CN110809476A - 用于神经退行性病症或中风的治疗的基因构建体 - Google Patents

用于神经退行性病症或中风的治疗的基因构建体 Download PDF

Info

Publication number
CN110809476A
CN110809476A CN201880023931.XA CN201880023931A CN110809476A CN 110809476 A CN110809476 A CN 110809476A CN 201880023931 A CN201880023931 A CN 201880023931A CN 110809476 A CN110809476 A CN 110809476A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
genetic construct
leu
use according
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201880023931.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN110809476B (zh
Inventor
彼得·威多森
基思·马丁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Quethera Ltd
Original Assignee
Quethera Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Quethera Ltd filed Critical Quethera Ltd
Publication of CN110809476A publication Critical patent/CN110809476A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110809476B publication Critical patent/CN110809476B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

本发明提供了基因构建体和包含此类构建体的重组载体。所述构建体和载体可在用于治疗、预防或改善神经退行性病症(包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、运动神经元疾病)，或用于治疗中风，或用于促进神经再生和/或存活的基因疗法中使用。

Description

用于神经退行性病症或中风的治疗的基因构建体
本发明涉及基因构建体，并且具体地涉及包含此类构建体的重组载体，以及所述构建体和载体在用于治疗、预防或改善神经退行性病症，或用于治疗中风，或用于促进神经再生和/或存活的基因疗法中的用途。
神经退行性疾病是那些主要影响神经元的疾病。退行过程可涉及神经元结构的逐渐丧失、神经元功能的逐渐丧失或者渐进性神经元细胞死亡。许多特定的疾病被归类为神经退行性疾病。帕金森氏病是一种长期神经退行性病症，据估计会影响约七百万人。亨廷顿氏病也是一种长期神经退行性病症，因此需要改善对帕金森氏病和亨廷顿氏病的治疗，并且促进神经再生或存活可有益于此类患者。
运动神经元疾病包括对运动神经元具有神经退行效应的任何病症。该病症包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、原发性侧索硬化症(PLS)、进行性肌萎缩症(PMA)、进行性延髓麻痹(PBP)、假性延髓麻痹或脊肌萎缩症。中风在通往脑的血流被中断或减少时发生，并且不良的血流可导致细胞死亡。
阿尔茨海默氏病占所有痴呆症的约60％，并且据估计，全世界有2600万人被报道患有阿尔茨海默氏病[1]。痴呆症涉及心智功能的逐渐下降，通常包括记忆力、语言和认知过程方面的缺陷。阿尔茨海默氏病不仅会影响患者自身，而且还对数百万需要照料患者的照护者产生重大影响，这些照护者通常是无偿的。由于阿尔茨海默氏病的最大风险因素是年龄，因此随着人们在老年期存活的时间延长，患病率急剧上升[1]。越来越多的阿尔茨海默氏病患者已经对全球医疗卫生系统产生了重大影响。与阿尔茨海默氏病相关的典型病理学涉及脑的严重萎缩、脑皮层中灰质的变薄、指示神经元丧失的脑室扩大、包含β-淀粉样肽[Aβ]的微观细胞外淀粉样斑块(其聚集成蛋白质团块)、包含聚集的Tau蛋白的细胞内神经元纤维缠结，以及脑血管淀粉样蛋白(即围绕血管的淀粉样蛋白)。在阿尔茨海默氏病中，脑中的许多区域具有由错误折叠的淀粉样β-肽的细胞外沉积造成的淀粉样斑块，以及由过度磷酸化的Tau蛋白组成的神经元纤维缠结，尤其是额部，颞部和顶叶皮质，海马，以及基底前脑的胆碱能核群(cholinergic nuclei)。这些脑区域代表了对于短期记忆而言必不可少的神经元回路中所涉及的关键区域。淀粉样斑块沉积在整个脑中随机出现，而细胞内神经元纤维缠结的出现看起来遵循明确定义的模式[2]，所述明确定义的模式首先在跨内嗅皮质中被检测到。然后观察到神经元纤维缠结依次扩散至内嗅皮质、海马区，然后向外扩散至脑皮层。大量研究已经表明，阿尔茨海默氏病中的最早变化之一涉及突触的丧失，突触的丧失与智力下降有关[3]，最终导致遍及多个脑区域的明显细胞丧失。因此，该疾病的症状跟随整个脑中破坏的缓慢进展，首先是无法形成新的记忆，形成新的记忆是依赖于海马的过程。
脑源性神经营养因子(BDNF)以及神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)是营养因子的神经营养蛋白家族的成员[4-5]。神经营养蛋白在周围神经系统和中枢神经系统两者中的广泛神经元的发育、存活和功能方面起至关重要的作用。神经营养蛋白与两种细胞表面受体相互作用，所述两种细胞表面受体为低亲和力p75NTR受体和高亲和力酪氨酸受体激酶(Trk)家族[4-5]。神经生长因子(NGF)优先结合TrkA，脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养蛋白-4/5(NT4/5)结合原肌球蛋白受体激酶-B(TrkB)，并且神经营养蛋白-3(NT-3)结合TrkC(以及以较低程度结合TrkA)[12-13]。
脑源性神经营养因子(BDNF)是这样的蛋白，所述蛋白高度表达并广泛分布于整个中枢神经系统中，尤其是海马和脑皮层中[6-7]。所述BDNF已显示为对海马神经元、皮层神经元、胆碱能神经元和多巴胺能神经元的存活和功能很重要[8]。BDNF与许多脑病症有关，包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、抑郁症、精神分裂症和瑞特综合征(Rett syndrome)。已有假说认为在阿尔茨海默氏病中观察到的早期记忆障碍可能与海马中的BDNF水平有关，因为有报道称阿尔茨海默氏病海马[9]和顶叶皮质[10]中的BDNF mRNA水平大幅下降并且内嗅皮质、海马、颞部、额部和顶叶皮质中BDNF的蛋白水平下降[11-16]。然而，BDNF水平的变化看起来是由于某些BDNF转录物的特异性下调所致。Meta分析还显示，与健康受试者相比，阿尔茨海默氏病患者血液中的神经营养蛋白水平显著降低[17]。而且，较低的脑脊液BDNF浓度被显示为预测从轻度认知障碍(MCI)到阿尔茨海默氏病的进展[18]。
大量研究表明，受试者表现出BDNF前-结构域(pro-domain)的Val66Met多态性(其中缬氨酸被蛋氨酸取代)与到阿尔茨海默氏病的进展增加有关[19]，并且其他BDNF多态性也可能牵涉其中。成熟BDNF(mBDNF)和BDNF的较大前体版本proBDNF的丧失发生在疾病的早期(在斑块沉积之前)，并且与记忆缺陷有关[20-21]。这些数据强烈表明了降低的BDNF浓度、突触丧失和细胞功能障碍之间存在联系，降低的BDNF浓度、突触丧失和细胞功能障碍是阿尔茨海默氏症认知障碍的基础。BDNF还被证明通过与TrkB受体相互作用并随后增强磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白激酶(Akt)信号传导来诱导神经元细胞中的快速Tau去磷酸化[22-23]。因此，BDNF浓度的降低也可导致Tau过度磷酸化，Tau过度磷酸化是AD的病理特征。Tau升高看起来也会引起相反的作用，导致小鼠中的BDNF表达降低[24]。最近的数据还表明了在存在神经营养蛋白(包括BDNF)的前-结构域的情况下Aβ神经毒性的潜在加重[25]。
在死后的阿尔茨海默氏症脑中也发现了表达mBDNF受体TrkB的神经元的变化。例如，据报道来自阿尔茨海默氏症患者的死后脑中TrkB阳性神经元减少了47％[26]。这可能归因于正常表达受体的神经元的丧失或归因于TrkB表达的生物化学下调。在阿尔茨海默病的额皮质和颞皮质两者中截短的受体同种型TrkB-T1和TrkB-Shc的上调也可加剧TrkB的减少，所述截短的受体同种型TrkB-T1和TrkB-Shc未表现出神经元存活所必需的激酶活性。神经元培养物中Aβ对蛋白酶钙蛋白酶的激活通过在受体Shc停靠位点附近切割而引起TrkB减少[28]，从而导致全功能型受体转化为具有缺陷激酶活性的截短同种型。然后，将功能性TrkB受体转化为截短同种型的效应可充当神经营养蛋白沉槽(neurotrophin sink)或显性负性(negative)受体。在阿尔茨海默氏病的小鼠模型中，观察到TrkB受体的敲除加剧了阿尔茨海默氏病样的信号传导畸变和记忆缺陷，但不影响Aβ的沉积[29]。这些数据表明，通过减少BDNF的产生和分泌而造成的TrkB受体的丧失和/或活性的丧失是产生阿尔茨海默氏症样症状和病理生理学的重要因素。
导致阿尔茨海默氏病脑中BDNF/TrkB信号传导缺陷的其他重要机制包括在不干扰TrkB-FL和磷脂酶-γ(PLCγ)激活的情况下通过亚致死浓度的Aβ来抑制有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK/ERK)和Pl3K/Akt通路[30]，以及破坏BDNF诱导的TrkB内吞作用。暴露于Aβ低聚物可通过糖原合酶激酶-3β(GSK3β)介导的发动蛋白-1磷酸化来削弱受体内吞作用和下游Akt激活[31]。此外，Aβ低聚物已显示为通过破坏泛素系统[33]和改变钙稳态[34]来干扰BDNF介导的TrkB逆行性运输[32]。
总体情况是阿尔茨海默氏病中的神经营养信号传导，特别是BDNF系统的明显受损。已经在阿尔茨海默氏病的几种动物模型中检查了补充或增强BDNF信号传导。例如，注射BDNF改善了由Aβ诱导的阿尔茨海默氏病大鼠模型中的学习缺陷[1-42][35]。注射含有BDNF的活性结构域的新型融合肽和可穿透脑的HIV编码的转录反式激活因子(TAT)通过在动物模型中激活TrkB/ERK1/2/Akt通路并恢复若干记忆相关蛋白而显著改善了空间记忆[36]。此外，使用基于慢病毒的基因疗法的BDNF表达显示出在阿尔茨海默氏病小鼠转基因模型和表现出认知减退的老年灵长类动物中具有神经保护效应[37]。
BDNF可在脑中产生并且可转运到周围，在周围处所述BDNF可支撑神经元并维持神经元存活[38-44]。在某些情况下，诸如在用诸如N-甲基-D-天冬氨酸等谷氨酸受体激动剂进行兴奋毒性损伤期间，BDNF也可在周围神经元中产生，尽管处于相对低的水平[45-46]。BDNF通常作为含有短信号肽序列的前原-多肽(prepro-polypeptide)(即preproBDNF)产生，这有助于将整个多肽运输到囊泡中以释放到细胞外空间。信号肽的切割和去除将preproBDNF转化为proBDNF。然后在细胞内或细胞外切割N末端proBDNF序列，以产生成熟的BDNF(mBDNF)[47]。pro-BDNF和mBDNF都具有生物学活性，其中pro-BDNF优先激活p75NTR受体，而较短的mBDNF激活TrkB受体[48-50]。例如，视网膜中p75NTR受体和TrkB受体的激活显示出对视网膜神经节细胞(RGC)存活的相反作用，p75NTR受体通过直接的RGC-细胞-身体-p75NTR激活[48-51]或间接地经由Muller细胞上的p75NTR激活而导致细胞凋亡，从而刺激肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放，这进一步促进了RGC丧失[52]。
青光眼动物模型已表明，在神经压迫或IOP升高后，存在从神经营养性mBDNF/TrkB信号传导朝向pro-BDNF/p75NTR通路的转变。已证明视网膜中mBDNF和TrkB受体的水平降低[50，53-54]，同时pro-BDNF受体[28]和p75NTR受体[55]的相对水平相反地升高。与未经治疗的眼睛相比，通过眼部注射重组蛋白向具有实验上升高的IOP的大鼠补充mBDNF提高了RGC的存活，从而证实了这种神经营养蛋白的关键神经保护作用[42-44]。
鉴于上述情况，因此需要用于促进神经再生或存活，用于神经退行性病症或中风的治疗、预防或改善的改良基因疗法。
本发明的发明人已经构建了新型基因构建体，所述新型基因构建体在单个启动子的控制下编码酪氨酸激酶受体B(TrkB)和TrkB受体的激动剂。所述构建体的启动子可用于确保所述激动剂和所述受体仅在适当的神经细胞中表达，并促进这些细胞的存活。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种用于治疗、预防或改善神经退行性病症或中风的基因构建体，所述基因构建体包含：启动子，所述启动子可操作地连接至第一编码序列，所述第一编码序列编码酪氨酸激酶受体B(TrkB)；以及第二编码序列，所述第二编码序列编码TrkB受体的激动剂。
本发明的发明人已经在实施例中证明了可在单个基因构建体中组合编码TrkB受体及其激动剂二者的基因。考虑到它们的大尺寸，这是尤其具有挑战性的，并且无法预测是否可以生理学上有用的浓度来共表达它们。有利地，利用本发明的构建体，不需要如现有技术中所述注射重组蛋白[56]。此外，在现有技术中，仍然有必要执行蛋白质的常规注射，而本发明的构建体仅需要单基因疗法施用。
优选地，在使用时，TrkB受体被激动剂激活，从而促进神经细胞的存活。本发明的基因构建体优选用于治疗、预防或改善神经退行性病症，所述神经退行性病症选自由以下项组成的组：亚历山大病(Alexander's disease)、阿尔珀氏病(Alper's disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、共济失调毛细血管扩张症、神经元蜡样质脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinoses)、巴滕病(Battendisease)、牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy；BSE)、卡纳万病(Canavandisease)、脑性瘫痪、科凯恩氏综合症(Cockayne syndrome)、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration)、戈谢病(Gaucher’s disease)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)、HIV相关性痴呆、肯尼迪氏病(Kennedy's disease)、克腊伯氏病(Krabbe's disease)、路易体痴呆(Lewy body dementia)、溶酶体贮积病(lysosomalstorage disorders)、神经性莱姆疏螺旋体病(neuroborreliosis)、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)、运动神经元病、多系统萎缩症、多发性硬化症、多硫酸酯酶缺乏症(multiple sulfatase deficiency)、脂质贮积病(mucolipidose)、发作性睡病(narcolepsy)、C型尼曼氏病(Niemann–Pick type C)、尼曼氏病(Niemann Pick disease)、帕金森氏病(Parkinson’s Disease)、佩-梅病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、皮克氏病(Pick's disease)、庞贝病(Pompe disease)、原发性侧索硬化症(primary lateralsclerosis)、朊病毒病(prion diseases)、进行性核上麻痹(progressive supranuclearpalsy)、雷夫苏姆病(Refsum's disease)、山德霍夫氏病(Sandhoff disease)、谢耳德氏病(Schilder's disease)、继发于恶性贫血的脊髓亚急性合并变性(subacute combineddegeneration of spinal cord secondary to pernicious anaemia)、四氏病(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease)、脊髓小脑共济失调(spinocerebellarataxia)、脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy)、三氏病(Steele-Richardson-Olszewski disease)、脊髓痨(Tabes dorsalis)，以及泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)。
在一个优选实施方式中，基因构建体用于治疗、预防或改善阿尔茨海默氏病。
在一个优选实施方式中，基因构建体用于治疗、预防或改善亨廷顿氏病。
在一个优选实施方式中，基因构建体用于治疗、预防或改善帕金森氏病。
在一个优选实施方式中，基因构建体用于治疗、预防或改善运动神经元疾病。
在一个优选的实施方式中，基因构建体用于治疗、预防或改善中风。
基因疗法构建体可具有用于治疗神经退行性病症(诸如阿尔茨海默氏病)或中风的几种有益的治疗效果。益处包括在治疗上补充耗尽的脑mBDNF浓度，或补充来自神经营养蛋白家族的其他营养因子。其他益处包括恢复正常脑组织中的TrkB受体密度水平。在缺乏对前-序列(pro-sequence)的编码(例如，缺乏对proBDNF的编码)的基因构建体中包含激动剂的潜能也具有恢复平衡的能力，有利于mBDNF/TrkB型信号传导并远离pro-BDNF/p75NTR型效应。此外，由于基因疗法可用于产生成熟形式的激动剂，诸如mBDNF，而不生成神经营养蛋白的前-结构域，因此加重Aβ神经毒性的风险将显著降低，Aβ神经毒性可在如果构建体产生并释放激动剂的前-形式(pro-form)，诸如proBDNF时发生。优选地，本发明的构建体被配置为减少神经元中的Tau磷酸化(Tau磷酸化是与阿尔茨海默氏脑有关的病理生理特征之一)。
有利地，本发明的构建体因此可用于靶向神经细胞，以维持或增强这些细胞中的TrkB信号转导。因此，该构建体可用于最大化抵抗病理生理应激源的保护，以及促进神经再生和/或存活。此外，由于在一个或多个启动子的控制下TrkB受体和所述受体的激动剂的表达，该构建体可用于提供对神经退行性病症或中风的长期治疗。因此，该构建体已经克服了使用多种替代治疗的需要，所述多种替代治疗即使组合使用也提供短暂的治疗效果。此外，本发明的构建体是有利的，因为其由于TrkB受体和所述受体的激动剂两者的局部增加而可用于显著增强神经细胞对TrkB受体的激动剂的敏感性。
优选地，本发明的基因构建体包含表达盒，所述表达盒的一个实施方式在图1中示出。如在图1中可看出的，该构建体包含启动子、编码TrkB受体的第一核苷酸序列，以及编码成熟的脑源性神经营养蛋白(mBDNF)的第二核苷酸序列，所述mBDNF充当TrkB受体的优选激动剂。然而，应当理解，如本文所讨论的，可使用其他激动剂。同样如图1所示，表达盒还包括2A间隔序列、编码肝炎病毒转录后调控元件(WHPE)的序列、编码polyA尾巴的序列，以及左手和右手反向末端重复序列(ITR)。
因此，优选地，基因构建体包含设置在第一编码序列与第二编码序列之间的间隔序列，所述间隔序列编码肽间隔物，所述肽间隔物被配置为被消化或切割，从而产生作为分离(separate)分子的TrkB受体和激动剂。在图1所示的实施方式中，TrkB受体的编码序列设置在受体激动剂(BDNF)的编码序列的5'，在它们之间有间隔序列。然而，在另一个实施方式中，可将受体激动剂的编码序列设置在受体的编码序列的5'，在它们之间有间隔序列。
优选地，基因构建体包含编码土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WHPE)的核苷酸序列，所述核苷酸序列增强两种转基因的表达，所述两种转基因即TrkB受体及其激动剂，优选地为BDNF。优选地，WHPE编码序列设置在转基因编码序列的3'。
土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WHPE)的一个实施方式长592bp，包括γ-α-β元件，并且在本文中称为SEQ ID No:57，如下所示：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG
[SEQ ID NO.57]
优选地，WHPE包含基本上如SEQ ID No:57所示的核酸序列，或其片段或变体。
然而，在一个优选实施方式中，使用截短的WHPE，所述截短的WHPE由于β元件的缺失而长247bp，并且在本文中称为SEQ ID No:58，如下所示：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGT
[SEQ ID NO.58]
有利地，构建体中使用的截短的WHPE序列总共免去了约300bp，而对转基因表达没有负面影响。优选地，WHPE包含基本上如SEQ ID No:58所示的核酸序列，或其片段或变体。
优选地，基因构建体包含编码polyA尾巴的核苷酸序列。优选地，polyA尾巴编码序列设置在转基因编码序列的3’，并且优选地设置在WHPE编码序列的3’。
优选地，polyA尾巴包含猿猴病毒40poly-A 224bp序列。polyA尾巴的一个实施方式在本文中称为SEQ ID No:59，如下所示：
AGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTA
[SEQ ID NO.59]
优选地，polyA尾巴包含基本上如SEQ ID No:59所示的核酸序列，或其片段或变体。
优选地，基因构建体包含左反向末端重复序列(ITR)和/或右反向末端重复序列(ITR)。优选地，每个ITR设置在构建体的5’端和/或3’端。
第一方面的基因构建体中的启动子可为能够诱导RNA聚合酶结合并转录第一编码序列和第二编码序列的任何核苷酸序列。在一个实施方式中，第一方面的基因构建体中的启动子可为巨细胞病毒(CMV)组成型启动子。该启动子被认为对于神经元和神经胶质细胞均是非选择性的。
在一个优选实施方式中，启动子是人突触蛋白I(SYN I)启动子，其已显示为在人脑中起作用。编码人突触蛋白I(SYN I)启动子的469个核苷酸的序列的一个实施方式在本文中被称为SEQ ID NO.1，如下所示：CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG
[SEQ ID NO.1]
因此，优选地，启动子可包含基本上如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
在另一个优选实施方式中，启动子是CAG启动子，其也已显示为在人脑中起作用。CAG启动子优选包含巨细胞病毒早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子，以及兔β-球蛋白基因的剪接受体。编码CAG启动子的1733个核苷酸的序列的一个实施方式在本文中称为SEQ ID NO.2，如下所示：
CTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTG
[SEQ ID NO.2]
在另一个优选实施方式中，启动子是CAG启动子的截短形式，诸如在本文中称为SEQ ID NO.3的启动子的664个核苷酸的形式，如下所示：CTAGATCTGAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
[SEQ ID NO:3]
在又一个优选实施方式中，启动子是CAG启动子的截短形式，诸如在本文中称为SEQ ID NO.48的启动子的584个核苷酸的形式，如下所示：GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
[SEQ ID No:48]
因此，优选地，启动子包含基本上如SEQ ID No:2、SEQ ID No:3或SEQ ID No:48所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
科学文献中提出的许多双顺反子基因构建体已经(i)并入了双重启动子以分别驱动两种基因的表达，或者(ii)使用脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES)来连接重组病毒载体内从单个启动子转录的两种基因[45-46]。然而，IRES依赖性翻译的效率在不同的细胞和组织中可能不同，并且在双顺反子载体中IRES依赖性第二基因表达可能显著低于cap依赖性第一基因表达[47]。此外，rAAV载体的大小限制(通常<5kb)阻止使用双重启动子或IRES接头将大基因构建体(诸如TrkB受体)与BDNF一起并入。
因此，在一个优选实施方式中，基因构建体包含设置在第一编码序列与第二编码序列之间的间隔序列，所述间隔序列编码肽间隔物，所述肽间隔物被配置为被消化，从而产生作为分离分子的TrkB受体和激动剂。优选地，间隔序列包含并编码病毒肽间隔序列，更优选地病毒2A肽间隔序列[47]。优选地，2A肽序列将第一编码序列连接至第二编码序列。这使得构建体能够克服在各种载体中表达时出现的大小限制，并使得由第一方面的构建体编码的所有肽的表达能够在单个启动子的控制下发生，作为单个蛋白质。
因此，在翻译含有TrkB、2A肽和激动剂(优选地BDNF)的序列的单一蛋白质后，切割在病毒2A肽序列的末端甘氨酸-脯氨酸连接处发生，从而释放出两种蛋白质，即TrkB和激动剂(例如mBDNF)。设计基因构建体，使得病毒2A肽的剩余短N末端氨基酸序列保持附接至TrkB受体的细胞内部分，从而去除免疫原性风险并且不会干扰成熟受体的细胞内信号传导能力。来自C末端病毒2A序列的残留脯氨酸氨基酸保持附接至N末端激动剂信号肽，并且最终在从成熟蛋白上切割掉信号序列后从激动剂蛋白中去除。
本发明的发明人已经产生了间隔序列的两个实施方式。本文所述的两个实施方式共同的肽间隔序列的一个重要区段是C末端。因此，优选地，肽间隔序列包含本文称为SEQID NO.4的氨基酸序列，或其片段或变体，如下所示：
QAGDVEENPGP
[SEQ ID No:4]
优选地，肽间隔序列的消化或切割位点设置在SEQ ID No:4中的末端甘氨酸与末端脯氨酸之间。
在第一优选实施方式中，间隔序列包含本文称为SEQ ID NO.5的核苷酸序列，或其片段或变体，如下所示：
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
[SEQ ID No:5]
在该第一实施方式中，肽间隔序列包含本文称为SEQ ID NO.6的氨基酸序列，或其片段或变体，如下所示：
GSGATNFSLLQAGDVEENPGP
[SEQ ID No:6]
在第二优选实施方式中，间隔序列包含本文称为SEQ ID NO.7的核苷酸序列，或其片段或变体，如下所示：
AGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGG AGGAGAACCCTGGACCT
[SEQ ID No:7]
在该第二实施方式中，肽间隔序列包含本文称为SEQ ID NO.8的氨基酸序列，或其片段或变体，如下所示：
SGATNFSLLKQAGDVEENPGP
[SEQ ID No:8]
发明人已经仔细考虑了TrkB受体的序列，并且已经产生了由第一方面的基因构建体中的第一编码序列编码的受体的几个优选实施方式。
在一个优选实施方式中，第一编码序列包含编码TrkB的人经典(canonical)同种型的核苷酸序列。优选地，TrkB的经典同种型包含在本文中称为SEQ ID NO.9的氨基酸序列(822个残基)，或其片段或变体，如下所示：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
[SEQ ID No:9]
优选地，在该实施方式中，第一编码序列包含在本文中称为SEQ ID NO.10的核苷酸序列，或其片段或变体，如下所示：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC
[SEQ ID No:10]
在另一个优选实施方式中，第一编码序列包含编码TrkB的同种型4的核苷酸序列。优选地，TrkB的同种型4包含在本文中称为SEQ ID NO.11的氨基酸序列，或其片段或变体，如下所示：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKDFSWFGFGKVKSRQGVGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
[SEQ ID No:11]
优选地，第一编码序列的该实施方式包含在本文中称为SEQ ID NO.12的核苷酸序列，或其片段或变体，如下所示：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGATTTCTCATGGTTTGGATTTGGGAAAGTAAAATCAAGACAAGGTGTTGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC
[SEQ ID No:12]
本发明的发明人已经付出了大量的创造性努力来研究TrkB受体的序列，并且已经认识到TrkB包含五个酪氨酸残基(在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和816处)，所述五个酪氨酸残基通常于在BDNF二聚体的存在下发生二聚化和自磷酸化后被磷酸化。这五个酪氨酸残基的磷酸化的问题是受体可容易地被诸如Shp-2磷酸酶等磷酸酶灭活。因此，为了防止受体在体内的磷酸化和由此导致的失活，优选地使这些关键酪氨酸中的一个或多个突变(更优选地，突变成谷氨酸)，以模拟所得的磷酸酪氨酸并产生这样的受体，所述受体在BDNF的存在下保持活性，并且不能被磷酸酶(诸如Shp-2磷酸酶)灭活。TrkB的此类突变形式旨在产生TrkB受体活性，所述TrkB受体活性持续保持有活性达更长的时间，或者保持有活性直到受体被内化为止。
下面提供的DNA和氨基酸序列说明了这五个酪氨酸(Y)残基的位置，这五个酪氨酸(Y)残基已突变为五个谷氨酸(E)残基。应当理解，在本发明的实施方式中，这些残基中的1个、2个、3个、4个或5个可突变为谷氨酸。还设想了这些突变的各种组合，例如仅位置516和701，或仅位置705、706和816，等等。
因此，在另一个优选实施方式中，所述第一编码序列包含编码TrkB受体的突变形式的核苷酸序列，其中SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的一个或多个酪氨酸残基是经修饰的或突变的。优选地，在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的至少两个、三个或四个酪氨酸残基是经修饰的。最优选地，在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的所有五个酪氨酸残基均是经修饰的。
优选地，所述或每个酪氨酸残基被修饰成不同的氨基酸残基，更优选地谷氨酸。因此，优选地，TrkB受体的突变形式包括Y516E、Y701E、Y705E、Y706E和/或Y816E。
优选地，TrkB受体的经修饰形式包含在本文中称为SEQ ID NO.13的氨基酸序列，或其片段或变体，如下所示：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQEFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVESTDEERVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVELDILG
[SEQ ID No:13]
优选地，在该实施方式中，第一编码序列包含在本文中称为SEQ ID NO.14的核苷酸序列，或其片段或变体，如下所示：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGGAATTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGGAAAGCACTGACGAAGAAAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCGAACTGGACATTCTAGGC
[SEQ ID No:14]
应当理解，第二编码序列编码TrkB受体的激动剂，所述TrkB受体的激动剂优选是营养因子的神经营养蛋白家族的成员。TrkB受体的激动剂可为缺乏前-序列的营养因子的神经营养蛋白家族的成员。TrkB受体的激动剂可为成熟形式的营养因子的神经营养蛋白家族的成员。因此，优选的TrkB受体的激动剂可选自由以下项组成的激动剂组：脑源性神经营养因子(BDNF)；神经生长因子(NGF)；神经营养蛋白-3(NT-3)；神经营养蛋白-4(NT-4)；以及神经营养蛋白-5(NT-5)；或它们的片段。优选的TrkB受体的激动剂可选自由以下项组成的激动剂组：缺乏前-序列的脑源性神经营养因子(BDNF)；缺乏前-序列的神经生长因子(NGF)；缺乏前-序列的神经营养蛋白-3(NT-3)；缺乏前-序列的神经营养蛋白-4(NT-4)；以及缺乏前-序列的神经营养蛋白-5(NT-5)；或它们的片段。优选的TrkB受体的激动剂可选自由以下项组成的激动剂组：成熟的脑源性神经营养因子(BDNF)；成熟的神经生长因子(NGF)；成熟的神经营养蛋白-3(NT-3)；成熟的神经营养蛋白-4(NT-4)；以及成熟的神经营养蛋白-5(NT-5)；或它们的片段。
这些激动剂中每一种的核苷酸序列和氨基酸序列是技术人员已知的。然而，举例来说，神经营养蛋白-4(NT-4)的一个实施方式的氨基酸序列基本上如SEQ ID NO.49所示，如下：
MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIESQPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRRGVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA
[SEQ ID No:49]
神经营养蛋白-4(NT-4)的该实施方式的核酸编码序列基本上如SEQ ID NO.50所示，如下：
ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGTCCCAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGCAGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGTGGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC
[SEQ ID No:50]
NT-4序列的信号肽的氨基酸序列基本上如SEQ ID NO.51所示，如下：MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIES
[SEQ ID No:51]
该信号肽的核酸序列基本上如SEQ ID NO.52所示，如下：
ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGTCC
[SEQ ID No:52]
该NT-4序列的前肽的氨基酸序列基本上如SEQ ID NO.53所示，如下：
QPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAP ANRSRR
[SEQ ID No:53]
该前肽的核酸序列基本上如SEQ ID NO.54所示，如下：
CAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGCAGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGT
[SEQ ID No:54]
该NT-4序列的成熟蛋白序列的氨基酸序列基本上如SEQ ID NO.55所示，如下：
GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA
[SEQ ID No:55]
该成熟的NT-4蛋白的核酸编码序列基本上如SEQ ID NO.56所示，如下：
GGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC
[SEQ ID No:56]
因此，在一个优选实施方式中，第二编码序列编码神经营养蛋白-4(NT-4)，所述NT-4可包含基本上如SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，或其片段或变体。因此，第二编码序列可包含基本上如SEQ ID No:50或SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
然而，最优选的TrkB受体的激动剂包括前原-脑源性神经营养因子(pre-pro-BDNF)、pro-BDNF或成熟BDNF(mBDNF)。BDNF最初由在内质网上发现的核糖体合成为前体蛋白preproBDNF。存在由人preproBDNF基因(ENSG00000176697)编码的至少17种已知的剪接变体。一旦preproBDNF进入糙面内质网，preproBDNF通过信号肽(即“pre”序列)的切割而转换为proBDNF。proBDNF通过proBDNF上存在的附加N末端肽序列的切割而转换为mBDNF。然后，proBDNF和mBDNF都分泌到细胞外空间中，在所述细胞外空间中它们结合并激活各种细胞上的受体。
proBDNF优先结合并激活受体P75NTR，该受体被激活时可诱导一些细胞类型的凋亡。因此，在一个优选实施方式中，proBDNF是p75NTR受体的激动剂。在一个实施方式中，proBDNF是经典proBDNF。优选地，经典proBDNF包含在本文中称为SEQ ID NO.15的氨基酸序列，或其片段或变体，如下所示：
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[SEQ ID No:15]
优选地，在该实施方式中，第二编码序列包含本文称为SEQ ID NO.16的核苷酸序列，或其片段或变体，如下所示：
GCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No:16]
在另一个实施方式中，proBDNF是proBDNF的同种型2，其优选包含缬氨酸至蛋氨酸突变(加下划线的氨基酸)。优选地，proBDNF的同种型2包含在本文中称为SEQ ID NO.17的氨基酸序列，或其片段或变体，如下所示：
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHMIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[SEQ ID No:17]
然而，在一个实施方式中，激动剂不是proBDNF或其片段或变体，而是替代地，第二编码序列优选地包含编码成熟BDNF的核苷酸序列。成熟BDNF(mBDNF)优先结合并激活TrkB，所述TrkB当被激活时促进神经细胞的存活。因此，成熟BDNF是最优选的TrkB激动剂。根据第一方面的构建体是有利的，因为与其他已知的基因构建体不同，该构建体能够产生未错误折叠的成熟BDNF蛋白。
因此，在一个优选实施方式中，第二编码序列包含编码成熟BDNF的核苷酸序列。mBDNF是该基因所编码的所有17种同种型所共有的。存在7种不同的蛋白质序列，所述7种中的五种已经将信号序列扩展成经典形式，并且一种具有经典信号序列，但具有缬氨酸至蛋氨酸的突变(这是同种型2、4、7、8、9、10、11、12、13、14和16所共有的)。据信缬氨酸至蛋氨酸的突变减少了BDNF从细胞的释放。
优选地，成熟BDNF包含在本文中称为SEQ ID NO.18的氨基酸序列，或其片段或变体，如下所示：
HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[SEQ ID No:18]
优选地，第二编码序列的该实施方式包含在本文中称为SEQ ID NO.19的核苷酸序列，或其片段或变体，如下所示：
ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No:19]
在另一个实施方式中，激动剂是缺乏前-序列但具有与N末端缀合的信号肽的营养因子的神经营养蛋白家族的成员。激动剂可为处于成熟形式下并且具有与N末端缀合的信号肽的营养因子的神经营养蛋白家族的任何成员。信号肽可为促进激动剂的正确折叠或产生的任何信号肽。在优选实施方式中，信号肽可为本文所公开的任何信号肽。
在又一个优选实施方式中，激动剂是这样的mBDNF，所述mBDNF具有与其N末端缀合的信号肽。如下所述，信号肽可为preproBDNF的经典信号肽，或IL-2的信号肽，或者由发明人创建的从头(de novo)新信号序列。
优选地，第二编码序列包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码用于所述TrkB受体的激动剂的信号肽，最优选用于BDNF的信号肽。在一个优选实施方式中，核苷酸序列编码用于BDNF的经典信号肽。优选地，第二编码序列的该实施方式包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码这样的信号肽，所述信号肽包含本文称为SEQ ID NO.20的氨基酸序列，或其片段或变体，如下所示：
MTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:20]
优选地，第二编码序列的该实施方式包含在本文中称为SEQ ID NO.21的核苷酸序列，或其片段或变体，如下所示：
ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATG AAGGCG
[SEQ ID No:21]
本发明的发明人已经创建了一系列扩展的信号肽。在优选实施方式中，编码BDNF的同种型信号肽的核苷酸序列选自由以下项组成的组：同种型2、3、6、5和4。这些扩展信号肽中的每一种的核酸序列和氨基酸序列在下面列出。
同种型2
MFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:22]
ATGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATG GTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:23]
同种型3和同种型6
MQSREEEWFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:24]
ATGCAGAGCCGGGAAGAGGAATGGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:25]
同种型5
MLCAISLCARVRKLRSAGRCGKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:26]
ATGCTCTGTGCGATTTCATTGTGTGCTCGCGTTCGCAAGCTCCGTAGTGCAGGAAGGTGCGGGAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:27]
同种型4
MCGATSFLHECTRLILVTTQNAEFLQKGLQVHTCFGVYPHASVWHDCASQKKGCAVYLHVSVEFNKLIPENGFIKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:28]
ATGTGTGGAGCCACCAGTTTTCTCCATGAGTGCACAAGGTTAATCCTTGTTACTACTCAGAATGCTGAGTTTCTACAGAAAGGGTTGCAGGTCCACACATGTTTTGGCGTCTACCCACACGCTTCTGTATGGCATGACTGTGCATCCCAGAAGAAGGGCTGTGCTGTGTACCTCCACGTTTCAGTGGAATTTAACAAACTGATCCCTGAAAATGGTTTCATAAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG ACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:29]
因此，在优选实施方式中，第二编码序列包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码这样的信号序列肽，所述信号序列肽在本文中称为SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQID NO.27或SEQ ID NO.29中的任一者。优选地，所述信号肽包含在本文称为SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.28中的任一者的氨基酸序列。
本发明的发明人还创建了用于激动剂(优选BDNF)的新信号肽的各种实施方式。这些信号肽提高了N末端区段(具有添加的赖氨酸(K)和精氨酸(R)残基)和随后的疏水区域(具有添加的亮氨酸(L)残基)的碱性水平，这与利用野生型经典信号序列时观察到的水平相比，增加了BDNF的分泌。
a)QTA003P(IL-2信号)
MYRMQLLSCIALSLALVTNS
[SEQ ID No:30]
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT
[SEQ ID No:31]
b)QTA004P
MKRRVMIILFLTMVISYFGCMK
[SEQ ID No:32]
ATGAAAAGAAGAGTGATGATCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGAGCG
[SEQ ID No:33]
c)QTA009P(经修饰的IL-2)
MRRMQLLLLIALSLALVTNS
[SEQ ID No:34]
ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT
[SEQ ID No:35]
d)QTA010P
MRRMQLLLLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:36]
ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:37]
e)QTA0012P
MRILLLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:38]
ATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:39]
f)QTA0013P
MRRILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:40]
ATGAGAAGAATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:41]
g)QTA0014P
MRRFLFLLVISYFGCMKA
[SEQ ID No:42]
ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:43]
i)QTA0015P
MRRFLFLLYFGCMKA
[SEQ ID No:44]
ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTTACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:45]
图6示出了这样的信号肽的进一步优选实施方式的核苷酸序列和氨基酸序列，所述信号肽被用于本发明的构建体中以增强激动剂(优选BDNF)的分泌。所述信号肽中的第二残基是苏氨酸(T)，所述苏氨酸(T)优选被一个或多个碱性残基(诸如赖氨酸(K)或精氨酸(R))替代。所述信号肽中包括异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和亮氨酸(L)的下一段残基优选被一个或多个疏水残基替代。
因此，在优选实施方式中，第二编码序列包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码这样的信号序列肽，所述信号序列肽在本文中称为SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101或SEQ ID NO.103中的任一者。优选地，信号肽包含本文称为SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ IDNO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ IDNO.100或SEQ ID NO.102中的任一者的氨基酸序列。
因此，应当理解，本发明的发明人已经通过以下方式修饰了BDNF基因序列：去除前-序列(这也是先前从未实现的，所述去除的结果是产生正确折叠的成熟BDNF)与引入完全新的信号肽(其极大地增强了BDNF的产生和释放，高于使用内源序列所能实现的BDNF的产生和释放)的组合。
优选地，基因构建体包含左反向末端重复序列(ITR)和/或右反向末端重复序列(ITR)。优选地，每个ITR设置在构建体的5’端和/或3’端。ITR可特异于病毒(例如AAV或慢病毒)血清型，可为任何序列，只要ITR在其二级结构中形成发夹环即可。
ITR的一个实施方式(来自可商购的AAV质粒的左ITR)的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:46，如下所示：
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
[SEQ ID NO:46]
ITR的另一个实施方式(来自可商购的AAV质粒的右ITR)的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:47，如下所示：
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
[SEQ ID NO:47]
根据前述内容，技术人员应理解第一方面的构建体的实施方式的核苷酸序列以及所编码的转基因的氨基酸序列。但是，为避免疑义，质粒QTA020P(和载体QTA020V)中包含的鼠TrkB受体-病毒-2A肽-mBDNF的密码子优化的2940bp序列的编码序列在本文中称为SEQID No:107，如下所示：
ATGAGCCCATGGCTGAAGTGGCACGGACCAGCAATGGCAAGACTGTGGGGCCTGTGCCTGCTGGTGCTGGGCTTCTGGAGAGCCAGCCTGGCCTGTCCAACCTCCTGCAAGTGTAGCTCCGCCAGGATCTGGTGCACAGAGCCTTCTCCAGGCATCGTGGCCTTTCCCCGCCTGGAGCCTAACAGCGTGGATCCCGAGAATATCACCGAGATCCTGATCGCCAACCAGAAGCGGCTGGAGATCATCAATGAGGACGATGTGGAGGCCTACGTGGGCCTGAGAAACCTGACAATCGTGGACTCCGGCCTGAAGTTCGTGGCCTATAAGGCCTTTCTGAAGAACTCTAATCTGAGGCACATCAACTTCACCCGCAATAAGCTGACATCTCTGAGCCGGAGACACTTTCGGCACCTGGATCTGTCCGACCTGATCCTGACCGGCAATCCATTCACATGCTCTTGTGACATCATGTGGCTGAAGACCCTGCAGGAGACAAAGTCTAGCCCCGATACCCAGGACCTGTACTGTCTGAACGAGTCCTCTAAGAATATGCCTCTGGCCAACCTGCAGATCCCTAATTGTGGACTGCCAAGCGCCCGGCTGGCCGCACCTAACCTGACAGTGGAGGAGGGCAAGTCCGTGACACTGTCCTGTTCTGTGGGCGGCGATCCCCTGCCTACCCTGTATTGGGACGTGGGCAACCTGGTGTCTAAGCACATGAATGAGACCTCCCACACACAGGGCTCTCTGAGAATCACAAATATCAGCTCCGACGATAGCGGCAAGCAGATCTCTTGCGTGGCAGAGAACCTGGTGGGAGAGGATCAGGACAGCGTGAATCTGACCGTGCACTTCGCCCCCACCATCACATTTCTGGAGTCTCCTACCAGCGATCACCACTGGTGCATCCCCTTCACAGTGCGGGGAAACCCAAAGCCCGCCCTGCAGTGGTTTTACAACGGCGCCATCCTGAATGAGTCCAAGTATATCTGTACCAAGATCCACGTGACCAACCACACAGAGTACCACGGCTGCCTGCAGCTGGATAATCCCACCCACATGAACAATGGCGACTACACACTGATGGCCAAGAACGAGTATGGCAAGGACGAGAGGCAGATCAGCGCCCACTTCATGGGCCGCCCTGGAGTGGATTATGAGACCAACCCTAATTACCCAGAGGTGCTGTATGAGGACTGGACCACACCTACCGATATCGGCGACACCACAAACAAGTCTAATGAGATCCCAAGCACAGATGTGGCCGACCAGTCTAACAGGGAGCACCTGAGCGTGTACGCAGTGGTGGTCATCGCCTCCGTGGTGGGCTTCTGCCTGCTGGTCATGCTGCTGCTGCTGAAGCTGGCCCGCCACTCTAAGTTTGGCATGAAGGGCCCAGCCTCCGTGATCTCTAATGACGATGACAGCGCCAGCCCCCTGCACCACATCAGCAACGGCTCCAATACCCCTTCTAGCTCCGAGGGCGGCCCAGATGCCGTGATCATCGGCATGACAAAGATCCCCGTGATCGAGAACCCTCAGTACTTCGGCATCACCAATTCCCAGCTGAAGCCTGACACATTTGTGCAGCACATCAAGCGGCACAACATCGTGCTGAAGAGGGAACTGGGAGAGGGAGCCTTCGGCAAGGTGTTTCTGGCCGAGTGCTATAACCTGTGCCCAGAGCAGGATAAGATCCTGGTGGCCGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGCGACAACGCCCGGAAGGACTTCCACAGAGAGGCCGAGCTGCTGACAAATCTGCAGCACGAGCACATCGTGAAGTTTTACGGCGTGTGCGTGGAGGGCGACCCTCTGATCATGGTGTTCGAGTATATGAAGCACGGCGATCTGAACAAGTTTCTGAGAGCACACGGACCAGATGCCGTGCTGATGGCAGAGGGAAATCCCCCTACCGAGCTGACACAGTCTCAGATGCTGCACATTGCACAGCAGATTGCAGCAGGAATGGTGTACCTGGCCAGCCAGCACTTCGTGCACAGGGATCTGGCAACCAGAAACTGCCTGGTGGGAGAGAATCTGCTGGTGAAGATCGGCGACTTTGGCATGTCCCGGGACGTGTACTCTACCGACTACTATAGAGTGGGCGGCCACACAATGCTGCCCATCAGGTGGATGCCACCCGAGAGCATCATGTATCGCAAGTTCACCACAGAGTCTGACGTGTGGAGCCTGGGCGTGGTGCTGTGGGAGATCTTTACCTACGGCAAGCAGCCTTGGTATCAGCTGTCCAACAATGAAGTGATCGAGTGTATTACACAGGGACGCGTGCTGCAGAGGCCACGCACATGCCCCCAGGAGGTGTACGAGCTGATGCTGGGCTGTTGGCAGCGGGAGCCACACACCAGAAAGAACATCAAGAGCATCCACACACTGCTGCAGAATCTGGCCAAGGCCTCCCCCGTGTATCTGGACATCCTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No:107]
质粒QTA029P(和载体QTA029V)中包含的人TrkB受体-病毒-2A肽-mBDNF的密码子优化的2943bp序列的编码序列在本文中称为SEQ ID No:108，如下所示：
ATGTCATCTTGGATCCGCTGGCACGGGCCAGCGATGGCCCGATTGTGGGGCTTCTGCTGGCTTGTTGTAGGCTTCTGGCGCGCGGCGTTCGCGTGTCCGACCTCTTGCAAATGCTCAGCAAGCCGAATTTGGTGCTCAGACCCTAGTCCAGGAATTGTTGCATTCCCCCGACTGGAACCAAACTCCGTCGACCCGGAGAATATAACTGAGATATTTATTGCAAATCAAAAACGCCTTGAAATCATTAACGAGGATGACGTGGAGGCCTACGTTGGTTTGAGAAATCTTACTATTGTCGACTCCGGACTTAAATTTGTAGCTCATAAAGCCTTCCTGAAGAACTCTAATCTGCAGCACATTAATTTCACGAGAAATAAGCTGACCAGCTTGTCCCGGAAGCATTTCCGCCATCTCGACCTGAGCGAGCTCATACTGGTCGGAAACCCATTTACGTGCTCCTGTGACATCATGTGGATCAAAACTCTGCAAGAGGCGAAAAGTAGTCCGGATACCCAAGACCTTTACTGTCTTAATGAAAGCTCAAAAAATATCCCGCTGGCCAACCTGCAGATACCGAACTGCGGACTTCCTAGTGCGAATTTGGCTGCCCCAAATCTTACCGTCGAAGAAGGCAAATCAATCACGCTTTCTTGTTCTGTAGCTGGAGATCCAGTGCCTAATATGTATTGGGACGTGGGTAACCTCGTCTCAAAACATATGAACGAAACGAGCCACACCCAGGGCTCTTTGCGGATAACAAACATCTCCTCTGATGATTCTGGAAAGCAAATCAGTTGCGTAGCTGAAAATCTGGTTGGCGAAGATCAAGATTCAGTCAATCTGACAGTCCATTTCGCCCCAACGATCACCTTTCTGGAGAGCCCAACTAGCGATCACCACTGGTGTATTCCGTTTACGGTAAAAGGAAATCCAAAACCTGCACTCCAATGGTTTTATAATGGAGCCATCTTGAATGAAAGCAAATATATCTGTACTAAAATCCATGTGACGAATCACACCGAGTATCACGGGTGTCTTCAATTGGATAATCCAACCCATATGAATAATGGTGATTATACTTTGATAGCGAAGAACGAATACGGCAAAGACGAAAAGCAAATATCCGCACATTTCATGGGTTGGCCTGGCATCGACGACGGTGCGAACCCGAACTACCCAGATGTTATTTACGAGGATTATGGGACTGCGGCAAACGACATTGGCGACACCACAAACCGAAGCAACGAGATACCAAGTACTGACGTCACTGACAAAACGGGTCGAGAGCATTTGTCTGTTTACGCCGTTGTTGTTATCGCCTCAGTTGTCGGATTTTGCCTGTTGGTCATGCTTTTCCTCCTGAAGCTCGCGCGACATTCCAAGTTTGGCATGAAGGGG
CCAGCAAGTGTTATATCCAATGATGATGATAGCGCTTCTCCATTGCACCACATAAGTAACGGCTCAAACACGCCGTCATCTAGTGAAGGTGGACCAGACGCGGTCATTATAGGGATGACTAAAATTCCCGTAATCGAAAACCCTCAGTACTTCGGCATAACCAACAGTCAGCTTAAACCCGATACTTTCGTGCAGCACATCAAAAGGCACAACATAGTCCTCAAGCGCGAACTCGGGGAGGGAGCCTTCGGAAAGGTCTTTCTTGCTGAGTGCTATAATTTGTGTCCTGAGCAGGATAAAATTCTTGTGGCTGTAAAAACTCTCAAAGATGCTTCCGACAACGCACGGAAGGATTTTCATCGGGAGGCCGAACTGTTGACGAATTTGCAGCACGAGCATATAGTAAAGTTCTACGGGGTATGTGTTGAGGGGGACCCGTTGATTATGGTCTTCGAGTATATGAAGCACGGGGACCTGAACAAATTTTTGCGCGCCCATGGGCCTGATGCCGTCCTTATGGCAGAAGGGAACCCTCCAACAGAACTCACCCAGAGTCAGATGTTGCACATAGCGCAACAGATCGCGGCCGGCATGGTTTACCTGGCCAGTCAACACTTCGTGCATAGAGATCTTGCCACTCGCAACTGTTTGGTCGGGGAGAACCTTCTGGTTAAGATTGGTGACTTTGGTATGTCACGAGATGTGTATTCCACTGACTATTACAGAGTTGGGGGTCATACAATGCTTCCTATTCGGTGGATGCCCCCCGAATCCATCATGTACAGAAAGTTCACGACAGAGAGTGATGTT TGG AGTCTCGGCGTGGTGCTCTGGGAAATTTTCACATACGGAAAGCAGCCGTGGTATCAACTTAGCAACAATGAGGTGATAGAGTGTATTACACAGGGTCGGGTGTTGCAGCGCCCTCGAACGTGCCCACAAGAAGTATATGAACTTATGCTCGGGTGCTGGCAAAGAGAACCACATATGAGAAAAAATATCAAGGGGATACATACATTGCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCACCCGTCTACCTCGATATACTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No:108]
因此，在最优选的实施方式中，所述构建体包含基本上如SEQ ID No:107或SEQ IDNo:108所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
本发明的发明人已经创建了包含本发明的构建体的一系列重组表达载体。
因此，根据第二方面，提供了包含根据第一方面的基因构建体的重组载体，所述重组载体用于治疗、预防或改善神经退行性病症或中风。
本文所述的构建体和表达载体可用于促进神经再生和存活。在一些实施方式中，重组载体用于治疗、预防或改善阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、运动神经元疾病或中风。本文所述的重组载体可用于本文所述的任何治疗或用途。
重组载体可为重组AAV(rAAV)载体。rAAV可为天然存在的载体或具有杂合AAV血清型的载体。rAAV可为AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10和AAV-11。优选地，rAAV是rAAV血清型2。
有利地，重组AAV2在宿主生物体中引起最小的免疫应答，并介导长期的转基因表达，所述长期的转基因表达在载体施用后可持续至少一年。
如本文所用，术语“重组AAV(rAAV)载体”是指含有至少一个末端重复序列的重组AAV来源核酸。
载体的优选实施方式示出在图2至图5中。
根据第三方面，提供了用于治疗、预防或改善受试者的神经退行性病症或中风，或用于促进受试者的神经再生和/或存活的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的根据第一方面的基因构建体或根据第二方面的重组载体。
在一些实施方式中，所述方法可用于治疗、预防或改善阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、运动神经元疾病、亨廷顿氏病，或本文公开的任何其他神经退行性病症。
优选地，将根据本发明的基因构建体或重组载体用于基因疗法技术中。由构建体或载体编码的激动剂激活同样由所述构建体/载体编码的TrkB，从而促进神经元细胞的存活。
在另一个实施方式中，构建体和载体可用于促进神经再生和/或存活。
应当理解，根据第一方面的基因构建体或根据第二方面的重组载体可在药物中使用，所述药物可用作单一疗法(即，使用根据本发明第一方面的基因构建体或根据本发明第二方面的载体)，以治疗、改善或预防神经退行性病症或中风，或用于促进神经再生和/或存活。或者，根据本发明的基因构建体或重组载体可用作已知疗法的辅助物(adjunct)或与已知疗法组合以用于治疗、改善或预防神经退行性病症或中风，或用于促进神经再生和/或存活。
根据本发明的基因构建体或根据本发明的重组载体可被组合在组合物中，所述组合物具有多种不同形式，所述形式具体取决于组合物的使用方式。因此，例如，组合物可为粉末剂、片剂、胶囊剂、液体剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、水凝胶剂、气雾剂、喷雾剂、胶束溶液剂、透皮贴剂、脂质体混悬剂，或可施用到需要治疗的人或动物的任何其他合适形式。应当理解，根据本发明的药物的媒介物(vehicle)应该是被给予所述药物的受试者所良好耐受的媒介物。
根据本发明的基因构建体或重组载体也可并入缓释或延迟释放装置中。此类装置可例如插入皮肤上或皮肤下，并且药物可持续数周甚至数月释放。该装置可至少位于治疗部位附近。当需要用基因构建体或重组载体进行长期治疗并且所述长期治疗通常需要频繁施用(例如至少每天注射)时，此类装置可为特别有利的。
在一个优选实施方式中，可通过注射到血流、神经中或直接注射到需要治疗的部位来将根据本发明的药物施用到受试者。例如，药物被配置为跨越血脑屏障。注射可为静脉内(推注或输注)或皮下(推注或输注)或皮内(推注或输注)的。
应当理解，所需的基因构建体或重组载体的量由所述基因构建体或重组载体的生物活性和生物利用度决定，所述生物活性和生物利用度又取决于施用模式、所述基因构建体或重组载体的理化性质，以及所述基因构建体或重组载体是被用作单一疗法还是联合疗法。施用频率还受环状多肽在所治疗的受试者中的半衰期的影响。最佳的施用剂量可由本领域技术人员确定，并且随着所使用的具体基因构建体或重组载体、药物组合物的强度、施用模式以及病症的进展或阶段而变化。取决于所治疗的具体受试者的其他因素将导致需要调整剂量，所述其他因素包括受试者的年龄、体重、性别、饮食和施用时间。
通常，取决于所使用的基因构建体或重组载体，可使用介于0.001μg/kg体重与10mg/kg体重之间，或介于0.01μg/kg体重与1mg/kg体重之间的日剂量的根据本发明的构建体或载体来治疗、缓解或预防神经退行性病症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、运动神经元疾病或中风。
基因构建体或重组载体可在病症发作之前、期间或之后施用。日剂量可作为单次施用给予(例如每日单次注射或吸入鼻喷雾剂)。或者，基因构建体或重组载体可需要在一天内施用两次或更多次。例如，可以以介于0.07μg与700mg之间(即，假定体重为70kg)的两次(或更多次，取决于所治疗病症的严重程度)日剂量来施用基因构建体或重组载体。接受治疗的患者可在醒来时服用第一剂，然后在晚上(如果采用两剂方案的话)或之后以3或4小时的间隔服用第二剂。或者，可使用缓释装置来向患者提供最佳剂量的根据本发明的基因构建体或重组载体，而不需要施用重复剂量。
已知程序，诸如制药行业常规采用的程序(例如，体内实验、临床试验等)，可用于形成根据本发明的基因构建体或重组载体的特定制剂以及精确的治疗方案(诸如药剂的每日剂量和施用频率)。本发明的发明人认为，他们是首个提出编码可操作地连接至TrkB受体和TrkB受体的激动剂的编码序列的启动子的基因构建体的人。
根据第四方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含根据第一方面的基因构建体或根据第二方面的重组载体，以及药学上可接受的媒介物。
根据第五方面，提供了制备根据第五方面的药物组合物的方法，所述方法包括使根据第一方面的基因构建体或根据第二方面的重组载体与药学上可接受的媒介物接触。
“受试者”可为脊椎动物、哺乳动物或驯养动物。因此，根据本发明的组合物和药物可用于治疗任何哺乳动物，例如牲畜(例如马)、宠物，或者可用于其他兽医应用。然而，最优选地，受试者是人类。
基因构建体、重组载体或药物组合物的“治疗有效量”是这样的任何量，所述量当施用到受试者时，是治疗神经退行性病症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、运动神经元疾病、中风或产生期望的效果(诸如促进神经再生和/或存活)所需的上述基因构建体、重组载体或药物组合物的量。
例如，所使用的基因构建体、重组载体或药物组合物的治疗有效量可为约0.01mg至约800mg，优选为约0.01mg至约500mg。优选的是，所述基因构建体、重组载体或药物组合物的量为约0.1mg至约250mg，最优选约0.1mg至约20mg的量。
本文中提到的“药学上可接受的媒介物”是本领域技术人员已知可用于配制药物组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。
在一个实施方式中，药学上可接受的媒介物可为固体，并且组合物可为粉末剂或片剂的形式。固态的药学上可接受的媒介物可包括这样的一种或多种物质，所述一种或多种物质也可用作调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填充剂、助流剂、压制助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、包衣，或片剂崩解剂。所述媒介物也可为封装材料。在粉剂中，媒介物是细碎的固体，所述细碎的固体与细碎的根据本发明的活性剂混合。在片剂中，可将活性剂(例如，根据本发明的基因构建体或重组载体)与具有必要的压制特性的媒介物以合适比例混合并压成期望的形状和大小。粉剂和片剂优选含有高达99％的活性剂。合适的固态媒介物包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施方式中，药物媒介物可为凝胶，并且组合物可为乳膏剂等形式。
然而，药物媒介物可为液体，并且药物组合物为溶液剂形式。液体媒介物被用于制备溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂，以及加压的(pressurized)组合物。可将根据本发明的基因构建体或重组载体溶于或悬浮于药学上可接受的液体媒介物中，所述药学上可接受的液体媒介物为诸如水、有机溶剂，两者的混合物，或药学上可接受的油或脂肪。液体媒介物可包含其他合适的药物添加剂，诸如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。用于经口和肠胃外施用的液体媒介物的合适示例包括水(部分地含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇类(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物，以及油类(例如分馏的椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，媒介物也可为油性酯，诸如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体媒介物可用于肠胃外施用的无菌液体形式组合物中。用于加压的组合物的液体媒介物可为卤代烃，或其他药学上可接受的推进剂。
液体药物组合物是无菌的溶液或悬浮液，其可通过例如肌内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内，尤其是皮下注射来利用。可将基因构建体或重组载体制备为无菌固态组合物，所述无菌固态组合物可在施用时使用无菌水、盐水或其他合适的无菌可注射介质溶解或悬浮。
本发明的基因构建体、重组载体和药物组合物可以以含有其他溶质或悬浮剂(例如，用于使溶液等渗的足量盐水或葡萄糖)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨糖醇的油酸酯及其酸酐与环氧乙烷的共聚物)等的无菌溶液或悬浮液的形式经口施用。根据本发明的基因构建体、重组载体或药物组合物也可以以液体或固体组合物形式经口施用。适用于经口施用的组合物包括固体形式，诸如丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂和粉剂，以及液体形式，诸如溶液剂、糖浆剂、酏剂和混悬剂。可用于肠胃外施用的形式包括无菌溶液剂、乳剂和混悬剂。
根据另一方面，提供了根据第一方面的基因构建体或根据第二方面的重组载体，所述根据第一方面的基因构建体或根据第二方面的重组载体用于治疗、预防或改善视神经病症或耳蜗病症，或用于促进神经再生和/或存活；其中第二编码序列包含来自神经营养蛋白家族的营养因子的成熟形式。第二编码序列可包含信号肽。所述构建体或载体可为使得激动剂缺乏前-序列但具有信号肽。信号肽可附接到N-末端，并且可增强激动剂的分泌、表达或折叠。第二编码序列可包含以下中的任一者：成熟神经生长因子(NGF)、成熟神经营养蛋白-3(NT-3)、成熟神经营养蛋白-5(NT-5)，或它们的片段或变体。
应当理解，本发明扩展到任何核酸或肽，或它们的变体、衍生物或类似物，所述任何核酸或肽，或它们的变体、衍生物或类似物包含本文所提及的任何序列的大致氨基酸序列或核酸序列，包括它们的变体或片段。术语“大致氨基酸/核苷酸/肽序列”、“变体”和“片段”可为这样的序列，所述序列与本文所提及的任何一种序列的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40％序列同一性，例如与被标识为SEQ ID No:1至SEQ ID No:108的序列例如40％的同一性，依此类推。
还设想与所提及的任何序列具有大于65％，更优选大于70％，甚至更优选大于75％，还更优选大于80％的序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列。优选地，所述氨基酸/多核苷酸/多肽序列与本文所提及的任何序列具有至少85％的同一性，更优选与本文所提及的任何序列具有至少90％的同一性，甚至更优选与本文所提及的任何序列具有至少92％的同一性，甚至更优选与本文所提及的任何序列具有至少95％的同一性，甚至更优选与本文所提及的任何序列具有至少97％的同一性，甚至更优选与本文所提及的任何序列具有至少98％的同一性，最优选与本文所提及的任何序列具有至少99％的同一性。
技术人员将理解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比，必须首先准备两个序列的比对，然后计算序列同一性值。两个序列的同一性百分比可取决于以下而取不同的值：(i)用于比对序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(在不同程序中实现)，或来自3D比较的结构比对；以及(ii)比对方法所使用的参数(例如，局部比对与全局比对)、所使用的成对评分矩阵(例如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)，以及空位罚分，例如功能形式和常数。
进行比对后，有许多不同的计算两个序列之间的同一性百分比的方式。例如，可将相同的数目除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数目；或(v)不包括突出端在内的等效位置的数目。此外，应理解，同一性百分比还强烈地取决于长度。因此，一对序列越短，可以预期偶然发生的序列同一性就越高。
因此，应认识到，蛋白质序列或DNA序列的精确比对是复杂的过程。流行的多重比对程序ClustalW(Thompson等人，1994,Nucleic Acids Research,22,4673-4680；Thompson等人，1997,Nucleic Acids Research,24,4876-4882)是生成根据本发明的蛋白质或DNA的多重比对的优选方法。用于ClustalW的合适参数如下所示：对于DNA比对：空位开放罚分＝15.0，空位延伸罚分＝6.66，并且矩阵＝同一性。对于蛋白质比对：空位开放罚分＝10.0，空位延伸罚分＝0.2，并且矩阵＝Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP＝-1，并且GAPDIST＝4。本领域技术人员应意识到，可能需要改变这些和其他参数以获得最佳的序列比对。
优选地，然后可根据诸如(N/T)*100的比对来计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比，其中N是序列共享相同残基的位置数，并且T是所比较位置(包括空位但不包括突出端)的总数。因此，用于计算两个序列之间的同一性百分比的最优选方法包括：(i)使用ClustalW程序，使用一组合适的参数(例如，如上所述)来准备序列比对；以及(ii)将N和T的值插入以下公式：-序列同一性＝(N/T)*100。
用于鉴定相似序列的替代方法是本领域技术人员已知的。例如，基本上相似的核苷酸序列由这样的序列编码，所述序列在严格条件下与DNA序列或其互补序列杂交。严格条件是指核苷酸在约45℃的3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与结合滤膜的DNA或RNA杂交，然后在约20-65℃的0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤至少一次。或者，基本上相似的多肽可与例如SEQID No:3和SEQ ID No:5所示的序列相差至少1个，但少于5个、10个、20个、50个或100个氨基酸。
由于遗传密码的简并性，很明显，本文所述的任何核酸序列可改变或变化，而基本上不影响由其编码的蛋白质的序列，以提供其功能性变体。合适的核苷酸变体是这样的核苷酸变体，所述核苷酸变体具有通过取代编码序列内的相同氨基酸的不同密码子而改变的序列，从而产生沉默变化。其他合适的变体是这样的变体，所述变体具有同源核苷酸序列，但所包含的全部或部分序列通过取代编码这样的氨基酸的不同密码子而变化，以产生保守改变，所述氨基酸具有的侧链与所取代的氨基酸具有相似的生物物理特性。例如，小的非极性疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸，以及蛋氨酸。大的非极性疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，应理解哪些氨基酸可被具有相似生物物理特性的氨基酸替代，并且技术人员应知道编码这些氨基酸的核苷酸序列。
本文描述的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以以任何组合与上述方面中的任一者组合，此类特征和/或步骤中的至少一些互斥的组合除外。
为了更好地理解本发明，并示出如何实施本发明的实施方式，现在将以举例的方式参考附图，在附图中：
图1是根据本发明的基因构建体的一个实施方式的示意图；
图2是根据本发明的重组载体的第一实施方式的示意图，所述重组载体的第一实施方式被称为“质粒QTA001PA”，其包含经典信号序列(蓝色)加上proBDNF(红色)和mBDNF(黑色)。其还包含-IRES-GFP-序列(青色和紫色)；
图3是根据本发明的重组载体的第二实施方式的示意图，所述重组载体的第二实施方式被称为“质粒QTA002P”，其不具有proBDNF(但仅产生mBDNF)并且具有与QTA001PA相同的信号序列(蓝色)。其还包含-IRES-GFP-序列(青色和紫色)；
图4是根据本发明的重组载体的第三实施方式的示意图，所述重组载体的第三实施方式被称为“质粒QTA003P”，其不具有proBDNF(但仅产生mBDNF)并且具有IL-2信号序列(蓝色)。其还包含-IRES-GFP-序列(青色和紫色)；
图5是根据本发明的重组载体的第四实施方式的示意图，所述重组载体的第四实施方式被称为“质粒QTA004P”，其不具有proBDNF(但仅产生mBDNF)并且具有新信号序列(蓝色)。其还包含-IRES-GFP-序列(青色和紫色)；
图6示出了用于本发明的构建体中的信号肽的不同实施方式的核苷酸序列和氨基酸序列。第二残基是苏氨酸(t)，所述苏氨酸(t)可被一个或多个碱性残基(诸如赖氨酸(K)或精氨酸(R))替代。包括异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和亮氨酸(L)的下一段残基可被一个或多个疏水残基替代。
图7示出了在质粒转导(4μg DNA/孔)后24小时，使用特异性ELISA，从HEK293细胞的BDNF释放，所述质粒含有编码mBDNF的基因，所述基因具有不同的信号肽序列并且不具有扩展的proBDNF组分的编码序列(数据显示为关于n＝4的平均值±SEM)；
图8示出了质粒转导后24小时，HEK293细胞裂解物中BDNF-免疫反应物质(任意单位)的细胞浓度的蛋白质印迹结果(数据显示为关于n＝4的平均值±SEM)。
图9示出了细胞裂解物的蛋白质印迹中的BDNF-免疫反应性，显示当用QTA001PA转导细胞时有两个分子量条带(32kDa和14kDa)，相对于使用QTA002P、QTA003P和QTA004P转导时仅有单一14kDa条带。
图10示出了在质粒转导后24小时，使用选择性proBDNF ELISA，使用特异性ELISA测量的HEK293孵育培养基中的proBDNF浓度(数据显示为关于n＝4的平均值±SEM)。
图11示出了通过质粒QTA002P(内源性经典信号肽序列)和QTA009P至QTA013P的HEK293细胞裂解物中的BDNF表达。数据显示为平均值+S.E.M。与QTA002P相比，**P<0.01；
图12示出了通过质粒QTA002P(内源性经典信号肽序列)和QTA009P至QTA013P的HEK293细胞孵育培养基中的BDNF表达。数据显示为平均值+S.E.M。与QTA002P相比，**P<0.01；
图13示出了用质粒QTA015P(表达BDNF和eGFP，所述BDNF和eGFP被IRES间隔物隔开)、QTA021P(表达BDNF，之后是eGFP，所述BDNF和eGFP被功能性病毒-2A肽序列隔开)、QTA022P(表达BDNF，之后是eGFP，所述BDNF和eGFP被非功能性病毒-2A肽序列隔开)和QTA023P(表达eGFP，之后是编码BDNF，所述eGFP和BDNF被功能性病毒-2A肽序列隔开)转染HEK293细胞后24小时，来自所述HEK293细胞的蛋白质印迹。数据显示为BDNF-免疫反应性(A)，eGFP-免疫反应性(B)和从HEK293细胞释放到孵育培养基中的BDNF的量(C)。数据显示为条带密度的平均值+S.E.M；
图14A示出了用QTA020V载体转染后48小时的HEK293细胞匀浆的蛋白质印迹，显示了大前体编码区的有效加工，所述大前体编码区包括被病毒2A-肽序列隔开的TrkB受体和BDNF。图14B和图14C示出了：在加工后，病毒-2A肽切割后产生的转基因蛋白已被转运至HEK293细胞中的正确细胞内区室(在释放前，TrkB受体被转运至细胞表面，BDNF被转运至储存囊泡)；
图15A示出了rAAV2载体QTA020V在小鼠视网膜匀浆中的TrkB受体表达，并且图15B示出了rAAV2载体QTA020V在小鼠视网膜匀浆中的BDNF表达。数据显示为小鼠视网膜匀浆的蛋白质印迹中密度的平均值±S.E.M。与原初
Figure BDA0002225874110000491
(未注射动物)相比，**P<0.01；
图16示出了在注射QTA020V后，如通过免疫细胞化学显示的小鼠视网膜神经节细胞层中TrkB(A)和BDNF(B)转基因的表达，QTA020V是一种rAAV2载体，其含有被病毒-2A肽序列隔开的TrkB受体和BDNF的编码；
图17示出了在用rAAV2-CAG-eGFP载体处理的对照动物与小鼠中，在视神经夹伤(optic nerve cursh；ONC)后视网膜神经节细胞(RGC)的存活。数据显示为每只动物的整个视网膜中视网膜神经节细胞的平均数目的平均值+S.E.M.，如通过视网膜平埋切片(flat-mount)中的Brn3A阳性细胞所计数的。与对照相比，***P<0.001，*P<0.05；
图18示出了在用不表达转基因的rAAV2病毒载体(Null病毒)、仅表达BDNF的rAAV2病毒载体(QTA027V)、仅表达TrkB的rAAV2病毒载体(QTA025V)和表达BDNF和TrkB两者的rAAV2病毒载体(QTA020V)进行转染后，通过蛋白质印迹法测得的未分化的人SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞匀浆中BDNF(图18A)和TrkB(图18B)转基因的表达。图18C示出了在用病毒载体Null、QTA020V、QTA025V或QTA027V转染后，在蛋白质印迹中SH-SY5Y细胞中激活的磷酸化TrkB受体的水平。发现与未转染的细胞相比，只有表达BDNF和TrkB两者的QTA020V载体显著增加了TrkB受体的激活(**P<0.01；对于多重比较，进行方差分析(ANOVA)，然后是Bonferroni改良的t检验)。数据显示为n＝4次实验的平均值+S.E.M.；
图19示出了在暴露于通过添加过氧化氢(0.1mM或1.0mM的H2O2)而产生的氧化胁迫后，通过TUNEL染色测得的培养物中未分化的SH-SY5Y细胞的凋亡性细胞死亡的水平。发现与未处理的细胞相比，在添加过氧化氢之前用表达BDNF和TrkB受体两者的rAAV2载体QTA020V转染的细胞显著地保护抵抗凋亡(**P<0.01；对于多重比较，进行方差分析，然后是Bonferroni改良的t检验)。数据显示为关于n＝6-10的平均值+S.E.M.；并且
图20示出了从P301S突变型人Tau转基因小鼠获得并用识别位置丝氨酸396/丝氨酸404(PHF-1)或丝氨酸202/丝氨酸205(AT8)处的磷酸化Tau的抗体染色的视神经的代表性免疫细胞化学图像。小鼠在3个月大时被玻璃体内注射rAAV2载体QTA020V(其表达mBDNF和TrkB受体两者)，并在三周后终止，然后取出视神经进行免疫细胞化学检查。
实施例
以下实施例证明了本发明实施方式用于促进神经再生和/或存活的用途。如本文所公开的，可从实施例所公开的用途、方法和治疗导出的教导也适用于神经退行性病症和中风的治疗。
方法与材料
分子克隆和质粒构建体
使用在线工具(http://www.idtdna.com/CodonOpt)进行DNA序列的密码子优化，并由Integrated DNA technologies,Inc.(IDT；9180 N.McCormick Boulevard,Skokie,IL60076-2920,USA)或GenScript(860 Centennial Ave,Piscataway,NJ 08854,USA)合成DNA区块。使用标准分子生物学和克隆技术执行克隆以制备主质粒(master plasmid)QTA001PA和后续质粒。
质粒放大(scale up)和纯化
在maxi-prep纯化后，将DNA质粒在SURE感受态细胞(Agilent Technologies；产品目录号200238)中放大过夜，提供了2.29μg/μl的质粒。将其余质粒放大至500μg规模，并且转导质量存在最少的内毒素。
HEK293培养和使用质粒DNA进行细胞转导
将HEK293细胞(400,000个细胞)在聚-L-赖氨酸(10μg/mL，Sigma-Aldrich；产品目录号P1274)包被的6孔板中在1.5mL的伊格尔极限必需培养基(Dulbecco's minimumessential medium,DMEM)中培养，直到达到80％融汇(confluent)，所述DMEM含有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素和1％链霉素(1％Pen/Strep)。然后将培养基更换为2mL DMEM(无添加剂)。两到三小时后，将另外0.5ml的含有4μg质粒DNA加10μL脂质转染胺(lipofectamine)(4μL/mL；Thermo Fisher Scientific；产品目录号12566014)的转染培养基加入每个孔中，从而在整个转染期间且对于上清液收集，产生2.5ml的总体积。
SH-SY5Y培养和使用rAAV2病毒载体的细胞转染
将SH-SY5Y细胞在6孔板(300,000个细胞)、96孔板(10,000个细胞)中或包被有聚-L-赖氨酸(10μg/mL，Sigma产品号P1274)的13mm玻璃盖玻片(100,000个细胞)上培养。使用含有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素和1％链霉素(1％Pen/Strep)的伊格尔极限必需培养基(DMEM)在37℃下将细胞培养至80％融汇，然后更换成不含添加剂的DMEM，之后进行转染。所使用的DMEM体积为6孔板(2mL)、96孔板(100μL)和盖玻片(500μL)。将在PBS中稀释的载体以1.0×1010(VP)/mL的终浓度直接加入到培养基中，并在37℃孵育48小时。
过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞死亡和TUNEL染色
在SH-SY5Y细胞转染后48小时，将培养基更换成新鲜的DMEM(不含添加剂)。将过氧化氢(H2O2)(Thermo Fisher Scientific；产品号BP2633500，批次号1378087)在过滤水中稀释(至浓度为0.1mM或l.0mM)，并以等体积加入到各孔或各板中，放置另外24小时。过滤水充当媒介物对照。将盖玻片在PBS中洗涤两次，并在室温下于1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％多聚甲醛中固定30分钟。在PBS中再洗涤三次后，将细胞通过在室温下在PBS中的5％正常山羊血清(NGS)、3％牛血清白蛋白(BSA)和0.3％Triton X-100中孵育60分钟而封闭并透化。然后将细胞与在封闭液中稀释的商售兔多克隆抗TrkB抗体(Abeam；产品号ab33655，批次号GR232306-1，以1:500稀释)、兔多克隆抗BDNF抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc；产品号sc-546；批次号CO915，以1:300稀释)或p-Tyr515-TrkB(Abeam，产品号ab109684；批次号GR92849-4，1:750)一起在4℃孵育过夜。使用与alexa fluor 488(Life Technologies；产品号A11034，1:1000)缀合的抗兔二抗在室温下染色2小时。为了进行TUNEL染色(Promega；产品号G3250；批次号0000215719)，将细胞在PBS中洗涤三次，并浸入TUNEL平衡缓冲液中10分钟。按照制造商的实验流程制备TUNEL反应混合物，并将100μL/盖玻片的所述TUNEL反应混合物加入细胞中，在37℃下保持1小时。通过在1X标准柠檬酸盐溶液(SCS)中孵育15分钟来终止反应。将细胞核用1μg/mL DAPI(Thermo Scientific；产品号D1306，1:8000)复染。将细胞另外洗涤三次，然后用fluorSaveTM试剂(Calbiochem/EMD Chemicals Inc.,Gibbstown,NJ,USA)固定，之后进行成像。使用20X物镜和Leica DM6000落射荧光显微镜(Leica Microsystems,Wetzlar,德国)进行成像。
通过ELISA进行BDNF测量
转染后24小时，在细胞培养基中测量从HEK293细胞分泌的BDNF的量。将培养基离心以去除碎片，并使用商售的人BDNF ELISA试剂盒(Sigma-Aldrich，产品号RAB0026)进行测量。通过将样品与新鲜制备的BDNF标准品进行比较来确定BDNF浓度。
BDNF和TrkB受体的蛋白质印迹
通过以下方式来测量HEK293细胞内BDNF和TrkB免疫反应性的量：去除DMEM孵育培养基，将细胞在冷磷酸盐缓冲盐水中洗涤，并向各孔中加入350μL新鲜制备的裂解缓冲液(10ml Lysis-M试剂+1片完整的小型蛋白酶抑制剂混合物(Mini Protease InhibitorCocktail)，Roche；产品目录号04719964001，+100μl停止磷酸酶抑制剂混合物(Haltphosphatase inhibitor cocktail)(100X)，Thermo Scientific；产品目录号78428)。在细胞匀浆后，使用BCA测定法(Pierce BCA蛋白测定法试剂盒，Thermo Scientific；产品目录号23227)对蛋白质悬浮物进行定量。将介于6μg与15μg之间的HEK293细胞裂解物蛋白/泳道沿着Bis-Tris凝胶(12％NuPAGE Novex；产品目录号NPo342BOX，Thermo Scientific)进行电泳，并使用兔多克隆抗-BDNF一抗(Santa Cruz Biotechnology Inc；产品号sc-546；以1:500稀释)、兔多克隆抗TrkB一抗(Abeam；产品目录号ab33655，以1:2000的稀释度使用)或eGFP抗体(Abeam产品号ab-290，以1:500使用)孵育过夜，通过蛋白质印迹法进行检查。将一抗使用HRP缀合的抗兔抗体(Vector Laboratories；产品目录号PI-1000，以1:8000)可视化，并使用ECL Prime(Amersham,GE Healthcare,UK)和Alliance蛋白质印迹成像系统(UVTtec Ltd,Cambridge,UK)进行信号检测。对于小鼠视网膜的蛋白质印迹，将来自经载体处理的动物的眼睛在500μL新鲜制备的裂解缓冲液(10ml Lysis-M试剂+1片完整的迷你蛋白酶抑制剂混合物，Roche产品号04719964001+100μl停止磷酸酶抑制剂混合物(100X)，Thermo Scientific产品号78428)中匀浆化。将组织破坏1分钟(Qiagen，TissueRuptor产品号9001273)，然后在冰上保持另外15分钟。然后如上所述通过蛋白质印迹法来分析蛋白质。
免疫细胞化学分析(Immunocytochemistry)
将HEK293细胞(70,000个)接种在4孔板内的包被有聚-L-赖氨酸的13mm盖玻片上，并在含有10％FBS和1％Pen/Strep的DMEM中以0.5ml培养基孵育。一旦细胞生长到80％融汇，就将培养基更换成0.4ml DMEM(不含添加剂)，持续2-3小时，然后加入另外0.1mL转染培养基(0.8μg质粒DNA+2μl脂质转染胺)，使得最终体积达到0.5ml。将盖玻片在PBS中洗涤两次，并在室温下于1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％多聚甲醛中固定30分钟。在PBS中再洗涤三次后，将细胞通过在室温下在PBS中的5％正常山羊血清(NGS)、3％牛血清白蛋白(BSA)和0.3％Triton X-100中孵育60分钟而封闭并透化。然后将细胞与在封闭液中稀释的商业兔多克隆抗BDNF抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc；产品号sc-546；以1:300稀释)或商业兔多克隆抗TrkB抗体(Abeam产品号ab33655，以1:500稀释)一起在4℃孵育过夜。使用与alexa fluor 647(Invitrogen；产品号A21248，以1:1000)缀合的抗兔二抗在室温下染色2小时。将细胞核也用1μg/ml DAPI(Thermo Scientific；产品号D1306，以1:8000)复染。将细胞另外洗涤三次，然后用fluorSaveTM试剂(Calbiochem/EMD Chemicals Inc.,Gibbstown,NJ,USA)固定，之后进行成像。使用20X物镜和Leica DM6000落射荧光显微镜(LeicaMicrosystems,Wetzlar,德国)，或配备有63X油物镜、使用3X数字变焦和0.5-0.8顺序扫描z阶距的Leica SP5共聚焦显微镜(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)来进行成像。
为了对来自对照或载体处理动物的视网膜结构和视神经进行免疫细胞化学分析(在注射后3或4周之间)，将仔细解剖的眼睛在4％多聚甲醛/0.1％PBS(pH 7.4)中固定过夜，并在4℃下在30％蔗糖/0.1％PBS中脱水(24小时)。然后将眼睛嵌入含有最适切割温度化合物(OCT)(Sakura Finetek,Zoeterwoude,荷兰)的硅模具中，并在干冰上冷冻。使用Bright OTF 5000低温恒温器(Bright Instruments,Huntingdon,UK)，将穿过P301S小鼠的视网膜的背-腹/上-下轴的13μm切片或穿过P301S小鼠的视神经的纵向切片收集在正电荷防脱载玻片(superfrost plus slide)(VWR产品号631-0108)上。将载玻片在PBS中洗涤三次，然后在室温下在PBS中的5％正常山羊血清(NGS)、3％牛血清白蛋白(BSA)和0.3％Triton X-100中透化60分钟。然后将载玻片与在封闭液中稀释的商业兔多克隆抗BDNF抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc；产品号sc-546；1:300)、商业兔多克隆抗TrkB抗体(Abeam；产品号ab33655，1:500)、商业兔多克隆抗Tau Ser396/404抗体(PHF-1；在Cambridge产生，1:500)或商业兔多克隆抗Tau Ser202/205抗体(AT8；Invitrogen产品号MN1020，1:500)一起在4℃孵育过夜。使用与alexa fluor 647(Invitrogen；产品号A21248，以1:1000)缀合的抗兔二抗在室温下染色2小时。将视网膜细胞核也用1μg/ml DAPI(Thermo Scientific；产品号D1306，以1:8000)复染。将载玻片另外洗涤三次，然后用fluorSaveTM试剂(Calbiochem/EMD Chemicals Inc.,Gibbstown,NJ,USA)固定，之后进行成像。使用20X物镜和Leica DM6000落射荧光显微镜(Leica Microsystems,Wetzlar,德国)，或配备有63X油物镜、使用3X数字变焦和0.5-0.8顺序扫描z阶距的Leica SP5共聚焦显微镜(LeicaMicrosystems,Wetzlar,德国)来进行成像。
玻璃体内注射
在7-10天的适应期后，将12周龄的C57/BL.6或16周龄的P301S(Harlan labs,Bicester,U.K.)小鼠随机分到各个研究组。然后通过腹膜内注射氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5g/kg)将它们麻醉。在研究的第1天施用局部1％丁卡因滴眼剂。使用1％的托吡卡胺滴眼剂实现瞳孔扩大。使用手术显微镜，用30-轨距(gauge)的针产生部分厚度的巩膜引导孔，以利于用尖端直径为30μm且尖端长度为2.5mm的细金属微量移液器穿透下面的巩膜、脉络膜和视网膜。然后将所述微量移液器连接到10μL的玻璃注射器(Hamilton Co.,Reno,NV)，之后取决于组别将2μL的载体悬浮液抽取到所述移液器中。在玻璃体内注射期间小心地避免穿透晶状体或损伤涡状静脉。注射部位位于颞上缘之后约3mm处。经1分钟缓慢进行注射，以使载体悬浮液扩散。右眼保持不触碰，并作为内部对侧对照。
视神经夹伤(ONC)
在施用载体后三周(21天)，使小鼠经受ONC程序，不进行处理或经受假-夹伤(sham-curshed)。在双眼手术范围内，用弹簧剪(springscissors)在结膜中从眼球(globe)下面开始并绕眼睛暂时地产生小切口。这暴露了眼球的后侧，从而使视神经可视化。用咬齿钳(cross-action forceps)(Dumont编号N7，产品目录号RS-5027；Roboz)距眼球约1-3mm将暴露的视神经夹住10s，仅使用来自自夹紧(self-clamping)作用的压力来压在神经上。10s后释放视神经，移开钳子，使眼睛旋转回原位。ONC后7天，将动物剔出处死(culled)。通过下述方法来固定来自每组的两只眼睛：将器官放置在4％多聚甲醛/0.1％PBS(pH 7.4)中过夜。然后，在从角膜切下后部眼结构并摘除晶状体后，制备视网膜平埋切片(flat-mounts)。将视网膜平埋切片在4％多聚甲醛/0.1％PBS中后固定30分钟，然后在PBS中的0.5％TritonX-100中洗涤。将视网膜在-80℃下冷冻10分钟以渗透核膜并改善抗体渗透，然后在室温下在PBS中的10％正常驴血清(NDS)、2％牛血清白蛋白(BSA)和2％Triton X-100中封闭60分钟。将RGC用抗Brn3A抗体(1:200Santa Cruz，编号sc-31984)复染，并使用20X物镜和LeicaDM6000落射荧光显微镜(Leica Microsystems,Wetzlar,德国)在荧光显微镜下进行可视化。使用配备有40X油物镜的Leica SP5共聚焦显微镜(Leica Microsystems)，使用1.5X数字变焦和0.5-0.8顺序扫描z阶距，获得更高分辨率的图像。使用用于对核计数的基于图像的工具插件(ITCN)，通过ImageJ测量RGC细胞计数，并表示为RGC/mm2的密度。
构建体和载体
本发明的发明人已经生成了如图1所示的基因构建体，所述基因构建体可用于治疗患有视神经病状(诸如青光眼)或耳蜗病状的受试者，或者用于促进神经再生和/或存活。该构建体被设计为维持或增加RGC的细胞表面上的TrkB受体的密度，并通过mBDNF的伴随产生和局部释放来维持或增加通过TrkB受体通路的信号传导。
该构建体包含编码TrkB受体及其激动剂成熟脑源性神经营养因子的转基因。这些转基因可操作地连接至单个启动子，所述单个启动子为人突触蛋白I(SYN I)启动子或CAG启动子。有利地，图1的构建体可被置于rAAV2载体中，而不受其编码的转基因的大小的阻碍。这是因为将构建体定向为使得第一转基因TrkB连接至病毒2A肽序列，之后是BDNF信号肽，然后是成熟蛋白。这种定向还使免疫原性风险最小化，因为病毒2A肽的短N末端氨基酸序列保持附接至TrkB受体的细胞内部分，而来自C末端病毒2A序列的残留脯氨酸氨基酸保持附接至N末端BDNF信号肽，并且在切割后最终从mBDNF蛋白中去除。可将载体置于可施用到受试者的药理学上可接受的缓冲溶液中。
图2至图5示出了表达载体的各种实施方式。图2示出了被称为“质粒QTA001PA”的载体，其包含经典信号序列(蓝色)(即MTILFLTMVISYFGCMKA[SEQ ID NO:20])加proBDNF(红色)和mBDNF(黑色)。图3示出了被称为“质粒QTA002P”的载体。该载体不编码proBDNF，而仅产生mBDNF，并且与QTA001PA编码相同的信号序列(蓝色)。图4示出了被称为“质粒QTA003P”的载体，其也不编码proBDNF，而是仅产生mBDNF。代替mBDNF的经典信号序列，所述载体包含IL-2信号序列(蓝色)。最后，图5示出了被称为“质粒QTA004P”的载体。该载体不编码proBDNF，而是替代地仅产生mBDNF。所述载体还编码新信号序列(蓝色)，[SEQ ID NO:32]。
本发明的发明人已经从成熟BDNF(mBDNF)元件开始制备并研究了与青光眼基因疗法概念有关的构建体和载体。他们已经清楚地证明，在用含有BDNF序列而没有proBDNF编码区的质粒(QTA002P，参见图3)进行脂质转染胺转导后，从HEK293细胞产生和释放mBDNF(参见图7)。从所述细胞释放的mBDNF是预测的14kDa单体(使用蛋白质印迹法和市售抗BDNF抗体测量的)，并且没有蛋白质聚集的证据，如已经由尝试使用基于酵母和其他细胞的制造方法来产生商业量的mBDNF的一些小组所报道的1。因此，mBDNF以这样的形式释放，所述形式可允许蛋白质分子形成非共价二聚体以便激活TrkB受体。
通过使用针对BDNF的ELISA(其不区分mBDNF和更大扩展的proBDNF蛋白)，本发明的发明人还证明了以下是可行的：在用含有BDNF基因的质粒进行细胞的脂质转染胺转导后，用新的肽序列(QTA004P-参见图5)取代编码内源性经典18氨基酸信号肽序列的DNA序列(MTILFLTMVISYFGCMKA)并将等效水平的BDNF释放到HEK293培养基中(参见图7)。
用编码白介素-2信号肽的序列取代内源性信号肽(QTA003P-参见图4)在从培养基中释放BDNF方面不太有效。释放到培养基中的BDNF的水平目前为约1-2nM，并且该激动剂的浓度足以最大化地激活特定的TrkB受体(IC50为约0.9nM)。与质粒QTA002P(参见图3)和QTA004P(参见图5)相比，使用含有proBDNF序列和mBDNF序列的组合并且还包含18氨基酸经典信号肽的质粒QTA001PA(参见图2)时的BDNF释放水平提高约35倍(876±87ng/mL BDNF)。
在脂质转染胺质粒转导后24小时，通过定量蛋白质印迹法测量细胞中剩余的BDNF显示，使用QTA001PA时的BDNF剩余浓度低于使用QTA002P和QTA004P时的BDNF剩余浓度(参见图8)。
此外，用QTA001PA转导的细胞裂解物中的BDNF免疫反应性的约一半为proBDNF形式(32kDa处的分子量条带)，而用QTA002P、QTA003P和QTA004P转导的细胞裂解物中不存在proBDNF条带(参见图9)，这可能是因为这些质粒不含有proBDNF扩展编码序列。
通过使用对proBDNF特异的ELISA，本发明的发明人能够证明约70ng/mL(2.2nM或3.5％)的从用QTA001PA转导的细胞释放的BDNF免疫反应性是proBDNF形式，而大多数(96.5％或876ng/mL/63nM)是作为mBDNF释放的(参见图10)。从用QTA002P、QTA003P或QTA004P转导的细胞中未检测到proBDNF免疫反应性，所述QTA002P、QTA003P或QTA004P不包含扩展proBDNF的编码序列。
因此，很明显，所有质粒都能够产生14kDa mBDNF蛋白，但是从HEK293细胞释放的mBDNF的量在很大程度上取决于蛋白储存和包装到分泌小泡内的效率。因此，用质粒QTA001PA(图2)产生的含有proBDNF序列和mBDNF序列的组合的扩展形式的蛋白质被包装到分泌小泡中，并比使用较小mBDNF序列(其看起来在细胞内积累)时有效得多地释放到孵育培养基中。
参考图11，其显示，用质粒QTA009P至QTA013P中包含的新序列取代质粒QTA002P中表示的内源性经典信号肽序列的编码，在用质粒转导后24小时增大了HEK293细胞中的BDNF浓度。图12表明，如在用质粒转导后24小时测得的，用新序列(质粒QTA009P至QTA013P)取代质粒QTA002P中包含的内源性经典信号肽编码序列增加了BDNF从HEK293细胞的释放(如通过ELISA测量的)。
如图13中所示，病毒-2A肽序列的加入导致将大前体蛋白的编码序列有效加工成两种转基因eGFP和BDNF。蛋白质印迹显示了用以下质粒转导HEK293细胞后24小时的HEK293细胞：(i)QTA015P(表达BDNF和eGFP，所述BDNF和eGFP被IRES间隔区隔开)；(ii)QTA021P(表达BDNF，之后是eGFP，所述BDNF和eGFP被功能性病毒-2A肽序列隔开)；(iii)QTA022P(表达BDNF，之后是eGFP，所述BDNF和eGFP被非功能性病毒-2A肽序列隔开)；以及(iv)QTA023P(表达eGFP，之后编码BDNF，所述eGFP和所述BDNF被功能性病毒-2A肽序列隔开)。
QTA021P(含有mBDNF-病毒-2A肽-eGFP的密码子优化序列的质粒)的编码序列在本文中称为SEQ ID No:104，如下所示：
ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCACGCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGTGGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATATTTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACTGGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGGATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATTTGCTCAAGTTGGCGGGGGATGTGGAAAGCAATCCCGGGCCAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACACAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCAGCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGAAAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGGAATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTAATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGAGCTTTACAAGTAA
[SEQ ID No:104]
QTA022P(含有mBDNF-非功能性病毒-2A肽-eGFP的密码子优化序列的质粒)的编码序列在本文中称为SEQ ID No:105，如下所示：ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCACGCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGTGGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATATTTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACTGGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGGATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCTGTCAAACAAACCCTCAATTTTGACTTGCTGAAGCTTGCTGGGGATGTCGAGTCCGCTGCCGCGGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACACAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCAGCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGAAAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGGAATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTAATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGAGCTTTACAAGTAA
[SEQ ID No:105]
QTA023P(含有eGFP-病毒-2A肽-mBDNF的密码子优化序列的质粒)的编码序列在本文中称为SEQ ID No:106，如下所示：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAGGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCTCCCGTTAAACAAACTCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCTGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No:106]
参照图14A，示出了用QTA020V载体转染后48小时的HEK293细胞匀浆的蛋白质印迹。其显示了对大前体编码区的有效加工，所述大前体编码区包括被病毒2A-肽序列隔开的TrkB受体和BDNF。两种TrkB和mBDNF免疫反应性转基因在预测的正确分子量大小内。应该注意的是，在TrkB受体条带上方没有对大前体蛋白的染色，表明了在五次重复中对前体蛋白的几乎完全的或完全的加工。图14B和图14C示出，在加工后，病毒-2A肽切割后产生的转基因蛋白已被转运至HEK293细胞中的正确细胞内区室(在释放前，TrkB受体被转运至细胞表面，BDNF被转运至储存囊泡)。
图15示出，在玻璃体内注射rAAV2载体QTA020V后，加入隔开TrkB受体和BDNF的两个编码区的病毒-2A肽序列导致有效加工成小鼠视网膜中的两种转基因。
图16示出了在注射QTA020V后，如通过免疫细胞化学显示的小鼠视网膜神经节细胞层中转基因的表达，QTA020V是一种rAAV2载体，其含有被病毒-2A肽序列隔开的TrkB受体和BDNF的编码。靶标视网膜神经节细胞体被抗Brn3A抗体染成红色，并且细胞核被DAPI复染成蓝色，以区分各视网膜层。
参考图17，示出了在用rAAV2-CAG-eGFP载体处理的对照动物与小鼠中，经由玻璃体内注射(2μl的9×1012个载体颗粒/ml)进行的QTA020V(含有TrkB受体和BDNF的编码，TrkB受体和BDNF被病毒-2A肽序列隔开)预处理赋予了对视神经夹伤后的视网膜神经节细胞存活的显著神经保护功效。QTA020V载体的神经保护水平也高于仅表达BDNF的载体所提供的神经保护水平。使所有三组动物经受视神经夹伤程序，并在损伤后7天测量视网膜神经节细胞的数目。与经受假夹伤的动物(数据未示出)相比，对照(黑色条形)中的视网膜神经节细胞减少了71％。
构建体的神经保护效应
参照图18，示出了在用不表达转基因的rAAV2病毒载体(Null病毒)、仅表达BDNF的rAAV2病毒载体(QTA027V)、仅表达TrkB的rAAV2病毒载体(QTA025V)和表达BDNF和TrkB两者的rAAV2病毒载体(QTA020V)进行转染后，通过蛋白质印迹法测得的未分化的人SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞匀浆中BDNF转基因(参见图18A)和TrkB转基因((参见图18B)的表达。显然，实现了良好的表达水平。
参照图18C，示出了在用病毒载体Null、QTA020V、QTA025V或QTA027V转染后，在蛋白质印迹中SH-SY5Y细胞中激活的磷酸化TrkB受体的水平。发现与未转染的细胞相比，只有表达BDNF和TrkB两者的QTA020V载体显著增加了TrkB受体的激活。因此，已经表明，本发明的构建体有效地表达两种转基因，并且在成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞中导致激活的磷酸化TrkB受体，表明能够治疗神经退行性病症(诸如阿尔茨海默氏病)或中风。
参照图19，示出了在暴露于通过添加过氧化氢(0.1mM或1.0mM的H2O2)产生的氧化胁迫后，通过TUNEL染色测得的培养物中未分化的成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞的凋亡性细胞死亡的水平。令人惊奇地发现，与未处理的细胞相比，在添加过氧化氢之前用表达BDNF和TrkB受体两者的rAAV2载体QTA020V转染的细胞显著地保护抵抗凋亡。再次，这些数据支持了本发明的构建体能够用于治疗、预防或改善神经退行性病症或中风的观念。
现在参照图20，示出了从P301S突变型人Tau转基因小鼠获得并用识别位置丝氨酸396/丝氨酸404(PHF-1)或丝氨酸202/丝氨酸205(AT8)处的磷酸化Tau的抗体染色的视神经的代表性免疫细胞化学图像。
P301S转基因小鼠在八个月内主要在海马中发展出神经元丧失和脑萎缩，但扩散到其他脑区域，包括新皮质和内嗅皮质。它们在新皮质、杏仁核、海马、脑干和脊髓中发展出广泛的神经纤维缠结状内含物(inclusions)。缠结病状伴有小胶质细胞增生和星形细胞增生，但没有淀粉样斑块[56,57,58]。
通过玻璃体内注射QTA020V来处理小鼠，该QTA020V在靶视网膜神经节细胞及其轴突中表达TrkB受体和BDNF。图20中的图像说明，通过使用PHF-1和AT-8，Tau过度磷酸化的程度在构成视神经的轴突中显著降低。这些体内数据表明，使用本发明的构建体来增加TrkB和BDNF的表达能够显著减少神经元中的Tau磷酸化，Tau磷酸化是与阿尔茨海默氏脑有关的病理生理特征之一。
结论
应当理解，对于阿尔茨海默氏病，没有这样的单一临床前模型，所述单一临床前模型通常被认为是该疾病的替代物，并且可在所述单一临床前模型中测试基因疗法的针对临床结局的可预测性程度。然而，可用的是这样的动物模型，在所述动物模型中对它们的基因组的修饰已经导致将定义的遗传/神经化学或生物化学变化之一引入啮齿动物中，所述定义的遗传/神经化学或生物化学变化已在患有该疾病的人中被鉴定出。这些变化包括Aβ的过量产生和斑块的形成[59]，被认为介导轴突运输的神经元细胞体和轴突中过度磷酸化的tau蛋白的生成[60]，以及BDNF及其同源受体TrkB二者的减少[11-14,27]
基于人类死后组织和能够通过阻断负责β-淀粉样蛋白生成的BACE-1酶(verubecestat；Merck)或通过抗体中和(例如solenezumab；Eli Lilly和bapineuzumab；Pfizer/J&J)成功地从两种实验动物中去除β-淀粉样蛋白的各种剂的能力，这两种方法均未能在III期临床研究中产生明显的临床益处。因此，在诊断为阿尔茨海默氏病的人脑中的广泛描述的死后变化中，与过度磷酸化的tau相关的神经元纤维缠结的存在和BDNF信号传导丧失是恢复或减慢与这种神经系统状况相关的病理生理变化的仅有的未经测试的方法。
通过重大的发明努力，本发明的发明人已经使用新的构建体解决了克服BDNF信号传导丧失的问题，所述构建体能够同时表达和上调TrkB受体和BDNF两者，据报道TrkB受体和BDNF两者在该疾病中均降低(参见上面引用的参考文献)。
由于BDNF具有短半衰期，因此可能需要每天数次注射入脑或通过持续输注的重组BDNF的规律施用在临床上不可行，并且可能与TrkB受体下调有关。此外，本发明的发明人还已经在图18C中证明，在SHSY-5Y细胞中，仅表达TrkB受体的rAAV2不足以显著增加该受体的活性，如通过活性p-Y515-TrkB染色的水平所测量的。本发明的构建体经特别地设计，以通过许多创造性步骤来适应TrkB受体和BDNF两者的大编码序列，所述创造性步骤包括：(i)使pro-BDBF编码缺失，(ii)引入新信号肽以克服由于缺少重要的Pro-BDNF序列而与BDNF的细胞内转运和正常蛋白折叠有关的问题，(iii)构建含有病毒-2A肽序列的单个转基因，这有利于在TrkB序列和BDNF序列的核糖体生产之间进行翻译“跳跃”，以及(iv)最后简短的WPRE和polyA序列。因此，发明人提供了以下证据，表达两种转基因(即BDNF及其同源受体BDNF)的新构建体远远优于仅单独上调TrkB受体。发明人还已经证明，如先前已经证明的，新的基因疗法构建体能够提供最佳的活性[56]，而不需要额外的(规律的)BDNF注射。
发明人的主要目的是开发一种基因疗法，所述基因疗法能够解决低水平的BDNF/TrkB信号传导，所提供的实施例清楚地证明了这一点。出乎意料的是，这种新的基因疗法构建体能够大大降低过度磷酸化的Tau蛋白的密度(使用两种沿着Tau蛋白长度识别若干磷酸化丝氨酸残基的抗体测量的)，如图20所示。Tau是在脑和其他神经组织(诸如视神经)中发现的一种普遍存在的蛋白质。通过使用视神经作为模型系统，发现眼中BDNF信号传导的增加会降低该蛋白同种型的提议病理水平。因此，未预期到使P301S转基因小鼠品系中BDNF/TrkB信号转导上调并观察到磷酸化Tau的密度如此大幅度降低的能力。
参考文献
1.Brookmeyer R,Johnson E,Ziegler-Graham K,Arrighi HM.Forecasting theglobal burden of Alzheimer's disease(2007).Alzheimers.Dement.,vol.3(3)PP:186–191.
2.Braak H,Braak E.(1991).Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.Acta Neuropathol.,vol.82(4),PP:239–259.
3.Dekosky ST,Scheff SW.(1990).Synapse loss in frontal cortex biopsiesin Alzheimer's disease:correlation with cognitive severity.Ann.Neurol.,vol.27(5),PP:457–464.
4.Chao MV(2003).Neurotrophins and their receptors:A convergence pointfor many signalling pathways.Nature Rev.Neurosci.vol.4,PP:299-309.
5.Dawbarn D,Allen SJ,(2003).Neurotrophins and neurodegeneration.Neuropathol.Appl.Neurobiol.,vol.29,PP:211-230.
6.Phillips HS,Hains JM,Laramee GR,Rosenthal A,Winslow JW(1990).Widespread expression of BDNF but not NT3 by target areas of basal forebraincholinergic neurons.Science,vol.250(4978),PP:290–294.
7.Wetmore C,Ernfors P,Persson H,Olson L,(1990).Localization of brain-derived neurotrophic factor mRNA to neurons in the brain by in situhybridization.Exp.Neurol.,vol.109(2),PP:141–152
8.Ghosh A,Carnahan J,Greenberg ME,(1994).Requirement for BDNF inactivity-dependent survival of cortical neurons.Science,vol.263(5153),PP:1618–1623.
9.Phillips HS,Hains JM,Armanini M,Laramee GR,Johnson SA,Winslow JW,(1991).BDNF mRNA is decreased in the hippocampus of individuals withAlzheimer's disease.Neuron,vol.7(5),PP:695–702.
10.Holsinger RM,Schnarr J,Henry P,Castelo VT,Fahnestock M,(2000).Quantitation of BDNF mRNA in human parietal cortex by competitive reversetranscription-polymerase chain reaction:decreased levels in Alzheimer'sdisease.Brain Res.Mol.Brain Res.,vol.76(2),PP:347–354.
11.Narisawa-Saito M,Wakabayashi K,Tsuji S,Takahashi H,Nawa H,(1996).Regional specificity of alterations in NGF,BDNF and NT-3 levels inAlzheimer's disease.Neuroreport,vol.7(18),PP:2925–2928.
12.Connor B,Young D,Yan Q,Faull R L,Synek B,Dragunow M,(1997).Brain-derived neurotrophic factor is reduced in Alzheimer's disease.BrainRes.Mol.Brain Res.,vol.49(1-2),PP:71–81.
13.Ferrer I,Marin C,Rey M J,Ribalta T,Goutan E,Blanco R,Tolosa E,Marti E,(1999).BDNF and full-length and truncated TrkB expression inAlzheimer disease.Implications in therapeutic strategies.J.Neuropathol.Exp.Neurol.,vol.58(7),PP:729–739.
14.Savaskan E,Muller-Spahn F,Olivieri G,Bruttel S,Otten U,RosenbergC,Hulette C,Hock C,(2000).Alterations in trk A,trk B and trk C receptorimmunoreactivities in parietal cortex and cerebellum in Alzheimer'sdisease.Eur.Neurol.,vol.44(3),PP:172–180.
15.Peng S,Wuu J,Mufson E J,Fahnestock M,(2005).Precursor form ofbrain-derived neurotrophic factor and mature brain-derived neurotrophicfactor are decreased in the pre-clinical stages of Alzheimer'sdisease.J.Neurochem.,vol.93(6)PP:1412–1421.
16.Michalski B,Fahnestock M,(2003).Pro-brain-derived neurotrophicfactor is decreased in parietal cortex in Alzheimer's disease.BrainRes.Mol.Brain Res.,vol.111(1-2),PP:148–154.
17.Qin XY,Cao C,Cawley NX,Liu TT,Yuan J,Loh YP,Cheng Y,(2016).Decreased peripheral brain-derived neurotrophic factor levels in Alzheimer’sdisease:A meta-analysis study(N＝7277).Mol.Psychiatry,vol.22,PP:312–320.
18.Forlenza OV,Diniz BS,Teixeira AL,Radanovic M,Talib LL,Rocha NP,Gattaz WF,(2015).Lower Cerebrospinal Fluid Concentration of Brain-DerivedNeurotrophic Factor Predicts Progression from Mild Cognitive Impairment toAlzheimer's Disease.Neuromolecular Med.,vol.17(3),PP:326-332.
19.Feher A,Juhasz A,Rimanoczy A,Kalman J,Janka Z,(2009).Associationbetween BDNF Val66Met polymorphism and Alzheimer disease,dementia with Lewybodies,and Pick disease.Alzheimer Dis.Assoc.Disord.,vol.23(3)PP:224–228.
20.Peng S,Wuu J,Mufson EJ,Fahnestock M,(2005).Precursor form ofbrain-derived neurotrophic factor and mature brain-derived neurotrophicfactor are decreased in the pre-clinical stages of Alzheimer’sdisease.J.Neurochem.,vol.93,PP:1412–1421.
21.Michalski B,Corrada MM,Kawas CH,Fahnestock M,(2015).Brain-derivedneurotrophic factor and TrkB expression in the“oldest-old”,the 90+study:Correlation with cognitive status and levels of soluble amyloid-β.Neurobiol.Aging,vol.36,PP:3130–3139.
22.Elliott E,Atlas R,Lange A,Ginzburg I,(2005).Brain-derivedneurotrophic factor induces a rapid dephosphorylation of tau protein througha PI-3 kinase signalling mechanism.Eur.J.Neurosci.,vol.22,PP:1081–1089.
23.Jiao S-S,Shen L-L,Zhu C,Bu X-L,Liu Y-H,Liu C-H,Yao X-Q,Zhang L-L,Zhou H-D,Walker DG,Tan J,Gortz J,Zhou X-F,Wang Y-J,(2016).Brain-derivedneurotrophic factor protects against tau-related neurodegeneration ofAlzheimer’s disease.Transl.Psychiatry,vol.6,e907.
24.Rosa E,Mahendram S,Ke YD,Ittner LM,Ginsberg SD,Fahnestock M,(2016).Tau downregulates BDNF expression in animal and cellular models ofAlzheimer's disease.Neurobiol.Aging,vol.48,PP:135-142.
25.Lim JY,Reighard CP,Crowther DC,(2015).The pro-domains ofneurotrophins,including BDNF,are linked to Alzheimer’s disease through atoxic synergy with Aβ.Hum.Mol.Genet.,vol.,24(14)PP:3929-3938.
26.Hashimoto R,Hirata Y,Asada T,Yamashita F,Nemoto K,Mori T,MoriguchiY,Kunugi H,Arima K,Ohnishi T,(2009).Effect of the brain-derived neurotrophicfactor and the apolipoprotein E polymorphisms on disease progression inpreclinical Alzheimer's disease.Genes Brain Behav.,vol.8(1)PP:43–52.
27.Allen S J,Wilcock G K,Dawbarn D,(1999).Profound and selective lossof catalytic TrkB immunoreactivity in Alzheimer's disease.Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.264(3)PP:648–651.
28.Kemppainen S,Rantamaki T,Jeronimo-Santos A,Lavasseur G,Autio H,Karpova N,Karkkainen E,Staven S,Vicente Miranda H,Outeiro TF,Diógenes MJ,Laroche S,Davis S,
Figure BDA0002225874110000701
AM,Castrén E,Tanila H,(2012).Impaired TrkBreceptor signaling contributes to memory impairment in APP/PS1mice.Neurobiol.Aging,vol.33,e1123–e1139.
29.Devi L,Ohno M(2015)TrkB reduction exacerbates Alzheimer’s disease-like signalling aberrations and memory deficits without affectingβ-amyloidosis in 5XFAD mice.Transl.Psychiatry,vol.5,e562.
30.Tong L,Balazs R,Thornton PL,Cotman CW,(2004).β-Amyloid peptide atsublethal concentrations downregulates brain-derived neurotrophic factorfunctions in cultured cortical neurons.J.Neurosci.,vol.24,PP:6799–6809.
31.Liu XH,Geng Z,Yan J,Li T,Chen Q,Zhang QY,Chen ZY,(2015).BlockingGSK3β-mediated dynamin1 phosphorylation enhances BDNF-dependent TrkBendocytosis and the protective effects of BDNF in neuronal and mouse modelsof Alzheimer’s disease.Neurobiol.Dis.,vol.74,PP:377–391.
32.Poon WW,Blurton-Jones M,Tu CH,Feinberg LM,Chabrier MA,Harris JW,Jeon NL,Cotman CW,(2011).β-amyloid impairs axonal BDNF retrogradetrafficking.Neurobiol.Aging,vol.32,PP:821–833.
33.Gong B,Cao Z,Zheng P,Vitolo OV,Liu S,Staniszewski A,Moolman D,Zhang H,Shelanski M,Arancio O,(2006).Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescuesβ-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory.Cell,vol.126,PP:775–788.
34.Gan KJ,Silverman MA,(2015).Dendritic and axonal mechanisms of Ca2+elevation impair BDNF transport in aβoligomer-treated hippocampalneurons.Mol.Biol.Cell,vol.26,PP:1058–1071.
35.Zhang L,Fang Y,Lian Y,Chen Y,Wu T,Zheng Y,Zong H,Sun L,Zhang R,Wang Z,Xu Y,(2015).Brain-derived neurotrophic factor ameliorates learningdeficits in a rat model of Alzheimer's disease induced by aβ1-42.,PLoS One,vol.10(4),e0122415.
36.Wu Y,Luo X,Liu X,Liu D,Wang X,Guo Z,Zhu L,Tian Q,Yang X,Wang JZ,(2015).Intraperitoneal Administration of a Novel TAT-BDNFPeptide AmelioratesCognitive Impairments via Modulating Multiple Pathways in Two Alzheimer'sRodent Models.Sci.Rep.,vol.5,PP:15032.
37.Nagahara AH,Merrill DA,Coppola G,Tsukada S,Schroeder BE,Shaked GM,Wang L,Blesch A,Kim A,Conner JM,Rockenstein E,Chao MV,Koo EH,Geschwind D,Masliah E,Chiba AA,Tuszynski MH,(2009).Neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor in rodent and primate models of Alzheimer’sdisease.Nat.Med.,vol.15(3),PP:331-337.
38.Mey J,Thanos S,(1993).Intravitreal injections of neurotrophicfactors support the survival of axotomized retinal ganglion cells in adultrats in vivo.Brain Res.,vol.602,PP:304-317.
39.Mansour-Rabaey S,Clarke DB,Wang Y-C,Bray GM,Aguayo AJ,(1994).Effects of ocular injury and administration of brain-derived neurotrophicfactor on survival and regrowth of axotomized retinal ganglioncells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,vol.91,PP:1632-1636.
40.Peinado-Ramon P,Salvador M,
Figure BDA0002225874110000711
-Perez MP,Vidal-Sanz M,(1996).Effects of axotomy and intraocular administration of NT-4,NT-3 and brain-derived neurotrophic factor on the survival of adult rat retinal ganglioncells.A quantitative in vivo study.Invest Ophthalmol.Vis.Sci.,vol.37,PP:489-500.
41.Di Polo A,Aigner LJ,Dunn RJ,Bray GM,Aguayo AJ,(1998).Prolongeddelivery of brain-derived neurotrophic factor by adenovirus-infected Müllercells temporarily rescues injured retinal ganglioncells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,vol.95,PP:3978-3983.
42.Klocker N,Kermer P,Weishaupt JH,Labes M,Ankerhold R,(2000).Brain-derived neurotrophic factor-mediated neuroprotection of adultrat retinal ganglion cells in vivo does not exclusively depend onphosphatidyl-inositol-3'-kinase/protein kinase B signaling.J.Neurosci.,vol.20,PP:6962-6967.
43.Ko ML,Hu DN,Ritch R,Sharma SC,Chen CF,(2001).Patterns of retinalganglion cell survival after brain-derived neurotrophic factor administrationin hypertensive eyes of rats.Neurosci.Lett.,vol.305,PP:139-142.
44.Chen H,Weber AJ,(2001).BDNF enhances retinal ganglion cellsurvival in cats with optic nerve damage.Invest Ophthamol.Vis.Sci.,vol.42,PP:966-974.
45.Pórez MTR,Caminos E,(1995).Expression of brain-derivedneurotrophic factor and its functional receptor in neonatal and adult ratretina.Neurosci.Lett.,vol.183,PP:96-99.
46.Vecino E,Ugarte M,Nash MS,Osborne NN.(1999).NMDA induces BDNFexpression in the albino rat retina in vivo.Neuroreport.,vol.10,PP:1103-1106.
47.Mowla SJ,Farhadi HF,Pareek S,Atwal JK,Morris SJ,Seidah NG,MurphyRA,(2001).Biosynthesis and post-translational processing of the precursor tobrain-derived neurotrophic factor.J.Biol.Chem.,,vol.276,PP:12660-12666.
48.Gupta VK,You Y,Gupta VB,Klistorner A,Graham SL,(2013).TrkBreceptor signalling:Implications in neurodegenerative,psychiatric andproliferative disorders.Int.J.Mol.Sci.,vol.14,PP:10122-10142
49.Teng HK,Teng KK,Lee R,Wright S,Tevar S,Almeida RD,Kermani P,TorkinR,Chen ZY,Lee FS,Kraemer RT,Nykjaer A,Hempstead BL,(2005).ProBDNF inducesneuronal apoptosis via activation of a receptor complex of p75NTR andsortilin.J.Neurosci.,vol.25,PP:5455-5463.
50.Wei Y,Zhang F,Zao J,Jiang X,Lu Q,Gao E,Wand N,(2012).Enhancedprotein expression of proBDNF and proNGF in elevated intraocular pressure-induced rat retinal ischemia.Chin.Med.J.,vol.125,PP:3875-3879.
51.Woo NH,Teng HK,Siao C-J,Chiaruttini C,Pang PT,Milner TA,HempsteadBL,Lu B,(2005).Activation of p75NTR by proBDNF facilitates hippocampal long-term depression.Nature Neurosci.,vol.8,PP:1069-1077.
52.Lebrun-Julien F,Bertrand MJ,De Backer O,Stellwagen D,Morales CR,DiPolo A,Barker PA,(2010).ProNGF induces TNFalpha-dependent death of retinalganglion cells through a p75NTR non-cell-autonomous signalingpathway.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.,vol.107,PP:3817-3822.
53.Quigley HA,McKinnon SJ,Zack DJ,Pease ME,Kerrigan-Baumrind LA,Kerrigan DF,Mitchell RS,(2000).Retrograde axonal transport of BDNF in retinalganglion cells is blocked by acute IOP elevation inrats.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,vol.41,PP:3460–3466.
54.Pease ME McKinnon SJ,Quigley HA,Kerrigan-Baumrind LA,Zack DJ,(2000).Obstructed axonal transport of BDNF and its receptor TRKB inexperimental glaucoma.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,vol.41,PP:764-774.
55.Wei Y,Wang N,Lu Q,Zhang N,Zheng D,Li J,(2007).Enhanced proteinexpressions of sortilin and p75NTR in retina of rat following elevatedintraocular pressure-induced retinal ischemia.Neurosci.Lett.,vol.429,PP:169-174.
56.Cheng L,Sapieha P,Kittlerova P,Hauswith WW,Di Polo A,(2002).TrkBgene transfer protects retinal ganglion cells from axotomy-induced death invivo.J.Neurosci.,vol.22(10),PP:3977-3986.
57.YoshiyamaY,Higuchi M,Zhang B,Huang SM,Iwata N,Saido TC,Maeda J,Suhara T,Trojanowski TC,Lee VM,(2007)..Synapse loss and microglial activationprecede tangles in a P301S Tauopathy mouse model.Neuron,vol.53,PP:337-351.
58.Takeuchi H,Iba M,Inoue H,Higuchi M,Takao K,Tsukita K,Karatsu Y,Iwamoto Y,Miyakama T,Suhara T,Trojanowski JQ,Lee VM,Takahashi R,(2011).P301Smutant human Tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathieswith dementia and altered sensorimotor gating.PLoS One,vol.6(6),e21050.
59.Hardy J,Allsop D,(1991).Amyloid deposition as the central event inthe aetiology of Alzheimer's disease,Trends Pharmacol.Sci.,vol.12(10),PP:383–388.
60.Mudher A,Lovestone S,(2002).Alzheimer's disease-do tauists andbaptists finally shake hands？.Trends Neurosci.,vol.25(1),PP:22–26.
序列表
<110> 奎西拉有限公司
<120> 用于神经退行性病症或中风的治疗的基因构建体
<130> 83344PCT1
<160> 108
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 469
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt gggttttagg accaggatga ggcggggtgg 60
gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc actggacaag cacccaaccc ccattcccca 120
aattgcgcat cccctatcag agagggggag gggaaacagg atgcggcgag gcgcgtgcgc 180
actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg 240
ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc 300
cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg 360
cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct gcgctgcggc gccggcgact cagcgctgcc 420
tcagtctgcg gtgggcagcg gaggagtcgt gtcgtgcctg agagcgcag 469
<210> 2
<211> 1733
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ctcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420
tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480
cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540
ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600
ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660
cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 720
cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 780
ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 840
aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 900
gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 960
gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1020
ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1080
tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1140
acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 1200
gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1260
cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1320
gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1380
cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1440
ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1500
agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1560
cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1620
tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 1680
tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttg 1733
<210> 3
<211> 664
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ctagatctga attcggtacc ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 60
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 120
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 180
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt 240
acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 300
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 360
cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc 420
catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc 480
agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg 540
gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa 600
gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg 660
ggcg 664
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aaggctggag acgtggagga gaaccctgga 60
cct 63
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Gln Ala Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga 60
cct 63
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 9
<211> 822
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
165 170 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
210 215 220
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
260 265 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
290 295 300
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305 310 315 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
370 375 380
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
405 410 415
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser
420 425 430
Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu
435 440 445
Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met
450 455 460
Lys Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro
465 470 475 480
Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly
485 490 495
Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu
500 505 510
Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr
515 520 525
Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu
530 535 540
Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu
545 550 555 560
Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp
565 570 575
Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu
580 585 590
Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val
595 600 605
Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp
610 615 620
Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala
625 630 635 640
Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile
645 650 655
Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe
660 665 670
Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu
675 680 685
Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr
690 695 700
Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met
705 710 715 720
Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val
725 730 735
Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln
740 745 750
Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln
755 760 765
Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu
770 775 780
Leu Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Met Arg Lys Asn Ile
785 790 795 800
Lys Gly Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val
805 810 815
Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
820
<210> 10
<211> 2466
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
atgtcgtcct ggataaggtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttctgctgg 60
ctggttgtgg gcttctggag ggccgctttc gcctgtccca cgtcctgcaa atgcagtgcc 120
tctcggatct ggtgcagcga cccttctcct ggcatcgtgg catttccgag attggagcct 180
aacagtgtag atcctgagaa catcaccgaa attttcatcg caaaccagaa aaggttagaa 240
atcatcaacg aagatgatgt tgaagcttat gtgggactga gaaatctgac aattgtggat 300
tctggattaa aatttgtggc tcataaagca tttctgaaaa acagcaacct gcagcacatc 360
aattttaccc gaaacaaact gacgagtttg tctaggaaac atttccgtca ccttgacttg 420
tctgaactga tcctggtggg caatccattt acatgctcct gtgacattat gtggatcaag 480
actctccaag aggctaaatc cagtccagac actcaggatt tgtactgcct gaatgaaagc 540
agcaagaata ttcccctggc aaacctgcag atacccaatt gtggtttgcc atctgcaaat 600
ctggccgcac ctaacctcac tgtggaggaa ggaaagtcta tcacattatc ctgtagtgtg 660
gcaggtgatc cggttcctaa tatgtattgg gatgttggta acctggtttc caaacatatg 720
aatgaaacaa gccacacaca gggctcctta aggataacta acatttcatc cgatgacagt 780
gggaagcaga tctcttgtgt ggcggaaaat cttgtaggag aagatcaaga ttctgtcaac 840
ctcactgtgc attttgcacc aactatcaca tttctcgaat ctccaacctc agaccaccac 900
tggtgcattc cattcactgt gaaaggcaac cccaaaccag cgcttcagtg gttctataac 960
ggggcaatat tgaatgagtc caaatacatc tgtactaaaa tacatgttac caatcacacg 1020
gagtaccacg gctgcctcca gctggataat cccactcaca tgaacaatgg ggactacact 1080
ctaatagcca agaatgagta tgggaaggat gagaaacaga tttctgctca cttcatgggc 1140
tggcctggaa ttgacgatgg tgcaaaccca aattatcctg atgtaattta tgaagattat 1200
ggaactgcag cgaatgacat cggggacacc acgaacagaa gtaatgaaat cccttccaca 1260
gacgtcactg ataaaaccgg tcgggaacat ctctcggtct atgctgtggt ggtgattgcg 1320
tctgtggtgg gattttgcct tttggtaatg ctgtttctgc ttaagttggc aagacactcc 1380
aagtttggca tgaaaggccc agcctccgtt atcagcaatg atgatgactc tgccagccca 1440
ctccatcaca tctccaatgg gagtaacact ccatcttctt cggaaggtgg cccagatgct 1500
gtcattattg gaatgaccaa gatccctgtc attgaaaatc cccagtactt tggcatcacc 1560
aacagtcagc tcaagccaga cacatttgtt cagcacatca agcgacataa cattgttctg 1620
aaaagggagc taggcgaagg agcctttgga aaagtgttcc tagctgaatg ctataacctc 1680
tgtcctgagc aggacaagat cttggtggca gtgaagaccc tgaaggatgc cagtgacaat 1740
gcacgcaagg acttccaccg tgaggccgag ctcctgacca acctccagca tgagcacatc 1800
gtcaagttct atggcgtctg cgtggagggc gaccccctca tcatggtctt tgagtacatg 1860
aagcatgggg acctcaacaa gttcctcagg gcacacggcc ctgatgccgt gctgatggct 1920
gagggcaacc cgcccacgga actgacgcag tcgcagatgc tgcatatagc ccagcagatc 1980
gccgcgggca tggtctacct ggcgtcccag cacttcgtgc accgcgattt ggccaccagg 2040
aactgcctgg tcggggagaa cttgctggtg aaaatcgggg actttgggat gtcccgggac 2100
gtgtacagca ctgactacta cagggtcggt ggccacacaa tgctgcccat tcgctggatg 2160
cctccagaga gcatcatgta caggaaattc acgacggaaa gcgacgtctg gagcctgggg 2220
gtcgtgttgt gggagatttt cacctatggc aaacagccct ggtaccagct gtcaaacaat 2280
gaggtgatag agtgtatcac tcagggccga gtcctgcagc gaccccgcac gtgcccccag 2340
gaggtgtatg agctgatgct ggggtgctgg cagcgagagc cccacatgag gaagaacatc 2400
aagggcatcc ataccctcct tcagaacttg gccaaggcat ctccggtcta cctggacatt 2460
ctaggc 2466
<210> 11
<211> 838
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
165 170 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
210 215 220
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
260 265 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
290 295 300
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305 310 315 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
370 375 380
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
405 410 415
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser
420 425 430
Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu
435 440 445
Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met
450 455 460
Lys Asp Phe Ser Trp Phe Gly Phe Gly Lys Val Lys Ser Arg Gln Gly
465 470 475 480
Val Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro
485 490 495
Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly
500 505 510
Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu
515 520 525
Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr
530 535 540
Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu
545 550 555 560
Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu
565 570 575
Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp
580 585 590
Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu
595 600 605
Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val
610 615 620
Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp
625 630 635 640
Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala
645 650 655
Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile
660 665 670
Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe
675 680 685
Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu
690 695 700
Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr
705 710 715 720
Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met
725 730 735
Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val
740 745 750
Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln
755 760 765
Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln
770 775 780
Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu
785 790 795 800
Leu Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Met Arg Lys Asn Ile
805 810 815
Lys Gly Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val
820 825 830
Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
835
<210> 12
<211> 2514
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
atgtcgtcct ggataaggtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttctgctgg 60
ctggttgtgg gcttctggag ggccgctttc gcctgtccca cgtcctgcaa atgcagtgcc 120
tctcggatct ggtgcagcga cccttctcct ggcatcgtgg catttccgag attggagcct 180
aacagtgtag atcctgagaa catcaccgaa attttcatcg caaaccagaa aaggttagaa 240
atcatcaacg aagatgatgt tgaagcttat gtgggactga gaaatctgac aattgtggat 300
tctggattaa aatttgtggc tcataaagca tttctgaaaa acagcaacct gcagcacatc 360
aattttaccc gaaacaaact gacgagtttg tctaggaaac atttccgtca ccttgacttg 420
tctgaactga tcctggtggg caatccattt acatgctcct gtgacattat gtggatcaag 480
actctccaag aggctaaatc cagtccagac actcaggatt tgtactgcct gaatgaaagc 540
agcaagaata ttcccctggc aaacctgcag atacccaatt gtggtttgcc atctgcaaat 600
ctggccgcac ctaacctcac tgtggaggaa ggaaagtcta tcacattatc ctgtagtgtg 660
gcaggtgatc cggttcctaa tatgtattgg gatgttggta acctggtttc caaacatatg 720
aatgaaacaa gccacacaca gggctcctta aggataacta acatttcatc cgatgacagt 780
gggaagcaga tctcttgtgt ggcggaaaat cttgtaggag aagatcaaga ttctgtcaac 840
ctcactgtgc attttgcacc aactatcaca tttctcgaat ctccaacctc agaccaccac 900
tggtgcattc cattcactgt gaaaggcaac cccaaaccag cgcttcagtg gttctataac 960
ggggcaatat tgaatgagtc caaatacatc tgtactaaaa tacatgttac caatcacacg 1020
gagtaccacg gctgcctcca gctggataat cccactcaca tgaacaatgg ggactacact 1080
ctaatagcca agaatgagta tgggaaggat gagaaacaga tttctgctca cttcatgggc 1140
tggcctggaa ttgacgatgg tgcaaaccca aattatcctg atgtaattta tgaagattat 1200
ggaactgcag cgaatgacat cggggacacc acgaacagaa gtaatgaaat cccttccaca 1260
gacgtcactg ataaaaccgg tcgggaacat ctctcggtct atgctgtggt ggtgattgcg 1320
tctgtggtgg gattttgcct tttggtaatg ctgtttctgc ttaagttggc aagacactcc 1380
aagtttggca tgaaagattt ctcatggttt ggatttggga aagtaaaatc aagacaaggt 1440
gttggcccag cctccgttat cagcaatgat gatgactctg ccagcccact ccatcacatc 1500
tccaatggga gtaacactcc atcttcttcg gaaggtggcc cagatgctgt cattattgga 1560
atgaccaaga tccctgtcat tgaaaatccc cagtactttg gcatcaccaa cagtcagctc 1620
aagccagaca catttgttca gcacatcaag cgacataaca ttgttctgaa aagggagcta 1680
ggcgaaggag cctttggaaa agtgttccta gctgaatgct ataacctctg tcctgagcag 1740
gacaagatct tggtggcagt gaagaccctg aaggatgcca gtgacaatgc acgcaaggac 1800
ttccaccgtg aggccgagct cctgaccaac ctccagcatg agcacatcgt caagttctat 1860
ggcgtctgcg tggagggcga ccccctcatc atggtctttg agtacatgaa gcatggggac 1920
ctcaacaagt tcctcagggc acacggccct gatgccgtgc tgatggctga gggcaacccg 1980
cccacggaac tgacgcagtc gcagatgctg catatagccc agcagatcgc cgcgggcatg 2040
gtctacctgg cgtcccagca cttcgtgcac cgcgatttgg ccaccaggaa ctgcctggtc 2100
ggggagaact tgctggtgaa aatcggggac tttgggatgt cccgggacgt gtacagcact 2160
gactactaca gggtcggtgg ccacacaatg ctgcccattc gctggatgcc tccagagagc 2220
atcatgtaca ggaaattcac gacggaaagc gacgtctgga gcctgggggt cgtgttgtgg 2280
gagattttca cctatggcaa acagccctgg taccagctgt caaacaatga ggtgatagag 2340
tgtatcactc agggccgagt cctgcagcga ccccgcacgt gcccccagga ggtgtatgag 2400
ctgatgctgg ggtgctggca gcgagagccc cacatgagga agaacatcaa gggcatccat 2460
accctccttc agaacttggc caaggcatct ccggtctacc tggacattct aggc 2514
<210> 13
<211> 822
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
165 170 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
210 215 220
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
260 265 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
290 295 300
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305 310 315 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
370 375 380
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
405 410 415
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser
420 425 430
Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu
435 440 445
Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met
450 455 460
Lys Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro
465 470 475 480
Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly
485 490 495
Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu
500 505 510
Asn Pro Gln Glu Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr
515 520 525
Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu
530 535 540
Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu
545 550 555 560
Cys Pro Glu Gln Asp Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp
565 570 575
Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu
580 585 590
Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val
595 600 605
Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp
610 615 620
Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala
625 630 635 640
Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile
645 650 655
Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe
660 665 670
Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu
675 680 685
Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Glu Ser Thr
690 695 700
Asp Glu Glu Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met
705 710 715 720
Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val
725 730 735
Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln
740 745 750
Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln
755 760 765
Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu
770 775 780
Leu Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro His Met Arg Lys Asn Ile
785 790 795 800
Lys Gly Ile His Thr Leu Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val
805 810 815
Glu Leu Asp Ile Leu Gly
820
<210> 14
<211> 2466
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
atgtcgtcct ggataaggtg gcatggaccc gccatggcgc ggctctgggg cttctgctgg 60
ctggttgtgg gcttctggag ggccgctttc gcctgtccca cgtcctgcaa atgcagtgcc 120
tctcggatct ggtgcagcga cccttctcct ggcatcgtgg catttccgag attggagcct 180
aacagtgtag atcctgagaa catcaccgaa attttcatcg caaaccagaa aaggttagaa 240
atcatcaacg aagatgatgt tgaagcttat gtgggactga gaaatctgac aattgtggat 300
tctggattaa aatttgtggc tcataaagca tttctgaaaa acagcaacct gcagcacatc 360
aattttaccc gaaacaaact gacgagtttg tctaggaaac atttccgtca ccttgacttg 420
tctgaactga tcctggtggg caatccattt acatgctcct gtgacattat gtggatcaag 480
actctccaag aggctaaatc cagtccagac actcaggatt tgtactgcct gaatgaaagc 540
agcaagaata ttcccctggc aaacctgcag atacccaatt gtggtttgcc atctgcaaat 600
ctggccgcac ctaacctcac tgtggaggaa ggaaagtcta tcacattatc ctgtagtgtg 660
gcaggtgatc cggttcctaa tatgtattgg gatgttggta acctggtttc caaacatatg 720
aatgaaacaa gccacacaca gggctcctta aggataacta acatttcatc cgatgacagt 780
gggaagcaga tctcttgtgt ggcggaaaat cttgtaggag aagatcaaga ttctgtcaac 840
ctcactgtgc attttgcacc aactatcaca tttctcgaat ctccaacctc agaccaccac 900
tggtgcattc cattcactgt gaaaggcaac cccaaaccag cgcttcagtg gttctataac 960
ggggcaatat tgaatgagtc caaatacatc tgtactaaaa tacatgttac caatcacacg 1020
gagtaccacg gctgcctcca gctggataat cccactcaca tgaacaatgg ggactacact 1080
ctaatagcca agaatgagta tgggaaggat gagaaacaga tttctgctca cttcatgggc 1140
tggcctggaa ttgacgatgg tgcaaaccca aattatcctg atgtaattta tgaagattat 1200
ggaactgcag cgaatgacat cggggacacc acgaacagaa gtaatgaaat cccttccaca 1260
gacgtcactg ataaaaccgg tcgggaacat ctctcggtct atgctgtggt ggtgattgcg 1320
tctgtggtgg gattttgcct tttggtaatg ctgtttctgc ttaagttggc aagacactcc 1380
aagtttggca tgaaaggccc agcctccgtt atcagcaatg atgatgactc tgccagccca 1440
ctccatcaca tctccaatgg gagtaacact ccatcttctt cggaaggtgg cccagatgct 1500
gtcattattg gaatgaccaa gatccctgtc attgaaaatc cccaggaatt tggcatcacc 1560
aacagtcagc tcaagccaga cacatttgtt cagcacatca agcgacataa cattgttctg 1620
aaaagggagc taggcgaagg agcctttgga aaagtgttcc tagctgaatg ctataacctc 1680
tgtcctgagc aggacaagat cttggtggca gtgaagaccc tgaaggatgc cagtgacaat 1740
gcacgcaagg acttccaccg tgaggccgag ctcctgacca acctccagca tgagcacatc 1800
gtcaagttct atggcgtctg cgtggagggc gaccccctca tcatggtctt tgagtacatg 1860
aagcatgggg acctcaacaa gttcctcagg gcacacggcc ctgatgccgt gctgatggct 1920
gagggcaacc cgcccacgga actgacgcag tcgcagatgc tgcatatagc ccagcagatc 1980
gccgcgggca tggtctacct ggcgtcccag cacttcgtgc accgcgattt ggccaccagg 2040
aactgcctgg tcggggagaa cttgctggtg aaaatcgggg actttgggat gtcccgggac 2100
gtggaaagca ctgacgaaga aagggtcggt ggccacacaa tgctgcccat tcgctggatg 2160
cctccagaga gcatcatgta caggaaattc acgacggaaa gcgacgtctg gagcctgggg 2220
gtcgtgttgt gggagatttt cacctatggc aaacagccct ggtaccagct gtcaaacaat 2280
gaggtgatag agtgtatcac tcagggccga gtcctgcagc gaccccgcac gtgcccccag 2340
gaggtgtatg agctgatgct ggggtgctgg cagcgagagc cccacatgag gaagaacatc 2400
aagggcatcc ataccctcct tcagaacttg gccaaggcat ctccggtcga actggacatt 2460
ctaggc 2466
<210> 15
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg
225
<210> 16
<211> 690
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
gcccccatga aagaagcaaa catccgagga caaggtggct tggcctaccc aggtgtgcgg 60
acccatggga ctctggagag cgtgaatggg cccaaggcag gttcaagagg cttgacatca 120
ttggctgaca ctttcgaaca cgtgatagaa gagctgttgg atgaggacca gaaagttcgg 180
cccaatgaag aaaacaataa ggacgcagac ttgtacacgt ccagggtgat gctcagtagt 240
caagtgcctt tggagcctcc tcttctcttt ctgctggagg aatacaaaaa ttacctagat 300
gctgcaaaca tgtccatgag ggtccggcgc cactctgacc ctgcccgccg aggggagctg 360
agcgtgtgtg acagtattag tgagtgggta acggcggcag acaaaaagac tgcagtggac 420
atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa aaggtccctg tatcaaaagg ccaactgaag 480
caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc atgggttaca caaaagaagg ctgcaggggc 540
atagacaaaa ggcattggaa ctcccagtgc cgaactaccc agtcgtacgt gcgggccctt 600
accatggata gcaaaaagag aattggctgg cgattcataa ggatagacac ttcttgtgta 660
tgtacattga ccattaaaag gggaagatag 690
<210> 17
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Met
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg
225
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
20 25 30
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
35 40 45
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
50 55 60
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
65 70 75 80
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
85 90 95
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
100 105 110
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
115
<210> 19
<211> 744
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
atgaccatcc ttttccttac tatggttatt tcatactttg gttgcatgaa ggctgccccc 60
atgaaagaag caaacatccg aggacaaggt ggcttggcct acccaggtgt gcggacccat 120
gggactctgg agagcgtgaa tgggcccaag gcaggttcaa gaggcttgac atcattggct 180
gacactttcg aacacgtgat agaagagctg ttggatgagg accagaaagt tcggcccaat 240
gaagaaaaca ataaggacgc agacttgtac acgtccaggg tgatgctcag tagtcaagtg 300
cctttggagc ctcctcttct ctttctgctg gaggaataca aaaattacct agatgctgca 360
aacatgtcca tgagggtccg gcgccactct gaccctgccc gccgagggga gctgagcgtg 420
tgtgacagta ttagtgagtg ggtaacggcg gcagacaaaa agactgcagt ggacatgtcg 480
ggcgggacgg tcacagtcct tgaaaaggtc cctgtatcaa aaggccaact gaagcaatac 540
ttctacgaga ccaagtgcaa tcccatgggt tacacaaaag aaggctgcag gggcatagac 600
aaaaggcatt ggaactccca gtgccgaact acccagtcgt acgtgcgggc ccttaccatg 660
gatagcaaaa agagaattgg ctggcgattc ataaggatag acacttcttg tgtatgtaca 720
ttgaccatta aaaggggaag atag 744
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 21
<211> 54
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
atgaccatcc ttttccttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 22
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met Phe His Gln Val Arg Arg Val Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met
1 5 10 15
Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met Lys Ala
20 25
<210> 23
<211> 78
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
atgttccacc aggtgagaag agtgatgacc atccttttcc ttactatggt tatttcatac 60
ttcggttgca tgaaggcg 78
<210> 24
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Gln Ser Arg Glu Glu Glu Trp Phe His Gln Val Arg Arg Val Met
1 5 10 15
Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met Lys
20 25 30
Ala
<210> 25
<211> 99
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
atgcagagcc gggaagagga atggttccac caggtgagaa gagtgatgac catccttttc 60
cttactatgg ttatttcata cttcggttgc atgaaggcg 99
<210> 26
<211> 47
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Met Leu Cys Ala Ile Ser Leu Cys Ala Arg Val Arg Lys Leu Arg Ser
1 5 10 15
Ala Gly Arg Cys Gly Lys Phe His Gln Val Arg Arg Val Met Thr Ile
20 25 30
Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met Lys Ala
35 40 45
<210> 27
<211> 141
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
atgctctgtg cgatttcatt gtgtgctcgc gttcgcaagc tccgtagtgc aggaaggtgc 60
gggaagttcc accaggtgag aagagtgatg accatccttt tccttactat ggttatttca 120
tacttcggtt gcatgaaggc g 141
<210> 28
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Cys Gly Ala Thr Ser Phe Leu His Glu Cys Thr Arg Leu Ile Leu
1 5 10 15
Val Thr Thr Gln Asn Ala Glu Phe Leu Gln Lys Gly Leu Gln Val His
20 25 30
Thr Cys Phe Gly Val Tyr Pro His Ala Ser Val Trp His Asp Cys Ala
35 40 45
Ser Gln Lys Lys Gly Cys Ala Val Tyr Leu His Val Ser Val Glu Phe
50 55 60
Asn Lys Leu Ile Pro Glu Asn Gly Phe Ile Lys Phe His Gln Val Arg
65 70 75 80
Arg Val Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly
85 90 95
Cys Met Lys Ala
100
<210> 29
<211> 300
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
atgtgtggag ccaccagttt tctccatgag tgcacaaggt taatccttgt tactactcag 60
aatgctgagt ttctacagaa agggttgcag gtccacacat gttttggcgt ctacccacac 120
gcttctgtat ggcatgactg tgcatcccag aagaagggct gtgctgtgta cctccacgtt 180
tcagtggaat ttaacaaact gatccctgaa aatggtttca taaagttcca ccaggtgaga 240
agagtgatga ccatcctttt ccttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 300
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Met Lys Arg Arg Val Met Ile Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser
1 5 10 15
Tyr Phe Gly Cys Met Lys
20
<210> 33
<211> 70
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
atgaaaagaa gagtgatgat catccttttc cttactatgg ttatttcata cttcggttgc 60
atgaagagcg 70
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Met Arg Arg Met Gln Leu Leu Leu Leu Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
atgaggagga tgcaactcct gctcctgatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
<210> 36
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Met Arg Arg Met Gln Leu Leu Leu Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe
1 5 10 15
Gly Cys Met Lys Ala
20
<210> 37
<211> 63
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
atgaggagga tgcaactcct gctcctgact atggttattt catacttcgg ttgcatgaag 60
gcg 63
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Arg Ile Leu Leu Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 39
<211> 54
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys
1 5 10 15
Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Thr Thr Cys
20 25 30
Ala Thr Ala Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Thr Gly Cys Ala Thr Gly
35 40 45
Ala Ala Gly Gly Cys Gly
50
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Met Arg Arg Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys
1 5 10 15
Met Lys Ala
<210> 41
<211> 57
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
atgagaagaa tccttttcct tactatggtt atttcatact tcggttgcat gaaggcg 57
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Met Arg Arg Phe Leu Phe Leu Leu Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 43
<211> 54
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
atgaggaggt tccttttcct tcttgttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Met Arg Arg Phe Leu Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Cys Met Lys Ala
1 5 10 15
<210> 45
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
atgaggaggt tccttttcct tctttacttc ggttgcatga aggcg 45
<210> 46
<211> 130
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 47
<211> 141
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141
<210> 48
<211> 584
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 60
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 120
aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 180
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 240
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 300
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 360
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 420
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 480
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 540
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcg 584
<210> 49
<211> 210
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Pro Ser Val Pro Ile Glu Ser Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro
20 25 30
Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu
35 40 45
Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala
50 55 60
Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg
65 70 75 80
Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Val
85 90 95
Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala Val Asp
100 105 110
Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly
115 120 125
Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp
130 135 140
Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly
145 150 155 160
Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr
165 170 175
Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp
180 185 190
Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly
195 200 205
Arg Ala
210
<210> 50
<211> 630
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
atgctccctc tcccctcatg ctccctcccc atcctcctcc ttttcctcct ccccagtgtg 60
ccaattgagt cccaaccccc accctcaaca ttgccccctt ttctggcccc tgagtgggac 120
cttctctccc cccgagtagt cctgtctagg ggtgcccctg ctgggccccc tctgctcttc 180
ctgctggagg ctggggcctt tcgggagtca gcaggtgccc cggccaaccg cagccggcgt 240
ggggtgagcg aaactgcacc agcgagtcgt cggggtgagc tggctgtgtg cgatgcagtc 300
agtggctggg tgacagaccg ccggaccgct gtggacttgc gtgggcgcga ggtggaggtg 360
ttgggcgagg tgcctgcagc tggcggcagt cccctccgcc agtacttctt tgaaacccgc 420
tgcaaggctg ataacgctga ggaaggtggc ccgggggcag gtggaggggg ctgccgggga 480
gtggacagga ggcactgggt atctgagtgc aaggccaagc agtcctatgt gcgggcattg 540
accgctgatg cccagggccg tgtgggctgg cgatggattc gaattgacac tgcctgcgtc 600
tgcacactcc tcagccggac tggccgggcc 630
<210> 51
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Pro Ser Val Pro Ile Glu Ser
20
<210> 52
<211> 72
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
atgctccctc tcccctcatg ctccctcccc atcctcctcc ttttcctcct ccccagtgtg 60
ccaattgagt cc 72
<210> 53
<211> 56
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp
1 5 10 15
Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro
20 25 30
Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly
35 40 45
Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg
50 55
<210> 54
<211> 168
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 54
caacccccac cctcaacatt gccccctttt ctggcccctg agtgggacct tctctccccc 60
cgagtagtcc tgtctagggg tgcccctgct gggccccctc tgctcttcct gctggaggct 120
ggggcctttc gggagtcagc aggtgccccg gccaaccgca gccggcgt 168
<210> 55
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Val
1 5 10 15
Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala Val Asp
20 25 30
Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp
50 55 60
Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly
65 70 75 80
Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr
85 90 95
Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp
100 105 110
Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly
115 120 125
Arg Ala
130
<210> 56
<211> 390
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
ggggtgagcg aaactgcacc agcgagtcgt cggggtgagc tggctgtgtg cgatgcagtc 60
agtggctggg tgacagaccg ccggaccgct gtggacttgc gtgggcgcga ggtggaggtg 120
ttgggcgagg tgcctgcagc tggcggcagt cccctccgcc agtacttctt tgaaacccgc 180
tgcaaggctg ataacgctga ggaaggtggc ccgggggcag gtggaggggg ctgccgggga 240
gtggacagga ggcactgggt atctgagtgc aaggccaagc agtcctatgt gcgggcattg 300
accgctgatg cccagggccg tgtgggctgg cgatggattc gaattgacac tgcctgcgtc 360
tgcacactcc tcagccggac tggccgggcc 390
<210> 57
<211> 592
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592
<210> 58
<211> 247
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 58
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag ttcttgccac ggcggaactc 180
atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 240
gtggtgt 247
<210> 59
<211> 224
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 60
aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 120
caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt 180
gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggta 224
<210> 60
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 61
<211> 54
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 61
atgaccatcc ttttccttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 62
<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Met Arg
1
<210> 63
<211> 6
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 63
atgaga 6
<210> 64
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Met Arg Arg
1
<210> 65
<211> 9
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 65
atgagaaga 9
<210> 66
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Met Arg Arg Arg
1
<210> 67
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 67
atgagaagaa ga 12
<210> 68
<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Met Lys
1
<210> 69
<211> 6
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 69
atgaaa 6
<210> 70
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Met Lys Lys
1
<210> 71
<211> 9
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 71
atgaaaaka 9
<210> 72
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Met Lys Lys Lys
1
<210> 73
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 73
atgaaaaaaa aa 12
<210> 74
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Met Lys Arg Arg
1
<210> 75
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 75
atgaaaagaa ga 12
<210> 76
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Met Arg Lys Arg
1
<210> 77
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 77
atgagaaaaa ga 12
<210> 78
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Met Arg Arg Lys
1
<210> 79
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 79
atgagaagaa aa 12
<210> 80
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Met Lys Lys Arg
1
<210> 81
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 81
atgaaaaaaa ga 12
<210> 82
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Phe Leu Phe Leu
1
<210> 83
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 83
ttccttttcc tt 12
<210> 84
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Phe Phe Phe Leu
1
<210> 85
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 85
ttcttcttcc tt 12
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Phe Ile Phe Leu
1
<210> 87
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 87
ttcatcttcc tt 12
<210> 88
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Phe Ile Phe Ile
1
<210> 89
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 89
ttcatcttca tc 12
<210> 90
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Phe Val Phe Ile
1
<210> 91
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 91
ttcgttttca tc 12
<210> 92
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Phe Val Phe Val
1
<210> 93
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 93
ttcgttttcg tt 12
<210> 94
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Phe Leu Phe Val
1
<210> 95
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 95
ttccttttcg tt 12
<210> 96
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Phe Ile Phe Val
1
<210> 97
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 97
ttcatcttcg tt 12
<210> 98
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Phe Phe Phe Ile
1
<210> 99
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 99
ttcttcttca tc 12
<210> 100
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Phe Phe Phe Val
1
<210> 101
<211> 12
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 101
ttcttcttcg tt 12
<210> 102
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Phe Ile Leu Phe Leu
1 5
<210> 103
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 103
ttcatccttt tcctt 15
<210> 104
<211> 1203
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 104
atgactatcc tgtttctgac aatggttatt agctatttcg gttgcatgaa ggctcacagt 60
gatcccgcac gccgcggaga acttagcgtg tgcgacagca tcagcgagtg ggtcaccgcc 120
gccgataaga agaccgctgt ggatatgtcc ggcgggaccg tcactgtact cgaaaaagtt 180
ccagtgagca aaggccaact gaaacaatat ttctatgaaa ctaagtgcaa ccccatgggg 240
tacaccaagg agggctgccg gggaatcgac aagagacact ggaattccca gtgccggacc 300
actcagagct acgtccgcgc cttgacgatg gattcaaaga agcgcatcgg atggcggttc 360
ataagaatcg acaccagttg tgtgtgcacg ctgacgataa aacgggggcg ggcccccgtg 420
aagcagaccc tgaactttga tttgctcaag ttggcggggg atgtggaaag caatcccggg 480
ccaatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggcgttg tgccaatact ggttgagttg 540
gatggcgatg tcaacggaca caaatttagc gtaagcgggg agggagaggg cgacgccaca 600
tatggcaagc tgaccctgaa gttcatttgc acgaccggca aattgcccgt cccttggccc 660
acacttgtga cgaccctgac ttatggcgta cagtgcttca gcaggtaccc tgatcatatg 720
aagcaacacg acttctttaa gagtgccatg ccagagggat acgtccagga aagaaccata 780
ttcttcaaag atgatggaaa ttacaaaacc cgggcagagg tcaagtttga aggcgacacc 840
ctggtgaaca ggatcgaact caaaggcatc gatttcaaag aggacggaaa catcctcgga 900
cacaaactgg aatacaatta caacagccac aacgtctaca tcatggcaga taaacaaaag 960
aacggtatta aagtgaactt caagatccgg cacaacatcg aagacggctc cgtccagctt 1020
gccgaccact accagcaaaa taccccgatc ggcgacggcc ccgttctcct ccccgataat 1080
cactacctga gtacacagtc agccttgagc aaagacccta atgaaaagcg ggaccacatg 1140
gttttgctgg agttcgttac cgcagcgggt attacgctgg gtatggacga gctttacaag 1200
taa 1203
<210> 105
<211> 1203
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 105
atgactatcc tgtttctgac aatggttatt agctatttcg gttgcatgaa ggctcacagt 60
gatcccgcac gccgcggaga acttagcgtg tgcgacagca tcagcgagtg ggtcaccgcc 120
gccgataaga agaccgctgt ggatatgtcc ggcgggaccg tcactgtact cgaaaaagtt 180
ccagtgagca aaggccaact gaaacaatat ttctatgaaa ctaagtgcaa ccccatgggg 240
tacaccaagg agggctgccg gggaatcgac aagagacact ggaattccca gtgccggacc 300
actcagagct acgtccgcgc cttgacgatg gattcaaaga agcgcatcgg atggcggttc 360
ataagaatcg acaccagttg tgtgtgcacg ctgacgataa aacgggggcg ggcccctgtc 420
aaacaaaccc tcaattttga cttgctgaag cttgctgggg atgtcgagtc cgctgccgcg 480
gctatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggcgttg tgccaatact ggttgagttg 540
gatggcgatg tcaacggaca caaatttagc gtaagcgggg agggagaggg cgacgccaca 600
tatggcaagc tgaccctgaa gttcatttgc acgaccggca aattgcccgt cccttggccc 660
acacttgtga cgaccctgac ttatggcgta cagtgcttca gcaggtaccc tgatcatatg 720
aagcaacacg acttctttaa gagtgccatg ccagagggat acgtccagga aagaaccata 780
ttcttcaaag atgatggaaa ttacaaaacc cgggcagagg tcaagtttga aggcgacacc 840
ctggtgaaca ggatcgaact caaaggcatc gatttcaaag aggacggaaa catcctcgga 900
cacaaactgg aatacaatta caacagccac aacgtctaca tcatggcaga taaacaaaag 960
aacggtatta aagtgaactt caagatccgg cacaacatcg aagacggctc cgtccagctt 1020
gccgaccact accagcaaaa taccccgatc ggcgacggcc ccgttctcct ccccgataat 1080
cactacctga gtacacagtc agccttgagc aaagacccta atgaaaagcg ggaccacatg 1140
gttttgctgg agttcgttac cgcagcgggt attacgctgg gtatggacga gctttacaag 1200
taa 1203
<210> 106
<211> 1203
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 106
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaag gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggct 720
cccgttaaac aaactctgaa cttcgacctg ctgaagctgg ctggagacgt ggagtccaac 780
cctggaccta tgaccatcct tttccttact atggttattt catacttcgg ttgcatgaag 840
gcgcactccg accctgcccg ccgtggggag ctgagcgtgt gtgacagtat tagcgagtgg 900
gtcacagcgg cagataaaaa gactgcagtg gacatgtctg gcgggacggt cacagtccta 960
gagaaagtcc cggtatccaa aggccaactg aagcagtatt tctacgagac caagtgtaat 1020
cccatgggtt acaccaagga aggctgcagg ggcatagaca aaaggcactg gaactcgcaa 1080
tgccgaacta cccaatcgta tgttcgggcc cttactatgg atagcaaaaa gagaattggc 1140
tggcgattca taaggataga cacttcctgt gtatgtacac tgaccattaa aaggggaaga 1200
tag 1203
<210> 107
<211> 2940
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 107
atgagcccat ggctgaagtg gcacggacca gcaatggcaa gactgtgggg cctgtgcctg 60
ctggtgctgg gcttctggag agccagcctg gcctgtccaa cctcctgcaa gtgtagctcc 120
gccaggatct ggtgcacaga gccttctcca ggcatcgtgg cctttccccg cctggagcct 180
aacagcgtgg atcccgagaa tatcaccgag atcctgatcg ccaaccagaa gcggctggag 240
atcatcaatg aggacgatgt ggaggcctac gtgggcctga gaaacctgac aatcgtggac 300
tccggcctga agttcgtggc ctataaggcc tttctgaaga actctaatct gaggcacatc 360
aacttcaccc gcaataagct gacatctctg agccggagac actttcggca cctggatctg 420
tccgacctga tcctgaccgg caatccattc acatgctctt gtgacatcat gtggctgaag 480
accctgcagg agacaaagtc tagccccgat acccaggacc tgtactgtct gaacgagtcc 540
tctaagaata tgcctctggc caacctgcag atccctaatt gtggactgcc aagcgcccgg 600
ctggccgcac ctaacctgac agtggaggag ggcaagtccg tgacactgtc ctgttctgtg 660
ggcggcgatc ccctgcctac cctgtattgg gacgtgggca acctggtgtc taagcacatg 720
aatgagacct cccacacaca gggctctctg agaatcacaa atatcagctc cgacgatagc 780
ggcaagcaga tctcttgcgt ggcagagaac ctggtgggag aggatcagga cagcgtgaat 840
ctgaccgtgc acttcgcccc caccatcaca tttctggagt ctcctaccag cgatcaccac 900
tggtgcatcc ccttcacagt gcggggaaac ccaaagcccg ccctgcagtg gttttacaac 960
ggcgccatcc tgaatgagtc caagtatatc tgtaccaaga tccacgtgac caaccacaca 1020
gagtaccacg gctgcctgca gctggataat cccacccaca tgaacaatgg cgactacaca 1080
ctgatggcca agaacgagta tggcaaggac gagaggcaga tcagcgccca cttcatgggc 1140
cgccctggag tggattatga gaccaaccct aattacccag aggtgctgta tgaggactgg 1200
accacaccta ccgatatcgg cgacaccaca aacaagtcta atgagatccc aagcacagat 1260
gtggccgacc agtctaacag ggagcacctg agcgtgtacg cagtggtggt catcgcctcc 1320
gtggtgggct tctgcctgct ggtcatgctg ctgctgctga agctggcccg ccactctaag 1380
tttggcatga agggcccagc ctccgtgatc tctaatgacg atgacagcgc cagccccctg 1440
caccacatca gcaacggctc caatacccct tctagctccg agggcggccc agatgccgtg 1500
atcatcggca tgacaaagat ccccgtgatc gagaaccctc agtacttcgg catcaccaat 1560
tcccagctga agcctgacac atttgtgcag cacatcaagc ggcacaacat cgtgctgaag 1620
agggaactgg gagagggagc cttcggcaag gtgtttctgg ccgagtgcta taacctgtgc 1680
ccagagcagg ataagatcct ggtggccgtg aagaccctga aggatgccag cgacaacgcc 1740
cggaaggact tccacagaga ggccgagctg ctgacaaatc tgcagcacga gcacatcgtg 1800
aagttttacg gcgtgtgcgt ggagggcgac cctctgatca tggtgttcga gtatatgaag 1860
cacggcgatc tgaacaagtt tctgagagca cacggaccag atgccgtgct gatggcagag 1920
ggaaatcccc ctaccgagct gacacagtct cagatgctgc acattgcaca gcagattgca 1980
gcaggaatgg tgtacctggc cagccagcac ttcgtgcaca gggatctggc aaccagaaac 2040
tgcctggtgg gagagaatct gctggtgaag atcggcgact ttggcatgtc ccgggacgtg 2100
tactctaccg actactatag agtgggcggc cacacaatgc tgcccatcag gtggatgcca 2160
cccgagagca tcatgtatcg caagttcacc acagagtctg acgtgtggag cctgggcgtg 2220
gtgctgtggg agatctttac ctacggcaag cagccttggt atcagctgtc caacaatgaa 2280
gtgatcgagt gtattacaca gggacgcgtg ctgcagaggc cacgcacatg cccccaggag 2340
gtgtacgagc tgatgctggg ctgttggcag cgggagccac acaccagaaa gaacatcaag 2400
agcatccaca cactgctgca gaatctggcc aaggcctccc ccgtgtatct ggacatcctg 2460
ggcagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 2520
ggacctatga gaatccttct tcttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 2580
cactccgacc ctgcccgccg tggggagctg agcgtgtgtg acagtattag cgagtgggtc 2640
acagcggcag ataaaaagac tgcagtggac atgtctggcg ggacggtcac agtcctagag 2700
aaagtcccgg tatccaaagg ccaactgaag cagtatttct acgagaccaa gtgtaatccc 2760
atgggttaca ccaaggaagg ctgcaggggc atagacaaaa ggcactggaa ctcgcaatgc 2820
cgaactaccc aatcgtatgt tcgggccctt actatggata gcaaaaagag aattggctgg 2880
cgattcataa ggatagacac ttcctgtgta tgtacactga ccattaaaag gggaagatag 2940
<210> 108
<211> 2943
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 108
atgtcatctt ggatccgctg gcacgggcca gcgatggccc gattgtgggg cttctgctgg 60
cttgttgtag gcttctggcg cgcggcgttc gcgtgtccga cctcttgcaa atgctcagca 120
agccgaattt ggtgctcaga ccctagtcca ggaattgttg cattcccccg actggaacca 180
aactccgtcg acccggagaa tataactgag atatttattg caaatcaaaa acgccttgaa 240
atcattaacg aggatgacgt ggaggcctac gttggtttga gaaatcttac tattgtcgac 300
tccggactta aatttgtagc tcataaagcc ttcctgaaga actctaatct gcagcacatt 360
aatttcacga gaaataagct gaccagcttg tcccggaagc atttccgcca tctcgacctg 420
agcgagctca tactggtcgg aaacccattt acgtgctcct gtgacatcat gtggatcaaa 480
actctgcaag aggcgaaaag tagtccggat acccaagacc tttactgtct taatgaaagc 540
tcaaaaaata tcccgctggc caacctgcag ataccgaact gcggacttcc tagtgcgaat 600
ttggctgccc caaatcttac cgtcgaagaa ggcaaatcaa tcacgctttc ttgttctgta 660
gctggagatc cagtgcctaa tatgtattgg gacgtgggta acctcgtctc aaaacatatg 720
aacgaaacga gccacaccca gggctctttg cggataacaa acatctcctc tgatgattct 780
ggaaagcaaa tcagttgcgt agctgaaaat ctggttggcg aagatcaaga ttcagtcaat 840
ctgacagtcc atttcgcccc aacgatcacc tttctggaga gcccaactag cgatcaccac 900
tggtgtattc cgtttacggt aaaaggaaat ccaaaacctg cactccaatg gttttataat 960
ggagccatct tgaatgaaag caaatatatc tgtactaaaa tccatgtgac gaatcacacc 1020
gagtatcacg ggtgtcttca attggataat ccaacccata tgaataatgg tgattatact 1080
ttgatagcga agaacgaata cggcaaagac gaaaagcaaa tatccgcaca tttcatgggt 1140
tggcctggca tcgacgacgg tgcgaacccg aactacccag atgttattta cgaggattat 1200
gggactgcgg caaacgacat tggcgacacc acaaaccgaa gcaacgagat accaagtact 1260
gacgtcactg acaaaacggg tcgagagcat ttgtctgttt acgccgttgt tgttatcgcc 1320
tcagttgtcg gattttgcct gttggtcatg cttttcctcc tgaagctcgc gcgacattcc 1380
aagtttggca tgaaggggcc agcaagtgtt atatccaatg atgatgatag cgcttctcca 1440
ttgcaccaca taagtaacgg ctcaaacacg ccgtcatcta gtgaaggtgg accagacgcg 1500
gtcattatag ggatgactaa aattcccgta atcgaaaacc ctcagtactt cggcataacc 1560
aacagtcagc ttaaacccga tactttcgtg cagcacatca aaaggcacaa catagtcctc 1620
aagcgcgaac tcggggaggg agccttcgga aaggtctttc ttgctgagtg ctataatttg 1680
tgtcctgagc aggataaaat tcttgtggct gtaaaaactc tcaaagatgc ttccgacaac 1740
gcacggaagg attttcatcg ggaggccgaa ctgttgacga atttgcagca cgagcatata 1800
gtaaagttct acggggtatg tgttgagggg gacccgttga ttatggtctt cgagtatatg 1860
aagcacgggg acctgaacaa atttttgcgc gcccatgggc ctgatgccgt ccttatggca 1920
gaagggaacc ctccaacaga actcacccag agtcagatgt tgcacatagc gcaacagatc 1980
gcggccggca tggtttacct ggccagtcaa cacttcgtgc atagagatct tgccactcgc 2040
aactgtttgg tcggggagaa ccttctggtt aagattggtg actttggtat gtcacgagat 2100
gtgtattcca ctgactatta cagagttggg ggtcatacaa tgcttcctat tcggtggatg 2160
ccccccgaat ccatcatgta cagaaagttc acgacagaga gtgatgtttg gagtctcggc 2220
gtggtgctct gggaaatttt cacatacgga aagcagccgt ggtatcaact tagcaacaat 2280
gaggtgatag agtgtattac acagggtcgg gtgttgcagc gccctcgaac gtgcccacaa 2340
gaagtatatg aacttatgct cgggtgctgg caaagagaac cacatatgag aaaaaatatc 2400
aaggggatac atacattgct tcagaacttg gccaaggcat cacccgtcta cctcgatata 2460
ctgggcagcg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac 2520
cctggaccta tgagaatcct tcttcttact atggttattt catacttcgg ttgcatgaag 2580
gcgcactccg accctgcccg ccgtggggag ctgagcgtgt gtgacagtat tagcgagtgg 2640
gtcacagcgg cagataaaaa gactgcagtg gacatgtctg gcgggacggt cacagtccta 2700
gagaaagtcc cggtatccaa aggccaactg aagcagtatt tctacgagac caagtgtaat 2760
cccatgggtt acaccaagga aggctgcagg ggcatagaca aaaggcactg gaactcgcaa 2820
tgccgaacta cccaatcgta tgttcgggcc cttactatgg atagcaaaaa gagaattggc 2880
tggcgattca taaggataga cacttcctgt gtatgtacac tgaccattaa aaggggaaga 2940
tag 2943

Claims (47)

1.一种用于治疗、预防或改善神经退行性病症或中风的基因构建体，所述基因构建体包含：启动子，所述启动子可操作地连接至第一编码序列，所述第一编码序列编码酪氨酸激酶受体B(TrkB)；以及第二编码序列，所述第二编码序列编码TrkB受体的激动剂。
2.根据权利要求1所述使用的基因构建体，其中所述基因构建体包含编码土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WHPE)的核苷酸序列，任选地其中所述WHPE包含基本上如SEQ ID No:57或SEQ ID No:58所示的核酸序列，或其片段或变体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述使用的基因构建体，其中所述构建体包含编码polyA尾巴的核苷酸序列，任选地其中所述polyA尾巴包含基本上如SEQ ID No:59所示的核酸序列，或其片段或变体。
4.根据任何前述权利要求所述使用的基因构建体，其中所述启动子是人突触蛋白I(SYN I)启动子，任选地其中所述启动子包含基本上如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
5.根据权利要求1至3中任一项所述使用的基因构建体，其中所述启动子是CAG启动子，任选地其中所述启动子包含基本上如SEQ ID No:2、SEQ ID No:3或SEQ ID No:48所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
6.根据任何前述权利要求所述使用的基因构建体，其中所述基因构建体包含设置在所述第一编码序列与所述第二编码序列之间的间隔序列，所述间隔序列编码肽间隔物，所述肽间隔物被配置为被消化，从而产生作为分离分子的TrkB受体和激动剂。
7.根据权利要求6所述使用的基因构建体，其中所述间隔序列包含并编码病毒肽间隔序列，更优选地病毒2A肽间隔序列。
8.根据权利要求6或权利要求7所述使用的基因构建体，其中所述肽间隔序列包含基本上如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，或其片段或变体。
9.根据权利要求6-8中任一项所述使用的基因构建体，其中所述间隔序列包含基本上如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
10.根据权利要求9所述使用的基因构建体，其中所述肽间隔序列包含基本上如SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列，或其片段或变体。
11.根据权利要求6-8中任一项所述使用的基因构建体，其中所述间隔序列包含基本上如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
12.根据权利要求11所述使用的基因构建体，其中所述肽间隔序列包含基本上如SEQID NO.8所示的氨基酸序列，或其片段或变体。
13.根据任何前述权利要求所述使用的基因构建体，其中所述第一编码序列包含编码TrkB的人经典同种型的核苷酸序列，任选地其中所述TrkB的经典同种型包含基本上如SEQID NO.9所示的氨基酸序列，或其片段或变体。
14.根据权利要求13所述使用的基因构建体，其中所述第一编码序列包含基本上如SEQID NO.10所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
15.根据前述权利要求中任一项所述使用的基因构建体，其中所述第一编码序列包含编码TrkB的同种型4的核苷酸序列。
16.根据权利要求16所述使用的基因构建体，其中所述TrkB的同种型4包含基本上如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，或其片段或变体。
17.根据权利要求16或17所述使用的基因构建体，其中所述第一编码序列包含基本上如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
18.根据前述权利要求中任一项所述使用的基因构建体，其中所述第一编码序列包含编码TrkB受体的突变形式的核苷酸序列，其中SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的一个或多个酪氨酸残基是经修饰的或突变的。
19.根据权利要求19所述使用的基因构建体，其中SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的至少两个、三个或四个酪氨酸残基是经修饰的。
20.根据权利要求20所述使用的基因构建体，其中SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的所有五个酪氨酸残基均为经修饰的。
21.根据权利要求19-21中任一项所述使用的基因构建体，其中所述或每个酪氨酸残基被修饰成谷氨酸。
22.根据权利要求19-22中任一项所述使用的基因构建体，其中所述TrkB受体的经修饰形式包含基本上如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，或其片段或变体。
23.根据权利要求23所述使用的基因构建体，其中所述第一编码序列包含基本上如SEQID NO.14所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
24.根据任何前述权利要求所述使用的基因构建体，其中所述第二编码序列编码所述TrkB受体的激动剂，所述TrkB受体的激动剂是营养因子的神经营养蛋白家族的成员，任选地其中所述激动剂选自由以下项组成的激动剂组：脑源性神经营养因子(BDNF)；神经生长因子(NGF)；神经营养蛋白-3(NT-3)；神经营养蛋白-4(NT-4)；以及神经营养蛋白-5(NT-5)；或它们的片段。
25.根据权利要求25所述使用的基因构建体，其中所述第二编码序列编码神经营养蛋白-4(NT-4)，所述NT-4包含基本上如SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，或其片段或变体，且/或所述第二编码序列包含基本上如SEQ ID No:50或SEQ ID No:56所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
26.根据任何前述权利要求所述使用的基因构建体，其中所述TrkB受体的激动剂是前原-脑源性神经营养因子(pre-pro-BDNF)、pro-BDNF或成熟BDNF(mBDNF)。
27.根据权利要求24所述使用的基因构建体，其中所述proBDNF是经典proBDNF，任选地其中所述经典proBDNF包含基本上如SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列，或其片段或变体，或者其中所述第二编码序列包含基本上如SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
28.根据权利要求27所述使用的基因构建体，其中所述proBDNF是proBDNF的同种型2，任选地其中所述proBDNF的同种型2包含在本文中称为SEQ ID NO.17的氨基酸序列，或其片段或变体。
29.根据权利要求27所述使用的基因构建体，其中所述第二编码序列包含编码成熟BDNF的核苷酸序列。
30.根据权利要求30所述使用的基因构建体，其中所述成熟BDNF包含基本上如SEQ IDNO.18所示的氨基酸序列，或其片段或变体。
31.根据权利要求31所述使用的基因构建体，其中所述第二编码序列包含基本上如SEQID NO.19所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
32.根据任何前述权利要求所述使用的基因构建体，其中所述第二编码序列包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码用于所述TrkB受体的激动剂的信号肽，最优选用于BDNF的信号肽。
33.根据权利要求33所述使用的基因构建体，其中所述核苷酸序列编码用于BDNF的经典信号肽。
34.根据权利要求34所述使用的基因构建体，其中所述第二编码序列包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码这样的信号肽，所述信号肽包含基本上如SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列，或其片段或变体。
35.根据权利要求36所述使用的基因构建体，其中所述第二编码序列包含基本上如SEQID NO.21所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
36.根据任何前述权利要求所述使用的基因构建体，其中所述第二编码序列包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码这样的信号序列肽，所述信号序列肽基本上如SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.29中的任一者所示，或者其中所述信号肽包含基本上如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.28中的任一者所示的氨基酸序列。
37.根据任何前述权利要求所述使用的基因构建体，其中所述第二编码序列包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码这样的信号序列肽，所述信号序列肽基本上如SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ IDNO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ IDNO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ IDNO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ IDNO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.101或SEQ ID NO.103中的任一者所示，或者其中所述信号肽包含基本上如SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ IDNO.60、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ IDNO.72、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ IDNO.84、SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ IDNO.96、SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100或SEQ ID NO.102中的任一者所示的氨基酸序列。
38.根据任何前述权利要求所述使用的基因构建体，其中所述构建体包含基本上如SEQID No:107或SEQ ID No:108所示的核苷酸序列，或其片段或变体。
39.一种用于治疗、预防或改善神经退行性病症或中风的重组载体，所述重组载体包含根据权利要求1至39中任一项所述的基因构建体。
40.根据权利要求40所述使用的重组载体，其中所述载体是重组AAV(rAAV)载体。
41.根据权利要求41所述使用的重组载体，其中所述rAAV是AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10或AAV-11。
42.根据权利要求42所述使用的重组载体，其中所述rAAV是rAAV血清型-2。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-39中任一项所述的基因构建体，或根据权利要求40-43中任一项所述的重组载体，以及药学上可接受的媒介物。
44.一种制备根据权利要求49所述的药物组合物的方法，所述方法包括使根据权利要求1-39中任一项所述的基因构建体或根据权利要求40-43中任一项所述的重组载体与药学上可接受的媒介物接触。
45.根据权利要求1-43中任一项所述使用的基因构建体或载体，或根据权利要求44所述的组合物，其中所述神经退行性病症选自由以下项组成的组：亚历山大病、阿尔珀氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、共济失调毛细血管扩张症、神经元蜡样质脂褐质沉积症、巴滕病、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳万病、脑性瘫痪、科凯恩氏综合症、皮质基底节变性、克雅二氏病、额颞叶变性、戈谢病、亨廷顿氏病、HIV相关性痴呆、肯尼迪氏病、克腊伯氏病、路易体痴呆、溶酶体贮积病、神经性莱姆疏螺旋体病、马查多-约瑟夫病、运动神经元病、多系统萎缩症、多发性硬化症、多硫酸酯酶缺乏症、脂质贮积病、发作性睡病、C型尼曼氏病、尼曼氏病、帕金森氏病、佩-梅病、皮克氏病、庞贝病、原发性侧索硬化症、朊病毒病、进行性核上麻痹、雷夫苏姆病、山德霍夫氏病、谢耳德氏病、继发于恶性贫血的脊髓亚急性合并变性、四氏病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩症、三氏病、脊髓痨，以及泰-萨二氏病。
46.根据权利要求1-43中任一项所述使用的基因构建体或载体，或根据权利要求44所述的组合物，其中所述神经退行性病症是阿尔茨海默氏病。
47.根据权利要求46所述使用的基因构建体或载体，其中神经元中的Tau磷酸化减少。
CN201880023931.XA 2017-04-05 2018-03-28 用于神经退行性病症或中风的治疗的基因构建体 Active CN110809476B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1705484.2A GB201705484D0 (en) 2017-04-05 2017-04-05 Genetic construct
GB1705484.2 2017-04-05
PCT/GB2018/050824 WO2018185468A1 (en) 2017-04-05 2018-03-28 Genetic construct for use in the treatment of neurodegenerative disorder or stroke

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110809476A true CN110809476A (zh) 2020-02-18
CN110809476B CN110809476B (zh) 2024-02-27

Family

ID=58682577

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880023931.XA Active CN110809476B (zh) 2017-04-05 2018-03-28 用于神经退行性病症或中风的治疗的基因构建体

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20200046850A1 (zh)
EP (1) EP3606546B1 (zh)
JP (1) JP7296321B2 (zh)
KR (1) KR102616629B1 (zh)
CN (1) CN110809476B (zh)
AU (1) AU2018248651A1 (zh)
CA (1) CA3058549A1 (zh)
ES (1) ES2881176T3 (zh)
GB (1) GB201705484D0 (zh)
MX (1) MX2019012000A (zh)
PL (1) PL3606546T3 (zh)
PT (1) PT3606546T (zh)
RU (1) RU2757932C2 (zh)
WO (1) WO2018185468A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023025193A1 (zh) * 2021-08-25 2023-03-02 上海交通大学医学院 神经生长因子突变体重组蛋白及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113454227A (zh) * 2018-12-19 2021-09-28 维萨梅布有限公司 编码蛋白质的rna
US20220162572A1 (en) 2019-03-04 2022-05-26 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science NUCLEIC ACID CONSTRUCT ENCODING Trk FRAGMENT AND USE THEREOF
BR112021019139A2 (pt) * 2019-03-27 2021-11-30 Sigilon Therapeutics Inc Célula de mamífero manipulada, composição, molécula isolada de dna de fita dupla, dispositivo implantável, cápsula de hidrogel, e, método de tratamento de um paciente com doença de fabry
GB202004832D0 (en) * 2020-04-01 2020-05-13 Instituto De Medicina Molecular Faculdade De Medicina Univ De Lisboa Therapeutic agaents, pharmaceutical compositions, and associated biomarkers

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2588221A1 (en) * 1999-06-08 2000-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US20030124095A1 (en) * 2001-12-31 2003-07-03 Regents Of The University Of California Methods for therapeutic use of brain derived neurotrophic factor in the entorhinal cortex
WO2009120978A2 (en) * 2008-03-27 2009-10-01 The Ohio State University Treatment of metabolic-related disorders using hypothalamic gene transfer of bdnf and compositions therfor
CN102439041A (zh) * 2008-12-19 2012-05-02 H.隆德贝克有限公司 用于治疗精神和行为障碍的对Vps10p-结构域受体家族的调节
CN104583405A (zh) * 2012-03-15 2015-04-29 科纳公司 通过抑制脑源神经营养因子(bdnf)的天然反义转录物治疗bdnf相关疾病
WO2017072498A1 (en) * 2015-10-26 2017-05-04 Quethera Limited Genetic construct

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2588221A1 (en) * 1999-06-08 2000-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US20030124095A1 (en) * 2001-12-31 2003-07-03 Regents Of The University Of California Methods for therapeutic use of brain derived neurotrophic factor in the entorhinal cortex
WO2009120978A2 (en) * 2008-03-27 2009-10-01 The Ohio State University Treatment of metabolic-related disorders using hypothalamic gene transfer of bdnf and compositions therfor
CN102439041A (zh) * 2008-12-19 2012-05-02 H.隆德贝克有限公司 用于治疗精神和行为障碍的对Vps10p-结构域受体家族的调节
CN104583405A (zh) * 2012-03-15 2015-04-29 科纳公司 通过抑制脑源神经营养因子(bdnf)的天然反义转录物治疗bdnf相关疾病
WO2017072498A1 (en) * 2015-10-26 2017-05-04 Quethera Limited Genetic construct
CN108350467A (zh) * 2015-10-26 2018-07-31 奎西拉有限公司 基因构建体

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALAN H. NAGAHARA等: "Potential therapeutic uses of BDNF in neurological and psychiatric disorders" *
ANDREW OSBORNE,: "Design of a Novel Gene Therapy Construct to Achieve Sustained Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling in Neurons" *
LI CHENG等: "TrkB Gene Transfer Protects Retinal Ganglion Cells from Axotomy-Induced Death In Vivo" *
马体栋等: "BDNF及TrKB可能成为肿瘤治疗的新希望" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023025193A1 (zh) * 2021-08-25 2023-03-02 上海交通大学医学院 神经生长因子突变体重组蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
RU2757932C2 (ru) 2021-10-25
JP7296321B2 (ja) 2023-06-22
RU2019131098A (ru) 2021-05-05
CA3058549A1 (en) 2018-10-11
GB201705484D0 (en) 2017-05-17
KR102616629B1 (ko) 2023-12-21
EP3606546A1 (en) 2020-02-12
US20200046850A1 (en) 2020-02-13
CN110809476B (zh) 2024-02-27
EP3606546B1 (en) 2021-04-28
AU2018248651A1 (en) 2019-10-17
RU2019131098A3 (zh) 2021-07-27
PT3606546T (pt) 2021-07-12
JP2020516244A (ja) 2020-06-11
WO2018185468A1 (en) 2018-10-11
KR20200005549A (ko) 2020-01-15
ES2881176T3 (es) 2021-11-29
PL3606546T3 (pl) 2021-11-08
MX2019012000A (es) 2020-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108350467B (zh) 基因构建体
CN110809476B (zh) 用于神经退行性病症或中风的治疗的基因构建体
JP7011467B2 (ja) ミスフォールドタンパク質の分解のための組成物及び方法
JP2023145597A (ja) Ｒｎａを編集するための組成物および方法
EP2797613B1 (en) Vectors encoding rod-derived cone viability factor
JP2010509235A (ja) 多発性硬化症の治療
JP2011500075A (ja) Ｇｄｎｆのスプライスバリアントおよびその用途
US20130209549A1 (en) Materials and methods for treating neurodegenerative diseases
JP2022554267A (ja) 組換えｃｄｋｌ５タンパク質、遺伝子療法、及び製造方法
KR20210116559A (ko) 중추신경계 질환의 치료 방법
WO2020083905A1 (en) Inhibitors of pick1 and uses thereof
WO2012144972A2 (en) Methods to inhibit neurodegeneration
JP2023544141A (ja) ＡＩＭＰ２－ＤＸ２および必要に応じてｍｉＲ－１４２の標的配列ならびにその組成物を使用した神経系疾患を処置する方法
Li et al. Split AAV8 Mediated ABCA4 Expression for Gene Therapy of Mouse Stargardt Disease (STGD1)
JP2020527132A (ja) ミエリン障害を治療するための組成物および方法
US20230348540A1 (en) Viral multimeric peptide constructs for targeting PDZ domains
US20220127347A1 (en) Inhibition of Tau Propagation
US20230416315A1 (en) Prion-fc region fusion protein and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant