ES2881176T3 - Construcción genética para uso en el tratamiento del trastorno neurodegenerativo o accidente cerebrovascular - Google Patents

Abstract

Un vector recombinante que comprende una construcción genética que comprende un promotor operativamente ligado a una primera secuencia codificante, que codifica el receptor de tirosina quinasa B (TrkB), y una segunda secuencia codificante, que codifica un agonista del receptor TrkB, donde el agonista es BDNF maduro o NT-4 maduro, en el que la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que aumenta la secreción del agonista del receptor TrkB, y en el que la construcción genética comprende una secuencia espaciadora dispuesta entre la primera y la segunda secuencias codificantes, cuya secuencia espaciadora codifica un péptido espaciador que está configurado para ser digerido para producir de ese modo el receptor TrkB y el agonista como moléculas separadas, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno neurodegenerativo.

Description

DESCRIPCIÓN

Construcción genética para uso en el tratamiento del trastorno neurodegenerativo o accidente cerebrovascular

La presente invención se refiere a construcciones genéticas, y en particular a vectores recombinantes que comprenden dichas construcciones, y a los usos de las construcciones y vectores en métodos de terapia génica para el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno neurodegenerativo, o para el tratamiento de accidentes cerebrovasculares, o para promover la regeneración nerviosa y/o la supervivencia. La invención se define en las reivindicaciones. Las enfermedades neurodegenerativas son aquellas que afectan principalmente a las neuronas. El proceso degenerativo puede implicar la pérdida progresiva de la estructura neuronal, la pérdida progresiva de la función neuronal o la muerte progresiva de las células neuronales. Muchos trastornos específicos se clasifican como enfermedades neurodegenerativas. La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo a largo plazo y se ha estimado que afecta a aproximadamente siete millones de personas. La enfermedad de Huntington también es un trastorno neurodegenerativo a largo plazo, por lo que existe la necesidad de mejores tratamientos para la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington, y la promoción de la regeneración nerviosa o la supervivencia podría ser beneficiosa para estos pacientes.

La enfermedad de las neuronas motoras incluye cualquier trastorno que tenga un efecto neurodegenerativo sobre las neuronas motoras. Esto incluye esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis lateral primaria (PLS), atrofia muscular progresiva (PMA), parálisis bulbar progresiva (PBP), parálisis pseudobulbar o atrofias musculares espinales. El accidente cerebrovascular ocurre cuando se interrumpe o reduce el flujo sanguíneo al cerebro, y el flujo sanguíneo deficiente puede provocar la muerte celular. La enfermedad de Alzheimer representa aproximadamente el 60 % de todas las demencias, y se estima que más de 26 millones de personas en todo el mundo padecen la enfermedad de Alzheimer [1]. La demencia implica un deterioro progresivo de la función mental, que generalmente incluye déficits en la memoria, el lenguaje y los procesos cognitivos. La enfermedad de Alzheimer no solo puede afectar a los propios pacientes, sino que tiene un impacto significativo en los millones de cuidadores, a menudo no remunerados, que se necesitan para cuidarlos. Dado que el mayor factor de riesgo de la enfermedad de Alzheimer es la edad, hay un aumento dramático en la prevalencia a medida que las personas sobreviven más en la vejez [1]. Un número cada vez mayor de pacientes con Alzheimer ya está teniendo un gran impacto en los sistemas sanitarios mundiales. La patología típica asociada con la enfermedad de Alzheimer incluye atrofia grave del cerebro, adelgazamiento de la materia gris en la corteza cerebral, ventrículos agrandados indicativos de pérdida neuronal, placas amiloides extracelulares microscópicas que comprenden péptido beta-amiloide [Ap], que se agregan en grupos de proteínas, intracelulares ovillos neurofibrilares que comprenden proteína Tau agregada y amiloide cerebrovascular, es decir, proteína amiloide que rodea los vasos sanguíneos. En la enfermedad de Alzheimer, muchas áreas del cerebro tienen placas amiloides causadas por depósitos extracelulares de péptido p amiloide mal plegado y ovillos neurofibrilares compuestos de proteína Tau hiperfosforilada, especialmente las cortezas frontal, temporal y parietal, el hipocampo y los núcleos colinérgicos del cerebro. prosencéfalo basal. Estas regiones del cerebro representan áreas clave involucradas en los circuitos neuronales esenciales para la memoria a corto plazo. El depósito de placa de amiloide aparece aleatoriamente en todo el cerebro, mientras que la aparición de ovillos neurofibrilares intracelulares parece seguir un patrón bien definido [2] que se detecta primero en la corteza transentorrinal. Luego se observa que los ovillos neurofibrilares se extienden secuencialmente a la corteza entorrinal, a áreas del hipocampo y luego hacia afuera a la corteza cerebral. Numerosos estudios han indicado que uno de los primeros cambios en la enfermedad de Alzheimer implica la pérdida de sinapsis, que se correlaciona con el deterioro mental [3] que eventualmente conduce a una pérdida marcada de células en varias áreas del cerebro. Por lo tanto, los síntomas de la enfermedad siguen la lenta progresión de la destrucción en todo el cerebro, comenzando con la incapacidad de crear nuevos recuerdos, un proceso que depende del hipocampo.

El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) junto con el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3) y la neurotrofina-4/5 (NT-4/5) son miembros de la familia de neurotrofinas de factores tróficos [4-5]. Las neurotrofinas cumplen una función esencial en el desarrollo, la supervivencia y la función de una amplia gama de neuronas tanto en el sistema nervioso central como en el periférico. Las neurotrofinas interactúan con dos receptores de la superficie celular, los receptores P7SNTR de baja afinidad y la familia de receptores de tirosina quinasa de alta afinidad (Trk) [4-5]. El factor de crecimiento nervioso (NGF) se une preferentemente a TrkA, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y la neurotrofina-4/5 (NT4/5) se une al receptor quinasa B de la tropmiosina (TrkB) y la neurotrofina-3 (NT-3) se une a TrkC (y TrkA en menor medida) [12-13].

El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) es una proteína que está altamente expresada y ampliamente distribuida por todo el sistema nervioso central, especialmente en el hipocampo y corteza cerebral [6-7]. Se ha demostrado que es importante en la supervivencia y función de las neuronas hipocampales, corticales, colinérgicas y dopaminérgicas [8]. El BDNF está asociado con una serie de trastornos del cerebro, que incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la depresión, la esquizofrenia y el síndrome de Rett. Se ha planteado la hipótesis de que la disfunción de la memoria temprana observada en la enfermedad de Alzheimer puede estar relacionada con los niveles de BDNF en el hipocampo, ya que hay informes de niveles sustancialmente reducidos de ARNm de BDNF en el hipocampo de la enfermedad de Alzheimer [9] y la corteza parietal [10] y niveles de proteína disminuidos de BDNF en la corteza entorrinal, hipocampo, corteza temporal, frontal y parietal [11-16]. Sin embargo, los cambios en los niveles de BDNF parecen deberse a una regulación por disminución específica de ciertas transcripciones de BDNF. El metanálisis también muestra una disminución significativa de los niveles de neurotrofina en la sangre de los pacientes con Alzheimer en comparación con los sujetos sanos [17]. Además, se demostró que una menor concentración de BDNF en el líquido cefalorraquídeo predice la progresión del deterioro cognitivo leve (DCL) a la enfermedad de Alzheimer [18].

Varios estudios indican que los sujetos que exhiben el polimorfismo Val66Met (donde la valina es sustituida por metionina) del dominio pro de BDNF está asociado con una mayor progresión a la enfermedad de Alzheimer [19] y también pueden estar implicados otros polimorfismos de BDNF. La pérdida de proBDNF, una versión precursora más grande del BDNF y del BDNF maduro (mBDNF), se produce al principio de la enfermedad (antes del depósito de placa) y se correlaciona con déficits de memoria [20-21]. Estos datos sugieren fuertemente un vínculo entre las concentraciones reducidas de BDNF, la pérdida sináptica y la disfunción celular que subyace al deterioro cognitivo de Alzheimer. También se ha demostrado que el BDNF induce una rápida desfosforilación de Tau en las células neuronales a través de interacciones con el receptor TrkB y el consiguiente aumento de la señalización de la fosfoinositol-3-quinasa (PI3K) y la proteína quinasa (Akt), [22-23]. Por lo tanto, la disminución de las concentraciones de BDNF también podría contribuir a la hiperfosforilación de Tau, una característica patológica de la EA. También parece haber un efecto inverso con un aumento de Tau que causa una reducción en la expresión de BDNF en ratones [24]. Los datos recientes también han demostrado una posible exacerbación de la neurotoxicidad Ap en presencia de pro-dominio de neurotrofinas, incluido el BDNF [25].

También se han encontrado cambios en las neuronas que expresan el receptor TrkB de mBDNF, en cerebros postmortem de Alzheimer. Por ejemplo, se ha informado de una reducción del 47 % en las neuronas positivas para TrkB en cerebros post-mortem de pacientes con Alzheimer [26]. Esto puede atribuirse a una pérdida de neuronas que normalmente expresan el receptor o a una regulación por disminución bioquímica de la expresión de TrkB. La disminución de TrkB también podría verse agravada por la regulación por aumento de las isoformas truncadas del receptor TrkB-Ti y TrkB-Shc en la corteza frontal y temporal en la enfermedad de Alzheimer, que no muestran actividad quinasa esencial para la supervivencia neuronal [27]. La activación de la proteasa, calpaína, por Ap en cultivos neuronales induce una disminución de TrkB [28] por escisión cerca del sitio de acoplamiento del receptor She que conduce a la conversión de receptores completamente funcionales en isoforma truncada con actividad de quinasa defectuosa. El efecto de la conversión de los receptores TrkB funcionales en isoformas truncadas puede actuar entonces como receptor de neurotrofinas o receptor negativo dominante. En un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer, se observó que la desactivación de los receptores TrkB exacerbaba las aberraciones de señalización y los déficits de memoria similares a la enfermedad de Alzheimer sin afectar la deposición de Ap [29]. Estos datos sugieren que la pérdida de receptores TrkB y/o la pérdida de actividad a través de la producción y secreción reducidas de BDNF representan elementos importantes en la producción de síntomas y fisiopatología similares a los del Alzheimer.

Otros mecanismos importantes que contribuyen a la deficiencia de la señalización de BDNF/TrkB en cerebros de Alzheimer incluyen la supresión de las rutas de proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK/ERK) y PI3K/Akt por concentraciones subletales de Ap, sin interferencia de TrkB-FL y activación de la fosfolipasa-Y (p LCy) [30] y la alteración de la endocitosis de TrkB inducida por BDNF. La exposición a oligómeros Ap puede alterar la endocitosis del receptor y la activación de Akt en la dirección descendente de la secuencia a través de la fosforilación de dinamina-1 mediada por glucógeno sintasa quinasa-3p (GSK3p) [31]. Además, se ha demostrado que los oligómeros Ap interfieren con el tráfico retrógrado de TrkB mediado por BDNF [32] a través de la interrupción del sistema de ubiquitina [33] y la alteración de la homeostasis del calcio [34].

El panorama general es para el deterioro significativo de la señalización neurotrófica en la enfermedad de Alzheimer y, en particular, para el sistema BDNF. Se ha examinado la suplementación o el refuerzo de la señalización de BDNF en varios modelos animales de la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, las inyecciones de BDNF mejoran los déficits de aprendizaje en un modelo de rata de la enfermedad de Alzheimer inducida por Ap [1-42] [35]. Las inyecciones de un péptido de fusión novedoso que contiene el dominio activo de BDNF con un transactivador de transcripción (TAT) codificado por el VIH que puede penetrar en el cerebro mejoraron significativamente la memoria espacial con la activación de la vía TrkB/ERK1/2/Akt y la restauración de varias memorias. proteínas asociadas en modelos animales [36]. Además, se demostró que la expresión de BDNF mediante terapia génica basada en lentivirales tiene un efecto neuroprotector en modelos transgénicos de ratón de la enfermedad de Alzheimer y en primates mayores que muestran deterioro cognitivo [37].

El BDNF se puede producir en el cerebro y se puede transportar a la periferia, donde puede dar soporte a las neuronas y mantener su supervivencia [38-44]. En determinadas condiciones, como durante las agresiones excitotóxicas con agonistas del receptor de glutamato, como el N-metil-D-aspartato, el BDNF también puede producirse en neuronas periféricas, aunque a niveles relativamente bajos [45-46]. El BDNF se produce normalmente como un prepropolipéptido (es decir, preproBDNF) que contiene una secuencia de péptido señal corta, que facilita el tráfico de todo el polipéptido a vesículas para su liberación al espacio extracelular. La escisión y eliminación del péptido señal convierte preproBDN en proBDNF. Una secuencia de proBDNF terminal N se escinde luego intracelularmente o extracelularmente para crear BDNF maduro (mBDNF) [47]. Tanto el pro-BDNF como el mBDNF poseen actividad biológica con pro-BDNF que activa preferentemente los receptores P7SNTR y los receptores más cortos de activación del mBDNF TrkB [48-50]. La activación de los receptores P7SNTR y TrkB en la retina, por ejemplo, muestra efectos opuestos sobre la supervivencia de las células ganglionares de la retina (RGC), siendo la primera responsable de la apoptosis a través de la activación directa de RGC-célula-cuerpo-P75NTR [48-51] o indirectamente a través de Activación de P75NTR en las células de Müller, lo que estimula la liberación del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) que promueve aún más la pérdida de RGC [52].

Los modelos animales de glaucoma han demostrado que después del aplastamiento del nervio, o aumento de la PIO, hay un cambio de señalización neurotrófica mBDNF/TrkB hacia vías pro-BDNF/p75NTR Se han demostrado niveles reducidos de receptores mBDNF y TrkB en la retina [50, 53-54] junto con elevaciones opuestas en los niveles relativos de receptores pro-BDNF [28] y p75NTR [55]. La suplementación de mBDNF mediante inyecciones oculares de proteína recombinante en ratas con PIO elevada experimentalmente aumenta la supervivencia de las RGC en comparación con los ojos no tratados, lo que confirma un papel neuroprotector clave para esta neurotrofina [42-44].

En vista de lo anterior, existe por tanto la necesidad de una terapia génica mejorada para la promoción de la regeneración o supervivencia nerviosa, para el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno neurodegenerativo o accidente cerebro vascular.

Los inventores han construido una nueva construcción genética, que codifica el receptor de tirosina quinasa B (TrkB) y un agonista del receptor TrkB bajo el control de un solo promotor. El promotor de la construcción puede usarse para asegurar que el agonista y el receptor solo se expresen en células nerviosas apropiadas y promover la supervivencia de estas células.

Por tanto, se proporciona una construcción genética que comprende un promotor operativamente unido a una primera secuencia codificante, que codifica el receptor de tirosina quinasa B (TrkB), y una segunda secuencia codificante, que codifica un agonista del receptor TrkB, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno neurodegenerativo o accidente cerebrovascular.

Los inventores han demostrado en los Ejemplos que es posible combinar los genes que codifican tanto el receptor TrkB como su agonista en una única construcción genética. Esto fue especialmente desafiante debido a sus grandes tamaños, y no se podría haber predicho que hubiera sido posible coexpresarlos en concentraciones fisiológicamente útiles. Ventajosamente, con la construcción de la invención, no hay necesidad de inyectar una proteína recombinante, como se describe en la técnica anterior [56]. Además, en la técnica anterior, todavía es necesario realizar inyecciones regulares de proteína, mientras que la construcción de la invención solo requiere una única administración de terapia génica.

Preferiblemente, en uso, el receptor TrkB es activado por el agonista para promover de ese modo la supervivencia de las células nerviosas. La construcción genética de la invención se usa preferiblemente para el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno neurodegenerativo seleccionado de un grupo que consiste en: enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ataxia telangiectasia, lipofuscinosis ceroide neuronal, Enfermedad de Batten, encefalopatía espongiforme bovina (EEB), enfermedad de Canavan, parálisis cerebral, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, degeneración lobar frontotemporal, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Huntington, demencia asociada al VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, cuerpo de Lewy demencia, trastornos por almacenamiento lisosómico, neuroborreliosis, enfermedad de Machado-Joseph, enfermedad de la neurona motora, atrofia de múltiples sistemas, esclerosis múltiple, deficiencia de sulfatasa múltiple, mucolipidosis, narcolepsia, Niemann-Pick tipo C, enfermedad de Niemann Pick, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, Enfermedad de Pick, enfermedad de Pompe, esclerosis lateral primaria, enfermedad de priones, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, degeneración combinada subaguda de la médula espinal secundaria a anemia perniciosa, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten, ataxia espinocerebelosa, atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, Tabes dorsalis y enfermedad de Tay-Sachs.

En una realización preferida, la construcción genética se usa para el tratamiento, prevención o mejora de la enfermedad de Alzheimer.

En una realización preferida, la construcción genética es para el tratamiento, prevención o mejora de la enfermedad de Huntington.

En una realización preferida, la construcción genética es para el tratamiento, prevención o mejora de la enfermedad de Parkinson.

En una realización preferida, la construcción genética es para el tratamiento, prevención o mejora de la enfermedad de la neurona motora.

En una realización preferida, la construcción genética es para el tratamiento, la prevención o la mejora del accidente cerebro vascular.

La construcción de terapia génica puede tener varios efectos terapéuticos beneficiosos para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer o el accidente cerebrovascular. Los beneficios incluyen complementar terapéuticamente las concentraciones de mBDNF en el cerebro empobrecido o complementar con otros factores tróficos de la familia de las neurotrofinas. Otros beneficios incluyen restaurar los niveles de densidad del receptor TrkB en el tejido cerebral normal. El potencial para incluir un agonista en la construcción genética que no tiene codificación para la pro-secuencia, por ejemplo, la ausencia de codificación para proBDNF, también tiene la capacidad de restaurar el equilibrio a favor de la señalización de tipo mBDNF/TrkB y lejos de efectos de tipo pro-BDNF/p75NTR. Además, como la terapia génica puede usarse para producir una forma madura del agonista, como mBDNF, sin generar neurotrofina pro-dominio, habrá un riesgo significativamente menor de exacerbar la neurotoxicidad Ap, lo que podría ocurrir si la construcción produjera y liberara una forma pro del agonista, como proBDNF. Preferiblemente, la construcción de la invención está configurada para reducir la fosforilación de Tau en neuronas (que es una de las características patofisiológicas asociadas con los cerebros de Alzheimer).

Por tanto, ventajosamente, la construcción de la invención puede usarse para apuntar a células nerviosas con el fin de mantener o mejorar la señalización de TrkB en estas células. Por tanto, la construcción puede usarse para maximizar la protección contra factores estresantes fisiopatológicos y para promover la regeneración y/o supervivencia nerviosa. Además, la construcción puede usarse para proporcionar un tratamiento a largo plazo de trastornos neurodegenerativos o accidentes cerebrovasculares debido a la expresión del receptor TrkB y un agonista del receptor bajo el control de uno o más promotores. De acuerdo con lo anterior, la construcción ha superado la necesidad de utilizar múltiples tratamientos alternativos que, incluso en combinación proporciona un efecto terapéutico transitorio. Además, la construcción de la invención es ventajosa porque puede usarse para mejorar significativamente la sensibilidad de las células nerviosas a los agonistas del receptor TrkB debido a un aumento localizado tanto en el receptor TrkB como en el agonista del receptor.

Preferiblemente, la construcción genética de la invención comprende un casete de expresión, una realización del cual se muestra en la Figura 1. Como puede verse en la Figura 1, la construcción comprende el promotor, la primera secuencia de nucleótidos que codifica el receptor TrkB y la segunda secuencia de nucleótidos que codifica el neurotrófico derivado del cerebro maduro (mBDNF), que actúa como un agonista preferido del receptor TrkB. Sin embargo, se apreciará que se pueden usar otros agonistas, como se describe en el presente documento. También como se muestra en la Figura 1, el casete de expresión también incluye una secuencia espaciadora 2A, una secuencia que codifica el elemento regulador postranscipcional del virus de la hepatitis (WHPE), una secuencia que codifica una cola polyAy secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de la izquierda y la derecha.

La construcción genética comprende una secuencia espaciadora dispuesta entre la primera y la segunda secuencias codificantes, cuya secuencia espaciadora codifica un péptido espaciador que está configurado para ser digerido o cortado para producir de ese modo el receptor TrkB y el agonista como moléculas separadas. En la realización ilustrada en la Figura 1, la secuencia codificante del receptor TrkB está dispuesta en 5' de la secuencia codificante del agonista del receptor (BDNF) con la secuencia espaciadora entre ellos. Sin embargo, en otra realización, la secuencia codificante del agonista del receptor puede estar dispuesta en 5' de la secuencia codificante del receptor con la secuencia espaciadora entremedias.

Preferiblemente, la construcción genética comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el Elemento Regulador Postranscripcional del Virus de la Hepatitis de la Marmota (WHPE), que potencia la expresión de los dos transgenes, es decir, el receptor TrkB y su agonista, que es preferiblemente BDNF. Preferiblemente, la secuencia codificante de WHPE está dispuesta 3' de la secuencia codificante del transgén.

Una realización del Elemento Regulador Postranscripcional del Virus de la Hepatitis de la Marmota (WHPE) tiene una longitud de 592 pb, incluidos los elementos gamma-alfa-beta, y se denomina aquí como SEQ ID NO: 57, como sigue:

AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGC TATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTC CTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTG TGCACTGTGTTTGGTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGA CTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGG GGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTC

GCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGG ACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAG TCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG

[SEQ ID NO. 57]

Preferiblemente, el WHPE comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 57, o un fragmento o variante de la misma.

Sin embargo, en una realización preferida, se usa un WHPE truncado, que tiene una longitud de 247 pb debido a la eliminación del elemento beta, y que se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 58, como sigue:

AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGC TATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTC CTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACA GGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGT

[SEQ ID NO. 58]

Ventajosamente, la secuencia de WHPE truncada utilizada en la construcción ahorró aproximadamente 300 pb en total sin afectar negativamente a la expresión del transgén. Preferiblemente, el WHPE comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 58, o un fragmento o variante de la misma.

Preferiblemente, la construcción genética comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cola polyA. Preferiblemente, la secuencia codificante de la cola de polyA está dispuesta en 3' de la secuencia codificante del transgén y preferiblemente 3' en la secuencia codificante WHPE.

Preferiblemente, la cola de polyA comprende la secuencia de 40 poly-A de 224 pb del virus de simio. Una realización de la cola de polyA se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 59, como sigue:

AGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTT ATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACA ACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCT CTACAAATGTGGTA

[SEQ ID NO. 59]

Preferiblemente, la cola de polyA comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 59, o un fragmento o variante de la misma.

Preferiblemente, la construcción genética comprende secuencias de repetición terminal invertida (ITR) izquierda y/o derecha. Preferiblemente, cada ITR está dispuesta en el extremo 5' y/o 3' de la construcción.

El promotor en la construcción genética del primer aspecto puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que sea capaz de inducir a la ARN polimerasa a unirse y transcribir la primera y segunda secuencias codificantes. En una realización, el promotor en la construcción genética del primer aspecto puede ser el promotor constitutivo del citomegalovirus (CMV). Se considera que esto no es selectivo para las células neuronales y gliales.

En una realización preferida, el promotor es el promotor de la sinapsina I humana (SYN I), que se ha demostrado que funciona en el cerebro humano. Una realización de la secuencia de 469 nucleótidos que codifica el promotor de sinapsina I humana (SYN I) se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 1, como sigue:

CTGCAGAGGGCCCIGGGTATGAGTGCAAGiGGGTGTTAGGAGCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGGCTAC CTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAG AGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGGGAGGCGCGTGGGCACTGCGAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGGC TTCGCGCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCAGTCGCCGGT CCCCCGCAAACTCGCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACC ACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCC TGAGTCTGGGGTGGGCAGCGGAGGAGICGTGTGGTGCCTGAGAGCGCAG

[SEQ ID NO. 1]

Preferiblemente, por lo tanto, el promotor puede comprender una secuencia de ácidos nucleotídicos sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 1, o un fragmento o variante de la misma.

En otra realización preferida, el promotor es el promotor CAG, que también se ha demostrado que funciona en el cerebro humano. El promotor CAG comprende preferiblemente el elemento potenciador temprano del citomegalovirus, el primer exón y el primer intrón del gen de la beta-actina de pollo y el aceptor de corte y empalme del gen de la betaglobina de conejo. Una realización de la secuencia de nucleótidos de 1733 que codifica el promotor CAG se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 2, como sigue:

CTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATIACGGGGTCATTA5TTCAIAG0CCATATAT GGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCIGACCGCCCAACGACCCCCGCCCAITG ACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGT ATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGT C A A T G .A C G G T. A A A T G G C C C G C C T G G C ATT A. T G C C C A G T A. CAI G A C C: T T A T G G G .A C T T T C C T .A C T T G G C A G TACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGGTTCACTCTCGCCA

t o t c c c c c c c c t c c c c a c c c c c a a t t t t g i c a t t t a t t t a t t t t t t a a t t a t t t t &t g c a g c g a t g g g g g c GGGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCCAGGCGGGGGGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGA GGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGC GGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTC CGCCGCGGCCTCGGGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTAGTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGAC

g g c c c t t c t c c t g g g g g c t g t a a t t a g c :g c t t g g t t t a a t g a c g g c t t g t t t g t t t t c t g t g g c t g c g t g

AAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGT

GiGGGi^G.GGa GCoL-AGCG J . G C .1.CG G . i GCGCijoCGGCJ.GioAGCGC..aa-GíGC^CGCaaA-GGGGGa CTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCT G C G A G G G G A A CAAAG GCTGCG T G C G G G G T G T G T G C G T G G G G G G G T GAGCAG G G GGTGTGGGG G C G T C G G T C G G G C T C A: A A C: C C G C C C T G C A C C C C C C T C C C C G AG T T C 5 C T G AG C A C G G C C C G G C T T C G G G T G G G GGGCTG CGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGG

a A' A' AGCCGC a -LC C G C :A C t Ca OC C .¡. A C C CG CA:. A C C A C G 0 C C G C G G a CGJG a A-v:rGCC:G C i a> 1 CG AGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCC CAAÁTCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGGGGGGCGAAGCGGT

g c g g c g c c g g c a g g a a g g a á a t &g g c g g g g a g g g c c t t c g t g c g t c g c c g c g c c g c g g t c c c c t t c t c c c TCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTGGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGC TTCTGGCGTGTGAGCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAA.CCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGC TCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTG

[SEQ ID NO. 2]

En otra realización preferida, el promotor es una forma truncada del promotor CAG, tal como una forma de 664 nucleótidos del promotor al que se hace referencia en el presente documento como SEQ ID NO: 3, como sigue:

CTAGATCTGAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATAT ATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCAT TGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGA CTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGAC GTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGC AGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCC CATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGG GCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGA GAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCG GCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG

[SEQ ID No:3]

En otra realización preferida más, el promotor es una forma truncada del promotor CAG, tal como una forma de 584 nucleótidos del promotor al que se hace referencia en el presente documento como SEQ ID NO: 48, como sigue: GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAAT AATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGG TAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACG GTAAATGGCCCGCGTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTA CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCC CCCTCCCCACCCCGAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGG GGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGC GGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTAT AAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG

[SEQ ID No: 48]

Por lo tanto, preferiblemente el promotor comprende una secuencia de ácidos nucleotídicos sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 2, 3 o 48, o un fragmento o variante de la misma.

Muchas construcciones de genes bicistrónicos presentados en la literatura científica tienen (i) promotores duales incorporados para conducir por separado la expresión de dos genes, o (ii) usan el sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) para vincular dos genes transcritos a partir de un único promotor dentro de vectores virales recombinantes [45-46]. Sin embargo, la eficiencia de la traducción dependiente de IRES puede variar en diferentes células y tejidos y la expresión del segundo gen dependiente de IRES puede ser significativamente menor que la del primer gen dependiente de cap en vectores bicistrónicos [47]. Además, la limitación de tamaño de los vectores rAAV (generalmente <5 kb) evitará la incorporación de grandes construcciones génicas, como el receptor TrkB junto con BDNF utilizando promotores duales o ligadores IRES.

De acuerdo con lo anterior, la construcción genética comprende una secuencia espaciadora dispuesta entre la primera y la segunda secuencias codificantes, cuya secuencia espaciadora codifica un péptido espaciador que está configurado para ser digerido para producir de ese modo el receptor TrkB y el agonista como moléculas separadas. Preferiblemente, la secuencia espaciadora comprende y codifica una secuencia espaciadora de péptido viral, más preferiblemente una secuencia espaciadora de péptido 2A viral [47]. Preferiblemente, la secuencia del péptido 2A conecta la primera secuencia codificante a la segunda secuencia codificante. Esto permite que la construcción supere las restricciones de tamaño que se producen con la expresión en varios vectores y permite que la expresión de todos los péptidos codificados por la construcción del primer aspecto se produzca bajo el control de un solo promotor, como una sola proteína.

Por tanto, después de la traducción de la única proteína que contiene las secuencias de TrkB, el péptido 2A y el agonista (preferiblemente BDNF), se produce la escisión en la secuencia del péptido 2A viral en el enlace terminal glicina-prolina, liberando así dos proteínas., es decir, TrkB y agonista (por ejemplo, mBDNF). La construcción genética está diseñada de manera que la secuencia corta de aminoácidos terminal N restante del péptido viral 2A permanezca unida a la porción intracelular del receptor TrkB, eliminando así los riesgos de inmunogenicidad y no interfiriendo con la capacidad de señalización intracelular del receptor maduro. El aminoácido prolina residual de la secuencia 2A viral terminal C permanece unido al péptido señal agonista terminal N y finalmente se elimina de la proteína agonista después de la escisión de la secuencia señal de la proteína madura.

Los inventores han generado dos realizaciones de la secuencia espaciadora. Una sección importante de la secuencia espaciadora de péptidos, que es común a ambas realizaciones descritas en este documento, es el extremo terminal C. Por consiguiente, preferiblemente la secuencia espaciadora de péptidos comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 4, o un fragmento o variante de la misma, como sigue:

QAGDVEENPGP

[SEQ ID NO: 4]

Preferiblemente, el sitio de digestión o corte de la secuencia espaciadora de péptidos está dispuesto entre la glicina terminal y la prolina de extremo en SEQ ID NO: 4.

En una primera realización preferida, la secuencia espaciadora comprende una secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia en el presente documento como SEQ ID NO: 5, o un fragmento o variante de la misma, como sigue:

GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT

[SEQ ID NO: 5]

En esta primera realización, la secuencia espaciadora de péptidos comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 6, o un fragmento o variante de la misma, como sigue:

GSGATNFSLLQAGDVEENPGP

[SEQ ID NO: 6]

En una segunda realización preferida, la secuencia espadadora comprende una secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia en el presente documento como SEQ ID NO: 7, o un fragmento o variante de la misma, como sigue:

AGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT

[SEQ ID NO: 7]

En esta segunda realización, la secuencia espadadora de péptidos comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 8, o un fragmento o variante de la misma, como sigue:

SGATNFSLLKQAGDVEENPGP

[SEQ ID NO: 8]

Los inventores han considerado cuidadosamente las secuencias del receptor TrkB y han producido varias realizaciones preferidas del receptor que está codificado por la primera secuencia codificante en la construcción genética del primer aspecto.

En una realización preferida, la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la isoforma canónica humana de TrkB. Preferiblemente, la isoforma canónica de TrkB comprende una secuencia de aminoácidos (822 residuos) denominada en el presente documento SEQ ID NO: 9, o un fragmento o variante de la misma, como se establece a continuación:

MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITE IFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAI-IKAFLKNSNLQPIINFTRNKLTSLSRKHFRHLDL SELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPMCGLPSANLAAPNLTVEE GKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVN LTVHFAPTITE’LESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQVJF YNGAILNESKYICTKIHVTNHTE YHGCLQLDFi PTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQI3AHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPST DVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNT PSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGIINSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNL CPFODKILVAVKTLKDASDNARKDFRREAELLTNLOHEHIVKFYGVCVEGDPLIMYFEYMKHGDLFKF'LR AHGPDAVLMAEGNPPTELTOSQMLHIAOOIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGEFILLVKIGDFGMSRD VYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGWLWEPFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGR VLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQKLAKASPVYLDILG

[SEQ ID No: 9]

Preferiblemente, en esta realización, la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 10, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGG GCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGA CCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAA ATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGA GAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCT GCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTG TCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAG AGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGC AAACCTGCAGATAGCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAA GGAAAGTCTATCAGATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTA ACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATC CGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAAC CTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTC CATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTC CAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAAT CCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGA TTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTA TGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACA GACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGG GATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCC AGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACT CCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATC

CCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAA CATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTC TGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGG ACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTG CGTGGAGGGCGACGCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGG GCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGC TGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTT GGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGAC GTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGA GCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTT CACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGA GTCCTGCAGCGACGCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGC CCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTA CCTGGACATTCTAGGC

[SEQ ID No: lo]

En otra realización preferida, la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la isoterma 4 de TrkB. Preferiblemente, la isoterma 4 de TrkB comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 11, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación: MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLWGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITE IFIAINIQKRLEIIinIEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVARKAFLKNSNLOHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDL SELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTODLYCLNES8KNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEE GKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVN LTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTMHTEYHGCLQLBN PTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGvíPGIDDGANPNYPDVIYEEYGTAANDIGDTTNRSNEIPSI DVTDKTGREHLS VYAWVIA.S VVGFCLL VE'íLFLLKLARHSKFGMKDF SWFGFGKVKSRQGVGPASVISND DDSASPLKHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQi’FGITNSQEKPDTFVQHIKRHNIVLKREL GEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLI MVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLiATRNCLV GENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGWLWEIFTYGKQPW YQLSNNE VIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGC’WQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG

[SEQ ID No: n]

Preferiblemente, esta realización de la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 12, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGG GCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGA CCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAA ATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGA GAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCT GCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTG TCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAG AGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGC AAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAA GGAAAGTCTATCAGATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTA ACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATC CGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAAC CTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTC CATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTC CAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAAT CCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGA TTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTA TGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACA GACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGG GATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGATTT CTCATGGTTTGGATTTGGGAAAGTAAAATCAAGACAAGGTGTTGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGAT GATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCC CAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAA CAGTCAGCTCAAGGCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTA GGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCT TGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCT CCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATC ATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGC TGATGGCTGAGGGGAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGC CGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTC GGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACA GGGTCGGTGGCCAGACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCAC GACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGG TACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGT GCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAA GGGCATCCATACCGTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC

[SEQ ID No: 12]

Los inventores han dedicado un esfuerzo inventivo considerable al estudio de la secuencia del receptor TrkB y se han dado cuenta de que TrkB comprende cinco residuos de tirosina (en la posición 516, 701, 705, 706 y 816 de SEQ ID NO: 9), que normalmente son fosforilados tras dimerización y autofosforilación en presencia de un dímero de BDNF. Un problema con la fosforilación de estos cinco residuos de tirosina es que el receptor puede desactivarse fácilmente mediante una fosfatasa, como la fosfatasa Shp-2. De acuerdo con lo anterior, para prevenir la fosforilación y la desactivación resultante del receptor in vivo, preferiblemente una o más de estas tirosinas clave se mutan (más preferiblemente, a ácido glutámico) para imitar la fosfotirosina resultante y producir un receptor que permanece activo en la presencia de BDNF, y que no puede ser desactivado por una fosfatasa, como la fosfatasa Shp-2. Tales formas mutantes de TrkB están destinadas a producir actividad del receptor de TrkB que permanece activo durante períodos más prolongados o hasta que el receptor se internaliza.

Las secuencias de ADN y aminoácidos proporcionadas a continuación ilustran las posiciones de estos cinco residuos de tirosina (Y) que se han mutado en cinco residuos de ácido glutámico (E). Se apreciará que 1, 2, 3, 4 o 5 de estos residuos se pueden mutar a ácido glutámico en realizaciones de la invención. También se prevén diversas combinaciones de estas mutaciones, por ejemplo, posiciones 516 y 701 solamente, o posiciones 705, 706 y 816 solamente, y así sucesivamente.

De acuerdo con lo anterior, en otra realización preferida, la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una forma mutante del receptor TrkB, en la que uno o más residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID NO: 9 está modificado o mutado. Preferiblemente, se modifican al menos dos, tres o cuatro residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID NO: 9. Lo más preferiblemente, se modifican los cinco residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID NO: 9.

Preferiblemente, el o cada residuo de tirosina se modifica a un residuo de aminoácido diferente, más preferiblemente un ácido glutámico. Por tanto, preferiblemente la forma mutante del receptor TrkB comprende Y516E, Y701E, Y705E, Y706E y/o Y816E.

Preferiblemente, la forma modificada del receptor TrkB comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 13, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLWGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITE IF IANQKR.LE IINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAP1KAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDL SELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEE GKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVN

l t v h f a p t i t f l e s p t s d h h w c i p f t v k g n p k p a l q w f y i s i g a i l n e s k y i c t k i h v t n h t e y h g c l q l d n p t h m n m g d y t l i a k n e y g k d e k q i s a h f m g w p g i d d g a n p n y p d v i y e d y g t a a n d i g d t t n r s n e i p s t DVTDKTGREHLSVYAVVVIA3VVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVI3NDDDSASPLHHISNGSNT PS55EGGPDAVII3MTKIPVIENPQEFGITNSQLKPD7FVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNL CPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLR AHGPDAVLMAEGFIPPTELTQSGMLHIAQQIAAGMVYLASOHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRD VESTDEERVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGR VLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVELDILG

[SEQ ID No: 13]

Preferiblemente, en esta realización, la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia en el presente documento como SEQ ID NO: 14, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGG GCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGA CCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAA ATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGA GAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCT GCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTG TCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAG AGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGC AAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAA GGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTA ACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATC CGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAAC CTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTC CATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTC CAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAAT CCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGA TTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTA TGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACA GACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGG GATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCC AGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACT CCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATC CCCAGGAATTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAA CATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTC TGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGG ACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTG CGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGG GCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGC TGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTT GGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGAC GTGGAAAGCACTGACGAAGAAAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGA GCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTT CACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGA GTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGC CCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCGA ACTGGACATTCTAGGC

[SEQ ID No: 14]

Se apreciará que la segunda secuencia codificante codifica un agonista del receptor TrkB, que es preferiblemente un miembro de la familia de factores tróficos de neurotrofinas. El agonista del receptor TrkB puede ser un miembro de la familia de factores tróficos de neurotrofinas que carecen de la pro-secuencia. El agonista del receptor TrkB puede ser un miembro de la familia de factores tróficos de las neurotrofinas en la forma madura. Por lo tanto, los agonistas preferidos del receptor TrkB pueden seleccionarse de un grupo de agonistas que consiste en: factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); factor de crecimiento nervioso (NGF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4); y neurotrofina-5 (NT-5); o fragmentos de los mismos. Los agonistas preferidos del receptor TrkB pueden seleccionarse de un grupo de agonistas que consiste en: factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) que carece de la pro­ secuencia; factor de crecimiento nervioso (NGF) que carece de la pro-secuencia; neurotrofina-3 (NT-3) que carece de la pro-secuencia; neurotrofina-4 (NT-4) que carece de la pro-secuencia; y neurotrofina-5 (NT-5) que carece de la pro­ secuencia; o fragmentos de los mismos. Los agonistas preferidos del receptor TrkB se pueden seleccionar de un grupo de agonistas que consiste en: factor neurotrófico derivado de Cerebro (BDNF); factor de crecimiento nervioso maduro (NGF); neurotrofina-3 madura (NT-3); neurotrofina-4 madura (NT-4); y neurotrofina-5 madura (NT-5); o fragmentos de los mismos.

El experto en la materia conocerá las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cada uno de estos agonistas. Sin embargo, a modo de ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una realización de Neurotropina-4 (NT-4) es sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 49, como sigue:

MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIESQPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRES AGAPANRSRRGVSETAPASRRGELAVCDA.VSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETR CKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSSCKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA

[SEQ ID No: 49]

La secuencia codificante de ácido nucleico de esta realización de Neurotropina-4 (NT-4) es sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 50, como sigue:

ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGT CCCAACCCCCACCGTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGT CCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCA GCAGGTGCCCCGGGCAACCGCAGCCGGCGTGGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGC TGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGA GGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGC TGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGA GGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCG TGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC

[SEQ ID No: 50] La secuencia de aminoácidos del péptido señal para la secuencia de NT-4 es sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 51, como sigue:

MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIES

[SEQ ID NO: 51]

La secuencia de ácido nucleico de este péptido señal es sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 52, como sigue:

ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGT CC

[SEQ ID No: 52] La secuencia de aminoácidos del propéptido para esta secuencia de NT-4 es sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 53, como sigue:

QPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRR

[SEQ ID NO: 53]

La secuencia de ácido nucleico de este propéptido es sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 54, como sigue:

CAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCC TGTCTAGGGGTGCGCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGC AGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGT

[SEQ ID No: 54] La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la proteína madura para esta secuencia de NT-4 es sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 55, como sigue:

La secuencia que codifica el ácido nucleico de esta proteína NT-4 madura es sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 56, como sigue:

GGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGG TGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGC TGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGC CCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGC AGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACAC TGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC

[SEQ ID No: 56] De acuerdo con lo anterior, en una realización preferida, la segunda secuencia codificante codifica neurotrofina-4 (NT-4), que puede comprender una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 49 o 55, o fragmento o variante de la misma. Por tanto, la segunda secuencia codificante puede comprender una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 50 o 56, o un fragmento o variante de la misma.

Los agonistas más preferidos del receptor TrkB, sin embargo, incluyen factor neurotrófico derivado de preprocerebro (pre-pro-BDNF), pro-BDNF o BDNF maduro (mBDNF). El BDNF se sintetiza inicialmente como la proteína precursora, preproBDNF, por los ribosomas que se encuentran en el retículo endoplásmico. Hay al menos 17 variantes de corte y empalme conocidas codificadas por el gen preproBDNF humano (ENSG00000176697). Una vez que preproBDNF ha entrado en el retículo endoplásmico rugoso, preproBDNF se convierte en proBDNF por escisión del péptido señal (es decir, la secuencia “pre”). proBDNF se convierte en mBDNF por escisión de una secuencia peptídica terminal N adicional que está presente en proBDNF.

A continuación, tanto el proBDNF como el mBDNF se secretan en el espacio extracelular, donde se unen y activan receptores en diversas células.

El proBDNF se une preferentemente al receptor p75NTR y lo activa, que, cuando se activa, puede inducir la apoptosis en algunos tipos de células. Por tanto, en una realización preferida, proBDNF es un agonista del receptor p75NTR. En una realización, el proBDNF es proBDNF canónico. Preferiblemente, el proBDNF canónico comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 15, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGILESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDAD LYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVD MSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGW RFIRIDTSCVCTLTIKRGR

[SEQ ID No: 15]

Preferiblemente, en esta realización, la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia en el presente documento como SEQ ID NO: 16, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

GCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGA CTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACA CGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGAC TTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGG AATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCG AGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGAC ATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCT ACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAA CTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGG CGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG

[SEQ ID No: 16]

En otra realización, el proBDNF es la isoforma 2 de proBDNF, que preferiblemente comprende una mutación de valina a metioniona (aminoácido subrayado). Preferiblemente, la isoforma 2 de proBDNF comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 17, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHMIEELLDEDQKVRPNEENNKDAD LYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVD MSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGW RFIRIDTSCVCTLTIKRGR

[SEQ ID No: 17]

En una realización, sin embargo, el agonista no es proBDNF, o un fragmento o variante del mismo, sino que la segunda secuencia codificante comprende preferiblemente una secuencia de nucleótidos que codifica BDNF maduro. El BDNF maduro (mBDNF) se une preferentemente a TrkB y lo activa, que, cuando se activa, promueve la supervivencia de las células nerviosas. Por tanto, el BDNF maduro es el agonista más preferido de TrkB. La construcción de acuerdo con el primer aspecto es ventajosa porque, a diferencia de otras construcciones genéticas conocidas, la construcción es capaz de producir proteína BDNF madura, que no se ha plegado incorrectamente.

Por tanto, en una realización preferida, la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el BDNF maduro. El mBDNF es común a las 17 isoformas codificadas por el gen. Hay 7 secuencias de proteínas diferentes, cinco de las cuales tienen secuencias de señal extendidas a la forma canónica, y una tiene una secuencia de señal canónica, pero una mutación de valina a metionina (que es común a las isoformas 2, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 16). Se considera que la mutación de valina a metionina reduce la liberación de BDNF de la célula.

Preferiblemente, el BDNF maduro comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 18, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRG IDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR

[SEQ ID No: 18]

Preferiblemente, esta realización de la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia en el presente documento como SEQ ID NO: 19, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAG CAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAA TGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTG TTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGG TGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCT AGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTG TGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGG TCACACTCCTTCAAAACCTCCCTCTATCAAAACCCCAACTCAACCAATACTTCTACCACACCAACTCCAA TCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACT ACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAG ACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG

[SEQ ID No: 19]

En otra realización, el agonista es miembro de la familia de neurotrofinas de factores tróficos que carecen de la pro­ secuencia, pero con un péptido señal conjugado con el extremo terminal N. El agonista puede ser cualquier miembro de la familia de factores tróficos de las neurotrofinas en la forma madura y con un péptido señal conjugado al terminal N. El péptido señal puede ser cualquier péptido señal que promueva la multiplicidad o la producción adecuados del agonista. En realizaciones preferidas, el péptido señal puede ser cualquier péptido señal descrito en este documento.

En otra realización preferida más, el agonista es mBDNF con un péptido señal conjugado a su terminal N. Como se analiza a continuación, el péptido señal puede ser un péptido señal canónico de preproBDNF, o el péptido señal de IL-2, o una secuencia señal de novo creada por los inventores.

Preferiblemente, la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal para el agonista del receptor TrkB, más preferiblemente un péptido señal para BDNF. En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos codifica el péptido señal canónico para BDNF. Preferiblemente, esta realización de la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento SEQ ID NO: 20, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

MTILFLTMVISYFGCMKA

[SEQ ID NO: 20]

Preferiblemente, esta realización de la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia en el presente documento como SEQ ID NO: 21, o un fragmento o variante del mismo, como se establece a continuación:

ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG

[SEQ ID NO: 21]

Los inventores han creado una serie de péptidos señal extendidos. En realizaciones preferidas, la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal de isoterma para BDNF se selecciona del grupo que consiste en: isoterma 2, 3, 6, 5 y 4. Se establecen las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para cada uno de estos péptidos señal extendidos adelante.

Isoforma 2

MFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA

[SEQ ID NO: 22]

Isoforma 3 y 6

MQSREEEWFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA

[SEQ ID NO: 24] ATGCAGAGCCGGGAAGAGGAATGGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTT ACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG

[SEQ ID No: 25] Isoforma 5

MLCAISLCARVRKLRSAGRCGKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA

[SEQ ID NO: 26] ATGCTCTGTGCGATTTCATTGTGTGCTCGCGTTCGCAAGCTCCGTAGTGCAGGAAGGTGCGGGAAGTTCC ACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGC

G

[SEQ ID No: 27] Isoforma 4 MCGATSFLHECTRLILVTTQNAEFLQKGLQVHTCFGVYPHASVWHDCASQKKGCAVYLHVSVEFNKLIPE NGFIKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA

[SEQ ID No: 28] ATGTGTGGAGCCACCAGTTTTCTCCATGAGTGCACAAGGTTAATCCTTGTTACTACTCAGAATGCTGAGT TTCTACAGAAAGGGTTGCAGGTCCACACATGTTTTGGCGTCTACCCACACGCTTCTGTATGGCATGACTG TGCATCCCAGAAGAAGGGCTGTGCTGTGTACCTCCACGTTTCAGTGGAATTTAACAAACTGATCCCTGAA AATGGTTTCATAAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCAT ACTTCGGTTGCATGAAGGCG

[SEQ ID No: 29] De acuerdo con lo anterior, en realizaciones preferidas, la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de secuencia señal denominado en el presente documento como cualquiera de SEQ ID NO: 23, 25, 27 o 29. Preferiblemente, el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento como cualquiera de SEQ ID NO: 22, 24, 26 o 28.

Los inventores también han creado varias realizaciones de péptidos señal novedosos para el agonista, preferiblemente BDNF. Estos péptidos señal aumentan el nivel de basicidad de la sección terminal N (con residuos de lisina (K) y arginina (R) añadidos) y la región hidrófoba que procede (con adiciones de residuos de leucina (L)), que aumentan la secreción de BDNF en comparación a los niveles observados con la secuencia señal canónica de tipo silvestre.

a) QTA003P (señal IL-2)

MYRMQLLSCIALSLALVTNS

[SEQ ID NO: 30]

ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT

[SEQ ID NO: 31]

b) QTA004P

MKRRVMIILFLTMVISYFGCMK

[SEQ ID NO: 32] ATGAAAAGAAGAGTGATGATCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGA GCG

[SEQ ID NO: 33]

c) QTA009P (IL-2 modificado)

MRRMQLLLLIALSLALVTNS

[SEQ ID NO: 34]

ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT

[SEQ ID NO: 35]

d) QTA010P

MRRMQLLLLTMVISYFGCMKA

[SEQ ID NO: 36] ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG

[SEQ ID NO: 37]

e) QTA0012P

MRILLLTMVISYFGCMKA

[SEQ ID NO: 38]

ATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG

[SEQ ID NO: 39]

f) QTA0013P

MRRILFLTMVISYFGCMKA

[SEQ ID NO: 40]

ATGAGAAGAATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG

[SEQ ID NO: 41]

g) QTA0014P

MRRFLFLLVISYFGCMKA

[SEQ ID NO: 42]

ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG

[SEQ ID NO: 43]

i) QTA0015P

MRRFLFLLYFGCMKA

[SEQ ID NO: 44]

ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTTACTTCGGTTGCATGAAGGCG

[SEQ ID NO: 45]

La Figura 6 muestra secuencias de nucleótidos y aminoácidos para realizaciones preferidas adicionales del péptido señal usado en la construcción de la invención para estimular la secreción del agonista, preferiblemente b Dn F. El segundo residuo en el péptido señal es treonina (T) que se reemplaza preferiblemente por uno o más residuos básicos, como lisina (K) o arginina (R). El siguiente tramo de residuos en el péptido señal que incluye isoleucina (I), leucina (L), fenilalanina (F) y leucina (L) se reemplaza preferiblemente por uno o más residuos hidrófobos.

De acuerdo con lo anterior, en realizaciones preferidas, la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de secuencia señal denominado en el presente documento como cualquiera de SEQ ID NO: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 o 103. Preferiblemente, el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos denominada en el presente documento como cualquiera de SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 o 102.

De acuerdo con lo anterior, se apreciará que los inventores han modificado la secuencia del gen BDNF mediante la eliminación de la pro-secuencia, lo que tampoco se había logrado antes, con el resultado de un BDNF maduro debidamente plegado generado, combinado con la introducción de péptidos señal completamente novedosos, que aumentan significativamente la producción y liberación de BDNF por encima de lo que jamás se logró con la secuencia endógena.

Preferiblemente, la construcción genética comprende secuencias de repetición terminal invertida (ITR) izquierda y/o derecha. Preferiblemente, cada ITR está dispuesto en el extremo 5 'y/o 3' de la construcción. Una ITR puede ser específica de un serotipo de virus (por ejemplo, AAV o lentivirus) y puede ser cualquier secuencia, siempre que forme un bucle en horquilla en su estructura secundaria.

La secuencia de ADN de una realización (ITR izquierda de un plásmido AAV disponible comercialmente) del ITR se representa aquí como SEQ ID NO: 46, como sigue:

La secuencia de ADN de otra realización (ITR derecha de un plásmido AAV disponible comercialmente) del ITR se representa en el presente documento como SEQ ID NO: 47, como sigue:

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACC AAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAG

G

[SEQ ID NO:47]

A partir de lo anterior, la persona experta apreciará la secuencia de nucleótidos de una realización de la construcción del primer aspecto, así como la secuencia de aminoácidos del transgén codificado. Sin embargo, para evitar dudas, la secuencia codificante de codón optimizado 2940 bp secuencia para el receptor TrkB murino-viral-2A péptidomBDNF contenida en el plásmido QTA020P (y el vector QTA020V), se denomina aquí como SEQ ID NO: 107, como sigue:

ATGAGCCCATGGCTGAAGTGGCACGGACCAGCAATGGCAAGACTGTGGGGCCTGTGCCTGCTGGTGCTGG GCTTCTGGAGAGCCAGCCTGGCCTGTCCAACCTCCTGCAAGTGTAGCTCCGCCAGGATCTGGTGCACAGA GCCTTCTCCAGGCATCGTGGCCTTTCCCCGCCTGGAGCCTAACAGCGTGGATCCCGAGAATATCACCGAG ATCCTGATCGCCAACCAGAAGCGGCTGGAGATCATCAATGAGGACGATGTGGAGGCCTACGTGGGCCTGA GAAACCTGACAATGGTGGACTCCGGCCTGAAGTTCGTGGCCTATAAGGCCTTTCTGAAGAACTCTAATCT GAGGCACATCAACTTCACCCGCAATAAGCTGACATCTCTGAGCCGGAGACACTTTCGGCACCTGGATCTG TCCGACCTGATCCTGACCGGCAATCCATTCACATGCTCTTGTGACATCATGTGGCTGAAGACCCTGCAGG AGACAAAGTCTAGCCCCGATACCCAGGACCTGTACTGTCTGAACGAGTCCTCTAAGAATATGCCTCTGGC CAACCTGCAGATCCCTAATTGTGGACTGCCAAGCGCCCGGCTGGCCGCACCTAACCTGACAGTGGAGGAG GGCAAGTCCGTGACACTGTCCTGTTCTGTGGGCGGCGATCCCCTGCCTACCCTGTATTGGGACGTGGGCA ACCTGGTGTCTAAGCACATGAATGAGACCTCCCACACACAGGGCTCTCTGAGAATCACAAATATCAGCTC CGACGATAGCGGCAAGCAGATCTCTTGCGTGGCAGAGAACCTGGTGGGAGAGGATCAGGACAGCGTGAAT CTGACCGTGCACTTCGCCCCCACCATCACATTTCTGGAGTCTCCTACCAGCGATCACCACTGGTGCATCC CCTTCACAGTGCGGGGAAACCCAAAGCCCGCCCTGCAGTGGTTTTACAACGGCGCCATCCTGAATGAGTC CAAGTATATCTGTACCAAGATCCACGTGACCAACCACACAGAGTACCACGGCTGCCTGCAGCTGGATAAT CCCACCCACATGAACAATGGCGACTACACACTGATGGCCAAGAACGAGTATGGCAAGGACGAGAGGCAGA TCAGCGCCCACTTCATGGGCCGCCCTGGAGTGGATTATGAGACCAACCCTAATTACCCAGAGGTGCTGTA TGAGGACTGGACCACACCTACCGATATCGGCGACACCACAAACAAGTCTAATGAGATCCCAAGCACAGAT GTGGCCGACCAGTCTAACAGGGAGCACCTGAGCGTGTACGCAGTGGTGGTCATCGCCTCCGTGGTGGGCT TCTGCCTGCTGGTCATGCTGCTGCTGCTGAAGCTGGCCCGCCACTCTAAGTTTGGCATGAAGGGCCCAGC CTCCGTGATCTCTAATGACGATGACAGCGCCAGCCCCCTGCACCACATCAGCAACGGCTCCAATACCCCT TCTAGCTCCGAGGGCGGCCCAGATGCCGTGATCATCGGCATGACAAAGATCCCCGTGATCGAGAACCCTC AGTACTTCGGCATCACCAATTCCCAGCTGAAGCCTGACACATTTGTGCAGCACATCAAGCGGCACAACAT CGTGCTGAAGAGGGAACTGGGAGAGGGAGCCTTCGGCAAGGTGTTTCTGGCCGAGTGCTATAACCTGTGC

CCAGAGCAGGATAAGATCCTGGTGGCCGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGCGACAACGCCCGGAAGGACT TCCACAGAGAGGCCGAGCTGCTGACAAATCTGCAGCACGAGCACATCGTGAAGTTTTACGGCGTGTGCGT GGAGGGCGACCCTCTGATCATGGTGTTCGAGTATATGAAGCACGGCGATCTGAACAAGTTTCTGAGAGCA CACGGACCAGATGCCGTGCTGATGGCAGAGGGAAATCCCCCTACCGAGCTGACACAGTCTCAGATGCTGC ACATTGCACAGCAGATTGCAGCAGGAATGGTGTACCTGGCCAGCCAGCACTTCGTGCACAGGGATCTGGC AACCAGAAACTGCGTGGTGGGAGAGAATCTGCTGGTGAAGATCGGCGACTTTGGCATGTCCCGGGACGTG TACTCTACCGACTACTATAGAGTGGGCGGCCACACAATGCTGCCCATCAGGTGGATGCCACCCGAGAGCA TCATGTATCGCAAGTTCACCACAGAGTCTGACGTGTGGAGCCTGGGCGTGGTGCTGTGGGAGATCTTTAC CTACGGCAAGCAGCCTTGGTATCAGCTGTCCAACAATGAAGTGATCGAGTGTATTACACAGGGACGCGTG CTGCAGAGGCCACGCACATGCCCCCAGGAGGTGTACGAGCTGATGCTGGGCTGTTGGCAGCGGGAGCCAC ACACCAGAAAGAACATCAAGAGCATCCACACACTGCTGCAGAATCTGGCCAAGGCCTCCCCCGTGTATCT GGACATCCTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCT GGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACC CTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGAC TGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAG CAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAA GGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAG AATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG

[SEQ ID No: 107]

La secuencia codificante de secuencia de codón optimizado de 2943 pb para el receptor TrkB humano-viral-2A péptido-mBDNF contenido dentro del plásmido QTA029P (y el vector QTA029V), se denomina aquí como SEQ ID NO: 108, como sigue:

ATGTCATCTTGGATCCGCTGGCACGGGCCAGCGATGGCCCGATTGTGGGGCTTCTGCTGGCTTGTTGTAG GCTTCTGGCGCGCGGCGTTCGCGTGTCCGACCTCTTGCAAATGCTCAGCAAGCCGAATTTGGTGCTCAGA CCCTAGTCCAGGAATTGTTGCATTCCCCCGACTGGAACCAAACTCCGTCGACCCGGAGAATATAACTGAG ATATTTATTGCAAATCAAAAACGCCTTGAAATCATTAACGAGGATGACGTGGAGGCCTACGTTGGTTTGA GAAATCTTACTATTGTCGACTCCGGACTTAAATTTGTAGCTCATAAAGCCTTCCTGAAGAACTCTAATCT GCAGCACATTAATTTCACGAGAAATAAGCTGACCAGCTTGTCCCGGAAGCATTTCCGCCATCTCGACCTG AGCGAGCTCATACTGGTCGGAAACCCATTTACGTGCTCCTGTGACATCATGTGGATCAAAACTCTGCAAG AGGCGAAAAGTAGTCCGGATACCCAAGACCTTTACTGTCTTAATGAAAGCTCAAAAAATATCCCGCTGGC CAACCTGCAGATAGCGAACTGCGGACTTCCTAGTGCGAATTTGGCTGCCCCAAATCTTACCGTCGAAGAA GGCAAATCAATCAGGCTTTCTTGTTCTGTAGCTGGAGATCCAGTGCCTAATATGTATTGGGACGTGGGTA ACCTCGTCTCAAAACATATGAACGAAACGAGCCACACCCAGGGCTCTTTGCGGATAACAAACATCTCCTC TGATGATTCTGGAAAGCAAATCAGTTGCGTAGCTGAAAATCTGGTTGGCGAAGATCAAGATTCAGTCAAT CTGACAGTCCATTTCGCCCCAACGATCACCTTTCTGGAGAGCCCAACTAGCGATCACCACTGGTGTATTC CGTTTACGGTAAAAGGAAATCCAAAACCTGCACTCCAATGGTTTTATAATGGAGCCATCTTGAATGAAAG CAAATATATCTGTACTAAAATCCATGTGACGAATCACACCGAGTATCACGGGTGTCTTCAATTGGATAAT CCAACCCATATGAATAATGGTGATTATACTTTGATAGCGAAGAACGAATACGGCAAAGACGAAAAGCAAA TATCCGCACATTTCATGGGTTGGCCTGGCATCGACGACGGTGCGAACCCGAACTACCCAGATGTTATTTA CGAGGATTATGGGACTGCGGCAAACGACATTGGCGACACCACAAACCGAAGCAACGAGATACCAAGTACT GACGTCACTGACAAAACGGGTCGAGAGCATTTGTCTGTTTACGCCGTTGTTGTTATCGCCTCAGTTGTCG GATTTTGCCTGTTGGTCATGCTTTTCCTCCTGAAGCTCGCGCGACATTCCAAGTTTGGCATGAAGGGG C CAGCAAGTGTTATATCCAATGATGATGATAGCGCTTCTCCATTGCACCACATAAGTAACGGCTCAAACAC GCCGTCATCTAGTGAAGGTGGACCAGACGCGGTCATTATAGGGATGACTAAAATTCCCGTAATCGAAAAC CCTCAGTACTTCGGCATAACCAACAGTCAGCTTAAACCCGATACTTTCGTGCAGCACATCAAAAGGCACA ACATAGTCCTCAAGCGCGAACTCGGGGAGGGAGCCTTCGGAAAGGTCTTTCTTGCTGAGTGCTATAATTT GTGTCCTGAGCAGGATAAAATTCTTGTGGCTGTAAAAACTCTCAAAGATGCTTCCGACAACGCACGGAAG GATTTTCATCGGGAGGCCGAACTGTTGACGAATTTGCAGCACGAGCATATAGTAAAGTTCTACGGGGTAT GTGTTGAGGGGGACCCGTTGATTATGGTCTTCGAGTATATGAAGCACGGGGACCTGAACAAATTTTTGCG CGCCCATGGGCCTGATGCCGTCCTTATGGCAGAAGGGAACCCTCCAACAGAACTCACCCAGAGTCAGATG TTGCACATAGCGCAACAGATCGCGGCCGGCATGGTTTACCTGGCCAGTCAACACTTCGTGCATAGAGATC TTGCCACTCGCAACTGTTTGGTCGGGGAGAACCTTCTGGTTAAGATTGGTGACTTTGGTATGTCACGAGA TGTGTATTCCACTGACTATTACAGAGTTGGGGGTCATACAATGCTTCCTATTCGGTGGATGCCCCCCGAA

TCCATCATGTACAGAAAGTTCACGACAGAGAGTGATGTT TGG AGT CTCGGCGTGGTGCTCTGGGAAA TTTTCACATACGGAAAGCAGCCGTGGTATCAACTTAGCAACAATGAGGTGATAGAGTGTATTACACAGGG TCGGGTGTTGCAGCGCCCTCGAACGTGCCCACAAGAAGTATATGAACTTATGCTCGGGTGCTGGCAAAGA GAACCACATATGAGAAAAAATATCAAGGGGATACATACATTGCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCACCCG TCTACCTCGATATACTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGA GAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCAC TCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATA AAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCA ACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATA GACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCA AAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGG AAGATAG

[SEQ ID No: 108]

Por tanto, en una realización más preferida, la construcción comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 107 o 108, o un fragmento o variante de la misma.

Los inventores han creado una serie de vectores de expresión recombinantes que comprenden la construcción de la invención.

Por tanto, de acuerdo con un segundo aspecto, se proporciona un vector recombinante que comprende la construcción genética de acuerdo con el primer aspecto, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno neurodegenerativo o accidente cerebrovascular.

Las construcciones y los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden usarse para promover la regeneración y supervivencia nerviosas. En algunas realizaciones, el vector recombinante es para el tratamiento, prevención o mejora de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de la neurona motora o accidente cerebrovascular. Los vectores de recombinación descritos en este documento pueden ser para cualquier tratamiento o uso como se describe en este documento.

El vector recombinante puede ser un vector de AAV recombinante (rAAV). El rAAV puede ser un vector de origen natural o un vector con un serotipo híbrido de AAV. El rAAV puede ser AAV-1, AAV-2, AAV-3A, AAV-3B, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 y AAV -11. Preferiblemente, el rAAV es el serotipo 2 del rAAV.

Ventajosamente, el AAV2 recombinante evoca una respuesta inmune mínima en los organismos hospedadores y media la expresión del transgén a largo plazo que puede persistir durante al menos un año después de la administración del vector.

El término “vector de AAV recombinante (rAAV)”, como se utiliza en este documento, significa un ácido nucleico derivado de AAV recombinante que contiene al menos una secuencia de repetición terminal.

Las realizaciones preferidas del vector se muestran en las Figuras 2-5.

Se proporciona un método para tratar, prevenir o mejorar un trastorno neurodegenerativo o accidente cerebrovascular en un sujeto, o para promover la regeneración nerviosa y/o la supervivencia en un sujeto, el método comprende administrar, a un sujeto que necesite dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción genética de acuerdo con el primer aspecto, o el vector recombinante de acuerdo con el segundo aspecto.

En algunas realizaciones, el método puede ser para el tratamiento, prevención o mejora de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de la neurona motora, enfermedad de Huntington o cualquier otro trastorno neurodegenerativo divulgado en el presente documento.

Preferiblemente, la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con la invención se utilizan en una técnica de terapia génica. El agonista codificado por la construcción o vector activa el TrkB también codificado por la construcción/vector para promover de ese modo la supervivencia de las células neuronales.

En otra realización, las construcciones y los vectores pueden usarse para promover la regeneración y/o supervivencia nerviosas.

Se apreciará que la construcción genética de acuerdo con el primer aspecto, o el vector recombinante de acuerdo con el segundo aspecto se puede usar en un medicamento, que se puede usar como monoterapia (es decir, el uso de la construcción genética de acuerdo con el primer aspecto o el vector de acuerdo con el segundo aspecto de la invención), para tratar, mejorar o prevenir un trastorno neurodegenerativo o accidente cerebro vascular, o para promover la regeneración y/o supervivencia nerviosa. Alternativamente, la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con la invención puede usarse como un complemento de, o en combinación con, terapias conocidas para tratar, mejorar o prevenir un trastorno neurodegenerativo o accidente cerebrovascular, o para promover la regeneración nerviosa y/o la supervivencia.

La construcción genética de acuerdo con el vector recombinante de acuerdo con la invención se puede combinar en composiciones que tienen varias formas diferentes dependiendo, en particular, de la manera en que se va a usar la composición. Así, por ejemplo, la composición puede estar en forma de polvo, comprimido, cápsula, líquido, pomada, crema, gel, hidrogel, aerosol, spray, solución micelar, parche transdérmico, suspensión de liposomas o cualquier otra forma adecuada que pueda ser administrado a una persona o animal que necesite tratamiento. Se apreciará que el vehículo de medicamentos de acuerdo con la invención debe ser uno que sea bien tolerado por el sujeto al que se administra.

La construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con la invención también se puede incorporar dentro de un dispositivo de liberación lenta o retardada. Dichos dispositivos pueden, por ejemplo, insertarse sobre o debajo de la piel, y el medicamento puede liberarse durante semanas o incluso meses. El dispositivo puede estar ubicado al menos adyacente al sitio de tratamiento. Dichos dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se requiere un tratamiento a largo plazo con la construcción genética o el vector recombinante y que normalmente requeriría una administración frecuente (por ejemplo, al menos una inyección diaria).

En una realización preferida, los medicamentos de acuerdo con la invención pueden administrarse a un sujeto mediante inyección en el torrente sanguíneo, un nervio o directamente en un sitio que requiera tratamiento. Por ejemplo, el medicamento está configurado para cruzar la barrera hematoencefálica. Las inyecciones pueden ser intravenosas (bolo o infusión) o subcutáneas (bolo o infusión) o intradérmicas (bolo o infusión).

Se apreciará que la cantidad de la construcción genético o del vector recombinante que se requiere está determinada por su actividad biológica y biodisponibilidad, que a su vez depende del modo de administración, las propiedades fisicoquímicas de la construcción genética o del vector recombinante y si se utiliza como monoterapia o en una terapia combinada. La frecuencia de administración también estará influenciada por la vida media del polipéptido cíclico en el sujeto que se está tratando. Los expertos en la técnica pueden determinar las dosis óptimas a administrar, y variarán con la construcción genética particular o el vector recombinante en uso, la concentración de la composición farmacéutica, el modo de administración y el avance o etapa del trastorno. Los factores adicionales que dependen del sujeto particular que se esté tratando darán como resultado la necesidad de ajustar las dosis, incluida la edad, el peso, el sexo, la dieta y el momento de administración del sujeto.

Generalmente, una dosis diaria de entre 0.001 pg/kg de peso corporal y 10 mg/kg de peso corporal, o entre 0.01 pg/kg de peso corporal y 1 mg/kg de peso corporal, de la construcción o vector de acuerdo con la invención puede usarse para tratar, mejorar o prevenir un trastorno neurodegenerativo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de la neurona motora o accidente cerebrovascular, dependiendo de la construcción genética o vector recombinante utilizado.

La construcción genética o el vector recombinante pueden administrarse antes, durante o después del inicio del trastorno. Las dosis diarias se pueden administrar como una sola administración (por ejemplo, una sola inyección diaria o la inhalación de un aerosol nasal). Alternativamente, la construcción genética o el vector recombinante pueden requerir la administración dos o más veces durante un día. Como ejemplo, la construcción genética o el vector recombinante pueden administrarse como dos (o más dependiendo de la gravedad del trastorno que se esté tratando) dosis diarias de entre 0.07 pg y 700 mg (es decir, asumiendo un peso corporal de 70 kg). Un paciente que recibe tratamiento puede tomar una primera dosis al despertar y luego una segunda dosis por la noche (si está en un régimen de dos dosis) o en intervalos de 3 o 4 horas a partir de entonces. Alternativamente, se puede usar un dispositivo de liberación lenta para proporcionar dosis óptimas de la construcción genética o del vector recombinante de acuerdo con la invención a un paciente sin la necesidad de administrar dosis repetidas.

Se pueden usar procedimientos conocidos, tales como los empleados convencionalmente por la industria farmacéutica (por ejemplo, experimentación in vivo, ensayos clínicos, etc.), para formar formulaciones específicas de la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con la invención y tratamientos terapéuticos precisos. regímenes (como las dosis diarias de los agentes y la frecuencia de administración). Los inventores consideran que son los primeros en sugerir un constructo genético que codifica un promotor unido operativamente a secuencias codificantes de un receptor TrkB y un agonista del receptor TrkB.

Se proporciona una composición farmacéutica que comprende la construcción genética o el vector recombinante y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se proporciona un método para preparar la composición farmacéutica, el método comprende poner en contacto la construcción genética o el recombinante con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un “sujeto” puede ser un vertebrado, mamífero o animal doméstico. Por tanto, las composiciones y medicamentos de acuerdo con la invención pueden usarse para tratar cualquier mamífero, por ejemplo, ganado (por ejemplo, un caballo), mascotas, o pueden usarse en otras aplicaciones veterinarias. Sin embargo, lo más preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” de la construcción genética, el vector recombinante o la composición farmacéutica es cualquier cantidad que, cuando se administra a un sujeto, es la cantidad de lo mencionado anteriormente que se necesita para tratar un trastorno neurodegenerativo, enfermedad de Alzheimer, La enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de la neurona motora, el accidente cerebrovascular o producen el efecto deseado, como promover la regeneración y/o la supervivencia nerviosas.

Por ejemplo, la cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción genética, el vector recombinante o la composición farmacéutica utilizada puede ser de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 800 mg, y preferiblemente de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 500 mg. Se prefiere que la cantidad de la construcción genética, el vector recombinante o la composición farmacéutica sea una cantidad de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 250 mg, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 20 mg.

Un “vehículo farmacéuticamente aceptable” como se menciona en el presente documento, es cualquier compuesto conocido o combinación de compuestos conocidos que los expertos en la técnica conocen por ser útil en la formulación de composiciones farmacéuticas.

En una realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser un sólido y la composición puede estar en forma de polvo o comprimido. Un vehículo sólido farmacéuticamente aceptable puede incluir una o más sustancias que también pueden actuar como agentes aromatizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, tintes, cargas, deslizantes, auxiliares de compresión, aglutinantes inertes, edulcorantes, conservantes, tintes, revestimientos o agentes desintegradores de comprimidos. El vehículo también puede ser un material encapsulante. En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que está mezclado con los agentes activos finamente divididos de acuerdo con la invención. En los comprimidos, el agente activo (por ejemplo, la construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con la invención) puede mezclarse con un vehículo que tenga las propiedades de compresión necesarias en proporciones adecuadas y compactarse en la forma y tamaño deseados. Los polvos y comprimidos contienen preferiblemente hasta un 99 % de los agentes activos. Los vehículos sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico. En otra realización, el vehículo farmacéutico puede ser un gel y la composición puede estar en forma de crema o similar.

Sin embargo, el vehículo farmacéutico puede ser un líquido y la composición farmacéutica está en forma de solución. Los vehículos líquidos se utilizan para preparar soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elíxires y composiciones presurizadas. La construcción genética o el vector recombinante de acuerdo con la invención se puede disolver o suspender en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable tal como agua, un disolvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, tampones, conservantes, edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, reguladores de viscosidad, estabilizadores u osmorreguladores. Ejemplos adecuados de vehículos líquidos para administración oral y parenteral incluyen agua (que contiene parcialmente aditivos como antes, por ejemplo, derivados de celulosa, preferiblemente solución de carboximetilcelulosa de sodio), alcoholes (incluidos alcoholes monohídricos y alcoholes polivalentes, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de cacahuete). Para la administración parenteral, el vehículo también puede ser un éster oleoso tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos líquidos estériles son útiles en composiciones en forma líquida estéril para administración parenteral. El vehículo líquido para composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propulsor farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas líquidas, que son soluciones o suspensiones estériles, se pueden utilizar, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa y particularmente subcutánea. La construcción genética o el vector recombinante se puede preparar como una composición sólida estéril que se puede disolver o suspender en el momento de la administración utilizando agua estéril, solución salina u otro medio inyectable estéril apropiado.

La construcción genética, el vector recombinante y la composición farmacéutica de la invención pueden administrarse por vía oral en forma de una solución o suspensión estéril que contenga otros solutos o agentes de suspensión (por ejemplo, suficiente solución salina o glucosa para hacer que la solución sea isotónica), sales biliares, goma arábiga, gelatina, monoleato de sorbitán, polisorbato 80 (ésteres oleato de sorbitol y sus anhídridos copolimerizados con óxido de etileno) y similares. La construcción genética, el vector recombinante o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención también se pueden administrar por vía oral en forma de composición líquida o sólida. Las composiciones adecuadas para la administración oral incluyen formas sólidas, como píldoras, cápsulas, gránulos, comprimidos y polvos, y formas líquidas, como soluciones, jarabes, elíxires y suspensiones. Las formas útiles para la administración parenteral incluyen soluciones, emulsiones y suspensiones estériles.

De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona la construcción genética de acuerdo con el primer aspecto, o el vector recombinante de acuerdo con el segundo aspecto, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno del nervio óptico o un trastorno coclear, o para promover la regeneración y/o la supervivencia nerviosas; en el que la segunda secuencia codificante comprende la forma madura de un factor trófico de la familia de las neurotrofinas. La segunda secuencia codificante puede comprender un péptido señal. La construcción o vector puede ser tal que el agonista carece de la pro-secuencia pero tiene un péptido señal. El péptido señal puede estar unido al extremo terminal N y puede estimular la secreción, expresión o multiplicidad del agonista. La segunda secuencia codificante puede comprender cualquiera de: factor de crecimiento nervioso maduro (NGF), neurotrofina-3 madura (NT-3), neurotrofina-5 madura (NT-5), o fragmentos o variantes de los mismos.

Se apreciará que la invención se extiende a cualquier ácido nucleico o péptido o variante, derivado o análogo del mismo, que comprende sustancialmente las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de cualquiera de las secuencias aquí mencionadas, que incluyen variantes o fragmentos de las mismas. Los términos “sustancialmente la secuencia de aminoácidos/nucleótidos/péptidos”, “variante” y “fragmento”, pueden ser una secuencia que tiene al menos un 40 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos/nucleótidos/péptidos de cualquiera de las secuencias referidas aquí, por ejemplo, 40 % de identidad con la secuencia identificada como SEQ ID NO: 1-108, y así sucesivamente.

También se prevén secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos con una identidad de secuencia que es superior al 65 %, más preferiblemente superior al 70 %, incluso más preferiblemente superior al 75 % y aún más preferiblemente superior al 80 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mencionadas. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos tiene al menos 85 % de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas, más preferiblemente al menos 90 % de identidad, incluso más preferiblemente al menos 92 % de identidad, incluso más preferiblemente al menos 95 % de identidad, incluso más preferiblemente al menos un 97 % de identidad, incluso más preferiblemente al menos un 98 % de identidad y, lo más preferiblemente al menos un 99 % de identidad con cualquiera de las secuencias a las que se hace referencia en este documento.

El técnico experto apreciará cómo calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos/polinudeótidos/polipéptidos. Para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos, primero debe prepararse un alineamiento de las dos secuencias, seguido del cálculo del valor de identidad de la secuencia. El porcentaje de identidad para dos secuencias puede tomar diferentes valores dependiendo de: -(i) el método utilizado para alinear las secuencias, por ejemplo, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman (implementado en diferentes programas), o alineación estructural de comparación 3D; y (ii) los parámetros utilizados por el método de alineación, por ejemplo, alineación local frente a global, la matriz de puntuación de pares utilizada (por ejemplo, BLOSUM62, PAM250, Gonnet, etc.) y penalización por espacio, por ejemplo, forma funcional y constantes.

Una vez realizado el alineamiento, existen muchas formas diferentes de calcular el porcentaje de identidad entre las dos secuencias. Por ejemplo, se puede dividir el número de identidades por: (i) la longitud de la secuencia más corta; (ii) la longitud de la alineación; (iii) la longitud media de la secuencia; (iv) el número de posiciones sin espacio; o (v) el número de posiciones equivalentes excluidos los voladizos. Además, se apreciará que el porcentaje de identidad también depende en gran medida de la longitud. Por lo tanto, cuanto más corto sea un par de secuencias, mayor será la identidad de secuencia que se puede esperar que ocurra por casualidad.

Por tanto, se apreciará que la alineación precisa de secuencias de proteínas o ADN es un proceso complejo. El popular programa de alineación múltiple ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22,4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882) es una forma preferida de generar múltiples alineaciones de proteínas o ADN de acuerdo con la invención. Los parámetros adecuados para ClustalW pueden ser los siguientes: Para alineaciones de ADN: penalización por espacio abierto = 15.0, penalización por extensión del espacio = 6.66 y matriz = identidad. Para alineaciones de proteínas: penalización por espacio abierto = 10.0, penalización por extensión del espacio = 0.2 y matriz = Gonnet. Para alineaciones de a Dn y proteínas: ENDGAP = -1 y GAPDIST = 4. Los expertos en la técnica sabrán que puede ser necesario variar estos y otros parámetros para una alineación de secuencia óptima.

Preferiblemente, el cálculo de identidades porcentuales entre dos secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos se puede calcular a partir de una alineación como (N/T) * 100, donde N es el número de posiciones en las que las secuencias comparten un residuo idéntico, y T es el número total de posiciones comparadas, incluidos los espacios, pero excluyendo los voladizos. Por lo tanto, un método más preferido para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias comprende (i) preparar una secuencia de alineación usando el programa ClustalW que utiliza un conjunto adecuado de parámetros, por ejemplo, como se establece arriba; y (ii) insertar los valores de N y T en la siguiente fórmula: -Secuencia de identidad = (N/T) * 100.

Los expertos en la técnica conocerán métodos alternativos para identificar secuencias similares. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar será codificada por una secuencia que hibrida con secuencias de ADN o sus complementos en condiciones rigurosas. Por condiciones rigurosas, nos referimos a que el nucleótido se hibrida con ADN o ARN ligado al filtro en 3x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C seguido de al menos un lavado en 0.2x SSC/0.1 % SDS a aproximadamente 20-65 °C. Alternativamente, un polipéptido sustancialmente similar puede diferir en al menos 1, pero menos de 5, 10, 20, 50 o 100 aminoácidos de las secuencias mostradas, por ejemplo, en las SEQ ID Nos: 3 y 5.

Debido a la degeneración del código genético, está claro que cualquier secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento podría variarse o cambiarse sin afectar sustancialmente a la secuencia de la proteína codificada por el mismo, para proporcionar una variante funcional de la misma. Las variantes de nucleótidos adecuadas son aquellas que tienen una secuencia alterada por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo aminoácido dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Otras variantes adecuadas son aquellas que tienen secuencias de nucleótidos homólogas pero que comprenden toda o partes de la secuencia, que se alteran mediante la sustitución de diferentes codones que codifican un aminoácido con una cadena lateral de propiedades biofísicas similares al aminoácido que sustituye, para producir un cambio conservador. Por ejemplo, los aminoácidos hidrófobos no polares pequeños incluyen glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina y metionina. Los aminoácidos hidrófobos no polares grandes incluyen fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos polares neutros incluyen serina, treonina, cisteína, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen lisina, arginina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Por lo tanto, se apreciará qué aminoácidos pueden reemplazarse con un aminoácido que tenga propiedades biofísicas similares, y el técnico experto conocerá las secuencias de nucleótidos que codifican estos aminoácidos.

Todas las características descritas en este documento (incluidas las reivindicaciones adjuntas, el resumen y los dibujos) y/o todas las etapas de cualquier método o proceso así divulgado, pueden combinarse con cualquiera de los aspectos anteriores en cualquier combinación, excepto combinaciones. donde al menos algunas de tales características y/o etapas son mutuamente excluyentes.

Para una mejor comprensión de la invención, y para mostrar cómo pueden llevarse a cabo realizaciones de la misma, ahora se hará referencia, a modo de ejemplo, a la figura adjunta, en la que:

La Figura 1 es esquemática de una realización de una construcción genética de acuerdo con la invención;

La Figura 2 es un dibujo esquemático de una primera realización de un vector recombinante de acuerdo con la invención conocido como “Plásmido QTA001PA” que contiene la secuencia señal canónica (azul) más proBDNF (rojo) y mBDNF (negro). También incluye una secuencia -IRES-GFP-(cian y violeta);

La Figura 3 es un dibujo esquemático de una segunda realización del vector recombinante de acuerdo con la invención conocido como “Plásmido QTA002P” sin proBDNF (pero produce solo mBDNF) y la misma secuencia señal (azul) que QTA001PA. También incluye una secuencia -IRES-GFP-(cian y violeta);

La Figura 4 es un dibujo esquemático de una tercera realización del vector recombinante de acuerdo con la invención conocido como “Plásmido QTA003P” sin proBDNF (pero produce solo mBDNF) y secuencia señal de IL-2 (azul). También incluye una secuencia -IRES-GFP-(cian y violeta);

La Figura 5 es un dibujo esquemático de una cuarta realización de un vector recombinante de acuerdo con la invención conocido como “Plásmido QTA004P” sin proBDNF (pero produce solo mBDNF) y una secuencia señal novedosa (azul). También incluye una secuencia -IRES-GFP-(cian y violeta);

La Figura 6 muestra secuencias de nucleótidos y aminoácidos para diferentes realizaciones del péptido señal utilizado en la construcción de la invención. El segundo residuo es treonina (t) que puede reemplazarse por uno o más residuos básicos, como lisina (K) o arginina (R). El siguiente tramo de residuos que incluye isoleucina (I), leucina (L), fenilalanina (F) y leucina (L) puede reemplazarse por uno o más residuos hidrófobos;

La Figura 7 muestra la liberación de BDNF de las células HEK293 usando un ELISA específico a las 24 horas después de la transducción de un plásmido (4 |jg de ADN/pocillo) que contiene genes que codifican mBDNF con diferentes secuencias de péptidos señal y sin la secuencia de codificación del componente proBDNF extendido (Los datos se muestran como media ± EEM para n = 4);

La Figura 8 muestra los resultados de la inmunotransferencia Western de las concentraciones celulares de material inmunorreactivo de BDNF (unidades arbitrarias) en lisados de células HEK29324 horas después de la transducción del plásmido (datos mostrados como media ± EEM para n = 4);

La Figura 9 muestra la inmunorreactividad de BDNF en inmunotransferencias Western de lisados celulares que muestran dos bandas de peso molecular (32 kDa y 14 kDa) cuando las células se transdujeron con QTA001PA, frente a una única banda de 14 kDa con transducción de QTA002p , QTA003P y QTA004P;

La Figura 10 muestra las concentraciones de proBDNF en el medio de incubación HEK293 medidas usando un ELISA específico 24 horas después de la transducción del plásmido usando un ELISA proBDNF selectivo (datos mostrados como media ± EEM para n = 4);

La Figura 11 muestra la expresión de BDNF en el lisado de células HEK293 por los plásmidos QTA002P (secuencia de péptido señal canónica endógena) y QTA009P a QTA013P. Los datos se muestran como media EEM ** P <0.01 en comparación con QTA002P;

La Figura 12 muestra la expresión de BDNF en medio de incubación de células HEK293 por los plásmidos QTA002P (secuencia de péptido señal canónica endógena) y QTA009P a QTA013P.

Los datos se muestran como media EEM. ** P <0.01 en comparación con QTA002P;

La Figura 13 muestra inmunotransferencias Western de células HEK29324 horas después de que fueron transducidas con los plásmidos QTA015P (que expresan BDNF y eGFP separados por un espaciador IRES), QTA021P (que expresan BDNF seguido de eGFP separados por una secuencia de péptido viral-2A funcional), QTA022P (que expresa BDNF seguido de eGFP separado por una secuencia de péptido viral-2A no funcional) y QTA023P (que expresa eGFP seguido de codificación de BDNF separado por una secuencia de péptido viral-2A funcional). Los datos se muestran como inmunorreactividad de BDNF (A), inmunorreactividad de eGFP (B) y la cantidad de BDNF liberada de las células HEK293 en el medio de incubación (C). Los datos se muestran como media EEM de la densidad en las bandas;

La Figura 14A muestra la inmunotransferencia Western de homogeneizados de células HEK29348 horas después de la transfección con el vector QTA020V y muestra el procesamiento eficiente de la región codificante del precursor grande que incluye el receptor TrkB y el BDNF separados por la secuencia del péptido viral-2A. Las Figuras 14B y 14C muestran que las proteínas transgénicas producidas después de la escisión del péptido vial-2A se han transportado a los compartimentos intracelulares correctos en las células HEK293 después del procesamiento (receptores TrkB a la superficie celular y BDNF a las vesículas de almacenamiento antes de la liberación); La Figura 15A muestra la expresión del receptor TrkB y la Figura 15B muestra la expresión de BDNF en un homogeneizado de retina de ratón para el vector rAAV2, QTA020V. Los datos se muestran como la media EEM de la densidad en la transferencia western de homogeneizados de retina de ratón. ** P <0.01 en comparación con los no tratados previamente (animales no inyectados);

La Figura 16 muestra la expresión de los transgenes TrkB (A) y BDNF (B) en la capa de células ganglionares de la retina de ratón como se muestra por inmunocitoquímica después de la inyección de QTA020V, un vector rAAV2 que contiene la codificación del receptor TrkB y BDNF, separados por la secuencia de péptidos del virus-2A;

La Figura 17 muestra la supervivencia de las células ganglionares de la retina (RGC) después del aplastamiento del nervio óptico (ONC) en el ratón frente a los animales de control tratados con el vector rAAV2-CAG-eGFP. Los datos se muestran como media EEM. para el número medio de células ganglionares de la retina a lo largo de la retina por animal contadas por células positivas para Brn3A en montajes planos retinianos. *** P <0.001, * P <0.05 en comparación con los controles;

La Figura 18 muestra la expresión de los transgenes BDNF (Figura 18A) y TrkB (Figura 18B) en homogeneizados de células de neuroblastoma SH-SY5Y humano indiferenciado mediante inmunotransferencia Western después de la transfección con vectores virales rAAV2 que no expresan transgenes (virus nulo), solo BDNF (QTA027V), TrkB solamente (QTA025V) y tanto BDNF como TrkB (QTA020V). La Figura 18C muestra el nivel de receptores TrkB fosforilados activados en las células SH-SY5Y en inmunotransferencias Western después de la transfección con los vectores virales nulos, QTA020V, QTA025V o QTA027V. Se encontró que solo el vector QTA020V que expresa tanto BDNF como TrkB aumenta significativamente la activación de los receptores TrkB, en comparación con las células no transfectadas (** P <0.01; ANOVA seguido de pruebas t modificadas de Bonferroni para comparaciones múltiples). Los datos se muestran como media EEM. para n = 4 experimentos;

La Figura 19 muestra el nivel de muerte celular apoptótica de células SH-SY5Y indiferenciadas en cultivo después de la exposición al estrés oxidativo producido por la adición de peróxido de hidrógeno (H2O2 a 0.1 mM o 1.0 mM) por tinción TUNEL. Se encontró que las células transfectadas con el vector rAAV2 QTA020V, que expresa los receptores BDNF y TrkB, antes de la adición del peróxido de hidrógeno, estaban significativamente protegidas contra la apoptosis en comparación con las células no tratadas (** P <0.01; ANOVA seguido de pruebas t modificadas de Bonferroni para comparaciones múltiples). Los datos se muestran como media EEM. para n = 6-10; y

La Figura 20 muestra imágenes inmunocitoquímicas representativas de nervios ópticos obtenidas de ratones transgénicos Tau humanos mutantes P301S y teñidas con anticuerpos que reconocen Tau fosforilada en las posiciones serina 396/serina 404 (PHF-1) o serina 202/serina 205 (AT8). A los ratones se les inyectó intravítreamente el vector rAAV2 QTA020V (que expresa los receptores mBDNF y TrkB) a los 3 meses de edad y se terminaron tres semanas más tarde antes de la eliminación de los nervios ópticos para inmunocitoquímica.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos demuestran el uso de realizaciones de la presente invención para promover la regeneración y/o supervivencia nerviosas. La enseñanza derivada de los usos, métodos y tratamientos divulgados por los Ejemplos también es aplicable al tratamiento de los trastornos neurodegenerativos y el accidente cerebrovascular, como se divulga en el presente documento.

Métodos y materiales

Clonación molecular y construcciones de plásmidos

La optimización de codones de las secuencias de ADN se realizó utilizando la herramienta en línea (http://www.idtdna.com/CodonOpt) y los bloques de ADN se sintetizaron mediante Integrated DNA Technologies, Inc.

(idT; 9180 N. McCormick Boulevard, Skokie, IL 60076-2920, EE. UU.) o GenScript (860 Centennial Ave, Piscataway, NJ 08854, EE. UU.). La clonación para producir el plásmido maestro QTA001PA y los plásmidos posteriores se realizaron usando biología molecular estándar y técnicas de clonación.

Ampliación y purificación de plásmidos

Los plásmidos de ADN se ampliaron en células competentes SURE (Agilent Technologies; cat. # 200238) durante la noche para proporcionar 2.29 pg/pl de plásmido después de la purificación maxi-prep. Los plásmidos restantes se ampliaron hasta una escala 500 pg y calidad de transducción con mínima presencia de endotoxinas.

Cultivo HEK293 y transducción celular con ADN plasmídico

Se cultivaron células HEK293 (400.000 células) en poli-L-lisina (10 ug/ml, Sigma-Aldrich; cat. # P1274) recubiertas con placas de 6 pocillos en 1.5 ml de medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que contenía un 10 % de suero fetal bovino (FBS), penicilina al 1 % y estreptomicina al 1 % (Pen/Strep al 1 %) hasta una confluencia del 80 %. A continuación, el medio se cambió por 2 ml de DMEM (sin aditivos). Dos o tres horas más tarde, se añadió a cada pocillo un medio de transfección adicional de 0.5 ml que contenía 4 |jg de ADN plasmídico más 10 j l de lipofectamina (4 jl/ml; Thermo Fisher Scientific; No. de cat. 12566014), lo que dio como resultado un volumen total de 2.5 ml durante todo el período de transfección. y para la recogida de sobrenadantes.

Cultivo SH-SY5Y y transfección celular con vectores virales rAAV2

Se cultivaron células SH-SY5Y en placas de 6 pocillos (300.000 células), placas de 96 pocillos (10.000 células) o en cubreobjetos de vidrio de 13 mm (100.000 células) recubiertos con poli-L-lisina (10 jg/ml, producto Sigma # P1274). Se usó medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que contenía 10 % de suero fetal bovino (FBS), 1 % de penicilina y 1 % de estreptomicina (1 % Pen/Strep) para cultivar células hasta un 80 % de confluencia a 37 °C antes de cambiarlas a DMEM con sin aditivos antes de la transfección. Los volúmenes de DMEM usados fueron placas de 6 pocillos (2 ml), placa de 96 pocillos (100 jl), cubreobjetos (500 jl). Los vectores, diluidos en PBS, se agregaron directamente al medio de cultivo a una concentración final de 1.0 x 1010 (VP)/mL y se incubaron durante 48 horas a 37 °C.

Muerte de células SH-SY5Y inducida por peróxido de hidrógeno y tinción TUNEL

48 horas después de la transfección de células SH-SY5Y, el medio se cambió por DMEM nuevo (sin aditivos). Se diluyó peróxido de hidrógeno (H2O2) (Thermo Fisher Scientific; número de producto BP2633500, número de lote 1378087) en agua filtrada (a una concentración de 0.1 o 1.0 mM) y se añadió en un volumen igual a los pocillos o placas durante 24 horas más. El agua filtrada sirvió como control del vehículo. Los cubreobjetos se lavaron dos veces en PBS y se fijaron durante 30 min en paraformaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1 M a temperatura ambiente.

Después de tres lavados más en PBS, las células se bloquearon y se permeabilizaron mediante incubación en suero de cabra normal al 5 % (NGS), albúmina de suero bovino (BSA) al 3 % y Triton X-100 al 0.3 % en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos policlonales de conejo comerciales para TrkB (Abcam; producto # ab33655, lote # GR232306-1 diluido 1: 500), anticuerpos policlonales anti-BDNF de conejo (Santa Cruz Biotechnology Inc; producto # sc- 546; lote No. CO915 a una dilución de 1: 300) o p-Tyr515-TrkB (producto Abeam No. ab109684 lote n.o GR92849-4 1: 750) diluido en solución de bloqueo. La tinción se reveló usando anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con alexa fluor 488 (Life Technologies; producto # A11034 a 1: 1000) durante 2 horas a temperatura ambiente. Para la tinción TUNEL (Promega; producto # G3250; lote # 0000215719), las células se lavaron tres veces en PBS y se sumergieron en tampón de equilibrio TUNEL durante 10 minutos. La mezcla de reacción TUNEL se preparó de acuerdo con el protocolo del fabricante y se añadieron 100 jl/cubreobjetos a las células durante 1 hora a 37 °C. La reacción se detuvo incubando en una solución de citrato estándar (SCS) 1X durante 15 minutos. Los núcleos celulares se contra tiñeron con 1 jg/m l de DAPI (Thermo Scientific; producto No. D1306 a 1: 8000). Las células se lavaron adicionalmente tres veces antes de montarlas con reactivo fluorSave ™ (Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, EE. UU.) Antes de la formación de imágenes. La formación de imágenes se llevó a cabo utilizando un objetivo de 20X y un microscopio de epifluorescencia Leica DM6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).

Medición de BDNF por ELISA

Se midió la cantidad de BDNF secretada por las células HEK293 en medio de cultivo celular 24 horas después de la transfección. El medio se centrifugó para eliminar los residuos y se midió usando un kit ELISA de BDNF humano comercial (Sigma-Aldrich, producto # RAB0026). La concentración de BDNF se determinó comparando muestras con estándares de BDNF recién hechos.

Inmunotransferencia Western para los receptores BDNF y TrkB

Se midió la cantidad de inmunorreactividad de BDNF y TrkB dentro de las células HEK293 retirando el medio de incubación DMEM, lavando las células en solución salina tamponada con fosfato fría y añadiendo 350 j l de tampón de lisis recién preparado a los pocillos (10 ml de reactivo Lysis-M 1 comprimido de Mini Cóctel inhibidor de proteasa completo, Roche; No. de cat. 04719964001, 100/jl de Cóctel inhibidor de la fosfatasa Halt (100X), Thermo Scientific; No. de cat. 78428). Después de la homogeneización celular, la suspensión de proteínas se cuantificó usando el ensayo BCA (kit de ensayo de proteínas Pierce BCA, Thermo Scientific; No. de cat. 23227). Entre 6 jg y 15 jg de proteína de lisado de células HEK293/carril se pasaron por un gel Bis-Tris (12% NuPAGE Novex; No. de cat. NP0342BOX, Thermo Scientific) y se examinaron mediante inmunotransferencia Western utilizando los anticuerpos anti-BDNF policlonales de conejo primarios (Santa Cruz Biotechnology Inc; producto # sc-546; a una dilución 1: 500), anticuerpos anti-TrkB policlonales de conejo (Abcam; cat. # Ab33655, usado a una dilución 1: 2000) o anticuerpos eGFP (Abeam producto # ab-290 usado a 1: 500) que se incubaron durante la noche. Los anticuerpos primarios se visualizaron con anticuerpos anticonejo conjugados con HRP (Vector Laboratories; cat. # PI-1000, a 1: 8000) y detección de señal usando ECL Prime (Amersham, GE Healthcare, Reino Unido) y un sistema de imágenes Alliance inmunotransferencia Western (UVItec Ltd, Cambridge, Reino Unido). Para las inmunotransferencias Western de retina de ratón, los ojos de los animales tratados con vector se homogeneizaron en 500 |jl de tampón de lisis recién preparado (10 ml de reactivo Lysis-M 1 comprimido de cóctel de inhibidor de proteasa Complete Mini, producto de Roche No. 04719964001 100 j l de cóctel de inhibidor de fosfatasa Halt (100X), Producto Thermo Scientific No. 78428). El tejido se rompió durante 1 minuto (Qiagen, producto TissueRuptor No. 9001273) y luego se mantuvo en hielo durante 15 minutos más. A continuación, la proteína se analizó mediante inmunotransferencia Western como se describió anteriormente.

Inmunocitoquímica

Se sembraron células HEK293 (70.000) en cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina de 13 mm dentro de placas de 4 pocillos y se incubaron en DMEM que contenía FBS al 10 % y Pen/Strep al 1 % en 0.5 ml de medio. Una vez que las células habían crecido hasta un 80 % de confluencia, el medio se intercambió por 0.4 ml de DMEM (sin aditivos) durante 2-3 horas y luego se añadió un medio de transfección de 0.1 ml adicional (0.8 jg de ADN plasmídico 2 j l de lipofectamina) para que el resultado final el volumen alcanzó 0.5 ml. Los cubreobjetos se lavaron dos veces en PBS y se fijaron durante 30 min en paraformaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1 M a temperatura ambiente. Después de tres lavados más en PBS, las células se bloquearon y se permeabilizaron mediante incubación en suero de cabra normal (NGS) al 5 %, albúmina de suero bovino (BSA) al 3 % y Triton X-100 al 0.3 % en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos policlonales de conejo comerciales para BDNF (Santa Cruz Biotechnology Inc; producto No. sc-546; a una dilución de 1: 300) o TrkB (producto de Abeam No. ab33655, diluido 1: 500) diluido en solución de bloqueo. La tinción se reveló usando anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con alexa fluor 647 (Invitrogen, producto No. A21248 a 1: 1000) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los núcleos celulares también se contra tiñeron con 1 jg/m l de DAPI (Thermo Scientific, producto No. D1306 a 1: 8000). Las células se lavaron adicionalmente tres veces antes de montarlas con reactivo fluorSave ™ (Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, EE. UU.) Antes de la formación de imágenes. La obtención de imágenes se realizó utilizando un objetivo de 20X y un microscopio de epifluorescencia Leica DM6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) o un microscopio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) equipado con un objetivo de aceite de 63X utilizando un zoom digital de 3X y 0.5­ 0.8 de intervalo de etapa z de exploración secuencial.

Para la inmunocitoquímica de estructuras retinianas y nervios ópticos de animales de control o tratados con vector (entre 3 o 4 semanas después de la inyección), los ojos cuidadosamente disecados se fijaron en paraformaldehído al 4 %/PBS al 0.1 % (pH 7.4) durante la noche y se deshidrataron en 30 °C. % sacarosa/PBS al 0.1 % a 4 °C (24 horas). A continuación, los ojos se incrustaron en moldes de silicona que contenían un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (Sakura Finetek, Zoeterwoude, Países Bajos) y se congelaron en hielo seco. Se recogieron secciones de trece jm a través del eje dorsal-ventral/superior-inferior de la retina o secciones longitudinales a través del nervio óptico de ratones P301S en portaobjetos superfrost plus (producto VWR No. 631-0108), utilizando un criostato Bright OTF 5000 (Bright Instruments, Huntingdon, Reino Unido). Los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS y se permeabilizaron en suero de cabra normal al 5 % (NGS), albúmina de suero bovino (BSA) al 3 % y Triton X-100 al 0.3 % en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego, los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos policlonales de conejo comercial para BDNF (Santa Cruz Biotechnology Inc; producto # sc-546 1: 300), TrkB (Abcam; producto # ab33655 1: 500), Tau Ser396/404 (PHF-1; generado en Cambridge 1: 500) o Tau Ser202/205 (AT8; producto de Invitrogen # MN1020 1: 500) diluido en solución de bloqueo. La tinción se reveló usando anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con alexa fluor 647 (Invitrogen, producto No. A21248 a 1: 1000) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los núcleos de las células de la retina también se contra tiñeron con 1 jg/m l de DAPI (Thermo Scientific, producto No. D1306 a 1: 8000). Los portaobjetos se lavaron adicionalmente tres veces antes de montarlos con el reactivo fluorSave™ (Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, EE. UU.) Antes de la formación de imágenes. La formación de imágenes se realizó con un objetivo de 20X y un microscopio de epifluorescencia Leica DM6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) o un microscopio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) equipado con un objetivo de aceite de 63X con un zoom digital de 3X y 0.5 - 0.8 de intervalo de etapas z de exploración secuencial.

Inyecciones intravítreas

Después de un período de aclimatación de 7 a 10 días, se asignaron al azar ratones C57/BL.6 de 12 semanas o P301S de 16 semanas (Harlan labs, Bicester, Reino Unido) en varios grupos de estudio. Luego fueron anestesiados con inyección intraperitoneal de ketamina (50 mg/kg) y xilacina (5 g/kg). Se administraron gotas oftálmicas de tetracaína tópica al 1 % el día 1 del estudio. La dilatación pupilar se logró utilizando gotas oftálmicas de tropicamida al 1 %. Utilizando un microscopio quirúrgico, se hizo un orificio piloto escleral de espesor parcial con una aguja de calibre 30 para facilitar la penetración de la esclerótica subyacente, la coroides y la retina mediante una micropipeta de metal fino con un diámetro de la punta de 30 jm y una longitud de la punta de 2.5 mm. A continuación, se conectó la micropipeta a una jeringa de vidrio de 10 j l (Hamilton Co., Reno, NV) antes de extraer 2 j l de suspensiones de vector en la pipeta, dependiendo del grupo. Se tuvo cuidado de evitar la penetración del cristalino o daños en las venas del vórtice durante la inyección intravítrea. El lugar de la inyección se apuntó aproximadamente 3 mm por detrás del limbo supero-temporal. Las inyecciones se administraron lentamente durante 1 minuto para permitir la difusión de la suspensión del vector. El ojo derecho se dejó intacto y sirvió como control contralateral interno.

Aplastamiento del nervio óptico (ONC)

Tres semanas (21 días) después de la administración del vector, los ratones se sometieron al procedimiento ONC, se dejaron sin tratar o se trituraron simuladamente. Bajo un endoscopio quirúrgico binocular, se hizo una pequeña incisión con tijeras de resorte en la conjuntiva comenzando por debajo del globo y alrededor del ojo temporalmente. Esto expuso la cara posterior del globo, lo que permitió la visualización del nervio óptico. El nervio óptico expuesto se sujetó aproximadamente a 1-3 mm del globo con unas pinzas de acción cruzada (Dumont # N7 cat. # RS-5027; Roboz) durante 10 s, con la única presión de la acción de autoapriete para presionar el nervio. Después de 10 s, se liberó el nervio óptico, se retiran las pinzas y el ojo vuelve a girar a su lugar. 7 días después de la ONC, se sacrificaron los animales. Ambos ojos de cada grupo se fijaron colocando el órgano en paraformaldehído al 4 %/PBS al 0.1 % (pH 7.4) durante la noche. A continuación, se prepararon montajes planos retinianos tras la disección de la estructura posterior del ojo de la córnea y la extracción del cristalino. Los montajes planos retinianos se fijaron posteriormente durante 30 minutos en paraformaldehído al 4 %/PBS al 0.1 % y se lavaron en Triton X-100 al 0.5 % en PBS. Las retinas se congelaron a -80 °C durante 10 minutos para penetrar la membrana nuclear y mejorar la permeación de anticuerpos antes de bloquearlas en suero de burro normal (NDS) al 10 %, albúmina de suero bovino (BSA) al 2 % y Triton X-100 al 2 % en p Bs durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las RGC se contratiñeron con anticuerpos contra Brn3A (Santa Cruz 1: 200, # SC-31984) y se visualizaron bajo microscopía de fluorescencia usando un objetivo de 20X y un microscopio de epifluorescencia Leica DM6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Se obtuvieron imágenes de mayor resolución utilizando un microscopio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems) equipado con un objetivo de aceite de 40X con un zoom digital de 1.5X y un intervalo de etapas z de barrido secuencial de 0.5 a 0.8. Los recuentos de células RGC se midieron con ImageJ utilizando la herramienta basada en imágenes para contar el complemento de núcleos (ITCN) y se expresaron como densidad de RGC/mm2.

Construcciones y vectores

Los inventores han generado una construcción genética, como se muestra en la Figura 1, que puede usarse para tratar a un sujeto que padece una patología del nervio óptico, como glaucoma, o una patología coclear, o para promover la regeneración y/o supervivencia del nervio. La construcción se ha diseñado para mantener o aumentar la densidad de los receptores TrkB en la superficie celular de las RGC y mantener o aumentar la señalización a través de la ruta del receptor TrkB mediante la producción concomitante y la liberación local de mBDNF.

La construcción comprende transgenes que codifican el receptor TrkB y su agonista, factor neurotrófico maduro derivado del cerebro. Estos transgenes están unidos operativamente a un único promotor, que es el promotor de la sinapsina I humana (SYN I) o el promotor CAG. De manera ventajosa, la construcción de la Figura 1 puede colocarse en un vector rAAV2 sin verse obstaculizada por el tamaño de los transgenes que codifica. Esto se debe a que la construcción está orientada de tal manera que el primer transgén, TrkB, se une a la secuencia del péptido 2A viral seguido por el péptido señal de BDNF y luego la proteína madura. Esta orientación también minimiza los riesgos de inmunogenicidad porque la secuencia corta de aminoácidos terminal N del péptido 2A viral permanece unida a la porción intracelular del receptor TrkB y el aminoácido prolina residual de la secuencia 2A viral terminal C permanece unido al péptido señal de BDNF de terminal N y finalmente se elimina de la proteína mBDNF después de la escisión. El vector se puede colocar en una solución tamponada farmacológicamente aceptable, que se puede administrar a un sujeto.

Las figuras 2-5 muestran varias realizaciones de vectores de expresión. La Figura 2 muestra el vector conocido como “Plásmido QTA001PA” que contiene la secuencia de señal canónica (azul) (es decir, MTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID NO: 20]) más proBDNF (rojo) y mBDNF (negro). La Figura 3 muestra el vector conocido como “Plásmido QTA002P”. No codifica proBDNF, sino que solo produce mBDNF y codifica la misma secuencia de señal (azul) que QTA001PA. La Figura 4 muestra el vector conocido como “Plásmido QTA003P” que tampoco codifica proBDNF, pero produce solo mBDNF. En lugar de la secuencia de señal canónica para mBDNF, comprende una secuencia de señal de IL-2 (azul). Finalmente, la Figura 5 muestra el vector conocido como “Plásmido QTA004P”. No codifica proBDNF, sino que solo produce mBDNF. También codifica una secuencia de señal novedosa (azul), [SEQ ID NO: 32].

Los inventores han producido e investigado la construcción y el vector relacionados con el concepto de terapia génica del glaucoma comenzando con el elemento BDNF maduro (mBDNF). Han demostrado claramente la producción y liberación de mBDNF a partir de células HEK293 después de la transducción de lipofectamina con un plásmido que contiene la secuencia de BDNF sin la región codificante de proBDNF (QTA002P, ver Figura 3) (ver Figura 7). El mBDNF liberado de las células es el monómero de 14 kDa previsto (medido mediante inmunotransferencia Western y un anticuerpo disponible comercialmente para BDNF) y no hay evidencia de agregados de proteínas, como lo han informado varios grupos que intentan generar cantidades comerciales de mBDNF utilizando levadura y otros enfoques de fabricación basados en células1. Por tanto, el mBDNF se libera en una forma que puede permitir que las moléculas de proteína formen dímeros no covalentes para activar los receptores TrkB.

Usando un ELISA para BDNF (que no diferencia entre mBDNF y la proteína proBDNF extendida más grande), los inventores también han demostrado que es posible sustituir la secuencia de ADN que codifica la secuencia de péptido señal canónica endógena de 18 aminoácidos (MTILFLTMVISYFGCMKA) con una nueva secuencia de péptidos (QTA004P - ver Figura 5) y liberan niveles equivalentes de BDNF en el medio de incubación HEK293 después de la transducción de lipofectamina de las células con plásmidos que contienen el gen BDNF (ver Figura 7).

La sustitución del péptido señal endógeno por la secuencia que codifica el péptido señal de interleucina-2 (QTA003P - ver Figura 4) fue menos eficaz para liberar BDNF del medio. Los niveles de BDNF liberados en el medio están actualmente alrededor de 1-2 nM y las concentraciones de este agonista son suficientes para activar al máximo los receptores TrkB específicos (IC50 de aproximadamente 0.9 nM). Los niveles de liberación de BDNF son aproximadamente 35 veces más altos (876 ± 87 ng/ml de BDNF) con el plásmido QTA001PA (ver Figura 2) que contiene las secuencias combinadas de proBDNF y mBDNF y que también incluye el péptido señal canónico de 18 aminoácidos en comparación a los plásmidos QTA002P (ver Figura 3) y QTA004P (ver Figura 5).

Las mediciones del BDNF que permanece en la célula mediante inmunotransferencia Western cuantitativa 24 horas después de la transducción del plásmido de lipofectamina revelaron concentraciones restantes de BDNF más bajas con QTA001PA que aquellas con QTA002P y QTA004P (ver Figura 8).

Además, aproximadamente la mitad de la inmunorreactividad de BDNF en los lisados celulares transducidos por QTA001PA estaba en forma de proBDNF (banda de peso molecular a 32 kDa) mientras que la banda de proBDNF estaba ausente en los lisados de células transducidas con QTA002P, QTA003P y QTA004P. (ver Figura 9), probablemente porque estos plásmidos no contienen una secuencia codificante extendida proBDNF.

Usando un ELISA específico para proBDNF, los inventores pudieron demostrar que alrededor de 70 ng/ml (2.2 nM o 3.5 %) de inmunorreactividad de BDNF liberada de células transducidas por QTA001PA está en forma de proBDNF mientras que la mayoría (96.5 % o 876 ng/mL/63 nM) se libera como mBDNF (consulte la Figura 10). No se detectó inmunorreactividad de proBDNF a partir de células transducidas por QTA002P, QTA003P o QTA004P que no contienen la secuencia codificante para el proBDNF extendido.

De acuerdo con lo anterior, está claro que todos los plásmidos son capaces de producir la proteína mBDNF de 14 kDa, pero que las cantidades de mBDNF liberadas de las células HEK293 dependen en gran medida de la eficiencia en el almacenamiento y empaquetamiento de proteínas en vesículas secretoras. Por lo tanto, la forma extendida de la proteína, que contiene las secuencias combinadas de proBDNF y mBDNF, como se produce con el plásmido QTA001PA (Figura 2), se empaqueta en vesículas secretoras y se libera al medio de incubación de manera mucho más eficiente que con las secuencias más pequeñas de mBDNF que parecen acumularse dentro la célula.

Con referencia a la Figura 11, se muestra que la sustitución de la codificación de la secuencia del péptido señal canónico endógeno, como se representa en el plásmido QTA002P, con nuevas secuencias incluidas en los plásmidos QTA009P a QTA013P aumenta la concentración de BDNF en las células HEK293 24 horas después de la transducción. con plásmidos. La Figura 12 demuestra que la sustitución de la secuencia codificante del péptido señal canónico endógeno incluida en el plásmido QTA002P con secuencias novedosas (plásmidos QTA009P a QTA013P) aumenta la liberación de BDNF (medido por ELISA) de las células HEK293, medido 24 horas después de la transducción con plásmidos.

Como se muestra en la Figura 13, la adición de la secuencia del péptido viral-2A da como resultado un procesamiento eficaz de la secuencia codificante de la proteína precursora grande en dos transgenes, eGFP y BDNF. Las inmunotransferencias Western muestran células HEK293 24 horas después de que fueron transducidas con plásmidos: (i) QTA015P (que expresa BDNF y eGFP separados por un espaciador IRES), (ii) QTA021P (que expresa BDNF seguido de eGFP separado por una secuencia de péptido funcional viral-2A ), (iii) QTA022P (que expresa BDNF seguido de eGFP separado por una secuencia peptídica viral-2A no funcional) y (iv) QTA023P (que expresa eGFP seguido de codificación de BDNF separado por una secuencia peptídica viral-2A funcional).

La secuencia codificante de QTA021P (plásmido que contiene la secuencia optimizada de codones para mBDNF-péptido viral 2A-eGFP) se denomina aquí como SEQ ID NO: 104, como sigue:

ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCAC GCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGT GGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATAT TTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACT GGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGG ATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCCGTG AAGCAGACCCTGAACTTTGATTTGCTCAAGTTGGCGGGGGATGTGGAAAGCAATCCCGGGCCAATGGTGA GCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACA CAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGC ACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCA GCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGA AAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACC CTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGG AATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTT CAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATC GGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTA

La secuencia codificante de QTA022P (plásmido que contiene secuencia optimizada de codones para mBDNF-péptido viral-2A no funcional-eGFP) se denomina aquí como SEQ ID NO: 105, como sigue:

ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCAC GCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGT GGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATAT TTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACT GGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGG ATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCTGTC AAACAAACCCTCAATTTTGACTTGCTGAAGCTTGCTGGGGATGTCGAGTCCGCTGCCGCGGCTATGGTGA GCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACA CAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGC ACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCA GCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGA AAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACC CTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGG AATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTT CAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATC GGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTA ATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGA GCTTTACAAGTAA

[SEQ ID No: 105]

La secuencia codificante de QTA023P (plásmido que contiene la secuencia de codones optimizados para eGFP-péptido viral 2A-mBDNF) se denomina aquí como SEQ ID NO: 106, como sigue:

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAA ACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTT CATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAG TGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACG TCCAGGAGCGCACGATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGG CGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCAC AAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGG TGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACAC CCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAG GACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCA TGGACGAGCTGTACAAGGCTCCCGTTAAACAAACTCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCTGGAGACGT GGAGTCCAACCCTGGACCTATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAG GCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGG CAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAA AGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGG GGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGG ATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAA AAGGGGAAGATAG

[SEQ ID No: 106]

Con referencia a la Figura 14A, se muestra una inmunotransferencia Western de homogeneizados de células HEK293 48 horas después de la transfección con el vector QTA020V. Se muestra un procesamiento eficiente de la gran región codificante del precursor que incluye el receptor TrkB y el BDNF separados por la secuencia del péptido viral-2A. Los dos transgenes inmunorreactivos de TrkB y mBDNF están dentro de los tamaños de peso molecular correctos predichos. Debe notarse una falta de tinción de la proteína precursora grande por encima de la banda del receptor TrkB, lo que indica un procesamiento casi completo o completo de la proteína precursora en cinco repeticiones. Las figuras 14b y 14C muestran que las proteínas transgénicas producidas después de la escisión del péptido vial-2A se han transportado a los compartimentos intracelulares correctos en las células HEK293 después del procesamiento (receptores TrkB a la superficie celular y BDNF a las vesículas de almacenamiento antes de la liberación).

La Figura 15 muestra que la adición de la secuencia de péptido viral-2A que separa las dos regiones codificantes para el receptor TrkB y BDNF da como resultado un procesamiento eficaz en los dos transgenes en la retina de ratón después de la inyección intravítrea del vector rAAV2, QTA020V.

La Figura 16 muestra la expresión de transgenes en la capa de células ganglionares de la retina de ratón como se muestra por inmunocitoquímica después de la inyección de QTA020V, un vector rAAV2 que contiene la codificación del receptor TrkB y BDNF, separados por la secuencia del péptido viral-2A. Los cuerpos de las células ganglionares de la retina diana se tiñen de rojo con anticuerpos anti-Brn3A y los núcleos de las células se tiñen de azul con DAPI para distinguir las capas de la retina.

Con referencia a la Figura 17, se muestra que el pretratamiento de QTA020V (que contiene la codificación del receptor TrkB y BDNF, separados por la secuencia del péptido viral-2A) mediante inyección intravítrea (2 pl de 9x1012 partículas de vector/ml) imparte una eficacia neuroprotectora significativa sobre la supervivencia de las células ganglionares de la retina tras el aplastamiento del nervio óptico en el ratón frente a los animales de control tratados con el vector rAAV2-CAG-eGFP. El nivel de neuroprotección por el vector QTA020V también fue mayor que el proporcionado por un vector que expresa únicamente BDNF. Los tres grupos de animales se sometieron a un procedimiento de aplastamiento del nervio óptico y se midió el número de células ganglionares de la retina 7 días después de la agresión. Las células ganglionares de la retina se redujeron en un 71 % en los controles (barras negras) frente a los animales sometidos a un aplastamiento simulado (datos no mostrados).

Los efectos neuroprotectores de las construcciones

Con referencia a la Figura 18, se muestra la expresión de los transgenes BDNF (ver Figura 18A) y los transgenes TrkB (ver Figura 18B) en homogeneizados de células de neuroblastoma SH-SY5Y humano indiferenciado mediante inmunotransferencia Western después de la transfección con vectores virales rAAV2 que no expresan transgenes (virus nulo), solo BDNF (QTA027V), solo TrkB (QTA025V) y tanto BDNF como TrkB (QTA020V). Está claro que se consiguen buenos niveles de expresión.

Con referencia a la Figura 18C, se muestra el nivel de receptores TrkB fosforilados activados en las células SH-SY5Y en inmunotransferencias Western después de la transfección con los vectores virales nulos, QTA020V, QTA025V o QTA027V. Se encontró que solo el vector QTA020V que expresa tanto BDNF como TrkB aumenta significativamente la activación de los receptores TrkB, en comparación con las células no transfectadas. Como tal, se ha demostrado que las construcciones de la invención expresan eficazmente ambos transgenes y dan como resultado receptores TrkB fosforilados activados en las células SH-SY5Y del neuroblastoma, lo que indica que se pueden tratar trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer o el accidente cerebrovascular.

Con referencia a la Figura 19, se muestra el nivel de muerte celular apoptótica de células SH-SY5Y de neuroblastoma indiferenciado en cultivo después de la exposición al estrés oxidativo producido por la adición de peróxido de hidrógeno (H2O2 a 0.1 mM o 1.0 mM) por tinción TUNEL. Se descubrió sorprendentemente que las células transfectadas con el vector rAAV2 QTA020V, que expresa tanto los receptores BDNF como TrkB, antes de la adición del peróxido de hidrógeno, estaban significativamente protegidas contra la apoptosis frente a las células no tratadas. Nuevamente, estos datos apoyan la idea de que las construcciones de la invención pueden usarse en el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno neurodegenerativo o accidente cerebrovascular.

Con referencia ahora a la Figura 20, se muestran imágenes inmunocitoquímicas representativas de nervios ópticos obtenidos de ratones transgénicos Tau humanos mutantes P301S y teñidos con anticuerpos que reconocen Tau fosforilada en las posiciones serina 396/serina 404 (PHF-1) o serina 202/serina 205 (AT8).

Los ratones transgénicos P301S desarrollan pérdida neuronal y atrofia cerebral a los ocho meses, principalmente en el hipocampo, pero extendiéndose a otras regiones cerebrales, incluyendo la neocorteza y la corteza entorrinal. Desarrollan inclusiones enredadas neurofibrilares generalizadas en el neocórtex, la amígdala, el hipocampo, el tronco encefálico y la médula espinal. La patología del enredo se acompaña de microgliosis y astrocitosis, pero no de placas amiloides [56, 57, 58].

Los ratones se trataron mediante inyección intravítrea con QTA020V que expresa tanto los receptores TrkB como el BDNF en las células ganglionares de la retina diana y sus axones. Las imágenes de la Figura 20 ilustran que el grado de hiperfosforilación de Tau, utilizando PHF-1 y AT-8, se reduce significativamente en los axones que constituyen el nervio óptico. Estos datos in vivo muestran que el aumento de la expresión de TrkB y BDNf , utilizando las construcciones de la invención, puede reducir significativamente la fosforilación de Tau en neuronas, que es una de las características fisiopatológicas asociadas con los cerebros de Alzheimer.

Conclusiones

Se apreciará que, para la enfermedad de Alzheimer, no existe un modelo preclínico único, que generalmente se considera un sustituto de la enfermedad y en el que se puede probar una terapia génica con un grado de previsibilidad hacia un resultado clínico. Sin embargo, lo que están disponibles son modelos animales en los que las modificaciones de su genoma han dado como resultado la introducción de uno de los cambios genéticos/neuroquímicos o bioquímicos definitorios en roedores que se han identificado en humanos con la enfermedad. Estos cambios incluyen la producción excesiva de Ap y la formación de placas [59] generación de una proteína tau hiperfosforilada dentro de los cuerpos de células neuronales y axones que se considera que median el transporte axonal [60] y la reducción tanto del BDNF como de su receptor afín, TrkB [11-14, 27].

Basado en tejido post-mortem humano y la capacidad de varios agentes que pueden eliminar con éxito el beta-amiloide de ambos animales experimentales mediante el bloqueo de la enzima BACE-1 responsable de su generación (verubecestat; Merck) o mediante la neutralización de anticuerpos (por ejemplo, solenezumab; Eli Lilly y bapineuzumab; Pfizer/J & J), ambos enfoques no han logrado producir un beneficio clínico significativo en los estudios clínicos de fase III. Por lo tanto, de los cambios post-mortem ampliamente descritos en cerebros humanos diagnosticados con enfermedad de Alzheimer, la pérdida de la señalización del BDNF y la presencia de ovillos neurofibrilares asociados con tau hiperfosforilada son los únicos enfoques no probados para restaurar o ralentizar los cambios fisiopatológicos asociados con esta afección neurológica.

Usando un esfuerzo inventivo significativo, los inventores han abordado el problema de superar la pérdida en la señalización de BDNF usando una construcción novedosa que es simultáneamente capaz de expresar y regular por aumento tanto los receptores TrkB como el BDNF, ambos de los cuales se ha informado que son reducido en esta enfermedad (véanse las referencias citadas anteriormente).

Como el BDNF tiene una vida media corta, la administración regular de BDNF recombinante, que puede requerir varias inyecciones al día en el cerebro o mediante infusión constante, no es clínicamente factible y probablemente estaría asociada con la regulación por disminución del receptor TrkB. Además, los inventores también han demostrado en la Figura 18C que en las células SHSY-5Y, un rAAV2 que exprese receptores TrkB solo no es suficiente para aumentar significativamente la actividad de este receptor, medido por los niveles de tinción activa p-Y515-TrkB. Las construcciones de la invención, que han sido diseñadas específicamente para acomodar las grandes secuencias codificantes tanto del receptor TrkB como del BDNF a través de una serie de etapas inventivas que incluyen: (i) pérdida de la codificación pro-BDBF, (ii) introducción de un péptido señal novedoso para superar los problemas asociados con el transporte intracelular y la multiplicidad normal de proteínas de BDNF debido a la omisión de la importante secuencia Pro-BDNF, (iii) construir un solo transgén que contenga una secuencia de péptido viral-2A que facilite el 'salto' de traducción entre la producción ribosómica de TrkB y las secuencias de BDNF, y (iv) finalmente abreviadas las secuencias de WPRE y poIyA. Por lo tanto, los inventores han proporcionado evidencia de que la nueva construcción que expresa dos transgenes, BDNF, y su receptor afín, BDNF, es muy superior a los receptores de TrkB de regulación por aumento simple solos. Los inventores también han demostrado que las nuevas construcciones de terapia génica son capaces de proporcionar una actividad óptima, como se ha demostrado previamente [56], pero sin el requisito de inyecciones adicionales (regulares) de BDNF.

El objetivo principal del inventor fue desarrollar una terapia génica que sea capaz de abordar los niveles bajos de señalización de BDNF/TrkB que los ejemplos proporcionados demuestran claramente. Lo inesperado fue que la nueva construcción de terapia génica es capaz de una reducción importante en la densidad de la proteína Tau hiperfosforilada (medida usando dos anticuerpos que reconocen varios residuos de serina fosforilada a lo largo de la longitud de la proteína Tau), como se muestra en la Figura 20. Tau es una proteína ubicua que se encuentra en el cerebro y otros tejidos neurales, como el nervio óptico. Utilizando el nervio óptico como sistema modelo, se encontró que el aumento de la señalización de BDNF en el ojo reduce el nivel patológico propuesto de esta isoforma de proteína. Por lo tanto, no se anticipó la capacidad de regulación por aumento la señalización de BDNF/TrkB en la cepa de ratón transgénico P301S y observar una reducción tan profunda en la densidad de Tau fosforilada.

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46. Vecino E, Ugarte M, Nash MS, Osborne NN. (1999). NMDA induces BDNF expression in the albino rat retina in vivo. Neuroreport., vol.10, PP: 1103-1106.

47. Mowla SJ, Farhadi HF, Pareek S, Atwal JK, Morris SJ, Seidah NG, Murphy RA, (2001). Biosynthesis and posttranslational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. J. Biol. Chem.,, vol. 276, PP: 12660­ 12666.

48. Gupta VK, You Y, Gupta VB, Klistorner A, Graham SL, (2013). TrkB receptor signalling: Implications in neurodegenerative, psychiatric and proliferative disorders. Int. J. Mol. Sci., vol.14, PP: 10122-10142

49. Teng HK, Teng KK, Lee R, Wright S, Tevar S, Almeida RD, Kermani P, Torkin R, Chen ZY, Lee FS, Kraemer RT, Nykjaer A, Hempstead BL, (2005). ProBDNF induces neuronal apoptosis via activation of a receptor complex of p 75NTR and sortilin. J. Neurosci., vol. 25, PP: 5455-5463.

50. Wei Y, Zhang F, Zao J, Jiang X, Lu Q, Gao E, Wand N, (2012). Enhanced protein expression of proBDNF and proNGF in elevated intraocular pressure-induced rat retinal ischemia. Chin. Med. J., vol. 125, PP: 3875-3879.

51. Woo NH, Teng HK, Siao C-J, Chiaruttini C, Pang PT, Milner TA, Hempstead BL,Lu B, (2005). Activation of P75NTR by proBDNF facilitates hippocampal long-term depression. Nature Neurosci., vol. 8, PP: 1069-1077.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un vector recombinante que comprende una construcción genética que comprende un promotor operativamente ligado a una primera secuencia codificante, que codifica el receptor de tirosina quinasa B (TrkB), y una segunda secuencia codificante, que codifica un agonista del receptor TrkB, donde el agonista es BDNF maduro o NT-4 maduro, en el que la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que aumenta la secreción del agonista del receptor TrkB, y en el que la construcción genética comprende una secuencia espaciadora dispuesta entre la primera y la segunda secuencias codificantes, cuya secuencia espaciadora codifica un péptido espaciador que está configurado para ser digerido para producir de ese modo el receptor TrkB y el agonista como moléculas separadas, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno neurodegenerativo.

2. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la construcción genética comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el Elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WHPE), opcionalmente en el que el WHPE comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se establece en la SEQ ID No: 57 o 58, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 57 o 58, y/o donde la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cola polyA, opcionalmente en la que

la cola de polyA comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 59, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 59.

3. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que: i) el promotor es el promotor de la sinapsina I humana (SYN I), en el que opcionalmente el promotor comprende una secuencia de ácidos nucleotídicos sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 1, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1; o

ii) el promotor es el promotor CAG, opcionalmente en el que el promotor comprende una secuencia de ácido nucleotídico sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 2, 3 o 48, o un fragmento o variante del mismo al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, 3 o 48.

4. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la secuencia espaciadora comprende y codifica una secuencia espaciadora de péptido viral, más preferiblemente una secuencia espaciadora de péptido 2A viral.

5. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que:

i) la secuencia espaciadora de péptidos comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 4, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4;

ii) la secuencia espaciadora comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 5, o un fragmento o variante de la misma con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 5;

iii) la secuencia espaciadora de péptidos comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 6, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6;

iv) la secuencia espaciadora comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 7, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7; o

v) la secuencia espaciadora de péptidos comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 8, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8.

6. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la isoforma canónica humana de TrkB, en el que la isoforma canónica de TrkB comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 9, o un fragmento o variante de al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 9, y/o en el que la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 10, o un fragmento o variante con al menos un 65 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10.

7. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la isoforma 4 de TrkB, opcionalmente en el que la isoforma 4 de TrkB comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 11, o un fragmento o variante con al menos un 65 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11.

8. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 12, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 12.

9. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 9, en el que uno o más residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID NO: 9 se modifica a un residuo de aminoácido diferente, opcionalmente en el que al menos dos, tres o cuatro residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID NO: 9 se modifican a un residuo de aminoácido diferente.

10. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que los cinco residuos de tirosina en la posición 516, 701, 705, 706 y/o 816 de SEQ ID NO: 9 se modifican a un residuo de aminoácido diferente, y/o en el que el o cada residuo de tirosina se modifica a un ácido glutámico.

11. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que la forma modificada del receptor TrkB comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 13, o un fragmento o variante con al menos un 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 13, en el que opcionalmente la primera secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 14, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 14.

12. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la segunda secuencia codificante codifica neurotrofina-4 (NT-4), que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 49 o 55, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 49 o 55, y/o la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 50 o 56, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 50 o 56.

13. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica BDNF maduro.

14. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el BDNF maduro comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 18, o un fragmento o variante con al menos un 65% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 18, en el que opcionalmente la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 19, o un fragmento o variante con al menos un 65 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 19.

15. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal para el agonista del receptor TrkB, lo más preferiblemente un péptido señal para BDNF, opcionalmente en el que:

i) la secuencia de nucleótidos codifica el péptido señal canónico para BDNF, en el que la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 20, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 20; o

ii) la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 21, o un fragmento o variante con al menos un 65 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 21.

16. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de secuencia señal como se establece en una cualquiera de SEQ ID NO: 23, 25, 27 o 29, o en el que el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 22, 24, 26 o 28, y/o en el que la segunda secuencia codificante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de secuencia señal como se establece en una cualquiera de SEQ ID NO: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 61, 63, 65, 6769, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 o 103; o en el que el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en una cualquiera de SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 o 102.

17. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la construcción comprende una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 107 o 108, o un fragmento o variante con al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 107 o 108.

18. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el vector es un vector AAV recombinante (rAAV), opcionalmente en el que el rAAV es AAV-i, AAV-2, AAV-3A, AAV-3B, AAV- 4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, a Av -10 o AAV-11, opcionalmente en el que el rAAV es rAAV serotipo-2.

19. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que el trastorno neurodegenerativo se selecciona de un grupo que consiste en: enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ataxia telangiectasia, lipofuscinosis ceroide neuronal, enfermedad de Batten, encefalopatía espongiforme bovina (EEB), enfermedad de Canavan, parálisis cerebral, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, degeneración lobar frontotemporal, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Huntington, demencia asociada al VIH, enfermedad de Krabbey, demencia con cuerpos de Lewy, trastornos de almacenamiento lisosómico, neuroborreliosis, enfermedad de Machado-Joseph, enfermedad de la neurona motora, atrofia del sistema múltiple, esclerosis múltiple, deficiencia de sulfatasa múltiple, mucolipidosis, narcolepsia, Niemann-Pick tipo C, enfermedad de Niemann Pick, enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Merzbacher Pelizaeus, enfermedad de Pick, enfermedad de Pompe, esclerosis lateral primaria, enfermedades priónicas, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, degeneración combinada subaguda de la médula espinal secundaria a anemia perniciosa, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten, ataxia espinocerebelosa, atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, Tabes dorsalis y Enfermedad de Tay-Sachs.

20. Un vector recombinante, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer, en el que opcionalmente se reduce la fosforilación de Tau en neuronas.