ES2901613T3

ES2901613T3 - Lebecetina, una lectina de tipo C, como inhibidor de la neovascularización

Info

Publication number: ES2901613T3
Application number: ES17826163T
Authority: ES
Inventors: Xavier Guillonneau; Fadoua Montassar; Naziha Marrakchi; Erij Messadi; Florian Sennlaub; José-Alain Sahel
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite; Institut Pasteur de Tunis
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite; Institut Pasteur de Tunis
Priority date: 2016-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2022-03-23
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: US11191807B2; JP7179010B2; IL267298B2; IL267298A; KR20190102003A; US20190298797A1; CA3046283A1; WO2018108945A1; JP2022119955A; EP3551211A1; KR20240025713A; EP3551211B1; JP2020511148A; IL267298B1

Abstract

Una proteína seleccionada a partir de lebecetina y variantes funcionales o fragmentos de la misma para uso en el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular, en donde dicha proteína comprende: - una primera subunidad que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad con la misma, y - una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad con la misma.

Description

DESCRIPCIÓN

Lebecetina, una lectina de tipo C, como inhibidor de la neovascularización

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la medicina, en particular al tratamiento de enfermedades que implican una neovascularización, y preferiblemente al tratamiento de enfermedades oculares que implican una neovasculariza ción retiniana.

Antecedentes de la invención

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es la principal causa de ceguera en personas mayores de 55 años, y las retinopatías isquémicas, como la retinopatía diabética (RD), la oclusión de las venas retinianas y la retinopatía del prematuro, son la principal causa de ceguera en personas menores de 55 años de edad (Friedman DS et al. 2004; Kempen JH et al. 2004; Klein R et al. 2004). Las formas proliferativas de estas patologías (DMAE húmeda y retinopatía diabética proliferativa) dan como resultado una pérdida de visión rápida e irreversible. En la DMAE, los vasos nuevos se originan principalmente a partir del lecho coroideo vascular y crecen en el espacio subretiniano o debajo del epitelio pigmentario retiniano (EPR), mientras que en la forma proliferativa de RD (RDP), una isquemia neural desencadena una neovascularización de los vasos retinianos.

La neoangiogénesis, también llamada neovascularización, es un proceso fundamental del brote capilar y de la confi guración de neovasculaturas a partir de los vasos sanguíneos existentes. Contrasta con la vasculogénesis/angiogénesis, otro proceso de formación de vasos sanguíneos que ocurre durante el desarrollo embriológico del sistema circulatorio o en el organismo adulto a partir de células progenitoras endoteliales circulantes.

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) es un mediador principal de la angiogénesis retiniana y coroidea (D'Amore P.A. et al. 1994). Las inyecciones intraoculares de anticuerpos dirigidos contra VEGF o de la forma soluble de VEGFR1, inhiben eficazmente la neovascularización coroidea en la DMAE húmeda. Sin embargo, el 10% de los pacientes sin tratamiento previo no responden al anti-VEGF (Brown, D.M. et al. 2006; Rosenfeld P.J. et al. 2006) y del 2 al 10% de los pacientes que responden al anti-VEGF se vuelven resistentes con el tiempo (Forooghian, F. et al.2009; Eghoj, M.S. et al. 2012). Las terapias anti-VEGF también son el tratamiento de primera línea del edema macular diabético. Por el contrario, las RDPs que se caracterizan por una neovascularización retiniana (NVR), se tratan principalmente mediante una fotocoagulación panretiniana preventiva (PRP, por sus siglas en inglés) (Martínez-Zapata, M. J. et al. 2014). Los anti-VEGFs ahora han sido aprobados en los EE.UU. para el tratamiento de la RDP como una alternativa a la PRP. Los estudios en curso determinarán la tasa de resistencia espontánea y adquirida en esta nueva indicación. En conjunto, estos datos clínicos respaldan la necesidad de terapias de anti-neovascularización adicionales que no se dirijan principalmente a la vía del VEGF.

Además, debido a que la neovascularización retiniana se asocia con exudación y hemorragias que son responsables de una pérdida rápida de la visión, la identificación de vías alternativas para bloquear una neoangiogénesis excesiva y la fuga vascular tiene, por tanto, un enorme interés terapéutico.

Compendio de la invención

Los inventores de la presente memoria han revelado un efecto inesperado de la lebecetina. De hecho, han demostrado que la lebecetina puede reducir eficazmente el grado de neovascularización coroidea o retiniana y, por tanto, propor cionar nuevas estrategias para inhibir la neovascularización.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una proteína seleccionada a partir de lebecetina y variantes funcionales y fragmentos de la misma para uso en el tratamiento de una enfermedad neovascular, tal y como se define en las reivindicaciones.

Esa proteína es lebecetina o una variante funcional de lebecetina que comprende una primera subunidad que com prende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoá cidos que tiene al menos un 75% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Dicha variante funcional de lebecetina también puede comprender una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 1 o 2 y que comprende de 1 a 30 sustituciones conservadoras de aminoácidos, y/o una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 3 o 4 y que comprende de 1 a 30 sustituciones conservadoras de aminoácidos. Preferiblemente, los residuos correspondien tes a 1) residuos de cisteína implicados en puentes disulfuro intracatenarios o entre las cadenas alfa y beta, es decir, Cys27, Cys38, Cys55, Cys106, Cys129, Cys149 y Cys154 de SEQ ID NO: 1, y Cys27, Cys38, Cys55, Cys100, Cys123, Cys136 y Cys144 de SEQ ID NO: 3; y/o 2) residuos de los dominios HCY, es decir, His37, Cys38, Tyr39 de SEQ ID NO: 1 y His37, Cys38, Tyr39 de SEQ ID NO: 3; y/o 3) residuos de los dominios Da Ek , es decir, Asp50, Ala51, Glu52 y Lys53 de SEQ ID NO: 1 y Asp50, Ala51, Glu52 y Lys53 de SEQ ID NO: 3; y/o 4) restos de motivos WIGL, es decir, de Trp94 a Leu96 de SEQ ID NO: 1 y de Trp94 a Leu96 de SEQ ID NO: 3, se conservan en la variante funcional de lebecetina.

Preferiblemente, la proteína utilizada según la invención se aísla a partir de veneno de M. lebetina o es una proteína recombinante.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína usada según la invención, o un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico, para uso en el tratamiento de una enfermedad neovascular, tal y como se define en las reivindicaciones.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína, el ácido nucleico o el vector según la presente invención y un excipiente farmacéutico, para uso en el tratamiento de una enfermedad neovascular, tal y como se define en las reivindicaciones. Preferiblemente, dicha composición farmacéu tica comprende además al menos un inhibidor de la angiogénesis, preferiblemente un inhibidor de la vía del VEGF.

En realizaciones particulares, dicha composición farmacéutica se puede usar en combinación con al menos un inhibi dor de la angiogénesis, preferiblemente un inhibidor de la vía del VEGF.

Preferiblemente, el sujeto que se va a tratar con la composición farmacéutica de la invención, es un sujeto que no responde o que se ha vuelto resistente a una terapia con un inhibidor de la angiogénesis, preferiblemente un inhibidor de la vía del VEGF.

La enfermedad neovascular es una enfermedad neovascular ocular, preferiblemente seleccionada a partir del grupo que consiste en degeneración macular relacionada con la edad, retinopatías diabéticas tales como isquemia retiniana diabética o retinopatía diabética proliferativa, neovascularización del iris, neovascularización intraocular, neovascularización corneal, neovascularización retiniana, neovascularización coroidea e inflamación corneal.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: LCT inhibe el brote vascular desde explantes aórticos y coroideos. (A, C) Microfotografías representativas de brotes endoteliales aórticos y coroideos. (B) Medición del brote vascular desde anillos aórticos de crías de rata Lewis P4 en los grupos de control y LCT (30 nM, 300 nM, 1,5 pM), (n = 4 por grupo, *p 0,05; ANOVA unidireccional seguida de una prueba posterior de Dunnett; CTL como control, representativo de 3 experimentos independien tes). (D) Medición del brote vascular desde explantes coroideos de ratones macho C57BL/6JRj de 3 semanas de edad en los grupos control y LCT (1,5 pM, 5 pM, 15 pM), (n > 5 por grupo, *p <0,05; ANOVA unidireccional seguida de una prueba posterior de Dunnett; CTL como control, representativo de 3 experimentos independientes). Barras de escala en A y C = 200 pm.

Figura 2: Una inyección intravítrea de LCT no altera la función visual. (A) Imagen SD-OCT representativa de la retina el D7 después de una inyección intravítrea de 1 pl de PBS o LCT (500 pM). (B) Cuantificación del grosor de toda la retina, ONL, INL y OS a 500 pm del nervio óptico, n = 4 ojos por grupo. (C) Rastros de electrorretinograma represen tativos del registro de ERG escotópica de los grupos CTL, PBS y LCT a 0,3 cd.s/m2. (D) Amplitudes de ondas a y b registradas de forma escotópica con diferentes intensidades de estímulo (0,003 cd.s/m2; 0,03 cd.s/m2; 0,3 cd.s/m2; 3 cd.s/m2; 10 cd.s/m2). (E) Amplitudes de respuesta fotópica con una intensidad de destellos de 10 cd.s/m2 de animales adaptados a la luz. (F) Rastros de electrorretinograma representativos procedentes de parpadeos de ERG registrados con frecuencias de destellos de 10 Hz con una intensidad de 1 cd.s/m2. (G) Amplitudes de respuestas de parpadeo registradas con frecuencias de destellos de 10 y 20 Hz, n = 10 ojos por grupo para cada registro de ERG. IPL: capa plexiforme interna, INL: capa nuclear interna, ONL: capa nuclear externa, OLM: membrana limitante externa. Barra de escala en A = 100 pm.

Figura 3: Una inyección intravítrea de LCT no altera la integridad vascular. (A) Microfotografías de preparaciones pla nas retinianas de ratones C57BL/6JRj inmunoteñidos con lectina BS-1 acoplada a FITC (verde), colágeno-IV (rojo) y (B) GFAP (verde), 7 días después de inyecciones intravítreas de PBS (1 pl) o LCT (1 pl, 500 pM). (C) Microfotogra fías de preparaciones planas retinianas de ratones CX3CR1+/GFP inmunoteñidos con anticuerpos de colágeno IV (rojo) e Iba1 (verde) en el plexo interno y externo, 7 días después de inyecciones intravítreas de PBS (1 pl) o LCT (1 pl, 500 pM). (D) Preparaciones planas coroideas de ratones C57BL/6JRj inmunoteñidos junto con faloidina acoplada a TRITC (rojo) y DAPI (azul) el D7 después de inyecciones intravítreas de PBS (1 pl) o LCT (1 pl, 500 pM). Barras de escala en A, B y C = 50 pm; en D = 100 pm.

Figura 4: LCT se une a las lesiones de NVC. (A) RT-PCR cuantitativa de ARNm de la subunidad de integrina (av, a5, p3, p5) normalizada con ARNm de GADPH de coroides de C57BL/6JRj recogidas los días 0, 1, 3 y 7, después de lesiones coroideas inducidas por láser, n = 8 ojos por grupo. (B) Microfotografías de lesiones de NVC inducidas por láser el D7 sobre preparaciones planas coroideas después de inyecciones intravítreas el D4 de albúmina de suero bovino (647-BSA), LCT (647-LCT) o Aflibercept (647-Aflibercept), conjugados covalentemente con un colorante Alexa Fluor 647. Todas las coroides se tiñeron conjuntamente con anticuerpo CD102 (verde). Barras de escala en B-E = 50 pm.

Figura 5: LCT inhibe la neovascularización coroidea inducida por láser. (A) Imágenes SD-OCT representativas de la lesión coroidea y la cuantificación del volumen de la lesión, 7 días después del láser y de inyecciones intravítreas de PBS (1 pl), LCT (1 pl, 500 pM) y Aflibercept (1 pl, 25 pM). (n = 26, 35 y 16 impactos de láser respectivamente por grupo. *p <0,05; ANOVA unidireccional seguida de una prueba posterior de Bonferroni; representativa de 2 experi mentos independientes). El volumen de la lesión se extrapola utilizando la siguiente fórmula (4/3n*a*b2)/2, a es el radio polar (eje vertical) y b es el radio del ecuador (eje horizontal). (B) Microfotografías de una lesión de NVC sobre prepa raciones planas coroideas de PBS (1 pl), L^cT (1 pl, 500 pM) y Aflibercept (1 pl, 25 pM) teñidas con CD102 (verde), Iba1 (rojo) y DAPI (azul). (C) Cuantificación de NVC (área positiva para CD102), 7 días después del láser e inyecciones intravítreas de PBS (1 pl), Lc T (1 pl, 500 pM) y Aflibercept (1 pl, 25 pM) (n = 29, 32 y 30 impactos de láser respecti vamente por grupo. *p <0,05; ANOVA unidireccional seguida de una prueba posterior de Bonferroni; representativa de 2 experimentos independientes). (D) Cuantificación de las células positivas para Iba1 por cada impacto, 7 días des pués del láser e inyecciones intravítreas de PBS (1 pl), LCT (1 pl, 500 pM) y Aflibercept (1 pl, 25 pM) (n = 29, 32 y 30 impactos de láser respectivamente por grupo. *p <0,05; ANOVA unidireccional seguida de una prueba posterior de Bonferroni; representativa de 2 experimentos independientes). (E) RT-PCR cuantitativa del ARNm de la subunidad de integrina (av, a5, (33, p5) normalizado con ARNm de GADPH de coroides de C57BL/6JRj el D3. Los ratones se trataron con una única inyección intravítrea de PBS (1 pl) o LCT (1 pl, 500 pM) el D2, n = 5 ojos por grupo. INL: capa nuclear interna, ONL: capa nuclear externa, barras de escala en A = 50 pm; en B = 100 pm.

Figura 6: La inyección intravítrea de LCT el D3 inhibe la neovascularización coroidea. (A) Microfotografías de lesiones de NVC teñidas con CD102 (verde) y DAPI (azul), 7 días después del láser (D0) e inyecciones intravítreas (D3) de PBS (1 pl), LCT (1 pl, 500 pM). (B) Cuantificación de NVC (área positiva para CD102) sobre preparaciones planas coroideas de PBS y LCT el D7 (n = 27 y 28 impactos de láser por grupo. *p <0,05; prueba U de Mann-Whitney; representativa de 2 experimentos independientes), barra de escala en A = 100 pm.

Figura 7: LCT inhibe la neovascularización retiniana en el modelo de retinopatía inducida por oxígeno (RIO). (A) Mi crofotografías de retina teñida con lectina BS-1 acoplada a FITC (verde) de ratones P17-RIO C57BL/6JRj que recibie ron una inyección intravítrea el P14 de LCT (647-LCT) conjugada covalentemente con un colorante Alexa Fluor 647 (rojo). (B) Microfotografías de retina teñida con lectina BS-1 acoplada con FITC, de ratones P17-RIO C57BL/6JRj, después de una inyección intravítrea el P12 de PBS (1 pl), LCT (1 pl, 500 pM) o Aflibercept (1 pl, 25 pM). Las áreas de neovascularización (NV) y vaso-obliteración (VO) se resaltaron en blanco y rojo, respectivamente. (C) Fotografías representativas con microscopía confocal de neovascularización en retinas tratadas y de control teñidas con lectina BS-1. (D) Cuantificación de la vaso-obliteración y (E) la neovascularización (área positiva para la lectina BS-1) en el control P17 y en preparaciones planas retinianas tratadas, (n = 35, 32 y 16 RIO-retina respectivamente. *p <0,05; ANOVA unidireccional seguida de una prueba posterior de Bonferroni; representativa de 2 experimentos independien tes). Barras de escala en A = 30 pm; en B = 80 mm; y en C = 100 pm.

Figura 8: (A) Cuantificación de la neovascularización (área positiva para la lectina BS-1) y (B) vaso-obliteración en ratones P17-RIO C57BL/6JRj, después de una inyección intravítrea el P12 de PBS (1 pl), Lc T (1 pl, 500 pM), Afliber cept (1 pl, 25 pM) o LCT Aflibercept (1 pl de Lc T 500 pM/Aflibercept 25 pM), (n = 35, 32, 16 y 24 RIO-retina respec tivamente). *p <0,05; ANOVA unidireccional seguida de la prueba posterior de Dunnett; representante de 2 experimen tos independientes).

Figura 9: (A) Microfotografías representativas de brotes endoteliales coroideos no tratados (CTL) o brotes endoteliales coroideos el día 6 (D6) tratados con lebecetina procedente de Macrovipera lebetina (LCT) o LCT recombinante (rLCT) el D3. (B) Medición del brote vascular de explantes coroideos de ratones macho C57BL/6JRj de 2 semanas de edad en los grupos de control, LCT (1,5 pM) y rLCT (1,5 pM, 5 pM, 15 pM). El brote vascular se expresa como el aumento entre D3 y D6. (n >10 por grupo, *p <0,05; ANOVA unidireccional seguida de la prueba posterior de Dunnett; CTL como control. (C) Medición del brote vascular de explantes coroideos de ratones macho C57BL/6JRj de 2 semanas de edad tratados durante 3 días con Aflibercept 2,5 pM, en grupos de control, LCT (1,5 pM) y rLCT (1,5 pM, 5 pM, 15 pM), (n >6 por grupo, *p <0,05; ANOVA unidireccional seguida de la prueba posterior de Dunnett; Afli como control). Barra de escala en A 500 pm.

Figura 10: (A) Microfotografías de retinas teñidas con CD102, de ratones P17-RIO C57BL/6JRj, inyectados intravítreamente el P12 con PBS (1 pl) o LCT recombinante (rLCT, 1 pl, 500 pM). Cuantificación de (B) la vaso-obliteración y (C) la neovascularización (área positiva para CD102) en el control P17 y preparaciones planas retinianas tratadas, (n = 9 y 10 RIO-retina respectivamente. *p <0,05; prueba t no apareada). Barra de escala en A = 500 pm; recuadro = 40 pm.

Figura 11: (A) Microfotografías de una lesión de NVC sobre preparaciones planas coroideas de PBS y LCT recombi nante (rLCT) teñidas con CD102. (B) Cuantificación de NVC (área positiva para CD102) 7 días después del láser e inyecciones intravítreas de PBS (1 pl) y rLCT (1 pl, 500 pM) (n = 29, 32 y 30 impactos de láser respectivamente por grupo. *p <0,05; ANOVA unidireccional seguida de una prueba posterior de Bonferroni; representativa de 2 experi mentos independientes). (E) Cuantificación de células positivas para Iba1 por cada impacto, 7 días después del láser y las inyecciones intravítreas de PBS (1 pl), LCT (1 pl, 500 pM) y Aflibercept (1 pl, 1,7 pg) (n = 35 y 47 impactos de láser respectivamente por grupo. *p <0,05; prueba t para datos no apareados). Barra de escala en A = 50 pm.

Descripción detallada de la invención

Los inventores de este documento demostraron que la lebecetina era eficaz para reducir el brote vascular en modelos ex vivo de neovascularización, es decir, explantes aórticos y coroideos, así como en modelos in vivo de neovascularización, es decir, neovascularización coroidea inducida por láser y modelo de retinopatía inducida con oxígeno, con una eficiencia comparable a una terapia anti-VEGF. De hecho, observaron que una inyección intravítrea de lebecetina permitía la prevención y la regresión de la neovascularización. También mostraron que una inyección intravítrea de una cantidad terapéuticamente eficaz de lebecetina no altera la estructura de la retina, la función de la retina o la integridad de los vasos. Por tanto, estos resultados demuestran claramente que la lebecetina se puede utilizar eficaz mente para tratar enfermedades que implican una neovascularización y, en particular, una neovascularización retiniana y/o coroidea.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una proteína seleccionada a partir de lebecetina, y variantes funcionales y fragmentos de la misma, para uso en el tratamiento de una enfermedad neovascular, tal y como se define en las reivindicaciones.

Tal y como se usa en este documento, el término "lebecetina" o "LCT" se refiere a una lectina de tipo C (CTL, por sus siglas en inglés) de 30 kDa, aislada a partir de Macrovipera iebetina (MVL). Las CTLs comparten características co munes que incluyen un armazón de cisteína (con un mínimo de 4 cisteínas) y un dominio de reconocimiento de car bohidratos (CRD, por sus siglas en inglés) o similar a CRD. La LCT se compone de una cadena alfa (MLVA1) (SEQ ID NO: 1) y una cadena beta (MLVB1) (SEQ ID NO: 3). Ambas subunidades se han clonado (Jebali et al. 2009) y están indexadas en la base de datos de Genbank (números de orden: ABW82656 y ABW82672, respectivamente). Las dos subunidades están unidas por enlaces disulfuro (Sarray, S. et al. 2003). MLVA1 y MLVB1 tienen un dominio CLECT, es decir, un dominio de reconocimiento de carbohidratos (MVLA1, dominio desde el residuo 27 al 155 (cdd 295302) y MVLB1, dominio desde el residuo 27 al 145 (cdd 214480)). Las formas homodímeras de MLVA1 o MLVB1 no son activas (Jebali et al. 2012). Se pueden omitir las supuestas secuencias del "péptido señal" de lebecetina desde el codón de inicio hasta el codón 24.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "fragmento funcional" se refiere a una proteína heterodímera que se obtiene a partir de lebecetina, que conserva la actividad anti-neovascularizante de la lebecetina y comprende i) la cadena alfa de lebecetina (SEQ ID NO: 1) y un fragmento de la cadena beta de lebecetina, ii) un fragmento de la cadena alfa de lebecetina y la cadena beta de lebecetina (SEQ ID NO: 3), o (iii) un fragmento de la cadena alfa de lebecetina y un fragmento de la cadena beta de lebecetina.

Preferiblemente, la expresión "fragmento funcional" se refiere a una forma madura de lebecetina, es decir, que no contiene un péptido señal en el extremo N-terminal de una o ambas subunidades, preferiblemente de ambas subuni dades. Por tanto, en una realización particular, la proteína utilizada en la presente invención es un fragmento funcional de lebecetina que es un heterodímero compuesto por dos subunidades diferentes: una primera subunidad que com prende, o que consiste en, SEQ ID NO: 2, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en SEQ ID NO: 4, estas dos subunidades están unidas por puentes disulfuro.

En una realización, la proteína utilizada en la presente invención es un heterodímero formado por dos subunidades diferentes: una primera subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 1 o 2, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en SEQ ID NO: 3 o 4, estas dos subunidades están unidas por puentes disulfuro.

En una realización particular, la proteína usada en la presente invención comprende una primera subunidad que com prende, o que consiste en, SEQ ID NO: 1 y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 3.

En otra realización particular, la proteína usada en la presente invención comprende una primera subunidad que com prende, o que consiste en, SEQ ID NO: 2 y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 4.

En otra realización particular, la proteína usada en la presente invención es un heterodímero que comprende dos subunidades diferentes: una primera subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 2 y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 4 o 18, estando estas dos subunidades unidas por puentes disulfuro.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "variante funcional" se refiere a una proteína heterodímera que se obtiene a partir de lebecetina y comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (p. ej., varias) posiciones en una o ambas de sus subunidades, y conserva la actividad anti-neovascularizante de la lebecetina. Esa actividad se puede evaluar fácilmente tal y como se describe en la sección experimental a continuación. El término "deleción", usado en relación con una posición o un aminoácido, significa que el aminoácido en la posición particular se ha eliminado o está ausente. El término "inserción", usado en relación con una posición o un aminoácido, significa que uno o más aminoácidos se han insertado o están presentes de forma adyacente e inme diatamente después del aminoácido que ocupa la posición en particular. El término "sustitución", tal y como se usa en este documento en relación con una posición o un aminoácido, significa que el aminoácido en la posición en particular ha sido reemplazado por otro aminoácido o que está presente un aminoácido diferente al de la proteína de tipo silves tre. Preferiblemente, el término "sustitución" se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido por otro seleccionado a partir de los 20 residuos de aminoácidos convencionales de origen natural, a partir de residuos de aminoácidos de origen natural raros (por ejemplo, hidroxiprolina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 6-N-metilisina, N-etilglicina, N-metilglicina, N-etilasparagina, alo-isoleucina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, piroglutamina, ácido aminobutírico, ornitina) y a partir de aminoácidos no naturales, a menudo preparados sintéticamente (p. ej., norleucina, norvalina y ciclohexilalanina). Preferiblemente, el término "sustitución" se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido por otro selec cionado a partir de los 20 residuos de aminoácidos convencionales de origen natural (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S y T). La variante puede obtenerse mediante diversos métodos bien conocidos en la técnica. En particular, los ejemplos de técnicas para alterar la secuencia de ADN que codifica la proteína de tipo silvestre incluyen, pero no se limitan a, la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis aleatoria y la construcción de oligonucleótidos sintéticos.

Más particularmente, la expresión "variante funcional" se refiere a un heterodímero preparado a partir de dos subuni dades diferentes: una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad con SEQ ID NO: 1 o 2, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad con SEQ ID NO: 3 o 4, conservando dicha variante la actividad anti-neovascularizante de la lebecetina.

En una realización, la variante funcional comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 1, y una segunda subuni dad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 3.

En otra realización, la variante funcional comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 2, y una segunda subuni dad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 4.

En otra realización, la variante funcional comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 2, y una segunda subuni dad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 18.

En una realización adicional, la variante funcional comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 1 o 2, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 3 o 4. En particular, la variante funcional puede com prender una primera subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 1, y una segunda subunidad que comprende, o consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 3, o puede comprender una primera subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 2, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 4. La variante funcional también puede comprender una primera subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 2 y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 18.

En otra realización, la variante funcional comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 1 o 2, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 3 o 4. En particular, la variante funcional puede comprender una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 1, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 3, o puede comprender una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 2, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 4. La variante funcional también puede comprender una primera subunidad que com prende, o que consiste en, una secuencia que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 2, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, SEQ ID NO: 18.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "identidad de secuencia" o "identidad" se refiere al número (%) de coincidencias (residuos de aminoácidos idénticos) en posiciones procedentes de un alineamiento de dos secuencias polipeptídicas. La identidad de secuencia se determina comparando las secuencias cuando se alinean para maximizar el solapamiento y la identidad, al tiempo que se minimizan los huecos de las secuencias. En particular, la identidad de secuencia se puede determinar usando cualquiera entre una variedad de algoritmos matemáticos de alineamiento global o local, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias de longitudes similares se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineamiento global (por ejemplo, algoritmo de Needleman y Wunsch; Needleman y Wunsch, 1970) que alinea las secuencias de manera óptima en toda la longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineamiento local (por ejemplo, el algoritmo de Smith y Waterman (Smith y Waterman, 1981) o el algoritmo de Altschul (Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005)). El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de los aminoá cidos se puede lograr de varias formas que están dentro de los conocimientos en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible, utilizable públicamente en sitios web de internet tales como http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ o http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr un alinea miento máximo en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los fines del presente documento, los valores del % de identidad de secuencia de los aminoácidos se refieren a valores generados utilizando el programa de alineamiento de secuencias por parejas EMBOSS Needle, que crea un alineamiento global óptimo de dos secuen cias utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch, en el que todos los parámetros de búsqueda se establecen como valores predeterminados, es decir, matriz de puntuación = BLOSUM62, hueco abierto = 10, extensión del hueco = 0,5, penalización por hueco final = falso, hueco final abierto = 10 y extensión del hueco final = 0,5

La actividad anti-neovascularizante de la proteína utilizada en la presente invención puede evaluarse mediante cual quier método conocido por el experto. Por ejemplo, esa actividad puede evaluarse tal y como se describe en los ejemplos, en particular utilizando modelos ex vivo de neovascularización, tales como explantes aórticos o coroideos (véase el ejemplo 1 a continuación).

Las variantes funcionales pueden incluir variantes naturales resultantes de un polimorfismo génico, así como variantes artificiales.

En una realización, las variantes funcionales se obtienen a partir de secuencias de aminoácidos de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 a 4) mediante la introducción de una o más mutaciones (deleciones, inserciones y/o sustitu ciones) en posiciones específicas de aminoácidos. Las mutaciones pueden introducirse en la primera subunidad, la segunda subunidad o en ambas.

En particular, las variantes funcionales pueden comprender una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene de 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2 residuos de aminoácidos delecionados, sustituidos o insertados, en comparación con la secuencia de referencia, es decir, SEQ ID NO: 1 o 2, y/o una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene de 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2 residuos de aminoácidos delecionados, sustituidos o insertados, en comparación con la secuencia de referencia, es decir, SEQ ID NO: 3 o 4. Más particularmente, las variantes funcionales pueden comprender una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene de 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2 residuos de aminoácidos delecionados, sustituidos o insertados, en comparación con SEQ ID NO: 2, y/o una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene de 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2 residuos de aminoácidos delecionados, sustituidos o insertados, en comparación con SEQ ID NO: 4.

Preferiblemente, las variantes funcionales pueden comprender una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene de 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2 residuos de aminoácidos delecionados, sustituidos o insertados, en comparación con SEQ ID NO: 2, y/o una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia que tiene de 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2 residuos de aminoácidos delecio nados, sustituidos o insertados en comparación con SEQ ID NO: 4. Más particularmente, la segunda subunidad puede comprender, o consistir en, una secuencia que tiene de 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2 residuos de aminoácidos delecionados, sustituidos o insertados, en comparación con SEQ ID NO: 18. Tal y como se describe a continuación, las modificaciones son preferiblemente sustituciones conservadoras, es decir, cuando uno o más resi duos de aminoácidos se reemplazan por un residuo biológicamente similar.

La expresión "sustitución conservadora" tal y como se usa en este documento, indica el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro, sin alterar la conformación general y la función del péptido, incluyendo, pero sin limitarse a, el reemplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares (tal como, por ejemplo, polaridad, potencial de enlaces de hidrógeno, ácido, básico, forma, hidrófobo, aromático y similares). Los aminoácidos con propiedades simi lares son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, arginina, histidina y lisina son aminoácidos hidrófilos básicos y pueden ser intercambiables. De manera similar, la isoleucina, un aminoácido hidrófobo, se puede reemplazar con leucina, metionina o valina. Los aminoácidos hidrófilos neutros, que pueden sustituirse entre sí, incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina.

Como tal, debe entenderse que en el contexto de la presente invención, una sustitución conservadora se reconoce en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. En la Tabla 1 a continuación se muestran ejemplos de sustituciones conservadoras:

Tabla 1: sustituciones conservadoras

En una realización, la variante funcional comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 1 o 2 y que comprende de 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2 sustituciones conservadoras de aminoácidos, y/o una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 3 o 4 y que comprende de 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En particular, la variante funcional puede comprender una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 2 y que comprende de 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 o 2 sustituciones conservadoras de aminoácidos, y/o una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obte nida a partir de SEQ ID NO: 4 y que comprende de 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones conservadoras de aminoácidos.

En una realización preferida, la variante funcional comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 1 y que comprende de 1 a 5, preferiblemente 1 o 2, sustituciones conservadoras de aminoácidos, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 3 y que comprende de 1 a 5, preferiblemente 1 o 2, sustituciones conservadoras de aminoáci dos.

En otra realización preferida, la variante funcional comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 2 y que comprende de 1 a 5, preferiblemente 1 o 2, sustituciones conservadoras de aminoácidos, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 4 y que comprende de 1 a 5, preferiblemente 1 o 2, sustituciones conservadoras de aminoáci dos. Más particularmente, la variante funcional comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 2 y que comprende de 1 a 5, preferiblemente 1 o 2, sustituciones conservadoras de aminoácidos, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, una secuencia obtenida a partir de SEQ ID NO: 18 y que comprende de 1 a 5, preferiblemente 1 o 2, sustituciones conservadoras de aminoá cidos.

Preferiblemente, algunos residuos importantes para la actividad de la lebecetina se conservan en la variante funcional. En particular, los residuos correspondientes a

1) residuos de cisteína implicados en puentes disulfuro intracatenarios o entre las cadenas alfa y beta, es decir, Cys27, Cys38, Cys55, Cys106, Cys129, Cys149 y Cys154 de SEQ ID NO: 1, y Cys27, Cys38, Cys55, Cys100, Cys123, Cys136 y Cys144 de SEQ ID NO: 3 (Jebali et al. 2009); y/o

2) residuos de los dominios HCY, es decir, His37, Cys38, Tyr39 de SEQ ID NO: 1 y His37, Cys38, Tyr39 de SEQ ID NO: 3 (Jebali et al. 2009); y/o

3) residuos de los dominios DAEK, es decir, Asp50, Ala51, Glu52 y Lys53 de SEQ ID NO: 1 y Asp50, Ala51, Glu52 y Lys53 de SEQ ID NO: 3 (Jebali et al. 2009); y/o

4) residuos de los motivos WIGL, es decir, de Trp94 a Leu96 de SEQ ID NO: 1 y de Trp94 a Leu96 de SEQ ID NO: 3 (Zelensky et al., 2005).

Preferiblemente, todos los residuos identificados en las subsecciones 1), 2), 3) y 4) se conservan en la variante fun cional.

El experto en la materia puede identificar fácilmente los residuos correspondientes a los residuos de lebecetina iden tificados anteriormente, basándose en cualquier método de alineamiento de rutina.

Los extremos N-terminales y/o C-terminales de la proteína usada en la presente invención descrita en el presente documento pueden protegerse opcionalmente contra una proteólisis. Por ejemplo, el extremo N-terminal puede estar en forma de un grupo acetilo y/o el extremo C-terminal puede estar en forma de un grupo amida. También se prevén modificaciones internas de la proteína para que sea resistente frente a una proteólisis, p. ej., cuando se modifica al menos un enlace peptídico -CONH- y se reemplaza con un enlace reducido (CH2NH), un enlace retro-inverso (NHCO), un enlace metilen-oxi (CH2-O), un enlace tiometileno (CH2-S), un enlace carba (CH2CH2), un enlace cetometileno (CO-CH2), un enlace hidroxietileno (CHOH-CH2), un enlace (NN), un enlace E-alceno o también un enlace -CH=CH.

Por ejemplo, la proteína puede modificarse mediante acetilación, acilación, amidación, reticulación, ciclación, forma ción de enlaces disulfuro, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristilación, oxidación, fosforilación y similares.

Las proteínas utilizadas según la invención pueden comprender o estar compuestas por aminoácido(s) en configura ción D, que hace que los péptidos sean resistentes a una proteólisis. También pueden estabilizarse mediante reticu lación intramolecular, p. ej., modificando al menos dos residuos de aminoácidos con cadenas laterales olefínicas, preferiblemente cadenas alquenilo C3-C8, preferiblemente cadenas penten-2-ilo, seguida de una reticulación química de las cadenas, de acuerdo con la tecnología denominada "grapa" descrita en Walensky et al., 2014. Por ejemplo, los aminoácidos en la posición i e i+4 a i+7 pueden ser sustituidos por aminoácidos no naturales que muestran residuos olefínicos reactivos. Todas esas proteínas modificadas químicamente resistentes a la proteólisis están incluidas en la presente invención.

La proteína utilizada en la presente invención también puede unirse covalentemente a una molécula de polietilenglicol (PEG) a través de su extremo C-terminal o un residuo de lisina, en particular un PEG de 1500 o 4000 PM, para una disminución del aclaramiento urinario y empleada en dosis terapéuticas, y para un aumento de la semivida en el plasma sanguíneo. La semivida proteica también puede aumentarse incluyendo la proteína en un material polimérico biodegradable y biocompatible para microesferas formadoras de sistemas de administración de fármacos. Los polí meros y copolímeros son, por ejemplo, poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLGA) (tal y como se ilustra en el documento US2007/0184015, Hahn SK et al.).

La lebecetina se puede aislar a partir de veneno de M. lebetina. La lebecetina o variantes funcionales o fragmentos de la misma también se pueden obtener mediante técnicas recombinantes conocidas por los expertos en la técnica. En ese caso, un ácido nucleico y/o una estructura artificial genética que comprende, o que consiste en, una secuencia de nucleótidos que codifica la primera subunidad y una secuencia de nucleótidos que codifica la segunda subunidad de la proteína, puede expresarse en una célula hospedadora y la proteína puede extraerse a partir de esas células hospedadoras o del medio de cultivo. Un ejemplo de técnica recombinante se describe en Jebali et al. 2012. Brevemente, el ADNc de cada subunidad (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 y 4) se clonó en vectores pAMoA-GD3 que comprendían la secuencia del péptido señal obtenida a partir del factor estimulante de colonias de granulocitos humanos. El ADNc que codifica la subunidad alfa y la subunidad beta puede prepararse mediante PCR usando secuencias que codifican MVLA1 (SEQ ID NO: 1) y MVLB1 (SEQ ID NO: 3), respectivamente.

La proteína usada en la presente invención también se puede sintetizar usando métodos sintéticos convencionales, conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, síntesis química o síntesis enzimática. Ejemplos de tecnologías de síntesis química, son la síntesis en fase sólida y en fase líquida.

Como síntesis en fase sólida, por ejemplo, el aminoácido correspondiente al extremo C-terminal de la proteína que se va a sintetizar se une a un soporte insoluble en disolventes orgánicos, y mediante una repetición alterna de reacciones, una en donde los aminoácidos con sus grupos amino y los grupos funcionales de la cadena lateral protegidos con grupos protectores apropiados, se condensan uno a uno en orden desde el extremo C-terminal al N-terminal, y una en donde los aminoácidos unidos a la resina o al grupo protector de los grupos amino de las proteínas, se liberan, de esta manera se prolonga la cadena de proteínas. Los métodos de síntesis en fase sólida se clasifican en gran medida por el método tBoc y el método Fmoc, según el tipo de grupo protector utilizado. Los grupos protectores usados típi camente incluyen tBoc (t-butoxicarbonilo), Cl-Z (2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z (2-bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo), Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y Clz-Bzl (2,6-diclorobencilo) para los grupos amino; NO2 (nitro) y Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo) para los grupos guanidino); y tBu (t-butilo) para los grupos hidroxilo). Des pués de la síntesis de la proteína deseada, esta se somete a una reacción de desprotección y se corta del soporte sólido. Esa reacción de corte de proteínas puede realizarse con fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometano sulfónico para el método Boc, y con TFA para el método Fmoc.

La proteína utilizada según la invención también se puede administrar en forma de al menos un ácido nucleico codifi cante. En una realización, las dos subunidades están codificadas por el mismo ácido nucleico. En otra realización, las dos subunidades están codificadas por ácidos nucleicos distintos.

Preferiblemente, el o los ácidos nucleicos codificantes están incluidos en una estructura artificial genética, es decir, un casete de expresión, que comprende además secuencias reguladoras (tales como promotores, potenciado res, terminadores, etc. adecuados) que permiten la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la proteína codificada (la proteína usada en la presente invención) en una célula hospedadora. La estructura artificial genética puede ser ADN o ARN, preferiblemente ADNc, y preferiblemente ADN de doble hebra. La estructura artificial genética puede estar en una forma adecuada para la transformación de la célula hospedadora o el organismo hospedador deseados, en una forma adecuada para una integración en el ADN genómico de la célula hospedadora deseada o en una forma adecuada para una replicación independiente, mantenimiento y/o herencia en el organismo hospedador previsto.

Por ejemplo, la estructura artificial genética puede estar en forma de un vector, como por ejemplo un plásmido, un cósmido, un YAC, un vector vírico o un transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar una expresión in vitro y/o in vivo (por ejemplo, en una célula hospedadora, un organismo hospedador y/o un sistema de expresión adecuados).

En un aspecto preferido pero no limitante, la estructura artificial genética comprende i) ácido(s) nucleico(s) que codifi can la proteína usada en la presente invención conectada funcionalmente a ii) uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado; y opcionalmente también iii) uno o más elementos adi cionales de estructuras artificiales genéticas tales como secuencias 3'-UTR o 5'-UTR, secuencias líder, marcadores de selección, marcadores de expresión/genes indicadores y/o elementos que pueden facilitar o aumentar (la eficacia de) la transformación o la integración.

En una realización preferida, el o los ácidos nucleicos que codifican la proteína utilizada en la presente invención son transportados por un vector vírico para una infección ex vivo o in vivo y una expresión de dicha proteína.

Preferiblemente, el vector es un vector vírico recombinante integrante o no integrante. Ejemplos de vectores víricos recombinantes incluyen, pero no se limitan a, vectores obtenidos a partir del virus del herpes, retrovirus, lentivirus, virus vaccinia, adenovirus, virus adenoasociados o virus del papiloma bovino.

Preferiblemente, el o los ácidos nucleicos que codifican la proteína usada en la presente invención, o la estructura artificial genética definida anteriormente, están contenidos en un vector de adenovirus, virus adenoasociado o lentivirus recombinante.

En una realización preferida, el vector es un vector de virus adenoasociado recombinante (VAA).

El parvovirus humano, virus adenoasociado (VAA) es un dependovirus naturalmente defectuoso para la replicación que es capaz de integrarse en el genoma de la célula infectada para establecer una infección latente. La última pro piedad parece ser única entre los virus de mamíferos porque la integración se produce en un sitio específico en el genoma humano, llamado AAVSI, ubicado en el cromosoma 19 (19ql3.3-qter). Por tanto, el VAA ha despertado un interés considerable como vector potencial para la terapia génica humana. Entre las propiedades favorables del virus se encuentran su falta de asociación con cualquier enfermedad humana, su capacidad para infectar células tanto en división como que no se dividen y la amplia gama de líneas celulares obtenidas a partir de diferentes tejidos que pueden infectarse.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "vector de VAA" se refiere a un vector polinucleotídico que com prende una o más secuencias heterólogas (es decir, una secuencia de ácido nucleico que no procede del VAA, por ejemplo, una secuencia que codifica la proteína usada en la presente invención) que están flanqueadas por al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de VAA, preferiblemente dos ITRs. Esos vectores de VAA se pueden replicar y empaquetar en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula hospedadora que ha sido infectada con un virus auxiliar adecuado (o que expresa funciones auxiliares adecuadas) y que expresa productos de genes rep y cap de VAA (es decir, proteínas Rep y Cap de VAA). Una secuencia de "repetición terminal invertida" o "ITR" es un término bien entendido en la técnica y se refiere a secuencias relativamente cortas que se encuentran en los extremos de los genomas víricos que tienen una orientación opuesta. Una secuencia de "repetición terminal invertida (ITR) de VAA" es una secuencia de aproximadamente 145 nucleótidos que está presente en ambos extremos del genoma de un VAA monocatenario natural. Los 125 nucleótidos más externos de la ITR pueden estar presentes en cualquiera entre dos orientaciones alternativas, lo que conduce a una heterogeneidad entre diferentes genomas de VAA y entre los dos extremos de un solo genoma de VAA. Los 125 nucleótidos más externos también contienen varias regiones más cortas de autocomplementariedad (denominadas regiones A, A', B, B', C, C y D), lo que permite que se produzca un emparejamiento de bases intracatenario dentro de esa porción de la ITR. Las ITRs de VAA pueden tener una secuencia de nucleótidos de tipo silvestre o pueden estar alteradas mediante inserción, deleción o sustitución. El serotipo de las repeticiones terminales invertidas (ITRs) del vector de VAA puede seleccionarse a partir de cualquier serotipo conocido de VAA humano o no humano.

El vector vírico se puede empaquetar en una cápside vírica para generar una "partícula vírica". En particular, el vector puede ser un vector de VAA empaquetado en una cápside obtenida a partir de VAA para generar una "partícula vírica adenoasociada" o "partícula de VAA" compuesta por al menos una proteína de la cápside de VAA y un genoma del vector de VAA encapsulado.

El serotipo de la cápside determina el rango de tropismo de la partícula de VAA. Se han identificado varios serotipos de virus adenoasociados (VAA), que incluyen 12 serotipos humanos y más de 100 serotipos de primates no humanos (Howarth al., 2010, Cell Biol Toxicol 26: 1-10). Entre esos serotipos, el serotipo 2 humano fue el primer VAA desarro llado como vector de transferencia de genes. Otros serotipos de VAA utilizados actualmente incluyen, entre otros, VAA1, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAArh8, VAA9, VAA10, VAArh10, VAA11, VAA12, VAArh74 y VAAdj, etc.

En una realización particular, el vector de VAA comprende una cápside obtenida a partir de un VAA seleccionado a partir del grupo que consiste en VAA2, VAA9, VAA9-2YF, VAA5, VAA2-7m8 (Dalkara D et al. Gene Ther. Febrero de 2012; 19(2): 176-81; Dalkara D et al. Sci Transl Mes. 12 de junio de 2013; 5(189): 189ra76) o una cápside de VAA8.

Además, variantes modificadas genéticamente no naturales y VAA quimérico también pueden ser útiles. En particular, las proteínas de la cápside pueden ser variantes que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos para mejorar la eficacia de la transducción, minimizar la inmunogenicidad, ajustar la estabilidad y el tiempo de vida de las partículas, para una degradación eficaz y/o para una entrega precisa en el núcleo. Las cápsides de VAA mutadas se pueden obtener a partir de modificaciones de una cápside, insertadas mediante PCR propensa a errores y/o una inserción de péptidos o mediante la inclusión de una o varias sustituciones de aminoácidos. En particular, se pueden realizar mutaciones en uno cualquiera o más de los residuos de tirosina de las proteínas naturales de la cápside o de las no naturales (por ejemplo, VP1, VP2 o VP3). Preferiblemente, los residuos mutados son residuos de tirosina ex puestos en la superficie. Las mutaciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de tirosina a fenilalanina tales como Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F e Y720F.

Alternativamente al uso de serotipos naturales de VAA, también se pueden usar serotipos artificiales de VAA que incluyen, sin limitación, VAA con una proteína de la cápside de origen no natural. Una cápside artificial de ese tipo se puede generar mediante cualquier técnica adecuada, usando una secuencia de VAA seleccionada (por ejemplo, un fragmento de una proteína de la cápside de VPI) en combinación con secuencias heterólogas que pueden obtenerse a partir de un serotipo de VAA seleccionado diferente, porciones no contiguas del mismo serotipo de VAA, de una fuente vírica que no es VAA o de una fuente no vírica. Un serotipo de VAA artificial puede ser, sin limitación, una cápside de VAA quimérica o una cápside de VAA mutada. Una cápside quimérica comprende proteínas de la cápside VP obtenidas a partir de al menos dos serotipos de VAA diferentes o comprende al menos una proteína de VP quimé rica que combina regiones o dominios de la proteína VP, obtenidos a partir de al menos dos serotipos de VAA. Una partícula de VAA puede comprender proteínas víricas y ácidos nucleicos víricos del mismo serotipo o de un serotipo mixto (es decir, VAA pseudotipado). Por ejemplo, el vector de VAA recombinante puede ser un sistema de entrega de genes recombinantes híbrido de serotipo 2/1 de VAA que comprende el genoma de VAA2 y las proteínas de la cápside de VAA1. Los expertos en la técnica están familiarizados con esos vectores y los métodos para su construcción y uso, véase por ejemplo, el documento WO 01/83692. El vector de VAA para uso en la presente invención puede ser elegido fácilmente por un experto en la materia.

La presente invención se refiere a una proteína seleccionada a partir de lebecetina, y variantes funcionales y fragmen tos de la misma, así como ácidos nucleicos, vectores o partículas víricas, como se han descrito anteriormente y que codifican dicha proteína, para uso en el tratamiento de una enfermedad neovascular, tal y como se define en las reivindicaciones.

Tal y como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" o "tratando" se refieren a cualquier acto destinado a mejorar el estado de salud de los pacientes, como terapia, prevención, profilaxis y retraso de la enfermedad. En determinadas realizaciones, esos términos se refieren a la mejora o la erradicación de una enferme dad o síntomas asociados con una enfermedad. En otras realizaciones, esos términos se refieren a minimizar la pro pagación o el empeoramiento de una enfermedad como resultado de la administración de uno o más agentes tera péuticos a un sujeto con esa enfermedad.

Tal y como se usa en este documento, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a un animal, preferiblemente a un mamífero, incluso más preferiblemente a un ser humano, incluyendo adultos, niños y seres humanos en la etapa prenatal.

En particular, la expresión "tratamiento de una enfermedad neovascular" puede referirse a la prevención o disminución de una neoangiogénesis patológica y excesiva, es decir, una neovascularización patológica.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "enfermedad neovascular" se refiere a cualquier enfermedad con un componente neovascular, es decir, que implica una neovascularización (neoangiogénesis patológica). Ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neovasculares oculares, cánceres y trastornos infla matorios con un componente neovascular.

La enfermedad neovascular en este documento es una enfermedad neovascular ocular (es decir, una enfermedad ocular con un componente neovascular), preferiblemente seleccionada a partir del grupo que consiste en degeneración macular relacionada con la edad, retinopatías diabéticas tales como isquemia retiniana diabética o retinopatía diabé tica proliferativa, neovascularización del iris, neovascularización intraocular, neovascularización corneal, neovascularización retiniana, neovascularización coroidea, inflamación corneal (en particular debida a queratitis, herpes ocular o herpes zoster).

En un aspecto adicional, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína (es decir, lebecetina, o una variante funcional o fragmento de la misma), o un ácido nucleico, un vector o una partícula vírica, tal y como se ha descrito anteriormente y que codifica dicha proteína, y un excipiente farmacéuti camente aceptable, para uso en el tratamiento de una enfermedad neovascular, tal y como se define en las reivindi caciones.

También se describe en este documento el uso de una proteína (es decir, lebecetina, o una variante funcional o fragmento de la misma), o un ácido nucleico, un vector o una partícula vírica tal y como se ha descrito anteriormente y que codifica dicha proteína, o una composición farmacéutica de la invención, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neovascular.

Todas las realizaciones descritas anteriormente también se contemplan en este aspecto.

En una realización, la composición farmacéutica usada según la invención comprende lebecetina o una variante fun cional o fragmento de la misma, tal y como se define en las reivindicaciones, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, la composición farmacéutica usada según la invención comprende un ácido nucleico, un vector o una partícula vírica que codifica lebecetina o una variante funcional o un fragmento de la misma, tal y como se ha descrito anteriormente, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

El excipiente farmacéuticamente aceptable se selecciona de acuerdo con la vía de administración y la naturaleza del ingrediente activo, p. ej., una proteína, un ácido nucleico o una partícula vírica. Tal y como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora o una farmacopea reco nocida como la Farmacopea Europea, para uso en animales y/o seres humanos. El término "excipiente" se refiere a un diluyente, adyuvante, soporte o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Como es bien conocido en la técnica, los excipientes farmacéuticamente aceptables son sustancias relativamente inertes que facilitan la admi nistración de una sustancia farmacológicamente eficaz y se pueden suministrar como soluciones o suspensiones lí quidas, como emulsiones o como formas sólidas adecuadas para una disolución o suspensión en un líquido antes del uso. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolalidad, agentes encapsulantes, sustancias tamponadoras del pH y tampones. Esos excipientes incluyen cual quier agente farmacéutico adecuado para una administración directa en el ojo que se pueda administrar sin una toxi cidad indebida.

Las posibles composiciones farmacéuticas incluyen las adecuadas para una administración oral, rectal, tópica (inclu yendo transdérmica, bucal, sublingual, instilación ocular), intraocular (incluyendo intravítrea, intracameral, subretiniana, supracoroidea, periocular, subconjuntival) o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intraespinal, in travenosa e intradérmica). Para esas formulaciones, se puede usar un excipiente convencional de acuerdo con méto dos bien conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, la composición farmacéutica es adecuada para una administración parenteral u ocular. Más preferiblemente, la composición farmacéutica es adecuada para una ad ministración ocular, incluyendo la instilación ocular tópica y la administración intraocular.

Las composiciones para una administración parenteral son generalmente soluciones o suspensiones estériles fisioló gicamente compatibles que pueden prepararse opcionalmente inmediatamente antes del uso a partir de una forma sólida o liofilizada. Se pueden disolver en el vehículo adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes tamponadores y se puede incluir un tensioactivo o un agente humectante en la composición para facilitar la distribución uniforme del ingrediente activo.

Para una administración ocular, la composición se puede formular con una o más soluciones acuosas o no acuosas, isotónicas, estériles, farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina equilibrada (BSS)), dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes del uso, que pueden contener agentes antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos, solutos o agentes de suspensión o espesantes.

Para una administración oral, la composición se puede formular en formas de dosificación oral convencionales, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos y preparaciones líquidas tales como jarabes, elixires y gotas concen tradas. Pueden usarse vehículos o diluyentes sólidos no tóxicos que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, magnesio, car bonato y similares. Para los comprimidos también son necesarios aglutinantes, que son agentes que imparten cuali dades cohesivas a los materiales en polvo. Por ejemplo, se pueden utilizar como aglutinantes almidón, gelatina, azúcares como lactosa o dextrosa y gomas naturales o sintéticas. Los agentes desintegrantes también son necesarios en los comprimidos para facilitar su fragmentación. Los agentes desintegrantes incluyen almidones, arcillas, celulosas, alginas, gomas y polímeros reticulados. Además, los comprimidos también incluyen agentes lubricantes y deslizantes para evitar la adhesión del material del comprimido a las superficies en el proceso de fabricación y para mejorar las características de flujo del material en polvo durante la fabricación. El dióxido de silicio coloidal se usa más común mente como agente deslizante y compuestos como el talco o los ácidos esteáricos se usan más comúnmente como agentes lubricantes.

Para una administración transdérmica, la composición se puede formular en forma de ungüento, crema o gel y se pueden usar agentes penetrantes o detergentes apropiados para facilitar la permeación, tales como dimetilsulfóxido, dimetilacetamida y dimetilformamida.

Para la administración transmucosa, se pueden usar aerosoles nasales, supositorios rectales o vaginales. El com puesto activo se puede incorporar en cualquiera de las bases de supositorio conocidas, mediante métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de tales bases incluyen manteca de cacao, polietilenglicoles (Carbowax), monoestearato de polietilensorbitán y mezclas de estos con otros materiales compatibles para modificar el punto de fusión o la tasa de disolución.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden formularse para liberar el fármaco activo sus tancialmente justo después de la administración o en cualquier momento o período de tiempo predeterminado después de la administración.

La composición farmacéutica puede comprender varias proteínas utilizadas según la presente invención (es decir, seleccionadas a partir de lebecetina y variantes funcionales o fragmentos de las mismas) y/o ácidos nucleicos, vecto res o partículas víricas como se han descrito anteriormente y que codifican dichas proteínas.

La composición farmacéutica también puede comprender al menos otro compuesto activo, en particular seleccionado entre los inhibidores de la angiogénesis.

Ejemplos de inhibidores de la angiogénesis incluyen, pero no se limitan a, agentes anti-VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) tales como anticuerpos dirigidos a VEGF o al receptor de VEGF (p. ej., bevacizumab, ranibizumab, DC101), moléculas pequeñas que se unen e inhiben los receptores de VEGF (p. ej., SU6668, TSU68, aflibercept), inhibidores de la tirosina cinasa (p. ej., axitinib, sunitnib, sorafenib y pazopanib), inhibidores de PI3K (p. ej., PI-103), inhibidores de EGFR (p. ej., gefitinib, erlotinib), inhibidores de Ras (FTIs), inhibidores de AKT (p. ej., nelfinavir), anti cuerpos anti-SFRP2, angiostatina, endostatina y metastatina. Preferiblemente, el inhibidor de la angiogénesis es un inhibidor de la vía de VEGF, en particular aflibercept.

En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende al menos otro compuesto activo que es un inhibidor de la angiogénesis, preferiblemente un inhibidor de la vía de VEGF, más preferiblemente aflibercept. En particular, la composición farmacéutica puede comprender una proteína que comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, y un inhibidor de la angiogénesis, preferiblemente un inhibidor de la vía de VEGF, más preferiblemente aflibercept. Más particularmente, la composición farmacéutica puede comprender una proteína que comprende una primera subunidad que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y un inhibidor de la angiogénesis, preferiblemente un inhibidor de la vía de VEGF, más preferiblemente aflibercept.

La cantidad de composición farmacéutica de la invención que se va a administrar debe determinarse mediante un procedimiento estándar bien conocido por los expertos en la técnica.

Los datos fisiológicos del paciente (p. ej., edad, tamaño y peso), las vías de administración y la enfermedad que se va a tratar, deben tenerse en cuenta para determinar la dosis adecuada. La dosificación apropiada de la composición farmacéutica de la invención también puede variar si se usa sola o en combinación.

La composición farmacéutica se puede administrar como una dosis única o en dosis múltiples, preferiblemente una dosis única.

En una realización particular, la composición farmacéutica está destinada a ser utilizada en el tratamiento de la enfer medad ocular y cada dosificación unitaria puede contener, por ejemplo, de 0,1 a 12 mg por ojo, preferiblemente de 1 a 5 mg por ojo.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede usarse sola o en combinación con otra terapia, en particular con un inhibidor de la angiogénesis, más preferiblemente un inhibidor de la vía de VEGF, incluso más pre feriblemente aflibercept.

En una realización particular, la composición farmacéutica se usa para tratar a un sujeto que no responde o se vuelve resistente a una terapia con un inhibidor de la angiogénesis, preferiblemente un inhibidor de la vía de VEGF, más preferiblemente aflibercept.

La presente descripción se refiere además a un método para tratar una enfermedad neovascular, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención a un sujeto que lo necesite.

Todas las realizaciones descritas anteriormente también se contemplan en esta descripción particular.

Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad de la composición farmacéutica administrada a un sujeto que es suficiente para prevenir o inhibir la formación de nuevos vasos sanguíneos, es decir, para prevenir o inhibir una neoangiogénesis, y en particular una neoangiogénesis patológica, y/o para permitir una regresión de la neovascularización.

En una realización preferida, el sujeto que lo necesita es un sujeto que no responde o que se vuelve resistente a una terapia con un inhibidor de la angiogénesis, preferiblemente un inhibidor de la vía de VEGF, más preferiblemente aflibercept.

También se describe en el presente documento lebecetina, una variante funcional o un fragmento de la misma, un ácido nucleico, un vector o una partícula vírica particular que codifica lebecetina o una variante funcional o un frag mento de la misma, o una composición farmacéutica de la invención, para uso como inhibidor de la neovascularización.

La presente descripción también se refiere a lebecetina, a una variante funcional o un fragmento de la misma, un ácido nucleico, un vector o una partícula vírica particular que codifica lebecetina o una variante funcional o un fragmento de la misma, o una composición farmacéutica de la invención, para uso para prevenir, inhibir o revertir una neovascularización en un sujeto que lo necesita.

Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no a modo de limitación.

Ejemplos

Materiales y métodos

Animales

Se adquirieron ratones machos C57BL/6JRj de tres y once semanas de edad y crías de rata Lewis de 4 días de edad en Janvier Labs (Le Genest-Saint-Isle, Francia). Se obtuvieron ratones machos CX3CR1+/GFP de once semanas de edad a partir del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, EE.UU.). Los animales se alojaron en la instalación para animales en condiciones específicas, exentas de agentes patógenos, en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h con agua y ali mentos de una dieta normal, disponibles a voluntad.

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de animales utilizados con fines científicos y aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, Comité d'éthique pour l'expérimentation animale Charles Darwin (N ° 02371.02).

Brote vascular a partir del anillo aórtico ex vivo

Después de decapitar las crías de rata Lewis, se cortaron las aortas torácicas en anillos de 1 mm de espesor y se cubrieron con 15 pl de matrigel exento de rojo fenol, reducido con factor de crecimiento (Corning, Boulogne Billancourt, Francia) en placas de cultivo tisular de 48 pocillos. Los anillos aórticos se cultivaron durante 3 días en medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) (Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, Francia) complementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% y fungizona al 0,2% (Lavalette, S. et al.2011). Los explantes fueron expuestos a LCT aislada a partir de veneno de M. lebetina con diferentes dosis (30 nM, 300 nM, 1,5 pM) desde el día 3 (D3) al D6 de cultivo. Los explantes de control se cultivaron en DMEM sin adición de LCT. Se tomaron fotografías de explantes individuales desde el D3 hasta el D6. La superficie de cada anillo aórtico individual y los brotes de la preincubación el D3 se restaron de la superficie el D6 para calcular el brote vascular que se producía en presencia o ausencia de LCT. Las áreas de brotes se cuantificaron con el programa informático Fiji (Schindelin, J. et al. 2012). Los datos se expresan como el porcentaje de crecimiento entre el D6 y el D3.

Brote vascular desde la coroides ex vivo

Se enuclearon ojos de ratones C57BL/6JRj y se mantuvieron en medio de crecimiento de endotelio helado (EGM-2) (Lonza, Levallois-Perret, Francia) antes de la disección. La coroides se separó de los otros tejidos oculares y se cortó aproximadamente en fragmentos de 1 mm x 1 mm. Los fragmentos de coroides se aislaron y se colocaron en matrigel exento de rojo fenol, reducido con factor de crecimiento (Corning, Boulogne Billancourt, Francia) y se sembraron en placas de 48 pocillos.

A continuación, los explantes coroideos se cultivaron durante 3 días en medio EGM-2 complementado con suero bovino fetal al 5%, penicilina/estreptomicina al 1% y fungizona al 0,2% en una incubadora de cultivo celular a 37°C (Shao, Z. et al. 2013). El D3, los fragmentos de coroides se trataron con LCT (1,5 nM, 5 pM, 15 pM) aislada a partir de veneno de M. lebetina o LCT recombinante (1,5 pM, 5 pM, 10 pM) desde el D3 hasta el D6 de cultivo. Se tomaron fotos de explantes individuales y se cuantificaron las áreas de brotes con el programa informático Fiji (Schindelin, J. et al. 2012). La superficie de cada explante coroideo individual y los brotes de la preincubación el d 3 se restaron de la superficie el D6 para calcular el brote vascular que se había producido en presencia o ausencia de LCT.

SD-OCT

Las pupilas se dilataron con tropicamida (Mydriaticum) (Théa, Clermont-Ferrand, Francia) y fenilefrina (neosinefrina) (Europhta, Mónaco). A continuación, los ratones se anestesiaron mediante inhalación de isoflurano (2%) (Axience, Pantin, Francia) y se colocaron frente al dispositivo de formación de imágenes de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT, por sus siglas en inglés) (Bioptigen 840 nm HHP; Bioptigen, Carolina del Norte, EE.UU.). Las imágenes se adquirieron desde el disco óptico a aproximadamente 0,1 o 1,4 mm de la retina superior. Se calibró la SD-OCT (1 píxel = 1,6 pm) como se ha descrito anteriormente (Dominguez, E. et al. 2015). Los espesores de la capa retiniana, la capa nuclear interna (INL), la capa nuclear externa (ONL) y los segmentos externos del fotorreceptor (OS) se midieron a 500 pm del centro del nervio óptico, el día 7 mediante el programa informático FIJI (Schindelin, J. et al. 2012).

Electrorretinografía (ERG)

Se realizó una ERG 7 días después de la inyección de PBS y LCT aislada a partir de veneno de M. lebetina (500 pM). Los ratones C57BL/6JRj se dejaron durante la noche para adaptarlos a la oscuridad y luego se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg, Virbac, Carros, Francia) y xilacina (10 mg/kg, Bayer HealthCare, Berlín, Alemania). Las pupilas se dilataron con fenilefrina (neosinefrina) (Europhta, Mónaco) y tropicamida (Mydriaticum) (Théa, Clermont-Ferrand, Francia). La córnea se anestesió con clorhidrato de oxibuprocaína (Théa, Clermont-Ferrand, Francia). La temperatura corporal se mantuvo a 37°C usando una almohadilla térmica. Se retrajeron los párpados superior e inferior para mantener los ojos abiertos y abultados. Se colocó un electrodo de asa de oro en contacto con la superficie de cada córnea y se sostuvo con lubricante (Zubial, Auros, Francia) para registrar la ERG (Espion, Diagnosys LLC, Lowell, MA, EE.UU.). Se colocaron electrodos de referencia y de tierra, respectivamente, en la frente y en la espalda del animal. El estímulo de luz fue proporcionado por un estimulador Ganzfeld (Espion, Diagnosys LLC, Lowell, MA, EE.UU.). Las respuestas se amplificaron y se filtraron (filtros de corte bajo de 1 Hz y alto de 300 Hz) con un amplificador de CC/CA de 1 canal. Se utilizaron cinco niveles de intensidad de estímulo (0,003 cd.s/m2; 0,03 cd.s/m2; 0,3 cd.s/m2; 3 cd.s/m2; 10 cd.s/m2) para registrar la ERG escotópica. Cada respuesta de ERG escotópica representa el promedio de cinco respuestas de un conjunto de cinco destellos de estimulación.

Para evaluar las respuestas de los conos, los ratones se expusieron durante 5 minutos a la luz con 20 cd/m2 para saturar los fotorreceptores de los bastones. Se empleó un nivel de 10 cd.s/m2 de intensidad del estímulo para las ERGs adaptadas a la luz. Las ERGs adaptadas a la luz se registraron sobre el mismo fondo blanco supresor de bastones que para la adaptación a la luz. Cada respuesta de ERG fotópica de los conos representa el promedio de diez respuestas de un conjunto de diez destellos consecutivos. La ERG de parpadeo también se utilizó para aislar las respuestas de los conos con frecuencias de destello de 10 y 20 Hz con una intensidad de 1 cd.s/m2.

Modelo de neovascularización coroidea inducida por láser (NVC)

Se anestesiaron ratones C57BL/6JRj con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg, Virbac, Carros, Fran cia) y xilacina (10 mg/kg, Bayer HealthCare, Berlín, Alemania). Se dilataron las pupilas y se realizaron 4 coagulaciones con láser (400 mW, 50 ms, tamaño de punto de 100 pm) con un Laser Yag 532 Eyelite (Alcon, Rueil-Malmaison, Francia) montado sobre una lámpara de hendidura (BQ 900, Hagg-Streitt, Chambery, Francia). La fotocoagulación con láser y la ruptura de la membrana de Bruch se confirmaron mediante la observación inmediata de una burbuja (Lavalette, S. et al. 2011, Berger, A. et al. 2014). A los ratones se les inyectó 1 pl de PBS, LCT aislada a partir de veneno de M. lebetina (500 pM), LCT recombinante (500 pM) o Aflibercept (25 pM), inmediatamente o 3 días después del láser.

Las retinas de los ratones se examinaron 7 días después de la lesión, con SD-OCT. Las secuencias de OCT se adquirieron y analizaron con Fiji (Schindelin, J. et al. 2012). El volumen de la lesión se calculó con la fórmula (4/3n*a*b2)/2, en donde a es el radio polar que corresponde a la medición a lo largo del eje vertical y b es el radio del ecuador que corresponde al eje horizontal (Berger, A. et al. 2014).

El D7, los ratones se sacrificaron mediante inhalación de CO2 y las áreas de NVC se cuantificaron sobre preparaciones planas coroideas inmunoteñidas con el programa informático MetaMorph (Molecular Devices, Saint-Gregoire, Francia).

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno (RIO)

Crías de ratones C57BL/6JRj con madres lactantes fueron expuestas a 75% de oxígeno el día postnatal (P) 7, durante 5 días consecutivos como se ha descrito anteriormente (Connor, K. M. et al.2009). El P12, los ratones fueron devueltos al aire ambiente y se les inyectó por vía intravítrea PBS, LCT aislada a partir de veneno de M. lebetina (500 pM) o LCT recombinante (500 pM) o Aflibercept (25 pM). El P17, los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de CO2 y las retinas se diseccionaron. Las áreas de vaso-obliteración (VO) y neovascularización (NV) se calcularon en las reti nas inmunoteñidas sobre una preparación plana con el programa informático MetaMorph (Molecular Devices, Saint-Gregoire, Francia).

RT-qPCR

La expresión génica de las subunidades de integrina av, a5, p3 y p5 se cuantificó mediante una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) en el modelo de NVC, los días 0, 1,3 y 7 después de la lesión con láser. Las coroides se diseccionaron en condiciones exentas de ARNasa. El ARN total se aisló con Nucleospin RNAII (Macherey Nagel, Hoerdt, Francia). Se sintetizó ADNc monocatenario a partir del ARN total (tratado previamente con ADNasal, grado de amplificación, Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, Francia) utilizando oligo-dT como cebador y transcriptasa inversa SuperscriptlI (Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, Francia). La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real se realizó utilizando ADNc y la mezcla SYBR Green Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, Francia) y los siguientes cebadores (0,5 pmol/pl) (Life Technologies, Saint-Aubin, Francia) : GAPDH sentido: 5'-ACG GCC g CA TCT TCT TGT GCA-3’ (SEq ID NO: 5); GAPDH antisentido: 5'-CAG GCG CCC AAT ACG GCC AA-3’ (SEQ ID NO: 6); ITGAV sentido: 5'-CAC CCT CAG AGA GGG AGA TG-3’ (SEQ ID NO: 7); ITGAV antisentido: 5'-ACG TAC AGG ATT GCG CTC TT-3’ (SEQ ID NO: 8); ITGA5 sentido: 5'-AGT ACG CAC CTT GCC GCT CA-3’ (SEQ ID NO: 9); ITGA5 antisentido: 5'-ACA CGG CCA GTC TTG GTG AAC-3’ (SEQ ID NO: 10); ITGB3 sentido: 5'-AAC CGG GGA ACG CTC CAT GA-3’ (SEQ ID NO: 11); ITGB3 antisentido: 5'-CGG CGT TTT TGC CAG TAT CCG-3’ (SEQ ID NO: 12); ITGB5 sentido: 5'-AGC CTT TGG GGA GAC GTG TGA-3’ (SEQ ID NO: 13); ITGB5 antisentido: 5'-TGG TGG TGG CAG GTC TGG TT-3’ (SEQ ID NO: 14).

Las reacciones de PCR se realizaron en 45 ciclos de 15 s a 95°C, 45 s a 60°C. Los datos se normalizaron para GAPDH y se expresaron en relación con los valores del grupo de control.

Reactivos y fármacos

La LCT se obtuvo como se ha descrito anteriormente (Sarray, S. et al. 2003). Brevemente, el veneno de M. lebetina se filtró en gel usando una columna Sephadex G-75. En primer lugar, la LCT se purificó mediante FPLC en una columna Mono S (HR5/5) y eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-1 M. La LCT se liofilizó y luego se disolvió en PBS. La calidad de la preparación de LCT se sometió a ensayo en una columna de HPLC de fase inversa C8 con gradiente lineal de acetonitrilo (Sarray, S. et al. 2003). Aflibercept (Eylea; Bayer, Lyon, Francia) fue amablemente proporcionado por la Dra. Chiara Eandi (Universidad de Torino) y la Dra. Audrey Giocanti-Aurégan (Hopital Avicenne Paris). Para los estudios in vivo, se inyectó 1 pl de la siguiente solución en el cuerpo vitreo: LCT 500 pM (15 pg/pl) o Aflibercept 25 pM (2,5 pg/pl). En algunos experimentos, se inyectaron 2 pl de PBS o de LCT marcada, Aflibercept marcado o BSA marcada en el ojo derecho.

Producción de LCT recombinante

Se han clonado dos secuencias de ácido nucleico que codifican las subunidades de LCT alfa (SEQ ID NO: 15) y beta (SEQ ID NO: 16) (incluyendo la señal peptídica m Ac PGFLWALVISTCLEFSMA (SEQ ID No: 17)) en dos plásmidos pCDNA3.1 (+). Las secuencias maduras de las subunidades alfa y beta de LCT son SEQ ID NO: 2 y 18, respectiva mente. La secuencia de LCT beta comprende el marcador 6-histidina en el dominio C-terminal. Se cotransfectaron células HEK expi293 con las dos estructuras artificiales. Los materiales sobrenadantes se recogieron cuatro días des pués mediante centrifugación durante 15 min a 500 g, 4°C, seguida de una segunda centrifugación 30 min a 15900 g, 4°C y una filtración a través de 0,22 pm antes del almacenamiento a -20°C. Los materiales sobrenadantes se purifica ron a temperatura ambiente y en condiciones exentas de endotoxinas. Los materiales sobrenadantes se descongela ron y se concentraron hasta 300 mL y se dialfiltraron a través de casetes de filtración de flujo tangencial (TFF) de 5 kDa-0,1 m2 (Centramate serie T, PALL) con tampón fosfato (NaPO420mM; NaCl 300 mM; pH 7,2). Se añadió imidazol 10 mM y las proteínas marcadas con histidina se purificaron en una columna Hitrap IMAC de sefarosa FF de 5 ml (GE Healthcare Life Sciences). Las etapas de equilibrado previo y de lavado se realizaron con tampón NaPO420 mM; pH 7,2; NaCl 300 mM, imidazol 10 mM. Una etapa con imidazol 40 mM permitía la eliminación de la mayoría de los contaminantes (otras proteínas celulares). La elución se realizó con un gradiente de imidazol de 80 a 500 mM. La concentración óptima de imidazol para eluir la LCT es 165 mM. Las fracciones eluidas se combinaron, luego se con centraron y se diafiltraron en Vivaspin® 3 kDa (GE healthcare Life Sciences) para eliminar el imidazol. Las proteínas se resuspendieron con tampón TBS (T ris-HCl 20 mM; NaCl 150 mM; pH 7,5) y se filtraron a través de una membrana de 0,22 pm.

Marcado de proteínas con Alexa Fluor® 647

Se utilizó el kit para marcar proteínas a microescala Alexa Fluor® 647 (Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, Francia) para marcar la LCT (500 pM), Aflibercept (25 pM) y la albúmina de suero bovino (BSA, 15,4 pM). Las proteínas se disolvieron en bicarbonato de sodio 1 M y se mezclaron con éster succinimidílico de Alexa Fluor 647 que reacciona con aminas primarias de proteínas y se incubaron durante 1 hora a 4°C. La proteína conjugada se separó del colorante sin reaccionar usando la columna de centrifugado proporcionada a temperatura ambiente. La concentración final se estimó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante a % de la concentración inicial.

Análisis histológico

Siete días después de la NVC y la inyección de PBS o 647-LCT, se inyectó intraperitonealmente una mezcla de 300 pL de ketamina (100 mg/kg, Virbac, Carros, Francia) y xilacina (10 mg/kg, Bayer HealthCare, Berlín, Alemania) a animales anestesiados en profundidad. Los ratones se perfundieron a través de la aorta ascendente 5 ml de solución de NaCl al 0,9% seguida de 30 ml de solución de paraformaldehído al 4%. Después de la fijación, se diseccionó cuidadosamente el cerebro y se fijó posteriormente 48 h en el mismo fijador. Se realizaron secciones flotantes libres (40 pm) usando un vibratomo (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).

Inmunoquímica

Los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de CO2. Los ojos se enuclearon y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente. Después de varios lavados en PBS, se retiraron la córnea y el cristalino y la retina se separó cuidadosamente de EPR/coroides/esclerótica.

Las preparaciones planas de la retina se tiñeron con anticuerpo policlonal de cabra anti-colágeno IV (AbD Serotec, Cergy Pontoise, Francia) y se combinaron con lectina de Bandeirae simplicifolia (BS)-1 (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia). Los astrocitos y las células de Muller activadas se marcaron usando anticuerpo anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) y las células microgliales se tiñeron usando anti cuerpo policlonal de conejo anti-Iba1 (Wako, Neuss, Alemania). El EPR se tiñó usando faloidina acoplada con TRITC (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) sobre preparaciones planas coroideas. Los núcleos se tiñeron con DAPI (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia). En el modelo de NVC, los neovasos se inmunotiñeron con CD102 (de rata anti-ratón, BD Biosciences Pharmingen, Le Pont de Claix, Francia), las células microgliales se marcaron con anti-Iba1 y los núcleos de las células endoteliales se tiñeron con DAPI en preparaciones planas coroideas. Las secciones de cerebro se colocaron en una solución de bloqueo que contenía suero de cabra normal al 3% y Triton X-100 al 0,1% durante 1 h, luego se incubaron con anti-ATF3 de conejo (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Ale mania) y lectina de Bandeirae simplicifolia (BS)-1 acoplada con TRITC, a 4° durante 48 h y se tiñeron con DAPI. En el modelo de RIO, los capilares retinianos se marcaron con FITC-lectina BS-1. Se utilizaron los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con Alexa (Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, Francia) para revelar los anticuerpos primarios.

Se observaron secciones de retina, coroides y cerebro con un microscopio de fluorescencia (DM5500B) (Leica, Saint Jorioz, Francia) o con un microscopio confocal (FV1000) (Olympus, Rungis, Francia). El microscopio se calibró para ratones de control (PBS) antes de las adquisiciones de ratones a los que se había inyectado LCT.

Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, EE.UU.) para el análisis de datos y la representación gráfica. Todos los valores se expresan como media ± SEM. Los datos se analizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney, ANOVA unidireccional seguida de las pruebas posteriores de Bonferroni o Dunnett. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Ejemplo 1: LCT inhibe el brote vascular desde explantes aórticos y coroideos

La LCT inhibe la proliferación de células endoteliales y la tubulogénesis in vitro (Pilorget, A. et al. 2007). Para someter a ensayo si la LCT inhibe la neovascularización ex vivo, cultivamos anillos aórticos de ratón en matrigel (Lavalette, S. et al. 2011). Los anillos aórticos se cultivaron durante 3 días para permitir el brote de los vasos y luego se trataron con dosis crecientes de LCT. Tres días después de la adición de LCT, el área de los brotes de los vasos se cuantificó y se expresó como el aumento (en porcentaje) del área de brotes entre el D3 y el D6 (Fig. 1A y B). En condiciones de control, el brote vascular aumentaba en un 259% entre el D3 y el D6. La LCT añadida hasta una concentración final de 30 nM no afectaba al brote vascular, mientras que 300 nM de LCT reducían el brote vascular entre el D3 y el D6 al 85%. La LCT con una dosis de 1,5 pM inhibía totalmente el brote y daba como resultado la regresión de los brotes vasculares existentes antes del D3 (Fig. 1B). Las dosis crecientes de LCT no afectaban notablemente a los fibroblastos que crecían fuera del explante y proliferaban sobre la superficie celular de la placa de plástico. A continuación, se sometió a ensayo la actividad de LCT en el modelo de explante coroideo de ratón que reproduce fielmente la formación de vasos desde el lecho coriocapilar (Shao, Z. et al. 2013). Las coroides se cultivaron como explantes como se ha descrito anteriormente (Shao, Z. et al. 2013). En cuanto a los anillos aórticos, los explantes se trataron el D3 con LCT y se analizaron el D6 (Fig. 1C y D). Primero usamos la dosis que daba lugar a una regresión vascular en los anillos aórticos. Con 1,5 pM, la LCT inhibía el brote de vasos en un 78%, en comparación con las condiciones de control, pero aún permitía un incremento del 286% de los vasos, en comparación con el D3. Con 5 pM, la LCT inhibía eficaz mente el crecimiento de los vasos, pero fallaba en la regresión de los brotes vasculares existentes antes del D3. Finalmente, con 15 pM, la LCT inducía una regresión de los brotes el D3 (Fig. 1D). La LCT era, por tanto, eficaz para reducir el brote vascular en dos modelos ex vivo de neovascularización.

Ejemplo 2: una inyección intravítrea de LCT no altera la integridad de la retina

Los experimentos ex vivo demostraron una variabilidad en la dosis requerida para inhibir la neovascularización. Por tanto, realizamos un estudio piloto para determinar la concentración necesaria para reducir la neovascularización en el modelo de neovascularización coroidea inducida por láser (NVC). Se utilizó un gl de LCT para inyección intravítrea, ya que el volumen vitreo es de 5,3 gl (Remtulla, S. et al. 1985), la concentración inicial de LCT se pudo estimar en 1/5 de su concentración inicial. Dependiendo de su farmacocinética, la LCT puede llegar a todos los compartimentos oculares (10 gl) y su concentración puede disminuir a 1/10 de la concentración inicial. A los animales se les inyectó por vía intravítrea 1 gl de LCT 150 o 500 gM para alcanzar la concentración final estimada de 15 gM (la dosis que produce la regresión de los brotes de explantes coroideos) o 50 gM (la concentración más alta de veneno que se pudo purificar). Determinamos que una inyección intravítrea de 1 gl de LCT 150 gM no era suficiente para reducir la NVC, mientras que una inyección de 1 gl de LCT 500 gM disminuye el área neovascular. Para someter a ensayo si una sola inyección de LCT 500 gM altera la estructura de la retina, inyectamos LCT en ratones adultos de control y examinamos su retina después de 7 días. La estructura de la retina se analizó mediante SD-OCT. La OCT no reveló cambios significativos en la estructura general de la retina (Fig. 2A). El grosor de toda la retina, de las capas nucleares interna y externa y de los segmentos externos no era estadísticamente diferente entre los controles y los ojos inyectados con LCT (Fig. 2B). Se registraron las respuestas ERG de los animales de control y de los animales tratados 7 días después de la inyección. Las inyecciones intravítreas de LCT no alteraban la ERG escotópica registrada con una intensidad que oscilaba de 0,003 a 10 cds/m2 (Fig. 2C; D), en comparación con animales de control o inyectados con PBS. De manera similar, las respuestas fotópicas (Fig. 2E) y las respuestas de parpadeo (Fig. 2F; G) no se alteraban después de las inyecciones de LCT, en comparación con los animales de control.

La integridad de la vasculatura se evaluó a continuación mediante inmunoquímica, 7 días después de la inyección. Las preparaciones planas retinianas se tiñeron con lectina BS-1-FITC y colágeno-IV que marcaban respectivamente las células endoteliales y las membranas basales vasculares. No se detectaron vasos fantasmas (detectados como vasos positivos para colágeno IV, vasos negativos para lectina) y ovillos neovasculares en ojos inyectados con LCT 500 gM (Fig. 3A). La pérdida de la integridad vascular daba como resultado la activación de las células micro y macrogliales. Por tanto, las preparaciones planas retinianas se inmunotiñeron con anticuerpos anti-GFAP (específicos para astrocitos y células de Muller activadas) o anti-Iba1 (específicos para células microgliales). La LCT no modificaba la morfología de los astrocitos ni la cobertura de los vasos y no se encontró ningún signo de activación de las células de Muller en la capa interna de la retina, una semana después de la inyección intravítrea de LCT o PBS (Fig. 3B). A continuación, examinamos la morfología de las células microgliales después de la inyección de LCT en el cuerpo vítreo de ratones CX3CR1+/GFP. La LCT no modificaba la morfología de las células positivas para CX3CR1 localizadas en el plexo superficial o profundo (Fig. 3C). Se sometió a ensayo la morfología de las células del EPR usando faloidina acoplada con TRITC, 7 días después de la inyección de LCT. No se detectó ningún signo de muerte celular o alteración de la morfología del EPR (Fig. 3D). En conjunto, nuestros resultados indicaban que una LCT no altera la estructura de la retina, la función de la retina o la integridad de los vasos, 7 días después de la inyección.

Ejemplo 3: LCT inhibe la neovascularización coroidea inducida por láser

Observamos que LCT inhibe la proliferación y la tubulogénesis de HBMEC in vitro (Pilorget, S. et al. 2007) y los brotes vasculares en modelos ex vivo de neovascularización (Fig. 1), sin afectar a la integridad vascular (Fig. 3). Para some ter a ensayo si la LCT inhibe in vivo la neovascularización, se sometió a ensayo la actividad de LCT en el modelo de ratón NVC. Recientemente se ha observado que las subunidades de integrina av y a5 aumentan desde el D3 al D7 en el modelo de NVC de rata (Nakajima, T. et al. 2014). Cuantificamos la expresión de las subunidades de integrina av y a5 y p3 y p5 en la coroides de ratón después de lesiones coroideas inducidas por láser en diferentes puntos de tiempo. Se indujeron lesiones coroideas el D0 con un láser oftálmico y se recogieron las coroides el D1, D3 y D7. La expresión de estas subunidades se analizó mediante RT-qPCR y se comparó con las coroides no lesionadas (D0). Se encontró que la expresión de todas las subunidades aumentaba en las 24 h posteriores a la lesión y alcanzaba un máximo el D3. El D7, av volvía al nivel basal mientras que a5, (33 y (35 permanecían elevadas (Fig.4A). Para determinar la especificidad de la unión de LCT después de las inyecciones intravítreas, a continuación inyectamos moléculas marcadas en el cuerpo vítreo de los ojos lesionados con láser. La albúmina de suero bovino (BSA), LCT y Aflibercept se conjugaron covalentemente con un colorante Alexa Fluor 647, usando un kit para marcar proteínas a microescala, y luego se purificaron y se inyectaron tres días (D4) antes del sacrificio (D7) en el ojo derecho. El ojo izquierdo recibió una inyección de PBS. La BSA conjugada con Alexa Fluor 647 (647-BSA) no marcaba las lesiones de NVC positivas para CD102. En contraste, tanto 647-LCT como 647-Aflibercept se encontró que marcaban las lesiones de NVC posi tivas para CD102 sobre preparaciones planas coroideas (Fig. 4D; E). A continuación, se marcaron las preparaciones planas retinianas con colágeno-IV para detectar depósitos y membranas basales vasculares. Se encontró que 647-LCT marcaba de forma intensa la parte exterior de la retina que miraba hacia la lesión de NVC y se observó un marcado débil en las arterias grandes en el ojo inyectado con LCT. No se encontró ningún marcado en el ojo inyectado con PBS contralateral. A continuación, analizamos si 647-LCT marcaba el nervio óptico, el nervio trigémino y diferentes áreas del cerebro de animales a los que se había inyectado 647-LCT y lo comparamos con animales a los que solo se había inyectado PBS. No se detectó LCT en el nervio óptico ni en el trigémino (datos no mostrados) ni en el hipo campo, corteza piriforme, corteza cingulada, hipotálamo, núcleo preóptico ventromedial (VMPO) y putamen caudado (estriado). Además, no detectamos un marcado con ATF3, indicativo de una lesión neuronal (Launay, P. S. et al. 2016; Tsujino, H. et al. 2000).

Para determinar las propiedades anti-neovascularización in vivo de LCT, cuantificamos los volúmenes de lesiones, 7 días después del impacto del láser como se ha descrito anteriormente (Berger, A. et al. 2014), después de una sola inyección de LCT el D0 y lo comparamos con animales tratados con PBS. La inyección de LCT disminuía el volumen de la lesión en un 31,9%, en comparación con los controles (Fig. 5A). A continuación, cuantificamos el área cubierta por neovasos sobre preparaciones planas coroideas teñidas con CD102 el D7. Las áreas de NVC se reducían signifi cativamente en un 26,7%, 7 días después de la inyección de LCT (Fig. 5B; C). Los anticuerpos anti-VEGF se utilizan habitualmente para tratar la neovascularización coroidea en pacientes con DMAE (Kovach, J. L. et al. 2012). A conti nuación, comparamos LCT con anti-VEGF. Los anticuerpos comerciales bevacizumab y ranibizumab solo reconocen el VEGF humano, por lo que usamos Aflibercept que se une al VEGF humano y de ratón (Papadopoulos, N. et al.

2012). Una sola inyección de Aflibercept reducía la neovascularización coroidea en un 31,5% (Fig. 5B; C). Las lesiones tratadas con LCT y Aflibercept no eran estadísticamente diferentes en tamaño (Fig. 5A). Los fagocitos mononucleares subretinianos (sMP, por sus siglas en inglés) participan en la neovascularización coroidea (Lambert, V. et al. 2013). Para evaluar el efecto de LCT sobre la acumulación de sMP alrededor de una lesión, se tiñeron preparaciones planas coroideas con el anticuerpo anti-Iba1 que marca los sMP. No se encontraron diferencias en el número de sMP alrede dor de la lesión entre los ojos tratados con LCT y PBS. De manera similar, no se encontraron diferencias en el número de sMP entre las lesiones tratadas con LCT y Aflibercept (Fig. 5B; D).

Las integrinas avp3 y avp5 son reguladores decisivos de la angiogénesis, por lo que determinamos si una inyección de LCT regula su expresión. Ya que avp3 y avp5 se expresan a través de un endotelio proliferante, investigamos la expresión de av, a5, p3 y p5 poco después de la inyección de LCT (24 h), para discriminar una posible regulación transcripcional del efecto anti-neovascularización a largo plazo de LCT. La expresión de av, a5, p3 y p5 es máxima el D3, por lo que analizamos su expresión el D3 después de una única inyección de LCT o PBS el D2. Un análisis con qPCR no revelaba diferencias significativas en su nivel de expresión entre LCT y PBS en extractos de EPR/coroides (Fig. 5E).

Observamos que dosis altas de LCT producen una regresión de los vasos existentes (Fig. 1), por lo tanto, inyectamos LCT en el cuerpo vítreo tres días después de los impactos de láser y cuantificamos el tamaño de la neovascularización. Cuando se inyectaba después del crecimiento inicial del vaso, la inyección de LCT permitía una regresión vascular de un 19% (Fig. 6A; B). En conjunto, nuestros resultados mostraban que una sola inyección de LCT permitía la prevención y la regresión de la neovascularización coroidea sin afectar al reclutamiento de sMP.

Ejemplo 4: LCT inhibe la neovascularización retiniana en el modelo de retinopatía inducida por oxígeno (RIO)

A continuación, analizamos el efecto de LCT sobre la neovascularización retiniana, una marca distintiva de las retinopatías isquémicas graves, en el modelo de RIO. Este modelo se ha utilizado ampliamente para comprender la pérdida vascular retiniana, el crecimiento de nuevo vascular, la neovascularización y la regresión neovascular (Connor, K. M. et al. 2009). La neovascularización retiniana se induce sometiendo a los roedores recién nacidos a hiperoxia entre el P7 y el P12 para inhibir el desarrollo vascular fisiológico. Cuando los animales vuelven al aire ambiente, la hipoxia retiniana relativa conduce a una neovascularización retiniana grave entre el P12 y el P17 (Smith, L. E. et al. 1994). Para determinar la especificidad de la unión de LCT, primero inyectamos LCT (647-LCT) conjugada con Alexa Fluor 647 en el cuerpo vítreo de animales sometidos a RIO, tres días antes de su sacrificio el P17. 647-LCT marcaba inten sivamente ovillos de neovasos positivos para lectina BS-1 mientras que la vasculatura retiniana no se marcaba (Fig. 7A). Para evaluar las propiedades anti-angiogénicas de LCT en el modelo de RIO, el P7 los ratones se sometieron a RIO y se les inyectó 1 pl de PBS o LCT 500 pM el día 12 y se devolvieron al aire ambiente. Los ratones se sacrificaron el P17 y se determinó la vaso-obliteración (VO) y el área de neovascularización (NV) en una preparación plana reti niana teñida con lectina BS-1 como se ha descrito anteriormente (Stahl, A. et al. 2009). La LCT no cambiaba la pro porción de VO en comparación con la inyección de PBS (Fig. 7B; D). Por el contrario, una sola inyección de LCT el P12 reducía el área cubierta por la neovascularización retiniana el P17 en un 48,1% (Fig. 7B; E). Para comparar el tratamiento con LCT con la terapia anti-VEGF, se inyectó Aflibercept 25 pM el P12, una dosis que ha mostrado que reduce la NV sin afectar el desarrollo de la retina (Stahl, A. et al. 2009) y se compararon la NV y la VO con animales tratados con LCT. No se encontraron diferencias en la VO ni la NV entre los tratamientos con LCT y Aflibercept (Fig. 7B-E).

Ejemplo 5: una inyección conjunta de LCT y Aflibercept da como resultado una inhibición de la neovascularización que es mayor que solo con Aflibercept.

A continuación, sometimos a ensayo el efecto de una inyección conjunta de LCT y Aflibercept sobre la neovasculari zación retiniana en el modelo de RIO. Para evaluar las propiedades anti-angiogénicas de la inyección conjunta de LCT y Aflibercept en el modelo de RIO, el P7 los ratones fueron sometidos a RIO y se les inyectó 1 pL de PBS, LCT 500 pM, Aflibercept 25 pM o LCT 500 pM y Aflibercept 25 pM el día 12 y se devolvieron al aire ambiente. Los ratones se sacrificaron el P17 y se determinó la vaso-obliteración (VO) y el área de neovascularización (NV) sobre una prepara ción plana retiniana teñida con lectina BS-1. Una inyección conjunta de LCT y Aflibercept no cambiaba la proporción de VO en comparación con PBS (Fig. 8). Por el contrario, una inyección conjunta de LCT y Aflibercept daba como resultado una mayor inhibición de la neovascularización que con Aflibercept o LCT solos.

Ejemplo 6: LCT recombinante inhibe el brote vascular desde explantes coroideos

La actividad de LCT recombinante se sometió a ensayo en el modelo de explante coroideo de ratón que reproduce fielmente la formación de vasos desde el lecho coriocapilar (Shao, Z. et al. 2013). Las coroides se cultivaron como explantes como se ha descrito anteriormente (Shao, Z. et al. 2013). Los explantes se trataron el D3 con LCT recom binante (rLCT) y se analizaron el D6 (Fig. 9). Con 1,5 pM, la rLCT inhibía el brote de vasos en un 65,0% en comparación con las condiciones de control.

Ejemplo 7: LCT recombinante inhibe la neovascularización retiniana en el modelo de retinopatía inducida por oxígeno (RIO)

A continuación, sometimos a ensayo el efecto de la LCT recombinante sobre la neovascularización retiniana, una marca distintiva de las retinopatías isquémicas graves, en el modelo de RIO. La neovascularización retiniana se induce sometiendo a hiperoxia roedores recién nacidos entre el P7 y el P12 para inhibir el desarrollo vascular fisiológico. Cuando los animales vuelven al aire ambiente, la hipoxia retiniana relativa conduce a una neovascularización retiniana grave entre el P12 y el P17 (Smith, L. E. et al. 1994). Para evaluar las propiedades anti-angiogénicas de rLCT en el modelo de RIO, el P7 los ratones se sometieron a RIO y se les inyectó 1 pl de PBS o rLCT 500 pM el día 12 y se devolvieron al aire ambiente. Los ratones se sacrificaron el P17 y se determinó la vaso-obliteración (VO) y el área de neovascularización (NV) sobre una preparación plana retiniana teñida con lectina BS-1 como se ha descrito previa mente (Stahl, A. et al. 2009) (Fig. 10A). La rLCT no cambiaba la relación de VO en comparación con la inyección de PBS (Fig. 10B). Por el contrario, una única inyección de rLCT el P12 reducía el área cubierta mediante neovasculari zación retiniana el P17 en un 22,1% (Fig. 10C).

Ejemplo 8: LCT recombinante inhibe la neovascularización coroidea inducida por láser

Para analizar si la LCT recombinante inhibe in vivo la neovascularización, se sometió a ensayo la actividad de rLCT en el modelo de ratón NVC. Se indujeron lesiones coroideas el D0 con un láser oftálmico y se recogieron las coroides el D7. Para determinar las propiedades de anti-neovascularización in vivo de rLCT, cuantificamos el área cubierta por los neovasos sobre preparaciones planas coroideas teñidas con CD102 el D7 (Fig. 11A). Las áreas de NVC se redu cían significativamente en un 29,8%, 7 días después de la inyección de rLCT (Fig. 11B).

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína seleccionada a partir de lebecetina y variantes funcionales o fragmentos de la misma para uso en el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular, en donde dicha proteína comprende:

- una primera subunidad que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad con la misma, y - una segunda subunidad que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad con la misma.

2. La proteína para uso según la reivindicación 1, en la que:

- la primera subunidad comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con la misma, y

- la segunda subunidad comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con la misma.

3. La proteína para uso según la reivindicación 1 o 2, en la que las dos subunidades están unidas por puentes disulfuro, formando de este modo un heterodímero.

4. La proteína para uso según la reivindicación 3, en la que:

- la primera subunidad comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y - la segunda subunidad comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 18.

5. La proteína para uso según la reivindicación 1 o 2, en la que la primera subunidad comprende, o consiste en, una secuencia que tiene de 1 a 30 residuos de aminoácidos delecionados, sustituidos o insertados en comparación con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y/o la segunda subunidad comprende, o consiste en, una secuencia que tiene de 1 a 30 residuos de aminoácidos delecionados, sustituidos o insertados en comparación con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

6. La proteína para uso según la reivindicación 5, en la que las sustituciones de los residuos de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos.

7. La proteína para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 y 6, en donde dicha proteína es una variante funcional de lebecetina y en donde los residuos correspondientes a

1) residuos de cisteína implicados en puentes disulfuro intra o inter, entre las cadenas alfa y beta, es decir, Cys27, Cys38, Cys55, Cys106, Cys129, Cys149 y Cys154 de SEQ ID NO: 1, y Cys27, Cys38, Cys55, Cys100, Cys123, Cys136 y Cys144 de SEQ ID NO: 3; y/o

2) residuos de dominios HCY, es decir, His37, Cys38, Tyr39 de SEQ ID NO: 1 y His37, Cys38, Tyr39 de SEQ ID NO: 3; y/o

3) residuos de dominios DAEK, es decir, Asp50, Ala51, Glu52 y Lys53 de SEQ ID NO: 1 y Asp50, Ala51, Glu52 y Lys53 de SEQ ID NO: 3; y/o

4) residuos de motivos WIGL, es decir, de Trp94 a Leu96 de SEQ ID NO: 1 y de Trp94 a Leu96 de SEQ ID NO: 3,

se conservan.

8. La proteína para uso según la reivindicación 1, en donde dicha proteína es lebecetina.

9. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un vector de expresión que comprende dicha secuencia de ácido nucleico, para uso en el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular.

10. Una composición farmacéutica que comprende la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la secuencia de ácido nucleico o el vector según la reivindicación 9, y un excipiente farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular.

11. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 10, en donde dicha composición se usa en combi nación con, o comprende adicionalmente, al menos un inhibidor de la angiogénesis.

12. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 11, en donde dicho inhibidor de la angiogénesis es un inhibidor de la vía del VEGF.

13. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 12, en donde el inhibidor de la vía de VEGF es aflibercept.

14. La proteína para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la secuencia de ácido nucleico o el vector para uso según la reivindicación 9, o la composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicacio nes 10 a 13, en donde dicha enfermedad neovascular ocular se selecciona a partir del grupo que consiste en degene ración macular relacionada con la edad, retinopatías diabéticas tales como isquemia retiniana diabética o retinopatía diabética proliferativa, neovascularización del iris, neovascularización intraocular, neovascularización corneal, neovascularización retiniana, neovascularización coroidea e inflamación corneal.

15. La proteína para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 13 y 14, la secuencia de ácido nucleico o el vector para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9, 13 y 14, y la composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde el sujeto que se va a tratar no responde o se ha vuelto resistente a una terapia con un inhibidor de la angiogénesis, preferiblemente un inhibidor de la vía de VEGF, más preferiblemente aflibercept.