KR20240025713A - 신혈관화 억제제로서 c-형 렉틴인, 레베세틴 - Google Patents

신혈관화 억제제로서 c-형 렉틴인, 레베세틴 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신혈관화 억제제로서, 특히, 신혈관 질환, 예컨대, 신혈관 성분을 지닌 안과 질환, 암 또는 염증성 장애의 치료시 사용하기 위한 레베세틴, 이의 기능성 변이체 또는 단편에 관한 것이다.

Description

신혈관화 억제제로서 C-형 렉틴인, 레베세틴{LEBECETIN, A C-TYPE LECTIN, AS NEOVASCULARIZATION INHIBITOR}
발명의 분야
본 발명은 의약 분야, 특히 신혈관과 관련된 질환의 치료, 및 바람직하게는 신장 신혈관화와 관련된 안구 질환(ocular disease)의 치료에 관한 것이다.
발명의 배경
노화 관련 시력 감퇴(AMD)는 55세 이상의 연령인 사람에서 실명의 주된 원인이며, 당뇨병성 망막병증(DR), 망막 정맥 폐색증(retinal vein occlusion) 및 미숙아 망막증과 같은 허혈성 망막병증은 55세 미만의 연령의 사람에서 실명의 주요 원인이다(Friedman DS et al. 2004; Kempen JH et al. 2004; Klein R et al. 2004). 이러한 병리학의 증식성 형태(습성 AMD 및 증식성 당뇨병성 망막병증)는 신속하고 비-가역적인 시력 상실을 야기한다. AMD에서, 신생 혈관은 주로 혈관 맥락막 층(vascular choroidal bed)으로부터 유래하며 망막하 공간내에서 또는 망막 색소 상피(RPE) 아래에서 성장하는 반면, DR의 증식성 형태(PDR)에서, 신경성 허혈은 망막 혈관으로부터의 신혈관화를 개시한다.
신혈관화로 또한 불리는 신생혈관형성(Neoangiogenesis)은 기존의 혈관으로부터 신혈관화의 모세혈관 스프라우팅(capillary sprouting) 및 구조화(configuring)의 기본 과정이다. 이는 맥관생성(vasculogenesis)/혈관형성(anovasculatore)과는 대조적으로, 순환계의 발생학적 발달 동안 또는 순환하는 내피 선조세포로부터 성체 유기체내에서 발생하는 혈관 형성의 다른 과정이다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 망막 및 맥락막 혈관형성의 주요 매개인자이다(D'Amore P.A. et al. 1994). VEGF에 대해 지시된 항체 또는 VEGFR1의 가용성 형태의 안구내 주사는 습윤 AMD에서 맥락막 신혈관화를 효과적으로 억제한다. 그러나, 치료-나이브(nave) 환자의 10%는 항-VEGF에 반응하지 않으며(Brown, D. M. et al. 2006; Rosenfeld P.J. et al. 2006) 항-VEGF 반응자의 2 내지 10%는 시간이 지나면서 내성으로 된다(Forooghian, F. et al. 2009; Eghøj, M. S. et al. 2012). 항-VEGF 치료요법은 또한 당뇨병성 황반 부종의 첫번째 라인 치료이다. 대조적으로, 망막 신혈관화(RNV)로 특징지워지는 PDR은 대부분 예방적인 범망막성 광응고법(pan-retinal photocoagulation: PRP)으로 치료된다(Martinez-Zapata, M. J. et al. 2014). 항-VEGF는 PRP에 대한 대안으로서 PDR의 치료용으로 미국에서 현재 승인되어 있다. 진행중인 연구는 이러한 새로운 처방에서 자발적인 및 획득된 내성의 비율을 결정할 것이다. 모두 함께, 이러한 임상 데이타는 VEGF 경로를 주로 표적화하지 않는 추가의 항-신혈관화 치료요법에 대한 필요성을 뒷받침한다.
또한, 망막 신혈관화가 급속한 시력 상실에 관여하는 삼출 및 출혈과 관련되어 있으므로, 따라서 과도한 신혈관화 및 혈관 누출을 차단하는 대안적 경로를 확인하는 것은 거대한 치료학적 이익이다.
발명의 요약
본 발명자들은 본원에서 레베세틴의 예상치못한 효과를 나타내었다. 실제로, 이들은 레베세틴이 맥락막 또는 망막 신혈관화의 정도를 효율적으로 감소시킴으로써 신혈관화를 억제하는 새로운 전략을 제공함을 입증하였다.
따라서, 제1 국면에서, 본 발명은 신혈관 질환의 치료에 사용하기 위한 레베세틴 및 이의 기능성 변이체 및 단편으로부터 선택된 단백질에 관한 것이다.
특히, 이러한 단백질은 레베세틴일 수 있거나 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2와 적어도 75% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 제1의 소단위(subunit) 및 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4의 아미노 서열, 또는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 제2 소단위를 포함하는 레베세틴의 기능성 변이체일 수 있다. 레베세틴의 상기 기능적 변이체는 또한 서열 번호: 1 또는 2로부터 유래하는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 30개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제1의 소단위, 및/또는 서열 번호: 3 또는 4로부터 유래한 서열을 포함하거나, 이로 이루어지고 1 내지 30개의 아미노산 보존적 치환을 포함하거나, 이로 이루어진 제2의 소단위를 포함할 수 있다. 바람직하게는 1) 알파 쇄와 베타 쇄 사이의 디설파이드 브릿지(disulfide bridge) 내 또는 브릿지 간에 포함된 시스테인 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 Cys27, Cys38, Cys55, Cys106, Cys129, Cys149 및 Cys 154, 및 서열 번호: 3의 Cys27, Cys38, Cys55, Cys100, Cys123, Cys136 및 Cys 144; 및/또는 2) HCY 도메인(domain)의 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 His37, Cys38, Tyr39 및 서열 번호: 3의 His37, Cys38, Tyr39; 및/또는 3) DAEK 도메인의 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 Asp50, Ala51, Glu52 및 lys53 및 서열 번호: 3의 Asp50, Ala51, Glu52 및 lys53; 및/또는 4) WIGL 모티프(motif)의 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 Trp94 내지 Leu96 및 서열 번호:3의 Trp94 내지 Leu96은 레베세틴의 기능성 변이체내에 보존되어 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용된 단백질은 엠. 레베티나(M. lebetina) 독으로부터 단리되거나 재조합 단백질이다.
제2 양태에서, 본 발명은 신혈관 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따라 사용된 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 사용된 단백질, 핵산 또는 벡터 및 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신혈관 질환의 치료시 사용하기 위한 상기 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 약제학적 조성물은 또한 적어도 하나의 추가의 활성 물질, 바람직하게는 하나의 혈관형성 억제제, 보다 바람직하게는 VEGF 경로의 억제제를 포함한다.
특수한 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 적어도 하나의 혈관형성 억제제, 바람직하게는 VEGF 경로의 억제제와 조합하여 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물로 치료될 대상체는 혈관형성 억제제, 바람직하게는 VEGF 경로의 억제제에 대해 반응하지 않거나 이에 대해 내성이 되는 대상체이다.
신혈관 질환은 안구 신혈관 질환 및 신생혈관 성분을 지닌 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 신생혈관 질환은 바람직하게는 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 망막성 허혈 또는 증식성 당뇨망막병증과 같은 당뇨 망막병증, 홍채 신혈관화, 안구내 신혈관화, 각막 신혈관화, 망막 신혈관화, 맥락막 신혈관화 및 각막 염증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 안구 신생혈관 질환이다. 일부 다른 구현예에서, 신혈관 질환은 바람직하게는 폐, 유방, 위, 결장직장, 췌장 및 뇌 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 신혈관 성분을 지닌 암이다.
도면의 간단한 설명
도 1: LCT는 대동맥 및 맥락막 체외이식편으로부터 스프라우팅(sprouting)되는 혈관을 억제한다. (A, C) 대동맥 및 맥락막 내피 스프라우트의 대표적인 현미경사진. (B) 대조군 및 LCT(30 nM, 300 nM, 1.5 μM) 그룹(n = 그룹당 4마리, *p 0.05; 일원(one-way) ANOVA에 이은 던네트 사후 시험(Dunnett's post-test); 대조군으로서 CTL, 3개의 독립된 실험 중 대표)에서 P4 루이스 랫트(Lewis rat) 새끼로부터의 대동맥 환으로부터 스프라우팅되는 혈관의 측정. (D) 대조군 및 LCT(1.5 μM, 5 μM, 15 μM) 그룹, (n≥ 그룹당 5마리, *p <0.05; 일원 ANOVA에 이은 던네트 사후 시험; 대조군으로서 CTL, 3개의 독립된 실험 중 대표)에서 3주령 C57BL/6JRj 수컷 마우스로부터 맥락막 체외이식편으로부터 스프라우팅되는 혈관의 측정. A 및 C에서 기준자(scale bar): 200 μm.
도 2: LCT 유리체내 주사는 시각 기능을 변경시키지 않는다. (A)　1 μl의 PBS 또는 LCT(500 μM)의 유리체내 주사 7일(D7) 후 망막의 대표적인 SD-OCT 영상. (B) 그룹당 n=4개의 눈에서, 500 μm의 시신경에서 전체 망막, ONL, INL 및 OS의 두께의 정량화. (C) 0.3 cds/m2에서 CTL, PBS 및 LCT 그룹의 암순응 ERG 기록으로부터 대표적인 망막전위도 추적. (D) 상이한 자극 강도(0.003 cd.s/ m2; 0.03 cd.s/ m2; 0.3 cd.s/m2; 3 cd.s/ m2; 10 cd.s/ m2)에서 암소시(scotopic) 기록된 a- 및 b-파장 진폭. (E) 10 cd.s/m2의 광 적응된 동물의 섬광 강도에서 광 반응 진폭. (F) 1 cd.s/m2 강도에서 10 Hz의 섬광 빈도에서 기록된 ERG 플리커(flicker)로부터 대표적인 망막전위도 추적. (G) 10 및 20 Hz의 섬광 빈도에서 기록된 플리커 반응 진폭, n = 각각의 ERG 기록을 위한 그룹당 10개의 눈. IPL: 내부 망상층(Inner plexiform layer), INL: 내부 핵 층, ONL: 외부 핵 층, OLM: 외부 경계막. A에서 기준자 = 100 μm.
도 3: LCT 유리체내 주사는 혈관 온전성(vascular integrity)을 변경시키지 않는다. (A) FITC-커플링된 BS-1 렉틴(녹색), 콜라겐-IV(적색)로 면역염색된 C57BL/6JRj 마우스로부터 망막 플랫마운트(retinal flatmount)의 현미경사진, 및 (B) PBS(1 μl) 또는 LCT(1 μl, 500 μM)의 유리체내 주사 후 7일째 GFAP(녹색). (C) PBS (1 μl) 또는 LCT (1 μl, 500 μM)의 유리체내 주사 후 7일째에 내부 및 외부 혈관총(plexus)내 콜라겐-IV(적색) 및 Iba1(녹색) 항체로 면역염색된 CX3CR1+/GFP 마우스로부터 망막 플랫마운트의 현미경사진. (D) PBS(1μl) 또는 LCT(1 μl, 500 μM)의 유리체내 주사 후 7일째에 TRITC-커플링된 팔로이딘(적색) 및 DAPI(청색)으로 공-면역염색된 C57BL/6JRj 마우스로부터 맥락막 플랫마운트. A, B 및 C에서 기준자 = 50 μm; D = 100 μm.
도 4: LCT는 CNV 병변에 결합한다. (A) 레이저-유도된 맥락막 병변 후 0, 1, 3, 및 7일째에 수집된 C57BL/6JRj 맥락막의 GADPH mRNA로 표준화된 인테그린 소단위 mRNA(αv, α5, β3, β5)의 정량적 RT-PCR (B) 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 염료에 공유결합으로 접합된 소 혈청 알부민(647-BSA), LCT(647-LCT) 또는 알플리베르셉트(647-아플리베르셉트)의 유리체내 주사 후 4일째에 맥락막 플랫마운트에서 7일째 레이저-유도된 CNV 병변의 현미경사진. 모든 맥락막을 CD102 항체(녹색)로 공-염색하였다. B-E에서 기준자 = 50 μm.
도 5: LCT는 레이저-유도된 맥락막 신혈관화를 억제한다. (A) PBS (1 μl), LCT (1 μl, 500 μM) 및 아플리베르셉트(1 μl, 25 μM)의 레이저 및 유리체내 주사 후 7일째에 맥락막 병변의 대표적인 SD-OCT 영상 및 병변 용적의 정량화. (n=26, 그룹당 각각 35 및 16회의 레이저 충격. *p<0.05; 일원 ANOVA에 이은 본페로니 사후 시험(Bonferroni post-test); 대표적인 2회의 별도의 실험). 병변 용적은 다음의 식을 사용하여 추론한다: (4/3π*a*b2)/2(여기서 a는 극성 반경(수직 축)이고　b는 적도 반경(equator radius)(수평 축)이다). (B) CD102(녹색), Iba1(적색) 및 DAPI(청색)으로 염색된 맥락막 플랫마운트의 PBS(1 μl), LCT(1 μl, 500 μM) 및 아플리베르셉트(1 μl, 25 μM)에서 CNV 병변의 현미경사진. (C) 레이저 및 PBS(1 μl), LCT(1 μl, 500 μM) 및 아플리베르셉트(1 μl, 25 μM)의 유리체내 주사 후 7일째에 CNV(CD102-양성 부위)의 정량화(그룹 당 각각 n=29, 32 및 30회의 레이저 충격. *p<0.05; 일원 ANOVA 후 본페로니 사후 시험; 대표적인 2회의 별도의 실험). (D) PBS(1μl), LCT(1 μl, 500 μM) 및 아플리베르셉트(1μl, 25 μM)의 레이저 및 유리체내 주사 후 7일째에 충격당 Iba1 양성 세포의 정량화(그룹 당 각각 n=29, 32 및 30회의 레이저 충격. *p<0.05; 일원 ANOVA에 이은 본페로닌 사후 시험; 대표적인 2회의 별도의 실험). (E) D3에서 C57BL/6JRj 맥락막의 GADPH mRNA로 표준화된 인테그린 소단위 mRNA (αv, α5, β3, β5)의 정량적 RT-PCR. 마우스를 그룹당 n=5개의 눈에서, D2에서 PBS(1μl) 또는 LCT(1 μl, 500 μM)의 단일의 수정체내 주사로 치료하였다. INL: 내부 핵 층, ONL: 외부 핵 층, A= 50 μm; B=100 μm에서 기준자.
도 6: D3에서 LCT 유리체내 주사는 맥락막 신혈관화를 억제한다. (A) 레이저(D0) 및 PBS(1μl), LCT(1 μl, 500 μM)의 유리체내 주사(D3) 후 7일째에 CD102(녹색), 및 DAPI(청색)으로 염색된 CNV 병변의 현미경사진. (B) D7(n=27 및 그룹당 28회의 레이저 충격)에서 PBS 및 LCT 맥락막 플랫마운트에서 CNV(CD102-양성 부위)의 정량화. *p<0.05; 만-휘트니(Mann-Whitney) U 시험test; 대표적인 2회의 별도의 실험), 기준자 A=100μm.
도 7: LCT는 산소 유도된 망막병증(OIR) 모델에서 망막 신혈관화를 억제한다. (A) 알렉사 플루오르 647 염료(적색)에 공유결합으로 접합된 LCT(647-LCT)의 P14에서 유리체내 주사를 제공받은 P17-OIR C57BL/6JRj 마우스의 FITC-커플링된 BS-1 렉틴-염색된 망막(녹색)의 현미경사진. (B) PBS(1μl), LCT(1μl, 500 μM) 또는 아플리베르셉트(1μl, 25 μM)의 P12에서 유리체내 주사 후, P17-OIR C57BL/6JRj 마우스의 FITC-커플링된 BS-1 렉틴-염색된 망막의 현미경사진. 신혈관화(NV) 및 혈관-폐색(VO) 부위를 각각 백색 및 적색으로 강조하였다. (C) BS-1 렉틴-염색된 대조군 및 치료된 망막에서 신혈관화의 대표적인 공초점 현미경 사진. (D) 혈관-폐색의 정량화 및 (E) P17 대조군 및 치료된 망막 플랫마운트내 신혈관화(BS-1 렉틴 양성-부위), (n= 각각 35, 32 및 16개의 OIR-망막. *p< 0.05; 일원 ANOVA에 이은 본페로니 사후 시험; 대표적인 2회의 별개의 실험). A= 30 μm; B= 80 mm; C = 100 μm에서의 기준자.
도 8: (A) 신혈관화(BS-1 렉틴 양성-부위)의 정량화 및 (B) PBS(1μl), LCT(1μl, 500 μM), 아플리베르셉트(1μl, 25 μM) 또는 LCT+아플리베르셉트(1μl 500 μM LCT/25 μM 아플리베르셉트)의 P12에서 유리체내 주사 후, P17-OIR C57BL/6JRj 마우스에서 혈관 폐색, (n= 각각 35, 32, 16 및 24개의 OIR-망막).*p<0.05; 일원 ANOVA에 이은 둔네트 사후 시험; 대표적인 2개의 별개의 실험).
도 9: (A) D3에서 마크로비페라 레베티나(Macrovipera lebetina)(LCT) 또는 재조합 LCT(rLCT)로부터의 레베세틴(Levecetin)으로 치료한 후 6일(D6)째에 치료되지 않은(CTL) 맥락막 내피 스프라우트 또는 맥락막 내피 스프라우트의 대표적인 현미경사진. (B) 대조군, LCT(1.5 μM) 및 rLCT(1.5 μM, 5 μM, 15 μM) 그룹에서 2주령 C57BL/6JRj 수컷 마우스로부터 맥락막 체외이식편의 혈관 스프라우팅의 측정. 혈관 스프라우팅은 D3와 D6 사이의 증가로서 나타낸다. (n은 그룹당 ≥10마리, *p <0.05; 일원 ANOVA에 이은 둔네트 사후 시험; 대조군으로서 CTL. (C) 2.5 μM 아플리베르셉트, 대조군에서, LCT(1.5 μM) 및 rLCT(1.5 μM, 5 μM, 15 μM) 그룹으로 3일 동안 치료한 2주령 C57BL/6JRj 수컷 마우스로부터 맥락막 체외이식편의 혈관 스프라우팅의 측정, (n은 그룹당 ≥ 6마리, *p <0.05; 일원 ANOVA에 이은 둔네트 사후 시험; 대조군으로서 Afli). A 500 μm에서 기준자.
도 10: (A) CD102-염색된 망막, PBS(1μl) 또는 재조합 LCT(rLCT, 1μl, 500 μM)로 P12에서 유리체내 주사된 P17-OIR C57BL/6JRj 마우스의 현미경사진. (B) 혈관-폐색 및 (C) P17 대조군 및 치료된 망막 플랫마운트에서 신혈관화(CD102 양성 부위)의 정량화, (n= 각각 9 및 10개의 OIR-망막. *p< 0.05; 쌍을 이루지 않은 t-시험). A=500 μm에서 기준자; 삽도(insert) = 40 μm.
도 11: (A) PBS 및 CD102로 염색된 재조합 LCT(rLCT)의 맥락막 플랫마운트에서 CNV 병변의 현미경사진. (B) 레이저 및 PBS(1μl) 및 rLCT(1 μl, 500 μM)(n=그룹당 각각 29, 32 및 30회의 레이저 충격. *p<0.05; 일원 ANOVA에 이은 본페로니 사후 시험; 대표적인 2회의 별개의 실험)의 레이저 및 유리체내 주사 후 7일째에 CNV(CD102-양성 부위)의 정량화. (E) PBS(1μl), LCT(1 μl, 500 μM) 및 아플리베르셉트(1μl, 1.7 μg)(n= 그룹당 각각 35 및 47회의 레이저 충격. *p<0.05; 쌍을 이루지 않은 t-시험)의 레이저 및 유리체내 주사 후 7일째에 충격당 Iba1 양성 세포의 정량화. A= 50 μm에서의 기준자.
발명의 상세한 설명
본 발명자는 레베세틴이 항-VEGF 치료요법과 비교가능한 효능으로, 신혈관화의 생체외 모델, 즉, 대동맥 및 맥락막 체외이식편뿐만 아니라, 신혈관화의 생체내 모델, 즉, 레이저 유도된 맥락막 신혈관화 및 산소 유도된 망막병증 모델에서 혈관 스프라우팅을 감소시키는데 있어서 효과적이었음을 입증하였다. 실제로, 이들은 레베세틴의 유리체내 주사가 신혈관화의 예방 및 회귀를 허용하였음을 관찰하였다. 이들은 또한 치료학적 유효량의 레베세틴의 유리체내 주사는 망막 구조, 망막 기능 또는 혈관 온전성을 변경시키지 않음을 나타내었다. 따라서 이러한 결과는 레베세틴이 신혈관화, 및 특히 망막 및/또는 맥락막 신혈관화를 포함하는 질환을 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있음을 명확하게 입증한다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 신혈관 질환의 치료시 사용하기 위한, 레베세틴으로부터 선택된 단백질, 및 이의 기능적 변이체 및 단편에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "레베세틴" 또는 "LCT"는 마크로비페라 레베티나( M acro v ipera l ebetina)(MVL)로부터 단리된 30 kDa의 C-형 레시틴(CTL)을 지칭한다. CTL은 시스테인 스캐폴드(최소 4개의 시스테인) 및 탄수화물 인식 도메인(Carbohydrate Recognition Domain: CRD) 또는 CRD-유사를 포함하는 일반적인 특징을 공유한다. LCT는 알파 쇄(MLVA1)(서열 번호: 1) 및 베타 쇄(MLVB1)(서열 번호: 3)로 구성된다. 소단위 둘 다가 클로닝되었으며(Jebali et al. 2009) 진뱅크(Genbank) 데이타베이스(수탁 번호: 각각 ABW82656 및 ABW82672)에 색인되어 있다. 2개의 소단위는 이황화물 연결로 연결되어 있다(Sarray, S. et al. 2003). MLVA1 및 MLVB1은 CLECT 도메인, 즉, 탄수화물-인식 도메인(MVLA1, 27 내지 155번 잔기 도메인(cdd 295302) 및 MVLB1, 27 내지 145번 잔기 도메인(cdd 214480))을 갖는다. MLVA1 또는 MLVB1의 단독이량체 형태는 활성이 아니다(Jebali et al. 2012). 출발 코돈으로부터 코돈 24까지 추정된 레베세틴 "신호 펩타이드" 서열은 누락될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 단편"은 레베세틴으로부터 유래한 이종이량체 단백질을 지칭하며, 레베세틴의 항-신혈관화 활성을 보유하고, i) 레베세틴의 알파 쇄(서열 번호: 1) 및 레베세틴의 베타 쇄의 단편, ii) 레베세틴의 알파 쇄 및 레베세틴의 베타 쇄(서열 번호: 3)의 단편, 또는 (iii) 레베세틴의 알파 쇄의 단편 및 레베세틴의 베타 쇄의 단편을 포함한다.
바람직하게는, 알파 쇄의 단편은 서열 번호: 1의 적어도 100, 110 또는 120개, 보다 바람직하게는 적어도 130개의 연속된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지고/지거나 베타 쇄의 단편은 서열 번호: 3의 적어도 100 또는 110개, 보다 바람직하게는 적어도 120개의 연속된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진다. 바람직하게는, 상기 연속된 아미노산은 소단위의 C-말단 끝을 포함한다.
바람직하게는, 용어 "기능성 단편"은 즉, 소단위 중 하나 또는 둘 다, 바람직하게는 소단위 둘 다의 N-말단 끝에서 신호 펩타이드를 함유하지 않는 레베세틴의 성숙한 형태를 지칭한다. 따라서, 특수한 구현예에서, 본 발명에 사용된 단백질은 다음의 2개의 상이한 소단위로 제조된 이종이량체인 레베세틴의 기능성 단편이며: 서열 번호: 2를 포함하거나 이로 이루어진 제1의 소단위, 및 서열 번호: 4를 포함하거나 이로 이루어진 제2의 소단위, 이들 2개의 소단위는 이황화물 브릿지에 의해 연결되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 사용된 단백질은 다음의 2개의 상이한 소단위로 제조된 이종이량체이고: 서열 번호: 1 또는 2를 포함하거나 이로 이루어진 제1의 소단위, 및 서열 번호: 3 또는 4를 포함하거나 이로 이루어진 제2의 소단위, 이러한 2개의 소단위는 이황화물 브릿지에 의해 연결되어 있다.
특수한 구현예에서, 본 발명에 사용된 단백질은 서열 번호: 1을 포함하거나 이로 이루어진 제1의 소단위 및 서열 번호: 3을 포함하거나 이로 이루어진 제2의 소단위를 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 본 발명에 사용된 단백질은 서열 번호: 2를 포함하거나 이로 이루어진 제1의 소단위 및 서열 번호: 4를 포함하거나 이로 이루어진 제2의 소단위를 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 본 발명에 사용된 단백질은 다음의 2개의 상이한 소단위를 포함하는 이종이량체이고: 서열 번호: 2를 포함하거나 이로 이루어진 제1의 소단위 및 서열 번호: 4 또는 18을 포함하거나 이로 이루어진 제2의 소단위, 이러한 2개의 소단위는 이황화물 브릿지에 의해 연결되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 변이체"는 레베세틴으로부터 유래한 이종이량체 단백질을 지칭하며 이의 소단위 중 하나 또는 둘 다에서 하나 이상의(예컨대, 수개의) 위치에서 변경, 즉, 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하며, 레베세틴의 항-심혈관화 활성을 보유한다. 이러한 활성은 하기 실험 단락에서 기술된 바와 같이 용이하게 평가될 수 있다. 위치 또는 아미노산과 관련하여 사용된, 용어 "결실"은 특수한 위치에서 아미노산이 결실되거나 부재함을 의미한다. 위치 또는 아미노산과 관련하여 사용된, 용어 "삽입"은 하나 이상의 아미노산이 삽입되거나 특수한 위치를 점유하는 아미노산에 인접한 및 바로 다음에 존재함을 의미한다. 위치 또는 아미노산과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환"은 특수한 위치에서 아미노산이 다른 아미노산으로 대체되거나 야생형 단백질 중 하나와 상이한 아미노산이 존재함을 의미한다. 바람직하게는, 용어 "치환"은 천연적으로-발생하는 표준 20개의 아미노산 잔기, 천연적으로 드물게 발생하는 아미노산 잔기(예컨대, 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 알로하이드록시라이신, 6-N-메틸라이신, N-에틸글리신, N-메틸글리신, N-에틸아스파라긴, 알로-이소루이신, N-메틸이소루이신, N-메틸발린, 피로글루타민, 아미노부티르산, 오르니틴), 및 흔히 합성적으로 제조되는, 비-천연적으로 발생하는 아미노산(예컨대, 노르루이신, 노르발린 및 사이클로헥실-알라닌)으로부터 선택된 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 교체를 지칭한다. 바람직하게는, 용어 "치환"은 천연적으로 존재하는 표준 20개의 아미노산 잔기(G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S 및 T)로부터 선택된 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 교체를 지칭한다. 변이체는 당해 분야에 잘 공지된 다양한 기술에 의해 수득될 수 있다. 특히, 야생형 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 변경시키기 위한 기술의 예는 부위-지시된 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발 및 합성 올리고뉴클레오타이드 작제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
보다 특히, 용어 "기능성 변이체"는 다음의 2개의 상이한 소단위로 제조된 이종이량체를 지칭하며: 서열 번호: 1 또는 2에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 3 또는 4에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위, 상기 변이체는 레베세틴의 항-신혈관화 활성을 보유한다.
일 구현예에서, 기능성 변이체는 서열 번호: 1에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 3에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함한다.
다른 구현예에서, 기능성 변이체는 서열 번호: 2에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 4에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함한다.
다른 구현예에서, 기능성 변이체는 서열 번호: 2에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 18에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함한다.
추가의 구현예에서, 기능성 변이체는 서열 번호: 1 또는 2를 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 3 또는 4에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함한다. 특히, 기능성 변이체는 서열 번호: 1을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 3에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함하거나, 서열 번호: 2를 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 4에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함할 수 있다. 기능성 변이체는 또한 서열 번호: 2를 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 18에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 기능성 변이체는 서열 번호: 1 또는 2에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 3 또는 4를 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함한다. 특히, 기능성 변이체는 서열 번호: 1에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 3을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함할 수 있거나, 서열 번호: 2에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 4를 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함할 수 있다. 기능성 변이체는 또한 서열 번호: 2에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 18을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성(sequence identity)" 또는 "동일성(identity)"은 2개의 폴리펩타이드 서열의 정렬로부터 위치내에서 일치(동일한 아미노산 잔기)의 수(%)를 지칭한다. 서열 동일성은 서열 갭(sequence gap)을 최소화하면서 오버랩 및 동일성을 극대화하도록 정렬한 경우 서열과 비교함으로써 측정된다. 특히, 서열 동일성은 2개의 서열의 길이에 따라서, 다수의 전체적인 또는 국소적인 수학적 정렬 알고리즘 중 임의의 것을 사용하여 측정할 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 전체 길이에 걸쳐 최적으로 서열을 정렬하는 전체적인 정렬 알고리즘(예컨대, 니들만 앤 운슈 알고리즘(Needleman and Wunsch algorithm); Needleman and Wunsch, 1970)을 사용하여 정렬되지만, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 국소 정렬 알고리즘(예컨대, 스미쓰 앤 워터맨 알고리즘(Smith and Waterman algorithm)(Smith and Waterman, 1981) 또는 알트슐 알고리즘(Altschul algorithm)(Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005))을 사용하여 바람직하게 정렬된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 측정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들면, 인터넷 웹 사이트, 예컨대, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/에서 이용가능한 공공 이용가능 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당해 분야의 기술내에 있는 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 비교하는 서열의 전체 길이에 걸쳐서 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위해 적절한 매개변수를 측정할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 % 값은 니들만-운슈 알고리즘을 사용하여 2개의 서열의 최적의 전체적인 정렬을 생성하는 쌍식 서열 정렬 프로그램 EMBOSS 니들(Needle)을 사용하여 생성된 값을 지칭하며, 여기서 모든 조사 매개변수는 디폴트 값(default value)으로 설정되는데, 즉, 점수매김 매트릭스(Scoring matrix) = BLOSUM62, 갭 오픈(Gap open) = 10, 갭 연장(Gap extend) = 0.5, 말단 갭 페널티(End gap penalty) = 거짓(false), 말단 갭 오픈(End gap open) = 10 및 말단 갭 연장(End gap extend) = 0.5이다.
본 발명에서 사용된 단백질의 항-신혈관화 활성은 기술자에게 공지된 임의의 방법으로 평가할 수 있다. 예를 들면, 이러한 활성은 실시예에 기술된 바와 같이, 특히 대동맥 또는 맥락막 체외이식편과 같은 신혈관화의 생체외(ex vivo) 모델을 사용하여 평가할 수 있다(참고: 하기 실시예 1).
기능성 변이체는 유전자 다형성뿐만 아니라 인공 변이체로부터 생성된 천연 변이체를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 기능성 변이체는 특이적인 아미노산 위치에서 하나 이상의 돌연변이(결실, 삽입 및/또는 치환)의 도입에 의해 야생형 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호: 1 내지 4)로부터 유래된다. 돌연변이가 제1 소단위, 제2 소단위, 또는 둘 다로 도입될 수 있다.
특히, 기능성 변이체는 참고 서열, 즉, 서열 번호: 1 또는 2과 비교하여 1 내지 30개, 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 변형된(예컨대, 결실되거나, 치환되거나 삽입된) 아미노산 서열 잔기를 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및/또는 참고 서열, 즉, 서열 번호: 3 또는 4와 비교하여 1 내지 30개, 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 변형된(예컨대, 결실되거나, 치환되거나 삽입된) 아미노산 잔기를 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함할 수 있다. 보다 특히, 기능성 변이체는 서열 번호: 2와 비교하여 1 내지 30개, 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 변형된(예컨대, 결실되거나, 치환되거나 삽입된) 아미노산 잔기를 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및/또는 서열 번호: 4과 비교하여 1 내지 30개, 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 변형된(예컨대, 결실되거나, 치환되거나 삽입된) 아미노산 서열 잔기를 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 기능성 변이체는 서열 번호: 2와 비교하여 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 변형된(예컨대, 결실되거나, 치환되거나 삽입된) 아미노산 잔기를 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및/또는 서열 번호: 4와 비교하여 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 변형된(예컨대, 결실되거나, 치환되거나 삽입된) 아미노산 잔기를 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함할 수 있다. 보다 특히, 제2 소단위는 서열 번호: 18과 비교하여 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 변형된(예컨대, 결실되거나, 치환되거나 삽입된) 아미노산 잔기를 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 후술한 바와 같이, 변형은 바람직하게는 보존적 치환이다.
특수한 구현예에서, 기능성 변이체는 야생형 레베세틴(예컨대, 서열 번호: 1 내지 4)에 대해 실질적으로 상동성이다.
2개의 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 잔기, 즉, 보존적 치환에 의해 교체된 경우 "상동성", "실질적으로 상동성"이거나 "실질적으로 유사"하다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "보존적 치환"은 펩타이드의 전체적인 구조 및 기능을 변경시키지 않고, 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 교체, 예컨대, 이에 한정되지 않는, 아미노산의 유사한 특성(예를 들면, 극성, 수소 결합 전위, 산성, 염기성, 형상, 소수성, 방향족 등)을 가진 것으로의 교체를 나타낸다. 유사한 특성을 지닌 아미노산은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신은 친수성-염기성 아미노산이고 상호교환적으로 사용될 수 있다. 유사하게, 소수성 아미노산인 이소루이신은 루이신, 메티오닌 또는 발린으로 교체될 수 있다. 다른 것을 치환할 수 있는 중성의 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민 및 트레오닌을 포함한다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 보존적 치환은 당해 분야에서 유사한 특성을 가진 다른 아미노산에 대한 하나의 아미노산의 치환으로서 인식됨을 이해하여야 한다. 보존적 치환의 예는 하기 표 1에 제시된다:
일 구현예에서, 기능성 변이체는 서열 번호: 1 또는 2로부터 유래된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 30개, 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제1 소단위, 및/또는 서열 번호: 3 또는 4로부터 유래된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 30개, 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제2 소단위를 포함한다. 특히, 기능성 변이체는 서열 번호: 2로부터 유래된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 30개, 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제1 소단위, 및/또는 서열 번호: 4로부터 유래된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 30개, 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 또는 2개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제2 소단위를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 기능적 변이체는 서열 번호: 1로부터 유래된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 2개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제1 소단위, 및 서열 번호: 3으로부터 유래된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 5개, 바람직하게는 1 또는 2개의, 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제2 소단위를 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 기능성 변이체는 서열 번호: 2로부터 유래된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 5개, 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제1 소단위, 및 서열 번호: 4로부터 유래된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 5개, 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제2 소단위를 포함한다. 보다 특히, 기능성 변이체는 서열 번호: 2로부터 유래된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 5개, 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제1 소단위, 및 서열 번호: 18로부터 유래된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 5개, 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제2 소단위를 포함한다.
바람직하게는, 레베세틴 활성에 중요한 일부 잔기는 기능성 변이체내에 보존되어 있다. 특히, 잔기는
1) 알파 쇄와 베타 쇄 사이에 이황화물 브릿지 내 또는 브릿지 간에 포함된 사이토신 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 Cys27, Cys38, Cys55, Cys106, Cys129, Cys149 및 Cys 154, 및 서열 번호:3의 Cys27, Cys38, Cys55, Cys100, Cys123, Cys136 및 Cys 144(Jebali et al. 2009); 및/또는
2) HCY 도메인의 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 His37, Cys38, Tyr39 및 서열 번호: 3의 His37, Cys38, Tyr39(Jebali et al. 2009); 및/또는
3) DAEK 도메인의 잔기, 즉, 서열 번호:1의 Asp50, Ala51, Glu52 및 lys53 및 서열 번호: 3의 Asp50, Ala51, Glu52 및 lys53(Jebali et al. 2009); 및/또는
4) WIGL 모티프의 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 Trp94 내지 Leu96 및 서열 번호: 3의 Trp94 내지 Leu96(Zelensky et al., 2005)에 상응한다.
바람직하게는, 1), 2), 3) 및 4) 소단락에 확인된 모든 잔기는 기능적 변이체내에 보존된다.
레베세틴의 상기 확인된 잔기에 상응하는 잔기는 임의의 통상의 정렬 방법을 기반으로 기술자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
본원에 기술된 본 발명에서 사용된 단백질의 N- 및/또는 C-말단 끝은 단백질분해에 대해 임의로 보호될 수 있다. 예를 들면, N-말단은 아세틸 그룹의 형태일 수 있고/있거나 C-말단은 아미드 그룹의 형태일 수 있다. 단백질분해에 대해 내성이 될 단백질의 내부 변형이 또한 고려되며, 예컨대, 적어도 -CONH- 펩타이드 결합이 변형되어 (CH2NH) 환원된 결합, (NHCO) 역 결합(retro-inverso bond), (CH2-O) 메틸렌-옥시 결합, (CH2-S) 티오메틸렌 결합, (CH2CH2) 카르바 결합, (CO-CH2) 세토메틸렌 결합, (CHOH-CH2) 하이드록시에틸렌 결합, (N-N) 결합, E-알첸 결합 또는 또한 -CH=CH-결합에 의해 대체된다.
예를 들면, 단백질은 아세틸화, 아실화, 아미드화, 가교결합, 환화(cyclization), 이황화물 결합 형성, 공유결합성 가료-결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성(anchor formation), 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 인산화 등에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 단백질은 D 구조의 아미노산(들)을 포함하거나 이로 구성될 수 있으며, 이는 펩타이드가 단백질분해에 대해 내성이 되도록 한다. 이들은 또한 분자간 가교결합에 의해, 예컨대, 적어도 2개의 아미노산 잔기를 올레핀성 측쇄, 바람직하게는 C3-C8 알케닐 쇄, 바람직하게는 펜텐-2-일 쇄로 변형시킨 후 소위 Walensky et al, 2014에 기술된 "스테이플(staple)" 기술에 따라, 쇄를 화학적 가교결합시킴으로써 안정화시킬 수 있다. 예를 들면, i 및 i+4 내지 i+7번 위치에서 아미노산은 반응성 올레핀성 잔기를 나타낸 비-천연 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 모든 이러한 단백질분해-내성의 화학적으로 변형된 단백질은 본 발명에 포함된다.
본 발명에 사용된 단백질은 또한 뇨 청소율(urinary clearance) 및 사용된 치료학적 용량에 있어서의 감소 및 혈액 혈장의 반감기의 증가를 위해, 이들의 C-말단의 말단 또는 라이신 잔기, 특히 1500 또는 4000 ME의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 의해 PEG 분자에 공유결합할 수 있다. 단백질 반감기는 또한 단백질을 미소구체를 형성하는 약물 전달 시스템을 위한 생분해성 및 생적합성 중합체 물질 속에 단백질을 포함시킴으로써 증가시킬 수 있다. 중합체 및 공중합체는 예를 들면, 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA)(Hahn SK 등의 제US2007/0184015호에 기술된 바와 같음)이다.
레베세틴은 엠. 레베티나(M. lebetina) 독으로부터 단리될 수 있다. 레베세틴 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편은 또한 당해 분야의 기술자에게 공지된 재조합 기술에 의해 수득될 수 있다. 이 경우에, 단백질의 제1 소단위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 제2 소단위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및/또는 유전 작제물은 숙주 세포내에서 발현될 수 있으며 단백질은 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 추출될 수 있다. 재조합 기술의 하나의 예는 Jebali et al. 2012에 기술되어 있다. 요약하면, 각각의 소단위(예컨대, 서열 번호: 2 및 4)의 cDNA는 사람 과립구 콜로니-자극 인자로부터 유래된 신호 펩타이드 서열을 포함하는 pAMoA-GD3 벡터내로 클로닝된다. 알파-소단위 및 베타-소단위를 암호화하는 cDNA는 각각 MVLA1(서열 번호: 1) 및 MVLB1(서열 번호: 3)을 암호화하는 서열을 사용하는 PCR에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용된 단백질은 또한 당해 분야의 기술자에게 공지된 표준 합성 방법, 예를 들면, 화학적 합성 또는 효소적 합성을 사용하여 합성할 수 있다. 화학적 합성 기술의 예는 고체 상 합성 또는 액체 상이다.
고체 상 합성으로서, 예를 들면, 합성될 단백질의 C-말단에 상응하는 아미노산은 유기 용매 속에서 불용성인 지지체에 결합되며, 반응, 즉 이들의 아미노 그룹 및 적절한 보호 그룹으로 보호된 측쇄 기능성 그룹을 지닌 아미노산이 C-말단으로부터 N-말단의 순서로 차례대로 축합되는 반응, 및 수지 또는 단백질의 아미노 그룹의 보호 그룹에 결합된 아미노산이 방출된 반응의 대안적 반복에 의해, 단백질 쇄는 따라서 이러한 방식으로 연장된다. 고체 상 합성 방법은 사용된 보호 그룹의 유형에 따라서, tBoc 방법 및 Fmoc 방법으로 크게 분류된다. 대표적으로 사용된 보호 그룹은 아미노 그룹의 경우 tBoc(t부톡시카보닐), Cl-Z(2-클로로벤질옥시카보닐), Br-Z(2-브로모벤질로이카보닐), Bzl(벤질), Fmoc(9-플루오레닐메톡시카보닐), Mbh(4,4'-디메톡시디벤즈하이드릴), Mtr(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐), Trt(트리틸), Tos(토실), Z(벤질옥시카보닐) 및 Clz-Bzl(2,6-디클로로벤질); 구아니디노 그룹의 경우 NO2(니트로) 및 Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐); 및 하이드록시 그룹의 경우 tBu(t-부틸)을 포함한다. 목적한 단백질의 합성 후, 이는 탈-보호 반응에 적용되며 고체 지지체로부터 절단된다. 이러한 단백질 절단 반응은 Boc 방법의 경우 불화수소 또는 트리-플루오로메탄 설폰산이고, Fmoc 방법의 경우 TFA를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따가 사용된 단백질은 또한 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 형태로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 2개의 소단위는 동일한 핵산에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, 2개의 소단위는 별개의 핵산에 의해 암호화된다.
바람직하게는, 암호화 핵산(들)은 숙주 세포내에서 암호화된 단백질(본 발명에서 사용된 단백질)의 발현(예컨대, 전사 및 해독)을 허용하는 조절 서열(예컨대, 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등)을 추가로 포함하는 유전 작제물, 즉, 발현 카세트내에 포함된다. 유전 작제물은 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 cDNA일 수 있고, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다. 유전 작제물은 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 형질전환에 적합한 형태, 의도된 숙주 세포의 게놈 DNA내로의 통합에 적합한 형태 또는 의도된 숙주 유기체내에서 독립적인 복제, 유지 및/또는 유전에 적합한 형태일 수 있다.
예를 들면, 유전 작제물은 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, YAC, 바이러스 벡터 또는 트랜스포존(transposon)과 같은 벡터의 형태일 수 있다. 특히, 벡터는 발현 벡터, 즉, 시험관내 및/또는 생체내(예컨대, 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템내) 발현을 위해 제공될 수 있는 벡터일 수 있다.
바람직하지만 비-제한적인 양태에서, 유전 작제물은, ii) 하나 이상의 조절 성분, 예컨대, 프로모터 및 임의로 적합한 터미네이터에 작동적으로 연결된 i) 본 발명에 사용된 단백질을 암호화하는 핵산(들); 및 임의로 또한 iii) 유전 작제물, 예컨대, 3'- 또는 5'-UTR 서열, 리더(leader) 서열, 선택 마커, 발현 마커/리포터 유전자의 하나 이상의 추가의 성분, 및/또는 형질전환 또는 통합(이의 효능)을 촉진시키거나 증가시킬 수 있는 성분을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용된 단백질을 암호화하는 핵산(들)은 생체외 또는 생체내 감염 및 상기 단백질의 발현을 위한 바이러스 벡터에 의해 수반된다.
바람직하게는, 벡터는 바이러스 벡터를 통합하거나 통합하지 않는 재조합체이다. 재조합체 바이러스 벡터의 예는 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 박시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 소 파필로마 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명에 사용된 단백질을 암호화하는 핵산(들), 또는 상기 정의된 유전 작제물은 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 내에 함유된다.
바람직한 구현예에서, 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다.
사람 파르보바이러스 아데노-관련 바이러스(AAV)는 잠복성 감염을 확립하기 위해 감염된 세포의 게놈내로 통합될 수 있는 천연적으로 복제 결함성인 데펜도바이러스(dependovirus)이다. 통합은 염색체 19 (19ql3.3-qter) 상에 위치한, AAVSI로 불리는, 사람 게놈내 특이적인 부위에서 발생하므로 마지막 특성은 포유동물 바이러스 중에서 유일한 것으로 여겨진다. 따라서, AAV는 사람 유전자 치료요법을 위한 잠재적인 바이러스 벡터로서 고려할만한 관심을 불러일으켜 왔다. 바이러스의 유리한 특성 중에는 임의의 사람 질환과의 관련성의 이의 결여, 분열하는 및 분열하지 않는 세포 둘 다를 감염시키는 이의 능력, 및 감염될 수 있는 상이한 조직으로부터 유래된 광범위한 세포주가 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "AAV 벡터"는 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR), 바람직하게는 2개의 ITR에 의해 플랭킹된(flanked) 하나 이상의 이종 서열(즉, AAV 유래가 아닌 핵산 서열, 예컨대, 본 발명에 사용된 단백질을 암호화하는 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 벡터를 지칭한다. 적합한 헬퍼 바이러스로 감염되는 (또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하는) 및 AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 이러한 AAV 벡터는 복제되어 숙주 세포내에 존재하는 경우 감염성 바이러스 입자내로 패키지될 수 있다. "역위된 말단 반복체" 또는 "ITR" 서열은 당해 분야에서 잘 이해된 용어이며 반대 배향으로 존재하는 바이러스 게놈의 말단에서 발견된 비교적 짧은 서열을 지칭한다. "AAV 역위된 말단 반복체(ITR)" 서열은 천연의 단일 가닥 AAV 게놈의 양쪽 말단에 존재하는 대략 145개 뉴클레오타이드 서열이다. ITR의 가장 바깥쪽 125개의 뉴클레오타이드는 2개의 대안적 배향 중 하나로 존재하여, 상이한 AAV 게놈 사이 및 단일의 AAV 게놈의 2개의 말단 사이에 이질성(heterogeneity)을 초래할 수 있다. 가장 바깥쪽의 125개 뉴클레오타이드는 또한 자가-상보성의 몇가지 보다 짧은 영역(A, A', B, B', C, C 및 D 영역으로 지정됨)을 함유함으로써, 가닥내 염기 쌍화(pairing)가 ITR의 이러한 부위에서 일어나도록 한다. AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있거나, 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. AAV 벡터의 역위된 말단 반복체(ITR)의 혈청형은 임의의 공지된 사람 또는 비사람 AAV 혈청형으로부터 선택될 수 있다.
바이러스 벡터는 바이러스 캡시드내로 패키지되어 "바이러스 입자"를 생성할 수 있다. 특히, 벡터는 AAV-유래된 캡시드내로 패키지되어 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된(encapsidated) AAV 벡터 게놈으로 구성된 "아데노-관련 바이러스 입자" 또는 "AAV 입자"로 패키지된 AAV 벡터일 수 있다.
캡시드 혈청형은 AAV 입자의 굴성 범위(tropism range)를 결정한다. 아데노-관련 바이러스(AAV)의 다수의 혈청형, 예컨대, 12개의 사람 혈청형 및 비사람 영장류로부터의 100개 이상의 혈청형이 현재 확인되었다(Howarth al., 2010, Cell Biol Toxicol 26: 1-10). 이러한 혈청형 중에서, 사람 혈청형 2는 유전자 전달 벡터로서 개발된 제1의 AAV이었다. 다른 현재 이용되는 AAV 혈청형은 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAVrh74 및 AAVdj 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특수한 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV9, AAV9-2YF, AAV5, AAV2-7m8 (Dalkara D et al. Gene Ther. 2012 Feb;19(2):176-81; Dalkara D et al. Sci Transl Mes. 2013 Jun 12;5(189):189ra76) 또는 AAV8 캡시드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 AAV-유래된 캡시드를 포함한다.
또한, 비-천연 가공된 변이체 및 키메라 AAV가 또한 유용할 수 있다. 특히, 캡시드 단백질은 형질도입 효능을 향상시키고, 면역원성을 최소화하며, 효율적인 분해 및/또는 핵으로 정확한 전달을 위해, 안정성 및 입자 수명을 조정하기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체일 수 있다. 돌연변이된 AAV 캡시드는 오류 유발(error prone) PCR 및/또는 펩타이드 삽입에 의해 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함함으로써 삽입된 캡시스 변형으로부터 수득될 수 있다. 특히, 돌연변이는 천연 또는 비-천연 캡시드 단백질(예컨대, VP1, VP2, 또는 VP3)의 하나 이상의 타이로신 잔기 내에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이된 잔기는 표면 노출된 타이로신 잔기이다. 예시적인 돌연변이는 타이로신-대-페닐알라닌 치환, 예컨대, Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F 및 Y720F를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
AAV 천연 혈청형을 사용하는 것에 대해 대안적으로, 인공 AAV 혈청형, 예컨대, 이에 한정되지 않는, 비-천연적으로 존재하는 캡시드 단백질을 지닌 AAV를 또한 사용할 수 있다. 이러한 인공 캡시드는 임의의 적합한 기술에 의해, 상이한 선택된 AAV 혈청형, 동일한 AAV 혈청형의 비-연속 부위, 비-AAV 바이러스 공급원, 또는 비-바이러스 공급원으로부터 수득될 수 있는 이종 서열과 함께 선택된 AAV 서열(예컨대, VP1 캡시드 단백질의 단편)을 사용하여 생성할 수 있다. 인공 AAV 혈청형은 이에 제한없이, 키메라 AAV 캡시드 또는 돌연변이된 AAV 캡시드일 수 있다. 키메라 캡시드는 적어도 2개의 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된 VP 캡시드 단백질을 포함하거나 적어도 2개의 AAV 혈청형으로부터 유래된 VP 단백질 영역 또는 도메인을 조합하는 적어도 하나의 키메라 VP 단백질을 포함한다. AAV 입자는 동일한 혈청형 또는 혼합된 혈청형(예컨대, 슈도타입(pseudotyped) AAV)의 바이러스 단백질 및 바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 재조합 AAV 벡터는 AAV2 게놈 및 AAV1 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 혈청형 2/1 하이브리드 재조합 유전자 전달 시스템일 수 있다. 당해 분야의 기술자는 이러한 벡터 및 이들의 작제 및 사용을 위한 방법에 친숙하다(참고: 예컨대, 제WO 01/83692호). 본 발명에서 사용하기 위한 AAV 벡터는 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명은 신혈관 질환의 치료시 사용하기 위한 레베세틴, 및 이의 기능성 변이체 및 단편뿐만 아니라, 상술한 바와 같은 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산, 벡터 또는 바이러스 입자에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 환자의 건강 상태를 완화시키도록 의도된 임의의 작용, 예컨대, 질환의 치료요법, 방지, 예방 및 지연을 지칭한다. 특정의 구현예에서, 이러한 용어는 질환 또는 질환과 관련된 증상의 완화 또는 근절을 지칭한다. 다른 구현예에서, 이러한 용어는 이러한 질환을 지닌 대상체에게 하나 이상의 치료제를 투여하는 것으로부터 야기되는 질환의 확산 또는 악화를 최소화시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 심지어 보다 바람직하게는 사람, 예컨대, 성인, 어린이 및 임신 단계에서의 사람을 지칭한다.
특히, 용어 "신혈관 질환의 치료"는 병리학적 및 과도한 신혈관생성, 즉, 병리학적 신혈관화의 방지 또는 감소를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "신혈관 질환"은 즉, 신혈관화(병리학적 신혈관형성)를 포함하는, 신혈관 성분을 지닌 임의의 질환을 지칭한다. 이러한 질환의 예는 안구 신혈관 질환, 암 및 신혈관 성분을 지닌 염증성 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
구현예에서, 신혈관 질환은 바람직하게는 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 망막성 허혈 또는 증식성 당뇨망막병증과 같은 당뇨 망막병증, 홍채 신혈관화, 안구내 신혈관화, 각막 신혈관화, 망막 신혈관화, 맥락막 신혈관화 및 각막 염증(특히 각막염, 안구 헤르페스 또는 헤르페스 조스터로 인한)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 안구 신생혈관 질환이다.
추가의 구현예에서, 질환은 신혈관 성분을 지닌 암이다. 암은 바람직하게는 고형암이다. 이는 폐, 유방, 위, 결장직장, 췌장 및 뇌 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 원발성 또는 전이성 암일 수 있다. 특히, 암의 신혈관 성분은 종양 신혈관화 및/또는 활성화 또는 VEGF 신호전달 경로와 같은 종양 혈관형성과 관련된 것으로 알려진 유전자 또는 신호전달 경로의 상향조절을 지칭할 수 있다.
다른 구현예에서, 질환은 바람직하게는 류마티스 관절염, 건선, 골관절염, 염증성 창자병, 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 결장염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 신혈관 성분을 지닌 염증 장애이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에서 사용된 단백질(즉, 레베세틴, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편), 또는 상술한 바와 같고 상기 단백질을 암호화하는 핵산, 벡터 또는 바이러스 입자, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 신혈관 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
이는 또한 본 발명에 따라 사용된 단백질(즉, 레베세틴, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편), 또는 상술한 바와 같고 상기 단백질을 암호화하는 핵산, 벡터 또는 바이러스 입자, 또는 신혈관 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상술한 구현예 모두는 당해 양태에서 또한 고려된다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명에 따라 사용된 단백질, 즉, 레베세틴 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명에 따라 사용되고 상술한 바와 같은 단백질(즉, 레베세틴 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편)을 암호화하는 핵산, 벡터 또는 바이러스 입자, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
약제학적으로 허용되는 부형제는 투여 경로 및 활성 성분, 예컨대, 단백질, 핵산 또는 바이러스 입자의 특성에 따라 선택된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물 및/또는 사람에서 사용하기 위해 규제 기관에 의해 승인되거나 약전, 예컨대, 유럽 약전에 의해 승인됨을 의미한다. 용어 "부형제"는 이와 함께 치료제가 투여되는 희석제, 보조제, 담체, 또는 비히클을 지칭한다. 당해 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 부형제는 약리학적으로 유효한 물질의 투여를 촉진하는 비교적 불활성인 물질이며 액체 용액 또는 현탁제로서, 유제로서, 또는 사용 전에 액체 속에서 용해시키거나 현탁시키기에 적합한 고체 형으로서 공급될 수 있다. 예를 들면, 부형제는 형태 또는 조도(consistency)를 제공할 수 있거나 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압 몰농도(osmolality)를 변화시키기 위한 염, 캡슐화제, pH 완충 물질, 및 완충제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 부형제는 과도한 독성없이 투여될 수 있는 눈으로의 직접 전달에 적합한 임의의 약제학적 제제를 포함한다.
가능한 약제학적 조성물은 경구, 직장, 국소(예컨대, 경피, 볼내, 설하, 안구 점적), 안내(예컨대, 유리체내, 전방내, 망막하, 맥락막상, 안구주위, 결막하) 또는 비경구(예컨대, 피하, 근육내, 척수내, 정맥내 및 피내) 투여에 적합한 것을 포함한다. 이러한 제형의 경우, 통상의 부형제는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 기술에 따라 사용될 수 있다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 비경구 또는 안구 투여에 적합하다. 보다 바람직하게는, 약제학적 조성물은 국소 안구 점적 및 안구내 투여를 포함하는 안구 투여용으로 적합하다.
비경구 투여용 조성물은 일반적으로 고체 또는 동결건조된 형태로부터 사용 직전에 임의로 제조될 수 있는 생리학적으로 혼화성인 멸균 용액 또는 현탁액이다. 국소 마취제, 방부제 및 완충제와 같은 보조제를 비히클 속에 용해시킬 수 있고 계면활성제 또는 습윤제를 조성물 속에 포함시켜 활성 성분의 균일한 분포를 촉진할 수 있다.
안구 투여를 위해, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 멸균 등장성의 수성 또는 비수성 용액(예컨대, 균형을 이룬 염 용액(BSS)), 분산액, 현탁액 또는 유액, 또는 사용 직전 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성시킬 수 있는 멸균 분말과 함께 제형화될 수 있으며, 이는 항산화제, 완충제, 정균제(bacteriostat), 용질 또는 현탁화 또는 증점제(thickening agent)를 함유할 수 있다.
경구 투여의 경우, 조성물은 통상의 경구 투여량 형태, 예컨대, 정제, 캅셀제, 산제, 과립제 및 액체 제제, 예컨대, 시럽, 엘릭서르(elixir), 및 농축된 점적제로 제형화될 수 있다. 비 독성 고체 담체 또는 희석제가 사용될 수 있으며 이는 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈, 마그네슘, 탄산염 등일 수 있다. 압축 정제의 경우, 분말화된 물질에 점착 품질(cohesive quality)을 부여하는 제제인, 결합제가 또한 필요하다. 예를 들면, 전분, 젤라틴, 당, 예를 들면, 락토즈 또는 덱스트로즈, 및 천연 또는 합성 검을 결합제로서 사용할 수 있다. 붕해제가 또한 정제의 파괴를 촉진하기 위해 정제 속에서 필수적이다. 붕해제는 전분, 점토, 셀룰로즈, 알긴, 검 및 가교결합된 중합체를 포함한다. 더욱이, 윤활제 및 활주제가 또한 정제 속에 포함되어 제조 공정시 표면에 정제 물질이 부착되는 것을 방지하고 제조 동안 분말 물질의 유동 특성을 개선시킨다. 콜로이드성 이산화규소는 활주제로서 가장 일반적으로 사용되며 활석 또는 스테아르산과 같은 화합물이 윤활제로서 가장 일반적으로 사용된다.
경피 투여의 경우, 조성물은 연고제, 크림제 또는 젤제 형태로 제형화될 수 있으며 적절한 침투제 또는 세제, 예컨대, 디메틸 설폭사이드, 디메틸 아세트아미드 및 디메틸포름아미드를 사용하여 침투를 촉진시킬 수 있다.
경점막 투여의 경우, 비강 스프레이, 직장 또는 질 좌제를 사용할 수 있다. 활성 화합물은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 임의의 공지된 좌제 염기에 혼입될 수 있다. 이러한 염기의 예는 코코어 버터, 폴리에틸렌 글리콜(카보왁스), 폴리에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 및 이들과 융점 또는 용해 속도를 변형시키기 위한 다른 혼화성 물질의 혼합물을 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 실질적으로 투여 직후 또는 투여 후 임의의 예정된 시간 또는 기간에 활성 약물을 방출시키기 위해 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 본 발명에 따라 사용된 수개의 단백질(즉, 레베세틴, 및 이의 기능성 변이체 또는 단편), 및/또는 상술한 바와 같이 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산, 벡터 또는 바이러스 입자를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 특히 혈관형성 억제제, 소염 약물, 항신생물제, 항-세균제 및 항-바이러스제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 활성 화합물을 포함할 수 있다.
혈관형성 억제제의 예는 항-VEGF(혈관 내피 성장 인자) 제제, 예컨대, VEGF 또는 VEGF 수용체에 대해 지시된 항체(예컨대, 베바키주맙, 라니비주맙, DC101), VEGF 수용체에 결합하여 이를 억제하는 소분자(예컨대, SU6668, TSU68, 아플리베르셉트), 타이로신 키나제 억제제(예컨대, 악시티닙, 수니트닙, 소라페닙, 및 파조파닙), PI3K 억제제(예컨대, PI-103), EGFR 억제제(예컨대, 게피티닙, 에를로티닙), Ras 억제제(FTIs), AKT 억제제(예컨대, 넬피나비르), 항-SFRP2 항체, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 및 메타스타틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 혈관형성 억제제는 VEGF 경로의 억제제, 특히 아플리베르셉트이다.
소염 약물의 예는 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 예컨대, 살리사이클레이트(예컨대, 아세틸살리실산), 프로피온산 유도체(에컨대, 이부프로펜, 케토프로펜), 아세트산 유도체(예컨대, 인도메타신, 아세클로페낙), 에놀산 유도체(예컨대, 피록시캄, 멜록시캄, 테녹시캄), 안트라닐산 유도체(예컨대, 메페남산) 및 선택적인 COX-2 억제제(예컨대, 셀레콕십)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"항신생물제"는 암 세포 또는 미성숙 전-암 세포의 성장을 억제하거나 중단시키고/시키거나, 암 세포 또는 미성숙 전-암 세포를 사멸시키고/시키거나 다른 항신생물제에 대한 암 또는 전-암 세포의 민감성을 증가시키고/시키거나 암 세포의 전이를 억제하는 항-암 활성을 지닌 제제이다. 이러한 제제는 화학제 뿐만 아니라 생물제도 포함할 수 있다. 예는 이에 제한없이, 5-아자-2'데옥시사이티딘, 17-AAG(17-N-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신), 트레티노인(ATRA), 보르테조밉, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 베박시주맙, 타목시펜, 류코보린, 도세탁셀, 트랜스투주맙, 에토포시드, 플라보피리돌, 5-플루오로우라실, 이리노테칸, TRAIL(TNF-관련 세포자멸사 유도 리간드), LY294002, PD184352, 페리포신, Bay 11-7082, 겜시타빈, 비칼루타미드, 졸레드론산, 시스-레티노산, MK-0457, 이마티닙, 데사티닙, 소라페닙, 테모졸로마이드, 악티노마이신, 안트라사이클린, 독소루비신, 다우노루비신, 발루비신, 이다루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 플리카마이신 및 미토마이신을 포함한다.
항-세균제의 예는 페니실린, 아미노글리코시드, 마크롤라이드, 모노박탐, 리파마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 클린다마이신, 리코마이신, 이미페넴, 푸시드산, 노보비오신, 포스포마이신, 푸시데이트 나트륨, 네오마이신, 폴리믹신, 카프레오마이신, 콜리스티메테이트, 콜리스틴, 그라미시딘, 미노사이클린, 독시사이클린, 바노마이신, 바시트라신, 가나마이신, 젠타마이신, 에리쓰로마이신 및 세팔로스포린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항-바이러스제의 예는 알파-메틸-파다만탄 메틸아민, 1-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3 카복사미드, 9-(2-하이드록시에톡시)메틸구아닌, 아다만타나민, 5-요오도-2'-독시우리딘, 트리플루오로티미딘, 인터페론, 아데닌 아라비노시드, CD4, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT), 9-(2-하이드록시에톡시메틸)-구아닌(아사이크롤비르), 포스포노포름산, 1-아다만탄아민, 펩타이드 T, 및 2',3'디데옥시사이티딘을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특수한 구현예에서, 약제학적 조성물은 혈관형성 억제제, 소염 약물 및 항-신생물제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 활성 화합물을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 혈관형성 억제제, 바람직하게는 VEGF 경로의 억제제, 보다 바람직하게는 아플리베르셉트인 적어도 하나의 다른 활성 화합물을 포함한다. 특히, 약제학적 조성물은 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함하는 단백질, 및 혈관형성 억제제, 바람직하게는 VEGF 경로의 억제제, 보다 바람직하게는 아플리베르셉트를 포함할 수 있다. 보다 특히, 약제학적 조성물은 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함하는 단백질, 및 혈관형성 억제제, 바람직하게는 VEGF 경로의 억제제, 보다 바람직하게는 아플리베르셉트를 포함할 수 있다.
투여될 본 발명의 약제학적 조성물의 양은 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지된 표준 과정에 의해 결정되어야 한다.
환자의 생리학적 데이타(예컨대, 연령, 체격, 및 체중), 투여 경로 및 치료될 질환은 적절한 투여량을 결정하기 위해 고려되어야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적절한 용량은 이것이 단독으로 사용되거나 함께 사용되는 경우, 또한 변할 수 있다.
약제학적 조성물은 단일 용량으로서 또는 다수의 용량으로, 바람직하게는 단일 용량으로 투여될 수 있다.
특수한 구현예에서, 약제학적 조성물은 안구 질환의 치료에 사용되기 위해 의도되며 각각의 단위 투여량은 예를 들면, 눈 당 0.1 내지 12 mg, 바람직하게는 눈 당 1 내지 5 mg을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료요법, 특히 혈관형성 억제제, 소염 약물, 항신생물제, 항-세균제 및/또는 항-바이러스제, 바람직하게는 혈관형성 억제제, 소염제 또는 항신생물제와 조합하여 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 약제학적 조성물과 함께 사용되는 경우, 항신생물제는 방사선치료제, 예컨대, X-선, 감마선, 알파 입자, 베타 입자, 양성자, 전자, 중성자, 방사선동위원소, 및 다른 형태의 이온화 방사선을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 혈관형성 억제제, 보다 바람직하게는 VEGF 경로의 억제제, 심지어 보다 바람직하게는 아플리베르셉트와 조합하여 사용된다.
특수한 구현예에서, 약제학적 조성물은 혈관형성 억제제, 바람직하게는 VEGF 경로의 억제제, 보다 바람직하게는 아플리베르셉트를 사용한 치료요법에 대해 반응하지 않거나 내성이 되는 대상체를 치료하는 데 사용된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 치료학적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 신혈관 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
상술한 모든 구현예는 본 양태에서 또한 고려된다.
"치료학적 유효량"은 새로운 혈관 형성을 방지하거나 억제하기에, 즉, 신생혈관형성, 및 특히 병리학적 신생혈관형성을 방지하거나 억제하고/하거나 신혈관화의 회귀를 허용하기에 충분한 대상체에게 투여된 약제학적 조성물의 양으로 의도된다.
바람직한 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 혈관형성 억제제, 바람직하게는 VEGF 경로의 억제제, 보다 바람직하게는 아플리베르셉트를 사용한 치료요법에 대해 반응하지 않거나 이에 대해 내성인 대상체이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 신혈관화 억제제로서 사용하기 위한 레베세틴, 이의 기능성 변이체 또는 단편, 레베세틴 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 핵산, 벡터 또는 바이러스 입자, 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 신혈관화를 방지하거나, 억제하거나 회귀하는데 사용하기 위한, 레베세틴, 이의 기능성 변이체 또는 단편, 레베세틴 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 암호화하는 핵산, 벡터 또는 바이러스 입자, 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다음의 실시예는 설명의 목적으로 제공되며 제한하지 않는다.
실시예
물질 및 방법
동물
3주 및 11주령의 C57BL/6JRj 수컷 마우스 및 4일령의 루이스 랫트(Lewis rat) 한배 새끼를 Janvier Labs(Le Genest- Saint-Isle, 프랑스)로부터 구입하였다. 11주령의 CX3CR1+/GFP 수컷 마우스는 Jackson Laboratory(미국 바 하버(Bar Harbor) 소재)로부터 입수하였다. 동물을 동물 우리에 특수한 병원체 유리된 조건 하에서, 12/12　h 명/암 주기 하에 물과 일반 식이(normal diet)를 자유로이 이용할 수 있도록 하면서 가두었다.
모든 과정을 과학 목적을 위해 사용되고 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, Comite d'ethique pourl'experimentation animale Charles Darwin (N°　02371.02))에 의해 승인된 동물 보호에 대한 유럽 의회의 지침(Directive 2010/63/EU)으로부터의 가이드라인에 따라서 수행하였다.
생체외 대동맥 환으로부터의 혈관 스프라우팅
루이스 랫트 한배새끼의 참수 후, 흉부 대동맥을 1-mm-두께의 환으로 절단하고 48 웰 조직 배양 플레이트(well tissue culture plate) 속에서 15 μl의 성장 인자-환원된 페놀 레드 유리 매트리겔(Corning, 프랑스 불로뉴 비양쿠르 소재)로 덮었다. 대동맥 환을 3일 동안 10% 태아 송아지 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 0.2% 펀지존(Lavalette, S. et al. 2011)이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM)(Thermo Fisher Scientific, 프랑스 빌레본-서-비엣 소재) 속에서 배양하였다. 체외이식편을 엠. 레베티나(M. lebetina) 독으로부터 단리한 LCT에 상이한 용량(30 nM, 300 nM, 1.5 μM)에서 배양 3일(D3) 내지 D6 동안 노출시켰다. 대조군 체외이식편을 LCT의 첨가없이 DMEM 속에서 배양하였다. 개개 체외 이식편의 사진을 D3 내지 D6째에 취하였다. D3에서 각각의 개개 대동맥 환 및 D3에 예비-배양 스프라우트의 표면을 D6에서의 표면으로부터 감하여 LCT의 존재 또는 부재하에서 발생한 혈관 스프라우팅을 계산하였다. 스프라우팅 부위는 Fiji 소프트웨어(Schindelin, J. et al. 2012)로 정량화하였다. 데이타는 D6 내지 D3 사이의 성장의 퍼센트로 나타낸다.
생체외 맥락막으로부터의 혈관 스프라우팅
눈은 C57BL/6JRj 마우스로부터 핵을 제거하고 해부 전에 빙냉 내피 성장 배지(EGM-2)(Lonza, 프랑스 르발로아-페레 소재) 속에 유지시켰다. 맥락막을 다른 눈 조직으로부터 분리하고 대략 1 mmХ1 mm로 절단한다. 맥락막 단편을 단리하고 48 웰 플레이트 속에서 씨딩된 성장 인자-환원된 페놀 레드 유리된 매트리겔(Corning, 프랑스 불로뉴 비양쿠르 소재) 속에 두었다.
이후에, 맥락막 체외이식편을 3일 동안 37℃의 세포 배양 항온처리기 속에서 5% 태아 송아지 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 0.2% 펀지존이 보충된 EGM-2 배지 내에서 배양하였다(Shao, Z. et al. 2013). D3에, 맥락막 단편을 엠. 레베티나 독으로부터 단리한 LCT(1.5 nM, 5 μM, 15 μM) 또는 재조합 LCT(1.5 μM, 5μM, 10μM)로 배양 D3로부터 D6까지 처리하였다. 개개 체외이식편의 사진을 찍고 스프라우트 부위를 Fiji 소프트웨어로 정량하였다(Schindelin, J. et al. 2012). D3에 각각의 개개 맥락막 체외이식편 및 예비-배양 스프라우트의 표면을 D6에서의 표면으로부터 감하여 LCT의 존재 또는 부재하에서 발생한 혈관 스프라우팅을 계산하였다.
SD-OCT
동공을 트로피카미드(마이드리아티쿰(Mydriaticum))(Thea, 프랑스 클레르몽-페랑 소재) 및 페닐에프린(네오시네프린)(Europhta, 모나코 소재)로 확장시켰다. 이후에, 마우스를 이소플루오란(2%)(Axience, 프랑스 팡티 소재)을 흡입시켜 마취시키고 스펙트럼 영역 광 간섭 단층 촬영(spectral domain optical coherence tomography: SD-OCT) 영상 장치(Bioptigen 840 nm HHP; Bioptigen, 미국 노쓰 캐롤라이나주 소재)의 앞쪽에 두었다. 영상을 상부 망막의 대략 0.1 또는 1.4 mm에서 시신경 원판으로부터 획득하였다. SD-OCT를 앞서 기술한 바와 같이(Dominguez, E. et al. 2015) 보정하였다(1 픽셀 = 1.6 μm). 망막 층, 내부 핵 층(INL), 외부 핵 층(ONL) 및 광수용체 외부 분절(OS) 두께를 FIJI 소프트웨어(Schindelin, J. et al. 2012)에 의해 7일째에 시신경의 중심으로부터 500μm에서 측정하였다.
망막전위도검사법(ERG)
ERG를 엠. 레베티나 독으로부터 단리한 LCT(500 μM) 및 PBS의 주사 후 7일 째에 수행하였다. C57BL/6JRj 마우스를 암 적응(dark adaptation)을 위해 밤새 유지시킨 후 케타민(100 mg/kg, Virbac, 프랑스 까로 소재) 및 크실라진(10 mg/kg, Bayer HealthCare, 독일 베를린 소재)의 복강내 주사로 마취시켰다. 동공을 페닐에프린(네오시네프린)(Europhta, 모나코 소재) 및 트로피카미드(마이드리아티쿰)(Thea, 프랑스 클레르몽-페랑 소재)으로 확장시켰다. 각막을 옥시부프로카인 클로르하이드레이트(Thea, 프랑스 클레르몽-페랑 소재)로 마취시켰다. 체온을 가열 패드를 사용하여 37℃로 유지시켰다. 윗 및 아래 눈꺼풀을 들어올려 눈이 떠져 튀어나오도록 하였다. 금-루프 전극을 각각의 각막의 표면과 접촉하도록 두고 루브리탈(lubrithal)(Zubial, Auros, France)을 사용하여 유지시켜 ERG(엡스피온(Espion), Diagnosys LLC, 미국 매사츄세츠주 로웰)를 기록하였다. 참고 및 접지 전극을 각각 동물의 이마 및 등에 두었다. 광 자극을 Ganzfeld 자극기(엡스피온, Diagnosys LLC, 미국 매사츄세츠주 로웰 소재)로 제공하였다. 반응을 증폭시키고 1 채널 DC/AC-증폭기를 사용하여 여과하였다(1 Hz-저 및 300 Hz-고 절단(high cut off) 여과기). 5 수준의 자극 강도(0.003 cd.s/m2; 0.03 cd.s/m2; 0.3 cd.s/m2; 3 cd.s/m2; 10 cd.s/m2)를 암순응 ERG 기록에 사용하였다. 각각의 암순응 ERG 반응은 자극의 5회 플래쉬의 세트로부터 5개 반응의 평균을 나타낸다.
추상체 반응(cone response)을 평가하기 위해, 마우스를 20 cd/m2에서 광에 5분 동안 노출시켜 간체시세포를 포화시켰다. 10 cd.s/m2 수준의 자극 강도를 광 적응된 ERG에 사용하였다. 광 적응된 ERG를 광 적응의 경우와 같이 동일한 간체-억제성 백색 배경(rod-suppressive white background)에서 기록하였다. 각각의 추상체 광순응 ERG 반응은 10회의 연속된 플래쉬 세트에 대한 10회 반응의 평균을 나타낸다. 플리커(flicker) ERG를 또한 사용하여 1 cd.s/m2 강도에서 10 및 20 Hz의 섬광 빈도에서 추상체 반응을 단리하였다.
레이저-유도된 맥락막 신혈관화(CNV) 모델
C57BL/6JRj 마우스를 케타민(100 mg/kg, Virbac, 프랑스 까로 소재) 및 크실라진(10 mg/kg, Bayer HealthCare, 독일 베를린 소재)의 복강내 주사로 마취시켰다. 동공을 확장시키고 4회의 레이저 응고(400 mW, 50 ms, 100 μm의 스폿 크기)를 슬릿 램프(slit lamp)(BQ 900, Hagg-Streitt, 프랑스 샴베리(Chambery) 소재) 위에 장착된 Laser Yag 532 Eyelite (Alcon, 프랑스 뤼에유-말메종 소재)로 수행하였다. 브루셔 막(Bruch's membrane)의 레이저 광응고 및 파열을 거품의 즉시 관찰로 확인하였다(Lavalette, S. et al. 2011, Berger, A. et al. 2014). 마우스에게 1 μl의 PBS, 엠. 레베티나 독으로부터 단리한 LCT(500 μM), 재조합 LCT(500μM) 또는 아플리베르셉트(25 μM)를 레이저 후 즉시 또는 3일째에 주사하였다.
병변 후 7일째에, 마우스의 망막을 SD-OCT로 시험하였다. OCT 서열을 획득하고 Fiji로 분석하였다(Schindelin, J. et al. 2012). 병변 용적을 식(4/3π*a*b2)/2(여기서, a는 수직 축에 따른 측정에 상응하는 극성 반경이고 b는 수평 축에 상응하는 적도 반경(equator radius)이다)를 사용하여 계산하였다(Berger, A. et al. 2014).
D7에, 마우스를 CO2 흡입에 의해 희생시키고 CNV 부위를 면역 염색된 맥락막 플랫마운트 상에서 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices, 프랑스 샹-그레고이르 소재)로 정량화하였다.
산소-유도된 망막병증(OIR) 모델
돌보는 어미와 함께 C57BL/6JRj 새끼 마우스를 앞서 기록한 바와 같이(Connor, K. M. et al. 2009) 5일 연속일 동안 출생일(P)로부터 7일째에 75% 산소에 노출시켰다. P12에, 마우스를 실내-공기에 돌려놓고 PBS, 엠. 레베티나 독으로부터 단리된 LCT(500 μM) 또는 재조합 LCT(500μM) 또는 아플리베르셉트(25 μM)를 유리체내에 주사하였다. P17에 마우스를 CO2　흡입으로 희생시키고 망막을 절개하였다. 혈관-소멸(VO) 및 신혈관화(NV) 부위를 플랫마운트되고(flatmounted) 면역침전된 망막에 대해 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices, 프랑스 샹-그레고이르 소재)를 사용하여 계산하였다.
RT-qPCR 　
인테그린 소단위 αv, α5, β3 및 β5 유전자 발현을 역 전사 정량적 폴리머라제 쇄 반응(RT-qPCR)에 의해 CNV 모델 내에서 레이저 손상 후 0, 1, 3 및 7일째에 정량화하였다. 맥락막을 RNase-유리 조건 하에서 절개하였다. 총 RNA를 뉴클레오스핀 RNAII(Macherey Nagel, 프랑스 호에르 소재)로 단리하였다. 단일 가닥 cDNA를 총 RNA(DNaseI 증폭 등급으로 전처리, Thermo Fisher Scientific, 프랑스 빌레봉-수-예벳 소재)로부터 프라이머로서 올리고-dT 및 슈퍼스크립트(superscript) II 리버스 트랜스크립타제(Thermo Fisher Scientific, 프랑스 빌레봉-수-예벳 소재)를 사용하여 합성하였다. 실시간 폴리머라제 쇄 반응을 cDNA 및 SYBR 그린 유전자 발현 마스터 믹스(Green Gene Expression Master Mix)(Thermo Fisher Scientific, 프랑스 빌레봉-수-예트 소재) 및 다음의 프라이머(0.5 pmol/μl)(Life Technologies, 프랑스 생-오뱅 소재)를 사용하여 수행하였다: GAPDH 센스: 5'-ACG GCC GCA TCT TCT TGT GCA-3' (서열 번호: 5) ; GAPDH 안티센스: 5'-CAG GCG CCC AAT ACG GCC AA-3' (서열 번호: 6); ITGAV 센스: 5'-CAC CCT CAG AGA GGG AGA TG-3' (서열 번호: 7); ITGAV 안티센스: 5'-ACG TAC AGG ATT GCG CTC TT-3' (서열 번호: 8); ITGA5 센스: 5'-AGT ACG CAC CTT GCC GCT CA-3' (서열 번호: 9); ITGA5 안티센스: 5'-ACA CGG CCA GTC TTG GTG AAC-3' (서열 번호: 10); ITGB3 센스: 5'-AAC CGG GGA ACG CTC CAT GA-3' (서열 번호: 11); ITGB3 안티센스: 5'-CGG CGT TTT TGC CAG TAT CCG-3' (서열 번호: 12); ITGB5 센스: 5'-AGC CTT TGG GGA GAC GTG TGA-3' (서열 번호: 13); ITGB5 안티센스: 5'-TGG TGG TGG CAG GTC TGG TT-3' (서열 번호: 14).
PCR 반응을 95℃에서 15초, 60℃에서 45초의 45 주기로 수행하였다. 데이타를 GAPDH에 대해 표준화하고 대조군 그룹 값에 대한 상대값으로 나타내었다.
시약 및 약물
LCT를 앞서 기술한 바와 같이(Sarray, S. et al. 2003) 수득하였다. 요약하면, 엠. 레베티나의 독을 세파덱스 G-75 컬럼을 사용하여 겔-여과하였다. 우선, LCT를 모노(Mono) S(HR5/5) 컬럼 위에서 FPLC로 정제하고 선형 0-1M NaCl 구배로 용출하였다. LCT를 동결건조시킨 다음 PBS 속에 용해하였다. LCT 제제 품질을 C8 역상 HPLC 컬럼 위에서 아세토니트릴의 선형 구배로 시험하였다(Sarray, S. et al. 2003). 아플리베르셉트(Eylea; Bayer, 프랑스 리옹 소재)는 치아라 에안디(Chiara Eandi) 박사(토리노 대학) 및 오드리 지오상티-오레강(Audrey Giocanti-Auregan) 박사(Hopital Avicenne Paris)가 친절하게 제공하였다. 생체내(in vivo) 연구를 위해 1 μl의 다음의 용액을 유리체내에 주사하였다: 500 μM LCT(15 μg/μl) 또는 25 μM 아플리베르셉트(2.5 μg/μl). 일부 실험에서, 2 μl의 PBS 또는 표지된-LCT, -아플리베르셉트 또는 -BSA를 우측 눈에 주사하였다.
재조합 LCT 생산
알파(서열 번호: 15) 및 베타(서열 번호: 16)　LCT 소단위(펩타이드 신호 MACPGFLWALVISTCLEFSMA(서열 번호: 17)를 포함)를 암호화하는 2개의 핵산 서열을 2개의 pCDNA3.1 (+) 플라스미드에 클로닝(cloning)하였다. 알파 및 베타 LCT 소단위의 성숙한 서열은 각각 서열 번호: 2 및 18이다. 베타 LCT 서열은 C-ter 도메인내에 6-히스티딘 태그(tag)를 포함한다. HEK expi293 세포를 2개의 작제물로 공형질감염시켰다. 상층액을 4일 후 500g에서 4℃로 15분 원심분리에 이어서, 15 900g에서 4℃로 30분 동안 두번째 원심분리하고 -20℃에서 저장하기 전에 0.22 μm 여과함으로써 4일 후에 수거하였다. 상층액을 실온에서 및 내독소-유리된 조건을 사용하여 정제하였다. 상층액을 해동시키고 300 mL 이하로 농축시키고 탄젠트 유동 여과(tangential flow filtration: TFF) 5kDa-0.1 m²　　카세트(Centramate serie T, PALL) 상에서 인산염 완충액(NaPO4　20mM;　　NaCl 300mM;　pH 7.2)을 사용하여 다이아필터링(diafiltering)하였다. 이미다졸 10mM를 가하고 히스티딘-태그된 단백질을 Hitrap IMAC 세파로즈 FF 5mL(GE healthcare Life Sciences) 컬럼에서 정제하였다. 예비-평형 및 세척 단계를 완충액　20mM NaPO4; pH 7.2; 　NaCl 300mM, 10 mM 이미다졸에서 수행하였다. 40 mM 이미다졸의 단계는 대부분의 오염물(다른 세포 단백질)이 제거되도록 하였다. 용출을 80 내지 500 mM의 이미다졸 구배로 수행하였다. LCT를 용출하기 위한 최적의 이미다졸 농도는 165 mM이다. 용출된 분획을 혼주(pooling)시킨 후, 농축시키고 Vivaspin® 3kDa(GE healthcare Life Sciences)에서 다이아필터링하여 이미다졸을 제거하였다. 단백질을 TBS 완충액(트리스-HCl 20 mM; NaCl 150 mM;　pH 7.5)으로 재현탁시키고 0.22 μm 막을 통해 여과하였다.
Alexa Fluor ® 647을 사용한 단백질의 표지
Alexa Fluor® 647 미세규모 단백질 표지 키트(Thermo Fisher Scientific, 프랑스 프랑스 빌레봉-수-예트 소재)를 사용하여 LCT(500 μM), 아플리베르셉트(25 μM) 및 소 혈청 알부민(BSA, 15.4 μM)을 표지하였다. 단백질을 1 M 중탄산나트륨 속에 용해하고 단백질의 1급 아민과 반응하는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 석신이미딜 에스테르과 혼합하고 1시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 접합된 단백질을 반응하지 않은 염료로부터 실온에서 공급된 스핀 컬럼(supplied spin column)을 사용하여 분리하였다. 최종 농도는 제조업자의 추천에 따라서 초기 농도의 ¼까지 평가하였다.
조직학적 분석
CNV 및 PBS 또는 647-LCT의 주사 후 7일째에, 케타민(100 mg/kg, Virbac, 프랑스 까로 소재) 및 크실라진(10 mg/kg, Bayer HealthCare, 독일 베를린 소재)의 300 μL 혼합물을 복강내 주사하여 동물을 깊게 마취시켰다. 마우스를 상행 대동맥(ascending aorta)을 통해 5 mL의 0.9% NaCl 용액에 이어서 30 mL의 4% 파라포름아미드 용액을 주입하였다. 고정 후, 뇌를 조심스럽게 절개하여 동일한 고정액 속에서 48시간 후-고정(post-fixed)시켰다. 유리-부유(free-floating) 단면(40 μm)을 바이브라톰(vibratome)(Leica Microsystems, 독일 베츨라르(Wetzlar) 소재)을 사용하여 수행하였다.
면역화학
마우스를 CO2 흡입으로 희생시켰다. 눈은 핵을 제거하고 4% 파라포름알데하이드 속에 30분 동안 실온에서 고정시켰다. PBS 속에서 수회 세척 후, 각막 및 수정체를 제거하고 망막을 RPE/맥락막/공막으로부터 조심스럽게 분리하였다.
망막 플랫마운트를 염소 폴리클로날 항-콜라겐 IV 항체(AbD Serotec, 프랑스 께르기 퐁토와 소재) 및 FITC-커플링된 반데이라에 심플리키폴리아(Bandeirae simplicifolia)(BS)-1　렉틴(Sigma-Aldrich, 프랑스 상 …티 팔라비에 소재)으로 염색하였다. 성상 세포 및 활성화된 뮐러 세포(Muller cell)를 항-아교세포 원섬유 산성 단백질(anti-Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP) 항체(Sigma-Aldrich, 프랑스 상 …티 팔라비에 소재)을 사용하여 표지하고 아교질 세포를 토끼 폴리클로날 항-Iba1(Wako, 독일 네우쓰 소재)로 염색하였다. RPE를 TRITC-커플링된 팔로이딘(Sigma-Aldrich, 프랑스 상 …티 팔라비에 소재)을 사용하여 맥락막 플랫마운트에서 염색하였다. 핵을 DAPI(Sigma-Aldrich, 프랑스 상 …티 팔라비에 소재)로 염색하였다. CNV 모델에서, 신혈관은 CD102(랫트 항-마우스, BD Biosciences Pharmingen, 프랑스 르 퐁 데 클라잇 소재)로 면역염색하고, 아교질 세포는 항-Iba1으로 표지하였으며 내피 세포 핵은 DAPI로 맥락막 플랫마운드에서 염색하였다. 뇌 단면을 3% 정상의 염소 혈청 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 차단 용액 속에서 1시간 동안 둔 다음, 토끼 항-ATF3(Santa Cruz Biotechnology, 독일 하이델베르크 소재) 및 TRITC-커플링된 반데이래 심플리키폴리아(Bandeirae simplicifolia)(BS)-1 렉틴과 함께 4℃에서 48시간 동안 항온처리하고 DAPI로 염색하였다. OIR 모델에서, 망막 모세혈관을 FITC-BS-1 렉틴으로 표지하였다. 상응하는 Alexa-접합된 제2 항체(Thermo Fisher Scientific, 프랑스 빌레봉-수-예트 소재)를 사용하여 1차 항체를 나타내었다.
망막, 맥락막 및 뇌 단면을 형광 현미경(DM5500B)(Leica, 프랑스 쌩 조리오즈 소재) 또는 공촛점 현미경(FV1000)(Olympus, 프랑스 루기 소재)으로 관찰하였다. 현미경을 LCT-주사된 마우스에서 획득 전에 대조군 마우스(PBS)에 대해 보정하였다.
통계적 분석
그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)(GraphPad Software, 미국 샌 디에고 소재)을 데이타 분석 및 그래프 표시를 위해 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM으로 기록하였다. 데이타는 만-휘트니 U 시험(Mann-Whitney U test), 일원 ANOVA에 이은 본페로니 또는 둔네트 사후 시험으로 분석하였다. P<0.05는 통계적으로 유의적인 것으로 고려하였다.
결과
실시예 1: LCT는 대동맥 및 맥락막 체외이식편으로부터 혈관 스프라우팅을 억제한다
LCT는 시험관내에서 내피 세포 증식 및 관형성(tubulogenesis)을 억제한다(Pilorget, A. et al. 2007). LCT가 생체외에서 신혈관화를 억제하는지를 시험하기 위하여, 본 발명자는 마우스 대동맥 환을 매트리겔에서 배양하였다(Lavalette, S. et al. 2011). 대동맥 환을 3일 동안 배양하여 혈관 스프라우팅이 되도록 한 후 증가하는 용량의 LCT로 처리하였다. LCT 첨가후 3일째에, 혈관 스프라우팅 부위를 정량화하고 D3 내지 D6 사이의 스프라우팅 부위의 증가로서 나타내었다(도 1의 A 및 B). 대조군 조건에서, 혈관 스프라우팅은 D3와 D6 사이에서 259%까지 증가하였다. 30 nM의 최종 농도로 첨가된 LCT는 혈관 스프라우팅에 영향을 미치지 않았으나, 300 nM의 LCT는 D3 내지 D6 사이에서 혈관 스프라우팅을 85%까지 감소시켰다. 1.5 μM의 용량에서 LCT는 스프라우팅을 전체적으로 억제하여 기존의 D3 혈관 스프라우트의 회귀를 야기하였다(도 1의 B). 증가하는 용량의 LCT는 체외이식편을 성장시켜 플라스틱 디쉬(plastic dish) 세포 표면에서 증식하는 섬유아세포에 주목할만한 영향을 미치지 않았다. LCT 활성을 다음에 초리오-모세혈관 상(chorio-capillary bed)으로부터의 혈관의 형성을 밀접하게 재생산하는 마우스 맥락막 체외이식편 모델에서 시험하였다(Shao, Z. et al. 2013). 맥락막을 앞서 기술한 바와 같이 체외이식편으로서 배양하였다(Shao, Z. et al. 2013). 대동맥 환의 경우와 같이, 체외이식편을 D3에서 LCT로 처리하고 D6에 분석하였다(도 1의 C 및 D). 본 발명자는 우선 대동맥 환에서 혈관 회귀를 야기한 용량을 사용하였다. 1.5 μM에서 LCT는 대조군 조건과 비교하여 혈관 스프라우팅을 78% 까지 억제하였지만 D3와 비교하여 여전히 혈관의 286% 증가를 허용하였다. 5 μM에서, LCT는 혈관 성장을 효율적으로 억제하였지만 기존의 D3 혈관 스프라우트를 회귀시키는데 실패하였다. 최종적으로, 15 μM에서, LCT는 D3 스프라우트 회귀를 유도하였다(도 1의 D). 따라서, LCT는 신혈관화의 2개의 별개의 생체외 모델을 감소시키는데 효과적이었다.
실시예 2: LCT 유리체내 주사는 망막 온전성을 변경시키지 않는다.
생체외 실험은 용량에 있어서의 가변성이 신혈관화를 억제하는데 필요하였음을 입증하였다. 따라서, 본 발명자는 파일럿트 연구를 수행하여 레이저 유도된 맥락막 신혈관화(CNV)의 모델에서 신혈관화를 감소시켰다. 1 μl의 LCT를 유리체내 주사를 위해 사용하였으며, 유리체 용적이 5.3 μl이므로(Remtulla, S. Et al. 1985), LCT의 초기 용적은 이의 초기 농도의 1/5로 추정될 수 있었다. 이의 약물동력학에 따라서 LCT는 이후에 모든 안구 구획에 이를 수 있으며(10 μl) 이의 농도는 초기 농도의 1/10로 감소시킬 수 있다. 따라서, 동물에게 1μl의 150 또는 500 μM의 LCT를 유리체내에 주사하여 15 μM(맥락막 체외이식편 스프라우트를 회귀시키는 용량) 또는 50 μM(본 발명자가 독으로부터 정제할 수 있는 최대 농도)의 평가된 최종 농도로 이르게 하였다. 본 발명자는 150 μM에서 1 μl LCT의 유리체내 주사는 CNV를 감소시키는데 충분하지 않았지만 500 μM LCT의 1 μl 주사는 신혈관 부위를 감소시킴을 측정하였다. 500 μM LCT의 단일 주사가 망막 구조를 변경시키는지를 시험하기 위하여 본 발명자는 LCT를 대조군 성체 마우스에 주사하고 이들의 망막을 7일 후에 시험하였다. 망막 구조는 SD-OCT로 분석하였다. OCT는 망막의 전체 구조에서 유의적인 변화를 나타내지 않았다(도 2의 A). 내부 및 외부 핵 층 및 외부 분절의 전체 망막의 두께는 대조군과 LCT 주사된 눈 사이에서 통계적으로 상이하지 않았다(도 2의 B). ERG 반응은 주사 후 7일째에 대조군 동물 및 치료된 동물로부터 기록하였다. LCT의 유리체내 주사는 대조군 또는 PBS-주사된 동물과 비교하는 경우 0.003 내지 10 cds/m²범위의 강도에서 기록된 암순응 ERG를 변경시키지 않았다(도 2의 C; D). 유사하게, 광순응 반응(도 2의 E) 및 플릭커 반응(flicker response)(도 2의 F; G)은 대조군 동물과 비교하는 경우 LCT 주사후 LCT를 변경시키지 않았다.
혈관구조 온전성을 다음에 면역화학으로 주사 7일째에 평가하였다. 망막 플랫마운트를 각각 내피 세포 및 혈관 기저 막을 표지하는 FITC-BS-1 렉틴 및 콜라겐-IV로 염색하였다. 고스트 혈관(Ghost vessel)(콜라겐 IV-양성, 렉틴-음성 혈관으로 검출) 및 신혈관 다발(neovascular tuft)은 LCT를 500 μM에서 주사한 눈에서 검출되지 않았다(도 3의 A). 혈관 온전성의 손실은 마이크로- 및 마크로-신경교 세포 활성화를 야기한다. 따라서, 망막 플랫마운트를 항-GFAP(성상 세포 및 활성화된 뮐러 세포에 대해 특이적임) 또는 항-Iba1(소교 세포에 대해 특이적임) 항체로 면역염색하였다. LCT는 성상세포 형태 및 혈관 커버를 변형시키지 않으며 뮐러 세포 활성화의 신호는 LCT 또는 PBS 유리체내 주사 후 1주째에 망막의 내부 층에서 발견되지 않았다(도 3의 B). 본 발명자는 다음에 CX3CR1+/GFP 마우스의 유리체내에서 LCT 주사 후 소교 세포 형태를 시험하였다. LCT는 표피 또는 심부 신경총(deep plexus)내에 위치한 CX3CR1-양성 세포의 형태를 변형시키지 않았다(도 3의 C). RPE 세포 형태를 LCT 주사 후 7일째에 TRITC-커플링된 팔로이딘을 사용하여 검정하였다. RPE 세포 사멸 또는 RPE 형태의 변경에 있어서 신호는 검출되지 않았다(도 3의 D). 본 발명자의 결과와 함께 모두는 LCT가 주사 후 7일째에 망막 구조, 망막 기능, 또는 혈관 온전성을 변경시키지 않음을 나타내었다.
실시예 3: LCT는 레이저-유도된 맥락막 신혈관화를 억제한다
본 발명자는 LCT가 시험관내에서의 HBMEC 증식 및, 관형성(Pilorget, S. et al. 2007) 및 혈관 온전성에 영향을 미치지 않고(도 3) 신혈관화의 생체외 모델에서 혈관 스프라우팅을 억제함(도 1)을 나타내었다. LCT가 생체내 혈관화를 억제하는지를 시험하기 위하여, LCT 활성을 CNV 마우스 모델에서 검정하였다. 인테그린 소단위 αv 및 α5는 랫트 DNV 모델에서 D3로부터 D7까지 증가되는 것으로 최근에 밝혀졌다(Nakajima, T. et al. 2014). 본 발명자는 상이한 시점에서 레이저-유도된 맥락막 병변 후 마우스 맥락막에서 인테그린 소단위 αv 및 α5 및 β3 및 β5의 발현을 정량화하였다. 맥락막 병변을 D0에 안과용 레이저로 유도하고 맥락막을 D1, D3 및 D7에 수집하였다. 이러한 소단위의 발현을 RT-qPCR로 분석하고 병변이 없는 맥락막(D0)과 비교하였다. 모든 소단위의 발현은 병변 후 24시간 내에 증가하여 D3에 최고가 되는 것으로 밝혀졌다. D7에, αv는 기본 수준으로 되돌아왔지만 α5, β3 및 β5는 상승된 채로 남았다(도 4의 A). 유리체내 주사 후 LCT 결합의 특이성을 측정하기 위하여, 본 발명자는 다음에 레이저-병변처리된 눈의 유리체내에 표지된 분자를 주사하였다. 소 혈청 알부민(BSA), LCT 및 아플리베르셉트를 알렉사 플루오르 647 염료에 미세규모 단백질 표지 키트를 사용하여 공유결합으로 접합시킨 다음, 정제하고 우측 눈에 희생(D7) 3일 전(D4)에 주사하였다. 좌측 눈에는 PBS를 주사하였다. 알렉사 플루오르 647-접합된 BSA(647-BSA)는 표지된 CD102-양성 CNV 병변을 나타내지 않았다. 647-LCT 및 647-아플리베르셉트 둘 다와는 대조적으로 표지화는 맥락막 플랫마운트 상의 CD102-양성 CNV 병변에서 발견되었다(도 4의 D; E). 이후에, 망막 플랫마운트를 콜라겐-IV로 표지하여 혈관 기저막 및 침착물을 검출하였다. 강력한 647-LCT 표지화가 CNV 병변을 접하는 망막의 외부 부위에서 발견되었으며 희미한 표지화는 LCT-주사된 눈의 대동맥에서 관찰되었다. 표지화는 대측의 PBS-주사된 눈에서는 발견되지 않았다. 본 발명자는 다음에 647-LCT 주사된 동물의 시신경, 3차 신경에서 및 뇌의 상이한 부위에서 647-LCT 표지화를 분석하였고 이를 PBS-만 주사된 동물과 비교하였다. LCT는 시신경 및 3차 신경(데이타는 나타내지 않음) 또는 해마, 조롱박 피질, 대상엽, 시상하부, 배옆 정중 시각전핵(ventromedial preoptic nucleus: VMPO) 및 꼬리모양 경막(선조체)에서 검출되지 않았다. 또한, 본 발명자는 신경 손상의 지표인 ATF3 표지화를 검출하지 못하였다(Launay, P. S. et al. 2016; Tsujino, H. et al. 2000).
LCT의 생체내 항-신혈관화 특성을 측정하기 위하여, 본 발명자는 앞서 기술한 바와 같이(Berger, A. et al. 2014) D0에 LCT의 단일 주사 후 레이저 충격 후 7일째 병변 용적을 정량화하고 이를 PBS 처리된 동물과 비교하였다. LCT 주사는 대조군과 비교하여 병변 용적을 31.9%까지 감소시켰다(도 5의 A). 본 발명자는 다음에 D7에서 CD102로 염색된 맥락막 플랫마운트에서 신혈관에 의해 덮힌 부위를 정량화하였다. CNV 부위는 LCT 주사 후 7일째에 26.7%까지 유의적으로 감소하였다(도 5의 B; C). 항-VEGF를 통상적으로 사용하여 AMD 환자에서 맥락막 신혈관화를 치료하였다(Kovach, J. L. et al. 2012). 본 발명자는 다음에 LCT를 항-VEGF와 비교하였다. 베막시주맙 및 라니비주맙 시판 항체는 사람 VEGF만을 인식하므로, 본 발명자는 사람 및 마우스 VEGF 둘 다에 결합하는 아플리베르셉트를 사용하였다(Papadopoulos, N. et al. 2012). 아플리베르셉트의 단일 주사는 맥락막 신혈관화를 31.5%까지 감소시켰다(도 5의 B; C). LCT 및 아플리베르셉트-치료된 병변은 크기에 있어서 통계적으로 상이하지 않았다(도 5의 A). 망막하 단핵 식균작용(sMP)은 맥락막 신혈관화에 관여한다(Lambert, V. et al. 2013). 병변 주변의 sMP 축적에 대한 LCT의 효과를 평가하기 위하여, 맥락막 플랫마운트를 sMP를 표지하는 항-Iba1 항체로 염색하였다. 병변 주변의 sMP의 수에 있어서 차이는 LCT와 PBS 치료된 눈 사이에서 발견되지 않았다. 유사하게, sMP의 수에 있어서의 차이는 LCT- 및 아플리베르셉트-치료된 병변 사이에서 발견되지 않았다(도 5의 B; D).
인테그린 αvβ3 및 αvβ5는 혈관형성의 중요한 조절인자이므로, 본 발명자는 LCT 주사가 이들의 발현을 조절하는지를 측정하였다. αvβ3 및 αvβ5는 증식하는 내피에 의해 발현되므로, 본 발명자는 LCT 주사 직후(24시간) αv, α5, β3 및 β5의 발현을 시험하여 LCT의 장기간 항-신혈관화 효과로부터 가능한 전사 조절을 구별하였다. αv, α5, β3 및 β5 발현은 D3에 최대이므로, 본 발명자는 D2에 LCT 또는 PBS의 단독 주사 후 D3에 이들의 발현을 분석한다. qPCR 분석은 RPE/맥락막 추출물 속에서 LCT와 PBS 사이에 이들의 발현 수준에 있어 유의적인 차이를 나타내지 않았다(도 5의 E).
본 발명자는 고 용량의 LCT가 기존 혈관을 회귀시킴을 나타내었으므로(도 1), 본 발명자는 다음에 레이저 충격 후 3일째에 유리체에서 LCT를 주사하고 신혈관화 크기를 정량화하였다. 초기 혈관 성장 후 주사한 경우, LCT 주사는 혈관 회귀를 19%까지 허용하였다(도 6의 A; B). 본 발명자의 결과 모두는 LCT의 단일 주사가 sMP 보충에 영향을 미치지 않으면서 맥락막 신혈관화를 방지 및 회귀시킴을 나타내었다.
실시예 4: LCT는 산소 유도된 망막병증(OIR) 모델에서 망막 신혈관화를 억제한다.
본 발명자는 다음에 OIR 모델에서 심각한 허혈성 망막병증의 특징인 망막 신혈관화에 대한 LCT의 효과를 시험하였다. 이러한 모델을 광범위하게 사용하여 망막 혈관 손실, 혈관 재성장, 신혈관화 및 신혈관 회귀를 이해하였다(Connor, K. M. et al. 2009). 망막 신혈관화는 신생 설치류에게 P7와 P12 사이에 고산소증을 처리하여 생리학적 혈관 발달을 억제함으로써 유도된다. 동물을 실내 공기로 돌려보내는 경우, 상대적인 망막 저산소증은 P12와 P17 사이에 심각한 망막 신혈관화를 야기한다(Smith, L. E. et al. 1994). LCT의 결합 특이성을 측정하기 위하여, 본 발명자는 P17에 이들을 희생시키기 3일 전에 OIR-처리된 동물의 유리체에 알렉사 플루오르 647-접합된 LCT(647-LCT)를 먼저 주사하였다. 647-LCT는 BS-1 렉틴 양성 신혈관 다발(tuft)을 강력하게 표지하였지만 망막 혈관구조는 표지하지 않았다(도 7의 A). OIR 모델에서 LCT의 항-혈관형성 특성을 평가하기 위하여, P7 마우스를 OIR에 적용시키고 12일째에 1 μl의 PBS 또는 500 μM LCT를 주사하고 실온으로 되돌렸다. 마우스를 P17에 희생시키고 혈관-소멸(VO) 및 신혈관화 부위(NV)를 앞서 기술한 바와 같이(Stahl, A. et al. 2009) BS-1 렉틴으로 염색된 망막 플랫마운트에서 측정하였다. LCT는 PBS 주사와 비교하는 경우 VO의 비를 변화시키지 않았다(도 7의 B; D). 대조적으로, P12에서 LCT의 단일 주사는 P17에 망막 신혈관화에 의해 덮힌 부위를 48.1%까지 감소시켰다(도 7의 B; E). LCT 치료를 항-VEGF 치료요법과 비교하기 위하여, 25 μM의 아플리베르셉트를 P12에 주사하고, 망막 발달( Stahl, A. et al. 2009)에 영향을 미치지 않으면서 NV를 감소시키는 것으로 밝혀진 용량과 NV 및 VO를 LCT 동물과 비교하였다. LCT와 아플리베르셉트 치료 사이에서 VO 및 NV에서 차이는 발견되지 않았다(도 7의 B 내지 E).
실시예 5: LCT 및 아플리베르셉트의 공-주사는 아플리베르셉트 단독보다 보다 큰 신혈관화 억제를 생성한다.
본 발명자는 다음에 OIR 모델에서 망막 신혈관화에 대한 LCT 및 아플리베르셉트의 공-주사의 효과를 시험하였다. OIR 모델에서 LCT 및 아플리베르셉트의 공-주사의 항-혈관형성 특성을 평가하기 위하여, P7 마우스를 OIR에 적용시키고 1 μL의 PBS, 500μM의 LCT, 25μM의 아플리베르셉트 또는 500μM의 LCT 및 25μM의 아플리베르셉트를 12일째에 주사하고 실내 공기로 되돌렸다. 마우스를 P17에 희생시키고 혈관-소멸(VO) 및 신혈관화 부위(NV)를 BS-1 렉틴으로 염색한 망막 플랫마운트에서 측정하였다. LCT 및 아플리베르셉트의 공-주사는 PBS와 비교하는 경우 VO의 비를 변화시키지 않았다(도 8). 대조적으로, LCT 및 아플리베르셉트의 공-투여는 아플리베르셉트 또는 LCT 단독보다 더 큰 신혈관화 억제를 야기한다.
실시예 6: 재조합 LCT는 맥락막 체외이식편으로부터 혈관 스프라우트를 억제한다
재조합 LCT 활성을 초리오-모세혈관상으로부터 혈관의 형성을 밀접하게 재생산하는 마우스 맥락막 체외이식편 모델에서 시험하였다(Shao, Z. et al. 2013). 맥락막을 앞서 기술한 바와 같이 체외이식편으로서 배양하였다(Shao, Z. et al. 2013). 체외이식편을 D3에서 재조합 LCT(rLCT)로 처리하고 D6에 분석하였다(도 9). 1.5 μM에서 rLCT는 대조군 조건과 비교하는 경우 혈관 스프라우팅을 65.0%까지 억제하였다.
실시예 7: 재조합 LCT는 산소 유도된 망막병증(OIR) 모델에서 망막 신혈관화를 억제한다.
본 발명자는 다음에 OIR 모델에서, 심각한 허혈성 망막병증의 특징인 망막 신혈관화에 대한 재조합 LCT의 효과를 시험하였다. 망막 신혈관화는 P7과 P12 사이에 고산소증에 신생 설치류를 적용시킴으로써 유도시켜 생리학적 혈관 발달을 억제하였다. 동물을 실내 공기로 되돌린 후, 상대적인 망막 저산소증은 P12 내지 P17 사이에 심각한 망막 신혈관화를 초래한다(Smith, L. E. et al. 1994). OIR 모델에서 rLCT의 항-혈관형성 특성을 평가하기 위하여, P7 마우스를 OIR에 적용시키고 1 μl의 PBS 또는 500 μM의 rLCT를 12일째에 주사하고 실내-공기에 되돌렸다. 마우스를 P17에 희생시키고 혈관-소멸(VO) 및 신혈관화 부위(NV)를 앞서 기술한 바와 같이 BS-1으로 염색한 망막 플랫마운트에서 측정하였다(Stahl, A. et al. 2009)(도 10의 A). rLCT는 PBS 주사와 비교하는 경우 VO의 비를 변화시키지 않았다(도 10의 B). 대조적으로, P12에서 rLCT의 단일 주사는 P17에서 망막 신혈관화에 의해 덮힌 부위를 22.1%까지 감소시켰다(도 10C).
실시예 8: 재조합 LCT는 레이저-유도된 맥락막 신혈관화를 억제한다
재조합 LCT가 생체내 신혈관화를 억제하는지를 시험하기 위하여, rLCT 활성을 CNV 마우스 모델에서 평가하였다. 맥락막 병변을 D0에서 안과용 레이저로 유도시키고 맥락막을 D7에 수집하였다. rLCT의 생체내 항-신혈관화 특성을 측정하기 위하여, 본 발명자는 D7에서 CD102로 염색된 맥락막 플랫마운트에서 신혈관에 의해 덮힌 부위를 정량화하였다(도 11의 A). CNV 부위는 rLCT 주사 후 7일째에 29.8%까지 유의적으로 감소되었다(도 11의 B).
참조문헌 (REFERENCES)
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Arg Lys Trp Val Asn Leu 130 135 140 Asn Cys Gly Gln Pro Tyr Arg Phe Thr Cys Glu Ile 145 150 155 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Lebecetin alpha subunit without peptide signal sequence <400> 2 Asp Gln Asp Cys Leu Pro Gly Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr 1 5 10 15 Lys Val Phe Asn Leu Asp Lys Thr Trp Glu Asp Ala Glu Lys Phe Cys 20 25 30 Thr Glu Gln Ala Asn Ser Gly His Leu Val Ser Ile Asp Ser Lys Lys 35 40 45 Glu Ala Asn Phe Val Ala Glu Leu Val Ser Gln Asn Ile Lys Glu Thr 50 55 60 Arg Arg Thr Asp Phe Val Trp Ile Gly Leu Arg Ala Glu Asp Lys Arg 65 70 75 80 Gln His Cys Ser Ser Glu Trp Ser Asp Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gln 85 90 95 Asn Trp Ile Glu Ala Glu Ser Lys Lys Cys Leu Gly Leu Glu Lys Gln 100 105 110 Thr Arg Tyr Arg Lys Trp Val Asn Leu Asn Cys Gly Gln Pro Tyr Arg 115 120 125 Phe Thr Cys Glu Ile 130 <210> 3 <211> 148 <212> PRT <213> Macrovipera lebetina <400> 3 Met Gly Arg Ile Ile Phe Val Ser Phe Gly Leu Leu Val Val Phe Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ser Gly Thr 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Claims (20)

  1. 신혈관 질환(neovascular disease)의 치료에 사용하기 위한, 레베세틴(lebecetin) 및 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택된 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 레베세틴인, 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단백질이
    - 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위(subunit), 및
    - 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함하는, 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 상기 단백질이
    - 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및
    - 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함하는, 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2와 적어도 75% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1의 소단위, 및 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함하는 레베세틴의 기능성 변이체인, 단백질.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1의 소단위, 및 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함하는 레베세틴의 기능성 변이체인, 단백질.
  7. 제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호: 2와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1의 소단위, 및 서열 번호: 4와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함하는 레베세틴의 기능성 변이체인, 단백질.
  8. 제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호: 2와 비교하여 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개의 변형된 아미노산 잔기를 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 소단위, 및/또는 서열 번호: 4와 비교하여 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개의 변형된 아미노산 잔기를 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 소단위를 포함하는 레베세틴의 기능성 변이체인, 단백질.
  9. 제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호: 1 또는 2로부터 유래한 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 30개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제1의 소단위, 및/또는 서열 번호: 3 또는 4로부터 유래한 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 1 내지 30개의 아미노산 보존적 치환을 포함하는 제2의 소단위를 포함하는, 단백질.
  10. 제1항 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 레베세틴의 기능성 변이체이고, 여기서
    1) 알파 쇄와 베타 쇄 사이의 디설파이드 브릿지(disulfide bridge) 내에 또는 사이에 포함된 시스테인 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 Cys27, Cys38, Cys55, Cys106, Cys129, Cys149 및 Cys 154, 및/또는 서열 번호: 3의 Cys27, Cys38, Cys55, Cys100, Cys123, Cys136 및 Cys 144; 및/또는
    2) HCY 도메인의 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 His37, Cys38, Tyr39 및 서열 번호: 3의 His37, Cys38, Tyr39; 및/또는
    3) DAEK 도메인의 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 Asp50, Ala51, Glu52 및 lys53 및 서열 번호: 3의 Asp50, Ala51, Glu52 및 lys53; 및/또는
    4) WIGL 모티프의 잔기, 즉, 서열 번호: 1의 Trp94 내지 Leu96 및 서열 번호: 3의 Trp94 내지 Leu96에 상응하는 잔기가 보존되는, 단백질.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 엠. 레베티나(M. lebetina) 독으로부터 단리되는(isolated), 단백질.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 재조합 단백질인, 단백질.
  13. 신혈관 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 또는 이러한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  14. 신혈관 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 제13항에 따른 핵산 서열 또는 벡터, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 활성 물질, 바람직하게는 혈관형성 억제제(angiogenesis inhibitor)를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 조성물이 적어도 하나의 혈관형성 억제제와 함께 사용되는, 약제학적 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 혈관형성 억제제가 VEGF 경로의 억제제, 바람직하게는 아플리베르셉트인, 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 제13항에 따른 핵산 서열 또는 벡터, 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따르는 약제학적 조성물에 있어서, 상기 신혈관 질환이 안구 신혈관 질환 및 바람직하게는 폐, 유방, 위, 결장직장, 췌장 및 뇌 암으로부터 선택된 신혈관 성분을 지닌 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단백질; 핵산 서열 또는 벡터; 또는 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 제13항에 따른 핵산 서열 또는 벡터, 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따르는 약제학적 조성물에 있어서, 상기 신혈관 질환이 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 망막성 허혈 또는 증식성 당뇨망막병증과 같은 당뇨 망막병증, 홍채 신혈관화, 안구내 신혈관화, 각막 신혈관화, 홍채 신혈관화, 맥락막 신혈관화 및 각막 염증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 안구 신생혈관 질환인, 단백질; 핵산 서열 또는 벡터; 또는 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 제13항에 따른 핵산 서열 또는 벡터, 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따르는 약제학적 조성물에 있어서, 치료될 대상체가 혈관형성 억제제, 바람직하게는 VEGF 경로 억제제, 보다 바람직하게는 아플리베르셉트를 사용한 치료요법에 대해 반응하지 않거나 내성이 된, 단백질; 핵산 또는 벡터; 또는 약제학적 조성물.
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