゴヌクレオチド構築を含む。

特に、「機能的変異体」の用語は、配列番号１又は２に対して少なくとも７５％の同一性を有する配列からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号３又は４に対して少なくとも７５％の同一性を有する配列からなる又は含む第２サブユニットとの２つの異なるサブユニットからなるヘテロ二量体であって、レベセチンの抗血管新生活性を保持する変異体を意味する。

一実施形態において、機能的変異体は、配列番号１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第２サブユニットとを含む。

他の実施形態において、機能的変異体は、配列番号２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号４に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第２サブユニットとを含む。

他の実施形態において、配列番号２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号１８に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第２サブユニットとを含む。

更なる実施形態において、機能的変異体は、配列番号１又は２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号３又は４に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第２サブユニットとを含む。特に、機能的変異体は、配列番号１からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第２サブユニットとを含んでもよく、又は、配列番号２からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号４に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第２サブユニットとを含んでもよい。また、機能的変異体は、配列番号２からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号１８に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第２サブユニットとを含んでもよい。

他の実施形態において、機能的変異体は、配列番号１又は２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号３又は４からなる又は含む第２サブユニットとを含む。特に、機能的変異体は、配列番号１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号３からなる又は含む第２サブユニットとを含んでもよく、又は、配列番号２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号４からなる又は含む第２サブユニットとを含んでもよい。また、機能的変異体は、配列番号２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９９％の同一性を有する配列からなる又は含む第１サブユニットと、配列番号１８からなる又は含む第２サブユニットとを含んでもよい。

本明細書で用いられる「配列同一性」又は「同一性」の用語は、２つのポリペプチド配列のアライメントの各位置における一致（同一のアミノ酸残基）の数（％）を意味する。配列同一性は、重複及び同一性を最大化して配列ギャップを最小化するようにアライメントさせて配列同士を比較することにより決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに依存して、多くの数学的グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムのいずれかを用いて決定され得る。類似する長さの配列は、好ましくは全体の長さにわたって最適に配列をアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム; Needleman and Wunsch, 1970）を用いてアライメントされ、実質的に異なる長さの配列は、好ましくはローカルアライメントアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム (Smith and Waterman, 1981)又はＡｌｔｓ
ｃｈｕｌアルゴリズム(Altschulet al., 1997; Altschul et al., 2005)）を用いてアラ
イメントされる。アミノ酸配列の同一性の割合を決定する目的のためのアライメントは、当業者が備える技術範囲内の種々の方法、例えばhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/又はhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/等のインターネットウェブサイトで利用可能な公のコンピューターソフトウェアを用いて達成され得る。当業者は、比較される配列同士の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要とされるアルゴリズムを含むアライメントの測定のための適切なパラメータを決定できる。ここでの目的のために、アミノ酸配列同一性の値（％）は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて２つの配列の最適なグローバルアライメントを生成するペアワイズ配列アライメントプログラムのＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用いて生じた値を意味し、全てのサーチパラメータは、デフォルト値、すなわちＳｃｏｒｉｎｇｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ ｏｐ
ｅｎ＝１０、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ＝０．５、Ｅｎｄ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝ｆａｌｓ
ｅ、Ｅｎｄ ｇａｐ ｏｐｅｎ＝１０及びＥｎｄｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ＝０．５に設定され
る。

本発明において用いられるタンパク質の抗血管新生活性は、当業者に周知の方法により評価され得る。例えば、この活性は、実施例において記載されるように評価され、特に大動脈又は脈絡膜の外植片等の血管新生のエクスビボモデルを用いて評価され得る（実施例１を参照）。

機能的変異体は、遺伝子多型で生じる自然変異体及び人工変異体を含み得る。

一実施形態において、機能的変異体は、特定のアミノ酸位置における１つ以上の変異（欠失、挿入及び／又は置換）の導入によって、野生型アミノ酸配列（例えば配列番号１～４）から誘導される。変異は、第１サブユニット、第２サブユニット又はその両方において導入され得る。

特に、機能的変異体は、参照配列、すなわち配列番号１又は２と比較して１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つの変異された（例えば欠失された、置換された又は挿入された）アミノ酸残基を有する配列からなる又は含む第１サブユニット、並びに／又は、参照配列、すなわち配列番号３又は４と比較して１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つの変異された（例えば欠失された、置換された又は挿入された）アミノ酸残基を有する配列からなる又は含む第２サブユニットを含み得る。特に、機能的変異体は、配列番号２と比較して１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つの変異された（例えば欠失された、置換された又は挿入された）アミノ酸残基を有する配列からなる又は含む第１サブユニット、並びに／又は、配列番号４と比較して１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つの変異された（例えば欠失された、置換された又は挿入された）アミノ酸残基を有する配列からなる又は含む第２サブユニットを含み
得る。

好ましくは、機能的変異体は、配列番号２と比較して１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つの変異された（例えば欠失された、置換された又は挿入された）アミノ酸残基を有する配列からなる又は含む第１サブユニット、並びに／又は、配列番号４と比較して１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つの変異された（例えば欠失された、置換された又は挿入された）アミノ酸残基を有する配列からなる又は含む第２サブユニットを含み得る。特に、第２サブユニットは、配列番号１８と比較して１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つの変異された（例えば欠失された、置換された又は挿入された）アミノ酸残基を有する配列からなる又は含み得る。以下に説明する通り、変異は保存的置換であることが好ましい。

特定の実施形態において、機能的変異体は、野生型レベセチン（例えば配列番号１～４）に実質的に相同である。

２つのアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸残基が生物学的に類似の残基に置換、すなわち保存的置換される際に、「相同」、「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。

本明細書において用いられる「保存的置換」の用語は、以下のものに限定されないが、（例えば極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、形状、疎水性及び芳香族等の）類似の特性を有するアミノ酸との置き換えを含む、ペプチドの全体の構造及び機能を変更することのない他のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置き換えを意味する。類似の特性を有するアミノ酸同士は、本技術分野において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリシンは、親水性の塩基性アミノ酸であり、置き換え可能となり得る。同様に、疎水性アミノ酸のイソロイシンは、ロイシン、メチオニン又はバリンと置換可能である。中性の親水性アミノ酸は、互いに置換が可能であり、それらはアスパラギン、グルタミン、セリン及びトレオニンを含む。

そのため、本発明においては、保存的置換は、一アミノ酸が類似の特性を有する他のアミノ酸に置換されることとして本技術分野において認識されていることが理解されるべきである。保存的置換の例は表１に示される。

一実施形態において、機能的変異体は、配列番号１又は２に由来し、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つアミノ酸の保存的置換を含む配列からなる又は含む第１サブユニット、並びに／又は、配列番号３又は４に由来し、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つアミノ酸の保存的置換を含む配列からなる又は含む第２サブユニットを含む。特に、機能的変異体は、配列番号２に由来し、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つアミノ酸の保存的置換を含む配列からなる又は含む第１サブユニット、並びに／又は、配列番号４に由来し、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１若しくは２つアミノ酸の保存的置換を含む配列からなる又は含む第２サブユニットを含む。

好ましい実施形態において、機能的変異体は、配列番号１に由来し、１～５、好ましくは１若しくは２つアミノ酸の保存的置換を含む配列からなる又は含む第１サブユニット、並びに／又は、配列番号３に由来し、１～５、好ましくは１若しくは２つアミノ酸の保存的置換を含む配列からなる又は含む第２サブユニットを含む。

他の好ましい実施形態において、機能的変異体は、配列番号２に由来し、１～５、好ま
しくは１若しくは２つアミノ酸の保存的置換を含む配列からなる又は含む第１サブユニット、並びに／又は、配列番号４に由来し、１～５、好ましくは１若しくは２つアミノ酸の保存的置換を含む配列からなる又は含む第２サブユニットを含む。特に、機能的変異体は、配列番号２に由来し、１～５、好ましくは１若しくは２つアミノ酸の保存的置換を含む配列からなる又は含む第１サブユニット、並びに／又は、配列番号１８に由来し、１～５、好ましくは１若しくは２つアミノ酸の保存的置換を含む配列からなる又は含む第２サブユニットを含む。

好ましくは、レベセチン活性に重要ないくつかの残基は、機能的変異体に保存されてい
る。特に、その残基は、
１）α鎖とβ鎖との間の鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋に関連するシステイン残基、すな
わち、配列番号１のＣｙｓ２７、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ５５、Ｃｙｓ１０６、Ｃｙｓ１２９
、Ｃｙｓ１４６及びＣｙｓ１５４と、配列番号３のＣｙｓ２７、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ５５
、Ｃｙｓ１００、Ｃｙｓ１２１、Ｃｙｓ１３６及びＣｙｓ１４４(Jebali et al. 2009)、
並びに／又は、
２）ＨＣＹドメインの残基、すなわち、配列番号１のＨｉｓ３７、Ｃｙｓ３８、Ｔｙｒ３
９と、配列番号３のＨｉｓ３７、Ｃｙｓ３８、Ｔｙｒ３９(Jebali et al. 2009)、並びに
／又は、
３）ＤＡＥＫドメインの残基、すなわち、配列番号１のＡｓｐ５０、Ａｌａ５１、Ｇｌｕ
５２及びｌｙｓ５３と、配列番号３のＡｓｐ５０、Ａｌａ５１、Ｇｌｕ５２及びｌｙｓ５
３(Jebali et al. 2009)、並びに／又は、
４）ＷＩＧＬモチーフの残基、すなわち、配列番号１のＴｒｐ９４からＬｅｕ９７と、配
列番号３のＴｒｐ９０からＬｅｕ９３(Zelensky et al., 2005)、に一致する。

好ましくは、１）、２）、３）及び４）で示された全ての残基は機能的変異体に保存されている。

レベセチンの上記残基に一致する残基は、ルーチンのアライメント方法に基づいて当業者に容易に同定され得る。

本明細書で示される本発明において用いられるタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端は、タンパク質加水分解に対して任意に保護され得る。例えば、Ｎ末端はアセチル基の形態となっていてもよく、及び／又はＣ末端はアミド基の形態となっていてもよい。また、タンパク質加水分解に対する耐性のためのタンパク質の内部の修飾も考えられ、例えば少なくとも１つの－ＣＯＮＨ－ペプチド結合は、（ＣＨ２ＮＨ）還元結合、（ＮＨＣＯ）レトロインベルソ結合、（ＣＨ２－Ｏ）メチレン－オキシ結合、（ＣＨ２－Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ２ＣＨ２）カルバ結合、（ＣＯ－ＣＨ２）セトメチレン結合、（ＣＨＯＨ－ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合、（Ｎ－Ｎ）結合、Ｅ－アルセン結合又は－ＣＨ＝ＣＨ－結合により修飾及び置換される。

例えば、タンパク質は、アセチル化、アシル化、アミド化、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、リン酸化等により修飾され得る。

本発明に従って用いられるタンパク質は、タンパク質加水分解に対する耐性をペプチドに与えるＤ型のアミノ酸で構成され得る又は含み得る。それらは、例えばWalensky et al, 2014に記載された所謂「ステープル」技術に従った鎖同士の化学的架橋によって、オレフィン側鎖、好ましくはＣ３－Ｃ８アルケニル鎖、好ましくはペンテン－２イル鎖を含む少なくとも２つのアミノ酸残基を修飾することによる分子内架橋により安定化され得る。
例えば、位置ｉとｉ＋４からｉ＋７とにおけるアミノ酸は、反応性のオレフィン残基を示す非天然アミノ酸により置換され得る。これらすべてのタンパク質加水分解耐性の化学修飾タンパク質は、本発明に含まれる。

本発明において用いられるタンパク質は、尿クリアランス及び用いられる治療用量の低減並びに血漿内半減期の増大のために、それらのＣ末端又はリシン残基においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、特に１５００又は４０００ＭＷのＰＥＧに共有結合され得る。タンパク質半減期は、マイクロスフェアを形成するドラッグデリバリーシステムのために、生物分解性及び生体適合性ポリマー材料にタンパク質を含むことにより増大され得る。ポリマー及びコポリマーは、例えば（US2007/0184015, Hahn SK et alに記載され
るような）ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）である。

レベセチンは、M. Lebetina毒から単離され得る。また、レベセチン又はその機能的変
異体若しくは断片は、当業者に周知の組換え技術により得られ得る。この場合、タンパク質の第１サブユニットをコードするヌクレオチド配列と第２サブユニットをコードするヌクレオチド配列とからなる又は含む核酸及び／又は遺伝子コンストラクトは、宿主細胞で発現され、これらの宿主細胞又は培養培地から抽出され得る。組換え技術の一例は、Jebali et al. 2012に記載されている。簡潔に説明すると、それぞれのサブユニット（例えば配列番号２及び４）のｃＤＮＡは、ヒト顆粒球コロニー刺激因子に由来するシグナルペプチド配列を含むｐＡＭｏＡ－ＧＤ３ベクター内にクローニングされた。そのαサブユニット及びβサブユニットをコードするｃＤＮＡは、それぞれＭＶＬＡ１（配列番号１）及びＢＶＬＢ１（配列番号３）をコードする配列を用いたＰＣＲにより調製され得る。

本発明において用いられるタンパク質は、例えば化学合成又は酵素合成といった当業者に周知の標準合成方法を用いて合成され得る。化学合成技術の例は、固相合成及び液相である。

固相合成としては、例えば合成されるためのタンパク質のＣ末端に対応するアミノ酸が、有機溶媒に不溶性の担体に結合され、アミノ基と適切な保護既を含む側鎖の官能基とを含むアミノ酸が、Ｃ末端からＮ末端に向かって順に一つずつ縮合される反応と、レジン又はタンパク質のアミノ基の保護基に結合されたアミノ酸を分離する反応とを交互に繰り返し行うことにより、タンパク質鎖は伸長される。固相合成法は、用いられる保護基の型に依存して主としてｔＢｏｃ法とＦｍｏｃ法に分類される。典型的に用いられる保護基は、アミノ基に対してｔＢｏｃ（ｔブトキシカルボニル）、Ｃｌ－Ｚ（２－クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ－Ｚ（２－ブロモベンジロイカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’－ジメトキシジベンジドリル）、Ｍｔｒ（４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）及びＣｌｚ－Ｂｚｌ（２，６－ジクロロベンジル）、グアニジノ基に対してＮＯ２（ニトロ）及びＰｍｃ（２，２、５，７、８－ペンタメチルクロマン－６－スルホニル）、並びにヒドロキシル基に対してｔＢｕ（ｔ－ブチル）を含む。所望のタンパク質の合成の後、それに対して脱保護反応を行い、固体担体から切り離す。そのようなタンパク質を切り離す反応は、Ｂｏｃ法においてはフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を用いて行われ、Ｆｍｏｃ法においてはＴＦＡを用いて行われ得る。

本発明に従って用いられるタンパク質は、少なくともそのタンパク質をコードする核酸の形態で投与され得る。一実施形態において、２つのサブユニットは、同一の核酸によりコードされている。他の実施形態において、２つのサブユニットは、別々の核酸によりコードされている。

好ましくは、その（それらの）コードする（複数の）核酸は、遺伝子コンストラクト、すなわち宿主細胞においてコードされたタンパク質（本発明に用いられるタンパク質）の発現（例えば転写及び翻訳）を可能とする制御配列（適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）をさらに含む発現カセットに含まれている。遺伝子コンストラクトは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはｃＤＮＡであってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。遺伝子コンストラクトは、対象となる宿主細胞又は宿主生物の形質転換に適切な形態、対象となる宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれるのに適切な形態、又は対象となる宿主生物において独立的な複製、維持及び／又は遺伝されるのに適切な形態にされ得る。

例えば、遺伝子コンストラクトは、例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター又はトランスポゾン等のベクターの形態であってもよい。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち（例えば宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系に適する）インビトロ及び／又はインビボで発現させることができるベクターであってもよい。

好ましいが非限定的な態様において、遺伝子コンストラクトは、ｉ）本発明において用いられるタンパク質をコードして下記制御エレメントに作動可能に接続された核酸と、ｉｉ）プロモーター及び任意に適切なターミネーター等の１つ以上の制御エレメントと、任意にｉｉｉ）３’又は５’ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子及び／又は形質転換若しくは組込み（の効率）を促進若しくは増大し得るエレメント等の１つ以上の更なる遺伝子コンストラクトのエレメントとを含む。

好ましい実施形態において、本発明において用いられるタンパク質をコードする核酸は、エクスビボ又はインビボでの感染、及び該タンパク質の発現のためにウイルスベクターにより運ばれる。

好ましくは、ベクターは、組換え組み込み型又は非組み込み型のウイルスベクターである。組換えウイルスベクターの例は、以下のものに限定されないが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又はウシパピローマウイルス由来のベクターを含む。

好ましくは、本発明において用いられるタンパク質をコードする核酸又は上記遺伝子コンストラクトは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又はレンチウイルスベクターに含まれる。

好ましい実施形態において、ベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

ヒトパルボウイルスであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、潜伏感染を起こすように、感染細胞のゲノム内に組み込まれ得る複製に元から欠陥があるディペンドウイルスである。最後の特性は、組み込みがヒトゲノムにおける第１９染色体に位置するＡＡＶＳＩと呼ばれる特定の位置（１９ｑｌ３．３－ｑｔｅｒ）で起こるため、哺乳動物ウイルスの中でも独特である。従って、ＡＡＶは、ヒトの遺伝子治療のために可能性があるベクターとしてかなりの興味がもたれている。そのウイルスの好ましい特性は、人の疾病に関連性が無いこと、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力、並びに感染できる種々の組織由来の細胞の範囲が広いことである。

本明細書で用いられる「ＡＡＶベクター」の用語は、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、好ましくは２つのＩＴＲに隣接された１つ以上の異種配列（すなわちＡＡＶ起源でない核酸配列、例えば本発明において用いられるタンパク質をコードする配列）を含むポリヌクレオチドベクターを意味する。そのようなＡＡＶベクターは、適切なヘ
ルパーウイルス（又は適切なヘルパー機能を発現するウイルス）に感染され、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶＲｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現する宿主細胞に存在する際に、複製されることが可能であり、感染性ウイルス粒子内に収容可能である。「逆位末端配列」又は「ＩＴＲ」配列は、本技術分野においてよく理解されている用語であり、逆方向であるウイルスゲノムの末端に見られる比較的に短い配列を意味する。「ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）」は、ネイティブ一本鎖ＡＡＶゲノムの両方の末端に存在する約１４５ヌクレオチド配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、異なるＡＡＶゲノム同士の間及び単一のＡＡＶゲノムの２つの末端の間の異種に至る２つの代替的方向のいずれかに存在し得る。最も外側の１２５ヌクレオチドは、鎖内塩基対合がＩＴＲのこの部分内で起こるように、自己相補性（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’及びＤ領域と示される）のいくつかの短い領域を含む。ＡＡＶＩＴＲｓは、野生型ヌクレオチド配列を有し得る、又は挿入、欠失若しくは置換により変更され得る。ＡＡＶベクターの逆位末端配列（ＩＴＲｓ）の血清型は、周知のヒト又は非ヒトＡＡＶ血清型のいずれかから選択され得る。

ウイルスベクターは、「ウイルス粒子」を生成するためにウイルスカプシド内に収容され得る。特に、ベクターは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質で構成された「アデノ随伴ウイルス粒子」又は「ＡＡＶ粒子」、及びカプシドに包含されたＡＡＶベクターゲノムを生成するために、ＡＡＶ由来カプシド内に収容されたＡＡＶベクターであってもよい。

カプシド血清型は、ＡＡＶ粒子の指向性範囲を決定する。現在、１２のヒト血清型及び１００以上の非ヒト霊長類の血清型を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の多数の血清型が、同定されている（Howarth al., 2010, Cell Biol Toxicol 26: 1-10）。これらの血
清型のうち、ヒト血清型２は、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであった。他の近年用いられているＡＡＶ血清型は、以下のものに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ７４及びＡＡＶｄｊ等を含む。

特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９－２ＹＦ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２－７ｍ８(Dalkara D et al. Gene Ther. 2012 Feb;19(2):176-81; Dalkara D et al.Sci Transl Mes. 2013 Jun 12;5(189):189ra76)、又はＡＡＶ８カプシ
ドからなる群から選択されるＡＡＶ由来カプシドを含む。

さらに、非天然の人工変異体及びキメラＡＡＶは有益となり得る。特に、カプシドタンパク質は、形質導入効率を増大する、免疫原性を最小化する、安定性及び粒子寿命を調整する、効率的に分解する、並びに／又は、核へ正確に輸送するために１つ以上のアミノ酸置換を含む変異体であってもよい。変異ＡＡＶカプシドは、エラープローンＰＣＲ及び／若しくははペプチド挿入により挿入されたカプシド修飾から得られ得る、又は１つ又は複数のアミノ酸置換を含むことにより得られ得る。特に、変異は、天然又は非天然カプシドタンパク質（例えばＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３）の１つ以上のチロシン残基のいずれかに対して行われ得る。好ましくは、変異される残基は、表面に露出されたチロシン残基である。代表的な変異は、以下のものに限定されないが、Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ２７５Ｆ、Ｙ２８１Ｆ、Ｙ５０８Ｆ、Ｙ５７６Ｆ、Ｙ６１２Ｇ、Ｙ６７３Ｆ及びＹ７２０Ｆ等のチロシンからフェニルアラニンへの置換を含む。

ＡＡＶ天然血清型の使用に変えて、人工ＡＡＶ血清型は、以下のものに限定されないが、非天然起源のカプシドタンパク質を含むＡＡＶが用いられ得る。そのような人工カプシ
ドは、異なる選択されたＡＡＶ血清型、同一のＡＡＶ血清型の非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、又は非ウイルス源から得られ得る異種配列と組み合わせて、選択されたＡＡＶ配列（例えばＶＰＩカプシドタンパク質の断片）を用いて適切な技術により生成され得る。人工ＡＡＶ血清型は、以下のものに限定されないが、キメラＡＡＶカプシド又は変異ＡＡＶカプシドであってもよい。キメラカプシドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型由来のＶＰカプシドタンパク質を含み、又はＶＰタンパク質領域若しくは少なくとも２つのＡＡＶ血清型に由来するドメインに結合する少なくとも１つのキメラＶＰタンパク質を含む。ＡＡＶ粒子は、同一の血清型又は混合された血清型（すなわち偽型ＡＡＶ）のウイルスタンパク質及びウイルス核酸を含み得る。例えば、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ血清型２／１ハイブリッド組換え遺伝子導入システムであってもよい。当業者は、それらの構築及び使用のためのそのようなベクター及び方法に精通している（例えばWO 01/83692を参照）。本発明において用いら
れるためのＡＡＶベクターは、当業者により容易に選択され得る。

本発明は、血管新生疾患の治療に用いるための、レベセチン並びにその機能的変異体及び断片、さらに上記の当該タンパク質をコードする核酸、ベクター又はウイルス粒子に関する。

本明細書で用いられる「治療（treatment）」、「治療する（treat）」又は「ちりょうすること（treating）」は、病気の治療、防止、予防及び抑制等の患者の健康状態を改善することを目的とした作用を意味する。特定の実施形態において、そのような用語は、病気又は病気に関連する症状の改善又は根絶を意味する。他の実施形態において、この用語は、そのような病気をもつ対象に１つ以上の治療剤を投与することで、病気の拡大又は悪化を最小化することを意味する。

本明細書で用いられる「対象」又は「患者」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは成人、子供及び胎児を含むヒトを意味する。

特に、「血管新生疾患の治療」の用語は、病理学的に過剰な血管新生、すなわち病的血管新生の防止又は減少を意味し得る。

本明細書で用いられる「血管新生疾患」の用語は、血管新生要素、すなわち血管新生（病的血管新生）に関連する要素を含む疾患のいずれかを意味する。そのような疾患の例は、以下のものに限定されないが、血管新生要素を含む眼の血管新生疾患、癌及び炎症性障害を含む。

一実施形態において、血管新生疾患は、眼の血管新生疾患（すなわち血管新生要素を含む眼の疾患）であり、好ましくは、加齢黄斑変性、糖尿病網膜虚血又は増殖性糖尿病網膜症等の糖尿病網膜変性症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生及び（特に角膜炎、眼ヘルペス又は帯状疱疹に起因する）角膜炎からなる群から選択される。

更なる実施形態において、疾患は、血管新生要素を含む癌である。癌は固形癌であることが好ましい。それは原発癌又は転移癌であってもよく、好ましくは、肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌及び脳癌からなる群から選択され得る。特に、癌の血管新生要素は、腫瘍血管新生及び／又は遺伝子若しくはＶＥＧＦ経路等の腫瘍血管新生に関連することが知られているシグナル経路の活性化若しくはアップレギュレーションを意味し得る。

他の実施形態において、疾患は、血管新生要素を含む炎症性障害であり、好ましくは関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、炎症性腸疾患、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる
群から選択される。

更なる態様において、本発明は、本発明において用いられるタンパク質（すなわちレベセチン又はその機能的変異体若しくは断片）、又は上記の該タンパク質をコードする核酸、ベクター若しくはウイルス粒子、及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物も提供する。好ましくは、本発明は、血管新生疾患の治療に用いるための本発明の医薬組成物にも関する。

それは、血管新生疾患の治療のための薬剤の製造のための、本発明に従って用いられるタンパク質（すなわちレベセチン又はその機能的変異体若しくは断片））、又は上記の該タンパク質をコードする核酸、ベクター若しくはウイルス粒子、又は本発明の医薬組成物の使用にも関する。

上記の全ての実施形態は、この態様内で考えられ得る。

一実施形態において、医薬組成物は、本発明に従って用いられるタンパク質、すなわちレベセチン又はその機能的変異体若しくは断片と、医薬的に許容可能な賦形剤とを含む。

他の実施形態において、医薬組成物は、本発明に従って用いられるタンパク質（すなわち、レベセチン又はその機能的変異体若しくは断片）をコードする上記核酸、ベクター又はウイルス粒子と、医薬的に許容可能な賦形剤とを含む。

医薬的に許容可能な賦形剤は、投与経路、及び有効成分、例えばタンパク質、核酸又はウイルス粒子の性質に従って選択される。本明細書において用いられる「医薬的に許容可能」の用語は、動物及び／又はヒトに使用するために、規制機関、又はヨーロッパ薬局方等の認定薬局方により承認されたこと意味する。「賦形剤」の用語は、治療剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、キャリア又はビヒクルを意味する。本技術分野において周知のように、医薬的に許容可能な賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を促進する比較的に不活性な物質であり、溶液若しくは懸濁液として、乳液として、又は使用前に液体に溶解若しくは懸濁するのに適切な固体として供給され得る。例えば、賦形剤は、形状若しくは粘性を与えることができ、又は希釈剤として作用できる。適切な賦形剤は、以下のものに限定されないが、安定化剤、湿潤及び乳化剤、浸透圧を変更する塩、カプセル化剤、ｐＨ緩衝物質並びに緩衝液を含む。そのような賦形剤は、過度の毒性がなく投与され得る眼に直接に導入するのに適切な医薬的因子のいずれかを含む。

候補となる医薬組成物は、経口、直腸、局所（経皮、口腔内、舌下、点眼を含む）、眼内（硝子体内、前房内、網膜下、脈絡膜、眼球周囲、結膜下を含む）、又は非経口（皮下、筋肉内、脊髄内、静脈内及び皮内を含む）の投与に適する賦形剤を含む。それらの製剤化のために、従来の賦形剤は、当業者に周知の技術に従って用いられ得る。好ましくは、医薬組成物は、非経口又は点眼投与に適する。より好ましくは、医薬組成物は、局所的点眼及び眼内投与を含む点眼投与に適する。

非経口投与のための組成物は、一般に、固体又は凍結乾燥形態から使用前に任意にすぐに調製され得る生理的に適合可能な無菌溶液又は懸濁液である。局所麻酔剤、保存料及び緩衝剤等のアジュバントは、ビヒクルに溶解されることが可能であり、界面活性剤又は湿潤剤は、有効成分の均一な分布を促進するために組成物に含まれ得る。

点眼投与のために、組成物は１つ以上の医薬的に許容可能な無菌等張水若しくは非水溶液（例えば平衝塩溶液（ＢＳＳ））、分散液、懸濁液若しくは乳液、又は使用直前に無菌注射液若しくは分散液に再構成され得る無菌粉末を用いて製剤化可能であり、それらは、
酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、溶質、又は懸濁若しくは増粘剤を含み得る。

経口投与のために、組成物は、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、及びシロップ剤、エリキシル剤等の液体製剤、及び濃縮ドロップといった従来の経口投与形態に製剤化され得る。非毒性の固体担体又は希釈剤が用いられてもよく、それらは、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン酸ナトリウム、タルカン、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、炭酸塩等を含む。圧縮錠剤のために、粉末材料に凝集性の特質を与える因子である結合剤も必要とされる。例えば、スターチ、ゼラチン、ラクトース又はブドウ糖等の糖、及び天然又は合成ゴムが結合剤として用いられ得る。崩壊剤は、錠剤の崩壊を促進するために錠剤に必要となる。崩壊剤は、スターチ、クレイ、セルロース、アルギン、ゴム及び架橋ポリマーを含む。さらに、潤滑剤及び滑剤は、製造プロセスにおいて表面に錠剤材料が付着することを防止するため、及び製造の際の粉末材料の流動性を向上するために錠剤に含まれる。コロイド状二酸化ケイ素は、滑剤として用いられる最も一般的なものであり、タルク又はステアリン酸等の化合物が潤滑剤として用いられる最も一般的なものである。

経皮投与のために、組成物は、軟膏、クリーム又はゲルに製剤化されることが可能であり、適切な浸透剤又は界面活性剤は、浸透を促進するために用いられ、例えばジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド及びジメチルホルムアミドである。

経粘膜投与のために、鼻内噴霧、肛門坐剤又は膣坐剤が用いられ得る。活性化合物は、本技術分野において周知の方法により、周知の坐剤基材のいずれかに組み込まれ得る。そのような基材の例は、ココアバター、ポリエチレングリコール（カルボワックス）、ポリエチレンソルビタンモノステアレート、及びそれらと融点又は溶解率を変更するための他の適合材料との混合を含む。

本発明に係る医薬組成物は、投与から実質的にすぐに、又は所定の時間で若しくは投与後の所定の時間で活性薬剤を放出するように、製剤化され得る。

医薬組成物は、本発明に従って用いられる複数のタンパク質（すなわちレベセチン又はその機能的変異体若しくは断片）、及び／又は該タンパク質をコードする上記核酸、ベクター若しくはウイルス粒子を含んでもよい。

医薬組成物は、少なくとも１つの他の活性化合物を含んでもよく、特に、それは血管新生阻害剤、抗炎症剤、抗悪性腫瘍剤、抗菌剤及び抗ウイルス剤からなる群から選択される。

血管新生阻害剤の例は、以下のものに限定されないが、ＶＥＧＦ指向性抗体若しくはＶＥＧＦレセプター（例えばベマシズマブ、ラニビズマブ、ＤＣ１０１）等の抗ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）剤、ＶＥＧＦレセプターに結合及び阻害する低分子（例えばＳＵ６６６８、ＴＳＵ６８、アフリベルセプト）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばアキシチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ及びパゾパニブ）、ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えばＰＩ－１０３）、ＥＧＦＲ阻害剤（例えばゲフィチニブ、エルロチニブ）、Ｒａｓ阻害剤（ＦＴＩｓ）、ＡＫＴ阻害剤（例えばネルフィナビル）、抗ＳＦＲＰ２抗体、アンジオスタチン、エンドスタチン及びメタスタチンを含む。好ましくは、血管新生阻害剤は、ＶＥＧＦ経路の阻害剤であり、特にアフリベルセプトである。

抗炎症剤の例は、以下のものに限られないが、サリチル酸塩（例えばアセチルサリチル酸）、プロピオン酸誘導体（例えばイブプロフェン、ケトプロフェン）、酢酸誘導体（例えばインドメタシン、アセクロフェナク）、エノール酸誘導体（例えばピロキシカム、メ
ロキシカム、テノキシカム）、アントラニル酸誘導体（例えばメフェナム酸）及び選択的ＣＯＸ－２阻害剤（例えばセレコキシブ）等の非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）を含む。

「抗悪性腫瘍剤」は、癌細胞若しくは未成熟な前癌細胞の増殖を阻害する若しくは止める、癌細胞若しくは未成熟な前癌細胞を殺傷する、他の抗悪性腫瘍剤に対する癌細胞若しくは前癌細胞の感受性を増大する、及び／又は癌細胞の転移を阻害する抗癌活性を有する因子である。これらの因子は、化学的薬剤及び生物学的薬剤を含んでもよい。それらの例は、以下のものに限定されないが、５－アザ－２’デオキシシチジン、１７－ＡＡＧ（１７－Ｎ－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン）、トレチノイン（ＡＴＲＡ）、ボルテゾミブ、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ベバシズマブ、タモキシフェン、ロイコボリン、ドセタキセル、トランスツマブ、エトポシド、フラボピリドール、５－フルオロウラシル、イリノテカン、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）、ＬＹ２９４００２、ＰＤ１８４３５２、ペリフォシン、Ｂａｙ１１－７０８２、ゲムシタビン、ビカルタミド、ゾレドロン酸、シス－レチノイン酸、ＭＫ－０４５７、イマチニブ、デサチニブ、ソラフェニブ、テモゾロミド、アクチノマイシン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン及びミトマイシンを含む。

抗菌剤の例は、以下のものに限定されないが、ペニシリン、アミノグリコシド、マクロライド、モノバクタム、リファマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、イミペネム、フシジン酸、ノボビオシン、ホスホマイシン、フシジン酸ナトリウム、ネオマイシン、ポリマイシン、カプレオマイシン、コリスチメタート、コリスチン、グラミシジン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、バノマイシン、バシトラシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン及びセファロスポリンを含む。

抗ウイルス剤の例は、以下のものに限定されないが、α－メチル－Ｐアダマンタンメチルアミン、１－Ｄ－リボフラノシル－１，２，４－トリアゾール－３カルボキサミド、９－（２－ヒドロキシエトキシ）メチルグアニン、アダマンタンアミン、５－ヨード－２’－デオキシウリジン、トリフルオロチミジン、インターフェロン、アデニンアラビノシド、ＣＤ４、３’－アジド－３’デオキシチミジン（ＡＺＴ）、９－（２－ヒドロキシエトキシメチル）－グアニン（アシクロビル）、ホスホノギ酸、１－アダマンタンアミン、ペプチドＴ及び２’，３’ジデオキシシチジンを含む。

特定の実施形態において、医薬組成物は、血管新生阻害剤、抗炎症剤及び抗悪性腫瘍剤からなる群から選択される少なくとも１つの他の活性化合物を含む。

好ましい実施形態において、医薬組成物は、血管新生阻害剤、好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤、より好ましくはアフリベルセプトである少なくとも１つの他の活性化合物を含む。特に、医薬組成物は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなる又は含む第１サブユニット、及び配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列からなる又は含む第２サブユニットを含むタンパク質と、血管新生阻害剤、好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤、より好ましくはアフリベルセプトとを含み得る。特に、医薬組成物は、配列番号２のアミノ酸配列からなる又は含む第１サブユニット、及び配列番号４のアミノ酸配列からなる又は含む第２サブユニットを含むタンパク質と、血管新生阻害剤、好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤、より好ましくはアフリベルセプトとを含み得る。

本発明の医薬組成物の投与量は、当業者に周知の標準的な手順により決定される。

患者の生理学的データ（例えば年齢、大きさ及び体重）、投与経路及び治療される疾患は、適切な用量を決定するのに考慮されなければならない。本発明の医薬組成物の適切な用量は、それが単独で用いられるのか又は併用されるのかによって異なり得る。

医薬組成物は、単回投与又は複数回投与、好ましくは単回投与で投与され得る。

特定の実施形態において、医薬組成物は眼疾患の治療に用いられることを目的とし、各単位用量は、例えば０．１～１２ｍｇ／眼、好ましくは１～５ｍｇ／眼を含み得る。

本発明に係る医薬組成物は、単独で又は他の治療、特に血管新生阻害剤、抗炎症剤、抗悪性腫瘍剤、抗菌剤及び／又は抗ウイルス剤、好ましくは血管新生阻害剤、抗炎症剤又は抗悪性腫瘍剤と併用で用いられ得る。

特に、本発明に係る医薬組成物と併用される場合、抗悪性腫瘍剤は、Ｘ線、ガンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、光子、電子、中性子、放射性同位体及び他の形態の電離放射線当の放射線治療因子を含み得る。

好ましくは、医薬組成物は、血管新生阻害剤、より好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤、さらに好ましくはアフリベルセプトと併用で用いられる。

特定の実施形態において、医薬組成物は、血管新生阻害剤、好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤、より好ましくはアフリベルセプトを用いた治療に反応しない又は耐性がある対象を治療するのに用いられる。

更なる態様において、本発明は、さらに、本発明の治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む血管新生疾患を治療する方法に関する。

上記の全ての実施形態は、この態様内で考えられ得る。

「治療有効量」は、新規の血管の形成を十分に防止若しくは阻害する、すなわち血管新生、特に病的血管新生を防止若しくは阻害する、及び／又は血管新生を退縮する、対象に投与される医薬組成物の量を意図する。

好ましい実施形態において、それを必要とする対象は、血管新生阻害剤、好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤、より好ましくはアフリベルセプトを用いた治療に反応しない又は耐性がある対象である。

更なる態様において、本発明は、血管新生阻害剤として用いるためのレベセチン、その機能的変異体若しくは断片、レベセチン若しくはその機能的変異体若しくは断片をコードする核酸、ベクター若しくはウイルス粒子、又は本発明の医薬組成物にも関する。

本発明は、それを必要とする対象における血管新生を防止、阻害又は退縮するために用いるためのレベセチン、その機能的変異体若しくは断片、レベセチン若しくはその機能的変異体若しくは断片をコードする核酸、ベクター若しくはウイルス粒子、又は本発明の医薬組成物にも関する。

以下の実施例は、説明の目的のために提供され、限定のためではない。

［材料と方法］
（動物）
３週齢及び１１週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊ雄マウス並びに４日齢のＬｅｗｉｓラットをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ (Le Genest- Saint-Isle, France)から購入した。１１週
齢のＣＸ３ＣＲ１^＋／^ＧＦＰ雄マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ (Bar Harbor, USA)から購入した。動物を特定の病原体がいない、１２時間毎の明暗サイクルで水及び通常の規定食を自由にとれる条件下で動物施設に収容した。

すべての手順は、科学的目的に用いられる動物の保護における欧州議会の指令２０１０／６３／ＥＵからのガイドラインに従って行い、動物実験委員会（Institutional Animal
Care and Use Committee）、Comited’ethique pour l’experimentation animale Charles Darwin (N° 02371.02)により承認された。

（エクスビボ大動脈リングからの血管発芽）
Ｌｅｗｉｓラットの断頭後、胸部大動脈を１ｍｍ厚に切断し、４８ｗｅｌｌ組織培養プレートにおいて１５μｌの増殖因子低減フェノールレッドフリーマトリゲル(Corning, Boulogne Billancourt, France)で覆った。大動脈リングを、１０％ウシ胎児血清、１％ペ
ニシリン／ストレプトマイシン及び０．２％ファンギゾンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）(Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, France)で３
日間培養した(Lavalette, S. et al. 2011)。培養組織を、M. lebetina毒から単離されたＬＣＴに、異なる用量（３０ｎＭ、３００ｎＭ、１．５μＭ）で３日目（Ｄ３）から６日目（Ｄ６）まで曝露した。対照培養組織は、ＬＣＴの添加無しのＤＭＥＭ中で培養した。それぞれの培養組織の写真を、Ｄ３からＤ６までで撮影した。Ｄ３におけるそれぞれの大動脈リング及びインキュベーション前の発芽の表面を、Ｄ６における表面から差し引いて、ＬＣＴの有無で起こる血管発芽を算出した。発芽領域を、Ｆｉｊｉソフトウェア(Schindelin, J. et al. 2012)で定量した。データはＤ６とＤ３との間の割合の増加で示される。

（エクスビボ脈絡膜からの血管発芽）
Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスから眼を摘出し、解剖前に氷冷内皮細胞用培地（ＥＧＭ－２）(Lonza, Levallois-Perret, France)で維持した。他の眼組織から脈絡膜を分離し、
約１ｍｍ×１ｍｍに切断した。脈絡膜断片を単離し、４８ｗｅｌｌプレートに播かれた増殖因子減少フェノールレッドフリーマトリゲル(Corning, Boulogne Billancourt, France)に置いた。

その後、脈絡膜培養組織を、５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び０．２％ファンギゾンを添加したＥＧＭ－２培地で、３７℃の細胞培養インキュベーター中で３日間培養した(Shao, Z. et al. 2013)。Ｄ３において、脈絡膜組織を、培養のＤ３からＤ６までにおいて、M. Lebetina毒から単離されたＬＣＴ（１．５ｎＭ、５μＭ
、１５μＭ）又は組換えＬＣＴ（１．５ｎＭ、５μＭ、１０μＭ）で処理した。それぞれの培養組織の写真を撮影し、発芽領域をＦｉｊｉソフトウェア(Schindelin, J. et al. 2012)で定量した。Ｄ３におけるそれぞれの脈絡膜の培養組織及びインキュベーション前の発芽の表面をＤ６における表面から差し引いて、ＬＣＴの有無で起こる血管発芽を算出した。

（ＳＤ－ＯＣＴ）
瞳孔をトロピカミド（ミドリアティカム）(Thea, Clermont-Ferrand, France)及びフェニレフリン（ネオシネフリン）(Europhta,Monaco)で拡張した。マウスを、イソフルラン
（２％）(Axience, Pantin, France)の吸入で麻酔し、スペクトラルドメイン光干渉断層
撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）イメージング装置(Bioptigen 840 nm HHP; Bioptigen, North Carolina, USA)の前に載置した。上網膜の約０．１又は１．４ｍｍにおける視神経円板から画
像を得た。ＳＤ－ＯＣＴを、以前に説明されるように(Dominguez, E. et al. 2015)較正
した（１ピクセル＝１．６μｍ）。網膜層、内顆粒層（ＩＮＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）及び視細胞外節（ＯＳ）の厚さを、Ｆｉｊｉソフトウェア(Schindelin, J. et al. 2012)によって、７日目の視神経の中心から５００μｍの箇所で測定した。

（網膜電図検査（ＥＲＧ））
ＰＢＳ及びM.lebetina毒から単離されたＬＣＴ（５００μＭ）の注射後７日間ＥＲＧを行った。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスを一晩中、暗順応させ、その後にケタミン(100 mg/kg, Virbac, Carros, France)及びキシラジン(10mg/kg, Bayer HealthCare, Berlin,Germany)の腹腔内注射により麻酔した。瞳孔をフェニレフリン（ネオシネフリン）(Europhta,
Monaco)及びトロピカミド（ミドリアティカム）(Thea,Clermont-Ferrand, France)で拡
張した。角膜をオキシブプロカイン塩酸塩(Thea,Clermont-Ferrand, France)で麻痺させ
た。体温を温熱パッドを用いて３７℃に維持した。上眼瞼及び下眼瞼を引き込ませて、眼を開き、膨らんだ状態で維持した。金ループ電極を、各角膜の表面に接触させて置き、ルブリタル(Zubial, Auros, France)で保持して、ＥＲＧを記録した(Espion,Diagnosys LLC, Lowell, MA, USA)。参照電極及び接地電極を、それぞれ動物の額及び背中に配置した。ガンツフェルト刺激装置(Espion, Diagnosys LLC, Lowell, MA, USA)により光刺激を提供した。１チャンネルＤＣ／ＡＣ増幅器により反応を増幅及びフィルタリング（１ Ｈｚ－ｌｏｗ及び ３００ Ｈｚ－ｈｉｇｈ カットオフフィルター）した。５つのレベルの刺激強度（０．００３ｃｄ．ｓ／ｍ^２；０．０３ｃｄ．ｓ／ｍ^２；０．３ｃｄ．ｓ／ｍ^２；３ｃｄ．ｓ／ｍ^２；１０ｃｄ．ｓ／ｍ^２）を、暗順応ＥＲＧ記録のために用いた。各暗順応ＥＲＧ反応は、５つのフラッシュの刺激の１セットから５つの反応の平均を示す。

錐体の反応の評価のために、マウスに２０ｃｄ／ｍ２の光を５分間曝露して桿体光受容体を飽和させた。明順応ＥＧＲｓのために１０ｃｄ．ｓ／ｍ^２レベルの刺激強度を用いた。明順応の場合と同一の桿体抑制性の白いバックグラウンドで明順応ＥＲＧｓを記録した。各錐体明順応ＥＲＧ反応は、１０回の連続するフラッシュの１セットに対する１０回の反応の平均を示す。１ｃｄ．ｓ／ｍ^２強度での１０及び２０Ｈｚのフラッシュ周波数における錐体反応を単離するためにフリッカーＥＲＧｓを用いた。

（レーザ誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデル）
Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスをケタミン(100 mg/kg, Virbac, Carros, France)及びキ
シラジン(10mg/kg, Bayer HealthCare, Berlin,Germany)の腹腔内注射により麻酔した。
瞳孔を拡張し、ｓｌｉｔ ｌａｍｐ (BQ 900, Hagg-Streitt, Chambery, France)に搭載
されたＬａｓｅｒ Ｙａｇ ５３２ Ｅｙｅｌｉｔｅ(Alcon, Rueil-Malmaison, France)で４回のレーザ凝固（400 mW,50 ms, スポットの大きさ100 μm）を行った。レーザ凝固
及びブルッフ膜の裂傷を、泡の迅速な観察により確認した(Lavalette, S. et al. 2011, Berger, A. et al. 2014)。レーザ処理の後すぐに又は３日後に、マウスに対して１μｌ
のＰＢＳ、M. lebetina毒から単離したＬＣＴ（５００μＭ）、組換えＬＣＴ（５００μ
Ｍ）又はアフリベルセプト（２５μＭ）を注射した。

損傷の７日後にマウスの網膜に対してＳＤ－ＯＣＴで試験した。ＯＣＴシークエンスを得て、Ｆｉｊｉ(Schindelin, J. et al. 2012)で分析した。損傷体積を数式（４／３π＊ａ＊ｂ^２）／２で算出し、ａは縦軸に沿った測定に対応する極半径であり、ｂは横軸に対応する長半径である(Berger, A. et al. 2014)。

Ｄ７において、マウスをＣＯ２吸入により安楽死させ、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア(Molecular Devices, Saint-Gregoire, France)を用いて免疫染色された脈絡膜フラッ
トマウントＣＮＶ領域においてＣＮＶ領域を定量した。

（酸素誘発網膜症（ＯＩＲ）モデル）
乳母と共にＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊ仔マウスを、以前の報告(Connor, K. M. et al. 2009)のように生後７日目（Ｐ７）に連続５日間７５％酸素に曝露した。Ｐ１２において、マ
ウスを室内気に戻し、ＰＢＳ、M. lebetina毒から単離したＬＣＴ（５００μＭ）、組換
えＬＣＴ（５００μＭ）又はアフリベルセプト（２５μＭ）を注射した。Ｐ１７において、マウスをＣＯ２吸入により屠殺し、網膜を解剖した。虚血（ＶＯ）及び血管新生（ＮＶ）領域を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア(Molecular Devices, Saint-Gregoire, France)により、免疫染色されたフラットマウント網膜で算出した。

（ＲＴ－ＰＣＲ）
インテグリンサブユニットαＶ、α５、β３及びβ５遺伝子の発現を、レーザ損傷後０、１、３及び７日目におけるＣＮＶモデルにおいて、逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により定量した。脈絡膜をＲＮａｓｅフリー条件で解剖した。総ＲＮＡをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡＩＩ(Macherey Nagel, Hoerdt, France)で単離した。一本鎖ｃＤＮＡ、プライマーとしてのオリゴｄＴ及びｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素(Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, France)を用いて、（ＤＮａｓ
ｅＩの増幅グレード（Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, France）で前
処理された）総ＲＮＡから合成した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を、ｃＤＮＡと、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, France)と、以下のプライマー(0.5 pmol/μl) (Life Technologies, Saint-Aubin, France)：ＧＡＰＤＨセンス:５’－ＡＣＧ
ＧＣＣ ＧＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＴＧＴ ＧＣＡ－３’(配列番号５) ; ＧＡＰＤＨ
アンチセンス:５’－ＣＡＧ ＧＣＧ ＣＣＣ ＡＡＴ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＡ－３’(配列番号６); ＩＴＧＡＶ センス：５’－ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＧＧ Ａ
ＧＡ ＴＧ－３’(配列番号７);ＩＴＧＡＶアンチセンス：５’－ＡＣＧ ＴＡＣ ＡＧ
Ｇ ＡＴＴ ＧＣＧ ＣＴＣ ＴＴ－３’（配列番号８）；ＩＴＧＡ５センス：５’－ＡＧＴ ＡＣＧ ＣＡＣ ＣＴＴ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡ－３’（配列番号９）； ＩＴＧＡ５アンチセンス：５’－ＡＣＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＧＴＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＡＡＣ－３’（配列番号１０）；ＩＴＧＢ３ センス：５’－ＡＡＣ ＣＧＧ ＧＧＡ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＡ－３’（配列番号１１）；ＩＴＧＢ３アンチセンス：５’－ＣＧＧ
ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＧＣ ＣＡＧ ＴＡＴ ＣＣＧ－３’（配列番号１２）；ＩＴＧＢ５センス：５’－ＡＧＣ ＣＴＴ ＴＧＧ ＧＧＡ ＧＡＣ ＧＴＧ ＴＧＡ－３’（配列番号１３）；ＩＴＧＢ５アンチセンス：５’－ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＴ－３’（配列番号１４)とを用いて行った。

ＰＣＲ反応を９５℃で１５秒、６０℃で４５秒の４５サイクルで行った。データをＧＡＰＤＨで正規化し、参照群の値と比較して示した。

（試薬及び薬剤）
ＬＣＴを以前に説明されるように入手した(Sarray, S. et al. 2003)。簡潔に説明すると、M.lebetinaの毒をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５カラムを用いてゲルろ過した。まず、ＬＣＴをＭｏｎｏ Ｓ (HR5/5)カラムでＦＰＬＣにより精製し、０～１Ｍの線形勾配Ｎ
ａＣｌで溶出した。ＬＣＴを凍結乾燥し、次にＰＢＳで溶解した。ＬＣＴの調製品質を、アセトニトリルの線形勾配を用いたＣ８逆相ＨＰＬＣカラムで試験した(Sarray, S. et al. 2003)。アフリベルセプト(Eylea; Bayer,Lyon, France)は、Ｃｈｉａｒａ Ｅａｎｄ
ｉ博士(University of Torino)及びＡｕｄｒｅｙ Ｇｉｏｃａｎｔｉ－Ａｕｒeｇａｎ博
士(Hopital Avicenne Paris)により親切に提供された。インビボ研究のために、１μｌの以下の溶液を硝子体に注射した：５００μＭのＬＣＴ(１５μｇ／μｌ)又は２５μＭのアフリベルセプト（２．５μｇ／μｌ）。いくつかの実施例において、２μｌのＰＢＳ又は標識化ＬＣＴ、標識化アフリベルセプト又は標識化ＢＳＡを右目に注射した。

（組換えＬＣＴの生成）
α（配列番号１５）及びβ（配列番号１６）ＬＣＴサブユニット（ペプチドシグナルＭＡＣＰＧＦＬＷＡＬＶＩＳＴＣＬＥＦＳＭＡを含む（配列番号１７））をコードする２つの核酸配列は、２つのｐＣＤＮＡ３．１（＋）プラスミドにクローニングした。α及びβＬＣＴサブユニットの成熟配列は、それぞれ配列番号２及び１８である。βＬＣＴ配列は、Ｃ末端ドメインに６ヒスチジンタグを含む。ＨＥＫ ｅｘｐｉ２９３細胞に２つのコンストラクトをコトランスフェクションした。その４日後に上清を５００ｇ、４℃で１５分間の遠心分離により回収し、その後、－２０℃で保管する前に１５９００ｇ、４℃で３０分間の遠心分離及び０．２２μｍのフィルタでろ過した。上清を、室温でエンドトキシンフリーの条件で精製した。上清を解凍し、３００ｍＬにまで濃縮し、リン酸緩衝液（ＮａＰＯ_４２０ｍＭ；ＮａＣｌ ３００ｍＭ；ｐＨ７．２）を用いてタンジェンシャルフロー
・フィルトレーション（ＴＦＦ）５ｋＤａ－０．１ｍ^２カセット(Centramate serie T, PALL)で完全にろ過した。１０ｍＭのイミダゾールを加え、ヒスチジンタグ化タンパク質をＨｉｔｒａｐ ＩＭＡＣセファロースＦＦ５ｍＬ(GE healthcare Life Sciences)カラム
で精製した。前平衡化及び洗浄ステップを、２０ｍＭのＮａＰＯ_４緩衝液；ｐＨ７．２；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールで行った。４０ｍＭのイミダゾールの段階で、ほとんどの汚染物質（他の細胞のタンパク質）を除去させた。８０～５００ｍＭのイミダゾールの勾配で溶出を行った。ＬＣＴを溶出するために最適なイミダゾールの濃度は１６５ｍＭである。溶出された分画をプールし、その後に、イミダゾールの除去のために濃縮及びVivaspin（登録商標）３ｋＤａ(GE healthcare Life Sciences)でろ過した。
タンパク質をＴＢＳ緩衝液（ｔｒｉｓ－ＨＣｌ２０ｍＭ；ＮａＣｌ １５０ｍＭ；ｐＨ７
．５）に再懸濁し、０．２２μｍの膜でろ過した。

（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７による標識化タンパク質）
ＬＣＴ（５００μＭ）、アフリベルセプト（２５μＭ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１５．４μＭ）を標識するためにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ(Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, France)を用いた。タンパク質を１Ｍの重炭酸ナトリウムで溶解し、タ
ンパク質の第一級アミンと反応するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７スクシンイミドエステ
ルと混合し、４℃で１時間インキュベートした。室温でコンジュゲートタンパク質を供給されたスピンカラムを用いて未反応の色素から分離した。最終濃度を、製造者の忠告に従って最初の濃度の１／４に見積もった。

（組織学的分析）
ＣＮＶの7日後に、ＰＢＳ、又は６４７－ＬＣＴ、ケタミン(100 mg/kg, Virbac, Carros, France)及びキシラジン(10mg/kg, Bayer HealthCare, Berlin,Germany)の混合液３０
０μＬを、深い麻酔をかけられた動物に腹腔内注射した。マウスに対して５ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液、続いて３０ｍＬの４％パラホルムアルデヒド溶液により上行大動脈を介して灌流した。固定後、脳を注意深く解剖し、同一の固定剤で後固定を４８時間行った。フリーフローティング切片（４０μｍ）をビブラトーム(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)を用いて行った。

（免疫化学）
マウスをＣＯ２の吸入により安楽死させた。眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒドにより室温で３０分間固定した。ＰＢＳで数回洗浄した後、角膜及びレンズを除去し、網膜を注意深くＲＰＥ／脈絡膜／強膜から分離した。

網膜フラットマウントをヤギポリクローナル抗コラーゲンＩＶ抗体(AbD Serotec, Cergy Pontoise, France)及びＦＩＴＣ結合Bandeiraesimplicifolia（ＢＳ）－１レクチン(Si
gma-Aldrich, Saint QuentinFallavier, France)により染色した。アストロサイト及び活性化ミュラー細胞を、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体を用いて標識し、ミクログリア細胞を、ウサギポリクローナル抗Ｉｂａ１(Wako, Neuss, Germany)を用いて染色した。ＲＰＥを、脈絡膜フラットマウントにおいてＴＲＩＴＣ結合ファロイジン(Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France)を用いて染色した。ＣＮＶモデルにおいて、脈絡膜フラットマウントで、新生血管をＣＤ１０２(ラット抗マウス, BD Biosciences Pharmingen, Le Pont deClaix, France)で免疫染色し、ミクログリア細胞を抗Ｉｂａ１を用いて標識化し、内皮細胞の核をＤＡＰＩで染色した。脳切片を３％標準ヤギ血清及び０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有ブロッキング溶液中に１時間置き、その後、ウサギ抗ＡＴＦ３(Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany)及びＴＲＩＴＣ結合Bandeirae simplicifolia（ＢＳ）－１レクチンと共に４℃で４８時間インキュベートし、ＤＡＰＩで染色した。ＯＩＲモデルにおいて、網膜の毛細血管を、ＦＩＴＣ－ＢＳ－１レクチンで標識した。対応するＡｌｅｘａコンジュゲート二次抗体(Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, France)を一次抗体を表すために用いた。

網膜、脈絡膜及び脳切片を蛍光顕微鏡(DM5500B) (Leica, Saint Jorioz, France)又は
共焦点顕微鏡(FV1000)(Olympus, Rungis, France)で観察した。顕微鏡は、ＬＣＴ注射マ
ウスの観察前に参照マウス（ＰＢＳ）で較正した。

（統計分析）
データ分析及びグラフィック表示のために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ(GraphPad Software, San Diego, USA)を用いた。すべての値を平均値±ＳＥＭで示した。データを
マン－ホイットニーのＵ検定、一元配置分散分析に続くボンフェローニ又はダネットのポストテストで分析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。

［結果］
（実施例１：ＬＣＴが大動脈及び脈絡膜外植片からの血管発芽を阻害する）
ＬＣＴは、インビトロにおける内皮細胞の増殖及び血管形成を阻害する(Pilorget, A. et al. 2007)。ＬＣＴがエクスビボで血管新生を阻害するか否かを試験するために、我々はマトリゲルにてマウスの大動脈リングを培養した(Lavalette, S. et al. 2011)。大動
脈リングを３日間培養して血管発芽させ、その後に漸増用量のＬＣＴで処理した。ＬＣＴを加えた後の３日間に、血管発芽領域を定量し、Ｄ３とＤ６との間での発芽領域の（割合の）増加を示した（図１Ａ及びＢ）。参照条件において、Ｄ３とＤ６との間で血管発芽が２５９％増大した。３０ｎＭの最小濃度で加えたＬＣＴは血管発芽に影響せず、３００ｎＭのＬＣＴはＤ３からＤ６までで血管発芽を８５％減少させた。１．５μＭの用量のＬＣＴは発芽を完全に阻害し、既存のＤ３における血管発芽の退縮を引き起こした（図１Ｂ）。ＬＣＴの用量の増大は、外植片から生じ、プラスチックディッシュの表面で増殖する線維芽細胞に特に影響はなかった。次に、ＬＣＴ活性について、脈絡膜－毛細血管床からの血管の形成を厳密に再現したマウスの脈絡膜外植片モデル(Shao, Z. et al. 2013)で試験した。脈絡膜は以前に説明されるように培養組織として培養した(Shao, Z. et al. 2013)。大動脈リングの場合のように、培養組織をＤ３のときにＬＣＴで処理し、Ｄ６で分析した（図１Ｃ及びＤ）。まず、我々は、大動脈リングにおいて血管退縮が生じた用量を用いた。参照条件と比較して１．５μＭのＬＣＴで血管発芽を７８％阻害したが、Ｄ３と比較して未だ２８６％の増大が見られた。５μＭにおいて、ＬＣＴは血管の成長を有効に阻害したが、既存のＤ３における血管発芽を退縮できなかった。最後に、１５μＭにおいて、ＬＣＴはＤ３の発芽を退縮した（図１Ｄ）。従って、ＬＣＴは血管新生の２つの独立したエクスビボモデルにおける血管発芽を有効に抑制した。

（実施例２：ＬＣＴの硝子体内注射は網膜完全性を変更しない）
エクスビボの試験は、血管新生の阻害に必要な用量における変動性を示した。従って、
我々は、レーザ誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のモデルにおける血管新生を抑制するのに必要な濃度を決めるための予備実験を行った。硝子体の体積が５．３μｌとして(Remtulla, S. Et al. 1985)、１μｌのＬＣＴを硝子体注射に用い、ＬＣＴの初期濃度はその初期濃度の１／５に見積もられ得る。その薬物動態に依存して、ＬＣＴは全ての眼のコンパートメント（１０μｌ）に達し、その濃度は、初期濃度の１／１０に低減し得る。従って、動物に対して、概算で１５μＭ（脈絡膜外植片の発芽を退縮する濃度）又は５０μＭ（我々が毒から生成できる最も高い濃度）の最終濃度になるように１μｌの１５０又は５００μＭのＬＣＴを硝子体内注射した。我々は、１５０μＭのＬＣＴを１μｌ硝子体内注射することはＣＮＶを抑制するのに十分でなく、５００μｌのＬＣＴを１μｌ注射することは血管新生領域を低減することを判定した。５００μＭのＬＣＴの単回注射が網膜構造を変更するか否かを試験するために、我々は、参照の生体マウスにＬＣＴを注射し、７日後にそれらの網膜を試験した。網膜構造をＳＤ－ＯＣＴにより分析した。ＯＣＴは、網膜の全体構造において顕著な汎化を示さなかった（図２Ａ）。内及び外顆粒層並びに外側の領域の全体の網膜の厚さは、参照とＬＣＴを注射した眼との間で統計的な差は無かった（図２Ｂ）。ＥＲＧ反応を、注射から７日後の参照動物及び処理動物から記録した。ＬＣＴの硝子体内注射は、参照又はＰＢＳ注射動物と比較して、０．００３から１０ｃｄｓ／ｍ^２の範囲の強度において記録された暗順応ＥＧＲを変更しなかった（図２Ｃ；Ｄ）。同様に、明順応反応（図２Ｅ）及びフリッカー反応（図２Ｆ；Ｇ）は、参照動物と比較してＬＣＴ注射後に変更されなかった。

次に、注射の７日後における免疫化学により血管系の完全性を評価した。網膜フラットマウントを、それぞれ内皮細胞及び血管の基底膜を標識するＦＩＴＣ－ＢＳ－１レクチン及びコラーゲンＩＶで染色した。ゴースト血管（コラーゲンＩＶ陽性、レクチン陰性血管として検出される）及び新生血管房は、５００μＭのＬＣＴを用いた眼の注射で検出されなかった（図３Ａ）。血管の完全性の損失は、ミクロ及びマクログリア細胞の活性化を引き起こした。網膜フラットマウントを、抗ＧＦＡＰ（アストロサイト及び活性化ミュラー細胞に特異的）又は抗Ｉｂａ１（ミクログリア細胞に特異的）抗体で免疫染色した。ＬＣＴは、アストロサイトの形態及び血管範囲を変更せず、ＬＣＴ又はＰＢＳの硝子体内注射の１週後の網膜における内層でミュラー細胞の活性化の兆候は無かった（図３Ｂ）。次に、我々は、ＣＸ３ＣＲ１^{＋／ＧＦＰ}マウスの硝子体内へのＬＣＴの注射後に、ミクログリア細胞の形態について試験した。ＬＣＴは、浅神経叢又は深神経叢に位置するＣＸ３ＣＲ１陽性細胞の形態を変更しなかった。ＲＰＥ細胞の形態を、ＬＣＴ注射の７日後にＴＲＩＴＣ結合ファロイジンを用いて評価した。ＲＰＥ細胞死又はＲＰＥ形態の変更の兆候は検出されなかった（図３Ｄ）。我々の結果は全て、ＬＣＴが注射の７日後において、網膜構造、網膜機能又は血管の完全性を変更しないことを示した。

（実施例３：ＬＣＴはレーザ誘発脈絡膜血管新生を阻害する）
我々は、ＬＣＴがインビトロでのＨＢＭＥＣの増殖及び管形成(Pilorget, S. et al. 2007)、並びに血管新生のエクスビボモデルでの血管発芽（図１）を血管完全性に影響なく（図３）阻害することを示した。ＬＣＴがインビボで血管新生を阻害するか否かを試験するために、ＬＣＴ活性をＣＮＶマウスモデルで評価した。インテグリンサブユニットαｖ及びα５は、ラットＣＮＶモデルにおいてＤ３からＤ７まで増大されることが最近に示された(Nakajima, T. et al. 2014)。我々は、レーザ誘発脈絡膜損傷後の異なる時点でのマウス脈絡膜におけるインテグリンサブユニットαｖ、α５、β３及びβ５の発現を定量した。Ｄ０において脈絡膜損傷を眼科用レーザで誘発し、Ｄ１、Ｄ３及びＤ７で脈絡膜を回収した。これらのサブユニットの発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより分析し、非損傷脈絡膜（Ｄ０）と比較した。全てのサブユニットの発現は、損傷後２４時間以内に増大が見られ、Ｄ３でピークとなった。Ｄ７において、αｖは基底レベルに戻ったが、α５、β３及びβ５は高いレベルを維持した（図４Ａ）。硝子体内注射後のＬＣＴ結合特異性を決定するために、次に我々は、レーザ損傷された眼の硝子体内に標識分子を注射した。ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、ＬＣＴ及びアフリベルセプトに、マイクロスケールタンパク質標識キットを用いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７色素を共有結合的にコンジュゲートし、その後に精製し、屠殺（Ｄ７）の３日前（Ｄ４）に右眼に注射した。左眼にはＰＢＳを注射した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７にコンジュゲートされたＢＳＡ（６４７－ＢＳＡ）は、Ｃ
Ｄ１０２陽性ＣＮＶ損傷を標識しなかった。これに対して、６４７－ＬＣＴ及び６４７－アフリベルセプトは、脈絡膜フラットマウントにおいてＣＤ１０２陽性ＣＮＶを標識した（図４Ｄ；Ｅ）。その後、網膜フラットマウントをコラーゲンＩＶで標識して、血管基底膜及び沈着物を検出した。強い６４７－ＬＣＴの標識は、ＣＮＶ損傷に面する網膜の外側部分に見られ、弱い標識はＬＣＴ注射された眼の大きい血管で観察された。反対側のＰＢＳが注射された眼では標識は見られなかった。次に、我々は、６４７－ＬＣＴが注射された動物における視神経、三叉神経及び脳の異なる領域における６４７－ＬＣＴの標識を分析し、ＰＢＳのみが注射された動物の標識と比較した。ＬＣＴは、視神経及び三叉神経において検出されず（図示せず）、海馬、梨状皮質、前帯状皮質、視床下部、腹側視索前核（ＶＭＰＯ）及び尾状核被殻（線条体）においても検出されなかった。さらに、我々は神経細胞障害を示すＡＴＦ３標識を検出しなかった(Launay, P. S. et al. 2016; Tsujino,
H. et al. 2000)。

インビボにおけるＬＣＴの抗血管新生特性を決定するために、我々は、Ｄ０にＬＣＴを単回注射した後、以前に説明されるように(Berger, A. et al. 2014)、レーザ刺激後７日間の損傷体積を定量し、ＰＢＳ処理をした動物の損傷体積と比較した。ＬＣＴ注射は、参照と比較して損傷体積を３１．９％低減した（図５Ａ）。次に、我々は、Ｄ７においてＣＤ１０２で染色された脈絡膜フラットマウントにおける新生血管により覆われた領域を定量した。ＣＮＶ領域は、ＬＣＴ注射後７日間で顕著に２６．７％低減された（図５Ｂ；Ｃ）。抗ＶＥＧＦを、ＡＭＤ患者における脈絡膜の血管新生を治療するためにルーチン的に用いられる(Kovach, J. L. et al. 2012)。次に、我々は、ＬＣＴを抗ＶＥＧＦと比較し
た。ベバシズマブ及びラニビズマブの市販の抗体は、ヒトＶＥＧＦのみを認識し、従って、我々はヒト及びマウスＶＥＧＦの両方に結合するアフリベルセプトを用いた(Papadopoulos, N. et al. 2012)。アフリベルセプトの単回注射は、脈絡膜の血管新生を３１．５％減少させた（図５Ｂ；Ｃ）。ＬＣＴ及びアフリベルセプト処理された損傷は、大きさに統計的な差が無かった（図５Ａ）。網膜下の単核貪食細胞（ｓＭＰ）は、脈絡膜の血管新生に関与する(Lambert, V. et al. 2013)。損傷の周囲におけるｓＭＰの蓄積において、Ｌ
ＣＴの効果を評価するために、脈絡膜のフラットマウントをｓＭＰを標識する抗Ｉｂａ１抗体で染色した。損傷の周囲におけるｓＭＰの数は、ＬＣＴ及びＰＢＳ処理された眼で差が見られなかった。同様に、ｓＭＰの数は、ＬＣＴ及びアフリベルセプト処理された損傷で差が見られなかった。

インテグリンαｖβ３及びαｖβ５は血管新生の重要な制御因子であり、従って、我々はＬＣＴ注射がそれらの発現を制御するか否かを決定した。αｖβ３及びαｖβ５は内皮の増殖により発現されるので、我々は、ＬＣＴの注射後（２４ｈ）すぐにαｖ、α５、β３及びβ５の発現を調べて、ＬＣＴの長期の抗血管新生効果から可能性がある転写制御を区別した。αｖ、α５、β３及びβ５の発現はＤ３で最大となり、従って、我々は、Ｄ２におけるＬＣＴ又はＰＢＳの単回投与の後、Ｄ３にそれらの発現を分析した。ｑＰＣＲ分析は、ＲＰＥ／脈絡膜抽出物におけるＬＣＴとＰＢＳとの間のそれらの発現レベルの顕著な差を示さなかった（図５Ｅ）。

我々は、高容量のＬＣＴが既存の血管を退縮することを示し（図１）、従って、次に我々は、レーザ処理の３日後に硝子体内にＬＣＴを注射し、血管新生の大きさを定量した。初期の血管成長後に注射した際に、ＬＣＴ注射は１９％の血管退縮をさせた（図６Ａ；Ｂ）。全ての我々の結果は、ＬＣＴの単回投与がｓＭＰの漸増を害することなく、脈絡膜の血管新生の防止及び退縮をさせることを示した。

（実施例４：ＬＣＴは酸素誘発網膜症（ＯＩＲ）モデルにおける網膜の血管新生を阻害する）
次に我々は、ＯＩＲモデルにおいて、いくつかの静脈うっ血性網膜症の特徴である網膜血管新生におけるＬＣＴの効果を試験した。このモデルは、網膜の血管損失、血管再生、血管新生及び新生血管の退縮を理解するために広く用いられている(Connor, K. M. et al. 2009)。げっ歯類の新生児に対してＰ７からＰ１２に高酸素を与えることにより網膜の
血管新生を誘導して、生理学的な血管発生を阻害する。動物が室内気に戻されると、相対的な網膜の低酸素がＰ１２からＰ１７の間で重度の網膜血管新生を引き起こす(Smith, L.
E. et al. 1994)。ＬＣＴの結合特異性を決定するために、まず我々は、ＯＩＲを受けた動物に対して、Ｐ１７での屠殺の３日前にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲートＬＣＴ（６４７－ＬＣＴ）を硝子体内に注射した。６４７－ＬＣＴは、ＢＳ－１レクチン陽性新生血管房を強く標識したが、網膜血管系は標識しなかった（図７Ａ）。ＯＩＲモデルにおけるＬＣＴの抗血管新生特性を評価するために、Ｐ７マウスに対してＯＩＲを受けさせて、１２日目に１μｌのＰＢＳ又は５００μＭのＬＣＴを注射し、室内気に戻した。マウスをＰ１７で屠殺し、虚血（ＶＯ）及び血管新生領域（ＮＶ）を、以前に説明されるように(Stahl, A. et al. 2009)ＢＳ－１を用いて染色された網膜フラットマウントで決定
した。ＬＣＴは、ＰＢＳ注射と比較してＶＯの比率を変更しなかった（図７Ｂ；Ｄ）。対照的に、Ｐ１２でのＬＣＴの単回注射は、Ｐ１７において網膜血管新生で覆われる領域を４８．１％低減した（図７Ｂ；Ｅ）。ＬＣＴ処理を抗ＶＥＧＦ治療と比較するために、網膜形成に影響なくＮＶの低減を示す用量( Stahl, A. et al. 2009)である２５μＭのアフリベルセプトをＰ１２において注射し、ＮＶ及びＶＯをＬＣＴ動物と比較した。ＬＣＴ処理とアフリベルセプト処理との間でＶＯ及びＮＶの差は見られなかった。

（実施例５：ＬＣＴ及びアフリベルセプトの同時注射は、アフリベルセプト単独よりも強い血管新生阻害を起こす）
次に我々は、ＯＩＲモデルの網膜血管新生に対するＬＣＴ及びアフリベルセプトの同時注射の効果を試験した。ＯＩＲモデルへのＬＣＴ及びアフリベルセプトの同時注射の抗血管新生特性を評価するために、Ｐ７マウスに対してＯＩＲを受けさせ、１２日目に１μｌのＰＢＳ、５００μＭのＬＣＴ、２５μＭのアフリベルセプト、又は５００μＭのＬＣＴ及び２５μＭのアフリベルセプトを注射し、室内気に戻した。マウスをＰ１７で屠殺し、虚血（ＶＯ）及び血管新生領域（ＮＶ）を、ＢＳ－１レクチンで染色された網膜フラットマウントにおいて決定した。ＬＣＴ及びアフリベルセプトの同時注射は、ＰＢＳと比較してＶＯの比率を変更しなかった（図８）。対照的に、ＬＣＴ及びアフリベルセプトの同時注射は、アフリベルセプト又はＬＣＴの単独よりも強い血管新生阻害を起こした。

（実施例６：組換えＬＣＴは脈絡膜の培養組織からの血管発芽を阻害する）
脈絡膜の毛細血管床からの血管の形成を厳密に再現するマウス脈絡膜培養組織モデル(Shao, Z. et al. 2013)において、組換えＬＣＴ活性を試験した。脈絡膜を以前に説明された培養組織と同様に(Shao, Z. et al. 2013)、培養した。培養組織をＤ３において組換えＬＣＴ（ｒＬＣＴ）で処理し、Ｄ６において分析した（図９）。参照条件と比較して、１．５μＭのｒＬＣＴは血管発芽を６５．０％阻害した。

（実施例７：組換えＬＣＴは酸素誘発網膜症（ＯＩＲ）モデルにおける網膜血管新生を阻害する）
次に我々は、ＯＩＲモデルにおいて、重度の静脈うっ血性網膜症の特徴である網膜の血管新生における組換えＬＣＴの効果を試験した。網膜の血管新生は、生理学的血管形成を阻害するために、げっ歯類の新生児にＰ７からＰ１２において高酸素を与えることにより誘導される。動物が室内気に戻された際に、相対的な低酸素がＰ１２からＰ１７において重度の網膜血管新生を引き起こす(Smith, L. E. et al. 1994)。ＯＩＲモデルにおけるｒ
ＬＣＴの抗血管新生特性を評価するために、Ｐ７マウスに対してＯＩＲを受けさせ、１２日目に１μｌのＰＢＳ又は５００μＭのｒＬＣＴを注射し、室内気に戻した。マウスをＰ１７において屠殺し、虚血（ＶＯ）及び血管新生領域（ＮＶ）を、以前に説明されるように(Stahl, A. et al. 2009)ＢＳ－１レクチンで染色された網膜フラットマウントにおい
て決定した（図１０Ａ）。ｒＬＣＴは、ＰＢＳ注射と比較してＶＯの比率を変更しなかった（図１０Ｂ）。対照的に、Ｐ１２におけるｒＬＣＴの単回注射は、Ｐ１７における網膜血管新生により覆われた領域を２２．１％低減した（図１０Ｃ）。

（実施例８：組換えＬＣＴはレーザ誘発脈絡膜血管新生を阻害する）
組換えＬＣＴがインビボにおける血管新生を阻害するか否かを試験するために、ｒＬＣＴ活性をＣＮＶマウスモデルにおいて評価した。Ｄ０において眼科用レーザを用いて脈絡膜損傷を誘発し、Ｄ７で脈絡膜を回収した。インビボにおけるｒＬＣＴの抗血管新生特性を決定するために、我々は、Ｄ７においてＣＤ１０２で染色された脈絡膜フラットマウントにおける新生血管により覆われた領域を定量した（図１１Ａ）。ＣＮＶ領域は、ｒＬＣＴ注射の７日後に顕著に２９．８％低減した（図１１Ｂ）。

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Claims (26)

1. 網膜血管新生又は脈絡膜血管新生疾患の治療のための医薬組成物であって、該医薬組成物はレベセチン及びその機能的変異体から選択されるタンパク質を含み、前記タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列、又はその配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１サブユニットと、
   配列番号４若しくは配列番号１８のアミノ酸配列、又はその配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２サブユニットと、を含む、医薬組成物。
2. 第１サブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、
   第２サブユニットは、配列番号４若しくは配列番号１８のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ２つのサブユニットはジスルフィド架橋により結合され、それによってヘテロ二量体を形成する請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 前記タンパク質はレベセチンの機能的変異体であり、
   第１サブユニットは、配列番号２の配列と比較して１～１０の欠失された、置換された、又は挿入されたアミノ酸残基を有する配列からなる又は含み、及び／又は、
   第２サブユニットは、配列番号４若しくは配列番号１８の配列と比較して１～１０の欠失された、置換された、又は挿入されたアミノ酸残基を有する配列からなる又は含む請求項１に記載の医薬組成物。
5. 前記アミノ酸残基の置換は、アミノ酸保存的置換であり、
   前記アミノ酸保存的置換とは、表１の左列のアミノ酸残基から右列のアミノ酸残基に置換されることを意味する請求項４に記載の医薬組成物。
   

   
6. 前記タンパク質はレベセチンの機能的変異体であり、
   １）α鎖とβ鎖との間の鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステイン残基、すなわち配列番号１のＣｙｓ２７、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ５５、Ｃｙｓ１０６、Ｃｙｓ１２９、Ｃｙｓ１４６及びＣｙｓ１５４、並びに、配列番号３のＣｙｓ２７、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ５５、Ｃｙｓ１００、Ｃｙｓ１２１、Ｃｙｓ１３６及びＣｙｓ１４４；
   ２）ＨＣＹドメインの残基、すなわち配列番号１のＨｉｓ３７、Ｃｙｓ３８及びＴｙｒ３９、並びに、配列番号３のＨｉｓ３７、Ｃｙｓ３８及びＴｙｒ３９；
   ３）ＤＡＥＫドメインの残基、すなわち配列番号１のＡｓｐ５０、Ａｌａ５１、Ｇｌｕ５２及びｌｙｓ５３、並びに、配列番号３のＡｓｐ５０、Ａｌａ５１、Ｇｌｕ５２及びｌｙｓ５３；及び／又は
   ４）ＷＩＧＬ又はＷＭＧＬモチーフの残基、すなわち配列番号１のＴｒｐ９４～Ｌｅｕ９７、及び配列番号３のＴｒｐ９０～Ｌｅｕ９３、
   に対応する残基が保存されている請求項１、４及び５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. 前記タンパク質はレベセチンである請求項１に記載の医薬組成物。
8. レベセチンは、M. lebetinaの毒から単離された又は組換えタンパク質である請求項７に記載の医薬組成物。
9. 網膜血管新生又は脈絡膜血管新生疾患の治療のための医薬組成物であって、該医薬組成物は請求項１～８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸配列、又は該核酸配列を含む発現ベクターを含む、医薬組成物。
10. 医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含む請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 少なくとも１つの血管新生阻害剤と組み合わせて用いられる又はさらに含む請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記血管新生阻害剤は、ＶＥＧＦ経路の阻害剤である請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 前記ＶＥＧＦ経路の血管新生阻害剤は、アフリベルセプトである請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 治療される対象は、血管新生阻害剤、好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤、より好ましくはアフリベルセプトによる治療に反応しない又は耐性となった対象である請求項１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 網膜血管新生又は脈絡膜血管新生疾患の治療のための薬剤の製造におけるタンパク質の使用であって、
    前記タンパク質はレベセチン及びその機能的変異体から選択され、前記タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列、又はその配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１サブユニットと、
    配列番号４若しくは配列番号１８のアミノ酸配列、又はその配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２サブユニットと、を含む、使用。
16. 第１サブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列からなり、
    第２サブユニットは、配列番号４若しくは配列番号１８のアミノ酸配列からなる、請求項１５に記載の使用。
17. ２つのサブユニットはジスルフィド架橋により結合され、それによってヘテロ二量体を形成する請求項１５又は１６に記載の使用。
18. 前記タンパク質はレベセチンの機能的変位体であり、
    第１サブユニットは、配列番号２の配列と比較して１～１５の欠失された、置換された、又は挿入されたアミノ酸残基を有する配列からなる又は含み、及び／又は、
    第２サブユニットは、配列番号４若しくは配列番号１８の配列と比較して１～１５の欠失された、置換された、又は挿入されたアミノ酸残基を有する配列からなる又は含む請求項１５に記載の使用。
19. 前記アミノ酸残基の置換は、アミノ酸保存的置換であり、
    前記アミノ酸保存的置換とは、表２の左列のアミノ酸残基から右列のアミノ酸残基に置換されることを意味する請求項１８に記載の使用。
    

    
20. 前記タンパク質はレベセチンの機能的変異体であり、
    １）α鎖とβ鎖との間の鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステイン残基、すなわち配列番号１のＣｙｓ２７、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ５５、Ｃｙｓ１０６、Ｃｙｓ１２９、Ｃｙｓ１４６及びＣｙｓ１５４、並びに、配列番号３のＣｙｓ２７、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ５５、Ｃｙｓ１００、Ｃｙｓ１２１、Ｃｙｓ１３６及びＣｙｓ１４４；
    ２）ＨＣＹドメインの残基、すなわち配列番号１のＨｉｓ３７、Ｃｙｓ３８及びＴｙｒ３９、並びに、配列番号３のＨｉｓ３７、Ｃｙｓ３８及びＴｙｒ３９；
    ３）ＤＡＥＫドメインの残基、すなわち配列番号１のＡｓｐ５０、Ａｌａ５１、Ｇｌｕ５２及びｌｙｓ５３、並びに、配列番号３のＡｓｐ５０、Ａｌａ５１、Ｇｌｕ５２及びｌｙｓ５３；及び／又は
    ４）ＷＩＧＬ又はＷＭＧＬモチーフの残基、すなわち配列番号１のＴｒｐ９４～Ｌｅｕ９７、及び配列番号３のＴｒｐ９０～Ｌｅｕ９３、
    に対応する残基が保存されている請求項１５、１８及び１９のいずれか１項に記載の使用。
21. 前記タンパク質はレベセチンである請求項１５に記載の使用。
22. 前記レベセチンは、M. lebetinaの毒から単離された又は組換えタンパク質である請求項２１に記載の使用。
23. 前記タンパク質は、少なくとも１つの血管新生阻害剤と組み合わせて用いられる請求項１７～２２のいずれか１項に記載の使用。
24. 前記血管新生阻害剤は、ＶＥＧＦ経路の阻害剤である請求項２３に記載の使用。
25. 前記ＶＥＧＦ経路の血管新生阻害剤は、アフリベルセプトである請求項２４に記載の使用。
26. 治療される対象は、血管新生阻害剤、好ましくはＶＥＧＦ経路の阻害剤、より好ましくはアフリベルセプトによる治療に反応しない又は耐性となった対象である請求項１７～２５のいずれか１項に記載の使用。

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