ES2886009T3 - Construcción genética - Google Patents

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Abstract

Un vector adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una construcción genética que comprende, en una orientación 5' a 3', un promotor operativamente unido a una primera secuencia codificante, que codifica el receptor de tirosina quinasa B (TrkB), y una segunda secuencia codificante, que codifica un agonista del receptor TrkB, en donde el agonista es BDNF maduro, en donde la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal para el agonista del receptor TrkB, de manera que cuando se expresa, el péptido señal se conjuga con el N-terminal del BDNF maduro, y en donde la construcción genética comprende una secuencia espaciadora dispuesta entre la primera y la segunda secuencia codificante, cuya secuencia espaciadora codifica un péptido espaciador que se configura para digerirlo para de esta manera producir el receptor TrkB y el agonista como moléculas separadas.

Description

DESCRIPCIÓN
Construcción genética
La presente invención se refiere a construcciones genéticas y vectores recombinantes que comprenden dichas construcciones, y a los usos de las construcciones y vectores en métodos de terapia génica para tratar una variedad de trastornos, que incluye glaucoma y sordera, o para promover la regeneración y/o supervivencia de nervios.
El glaucoma es un término usado para definir un grupo de trastornos oculares caracterizados por la degeneración progresiva del nervio óptico, la muerte de las células ganglionares de la retina (CGR) y la pérdida de axones, que resulta en una apariencia excavada de la cabeza del nervio óptico y pérdida de la visión. El glaucoma es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo [1] y la incidencia de glaucoma aumenta drásticamente con la edad. Alrededor de medio millón de personas en el Reino Unido y más de 2,2 millones de personas en América del Norte de 40 años o más tienen glaucoma. Además, cada hora, alguien se queda ciego a causa de esta enfermedad que amenaza la vista en los EE.UU. [2]. A medida que el tamaño de la población anciana continua creciendo rápidamente, el glaucoma se ha convertido en un problema social inminente así como también un problema médico. La presión intraocular elevada (PIO) es el factor de riesgo más importante para el glaucoma [3], además de la edad y todos los tratamientos autorizados actualmente funcionan al reducir la PIO [4-5].
El glaucoma se puede diagnosticar antes de la pérdida de la visión mediante pruebas de campo visual y examen oftalmoscópico del nervio óptico para detectar "ahuecamiento". El tratamiento actual del glaucoma se basa en reducir la PIO a niveles normales, que están entre 10 y 21 mm Hg, con el fin de prevenir un mayor daño del nervio óptico mediante el uso de fármacos de aplicación tópica [6]. La PIO media en adultos normales es de 15 a 16 mm Hg. Actualmente existen cinco clases principales de medicamentos que se usan para reducir la PIO: antagonistas padrenérgicos, agonistas adrenérgicos, parasimpaticomiméticos, análogos de tipo prostaglandina e inhibidores de la anhidrasa carbónica [7]. Si bien son relativamente efectivos para reducir la PIO cuando se usan correctamente, estos medicamentos pueden causar efectos secundarios graves en algunos pacientes y de esta manera, afectar negativamente la calidad de vida del paciente. Además, la adherencia al tratamiento con gotas para los ojos para reducir la PIO suele ser deficiente, particularmente en pacientes de edad avanzada que deben tomar varios medicamentos. Se ha estimado que menos del 50 % de los pacientes a los que se les prescribió un tratamiento para reducir la PIO en realidad lo usan con regularidad según las indicaciones, con obvias implicaciones para el control de la afección subyacente. Si está indicada una reducción adicional de la PIO, o si la medicación no logra reducir suficientemente la PIO, puede usarse la trabeculoplastia con láser, pero este tratamiento no logra una reducción adecuada de la PIO en muchos pacientes. Si la PIO no se controla adecuadamente todavía, se puede indicar la cirugía de glaucoma incisional. Sin embargo, el tratamiento para reducir la PIO no previene el deterioro en muchos pacientes y el glaucoma sigue siendo la principal causa de ceguera irreversible en todo el mundo. La neuroprotección de las CGR glaucomatosas y sus proyecciones axónicas, que forman el nervio óptico, por lo tanto, sería un paradigma terapéutico valioso para su uso como complemento de los tratamientos convencionales de reducción de la PIO y de particular importancia en pacientes que se deterioran a pesar de la terapia convencional [8].
La neuropatía óptica glaucomatosa parece ser el resultado de cambios fisiopatológicos específicos y la muerte subsiguiente de las CGR y sus axones. Se cree que el proceso de muerte de las CGR es bifásico, es decir, a una lesión primaria responsable del inicio del daño le sigue una degeneración secundaria más lenta atribuible al microambiente hostil que rodea a las células en degeneración [9].
Se ha demostrado que los mecanismos de muerte de las CGR en modelos animales experimentales de glaucoma y glaucoma humano implican apoptosis [10]. Aunque no se ha identificado el mecanismo molecular que desencadena la apoptosis, se sospecha que la privación de factores neurotróficos, la isquemia, la elevación crónica de glutamato y el metabolismo desorganizado del óxido nítrico son posibles mecanismos [11].
El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) junto con el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3) y la neurotrofina-4/5 (NT-4/5) son miembros de la familia de neurotrofinas de factores tróficos [12-13]. Las neurotrofinas desempeñan un papel esencial en el desarrollo, la supervivencia y la función de un amplio rango de neuronas tanto en el sistema nervioso central como en el periférico, incluidas las GCR. Las neurotrofinas interactúan con dos tipos de receptores de superficie celular, receptores p75NTRde baja afinidad y la familia de receptores de tirosina quinasa de alta afinidad (Trk) [12-13]. El factor de crecimiento nervioso (NGF) se une preferentemente a TrkA, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y la neurotrofina-4/5 (NT4/5) se une al receptor quinasa B de la tropomiosina (TrkB) y la neurotrofina-3 (NT-3) se une al TrkC (y TrkA en menor medida) [12-13].
Entre las neurotrofinas, el BDNF es el factor de supervivencia más potente para las CGR lesionadas [14-21]. El BDNF es una molécula de proteína que se produce en el cerebro y se transporta a la retina por medio del transporte axonal retrógrado a través del nervio óptico, donde apoya a las GCR y mantiene su supervivencia [15-21]. En determinadas condiciones, tal como durante las agresiones excitotóxicas con agonistas del receptor de glutamato, tal como el N-metil-D-aspartato, el BDNF también se puede producir en las CGR, aunque a niveles relativamente bajos [22-23]. El BDNF se produce normalmente como un prepropolipéptido (es decir, preproBDNF) que contiene una secuencia de péptido señal corta, que facilita el tráfico de todo el polipéptido a vesículas para su liberación al espacio extracelular. La escisión y eliminación del péptido señal convierte preproBDNF en proBDNF. Una secuencia de proBDNF N-terminal se escinde luego ya sea intracelularmente o extracelularmente para crear BDNF maduro (mBDNF) [24]. Tanto el pro-BDNF como el mBDNF poseen actividad biológica, el pro-BDNF activa preferentemente receptores p75 NTR y el mBDNF más corto activa los receptores TrkB [25-27]. La activación de receptores p75 NTR y los receptores TrkB en la retina muestran efectos opuestos sobre la supervivencia de las CGR, el primero es responsable de la apoptosis a través de la activación directa de p75NTR en cuerpos celulares CGR [25-28] o indirectamente a través de la activación de p75 NTR en células de Müller, de esta manera estimula la liberación del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) que promueve aún más la pérdida de las CGR [29].
Los modelos animales de glaucoma han demostrado que después del aplastamiento del nervio o aumento de la PIO, hay un cambio de las vías de señalización de la señalización neurotrófica mBDNF/TrkB hacia la señalización pro-BDNF/p75NTR. Se ha demostrado niveles reducidos de receptores mBDNF y TrkB en la retina [27, 30-31] junto con elevaciones opuestas en los niveles relativos de pro-BDNF [28] y receptores p75NTR[32]. La suplementación de mBDNF a través de inyecciones oculares de proteína recombinante en ratas con PIO elevada de manera experimental aumenta la supervivencia de las CGR en comparación con los ojos no tratados, de esta manera se confirma para esta neurotrofina un papel neuroprotector clave [19-21].
Para mantener los niveles de mBDNF en ojos con glaucoma, se requerirían inyecciones regulares de mBDNF ya que el mBDNF se degrada rápidamente dentro del ojo. Para superar la necesidad de inyecciones intraoculares regulares de mBDNF, los intentos de proporcionar un BDNF elevado constante han recurrido al uso de adenovirus recombinantes o vectores virales adenoasociados (rAAV) para la entrega a la retina del transgén que codifica el BDNF para retrasar o prevenir la muerte de las CGR en modelos de animales con glaucoma [l8, 33-34]. Los vectores rAAV consisten en un genoma de ADN monocatenario. Se han usado con éxito como vector viral para terapia génica en múltiples ensayos clínicos, mientras que muestran una toxicidad limitada. Si bien las inyecciones intravítreas de mBDNF recombinante solo, o el aumento de la producción local de BDNF a través de la terapia génica, han mostrado ser efectivas para prevenir la pérdida de las CGR durante un breve período después de la elevación de la PIO u otro daño del nervio óptico, el efecto beneficioso del BDNF se ha mostrado que es transitorio [18]. Sin embargo, la terapia génica que incorpora la secuencia del gen de BDNF endógeno también es capaz de producir y liberar pro-BDNF así como también el mBDNF previsto.
La terapia génica dirigida a atenuar o prevenir la pérdida de la señalización de TrkB a través del aumento de la expresión del receptor en las CGR o a través de la estimulación constante de los receptores TrkB extracelulares restantes mediante el uso de un anticuerpo con propiedades agonistas también ha demostrado tener éxito en la prevención de la pérdida de las CGR [35-36]. Sin embargo, las reducciones en la señalización trófica a través de la vía mBDNF/TrkB se complica aún más por la internalización de los receptores TrkB activados por mBDNF y el reemplazo de estos receptores en la superficie celular con isoformas TrkB incapaces de inducir la señalización intracelular [37-38]. Además, el sistema bioquímico responsable de la desactivación de los receptores TrkB después de la autofosforilación de los dímeros del receptor TrkB en presencia de mBDNF está regulada positivamente en las retinas sometidas a un aumento de la PIO [39].
Además, aparte de glaucoma, el eje BDNF/TrkB también se ha implicado en la neuroprotección de los componentes del oído interno, específicamente de la estructura coclear donde las agresiones pueden resultar en la pérdida de células ciliadas lo que resulta en sordera [40-42], y de la regeneración de nervios[43-44].
Por lo tanto, existe la necesidad de una terapia génica mejorada para el tratamiento del glaucoma y la sordera, y para promover la regeneración o supervivencia de nervios.
Los inventores han construido una nueva construcción genética, que codifica el receptor tirosina quinasa B (TrkB) y un agonista del receptor TrkB bajo el control de un solo promotor. El promotor de la construcción puede usarse para asegurar que el agonista y el receptor solo se expresen en células ganglionares de la retina (CGR), células cocleares o nerviosas, y promuevan la supervivencia de estas células.
La invención es como se define en las reivindicaciones.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un vector adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una construcción genética que comprende, en una orientación 5' a 3', un promotor operativamente unido a una primera secuencia codificante, que codifica el receptor tirosina quinasa B (TrkB), y una segunda secuencia codificante, que codifica un agonista del receptor TrkB, en donde el agonista es BDNF maduro, en donde la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal para el agonista del receptor TrkB, de manera que cuando se expresa, el péptido señal se conjuga con el extremo N-terminal del BDNF maduro, y en donde la construcción genética comprende una secuencia espaciadora dispuesta entre la primera y la segunda secuencia codificante, cuya secuencia espaciadora codifica un péptido espaciador que se configura para digerirlo y de esta manera producir el receptor y el agonista de TrkB como moléculas separadas. De acuerdo con un segundo aspecto, se proporciona un vector recombinante de acuerdo con el primer aspecto, para su uso como medicamento.
De acuerdo con un tercer aspecto, se proporciona un vector recombinante de acuerdo con el primer aspecto, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno del nervio óptico, o para promover la regeneración y/o supervivencia de nervios, en donde opcionalmente el trastorno del nervio óptico que se trata es cualquier condición fisiopatológica que resulte en la pérdida de las CGR, tal como un traumatismo en la cabeza o la cara o lesiones vasculares, por ejemplo, pérdida parcial o completa del suministro de sangre a las estructuras oculares o regiones del cerebro que reciben información del nervio óptico, o se usa para apoyar el reemplazo de las CGR mediante la introducción de células madre transformadas o no transformadas en el ojo o regiones asociadas con la visión en pacientes, en donde opcionalmente el trastorno del nervio óptico que se trata es glaucoma.
De acuerdo con un cuarto aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la composición de acuerdo con el primer aspecto y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con un quinto aspecto, se proporciona un método para preparar la composición farmacéutica de acuerdo con el cuarto aspecto, el método comprende poner en contacto al vector recombinante de acuerdo con el primer aspecto, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Así, de acuerdo con un primer ejemplo, se proporciona una construcción genética que comprende un promotor operativamente unido a una primera secuencia codificante, que codifica el receptor tirosina quinasa B (TrkB), y una segunda secuencia codificante, que codifica un agonista del receptor TrkB.
Los inventores han demostrado en los Ejemplos que es posible combinar los genes que codifican tanto para el receptor TrkB como para su agonista en una única construcción genética. Esto fue especialmente desafiante dados sus grandes tamaños, y no se podría haber predicho que hubiera sido posible coexpresarlos en concentraciones fisiológicamente útiles. Ventajosamente, con la construcción de la invención, no hay necesidad de inyectar una proteína recombinante, como se describe en la técnica anterior. Además, en la técnica anterior, todavía es necesario realizar inyecciones regulares de proteína, mientras que la construcción de la invención solo requiere una única inyección de terapia génica.
Preferentemente, en uso, el agonista del receptor TrkB activa el receptor TrkB para promover de esta manera la supervivencia de las células ganglionares de la retina (CGR), células nerviosas o células cocleares. Ventajosamente, la construcción de la invención puede, por lo tanto, usarse para alcanzar el objetivo, ya sean las c Gr , células nerviosas o células cocleares con el fin de mantener o mejorar la señalización del TrkB en estas células. Por lo tanto, la construcción puede usarse para maximizar la protección contra factores estresantes fisiopatológicos del glaucoma y la sordera, y para promover la regeneración y/o la supervivencia de nervios. Además, la construcción puede usarse para proporcionar un tratamiento a largo plazo del glaucoma o la sordera debido a la expresión del receptor TrkB y un agonista del receptor bajo el control de uno o más promotores. En consecuencia, la construcción ha superado la necesidad de usar múltiples tratamientos alternativos que, incluso en combinación, proporcionan un efecto terapéutico transitorio. Además, la construcción de la invención es ventajosa porque puede usarse para mejorar significativamente la sensibilidad de las células cocleares o CGR a los agonistas del receptor TrkB debido a un aumento localizado tanto del receptor TrkB como del agonista del receptor.
Preferentemente, la construcción genética de esta descripción comprende un casete de expresión, un ejemplo del cual se muestra en la Figura 1. Como puede verse en la Figura 1, la construcción comprende el promotor, la primera secuencia de nucleótidos que codifica el receptor TrkB y la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la forma madura del factor neurotrófico derivado del cerebro (mBDNF), que actúa como un agonista preferido del receptor TrkB. Sin embargo, se apreciará que pueden usarse otros agonistas, como se describe en la presente descripción. También como se muestra en la Figura 1, el casete de expresión también incluye una secuencia espaciadora 2A, una secuencia que codifica el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis (WHPE), una secuencia que codifica una cola de poliA y secuencias de repetición terminal invertida (ITR) en el extremo izquierdo y derecho del casete.
Por lo tanto, preferentemente la construcción genética comprende una secuencia espaciadora dispuesta entre la primera y la segunda secuencia codificante, la secuencia espaciadora que codifica un péptido espaciador se configura para digerirlo o cortado para producir de esta manera el receptor TrkB y el agonista como moléculas separadas. En el ejemplo ilustrado en la Figura 1, la secuencia codificante del receptor TrkB está dispuesta en la posición 5' de la secuencia codificante del agonista del receptor (BDNF) con la secuencia espaciadora entre ellos. Sin embargo, en otro ejemplo, la secuencia codificante para el agonista del receptor puede estar dispuesta en la posición 5' de la secuencia codificante del receptor con la secuencia espaciadora entre ellos.
Preferentemente, la construcción genética comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WHPE), que potencia la expresión de los dos transgenes, es decir, el receptor TrkB y su agonista, que es preferentemente BDNF. Preferentemente, la secuencia codificante de WHPE está dispuesta en la posición 3' de la secuencia codificante del transgén.
Una modalidad del elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WHPE) tiene una longitud de 592 pb, incluidos los elementos gamma-alfa-beta, y se denomina en la presente descripción como SEQ ID No: 57, como sigue:
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGC
TATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTC
CTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTG
TGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGA
CTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGG
GGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTC
GCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGG
ACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAG
TCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG
[SEQ ID NO. 57]
Preferentemente, el WHPE comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 57, o un fragmento o variante de la misma.
Sin embargo, en una modalidad preferida, se usa un WHPE truncado, que tiene una longitud de 247 pb debido a la deleción del elemento beta, y al que se hace referencia en la presente descripción como SEQ ID No: 58, como sigue:
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAAC TATGTTGCTCCTTTTACGC
TATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTC
CTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACA
GGGGC TCGGCTGTT GGGCAC T GACAAT TCCGTGGTGT
[SEQ ID NO. 58]
Ventajosamente, la secuencia de WHPE truncada usada en la construcción guarda aproximadamente 300 pb en total sin afectar negativamente a la expresión del transgén. Preferentemente, el WHPE comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 58, o un fragmento o variante de la misma.
Preferentemente, la construcción genética comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cola de poliA. Preferentemente, la secuencia codificante de la cola de poliA está dispuesta en la posición 3' de la secuencia de codificante del transgén, y preferentemente en la posición 3' de la secuencia codificante de WHPE.
Preferentemente, la cola de poliA comprende la secuencia de poliA de 224 pb del virus simio 40. Una modalidad de la cola de poliA se referencia en la presente descripción como SEQ ID No: 59, como sigue:
AGCAGACATGATAAGATACAT TGATGAGTTTGGACAAACCACAAC TAGAATGCAGTGAAAAAAATGC T T T
ATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACA
ACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCT
CTACAAATGTGGTA
[SEQ ID NO. 59] Preferentemente, la cola de poliA comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 59, o un fragmento o variante de la misma.
Preferentemente, la construcción genética comprende secuencias de repetición terminal invertida (ITR) en su extremo izquierdo y/o derecho. Preferentemente, cada ITR está dispuesta en el extremo 5' y/o 3' de la construcción.
El promotor en la construcción genética de esta descripción puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que sea capaz de inducir a la ARN polimerasa a unirse y transcribir la primera y segunda secuencia codificante. En una modalidad preferida, el promotor es el promotor de la sinapsina I humana (SYN I). Una modalidad del promotor de la secuencia de 469 nucleótidos que codifica la sinapsina I humana (SYN I) se denomina en la presente descripción como SEQ ID NO.1, como sigue:
CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTAC
C T GAC GAC C GAC C C C GAC C CAC T GGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAG
AGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGIGCGCACIGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGIGCC
TTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGT
CCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACC
ACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCC
TCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG
[SEQ ID NO. l] Preferentemente, por lo tanto, el promotor puede comprender una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 1, o un fragmento o variante de la misma.
En otra modalidad preferida, el promotor es el promotor CAG. El promotor CAG comprende preferentemente el elemento potenciador temprano del citomegalovirus, el primer exón y el primer intrón del gen de beta-actina del pollo y el aceptor de corte y empalme del gen de beta-globina de conejo, que facilita de esta manera la expresión específica de tejido solamente en células CGR y células cocleares. Una modalidad de la secuencia de 1733 nucleótidos que codifica el promotor CAG se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO.2, como sigue:
CTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATAT
GGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTG
ACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGT
ATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGT
CAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAG
TACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCA
TCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGC
GGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGA
GGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGC
GGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTC
CGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGAC
GGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTG
AAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGT
GTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGG
CTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCT
GCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGT
CGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTC
CGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGG
CGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCG
AGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCC
CAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGT
GCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCC
TCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGC
TTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGC
TCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTG
[SEQ ID NO. 2] En otra modalidad preferida, el promotor es una forma truncada del promotor CAG, tal como una forma de 664 nucleótidos del promotor que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO.3, como sigue:
CTAGATCTGAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATAT
ATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCAT
TGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGA
CTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGAC
GTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGC
AGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCC
CATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGG
GCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGA
GAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCG
GCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
[SEQ ID No:3]
En otra modalidad preferida adicional, el promotor es una forma truncada del promotor CAG, tal como una forma de 584 nucleótidos del promotor que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 48, como sigue:
GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAAT
AATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGG
TAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACG
GTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTA
CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCC
CCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGG
GGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGC
GGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTAT
AAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
[SEQ ID No: 48]
Por lo tanto, preferentemente, el promotor comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 2, 3, o 48 un fragmento o variante de la misma.
Muchas construcciones de genes bicistrónicos presentados en la literatura científica tienen (i) incorporado promotores duales para impulsar por separado la expresión de dos genes, o (ii) usan el sitio interno de unión a ribosoma (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) para unir dos genes transcritos de un solo promotor dentro de vectores virales recombinantes [45-46]. Sin embargo, la eficiencia de la traducción dependiente de IRES que puede variar en diferentes células y tejidos y la expresión del segundo gen dependiente de IRES puede ser significativamente menor que la expresión del primer gen dependiente de cap en vectores bicistrónicos [47]. Además, la limitación de tamaño de los vectores rAAV (generalmente <5 kb) evitará la incorporación de grandes construcciones génicas, tal como el receptor TrkB junto con BDNF que usan promotores duales o enlazadores IRES.
En consecuencia, en una modalidad preferida, la construcción genética comprende una secuencia espaciadora dispuesta entre la primera y la segunda secuencia codificante, cuya secuencia espaciadora codifica un péptido espaciador que se configura para digerirlo y de esta manera producir el receptor TrkB y el agonista como moléculas separadas. Preferentemente, la secuencia espaciadora comprende y codifica una secuencia espaciadora de un péptido viral, con mayor preferencia una secuencia espaciadora del péptido 2A viral [47]. Preferentemente, la secuencia del péptido 2A conecta la primera secuencia codificante a la segunda secuencia codificante. Esto permite que la construcción supere las restricciones de tamaño que ocurren con la expresión en varios vectores y permite que la expresión de todos los péptidos codificados por la construcción de esta descripción ocurra bajo el control de un solo promotor, como una sola proteína.
Por lo tanto, después de la traducción de la proteína única que contiene las secuencias de TrkB, el péptido 2A y el agonista (preferentemente BDNF), se produce la escisión en la secuencia del péptido 2A viral en el enlace terminal glicina-prolina, de esta manera se liberan dos proteínas, es decir, TrkB y el agonista (es decir, mBDNF). La construcción genética está diseñada de manera que la secuencia corta de aminoácidos N-terminal restante del péptido 2A viral permanezca unida a la porción intracelular del receptor TrkB, de esta manera se eliminan los riesgos de inmunogenicidad y no interfiere con la capacidad de señalización intracelular del receptor maduro. El aminoácido prolina residual del C-terminal de la secuencia 2A viral permanece unido al péptido señal del N-terminal del BDNF y finalmente se elimina de la proteína mBDNF después de la escisión de la secuencia señal de la proteína madura.
Los inventores han generado dos modalidades de la secuencia espadadora. Una sección importante de la secuencia espaciadora del péptido, que es común a ambas modalidades descritas en la presente descripción, es el extremo carboxilo. En consecuencia, preferentemente la secuencia espaciadora del péptido comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID No . 4, o un fragmento o variante de la misma, como sigue:
QAGDVEENPGP [SEQ ID No: 4]
Preferentemente, el sitio de digestión o corte de la secuencia espaciadora del péptido se dispone entre la glicina terminal y la prolina terminal en la SEQ ID No: 4.
En una primera modalidad preferida, la secuencia espaciadora comprende una secuencia de nucleótidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO.5, o un fragmento o variante de la misma, como sigue: GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT [SEQ ID No: 5] En esta primera modalidad, la secuencia espaciadora del péptido comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 6, o un fragmento o variante de la misma, como sigue: GSGATNFSLLQAGDVEENPGP [SEQ ID No: 6]
En una segunda modalidad preferida, la secuencia espaciadora comprende una secuencia de nucleótidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 7, o un fragmento o variante de la misma, como sigue: AGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT [SEQ ID No: 7] En esta segunda modalidad, la secuencia espaciadora del péptido comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 8, o un fragmento o variante de la misma, como sigue: SGATNFSLLKQAGDVEENPGP [SEQ ID No: 8]
Los inventores han considerado cuidadosamente las secuencias del receptor TrkB y han producido varias modalidades preferidas del receptor que se codifica por la primera secuencia codificante en la construcción genética de esta descripción.
En una modalidad preferida, la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la isoforma canónica humana de TrkB. Preferentemente, la isoforma canónica de TrkB comprende una secuencia de aminoácidos (822 residuos) que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 9, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLWGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITE
IFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDL
SELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEE
GKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVN
LTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDN
PTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPST
DVTDKTGREHLSVYAVWIASWGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNT
PSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNL
CPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLR
AHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRD
VYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGWLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGR
VLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKG1HTLLQNLAKASPVYLDILG
[SEQ ID No: 9]
Preferentemente, en esta modalidad, la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 10, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGG
GCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGA
CCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAA
AT T T T CAT CGCAAACCAGAAAAGGT TAGAAATCATCAACGAAGATGAT GT T GAAGCT TATGTGGGAC TGA
GAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCT
GCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTG
TCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAG
AGGC T AAAT C CAGT C CAGACAC T CAGGAT T T GTAC T GC C T GAAT GAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGC
AAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAA
GGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTA
ACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATC
CGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAAC
CTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTC
CATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTC
CAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAAT
CCCACTCACATGAACAATGGGGACTACAC TC TAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGA
TTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTA
T GAAGAT TAT GGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACA
GACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGG
GATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCC
AGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACT
CCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATC
CCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAA
CATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTC
TGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGG
ACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTG
CGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGG
GCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGC
TGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTT
GGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGAC
GTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGA
GCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTT
CACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGA
GTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGC
CCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTA
CCTGGACATTCTAGGC
[SEQ ID No: 10]
En otra modalidad preferida, la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la isoforma 4 de TrkB. Preferentemente, la isoforma 4 de TrkB comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 11, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLWGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDP SPGIVAFPRLEPNSVDPENITE
IFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDL
SELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEE
GKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVN
LTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTK1HVTNHTEYHGCLQLDN
PTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPST
DVTDKTGREHLSVYAVWIASWGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKDFS WFGFGKVKSRQGVGPASVI SND
DDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKREL
GEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLI
MVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLV
GENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGWLWEIFTYGKQPW
YQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKG1HTLLQNLAKASPVYLDILG
[SEQ ID No: ll]
Preferentemente, esta modalidad de la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 12, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGG
GCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGA
CCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAA
ATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGT TAGAAATCAT CAACGAAGATGATGT T GAAGCT TATGTGGGAC TGA
GAAAT C T GACAAT T GT GGAT T C T GGAT TAAAAT TTGTGGCTCATAAAGCAT T T C T GAAAAACAGCAAC C T
GCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGT C TAGGAAACATT TCCGTCACCTTGAC T T G
TCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAG
AGGC T AAAT C CAGT C CAGACAC T CAGGAT T T GTAC T GC C T GAAT GAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGC
AAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAA
GGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTA
ACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATC
C GAT GACAGT GGGAAGCAGAT CTCTTGTGTGGCGGAAAATC T TGTAGGAGAAGATCAAGATTC TGTCAAC
CTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTC
CATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTC
CAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAAT
CCCACTCACATGAACAATGGGGACTACAC TC TAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGA
TTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTA
T GAAGAT TAT GGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACA
GACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGG
GATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGATTT
CTCATGGTTTGGATTTGGGAAAGTAAAATCAAGACAAGGTGTTGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGAT
GATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCC
CAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAA
CAGTCAGC T CAAGCCAGACACAT T TGT T CAGCACAT CAAGC GACATAACAT TGT TC T GAAAAGGGAGC T A
GGCGAAGGAGCC T T TGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGC TAT AACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATC T
TGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCT
CCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATC
ATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGC
TGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGC
CGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTC
GGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACA
GGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCAC
GACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGG
TACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGT
GC C C C CAGGAGGT GTAT GAGC TGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAA
GGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC
[SEQ ID No: 12]
Los inventores han dedicado un esfuerzo inventivo considerable al estudio de la secuencia del receptor TrkB y se han dado cuenta de que TrkB comprende cinco residuos de tirosina (en la posición 516, 701, 705, 706 y 816 de SEQ ID No: 9), que normalmente se fosforilan después de la dimerización y autofosforilación en presencia de un dímero de BDNF. Un problema con la fosforilación de estos cinco residuos de tirosina es que el receptor puede desactivarse fácilmente mediante una fosfatasa, como la fosfatasa Shp-2. En consecuencia, para prevenir la fosforilación y la desactivación resultante del receptor en vivo, preferentemente una o más de estas tirosinas clave se mutan (con mayor preferencia, a ácido glutámico) para imitar la fosfotirosina resultante y producir un receptor que permanece activo en presencia de BDNF, y que no puede ser desactivado por una fosfatasa, tal como la Shp-2 fosfatasa. Dichas formas mutantes de TrkB se dirigen a mejorar la actividad del receptor TrkB que permanece activo durante períodos más prolongados o hasta que el receptor se internaliza.
Las secuencias de ADN y aminoácidos proporcionadas más abajo ilustran las posiciones de estos cinco residuos de tirosina (Y) que se han mutado a cinco residuos de ácido glutámico (E). Se apreciará que 1, 2, 3, 4 o 5 de estos residuos se pueden mutar a ácido glutámico en modalidades de la invención. También se prevén diversas combinaciones de estas mutaciones, por ejemplo, posiciones 516 y 701 únicamente, o posiciones 705, 706 y 816 únicamente, y así sucesivamente.
En consecuencia, en otra modalidad preferida, la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una forma mutante del receptor TrkB, en donde uno o más residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID No: 9 se modifican o se mutan. Preferentemente, al menos dos, tres o cuatro residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID No: 9 se modifican. Con la máxima preferencia, todos los cinco residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID No: 9 se modifican.
Preferentemente, el o cada residuo de tirosina se modifica a un residuo de aminoácido diferente, con mayor preferencia un ácido glutámico. Por lo tanto, preferentemente la forma mutante del receptor TrkB comprende Y516e , Y701E, Y705E, Y706E y/o Y816E.
Preferentemente, la forma modificada del receptor TrkB comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 13, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDP SPGIVAFPRLEPNSVDPENITE
IFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDL
SELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEE
GKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVN
LTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTK1HVTNHTEYHGCLQLDN
PTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPST
DVTDKTGREHLSVYAVWIASWGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNT
PSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQEFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNL
CPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLR
AHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRD
VESTDEERVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGWLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGR
VLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKG1HTLLQNLAKASPVELDILG
[SEQ ID No: 13]
Preferentemente, en esta modalidad, la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 14, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGG
GCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGA
CCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAA
ATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGT TAGAAATCAT CAACGAAGATGATGT T GAAGCT TATGTGGGAC TGA
GAAAT C T GACAAT T GT GGAT T C T GGAT TAAAAT TTGTGGCTCATAAAGCAT T T C T GAAAAACAGCAAC C T
GCAGCACATCAATTTTACCC GAAACAAACTGACGAGTTTGT C TAGGAAACATTTCCGTCACCTTGAC T T G
TCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAG
AGGC T AAAT C CAGT C CAGACAC T CAGGAT T T GTAC T GC C T GAAT GAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGC
AAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAA
GGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTA
ACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATC
C GAT GACAGT GGGAAGCAGAT CTCTTGTGTGGCGGAAAATC T TGTAGGAGAAGATCAAGATTC TGTCAAC
CTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTC
CATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTC
CAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAAT
CCCACTCACATGAACAATGGGGACTACAC TC TAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGA
TTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTA
T GAAGAT TAT GGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACA
GACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGG
GATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCC
AGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACT
CCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATC
CCCAGGAATTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAA
CATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCC T T TGGAAAAGTGT TCC TAGC TGAATGC TATAACC T C
TGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGG
ACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTG
CGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGG
GCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGC
TGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTT
GGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGAC
GT GGAAAGCAC T GAC GAAGAAAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGA
GCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTT
CACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGA
GTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGC
CCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCGA
AC T GGACATTCTAGGC
[SEQ ID No: 14]
Se apreciará que la segunda secuencia codificante codifica un agonista del receptor TrkB, que es preferentemente un miembro de la familia de factores tróficos de las neurotrofinas. Por lo tanto, los agonistas preferidos del receptor TrkB pueden seleccionarse de un grupo de agonistas que consiste de: El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); factor de crecimiento nervioso (NGF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4); y neurotrofina-5 (NT-5); o fragmentos de los mismos.
El experto en la materia conocerá las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cada uno de estos agonistas. Sin embargo, a manera de ejemplo, la secuencia de aminoácidos de un ejemplo de Neurotropina-4 (NT-4) es sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 49, como sigue:
MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIESQPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRWLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRES
AGAPANRSRRGVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETR
CKADNAE E GGP GAGGGGC RGVD RRHWV S E C KAKQ S YVRAL TADAQGRVGWRWIRID TACVC TLL S RT GRA
[SEQ ID No: 49] La secuencia codificante de ácido nucleico de este ejemplo de Neurotropina-4 (NT-4) es sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 50, como sigue:
ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGT
CCCAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGT
CCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCA
GCAGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGTGGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGC
TGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGA
GGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGC
TGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGA
GGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCG
TGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC
[SEQ ID No: 50]
La secuencia de aminoácidos del péptido señal para la secuencia de NT-4 es sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 51, como sigue:
MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIES [SEQ ID No: 51]
La secuencia de ácido nucleico de este péptido señal es sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 52, como sigue:
ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGT
CC
[SEQ ID No: 52]
La secuencia de aminoácidos del propéptido para esta secuencia de NT-4 es sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 53, como sigue:
QPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRR [SEQ ID No: 53]
La secuencia de ácido nucleico de este propéptido es sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 54, como sigue:
CAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCC
TGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGC
AGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGT
[SEQ ID No: 54]
La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la proteína madura para esta secuencia de NT-4 es sustancialmente como se expone en la SEQ ID NO. 55, como sigue:
GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGG
PGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA
[SEQ ID No: 55]
La secuencia de ácido nucleico codificante de esta proteína NT-4 madura es sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 56, como sigue:
GGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGG
TGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGC
TGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGC
CCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGC
AGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACAC
TGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC
[SEQ ID No: 56]
En consecuencia, en un ejemplo preferido, la segunda secuencia codificante codifica una neurotrofina-4 (NT-4), que puede comprender una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO: 49 o 55, o un fragmento o variante de las mismas. Por tanto, la segunda secuencia codificante puede comprender una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 50 o 56, o un fragmento o variante de las mismas.
Los agonistas más preferidos del receptor TrkB, sin embargo, incluyen la forma prepro del factor neurotrófico derivado del cerebro (pre-pro-BDNF), pro-BDNF o BDNF maduro (mBDNF). El BDNF se sintetiza inicialmente como la proteína precursora, preproBDNF, por los ribosomas que se encuentran en el retículo endoplásmico. Hay al menos 17 variantes de corte y empalme conocidas codificadas por el gen preproBDNF humano (ENSG00000176697). Una vez que preproBDNF ha entrado en el retículo endoplásmico rugoso, preproBDNF se convierte en proBDNF por escisión del péptido señal (es decir, la secuencia "pre"). proBDNF se convierte en mBDNF por escisión de una secuencia peptídica N-terminal adicional que está presente en proBDNF. Luego, tanto el proBDNF como el mBDNF se secretan en el espacio extracelular, donde se unen y activan receptores en varias células, incluidas las CGR y las células cocleares.
proBDNF se une preferentemente al receptor y lo activa, p75NTR, que, cuando se activa, induce la apoptosis en las CGR y las células cocleares. Por lo tanto, en un ejemplo preferido, proBDNF es un agonista del receptor p75NTR. En un ejemplo, proBDNF es el proBDNF canónico. Preferentemente, el proBDNF canónico comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como s Eq ID NO. 15, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDAD
LYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVD
MSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGW
RFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[SEQ ID No: 15]
Preferentemente, en este ejemplo, la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 16, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
GC C C C CAT GAAAGAAGCAAACAT C C GAGGACAAGG TGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGA
C T C T GGAGAGC GT GAAT GGGC C CAAGGCAGGT T CAAGAGGC T T GACAT CATTGGCT GACAC T T T C GAACA
CGT GATAGAAGAGC T GT T GGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGAC
TTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGG
AATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCG
AGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGAC
ATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCT
ACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAA
CTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGG
CGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No: l6] En otro ejemplo, el proBDNF es la isoforma 2 de proBDNF, que preferentemente comprende una mutación de valina a metionina (aminoácido subrayado). Preferentemente, la isoforma 2 de proBDNF comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID No . 17, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHMIEELLDEDQKVRPNEENNKDAD
LYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVD
MSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGW
RFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[SEQ ID No: 17]
En una modalidad, sin embargo, el agonista no es proBDNF, o un fragmento o variante del mismo, pero en lugar la segunda secuencia codificante comprende preferentemente una secuencia de nucleótidos que codifica el BDNF maduro. El BDNF maduro (mBDNF) se une preferentemente a TrkB y lo activa, cuando TrkB se activa, promueve la supervivencia de las CGR y/o las células cocleares. Por lo tanto, el BDNF maduro es el agonista de TrkB de máxima preferencia. La construcción de acuerdo con esta descripción es ventajosa porque, a diferencia de otras construcciones genéticas conocidas, la construcción es capaz de producir la proteína BDNF madura, que no se ha plegado incorrectamente.
Por tanto, en una modalidad preferida, la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el BDNF maduro. El mBDNF es común a todas las 17 isoformas codificadas por el gen. Hay 7 secuencias de proteínas diferentes, cinco de las cuales tienen secuencias de señal extendidas a la forma canónica, y una tiene una secuencia de señal canónica, pero una mutación de valina a metionina (que es común para las isoformas 2, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 16). Se cree que la mutación de valina a metionina reduce la liberación de BDNF de la célula.
Preferentemente, el BDNF maduro comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 18, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRG
IDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[SEQ ID No: 18]
Preferentemente, esta modalidad de la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 19, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAG
CAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAA
TGGGCCCAAGGCAGGT TCAAGAGGCT TGACATCATTGGCTGACAC T T TCGAACACGTGATAGAAGAGCTG
TTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGG
TGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCT
AGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTG
TGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGG
TCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAA
TCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACT
ACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAG
ACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No: 19]
En otra modalidad preferida más, el agonista es mBDNF con un péptido señal conjugado a su extremo N-terminal. Como se discute más abajo, el péptido señal puede ser un péptido señal canónico de preproBDNF, o el péptido señal de IL-2, o una secuencia señal nueva de novo creada por los inventores.
Preferentemente, la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal para el agonista del receptor TrkB, y la máxima preferencia es un péptido señal para BDNF. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos codifica el péptido señal canónico para BDNF. Preferentemente, esta modalidad de la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 20, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
MTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 20]
Preferentemente, esta modalidad de la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que se referencia en la presente descripción como SEQ ID NO. 21, o un fragmento o variante de la misma, como se expone más abajo:
ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [SEQ ID No: 21]
Los inventores han creado una serie de péptidos señal extendidos. En ejemplos preferidos, la secuencia de nucleótidos que codifican para un péptido señal de una isoforma para BDNF se selecciona del grupo que consiste en: isoforma 2, 3, 6, 5 y 4. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para cada uno de estos péptidos señal extendidos se exponen más abajo.
Isoforma 2
MFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 22]
ATGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCA
TGAAGGCG
[SEQ ID No: 23] Isoforma 3 y 6
MQSREEEWFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 24]
AT GCAGAGCCGGGAAGAGGAATGGT TCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTT ACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No: 25] Isoforma 5
MLCAISLCARVRKLRSAGRCGKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 26]
ATGCTCTGTGCGATTTCATTGTGTGCTCGCGTTCGCAAGCTCCGTAGTGCAGGAAGGTGCGGGAAGTTCC
ACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGC
G
[SEQ ID No: 27] Isoforma 4
MCGATSFLHECTRLILVTTQNAEFLQKGLQVHTCFGVYPHASVWHDCASQKKGCAVYLHVSVEFNKLIPE
NGFIKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No: 28]
ATGTGTGGAGCCACCAGTTTTCTCCATGAGTGCACAAGGTTAATCCTTGTTACTACTCAGAATGCTGAGT
TTCTACAGAAAGGGTTGCAGGTCCACACATGTTTTGGCGTCTACCCACACGCTTCTGTATGGCATGACTG
TGCATCCCAGAAGAAGGGCTGTGCTGTGTACCTCCACGTTTCAGTGGAATTTAACAAACTGATCCCTGAA
AATGGTTTCATAAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCAT
AC T TC GGT T GCAT GAAGGCG
[SEQ ID No: 29] En consecuencia, en modalidades preferidas, la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de secuencia señal que se referencia en la presente descripción como cualquiera de SEQ ID NO. 23, 25, 27 o 29. Preferentemente, el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como cualquiera de SEQ ID NO. 22, 24, 26 o 28.
Los inventores también han creado varias modalidades de péptidos señal novedosos para el agonista, preferentemente BDNF. Estos péptidos señal aumentan el nivel de basicidad de la sección N-terminal (con la adición de residuos de lisina (K) y arginina (R)) y la región hidrófoba que le procede (con adiciones de residuos de leucina (L)), lo cual aumenta la secreción de BDNF en comparación a los niveles observados con la secuencia señal canónica de tipo silvestre.
a) QTA003P (señal de IL-2)
MYRMQLLSCIALSLALVTNS [SEQ ID No: 30] ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT [SEQ ID No: 31] b) QTA004P
MKRRVMIILFLTMVISYFGCMK [SEQ ID No: 32] ATGAAAAGAAGAGTGATGATCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGAGCG [SEQ ID No: 33]
c) QTA009P (IL-2 modificada)
MRRMQLLLLIALSLALVTNS [SEQ ID No: 34] ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT [SEQ ID No: 35] d) QTA010P
MRRMQLLLLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 36] ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [SEQ ID No: 37] e) QTA0012P
MRILLLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 38] ATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [SEQ ID No: 39]
f) QTA0013P
MRRILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 40] ATGAGAAGAATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [SEQ ID No: 41] g) QTA0014P
MRRFLFLLVISYFGCMKA [SEQ ID No: 42] ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [SEQ ID No: 43]
i) QTA0015P
MRRFLFLLYFGCMKA [SEQ ID No: 44]
ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTTACTTCGGTTGCATGAAGGCG [SEQ ID No: 45]
La Figura 6 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para modalidades preferidas adicionales del péptido señal usadas en la construcción de la invención para estimular la secreción del agonista, preferentemente BDNF. El segundo residuo en el péptido señal es treonina (T) que preferentemente se reemplaza por uno o más residuos básicos, como lisina (K) o arginina (R). El siguiente tramo de residuos en el péptido señal que incluye isoleucina (I), leucina (L), fenilalanina (F) y leucina (L) se reemplazan preferentemente por uno o más residuos hidrófobos.
En consecuencia, en modalidades preferidas, la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de secuencia señal que se referencia en la presente descripción como cualquiera de SEQ ID NO. 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 o 103. Preferentemente, el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos que se referencia en la presente descripción como cualquiera de SEQ ID NO. 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 o 102.
En consecuencia, se apreciará que los inventores han modificado la secuencia del gen BDNF mediante la eliminación de la pro-secuencia, lo que tampoco se había logrado antes, lo que resulta en la generación de un BDNF maduro debidamente plegado, combinado con la introducción de péptidos señal completamente nuevos, que estimulan significativamente la producción y liberación de BDNF por encima de lo que alguna vez se logró con la secuencia endógena.
Preferentemente, la construcción genética comprende secuencias de repetición terminal invertida (ITR) en su extremo izquierdo y/o derecho. Preferentemente, cada ITR está dispuesta en el extremo 5' y/o 3' de la construcción. Una ITR puede ser específica para un serotipo de virus (por ejemplo, AAV o lentivirus) y puede ser cualquier secuencia, siempre que forme un bucle en horquilla en su estructura secundaria.
La secuencia de ADN de un ejemplo (ITR del extremo izquierdo de un plásmido AAV disponible comercialmente) del ITR se representa en la presente descripción como SEQ ID No: 46, como sigue:
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGG
CCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
[SEQ ID NO:46]
La secuencia de ADN de otro ejemplo (ITR del extremo derecho de un plásmido AAV disponible comercialmente) del ITR se representa en la presente descripción como SEQ ID No: 47, como sigue:
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACC
AAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAG
G
[SEQ ID NO:47]
A partir de lo anterior, la persona experta apreciará la secuencia de nucleótidos de una modalidad de la construcción de esta descripción, así como también la secuencia de aminoácidos del transgén codificado. Sin embargo, para evitar dudas, la secuencia codificante de codón optimizado de 2940 pb de secuencia para el receptor TrkB murinopéptido viral-2A-mBDNF contenida dentro del plásmido QTA020P (y el vector QTA020V), se refiere aquí como SEQ ID No: 107, como sigue:
ATGAGCCCATGGCTGAAGTGGCACGGACCAGCAATGGCAAGACTGTGGGGCCTGTGCCTGCTGGTGCTGG GCTTCTGGAGAGCCAGCCTGGCCTGTCCAACCTCCTGCAAGTGTAGCTCCGCCAGGATCTGGTGCACAGA GCCTTCTCCAGGCATCGTGGCCTTTCCCCGCCTGGAGCCTAACAGCGTGGATCCCGAGAATATCACCGAG AT C C T GAT C GC CAAC CAGAAGC GGC T GGAGAT CAT CAAT GAGGAC GAT GT GGAGGC C TAC GT GGGC C T GA GAAACCTGACAATCGTGGACTCCGGCCTGAAGTTCGTGGCCTATAAGGCCTTTCTGAAGAACTCTAATCT GAGGCACAT CAAC T T CAC C C GCAATAAGC T GACAT C T C T GAGCCGGAGACACTTTCGGCACCTGGATCTG TCCGACCTGATCCTGACCGGCAATCCATTCACATGCTCTTGTGACATCATGTGGCTGAAGACCCTGCAGG AGACAAAGTCTAGCCCC GATACCCAGGACCTGTACTGTCTGAACGAGTCC T CTAAGAATATGCCTCTGGC CAAC C T GCAGAT C C C TAAT T GT GGAC T GC CAAGC GC C CGGCTGGCCGCACC TAAC C T GACAGT GGAGGAG GGCAAGTCCGTGACACTGTCCTGTTCTGTGGGCGGCGATCCCCTGCCTACCCTGTATTGGGACGTGGGCA ACCTGGTGTCTAAGCACATGAATGAGACCTCCCACACACAGGGCTCTCTGAGAATCACAAATATCAGCTC CGACGATAGCGGCAAGCAGATCTCTTGCGTGGCAGAGAACC TGGTGGGAGAGGATCAGGACAGCGTGAAT CTGACCGTGCACTTCGCCCCCACCATCACATTTCTGGAGTCTCCTACCAGCGATCACCACTGGTGCATCC CCTTCACAGTGCGGGGAAACCCAAAGCCCGCCCTGCAGTGGTTTTACAACGGCGCCATCCTGAATGAGTC CAAGTATATCTGTACCAAGATCCACGTGACCAACCACACAGAGTACCACGGCTGCCTGCAGCTGGATAAT CCCACCCACATGAACAATGGCGAC TACACAC TGAT GGCCAAGAACGAGTATGGCAAGGACGAGAGGCAGA TCAGCGCCCACTTCATGGGCCGCCCTGGAGTGGATTATGAGACCAACCCTAATTACCCAGAGGTGCTGTA T GAGGAC T GGAC CACACCTACCGATATCGGCGACACCACAAACAAGTC TAATGAGATCCCAAGCACAGAT GTGGCCGACCAGTCTAACAGGGAGCACCTGAGCGTGTACGCAGTGGTGGTCATCGCCTCCGTGGTGGGCT TCTGCCTGCTGGTCATGCTGCTGCTGCTGAAGCTGGCCCGCCACTCTAAGTTTGGCATGAAGGGCCCAGC CTCCGTGATCTCTAATGACGATGACAGCGCCAGCCCCCTGCACCACATCAGCAACGGCTCCAATACCCCT TCTAGCTCCGAGGGCGGCCCAGATGCCGT GATCATCGGCATGACAAAGATCCCCGTGATCGAGAACCC TC AGTACTTCGGCATCACCAATTCCCAGCTGAAGCCTGACACATTTGTGCAGCACATCAAGCGGCACAACAT CGTGCTGAAGAGGGAACTGGGAGAGGGAGCCTTCGGCAAGGTGTTTCTGGCCGAGTGCTATAACCTGTGC C CAGAGCAGGATAAGATCCTGGTGGCCGT GAAGAC CC TGAAGGATGCCAGCGACAACGCCCGGAAGGACT TCCACAGAGAGGCCGAGCTGCTGACAAATCTGCAGCACGAGCACATCGTGAAGTTTTACGGCGTGTGCGT GGAGGGCGACCCTCTGATCATGGTGTTCGAGTATATGAAGCACGGCGATCTGAACAAGTTTCTGAGAGCA CAC GGAC CAGAT GCCGTGCTGATGGCAGAGGGAAATCCCCCTACCGAGC TGACACAGTC TCAGATGC TGC ACAT T GCACAGCAGAT T GCAGCAGGAATGGTGTAC C T GGCCAGCCAGCAC T TCGTGCACAGGGAT C T GGC AAC CAGAAACTGCCTGGTGGGAGAGAATCTGCTGGTG AAGATCGGCGAC TTTGGCATGTCCCGGGACGTG TACTCTACCGACTACTATAGAGTGGGCGGCCACACAATGCTGCCCATCAGGTGGATGCCACCCGAGAGCA TCATGTATCGCAAGTTCACCACAGAGTCTGACGTGTGGAGCCTGGGCGTGGTGCTGTGGGAGATCTTTAC CTACGGCAAGCAGCCTTGGTATCAGCTGTCCAACAATGAAGTGATCGAGTGTATTACACAGGGACGCGTG CTGCAGAGGCCACGCACATGCCCCCAGGAGGTGTACGAGCTGATGCTGGGCTGTTGGCAGCGGGAGCCAC ACACCAGAAAGAACATC AAGAGCATCCACACACTGCTGCAGAATCTGGCCAAGGCCTCCCCCGTGTATCT GGACAT C C T GGGCAGC GGAGC TAC TAAC TTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCC T GGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACC CTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGAC TGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAG
CAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAA
GGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAG
AATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No: 107] La secuencia codificante de codón optimizado de 2943 pb de secuencia para el receptor TrkB humano-péptido viral-2A-mBDNF contenida dentro del plásmido QTA029P (y el vector QTA029V), se refieren aquí como SEQ iD No: 108, como sigue:
ATGTCATCTTGGATCCGCTGGCACGGGCCAGCGATGGCCCGATTGTGGGGCTTCTGCTGGCTTGTTGTAG
GCTTCTGGCGCGCGGCGTTCGCGTGTCCGACCTCTTGCAAATGCTCAGCAAGCCGAATTTGGTGCTCAGA
CCCTAGTCCAGGAATTGTTGCATTCCCCCGACTGGAACCAAACTCCGTCGACCCGGAGAATATAACTGAG
ATATTTATTGCAAATCAAAAACGCCTTGAAATCATTAACGAGGATGACGTGGAGGCCTACGTTGGTTTGA
GAAATCTTACTATTGTCGACTCCGGACTTAAATTTGTAGCTCATAAAGCCTTCCTGAAGAACTCTAATCT
GCAGCACATTAATTTCACGAGAAATAAGCTGACCAGCTTGTCCCGGAAGCATTTCCGCCATCTCGACCTG
AGCGAGCTCATACTGGTCGGAAACCCATTTACGTGCTCCTGTGACATCATGTGGATCAAAACTCTGCAAG
AGGCGAAAAGTAGTCCGGATACCCAAGACCTTTACTGTCTTAATGAAAGCTCAAAAAATATCCCGCTGGC
CAACCTGCAGATACCGAACTGCGGACTTCCTAGTGCGAATTTGGCTGCCCCAAATCTTACCGTCGAAGAA
GGCAAATCAATCACGCTTTCTTGTTCTGTAGCTGGAGATCCAGTGCCTAATATGTATTGGGACGTGGGTA
ACCTCGTCTCAAAACATATGAACGAAACGAGCCACACCCAGGGCTCTTTGCGGATAACAAACATC TCC TC
T GAT GAT T C T GGAAAGCAAAT CAGT T GC GTAGC T GAAAAT CTGGTTGGC GAAGAT CAAGAT T CAGT C AAT
CTGACAGTCCATTTCGCCCCAACGATCACCTTTCTGGAGAGCCCAACTAGCGATCACCACTGGTGTATTC
CGTTTACGGTAAAAGGAAATCCAAAACCTGCACTCCAATGGTTTTATAATGGAGCCATCTTGAATGAAAG
CAAATATATCTGTACTAAAATCCATGTGACGAATCACACCGAGTATCACGGGTGTCTTCAATTGGATAAT
CCAAC CCATATGAATAATGGTGATTATACTTTGATAGCGAAGAACGAATAC GGCAAAGACGAAAAGCAAA
TATCCGCACATTTCATGGGTTGGCCTGGCATCGACGACGGTGCGAACCCGAACTACCCAGATGTTATTTA
CGAGGATTATGGGACTGCGGCAAACGACAT TGGCGACACCACAAACCGAAGCAACGAGATACCAAGTAC T
GACGTCACTGACAAAACGGGTCGAGAGCATTTGTCTGTTTACGCCGTTGTTGTTATCGCCTCAGTTGTCG
GATTTTGCCTGTTGGTCATGCTTTTCCTCCTGAAGCTCGCGCGACATTCCAAGTTTGGCATGAAGGGG C
CAGCAAGTGTTATATCCAATGATGATGATAGCGCTTCTCCATTGCACCACATAAGTAACGGCTCAAACAC
GCCGTCATCTAGTGAAGGTGGACCAGACGCGGTCATTATAGGGATGACTAAAATTCCCGTAATCGAAAAC
CCTCAGTACTTCGGCATAACCAACAGTCAGCTTAAACCCGATACTTTCGTGCAGCACATCAAAAGGCACA
ACATAGTCCTCAAGCGCGAACTCGGGGAGGGAGCCTTCGGAAAGGTCTTTCTTGCTGAGTGCTATAATTT
GTGTCCTGAGCAGGATAAAATTCTTGTGGCTGTAAAAACTCTCAAAGATGCTTCCGACAACGCACGGAAG
GATTTTCATCGGGAGGCCGAACTGTTGACGAATTTGCAGCACGAGCATATAGTAAAGTTCTACGGGGTAT
GTGTTGAGGGGGACCCGTTGATTATGGTCTTCGAGTATATGAAGCACGGGGACCTGAACAAATTTTTGCG
CGCCCATGGGCCTGATGCCGTCCTTATGGCAGAAGGGAACCC TCCAACAGAAC TCACCCAGAGTCAGATG
TTGCACATAGCGCAACAGATCGCGGCCGGCATGGTTTACCTGGCCAGTCAACACTTCGTGCATAGAGATC
TTGCCACTCGCAACTGTTTGGTCGGGGAGAACCTTCTGGTTAAGATTGGTGACTTTGGTATGTCACGAGA
TGTGTATTCCACTGACTATTACAGAGTTGGGGGTCATACAATGCTTCCTATTCGGTGGATGCCCCCCGAA
TCCATCATGTACAGAAAGTTCACGACAGAGAGTGATGTT TGG AGT CTCGGCGTGGTGCTCTGGGAAA
TTTTCACATACGGAAAGCAGCCGTGGTATCAACTTAGCAACAATGAGGTGATAGAGTGTATTACACAGGG
TCGGGTGTTGCAGCGCCCTCGAACGTGCCCACAAGAAGTATATGAACTTATGCTCGGGTGCTGGCAAAGA
GAAC CACATAT GAGAAAAAATAT CAAGGGGATACATACAT T GC T T CAGAAC T T GGC CAAGGCAT CAC C C G
TCTACCTCGATATACTGGGCAGCGGAGCTAC TAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGA
GAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCAC
TCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATA
AAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCA
ACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATA
GACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCA
AAAAGAGAAT TGGCTGGC GAT T CATAAGGATAGACAC T T C C T GT GTAT GTACAC T GAC CAT TAAAAGGGG
AAGATAG
[SEQ ID No: 108]
Por lo tanto, en una modalidad de mayor preferencia, la construcción comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 107 o 108, o un fragmento o variante de las mismas.
Los inventores han creado una serie de vectores de expresión recombinante que comprenden la construcción de la invención.
Por lo tanto, de acuerdo con otro ejemplo, se proporciona un vector recombinante que comprende la construcción genética según esta descripción.
El vector recombinante puede ser un vector de AAV recombinante (rAAV). El rAAV puede ser un vector de origen natural o un vector con un serotipo híbrido de AAV. El rAAV puede ser AAV-1, AAV-2, AAV-3A, AAV-3B, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 y AAV-11. Preferentemente, el rAAV es el serotipo-2 de rAAV.
Ventajosamente, el AAV2 recombinante provoca una respuesta inmune mínima en los organismos hospedadores y media la expresión del transgén a largo plazo que puede persistir en la retina durante al menos un año después de la administración del vector.
El término "vector de AAV recombinante (rAAV)" como se usa en la presente descripción significa un ácido nucleico derivado de AAV recombinante que contiene al menos una secuencia de repetición terminal.
Los ejemplos preferidos del vector se muestran en las Figuras 2-5.
Las construcciones y los vectores de expresión descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar trastornos del nervio óptico y trastornos cocleares, y de manera más general para promover la regeneración y supervivencia de nervios.
Por lo tanto, de acuerdo con otro ejemplo, se proporciona la construcción genética, o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción, para su uso como medicamento o en terapia.
De acuerdo con otro ejemplo, se proporciona la construcción genética, o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno del nervio óptico o un trastorno coclear, o para promover la regeneración y/o supervivencia de nervios.
Preferentemente, la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con la invención se usan en una técnica de terapia génica. El agonista codificado por la construcción o el vector activa el TrkB también codificado por la construcción/vector para promover de esta manera la supervivencia de las células ganglionares de la retina (CGR) o las células cocleares.
En una modalidad, el trastorno del nervio óptico que se trata puede ser glaucoma o cualquier otra afección patofisiológica que pueda resultar en la pérdida de las CGR, tales como un traumatismo en la cabeza o la cara o lesiones vasculares, por ejemplo, pérdida parcial o completa del suministro de sangre a las estructuras oculares o regiones del cerebro que reciben información del nervio óptico. Además, la construcción también puede usarse para apoyar el reemplazo de las CGR a través de la introducción de células madre transformadas o no transformadas en el ojo o regiones asociadas con la visión en pacientes.
En un ejemplo, el trastorno coclear que se trata puede ser pérdida de la audición o sordera. Las construcciones y vectores de esta descripción mejoran significativamente la sensibilidad de las células cocleares a los agonistas del receptor TrkB debido a un aumento localizado tanto del receptor TrkB como del agonista del receptor. Las células cocleares pueden ser células ciliadas o células ganglionares espirales neuronales que envían señales auditivas a través de sus axones desde el oído hasta el tallo cerebral. Las células ciliadas pueden ser células ciliadas del oído interno o células ciliadas del oído externo [42, 43, 44].
En otra modalidad, las construcciones y los vectores pueden usarse para promover la regeneración y/o la supervivencia de nervios.
Se apreciará que la construcción genética, o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción puede usarse en un medicamento, que puede usarse como monoterapia (es decir, el uso de la construcción genética o el vector de acuerdo con esta descripción), para tratar, mejorar o prevenir un trastorno del nervio óptico o un trastorno coclear, o para promover la regeneración y/o supervivencia de nervios. Alternativamente, la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción puede usarse como un complemento de, o en combinación con, terapias conocidas para tratar, mejorar o prevenir un trastorno del nervio óptico o un trastorno coclear, o para promover la regeneración y/o supervivencia de nervios.
La construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción se pueden combinar en composiciones que tienen un número diferente de formas, en dependencia, en particular, de la manera en la que se va a usar la composición. Por lo tanto, por ejemplo, la composición puede estar en forma de polvo, comprimido, cápsula, líquido, pomada, crema, gel, hidrogel, aerosol, atomizador, solución micelar, parche transdérmico, suspensión de liposomas o cualquier otra forma adecuada que se pueda administrar a una persona o animal que necesite tratamiento. Se apreciará que el vehículo de medicamentos de acuerdo con esta descripción debe ser uno que sea bien tolerado por el sujeto a quien se administra.
La construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción también se puede incorporar dentro de un dispositivo de liberación lenta o retardada. Tales dispositivos se pueden, por ejemplo, insertar sobre o debajo de la piel y el medicamento puede liberarse durante semanas o incluso meses. El dispositivo se puede ubicar al menos en una región adyacente al sitio de tratamiento. Tales dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se requiere un tratamiento a largo plazo con la construcción genética o el vector recombinante y que normalmente requerirían una administración frecuente (por ejemplo, al menos una inyección diaria).
En un ejemplo preferido, los medicamentos de acuerdo con esta descripción se pueden administrar a un sujeto mediante inyección en el torrente sanguíneo o directamente en un sitio que requiera tratamiento. Por ejemplo, el medicamento se puede inyectar al menos en una región adyacente a la retina o al oído. Las inyecciones pueden ser intravenosas (bolo o infusión) o subcutáneas (bolo o infusión) o intradérmicas (bolo o infusión).
Se apreciará que la cantidad de la construcción genética o el vector recombinante que se requiere está determinada por su actividad biológica y biodisponibilidad, que a su vez depende del modo de administración, las propiedades fisicoquímicas de la construcción genética o el vector recombinante y si se usa como monoterapia o en una terapia combinada. La vida media de los polipéptidos cíclicos dentro del sujeto que se trata influye también en la frecuencia de administración. Los expertos en la técnica pueden determinar las dosis óptimas a administrar, y variarán con la construcción genética o vector recombinante particular en uso, la concentración de la composición farmacéutica, el modo de administración y el avance del trastorno del nervio óptico o el trastorno coclear. Los factores adicionales en dependencia del sujeto particular que se trata, que incluyen la edad del sujeto, el peso, el género, la dieta, y el tiempo de administración, resultarán en una necesidad de ajustar las dosis.
Generalmente, se puede usar una dosis diaria de entre 0,001 pg/kg de peso corporal y 10 mg/kg de peso corporal, o entre 0,01 pg/kg de peso corporal y 1 mg/kg de peso corporal del polipéptido cíclico de acuerdo con esta descripción, que puede usarse para tratar, mejorar o prevenir un trastorno del nervio óptico o un trastorno coclear, en dependencia de la construcción genética o vector recombinante que se usa.
La construcción genética o el vector recombinante se pueden administrar antes, durante o después del inicio del trastorno del nervio óptico o coclear. Las dosis diarias se pueden administrar como una sola administración (por ejemplo, una sola inyección o inhalación de una atomización nasal al día). Alternativamente, se puede requerir la administración de dos o más veces durante un día de la construcción genética o el vector recombinante. Como ejemplo, la construcción genética o el vector recombinante se pueden administrar como dos (o más en dependencia de la gravedad del nervio óptico o trastorno coclear que se trata) dosis diarias de entre 0,07 pg y 700 mg (es decir, al asumir un peso corporal de 70 kg). Un paciente que recibe tratamiento puede tomar una primera dosis al despertar y luego una segunda dosis por la noche (si está en un régimen de dos dosis) o en intervalos de 3 o 4 horas a partir de entonces. Alternativamente, puede usarse un dispositivo de liberación lenta para proporcionar dosis óptimas de la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción a un paciente sin la necesidad de administrar dosis repetidas.
Procedimientos conocidos, tal como los empleados convencionalmente por la industria farmacéutica (por ejemplo, experimentación in vivo, ensayos clínicos, etc.), pueden usarse para formar formulaciones específicas de la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción y regímenes terapéuticos precisos (tales como dosis diarias de los agentes y la frecuencia de administración). Los inventores creen que son los primeros en sugerir una construcción genética que codifica un promotor unido operativamente a secuencias codificantes de un receptor TrkB y un agonista del receptor TrkB.
De acuerdo con otro ejemplo, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con otro ejemplo, se proporciona un método para preparar la composición farmacéutica de acuerdo con esta descripción, el método comprende poner en contacto la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un "sujeto" puede ser un vertebrado, un mamífero o un animal doméstico. Por lo tanto, las composiciones y los medicamentos de acuerdo con esta descripción pueden usarse para tratar cualquier mamífero, por ejemplo ganado (por ejemplo, un caballo), mascotas o pueden usarse en otras aplicaciones veterinarias. Sin embargo, con la máxima preferencia, el sujeto es un ser humano.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de la construcción genética, el vector recombinante o la composición farmacéutica es cualquier cantidad que, cuando se administra a un sujeto, es la cantidad mencionada anteriormente que se necesita para tratar el glaucoma, la sordera o producir el efecto deseado, tal como promover la regeneración y/o supervivencia de nervios.
Por ejemplo, la cantidad terapéuticamente efectiva de la construcción genética, el vector recombinante o la composición farmacéutica usada puede ser de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 800 mg, y preferentemente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg. Se prefiere que la cantidad de la construcción genética, el vector recombinante o la composición farmacéutica sea una cantidad de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 250 mg, y de máxima preferencia de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se referencia en la presente descripción, es cualquier compuesto conocido o combinación de compuestos conocidos que los expertos en la técnica conocen por ser útil en la formulación de composiciones farmacéuticas.
En un ejemplo, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser un sólido, y la composición puede estar en forma de polvo o comprimido. Un vehículo sólido farmacéuticamente aceptable puede incluir una o más sustancias que también pueden actuar como agentes saborizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, colorantes, rellenos, deslizantes, coadyuvantes de compresión, aglutinantes inertes, edulcorantes, conservantes, revestimientos, o agentes desintegradores de comprimidos. El vehículo también puede ser un material encapsulante. En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que se mezcla con los agentes activos finamente divididos de acuerdo con esta descripción. En comprimidos, el agente activo (por ejemplo, la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción) se puede mezclar con un vehículo que tenga las propiedades de compresión necesarias en proporciones adecuadas y compactarse en la forma y tamaño deseados. Los polvos y comprimidos contienen preferentemente hasta un 99 % de los agentes activos. Los vehículos sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico. En otro ejemplo, el vehículo farmacéutico puede ser un gel y la composición puede estar en forma de crema o similar.
Sin embargo, el vehículo farmacéutico puede ser un líquido, y la composición farmacéutica tiene forma de una solución. Los vehículos líquidos son usados para preparar soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. La construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con esta descripción se puede disolver o suspender en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable tal como agua, un solvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, amortiguadores, conservantes, edulcorantes, agentes saborizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, reguladores de viscosidad, estabilizadores u osmorreguladores. Los ejemplos de vehículos líquidos adecuados para administración oral y parenteral incluyen agua (que contiene parcialmente aditivos como los mencionados anteriormente, por ejemplo, derivados de celulosa, preferentemente solución de carboximetilcelulosa de sodio), alcoholes (incluidos alcoholes monohídricos y alcoholes polihídricos, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de cacahuete). Para la administración parenteral, el vehículo puede ser un éster oleoso tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos líquidos estériles se usan en las composiciones en forma líquida estériles para administración parenteral. El vehículo líquido para las composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas líquidas, que son soluciones o suspensiones estériles, se pueden utilizar, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa y particularmente subcutánea. La construcción genética o vector recombinante se puede preparar como una composición sólida estéril que se puede disolver o suspender en el momento de la administración mediante el uso de agua estéril, solución salina u otro medio inyectable estéril apropiado.
La construcción genética, el vector recombinante y la composición farmacéutica de esta descripción se pueden administrar por vía oral en forma de una solución o suspensión estéril que contiene otros solutos o agentes en suspensión (por ejemplo, suficiente solución salina o glucosa para fabricar una solución isotónica), sales biliares, goma arábiga, gelatina, monoleato de sorbitán, polisorbato 80 (ésteres oleato de sorbitol y sus anhídridos copolimerizados con óxido de etileno) y similares. La construcción genética, el vector recombinante o la composición farmacéutica de acuerdo con esta descripción también se puede administrar por vía oral en forma de una composición líquida o sólida. Las composiciones adecuadas para la administración oral incluyen formas sólidas, tales como píldoras, cápsulas, grageas, comprimidos y polvos, y formas líquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires y suspensiones. Las formas útiles para la administración parenteral incluyen soluciones, emulsiones y suspensiones estériles.
Se apreciará que esta descripción se extiende a cualquier ácido nucleico o péptido o variante, derivado o análogo del mismo, que comprende sustancialmente las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de cualquiera de las secuencias que se referencian en la presente descripción, que incluye variantes o fragmentos de las mismas. Los términos "sustancialmente la secuencia de aminoácidos/nucleótidos/péptidos", "variante" y "fragmento", puede ser una secuencia que tiene al menos un 40 % de identidad con las secuencias de aminoácidos/nucleótidos/péptidos de cualquiera de las secuencias que se referencian en la presente descripción, por ejemplo, 40 % de identidad con la secuencia identificada como SEQ ID No. 1-108, y así sucesivamente.
Las secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos con una identidad de secuencia superior al 65 %, con mayor preferencia superior al 70 %, y aún con mayor preferencia superior al 75 %, y aún con mayor preferencia superior al 80 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias referenciadas también se prevén. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos tiene al menos un 85 % de identidad con cualquiera de las secuencias referenciadas, con mayor preferencia al menos 90 % de identidad, aún con mayor preferencia al menos 92 % de identidad, aún con mayor preferencia 95 % de identidad, aún con mayor preferencia al menos 97 % de identidad, aún con mayor preferencia al menos 98 % de identidad y, con la máxima preferencia al menos 99 % de identidad con cualquiera de las secuencias referenciadas en la presente descripción.
El técnico experto apreciará como calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos. Para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos, primero debe prepararse un alineamiento de las dos secuencias, seguido del cálculo del valor de identidad de la secuencia. El porcentaje de identidad para dos secuencias puede tomar diferentes valores en dependencia de:-(i) el método usado para alinear las secuencias, por ejemplo, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman (implementado en diferentes programas), o alineación estructural a partir de la comparación 3D; y (ii) los parámetros usados por el método de alineación, por ejemplo, local vs alineación global, la matriz de puntuación de pares usada (por ejemplo, BLOSUM62, PAM250, Gonnet, etc.), y penalización por huecos, por ejemplo, forma funcional y constantes.
Una vez realizada la alineación, hay muchas formas diferentes de calcular el porcentaje de identidad entre las dos secuencias. Por ejemplo, se puede dividir el número de identidades por: (i) la longitud de la secuencia más corta; (ii) la longitud de la alineación; (iii) la longitud media de la secuencia; (iv) el número de posiciones sin huecos; o (iv) el número de posiciones equivalentes excluyendo las salientes. Además, se apreciará que el porcentaje de identidad también es dependiente en gran medida de la longitud. Por lo tanto, cuanto más cortas sean un par de secuencias, mayor será la identidad de secuencia que se espera pueda ocurrir por casualidad.
Por lo tanto, se apreciará que la alineación precisa de secuencias de proteínas o ADN es un proceso complejo. El popular programa de alineación múltiple ClustalW (Thompson y otros., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673­ 4680.; Thompson y otros., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882) es una forma preferida para generar múltiples alineamientos de proteínas o ADN de acuerdo con esta descripción. Los parámetros adecuados para ClustalW pueden ser los siguientes: Para alineaciones de ADN: Penalización por huecos abierta = 15,0, Penalización de extensión de huecos = 6,66 y Matriz = Identidad. Para alineaciones de proteínas: Penalización por huecos abierta = 10,0, Penalización de extensión de huecos = 0,2 y Matriz = Gonnet. Para alineaciones de ADN y proteínas: ENDGAP = -1 y GAPDIST = 4. Los expertos en la técnica serán conscientes que puede ser necesario variar estos y otros parámetros para una alineación de secuencia óptima.
Preferentemente, el cálculo de porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos puede calcularse a partir de una alineación tal como (N/T)* 100, donde N es el número de posiciones en las que las secuencias comparten un residuo idéntico, y T es el número total de posiciones comparadas, incluidos los huecos, pero excluidos los salientes. Por lo tanto, un método más preferido para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias comprende (i) preparar una alineación de secuencia mediante el uso del programa ClustalW mediante el uso de un conjunto adecuado de parámetros, por ejemplo, como se expuso anteriormente; e (ii) insertar los valores de N y T en la siguiente fórmula:-Secuencia de identidad = (N/T)*100.
Los expertos en la técnica conocerán métodos alternativos para identificar secuencias similares. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar se codificará por una secuencia que se hibrida con secuencias de ADN o sus complementos en condiciones estrictas. Por condiciones estrictas, se entiende que el nucleótido se hibrida con ADN o ARN unido al filtro en 3x de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C seguido de al menos un lavado en 0,2x SSC/0,1 % SDS a aproximadamente 20-65 °C. Alternativamente, un polipéptido sustancialmente similar puede diferir en al menos 1, pero menos de 5, 10, 20, 50 o 100 aminoácidos de las secuencias mostradas en, por ejemplo las SEQ ID Nos: 3 y 5.
Debido a la redundancia del código genético, está claro que cualquier secuencia de ácido nucleico descrita en la presente descripción podría variarse o cambiarse sin afectar sustancialmente la secuencia de la proteína codificada de esta manera, para proporcionar una variante de la misma. Las variantes de nucleótidos adecuadas son aquellas que tienen una secuencia alterada por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo aminoácido dentro de la secuencia, por lo tanto se produce un cambio silencioso. Otras variantes adecuadas son aquellas que tienen secuencias de nucleótidos homólogas pero que comprenden toda o porciones de la secuencia, que se alteran mediante la sustitución de diferentes codones que codifican un aminoácido con una cadena lateral de propiedades biofísicas similares al aminoácido que sustituye, para producir un cambio conservador. Ejemplos de aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina y metionina. Los aminoácidos hidrófobos no polares grandes incluyen fenilalanina, triptófano y tirosina. Ejemplos de aminoácidos polares neutros incluyen, serina, treonina, cisteína, asparagina y glutamina. Ejemplos de aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen lisina, arginina e histidina. Ejemplos de aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Por lo tanto, se apreciará cuáles aminoácidos se pueden reemplazar con un aminoácido que tenga propiedades biofísicas similares, y el técnico experto conocerá las secuencias de nucleótidos que codifican estos aminoácidos.
De acuerdo con otro ejemplo, se proporciona una construcción genética que comprende un promotor operativamente ligado a una primera secuencia codificante, que codifica el receptor tirosina quinasa B (TrkB), y una segunda secuencia codificante, que codifica un agonista del receptor TrkB para activar el TrkB para promover de esta manera la supervivencia de las células ganglionares de la retina (CGR), células nerviosas o células cocleares.
Todas las características descritas en la presente descripción (que incluye cualquier reivindicación anexa, resumen y dibujos), y/o todas las etapas de cualquier método o proceso así descrito, se pueden combinar con cualquiera de los aspectos anteriormente mencionados en cualquier combinación, excepto combinaciones donde al menos alguna de tales características y/o etapas son mutuamente exclusivas.
Para una mejor comprensión de la invención y para mostrar cómo pueden llevarse a cabo modalidades de la misma, se hará ahora referencia, a manera de ejemplo, a las figuras anexas, en la que:-
la Figura 1 es un esquema de una modalidad de una construcción genética de acuerdo con la invención;
la Figura 2 es un dibujo esquemático de una primera modalidad de un vector recombinante de acuerdo con la invención conocido como "Plásmido QTA001PÁ' que contiene la secuencia señal canónica (azul) más proBDNF (rojo) y mBDNF (negro). También incluye una secuencia -IRES-GFP-(turquesa y violeta);
la Figura 3 es un dibujo esquemático de una segunda modalidad del vector recombinante de acuerdo con la invención conocido como "Plásmido QTA002P" sin proBDNF (pero produce solamente mBDNF) y la misma secuencia señal (azul) que en QTA001PA. También incluye una secuencia -IRES-GFP-(turquesa y violeta);
la Figura 4 es un dibujo esquemático de una tercera modalidad del vector recombinante de acuerdo con la invención conocido como "Plásmido QTA003P" sin proBDNF (pero produce solamente mBDNF) y la secuencia señal de IL-2 (azul). También incluye una secuencia -IRES-GFP-(turquesa y violeta);
la Figura 5 es un dibujo esquemático de una cuarta modalidad de un vector recombinante de acuerdo con la invención conocido como "Plásmido QTA004P" sin proBDNF (pero produce solamente mBDNF) y una secuencia señal novedosa (azul). También incluye una secuencia -IRES-GFP-(turquesa y violeta);
la Figura 6 muestra secuencias de nucleótidos y aminoácidos del péptido señal usado en la construcción de la invención para diferentes modalidades. El segundo residuo es treonina (t) que se puede reemplazar por uno o más residuos básicos, tales como lisina (K) o arginina (R). El siguiente tramo de residuos que incluye isoleucina (I), leucina (L), fenilalanina (F) y leucina (L) se puede reemplazar por uno o más residuos hidrófobos;
la Figura 7 muestra la liberación de BDNF de las células HEK293 mediante el uso de un ELISA específico a las 24 horas después de la transducción de un plásmido (4 |jg de ADN/pocillo) que contiene genes que codifican para mBDNF con diferentes secuencias de péptidos señal y sin la secuencia codificante del componente proBDNF extendido (los datos se muestran como la media ± SEM para n = 4);
la Figura 8 muestra los resultados de la transferencia Western de las concentraciones celulares del material inmunorreactivo de BDNF (unidades arbitrarias) en lisados de células HEK29324 horas después de la transducción del plásmido (datos mostrados como la media ± SEM para n = 4);
la Figura 9 muestra la inmunorreactividad de BDNF en transferencias Western de lisados celulares que muestran dos bandas de peso molecular (32 kDa y 14 kDa) cuando las células se transdujeron con QTA001PA, frente a una única banda de 14 kDa con transducción de QTA002P, QTA003P y QTA004P;
la Figura 10 muestra las concentraciones de proBDNF en el medio de incubación de las células HEK293 medidas mediante el uso de un ELISA específico 24 horas después de la transducción del plásmido mediante el uso de un ELISA selectivo para proBDNF (datos mostrados como la media ± SEM para n = 4);
la Figura 11 muestra la expresión de BDNF por los plásmidos QTA002P (secuencia de péptido señal canónica endógena) y QTA009P a QTA013P en el lisado de células HEK293. Los datos se muestran como la media SEM ** P <0,01 en comparación con QTA002P;
la Figura 12 muestra la expresión de BDNF por los plásmidos QTA002P (secuencia de péptido señal canónica endógena) y QTA009P a QTA013P en el medio de incubación de células HEK293. Los datos se muestran como la media SEM ** P <0,01 en comparación con QTA002P;
la Figura 13 muestra las transferencias Western de células HEK29324 horas después de su transducción con los plásmidos QTA012P (que expresa BDNF y eGFP separados por un espaciador IRES), QTA021P (que expresa BDNF seguido por eGFP separados por una secuencia funcional del péptido viral-2A), QTA022P (que expresa BDNF seguido por eGFP separados por una secuencia del péptido viral-2A no funcional) y QTA023P (que expresa eGFP seguido por BDNF separados por una secuencia de péptido funcional viral-2A). Los datos se muestran como inmunorreactividad de BDNF (A), inmunorreactividad de eGFP (B) y la cantidad de BDNF liberada de las células HEK293 en el medio de incubación (C). Los datos se muestran como la media SEM de la densidad en las bandas; la Figura 14A muestra una transferencia Western de homogeneizados de células HEK29348 horas después de la transfección con el vector QTA020V y muestra un procesamiento eficiente de la región codificante del precursor grande que incluye el receptor TrkB y el BDNF separados por la secuencia del péptido viral-2A. las Figuras 14B y 14C muestran que las proteínas transgénicas producidas después de la escisión del péptido viral-2A se han transportado a los compartimentos intracelulares correctos en las células HEK293 después del procesamiento (receptores TrkB a la superficie celular y BDNF a las vesículas de almacenamiento antes de la liberación);
la Figura 15A muestra la expresión del receptor TrkB y la Figura 15B muestra la expresión de BDNF por el vector rAAV2, QTA020V, en homogeneizado de retina de ratón. Los datos se muestran como la media SEM de la densidad de las bandas resultantes de la transferencia Western de homogeneizados de retina de ratón. ** P <0,01 en comparación con los no tratados (animales no inyectados);
la Figura 16 muestra la expresión de los transgenes TrkB (A) y BDNF (B) en la capa de células ganglionares de la retina de ratón como se muestra por inmunocitoquímica después de la inyección de QTA020V, un vector rAAV2 que contiene la codificación del receptor TrkB y BDNF, separados por la secuencia del péptido viral-2A; y
la Figura 17 muestra la supervivencia de las células ganglionares de la retina (CGR) después del aplastamiento del nervio óptico (ONC) en el ratón en comparación con los animales control tratados con el vector rAAV2-CAG-eGFP. Los datos se muestran como la media SEM para el promedio de células ganglionares de la retina a lo largo de la retina por animal, contadas mediante la expresión positiva para Brn3A en montajes planos de la retina. *** P <0,001, * P <0,05 en comparación con los controles.
EJEMPLOS
Material y métodos
Clonación molecular y construcción de plásmidos
La optimización de codones de las secuencias de ADN se realizó mediante el uso de la herramienta en línea (http: //www.idtdna.com/CodonOpt) y los bloques de ADN se sintetizaron por Integrated DNA technologies, Inc. (IDT; 9180 N. McCrmick Boulevard, Skokie, IL 60076-2920, EE. UU.) o GenScript (860 Centennial Ave, Piscataway, NJ 08854, EE. UU.). La clonación para producir el plásmido maestro QTA001PA y los plásmidos subsecuentes se realizaron mediante el uso de biología molecular estándar y técnicas de clonación.
Escalado y purificación de plásmidos
Los plásmidos de ADN se multiplicaron en células competentes SURE (Agilent Technologies; cat. # 200238) durante toda la noche para proporcionar 2,29 pg/pl de plásmido después de la purificación maxi-prep. Los plásmidos restantes se multiplicaron a una escala de 500 pg y una calidad de transducción con una presencia mínima de endotoxina.
Cultivo HEK293 y transducción celular con ADN plasmídico
Se cultivaron células HEK293 (400 000 células) en placas de 6 pocillos recubiertas con poli-L-lisina (10 ug/ml, Sigma-Aldrich; cat. # P1274) en 1,5 ml de medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS), penicilina al 1 % y estreptomicina al 1 % (Pen/Strep al 1 %) hasta una confluencia del 80 %. Luego, el medio se cambió por 2 ml de DMEM (sin aditivos). Dos o tres horas más tarde, un volumen adicional de 0,5 ml de medio de transfección que contenía 4 pg de ADN plasmídico más 10 pl de lipofectamina (4 pl/ml; Thermo Fisher Scientific; cat. #12566014) se adicionó a cada pocillo, lo que dio como resultado un volumen total de 2,5 ml a lo largo del período de transfección y para la colecta del sobrenadante.
Medición de BDNF por ELISA
La cantidad de BDNF secretada por las células HEK293 se midió en el medio de cultivo celular 24 horas después de la transfección. El medio se centrifugó para eliminar los restos celulares y se midió mediante el uso de un kit ELISA comercial para BDNF humano (Sigma-Aldrich, producto # RAB0026). La concentración de BDNF se determinó al comparar las muestras con estándares de BDNF recién preparados.
Transferencia Western para receptores TrkB y BDNF.
La cantidad de inmunorreactividad del BDNF y TrkB dentro de las células HEK293 se midió al retirar el medio de incubación DMEM, al lavar las células con una solución salina fría amortiguada con fosfatos y al adicionar a los pocillos 350 |jl del amortiguador de lisis recién preparado (10 ml del reactivo lisis-M 1 comprimido de un mini cóctel completo de inhibidores de proteasas, Roche; cat. #04719964001 100 j l del cócte1Halt de inhibidores de fosfatasas (100X), Thermo Scientific; cat. #78428). Después de la homogeneización celular, la suspensión de proteínas se cuantificó mediante el uso del ensayo BCA (kit de ensayo de proteínas Pierce BCA, Thermo Scientific; cat. #23227). Entre 6 jg y 15 jg de proteína del lisado de células HEK293/carril se pasaron por un gel Bis-Tris (12 % NuPAGE Novex; cat. #NP0342BOX, Thermo Scientific) y se examinaron mediante transferencia Western mediante el uso de anticuerpos primarios policlonales anti-BDNF de conejo (Santa Cruz Biotechnology Inc; producto #sc-546; a una dilución 1:500), anticuerpos policlonales anti-TrkB de conejo (Abcam; cat. #Ab33655, usado a una dilución 1:2000) o anticuerpos eGFP (Abcam producto #ab-290 usado a 1:500), los cuales se incubaron durante toda la noche. Los anticuerpos primarios se visualizaron con anticuerpos anticonejo conjugados a HRP (Vector Laboratories; cat. #PI-1000, a 1:8000) y la detección de la señal mediante el uso de eCl Prime (Amersham, GE Healthcare, Reino Unido) y un sistema de obtención de imágenes de transferencia Western Alliance (UVItec Ltd, Cambridge, Reino Unido). Para las transferencias Western de la retina de ratón, los ojos de los animales tratados con el vector se homogeneizaron en 500 j l del amortiguador de lisis recién preparado (10 ml del reactivo lisis-M 1 comprimido de un mini cóctel completo de inhibidores de proteasas, Roche; producto #04719964001 100 j l del cóctel Halt de inhibidores de fosfatasas (100X), Thermo Scientific; cat. #78428). El tejido se rompió durante 1 minuto (Qiagen, producto TissueRuptor #9001273) y luego se mantuvo en hielo durante 15 minutos adicionales. La proteína se analizó mediante transferencia Western como se describió anteriormente.
Inmunocitoquímica
Se sembraron células HEK293 (70000) en cubreobjetos de 13 mm recubiertos con poli-L-lisina dentro de placas de 4 pocillos y se incubaron en DMEM que contenía f Bs al 10 % y Pen/Strep al 1 % en 0,5 ml de medio. Una vez que las células habían crecido hasta un 80 % de confluencia, el medio se cambió por 0,4 ml de DMEM (sin aditivos) durante 2-3 horas y luego un volumen adicional de 0,1 ml de medio de transfección (0,8 jg de ADN plasmídico 2 j l de lipofectamina) se adicionó, así que el volumen final alcanzó los 0,5 ml. Los cubreobjetos se lavaron dos veces en PBS y se fijaron durante 30 min en paraformaldehído al 4 % en solución salina amortiguada con fosfatos (PBS) 1 M a temperatura ambiente. Después de tres lavados más en PBS, las células se bloquearon y se permeabilizaron por incubación en suero de cabra normal (NGS) al 5 %, albúmina de suero bovino (BSA) al 3 % y Triton X-100 al 0,3 % en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se incubaron durante toda la noche a 4 °C con anticuerpos policlonales de conejo comerciales para BDNF (Santa Cruz Biotechnology Inc; producto #sc-546; a una dilución de 1:300) o TrkB (Abcam, producto #ab33655, diluido 1:500) diluidos en la solución de bloqueo. La tinción se reveló mediante el uso de anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados a alexa fluor 647 (Invitrogen, producto #A21248 a 1:1000) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los núcleos celulares también se contratiñeron con 1 jg/ml de DAPI (Thermo Scientific, producto #D1306 a 1:8000). Las células se lavaron adicionalmente tres veces antes de montarlas con el reactivo fluorSave™ (Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, EE.UU.) antes de la obtención de imágenes. La obtención de imágenes se realizó mediante el uso de un objetivo de 20X y un microscopio de epifluorescencia Leica DM6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) o un microscopio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) equipado con un objetivo de aceite de 63X que usa un zoom digital de 3X y un intervalo de pasos en Z de exploración secuencial de 0,5-0,8.
Para la inmunocitoquímica de las estructuras de la retina de animales control o tratados con el vector, los ojos cuidadosamente disecados se fijaron en paraformaldehído al 4 %/PBS al 0,1 % (pH 7,4) durante toda la noche y se deshidrataron en sacarosa al 30 %/PBS al 0,1 % a 4 °C (24 horas). A continuación, los ojos se insertaron en moldes de silicona que contenían un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (Sakura Finetek, Zoeterwoude, Países Bajos) y se congelaron en hielo seco. Se colectaron secciones de 13 jm a través del eje dorsalventral/superior-inferior de la retina en portaobjetos superfrost plus (VWR, producto #631-0108), mediante el uso de un criostato Bright OTF 5000 (Bright Instruments, Huntingdon, Reino Unido). Los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS y se permeabilizaron en suero de cabra normal al 5 % (NGS), albúmina de suero bovino al 3 % (BSA) y Triton X-100 al 0,3 % en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron durante toda la noche a 4 °C con anticuerpos policlonales de conejo comerciales para BDNF (Santa Cruz Biotechnology Inc, producto #sc-546, 1:300) o TrkB (Abcam, producto #ab33655, 1: 500), diluidos en solución de bloqueo. La tinción se reveló mediante el uso de anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados a alexa fluor 647 (Invitrogen, producto #A21248 a 1:1000) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los núcleos de las células de la retina también se contratiñeron con 1 |jg/ml de DAPI (Thermo Scientific, producto # D1306, a 1:8000). Los portaobjetos se lavaron adicionalmente tres veces antes de montarlos con el reactivo fluorSave™ (Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, EE. UU.) antes de la obtención de imágenes. La obtención de imágenes se realizó mediante el uso de un objetivo de 20X y un microscopio de epifluorescencia Leica DM6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) o un microscopio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) equipado con un objetivo de aceite de 63X que usa un zoom digital de 3X y un intervalo de pasos en z de exploración secuencial de 0,5-0,8.
Inyecciones intravítreas
Después de un período de aclimatación de 7-10 días, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en varios grupos de estudio. Luego se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de ketamina (50 mg/kg) y xilacina (5 g/kg). Se administraron gotas oftálmicas de tetracaína tópica al 1 % el día 1 del estudio. La dilatación pupilar se logró mediante el uso de gotas oftálmicas de tropicamida al 1 %. Mediante el uso de un microscopio quirúrgico, se hizo un orificio piloto escleral de espesor parcial con una aguja de calibre 30 para facilitar la penetración de la esclerótica, la coroides y la retina mediante una micropipeta de metal fino con un diámetro de la punta de 30 jm y una longitud de la punta de 2,5 mm. La micropipeta se conectó luego a una jeringa de vidrio de 10 j l (Hamilton Co., Reno, NV) antes de extraer 2 j l de suspensiones del vector en la pipeta, en dependencia del grupo. Se tuvo cuidado de evitar la penetración del cristalino o daño en las venas del vórtice durante la inyección intravítrea. El lugar de la inyección se dirigió aproximadamente a 3 mm posterior al limbo supero-temporal. Las inyecciones se administraron lentamente durante 1 minuto para permitir la difusión de la suspensión del vector. El ojo derecho se dejó intacto y sirvió como control contralateral interno.
Aplastamiento del nervio óptico (ONC)
Tres semanas (21 días) después de la administración del vector, los ratones se sometieron al procedimiento ONC, se dejaron sin tratar o el aplastamiento se simulo. Bajo un endoscopio quirúrgico binocular, se hizo una pequeña incisión con tijeras de resorte en la conjuntiva comenzando por debajo del globo y alrededor del ojo temporalmente. Esto expuso la cara posterior del globo, lo que permite la visualización del nervio óptico. El nervio óptico expuesto se sujetó aproximadamente a 1-3 mm del globo con unas pinzas de acción cruzada (Dumont # N7 cat. #RS-5027; Roboz) durante 10 s, con la única presión de la acción de autofijación para presionar el nervio. Después de 10 s, el nervio óptico se liberó, se retiran las pinzas y el ojo vuelve a girar a su lugar. 7 días después de la ONC, se sacrificaron los animales. Ambos ojos de cada grupo se fijaron colocando el órgano en paraformaldehído al 4 %/PBS al 0,1 % (pH 7,4) durante toda noche. Se prepararon montajes planos de la retina después de la disección de la estructura posterior del ojo de la córnea y la extracción del cristalino. Los montajes planos de la retina se fijaron posteriormente durante 30 minutos en paraformaldehído al 4 %/PBS al 0,1 % y se lavaron en Triton X-100 al 0,5 % en PBS. Las retinas se congelaron a -80 °C durante 10 minutos para permeabilizar la membrana nuclear y mejorar la penetración de los anticuerpos antes de bloquearlas en suero de burro normal (NDS) al 10 %, albúmina de suero bovino (BSA) al 2 % y Triton X-100 al 2 % en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las CGR se contratiñeron con anticuerpos contra Brn3A (Santa Cruz 1:200, #sc-31984) y se visualizaron bajo microscopía de fluorescencia mediante el uso de un objetivo de 20X y un microscopio de epifluorescencia Leica DM6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Se obtuvieron imágenes de alta resolución mediante el uso de un microscopio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems) equipado con un objetivo de aceite de 40X que usa un zoom digital de 1,5X y un intervalo de pasos z de exploración secuencial de 0,5-0,8. Los recuentos de células CGR se midieron por ImageJ mediante el uso de una herramienta basada en imágenes para contar núcleos (ITCN) y se expresaron como densidad de CGR/mm2.
Construcciones y vectores
Los inventores han generado una construcción genética, como se muestra en la Figura 1, que puede usarse para tratar a un sujeto afectado por una patología del nervio óptico, como glaucoma, o una patología coclear, o para promover la regeneración y/o supervivencia de nervios. La construcción se ha diseñado para mantener o aumentar la densidad de los receptores TrkB en la superficie celular de las CGR y mantener o aumentar la señalización a través de la vía del receptor TrkB mediante la producción concomitante y la liberación local de mBDNF.
La construcción comprende transgenes que codifican para el receptor TrkB y su agonista, la forma madura del factor neurotrófico derivado del cerebro. Estos transgenes están unidos operativamente a un solo promotor, que es el promotor de la sinapsina I humana (SYN I) o el promotor CAG. Ventajosamente, la construcción de la Figura 1 se puede colocar en un vector rAAV2 sin verse obstaculizada por el tamaño de los transgenes que codifica. Esto se debe a que la construcción está orientada de manera que el primer transgén, TrkB, se une a la secuencia del péptido viral 2A seguido por el péptido señal del BDNF y luego la proteína madura. Esta orientación también minimiza los riesgos de inmunogenicidad porque la secuencia corta de aminoácidos en el N-terminal del péptido viral 2A permanece unida a la porción intracelular del receptor TrkB y el aminoácido residual prolina de la secuencia 2A viral C-terminal permanece unido al N-terminal del péptido señal de BDNF y finalmente se elimina de la proteína mBDNF después de la escisión. El vector se puede colocar en una solución amortiguada farmacológicamente aceptable, que se puede administrar a un sujeto.
Las Figuras 2-5 muestran diversas modalidades de vectores de expresión. La Figura 2 muestra el vector conocido como "Plásmido QTA001PA" que contiene la secuencia señal canónica (azul) (es decir, MTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID NO: 20]) más proBDNF (rojo) y mBDNF (negro). La Figura 3 muestra el vector conocido como "Plásmido QTA002P". No codifica proBDNF, sino que solamente produce mBDNF y codifica la misma secuencia de señal (azul) que QTA001PA. La Figura 4 muestra el vector conocido como "Plásmido QTA003P" que tampoco codifica proBDNF pero produce solamente mBDNF. En lugar de la secuencia de señal canónica para mBDNF, comprende una secuencia de señal de IL-2 (azul). Finalmente, la Figura 5 muestra el vector conocido como "Plásmido QTA004P". No codifica proBDNF, sino que solamente produce mBDNF. También codifica una secuencia de señal novedosa (azul), [SEQ ID NO: 32].
Los inventores han producido e investigado la construcción y el vector relacionados al concepto de terapia génica del glaucoma al comenzar con el elemento BDNF maduro (mBDNF). Han demostrado claramente la producción y liberación de mBDNF de células HEK293 después de la transducción con un plásmido que contiene la secuencia de BDNF sin la región codificante de proBDNF (QTA002P, ver Figura 3) (ver Figura 7). El mBDNF liberado de las células es el monómero de 14 kDa previsto (medido mediante el uso de transferencia Western y un anticuerpo disponible comercialmente para BDNF) y no hay evidencia de agregados de proteínas, como lo han informado varios grupos que intentan generar cantidades comerciales de mBDNF mediante el uso de levadura y otros enfoques de fabricación basados en células1. Por lo tanto, el mBDNF se libera en una forma que puede permitir que las moléculas de proteína formen dímeros no covalentes para activar los receptores TrkB.
Mediante el uso de un ELISA para BDNF (que no diferencia entre mBDNF y la proteína proBDNF extendida más grande), los inventores también han demostrado que es posible sustituir la secuencia codificante de ADN de la secuencia del péptido señal endógeno canónico de 18 aminoácidos (MTILFLTMVISYFGCMKA) con una secuencia de péptidos novedosa (QTA004P - ver Figura 5) y las HEK293 liberan niveles equivalentes de BDNF al medio de incubación después de la transducción con lipofectamina de las células con plásmidos que contienen el gen BDNF (ver Figura 7).
La sustitución del péptido señal endógeno con la secuencia codificante del péptido señal de interleucina-2 (QTA003P - ver Figura 4) fue menos efectiva en la liberación de BDNF al medio. Los niveles de BDNF liberados al medio están actualmente alrededor de 1-2 nM y las concentraciones de este agonista son suficientes para activar al máximo los receptores TrkB específicos (IC50 de aproximadamente 0,9 nM). Los niveles de liberación de BDNF son aproximadamente 35 veces más altos (876 ± 87 ng/ml de BDNF) con el plásmido QTA001PA (ver Figura 2) que contiene las secuencias combinadas de proBDNF y mBDNF y que también incluye el péptido señal canónico de 18 aminoácidos en comparación a los plásmidos QTA002P (ver Figura 3) y QTA004P (ver Figura 5).
Las mediciones del BDNF que permanece en la célula mediante transferencia Western cuantitativa 24 horas después de la transducción del plásmido con lipofectamina revelaron concentraciones remanentes de BDNF más bajas con QTA001PA que con q Ta 002P y QTA004P (ver Figura 8).
Además, alrededor de la mitad de la inmunorreactividad de BDNF en los lisados celulares transducidos por QTA001PA estaba en forma de proBDNF (banda de peso molecular a 32 kDa), mientras que la banda de proBDNF estaba ausente en los lisados de células transducidas con QTA002P, QTA003P y QTA004P (ver Figura 9), probablemente porque estos plásmidos no contienen una secuencia codificante extendida proBDNF.
Mediante el uso de un ELISA específico para proBDNF, los inventores fueron capaces de demostrar que alrededor de 70 ng/ml (2,2 nM o 3,5 %) de inmunorreactividad de BDNF liberada de las células transducidas por QTA001PA está en forma de proBDNF, mientras que la mayoría (96,5 % o 876 ng/ml / 63nM) se libera como mBDNF (ver Figura 10). No se detectó inmunorreactividad de proBDNF de células transducidas por QTA002P, QTA003P o QTA004P que no contienen la secuencia codificante para el proBDNF extendido.
En consecuencia, está claro que todos los plásmidos son capaces de producir la proteína mBDNF de 14 kDa, pero que las cantidades de mBDNF liberadas por las células HEK293 dependen en gran medida de la eficiencia en el almacenamiento y empaquetamiento de proteínas en vesículas secretoras. Por lo tanto, la forma extendida de la proteína, que contiene las secuencias combinadas de proBDNF y mBDNF, como se produce con el plásmido QTA001PA (Figura 2), se empaqueta en vesículas secretoras y se libera en el medio de incubación de manera mucho más eficiente que con las secuencias más pequeñas de mBDNF que parecen acumularse dentro de la célula. Con referencia a la Figura 11, muestra que la sustitución de la codificación de la secuencia del péptido señal canónico endógeno, como se representa en el plásmido QTA002P, con nuevas secuencias incluidas en los plásmidos QTA009P a QTA013P aumenta la concentración de BDNF en las células HEK29324 horas después de la transducción con plásmidos. La Figura 12 demuestra que la sustitución de la secuencia codificante del péptido señal canónico endógeno incluida en el plásmido QTA002P con secuencias novedosas (plásmidos QTA009P a QTA013P) aumenta la liberación de BDNF (medido por ELISA) por las células HEK293, medido 24 horas después de la transducción con plásmidos.
Como se muestra en la Figura 13, la adición de la secuencia del péptido viral-2A da como resultado un procesamiento eficiente de la secuencia codificante de la proteína precursora grande en dos transgenes, eGFP y BDNF. Las transferencias Western muestran que células HEK293 24 horas después de ser transducidas con plásmidos: (i) QTA012P (que expresa BDNF y eGFP separados por un espaciador IRES), (ii) QTA021P (que expresa BDNF seguido de eGFP separado por una secuencia del péptido viral-2A funcional), (iii) QTA022P (que expresa BDNF seguido de eGFP separado por una secuencia del péptido viral-2A no funcional) y (iv) QTA023P (que expresa eGFP seguida de la codificación para BDNF separada por una secuencia del péptido viral-2A funcional). La secuencia codificante de QTA021P (plásmido que contiene la secuencia optimizada de codones para mBDNF-péptido viral-2A-eGFP) se refiere aquí como SEQ ID No: 104, como sigue:
ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCAC
GCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGT
GGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATAT
TTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACT
GGAATTCCCAGTGCCGGACCAC TCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGAT TCAAAGAAGCGCATCGG
ATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCCGTG
AAGCAGACCCTGAACTTTGATTTGCTCAAGTTGGCGGGGGATGTGGAAAGCAATCCCGGGCCAATGGTGA
GCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACA
CAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGC
ACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCA
GCAGG TAC C C T GAT CAT ATGAAGCAACACGAC T TC T T TAAGAGTGCCATGC CAGAGGGATACGTCCAGGA
AAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTAC AAAACCCGGGCAGAGGT CAAGT TTGAAGGCGACACC
C T GGT GAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGAT T TCAAAGAGGACGGAAACATCC TCGGACACAAACTGG
AATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTT
CAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCAC TACCAGCAAAATACCCCGATC
GGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCC T TGAGC AAAGACCC TA
ATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGA
GCTTTACAAGTAA
[SEQ ID No: 104] La secuencia codificante de QTA022P (plásmido que contiene la secuencia optimizada de codones para mBDNF-péptido viral-2A no funcional-eGFP) se refiere aquí como SEQ ID No: 105, como sigue:
ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCAC
GCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGT
GGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATAT
TTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACT
GGAATTCCCAGTGCCGGACCAC TCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGAT TCAAAGAAGCGCATCGG
ATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCTGTC
AAACAAACCCTCAATTTTGACTTGCTGAAGCTTGCTGGGGATGTCGAGTCCGCTGCCGCGGCTATGGTGA
GCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACA
CAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGC
ACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCA
GCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGAC T TC T T T AAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGA
AAGAAC CATATTCTT C AAAGAT GAT GGAAAT T AC AAAAC C C GGGC AGAGGT C AAGT T T GAAGGC GAC AC C
C T GGT GAACAGGATCGAACTCAAAGGCAT CGAT T T CAAAGAGGACGGAAACATCC TCGGACACAAAC TGG
AATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTT
CAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATC
GGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTA
ATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGA
GCTTTACAAGTAA
[SEQ ID No: 105] La secuencia codificante de QTA023P (plásmido que contiene la secuencia optimizada de codones para eGFP-péptido viral-2A-mBDNF) se refiere aquí como SEQ ID No: 106, como sigue:
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAA
ACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTT
CATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAG
TGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACG
TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGG
CGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCAC
AAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGG
TGAACT TC AAGATCCGCCAC AACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCAC TACCAGCAGAACAC
CCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAG
GACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCA
T GGAC GAGCT GTACAAGGC TCCCGT TAAACAAAC TC TGAAC T TCGACC TGC TGAAGCTGGC TGGAGACGT
GGAGTCCAACCCTGGACCTATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAG
GCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGG
CAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAA
AGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGG
GGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGG
ATAGC AAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAA
AAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No: 106] Con referencia a la Figura 14A, se muestra una transferencia Western de homogeneizados de células HEK29348 horas después de la transfección con el vector QTA020V. Muestra un procesamiento eficiente de la región codificante grande del precursor que incluye el receptor TrkB y el BDNF separado por la secuencia del péptido viral-2A. Los dos transgenes inmunorreactivos de TrkB y mBDNF están dentro de los tamaños de peso molecular correctos predichos. Debe notarse una falta de tinción de la proteína precursora grande arriba de la banda del receptor TrkB, lo que indica un procesamiento casi completo o completo de la proteína precursora en cinco repeticiones. Las Figuras 14B y 14C muestran que las proteínas transgénicas producidas después de la escisión del péptido viral-2A se han transportado a los compartimentos intracelulares correctos en las células HEK293 después del procesamiento (receptores TrkB a la superficie celular y BDNF a las vesículas de almacenamiento antes de la liberación).
La Figura 15 muestra que la adición de la secuencia del péptido viral-2A que separa las dos regiones codificantes para el receptor TrkB y BDNF da como resultado un procesamiento eficiente en los dos transgenes en la retina de ratón después de la inyección intravítrea del vector rAAV2, QTA020V.
La Figura 16 muestra la expresión de transgenes en la capa de células ganglionares de la retina de ratón como se muestra por inmunocitoquímica después de la inyección de QTA020V, un vector rAAV2 que contiene la codificación del receptor TrkB y BDNF, separados por la secuencia del péptido viral-2A. Los cuerpos de las células ganglionares de la retina diana se tiñeron de rojo con anticuerpos anti-Brn3A y los núcleos de las células se tiñeron de azul con DAPI para distinguir las capas de la retina.
Con referencia a la Figura 17, se muestra que el pretratamiento de QTA020V (que contiene la codificación del receptor TrkB y BDNF, separados por la secuencia del péptido viral-2A) mediante inyección intravítrea (2 pl de 9x1012 partículas de vector/ml) imparte una eficacia neuroprotectora significativa sobre la supervivencia de las células ganglionares de la retina después del aplastamiento del nervio óptico en el ratón en comparación a los animales control tratados con el vector rAAV2-CAG-eGFP. El nivel de neuroprotección por el vector QTA020V también fue mayor que el proporcionado por un vector que expresa únicamente BDNF. Los tres grupos de animales se sometieron a un procedimiento de aplastamiento del nervio óptico y se midió el número de células ganglionares de la retina 7 días después de la agresión. Las células ganglionares de la retina se redujeron en un 71 % en los controles (barras negras) en comparación a los animales sometidos a un aplastamiento simulado (datos no mostrados).
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un vector adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una construcción genética que comprende, en una orientación 5' a 3', un promotor operativamente unido a una primera secuencia codificante, que codifica el receptor de tirosina quinasa B (TrkB), y una segunda secuencia codificante, que codifica un agonista del receptor TrkB, en donde el agonista es BDNF maduro, en donde la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal para el agonista del receptor TrkB, de manera que cuando se expresa, el péptido señal se conjuga con el N-terminal del BDNF maduro, y en donde la construcción genética comprende una secuencia espaciadora dispuesta entre la primera y la segunda secuencia codificante, cuya secuencia espaciadora codifica un péptido espaciador que se configura para digerirlo para de esta manera producir el receptor TrkB y el agonista como moléculas separadas.
  2. 2. Un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la construcción genética comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WHPE), en donde opcionalmente el WHPE comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se expone en la SEQ ID No: 57 o 58, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 57 o 58, y/o en donde la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cola de poliA, en donde opcionalmente la cola de poliA comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 59, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 59.
  3. 3. Un vector recombinante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el promotor es el promotor de sinapsina I humana (SYN I), en donde opcionalmente el promotor comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 1, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 1, o en donde el promotor es el promotor CAG, en donde opcionalmente el promotor comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 2, 3 o 48, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 2, 3 o 48.
  4. 4. Un vector recombinante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la secuencia espaciadora comprende y codifica una secuencia espaciadora de un péptido viral, con mayor preferencia una secuencia espaciadora del péptido viral 2A.
  5. 5. Un vector recombinante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la secuencia espaciadora de péptido comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 4, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 4, o en donde la secuencia espaciadora comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO.5, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 5, o en donde la secuencia espaciadora de péptido comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 6, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 6, o en donde la secuencia espaciadora comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 7, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 7, o en donde la secuencia espaciadora de péptido comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 8, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 8.
  6. 6. Un vector recombinante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la isoforma canónica humana de TrkB, en donde la isoforma canónica de TrkB comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 9, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 9, y/o en donde la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 10, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 10, y/o en donde la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la isoforma 4 de TrkB, en donde opcionalmente la isoforma 4 de TrkB comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 11, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 11 y, en donde opcionalmente la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 12, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 12.
  7. 7. Un vector recombinante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 9, en donde uno o más residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID No: 9 se modifica a un residuo de aminoácido diferente, en donde opcionalmente al menos dos, tres o cuatro residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID No: 9 se modifican a un residuo de aminoácido diferente, en donde opcionalmente los cinco residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID No: 9 se modifican a un residuo de aminoácido diferente y, en donde opcionalmente el o cada residuo de tirosina se modifica a un ácido glutámico.
  8. 8. Un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la forma modificada del receptor TrkB comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 13, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 13, en donde opcionalmente la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 14, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 14.
  9. 9. Un vector recombinante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica BDNF maduro, en donde opcionalmente el BDNF maduro comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO.
    18, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 18 y, en donde opcionalmente la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 19, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 19.
  10. 10. Un vector recombinante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal para BDNF, en donde opcionalmente la secuencia de nucleótidos codifica el péptido señal canónico para BDNF, en donde la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO. 20, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 20, o en donde la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO. 21, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 21.
  11. 11. Un vector recombinante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de secuencia señal sustancialmente como se expone en cualquiera de SEQ ID No .23, 25, 27 o 29, o en donde el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO. 22, 24, 26 o 28, y/o en donde la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de secuencia señal sustancialmente como se expone en cualquiera de SEQ ID NO.
    31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 o 103; o en donde el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en cualquiera de SEQ ID NO. 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 o 102, y/o en donde la construcción comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID No: 107 o 108, o un fragmento o variante con al menos el 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID No: 107 o 108 y/o en donde el rAAV es AAV-1, AAV-2, AAV-3A, AAV-3B, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 o AAV-11, y en donde opcionalmente el rAAV es el serotipo-2 de rAAV.
  12. 12. El vector recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso como medicamento o en terapia.
  13. 13. El vector recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno del nervio óptico, o para promover la regeneración y/o la supervivencia de nervios, en donde opcionalmente el trastorno del nervio óptico que se trata es cualquier afección fisiopatológica que da como resultado la pérdida de las CGR, como un traumatismo en la cabeza o la cara o lesiones vasculares, por ejemplo, la pérdida parcial o completa del suministro de sangre a las estructuras oculares o regiones del cerebro que reciben información del nervio óptico, o se usan para apoyar el reemplazo de las CGR mediante la introducción de células madre transformadas o no transformadas en el ojo o regiones asociadas con la visión en pacientes, en donde opcionalmente el trastorno del nervio óptico que se trata es glaucoma.
  14. 14. Una composición farmacéutica que comprende el vector recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  15. 15. Un método para preparar la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, el método comprende el poner en contacto el vector recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1­ 11, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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